KR20200071724A - G-단백질 활성화의 평가를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

G-단백질 활성화의 평가를 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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크리스티앙 르 구일
미셸 부비에
빅토리야 루카시바
미레유 호그
빌리 브레튼
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유니버시떼 드 몬트리얼
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Abstract

형질 막 및 엔도솜과 같은 다양한 세포 구획에서, 및 Gα 단백질 서브유닛 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 방법이 기재된다. 이들 시스템 및 방법은 또한 G 단백질-결합 수용체(GPCR)-매개 뿐만 아니라 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화의 모니터링을 허용하고, 적합한 에너지(BRET) 공여체 및 수용체로 태그된 G 단백질 및 세포 구획 마커의 특이적 이펙터의 G 단백질-결합 도메인의 사용을 기초로 한다.

Description

G-단백질 활성화의 평가를 위한 시스템 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 10월 18일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/573,853호의 우선권을 주장하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 세포에서 G-단백질 활성화의 모니터링에 관한 것이다.
이종삼량체 G 단백질은 G 단백질-결합 수용체(GPCR)의 표준적인 신호전달 파트너이며, 또한 다른 유형의 수용체, 특히 수용체 티로신 키나제(RTK)의 Gα-상호작용 소포-관련 단백질(GIV; 또한 Girdin으로도 알려짐)을 통한 신호전달에 수반되는 것으로 알려져 있다(Ghosh P, 2016, Pharmacol Res.　105:99-107). 수용체 활성화는 Gα-결합된 GDP의 GTP로의 교환을 촉발시켜, Gα 및 Gβ/γ 서브유닛의 해리를 촉진하는 이종삼량체 G 단백질의 형태적 재배열을 초래한다. 이어서 GTP-결합된 Gα 및 유리 Gβ/γ 서브유닛은 특이적 이펙터에 개입할 수 있다.
G 단백질은 Gα 서브유닛의 활성화 후 신호전달 결과에 기초한 패밀리로 그룹화된다. Gs 패밀리(Gαs, Gαolf)는 아데닐릴 시클라제(AC)의 직접 활성화를 통해 cAMP의 생산을 강화시킨다. 반대로, Gi 패밀리(Gαi1, Gαi2, Gαi3, GαoA, GαoB 및 Gαz)는 특이적 AC를 억제함으로써 cAMP 수준을 감소시킨다. Gq 패밀리(Gαq, Gα11, Gα14 및 Gα15)는 포스포리파제 Cβ(PLCβ)를 활성화시켜 2차 메신저 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)를 생산하며, 이는 이후에 소포체로부터 각각 PKC의 활성화 및 Ca2+ 방출을 촉진한다. 마지막으로, G12/13 패밀리(Gα12 및 Gα13)는 LARG, p115 및 TRIO와 같은 Rho-GEF를 제어하고 따라서 세포골격 리모델링과 연관된 과정(예를 들어, 화학주성)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 상이한 패밀리에 속하는 G 단백질의 활성화 후 신호전달의 명확한 결과를 고려하여, G 단백질 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 모니터링을 허용하는 시스템 및 검정은 예를 들어 다양한 리간드에 의해 세포 표면 수용체 활성화를 보다 잘 특징화하고(예를 들어 주어진 리간드에 의해 활성화된 신호전달 경로) G 단백질의 보다 특이적인 조절인자를 확인하는데 필요하다.
세포 표면 수용체 활성화가 리간드 결합에 반응하여 형질 막(PM)에서 주로 발생하지만, 세포 표면 수용체(예를 들어, GPCR, RTK)의 신호전달은 엔도솜 및 골지를 포함한 다른 세포 구획에서 발생하는 것으로 제시된 바 있다. 활성화시, 많은 세포 표면 수용체는 엔도솜에 진입하고, 엔도솜 내의 리간드-수용체 복합체의 트래피킹(trafficking)은 수용체의 분해를 통해 신호전달을 종결시키거나(리소좀 및 프로테아좀에서), 또는 수용체의 재순환을 통해 신호전달을 세포 표면으로 다시 지속시키는 메커니즘을 제공한다. 그러나, 수용체 신호전달이 또한 엔도솜에서 개시되고, 지속되고, 종결될 수 있음이 입증된 바 있다(Murphy et al., 2009, PNAS, vol. 106 no. 42, 17615-17622; Tsvetanova et al., 2015, J. Biol. Chem. 290(11), pp. 6689-6696; Vilardaga et al., 2014, Nature Chemical Biology 10, 700-706). 유사하게, 일부 G 단백질은 골지(Lo et al., 2015,　Dev.　Cell.　33: 189-203) 및 소포체(ER)-골지 계면(Bastin et al., Front Bioeng Biotechnol.　2015 Sep 1;3: 128)과 회합하고 활성화되는 것으로 밝혀진 바 있다. 상이한 신호는 PM, 및 엔도솜 및 골지와 같은 다른 구획에서 수용체로부터 발생하여 명확한 생리학적 반응을 초래할 수 있고, 상이한 메커니즘은 이들 구획에서 수용체의 신호전달을 조절한다. 신호전달 및 조절에 대한 이러한 명확한 메커니즘은 (PM 보다는) 다른 세포 구획에서 신호전달을 표적화하는 것에 기초한 신규 요법의 가능성을 높이고, 따라서 상이한 세포 구획에서 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정이 필요하다.
미국 특허 제9,029,097호 및 WO/2016/058094는 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 BRET-기반 바이오센서를 개시한다. 그러나, 이들 바이오센서는 G 단백질 서브유닛(Gα, Gβ, 및/또는 Gγ) 중 하나 이상, 및/또는 GPCR의 태깅을 필요로 하며, 이는 이들 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이들 바이오센서는 세포에서 전반적인 G 단백질 활성화를 검출하지만, 상이한 세포 구획에서 및 G 단백질 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 모니터링을 허용하지는 않는다.
본 명세서는 다수의 문서를 지칭하며, 그의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 하기 양태(item) 1 내지 67을 제공한다:
1. Gα 단백질 서브유닛 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 조절(modulation)을 측정하는 시스템으로, 상기 시스템은 하기를 성분을 발현하는 세포를 포함하며:
(i) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 Gα 서브유닛 상호작용 폴리펩티드(GASIP)를 포함하는 제1 성분으로서, 여기서: 상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gi이면, 상기 GASIP는 Gi에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고; 상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gq이면, 상기 GASIP는 Gq에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고; 상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 G12/13이면, 상기 GASIP는 G12/13에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하는 것인, 제1 성분; 및
(ii) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 형질 막(PM)-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티를 포함하는 제2 성분;
여기서 상기 GASIP가 상기 형광 수용체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 형광 수용체 분자로 태그되는 것인, 시스템.
2. 양태 1에 있어서, Gi에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 Rap1GAP 또는 G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질의 G-단백질 결합 도메인인, 시스템.
3. 양태 2에 있어서, 상기 GASIP가 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
4. 양태 3에 있어서, 상기 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인이 위치 437, 439 및 441에서 세린 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되거나 또는 부재하는 Rap1GAP의 잔기 1 내지 442(서열번호(서열식별번호):8), 또는 그의 변이체를 포함하는, 시스템.
5. 양태 4에 있어서, 상기 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인이 Rap1GAP의 잔기 1 내지 420 또는 1 내지 436을 포함하는, 시스템.
6. 양태 4에 있어서, 상기 위치 437, 439 및 441에서 모든 3개의 세린 잔기가 돌연변이되는, 시스템.
7. 양태 4 또는 6에 있어서, 상기 세린 잔기가 알라닌으로 치환되는, 시스템.
8. 양태 2에 있어서, 상기 GASIP가 RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
9. 양태 8에 있어서, 상기 RGS 단백질이 RGS17, RGS19 또는 RGS20인, 시스템.
10. 양태 9에 있어서, 상기 G 단백질-결합 도메인이 RGS17의 잔기 64 내지 210(서열번호:17), RGS19의 잔기 70-217(서열번호:18), 또는 RGS20의 잔기 242-388(서열번호:19)을 포함하는, 시스템.
11. 양태 1에 있어서, Gq에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 P63RhoGEF 또는 GRK2의 G 단백질-결합 도메인인, 시스템.
12. 양태 11에 있어서, 상기 GASIP가 P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
13. 양태 12에 있어서, 상기 P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 P63RhoGEF의 잔기 295 내지 502(서열번호:25)를 포함하는, 시스템.
14. 양태 11에 있어서, 상기 GASIP가 GRK2의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템
15. 양태 14에 있어서, 상기 GRK2의 G 단백질-결합 도메인이 GRK2의 잔기 30 내지 203(서열번호:27)을 포함하는, 시스템.
16. 양태 1에 있어서, G12/13에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인인, 시스템.
17. 양태 16에 있어서, 상기 GASIP가 PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
18. 양태 17에 있어서, 상기 PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 PDZRhoGEF의 잔기 281 내지 483(서열번호:21)을 포함하는, 시스템.
19. 양태 16에 있어서, 상기 GASIP가 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
20. 양태 19에 있어서, 상기 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 P115RhoGEF의 잔기 1 내지 244(서열번호:23)를 포함하는, 시스템.
21. 양태 1 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티가 상기 형광 수용체 분자로 태그되는, 시스템.
22. 양태 1 내지 21 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 PM에 국부화된 PM 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
23. 양태 22에 있어서, 상기 PM 단백질 또는 그의 단편이 (a) 팔미토일화, 미리스토일화, 및/또는 프레닐화 신호 서열 및/또는 (b) 다염기성 서열을 포함하는, 시스템.
24. 양태 22 또는 23에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 아미노산 서열 GCMSCKCVLS(서열번호:62), GCMGLPCVVM(서열번호:63), CVKIKKCIIM(서열번호:64), KKKKKKSKTKCVIM(서열번호:65), KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL(서열번호: 45), CMSCKCCIL(서열번호:46), 또는 SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS(서열번호:47)를 포함하는, 시스템.
25. 양태 24에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 아미노산 서열 GKKKKKKSKTKCVIM(서열번호:1)을 포함하는, 시스템.
26. 양태 1 내지 21 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 엔도솜에 국부화된 엔도솜 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
27. 양태 26에 있어서, 상기 엔도솜 단백질 또는 그의 단편이 FYVE 도메인을 포함하는, 시스템.
28. 양태 27에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 인간 엔도핀의 FYVE 도메인을 포함하는, 시스템.
29. 양태 28에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 인간 엔도핀의 잔기 739 내지 806(서열번호:39)을 포함하는, 시스템.
30. 양태 1 내지 21 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 골지에 국부화된 골지 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
31. 양태 30에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 골지에 국부화된 eNOS1 또는 그의 단편인, 시스템.
32. 양태 31에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 인간 eNOS1의 잔기 1 내지 73(서열번호:48)을 포함하는, 시스템.
33. 양태 1 내지 32 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 제1 성분이 (i) 상기 GASIP와 (ii) 상기 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자 사이의 링커를 추가로 포함하는, 시스템.
34. 양태 1 내지 33 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 제2 성분이 (i) 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티와 (ii) 상기 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자 사이의 링커를 추가로 포함하는, 시스템.
35. 양태 33 또는 34에 있어서, 상기 링커가 5 내지 25개의 아미노산으로 연결된 펩티드인, 시스템.
36. 양태 1 내지 35 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 G 단백질을 통해 신호를 보내는 세포 표면 수용체인 제3 성분을 추가로 포함하는 시스템.
37. 양태 36에 있어서, 상기 세포 표면 수용체가 GPCR, RTK 또는 인테그린 수용체인, 시스템.
38. 양태 1 내지 37 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 G 단백질 활성화가 G 단백질-결합 수용체(GPCR)-매개 G 단백질 활성화인, 시스템.
39. 양태 1 내지 38 중 어느 한 양태에 있어서, 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드인 제4 성분을 추가로 포함하는 시스템.
40. 양태 39에 있어서, 상기 G 단백질 활성화가 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화이고, 상기 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드가 상기 Gα 서브유닛 폴리펩티드의 카르복시(C)-말단 도메인에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 C-말단 도메인이 상기 Gα 서브유닛 폴리펩티드의 마지막 7개 잔기에 상응하는, 시스템.
41. 양태 40에 있어서, 상기 돌연변이가 적어도 마지막 2개의 C-말단 잔기의 결실 또는 치환인, 시스템.
42. 양태 41에 있어서, 상기 돌연변이가 적어도 마지막 5개의 C-말단 잔기의 결실 또는 치환인, 시스템.
43. 양태 40에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 C-말단 도메인에서 보존된 류신 잔기 중 적어도 1개의 결실 또는 치환인, 시스템.
44. 양태 43에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 C-말단 도메인에서 마지막 보존된 류신 잔기의 치환인, 시스템.
45. 양태 44에 있어서, 상기 치환이 류신을 아스파르테이트로, 류신을 프롤린으로, 또는 류신을 아르기닌으로 치환인, 시스템.
46. 양태 40 내지 45 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 GEF가 GIV/Girdin이고, 상기 GASIP가 양태 1 내지 7 중 어느 한 양태에 정의된 바와 같은 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
47. 양태 46에 있어서, 상기 GEF가 수용체 티로신 키나제(RTK)에 의해 활성화되는, 시스템.
48. 양태 1 내지 47 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 생물발광 공여체 분자가 루시퍼라제, 바람직하게는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 단백질(rLuc)인, 시스템.
49. 양태 1 내지 48 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 형광 수용체 분자가 녹색 형광 단백질(GFP), 바람직하게는 레닐라 GFP(rGFP)인, 시스템.
50. 양태 1 내지 49 중 어느 한 양태의 시스템의 제1 및/또는 제2 성분을 암호화하는 하나 이상의 핵산.
51. 양태 50에 있어서, 양태 1 내지 49 중 어느 한 양태의 시스템의 제1 성분을 암호화하는 제1 핵산 및 양태 1 내지 49 중 어느 한 양태의 시스템의 제2 성분을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산.
52. 양태 50 또는 51의 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터.
53. 양태 1 내지 49 중 어느 한 양태에 정의된 시스템의 성분을 발현하는 숙주 세포.
54. 제제(agent)가 관심 G 단백질의 활성화를 조절하는지 여부를 결정하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법: (a) 양태 1 내지 49 중 어느 한 양태의 시스템을 상기 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템에서 BRET 신호를 측정하며, 여기서 상기 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 상기 관심 G 단백질의 활성화를 조절함을 나타내는 것인, 단계.
55. 양태 54에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 양태 1 내지 7 중 어느 한 양태에 정의된 바와 같은 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
56. 양태 49에 있어서, 상기 시스템이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
57. 양태 56에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
58. 양태 54에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 양태 1 및 11 내지 15 중 어느 한 양태에 정의된 바와 같은 P63RhoGEF 또는 GRK2의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
59. 양태 58에 있어서, 상기 시스템이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
60. 양태 59에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
61. 양태 54에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 양태 1 및 16 내지 20 중 어느 한 양태에 정의된 바와 같은 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
62. 양태 61에 있어서, 상기 시스템이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
63. 양태 62에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
64. 제제가 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화를 조절하는지 여부를 결정하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법: (a) 양태 40 내지 47 중 어느 한 양태의 시스템을 상기 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템에서 BRET 신호를 측정하며, 여기서 상기 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 비-수용체 GEF-매개 G 단백질 활성화를 조절함을 나타내는 것인, 방법.
65. 양태 54 내지 64 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 BRET 신호가 플레이트 판독기를 사용하거나 또는 현미경 검사에 의해 측정되는, 방법.
66. 양태 54 내지 65 중 어느 한 양태에 있어서, 상기 기질이 코엘렌테라진 기질인, 방법.
67. 양태 66에 있어서, 상기 코엘렌테라진 기질이 메톡시 e-코엘렌테라진인, 방법.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 특성은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로 주어진 하기 특정 구현예의 비제한적인 설명을 읽으면 보다 명백해질 것이다.
첨부된 도면의 설명은 다음과 같다:
도 1a는 GPCR-매개 직접 G 단백질 활성화(상부 패널 i) 또는 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화(하부 패널 ii)를 모니터링하기 위한 이펙터-기반 센서의 원리를 도시한다. 수용체, 적합한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 공여체 또는 수용체(예를 들어, rGFP)로 태그된 세포 구획(또는 세포하 국부화) 마커, 예컨대 형질 막(PM) 또는 초기 엔도솜(EE) 마커, 적합한 BRET 공여체 또는 수용체(예를 들어, RlucII)로 태그된 특이적 G 단백질 이펙터의 Gα-상호작용 도메인을 발현하는 세포는 작용제에 노출되어 공동발현된 G 단백질을 활성화시킨다. 패널 i)에서, 작용제-유도 GPCR 자극은 G 단백질을 직접적으로 활성화시키며, 이는 태그된 이펙터를 세포질에서 표지된 막으로 동원한다. 패널 ii)에서 G 단백질 활성화는 RTK(예를 들어, EGFR) 또는 인테그린 α-β 복합체의 활성화 후 GIV/Girdin과 같은 GEF의 동원에 의해 매개된다.
도 1b-1e는 3개의 상이한 G 단백질 이펙터로 수득된 특이성의 예를 도시한다. Gq, Gi 및 G12/13 패밀리의 구성원에 결합된 수용체를 PM 마커에 융합된 rGFP(rGFP-CAAX, GKKKKKKSKTKCVIM, 서열번호: 1) 및 RlucII로 태그된 G 단백질 이펙터와 함께, 이들 G 단백질과 공동-발현시켰다. 도 1b는 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 및 rGFP-CAAX(PM 마커)를 사용하여, 혈소판-활성화 인자(PAF)/PAFR-매개 G 단백질(Gq, G11, G14, G12, GoA, GoB, Gz, Gi1, Gi2, Gi3) 활성화로 수득된 용량 반응 곡선(DRC)을 도시한다. 모의 반응은 내인성으로 발현된 Gi1, i2 및 i3 단백질의 활성화를 나타낸다. 도 1c는 PDZRG-RlucII 및 rGFP-CAAX를 사용하여, U46619/TPαR-매개 G 단백질(Gq, G11, G14, G15, G12, G13, Gz) 활성화로 수득된 DRC를 도시한다. 모의 반응은 내인성으로 발현된 G12 및 G13 단백질의 활성화를 나타낸다. 도 1d 및 1e는 P63RG-RlucII 및 rGFP-CAAX를 사용하여, PAF/PAFR-매개 G 단백질(Gq, G11, G14, G12, GoA, GoB, Gz, Gi1, Gi2, Gi3) 활성화(도 1d) 및 U46619/TPαR-매개 G 단백질(Gq, G11, G14, G15, G12, G13, Gz) 활성화(도 1e)로 수득된 DRC를 도시한다. 모의 반응은 내인성으로 발현된 Gq 및 G11 단백질의 활성화를 나타낸다.
도 2a는 Gi 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 Rap1GAP-기반 시스템의 시험된 다양한 작제물을 도시한다. 첫번째 작제물은 C-말단에서 BRET 공여체, Rluc8로 태그된 Rap1GAP의 일부(잔기 1-442)로 이루어진다. 이 작제물로부터, 상이한 링커를 사용하고 Rluc8 대신에 RlucII를 사용하여 두번째 작제물을 유도하였다. 실험 결과는 도 2b-2z에 도시되어 있다. 링커A = GSGGGSGGGA(서열번호: 6) 및 링커B = GSAGTGGRAIDIKLPAT(서열번호: 7). Rap1GAP 1-442 = 서열번호: 8; Rap1GAP Δcterm(1-420) = 서열번호: 10; Rap1GAP ΔSSS = 서열번호: 9; Rap1GAP SS-AA = 서열번호: 13; Rap1GAP SS-DA = 서열번호: 14; Rap1GAP SS-AD = 서열번호: 15; Rap1GAP SS-DD = 서열번호: 16; Rap1GAP SSS-AAA = 서열번호: 11; Rap1GAP SSS-TTT = 서열번호: 12.
도 2b-2e는 3개의 상이한 Rap1GAP-Rluc 작제물: Rap1GAP(1-442)-Rluc8(원형), Rap1GAP(1-442)-RlucII(삼각형) 및 Rap1GAP(ΔCT)-RlucII(다이아몬드형)을 사용하여 AR-M100390(ARM) 자극시 Gi1(도 2b), Gi2(도 2c), GoA(도 2d) 및 Gz(도 2e)의 인간 Mu 오피오이드 수용체(hMOR1)-매개 활성화를 사용한 DRC를 도시한다.
도 2f-2h는 Rap1GAP(1-442)-Rluc8(도 2f), Rap1GAP(1-442)-RlucII(도 2g) 또는 RAP1GAP(ΔCT)-RlucII(도 2h)를 사용하여, 상이한 단백질의 인산화를 초래하는 단백질 키나제 A의 cAMP 생산 증가 및 활성화를 촉진시키는, 포스콜린(삼각형) 또는 비히클(DMSO/타이로드, 원형)의 존재 하에 PM에서 Gz의 hMOR1/ARM-촉진된 활성화를 사용한 DRC를 도시한다.
도 2i-2n은 Rap1GAP(1-442)-RlucII(도 2i), 절단된(잔기 1-436) 버전 Rap1GAP(ΔSSS)-RlucII(도 2j), Rap1GAP(SS-AD)-RlucII(도 2k), Rap1GAP(SS-DA)-RlucII(도 2l), Rap1GAP(SS-AA)-RlucII(도 2m), 또는 Rap1GAP(SS-DD)-RlucII(도 2n)를 사용하여 포스콜린(사각형) 또는 비히클(원형)의 존재 하에 PM에서 Gi2의 hMOR1/ARM-촉진된 활성화를 사용한 DRC를 도시한다.
도 2o-2q는 Rap1GAP(1-442)-RlucII(도 2o), Rap1GAP(SSS-TTT)-RlucII(도 2p) 및 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII(도 2q)를 사용하여 포스콜린(삼각형) 또는 비히클(원형)의 존재 하에 PM에서 GoB의 hMOR1/ARM-촉진된 활성화를 사용한 DRC를 도시한다.
도 2r은 Gi1, Gi2, Gi3, GoA 또는 GoB의 공동-발현과 함께, 형질 막으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 전위를 사용하여 도파민 D4 수용체(D4R)의 도파민-촉진된 자극 후 G 단백질 활성화의 DRC를 도시한다.
도 2s-2w는 리간드 A412,997, 도파민, L741,742 및 Way-100635로 도파민 수용체 D4R(도 2s), D1R(도 2t), D2R(도 2u), D3R(도 2u) 또는 D1R(도 2w)의 자극 후 Gz 활성화의 DRC를 도시한다.
도 2x-2z는 검정의 견고성을 나타내는 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT Gi2(도 2x), WT GoA(도 2y), 또는 WT Gz(도 2z)와 함께, D4R, Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII, rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 6-8 분 동안 37℃에서 100nM 도파민(삼각형) 또는 비히클(DMSO/타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 3a는 본원에 기재된 연구에서 사용된 G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질의 구성원의 RGS 도메인에 기초한 Gi 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 다른 작제물을 도시한다. RGS17(서열번호: 17의 잔기 64-210), RGS19(서열번호: 18의 잔기 70-217) 및 RGS20(서열번호: 19의 잔기 242-388)의 RGS(Gi-결합) 도메인을 포함하는 단편은 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그되어 있다. 링커B' = GSAGTGGRAIDIKLASAT(서열번호: 20).
도 3b-3d는 GoA, GoB, Gz, Gi1, Gi2 또는 Gi3의 공동-발현과 함께, PM으로 RGS(RGS17)-RlucII(도 3b), RGS(RGS19)-RlucII(도 3c) 또는 RGS(RGS20)-RlucII(도 3d) 전위를 사용하여 D4)의 도파민-촉진된 자극 후 G 단백질 활성화의 DRC를 도시한다.
도 4a는 본원에 기재된 연구에서 사용된 G12/13 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 PDZRhoGEF(PDZRG)-RlucII 작제물을 도시한다. PDZRhoGEF(서열번호: 21의 잔기 281-483)의 G12/13 결합 도메인을 포함하는 단편은 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그되어 있다. 링커D = GIRLREALKLPAT(서열번호: 22).
도 4b 및 4c는 TPαR 작용제 I-BOP(CAS 번호: 128719-90-4)로 자극 후, Gα 없음(모의), 5 ng의 Gα, 20 ng의 Gα 또는 100 ng의 Gα 중 어느 하나와 함께 트롬복산 수용체(TPαR), PDZRG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동형질감염된 HEK293 세포에서 G12(도 4b) 및 G13(도 4c) 활성화의 DRC를 도시한다.
도 4d 및 4e는 PDZRG-RlucII를 사용하여 PM에서 G12(도 4d) 및 13(도 4e) 활성화에 대한 TPαR 리간드의 DRC를 도시한다. 트롬복산 수용체(TPαR), PDZRG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동형질감염된 HEK293 세포를 알려진 완전 작용제(U46619, I-BOP, CTA2), 부분 작용제(U51605) 및 길항제 I-SAP 및 SQ 29,558로 자극하였다. 결과를 정규화하고 I-BOP 반응의 %(n=4) +/- SEM으로 제시하였다.
도 4f 및 4g는 PDZRG-RlucII 작제물을 사용하여 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT G12(도 4f) 또는 WT G13(도 4g)과 함께 TPαR, PDZRG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 6-8 분 동안 37℃에서 100 nM의 TPαR 작용제 U46619(삼각형) 또는 비히클(메틸 아세테이트/타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 PDZRG-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 5a는 본원에 기재된 연구에서 사용된 G12/13 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 P115RhoGEF(P115RG)-RlucII 작제물을 도시한다. P115RhoGEF(서열번호:23의 잔기 1-244)의 G12/13 결합 도메인을 포함하는 단편은 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그되어 있다. 링커C = RLKLPAT(서열번호: 24).
도 5b 및 5c는 P115RG-RlucII를 사용하여 PM에서 G12(도 5b) 및 G13(도 5c) 활성화에 대한 TPαR 리간드의 DRC를 도시한다. 트롬복산 수용체(TPαR), P115RG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동형질감염된 HEK293 세포를 U46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP 및 SQ 29,558로 자극하였다. 결과를 정규화하고 I-BOP 반응의 %(n=4) +/- SEM으로 제시하였다.
도 5d 및 5e는 PDZRG-RlucII 작제물을 사용하여 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT G12(도 5d) 또는 WT G13(도 5e)과 함께 TPαR, P115RG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 6-8 분 동안 37℃에서 100 nM의 TPαR 작용제 U46619(삼각형) 또는 비히클(메틸 아세테이트/타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 P115RG-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 6a는 본원에 기재된 연구에서 사용된 Gq 패밀리(Gq, G11, G14 & G15)의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 P63RhoGEF(P63RG) 작제물을 도시한다. P63RhoGEF의 Gq 결합 도메인(서열번호: 25의 잔기 295-502)을 포함하는 단편은 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그되어 있다. 링커E = ASGSAGTGGRAIDIKLPAT(서열번호: 26).
도 6b-6e는 TPαR 작용제 U46619로 자극 후, Gα 없음(모의, 내인성 G 단백질로부터 수득된 반응) 또는 상이한 품질의 Gα 서브유닛 중 어느 하나와 함께 TPαR, P63RG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동형질감염된 HEK293 세포의 PM에서 Gq(도 6b), G11(도 6c), G14(도 6d) 및 G15(도 6e) 활성화의 DRC를 도시한다.
도 6f-6i는 TPαR 작용제 U46619로 자극 후, Gα 없음(모의, 내인성 G 단백질로부터 수득된 반응) 또는 상이한 품질의 Gα 서브유닛 중 어느 하나와 함께 TPαR, P63RG-RlucII, rGFP-FYVE로 공동형질감염된 HEK293 세포의 초기 엔도솜(EE)에서 Gq(도 6f), G11(도 6g), G14(도 6h) 및 G15(도 6i) 활성화의 DRC를 도시한다.
도 6j-6m은 도 6b-6e에서 결정된 최적 조건 하에 P63RG-RlucII를 사용하여 PM에서 Gq(도 6j), G11(도 6k), G14(도 6l) 및 G15(도 6m) 활성화에 대한 TPαR 리간드의 DRC를 도시한다. 트롬복산 수용체(TPαR), P63RG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동형질감염된 HEK293 세포를 U46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP 및 SQ 29,558로 자극하였다. 결과를 정규화하고 I-BOP 반응의 %(n=3 내지 n=5) +/- SEM으로 제시하였다.
도 6n-6q는 도 6f-6i에서 결정된 최적 조건 하에 P63RG-RlucII를 사용하여 EE에서 Gq(도 6n), G11(도 6o), G14(도 6p) 및 G15(도 6q) 활성화에 대한 TPαR 리간드의 DRC를 도시한다. 트롬복산 수용체(TPαR), P63RG-RlucII, rGFP-FYVE로 공동형질감염된 HEK293 세포를 U46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP 및 SQ 29,558로 자극하였다. 결과를 정규화하고 I-BOP 반응의 %(n=3 내지 n=5) +/- SEM으로 제시하였다.
도 6r 및 6s는 P63RG-RlucII 작제물을 사용하여 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT Gq(도 6r) 또는 WT G11(도 6s)과 함께 TPαR, P63RG-RlucII, rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 6-8 분 동안 37℃에서 100 nM의 TPαR 작용제 U46619(삼각형) 또는 비히클(메틸 아세테이트/타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 P63RG-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 7a는 본원에 기재된 연구에서 사용된 Gq 패밀리(Gq, G11, G14 & G15)의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 2개의 RGS(GRK2) 작제물을 도시한다. GRK2의 Gq 결합 도메인(RGS 도메인)(서열번호: 27의 잔기 30-203)을 포함하는 단편은 N-말단 RlucII-RGS(GRK2) 또는 C-말단(RGS(GRK2)-RlucII)에서 BRET 공여체 RlucII로 태그되어 있다. 링커B' = GSAGTGGRAIDIKLASAT(서열번호: 20).
도 7b 및 7c는 RlucII-RGS(GRK2)를 사용하여, 2개의 리간드/수용체 시스템, 즉 At1AR/ANGII(도 7b) 및 TPαR/U46619(도 7c)의 PM에서 Gq, G11, G14 및 G15의 활성화의 DRC를 도시한다.
도 7d 및 7e는 RGS(GRK2)-RlucII를 사용하여, 2개의 리간드/수용체 시스템, 즉 At1AR/ANGII(도 7d) 및 TPαR/U46619(도 7e)의 PM에서 Gq, G11, G14 및 G15의 활성화의 DRC를 도시한다.
도 7f는 RlucII-RGS(GRK2) 작제물을 사용하여 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT Gq와 함께 TPαR, RlucII-RGS(GRK2), rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 6-8 분 동안 37℃에서 100 nM의 TPαR 작용제 U46619(삼각형) 또는 비히클(메틸 아세테이트/타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 RlucII-RGS(GRK2)의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 8a는 G 단백질의 GEF-매개 활성화, 즉 GPCR에 의해 매개되지 않은 G 단백질 활성화를 모니터링하는 그의 능력에 대해 본원에 기재된 연구에서 시험된 돌연변이된 Gi2 및 GoB 단백질을 도시한다. Gαi2 Δ5 = 서열번호: 28; Gαi2 Δ2 = 서열번호: 29; Gαi2 L-2G = 서열번호: 31; Gαi2 L-2P = 서열번호: 33; Gαi2 L-2R = 서열번호: 34; Gαi2 L-2D = 서열번호: 32; Gαi2 L-7G = 서열번호: 30; GαoB Δ5 = 서열번호: 36; GαoB L-2G = 서열번호: 35.
도 8b-8g는 Gi2 및 GoB의 결실 돌연변이체, 즉 Gi2 Δ2(도 8b 및 8c), Gi2 Δ5(도 8d 및 8e) 및 GoB Δ5(도 8f 및 8g)의 활성화의 DRC를 도시한다. HEK293을 EGF 수용체(EGFR, 도 8b, 8d, 8f) 또는 브래디키닌 수용체(BKB2R, 도 8c, 8e, 8g) 중 어느 하나, Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII, rGFP-CAAX, 및 WT 또는 돌연변이된 Gi2/GoB 서브유닛을 암호화하는 구출물로 공동-형질감염시켰다.
도 8h-8m은 Gi2 및 GoB의 Leu을 Gly으로 돌연변이체, 즉 Gi2 L-7G(도 8h 및 8i), Gi2 L-2G(도 8j 및 8k) 및 GoB L-2G(도 8l 및 8m)의 활성화의 DRC를 도시한다. HEK293을 EGFR(도 8h, 8j, 8l) 또는 BKB2R(도 8i, 8k, 8m) 중 어느 하나, Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII, rGFP-CAAX, 및 WT 또는 돌연변이된 Gi2/GoB 서브유닛을 암호화하는 작제물로 공동-형질감염시켰다.
도 8n-8s는 Gi2의 위치 -2 돌연변이체, 즉 Gi2 L-2D(도 8n 및 8o), Gi2 L-2P(도 8p 및 8q) 및 Gi2 L-2R(도 8r 및 8s)의 활성화의 DRC를 도시한다. HEK293을 EGFR(도 8n, 8p, 8r) 또는 BKB2R(도 8o, 8q, 8s) 중 어느 하나, Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII, rGFP-CAAX, 및 WT 또는 돌연변이된 Gi2 서브유닛을 암호화하는 작제물로 공동-형질감염시켰다.
도 8t-8u는 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 작제물을 사용하여 G 단백질의 GEF-매개 활성화를 모니터링하는 검정에 대한 Z' 인자를 도시하는 그래프이다. HEK293을 WT Gi2(도 8t) 또는 돌연변이체 Gi2 L-2P(도 8u)와 함께 EGFR, Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII, rGFP-CAAX로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 2 분 동안 RT에서 10 ng/ml의 EGF(삼각형) 또는 비히클(타이로드; 사각형)로 자극하였다. PM으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. BRET 값은 제시된 그래프에 웰당 표시되어 있다.
도 8v-8x는 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 작제물(원형) 및 RGS(RGS17)-RlucII(삼각형)를 사용하여 모니터링된, 2개의 GPCR, 도 8v에서 델타-오피오이드 수용체(DOR), 및 도 8w에서 D2R, 및 RTK(EGFR; 도 8x)에 의한 Gi2 활성화의 DRC를 도시한다. HEK293을 수용체(DOR, D2R 또는 EGFR), Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 또는 RGS(RGS17)-RlucII, rGFP-CAAX 및 WT Gi2를 암호화하는 작제물로 공동-형질감염시키고, 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, GPCR 작용제(도 8v, 8w)로 8 분 동안 또는 EGF(도 8x)로 7 분 동안, RT에서 지시된 용량으로 자극하였다. PM으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 및 RGS(RGS17)-RlucII의 동원을 BRET2에서 평가하였다. 제시된 DRC는 대표적인 3개의 독립 실험이다.
도 9a-9d는 본원에 기재된 연구에서 사용된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다.
본원에 사용된 유전학, 분자 생물학, 생화학 및 핵산의 용어 및 기호는 당업계의 표준 논문 및 텍스트, 예를 들어 Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W University Science Books, 2005); Lehninger, Biochemistry, 6th Edition (W H Freeman & Co (Sd), New York, 2012); Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984) 등의 것들을 따른다. 모든 용어는 관련 업계에서 확립된 그들의 전형적인 의미로 이해되어야 한다.
단수형은 본원에서 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉 적어도 하나)를 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 문맥상 요구되지 않는 한, "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 언급된 Genbank, RefSeq, UniProt, NCBI 및/또는 Ensembl　수탁 번호(또는 임의의 다른 데이터베이스)에 상응하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 포함한 정보는 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 달리 본원에 지시되지 않거나 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어("예를 들어", "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 제한을 두지 않는다.
본원에서, "약"이라는 용어는 일반적인 의미를 갖는다. "약"이라는 용어는 값이 값을 결정하기 위해 이용되는 장치 또는 방법에 대한 고유의 오차 변동을 포함하거나, 또는 언급된 값에 가까운 값, 예를 들어 언급된 값(또는 값의 범위)의 10% 또는 5% 이내를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본원에 개시된 구현예 및 특성의 임의의 및 모든 조합 및 하위조합은 본 발명에 의해 포함된다. 예를 들어, 본원에 확인된 유전자들 중 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 임의의 조합의 표현은 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
본 개시내용은 G 단백질 패밀리-선택적 방식으로, 및 상이한 세포 구획에서 G 단백질 활성화의 모니터링을 허용하는 시스템 및 검정에 관한 것이다. 이들 시스템 및 검정은 적합한 에너지(즉 BRET) 공여체 및 수용체로 태그된 G 단백질 및 세포 구획 마커의 특이적 이펙터의 사용에 기초한다. 이들 시스템 및 검정은 유리하게는 특이적 G 단백질 이펙터의 전위를 평가하여, 이에 따라 G 단백질의 기능/활성이 변경될 위험을 최소화함으로써 특정 세포 구획에서 G 단백질 활성화가 G 단백질 패밀리-선택적 방식으로 간접적으로 검출됨에 따라 임의의 G 단백질 서브유닛(Gα, Gβ 또는 Gγ)의 변형(예를 들어, BRET 공여체 또는 수용체 또는 다른 검출가능한 표지로 태깅/융합)을 필요로 하지 않는다. 본원에 기재된 시스템으로 수득된 동적 창은 G 단백질 활성화를 평가하기 위해 다른 시스템으로 수득된 것보다 더 높으며(예를 들어, 미국 특허 번호 제9,029,097호 및 WO/2016/058094), 이는 고처리량 스크리닝(HTS) 적용(부분 작용제의 확인 포함)에 중요할 수 있고, 또한 내인성 G 단백질에 의해 매개된 신호의 검출을 (G 단백질 패밀리 수준에서) 허용한다. 특이성은 관심 G 단백질 서브유닛(들)에 특이적인 G 단백질 이펙터의 G 단백질-결합 도메인, 예컨대 Gi 패밀리(Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB, Gz)에 대한 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인, Gq 패밀리(Gq, G11, G14 & G15)에 대한 P63RhoGEF(P63RG)의 G 단백질-결합 도메인 및 G12/13 패밀리에 대한 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 사용함으로써 달성된다. 필요한 경우, G 단백질 서브유닛 수준에서의 특이성은 관심 G 단백질 서브유닛(들)을 연구된 수용체와 공동-발현함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 개시내용은 Gα 단백질 서브유닛 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 조절을 측정하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 하기 성분을 발현하는 세포를 포함하며:
(i) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 Gα 서브유닛 상호작용 폴리펩티드(GASIP)를 포함하는 제1 성분으로서;
여기서:
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gi이면, 상기 GASIP는 Gi에 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gq이면, 상기 GASIP는 Gq에 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 G12/13이면, 상기 GASIP는 G12/13에 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gs이면, 상기 GASIP는 Gs에 결합하는 단백질의 도메인을 포함하는 것인, 제1 성분; 및
(ii) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 형질 막(PM)-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티를 포함하는 제2 성분;
여기서 상기 GASIP가 상기 형광 수용체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 형광 수용체 분자로 태그된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 Gα 단백질 서브유닛 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 조절을 측정하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 하기 성분을 발현하는 세포를 포함하며:
(i) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 Gα 서브유닛 상호작용 폴리펩티드(GASIP)를 포함하는 제1 성분으로서;
여기서:
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gi이면, 상기 GASIP는 Rap1GAP, G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질 또는 TNFAIP8의 G 단백질-결합 도메인, 바람직하게는 Rap1GAP 또는 RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gq이면, 상기 GASIP는 RhoGEF 단백질(예를 들어, P63RhoGEF 또는 TRIO), GRK2, GRK3, TPR1(테트라트리코펩티드 반복 도메인 1) 또는 RGS 단백질(예를 들어, RGS2)의 G 단백질-결합 도메인, 바람직하게는 P63RhoGEF 또는 GRK2/GRK3의 G 단백질-결합 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 G12/13이면, 상기 GASIP는 RhoGEF 단백질(PDZRhoGEF, P115RhoGEF 또는 LARG), JNK-상호작용 류신 지퍼 단백질(JLP), 카데린, Axin1, PP2A, SNAP-알파, 폴리시스틴1, RGS16, AKAP110 또는 HAX1(HS1-관련 단백질 X1)의 G 단백질-결합 도메인, 바람직하게는 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하고;
상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gs(Gαs, XLGαs, Gαolf)이면, 상기 GASIP는 SNX13(RGS-PX1), AXIN1 또는 TPR1(테트라트리코펩티드 반복 도메인 1)의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는 것인, 제1 성분;
(ii) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 형질 막(PM)-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티를 포함하는 제2 성분;
여기서 상기 GASIP가 상기 형광 수용체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되면, 상기 세포 M-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 형광 수용체 분자로 태그된다.
생물발광 공여체 분자(또는 BRET 공여체) 및 형광 수용체 분자(또는 BRET 수용체)는 생물발광 공여체 분자의 방출 스펙트럼이 형광 수용체 분자의 흡광 스펙트럼과 중첩되도록 선택된다. 이러한 조건 하에, 생물발광 공여체 분자에 의해 전달된 광 에너지는 형광 수용체 분자를 여기할 수 있는 파장, 즉 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)에 있다. 공명 에너지 전달(약칭 RET)은 중첩 방출/흡수 스펙트럼을 갖는 2개의 발색단 사이의 에너지 전달을 설명하는 메커니즘이다. 2개의 발색단("공여체" 및 "수용체")이 서로 짧은 거리(예를 들어, 10-100 옹스트롬) 내에 있고 그들의 전이 쌍극자가 적당하게 배향되면, 공여체 발색단은 그의 여기된-상태 에너지를 비-방사성 쌍극자-쌍극자 커플링을 통해 수용체 발색단에 전달할 수 있다. 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)은 공여체 생물발광 분자(레닐라 루시퍼라제와 같은 생물발광 효소)와 수용체 형광 분자(예를 들어, 레닐라 GFP) 사이에 에너지의 비-방사성 전달에 기초한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물발광 공여체 분자라는 용어는 적합한 기질에 대한 작용, 또는 외부 공급원에 의한 자체 여기 후 발광을 생성할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 본 개시내용에 이용될 수 있는 복수의 상이한 생물발광 공여체 분자가 있다. 발광 시스템은 박테리아, 원생동물, 강장동물, 연체동물, 어류, 배각류, 날벌레, 진균, 벌레, 갑각류, 및 초시류, 특히 피로포루스(Pyrophorus) 속의 방아 벌레 및 포티누스(Photinus), 포투리스(Photuris), 및 루시올라(Luciola) 속의 반딧불이를 포함한 많은 발광성 유기체로부터 단리되고 알려져 있다. 생물발광을 나타내는 추가 유기체는 PCT 공보 번호 WO 00/024878 및 WO 99/049019에 열거되어 있다. 한 구현예에서, 생물발광 공여체 분자는 루시퍼라제이다. 루시퍼라제 활성을 갖는 생물발광 단백질의 예는 미국 특허 번호 제5,229,285호, 제5,219,737호, 제5,843,746호, 제5,196,524호, 및 제5,670,356호에 개시되어 있다. 가장 널리 사용되는 루시퍼라제 중 2종은 (i) 레닐라 루시퍼라제 및 (ii) 파이어플라이(Firefly) 루시퍼라제이다.
한 구현예에서, 생물발광 공여체 분자는 레닐라 루시퍼라제(rLuc)이다. 본원에 사용된 바와 같은 레닐라 루시퍼라제라는 용어는 생물발광에 사용된 산화 효소를 지칭하며 레닐라 속의 유기체, 예컨대 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 또는 레닐라 물레리(Renilla mulleri)로부터 유래된다. 이는 레닐라 유기체, 또는 그의 변이체로부터의 고유 루시퍼라제, 예를 들어 레닐라 레니포르미스 루시퍼라제(Rluc) 또는 그의 변이체의 고유 형태(아미노산 서열 면에서) 예컨대 RlucII, Rluc3, 녹색 레닐라 루시퍼라제 또는 Rluc8을 포함한다. "RlucII"라는 용어는 고유 레닐라　루시퍼라제에 비해 하기 아미노산 치환: A55T, C124A 및 M185V를 포함하는 레닐라 레니포르미스　루시퍼라제의 돌연변이체 형태를 지칭한다. 한 구현예에서, RlucII는 도 9c에 도시된 서열을 포함한다. "Rluc8"이라는 용어는 고유 레닐라 레니포르미스 루시퍼라제에 비해 하기 아미노산 치환: A55T, C124A, S130A, K136R, A143M, M185V, M253L, 및 S287L을 포함하는 레닐라 레니포르미스 루시퍼라제의 돌연변이체 형태를 지칭한다. 고유 레닐라 물레리 루시퍼라제의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 AAG54094.1에 개시되어 있다.
이들 효소에 대한 천연 및 합성 발광성 기질은 당업계에 널리 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다. 루시퍼라제 기질의 예는 루시페린(예를 들어, D-루시페린 및 그의 염, 라티아 루시페린, 박테리아 루시페린, 디노플라겔레이트 루시페린 등), 코엘렌테라진, 코엘렌테라진 h, 코엘렌테라진 e, 코엘렌테라진 f, 코엘렌테라진 fcp, 코엘렌테라진 cp, 코엘렌테라진 hcp, 코엘렌테라진 i, 코엘렌테라진 ip, 코엘렌테라진 n, 코엘렌테라진 400a(DeepblueC™), 메톡시 e-코엘렌테라진(NanoLight Technology®로부터의 Prolume® Purple I), 메톡시-코엘렌테라진-메톡시(NanoLight Technology®로부터의 Prolume® Purple II), 메톡시-코엘렌테라진-F(NanoLight Technology®로부터의 Prolume® Purple III), 메톡시-코엘렌테라진-요오딘(NanoLight Technology®로부터의 Prolume® Purple), 메톡시-v-코엘렌테라진- 메톡시(NanoLight Technology®로부터의 Prolume® Purple V), ViviRenTM(Promega®로부터 입수)을 포함한다. 생물발광 공여체 분자의 적합한 기질은 생물발광 단백질에 의해 방출된 광의 원하는 파장 및/또는 강도에 기초하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 루시퍼라제 기질은 코엘렌테라진-h, 메톡시 e-코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 400A이다.
본원에 사용된 바와 같이, 형광 수용체 분자라는 용어는 생물발광 공여체 분자의 활성의 결과로서 방출된 에너지를 수용하고, 이를 광 에너지로서 재방출할 수 있는 임의의 화합물을 지칭한다. 대표적인 형광 수용체 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 녹색 형광 단백질의 변이체(예컨대 GFP10), 청색 형광 단백질(BFP), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 GFP(EGFP), 강화된 CFP(ECFP), 강화된 YFP(EYFP), GFPS65T, mAmetrine, LSS-mOrange, LSS-mKate, 에메랄드, 토파즈, GFPuv, 불안정화된 EGFP(dEGFP), 불안정화된 ECFP(dECFP), 불안정화된 EYFP(dEYFP), HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, mRFPl, 포실로포린, 레닐라 GFP(rGFP), 몬스터 GFP, paGFP, 카에데 단백질 또는 피코빌리단백질, 또는 이들 중 임의의 하나의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 단편을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 가장 빈번하게 사용되는 생물발광 또는 형광단은 해파리 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터의 GFP 및 예를 들어 돌연변이유발 및 키메라 단백질 기술로 수득된 수많은 다른 변이체(GFP)이다. GFP는 그들의 발색단의 독특한 성분에 기초하여 분류되며, 각각의 부류는 명확한 여기 및 방출 파장을 갖는다: 부류 1, 중성 페놀 및 음이온성 페놀레이트의 야생형 혼합물: 부류 2, 페놀레이트 음이온: 부류 3, 중성 페놀: 부류 4, 적층된 s-전자 시스템을 갖는 페놀레이트 음이온: 부류 5, 인돌: 부류 6, 이미다졸: 및 부류 7, 페닐.
비-단백성 형광 수용체 분자의 예는 Alexa™(Molecular Probes), 플루오르 염료, Bodipy dye™(Life technologies), Cy dye™(Life technologies), 플루오레세인, 단실, 엄벨리페론(7-히드록시쿠마린), 형광 미소구체, 발광성 나노결정, Marina blue™(Life technologies), Cascade blue™(Life technologies), Cascade yallow™(Life technologies), Pacific Blue™(Life technologies), Oregon green™(Life technologies), 테트라메틸로다민, 로다민, Texas red™(Life technologies), 희토류 원소 킬레이트, 또는 그의 임의의 조합 또는 유도체이다.
다른 대표적인 형광 수용체 분자는 하기를 포함할 있으나 이에 제한되지는 않는다: sgGFP, sgBFP, BFP 청색-이동 GFP(Y66H), 시안 GFP, DsRed, 단량체 RFP, EBFP, ECFP, GFP(S65T), GFP 적색-이동(rsGFP), 비-UV 여기(wtGFP), UV 여기(wtGFP), GFPuv, HcRed, rsGFP, 사파이어 GFP, sgBFP™, sgBFP™(수퍼 글로 BFP), sgGFP™, sgGFP™(수퍼 글로 GFP), 옐로 GFP, 반도체 나노입자(예를 들어, 라만 나노입자), 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸엄벨리페론; 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카르복시플루오레세인(5-FAM); 5-카르복시나프토플루오레세인; 5 -카르복시 테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-FAM(5-카르복시플루오레세인); 5-HAT(히드록시 트립타민); 5-히드록시 트립타민(HAT); 5-ROX(카르복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카르복시테트라메틸로다민); 6-카르복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD); 7-히드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 산성 푹신; ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로; 아크리플라빈; 아크리플라빈 포일겐 SITS A; 에쿼린(발광단백질); AFP(자동형광 단백질; Quantum Biotechnologies); Alexa Fluor 350™; Alexa Fluor 430™; Alexa Fluor 488™; Alexa Fluor 532™; Alexa Fluor 546™; Alexa Fluor 568™; Alexa Fluor 594™; Alexa Fluor 633™; Alexa Fluor 647™; Alexa Fluor 660™; Alexa Fluor 680™; 알리자린 콤플렉손; 알리자린 레드; 알로피코시아닌(APC); AMC, AMCA-S; AMCA(아미노메틸쿠마린); AMCA-X; 아미노악티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아미노메틸쿠마린(AMCA); 아닐린 블루; 안트로실 스테아레이트; APC(알로피코시아닌); APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; 아스트라존 브릴리언트 레드 4G; 아스트라존 오렌지 R; 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 옐로 7 GLL; 아타브린; ATTO-TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; 아우라민; 아우로포스핀 G; 아우로포스핀; BAO 9(비스아미노페닐옥사디아졸); BCECF(높은 pH); BCECF(낮은 pH); 베르베린 술페이트; 베타 락타마제; 비메인; 비스벤즈아미드; 비스벤즈이미드(회흐스트); 비스-BTC; 블란코포르 FFG; 블란코포르SV; BOBO™-l ; BOBO™-3; 보디피 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세라마이드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 접합체; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; B0-PR0™-1 ; BO-PRO™-3; 브릴리언트 술포플라빈 FF; BTC; BTC-5N; 칼세인; 칼세인 블루; Calcium Crimson™; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2+　염료; 칼슘 그린-2 Ca2+; 칼슘 그린-5N Ca2+; 칼슘 그린-C18 Ca2+; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르 화이트; 카르복시-X-로다민(5-ROX); Cascade Blue™; 캐스캐이드 옐로; 카테콜아민; CCF2(진블레이저); CFDA; 클로로필; 크로모마이신 A; 크로모마이신 A; CL-NERF; CMFDA; 쿠마린 팔로이딘; C-피코시아닌; CPM 메틸쿠마린; CTC; CTC 포르마잔; Cy2™; Cy3.18; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.18; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; 사이클릭 AMP 플루오로센서(FiCRhR); 답실; 단실; 단실 아민; 단실 카다베린; 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실; 다폭실 2; 다폭실 3'DCFDA; DCFH(디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트); DDAO; DHR(디히도로다민 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS(비-비율); DiA(4-디-16-ASP); 디클로로디히도플루오레세인 디아세테이트(DCFH); DiD-친유성 트레이서; DiD(DilC18(5)); DIDS; 디히드로로다민 123(DHR); Dil(DilC18(3)); 디니트로페놀; DiO(DiOC18(3)); DiR; DiR(DilC18(7)); DM-NERF(높은 pH); DNP; 도파민; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; ELF 97; 에오신; 에리트로신; 에리트로신 ITC; 에티듐 브로마이드; 에티듐 호모다이머-1(EthD-1); 유크리신; 유코라이트; 유로퓸(III) 클로라이드; EYFP; 패스트 블루; FDA; 포일겐(파라로사닐린); FIF(포름알데히드 유도된 형광); FITC; 플라조 오렌지; 플루오-3; 플루오-4; 플루오레세인(FITC); 플루오레세인 디아세테이트; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드(히드록시스틸바미딘); 플루오르-루비; 플루오르X; FM 1-43™; FM 4-46; Fura Red™(높은 pH); Fura Red™/플루오-3; 푸라-2; 푸라-2/BCECF; 게나크릴 브릴리언트 레드 B; 게나크릴 브릴리언트 옐로 10GF; 게나크릴 핑크 3G; 게나크릴 옐로 5GF; 진블레이저(CCF2); 글록살산; 그래뉼 블루; 해마토포르피린; 회흐스트 33258; 회흐스트 33342; 회흐스트 34580; HPTS; 히드록시쿠마린; 히드록시스틸바미딘(플루오로골드); 히드록시트립타민; 인도-1, 고 칼슘; 인도-1, 저 칼슘; 인도디카르보시아닌(DiD); 인도트리카르보시아닌(DiR); 인트라화이트 Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; 레이저프로; 라우로단; LDS 751(DNA); LDS 751(RNA); 류코포르 PAF; 류코포르 SF; 류코포르 WS; 리사민 로다민; 리사민 로다민 B; 칼세인/에티듐 호모다이머; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 옐로; 리소 트랙커 블루; 리소 트랙커 블루-화이트; 리소 트랙커 그린; 리소 트랙커 레드; 리소 트랙커 옐로; 리소센서 블루; 리소센서 그린; 리소센서 옐로/블루; 매그 그린; 매그달라 레드(플록신 B); 매그-푸라 레드; 매그-푸라-2; 매그-푸라-5; 매그-인도-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라키트 그린; 마리나 블루; 맥실론 브릴리언트 플라빈 10 GFF; 맥실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트랙커 그린 FM; 미토트랙커 오렌지; 미토트랙커 레드; 미트라마이신; 모노브로모비메인; 모노브로모비메인(mBBr-GSH); 모노클로로비메인; MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 닐 레드; 니트로벤즈옥사디돌; 노르아데날린; 뉴클레어 패스트 레드; 뉴클레어 옐로; 닐로산 브릴리언트 라빈 E8G; 오레곤 그린; 오레곤 그린 488-X; Oregon Green™; Oregon Green™ 488; Oregon Green™ 500; Oregon Green™ 514; 퍼시픽 블루; 파라로사닐린(포일겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드[레드 613]; 플록신 B(매그달라 레드); 포르위트 AR; 포르위트 BKL; 포르위트 Rev; 포르위트 RPA; 포스핀 3R; 포토레지스트; 피코에리트린 B[PE]; 피코에리트린 R[PE]; PKH26(Sigma); PKH67; PMIA; 폰토크롬 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1 ; PO-PRO-3; 프리물린; 프로시온 옐로; 프로피듐 요오다이드(PI); PyMPO; 피렌; 피로닌; 피로닌 B; 피로잘 브릴리언트 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크린 머스타드; 레드 613[PE-텍사스레드]; 레소루핀; RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 엑스트라; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘; 로다민 팔로이딘; 로다민 레드; 로다민 WT; 로즈 벵갈; R-피코시아닌; R-피코에리트린(PE); S65A; S65C; S65L; S65T; SBFI; 세로토닌; 세브론 브릴리언트 레드 2B; 세브론 브릴리언트 레드 4G; 세브론 브릴리언트 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로 L; SITS; SITS(프리물린); SITS(스틸벤 이소티오술폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARF1; 나트륨 그린; 스펙트럼아쿠아; 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 레드; SPQ(6-메톡시-N-(3-술포프로필)퀴놀리늄); 스틸벤; 술포로다민 B can C; 술포로다민 엑스트라; SYTO 11 ; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41 ; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61 ; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX 블루; SYTOX 그린; SYTOX 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민(TRITC); Texas Red™; Texas Red-X™ 접합체; 티아디카르보시아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티올라이트; 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS(칼코플루오르 화이트); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트리컬러(PE-Cy5); TRITC 테트라메틸로다민이소티오시아네이트; 트루 블루; 트루레드; 울트라라이트; 우라닌 B; 우비텍스 SFC; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1 ; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, SYBR 그린, 및 티아졸 오렌지(삽입 염료).
한 구현예에서, 형광 수용체 분자는 레닐라 GFP(rGFP)이다. "레닐라 GFP"라는 용어는 레닐라 속, 예컨대 레닐라 레니포르미스 또는 레닐라 물레리의 유기체로부터 유래된 녹색 형광 단백질을 지칭한다. 이는 레닐라 유기체, 또는 그의 변이체로부터의 고유 GFP를 포함한다. 한 구현예에서, 레닐라 GFP는 레닐라 레니포르미스 GFP, 추가 구현예에서, 레닐라 레니포르미스 GFP의 고유 형태(아미노산 서열 면에서)이다. 한 구현예에서, rGFP는 도 9d에 도시된 서열을 포함한다. 고유 레닐라 물레리 GFP의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 AAG54098.1에 개시되어 있다. 레닐라 루시퍼라제 및/또는 레닐라 GFP의 핵산 서열은 인간 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다(즉 "인간화", 예를 들어, 레닐라 물레리 GFP의 인간화 버전에 대해 WO 2002/057451 참조).
BRET에 적합한 생물발광 공여체 및 형광 수용체 분자의 대표적인 조합(BRET 쌍으로 지칭됨)은 루시퍼라제(Luc)/GFP, Luc/비너스, Luc/토파즈, Luc/GFP-10, Luc/GFP-2, Luc/YFP, Luc/rGFP 등을 포함한다. 다른 구현예에서, 하기 BRET 구성 중 하나가 본원에 기재된 바이오센서 및 방법에 사용된다: RlucII/coel-400a/강화된 청색(EB) FP2, RlucII/coel-400a/슈퍼 시안 형광 단백질(SCFP3A), RlucII/coel-400a/mAmetrine, RlucII/coel-400a/rGFP, RlucII/coel-400a/mAmetrine.
한 구현예에서, 생물발광 공여체 분자는 레닐라 루시퍼라제이고 형광 수용체 분자는 레닐라 GFP이다.
한 구현예에서, 제2 성분은 PM-표적화 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "형질 막(PM) 표적화 모이어티"라는 용어는 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자(예를 들어, 레닐라 GFP 또는 레닐라 Luc)를 PM에 동원 또는 격리할 수 있는 임의의 모이어티를 지칭한다. 따라서 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자는 형질 막에서 발견된 임의의 단백질(예를 들어, PM에서 발견된 수용체 또는 임의의 다른 단백질), 또는 그의 단편에 융합될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 많은 세포 유형에서 발견된 포낭(형질 막의 작은(50-100 nm) 함입에 상응하는 지질 뗏목 유형)의 주요 성분인 카베올린-1이다. CAV1 유전자의 대안적인 스플라이싱에 의해 생성된 카베올린-1의 2개의 이소형이 확인되었다: 카베올린-1α(잔기 2-178 포함) 및 카베올린-1β(32-178 서열에 상응). 이러한 모이어티의 다른 예는 단백질 지질화/지방산 아실화, 예컨대 미리스토일화, 팔미토일화 및 프레닐화, 뿐만 아니라 다염기성 도메인에 대한 신호 서열을 포함하는 펩티드/폴리펩티드를 포함한다. 여러 단백질은 미리스토일화, 팔미토일화 및/또는 프레닐화되는 것으로 알려져 있고(예를 들어, 단백질 키나제 및 포스파타제 예컨대 Yes, Fyn, Lyn, Lck, Hck, Fgr, Gα　단백질, 산화 질소 신타제, ADP-리보실화 인자(ARF), 칼슘 결합 단백질 및 막 또는 세포골격-관련 구조 단백질 예컨대 MARCKS(예를 들어, Wright et al., J Chem Biol. Mar 2010; 3(1): 19-35; Alcart-Ramos et al., Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Biomembranes, Volume 1808, Issue 12, December 2011, Pages 2981-2994 참조), 따라서 이들 단백질 중 임의의 것으로부터의 미리스토일화, 팔미토일화 및 프레닐화(예를 들어, 게라닐게라닐화) 신호 서열은 바이오센서에서 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 미리스토일화 및/또는 팔미토일화 서열은 Lyn 키나제로부터의 것이다.
한 구현예에서, PM 막 표적화 모이어티는 CAAX 모티프(C는 시스테인 잔기이고, AA는 2개의 지방족 잔기이고, X는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함한다. CAAX 모티프는 번역후 변형을 지시하는 C-말단에서 특이적 아미노산 서열을 갖는 단백질의 그룹으로 정의된 "CAAX 단백질"에서 발견된다. CAAX 단백질은 핵 라민(중간 필라멘트) 예컨대 프리라민 A, 라민 B1 및 라민 B2, Ras 및 복수의 GTP-결합 단백질(G 단백질) 예컨대 Ras, Rho, Rac, 및 Cdc42, 여러 단백질 키나제 및 포스포타제 등을 포함하는 매우 다양한 분자를 포함한다(예를 들어, Gao et al., Am J Transl Res. 2009; 1(3): 312-325 참조). C-말단의 단부에서 CAAX 모티프 또는 박스를 갖는 단백질은 전형적으로 단백질이 형질 막 또는 핵 막으로 이동하여 상이한 기능을 발휘하기 전에 프레닐화 과정을 필요로 한다. 한 구현예에서, CAAX 박스는 인간 RAS 패밀리 단백질, 예를 들어 HRAS, NRAS, Ral-A, KRAS4A 또는 KRAS4b로부터 유래된다. RAS, NRAS, KRAS4A 또는 KRAS4b의 마지막 C-말단 잔기(초가변 영역 또는 HVR로 지칭됨)는 하기 도시되며, 추정된 최소 형질 막 표적화 영역은 이탤릭체로 및 CAAX 박스는 밑줄로 표시되어 있다(예를 들어, Ahearn et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 13: 39-51, January 2012 참조): HRAS: KLNPPDESGPGCMSCK CVLS (서열번호: 41); NRAS: KLNSSDDGTQGCMGLP CVVM (서열번호: 42); KRAS4A: KISKEEKTPGCVKIKK CIIM (서열번호: 43); KRAS4B: KMSKDGKKKKKKSKTK CVIM (서열번호: 44); Ral-A/Ral1: KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL(서열번호: 45). 한 구현예에서, PM 표적화 모이어티는 아미노산 서열 GCMSCKCVLS(서열번호:60), GCMGLPCVVM(서열번호:61), CVKIKKCIIM(서열번호:62), KKKKKKSKTKCVIM(서열번호:63), 또는 KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL(서열번호: 45)을 포함하고, 바람직하게는 PM 표적화 모이어티는 KRAS4B로부터의 서열 GKKKKKKSKTKCVIM(서열번호:1)을 포함한다. 다른 구현예에서, PM 표적화 모이어티는 HRAS로부터의 형질 막 표적화 팔미토일화 서열 및 Ral-A/Ral1로부터의 프레닐화 신호 서열(서열: CMSCKCCIL, 서열번호: 4)을 포함한다.
여러 단백질은 또한 PM을 표적으로 하는 비-지질, 다염기성 도메인 예컨대 Ras 소형 GTPases, 포스포타제 PTEN, 비수용체 티로신 키나제 Src, 액틴 조절인자 WASP 및 MARCKS, 및 G 단백질-결합 수용체 키나제(GRK)　예컨대 GRK5를 함유한다. 한 구현예에서, 다염기성 도메인은 GRK5로부터의 것이며, 서열 SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS(서열번호: 5)를 포함한다.
한 구현예에서, 제2 성분은 엔도솜 표적화 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "엔도솜 표적화 모이어티"라는 용어는 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자를 엔도솜, 예를 들어, 초기 엔도솜에 동원 또는 격리할 수 있는 임의의 모이어티를 지칭한다. 여러 엔도솜 표적화 모이어티/마커가 당업계에 알려져 있으며 단백질의 Rab 패밀리(RAB4, RAB5, RAB7, RAB9 및 RAB11), 만노스 6-포스페이트 수용체(M6PR), 카베올린-1 및 -2, 트랜스페린 및 그의 수용체, 클라트린, 뿐만 아니라 FYVE 도메인 예컨대 초기 엔도솜 자가항원 1(EEA1), 라베노신-5, 수용체 활성화를 위한 Smad 앵커(SARA), Vps27p 및 엔도핀을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 마커는 초기 엔도솜에 보다 특이적이고(예를 들어, RAB4, 트랜스페린 및 그의 수용체, 및 FYVE 도메인을 포함하는 단백질), 다른 마커는 후기 엔도솜에 보다 특이적이며(예를 들어, RAB7, RAB9, 및 M6PR), 다른 마커는 재순환 엔도솜에 보다 특이적이다(예를 들어, RAB11, RAB4). 따라서, 이들 단백질 또는 적합한 그의 단편은 생물발광 공여체 분자(예를 들어, 레닐라 Luc) 또는 형광 수용체 분자(예를 들어, 레닐라 GFP)에 융합되어 그들을 엔도솜 국부화에 연결/표적할 수 있다.
한 구현예에서, 엔도솜 표적화 모이어티는 FYVE 도메인을 포함한다. FYVE 도메인은 3개의 보존된 요소에 의해 정의된다: N-말단 WxxD, 중앙 RR/KHHCR, 및 C-말단 RVC 모티프. FYVE 도메인을 함유하는 인간 단백질의 예는 ANKFY1, EEA1 FGD1, FGD2, FGD3, FGD4, FGD5, FGD6, FYCO1, HGS MTMR3, MTMR4, PIKFYVE, PLEKHF1, PLEKHF2, RUFY1, RUFY2, WDF3, WDFY1, WDFY2, WDFY3, ZFYVE1, ZFYVE16, ZFYVE19, ZFYVE20, ZFYVE21, ZFYVE26, ZFYVE27, ZFYVE28 및 ZFYVE9(EMBL-EBI, 패밀리 FYVE(PF01363))를 포함한다. 한 구현예에서, 엔도솜 표적화 모이어티는 인간 ZFYVE16/엔도핀의 FYVE 도메인(UniProtKB - Q7Z3T8, 서열번호: 39), 예를 들어 약 잔기 747 내지 805 또는 약 잔기 739 내지 806 인간 엔도핀을 포함한다.
한 구현예에서, 제2 성분은 골지 표적화 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "골지 표적화 모이어티"라는 용어는 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자를 골지 기관에 동원 또는 격리할 수 있는 임의의 모이어티를 지칭한다. 여러 골지 표적화 모이어티/마커가 당업계에 알려져 있으며 eNOS(예를 들어, 그의 N-말단 부분, J. Liu et al., Biochemistry, 35(1996), pp. 13277-13281), GM130, 골지n-97, 58K 단백질, 트랜스-골지 네트워크 막 단백질 2(TGOLN2), TGN46, TGN38, 만노시다제 2, 신탁신 6, GM130(GOLGA2), Golgin-160, 멤브린(GS27), GS28, 코토머 단백질, Rbet1 및 RCAS1을 포함한다. 따라서, 이들 단백질 또는 적합한 그의 단편은 레닐라 Luc 또는 레닐라 GFP에 융합되어 그들을 골지 기관 국부화에 연결/표적할 수 있다. 한 구현예에서, 골지 표적화 모이어티는 인간 eNOS 단백질의 N-말단 부분(서열번호:46), 예를 들어 인간 eNOS1의 잔기 1 내지 73.
한 구현예에서, (i) PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티와 (ii) GASIP 사이에 직접 단백질-단백질 상호작용은 없다.
생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자는 표적화 모이어티에 대해 N-말단, 내부 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 한 구현예에서, PM 표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자의 C-말단 단부에 융합된다. 한 구현예에서, PM 표적화 모이어티는 형광 수용체 분자, 바람직하게는 형광 수용체 분자의 C-말단 단부에 융합된다. 한 구현예에서, 엔도솜 표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자의 C-말단 단부에, 추가 구현예에서 상기 형광 수용체 분자의 C-말단 단부에 융합된다.
생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자는 GASIP에 대해 N-말단, 내부, 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 한 구현예에서, 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자는 GASIP의 N-말단 단부에 융합된다. 다른 구현예에서, 생물발광 공여체 또는 형광 수용체 분자는 GASIP의 C-말단 단부에 융합된다. 추가 구현예에서, 생물발광 공여체 분자는 GASIP에, 바람직하게는 GASIP의 C-말단 단부에 융합된다.
"Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는, Rap1 GTPase-활성화 단백질 1(Rap1GAP) 단백질의 도메인(UniProt 수탁 번호 P47736, 서열번호:47), 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 Rap1GAP의 N-말단 부분에 위치하며, 예를 들어 고유 Rap1GAP로부터 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기를 포함한다. Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 Gα 서브유닛 단백질에 대한 결합을 방해하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 Rap1GAP의 잔기 1 내지 420 또는 1 내지 436, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 잔기 1 내지 442, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 N-말단 단부에 융합된다.
다른 구현예에서, Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 키나제 활성화(예를 들어, 단백질 키나제 A)와 같은 다운스트림 신호전달 사건에 대한 그의 민감도를 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 키나제 활성화와 같은 다운스트림 신호전달 사건에 대한 민감도의 이러한 감소는 추정되는 인산화 부위 중 하나 이상의 돌연변이(들)(예를 들어, 결실, 치환)의 도입, 예를 들어 고유 Rap1GAP의 위치 431, 437, 439 및/또는 441에서 세린 잔기에 의해 달성될 수 있다. 추가 구현예에서, 위치 437, 439 및/또는 441에서 세린 잔기 중 하나 이상은 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인에서 돌연변이되며, 바람직하게는 위치 437, 439 및/또는 441에서 세린 잔기 중 적어도 2개는 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인에서 돌연변이되고, 보다 바람직하게는 위치 437, 439 및 441에서 모든 3개의 세린 잔기가 돌연변이된다. 추가 구현예에서, 돌연변이는 예를 들어 인산화될 수 없는 아미노산, 예를 들어 알라닌 잔기에 의한 치환이다. 한 구현예에서, 위치 437, 439 및 441에서 모든 3개의 세린 잔기는 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인에서 알라닌으로 치환된다. 한 구현예에서, Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인은 도 9a 및 도 9b에 도시된 서열 중 하나를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 RGS 단백질의 도메인, 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. RGS 단백질은 RGS-박스 또는 RGS 도메인을 포함하는 22개 단백질(RGS1-RGS22)의 패밀리(PROSITE 엔트리 PS50132)이다. RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 RGS 단백질로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, GASIP는 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 RZ/A 하위패밀리의 RGS 단백질, 바람직하게는 RGS17(RGSZ2, UniProt 수탁 번호 Q9UGC6, 서열번호:17), RGS19(GAIP, UniProt 수탁 번호 P49795, 서열번호:18) 또는 RGS20(RGSZ1, UniProt 수탁 번호 O76081, 서열번호:19)의 G 단백질-결합 도메인, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS17의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS17의 잔기 84-200 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS17의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS17의 잔기 64-210 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS19의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS19의 잔기 90-206 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS19의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS19의 잔기 70-217 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS20의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS20의 잔기 262-378 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS20의 G 단백질-결합 도메인은 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 고유 RGS20의 잔기 242-388 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 N-말단 단부에 융합된다.
본원에 기재된 시스템/방법에 사용될 수 있는 Gi 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 도메인을 포함하는 다른 단백질은 종양 괴사 인자-알파(TNFα)-유도 단백질 8(TNFAIP8, UniProtKB 수탁 번호 O95379, 서열번호: 48)이다.
"P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 P63RhoGEF(Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 25) 단백질의 도메인(UniProt 수탁 번호 Q86VW2, 서열번호:25), 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 P63RhoGEF의 C-말단 부분에 위치하며, 예를 들어 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P63RhoGEF로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기, 또는 그의 변이체를 포함한다. P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 Gα 서브유닛 단백질에 대한 결합을 방해하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P63RhoGEF의 잔기 348 내지 466, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P63RhoGEF의 잔기 295 내지 502, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 N-말단 단부에 융합된다.
"GRK2의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 GRK2(베타-아드레날린 수용체 키나제 1) 단백질의 도메인(UniProt 수탁 번호 P25098, 서열번호: 27), 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. GRK2의 G 단백질-결합 도메인은 GRK2의 N-말단 부분에 위치하며, 예를 들어 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 GRK2로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기, 또는 그의 변이체를 포함한다. GRK2의 G 단백질-결합 도메인은 Gα 서브유닛 단백질에 대한 결합을 방해하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, GRK2의 G 단백질-결합 도메인은 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 GRK2의 잔기 54 내지 175, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, GRK2의 G 단백질-결합 도메인은 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 GRK2의 잔기 30 내지 203, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, GRK2의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 C-말단 단부에 융합된다.
본원에 기재된 시스템/방법에 사용될 수 있는 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 도메인을 포함하는 다른 단백질은 GRK3(예를 들어, 잔기 ~54-175), PLCβ 단백질, RGS 단백질(예를 들어, RGS2, 잔기 ~83-199), TRP1 및 다른 RhoGEF 단백질(예를 들어, 삼중 기능성 도메인 단백질, TRIO)을 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 Gq 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 이들 도메인 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드가 본원에 기재된 시스템/방법에 사용될 수 있다.
"PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 PDZRhoGEF(Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 11) 단백질의 도메인(UniProt 수탁 번호 O15085, 서열번호:21), 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 PDZRhoGEF의 중앙 부분에 위치하며, 예를 들어 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 PDZRhoGEF로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기, 또는 그의 변이체를 포함한다. PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 Gα 서브유닛 단백질에 대한 결합을 방해하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 PDZRhoGEF의 잔기 306 내지 486, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 PDZRhoGEF의 잔기 281 내지 483, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 N-말단 단부에 융합된다.
"P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인"이라는 용어는 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 갖는 P115RhoGEF(Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1) 단백질의 도메인(UniProt 수탁 번호 Q92888, 서열번호:23), 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 P115RhoGEF의 N-말단 부분에 위치하며, 예를 들어 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P115RhoGEF로부터의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 잔기, 또는 그의 변이체를 포함한다. P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 Gα 서브유닛 단백질에 대한 결합을 방해하지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P115RhoGEF의 잔기 41 내지 232, 또는 그의 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 고유 P115RhoGEF의 잔기 1 내지 244, 또는 그의 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인은 생물발광 공여체 분자의 N-말단 단부에 융합된다.
본원에 기재된 시스템/방법에 사용될 수 있는 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 도메인을 포함하는 다른 단백질은 RhoGEF 예컨대 Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 12(LARG, UniProtKB 수탁 번호 Q9NZN5, 서열번호:49)(예를 들어, 잔기 ~367-558), JNK-상호작용 류신 지퍼 단백질(JLP, C-말단 부분) 카데린 단백질, AXIN1(UniProtKB 수탁 번호 O15169, 서열번호: 50, 잔기 ~88-212, G12에 대해 보다 선택적), PP2A(G12에 대해 보다 선택적), 알파-가용성 NSF 부착 단백질(알파SNAP, UniProtKB 수탁 번호 P54920, 서열번호: 51, N-말단 부분, G12에 대해 보다 선택적), 폴리시스틴-1(UniProtKB 수탁 번호 P98161, 서열번호: 52, G12에 대해 보다 선택적), RGS16(UniProtKB 수탁 번호 O15492, 서열번호: 53, N-말단 부분, G13에 대해 보다 선택적), AKAP110(UniProtKB 수탁 번호 O75969, 서열번호: 54, C-말단 부분, G13에 대해 보다 선택적), HS1-관련 단백질 X1(HAX1, UniProtKB 수탁 번호 O00165, 서열번호: 55, 잔기 ~176-247, G13에 대해 보다 선택적)을 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 G12/13 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 능력을 보유하는 이들 도메인 또는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 본원에 기재된 시스템/방법에 사용될 수 있다. 서브유닛 중 하나(G12 또는 G13)에 대해 보다 선택적인 도메인을 사용하는 것은 내인성 G12 또는 G13 단백질의 선택적 활성화를 평가하는데 유용할 수 있다.
Gs 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질(들)에 결합하는 도메인은 SNX13(RGS-PX1, UniProtKB 수탁 번호 Q9Y5W8, 서열번호: 56, 잔기 ~373-496), AXIN1(UniProtKB 수탁 번호 O15169, 서열번호: 50, 잔기 ~88-211) 또는 TPR1(테트라트리코펩티드 반복 도메인 1, UniProtKB 수탁 번호 Q99614, 서열번호: 57, C-말단 부분)을 포함한다. 한 구현예에서, Gs 패밀리의 Gα 서브유닛 단백질은 막-고정 XL(알파) 서브유닛이다.
한 구현예에서, GASIP의 길이는 약 50, 75 또는 100개 아미노산 내지 약 500, 600, 700 또는 800개 아미노산, 예를 들어 약 100 또는 150개 아미노산 내지 약 200, 250, 300, 350, 400 또는 500개 아미노산이다.
한 구현예에서, GASIP는 Rap1GAP, RGS 단백질(예를 들어, RGS17, 19 또는 20), P63RhoGEF, GRK2, PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 전장 서열을 포함하지 않으며, 즉, 전장 단백질에 대한 하나 이상의 돌연변이(치환, 결실 등)를 포함한다. 한 구현예에서, GASIP는 PM으로 동원 또는 고정에 수반되는 잔기 또는 도메인, 예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화 및/또는 프레닐화 신호 서열이 결여되어 있다. 이들 단백질의 절단된 및/또는 돌연변이된 버전을 사용하는 것은 유리하게는 다운스트림 신호전달 사건(예를 들어, 키나제 활성화)의 효과를 최소화하고/하거나 G 단백질 활성화시 GASIP의 상이한 구획으로의 적절한 국부화(시토졸) 및 전위를 보장할 수 있게 하며, 이는 검정의 신뢰도 및/또는 민감도를 개선시킨다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 시스템은 재조합 Gα 단백질 서브유닛을 추가로 포함한다. 본원에 정의된 바와 같은 Gα 단백질 서브유닛은 17개의 상이한 알려진 이소형, 그들의 스플라이스 변이체, 및 임의의 돌연변이된 Gα 단백질, 예를 들어 비-선택적/무차별 Gα를 초래하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 비제한적 구현예에서, 본원에 기재된 Gα 단백질은 임의의 천연 포유류 Gα 단백질 중에서 선택되며, 이는 Gq, Gs, Gi1, Gi2, Gi3, Gt-콘(cone), Gt-로드(rod), Gt-거스트(gust), Gz, GoA, GoB, Golf, G11, G12, G13, G14, 및 G15/G16(또한 GNA15로도 지정됨), 이들 이소형의 스플라이스 버전, 뿐만 아니라 그의 기능성 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, 재조합 Gα 단백질 서브유닛은 Gi 패밀리, 예를 들어, Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB, Gt-콘, Gt-로드, Ggus, 및/또는 Gz의 것이다. 한 구현예에서, Gα 단백질 서브유닛은 Gq 패밀리, 예를 들어, Gq, G11, G14 및/또는 G15/16)의 것이다. 한 구현예에서, Gα 단백질 서브유닛은 G12/13 패밀리의 것이다.
한 구현예에서, 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드는 GPCR에 의한 활성화를 감소시키거나 또는 방해하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이된 Gα 서브유닛 폴리펩티드는 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화를 평가하는데 유용할 수 있으며, 즉 G 단백질 활성화는 GPCR 개입을 통해 유도되지 않는다. 한 구현예에서, 돌연변이는 카르복시(C)-말단 도메인에 있으며, 바람직하게는 상기 Gα 서브유닛 폴리펩티드의 C-말단에서 적어도 7개 잔기 중 하나 이상에서 돌연변이가 있다. 한 구현예에서, 돌연변이는 C-말단에서 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 잔기의 절단이다. 다른 구현예에서, 돌연변이는 C-말단에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모든 잔기의 치환이다. 한 구현예에서, 돌연변이는 상기 C-말단 도메인에서 보존된 류신 잔기 중 적어도 1개의 결실 또는 치환, 바람직하게는 상기 C-말단 도메인에서 마지막 보존된 류신 잔기(고유 단백질의 끝에서 두번째 잔기)의 결실 또는 치환이다. 추가 구현예에서, 돌연변이는 마지막 보존된 류신 잔기의 치환, 바람직하게는 아스파르트산(D), 프롤린(P) 또는 아르기닌(R) 잔기의 치환이다. 한 구현예에서, 돌연변이된 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드는 Gi 패밀리, 예를 들어 Gi2 또는 GoB의 것이다. 추가 구현예에서, 돌연변이된 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드는 도 9b 및 9c에 도시된 서열 중 하나, 예를 들어, Gαi2 Δ5(서열번호: 28); Gαi2 Δ2(서열번호: 29); Gαi2 L-2G(서열번호: 31); Gαi2 L-2P(서열번호: 33); Gαi2 L-2R(서열번호: 34); Gαi2 L-2D(서열번호: 32); Gαi2 L-7G(서열번호: 30); GαoB Δ5(서열번호: 36); 또는 GαoB L-2G(서열번호: 35)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합"이라는 용어는 재조합 핵산 분자로부터 발현되는 단백질 분자, 즉 분자 생물학/유전 공학 기술의 도움으로 제조된 핵산, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산(예를 들어, 벡터에 존재)으로 세포(또는 그의 자손)의 형질감염/형질전환 후 발현되는 단백질(세포에 의해 천연적으로 발현되는 단백질과 대조적)을 지칭한다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 시스템은 세포 표면 수용체를 추가로 포함한다. 바이오센서의 세포는 세포 표면 수용체를 천연적으로 발현할 수 있거나, 또는 세포 표면 수용체가 재조합 세포 표면 수용체일 수 있다(예를 들어, 세포는 세포 표면 수용체를 암호화하는 핵산으로 형질감염 또는 형질전환된 바 있음). 본원에 사용된 바와 같은 "세포 표면 수용체"라는 용어는 형질 막에 부착되거나 또는 내장되고 리간드의 결합시 G 단백질 활성화를 유도하는 단백질을 지칭한다. G 단백질 활성화를 유도하는 세포 표면 수용체의 예는 G 단백질-결합 수용체(GPCR), 수용체 티로신 키나제(RTK), 인테그린을 포함한다. G 단백질 활성화는 전형적으로 리간드에 의한 GPCR 개입을 통해 발생하지만, G 단백질 활성화는 또한 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 예컨대 GIV(Gα-상호작용 소포-관련 단백질, 또한 Girdin으로도 알려짐), NUCB1(뉴클레오빈딘1, 또한 calnuc로도 알려짐), NUCB2 및 DAPLE(흩어진-회합 단백질)를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, GIV 활성은 RTK(예를 들어, EGFR) 및 Gi 활성의 인테그린 α-β 복합체 조절과 관련되어 있다. 한 구현예에서, GASIP는 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하고, 세포 표면 수용체는 GPCR 또는 RTK이다. 다른 구현예에서, GASIP는 RGS 단백질, 바람직하게는 RGS17의 G 단백질-결합 도메인을 포함하고, 세포 표면 수용체는 GPCR이다.
"GPCR"은 전장 고유 GPCR 분자 뿐만 아니라 돌연변이체 GPCR 분자를 지칭한다. GPCR의 목록은 Foord et al.(2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288에 제시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함되고, GPCR의 업데이트된 목록은 IUPHAR-DB 데이터베이스(Harmar AJ, et al. (2009) IUPHAR-DB: the IUPHAR database of G protein-coupled receptors and ion channels. Nucl. Acids Res.　37　(Database issue): D680-D685; Sharman JL, et al., (2013) IUPHAR-DB: updated database content and new features. Nucl. Acids Res.　41　(Database Issue): D1083-8)에서 이용가능하다.
"RTK"는 전장 고유 RTK 단백질 뿐만 아니라 돌연변이체 RTK 단백질을 지칭한다. RTK(IUBMB 효소 명명법에 따라 EC 2.7.10.1)는 많은 폴리펩티드 성장 인자, 시토카인, 및 호르몬에 대한 세포 표면 수용체이며, 이들 수용체의 키나제 활성을 담당하는 촉매 도메인을 포함하는 세포내 영역을 특징으로 하며, 이는 수용체 자가인산화 및 RTK 기질의 티로신 인산화를 촉매한다. 인간에서 58개의 알려진 RTK가 있으며, 20개의 하위패밀리로 분포되어 있다(Robinson et al., Oncogene 2000, 19(49):5548-57).
"인테그린"은 전장 고유 인테그린 단백질 뿐만 아니라 돌연변이체 인테그린 단백질을 지칭한다. 인테그린은 α 및 β로 불리는 2개의 비공유적으로 회합된 막관통 당단백질 서브유닛으로 구성된다. 다양한 인간　인테그린　이종이량체는 9개 유형의 β 서브유닛 및 24개 유형의 α 서브유닛으로부터 형성된다. 척추동물에서 발견되는 대표적인 인테그린은 α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7β1, αLβ2, αMβ2, αIIbβ3, αVβ1, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, 및 α6β4를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "변이체"(또는 "돌연변이체")라는 용어는 참조(예를 들어, 고유) 서열과 적어도 60%의 서열 동일성을 갖고 그의 원하는 활성, 예를 들어 Gα 서브유닛에 결합하거나 또는 BRET 공여체 또는 수용체로서 작용하는 능력을 보유하는 단백질/폴리펩티드를 지칭한다. 추가 구현예에서, 변이체는 참조(예를 들어, 고유) 서열과 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 유사성 또는 동일성을 갖고 그의 원하는 활성을 보유한다. "유사성" 및 "동일성"은 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 유사성/동일성을 지칭한다. 유사성 또는 동일성은 정렬된 서열에서 각각의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성 정도는 서열에 의해 공유되는 위치에서 일치하거나 또는 동일한 아미노산 수의 함수이다. 유사성 또는 동일성의 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 다양한 알고리즘, 예컨대 Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482의 국부 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444의 유사성 방법에 대한 탐구 및 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(예컨대 미국 위스콘신주 매디슨 소재 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)을 사용하여 수행될 수 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 또한 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10(공개된 디폴트 설정 사용)에 기재된 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트를 통해 이용가능할 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 성분(융합 분자)의 도메인은 적합한 링커 모이어티, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 링커 또는 다른 유형의 화학적 링커(예를 들어, 탄수화물 링커, 지질 링커, 지방산 링커, 폴리에테르 링커, PEG 등)를 통해 직접적으로(예를 들어 펩티드 결합을 통해) 또는 "간접적으로" 공유적으로 연결될 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 추가 도메인(들)은 상기 정의된 도메인 앞에(N-말단), 사이에 또는 뒤에(C-말단) 삽입될 수 있다. 한 구현예에서, 융합 분자의 도메인은 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 다른 구현예에서, 융합 분자의 성분 중 하나 이상은 펩티드 링커를 통해 연결된다. 일 구현예에서, 링커는 전형적으로 2 내지 30개 아미노산 길이, 예를 들어 약 5 내지 약 20-25개 아미노산 또는 약 10 내지 약 15-20개 아미노산 범위의 펩티드 링커이다. 링커 각각의 조성 및 길이는 원하는 다양한 특성 예컨대 유연성 및 수용해도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 글리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비교적 작은 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며; 작은 아미노산 잔기는 입체 벌크를 감소시키고 펩티드 링커의 유연성을 증가시킬 수 있다. 펩티드 링커는 또한 세린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 극성 아미노산을 포함할 수 있다. 극성 아미노산 잔기는 펩티드 링커의 수용해도를 증가시킬 수 있다. 또한, Globplot 2.3(Linding et al., GlobPlot: exploring protein sequences for globularity and disorder, Nucleic Acid Res 2003 - Vol. 31, No.13, 3701-8)과 같은 프로그램을 사용하여 무질서 및 구형성 정도, 따라서 또한 그의 유연성 정도를 결정하는 것을 도울 수 있다. 한 구현예에서, 펩티드 링커는 하기 실시예 및/또는 도면에 개시된 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함한다(서열번호:6, 7, 20, 22, 24 및 26).
한 구현예에서, 시스템은 본원에 정의된 다양한 성분, 즉 제1 및 제2 성분을 발현하는 세포, 및 임의적으로 재조합 Gα 단백질 서브유닛 및/또는 세포 표면 수용체를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 상기 정의된 제1 및/또는 제2 성분(들)을 암호화하는 핵산 또는 복수의 핵산을 제공한다. 한 구현예에서, 핵산(들)은 벡터/플라스미드(또는 복수의 벡터/플라스미드), 추가 구현예에서 발현 벡터(들)/플라스미드(들)에 존재한다. 이러한 벡터는 하나 이상의 전사 조절 서열(들), 예컨대 프로모터, 인핸서 및/또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 정의된 제1 및/또는 제2 성분(들)을 암호화하는 핵산(들)을 포함한다. 한 구현예에서, 핵산은 제1 및 제2 성분(폴리시스트론성 작제물)을 암호화한다.
"벡터"라는 용어는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 벡터의 한 유형은 에피솜, 즉, 염색체외 복제할 수 있는 핵산이다. 바람직한 벡터는 이들이 연결된 핵산의 자율적 복제 및/또는 발현을 할 수 있는 것들이다. 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어, Sambrook 등의 상기 문헌에서 발견된 표준 기술에 의해 구축될 수 있다. DNA의 단편을 결찰하기 위한 다양한 전략이 이용가능하며, DNA 단편의 말단의 성질에 따라 선택되고 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 벡터는 또한 박테리아 및 숙주 세포에서 벡터 전파 및 선택을 용이하게 하기 위해 다른 서열 요소를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위에 대한 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 예컨대 선택가능한 마커 및 리포터 유전자에 대한 코딩 서열은 당업자에게 널리 알려져 있다.
본원에 정의된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 재조합 발현 벡터는 세포(숙주 세포)로 도입될 수 있으며, 이는 정의된 재조합 발현 벡터로부터 단백질 코딩 영역을 발현할 수 있는 살아있는 세포를 포함할 수 있다. 살아있는 세포는 배양된 세포 및 살아있는 유기체 내의 세포 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. "세포", "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 특정한 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 세포로 도입될 수 있다. "형질전환" 및 "형질감염"이라는 용어는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션, 전기천공, 미세주입 및 바이러스-매개 형질감염을 포함하여, 외부 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위한 기술을 지칭한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기에 적합한 방법은 예를 들어 Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)), 및 다른 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다. "전사 조절 서열/요소"는 단백질 코딩 서열의 전사를 이들이 작동가능하게 연결된 것으로 유도 또는 제어하는 개시 및 종결 신호, 인핸서, 및 프로모터, 스프라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호와 같은 DNA 서열을 지칭하는 일반적인 용어이다. 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 필요한 경우 리딩 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역이 연결된다. 그러나, 예를 들어, 인핸서는 일반적으로 여러 킬로베이스에 의해 프로모터로부터 분리될 때 기능하고 인트론 서열은 가변 길이일 수 있으므로, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결될 수 있지만 인접하지 않다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 제1 성분을 암호화하는 제1 핵산 및 제2 성분을 암호화하는 제2 핵산, 또는 제1 및 제2 성분을 암호화하는 핵산을 포함하는 키트를 제공한다. 한 구현예에서, 키트는 Gα 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 세포 표면 수용체를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 정의된 제1 및/또는 제2 성분(들)을 포함하거나 또는 발현하는 세포를 제공한다. 한 구현예에서, 세포는 상기 정의된 제1 및/또는 제2 성분(들)을 암호화하는 핵산으로 형질감염 또는 형질전환된 바 있다. 한 구현예에서, 세포는 재조합 Gα 단백질 서브유닛을 추가로 포함하거나 또는 발현한다. 한 구현예에서, 세포는 재조합 세포 표면 수용체, 예를 들어, GPCR, RTK 또는 인테그린을 추가로 포함하거나 또는 발현한다.
본 개시내용는 예를 들어 당업계에 널리 알려진 배양 배지 및 시약을 사용하여, 본 발명의 제1 및/또는 제2 성분(들)의 발현을 위한, 상기 기재된 것들과 같은 재조합 발현 시스템, 벡터 및 세포를 추가로 제공한다. 세포는 상기 정의된 제1 및 제2 성분(들)을 발현할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포 및 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 정의된 성분(들)을 발현할 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포와 같은 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다(예를 들어, 마우스 래트 및 햄스터 세포주와 같은 설치류 세포, 인간 세포/세포주). 다른 구현예에서, 상기 언급된 세포는 인간 세포주, 예를 들어 배아 신장 세포주(예를 들어, HEK293 또는 HEK293T 세포)이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 제제가 관심 G 단백질의 활성화를 조절하는지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하며:
본원에 정의된 시스템을 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계;
상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템에서 BRET 신호를 측정하는 단계;
여기서 상기 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 상기 관심 G 단백질의 활성화를 조절함을 나타낸다.
한 구현예에서, 제제는 작용제이고 상기 BRET 신호의 차이는 증가이다.
한 구현예에서, 관심 G 단백질은 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 것이며, 여기서 GASIP는 본원에 정의된 바와 같은 Rap1GAP 또는 RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 언급된 방법에 사용된 시스템은 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드, 즉 재조합 Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB, 또는 Gz 서브유닛 폴리펩티드를 포함한다. 주어진 시험 제제의 프로파일 또는 특징을 확인하기 위해(즉 시험 제제에 의해 활성화된 특이적 Gi 단백질 서브유닛(들)을 확인하기 위해), 상기 언급된 방법은 복수의(즉 2개 이상의) 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 각각의 시스템은 상이한 Gi 단백질 서브유닛을 포함하는데, 예를 들어, 제1 시스템은 재조합 Gi1을 포함하고, 제2 시스템은 재조합 Gi2를 포함하고, 제3 시스템은 재조합 Gi3을 포함한다.
다른 구현예에서, 관심 G 단백질은 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 것이며, 여기서 GASIP는 본원에 정의된 바와 같은 P63RhoGEF 또는 GRK2의 G 단백질-결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 언급된 방법에 사용된 시스템은 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드, 즉 재조합 Gq, G11, G14 또는 G15 서브유닛 폴리펩티드를 포함한다. 주어진 시험 제제의 프로파일 또는 특징을 확인하기 위해(즉 시험 제제에 의해 활성화된 특이적 Gq 단백질 서브유닛(들)을 확인하기 위해), 상기 언급된 방법은 복수의(즉 2개 이상의) 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 각각의 시스템은 상이한 Gq 단백질 서브유닛을 포함하는데, 예를 들어, 제1 시스템은 재조합 Gq를 포함하고, 제2 시스템은 재조합 G11을 포함하고, 제3 시스템은 재조합 G14를 포함한다.
다른 구현예에서, 관심 G 단백질은 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 것이며, 여기서 GASIP는 본원에 정의된 바와 같은 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 언급된 방법에 사용된 시스템은 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드, 즉 재조합 Gq, G12 또는 G13 서브유닛 폴리펩티드를 포함한다. 주어진 시험 제제의 프로파일 또는 특징을 확인하기 위해(즉 시험 제제에 의해 활성화된 특이적 G12/13 단백질 서브유닛(들)을 확인하기 위해), 상기 언급된 방법은 복수의(즉 2개 이상의) 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 각각의 시스템은 상이한 G12/13 단백질 서브유닛을 포함하는데, 예를 들어, 제1 시스템은 재조합 G12를 포함하고 제2 시스템은 재조합 G13을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 제제가 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화를 조절하는지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하며:
본원에 정의된 시스템을 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계;
상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템의 BRET 신호를 측정하는 단계로서, 여기서 상기 시스템은 GPCR에 의한 활성화를 감소 또는 방해하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 것인, 단계;
여기서 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 비-수용체 GEF-매개 G 단백질 활성화를 조절함을 나타낸다.
한 구현예에서, 제제는 작용제이고 상기 BRET 신호의 차이는 증가(또는 더 높은 BRET 신호)이다.
다른 구현예에서, 제제는 길항제이고 상기 BRET 신호의 차이는 감소(또는 더 낮은 BRET 신호)이다. 한 구현예에서, 제제가 길항제인지 여부를 확인하기 위해, 시스템을 알려진 작용제와 접촉시키고, 제제의 존재 하에 알려진 작용제에 의해 유도된 BRET 신호의 감소는 제제가 길항제임을 나타낸다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 제제가 GPCR-매개 G단백질 활성화 또는 RTK/GEF-매개 G단백질 활성화를 유도하는지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하며:
GASIP가 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인, 바람직하게는 다운스트림 신호전달 사건(예를 들어, 키나제 활성화)에 대한 그의 민감도를 감소시키는 돌연변이를 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 위치 437, 439 및/또는 441에서 세린 잔기 중 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, Rap1GAP(SSS-AAA))를 포함하는 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인를 포함하는 제1 바이오센서를 사용하여 제제의 존재 하에 BRET 신호를 측정하는 단계;
GASIP가 상기 정의된 바와 같은 RGS 단백질, 바람직하게는 RGS17의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는 제2 바이오센서를 사용하여 제제의 존재 하에 BRET 신호를 측정하는 단계;
여기서 제2 바이오센서에서 제제의 존재 하에 BRET 신호의 증가없이 제1 바이오센서에서 제제의 존재 하에 BRET 신호의 증가(예를 들어, 용량-의존적 증가)는 제제가 RTK/GEF-매개 G단백질 활성화를 유도함을 나타내고; 여기서 제1 및 제2 바이오센서에서 제제의 존재 하에 BRET 신호의 증가(예를 들어, 용량-의존적 증가)는 제제가 GPCR-매개 G단백질 활성화를 유도함을 나타낸다.
"화합물", "제제(agent)", "시험 화합물" 또는 "시험 제제"라는 용어는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 임의의 수의 공급원으로부터 수득될 수 있는 본원에 기재된 시스템/검정에 의해 스크리닝될 수 있는 임의의 분자(예를 들어, 약물 후보물질)를 지칭한다. 예를 들어, 무작위화 올리고뉴클레오티드의 발현을 포함한 많은 수단이 매우 다양한 유기 화합물 생체분자의 무작위 및 직접 합성에 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용가능하거나 용이하게 생산된다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물이 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형된다.
한 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 "증가된 신호" 또는 "더 높은 신호"는 시험 제제의 부재 하에 측정된 참조 신호에 비해 적어도 10, 20, 30, 40, 45 또는 50% 더 높은 신호를 지칭한다. 다른 구현예에서, "더 높은 신호"는 시험 제제의 부재에 비해 존재 하에 측정된 신호에서 통계적으로 유의한 차이(적합한 통계 분석을 사용하여 결정됨)를 나타냄으로써, 예를 들어 복수의 샘플에서 수득된 결과를 조합합으로써 결정된다. 상이한 데이트 세트 사이의 유의한 차이를 결정하기 위한 통계 분석(ANOVA, 스튜던트 t-검정, 카이 제곱 등)은 당업계에 알려져 있으며, 이러한 분석은 적합한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
양성 대조군 및 음성 대조군이 본원에 기재된 방법/검정에 사용될 수 있다. 대조군 및 시험 샘플은 통계적으로 유의한 결과를 수득하기 위해 다수회 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 언급된 방법은 고처리량 방법(고처리량 스크리닝, HTS)이다. 본원에 사용된 바와 같은 "고처리량 스크리닝"(HTS)이라는 용어는 표적 분자에 대한 결합 활성 또는 생물학적 활성에 대해 다수의 화합물(수백개, 수천개)을 신속하게 및 동시에 스크리닝하도록 하는 방법을 지칭한다. 이러한 HTS 방법은 전형적으로 여러 웰, 예를 들어 384, 1536, 또는 3456 웰을 갖는 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. HTS의 경우, 판독 신호가 높은 민감도, 정확도 및 재현성으로 검출되는 것이 중요하다. 방법이 HTS에 적합한지 또는 양립할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 한 가지 방식은 하기 실시예에 기재된 바와 같이, Z-인자를 측정하는 것이다. 이상적으로, Z-인자는 적어도 0.5(즉 0.5 내지 1), 및 바람직하게는 적어도 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75 또는 0.8이어야 한다.
BRET 신호를 측정하는 방법 및 장치는 당업계에 널리 알려져 있다. BRET 신호는, 예를 들어, BRET 수용체 신호의 강도(광 강도)를 결정함으로써, 및/또는 BRET 공여체에 의해 방출된 신호 또는 광 강도에 비해 BRET 수용체에 의해 방출된 신호 또는 광 강도의 비(BRET 비)를 계산함으로써 측정될 수 있다. BRET 신호는 BRET 공여체 및/또는 BRET 수용체 광 방출을 검출하기 위해 적합한 필터 세트를 갖는 마이크로플레이트 판독기 또는 현미경을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 기재된 시스템 및 방법은 G 단백질 활성화를 조절하는데 있어서 활성이고(GPCR 또는 G 단백질을 통한 다른 수용체 신호전달을 통해) 따라서 잠재적인 약물 후보물질인 화합물을 확인하기 위해 또는 G 단백질 신호전달이 수반되는, 예를 들어, G 단백질 억제 또는 자극이 유익할 수 있는 질환을 치료하는데 사용하기 위해 HTS에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 시스템 및 방법은 또한 리간드 프로파일링을 수행하기 위해, 예를 들어, GPCR 또는 G 단백질을 통한 다른 수용체 신호전달의 리간드에 의해 조절된 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 시스템 및 방법은 약물 개발을 위한 잠재적인 후보물질을 확인하기 위해 화합물 라이브러리의 스크리닝에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 시스템이 화합물과 접촉될 때 BRET 신호 비의 변화는 약물 또는 약제학적으로 활성인 화합물을 확인할 수 있고 세포 경로에 대한 그들의 효과를 확인할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 또한 약물 후보물질의 투여량 의존성을 결정하는데 사용될 수 있다.
전기기계식 플레이트 판독기는 신호 비 변화를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 플레이트 판독기는 본 발명의 시스템을 사용하여 HTS, 약물 후보물질 스크리닝, 및 약물 투여량 의존성 연구에 이용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 플레이트 판독기의 예는 PerkinElmer Fusion™ Universal Microplate Analyzer 장치를 포함하여 PerkinElmer(마이애미주 보스톤 소재)에 의해 제공되는 Fusion™ 패밀리의 플레이트 판독기를 포함한다. PerkinElmer EnVision™ HTS 모델이 또한 본원에 기재된 방법을 실시하는데 이용될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 방식(들)
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 보다 상세하게 예시된다.
실시예 1: 물질 및 방법
물질. 안지오텐신 II(AngII; [Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe], 서열번호: 58), 포르콜린, 도파민 및 폴리-오르니틴은 Sigma-Aldrich으로부터 입수하였다. u46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP, SQ 29558은 Cayman Chemical®(미시간주 앤아버)로부터 입수하였다. 인간 EGF는 Cedarlane 실험실로부터 입수하였다. 칼리딘([Lys0]-브래디키닌)은 Eurogentec으로부터 입수하였다. WAY-100635, A 412997, L 741742, SNC-80 및 AR-M100390은 Tocris Bioscience(Bio-Techne)로부터 입수하였다. 혈소판 활성화 인자(PAF-C16)는 Enzo Life Sciences, Inc.로부터 입수하였다. 연어 정자 DNA, 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 소 태아 혈청, 송아지 혈청, OPTI-MEM®, 및 다른 세포 배양 시약은 Life technologies(Thermo Fisher Scientific) 및 Wisent Inc.로부터 구입하였다. 폴리에틸렌이민(PEI) 25 kDa 선형은 Polysciences Inc.로부터 입수하였다. Prolume Purple I은 Nanolight® Technology로부터 구입하였다. 퓨전 DNA 폴리머라제는 Thermo Fisher Scientific으로부터 입수하였다. 제한 효소, T4 DNA 리가제 및 Gibson 어셈블리 믹스는 New England Biolabs Ltd.로부터 수득하였다. 백색 96-웰 폴리스티렌 세포 배양 마이크로플레이트, 고형 바닥(CellStar 655 083)은 Greiner로부터 입수하였다.
플라스미드 및 구축(constructions) 형질 막 마커 rGPF-CAAX 및 초기 엔도솜 마커 rGFP-FYVE 작제물(construct)은 이미 기재되었다(Namkung Y. et al. 2016; Nat Commun. 7:12178). TPα 수용체 작제물을 암호화하는 플라스미드, 모든 Gα 서브유닛, Gβ1 서브유닛 및 Gγ1 서브유닛은 cdna.org로부터 입수한다. 신호 펩티드: MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS(서열번호: 59)를 갖는 인간 수용체 D4R, At1AR 및 Mu 오피오이드 수용체(hMOR1)의 코딩 서열(cds)을 서열-최적화하고, GeneART(Thermo Fisher Scientific)에서 합성하고, Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)으로부터의 pCDNA3.1(+)에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하였으며; hMOR1을 pLVX IRES puro(Clontech, 캘리포니아주 소재)에 서브클로닝하였다. 인간 EGFR을 암호화하는 작제물은 Yosef Yarden 박사(Tzahar E. et al. 1996; Molecular and Cellular Biology 16(10): 5276-5287)에 의해 제공되었다. 브래디키닌 B2 수용체(BKB2R) cds 및 RAPGAP(1-442)-Rluc8 작제물(도 9a 및 9b 참조)을 서열-최적화하고, 합성하고, Topgenetech에서 pCDNA3.1(+)에서 서브클로닝하였으며; 펩티드 링커 GSGGGSGGGA(서열번호: 6)는 RapGAP(1-442)와 Rluc8 사이에 존재한다(도 2a 참조). RapGAP(1-442), Rap1GAP ΔCT(1-420), Rap1GAP ΔSSS(1-436), Rap1GAP SSS-AAA(1-442;S437A/S439A/S441A), Rap1GAP SSS-TTT(1-442;S437T/S439T/S441T), Rap1GAP SS-AA(1-442;S437A/S441A), Rap1GAP SS-DA(1-442;S437A/S441A), Rap1GAP SS-AD(1-442;S437A/S441D), Rap1GAP SS-DD(1-442;S437A/S441A)의 RlucII 태그된 버전을 암호화하는 작제물을 pCDNA3.1(+) RapGAP(1-442)-Rluc8로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 Rap1GAP의 상이한 변이체의 코딩 서열로 대체하였다(도 2a, 9a 및 9b 참조). 펩티드 링커: GSAGTGGRAIDIKLPAT(서열번호: 7)는 RAPGAP와 RlucII 사이에 존재한다(도 2a 참조). RlucII로 태그된 인간 RGS17의 RGS 결합 도메인(잔기: 64-210)을 암호화하는 작제물을 pCDNA 3.1 HA-RGS17(cDNA.org로부터 입수)로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 RGS의 cds(RGS17 64-210)로 대체하였다(도 3a 및 9d 참조). RlucII로 태그된 인간 RGS19의 RGS 결합 도메인(잔기: 70-217)을 암호화하는 작제물을 pCDNA 3.1 HA-RGS19(cDNA.org로부터 입수)로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 RGS19의 코딩 서열(70-217)로 대체하였다(도 3a 및 9d 참조). RlucII로 태그된 인간 RGS20 var1의 RGS 결합 도메인(잔기: 242-388)을 암호화하는 작제물을 pCDNA 3.1 HA-RGS20 var1(cDNA.org로부터 입수)로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 RGS의 코딩 서열(RGS20 242-388)로 대체하였다(도 3a 및 9d 참조). 펩티드 링커: GSAGTGGRAIDIKLASAT(서열번호: 20)는 Rap1GAP와 RlucII 사이에 존재한다(도 3a 참조). RlucII로 태그된 인간 PDZRhoGEF(잔기: 281-483) 및 P115RhoGEF(잔기: 1-244)의 G12/13 결합 도메인을 암호화하는 작제물을 IMAGE 클론(OpenBiosystems)으로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 대체하였다(도 4a, 5a 및 9d 참조). 펩티드 링커: GILREALKLPAT(서열번호: 22) 및 RLKLPAT(서열번호: 24)는 각각 PDZRhoGEF 및 P115RhoGEF의 RlucII와 G12/13 결합 도메인 사이에 존재한다(도 4a 및 5a 참조). RlucII로 태그된 인간 P63RhoGEF의 Gq 결합 도메인(잔기: 295-502)을 암호화하는 작제물을 IMAGE 클론(OpenBiosystems)으로부터 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 대체하였다(도 6a 및 9b 참조). 펩티드 링커: ASGSAGTGGRAIDIKLPAT(서열번호: 26)는 Gq 결합 도메인과 RlucII 사이에 존재한다(도 6a 참조). RlucII로 태그된 인간 GRK2의 RGS 도메인(잔기: 30-203)을 암호화하는 작제물을 pcDNA3.1Z-GRK2-GFP10으로부터 PCR 증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Hygro(+) GFP10-RlucII 및 pCDNA3.1(+) RlucII-GFP10st2에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하여, GFP10을 대체하고 각각 RGS(GRK2)-RlucII 및 RlucII-RGS(GRK2)를 생성하였다(도 7a 및 9b 참조). 펩티드 링커: GSAGTGGRAIDIKLASAT(서열번호: 20)는 2개의 작제물에서 RGS(GRK2) 도메인과 RlucII 사이에 존재한다(도 7a 참조). Gαi2 및 GαoB 돌연변이체를 암호화하는 작제물: Gαi2 Δ5(=1-350), Gαi2 Δ2(=1-353), Gαi2 L-7G(=L354G), Gαi2 L-2G(=L354G), Gαi2 L-2D(=L354D), Gαi2 L-2P(=L354P), Gαi2 L-2R(=L354R), GαoB L-2G(=L353G), GαoB Δ5(=1-349)을 pCDNA3.1(+) GNAi2 및 pCDNA3.1(+) GNAoB(cdna.org로부터 입수)로부터 PCR-증폭으로 생성하고, pCDNA3.1 Zeo(+)에서 Gibson 어셈블리로 서브클로닝하였다.
세포 배양 및 일시적 형질감염. 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 5% CO2가 있는 가습 대기에서 37℃에서 10% 소 태아 혈청, 100 유닛/ml 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지하였다. HEK293SL 세포를 5% 소 태아 혈청 및 20 μg/ml 젠타마이신으로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 5% CO2 및 90% 습도에서 37℃에서 성장시켰다.
폴리(에틸렌이민)(PEI)을 사용한 형질감염: 실험 2일 전에, HEK293 세포를 칼슘 또는 마그네슘 무함유 PBS로 세척하고, 형질감염제로서 PEI를 사용하여 지시된 플라스미드로 형질감염시켰다(3 대 1의 비, PEI/DNA). 이어서 세포를 웰당 35 000개 세포의 밀도로 폴리-L-오르니틴 히드로브로마이드로 전처리되거나 또는 전처리되지 않은 96-웰 플레이트에 직접적으로 시딩하였다. Spark 10M 판독기에서 판독한 모든 실험을 처리되지 않은 플레이트를 사용하여 수행하였다.
BRET 측정. 형질감염 48-시간 후, 세포를 예열된 타이로드 완충액(140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM CaCl2, 12 mM NaHCO3, 5.6 mM D-글루코스, 0.5 mM MgCl2, 0.37 mM NaH2PO4, 25 mM HEPES, pH 7.4)으로 2회 세척한 후 지시된 바와 같이 실온(RT) 또는 37℃에서 다양한 농도의 리간드로 자극하였다. 세포-투과성 기질, 코엘렌테라진 Purple I을 적어도 6 분(37℃에서) 내지 10분(RT에서) 동안 타이로드 완충액에서 1 μM의 최종 농도로 첨가한 후 BRET 측정하였다. 측정은 Spark 10M 판독기(Tecan Life Sciences; 공여체: 360nm/380nm & 수용체: 505nm/570nm), LB 941 멀티모드 플레이트 판독기(Berthold Technologies; 공여체: 400/470-nm 및 수용체: 515/520-nm 필터) 또는 Synergy Neo(Biotek: (공여체: 400/480 nm, 수용체: 515/530 nm)에서 수행하였다. RlucII(공여체)에 의해 방출된 광 강도에 비해 rGFP(수용체)에 의해 방출된 광 강도의 비를 계산함으로써 BRET 신호를 결정하였다. 모든 BRET 측정을 Tristar 판독기에서 37℃에서(도 1-2m & 도 2r-7f), Spark 10M 판독기에서 RT에서(도 2n-2q & 도 8b-8s) 또는 Synergy Neo에서 RT에서(도 8t-8x) 수행하였다.
Z'-인자 결정. Z'-인자 값은 Zhang 등(J Biomol Screen.　1999;4(2):67-73)에 의해 기재된 바와 같이 계산하였다. 0.4 초과의 Z'-인자는 강력한 검정으로 고려된다.
데이터 분석. GraphPad® Prism 곡선 맞춤 프로그램을 사용하여 EC50 값의 추정치를 계산하였다. 최적 맞춤을 나타내는 곡선이 이 연구 전반에 걸쳐 제시되며, 또한 이 GraphPad® Prism 그램을 사용하여 생성하였다.
실시예 2: G 단백질 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정의 생성 및 특이성(generation and specificity)
도 1a 내지 1e는 G 단백질 이펙터로부터 Gα 서브유닛 상호작용 폴리펩티드(GASIP)의 전위에 기초하여, G 단백질 패밀리-선택적 방식으로, 및 상이한 세포 구획에서 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정의 생성 및 특이성을 도시한다. 도 1a는 i) GPCR-매개 직접 G 단백질 활성화, 및 ii) 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G단백질 활성화를 모니터링하기 위한 이펙터-기반 센서의 원리를 도시한다. 수용체, rGFP로 태그된 세포하 국부화 도메인(예를 들어 형질 막(PM) 또는 초기 엔도솜(EE)의 경우), BRET 공여체(예를 들어, RlucII)로 태그된 특이적 이펙터의 Gα-상호작용 도메인을 발현하는 세포를 작용제에 노출시켜 공동-발현된 G 단백질을 활성화시킨다. i)에서, 작용제-유도 GPCR 자극은 G 단백질을 직접적으로 활성화시켜, 세포질에서 rGFP-표지된 막으로 태그된-이펙터를 동원한다. ii)에서, G 단백질 활성화는 RTK(예를 들어, EGFR) 또는 인테그린 α-β 복합체의 활성화 후 GEF 예컨대 GIV/Girdin의 동원으로부터 매개된다. G 단백질 서브유닛은 그들의 활성화를 모니터링하기 위해 변형될 필요가 없으며, 특이성은 Gα 단백질 서브유닛을 연구된 수용체와 공동 발현하고 G 단백질의 각각의 패밀리에 특이적인 GASIP 예컨대 Gi 패밀리(Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB, Gz)의 경우 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인(도 1b), Gq 패밀리(Gq, G11, G14 & G15)의 경우 P63RhoGEF(P63RG)의 G 단백질-결합 도메인(도 1c) 및 G12/13 패밀리의 경우 PDZRhoGEF(PDZRG)의 G 단백질-결합 도메인(도 1d 및 1e)을 사용함으로써 달성된다. Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 사용한 경우 Gi 패밀리의 구성원만이 모의 조건보다 더 큰 반응을 나타내었고(내인성으로 발현된 Gi1, i2 & i3 단백질의 활성화)(도 1b), PDZRG를 사용한 경우 G12/13 패밀리의 구성원만이 모의 조건보다 더 큰 반응을 나타내었고(내인성으로 발현된 G12 및 G13 단백질의 활성화)(도 1c), P63RG를 사용한 경우 Gq 패밀리의 구성원만이 모의 조건보다 더 큰 반응을 나타내었으며(내인성으로 발현된 Gq 및 G11 단백질의 활성화)(도 1d 및 1e), 따라서 검정의 특이성을 확인하였다.
실시예 3: Gi 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정
도 2a 내지 2z는 Gi 패밀리(Gi1, i2, i3, oA, oB, z)의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 Rap1GAP-기반 BRET 센서의 최적화 및 사용을 도시한다. 시험된 다양한 작제물은 도 2a에 도시되어 있다. 도 2b 내지 2e에 제시된 결과는 검출가능한 BRET 신호가 시험된 2개의 BRET 공여체(Rluc8 및 RlucII)를 사용하여 수득되었으며, RlucII가 전형적으로 Rluc8에 비해 보다 우수한 동적 창을 제공함을 나타낸다. 도 2f 및 2g에 제시된 결과는 세포가 포스콜린(이는 cAMP 생산 증가 및 단백질 키나제 A의 활성화를 촉진시켜 상이한 단백질의 인산화를 초래함)으로 전처리된 경우 측정된 더 낮은 반응에 의해 입증되는 바와 같이 Rap1GAP(1-442) 작제물이 인산화에 민감하여, 검정에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다. C-말단 절단된 변이체(1-420 및 1-436), 및 Ser을 Ala으로 및 Ser을 Asp으로 치환의 조합을 포함하는 상이한 돌연변이체를 제조하고 추정되는 인산화 부위(잔기 Ser 437, 439 및 441)에서 생성 및 시험하였다. RAP1GAP의 C-말단 절단된 변이체(ΔCT)는 포스콜린의 영향에 민감하지 않았지만, 이 더 짧은 단편(Rap1GAP 1-420)의 창은 Rap1GAP(1-442)의 것보다 유의하게 더 낮다(도 2h). 시험된 다른 돌연변이체 중에서, 포스콜린에 의해 여전히 영향을 받은 유일한 돌연변이체는 Rap1GAP(SS-AD), Rap1GAP(SSS-TTT) 및 Rap1GAP(SS-AA)였으며, 후자는 Rap1GAP(1-442)-RlucII와 필적할만한 동적 창을 나타냈다(도 2j-2q). Rap1GAP(SSS-AAA)를 하기 기재된 다른 실험을 위해 사용하였다.
도파민-촉진된 자극시 도파민 D4 수용체(D4R)의 G 단백질 프로파일을 형질 막으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII 전위로 수득하였으며, 각각의 G 단백질(Gi1, Gi2, Gi3, GoA & GoB)은 명확한 약제학적 특징을 갖는 용량-반응 곡선을 나타내었다(도 2r). Gz 활성화를 사용하여 5개 도파민 수용체에 대한 여러 도파민 수용체 리간드(A412 997, 도파민, L741 742 및 Way-100635)를 프로파일링하였고, 그 결과는 도 2s 내지 2w에 도시되어 있다. 도파민은 모든 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났으며(EC50: D1R = 380 nM, D2R = 2.6 nM, D3R = 0.50 nM, D4R = 0.11 nM, D5R = 51 nM), 알려진 D4R 길항제 L741,742는 임의의 도파민 수용체에 대해 작용제 또는 역 특성을 나타내지 않았다. WAY-100635는 단지 D4R(EC50 = 0.83)에 대한 작용제 특성을 나타낸 반면, A412,997은 D3R(EC50 = 281 nM) 및 D4R(EC50 = 0.04 nM) 둘 다를 활성화시켰지만, D1R, D2R 또는 D5R는 활성화시키지 않았다. 도 2x-2z에 도시된 결과는 검정이 강력하고 고처리량 스크리닝(HTS)과 양립할 수 있으며, Z' 인자가 각각 Gi2, GoA 및 Gz 활성화에 대해 0.812, 0.703 및 0.607로 평가되었음을 나타낸다.
도 3a-3d는 RGS17, 19 및 20과 같은 G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질의 구성원의 RGS 도메인이 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위해 Rap1GAP에 대한 대안으로 사용될 수 있음을 나타낸다. RGS17(잔기 64-210), RGS19(잔기 70-217) 및 RGS20(잔기 242-388) 단백질의 RGS 도메인에 기초한 RlucII-태그된 작제물은 도 3a에 제시되어 있다. 이들 단백질의 Gα-결합 RGS 도메인만을 사용하는 것은 유리하게는 G 단백질 활성화시 상이한 구획으로 시토졸 국부화 및 전위를 허용하며, 전장 단백질에 존재하는 다른 도메인 또는 이들 단백질의 N-말단 부분에 존재하는 팔미토일화 부위에는 영향을 미치지 않는다. RGS(RGS17)-RlucII(도 3b), RGS(RGS19)-RlucII(도 3c) 및 RGS(RGS20)-RlucII(도 3d)로 수득된 용량-반응 곡선은 PM에서 Gi1, Gi2, Gi3, GoA, GoB 및 Gz 활성화의 D4R/도파민-매개 활성화에 대해 제시된다. 3개의 RGS 작제물에 대해 유사한 결과(커플링 및 EC50)를 수득하였으며, 이들 RGS-기반 작제물이 Gi 및 Go 활성화를 모니터링하는데 사용될 수 있음을 확인하였다. 결과는, Gz의 공동발현이 모의 조건과 구별가능한 신호를 초래하지 않았고, Gi3에 대한 동적 창이 Rap1GAP-기반 작제물에 비해 RGS-기반 작제물을 사용하여 더 작았다는 것을 제외하고는, Rap1GAP-기반 작제물을 사용하여 수득된 것들과 유사하였다.
실시예 4: G12/13 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정.
G12/13 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 PDZRhoGEF-기반 BRET 시스템의 최적화 및 사용은 도 4a-g에 기재되어 있다. G12/13 결합 도메인(잔기 281-483, PDZRG) 을 포함하는 PDZRhoGEF의 단편을 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그하였다(도 4a). G12 및 13의 활성화를 측정하기 위한 동적 창은 Gα 서브유닛의 발현 수준에 직접적으로 따르는 것으로 나타났지만, 발현 수준은 상이한 양의 G12 및 13으로 수득된 필적할만한 LogEC50에 의해 입증된 바와 같이 G12 및 13의 I-BOP/TPαR-매개 활성화에 대한 효능에 영향을 미치지 않았다(도 4b 및 4c). PDZRG-RlucII를 사용하여 PM에서 G12 및 G13 활성화에 대한 TPαR 리간드를 프로파일링하였다. 세포를 하나의 부분 작용제(U51605) 및 길항제 I-SAP 및 SQ 29,558과 함께 알려진 완전 작용제(U46619, I-BOP, CTA2)로 자극하였다. 도 4d 및 4e에 도시된 결과는 SQ 29,558이 TPαR 작용제로서 작용하지 않음을 나타낸다. 그들의 알려진 활성/특성과 일치하게, U46619, I-BOP 및 CTA2는 G12 및 13 활성화에 대한 완전 작용제이며, 이는 G12/13 활성화를 모니터링하기 위한 검정의 타당성을 검증한다. 흥미롭게도, U51605 및 I-SAP는 편향된 리간드로서 작용하는 것으로 제시되었다. U51605는 G12(Max의 40%) 활성화에 대한 부분 작용제, 및 G13(Max의 93%)에 대한 거의 완전 작용제인 것으로 입증되었다. 대조적으로, I-SAP 자극은 검정에서 유의한 G12 활성화를 유도하지 못하지만(도 4d), 부분 작용제 활성(Max의 53%)은 G13에서 검출되었다(도 4e). 최종적으로, G12 활성화에 대해 0.645 및 G13 활성화에 대해 0.812로 평가된 Z' 인자를 수득하였으며(도 4f 및 4g), 이는 검정이 강력하고 G12/G13 조절에 기초한 고처리량 스크리닝 적용과 양립할 수 있음을 다시 나타낸다.
G12/13 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 P115RhoGEF-기반 BRET 시스템의 최적화 및 사용은 도 5a-e에 기재되어 있다. G12/13 결합 도메인(잔기 1-244, P115RG)을 포함하는 P115RhoGEF의 단편을 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그하였다(도 5a). P115RG-RlucII를 사용하여 PM에서 G12 및 G13 활성화에 대한 TPαR 리간드를 프로파일링하였다. 세포를 U46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP 및 SQ 29,558로 자극하였다. 도 5b 및 5c에 도시된 결과는 PDZRG-RlucII로 수득된 것들과 일치하며, SQ 29,558이 TPαR 작용제로서 작용하지 않으며, U46619, I-BOP 및 CTA2가 G12 및 13 활성화에 대한 완전 작용제이며, U51605 및 I-SAP가 편향된 리간드로서 작용하는 것으로 제시되었음을 나타낸다. U51605는 G12(Max의 14%) 및 G13(Max의 60%) 활성화에 대한 부분 작용제인 것으로 입증된 반면, I-SAP 자극은 G13(Max의 19%)에 대해 부분 작용제이고 G12 활성화에 대해 중성이었다. 최종적으로, G12 활성화에 대해 0.703 및 G13 활성화에 대해 0.743으로 평가된 Z' 인자를 수득하였으며(도 5d 및 5e), 이는 검정이 강력하고 G12/G13 조절에 기초한 고처리량 스크리닝 적용과 양립할 수 있음을 다시 나타낸다.
실시예 5: Gq 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정.
Gq 패밀리(Gq, G11, G14 및 G15)의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 P63RhoGEF-기반 BRET 시스템의 최적화 및 사용은 도 6a-s에 기재되어 있다. Gq 결합 도메인(잔기 295-502, P63RG)을 포함하는 P63RhoGEF의 단편을 C-말단에서 BRET 공여체 RlucII로 태그하였다(도 6a). 전장 P63RhoGEF 단백질은 그의 N-말단에 의해 PM과 회합된다. PDZRG-RlucII 및 P115RG-RlucII와 같이, P63RhoGEF의 G 단백질 결합 도메인만을 포함하는 단편을 사용하는 것은 유리하게는 G 단백질 활성화시 상이한 구획으로 시토졸 국부화 및 전위를 허용한다. 상이한 막 마커(PM의 경우 rGFP-CAAX 및 EE의 경우 rGFP-FYVE)를 사용하여 PM 및 초기 엔도솜(EE)에서 G 단백질 활성을 모니터링하기 위한 최적화는 도 6b-6e(PM의 경우) 및 도 6f-i(EE의 경우)에 제시되어 있다. 모의는 재조합 Gα로 형질감염되지 않은 세포에서 내인성 G 단백질로부터 수득된 반응을 나타낸다. Gq 패밀리의 구성원의 활성화를 측정하기 위한 동적 창은 Gα 서브유닛의 발현 수준에 따르는 것으로 제시되었다. Gq에 대해 도 6b 및 G14에 대해 도 6d에 제시된 바와 같이, 동적 창은 더 많은 Gα가 공동형질감염될수록 증가한다. G15의 경우(도 6e), 효과는 Gα15를 암호화하는 공동-형질감염된 작제물 5ng에서 이미 최대이며, 형질감염은 보다 유의한 효과를 갖지 않았다. G11의 경우(도 6c에서), 5 ng 초과의 형질감염된 DNA 수준을 증가시키는 것은 동적 창의 감소를 초래하는 것으로 제시되었다. EE에서 G 단백질 활성의 모니터링에 대해 유사한 결과를 수득하였다(도 6f-i).
최적화된 조건을 사용하여 PM(도 6j-6m) 및 EE(도 6n-6q)에서 TPαR 리간드 U46619, I-BOP, CTA2, U51605, I-SAP 및 SQ 29,558을 프로파일링하였다. 도 6j-6m에 제시된 바와 같이, U46619, I-BOP 및 CTA2는 Gq(도 6j), G14(도 6k), G11(도 6l) 및 G15(도 6m)에 대한 완전 작용제이며; U51605는 부분 작용제이며(Gq의 경우 I-BOP 최대 반응의 32%, G14의 경우 25%, G11의 경우 24% 및 G15의 경우 10%); I-SAP(Gq에 대해 단지 7%) 및 SQ 29,558은 PM에서 모든 4개의 G 단백질의 유의한 활성화를 유도하지 못한다. EE에서 G 단백질 활성을 모니터링하는 경우 유사한 결과(효능 및 효과)를 수득하였다(도 6n-6q). U51605의 경우, Gq(I-BOP 최대 반응의 71%), G11(61%) 및 G14(75%)에 대해 EE에서 더 높은 효과를 관찰하였지만, G15에 대한 반응은 없었다. 최종적으로, PM에서 각각 Gq 및 G11 활성화에 대해 0.840 및 0.879로 평가된 Z' 인자를 수득하였으며(도 6r 및 6s), 이는 검정이 강력하고 Gq 조절에 기초한 고처리량 스크리닝 적용과 양립할 수 있음을 다시 나타낸다.
Gq 패밀리(Gq, G11, G14 및 G15)의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 GRK2-기반 BRET 시스템의 최적화 및 사용은 도 7a-7f에 기재되어 있다. 2개의 RGS(GRK2) 작제물이 제시되어 있다. Gq 결합 도메인(RGS 도메인)(잔기 30-203, RGS(GRK2))을 포함하는 GRK2의 단편을 N-말단(RlucII-RGS(GRK2)) 또는 C-말단(RGS(GRK2)-RlucII)에서 BRET 공여체, RlucII로 태그하였다. 전장 GRK2 단백질은 플렉스트린(PH) 도메인 및 PM으로 자체 동원을 조절하는 Gβγ-상호작용 도메인을 갖는다. GRK2의 Gq-결합 RGS 도메인만을 사용하는 것은 유리하게는 Gq 단백질 활성화시 상이한 구획으로 시토졸 국부화 및 전위를 허용하며, 예를 들어 다른 비-Gq G 단백질의 활성화를 통해 조절될 수 있는 PIP2 또는 유리 Gβγ 서브유닛 수준에 영향을 미치지 않는다. 도 7b 및 7c에서, RlucII-RGS(GRK2)로 수득된 용량-반응 곡선은 2개의 Gq-결합된 수용체, 안지오텐신II로 자극된 AT1AR(도 7b) 및 U46619로 자극된 TPαR(도 7c)에 의해 PM에서 Gq, G11, G14 및 G15 활성화에 대해 제시된다. 도 7d 및 7e에 도시된 바와 같이, RGS(GRK2)-RlucII로 유사한 결과(커플링 및 EC50)를 수득하였지만, 동적 창은 일반적으로 RlucII-RGS(GRK2)에 비해 더 낮았다. 100 nM U46619로 TPαR의 활성화 후 PM으로 RlucII-RGS(GRK2)의 동원을 평가하는 경우 0.785로 평가된 Z' 인자를 수득하였으며, 이는 검정이 강력하고 Gq 조절에 기초한 고처리량 스크리닝 적용과 양립할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)에 의한 G 단백질 활성화를 모니터링하기 위한 시스템 및 검정.
G 단백질 활성화는 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF) 예컨대 GIV(Gα-상호작용 소포-관련 단백질, 또한 Girdin으로도 알려짐), NUCB1(뉴클레오빈딘1, 또한 calnuc로도 알려짐), NUCB2 및 DAPLE(흩어진-회합 단백질)를 통해 달성될 수 있다. GIV/Girdin 활성은 RTK(예를 들어, EGFR) 및 Gi 활성의 인테그린 조절과 관련된다. DAPLE는 wnt/Frizzle 수용체(GPCR)를 통한 rac 및 Gi-활성화와 관련된다. WT Gi 단백질의 GEF-매개 활성화는 본원에 기재된 Gi 패밀리의 G 단백질의 활성화를 모니터링하기 위한 시스템/검정, 예컨대 Rap1Gap(SSS-AAA)-RlucII를 사용한 시스템/검정을 사용하여 모니터링할 수 있다. 그러나, GPCR이 EGFR 및 IGFR과 같은 RTK를 전사활성화시키는 것으로 제시된 바 있으므로, HTS 적용 및 리간드 프로파일링 연구를 위해, G 단백질의 GPCR과 GEF-매개 활성화 사이를 구별할 수 있는 것이 유용할 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해, C-말단 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Gαi2 단백질의 그룹(도 8a)을 설계 및 시험하였다. WT 및 돌연변이체 Gi2의 EGFR-매개 활성화를 용량 반응 곡선으로 GPCR(BKB2R) 반응과 비교하였다. Gαi2의 마지막 2개 잔기(도 8b, 8c) 또는 Gαi2(도 8d, 8e) 및 GαoB(도 8f, 8g)의 마지막 5개 잔기의 결실은 Gi2 및 GoB의 EGFR-매개 활성화를 유지하면서 GPCR-매개 G 단백질 활성화를 방지하기에 충분하였다. Gi2의 경우, 두 결실은 EGFR을 공동-발현하는 세포에 대해 WT G 단백질과 비교하여 기저 활성을 변화시켰다. 2개의 보존된 류신 잔기(위치 -7 및 -2)에서 치환을 수행하여 EGFR과 유사한 기저 활성을 초래할 수 있지만 GPCR 활성화시 여전히 불활성인 돌연변이체를 갖는 잔기를 확인하였다. 그러므로 L-7G 돌연변이체는 EGFR을 갖는 WT와 상이한 기저 활성을 나타내었다(도 8h, 8i). Gαi2의 L-2G 돌연변이체에 대한 결과는 EGFR을 갖는 WT와는 유사하지만 BKB2R을 갖는 것과는 상이한 기저 활성을 나타내었다(도 87j, 8k). GαoB L-2G 돌연변이체의 경우, 기저 활성은 두 수용체에 대해 WT 단백질과 유사하였다(도 8l, 8m). 추가의 L-2 돌연변이체 Gαi2 단백질을 시험하였다(L-2D, L-2P 및 L-2R). 그들의 동적 창은, PM으로 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII의 작용제-유도 전위의 측정시, WT 단백질을 사용한 것보다 더 작지만, 기저 활성에서의 차이는 Gαi2 단백질의 결실 또는 L-2G 돌연변이체에 비해 훨씬 더 근접하였다(도 8n-8s). WT Gαi2를 사용하여 0.70(도 8t) 및 L-2P Gαi2 돌연변이체를 사용하여 0.73(도 8u)으로 평가된 Z' 인자를 수득하였으며, 이는 돌연변이체 및 WT G 단백질 둘 다를 사용하여 비-GPCR-매개 G 단백질 활성화를 모니터링하는 강력한 검정을 나타낸다. 도 8v-8x는 Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII가 GPCR(SNC80-매개 DOR 활성화에 대해 도 8v 및 도 8w에서, D2R의 퀸피롤-매개 활성화) 뿐만 아니라 GEF-매개 G단백질 활성화(EGFR 자극을 통해; 도 8x)를 모니터링하는데 사용될 수 있는 반면, 작용제 EGF의 상승 농도의 존재 하에 BRET 신호에서 유의한 증가가 없기 때문에, RGS(RGS17)-RlucII-기반 센서는 단지 GPCR-매개 활성화를 모니터링함을 나타낸다. GPCR 활성화는 RTK 전사활성화를 초래할 수 있기 때문에, 이들 결과는 WT Gα/RGS(RGS17)-RlucII 및 돌연변이체 Gα/Rap1GAP(SSS-AAA)-RlucII가 RTK/GEF-매개 G단백질 활성화로부터 GPCR-매개된 것을 구별하는데 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.
본 발명이 특정 구현예의 방식으로 상기 본원에 기재되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 대상 발명의 취지 및 본질을 벗어나지 않으면서 변형될 수 있다. 청구범위에서, "포함하는"이라는 단어는 "포함하나 이에 제한되지는 않는"이라는 어구와 실질적으로 동등한 개방형 용어로서 사용된다. 단수형은 달리 문맥상 명백하게 나타내지 않는 한 상응하는 복수형을 포함한다.
<110> UNIVERSITE DE MONTREAL DOMAIN THERAPEUTICS <120> SYSTEMS AND METHODS FOR THE ASSESSMENT OF G-PROTEIN ACTIVATION <130> G15691.00141 <150> US 62/573,853 <151> 2017-10-18 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Cys Ile Lys Ser Lys Gly Lys Asp Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Met Ser Cys Lys Cys Cys Ile Leu 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Pro Lys Lys Gly Leu Leu Gln Arg Leu Phe Lys Arg Gln His Gln 1 5 10 15 Asn Asn Ser Lys Ser 20 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 6 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 7 Gly Ser Ala Gly Thr Gly Gly Arg Ala Ile Asp Ile Lys Leu Pro Ala 1 5 10 15 Thr <210> 8 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ile Glu Lys Met Gln Gly Ser Arg Met Asp Glu Gln Arg Cys Ser 1 5 10 15 Phe Pro Pro Pro Leu Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Ile Pro Tyr Pro Ser 20 25 30 Val His Glu Val Leu Gly Arg Glu Gly Pro Phe Pro Leu Ile Leu Leu 35 40 45 Pro Gln Phe Gly Gly Tyr Trp Ile Glu Gly Thr Asn His Glu Ile Thr 50 55 60 Ser Ile Pro Glu Thr Glu Pro Leu Gln Ser Pro Thr Thr Lys Val Lys 65 70 75 80 Leu Glu Cys Asn Pro Thr Ala Arg Ile Tyr Arg Lys His Phe Leu Gly 85 90 95 Lys Glu His Phe Asn Tyr Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Leu Gly His Leu 100 105 110 Val Phe Ser Leu Lys Tyr Asp Val Ile Gly Asp Gln Glu His Leu Arg 115 120 125 Leu Leu Leu Arg Thr Lys Cys Arg Thr Tyr His Asp Val Ile Pro Ile 130 135 140 Ser Cys Leu Thr Glu Phe Pro Asn Val Val Gln Met Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Cys Glu Asp Val Asn Val Asp Arg Phe Tyr Pro Val Leu Tyr Pro Lys 165 170 175 Ala Ser Arg Leu Ile Val Thr Phe Asp Glu His Val Ile Ser Asn Asn 180 185 190 Phe Lys Phe Gly Val Ile Tyr Gln Lys Leu Gly Gln Thr Ser Glu Glu 195 200 205 Glu Leu Phe Ser Thr Asn Glu Glu Ser Pro Ala Phe Val Glu Phe Leu 210 215 220 Glu Phe Leu Gly Gln Lys Val Lys Leu Gln Asp Phe Lys Gly Phe Arg 225 230 235 240 Gly Gly Leu Asp Val Thr His Gly Gln Thr Gly Thr Glu Ser Val Tyr 245 250 255 Cys Asn Phe Arg Asn Lys Glu Ile Met Phe His Val Ser Thr Lys Leu 260 265 270 Pro Tyr Thr Glu Gly Asp Ala Gln Gln Leu Gln Arg Lys Arg His Ile 275 280 285 Gly Ala Ala Ile Val Ala Val Val Phe Gln Asp Glu Asn Thr Pro Phe 290 295 300 Val Pro Asp Met Ile Ala Ser Asn Phe Leu His Ala Tyr Val Val Val 305 310 315 320 Gln Ala Glu Gly Gly Gly Pro Asp Gly Pro Leu Tyr Lys Val Ser Val 325 330 335 Thr Ala Arg Asp Asp Val Pro Phe Phe Gly Pro Pro Leu Pro Asp Pro 340 345 350 Ala Val Phe Arg Lys Gly Pro Glu Phe Gln Glu Phe Leu Leu Thr Lys 355 360 365 Leu Ile Asn Ala Glu Tyr Ala Cys Tyr Lys Ala Glu Lys Phe Ala Lys 370 375 380 Leu Glu Glu Arg Thr 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Phe Arg Gln Asn Ala Leu Tyr Val Arg Met 500 505 510 Leu Ala Glu Leu Asp Met Leu Lys Asp Pro Ser Phe Arg Gly Ser Asp 515 520 525 Asp Gly Asp Gly Glu Ser Phe Asn Gly Ser Pro Thr Gly Ser Ile Asn 530 535 540 Leu Ser Leu Asp Asp Leu Ser Asn Val Ser Ser Asp Asp Ser Val Gln 545 550 555 560 Leu His Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Tyr Ala Asp Tyr Asp Pro Tyr 565 570 575 Ala Val Ala Gly Val Cys Asn Asp His Gly Lys Thr Tyr Ala Leu Tyr 580 585 590 Ala Ile Thr Val His Arg Arg Asn Leu Asn Ser Glu Glu Met Trp Lys 595 600 605 Thr Tyr Arg Arg Tyr Ser Asp Phe His Asp Phe His Met Arg Ile Thr 610 615 620 Glu Gln Phe Glu Ser Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Pro Gly Lys Lys 625 630 635 640 Thr Phe Asn Asn Met Asp Arg Asp Phe Leu Glu Lys Arg Lys Lys Asp 645 650 655 Leu Asn Ala Tyr Leu Gln Leu Leu Leu Ala Pro Glu Met Met Lys Ala 660 665 670 Ser Pro Ala Leu Ala His Tyr Val Tyr Asp Phe Leu Glu Asn Lys Ala 675 680 685 Tyr Ser Lys Gly Lys Gly Asp Phe Ala Arg Lys Met Asp Thr Phe Val 690 695 700 Asn Pro Leu Arg Asn Ser Met Arg Asn Val Ser Asn Ala Val Lys Ser 705 710 715 720 Leu Pro Asp Ser Leu Ala Glu Gly Met Thr Lys Met Ser Asp Asn Met 725 730 735 Gly Lys Met Ser Glu Arg Leu Gly Gln Asp Ile Lys Gln Ser Phe Phe 740 745 750 Lys Val Pro Pro Leu Ile Pro Lys Thr Asp Ser Asp Pro Glu His Arg 755 760 765 Arg Val Ser Ala Gln Leu Asp Asp Asn Val Asp Asp Asn Ile Pro Leu 770 775 780 Arg Val Met Leu Leu Leu Met Asp Glu Val Phe Asp Leu Lys Glu Arg 785 790 795 800 Asn Gln Trp Leu Arg Arg Asn Ile Lys Asn Leu Leu Gln Gln Leu Ile 805 810 815 Arg Ala Thr Tyr Gly Asp Thr Ile Asn Arg Lys Ile Val Asp His Val 820 825 830 Asp Trp Met Thr Ser Pro Glu Gln Val Ala Asp Ser Val Lys Arg Phe 835 840 845 Arg Asp Ala Phe Trp Pro Asn Gly Ile Leu Ala Glu Ala Val Pro Cys 850 855 860 Arg Asp Lys Ser Ile Arg Met Arg Thr Arg Val Ala Gly Lys Thr Lys 865 870 875 880 Leu Leu Ala Ile Met Pro Asp Glu Leu Lys His Ile Ile Gly Ala Glu 885 890 895 Thr Thr Arg Lys Gly Ile Leu Arg Val Phe Glu Met Phe Gln His Asn 900 905 910 Gln Leu Asn Arg Arg Met Val Tyr Val Phe Leu Glu Gly Phe Leu Glu 915 920 925 Thr Leu Phe Pro Gln Tyr Lys Phe Arg Glu Leu Phe Asn Lys Leu His 930 935 940 Ser Arg Ser Lys Gln Met Gln Lys Tyr Lys Gln Lys Leu Gln Thr Thr 945 950 955 960 Gln Ala Pro Ser Leu Gln Lys Arg 965 <210> 57 <211> 292 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Met Gly Glu Lys Ser Glu Asn Cys Gly Val Pro Glu Asp Leu Leu Asn 1 5 10 15 Gly Leu Lys Val Thr Asp Thr Gln Glu Ala Glu Cys Ala Gly Pro Pro 20 25 30 Val Pro Asp Pro Lys Asn Gln His Ser Gln Ser Lys Leu Leu Arg Asp 35 40 45 Asp Glu Ala His Leu Gln Glu Asp Gln Gly Glu Glu Glu Cys Phe His 50 55 60 Asp Cys Ser Ala Ser Phe Glu Glu Glu Pro Gly Ala Asp Lys Val Glu 65 70 75 80 Asn Lys Ser Asn Glu Asp Val Asn Ser Ser Glu Leu Asp Glu Glu Tyr 85 90 95 Leu Ile Glu Leu Glu Lys Asn Met Ser Asp Glu Glu Lys Gln Lys Arg 100 105 110 Arg Glu Glu Ser Thr Arg Leu Lys Glu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Lys 115 120 125 Lys Gly Asp Tyr Ile Glu Ala Glu Ser Ser Tyr Ser Arg Ala Leu Glu 130 135 140 Met Cys Pro Ser Cys Phe Gln Lys Glu Arg Ser Ile Leu Phe Ser Asn 145 150 155 160 Arg Ala Ala Ala Arg Met Lys Gln Asp Lys Lys Glu Met Ala Ile Asn 165 170 175 Asp Cys Ser Lys Ala Ile Gln Leu Asn Pro Ser Tyr Ile Arg Ala Ile 180 185 190 Leu Arg Arg Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Thr Asp Lys Leu Asp Glu Ala 195 200 205 Leu Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Leu Glu Lys Asp Pro Ser Ile His Gln 210 215 220 Ala Arg Glu Ala Cys Met Arg Leu Pro Lys Gln Ile Glu Glu Arg Asn 225 230 235 240 Glu Arg Leu Lys Glu Glu Met Leu Gly Lys Leu Lys Asp Leu Gly Asn 245 250 255 Leu Val Leu Arg Pro Phe Gly Leu Ser Thr Glu Asn Phe Gln Ile Lys 260 265 270 Gln Asp Ser Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Phe Val Gln Asn Pro 275 280 285 Asn Asn Asn Arg 290 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe 1 5 <210> 59 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser 20 25 30 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 1 5 10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 1 5 10

Claims (67)

  1. Gα 단백질 서브유닛 패밀리-선택적 방식으로 G 단백질 활성화의 조절(modulation)을 측정하는 시스템으로서, 상기 시스템은
    하기 성분을 발현하는 세포를 포함하며:
    (i) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 Gα 서브유닛 상호작용 폴리펩티드(GASIP)를 포함하는 제1 성분으로서,
    여기서:
    상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gi이면, 상기 GASIP는 Gi에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고;
    상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 Gq이면, 상기 GASIP는 Gq에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하고;
    상기 Gα 단백질 서브유닛 패밀리가 G12/13이면, 상기 GASIP는 G12/13에 특이적으로 결합하는 단백질의 도메인을 포함하는 것인, 제1 성분; 및
    (ii) 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자로 태그된 형질 막(PM)-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티를 포함하는 제2 성분;
    여기서 상기 GASIP가 상기 형광 수용체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되면, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티는 상기 형광 수용체 분자로 태그되는 것인, 시스템.
  2. 제1항에 있어서, Gi에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 Rap1GAP 또는 G-단백질 신호전달 조절인자(RGS) 단백질의 G-단백질 결합 도메인인, 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 GASIP가 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인이 위치 437, 439 및 441에서 세린 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되거나 또는 부재하는 Rap1GAP의 잔기 1 내지 442(서열번호:8), 또는 그의 변이체를 포함하는, 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인이 Rap1GAP의 잔기 1 내지 420 또는 1 내지 436을 포함하는, 시스템.
  6. 제4항에 있어서, 상기 위치 437, 439 및 441에서 모든 3개의 세린 잔기가 돌연변이되는, 시스템.
  7. 제4항 또는 제6항에 있어서, 상기 세린 잔기가 알라닌으로 치환되는, 시스템.
  8. 제2항에 있어서, 상기 GASIP가 RGS 단백질의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RGS 단백질이 RGS17, RGS19 또는 RGS20인, 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 G 단백질-결합 도메인이 RGS17의 잔기 64 내지 210(서열번호:17), RGS19의 잔기 70-217(서열번호:18), 또는 RGS20의 잔기 242-388(서열번호:19)을 포함하는, 시스템.
  11. 제1항에 있어서, Gq에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 P63RhoGEF 또는 GRK2의 G 단백질-결합 도메인인, 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 GASIP가 P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 상기 P63RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 P63RhoGEF의 잔기 295 내지 502(서열번호:25)를 포함하는, 시스템.
  14. 제11항에 있어서, 상기 GASIP가 GRK2의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 GRK2의 G 단백질-결합 도메인이 GRK2의 잔기 30 내지 203(서열번호:27)을 포함하는, 시스템.
  16. 제1항에 있어서, G12/13에 특이적으로 결합하는 단백질의 상기 도메인이 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인인, 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 상기 GASIP가 PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 PDZRhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 PDZRhoGEF의 잔기 281 내지 483(서열번호:21)을 포함하는, 시스템.
  19. 제16항에 있어서, 상기 GASIP가 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 상기 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인이 P115RhoGEF의 잔기 1 내지 244(서열번호:23)를 포함하는, 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GASIP가 상기 생물발광 공여체 분자로 태그되고, 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티가 상기 형광 수용체 분자로 태그되는, 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 PM에 국부화된 PM 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PM 단백질 또는 그의 단편이 (a) 팔미토일화, 미리스토일화, 및/또는 프레닐화 신호 서열 및/또는 (b) 다염기성 서열을 포함하는, 시스템.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 아미노산 서열 GCMSCKCVLS(서열번호:60), GCMGLPCVVM(서열번호:61), CVKIKKCIIM(서열번호:62), KKKKKKSKTKCVIM(서열번호:63), 또는 KNGKKKRKSLAKRIRERCCIL(서열번호: 45), CMSCKCCIL(서열번호:4), 또는 SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS(서열번호:5)를 포함하는, 시스템.
  25. 제24항에 있어서, 상기 PM 표적화 모이어티가 아미노산 서열 GKKKKKKSKTKCVIM(서열번호:1)을 포함하는, 시스템.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 엔도솜에 국부화된 엔도솜 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 엔도솜 단백질 또는 그의 단편이 FYVE 도메인을 포함하는, 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 인간 엔도핀의 FYVE 도메인을 포함하는, 시스템.
  29. 제28항에 있어서, 상기 엔도솜 표적화 모이어티가 인간 엔도핀의 잔기 739 내지 806(서열번호:39)을 포함하는, 시스템.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 골지에 국부화된 골지 단백질 또는 그의 단편인, 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 골지에 국부화된 eNOS1 또는 그의 단편인, 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 상기 골지 표적화 모이어티가 인간 eNOS1의 잔기 1 내지 73(서열번호:46)을 포함하는, 시스템.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 성분이 (i) 상기 GASIP와 (ii) 상기 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자 사이의 링커를 추가로 포함하는, 시스템.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 성분이 (i) 상기 PM-표적화 모이어티, 엔도솜-표적화 모이어티 또는 골지-표적화 모이어티와 (ii) 상기 생물발광 공여체 분자 또는 형광 수용체 분자 사이의 링커를 추가로 포함하는, 시스템.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 링커가 5 내지 25개의 아미노산으로 연결된 펩티드인, 시스템.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G 단백질을 통해 신호를 보내는 세포 표면 수용체인 제3 성분을 추가로 포함하는, 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체가 GPCR, RTK 또는 인테그린 수용체인, 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G 단백질 활성화가 G 단백질-결합 수용체(GPCR)-매개 G 단백질 활성화인, 시스템.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드인 제4 성분을 추가로 포함하는, 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 G 단백질 활성화가 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화이고, 상기 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드가 상기 Gα 서브유닛 폴리펩티드의 카르복시(C)-말단 도메인에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 C-말단 도메인이 상기 Gα 서브유닛 폴리펩티드의 마지막 7개 잔기에 상응하는, 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 상기 돌연변이가 적어도 마지막 2개의 C-말단 잔기의 결실 또는 치환인, 시스템.
  42. 제41항에 있어서, 상기 돌연변이가 적어도 마지막 5개의 C-말단 잔기의 결실 또는 치환인, 시스템.
  43. 제40항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 C-말단 도메인에서 보존된 류신 잔기 중 적어도 1개의 결실 또는 치환인, 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 상기 돌연변이가 상기 C-말단 도메인에서 마지막 보존된 류신 잔기의 치환인, 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 치환이 류신을 아스파르테이트로, 류신을 프롤린으로, 또는 류신을 아르기닌으로 치환인, 시스템.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GEF가 GIV/Girdin이고, 상기 GASIP가 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 상기 GEF가 수용체 티로신 키나제(RTK)에 의해 활성화되는, 시스템.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물발광 공여체 분자가 루시퍼라제, 바람직하게는 레닐라 루시퍼라제 단백질(rLuc)인, 시스템.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 수용체 분자가 녹색 형광 단백질(GFP), 바람직하게는 레닐라 GFP(rGFP)인, 시스템.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 시스템의 제1 및/또는 제2 성분을 암호화하는, 하나 이상의 핵산.
  51. 제50항에 있어서, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 시스템의 제1 성분을 암호화하는 제1 핵산 및 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 시스템의 제2 성분을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는, 하나 이상의 핵산.
  52. 제50항 또는 제51항의 하나 이상의 핵산을 포함하는, 하나 이상의 벡터.
  53. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 정의된 시스템의 성분을 발현하는, 숙주 세포.
  54. 제제(agent)가 관심 G 단백질의 활성화를 조절하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 시스템을 상기 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템에서 BRET 신호를 측정하는 단계로서, 여기서 상기 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 상기 관심 G 단백질의 활성화를 조절함을 나타내는 것인, 단계.
  55. 제54항에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 Rap1GAP의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 시스템이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 Gi 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 제1항 및 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 P63RhoGEF 또는 GRK2의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 시스템이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 Gq 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  61. 제54항에 있어서, 상기 관심 G 단백질이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 것이고, 상기 GASIP가 제1항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 PDZRhoGEF 또는 P115RhoGEF의 G 단백질-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 시스템이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 방법이 복수의 시스템을 사용하여 수행되고, 상기 시스템 각각이 G12/13 단백질 서브유닛 패밀리의 상이한 재조합 Gα 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  64. 제제(agent)가 비-수용체 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)-매개 G 단백질 활성화를 조절하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항의 시스템을 상기 생물발광 공여체 분자에 대한 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 제제의 존재 및 부재 하에 시스템의 BRET 신호를 측정하는 단계로서, 상기 제제의 부재에 비해 상기 제제의 존재 하에 상기 BRET 신호의 차이는 상기 제제가 비-수용체 GEF-매개 G 단백질 활성화를 조절함을 나타내는 것인, 단계.
  65. 제54항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BRET 신호가 플레이트 판독기를 사용하거나 또는 현미경 검사에 의해 측정되는, 방법.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질이 코엘렌테라진 기질인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 기질이 메톡시 e-코엘렌테라진인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10430987B1 (en) 2017-06-09 2019-10-01 Snap Inc. Annotating an image with a texture fill
CN117024557B (zh) * 2023-10-10 2024-01-30 天津外泌体科技有限公司 14-3-3蛋白theta异构体作为细胞外囊泡支架蛋白的应用和细胞外囊泡

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196524A (en) 1989-01-06 1993-03-23 Eli Lilly And Company Fusion reporter gene for bacterial luciferase
US5219737A (en) 1990-03-27 1993-06-15 Kikkoman Corporation Mutant luciferase of a firefly, mutant luciferase genes, recombinant dnas containing the genes and a method of producing mutant luciferase
US5229285A (en) 1991-06-27 1993-07-20 Kikkoman Corporation Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly
JP3466765B2 (ja) 1994-07-27 2003-11-17 キッコーマン株式会社 ビオチン化ホタルルシフェラーゼ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、ビオチン化ホタルルシフェラーゼの製造法及び生物発光分析法
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
AU765703B2 (en) 1998-03-27 2003-09-25 Bruce J. Bryan Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
GB9823468D0 (en) 1998-10-28 1998-12-23 Secr Defence Novel enzyme
US6645761B1 (en) 2000-12-22 2003-11-11 Stratagene Humanized polynucleotide sequence encoding Renilla mulleri green fluorescent protein
WO2005121755A1 (en) * 2004-06-14 2005-12-22 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Cell free g-protein coupled receptor and ligand assay
WO2006086883A1 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 Universite De Montreal Biosensors for monitoring receptor-mediated g-protein activation
PL3194960T3 (pl) * 2014-09-19 2020-06-01 The Royal Institution For The Advancement Of Learning / Mcgill University Bioczujniki do monitorowania lokalizacji i migracji biocząsteczek w komórkach
CN107074926B (zh) * 2014-10-14 2021-09-21 蒙特利尔大学 基于Gβγ互作蛋白监测G蛋白激活的生物传感器

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