KR20200071452A - 메타리지움 아니소플리애 ft319 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제 - Google Patents

메타리지움 아니소플리애 ft319 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제에 관한 것으로서, 해충인 배추좀나방 유충을 방제하여 우수하고 안전한 농산물을 생산할 수 있다. 또한, 친환경 재배지역에서 사용할 수 있는 해충 방제 기술 개발로 농가의 방제비용 및 방제력 절감에 효과가 있으며, 재배 작물의 수량 및 상품성 증가로 농가소득의 증대를 기대할 수 있다.

Description

메타리지움 아니소플리애 FT319 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제{Microbial agent for control of Plutella xylostella larva using Metarhizium anisopliae FT319 and its culture media}
본 발명은 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 또는 이를 함유하는 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충 방제용 미생물제제에 관한 것이다.
곤충병원성 곰팡이는 대부분 불완전균류(Hyphomycetes)에 속하며 사람과 동식물에는 무해하면서 대상으로 하는 해충에는 특이적으로 병원성을 나타내는 곰팡이로서 자연상태에서 숙주의 밀도를 조절하는 역할을 한다. 곤충병원성 곰팡이의 곤충숙주에 대한 침입 기작은 숙주의 섭식을 통해 감염되는 곤충병원성 세균이나 바이러스와는 달리 곰팡이 포자가 숙주 표피에 부착되는 것을 시작으로 표피를 물리적, 화학적 작용으로 뚫고 내부로 침입하여 곤충의 면역작용을 차단하고 독성물질을 분비하여 숙주를 치사시킨다. 이들 곤충병원성 곰팡이를 해충방제에 이용할 경우 인간과 고등생물, 어류, 곡물 등에 직접적인 또는 위험물질의 축적 등과 같은 간접적인 위해 요소가 없어 안정성이 높고, 목적하는 해충만 선별적으로 제거할 수 있는 선택성이 있으며, 또한 살충효과의 지속성이 유지되어 반복적인 미생물제제의 살포를 최소한으로 줄일 수 있다는 이점이 있다.
현재까지 약 750여 종 이상의 곤충병원성 곰팡이가 알려져 있으며, 그 중 보베리아 바시아나(Beauveria bassiana), 노무라에 릴레이이(Nomuraea rileyi) 등이 대표적으로 미생물 살충제로 개발되어 여러 해충 방제에 이용되고 있다.
배추좀나방(Plutella xylostella)은 시설재배 엽채류 중에서 배추를 비롯한 십자화과 작물의 잎과 엽맥을 폭식하면서 다양한 형태로 가장 많은 피해를 주는 나비목(Lepidoptera) 집나방상과(Yponomeutoidea)에 속하는 해충으로서, 전 세계적으로 광범위하게 분포하고 80개국 이상에서 그 피해가 보고된 바 있으며, 시설 재배지 농가에 심각한 경제적 피해를 야기한다.
최근까지 배추좀나방의 방제는 주로 화학 살충제에 의존함으로써 연간 10억 달러 이상의 방제비용이 소요되고 있다. 막대한 방제비용과 더불어 계속되는 화학 살충제의 연용은 배추좀나방의 저항성 발달을 야기시켰다. 배추좀나방이 DDT에 대하여 저항성을 가졌다고 보고한 이래 유기인계, 카바메이트계, 합성 피레스로드계 등과 곤충생장조절제 계통의 테프루벤주론(teflubenzuron)과 클로르프루아주론(chlorfluazuron)에도 저항성이 보고되었다. 이러한 저항성은 화학 살충제의 살포 농도와 횟수를 증가시켰으며 생물농축을 일으켜 인간의 삶에도 악영향을 끼치게 되었다.
한편, 본 발명자들은 곤충병원성 미생물에 대한 연구를 하던 중, 메타지리움 아니소플리애의 신규 균주가 배추좀나방 유충을 효과적으로 방제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1836007호 (발명의 명칭 : 해충방제 및 항균활성을 가지는 곤충병원성 곰팡이 메타리지움 아니소플리애 SD4-2 균주, 출원인 : 대한민국, 등록일자 : 2018.02.28.)
MA Jun, Laboratory susceptibility of Plutella xylostella to Metarhizium anisopliae and Nomuraea rileyi, ENTOMOLOGIA SINICA, 2000, Vol.7, No.1, pp.53-57
본 발명의 목적은 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주 또는 이를 이용한 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충의 해충방제용 미생물제제를 제공하는데 있다.
본 발명은 곤충병원성 신규 미생물 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 배추좀나방 유충에 대해 방제효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 균주는 서열번호 1로 표현되는 18S rRNA 유전자의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주의 균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제를 제공한다.
본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 살충 미생물 농약, 엽면살포제 또는 관주살포제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 미생물제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×104 내지 1×107개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및 상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배추좀나방 유충을 방제하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명은 배추좀나방 유충에 대해 방제효과를 갖는 곤충병원성 신규 미생물 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주에 관한 것으로서, 상기 균주 또는 이의 배양액, 이들이 포함된 미생물제제를 배추좀나방 유충의 방제제로서 이용할 수 있다.
상기 배양액은 바람직하게는 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주가 미생물 배지에서 배양된 배양액일 수 있다. 상기 미생물 배지로는 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주가 생장할 수 있는 PDA(potato dextrose agar), PDB(potato dextrose broth), SDA(sabouraud dextrose agar), SDAY(sabouraud dextrose agar with yeast extract), AD(Modified adamek's media) 액체배지, AD 고체배지 등의 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 PDA 배지를 사용할 수 있다.
상기 PDA 배지는 4g/L potato starch, 20g/L dextrose, 15g/L agar를 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. PDB 배지는 PDA에서 agar를 혼합하지 않고 제조한 액체배지이다. AD 액체배지는 Adameks media의 기본조성을 변형하여 20g/L glucose, 20g/L yeast extract, 30g/L corn steep liquor를 혼합하여 제조할 수 있다. AD 고체배지는 상기 AD 액체배지에 15g/L agar를 혼합하여 제조할 수 있다. SDA는 40g/L dextrose, 10g/L mycological peptone, 15g/L agar를 혼합하여 제조할 수 있다. SDAY는 SDA에 10g/L yeast extract를 혼합하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서 배추좀나방 유충을 효과적으로 방제하기 위한 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주 또는 이의 배양액은 이를 희석한 것으로서 1×104 내지 1×107 conidia/㎖인 것이 바람직하다.
본 발명의 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 배양액은 균주를 15~35℃에서 5~15일간 배양하여 수득된 배양액인 것이 특징이다. 상기 균주의 배양 조건은 15~35℃에서 5~15일간인 것이 적절하며 보다 바람직하게는 20~30℃에서 14일간 배양하는 것이 좋다. 이 때 배양온도가 15℃ 미만이 되면 배양온도가 너무 낮아 상기 균주의 증식속도를 더디게 하며, 35℃를 초과할 경우에는 배양온도가 너무 높아 오히려 상기 균주의 증식이 제한될 수 있다.
또한, 상기 균주를 배양할 때 pH는 pH 6.8 내지 7.2인 것이 바람직하며 보다 바람직하게는 pH 7.0인 것이 좋다.
본 발명에서 배추좀나방 유충을 방제하는 위해 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주 또는 배양액이 포함된 미생물제제를 배추좀나방 유충이 존재하는 식물체에 분무 처리하는 것이 특징이다. 이 때 바람직하게는 미생물제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×104~1×107개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및, 상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;를 포함하는 배추좀나방 유충을 방제할 수 있다. 상기 분무처리는 15~30℃의 온도 하에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 균주 및 이의 배양액, 이를 함유하는 미생물제제를 적용할 수 있는 식물은 배추(Bassica rapa), 양배추(Bassica oleracea), 무(Raphanus sativus), 유채(Brassica napus) 등의 작물일 수 있으나, 상기 식물이 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 미생물제제는 활성 균주 포자의 생존기간, 생존기간 중 발아율, 살충력이 우수하므로 살충 미생물농약, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이용될 수 있다.
본 발명은 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제에 관한 것으로서, 해충인 배추좀나방 유충을 방제하여 우수하고 안전한 농산물을 생산할 수 있다. 또한, 친환경 재배지역에서 사용할 수 있는 해충 방제 기술 개발로 농가의 방제비용 및 방제력 절감에 효과가 있으며, 재배 작물의 수량 및 상품성 증가로 농가소득의 증대를 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2는 배추좀나방 유충에 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주를 접종하고 7일 후 유충이 미생물에 감염된 것을 촬영한 사진이다.
도 3은 배추좀나방 유충에 대한 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 온도별 실내 살충률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자 분무처리 농도에 따른 배추좀나방 유충의 살충률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 배추 포장재배시 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자 분무처리 농도에 따른 배추좀나방 유충의 살충률을 나타낸 그래프이다.
도 6은 배추 포장재배시 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자 분무처리 농도에 따른 배추 상태를 촬영한 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 토양으로부터 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 분리 및 동정>
실시예 1-1. 균주의 분리
토양으로부터 insect-bait법(미끼곤충 : 갈색거저리 유충)을 활용하여 수집한 곤충병원성 곰팡이 중 배추좀나방 유충에 대한 병원성을 가지는 균주를 선발하였다. 보다 자세하게는 부여의 비경작지의 20㎡ 4군데 지점에서 500㎖의 토양을 채취하여 지퍼백에 담아 잘 섞어주었다. 실험실에 가져온 토양은 2㎜ 체에 내려 20㎖를 플라스틱 통에 담고 1.5㎝ 크기의 갈색거저리 유충을 10마리씩 투입하였다. 14일간 25℃에서 배양한 후 감염된 갈색거저리 유충의 표면으로부터 곤충병원성 균주를 분리하였다.
실시예 1-2. 균주의 동정
상기 실시예 1-1의 방법으로 갈색거저리 유충의 표면으로부터 순수분리된 진균 중, 항균활성이 가장 큰 균주를 현미경 관찰을 통해 형태학적 특징을 파악하고, 이 균주의 18S rRNA 유전자의 DNA 염기서열을 추출하여 ITS 분석을 수행하였다. 그 결과, 최종적으로 상기 균주가 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae)와 18S rRNA가 일치하고, 하기의 서열번호 1의 18S rRNA 유전자의 DNA 염기서열을 갖는 것을 확인하여, 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319)이라 명명하고 국립농업과학원에 기탁하였다(KACC 93315P).
18S rRNA 유전자의 DNA 염기서열 - 서열번호 1 :
Figure pat00001
실시예 2. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자현탁액의 제조
순수분리한 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319)의 분생포자를 PDA 배지에 접종하여 28℃에서 14일간 배양하고 포자를 수거하여 0.01% tween 80 용액으로 현탁한 후, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 포자농도 1×104, 1×105, 1×106, 1×107 conidia/㎖이 되도록 포자현탁액을 제조하였다.
실험예 1. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 온도별 발아율과 균사생장 확인
실험예 1-1. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 온도별 발아율
선발된 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319) 균주의 온도별 발아율을 확인하기 위해 균주의 현탁액(1×106 conidia/㎖)을 물한천배지(water agar)에 100㎕씩 도말하여 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃에서 24시간 동안 배양한 후 락토페놀코튼블루액(Lactophenol cotton blue solution)을 떨어뜨려 포자의 발아율을 조사하였다.
Isolates 온도(℃)
15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃
FT319
(24시간 발아율, %)		 88.2±0.7 94.3±0.9 93.7±1.1 94.3±0.4 77.5±2.1
상기 표 1에 나타나 있듯이, 본 발명의 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주는 15~35℃에서 모두 포자의 발아율이 좋으며, 특히 20~30℃에서 가장 발아율이 높은 것으로 확인되었다.
실험예 1-2. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 온도별 균사생장
선발된 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319)의 균체를 PDA배지 중앙에 치상하고 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃에서 14일간 배양하여 균사의 생장을 조사하였다.
Isolates 온도(℃)
15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃
FT319
(14일간 균사생장, ㎜)		 10.3±0.5 17.0±2.8 22.7±0.5 20.1±2.9 14.7±0.3
상기 표 2에 나타나 있듯이, 본 발명의 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주는 15 내지 35℃에서 모두 생육상태가 좋으며, 특히 25 내지 30℃에서 가장 잘 자라는 것으로 확인되었다.
또한 이외에도 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주가 생육하기에 적절한 pH는 6.8~7.2인 것으로 확인되며, 가장 적절하게는 pH 7.0인 것으로 확인되었다.
실험예 2. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 온도별 실내 살충력 검정
상기 실시예 2에서 제조한 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319) 균주의 포자현탁액(1×107 conidia/㎖)을 준비하였다. 배추좀나방 유충에 대한 온도별 살충력을 검정하기 위하여 준비된 포자현탁액을 배추좀나방 유충(3령, 부화 후 5일째)이 투입된 지름 90㎜의 배춧잎 앞, 뒷면에 1㎖씩 분사처리 후 95% 이상의 상대습도를 유지하면서 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃의 서로 다른 온도조건으로 사육하였다. 살충력에 대한 조사는 분사처리 후 6일째 까지 매일 실시하였으며, 10마리씩 각 5회 반복하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, 상기 균주의 포자현탁액을 분사처리한 배춧잎에서 배추좀나방 유충은 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃의 서로 다른 온도조건임에도 불구하고 모두 6일째 되는 날 살충률 100%를 나타내었다. 이를 통해 본 발명의 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주는 온도에 관계없이 배추좀나방 유충에 대한 방제효과가 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 3. 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자 분무처리 농도별 배추좀나방 유충에 대한 방제효과 확인
상기 실시예 2에서 제조한 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자현탁액(1×104, 1×105, 1×106, 1×107 conidia/㎖)을 준비하였다.
다음으로는 준비된 포자현탁액(1×104, 1×105, 1×106, 1×107 conidia/㎖)을 각각 배추좀나방 유충(3령, 부화 후 5일째)이 10마리씩 투입된 배추유묘에 30㎖씩 분사처리 후 아크릴케이지에 넣어 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 상대습도를 유지하면서 25℃의 온도조건으로 사육하였다. 살충력에 대한 조사는 분사처리 후 5일째 까지 매일 실시하였으며, 10마리씩 각 2회 반복하였고 그 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4를 참고하면, 본 발명의 신규 미생물인 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자현탁액은 1×107 conidia/㎖ 농도로 분무처리할 시 가장 높은 살충률을 나타내며 5일째에 약 90%의 살충률을 나타내어 신규 균주의 포자현탁액은 1×107 conidia/㎖의 농도에서 우수한 살충효과가 있는 것으로 확인되었다.
실험예 4. 포장재배 시 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 배추좀나방 유충에 대한 방제효과 확인
상기 실시예 2에서 제조한 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주의 포자현탁액(1×106, 1×107 conidia/㎖)을 준비하였다. 포장재배시 배추좀나방 유충에 대한 방제효과를 확인하기 위해 상기 준비한 포자현탁액(1×106, 1×107 conidia/㎖)을 배추좀나방 유충(3령, 부화 후 5일째)이 20마리씩 투입된 포장 배추에 30㎖씩 분사처리하고 6일간 배추좀나방 유충의 살충수를 조사하였다. 실험은 처리당 20주의 배추유묘를 이용하였으며 포장의 온도, 습도, 광량은 30분 단위로 조사하였다. 실험결과는 도 5에 그래프로 나타내었으며 6일째의 포장 배추 상태를 도 6에 나타내었다.
* 포장환경
- 평균온도 23.7℃(최고 35.0℃, 최저 16.5℃)
- 습도 82.3%(최고 97.4%, 최저 44.5%)
- 광량 179.4 lm/ft2(최대 1619.0 lm/ft2, 최소 0.4 lm/ft2)
도 5를 참고하면, 포장 배추에 상기 균주의 포자현탁액(1×106, 1×107 conidia/㎖)을 처리하였을 때, 처리 후 3일 째부터 배추좀나방 유충에 대한 살충률이 약 80% 이상을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 4일 째부터는 처리한 포자현탁액의 농도에 관계없이 90% 이상의 살충률을 나타내었다. 특히 처리 5일 후에는 89.2±3.6%의 살충률을 나타내어 메타리지움 아니소플리애 FT319 균주가 배추좀나방 유충에 대한 방제효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 6을 참고하면 상기 균주의 포자현탁액(1×106, 1×107 conidia/㎖)을 처리한 포장 배추가 무처리군 포장 배추에 비해 배추좀나방 유충에 대한 피해가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
국립농업과학원 KACC93315P 20181112
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Microbial agent for control of Plutella xylostella larva using Metarhizium anisopliae FT319 and its culture media <130> 0365 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Metarhizium anisopliae <400> 1 acccctgtga attatacctt taattgttgc ttcggcggga cttcgcgccc gccggggacc 60 caaaccttct gaatttttta ataagtatct tctgagtggt taaaaaaaaa tgaatcaaaa 120 ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 180 taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgtca 240 gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt cattacgccc ctcaagtccc ctgcggactt 300 ggtgttgggg atcggcgagg ctggttttcc agcacagccg tcccttaaat taattggcgg 360 tctcgccgtg gccctcctct gcgcagtagt aaagcactcg caacaggagc ccggcgcggt 420 ccactgccgt aaaacccccc aactttttat agttgacctc gaatcaggta ggactacccg 480 ctgaacttaa gcatatca 498

Claims (5)

  1. 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 대해 방제효과를 갖는 것을 특징으로 하는 신규 미생물 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주.
  2. 제1항의 메타리지움 아니소플리애 FT319(Metarhizium anisopliae FT319, KACC 93315P) 균주의 균체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충 방제용 미생물제제.
  3. 제2항의 미생물제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 살충 미생물 농약.
  4. 제2항의 미생물제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 엽면살포제.
  5. 제2항의 미생물제제를 포자 농도가 1㎖ 당 1×104 내지 1×107개가 되도록 희석하여 희석액을 얻는 단계; 및,
    상기 희석액을 방제대상 식물에 분무하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충을 방제하는 방법.
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