KR20200071740A - 저해성 키메라 항원 수용체 (icar)를 제조하기 위한 보편적 플랫폼 - Google Patents

저해성 키메라 항원 수용체 (icar)를 제조하기 위한 보편적 플랫폼 Download PDF

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KR20200071740A
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기드온 그로스
윌 깁슨
드비르 다하리
메라브 베이만
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임팩트-바이오 리미티드.
가비쉬-가릴리 바이오 어플리케이션스 리미티드.
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Abstract

본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 또는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)를 제조하기 위한 표적을 식별하는 방법을 제공한다.
또한, iCAR 표적의 목록뿐만 아니라, 핵산 분자를 포함하는 형질도입된 효과기 면역 세포 및 벡터 및 상기 형질도입된 효과기 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

저해성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하기 위한 보편적 플랫폼
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2017년 9월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/564,454호, 및 2018년 3월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/649,429호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 원용에 의해 본원에 포함된다.
서열 목록
본 특허 출원은, ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체 내용이 원용에 의해 본원에 포함된 서열 목록을 포함한다. 2018년 9월 27일에 작성된 상기 ASCII 사본은 120575-5003_ST25.txt로 명명된다.
ASCII 표
본원이 우선권을 주장하는 가출원은 긴 표 섹션을 포함한다. 상기 표의 사본은 2018년 3월 28일에 출원된 우선권 미국 가출원 제62/649,429호와 함께 ASCII 형식으로 콤팩트 디스크로 미국 특허청에 제출되었으며, 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 2018년 3월 28일에 작성된 상기 ASCII 표는 다음과 같다: 120575-5003-PR allCandExt1167Genes_5003_PR.txt, 272,719,870 bytes.
기술분야
본 발명은, 종양 세포의 표면에 발현되는 항원을 인식하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR), 정상 세포에 의해 발현되지만 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양에 의해서는 발현되지 않는 동일하거나 다른 세포 표면 항원의 대립유전자 변이체에 대해 지시된 억제성 CAR (iCAR) 및 보호 CAR (pCAR)을 사용하는, 입양 세포 전달에 의한 암 면역요법 분야에 관한 것이다.
종양 세포에 의해 독점적으로 발현되며 건강한 조직에 의해서는 발현되지 않는 표적화가능한 항원의 식별이 현재의 암 면역요법의 주요 도전 과제임은 의심할 여지가 없다. 암 치료를 위해 T 세포를 활용하기 위한 매우 다양한 접근법을 평가하는 수많은 연구로부터, T 세포가 종양 세포를 근절할 수 있다는 임상적 증거가 나왔다 (문헌 [Rosenberg and Restifo, 2015]). 이들 접근법은 공여자 림프구 주입을 통한 골수 이식, 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 입양 전달, CAR (문헌 [Gross and Eshhar, 2016a]) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 지정된 항원으로 유전적으로 재지시된 T 세포를 이용한 치료, 면역 체크포인트 억제제 또는 능동 백신 접종의 사용을 활용한다. 이들 중, 유전자 조작된 T 세포 및 능동 면역화를 위한 상이한 전략의 사용은, 지속적인 임상 반응을 나타내면서도 부작용을 최소화할 가능성이 있는 후보 항원에 대한 기존 정보를 수반한다. 그러나 S. Rosenberg의 최근 보고서의 명칭에 기술된 바와 같이, "적합한 표적을 찾는 것이 암 유전자 요법의 주요 장애물이다" (문헌 [Rosenberg, 2014]).
키메라 항원 수용체 (또는 CAR)를 사용하여 선택된 항원에 대해 지시된 T 세포 (또는 면역계의 다른 살해 세포, 예를 들어 자연 살해 (NK) 세포 및 사이토카인-유도 살해 세포)를 MHC-독립적 방식으로 유전적으로 재지시시키는 개념은 Gross와 Eshhar에 의해 1980년대 후반에 처음 소개되었다 (문헌 [Gross 등, 1989]). 이들은 가요성 힌지 및 막횡단 표준적 모티프를 통해 T 세포를 활성화할 수 있는 CD3-ζ 또는 FcRy 사슬의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프를 포함하는 신호전달 성분에 융합된 세포외 단일쇄 항체 가변 단편 (scFv)을 암호화하는 키메라 유전자로부터 합성적으로 생산된다. 현재, CAR은 수십개의 임상 시험에서 검사되고 있으며 지금까지 B 세포 악성 종양에서 매우 높은 효능을 나타내었다 (문헌 [Dotti 등, 2014; Gill and June, 2015; Gross and Eshhar, 2016a]). CAR-T 세포 요법의 안전성은, 일반적으로, 종양과 건강한 조직을 구별하는 능력에 의해 결정된다. 임상 및 전임상 연구에서 보고된 자가면역 부작용의 주요 위험과 직접적인 원인은 표적 항원의 종양외 발현으로 인한 종양-외 (off-tumor), 표적-상 (on-target) 독성이다 (본 발명자들의 최근 보고서인 [문헌 Gross 및 Eshhar, 2016b] 및 [문헌 Klebanoff 등, 2016]에서 자세히 다루고 있음). 이러한 위험과 관련하여, CAR 요법에 대해 최근 임상적으로 또는 전임상적으로 시험된, 공유되는 돌연변이되지 않은 세포 표면 항원은 일반적으로 조직 분포 및 발현 방식에 따라 다음과 같은 다수의 범주로 나뉠 수 있다:
- 엄격하게 종양 특이적인 항원. 이 군에서 이미 임상적으로 검사되고 있는 유일한 구성원은 아마도, 교모세포종에서 자주 과발현되며 비소 세포 폐 암종 및 전립선, 유방, 두경부 및 난소 암에서 또한 발견되지만 정상 조직에서는 발견되지 않는 표피 성장 인자 수용체 (EGFRvIII)의 변이체 III일 것이다.
- 종양 및 필수적이지 않은 건강한 조직에 발현되는 표면 항원. 이 군의 잠재적인 CAR 항원은 주로 B 세포 계통으로 제한되는 분화-관련 분자이다. 이들 (및 수많은 임상 시험에서의 표적 항원) 중에서 두드러지는 것은, B 세포 분화에서 매우 초기에 획득되고 B 세포 수용체 (BCR)에 의한 신호전달에 관여하는 범-B 세포 마커 (pan-B cell marker)인 CD19이다. 막 전립선 항원은 이 범주 내에서 다른 부류의 항원을 구성한다.
- 비악성 종양-촉진 세포에 의해 전형적으로 발현되는 항원. 이러한 항원 중 하나는 다양한 원발성 및 전이성 암에서 종양-관련 섬유아세포에 의해 거의 항상 발현되는 세포 표면 세린 프로테아제인 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)이다. 또 다른 항원은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)이며, 이는 종양 혈관형성 동안 고도로 발현되고, 많은 필수적인 기관의 혈관 및 림프 내피 세포에서 일반적으로 발현된다.
- 필수적인 건강한 조직과 공유되는 종양 관련 항원 (TAA).
전임상 및 임상 연구에서 현재 평가되고 있는 대부분의 다른 TAA는 종양에 의해 과발현되지만, 필수적인 정상 조직에도, 일반적으로 더 낮은 수준으로, 존재한다.
CAR T 세포 요법에서 자가면역을 다루기 위해 고안된 광범위한 전략은, 손상이 이미 명백한 경우 전달된 T 세포를 제거하거나 억제하기 위한 전략 (반응적 조치) 및 애당초에 잠재적인 손상을 방지하기 위한 전략 (사전 조치)으로 나뉠 수 있다 (문헌 [Gross and Eshhar, 2016a]). 반응적 접근법은 종종 자살 유전자, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-tk), 및 절단된 인간 카스파제 9 및 돌연변이된 FK506-결합 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드인 iC9를 사용한다. 다른 접근법은, 혼란을 일으키는 조작된 세포를 선택적으로 제거하기 위한 항체, 또는 최근에 입증된 바와 같이, CAR 인식 모이어티와 세포내 신호전달 도메인의 결합을 통제하는 이종이량체화 소분자 작용제를 사용한다 (문헌 [Wu 등, 2015]). 일부 사전 조치는 CAR T 세포의 생체내 지속성 또는 기능을 제한하도록 설계 (예를 들어, 유전자 전달을 위한 mRNA 전기천공의 사용)된 반면, 다른 것들은 비종양 조직의 손상을 피하기 위해 치료 CAR의 항원 선택성을 증가시키는 주요 도전 과제를 직접적으로 해결한다. 이들 중 다음 2개는, CAR T 세포에 의해 안전하게 표적화될 수 있는 종양 항원의 범위를 잠재적으로 넓힐 수 있기 때문에, 특히 관심을 끈다:
- 조합적 (또는 '분할된') 항원 인식. 진정한 종양-특이적 표면 항원은 드물지만, 특정 종양에 의해 공동 발현되는 종양-관련 항원으로 반드시 분류되는 것은 아닌 2개의 상이한 항원의 조합은 새로운 종양-특이적 시그니처 (tumor-specific signature)를 정의할 수 있다. CAR T 세포의 활성을 이러한 항원 쌍으로 제한하는 것은 중요한 안전성 기준을 제공하고, 결과적으로 종양-특이적 표적의 스펙트럼을 확장 시키며, 상당한 치료적 가치를 가질 수 있다. 2세대 및 3세대 CAR은 CAR 엔도도메인에서의 2개 이상의 신호전달 부분의 테더링을 통해 단일 항원과 결합시 활성화 및 공동자극 신호를 치료 T 세포에 제공하도록 설계되었다. 그러나, 활성화 및 공동자극이 동일한 T-세포에서 상이한 항원에 대해 각각 특이적인 2개의 CAR로 분할되는 경우, 본격적인 반응은 상기 2개의 항원의 존재하에서만 달성될 수 있는 2개의 상보적 신호의 협력을 요구할 것이다. 이 원리는 여러 전임상 연구에서 입증되었다 (문헌 [Kloss 등, 2013; Lanitis 등, 2013; Wilkie 등, 2012; WO 2016/126608]).
의심할 여지없이 흥미롭게도, 이 접근법은, 유효한 표적-상 (on-target), 종양-상 (on-tumor) T 세포 반응성만을 허용하는 최적의 균형에 도달하기 위해 활성화 및 공동자극 신호 둘 모두의 강도에 대한 꼼꼼한 적정 (titration)의 필요성에 여전히 직면하고 있다. 임상 환경에서 이러한 균형을 일상적으로 달성할 수 있는지 여부에는 여전히 의문의 여지가 있다.
2개의 항원의 고유한 조합을 발현하는 표적 세포로만 T 세포 반응을 제한하기 위한 완전히 새로운 접근법이 최근에 공개되었다 (문헌 [Roybal 등, 2016a]). 그의 핵심 요소는 노치 (Notch)를 포함한 여러 세포 표면 수용체의 작용 방식을 이용하는 '유전자 스위치'로 기능한다. 이러한 수용체가 그의 리간드에 결합한 후, 이는 이중 절단을 거치며, 이는 그의 세포내 도메인의 유리를 초래하고, 이는 세포핵으로 이동하여, 이 곳에서 이는 전사 인자로서 기능한다. 이 원리의 구현은 효과기 T 세포로의 2개의 유전자의 공동도입을 수반한다. 제1 유전자는 구성적으로 발현되고, 제1 항원에 대해 지시된 인식 모이어티를 갖는 키메라 절단성 수용체를 암호화한다. 표적 세포의 표면의 이 항원과의 결합은 제2 항원에 대해 지시된 통상적인 CAR을 암호화하는 제2 유전자의 발현을 촉발시킨다. 이 제2 항원도 공동 발현하는 경우에만 표적 세포가 살해된다.
억제성 CAR. 종양-외 반응성은 CAR-재지시된 살해 세포의 표적 항원이 정상 조직과 공유되는 경우 발생한다. 이 정상 조직이 종양에 존재하지 않는 다른 표면 항원을 발현하는 경우, 유전자-변형된 세포에서, 억제성 신호전달 모이어티를 보유하는 이러한 비공유 항원을 표적화하는 추가적인 CAR을 공동 발현하는 것은 정상 조직에 의한 T-세포 활성화를 방지할 수 있다.
활성화 도메인 (예를 들어 FcRy 또는 CD3-ζ) 대신에, iCAR은 T 세포 활성화를 길항할 수 있는 억제성 수용체, 예를 들어 CTLA-4, PD-1 또는 NK 억제성 수용체로부터 유래한 신호전달 도메인을 보유한다. 후보인 aCAR 항원을 종양과 공유하는 정상 조직이 종양과 공유되지 않는 다른 표면 항원을 발현하는 경우, 이 비공유 항원을 표적화하는 동일한 T 세포에 의해 발현되는 iCAR은 상기 정상 조직을 보호할 수 있다 (도 1).
체세포적으로 재배열된 유전자 분절에 의해 암호화되는 고유한 2쇄 TCR을 각각 발현하는 T 세포와는 달리, NK 세포는 항원-특이적 수용체를 발현하지 않는다. 대신에, NK 세포는 감염된 세포 및 건강한 세포의 세포 표면에서 다수의 활성화 및 억제성 리간드를 각각 인식하는 생식계열-암호화된 활성화 및 억제성 수용체의 어레이를 발현한다. KIR3DL1과 같은 NK 억제성 수용체에 기초한 iCAR의 보호 능력이 설명된 바 있다 (US 9,745,368). KIR3DL1 및 다른 NK 억제성 수용체는 면역학적 시냅스를 빠르고 포괄적인 방식으로 해체함으로써 기능한다. 단일 NK 세포는 억제성 및 활성화 리간드 둘 모두를 발현하는 저항성 세포를 살리면서도, 이것이 동시에 결합하는 활성화 리간드만을 발현하는 민감 세포를 살해할 수 있다는 설득력 있는 증거가 존재한다 (문헌 [Abeyweera 등, 2011; Eriksson 등, 1999; Treanor 등, 2006; Vyas 등, 2001]). 이러한 정교한 능력은, 결과적으로 세포용해 과립의 세포외배출에 영향을 미치는 각각의 면역 시냅스에서 형성된 신호전달 분자의 상이한 공간적 조직에 의해 통제된다 (검토를 위해 문헌 [Huse 등, 2013] 참조). 보다 최근에, Fedorov 등 (문헌 [Fedorov 등, 2013a; WO 2015/142314])은 이러한 목적으로 PD-1 및 CTLA-4의 세포내 도메인을 성공적으로 사용하였다. NK 억제성 수용체와는 달리, 이들 iCAR의 조절 효과는 전체 세포에 영향을 미쳤다. 그러나, 이들 효과는 일시적이어서, aCAR 항원만을 발현하는 표적 세포와의 후속 접촉시 완전한 T-세포 활성화를 허용하였다.
iCAR 및 aCAR에 의해 표적화되는 항원의 조직 분포는, 임상 효능을 손상시키지 않으면서 최대 안전성을 부여하는데 필요한 iCAR의 최적 작용 방식에 영향을 준다. 예를 들어, 종양의 해부학적 부위 및 보호될 정상 조직(들)이 교차하지 않는 경우, 일시적 억제 (CTLA-4- 또는 PD-1-유사)로 충분할 것이다. 그러나, 이들 부위가 중첩되는 경우, 시냅스-제한된 억제 (예를 들어, NK 작용 방식)만이 치료 세포의 지속적인 마비를 방지하고 이들의 효과적인 종양파괴 활성을 허용한다. 표적-상 종양-외 반응성을 감소시키기 위해 iCAR을 사용하는 접근법은, 종양 세포에서는 하향조절되지만 정상 조직에는 존재하는 항원의 심각한 결핍에 시달리고 있다.
차세대 시퀀싱 (NGS)은 특정 종양 생검에서 모든 단백질-암호화 유전자 (전체 게놈의 약 1%)의 DNA 서열의 식별, 및 동일한 환자의 암 '진유전체'와 건강한 조직 (일반적으로 혈액 세포로부터의 것임)의 것의 비교를 가능하게 한다. 진유전체 시퀀싱은 생검 제거 후 수일 내에 비교적 저렴한 비용으로 완료될 수 있다. 동시에, 전사체 분석 (RNA-seq)은 동일한 세포 샘플에 의해 실제로 발현되는 유전자에 대한 상보적 정보를 제공할 수 있다.
각각의 개별 종양의 돌연변이 환경이 고유하다는 것이 점점 더 명백해지고 있다 (문헌 [Lawrence 등, 2013; Vogelstein 등, 2013]). 비동의 돌연변이의 결과로, 종양 세포는 잠재적으로, 환자의 HLA 생성물 중 하나 이상에서 환자의 면역계에 네오펩티드의 전용 세트를 제시할 수 있다. 실제로, 최근 몇 년 동안, 환자 자신의 CD8 또는 CD4 T 세포 레퍼토리에 의해 인식될 수 있으면서 면역요법의 표적으로서 기능할 수 있는 종양-특이적 네오에피토프를 식별하기 위해 막대한 노력이 수행되고 있다 (검토를 위해 문헌 [Blankenstein 등, 2015; Van Buuren 등, 2014; Heemskerk 등, 2013; Overwijk 등, 2013; Schumacher 및 Schreiber, 2015] 참조). 그러나, 누적된 발견들은, 신생항원-기반 T 세포 면역요법은 흑색종 및 폐암과 같이 더 높은 돌연변이 부하를 나타내는 암에 효과적일 가능성이 더 높기는 하지만, 더 적은 돌연변이를 갖는 대부분의 암에서 이점을 나타내지 못하는 경우가 많을 수 있음을 암시한다 (문헌 [Savage, 2014; Schumacher and Schreiber, 2015]). 또한, 상당한 종양내 이질성 (Burrell 등, 2013)은 돌연변이-상실 변이체의 출현을 피하기 위해 여러 항원의 동시적인 공동 표적화를 수반하며, 이 과제는 유용한 면역원성 네오펩티드의 부족으로 인해 점점 더 요구가 많아지고 있다.
대체로, 유전적으로 재지시된 살해 세포의 입양 전달을 통해 암 면역요법에 적합한 표적을 식별하기 위한 시급한 요구는 여전히, 크게 충족되지 못하고 있는 실정이다.
일부 측면에서, 본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 또는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)를 제조하기 위한 표적을 식별하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 표적은 하기를 포함하는 방법에 의해 식별된다:
(i) 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 갖는 유전자를 식별하는 단계;
(ii) 상기 발현된 대립유전자 중 적어도 하나가 세포외 다형성 에피토프 기준 서열에 비해 세포외 다형성 에피토프 서열에서의 아미노산 서열 변화를 나타내는 것을 확인하는 단계;
(iii) 상기 유전자가 종양 유형에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 염색체 영역에 위치하는 것을 확인하는 단계; 및
(iv) 상기 유전자가, 염색체 영역이 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 종양 유형의 기원 조직에서 발현되는 것을 확인하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 LOH 위치는 치환, 결실 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 LOH 위치는 SNP이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA 유전자이다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA_DQ, 또는 HLA-DR 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-A 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-B 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-C 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-G 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-E 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-F 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-K 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-L 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DM 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DO 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프는 HLA-DP 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프는 HLA-DQ 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프는 HLA-DR 유전자이다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 1번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 2번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 3번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 4번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 5번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 6번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 7번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 8번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 9번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 10번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 11번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 12번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 13번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 14번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 15번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 16번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 17번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 18번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 19번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 20번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 21번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 22번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 X 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 유방 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁경부 종양, 피부 종양, 췌장 종양, 결장직장 종양, 신장 종양, 간 종양, 뇌 종양, 림프종, 백혈병, 폐 종양 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 종양은 부신 종양, 신장 종양, 흑색종, DLBC, 유방 종양, 육종, 난소 종양, 폐 종양, 방광 종양 및 간 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 부신 종양은 부신피질 암종이다. 일부 구현예에서, 상기 신장 종양은 비염색 신장 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 상기 흑색종은 포도막 흑색종이다.
본 발명은 또한 안전한 효과기 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 (i) 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 iCAR 또는 pCAR 및 (ii) 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR)를 발현하는 안전한 효과기 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 제47항의 안전한 효과기 면역 세포로서, 여기서 상기 aCAR은 종양-관련 항원 또는 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR의 보호 효과로 인해, 상기 aCAR은 암 세포에 발현되는 임의의 표면 단백질에 대해 지시될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR은 종양-관련 단백질, 표 1에 열거된 CAR 표적, 상기 iCAR이 또한 발현되는 종양 조직에서 발현되는 임의의 세포 표면 단백질에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 비다형성 세포 표면 에피토프는 CD19, CD20, CD22, CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX Igκ, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34, CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2,GD3, hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-α, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Rα2, FAP, Mesothelin, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1, MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80, CD89, CDH17, CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1, WT-1 및 EGFR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항의 안전한 면역 효과기 세포로서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는 자가 또는 보편적인 (동종이계) 효과기 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포 및 사이토카인-유도 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR의 발현 수준은 상기 aCAR의 발현 수준 이상이다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR은 제1 벡터에 의해 발현되고 상기 aCAR은 제2 벡터에 의해 발현된다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR 및 상기 aCAR은 모두 동일한 벡터에 의해 발현된다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드를 포함한다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 토세아 아시그나 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 에퀸 리니티스 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)로부터의 P2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 가요성 링커를 통해 상기 iCAR 또는 pCAR에 연결된다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함한다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는, 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)와 상동성이다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 예를 들어 KIR2DS 및 KIR3DS와 상동성이다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 어댑터 분자, 예를 들어 DAP12와 상동성이다.
상기 안전한 효과기 면역 세포의 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40) 또는 GITR의 공동자극 신호전달 요소와 상동성이다.
본 발명은 또한 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 iCAR을 발현하는 안전한 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 안전한 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 포유류 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 및 필수적인 기관에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR 표적은 상기 aCAR 표적이 정상적으로 발현되는 모든 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR 표적은 상기 aCAR이 발현되는 필수적인 기관 세포에서 발현된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 본 발명의 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 본 발명에 따른, 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 공지된 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터 단백질-암호화 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계; (ii) (a) 상응하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서 아미노산 서열 변이를 야기하는 변이체를 선택하고, (b) 아미노산 서열 변이가 암호화된 단백질의 세포외 도메인에 존재하는 유전자의 변이체를 선택하고, (c) 적어도 하나의 종양에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 유전자의 변이체를 선택하고, (d) (c)에 따라 적어도 LOH를 겪는 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 유전자의 변이체를 선택하여, LOH로 인해 상기 적어도 하나의 종양에서 상실되고 적어도 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 세포외 도메인에 아미노산 서열 변이를 갖는 변이체의 목록을 획득함으로써, 검색된 변이체의 상기 목록을 필터링하는 단계; (iii) (ii)에서 획득된 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 정의하고, 상기 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 상기 서열 영역 및 상응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브클로닝하고 발현하여, 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계; (iv) (iii)에서 수득된, 상기 클로닝된 서열 영역에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드, 또는 상응하는 기준 대립유전자에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선택하는 단계; 및 (vii) (iv)에 정의된 iCAR 결합 도메인을 각각 포함하는 본원에 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안전한 효과기 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 종양-관련 항원에 대해 지시된 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 본원에 정의된 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키거나 또는 상기 세포를 본원에 정의된 벡터로 형질도입시키는 단계; 또는 (ii) 천연 효과기 면역 세포를 본원에 정의된 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계; 또는 효과기 면역 세포를 본원에 정의된 벡터로 형질도입시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 방법에 의해 수득된 안전한 효과기 면역 세포를 제공한다. 상기 안전한 효과기 면역 세포는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 및 iCAR을 발현하는 재지시된 T 세포일 수 있으며, 여기서 상기 외인성 TCR은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되며, 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되며, 상기 iCAR은 본원에 정의된 바와 같고; 상기 안전한 효과기 면역 세포는 본원에 정의된 iCAR 및 aCAR을 발현하는 재지시된 효과기 면역 세포, 예를 들어 자연 살해 세포 또는 T 세포이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 상기 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계; (ii) 상기 대상체로부터 정상 조직의 샘플, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)을 수득하는 단계; 및 (iii) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하여, 상기 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 정의된 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 안전한 효과기 면역 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 상기 환자의 필수적인 기관을 비롯한, 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR은 상기 aCAR 표적이 정상적으로 발현되는 모든 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR은 상기 aCAR이 발현되는 필수적인 기관 세포에서 발현된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계; (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 상기 암 환자의 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는, 단계; (iii) 본원에 정의된 iCAR을 정의하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 적어도 하나의 본원에 정의된 벡터를 선택하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고, 상기 aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는, 단계; (iv) 효과기 면역 세포를 (iii)의 핵산 분자로 형질감염시키거나 효과기 면역 세포를 (iii)의 벡터로 형질도입함으로써, 안전한 재지시된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 제조하거나 얻는 단계; 및 (v) (iv)의 안전한 재지시된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
유사한 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 안전한 재지시된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 제공하며, 여기서 상기 안전한 재지시된 면역 세포는 (i) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계; (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 상기 암 환자의 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는, 단계; (iii) 본원에 정의된 iCAR을 정의하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 본원에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 적어도 하나의 본원에 정의된 벡터를 선택하거나 얻는 단계로서, 상기 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고, 상기 aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는, 단계; (iv) 효과기 면역 세포를 (iii)의 핵산 분자로 형질감염시키거나 효과기 면역 세포를 (iii)의 벡터로 형질도입함으로써, 안전한 재지시된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 제조하거나 얻는 단계에 의해 수득된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제어된 효과기 면역 세포 활성화 시스템의 상이한 구성원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 핵산 분자의 조합에 관한 것이며, 상기 핵산 분자는 단일한 연속적인 핵산 분자의 일부이거나 이러한 핵산 분자를 형성하거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 제어된 효과기 면역 활성화 시스템은 효과기 면역 세포에게 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 하나 이상의 염색체 또는 그의 단편을 상실한 종양 세포를 살해하도록 지시하고 관련 정상 조직의 세포를 살리며, (a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR) 폴리펩티드를 포함하며, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유류 조직의 세포에 의해 공유되고; (b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상 포유류 조직에 의해 발현되지는 않지만 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함한다.
도 1은 iCAR의 개념을 도시한다 (문헌 [Fedorov 등, 2013a]에서 발췌함).
도 2는 aCAR/pCAR 분자 설계 및 작용 방식을 도시한다. 정상 세포 상의 항원에 대한 pCAR의 결합은, 이들이 aCAR 항원을 발현하는지 여부에 관계없이, 신속한 RIP를 초래하고 폴리펩티드를 3개의 별개의 단편으로 분해시킬 것으로 예측된다.
도 3a 내지 3c는 HLA 클래스 I 유전자좌를 암호화하는 염색체 영역에서 LOH를 겪는 종양 샘플의 백분율을 도시한다. TCGA 데이터베이스로부터의 종양 유형에서, A. HLA-G, B. HLA-A, C. ZNRD1. 신장 비염색 [KICH], 부신피질 암종 [ACC], 췌장 선암종 [PAAD], 육종 [SARC], 신장 유두 세포 암종 [KIRP], 식도 암종 [ESCA], 폐 편평 세포 암종 [LUSC], 신장 투명 세포 암종 [KIRC], 방광 요로상피세포 암종 [BLCA], 난소 장액 낭선암종[OV], 흉선종 [THYM], 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경내 선암종 [CESC], 두경부 편평 세포 암종 [HNSC], 유방 침습성 암종 [BRCA], 위 선암종 [STAD], 림프성 종양 확산성 거대 B-세포 림프종 [DLBC], 다형 교모세포종 [GBM], 결장 선암종 [COAD], 직장 선암종 [READ], 폐 선암종 [LUAD], 고환 생식 세포 종양 [TGCT], 중피종 [MESO], 담관암종 [CHOL], 자궁 암육종 [UCS], 피부 흑색종 [SKCM], 자궁 체부 자궁내막 암종 [UCEC], 뇌 저등급 신경교종 [LGG], 전립선 선암종 [PRAD], 간세포 암종 [LIHC], 갑상선 암종 [THCA], 크롬친화세포종 및 부신경절종 [PCPG], 급성 골수성 백혈병 [LAML], 포도막 흑색종 [UVM]
도 4는 게놈에서의 다른 모든 단백질 암호화 유전자에 대비한 HLA-A의 발현을 도시한다. 각 유전자에 대한 값은 GTEX (gtexportal.org)에서 획득한 조직 중간값의 평균 RPKM 값을 반영한다.
도 5는 실시예 5에서의 암들에 대한 HLA 단백질 이형접합성 상실의 분석을 위한 제안된 워크플로우를 도시한다.
도 6은 ABSOLUTE 처리된 카피 수 데이터를 사용하여 pancan12 데이터세트에서의 LOH의 빈도를 도시한다. 선은 빈도에 대한 95% 이항 신뢰 구간을 도시한다.
도 7은 HLA-A에서 관찰된 LOH의 유형을 도시한다. HLA-A LOH의 588개의 에피소드 중, HLA-A 유전자 내의 중단점에 관여한 것은 없었다.
도 8은 HLA-A를 포함하는 결실의 길이 (염기쌍)의 분포를 도시한다. 이들 결실의 대부분은 6p 염색체의 길이보다 크다.
도 9는 임계값 -0.1에서 상대 및 ABSOLUTE 카피 수 데이터에서의 HLA-A의 LOH를 갖는 환자의 분율의 상관 관계를 도시한다.
도 10a 내지 도 10c는 32개의 암들에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 LOH 비율의 비교가 거의 동일한 LOH 패턴을 나타냄을 도시한다.
도 11은 6p 염색체의 결실에 대해 분류된 AML 카피 수 프로파일의 IGV 스크린샷을 도시한다. 청색은 결실을 나타내고 적색은 증폭을 나타낸다. HLA-A의 결실은 존재하지 않는다.
도 12는 모든 SNP에 대해 LOH를 겪는 포도막 흑색종 종양의 비율을 도시한다.
도 13은 TCGA 연구 약어를 제공한다 (https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations에서도 입수가능함).
도 14는 17번 염색체에 암호화된 종양 억제 단백질 TP53에 인접한 염색체 영역의 상실을 도시한다. iCAR 표적으로 식별된 17번 염색체에 암호화된 유전자를 사용하여 환자 RC001을 치료할 수 있다.
도 15는 iCAR 및 aCAR 구조체의 개략도를 제공한다.
도 16은 ELISA에 의해 측정된 IL-2 분비에 관한 데이터를 제공한다. iCAR은 iCAR 표적을 발현하는 표적 세포와의 상호작용시 IL-2 분비를 특이적으로 억제한다.
도 17은 iCAR이, CBA에 의해 측정하였을 때, iCAR 표적을 발현하는 표적 세포와의 상호작용시 IL-2 분비를 특이적으로 억제함을 나타낸다.
도 18은 CD19 발현 표적 세포에 의한 CD19 aCAR 저캇-NFAT의 특이적 활성화를 도시한다.
도 19는 CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR 저캇-NFAT에서의 NFAT 활성화의 특이적 억제를 도시한다.
도 20은 상이한 E/T 비에서의 NFAT 활성화의 특이적 억제를 도시한다.
도 21은 도 15의 iCAR 및 aCAR 구조체에 대한 서열을 제공한다.
도 22는 1167개의 잠재적 iCAR, pCAR 및/또는 aCAR 표적을 제공한다.
도 23은 도 22에 열거된 1167개의 유전자로부터의 3288개의 SNP를 제공한다.
I. 서론
1971년에 A. G. Knudson이 제시한 종양 억제 유전자 (TSG)의 혁신적인 개념 (문헌 [Knudson Jr., 1971])을 언급하면서, Devilee, Cleton-Jansen 및 Cornelisse는 'Knudson 이후로 (Ever since Knudson)'라는 명칭의 보고서 (문헌 [Devilee 등, 2001])의 도입절에서 다음과 같이 기술하였다: "다양한 간행물이 다양한 종양에서의 많은 상이한 염색체에서의 LOH를 기록하였으며, 이는 다수의 TSG의 존재를 암시한다. Knudson의 2회 충격 가설 (two-hit hypothesis)은 이들 LOH 사건이 TSG의 두 대립유전자의 불활성화의 제2 단계라고 예측한다". 인간 암의 유전적 불안정성에 대한 중요한 보고서 (문헌 [Lengauer 등, 1998])에서 Lengauer, Kinzler 및 Vogelstein은 다음과 같이 기술하였다: "핵형 연구는 대부분의 암이 염색체를 상실하였거나 획득하였음을 입증하였고, 분자 연구는 핵형 데이터가 이러한 변화의 실제 정도를 실제로 과소 평가함을 나타낸다. 종양에서의 이형접합성 상실, 즉 모계 또는 부계 대립유전자의 상실은 광범위하며, 종종 반대 대립유전자의 이득을 동반한다. 종양은 예를 들어, 8번 부계 염색체를 복제하면서 8번 모계 염색체를 상실할 수 있으며, 이는 해당 세포가 정상적인 8번 염색체 핵형을 갖지만 비정상적인 8번 염색체 '대립유전자형'을 갖도록 만든다. 결장, 유방, 췌장 또는 전립선의 '평균적인' 암은 그의 대립유전자의 25%를 상실할 수 있으며 종양이 그의 대립유전자의 절반 이상을 상실하는 것은 드문 일이 아니다." 이러한 관찰은 이후 많은 보고서에서 실질적으로 모든 암종을 포함한 거의 모든 인간 암으로 보강되고 확장되었다 (검토를 위해 문헌 [McGranahan 등, 2012] 참조). 거의 모든 개별 종양이 다양한 크기의 전체 염색체, 전체 염색체 아암 (arm) 또는 하위 염색체 영역의 다중 상실을 나타내는 것이 분명하게 확립되었다. 진유전체 서열 데이터에 기초하여 임의의 특정 세포 샘플에서의 LOH 프로파일의 측정을 위한 새로운 알고리즘이 빠르게 개발되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Sathirapongsasuti 등, 2011]). 통계적 편견이 현재 일부 해석의 타당성에 의문을 제기할 수 있지만 (문헌 [Teo 등, 2012]), 이러한 알고리즘은 NGS 이전 시대에 이러한 목적을 위해 사용되었던 LOH 프로파일을 확립하기 위한 대부분의 다른 방법론을 개선하고 대체할 가능성이 있다.
초기 LOH 사건은, 동일한 조직의 전암 세포에서는 검출되지만 주변 정상 세포에서는 검출되지 않을 수 있다 (문헌 [Barrett 등, 1999]). LOH는 비가역적이고 사건은 단지 축적될 수만 있으므로, 종양 이질성은 종양 진행 전반에 걸친 상실의 축적을 반영한다. 후기 LOH 사건에 있어 상이한 종양 서브클론이 발생할 수 있지만, 특정 환자에서 전암 세포, 추정 종양 줄기 세포 및 모든 종양 서브클론에 의해 공유되는 최소 LOH 시그니처의 존재가 지배적인 것으로 예측된다. 이 '트렁크 (trunk)' LOH 패턴에서 유래한 분파는 동일한 환자의 모든 종양 세포를 포함하는 부분적으로 중첩되는 시그니처의 제한된 세트를 여전히 생성한다.
총 LOH 사건의 불가피한 결과는 결실된 염색체 물질에 존재하는 다른 모든 유전자의 부수적인 상실이며, 이들은 자연적으로, 막횡단 단백질을 암호화하는 많은 유전자를 포함한다. 이들의 정체성과 관련하여, 3,702개의 상이한 인간 세포 표면 단백질 ('서피세옴 (surfaceome)')의 카탈로그가 작성되었다 (문헌 [Da Cunha 등, 2009]). 서피세옴 유전자의
Figure pct00001
42%의 발현은 광범위한 조직 분포를 나타내는 반면,
Figure pct00002
85개의 유전자가 검사된 모든 조직에 의해 발현되는데, 이는 하우스키핑 유전자의 홀마크 (hallmark)이다. 이들 유전자가 후보이며, 이들의 상이한 다형성 변이체는 본 발명의 iCAR 및 aCAR에 대한 표적으로서 작용할 수 있다.
보다 최근에, Bausch-Fluck 등 (문헌 [Bausch-Fluck 등, 2015])은 그들의 화학단백질체 세포 표면 포획 기술 (Chemoproteomic Cell Surface Capture technology)을 적용하여 41개의 인간 세포 유형에서 1492개의 세포 표면 당단백질의 조합된 세트를 식별하였다. 서피세옴의 많은 부분이 임의의 특정 종양에 의해 발현되며, 각각은 특징적인 프로파일을 나타낼 것으로 예측된다. 세포 표면 단백질을 암호화하는 유전자는 다른 모든 유전자보다, 이들의 암호화 영역에 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 약간 풍부한 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Da Cunha 등, 2009]). 다형성 프레임내 삽입 및 결실 (이들은 드묾)은 변이체의 수에 더 기여하고 펩티드 서열-변경 (비동의) SNP보다 폴리펩티드 생성물에 더 강력한 구조적 효과를 발휘할 가능성이 있다. 전체적으로, 전형적인 게놈은 비동의 변이체를 갖는 10,000 내지 12,000개의 부위 및 190 내지 210개의 프레임내 삽입/결실을 포함한다 (문헌 [Abecasis 등, 2010; Auton 등, 2015]). 이들 변이체는 HLA 유전자좌와 같은 고도 다형성 유전자로서 게놈 전체에 균등하게 분포되지 않거나 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html), 또는 특정 G-단백질-결합 수용체 (GPCR) 유전자 (문헌 [Lee 등, 2003; Rana 등, 2001])는 별개의 변이체 '핫스팟 (hotspot)'을 생성한다. LOH-관련 핫스팟의 또 다른 층은 상이한 암에서의 특정 염색체 또는 염색체 아암의 빈번한 상실 (예를 들어, 소세포 폐 암종에서 3p 및 17p (문헌 [Lindblad-Toh 등, 2000]), 결장직장암에서 17p 및 18q (문헌 [Vogelstein 등, 1989]), 유방암에서 17q 및 19 (문헌 [Li 등, 2014; Wang 등, 2004)], 흑색종에서 9p (문헌 [Stark and Hayward, 2007]), 교모세포종에서 10q (문헌 [Ohgaki 등, 2004]) 등)로 인한 것이다.
표면 단백질의 대립유전자 변이의 상당 부분은 각각의 유전자 생성물의 세포외 부분에 영향을 미쳐서, 원칙적으로 고특이적 mAb에 의해 다른 변이체로부터 구별되고 인식될 수 있는 별개의 대립유전자-제한된 에피토프를 잠재적으로 생성할 수 있다. 단일 아미노산에 있어서만 상이한 동일한 단백질의 2개의 변이체를 구별하는 mAb가 단리될 수 있다는 점은 잘 증명되어 있다 (예를 들어, 정교한 특이성을 갖는 Ras 종양 유전자의 점돌연변이 생성물을 인식하는 mAb의 초기 예 참조 (문헌 [Carney 등, 1986])). 흥미롭게도, 단백질 에피토프에서의 단일 아미노산 교환에 특이적인 2개의 mAb는 이들의 중쇄 및 경쇄 V 유전자 풀과는 구조적으로 다른 가변 영역을 사용할 수 있다는 것이 입증되었다 (문헌 [Stark and Caton, 1991]). 최근 Skora 등 (문헌 [Skora 등, 2015])은 돌연변이된 KRAS와 EGFR 단백질에서 유래한 HLA-I-결합 네오펩티드와 이들의 야생형 대응물을 구별할 수 있는 펩티드-특이적 scFv의 단리를 보고하였다.
종합하면, 종양 세포의 고유한 항원성 시그니처가 출현하며, 이는 개별 환자의 신체 전체에 존재하는 다른 모든 세포와 이들의 명백한 구별을 가능하게 한다. 이는, LOH로 인해 종양 세포 표면에는 존재하지 않지만 암 기원 조직의 정상 세포 또는 이들 유전자를 발현하는 다른 조직에는 존재하는 대립유전자 변이체에 의해 암호화되는 모든 막횡단 단백질을 포함한다. 당연히, LOH에 의해 영향을 받는 각각의 유전자는 진짜 하우스키핑 유전자를 제외하고는 뚜렷한 패턴의 조직 분포를 특징으로 한다. 이들 유전자의 대부분은 형질전환된 표현형의 종양 형성 또는 유지에 직접 관여할 것으로 예측되지 않으며, 이러한 의미에서, 이들의 상실은 '패신저 (passenger)' 성질을 갖는다.
상기에 제시된 이론적 근거는, 고유한 분자 묘사는 거의 모든 종양에 대해 필연적으로 LOH에 의해 형성되며, 이는 정상 세포에 존재하는 수많은 다형성 표면 구조의 부재에 의해 나타남을 입증한다. 개별 종양의 이러한 추정된 시그니처를 항원성 에피토프의 표적화가능한 세트로 전환시키는 것은 특정 '부재 (absence)'에 대한 인식을 표적 세포 살해를 유발할 수 있는 활성화 신호로 번역하기 위한 실행가능한 면역학적 전략을 수반한다. 중요하게는, 표적-상 종양-외 반응성을 엄격히 피할 수 있도록 안전 장치를 포함하는 것이 이 전략의 향후 임상 구현에 있어 매우 유리하다
본 발명은 단일 유전자 쌍의 각각의 치료용 살해 세포에서의 공동 발현을 통해 이러한 도전 과제에 대처한다. 이 쌍의 한 파트너는 활성화 CAR (aCAR)을 암호화하고 다른 파트너는 보호 CAR (pCAR) 또는 억제성 CAR (iCAR)을 암호화한다.
II. 정의 선택
본원에서, 용어 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다.
용어 "암호화"는 뉴클레오티드의 정의된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 정의된 서열 및 그로부터 초래된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 공정에서의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서의 뉴클레오티드의 특이적 서열의 선천적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 상기 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비암호화 가닥 둘 모두가 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전 (degenerate version)이며 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내에서 생산되거나 이들로부터 유래한 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부에서 생산되거나 이들로부터 유래한 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서, 용어 "발현"은 그의 프로모터에 의해 구동된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소 (cis-acting element)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해서 또는 시험관내 발현 시스템 내에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당업계에 공지된 모든 것들, 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 노출되거나 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본원에서, 용어 "게놈 변이체"는 동일한 게놈 위치에서 기준 또는 공통 서열과 비교하여 시퀀싱된 샘플에서의 게놈 수준에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변화를 지칭한다.
변이체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "상응하는 기준 대립유전자"는 변이체와 동일한 게놈 위치에서의 기준 또는 공통 서열 또는 뉴클레오티드를 의미한다.
단백질과 관련하여 본원에 사용된 용어 "세포외 도메인"은 세포막 외부에 위치한 단백질의 영역을 의미한다.
본원에서, 용어 "이형접합성 상실" 또는 "LOH"는 체세포의 2개의 염색체의 한 카피에서의 염색체 물질, 예를 들어 완전한 염색체 또는 그의 일부의 상실을 의미한다.
변이체 또는 기준 대립유전자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "서열 영역"은 변이체의 위치의 상류에서 시작하여 그의 하류에서 끝나는 서열을 의미하며, 이는 항체에 의해 인식될 수 있는 "에피토프 펩티드"로 번역될 수 있다.
본원에서, 용어 "CAR"은 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포로부터의 세포 면역-기능 수용체 또는 어댑터 분자와 구조적 및 기능적 특성을 공유하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. CAR은 TCAR 및 NKR-CAR을 포함한다. 동족 항원에 결합시, CAR은 그것이 배치된 세포독성 세포를 활성화 또는 비활성화하거나, 또는 세포의 항종양 활성을 조절하거나, 또는 그렇지 않으면, 세포 면역 반응을 조절할 수 있다.
다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인, 예를 들어 scFv와 관련하여 본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 하나의 대립유전자 변이체에 대한 상기 scFv의 상대적 결합, 및 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상응하는 상이한 대립유전자 변이체에는 상기 scFv가 결합하지 못함을 지칭한다. 이는 결합성 (T 세포 상의 CAR 카피 수, 표적 세포 (또는 보호될 세포) 표면 상의 항원 분자의 수 및 사용된 특정 CAR의 친화도)에 의존하기 때문에, 기능적 정의는, 상기 특정 scFv가 이에 대해 특이적인 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 대해 ELISA에서 현저한 신호를 제공하거나, scFv를 나타내는 CAR로 형질감염된 세포가 FACS 분석에서 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체로 명확히 표지되는 반면, 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상응하는 상이한 대립유전자 변이체를 사용하는 동일한 분석은 검출가능한 신호를 제공하지 않는다는 것이다.
본원에서, 용어 "치료하는"은 목적하는 생리학적 효과를 달성하는 수단을 지칭한다. 상기 효과는 질환 및/또는 상기 질환에 기인한 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유하는 관점에서 치료적일 수 있다. 상기 용어는 질환을 억제하는 것, 예를 들어 그의 진행을 정지시키는 것; 또는 질환을 개선하는 것, 예를 들어 질환의 퇴행을 유발하는 것을 지칭한다.
본원에서, 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예를 들어 인간을 지칭한다.
문구 "안전한 효과기 면역 세포" 또는 "안전한 효과기 세포"는 본원에 기술된 적어도 하나의 iCAR 또는 pCAR을 발현하는 본 발명에 의해 기술된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 "안전한 효과기 면역 세포" 또는 "안전한 효과기 세포"는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 "안전한 효과기 면역 세포" 또는 "안전한 효과기 세포"는 본원에 기술된 aCAR을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 "안전한 효과기 면역 세포" 또는 "안전한 효과기 세포"는 본원에 기술된 iCAR 또는 pCAR을 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 "안전한 효과기 면역 세포" 또는 "안전한 효과기 세포"는 본원에 기술된 iCAR 또는 pCAR 및 본원에 기술된 aCAR을 추가로 발현한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 상기 담체(들)는 상기 조성물의 다른 성분들과 상용성이고 수용체에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다.
문구 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기술된 화합물, 제제, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다.
담체, 투여 방식, 제형 등에 대한 하기 예시는 상기 담체, 투여 방식, 제형 등이 본 발명에 사용되기 위해 선택될 수 있는 공지된 가능성으로서 열거된다. 그러나, 당업자는 선택된 임의의 특정 제제 및 투여 방식이 목적하는 결과를 달성하는지를 측정하기 위해서는 먼저 그것이 시험되어야 한다는 것을 이해할 것이다.
투여 방법은 비경구, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 점막 (예를 들어, 경구, 비강내, 협측, 질, 직장, 안구내), 척추강내, 국소 및 피내 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구 투여에 적합하다.
용어 "담체"는 활성제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 상기 약학적 조성물 내의 담체는 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 (폴리비돈 또는 포비돈), 검 트래거캔스, 젤라틴, 전분, 락토스 또는 락토스 일수화물; 붕해제, 예를 들어 알긴산, 옥수수 전분 등; 윤활제 또는 계면 활성제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또는 라우릴 황산나트륨; 및 활택제, 예를 들어 콜로이드성 이산화규소를 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)"는 림프구, 단핵구 또는 대식세포와 같은 둥근 핵을 갖는 임의의 혈액 세포를 지칭한다. 혈액으로부터 PBMC를 단리하는 방법은 당업자에게 명백하다. 비제한적인 예는, 단핵구 및 림프구가 혈장 층 아래에서 연막을 형성시키면서 혈액 층을 분리하는 친수성 다당류인 피콜을 사용하거나, 또는 적혈구 및 백혈구-부족 혈장을 공여자에게 돌려주면서 백혈구 농축액을 제조하는 방법인 백혈구분반술 (leukapheresis)에 의해, 전혈로부터 이들 세포를 추출하는 것이다.
본원에서, 용어 "암"은 비정상 세포의 신속하고 비제어된 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 신경교종 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
III. CAR-T 시스템: iCAR, pCAR 및 aCAR
본 발명은 정상 세포를 안전하게 유지하면서 종양 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 새로운 방안을 제공한다는 것이 강조되어야 한다. 본원에 제시된 개념은 iCAR (또는 pCAR 또는 보호 CAR)에 대한 새로운 표적의 식별을 제공하며, 이들 표적은, 정상 조직에서는 발현이 유지되면서 종양 세포가 존재하는 염색체 영역의 LOH로 인해 종양 세포로부터는 상실되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 포함하는 것으로 정의된다. 상기 다형성 변이로 인해, 2개의 대립유전자를 구별하고 종양 세포에 결손된 대립유전자만을 표적화하는 것이 가능하다. 또한, 표적 항원 자체가 반드시 종양 억제 유전자, 또는 암과 관련될 것으로 예측되는 유전자일 필요는 없는데, 이는, 그것은 LOH에 의해 상실된 영역에 존재하도록 선택되며 따라서 이러한 유전자에 간단히 연결될 수 있기 때문이다. 이는, 다형성에 관계없이 종양에서 하향조절되는 항원 또는 종양 관련 항원을 표적화하는, 암 요법에서 지금까지 사용되거나 제안된 방법과 개념적으로 상이하다. 본 방법은 또한 본원에 기술된 iCAR 및/또는 pCAR의 공동 발현을 통해 정상 세포의 보호를 제공함으로써, 종양 관련 항원을 넘어선 aCAR의 선택의 확장을 제공한다.
게놈 사건인 LOH는 종양으로부터의 특정 변이체의 완전한 상실을 초래하며, 상실된 대립유전자를 다시 획득할 확률은 매우 드물기 때문에, 상기 구별이 중요하다. LOH 사건이 종양의 발달에서 매우 일찍 발생하는 경우, 이는 전이성 종양을 비롯한 초기 전암 조직으로부터 유래한 모든 종양 세포에서 균일한 표적 시그니처를 보장한다. 또한, LOH는 거의 모든 유형의 암에서 발생하므로, 이 개념은 이러한 모든 암 유형과 관련된 마커를 개발하기 위한 보편적인 도구로 사용될 수 있다. LOH 사건은 어느 정도 무작위적이므로, 본 발명은 환자에서 발생한 특정 LOH 사건에 기초하여 각각의 개별 암 환자에 대한 개인화된 종양 마커의 선택을 추가로 제공한다. 이러한 개념, 즉 상기 aCAR 및 상기 iCAR을 실행하기 위해 사용된 도구는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 WO 2015/142314 및 US 9,745,368에 교시된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있으며, 상기 두 문헌은 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함된다.
한 전략에 따르면, 모든 특정 쌍에서의 2개의 CAR은 환자가 이형접합성인 동일한 표적 유전자의 상이한 대립유전자 변이체의 생성물을 특이적으로 인식한다. 기본 원리는 다음과 같다: 상기 aCAR은, 특정 종양 세포에 의해 발현되고 LOH에 의해 영향을 받지 않는 선택된 세포 표면 단백질의 대립유전자 변이체를 표적화하는 반면, 상기 pCAR 또는 iCAR은 LOH로 인해 이 종양 세포에서 상실된 동일한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 암호화되는 생성물을 표적화한다. 상기 유전자를 발현하는 개별 환자의 기타 정상 조직에는, 두 대립유전자가 존재하고 동등하게 기능하는 것으로 알려져 있으며, 즉, (무작위적인 단일대립유전자 발현을 나타낼 수 있는 다른 유전자와 달리) 발현이 모든 조직에서 이중대립유전자성이다 (문헌 [Chess, 2012; Savova 등, 2016]). 하나의 시나리오에서, 상기 2개의 CAR은 단백질 생성물 상의 동일한 위치에 존재하는, 하나 또는 오직 소수의 아미노산만이 상이한, 2개의 관련 에피토프를 표적화한다. 다른 시나리오에서, 상기 aCAR은 동일한 단백질 상의 비다형성 에피토프를 표적화하는 반면, 상기 pCAR 또는 iCAR은 대립유전자-특이적이다. 이 경우, 정상 세포에서의 aCAR 에피토프의 밀도는 일반적으로 iCAR 또는 pCAR 에피토프의 밀도보다 2배 높을 것이다. 일부 구현예에서, 단일 핵산 벡터는 상기 aCAR 및 iCAR 또는 pCAR 모두를 암호화한다.
다른 전략에서, 상기 pCAR 또는 iCAR은 하우스키핑 유전자의 단백질 생성물을 표적화한다. 정의상, 이들 유전자는 신체의 모든 세포에서 발현되므로, 이들은 pCAR 또는 iCAR에 대한 안전한 표적이다. 즉, 상기 pCAR 또는 iCAR이 특정 환자가 이형접합성인 하우스키핑 유전자의 막 생성물을 표적화하는 경우, LOH로 인해 이 대립유전자를 상실한 종양 세포를 제외한 신체의 모든 세포가 보호된다. 이 전략은 pCAR 또는 iCAR 표적 유전자 생성물로부터의 aCAR 표적 유전자 생성물의 분리 (uncoupling)을 가능하게 한다. 실제로, 이 경우 상기 aCAR 표적은 종양에 의해 발현되는 임의의 비다형성 에피토프일 수 있다. 이 전략의 변형은 비다형성 종양-관련 항원, 예를 들어 임상적으로 사용 중이거나 임상 시험에서 시험 중인 aCAR을 표적화하는 공지된 aCAR을, 특정 환자가 이형접합성이고 적어도 종양의 기원 조직에서, 바람직하게는 aCAR 표적 항원이 발현되는 추가적인 중요한 정상 조직에서 발현되는 유전자의 막 생성물에 대해 지시된 iCAR 또는 pCAR와 조합하여 사용한다.
iCAR/pCAR표적 항원으로부터 aCAR 표적 항원의 분리를 가능하게 하는 동일한 이론적 근거에 따라, iCAR/pCAR표적 항원은 반드시 하우스키핑 유전자의 생성물일 필요는 없다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR은 종양 이외에 상기 aCAR 표적 항원을 발현하는 필수적인 정상 조직을 보호할만큼 발현 패턴이 충분히 넓은 임의의 유전자의 생성물이다. 결론적으로, aCAR 항원은, 하우스키핑 유전자에 대해 논의된 바와 같이, 공지된 '종양-관련 항원'에 국한되지 않는, 종양에 의해 발현되는 임의의 비다형성 에피토프일 수 있으며, 이에 대한 고려는 후보 aCAR의 목록을 크게 확장시킬 수 있다. 일반적으로, 하우스키핑 및 비-하우스키핑 유전자 모두에 대해, 이러한 정상적인 필수적인 조직의 정체성 및 발현 수준은 aCAR가 표적화하는 이러한 후보의 우선 순위 결정에서 중요한 기준으로 작용할 것이다.
상기 iCAR에 의해 전송된 억제 신호가 aCAR 신호에 대비해 엄격하고 영구적으로 우세하도록 하며, 상기 iCAR과 상기 aCAR간에 교차 인식이 발생하지 않도록 주의해야 한다. 상기 iCAR의 우세는 두 대립유전자 모두를 발현하는 정상 세포와의 접촉시 살해 세포의 활성화가 방지될 것을 보장한다. 그러나, 이 기본 브레이크는 종양 세포와의 결합시 작동하지 않을 것이다: 표적 항원의 부재시, 상기 iCAR은 억제 신호를 전달하지 않을 것이며, 이는 예측되는 aCAR-매개 세포 활성화 및 후속 종양 세포 용해를 촉발시킨다.
iCAR 기술은 면역 체크포인트를 기반으로 할 수 있다. 이와 관련하여, PD-1 및 CTLA-4의 조절 요소는, iCAR 신호전달 성분으로서 포함되는 경우, 강력한 T 세포 억제 능력을 갖는다는 입증 (문헌 [Fedorov 등, 2013b; WO 2015/142314])이 유망하나, 이러한 관찰의 보편성에 대해 최근 의문이 제기되었다 (문헌 [Chicaybam and Bonamino, 2014, 2015]). 또한, 이들 체크포인트 단백질에 의해 유발된 정확한 분자 경로는 완전히 이해되지는 않았지만, 이들의 관여는 근위 및 원위 메커니즘을 통해 T-세포 활성화를 약화시켜, T 세포를 수반되는 활성화 자극에 반응하지 않도록 만든다 (문헌 [Nirschl and Drake, 2013]). 따라서, PD-1 및 CTLA-4 iCAR에 의해 확보된 불활성화 상태는 실제로 일시적이고 가역적이지만 (문헌 [Fedorov 등, 2013b]), iCAR 및 aCAR 표적 둘 모두를 발현하는 조직에서 T 세포 활성화를 허용하지 않을 것이다. 대조적으로, 활성화 수용체에 대비한 NK 억제성 수용체의 우세는 건강한 세포가 일시적인 메커니즘보다는 공간적 메커니즘을 통해 NK 세포 공격으로부터 보호된다는 것을 확인시켜 준다. (문헌 [Long 등, 2013]). 단일 NK 세포는 억제성 및 활성화 리간드 둘 모두를 발현하는 저항성 세포를 살리면서도, 이것이 동시에 결합하는 활성화 리간드만을 발현하는 민감 세포를 살해할 수 있다는 설득력 있는 증거가 존재한다. 이러한 정교한 능력은, 결과적으로 세포용해 과립의 세포외배출에 영향을 미치는 각각의 면역 시냅스에서 형성된 신호전달 분자의 상이한 공간적 조직에 의해 통제된다 (예를 들어, 문헌 [Abeyweera 등, 2011; Eriksson 등, 1999; Treanor 등, 2006; Vyas 등, 2001; US 9,745,368]).
iCAR에 의해 확고해지는 제어에 기초한 전략은 위에서 설명한 바와 같이 aCAR 활성에 대비한 iCAR 활성의 우세에 의존한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이러한 유형의 iCAR을 제공하며, 이는 본원에서 pCAR (보호 CAR에 대해, 도 2 참조)로 지칭되며, 이는 시냅스-선택적 방식으로 CAR T 세포에서 작동하며 공동 발현된 aCAR에 대비한 완전한 우세를 보장하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 iCAR은 본원에서 보호 CAR (pCAR)로 지칭되는 이러한 특정 유형의 iCAR이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 pCAR은 2개의 기술적 특징을 통합한다. 먼저, 상기 pCAR은, 이들을 2개의 상이한 폴리펩티드 생성물에 유전적으로 배치함으로써, 인식 단위 및 공동자극 요소 (예를 들어, CD28, 4-1BB, CD134 (OX40, GITR, IL2Rβ 및 STAT3 결합 모티프 (YXXQ))로부터의 상기 aCAR의 활성화 모이어티 (FcRγ/CD3-ζ)의 분리를 가능하게 한다. aCAR 기능에 필수적인, 이들 요소의 재결합은 각각의 폴리펩티드에 개별적으로 포함된 각각의 결합 부위를 연결할 수 있는 이종이량체화 약물의 첨가에 의해서만 발생한다 (도 2b). 유사하게 분할된 인식 및 활성화 모이어티를 이종이량체화 약물에 의해 연결하는 것에 의한 완전히 기능적인 CAR의 재구성이 최근 Wu 등 (문헌 [Wu 등, 2015])에 의해 보고되었다. 이러한 목적을 위해, 이들 저자는 라파마이신 유사체 AP21967 (하기 화학식 I)의 존재하에 이종이량체화되는 FKBP-라파마이신 결합 도메인 (FRB, 89개 아미노산)의 T2089L 돌연변이체 및 FK506 결합 단백질 도메인 (FKBP, 104개 아미노산)을 사용하였다. 이 약물은 라파마이신과 비교하여 1000배 적은 면역억제 활성을 가지며 (문헌 [Bayle 등, 2006; Graef 등, 1997; Liberles 등, 1997]) 상업적으로 입수가능하다 (ARGENTTM, Regulated Heterodimerization Kit, ARIAD). 일부 구현예에서, 상기 약물은 경구 투여된다.
화학식 I. AP21967의 구조
Figure pct00003
둘째로, 2개의 막내 절단 부위를 포함하는 RIP-제어된 수용체의 막횡단 도메인의 2개의 표면에 pCAR 인식 단위 및 결손 활성화 도메인을 각각 이식한다 (도 2a). 상기 pCAR의 그의 항원에 대한 결합은 먼저 엑토도메인을 제거하는 세포외 디스인테그린 및 금속단백분해효소 (ADAM) 패밀리의 구성원, 및 이후, 상기 pCAR의 세포내 도메인을 유리시키는 세포내 γ-세크레타제에 의한 암호화된 폴리펩티드의 이중 절단을 유발한다. 이 제1 절단 사건은, 절단된 aCAR이 그의 결손 활성화 요소의 기능적이고 막-고정된 구성에 접근하는 능력을 방해하여, 작동 모드를 획득할 것으로 예측된다 (도 2c). 이 원리는 최근에, RIP를 통해 기능하는 잘 연구된 2개의 수용체인 노치 수용체 (문헌 [Morsut 등, 2016; Roybal 등, 2016b]) 또는 상피 세포 부착 분자 (EpCAM, Pizem, Y., M.Sc. 본 발명자 감독하의 논문)를 적용한, CAR T 세포 활성을 종양 세포 상의 2개의 상이한 항원의 동시 인식으로 제한하도록 설계된 새로운 유전자 스위치의 개발에 이용되었다. 이들 연구에서, 하나의 항원에 대한 RIP-기반 CAR의 결합은 유전자적으로-조작된 세포내 도메인을 방출하며, 이는 세포핵으로 이동하며, 이 곳에서 이는 제2 CAR의 발현을 촉발한다. 본 발명과 달리, 이는 보호 항원의 존재하에 임의의 잠재적인 aCAR 활성을 해제하기 위해서만 이 공정을 이용한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 절단 사건은, 절단된 aCAR이 그의 결손 활성화 요소의 기능적이고 막-고정된 구성에 접근하는 능력을 방해하여, 작동 모드를 획득한다.
전술된 제안된 작용 방식은 동일한 시냅스에 존재하는 aCAR만이 영향을 받고 더 이상 이들의 항원에 생산적으로 결합하여 면역학적 시냅스를 형성할 수 없도록 국소 효과를 발휘할 것으로 예측된다. 결과적으로, 다수의 비종양 세포와 상기 aCAR의 다중 상호작용이 일어날 가능성이 있는 경우에도, 이들은 세포가 추가 상호작용을 완전히 수행할 수 있도록 단지 일시적이고 비기능성일 것으로 예측된다.
상기 pCAR의 이들의 aCAR 대응물에 대비한 우세는 이 시스템에 내재되어 있는데, 이는 상기 aCAR의 기능이 상기 pCAR의 존재에 전적으로 의존하기 때문이다. 특정 T 세포에서의 pCAR의 상대적 부족은 활성화 도메인의 부족으로 인해 상기 aCAR을 비기능성으로 만들 것이다. 일부 구현예에서, 특정 T 세포에서의 pCAR의 부족은 활성화 도메인의 부족으로 인해 상기 aCAR을 비기능성으로 만든다.
인식 도메인 및 활성화 도메인 둘 모두가 원형질 막에 국한되는 것이 중요하다 (문헌 [Wu 등, 2015]). 따라서, 활성화 도메인을 원형질 막으로부터 분리시키는 제2 절단은 이 도메인을 비기능성으로 만들고 원치않는 세포 활성화를 방지할 것이다. 일부 구현예에서, 인식 도메인 및 활성화 도메인이 원형질 막에 국한되는 것이 중요하다. 일부 구현예에서, 상기 제2 절단은 활성화 도메인을 원형질 막으로부터 분리시키고, 이 도메인을 비기능성으로 만들고, 원치않는 세포 활성화를 방지한다.
상기 aCAR 및 pCAR은 상호 배타적인 메커니즘을 통해 기능하도록 설계된다. 상기 pCAR가 절단을 거치는 능력은 억제 신호전달의 강도에 의존하지 않으므로 신호전달 결과에 대한 완료가 발생하지 않는다. 상기 pCAR이 절단되는 한, 상기 aCAR은, 이들과 이들의 각각의 항원의 상호작용의 상대적인 결합력에 관계없이, 기능할 수 없으며, 이는 또 다른 중요한 수준의 안전성을 확보하는 시나리오이다.
일부 구현예에서, 상기 포유류 조직은 인간 조직이고, 다른 구현예에서 상기 관련 포유류 정상 조직은 종양이 발생한 정상 조직이다.
일부 구현예에서, 상기 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포 또는 사이토카인-유도 살해 세포이다.
일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 억제할 수 있는 적어도 하나의 신호전달 요소는 면역 체크포인트 단백질, 예를 들어 PD1; CTLA4; BTLA; 2B4; CD160; CEACAM, 예를 들어 CEACAM1; KIRs, 예를 들어 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 및 CD94-NKG2A; LAG3; TIM3; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA); 인터페론 유전자의 자극기 (STING); 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)-함유 단백질, T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인 (TIGIT), 및 아데노신 수용체 (예를 들어, A2aR)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질의 신호전달 요소와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 단백질은 음성 면역 조절인자이다. 일부 구현예에서, 상기 음성 면역 조절인자는 2B4, LAG-3 및 BTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 단백질은 자연 살해 세포 억제성 수용체, 예를 들어 KIR, 예를 들어 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3; 또는 백혈구 Ig-유사 수용체, 예를 들어 LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8; 및 CD94와 이종이량체를 형성하고 2개의 ITIM을 포함하는 C형 렉틴 수용체인 CD94-NKG2A이다.
iCAR에서 살해 세포 수용체를 제조 및 사용하는 방법은 US 9,745,368에 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 어느 하나의 세포외 도메인은 가요성 힌지 및 막횡단 표준적 모티프를 통해 상기 세포내 도메인에 융합된다.
i. 표적 식별: aCAR, iCAR 및 pCAR
본 발명은 세포외 다형성 에피토프를 갖는 후보 유전자의 식별에 기반한 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR 표적을 식별하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 종양 조직에 발현되는 임의의 세포외 단백질에 대해 지시될 수 있다. 일부 구현예에서, aCAR 표적은 비종양 조직에서 추가로 발현되고, 상기 iCAR 표적 또한 비종양 조직에서는 발현되지만 종양 조직에서는 발현되지 않는다.
일부 구현예에서, 후보 유전자를 식별하는 상기 방법은 먼저 유전자가 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 막횡단 단백질을 암호화하는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 후보 유전자를 식별하는 상기 방법은 유전자가 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 갖는지를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 대립유전자는 적어도 하나의 대립유전자 변이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 대립유전자 변이는 예를 들어, 하나 이상의 SNP의 존재, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자에 대해 발견된 상기 대립유전자 변이는 단백질의 세포외 영역에서 기준 서열에 대비한 아미노산 변화를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자는 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 염색체 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자는 암에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 염색체 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자는 상응하는 영역이 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 종양 유형의 기원 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 유전자는 적어도, 상기 aCAR이 발현되는 하나 이상의 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR 표적은 상기 aCAR이 발현되는 필수적인 기관 세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프를 갖는 유전자의 식별에 기초하여 선택되고, 여기서 상기 유전자는 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 이형접합성 상실을 겪는 염색체 영역에 위치한 유전자의 식별에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 암에서 이형접합성 상실을 겪는 염색체 영역에 위치한 유전자의 식별에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 이론적 SNP에 대한 점수가 계산되고 허용 한계가 결정된다. 예를 들어, SNP의 32%만이 염색체에 종양 억제 유전자를 가진 경우, 이를 갖는 것에 대한 백분위 점수는 0.68일 것이다. 또한, 예를 들어, 대립유전자가 0.49의 부수적 대립유전자 분율 (여기서 0.5가 가능한 최고 값임)을 갖는 경우, 백분위 점수는 0.99일 것이다. LOH의 비율이 0.10이고 SNP의 75%가 이보다 많은 LOH를 가진 경우, 백분위 점수는 0.25일 것이다. 이 SNP를 보유하는 유전자에 대해 중간값에 대한 조직 전체에 걸친 발현 값의 표준 편차의 비가 1.3이고, 이것이 다른 유전자의 90%보다 우수한 경우, 백분위 점수는 0.9이다. 이 경우 이 SNP의 총점은 0.68*0.99*0.25*0.9=0.15일 것이다. 일부 구현예에서, 이 LOH 후보 점수는 후보 유전자가 적합한 iCAR 또는 pCAR 표적인지를 결정하는 하나의 방법으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표적은 이 LOH 점수에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 후보 유전자는 iCAR 또는 pCAR 표적으로 적합한 것으로 결정된다. 0.4 초과의 LOH 후보 점수에 기초한 LOH 후보.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프를 갖는 유전자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 표적은 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 22번 염색체, 또는 X 염색체에 위치한 유전자이다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 1번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 2번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 3번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 4번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 5번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 6번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 6번 염색체에 위치하며, HLA 표적을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G이다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 HLA-A2이다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 7번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 8번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 9번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 10번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 11번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 12번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 13번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 14번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 15번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 16번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 17번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 18번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 19번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 20번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 21번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 22번 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 X 염색체에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 표적은 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 암을 치료하는데 사용되는 aCAR은, 표적화된 단백질이 발현되는 모든 정상 조직에서 상기 iCAR이 발현되는 한, 종양 조직에서 발현되는 임의의 막 단백질에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은, 본원에 열거된 기준에 따라, 종양 관련 단백질, 종양 관련 항원 및/또는 임상 시험 중의 항원, 표 1에 열거된 CAR 표적뿐만 아니라 표적 결합과 관련하여 iCAR이 매칭되거나 짝을 이룰 수 있는 종양 조직에서 발현되는 임의의 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하거나, 또는 이에 대해 지시될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR이 상기 aCAR과 동일한 조직 또는 임의의 필수적인 조직에서는 발현되지만 종양 세포에서는 상실되는 한, 상기 aCAR은 세포외 도메인을 갖는 임의의 발현된 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암을 치료하는데 사용되는 aCAR, 예를 들어 상기 언급된 암 유형 중 어느 하나는 CD19와 같은 표 1에 열거된 항원으로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다. 일부 구현예에서, 상기 암을 치료하는데 사용되는 aCAR은 다음의 항원 목록으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다: CD19, CD20, CD22,CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX Igκ, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34,CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2,GD3,hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-α, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Rα2, FAP, 메소텔린, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80 CD89, CDH17,CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1 WT-1 및 EGFR. 일부 구현예에서, 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR 표적은 표 1에 열거된 항원이다.
Figure pct00004
Figure pct00005
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ii. 인식 모이어티: aCAR, iCAR 및 pCAR
본 발명은 또한 상기 표적에 대한 특이적인 결합을 제공하도록 설계된 인식 모이어티를 제공한다. 상기 인식 모이어티는 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR의 특이적이고 표적화된 결합을 지시할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 상기 표적에 대한 특이적인 결합을 제공하도록 설계된 인식 모이어티는 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이적 결합을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 인식 모이어티는 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인의 일부이다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 항체, 그의 유도체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체; 인간 항체; 항체의 기능적 단편; 나노바디 (nanobody)와 같은 단일-도메인 항체; 재조합 항체; 및 단일쇄 가변 단편 (ScFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 항체 모방 체, 예를 들어 어피바디 (affibody) 분자; 아필린 (affilin); 아피머 (affimer); 아피틴 (affitin); 알파바디 (alphabody); 안티칼린 (anticalin); 아비머 (avimer); 다르핀 (DARPin); 피노머 (fynomer); 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 펩티드; 및 모노바디 (monobody)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 앱타머를 포함한다.
일반적으로, 임의의 관련 기술이, 상기 aCAR 및 pCAR 또는 iCAR의 이들의 표적에 대한 특이적인 결합을 부여하는 인식 모이어티를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 iCAR-aCAR 라이브러리를 포함하는 인식 모이어티는 조합적 디스플레이 라이브러리로부터 이상적으로 선택된 마스터 인식 모이어티 풀 (master recognition moiety pool)로부터 유래할 수 있으며, 결과적으로,
- 총체적으로, 선택된 인식 모이어티는 22개의 모든 인간 상염색체의 두 아암 각각에 존재하는 유전자 어레이의 세포-표면 생성물을 표적화한다. 이웃 유전자 간의 거리가 짧을수록 범위가 더 넓어지고, 따라서 용도의 보편성이 더 커진다.
- 선택된 유전자 각각에 대해, 대립유전자-특이적 인식 모이어티의 세트가 단리되고, 각각은 인간 집단에서 우세한 상이한 대립유전자 변이체들 간의 엄격한 구별을 가능하게 한다. 표적화된 변이체의 수가 많을수록 환자에게 제공될 수 있는 치료 유전자 쌍의 수가 많다.
특정 대립유전자 생성물은, 각각의 경우에서의 특정 LOH 패턴에 따라, 한 환자에서는 잠재적인 pCAR 또는 iCAR 표적이 될 수 있고, 동일한 대립유전자를 갖는 다른 환자에서는 유용한 aCAR 표적이 될 수 있다. 따라서, 적합한 인식 모이어티 유전자가 식별되는 경우, 각각은 pCAR 또는 iCAR 및 aCAR 유전자 스캐폴드 모두에 이식된다. 따라서, 동일한 유전자의 대립유전자 변이체에 대해 지시된 모든 인식 모이어티는 유사한 범위의 결합 친화도를 갖는 것이 바람직하다. 인식 모이어티의 이러한 특정 세트 내에서, 전체 집단에서 해당 유전자의 잠재적 대립유전자 조성의 가장 높은 범위를 보장하기 위해 pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍의 모든 가능한 조합이 사전 조립될 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는, 그 생성물이 비동의 SNP 또는 덜 빈번하게는 삽입-결실의 결과로서 암호화된 폴리펩티드를 따라 단일 위치에 있어 상이한 주요 대립유전자 및 부수적 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 일부 다른 구현예에서, 환자는 2개의 별개의 위치에서 주요 대립유전자와 상이한 2개의 부수적 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 개별 환자에서의 상기 유전자를 수반하는 특정 LOH 사건에 따라, 특정 변이체 에피토프는 한 환자에서 iCAR 표적으로 작용하고 다른 환자에서는 aCAR 표적으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, iCAR 표적으로 작용할 수 있는 변이체 에피토프는 주요 대립유전자 변이체가 아니다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 표적으로 작용할 수 있는 변이체 에피토프는 부수적 대립유전자이다.
변이체-특이적 mAb의 식별 (즉, 부수적 대립유전자 'a'에 의해 암호화되는 에피토프에 특이적인 mAb)은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 원칙적으로, 임의의 통상적인 항원 결정기에 대한 mAb의 식별과 유사하며, 일반적으로, 예를 들어 파지 (문헌 [Barbas 등, 2004]), 리보솜 (문헌 [Hanes 등, 1997]) 또는 효모 (문헌 [Chao 등, 2006]) 디스플레이 기술을 이용하여 재조합 항체 scFv 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 통해 가장 잘 달성될 수 있다. 라이브러리 스크리닝에 사용되는 항원은, 2개의 대립유전자 사이에 변이 위치를 포괄하는 합성 펩티드(전형적으로 15-20개 아미노산 길이 또는 그 이상), 상업적으로 입수가능하거나 이 분야에서 사업하는 많은 회사 중 하나에 의해 맞춤 합성될 수 있는 재조합 전장 폴리펩티드, 또는 심지어, 이 대립유전자를 발현하지 않는 동일한 세포에서 수행된 추출 단계 후에 수행된 유전자 형질감염 (예를 들어, pGEM4Z/A64 벡터에서 시험관내 mRNA 전사를 위한 주형으로서 클로닝된 전장 cDNA를 암호화하는 mRNA의 전기천공 (문헌 [Boczkowski 등, 2000]))에 의해 높은 수준으로 상기 대립유전자 변이체를 발현하는 전체 세포일 수 있다. 이들 방법은 널지 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Second Edition), Edited by Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow 및 David Lane, 1999 CSH laboratory press]에 기술되어 있다.
정의상, 주요 대립유전자 ('A')에 의해 암호화되는 상응하는 에피토프 (동일한 위치)는 단일 아미노산 (SNP)의 정체성 또는 길이 (삽입-결실; 예를 들어 삽입 또는 결실)에 있어 'a'에 의해 생성된 것과 상이한 고유한 항원 결정기를 생성한다. 이 결정기는, 원칙적으로, 동일한 또는 기타 항체 디스플레이 스크리닝 기술에 의해 식별된 상이한 mAb 세트에 의해 인식될 수 있다. 식별된 mAb의 두 세트 각각의 별개의 구성원이 두 에피토프 또는 변이체를 구별하는 능력, 예를 들어, 제1 세트의 항체는 대립유전자 'a'의 생성물에 결합하지만 'A'의 생성물에는 결합하지 않고, 제2 세트의 Ab는 'A'와 상호간에 결합하지만 'a'에 결합하지 않는 것은, ELISA 또는 유세포 분석 (문헌 [Skora 등, 2015]) 또는 세포 염색을 위한 기타 기술과 같은 통상적인 결합 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 대안적으로, 'A'에 결합하지 않는 'a'-결합 Ab가 식별되고 그의 단백질 서열이 확인되고 나면, 잠재적으로 계산 방법을 사용하여 'A'에 결합하지만'a'에는 결합하지 않는 '상보적인' 항체 scFv의 서열을 예측할 수 있다. 이러한 계산 방법에 대해서는 예를 들어 문헌 [Sela-Culang 등, 2015a,b]를 참조한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 표적 유전자로서의 HLA-클래스 I 유전자좌 유전자 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C와 관련하여, 이용가능한 다수의 대립유전자-특이적 단일클론 항체가 존재하며, 실시예 3에 열거된 항체를 예로 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 인식 모이어티의 생성에 사용하기 위한 표적은 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표적은 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 22번 염색체, 또는 X 염색체에 위치한 유전자의 생성물이다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 1번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 1번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 2번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 2번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 3번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 3번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 4번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 4번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 5번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 5번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 6번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 6번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 7번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 7번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 8번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 8번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 9번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 9번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 10번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 10번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 11번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 11번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 12번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 12번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 13번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 13번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 14번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 14번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 15번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 15번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 16번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 16번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 17번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 17번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 18번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 18번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 19번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 19번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 20번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 20번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 21번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 21번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 22번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 22번 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 X 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 X 염색체로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
이들 항체의 가변 영역을 암호화하는 서열은 관련 하이브리도마로부터 용이하게 클로닝될 수 있고, 예를 들어, 특정 HLA 클래스-I 대립유전자 에피토프 변이체에 대한 scFv를 비롯한 임의의 목적하는 표적에 대한 scFv를 암호화하며, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Green 및 Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Antibodies: A Laboratory Manual (Second Edition), Edited by Edward A. Greenfield, 2012 CSH laboratory press; Using Antibodies, A laboratory manual by Ed Harlow 및 David Lane, 1999 CSH laboratory press]에 개시된 널리 이용가능한 도구를 사용한 CAR 구조체 내로의 혼입에 적합한 유전자를 구축하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 LOH로 인해 종양 세포에서 상실되며 세포-표면 생성물을 암호화하는 다형성 변이체의 DNA 서열을 포함하는 데이터베이스를 제공하며, 여기서 상기 DNA 서열에서의 변이는 암호화된 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열에서의 변이를 초래한다. 이 정보는, 특히 다양한 종양 유형에서의 유전자의 상대 카피 수를 추정하는데 사용될 수 있는 데이터를 제공하는 일반 대중에게 공개된 여러 데이터베이스, 예를 들어 공공 미국 국립 보건원 (National Institute of Health) TCGA 데이터 포털 (https://gdc.cancer.gov/)에서 입수가능한 TCGA 및 TCGA에 대한 cbio 포털 (http://www.cbioportal.org) (문헌 [Cerami 등, 2012, Gao 등, 2013]); 특히 다양한 집단에서의 SNP 변이체의 대립유전자 빈도를 제공하는 진유전체 통합 컨소시엄 (Exome Aggregation Consortium (ExAC)) 데이터베이스 (exac.broadinstitute.org, 문헌 [Lek 등, 2016]); 유전자에 대한 조직 발현 데이터를 포함하는 유전자형-조직 발현 (Genotype-Tissue Expression (GTEX)) 데이터베이스 v6p (dbGaP Accession phs000424.v6.p1) (https://gtexportal.org/home, Consortium GT. Human genomics, 2015); 및 단백질의 구조적 정보를 제공하는 데이터베이스, 예를 들어 인간 단백질 아틀라스 (Human Protein Atlas) (문헌 [Uhlen 등, 2015]); N-글리코실화된 세포-표면 단백질의 질량 분석 기반 데이터베이스인 세포 표면 단백질 아틀라스 (Cell Surface Protein Atlas) (문헌 [Bausch-Fluck 등, 2015]), 및 UniProt 데이터베이스 (www.uniprot.org/downloads)로부터 검색되었다.
본 발명은 LOH를 겪는 발현된 세포-표면 단백질을 암호화하는 유전자의 전장 게놈 식별 방법을 추가로 제공한다. 상기 식별된 유전자는 다음 기준을 충족해야 한다: 1) 상기 유전자는 막횡단 단백질을 암호화하며, 따라서 세포 표면에 일부가 발현되게 하여 iCAR 또는 pCAR 결합을 허용한다; 2) 상기 유전자는 (적어도 하나의 확인된 인종 집단에서의) 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 갖는다; 3) 상기 유전자에 대해 발견된 대립유전자 변이는 단백질의 세포외 영역에서 기준 서열에 대비한 아미노산 변화를 일으킨다; 4) 상기 유전자는 암에서 LOH를 겪는 염색체 영역에 위치한다; 5) 상기 유전자는 상응하는 영역이 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 종양 유형의 기원 조직에서 발현된다.
원칙적으로, iCAR 또는 pCAR 결합을 위한 표적을 암호화하기에 적합한 전술된 유전자들은 데이터베이스 마이닝 (database mining)뿐만 아니라 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, LOH의 개념은 새로운 것이 아니고, 특정 종양의 특정 유전자, 염색체 또는 게놈/염색체 영역에 대한 LOH 정보는 이미 문헌에 공개되어 있으며, 따라서 후보 유전자는 입수가능한 간행물로부터 도출될 수 있다. 대안적으로, 이러한 정보는 미소부수체 프로브와 같은 염색체 마커를 사용한 전장 게놈 혼성화 (문헌 [Medintz 등, 2000, Genome Res. 2000 Aug; 10(8): 1211-1218]) 또는 다른 적절한 방법(문헌 [Ramos and Amorim, 2015, J. Bras. Patol. Med. Lab. 51(3):198-196])에 의해 발견될 수 있다.
유사하게, 대립유전자 변이체에 관한 정보는 다양한 데이터베이스에서 공개적으로 이용가능하며, 또한 개인화된 경우에 대해 의심되는 영역의 게놈 시퀀싱에 의해 쉽게 입수될 수 있다. 또한, 단백질 구조 및 발현 패턴에 관한 정보는 전술된 바와 같이 공개적으로 이용가능하고 쉽게 접근가능하다.
따라서, 많은 유전자 및 SNP에 대한 다양한 기준에 관한 정보가 공개적으로 이용가능하고 이를 검색하는 기술이 일반적으로 공지되어 있으므로, 본원의 주된 신규성은 iCAR 또는 pCAR 인식을 위한 표적을 선택하기 위한 기준으로서 LOH를 사용하는 것, 및 특정 환자에서 상실된 특정 대립유전자를 기반으로 한 개인화된 치료의 개념이다.
비제한적인 예로서, 본 발명에 따르면 비고전적 HLA-I 및 HLA-II 유전자를 비롯한 HLA 유전자 (예를 들어, HLA-A, HLA-B HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR HLA-K 및/또는 HLA-L) LOH는, 다양한 빈도로, 많은 종양 유형에서 비교적 빈번한 사건이며 (도 10a 내지 도 10c 참조), 이는 이들 유전자를 본 발명의 목적을 위한 iCAR/pCAR 인식을 위한 표적으로서 사용되기에 적합한 후보로 만든다.
상기 pCAR 또는 iCAR 표적의 부재시 임의의 건강한 필수 조직에서의 정상 세포 상의 aCAR 표적의 인식은 해로우며 엄격히 금지될 것이다. 이와 관련하여, 본원에 제안된 pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍의 개념은 페일 세이프 활성화 스위치 (fail-safe activation switch)를 구성하는데, 이는, i) 선택된 유전자를 발현하지 않는 세포 (상기 aCAR 및 상기 pCAR 또는 iCAR 표적이 동일한 유전자의 상이한 생성물을 표적화하는 경우)가 상기 aCAR 표적 항원의 부재로 인해 표적화되지 않으며; ii) 이 동일한 유전자를 발현하는 정상 세포는 두 대립유전자 모두를 공동 발현하고 상기 pCAR 또는 iCAR의 우세로 인해 표적화되지 않으며; iii) 상기 pCAR 또는 iCAR이 다형성 하우스키핑 유전자의 생성물을 표적화하는 경우, 신체의 모든 세포가 보호되고; iv) 상기 aCAR 표적을 발현하지만 상기 pCAR 또는 iCAR 표적은 발현하지 않는 종양 세포만이 공격되기 때문이다. 일부 구현예에서, 상기 pCAR 또는 iCAR 표적 부재시 임의의 건강한 필수 조직에서의 정상 세포 상의 aCAR 표적의 인식은 해로울 것이다. 일부 구현예에서, 선택된 유전자를 발현하지 않는 세포 (상기 aCAR 및 상기 pCAR 또는 iCAR 표적이 동일한 유전자의 상이한 생성물을 표적화하는 경우)는 상기 aCAR 표적 항원의 부재로 인해 표적화되지 않는다. 일부 구현예에서, 이 동일한 유전자를 발현하는 정상 세포는 두 대립유전자 모두를 공동 발현하고 상기 pCAR 또는 iCAR의 우세로 인해 표적화되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 pCAR 또는 iCAR이 다형성 하우스키핑 유전자의 생성물을 표적화하는 경우, 신체의 모든 세포가 보호된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 표적을 발현하지만 상기 pCAR 또는 iCAR 표적은 발현하지 않는 종양 세포만이 공격된다. 일부 구현예에서, aCAR/iCAR 쌍 표적 둘 모두 또는 aCAR/pCAR 쌍 표적 둘 모두를 발현하는 세포가 보호된다.
상기에 강조한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 활성화 신호에 대비한 억제 신호의 영구적 우세가 존재해야 한다. 따라서, iCAR 파트너의 부재시, 언제든지 특정 살해 세포에서 aCAR 유전자가 발현되지 않도록 해야 한다. 이는, 단일쇄 생성물로서의 이들 iCAR-aCAR 유전자 쌍의 탠덤 어셈블리 (tandem assembly)를 통해, 또는 예를 들어 내부 리보솜 진입 부위 또는 여러 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드 중 하나에 기초한 적합한 바이시스트론 방식을 통해 구현될 수 있다. 바이시스트론 발현에 대해 보고된 방대한 양의 데이터에 의해 제안되는 바와 같이, iCAR 유전자는 유리한 화학량론을 보장하기 위해 항상 그의 aCAR 파트너의 상류에 위치한다. 다른 옵션은 살해 세포를 2개의 독립적인 구조체로 형질감염시키거나 형질도입함으로써 살해 세포가 aCAR 및 iCAR 또는 pCAR 둘 모두를 발현하도록 조작하는 것이며, 각각의 구조체는 aCAR 또는 iCAR/pCAR을 암호화한다. 물론, pCAR-aCAR 유전자 쌍을 사용하는 경우 이는 문제가 되지 않는다. 일부 구현예에서, 억제 신호는 활성화 신호에 대비해 우세하다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 iCAR 또는 pCAR은 동일한 세포에서 동시에 발현된다.
iCAR 우세 확보를 위한 또 다른 매력적인 옵션은 aCAR 인식 모이어티를 그의 활성화/공동자극 부분에서 분리하여, 이종이량체화 소분자의 존재시에만 두 개체 모두가 하나의 기능성 수용체로 조립될 수 있도록 하는 것이다. 정확한 타이밍, 투여량 및 위치에 의해 이러한 분할 수용체의 작동 상태를 엄격하게 제어하는 능력이 최근 항종양 CAR의 맥락에서 입증되었다 (문헌 [Wu 등, 2015]).
또한, 예측된 우세는 선택된 aCAR 플랫폼의 신호전달 강도와 '경쟁'해야 하는 선택된 iCAR 설계에서 세포내 부분에 포함된 iCAR 신호전달 요소의 특정 구성에 내재된 것으로 보인다. 이 능력은 또한 (상기에서 다루어진) 각각의 표적 에피토프에 대한 2개의 인식 모이어티의 상대적 친화도 및 이들의 상호작용의 전체적인 결합력에 의해 영향을 받는다. 후자와 관련하여, 제안된 전략은 유리한 iCAR/aCAR 화학량론과 정상 세포에서의 이들 각각의 표적 에피토프의 균형잡힌 분포를 보장한다. 다시 언급하자면, pCAR-aCAR 유전자 쌍을 사용하는 경우 이는 문제가 되지 않는다.
안전성을 추가로 보장하기 위해, CAR 및 TCR 면역요법 분야에서 현재 실행되는 다른 통상적인 수단, 예를 들어 자살 유전자의 사용 또는 일시적 발현을 위한 mRNA 전기천공의 사용이 사용될 수 있다.
LOH는 종종 특정 유전자의 단 하나의 대립유전자만을 갖는 세포를 남기지만, 종종 나머지 염색체 또는 염색체 부분의 복제를 수반하여 '카피 수 중성'-LOH를 초래한다 (문헌 [Lo 등, 2008; O'Keefe 등, 2010; Sathirapongsasuti 등, 2011]). 이러한 상황에서, 에피토프-상실 변이체의 출현은 2개의 독립적인 사건을 필요로 하므로 가능성이 적다. 유전자-변형된 세포의 상이한 단편들에서 여러 pCAR-aCAR 또는 iCAR-aCAR 쌍을 발현하는 것은 표적 대립유전자의 단일 카피만이 유지된 '카피 수 상실' LOH 경우에서도 돌연변이 탈주자의 출현을 방지할 수 있다. 그러나, 단일-카피 유전자가 필수적이 될 수 있기 때문에, 이들의 기능적 상실의 가능성은 훨씬 적을 것이다.
상기를 고려할 때, 일 측면에서, 본 발명은 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 포유류 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 또는 상기 aCAR이 발현되는 필수적인 기관에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 다형성 세포 표면 에피토프는 종양 억제 유전자 또는 종양 억제 유전자에 유전자적으로 연결된 유전자에 의해 암호화되는 항원의 일부인데, 이는 이러한 유전자는 종양에서 LOH로 인해 상실될 수 있기 때문이다. 또한, 상기 다형성 세포 표면 에피토프는 암 세포에서 종종 LOH를 겪는 염색체 또는 염색체 아암, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 3p, 6p, 9p, 10q, 17p, 17q, 또는 18q, 또는 19번 염색체에 일반적으로 상주하는 유전자에 의해 암호화되는 항원의 일부일 수 있다. 이들 에피토프는 본원에 기술된 관련 데이터베이스에서 쉽게 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 다형성 세포 표면 에피토프는 하우스키핑 유전자 생성물, 예를 들어 미분류된 AP2S1, CD81, GPAA1, LGALS9, MGAT2, MGAT4B, VAMP3; 세포 부착 단백질 CTNNA1 NM_001903, CTNNB1, CTNNBIP1 NM_020248, CTNNBL1 NM_030877, CTNND1 NM_001085458델타 카테닌; 채널 및 수송체 ABCB10 NM_012089, ABCB7 NM_004299, ABCD3 NM_002857, ABCE1 NM_002939, ABCF1 NM_001090, ABCF2 NM_005692, ABCF3 NM_018358, CALM1[1][7] 칼슘 이온을 포획하는 칼모듈린 (calmodulin), TETRAN 또는 테트라사이클린 수송체-유사 단백질로도 불리는 MSFD10과 유사한 MFSD11 NM_024311[1], MFSD12 NM_174983, MFSD3 NM_138431, MFSD5 NM_032889, SLC15A4 NM_145648, SLC20A1 NM_005415, SLC25A11[1] 미토콘드리아 옥소글루타르산염/말산염 담체, SLC25A26 NM_173471, SLC25A28 NM_031212, SLC25A3 NM_002635, SLC25A32 NM_030780, SLC25A38 NM_017875, SLC25A39 NM_016016, SLC25A44 NM_014655, SLC25A46 NM_138773, SLC25A5 NM_001152, SLC27A4 NM_005094, SLC30A1 NM_021194, SLC30A5 NM_022902, SLC30A9 NM_006345, SLC35A2 NM_005660, SLC35A4 NM_080670, SLC35B1 NM_005827, SLC35B2 NM_178148, SLC35C2 NM_015945, SLC35E1 NM_024881, SLC35E3 NM_018656, SLC35F5 NM_025181, SLC38A2 NM_018976, SLC39A1 NM_014437, SLC39A3 NM_144564, SLC39A7 NM_006979, SLC41A3 NM_017836, SLC46A3 NM_181785, SLC48A1 NM_017842, ACVRL1 TGF 베타 수용체 패밀리 렌두-오슬러-웨버 증후군과 유사한 수용체 ACVR1 NM_001105, ACVR1B NM_004302,CD23[1] FCER2 저친화도 IgE 수용체 (렉틴); 및 RNA 스플라이싱에 관여하는 DDX39B로도 불리는 HLA/면역글로불린/세포 인식군 BAT1, BSG 바시긴 면역글로불린 수퍼패밀리, 세포외 금속단백분해효소, MIF 대식세포 이동 억제 인자 및/또는 TAPBP을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하우스키핑 유전자는 HLA I형, G-단백질-결합 수용체 (GPCR), 이온 채널 또는 수용체 티로신 키나제, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C이다. 일부 구현예에서, 상기 하우스키핑 유전자는 HLA-A이다. 일부 구현예에서, 상기 하우스키핑 유전자는 HLA-B이다. 일부 구현예에서, 상기 하우스키핑 유전자는 HLA-C이다.
임의의 관련 기술이, 상기 aCAR 및 pCAR 또는 iCAR의 이들의 표적에 대한 특이적인 결합을 부여하는 인식 모이어티를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 (i) 항체, 그의 유도체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체; 인간 항체; 항체의 기능적 단편; 나노바디 (nanobody)와 같은 단일-도메인 항체; 재조합 항체; 및 단일쇄 가변 단편 (ScFv); (ii) 항체 모방체, 예를 들어 어피바디 (affibody) 분자; 아필린 (affilin); 아피머 (affimer); 아피틴 (affitin); 알파바디 (alphabody); 안티칼린 (anticalin); 아비머 (avimer); 다르핀 (DARPin); 피노머 (fynomer); 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 펩티드; 및 모노바디 (monobody); 또는 (iii) 앱타머를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포외 도메인은 ScFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 세포외 도메인은 종양-관련 항원 에피토프인 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 세포외 도메인은 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는 종양-관련 항원인 에피토프에 결합하고, 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 암을 치료하는데 사용되는 aCAR은, 상기 iCAR 표적이 표적화된 aCAR 단백질이 발현되는 모든 정상 조직에서 발현되는 한, 종양 조직에서 발현되는 임의의 막 단백질에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 다음의 항원 목록으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다: CD19, CD20, CD22, CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX Igκ, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34,CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2,GD3, hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-α, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Rα2, FAP, 메소텔린, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80 CD89, CDH17,CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1, WT-1 및 EGFR. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 CD19에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 CD19의 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR은 에프린 수용체 (예를 들어, EPHA 7) 및 클라우딘을 포함하지 않는 항원의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 HLA 유전자 (HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자)의 단일 대립유전자 변이체에 의해 암호화되는 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
iii. 세포내 도메인: aCAR, iCAR 및 pCAR
또한, 본 발명은 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR의 일부로서의 세포내 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 도메인은 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함한다.
일반적으로, 임의의 관련 기술을 사용하여 상기 aCAR 및 pCAR 또는 iCAR에 세포 기능을 유도하는 능력, 예를 들어 효과기 면역 세포를 억제하거나 또는 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 능력을 부여하는 신호전달 요소를 조작할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 효과기 면역 세포를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 억제할 수 있는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 면역 체크포인트 단백질의 신호전달 요소와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 단백질은 PD1, CTLA4, BTLA, 2B4, CD160, CEACAM (예를 들어, CEACAM1 포함), KIR (예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 및 CD94 포함), NKG2A; LAG3; TIM3; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA); 인터페론 유전자의 자극기 (STING); 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)-함유 단백질, T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인 (TIGIT), 및 아데노신 수용체 (예를 들어, A2aR)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 면역 체크포인트 단백질은 음성 면역 조절인자이다. 일부 구현예에서, 상기 음성 면역 조절인자는 2B4, LAG-3 및 BTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 신호전달 요소는 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 신호전달 요소는 활성화 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 신호전달 요소는 공동자극 도메인이다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 신호전달 요소는 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM), 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체, 또는 어댑터 분자, 및/또는 공동자극 신호전달 요소와 상동성이다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 신호전달 요소는 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 ITAM은 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 단백질로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 신호전달 요소는 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR)와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 KIR은 예를 들어 KIR2DS 및 KIR3DS를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 신호전달 요소는 어댑터 분자와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 어댑터 분자는 예를 들어 DAP12를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 신호전달 요소는 공동자극 신호전달 요소와 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극 신호전달 요소는 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), 및/또는GITR을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 신호전달 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 가요 성 힌지 및 막횡단 표준적 모티프를 통해 상기 세포내 도메인에 융합된다.
일부 구현예에서, 상기 pCAR의 사용은, 상기 인식 단위 및 상기 공동자극 요소 (예를 들어, CD28, 4-1BB)으로부터의 상기 aCAR의 활성화 모이어티 (FcRγ/CD3-ζ)의 분리를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 이들 요소는 2개의 상이한 폴리펩티드 생성물에 유전자적으로 배치된다. 일부 구현예에서, aCAR 기능에 필수적인, 이들 요소의 재결합은 각각의 폴리펩티드에 개별적으로 포함된 각각의 결합 부위를 연결할 수 있는 이종이량체화 약물의 첨가에 의해서만 발생한다.
활성화 도메인 (예를 들어 FcRy 또는 CD3-ζ) 대신에, iCAR은 T 세포 활성화를 길항할 수 있는 억제성 수용체로부터 유래한 신호전달 도메인을 보유한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 T 세포 활성화를 길항할 수 있는 억제성 수용체로부터 유래한 신호전달 도메인을 보유한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 신호전달 도메인은 예를 들어 CTLA-4, PD-1 또는 NK 억제성 수용체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 억제성 수용체로부터 유래한다.
iv. CAR-T 벡터 제조 (aCAR; iCAR; pCAR)
일부 구현예에서, 상기 aCAR은 제1 핵산 벡터에 의해 암호화되고 상기 iCAR 또는 pCAR은 제2 핵산 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 제1 핵산 벡터에 의해 암호화되고 상기 iCAR 또는 pCAR은 제2 핵산 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 제1 핵산 벡터에 의해 암호화되고 상기 iCAR 또는 pCAR은 제2 핵산 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 제2 벡터에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 구현예 중 어느 하나에 정의된 본 발명의 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 (LV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 상업적 LV 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 pLVX-Puro, pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro, pLVx-EF1a-IRES (TAKARA), 및/또는 pcLV-EF1a (Sirion)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 pLVX-Puro이다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro이다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 pLVx-EF1a-IRES (TAKARA)이다. 일부 구현예에서, 상기 LV 벡터는 pcLV-EF1a (Sirion)이다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 EF1 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 PGK 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 CD8 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 CD28 TM 및 41BB 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기서 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되고, 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화되는 aCAR의 세포외 도메인은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 iCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화되는 iCAR의 세포외 도메인은, 예를 들어 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자를 비롯한 HLA 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
일부 구현예에서, 상기 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다.
일부 구현예에서, 상기 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화되는 iCAR의 세포외 도메인은, 예를 들어 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자를 비롯한 HLA 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되고; 상기 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 암호화되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다.
일부 구현예에서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 aCAR의 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는, 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM); 예를 들어 KIR2DS 및 KIR3DS의 활성화 KIR 막횡단 도메인, 또는 양으로 하전된 측쇄, 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR)의 막횡단 도메인, 또는 DAP12와 같은 어댑터 분자; 또는 예를 들어 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB) 또는 CD134 (OX40)의 공동자극 신호전달 요소와 상동성이다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR은 제1 벡터에 의해 발현되고 상기 aCAR은 제2 벡터에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR 및 상기 aCAR은 모두 동일한 벡터에 의해 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 벡터의 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함한다. 일반적으로, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 순차적 순서일 수 있지만, 특정 구현예에서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 단일 벡터에 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 위치한 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터의 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 토세아 아시그나 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 에퀸 리니티스 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및/또는 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)로부터의 P2A를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 토세아 아시그나 바이러스 (TaV)로부터의 T2A이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 에퀸 리니티스 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A이다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)로부터의 P2A이다.
일부 구현예에서, 상기 벡터는 가요성 링커를 통해 상기 iCAR에 연결된 구성적 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
면역 세포는 예를 들어 RNA 형질감염에 의해 또는 진핵 세포 또는 바이러스 벡터에서의 복제 및/또는 전사에 적합한 플라스미드 내로의 혼입에 의해 본원에 기술된 적절한 핵산 분자로 형질감염될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터로부터 선택된다.
레트로바이러스 벡터 및 적절한 패키징 라인의 조합이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 캡시드 단백질이 인간 세포를 감염시키는 기능을 한다. PA12 (문헌 [Miller 등 (1985) Mol. Cell. BioI. 5:431-437); PA317 (Miller 등 (1986) Mol. Cell. Bioi. 6:2895-2902]); 및 CRIP (문헌 [Danos 등 (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:6460-6464])를 비롯한, 여러 암포트로픽 (amphotropic) 바이러스-생산 세포주가 공지되어 있다. 대안적으로, 비-암포트로픽 입자, 예를 들어 VSVG, RD 114 또는 GAL V 외피를 갖는 위형 (pseudotype) 입자가 사용될 수 있다. 세포는, 생산 세포와의 직접 공동 배양, 예를 들어 문헌 [Bregni 등 (1992) Blood 80: 1418-1422]의 방법에 의해, 또는 바이러스 상층액 단독 또는 농축된 벡터 스톡을 사용한 배양, 예를 들어 문헌 [Xu 등 (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; 및 Hughes 등 (1992) J Clin. Invest. 89: 1817]의 방법에 의해 추가로 형질도입될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 상기에 정의된 본 발명에 따른, 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 공지된 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터 단백질-암호화 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계; (ii) (a) 상응하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서 아미노산 서열 변이를 야기하는 변이체를 선택하고, (b) 아미노산 서열 변이가 암호화된 단백질의 세포외 도메인에 존재하는 유전자의 변이체를 선택하고, (c) 적어도 하나의 종양에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 유전자의 변이체를 선택하고, (d) (c)에 따라 적어도 LOH를 겪는 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 유전자의 변이체를 선택하여, LOH로 인해 상기 적어도 하나의 종양에서 상실되고 적어도 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 세포외 도메인에 아미노산 서열 변이를 갖는 변이체의 목록을 획득함으로써, 검색된 변이체의 상기 목록을 필터링하는 단계; (iii) (ii)에서 획득된 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 정의하고, 상기 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 상기 서열 영역 및 상응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브클로닝하고 발현하여, 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계; (iv) (iii)에서 수득된, 상기 클로닝된 서열 영역에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드, 또는 상응하는 기준 대립유전자에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선택하는 단계; 및 (vii) (iv)에 정의된 iCAR 결합 도메인을 각각 포함하는 본원에서 상기에 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 유전자의 후보 변이체는 특정 종양 유형에서 적어도 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에서 LOH를 겪는다.
일부 구현예에서, 선택된 각각의 변이체에 대한 부수적 대립유전자 빈도는 적어도 하나의 집단에서 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제어된 효과기 면역 세포 활성화 시스템의 상이한 구성원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하는 2개 이상의 핵산 분자의 조합에 관한 것이며, 상기 핵산 분자는 단일한 연속적인 핵산 분자의 일부이거나 이러한 핵산 분자를 형성하거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 제어된 효과기 면역 활성화 시스템은 효과기 면역 세포에게 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 하나 이상의 염색체 또는 그의 단편을 상실한 종양 세포를 살해하도록 지시하고 관련 정상 조직의 세포를 살리며, (a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR) 폴리펩티드를 포함하며, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유류 조직의 세포에 의해 공유되고; (b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상 포유류 조직에 의해 발현되지는 않지만 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 구성원은 (a) 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 구성적 aCAR; 및 (b) 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제1 구성원 및 임의로 적어도 하나의 공동자극 신호전달 요소를 포함하지만 활성화 신호전달 요소는 포함하지 않는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 조건부 aCAR로부터 선택되고; 제2 구성원은 (c) 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR); 또는 (d) 셰다제를 위한 기질을 포함하는 세포외 조절 영역; 막내-절단 프로테아제를 위한 기질을 포함하는 막횡단 표준적 모티프; 및 세포내 도메인을 추가로 포함하는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)이고, 상기 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소 및 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제2 구성원을 포함한다.
일부 구현예에서, (i) 상기 iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; (ii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; 또는 (iii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
일부 pCAR 구현예에서, 셰다제를 위한 상기 기질은 디스인테그린 및 금속단백분해효소 (ADAM) 또는 베타-세크레타제1 (BACE1)를 위한 기질이다. 일부 구현예에서, 상기 기질은 상기 세포외 도메인의 일부를 형성하고 Lin12/노치 반복부 및 ADAM 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
ADAM 절단을 예측하는 일관된 서열 모티프는 존재하지 않는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있지만, Caescu 등 (문헌 [Caescu 등, 2009])은 표 3에 다수의 ADAM10 및/또는 ADAM17 기질 서열을 개시하고 있으며, 이는 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 ADAM를 위한 기질로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ADAM 기질 서열은 아밀로이드 전구체 단백질, BTC, CD23, 콜라겐, DII-1, 에볼라 당단백질, E-카드헤린, EGF, 에피레귤린, Fas 리간드, 성장 호르몬 수용체, HB-EGF, II형 인터루킨-1 수용체, IL-6 수용체, L-셀렉틴, N-카드헤린, 노치, p55 TNF 수용체, p75 TNF 수용체, Pmel17, 프리온 단백질, 수용체형 단백질 티로신 포스파타제 Z, TGF-α, TNF 또는 TR의 것이다 (문헌 [Caescu 등, 2009]).
본 발명의 pCAR에서 ADAM10 절단 서열을 사용하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 ADAM 10이 예를 들어 림프구 상에서 비교적 높은 수준으로 구성적으로 존재하기 때문이다. ADAM10과 대조적으로, 가까운 친척인 TACE/ADAM17은 미자극 세포 상에서 단지 낮은 수준으로 검출된다. T 세포 아세포 상에서의 ADAM17 표면 발현은 자극에 의해 빠르게 유도된다 (문헌 [Ebsen 등, 2013]).
Hemming 등 (문헌 [Hemming 등, 2009])은 BACE1 절단을 예측하는 일관된 서열 모티프가 비-기질 대비 기질에서 식별되지 않았지만, 표 1에 BAC1 절단 서열을 갖는 다수의 BACE1 기질을 개시하고 있으며, 이는 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 BACE1을 위한 기질로서 작용할 수 있다.
일부 pCAR 구현예에서, 막내-절단 프로테아제를 위한 기질은 SP2, γ-세크레타제, 신호 펩티드 펩티다제 (spp), spp-유사 프로테아제 또는 능형 프로테아제를 위한 기질이다.
Rawson 등 (문헌 [Rawson, 2013])은 SP2 기질이 적어도 하나의 2형 막-관통 헬릭스 (type 2 membrane-spanning helix)를 가지며 SP2 기질 내에 Asp-Pro 모티프와 같은 헬릭스-불안정화 모티프를 포함함을 개시하고 있다. 이 논문은 표 1에 SP2-절단 서열을 갖는 다수의 SP2 기질을 개시하고 있으며, 이는 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 SP2를 위한 기질로서 작용할 수 있다.
Haapasalo 및 Kovacs (문헌 [Haapasalo 및 Kovacs, 2011])는 아밀로이드-β 단백질 전구체 (AβPP)가 프레세닐린 (PS)-의존적 γ-세크레타제 (PS/γ-세크레타제)를 위한 기질이며 적어도 90개의 추가적인 단백질이 이 효소 복합체에 의해 유사한 단백질 분해를 겪는 것으로 밝혀졌음을 교시하였다. γ-세크레타제 기질은 다음과 같은 몇 가지 공통된 특징을 갖는다: 대부분의 기질 단백질은 I형 막횡단 단백질이고; PS/γ-세크레타제-매개 γ-유사 절단 (AICD를 방출하는 AβPP에서의 절단에 상응함)은 막횡단 및 세포질 도메인의 경계 또는 그 부근에서 발생한다. &-유사 절단 부위는 라이신 및/또는 아르기닌 잔기가 풍부한 소수성 아미노산 서열의 구간에 플랭크 (flank)된다. PS/γ-세크레타제 절단은 절단 부위 또는 그 근처의 특정 아미노산 표적 서열에 의존하지 않고, 아마도 막횡단 도메인의 입체구조 상태에 의존하는 것으로 보인다. Haapasalo 및 Kovacs은 표 1에 γ-세크레타제 기질의 목록을 개시하고 있으며, 그의 절단 서열은 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 γ-세크레타제를 위한 기질로서 작용할 수 있다.
Voss 등 (문헌 [Voss 등, 2013])은 GxGD 아스파틸 프로테아제 (spp)의 경우, 기질 내에서 1차 서열 요소에 기초한 공통 절단 부위가 지금까지 기술되지 않았다고 교시하고 있다. 막 단백질의 막횡단 도메인은 바람직하게는 이들의 펩티드 결합이 프로테아제에 거의 접근할 수 없는 α-헬릭스 형태를 채택한다. 따라서, 막횡단 도메인을 막내 단백질 분해에 취약하게 만들기 위해, 헬릭스 불안정화 아미노산에 의해 α-헬릭스 함량이 감소될 필요가 있다고 상정되었다. 이 가설과 일치하게, 다양한 신호 펩티드가, SPP에 의한 단백질 분해 처리에 결정적으로 영향을 미치는 h-영역 내에 헬릭스 불안정화 아미노산을 포함하는 것으로 나타났다. 또한, 신호 펩티드의 h-영역 내의 극성 잔기는 SPP에 의한 절단에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 예를 들어 다양한 HCV 균주의 신호 펩티드 내의 세린 및 시스테인 잔기가 SPP 절단에 중요하기 때문이다. 이들 극성 잔기가 또한 신호 펩티드의 헬릭스 함량에 단순히 영향을 미치는지, 또는 SPP에 의한 절단을 유발하기 위해 히드록실 또는 설프히드릴기가 특히 필요한지는 아직 완전히 이해되지 않았다. 유사하게, SPPL2b에 의한 Bri2 막횡단 도메인의 절단은 Bri2 막횡단 도메인의 α-헬릭스 함량이 감소하는 경우 상당히 증가된다. 흥미롭게도, 추정되는 헬릭스 불안정화 효능을 갖는 4개의 아미노산 잔기 중 하나의 잔기만이 인지질계 환경에서 Bri2 막횡단 도메인의 α-헬릭스 함량을 상당히 감소시켰다. 이는, α-헬릭스 막횡단 도메인의 불안정화가 단순히 특정 아미노산 잔기에 의해 야기되는 것이 아니라, 이들 아미노산의 상황 및 위치가 이들의 헬릭스 불안정화 가능성을 결정하고, 따라서 SPP/SPPL에 의한 막내 단백질 분해에 대한 막횡단 도메인의 접근성을 결정한다는 것을 암시한다. Voss 등은 표 1에 spp 및 spp-유사 기질의 목록을 개시하고 있으며, 그의 절단 서열은 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 spp를 위한 기질로서 작용할 수 있다.
Bergbold 등 (문헌 [Bergbold 및 Lemberg, 2013])는 능형 프로테아제의 경우, 기질 인식에 대한 2개의 상이한 모델이 제안되었음을 교시하였다. 제1 모델에서, 능형 활성 부위 근처에서의 막의 침지와 조합된 기질 펩티드 골격의 입체구조적 유연성은 특이성을 제공하기에 충분하다. 잘 특성화된 초파리 기질인 스피츠 (Spitz)의 경우, 글리신-알라닌 모티프는 막횡단 도메인을 능형 활성 부위로 펼칠 수 있는 헬릭스 파괴체로 작용하는 것으로 나타났다. 제2 모델은 능형 프로테아제가 절단 부위를 둘러싼 특정 서열을 주로 인식하고 막 횡단 헬릭스-안정화 잔기가 일부 기질에만 요구되는 2차적 특징임을 암시한다. 상기 특정 서열은 아직 식별되지 않았다. Bergbold 등은 표 3에 능형 프로테아제 기질의 목록을 개시하고 있으며, 그의 절단 서열은 본원에 완전히 개시되어 있는 것처럼 원용에 의해 본원에 포함되며, 본 발명의 pCAR에서 능형 프로테아제를 위한 기질로서 작용할 수 있다.
상기를 고려할 때, 대부분의 경우 막내-절단 프로테아제에 대한 공통 모티프가 아직 확립되지 않았고, 막내-절단 프로테아제 기질을 식별하기 위한 분석은 상기 인용된 문헌에 기술된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있기 때문에, 상기 pCAR은 이와 같이 식별된 아미노산 서열을 포함할 수 있고 막횡단 헬릭스-불안정화 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 기질은 막횡단 표준적 모티프의 일부를 형성하고, 노치, ErbB4, E-카드헤린, N-카드헤린, 에프린-B2, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 CD44의 막횡단 도메인과 상동성이거나, 또는 이로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 상기는 개별 단백질로서의 상기 조건부 aCAR의 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 각각의 도메인은 막횡단 표준적 모티프에 독립적으로 융합되고 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 상이한 구성원을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제1 및 제2 구성원 각각은 (i) 타크로리무스 (FK506) 결합 단백질 (FKBP) 및 FKBP; (ii) FKBP 및 칼시뉴린 촉매 아단위 A (CnA); (iii) FKBP 및 시클로필린; (iv) FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질 (FRB); (v) 기라제 B (GyrB) 및 GyrB; (vi) 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 DHFR; (vii) DmrB 동종이량체화 도메인 (DmrB) 및 DmrB; (viii) PYL 단백질 (아브시스산 수용체 및 RCAR로도 알려짐) 및 ABI; 및 (ix) GAI 애기장대 단백질 (지베렐린산 비반응성 및 DELLA 단백질 GAI; GAI로도 알려짐) 및 GID1 애기장대 단백질 (지베렐린 수용체 GID1; GID1로도 알려짐)로부터 선택된 단백질로부터 유래한다.
v. 효과기 세포의 제조
또 다른 측면에서, 본 발명은 안전한 효과기 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 종양-관련 항원에 대해 지시된 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 본원에서 상기에 정의된 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키거나 또는 상기 세포를 벡터로 형질도입시키는 단계; 또는 (ii) 천연 효과기 면역 세포를 본원에서 상기에 정의된 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 본원에서 상기에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계; 또는 효과기 면역 세포를 본원에서 상기에 정의된 벡터로 형질도입시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작에 사용하기 위한 면역 세포는 T-세포, 자연 살해 세포 또는 사이토카인-유도 살해 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 조작에 사용하기 위한 면역 세포는 저캇 T-세포, 저캇-NFAT T-세포 및/또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술된 본 발명의 방법에 의해 수득된 안전한 효과기 면역 세포를 제공한다. 상기 안전한 효과기 면역 세포는 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 및 iCAR 또는 pCAR을 발현하는 재지시된 T 세포일 수 있으며, 여기서 상기 외인성 TCR은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되며, 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되며, 상기 iCAR 또는 pCAR은 본원에서 상기에 정의된 바와 같고; 상기 안전한 효과기 면역 세포는 본원에서 상기에 정의된 iCAR 또는 pCAR 및 aCAR을 발현하는 재지시된 효과기 면역 세포, 예를 들어 자연 살해 세포 또는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는, 그의 표면 상에, 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR 또는 pCAR을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; 또는 상기 iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA_DQ, 또는 HLA-DR 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되고; 세포 표면에서 발현되는 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 상기 iCAR은 별개의 단백질로서 세포 표면에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 세포 표면에서의 발현 수준은 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준 이상이다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR에 사용하기 위한 인식 모이어티는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터의 유전자 생성물의 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프에 대한 특이성을 제공한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 HLA-A2의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 세포 표면에서 발현되는 iCAR 및/또는 pCAR의 세포외 도메인은 CD20의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 HLA-A2에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 CD20에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 CD19에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 세트는 각각 HLA-A2 및 CD19에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 세트는 각각 CD20 및 CD19을 포함한다.
vi. 표적 세포의 제조
일부 구현예에서, 표적 세포는 시험관내 시스템에서 제조 및 시험된다. 일부 구현예에서, 시험관내 재조합 시스템은 표적-외 세포에 대한 상기 aCAR의 활성을 억제하는데 있어서의 상기 iCAR 및/또는 pCAR 구조체의 기능성을 시험하기 위해 확립된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 에피토프, iCAR 에피토프 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포가 생산된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 에피토프, pCAR 에피토프 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포가 생산된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 에피토프를 발현하는 재조합 세포는 표적-상 '종양-상' 세포를 나타내는 반면, aCAR 및 iCAR 에피토프 둘 모두를 발현하는 세포는 표적-상 '종양-외' 건강한 세포를 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 세트는 각각 HLA-A2 및 CD19에 대해 지시되고, HLA-A2, CD19 또는 둘 모두를 발현하는 재조합 세포는 세포주 (예를 들어, 헬라 (Hela), 헬라-루시페라제 또는 라지 (Raji))를 이들 유전자를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생산된다. 재조합 CD19 및 HLA-A2 발현의 검출을 위해, 두 유전자 모두 단백질 태그 (예를 들어, HA 또는 Flag 또는 Myc 등)에 융합된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 표적 세트는 CD 20/CD19이고 상기 재조합 세포는 CD19, CD20 또는 둘 모두를 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 표적 세트를 포함하는 발현 벡터는 세포내로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 세포내로 형질감염되어 상기 표적 및 종양-외 효과를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PTGFRN, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2AD2A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기에 정의된 암을 치료하기 위해 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는, 그의 표면 상에, 종양-관련 항원 또는 항원의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인 적어도 종양의 기원 조직에서 발현되는 항원, 예를 들어 상기에 열거된 것들 중 임의의 하나의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 상기 aCAR이 발현되는 것과 동일한 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 iCAR은 동일한 유전자의 상이한 대립유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 iCAR은 상이한 단백질이고, 따라서 상이한 대립유전자이다.
A. 시험관내 분석
일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR은 다양한 분석을 사용하여 효과 및 억제 능력을 비롯한 효과에 있어서의 활성에 대해 시험된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR의 억제 효과는 시험관내 및/또는 생체내에서 시험된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR의 억제 효과는 시험관내에서 시험된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR의 억제 효과는 생체내에서 시험된다. 일부 구현예에서, 상기 시험관내 분석은 사이토카인 분비 및/또는 세포독성 효과를 측정한다. 일부 구현예에서, 상기 생체내 분석은 표적-상 종양-외 이종 이식편에 대한 iCAR 및/또는 pCAR 억제 및 보호를 평가한다. 일부 구현예에서, 상기 생체내 분석은 표적-상 종양-외 조직 및/또는 바이러스성 기관에 대한 iCAR 및/또는 pCAR 억제 및 보호를 평가한다.
i. 루시페라제 세포독성 분석
일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR은 루시페라제 세포독성 분석을 사용하여 평가된다. 일반적으로, 루시페라제 세포독성 분석의 경우, 재조합 표적 세포 ("T"로 지칭될 수 있음)는 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 상업적 헬라-Luc 세포는 표적 단백질을 암호화하는 DNA로 형질감염될 수 있다. 상기 시험관내 루시페라제 분석은 Bright-Glo 루시페라제 분석 (Promega 또는 BPS Biosciences 또는 다른 상업적 공급업체로부터 상업적으로 입수가능함)에 따라 수행될 수 있다. 형질도입된 효과기 (E) T 세포 (iCAR 또는 pCAR 및 aCAR 둘 모두 또는 aCAR 또는 모의 CAR로 형질도입됨)는, 상이한 효과기 대 표적 비에서 시험되기 위해, HLA-A2, CD19, 또는 CD19 및 HLA-A2 둘 모두, 또는 CD20, 또는 CD20 및 CD19 둘 모두를 발현하는 재조합 표적 세포와 함께 24-48시간 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 또는 pCAR/aCAR 쌍은 전술된 성분을 갖는 aCAR, pCAR 및/또는 iCAR 중 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 쌍은 HLA-A2 표적화된 iCAR 및 CD19 표적화된 aCAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 쌍은 CD20 표적화된 iCAR 및 CD19 표적화된 aCAR을 포함한다. 세포 살해는 Bright-Glo 루시페라제 시스템을 사용하여 살아있는 세포의 수를 추정함으로써 간접적으로 정량된다.
일부 구현예에서, '종양-외' 세포독성은 iCAR/aCAR 발현 수준에 따라 형질도입된 T 세포 집단을 분류하거나, 또는 예를 들어 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프를 암호화하는 유전자 생성물의 발현을 비롯한 표적 발현에 따라 재조합 표적 세포의 하위 집단을 선택함으로써, 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR, iCAR 및/또는 pCAR 표적은 세포외 도메인을 갖는 임의의 표적이다. 일부 구현예에서, 상기 분류는 CD19 또는 HLA-A2 발현 수준을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR은, 상기 iCAR 형질도입된 T 세포가 시험관내에서 '종양-상' 세포 (예를 들어, 종양 세포)와 '종양-외' 세포 (예를 들어, 비종양 세포)를 구별할 수 있는지를 측정하기 위해 검사된다. 일반적으로 이는 '종양-상' 세포 및 '종양-외' 세포의 혼합물과 함께 1:1의 비로 배양된 형질도입된 T 세포의 살해 효과를 조사함으로써 시험한다. 일부 구현예에서, 상기 비는 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 또는 1:8이다. 한 번에 하나의 세포 집단만이 루시페라제 유전자를 발현하도록 조작되는 구현예에서, 종양-상 재조합 세포는 루시페라제 발현에 의해 '종양-외' 재조합 세포와 구별될 수 있다. Bright-Glo 루시페라제 분석 (Promega)을 사용하여 24-48시간의 공동 배양 후 살해를 정량할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 및/또는 pCAR/aCAR 형질도입된 T 세포는, aCAR로는 형질도입되었지만 상기 iCAR 및/또는 pCAR로는 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 및/또는 약 95% 적은 종양-외 세포 살해를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 및/또는 pCAR/aCAR 형질도입된 T 세포는, aCAR로는 형질도입되었지만 상기 iCAR 및/또는 pCAR로는 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여, 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 또는 약 10배 적은 종양-외 세포 살해를 나타낸다.
ii. 카스파제 3
일부 구현예에서, '종양-상' 세포 (예를 들어, 종양 세포) 및 '종양-외' 세포 (예를 들어, 비종양 세포)의 세포자멸사 수준을 시험관내에서 측정하기 위해 상기 iCAR 및/또는 pCAR을 검사하기 위해 카스파제 3-검출 분석이 사용된다. 일부 구현예에서, 활성화된 절단된 카스파제 3에 대한 항체에 의한 세포독성 림프구 (CTL) 유도된 세포자멸사의 카스파제 3-검출이 검사된다.
일반적으로, CTL이 표적 세포를 살해하는 경로 중 하나는 Fas 리간드를 통해 세포자멸사를 유도하는 것이다. CASP3 단백질은 시스테인-아스파르트산 프로테아제 (카스파제) 패밀리의 구성원이다. 전형적으로, 카스파제의 순차적 활성화는 세포자멸사의 실행 단계에서 중요한 역할을 하며, 따라서 프로-카스파제 3에서 카스파제 3으로의 절단은 형태적 변화 및 촉매 활성의 발현을 초래한다. 카스파제 3의 절단된 활성화 형태는 단일클론 항체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 형질도입된 T 세포는 '종양-상' (예를 들어, 모의 종양) 및 '종양-외' 세포 (예를 들어, 모의 비종양) 재조합 세포와 함께 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 '종양-상' (예를 들어, 종양) 및 '종양-외' 세포 (예를 들어, 비종양) 재조합 세포는 CFSE ((5(6)-카르복시플루오레세인 N-히드록시숙신이미딜 에스테르)) 또는 기타 세포 추적 염료 (예를 들어 CellTrace Violet)로 사전에 표지된다. 일부 구현예에서, 효과기 세포와 표적 세포의 공동 배양은 약 1시간 내지 약 6시간, 약 2시간 내지 약 5시간, 또는 약 2 내지 약 4시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포 세포자멸사는 유세포 분석에 의해 정량된다. 세포는 내부 염색 키트 (Miltenyi 또는 BD bioscience)로 투과화 및 고정되고 활성화된 카스파제 3에 대한 항체 (BD bioscience)로 염색될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 및/또는 pCAR/aCAR 형질도입된 T 세포는, aCAR로는 형질도입되었지만 상기 iCAR 및/또는 pCAR로는 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 및/또는 약 95% 적은 종양-외 세포자멸사를 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR/iCAR 및/또는 aCAR/pCAR 형질도입된 T 세포는, aCAR로는 형질도입되었지만 상기 iCAR 및/또는 pCAR로는 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여, 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 또는 약 10배 적은 종양-외 세포자멸사를 유도한다.
iii. 시간 경과 현미경
시간 경과 현미경 CTL-
표적 결합을 포착하기 위해 iCAR 및/또는 pCAR 형질도입된 T 세포의 시간 경과 현미경이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 리포터 유전자 (예를 들어 이에 제한되지는 않지만, mCherry와 같은 형광 단백질)로 표지된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 T 세포는 '종양-상' 또는 '종양-외' 세포와 함께 최대 5일 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 시간 경과 현미경을 사용하여 살해를 시각화할 수 있다. 일부 구현예에서, 종점 시점에서의 표적 세포 수를 측정하기 위해 생존가능한 세포 수 염색 및 CountBright 비드 (Invitrogen)를 사용한 유세포 분석이 수행된다.
일부 구현예에서, aCAR/iCAR 또는 aCAR/pCAR 형질도입된 T 세포가 시험관내에서 표적을 식별할 수 있는지를 측정하기 위해, 각각의 재조합 표적 세포 ('종양-상' 또는 '종양-외')는 상이한 리포터 단백질 (예를 들어 GFP 및 mCherry)로 표지된다. 일부 구현예에서, 리포터 쌍이 용이하게 구별될 수 있는 2개의 리포터를 포함하는 한, 임의의 리포터 단백질 쌍이 유효할 것이다. 일부 구현예에서, 형질도입된 T 세포 (효과기 세포)는 1:1 비의 E/T로 재조합 세포 (표적 세포)와 공동 배양된다. 일부 구현예에서, 효과기 대 표적의 비 (E/T)은 16:1, 12:1, 10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 또는 1:1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 이어서, 세포 운명은 현미경 이미징에 의해 검사된다.
iv. 사이토카인 방출
T 세포 활성화를 측정하기 위해 사이토카인 방출이 검사될 수 있다. 일부 구현예에서, iCAR/aCAR 및/또는 pCAR/aCAR 형질도입된 T 세포는 재조합 표적 세포와 함께 배양되고, 하나 이상의 사이토카인에 대한 사이토카인 생산량이, 예를 들어 BioLegend의 ELISA MAXTM Deluxe Set 키트에 따라 세포 배양 상층액에서의 사이토카인 분비를 측정함으로써, 또는 사이토카인을 생산하는 T 세포의 백분율에 대한 유세포 분석에 의해 정량된다. 유세포 분석의 경우, 사이토카인의 분비를 방지하기 위해 골지 스톱 (Golgi stop)이 일반적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 T 세포를 표적 세포와 6시간 및 18시간 내지 24시간 배양한 후, T 세포는 내부 염색 키트 (Miltenyi)에 의해 투과화 및 고정되고 T 세포 마커 (CD3 및 CD8) 및 하나 이상의 사이토카인에 대한 항체로 염색된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-2, INFγ 및/또는 TNFα를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
v. CD107a 염색
형질도입된 T 세포의 세포용해 활성을 측정하기 위해 CD107a에 대한 염색을 또한 검사할 수 있다. 일반적으로, T 세포의 탈과립화는 리소좀 관련 막 단백질 (LAMP-1)인 CD107a의 표면 발현에 의해 식별될 수 있으며, LAMP-1의 표면 발현은 CD8 T 세포 세포독성과 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 추가로, 이 분자는 리소좀의 내강 측에 위치한다. 전형적으로, 활성화시, CD107a는 활성화된 림프구의 세포막 표면으로 전달된다. 또한, CD107a는 세포 표면에서 일시적으로 발현되고 식작용 경로를 통해 신속하게 재내재화된다. 따라서, 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, CD107a 검출은 세포 자극 동안의 항체 염색 및 모넨신의 첨가 (예를 들어, 세포 이물 흡수된 CD107a 항체 복합체의 산성화 및 후속 분해를 방지하기 위함임)에 의해 최대화된다.
일부 구현예에서, 상기 aCAR/iCAR 및/또는 aCAR/pCAR 형질도입된 T 세포는 약 6시간 내지 약 24시간 동안 표적 세포와 함께 배양되고 CD8 T 세포 상에서의 CD107a 발현이 검사된다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 (종양 세포에서와 같이) aCAR에 의해 인식되는 하나의 표적 단백질만을 발현하거나, 또는 표적 세포는 (정상 세포에서와 같이) aCAR 및 iCAR에 의해 인식되는 표적 단백질 둘 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR 형질도입된 T 세포는 모넨신의 존재하에 표적 세포와 함께 약 6시간 내지 약 24시간 동안 배양되고, CD8 T 세포 상에서의 CD107a 발현이 T 세포 표면 마커 (예를 들어, CD3 및 CD8)에 대한 접합된 항체 및 CD107a에 대한 접합된 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정된다.
vi. ELISA에 의한 분비된 사이토카인의 정량
일부 구현예에서, iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T-세포 (저캇 또는 1차 T-세포)와 iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 항원 둘 모두를 발현하는 변형된 표적 세포의 공동 배양 후, 조정 배지를 수집하고, 사이토카인 ELISA에 의해 사이토카인의 농도를 측정한다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-2, INFγ 및/또는 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 INFγ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 TNFα로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이중 CAR (aCAR/iCAR) 형질도입된 세포에서 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 감소가 나타난다.
vii. 세포 계측 비드 어레이 (Cytometric Bead Array (CBA)) 분석에 의해 측정된 사이토카인 분비
세포 계측 비드 어레이 (CBA)는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 비롯한 다양한 가용성 세포내 단백질을 측정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 구조체 (효과기 세포)로 형질도입된 T-세포 (1차 T-세포 또는 저캇 세포)는, 세포 표면에 iCAR 및 aCAR 둘 모두 또는 aCAR 또는 iCAR 표적 항원을 발현하는 변형된 표적 세포로 자극된다. 일부 구현예에서, 효과기 대 표적 비는 20:1 내지 1:1의 범위이다. 일부 구현예에서, 효과기 대 표적 비는 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1,2:1, 또는 1:1의 범위이다. 일부 구현예에서, 수시간의 공동 배양 후, 효과기 세포는 효과기 상태를 나타내는 사이토카인을 생산하고 분비한다. 일부 구현예에서, 반응 상층액을 수집하고, 분비된 IL-2를 다중 CBA 분석에 의해 측정하고 정량하였다.
일부 구현예에서, 두 표적 항원 모두를 발현하는 표적 세포와 공동 배양된 이중 CAR (aCAR/iCAR) 형질도입된 세포에서, 동일한 효과기 세포와 하나의 표적만을 발현하는 표적 세포의 공동 배양으로부터 생성된 IL-2 분비와 비교하여 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 감소가 나타난다. 일부 구현예에서, 이중 CAR (aCAR/iCAR) 형질도입된 세포가 두 표적 항원 모두를 발현하는 표적 세포와 공동 배양된 경우, 동일한 효과기 세포와 하나의 표적만을 발현하는 표적 세포의 공동 배양으로부터 생성된 IL-2 분비와 비교하여, IL-2 분비에 있어 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%의 감소가 나타났다. 일부 구현예에서, 86%의 감소. 일부 구현예에서, 상기 aCAR은 CD19 aCAR이다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 HLA-A2 iCAR이다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR은 CD20 iCAR이다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR/iCAR 쌍은 CD19 aCAR 및 HLA-A2 iCAR이다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR/iCAR 쌍은 CD19 aCAR 및 CD20 iCAR이다.
viii. CD107a 염색에 의해 측정된 T-세포 탈과립 분석
일부 구현예에서, T 세포의 탈과립화는 리소좀 관련 막 단백질 (LAMP-1) 인 CD107a의 표면 발현에 의해 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, LAMP-1의 표면 발현은 CD8 T 세포 세포독성과 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 일부 구현예에서, 과립화 (CD107a)는 살해 가능성에 대한 마커이다.
B. 생체내 분석
일부 구현예에서, 상기 iCAR/aCAR 및/또는 iCAR/pCAR 쌍은 생체내 효과에 대해 시험된다. 일부 구현예에서, NOD/SCID/γc- 또는 유사한 마우스에 종양 세포를 정맥내 접종한다. 일부 구현예에서, 상기 종양 세포는 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 조작된 CD19 양성 NALM 6 (ATCC, 인간 B-ALL 세포주) 세포이다. 일부 구현예에서, '표적-상' 세포 및 '종양-외' 세포의 확립 및/또는 분화를 위해, NALM 6은 iCAR 및/또는 pCAR 에피토프를 발현하여 건강한 세포를 나타내도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR 에피토프는 적어도 하나의 세포외 다형성 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 iCAR 및/또는 pCAR에피토프는 HLA-A2 또는 CD20으로부터의 것이다. 이들 분석에 사용될 수 있는 다른 세포는 라지 또는 다른 재조합 세포주를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 분석은 PDX (환자 유래 이종 이식편) 모델에서 일 수 있다.
분석을 위해, 마우스를 연구군들로 나누고; 한 군에는 NALM 6 세포를 주사하고 다른 군에는 iCAR 에피토프를 발현하는 NALM-6을 주사한다. 며칠 후, 마우스에 aCAR, aCAR/iCAR로 형질도입된 T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포의 대조군 또는 T 세포가 없는 대조군을 정맥내로 주입한다. 마우스를 희생시키고 총 유동에 따라 종양 부담을 정량한다.
상기 분석의 일 구현예에 따르면, iCAR 및/또는 pCAR 구조체를 발현하는 T 세포가 동일한 유기체 내에서 생체내에서 표적 세포와 표적-외 세포를 구별할 수 있는지를 시험하기 위해, 마우스에 '종양-상'/ '종양-외' NALM-6 세포의 1:1 혼합물을 주사한 후, aCAR 단독 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T 세포를 주사하였다. 이 구현예에서, 마우스 희생시, 비장 및 골수에서의 '종양-상' 및 '종양-외' 세포의 존재가 2개의 마커, 즉 CD19 및 iCAR 에피토프에 대한 유세포 분석에 의해 분석된다.
i. 인간 이종 이식 마우스 모델에서의 생체내 CTL 분석
일부 구현예에서, aCAR 및 iCAR 구조체 둘 모두를 발현하는 T-세포가 동일한 유기체 내에서 표적 세포와 '표적-외' 세포를 구별하고 '표적-외'세포를 살리면서 표적 세포를 효과적으로 살해하는지 여부에 대한 시험은 생체내 CTL 분석에 의해 평가된다.
일부 구현예에서, iCAR 또는 aCAR 또는 iCAR 및 aCAR 둘 모두를 갖는 형질도입된 T 세포를 천연 NOD/SCID/γc- 또는 유사한 마우스에 i.v. 주사한 후, 최대 수시간 후에, iCAR, aCAR 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포를 주사한다. 일부 구현예에서, 이들 표적은 CFSE/CPDE 또는 유사한 세포 추적 염료로 상이한 농도 (고, 중, 저)로 표지되며, 이는 이들을 추가로 구별할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 실시예 5에 기술된 바와 같이 특이적 살해의 백분율이 계산된다.
ii. 인간 이종 이식 마우스 모델에서의 종양 성장 동역학
일부 구현예에서, 상기 종양 세포는 iCAR 표적, aCAR 표적 또는 둘 모두를 발현한다. 일부 구현예에서, aCAR 종양 세포주는 CD19 양성 NALM 6 (ATCC, 인간 BALL 세포주)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 종양 세포 (즉, '종양-외' 세포)는 iCAR 에피토프 (예를 들어, HLA-A2)를 발현하여 건강한 세포를 나타내도록 조작된 NALM 6이다. 일부 구현예에서, NALM 6 및 NAlM 6-HLA-A2는 용이한 검출을 위해 리포터 유전자 (예를 들어 반딧불이 루시페라제)를 발현하도록 또한 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 기계적 수단 (캘리퍼) 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하여 종양 부피를 측정함으로써 모니터링이 수행된다. 일부 구현예에서, 종양 부담이 정량될 수 있고, 침윤성 T-세포 집단은 FACS에 의해 분석될 수 있다.
iii. 형질전환 마우스 모델에서의 독성 및 종양 성장 동역학
일부 구현예에서, 또한, 인간 aCAR 및 iCAR 표적을 발현하는 형질전환 마우스를 사용하여, 형질도입된 T-세포의 효능을 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 효능 및 독성 문제를 모니터링할 수 있게 한다.
C. 생체내 용도: 치료, 바이오 마커
또 다른 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 상기 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계; (ii) 상기 대상체로부터 정상 조직의 샘플, 예를 들어 PBMC를 수득하는 단계; 및 (iii) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하여, 상기 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 바이오마커는 상기 대상체의 치료를 맞춤화하기 위해 사용되므로, 상기 방법은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 단계를 추가로 포함하고, 이는 상기에 정의된 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 iCAR은 (iii)에서 식별된 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 상기 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계; (ii) 상기 대상체로부터 정상 조직의 샘플, 예를 들어 PBMC를 수득하는 단계; 및 (iii) LOH 후보 점수에 기초하여, LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 단계를 포함하며, 여기서 대립유전자 변이체는 상기 대상체에 대한 개인화된 바이오마커로서 식별된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에 정의된 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
유사한 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에서 종양 부담을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에 정의된 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 또는 적어도 상기 aCAR이 발현되는 필수적인 조직에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
또 다른 유사한 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에서 생존을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에 정의된 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자를 치료하거나, 그의 종양 부담을 감소시키거나, 그의 생존을 증가시키는데 사용하기 위한 상기에 정의된 안전한 효과기 면역 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계; (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 상기 암 환자의 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는, 단계; (iii) 본원에서 상기에 정의된 iCAR을 정의하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 본원에서 상기에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 적어도 하나의 본원에서 상기에 정의된 벡터를 선택하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고, 상기 aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는, 단계; (iv) 효과기 면역 세포를 (iii)의 핵산 분자로 형질감염시키거나 효과기 면역 세포를 (iii)의 벡터로 형질도입함으로써, 안전한 재지시된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 제조하거나 얻는 단계; 및 (v) (iv)의 안전한 재지시된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
유사한 측면에서, 본 발명은 LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 안전한 재지시된 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 제공하며, 여기서 상기 안전한 재지시된 면역 세포는 (i) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계; (ii) 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하는 정보를 식별하거나 얻는 단계로서, 여기서 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 상기 암 환자의 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되는, 단계; (iii) 본원에서 상기에 정의된 iCAR을 정의하는 적어도 하나의 핵산 분자 및 본원에서 상기에 정의된 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자, 또는 적어도 하나의 본원에서 상기에 정의된 벡터를 선택하거나 얻는 단계로서, 상기 iCAR은 (i)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하고, 상기 aCAR은 (ii)의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는, 단계; (iv) 효과기 면역 세포를 (iii)의 핵산 분자로 형질감염시키거나 효과기 면역 세포를 (iii)의 벡터로 형질도입함으로써, 안전한 재지시된 효과기 면역 세포의 적어도 하나의 집단을 제조하거나 얻는 단계에 의해 수득된다.
암의 치료 또는 암의 치료에 사용하기 위한 안전한 면역 효과기 세포의 치료에 관한 상기 구현예 중 어느 하나를 언급하는 일부 구현예에서, (i) 상기 iCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; (ii) 상기 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; 또는 (iii) 상기 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 치료는, (iii)의 aCAR을 발현하지만 (iii)의 iCAR을 포함하지 않는 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료와 비교하여, 감소된 표적-상, 종양-외 반응성을 초래한다.
일부 구현예에서, 상기에 정의된 암을 치료하기 위해 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는, 그의 표면 상에, 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 적어도 하우스키핑 단백질 또는 종양의 기원 조직에서 발현되는 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 상기에 정의된 암을 치료하기 위해 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는, 그의 표면 상에, 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 적어도 하우스키핑 단백질 또는 종양의 기원 조직에서 발현되는 항원, 예를 들어 HLA 유전자 (예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR)의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 상기에 정의된 암을 치료하기 위해 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는, 그의 표면 상에, 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 적어도 종양의 기원 조직에서 발현되는 항원, 예를 들어 HLA-A의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 면역 효과기 세포의 하나 초과의 집단이 투여되고, 상기 상이한 집단들은 상이한 유전자 생성물의 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 상이한 쌍의 aCAR 및 iCAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 암을 치료하는 상기 방법에 사용되는 안전한 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포 또는 사이토카인-유도 살해 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는 자가 또는 보편적인 (동종이계) 효과기 세포이다. 일부 구현예에서, 상기에 정의된 암을 치료하는 상기 방법 중 어느 하나에 사용되는 iCAR은 상기 aCAR의 표적-항원이 존재하는 환자의 모든 조직에 대해 지시되며, 여기서 상기 aCAR의 표적 항원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체이며, 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유된다.
일부 구현예에서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병 [LAML], 부신피질 암종 [ACC], 방광 요로상피세포 암종 [BLCA], 뇌 저등급 신경교종 [LGG], 유방 침습성 암종 [BRCA], 자궁경부 편평 세포 암종 및 자궁경내 선암종 [CESC], 담관암종 [CHOL], 결장 선암종 [COAD], 식도 암종 [ESCA], 다형 교모세포종 [GBM], 두경부 편평 세포 암종 [HNSC], 신장 비염색 [KICH], 신장 투명 세포 암종 [KIRC], 신장 유두 세포 암종 [KIRP], 간세포 암종 [LIHC], 폐 선암종 [LUAD], 폐 편평 세포 암종 [LUSC], 림프성 종양 확산성 거대 B-세포 림프종 [DLBC], 중피종 [MESO], 난소 장액 낭선암종 [OV], 췌장 선암종 [PAAD], 크롬친화세포종 및 부신경절종 [PCPG], 전립선 선암종 [PRAD], 직장 선암종 [READ], 육종 [SARC], 피부 흑색종 [SKCM], 위 선암종 [STAD], 고환 생식 세포 종양 [TGCT], 흉선종 [THYM], 갑상선 암종 [THCA], 자궁 암육종 [UCS], 자궁 체부 자궁내막 암종 [UCEC], 포도막 흑색종 [UVM]으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암 치료에 사용하기 위한 iCAR 및/또는 pCAR은 본원에 기술된 임의의 iCAR 및/또는 pCAR이다. 일부 구현예에서, 상기 암, 예를 들어 상기 언급된 암 유형 중 어느 하나를 치료하는데 사용되는 iCAR 및/또는 pCAR는 HLA 유전자 (예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, 또는 HLA-DR, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자)의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, 상기 암, 예를 들어 상기 언급된 암 유형 중 어느 하나를 치료하는데 사용되는 iCAR 은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-C 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하거나, 또는 표 8에 열거된 유전자의 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되고; 상기 암, 예를 들어 상기 언급된 암 유형 중 어느 하나를 치료하는데 사용되는 aCAR은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합한다.
경구 투여의 경우, 약학적 제제는 액체 형태, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 의약품으로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르 또는 분별 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어 결합제 (예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어, 락토스, 미정질 셀룰로스 또는 인산 수소 칼슘); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들어, 라우릴 황산나트륨)를 사용하여 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐제 형태를 취할 수 있다. 상기 정제는 당업계에 널리 공지된 방법으로 코팅될 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 제공하도록 적합하게 제제화될 수 있다.
협측 투여의 경우, 상기 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
상기 조성물은 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 제형, 예를 들어 앰플 또는 다중 투여 용기로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 무발열원 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
상기 조성물은 또한, 예를 들어 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 포함하는 직장 조성물, 예를 들어 좌약 또는 정체관장으로 제제화될 수 있다.
흡입 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은, 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 카트리지 및 캡슐제는 상기 화합물의 분말 혼합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스를 포함하도록 제제화될 수 있다.
명확성을 위해, 그리고 본 교시의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 언급된 수량, 백분율 또는 비율을 나타내는 모든 수, 및 다른 수치는, 모든 경우에서, 용어 "약"이 선행하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 본 명세서에 언급된 수치 파라미터는 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 예를 들어, 각각의 수치 파라미터는, 보고된 유효 자릿수를 고려하고 통상의 반올림 기술을 적용하여 이해될 수 있다.
본원에서, 용어 "약"은 표시된 값의 상하 10% 이하의 값이 또한 포함됨을 의미한다.
예시적인 구현예
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 예시적인 구현예를 제공한다.
1. 핵산 분자로서, 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 또는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 iCAR 또는 pCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 포유류 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 다형성 세포 표면 에피토프는 하우스키핑 유전자 생성물, 예를 들어 HLA 유전자, G-단백질-결합 수용체 (GPCR), 이온 채널 또는 수용체 티로신 키나제, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C; 또는 표 8로부터 선택된 유전자의 다형성 세포 표면 에피토프를 갖는, 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 (i) 항체, 그의 유도체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체; 인간 항체; 항체의 기능적 단편; 나노바디 (nanobody)와 같은 단일-도메인 항체; 재조합 항체; 및 단일쇄 가변 단편 (ScFv); (ii) 항체 모방체, 예를 들어 어피바디 (affibody) 분자; 아필린 (affilin); 아피머 (affimer); 아피틴 (affitin); 알파바디 (alphabody); 안티칼린 (anticalin); 아비머 (avimer); 다르핀 (DARPin); 피노머 (fynomer); 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 펩티드; 및 모노바디 (monobody); 또는 (iii) 앱타머를 포함하는, 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 상기 포유류 조직은 인간 조직이고 상기 관련 포유류 정상 조직은 종양이 발생한 정상 조직인, 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포 또는 사이토카인-유도 살해 세포인, 핵산 분자.
6. 제1항에 있어서, 효과기 면역 세포를 억제할 수 있는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 면역 체크포인트 단백질의 신호전달 요소와 상동성인, 핵산 분자.
7. 제6항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 단백질은 PD1; CTLA4; BTLA; 2B4; CD160; CEACAM, such as CEACAM1; KIRs, such as KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 및 CD94-NKG2A; LAG3; TIM3; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA); 인터페론 유전자의 자극기 (STING); 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)-함유 단백질, T 세포 면역글로불린 및 ITIM 도메인 (TIGIT), 및 아데노신 수용체 (예를 들어, A2aR)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
8. 제1항에 있어서, 상기 세포외 도메인은 가요 성 힌지 및 막횡단 표준적 모티프를 통해 상기 세포내 도메인에 융합되는, 핵산 분자.
9. 벡터로서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하는, 벡터.
10. 제9항에 있어서, 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 적어도 관련 종양 및 정상 조직의 세포에 의해 공유되고, 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는, 벡터.
11. 제10항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하고, 상기 iCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는, 벡터.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는, 벡터.
13. 제10항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는, 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM); KIR2DS 및 KIR3DS와 같은 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 또는 DAP12와 같은 어댑터 분자; 또는 예를 들어 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB) 또는 CD134 (OX40)의 공동자극 신호전달 요소와 상동성인, 벡터.
14. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는, 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는, 벡터.
16. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드를 포함하는, 벡터.
17. 제16항에 있어서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 토세아 아시그나 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 에퀸 리니티스 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)로부터의 P2A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
18. 제10항에 있어서, 가요성 링커를 통해 상기 iCAR에 연결된 구성적 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
19. 제1항 내지 제8항에 정의된 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR)를 제조하는 방법으로서,
(i) 공지된 변이체의 적어도 하나의 데이터베이스로부터 단백질-암호화 유전자의 인간 게놈 변이체의 목록을 검색하는 단계;
(ii) (a) 상응하는 기준 대립유전자와 비교하여 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질에서 아미노산 서열 변이를 야기하는 변이체를 선택하고,
(b) 아미노산 서열 변이가 암호화된 단백질의 세포외 도메인에 존재하는 유전자의 변이체를 선택하고,
(c) 적어도 하나의 종양에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 유전자의 변이체를 선택하고,
(d) (c)에 따라 적어도 LOH를 겪는 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 유전자의 변이체를 선택하여, LOH로 인해 상기 적어도 하나의 종양에서 상실되고 적어도 상기 적어도 하나의 종양의 기원 조직에서 발현되는 각각의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 세포외 도메인에 아미노산 서열 변이를 갖는 변이체의 목록을 획득함으로써, 검색된 변이체의 상기 목록을 필터링하는 단계;
(ⅲ) (ii)에서 획득된 목록으로부터 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 서열 영역을 정의하고, 상기 적어도 하나의 단일 변이체를 포함하는 상기 서열 영역 및 상응하는 기준 대립유전자를 포함하는 서열 영역을 서브클로닝하고 발현하여, 각각의 에피토프 펩티드를 수득하는 단계;
(ⅳ) (iii)에서 수득된, 상기 클로닝된 서열 영역에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드, 또는 상응하는 기준 대립유전자에 의해 암호화되는 에피토프 펩티드에 특이적으로 결합하는 iCAR 결합 도메인을 선택하는 단계; 및
(vii) (iv)에 정의된 iCAR 결합 도메인을 각각 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 iCAR을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
20. 제19항에서, 각각의 변이체에 대한 부수적 대립유전자 빈도는 1, 2, 3, 4 또는 5% 이상인, 방법.
21. 안전한 효과기 면역 세포를 제조하는 방법으로서, (i) 종양-관련 항원에 대해 지시된 TCR-조작된 효과기 면역 세포를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키거나 또는 상기 세포를 제9항의 벡터로 형질도입시키는 단계; 또는 (ii) 천연 효과기 면역 세포를 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질감염시키는 단계; 또는 효과기 면역 세포를 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입시키는 단계를 포함하는, 방법.
22. 안전한 효과기 면역 세포로서, 제21항의 방법에 의해 수득되는, 안전한 효과기 면역 세포.
23. 제22항에 있어서, 그의 표면 상에, 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 상이한 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현하는, 안전한 효과기 면역 세포.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 aCAR의 세포외 도메인은 표 1에 열거된 항원, 예를 들어 CD19로부터 선택된 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는, 안전한 효과기 면역 세포.
25. 제22항에 있어서, 상기 aCAR 및 상기 iCAR은 별개의 단백질로서 세포 표면에 존재하는, 안전한 효과기 면역 세포.
26. 제22항에 있어서, 상기 iCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준은 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준 이상인, 안전한 효과기 면역 세포.
27. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 선택하는 방법으로서,
(i) 상기 대상체로부터 종양 생검을 수득하는 단계;
(ii) 상기 대상체로부터 정상 조직의 샘플, 예를 들어 PBMC를 수득하는 단계;
(iii) LOH로 인해 종양 세포에 의해서는 발현되지 않지만 정상 조직의 세포에 의해서는 발현되는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체를 식별하여,
상기 대상체에 대한 개인화된 바이오마커를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
28. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제22항의 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되는, 방법.
29. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 제22항의 안전한 효과기 면역 세포로서, 상기 iCAR은 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 종양 세포에는 존재하지 않지만 적어도 상기 환자의 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프를 암호화하는 단일 대립유전자 변이체에 대해 지시되는, 안전한 효과기 면역 세포.
30. 제29항의 용도를 위한 안전한 효과기 면역 세포로서, 상기 치료는, (iii)의 aCAR을 발현하지만 (iii)의 iCAR을 포함하지 않는 면역 효과기 세포의 적어도 하나의 집단을 상기 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료와 비교하여, 감소된 표적-상, 종양-외 반응성을 초래하는, 안전한 효과기 면역 세포.
31. 제29항의 용도를 위한 안전한 효과기 면역 세포로서, 그의 표면 상에, 종양-관련 항원 또는 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 aCAR, 및 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인, 적어도 하우스키핑 단백질 또는 종양의 기원 조직에서 발현되는 항원, 예를 들어 HLA-A의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 iCAR을 발현하는, 안전한 효과기 면역 세포.
32. 제28항의 용도를 위한 안전한 면역 효과기 세포로서, 자가 또는 보편적인 (동종이계) 효과기 세포인, 안전한 효과기 면역 세포.
33. 제28항 내지 제32항의 중 어느 한 항의 용도를 위한 안전한 효과기 면역 세포로서, T 세포, 자연 살해 세포 또는 사이토카인-유도 살해 세포로부터 선택되는, 안전한 효과기 면역 세포.
34. 2개 이상의 핵산 분자의 조합으로서, 각각의 핵산 분자는 제어된 효과기 면역 세포 활성화 시스템의 상이한 구성원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 핵산 분자는 단일한 연속적인 핵산 분자를 형성하거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 분자를 포함하고, 상기 제어된 효과기 면역 활성화 시스템은 효과기 면역 세포에게 이형접합성 상실 (LOH)로 인해 하나 이상의 염색체 또는 그의 단편을 상실한 종양 세포를 살해하도록 지시하고 관련 정상 조직의 세포를 살리며,
(a) 제1 구성원은 항원의 비다형성 세포 표면 에피토프 또는 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제1 세포외 도메인을 포함하는 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR) 폴리펩티드를 포함하며, 상기 비다형성 또는 다형성 세포 표면 에피토프는 종양-관련 항원이거나 또는 관련 비정상 및 정상 포유류 조직의 세포에 의해 공유되고;
(b) 제2 구성원은 LOH로 인해 비정상 포유류 조직에 의해 발현되지는 않지만 관련 포유류 정상 조직의 모든 세포에 존재하는 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는 제2 세포외 도메인을 포함하는 조절 폴리펩티드를 포함하는, 2개 이상의 핵산 분자의 조합.
35. 제34항에 있어서, 상기 제1 구성원은,
(a) 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 구성적 aCAR; 및
(b) 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제1 구성원 및 임의로 적어도 하나의 공동자극 신호전달 요소를 포함하지만 활성화 신호전달 요소는 포함하지 않는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 조건부 aCAR로부터 선택되고; 상기 제2 구성원은,
(c) 효과기 면역 세포를 억제하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함하는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR); 또는
(d) 셰다제를 위한 기질을 포함하는 세포외 조절 영역; 막내-절단 프로테아제를 위한 기질을 포함하는 막횡단 표준적 모티프; 및 세포내 도메인을 추가로 포함하는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)이고, 상기 세포내 도메인은 효과기 면역 세포를 활성화 및/또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소 및 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 제2 구성원을 포함하는, 조합.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
(i) 상기 iCAR 또는 pCAR의 세포외 도메인은, 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 것과 상이한 항원인 항원의 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나;
(ii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 항원의 상이한 다형성 세포 표면 에피토프의 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하거나; 또는
(iii) 상기 pCAR 또는 iCAR의 세포외 도메인은 상기 aCAR의 세포외 도메인이 결합하는 동일한 다형성 세포 표면 에피토프의 상이한 단일 대립유전자 변이체에 특이적으로 결합하는, 조합.
37. 제34항에 있어서, 셰다제를 위한 상기 기질은 디스인테그린 및 금속단백분해효소 (ADAM) 또는 베타-세크레타제1 (BACE1)를 위한 기질인, 조합.
38. 제37항에 있어서, 상기 기질은 상기 세포외 도메인의 일부를 형성하고 Lin12/노치 반복부 및 ADAM 프로테아제 절단 부위를 포함하는, 조합.
39. 제34항에 있어서, 막내-절단 프로테아제를 위한 상기 기질은 SP2, γ-세크레타제, 신호 펩티드 펩티다제 (spp), spp-유사 프로테아제 또는 능형 프로테아제를 위한 기질인, 조합.
40. 제39항에 있어서, 상기 기질은 막횡단 표준적 모티프의 일부를 형성하고, 노치, ErbB4, E-카드헤린, N-카드헤린, 에프린-B2, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 CD44의 막횡단 도메인과 상동성이거나, 또는 이로부터 유래하는, 조합.
41. 제34항에 있어서, 개별 단백질로서의 상기 조건부 aCAR의 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 도메인은 막횡단 표준적 모티프에 독립적으로 융합되고 이종이량체화 소분자에 대한 결합 부위의 상이한 구성원을 포함하는, 조합.
42. 제34항에 있어서, 이종이량체화 소분자에 대한 상기 결합 부위의 상기 제1 및 제2 구성원 각각은 하기로부터 유래하는, 조합:
(i) 타크로리무스 (FK506) 결합 단백질 (FKBP) 및 FKBP;
(ii) FKBP 및 칼시뉴린 촉매 아단위 A (CnA);
(iii) FKBP 및 시클로필린;
(iv) FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질 (FRB);
(v) 기라제 B (GyrB) 및 GyrB;
(vi) 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 DHFR;
(vii) DmrB 동종이량체화 도메인 (DmrB) 및 DmrB;
(viii) PYL 단백질 (아브시스산 수용체 및 RCAR로도 알려짐) 및 ABI; 및
(ix) GAI 애기장대 단백질 (지베렐린산 비반응성 및 DELLA 단백질 GAI; GAI로도 알려짐) 및 GID1 애기장대 단백질 (지베렐린 수용체 GID1; GID1로도 알려짐).
긴 표
본원은 긴 표 부분을 포함한다. 상기 표의 사본은 본원과 함께 CD-ROM으로 동시에 제출된다.
실시예
실시예와 관련하여, 다음의 용어가 사용된다.
용어 염색체가 사용되는 경우, 이는 일반적으로 SNP가 존재하는 염색체를 지칭한다. SNP 분석의 경우, 위치는 SNP의 게놈 위치를 지칭한다 (어셈블리 GRCh37.p13). 사용되는 경우 snp_id는 dbSNP rs ID (존재하는 경우)를 지칭한다.
용어 "ref"는 기준 뉴클레오티드 대립유전자를 지칭한다. 용어 "alt"는 대체 뉴클레오티드 대립유전자를 지칭한다.
용어 "품질"은 진유전체 통합 컨소시엄 (Exome Aggregation Consortium (ExAC))의 품질 점수를 지칭한다. 용어 "filter_status"는 ExAC의 필터 정보를 지칭한다.
용어 "allele_frequency"는 ExAC의 전체 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어"max_allele_frequency"는 가장 보편적인 대체 대립유전자의 전체 대립유전자 빈도를 지칭한다 (일반적으로 이는 SNP가 동일한 부위에 2개 초과의 대체 대립유전자를 가지고 있는 경우에만 해당되며, 이는 종종 시퀀싱 오류를 의미할 수 있다).
용어 "het_allele_count"는 이형접합체인 ExAC의 참가자 수를 지칭한다. 용어 "AFR_AF"는 아프리카인 게놈으로부터의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "AMR_AF"는 라틴계 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "EAS_AF"는 동아시아인 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "FIN_AF"는 핀란드인 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "NFE_AF"는 비-핀란드인-유럽인 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "OTH_AF"는 기타 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다. 용어 "SAS_AF"는 남아시아인 게놈에서의 부수적 대립유전자 빈도를 지칭한다.
용어 "max_AF"는 ExAC에서 분류된 집단 중 최대 부수적 대립유전자 빈도를 의미한다 (0.5는 최대 허용가능한 대립유전자 빈도임).
용어 "유전자"는 SNP가 속하는 유전자의 휴고 (HUGO) 기호를 지칭한다.
용어 "hgnc_ID"는 SNP가 속하는 유전자의 HUGO 유전자 명명 위원회 (HUGO Gene Nomenclature Committee) 수치 ID를 지칭한다.
용어 "결과"는 SNP가 번역된 단백질 생성물에 미치는 영향을 의미한다. 이는 missense_variant, frameshift_variant, inframe_deletion, stop_gained를 비롯한 여러 가지 중 하나일 수 있다.
용어 "protein_consequence"는 기준 단백질 전사체 (예를 들어, pArg482Gln) 상에서의 아미노산 치환 및 그의 위치를 보고한다.
용어 "aa_affected"은 공통 단백질 전사체 상의 영향을 받은 아미노산의 수치 위치를 지칭한다.
용어 "allele_1"은 기준 대립유전자에 의해 암호화되는 아미노산을 지칭한다.
용어 "allele_2"는 대체 대립유전자에 의해 암호화되는 아미노산을 지칭한다.
용어 "sift_score"는 SIFT 알고리즘에 의한 아미노산 치환의 예측된 기능적 효과의 해석 및 점수를 지칭한다. sift5.2.2 버전을 사용한다. 점수는 0 내지 1 범위이다. 낮은 점수는 아미노산 치환이 용인될 가능성이 더 많음을 의미한다.
용어 "polyphen_score"는 polyphen 알고리즘에 의한 아미노산 치환의 예측된 기능적 효과의 해석 및 점수를 지칭한다. PolyPhen (v2.2.2)을 사용한다. 점수는 0 내지 1 범위이다. 낮은 점수는 아미노산 치환이 해로울 가능성이 더 많음을 의미한다.
용어 "polyphen_numeric"은 polyphen 알고리즘에서 추출된 수치 단독 점수를 지칭한다.
용어 "protein_domains_affected"는 Gene3D, hmmpanther, 및 Prosite 알고리즘 기반의 예측된 단백질 도메인을 지칭한다.
용어 "BLOSUM_score"는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62의 BLOSUM62 매트릭스를 기반으로 한 아미노산 치환의 점수를 지칭한다. 음의 점수는 진화 과정에서 시간이 지남에 따라 덜 자주 발생한 아미노산 치환 (단백질 기능에 영향을 줄 가능성이 더 큼)을 나타낸다.
용어 "allele_1_one_letter"는 기준 아미노산 대립유전자의 단일 문자 아미노산 코드를 지칭한다.
용어 "allele_2_one_letter"는 대체 아미노산 대립유전자의 단일 문자 아미노산 코드를 지칭한다.
용어 "mono_allelic_expression"은 SNP가 속한 유전자가 인간에서 단일 대립유전자 발현을 겪는지 여부를 지칭한다. Savova 등에 의해 확립된 데이터베이스를 이 주석에 사용하였다7. 이 열에서 1은 유전자가 단일 대립유전자 발현을 나타냄을 나타낸다. 이 열에서 0은 유전자가 Savova 등의 데이터베이스에서 단일 대립유전자 발현을 나타내지 않았음을 나타낸다. 이 열에서 NA은 유전자가 Savova 등의 논문에서 주석이 표시되지 않았음을 나타낸다.
용어 "세포외"는 SNP가 영향을 받은 단백질의 세포외 도메인에 속하는지 여부를 지칭한다. 이 열에서 1은 SNP가 세포외 도메인에 존재함을 나타내고 0은 그렇지 않음을 나타낸다. 단백질 도메인의 주석에 대해 Uniprot를 사용하였다.
용어 "Pdb_id"는, 존재하는 경우, 영향을 받은 단백질의 단백질 데이터뱅크 ID를 지칭한다. 하나의 단백질에 대해 많은 단백질 데이터뱅크 항목이 존재하는 경우, 첫번째 ID만 포함된다.
용어 "aa_context_21aa_allele_1"은 공통 단백질 서열 상의 SNP 아미노산을 둘러싼 21 아미노산 윈도우를 지칭한다. 상기 서열은 공통 단백질 서열의 선행 부분으로부터의 10개의 아미노산으로 이루어진다. 기준 아미노산이 영향을 받은 위치에서의 공통 단백질 서열과 일치하는지를 확인하였다. 이 두 아미노산이 동일하지 않은 경우, 항목에 "공통 이소형에 기반한 uniprot fasta와의 불일치"가 표시된다.
용어 "aa_context_21aa_allele_2": 상기와 동일한 아미노산 윈도우이지만, 아미노산 대립유전자 2를 중간에 삽입함.
용어 "gtex_mean": 조직 전체에 걸친 평균 유전자 발현 (RPKM). 이는 GTEX로부터의 조직 전체에 걸친 중간 RPKM 값의 평균 값으로 이루어진다. 예를 들어, 특정 유전자의 값이 폐 (중간값) = 3, 유방 (중간값) = 2, 췌장 (중간값) = 5 인 경우, 이 항목에 보고된 값은 3.33일 것이다.
용어 "gtex_min": 모든 조직에 걸쳐 조직에 대한 가장 낮은 유전자 발현. 이 값은 모든 조직에 걸친 유전자 발현의 중간값 목록으로부터 도출된다. 예를 들어, 특정 유전자의 값이 폐 (중간값) = 3, 유방 (중간값) = 2, 췌장 (중간값) = 5 인 경우, 이 항목에 보고된 값은 2일 것이다.
용어 "gtex_max": 모든 조직에 걸쳐 조직에 대한 가장 높은 유전자 발현. 이 값은 모든 조직에 걸친 유전자 발현의 중간값 목록으로부터 도출된다. 예를 들어, 특정 유전자의 값이 폐 (중간값) = 3, 유방 (중간값) = 2, 췌장 (중간값) = 5 인 경우, 이 항목에 보고된 값은 5일 것이다.
용어 "gtex_std_dev": 특정 유전자에 대한 조직에 걸친 유전자 발현 값의 표준 편차. 예를 들어, 특정 유전자의 값이 폐 (중간값) = 3, 유방 (중간값) = 2, 췌장 (중간값) = 5 인 경우, 이 항목에 보고된 값은 1.5일 것이다.
용어 "cell_surface_protein_atlas": 단백질이 세포 표면 단백질 아틀라스 (wlab.ethz.ch/cspa/)에서 막 단백질로 주석이 표시되었는지 여부에 대한 이원 마커. 1은 유전자가 이 데이터베이스에서 막 단백질로 주석이 표시되어 있음을 나타낸다.
용어 "human_protein_atlas_membrane_proteins": 단백질이 인간 단백질 아틀라스 (https://www.proteinatlas.org/)에서 막 단백질로 주석이 표시되었는지 여부에 대한 이원 마커. 1은 유전자가 이 데이터베이스에서 막 단백질로 주석이 표시되어 있음을 나타낸다.
용어 "subcellular_map_proteome_membrane_proteins": 단백질이 프로테옴의 세포내 지도 (http://science.sciencemag.org/content/early/2017/05/10/science.aal3321/)에서 막 단백질로 주석이 표시되었는지 여부에 대한 이원 마커. 1은 유전자가 이 데이터베이스에서 막 단백질로 주석이 표시되어 있음을 나타낸다.
용어 "n_membrane_databases_w_gene": 세포막에 발현되는 유전자로 주석이 표시된 유전자를 갖는 데이터베이스의 총 수. 최대 = 3, 최소 = 0.
용어 "membrane_protein_call": 그 유전자를 포함한 막 데이터베이스의 수에 대한 원문 해석. 유전자가 하나의 데이터베이스에 포함된 경우, 판정은 "저신뢰도" 막 단백질이다. 유전자가 2개의 데이터베이스에 포함된 경우, 판정은 "중간-신뢰도" 막 단백질이다. 유전자가 3개의 데이터베이스에 포함된 경우, 판정은 "고신뢰도" 막 단백질이다.
용어 "ratio_gtex_std_dev_to_mean": 조직 전체에 걸친 평균 유전자 발현에 대비한 조직 전체에 걸친 유전자 발현의 표준 편차의 비. 예를 들어, 특정 유전자의 값이 폐 (중간값) = 3, 유방 (중간값) = 2, 췌장 (중간값) = 5 인 경우, 이 항목에 보고된 값은 1.5/3.33= 0.45일 것이다. 이는 조직 전체에 걸친 발현의 균일성의 척도이다. 낮은 값은 유전자가 균일하게 발현됨을 나타낸다. 높은 값은 유전자가 일부 조직에서 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않는 경향이 있음을 암시한다.
용어 "universally_expressed": 유전자가 보편적으로 발현되는 것으로 보이는지 여부에 대한 이원 마커. gtex_mean이 gtex_min인 10 초과인 경우, 유전자가 보편적으로 발현되는 것으로 일컬어진다. 용어 "> 1, 및 ratio_gtex_std_dev_to_mean < 1". 이 열의 1은 해당 유전자가 이들 기준을 충족했음을 나타낸다.
용어 "질환": 스프레드시트의 이 행에서 LOH 데이터에 대해 분석된 질병에 대한 TCGA 바코드.
용어 "mean_expression_in_tissue": 분석된 조직에서의 평균 유전자 발현. 여러 조직 분류가 단일 TCGA 종양 유형에 매핑될 수 있다. GTEX에서의 조직으로부터 TCGA 종양 유형으로의 매핑이 "tcga_disease_tissue_lookup.txt" 파일에 제공된다. 대표적인 샘플은 다음과 같다:
Figure pct00008
용어 "mean_expression_in_other_tissues": 분석된 조직을 제외한 다른 모든 조직에서의 평균 유전자 발현. 예를 들어, 분석되는 유전자가 PSMA (전립선 특이적 유전자)인 경우, 분석된 종양 유형이 PRAD (전립선 선암종)일 때, 이 값은 매우 낮을 것이다.
용어 "cohens_d": 다른 모든 조직에 대비한 분석된 조직에서의 발현의 분리에 대한 코헨의 d (Cohen's d) 척도. 이는 얼마나 많은 이러한 유전자가 분석된 조직에서 고유하게 발현되는지에 대한 척도이다. 높은 코헨의 d는 이 유전자가 분석된 조직에서 고유하게 발현되므로 좋은 aCAR 표적일 수 있음을 암시한다.
용어 "proportion_w_LOH_relative": LOH의 증거를 나타내는 분석된 종양 유형에서의 종양의 비율. LOH를 암시하는 게놈 분절을 호출하기 위한 임계값은 -0.1 (상대 카피 수 단위)이었다. 분절의 상대 카피 수는 종양의 카피 수 신호를 일치된 정상 세포의 카피 수 신호로 나눈 값의 로그였다. 이들 데이터는 cbio 포털에서 획득하였으며 그 기술은 1부에서 검증되었다.
용어 "CI_95_low_relative": 이 유전자좌에서 LOH를 겪는 종양의 비율에 대한 95% 신뢰 구간의 하한. R의 prop.test 함수가 이 계산에 사용되었다. 이 함수는 예이츠의 연속성 보정 (Yates' continuity correction)으로 이항 신뢰 구간을 계산한다.
용어 "CI_95_high_relative": 이 유전자좌에서 LOH를 겪는 종양의 비율에 대한 95% 신뢰 구간의 상한. R의 prop.test 함수가 이 계산에 사용되었다. 이 함수는 예이츠의 연속성 보정 (Yates' continuity correction)으로 이항 신뢰 구간을 계산한다.
용어 "mutsig_hits_on_chr": 암의 유발자인 것에 대한 통계적 유의성 (q-값 < 0.25)을 통과하는 SNP와 동일한 염색체 상의 유전자. Mutsig 2.0 알고리즘이 사용되었다. 형식은 "유전자 기호, q=q-값; 유전자 기호 2,…"이다
용어 "tsg_on_chr_mutated_in_disease": mutsig로부터의 통계적 유의성을 통과하는 유전자 중 하나가 종양 억제 유전자인지 여부에 대한 이항 지시 변수. 이 주석에 사용되는 종양 억제 유전자의 목록은 Vogelstein 등9에 의해 발표된 표로부터의 목록이었다. 이 열에서 1은 유전자가 종양 억제 유전자로 주석이 표시되어 있음을 나타낸다.
용어 "hallmark_tsg_on_chr_mutated_in_disease": 분석된 종양 유형에서 현저하게 돌연변이된 것으로 식별된 SNP와 동일한 염색체 상의 유전자 중 임의의 것이 "홀마크" 종양 억제 유전자인지 여부에 대한 이항 지시 변수. "홀마크" 종양 억제 유전자는 종양 발달 초기에 돌연변이될 가능성이 더 높은 매우 잘 검증된 종양 억제 유전자의 작은 목록이다. 이들 유전자는 TP53, PTEN, APC, MLL3, MLL2, VHL, CDKN2A, 및 RB1이었다. 이 열의 1은 이들 홀마크 TSG 중 하나가 해당 SNP와 동일한 염색체에 존재하고 분석된 종양 유형에서 현저하게 돌연변이됨을 나타낸다.
용어 "gistic_deletion_n_peaks": SNP가 속하는 염색체의 GISTIC 피크 수. 숫자가 높을수록 이 염색체에 유전 물질의 상실을 유발하는 선택적 힘이 더 많다는 것을 암시한다.
용어 "gistic_deletion_best_q_value: SNP가 속하는 염색체에서의 게놈 상실에 대한 최저 GISTIC q-값. 매우 낮은 q-값은 염색체 어딘가에서 게놈 물질을 상실할 수 있는 현저한 선택적 압력이 있음을 암시한다.
용어 "proportion_of_patients_eligible": i) SNP의 생식계열 이형접합성 및 ii) 종양에서의 SNP의 LOH를 갖는 환자의 추정된 비율. SNP의 생식계열 이형접합성을 갖는 환자 비율의 추정치는 이형접합체 비율 방정식 = 2pq를 사용하여 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 취한다. 여기서 p는 SNP의 전체 대립유전자 분율이며 q = 1-p이다.
용어 "proportion_of_patients_eligible_max_ethnicity_targeted": i) SNP의 생식계열 이형접합성 및 ii) 종양에서의 SNP의 LOH를 갖는 환자의 추정된 비율. SNP의 생식계열 이형접합성을 갖는 환자 비율의 추정치는 이형접합체 비율 방정식 = 2pq를 사용하여 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 취한다. 여기서 p는 SNP의 최대 집단-제한 대립유전자 분율이며 q = 1-p이다. 예를 들어, 어떤 경우에는 사용된 집단이 아프리카인일 수 있고, 어떤 경우에는 남아시아인일 수 있다.
용어 "cumulative_score": SNP가 iCAR 표적에 대해 어느 정도 양호한 후보인지 정도를 정량하는 점수. 점수는 0에서 이론적 1 사이이다. 이 점수의 계산에 대한 자세한 내용은 "후보 SNP 순위를 매기기 위한 누적 점수" 부분을 참조한다.
실시예 1. 암들에 대한 HLA 유전자의 LOH 비율 평가
서론:
암 세포에서 게놈 상실에 의해 발생하는 취약점을 해결하기 위한 치료 전략이 제안된다. 제안된 전략은 활성화-CAR T-세포 (aCAR) 및 억제성-CAR T-세포 (iCAR)의 조합을 사용하여, 모계 및 부계 대립유전자에 대해 이형접합성인 세포막 단백질을 암호화하는 게놈 분절을 상실한 표적 종양 (즉, 다형성 단백질 암호화 변화를 가짐)을 보다 안전하게 표적화한다.
상기 iCAR의 표적이 비종양 조직에 의해서만 발현되는 경우, iCAR은 항종양 효능을 감소시키지 않으면서 CAR-T 요법의 종양-외 독성을 감소시킬 수 있다. iCAR 표적이 비종양 세포에 의해서만 발현되는 이러한 시나리오 중 하나는 iCAR 항원이, 종양 세포에서 결실된 게놈의 일부에 의해 암호화되는 경우 발생한다. 고도로 다형성이고 모든 세포에서 발현되는 것으로 알려진 하나의 유전자 패밀리는 HLA이다.
HLA 단백질은 포유류 세포에 의해 거의 보편적으로 발현되어, 면역계의 세포에 비자기 항원의 제시를 가능하게 한다. HLA 유전자는 또한 정량적으로 고도로 발현되는 경향이 있어서, 치료 표적화에 보다 적합하다. HLA 유전자의 RNA 발현은 게놈에서의 다른 단백질 암호화 유전자의 99.3%보다 높다 (도 4). HLA 유전자의 평균 조직 발현 및 그의 게놈 위치는 CD-ROM에 제공된 긴 표뿐만 아니라 표 3에도 포함되어 있다.
이 섹션의 목표는 HLA 유전자가 빈번하게 결실되는 암 유형을 식별하는 것이다. 2차 분석은 HLA 유전자좌에서의 게놈 상실의 유발자를 식별하려는 시도를 포함한다.
본 발명자들은 HLA 유전자의 빈번한 카피-상실을 유발한 선택적 압력을 갖는 암을 식별하기 위한 세부 계획을 실행하였다 (도 5).
ABSOLUTE 데이터를 사용한 종양 유형 전체에 걸친 HLA 상실의 빈도:
본 발명자들은 ABSOLUTE 알고리즘에 의해 처리된 TCGA의 카피 수 프로파일을 사용하여 HLA-A의 대립유전자 상실률의 실측 추정치를 평가하였다. 공개적으로 이용가능한 ABSOLUTE 분할된 카피-수 데이터를 (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn1710464.2)1로부터 다운로드하였다. ABSOLUTE 알고리즘은 단일 암 게놈 내의 각각의 대립유전자 분절의 정수 카피 수준을 출력한다. 6번 염색체 (HLA 유전자좌를 보유함)의 단일 카피가 상실되는 경우, 대립유전자 카피 수는 유지된 분절의 경우 1일 것이고 상실된 분절의 경우 0일 것이다. 이형접합성의 카피-중성 상실의 경우, 보유된 분절은 카피 수 2를 가질 것이고 상실된 분절은 카피 수 0을 가질 것이다. ABSOLUTE에 의해 처리된 공개적으로 이용가능한 카피 수 데이터는 12종의 종양 유형에 대해 입수가능하였다 (표 4). 폐 편평 세포 암종 (LUSC)은 다른 종양 유형과 비교하여 HLA-A LOH의 빈도가 가장 높았다 (도 6). 자궁/자궁내막 암 (UCEC)은 모든 평가가능한 종양 중에서 HLA-A LOH의 빈도가 가장 낮았다 (AML 샘플은 ABSOLUTE 데이터가 입수불가능하여 포함되지 않았음). HLA-A 유전자의 588개 결실 중, 어느 것도 유전자내 중단점을 갖지 않았다 (도 7). HLA-A 유전자의 대부분의 결실은 염색체의 많은 부분을 포함하였다 (도 8). AML 샘플의 경우 ABSOLUTE 카피 수 데이터를 이용할 수 없었지만, 이들 샘플에서의 상대 카피 수 데이터의 수동 검사에서 결실되지 않은 것으로 나타났다 (도 11).
ABSOLUTE 카피 수 데이터와 비교한 상대 카피 수 데이터의 검증:
본 발명자들은 공개적으로 이용가능한 것만큼 많은 종양 유형의 LOH 빈도를 획득하기 위해 노력하였다. 그러나 이들 데이터는 ABSOLUTE에 의해 처리되지 않았으며, ABSOLUTE에 의해 처리할 미가공 데이터가 공개적으로 이용가능하지 않았다. 대신, 본 발명자들은 TCGA로부터 32종의 종양 유형에 대한 상대 카피 수 데이터를 사용하였다 (도 13). 이들 데이터는 cbioportal (cbioportal.org/data_sets.jsp)로부터 다운로드되었다. 상대 카피 수 데이터는 종양 샘플의 Affymetrix SNP 6.0 어레이로부터 획득되었다.
상대 카피 수 데이터로부터 LOH의 정확한 추정치를 획득할 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 ABSOLUTE로부터의 LOH 데이터를 이미 가지고 있었던 종양에 대한 상대 데이터를 사용하여 LOH의 비율을 계산하였다. 이들 데이터는 분할된 카피 수 파일로 이루어졌다. 각 부분에는 상대 카피-비가 할당된다. 카피 비는 일치된 정상 세포와 비교하여 종양에서의 신호의 밀도의 비의 로그로 정의된다 (Affymetrix 어레이). 일치된 대조군 (일반적으로 말초 혈액으로부터의 것임)으로의 정규화는 생식계열 카피-수 변이체가 실수로 체세포로 해석되는 것을 제거하는데 도움이 된다. 해당 게놈 분절의 상대 카피 수가 특정 임계값 미만인 경우, 그 분절은 게놈 상실을 겪은 것으로 일컬어진다. 예를 들어, 321번 분절의 상대 카피 수가 -0.4이고 카피-상실에 대한 임계값이 -0.3인 경우, 321번 분절은 카피-상실을 겪은 것으로 일컬어지며, 본 발명자들은 직접적인 대립유전자 정보를 갖고 있지 않기 때문에, 이는 또한 LOH를 겪은 것으로 일컬어진다.
본 발명자들은 먼저, 상대 카피 수 분절을 표지하기 위한 최적 카피 수 한계를 LOH를 겪은 것으로서 결정하는 것을 시도하였다. LOH의 ABSOLUTE 및 상대 카피 수 추정치의 일치는 상대 카피 수에 대한 한계 -0.1에서 가장 높았다 (표 5 및 도 9). 이 임계값은 또한 TCGA Tumorscape 포털 (http://portals.broadinstitute.org/tcga/home)에서 카피-상실을 정의하기 위해 TCGA 카피 수 군에 의해 사용되는 임계값이다. 상대 데이터 대 절대 데이터에서 HLA-A LOH를 갖는 개체의 분율 사이의 상관관계는 0.55였다. 이 상당히 높은 상관관계는 본 발명자들로 하여금 이용가능한 상대 카피 수 데이터를 이용하여 모든 종양 유형의 분석을 진행할 수 있게 해주었다.
상대 카피 수 데이터를 사용한 32종의 종양 유형 전체에 걸친 HLA-LOH 환자의 분율
HLA-A의 LOH를 갖는 환자의 부분을 TCGA로부터 이용가능한 32개의 종양 모두에 대해 계산하였다 (도 10a; COAD 및 READ를 함께 분석함). 가장 높은 비율의 HLA-A LOH를 갖는 종양은 신장 비염색 암이었다. 가장 낮은 비율의 HLA-A LOH를 갖는 종양은 포도막 흑색종이었다 (표 6). 본 발명자들이 이 분석에서 도출한 LOH의 비율이 게놈 위치의 작은 변화에 강하다는 것을 보장하기 위해, 본 발명자들은 HLA-A의 상류 및 하류 유전자의 LOH 비율을 분석하여, 이들의 HLA-LOH의 비율이 HLA-A와 유사한지를 확인하였다. 예측한 바와 같이, 상류 및 하류 유전자인 HLA-G 및 ZNRD1 각각의 LOH의 비율은 HLA-A와 정확히 동일하였다. (도 3a 내지 3c). 이들 데이터는 HLA-A LOH 호출이 게놈 위치에서의 작은 편차에 강하다는 것을 입증한다. 다음으로, 본 발명자들은 다른 HLA 유전자들 (A, B, C)이 HLA-A에 비해 유사한 LOH 비율을 가지고 있는지를 측정하고자 하였다. 이들 유전자는 모두 6p 염색체 상의 1.3Mb 영역에 속한다. 게놈 거리에 있어, 이는 작은 영역이다. 본 발명자들은 HLA-B 및 HLA-C에 대해 HLA-A 분석을 반복하였다. LOH의 패턴은 분석된 32개의 종양 전체에 걸쳐 3개의 HLA 유전자 모두에서 거의 동일하였다 (도 10a 내지 도 10c).
HLA-A LOH 비율에 대한 선택 압력의 추가
종양내 게놈 이형접합성은 지금까지 분석된 거의 모든 인간 암의 최근 이해된 특징이다2, 3. 종양 세포의 일부에만 존재하는 유전자 변경을 표적화한 요법은 상기 변경을 보유한 종양 세포에만 영향을 미칠 수 있다. 종양 세포에 존재하지 않는 항원을 표적화하는 iCAR 전략은, 항원이 클론적으로 결실되지 않은 경우, 일부 종양 세포를 aCAR 공격으로부터 보호할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 HLA 유전자가 클론 LOH를 겪을 가능성이 있는 종양을 식별하고자 하였다. 진화 초기에 발생하는 LOH는 종양 개시 및/또는 유지의 선택적 힘에 의해 유발될 가능성이 있다. 따라서 본 발명자들은 3가지 방법으로 6번 염색체 (HLA 유전자좌를 보유함) 상의 종양 억제제를 찾아보았다. 먼저, 본 발명자들은 평가된 각각의 종양 유형에서 6번 염색체에서 현저하게 돌연변이된 유전자를 찾아보았다4. 스프레드시트는 "chr6_mutsig_sig_genes" 열에 6번 염색체 상의 현저한 돌연변이를 가진 유전자를 보고하고 있다.
둘째로, 본 발명자들은 결실된 종양 억제제를 의미할 가능성이 있는 현저하게 결실된 유전자의 영역을 찾아보았다. 이들 데이터에 대해 GISTIC2.0 실행 결과를 사용하였다. 스프레드시트는 6번 염색체 상의 GISTIC 결실 피크 수 (q<0.25)와 이들 결실 피크의 최저 q-값을 보고하고 있다. 일반적으로 GISTIC 결실 피크가 많고 q-값이 낮을수록 선택 압력이 강하다. 그러나, 하나의 매우 강한 GISTIC 피크가 우세하고 피크 수가 적은 시나리오를 갖는 것도 가능하지만, 유발자의 유의성은 확실하다. 일반적으로, 최저 q-값은 특정 염색체 상의 종양 억제자 유발자 존재의 가장 강한 상관물이어야 한다.
셋째로, 본 발명자들은 각각의 종양에서 현저하게 돌연변이된 유전자 세트를 공지된 종양 억제 유전자 목록과 중첩시켜 상기 돌연변이된 유전자 중 임의의 것이 6번 염색체의 상실을 유발할 가능성이 있는지를 확인였다5. 본 발명자들은 가능한 돌연변이 유발자를 갖는 2종의 종양 유형을 식별할 수 있었다. 부신피질 암종에서, DAXX 유전자가 현저하게 돌연변이되었고 (q=.0571), 확산성 거대 B 세포 림프종에서는 TNFAIP3 유전자가 현저하게 돌연변이되었다 (q=0.00278). DAXX는 히스톤 샤페론을 암호화하며, 그의 돌연변이는 부신피질 암종에서의 더 긴 텔로미어와 관련이 있다6. TNFAIP3는 NF-카파B 신호전달의 음성 조절인자를 암호화한다. 따라서 DLBCL에서 발생하는 이 유전자의 돌연변이는 NF-카파B의 신호전달을 증가시키는 것으로 나타났다7.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
상기에 근거하여, 본 발명자들은 HLA 영역 LOH가 많은 종양에서 보편적인 사건이지만 LOH의 백분율은 종양 유형에 따라 다른 것으로 결론지었다. 따라서, HLA 유전자는 iCAR 표적에 대한 양호한 후보이다.
실시예 1에 대한 참고문헌:
1. Zack TI, Schumacher SE, Carter SL, Cherniack AD, Saksena G, Tabak B, Lawrence MS, Zhsng CZ, Wala J, Mermel CH, Sougnez C, Gabriel SB, Hernandez B, Shen H, Laird PW, Getz G, Meyerson M, Beroukhim R. Pan-cancer patterns of somatic copy number alteration. Nature genetics. 2013;45:1134-1140
2. Gibson WJ, Hoivik EA, Halle MK, Taylor-Weiner A, Cherniack AD, Berg A, Holst F, Zack TI, Werner HM, Staby KM, Rosenberg M, Stefansson IM, Kusonmano K, Chevalier A, Mauland KK, Trovik J, Krakstad C, Giannakis M, Hodis E, Woie K, Bjorge L, Vintermyr OK, Wala JA, Lawrence MS, Getz G, Carter SL, Beroukhim R, Salvesen HB. The genomic landscape and evolution of endometrial carcinoma progression and abdominopelvic metastasis. Nature genetics. 2016;48:848-855
3. Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Math M, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, Martinez P, Matthews N, Stewart A, Tarpey P, Varela I, Phillimore B, Begum S, McDonald NQ, Butler A, Jones D, Raine K, Latimer C, Santos CR, Nohadani M, Eklund AC, Spencer-Dene B, Clark G, Pickering L, Stamp G, Gore M, Szallasi Z, Downward J, Futreal PA, Swanton C. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England journal of medicine. 2012;366:883-892
4. Lawrence MS, Stojanov P, Mermel CH, Robinson JT, Garraway LA, Golub TR, Meyerson M, Gabriel SB, Lander ES, Getz G. Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21 tumour types. Nature. 2014;505:495-501
5. Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Jr., Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science. 2013;339:1546-1558
6. Zheng S, Cherniack AD, Dewal N, Moffitt RA, Danilova L, Murray BA, Lerario AM, Else T, Knijnenburg TA, Ciriello G, Kim S, Assie G, Morozova O, Akbani R, Shih J, Hoadley KA, Choueiri TK, Waldmann J, Mete O, Robertson AG, Wu HT, Raphael BJ, Shao L, Meyerson M, Demeure MJ, Beuschlein F, Gill AJ, Sidhu SB, Almeida MQ, Fragoso M, Cope LM, Kebebew E, Habra MA, Whitsett TG, Bussey KJ, Rainey WE, Asa SL, Bertherat J, Fassnacht M, Wheeler DA, Cancer Genome Atlas Research N, Hammer GD, Giordano TJ, Verhaak RGW. Comprehensive pan-genomic characterization of adrenocortical carcinoma. Cancer cell. 2016;29:723-736
7. Compagno M, Lim WK, Grunn A, Nandula SV, Brahmachary M, Shen Q, Bertoni F, Ponzoni M, Scandurra M, Califano A, Bhagat G, Chadburn A, Dalla-Favera R, Pasqualucci L. Mutations of multiple genes cause deregulation of nf-kappab in diffuse large b-cell lymphoma. Nature. 2009;459:717-721
실시예 2. 이형접합성 상실을 겪는 발현된 세포-표면 단백질을 암호화하는 생식계열 대립유전자의 전장 게놈 식별
서론:
상기 iCAR의 표적이 비종양 조직에 의해서만 발현되는 경우, 억제성-CAR-T 세포는 항종양 효능을 감소시키지 않으면서 CAR-T 요법의 종양-외 독성을 감소시킬 수 있다. iCAR 표적이 비종양 세포에 의해서만 발현되는 이러한 시나리오 중 하나는 iCAR 항원이, 종양 세포에서 결실된 게놈의 일부에 의해 암호화되는 경우이다. 이 워크플로우 섹션의 목표는 이러한 대립유전자를 식별하는 것이다.
대립유전자 식별:
본 발명자들은 진유전체 통합 컨소시엄 (Exome Aggregation Consortium (ExAC)) 데이터베이스를 분석의 입력으로 사용하였다 (exac.broadinstitute.org). ExAC 데이터베이스는 다양한 집단-수준 시퀀싱 연구로부터의 총 60,706개의 진유전체를 모은 것이다1. ExAC는 대체 대립유전자와 비교한 기준 대립유전자의 수 (대립유전자 빈도)를 비롯한 각각의 변이체에 대한 정보를 포함한다. 대립유전자 빈도 정보는 표 7에 설명된 바와 같이 데이터베이스 내의 소집단으로 확장된다.
Figure pct00013
ExAC 데이터베이스로부터의 변이체에 다음 필터를 적용하였다: i) 변이체는 암호화된 단백질의 아미노산 조성에 영향을 미쳐야 한다; ii) 변이체는 표 6의 집단 중 적어도 하나에서 0.05 (5%) 초과의 부수적 대립유전자 빈도를 가져야 한다. 분석은, 부수적 대립유전자가 0.5 (50%) 초과의 대립유전자 분율을 가진 시나리오에 대해 보정되었다. 한 부위에서 3개 초과의 대립유전자가 관찰된 경우, 가장 일반적인 치환이 사용되었다 (이들 부위는 종종 시퀀싱 오류 부위이므로 주의해서 해석해야 한다).
SNP 중 임의의 것이 다음의 변이체 계열 중 임의의 것을 생산한 경우, SNP가 단백질의 구성에 영향을 미치는 것으로 간주되었다: 'missense_variant', 'inframe_deletion', 'start_lost','stop_gained', 'inframe_insertion', 'stop_retained_variant', 'frameshift_variant', 'stop_lost', 'coding_sequence_variant', 'protein_altering_variant'.
분석은 9,362,319개의 변이체로 시작하였고 29,904개의 변이체가 이들 두 필터를 통과하였다. 이들 변이체는 10,302개의 유전자에 속한다. 이들 두 필터와 매칭되는 모든 대립유전자가 분석에 포함되었다.
발현된 유전자의 식별:
본 발명자들은 다양한 조직 유형에서 발현되는 유전자의 식별을 위해 유전자형-조직 발현 (Genotype-Tissue Expression (GTEX)) 데이터베이스 v6p (dbGaP Accession phs000424.v6.p1)를 사용하였다 (https://gtexportal.org/home/)2. GTEX 데이터베이스는 다양한 건강한 조직 유형의 8,555개 인간 샘플에 대한 RNA-시퀀싱으로 이루어져 있다. 이 데이터베이스로부터 여러 주석을 획득하였다. 먼저, 본 발명자들은 모든 조직에 걸쳐 각각의 유전자의 평균 발현을 측정하였다. 각각의 유전자에 대한 평균 발현은 조직 당 중간값 발현 데이터를 취하고 조직 전체에 대해 이들 값의 평균을 계산함으로써 계산되었다. 이들 데이터는 https://gtexportal.org/home/datasets에서 이용가능한 GTEx_Analysis_v6p_RNA-seq_RNA-SeQCv1.1.8_gene_median_rpkm.gct 파일에서 획득하였다.
각각의 종양 유형에 상응하는 각각의 유전자의 평균 발현도 포함되었다. 이들 데이터를 얻기 위해, 본 발명자들은 종양 유형을 상응하는 정상 조직에 매핑하였다. 예를 들어, 췌장암 TCGA 데이터는 GTEX의 췌장 조직으로 주석이 표시될 것이다. 일부 경우에서, 상기 매핑은 더 근사치였다. 예를 들어, 교모세포종 발현 데이터는 GTEX에서 뇌로 주석이 표시된 모든 조직으로부터 매핑되었다. 이들 매핑을 포함하는 표 (제목: tcga_disease_tissue_lookup.txt)를 첨부하였다. 각각의 조직/종양 유형에서의 각각의 유전자의 동종성 또는 과발현을 평가하기 위해 여러 측정값이 계산되었다. 각각의 종양 유형에 대해, 유전자의 가능한 과발현을 확립하기 위해 코헨의 D 점수를 계산하였다. 특정 조직에서 과발현되는 유전자는 양호한 aCAR 표적일 가능성이 높다. 반대로, 본 발명자들은 조직 전체에 걸친 유전자 발현의 표준 편차를 측정하고 이것을 모든 조직에 걸친 평균 발현과 비교하였다. 이 비가 낮은 경우, 해당 유전자는 모든 조직에 걸쳐 균일하게 발현된다. 모든 조직에 걸쳐 균일한 발현을 갖는 유전자가 더 양호한 iCAR 표적일 가능성이 높다.
유전자가 다음 기준을 충족하는 경우 "보편적으로 발현된" 것으로 지칭된다: (i) 조직 전체에 걸친 평균 발현이 10 RPKM 초과이다. (ii) 발현이 가장 적은 조직이 1 초과의 RPKM을 가졌다. (iii) 평균 RPKM과 비교하여 조직 전체에 걸친 중간값 RPKM의 표준 편차의 비가 1 미만이었다. 1,092개의 유전자만이 보편적으로 발현된 것으로 주석이 표시되었다.
후보는 UniProt 주석만을 기초로 하여 선택되었다. 막횡단 단백질의 경우, 일반적으로 세포외 단백질의 분절에 대한 명확한 예측이 존재한다.
표 8은 염색체 위치에 따라 분류된 세포외 다형성 에피토프를 갖는 상기 방법에 의해 식별된 1167개의 양호한 후보 유전자의 목록을 제시한다.
대립유전자의 주석
단백질 기능에 대한 대립유전자의 영향:
iCAR이 막 단백질의 하나의 대립유전자를 상실한 암 세포만을 효과적으로 인식하기 위해서는, 어느 대립유전자가 암호화되는지에 따라 그 단백질의 구조가 충분히 상이해야 한다. 생성된 단백질에 대한 각각의 SNP의 효과를 정량하기 위해 몇 가지 측정이 수행되었다. 먼저, 보고된 SNP 변이체 유형 (예를 들어, 미스센스, 넌센스)가 '결과' 열에 보고되었다. 공통 단백질 번역에 대한 효과는 'protein_consequence' (예를 들어 p.Arg482Gln) 열에 포함되었다. SIFT 알고리즘은 단백질 변이체가 단백질 구조에 영향을 미쳐 기능할지 여부를 예측하고자 한다6. 점수는 0 (유해) 내지 1 (양성)의 범위일 수 있다. SIFT 점수 (sift5.2.2 버전)는 점수가 이용가능한 모든 SNP에 대해 포함되었다. 예를 들어 프레임시프트 돌연변이에 대해서는 점수가 이용가능하지 않았다. 변이체가 단백질 구조 및 기능에 영향을 줄 수 있는 가능성을 예측하기 위해 PolyPhen (v2.2.2)이 또한 사용되었다. Polyphen 알고리즘은 SIFT와 반대 방식으로 점수를 보고하며, 점수 0은 양성에 해당하고 점수 1은 유해에 해당한다.
아미노산 치환이 구조적 변화를 유도할 가능성에 대한 하나의 전형적인 척도는 BLOSUM62 치환 매트릭스를 사용하는 것이다. 본 발명자들은 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62로부터 BLOSUM62 매트릭스를 다운로드하였다. 각각의 SNP는 그의 치환에 상응하는 BLOSUM62 점수로 주석이 표시되었다.
단백질의 세포외 부분에 속하는 대립유전자의 분류:
iCAR이 대립유전자를 인식하기 위해서는, 상기 대립유전자가 단백질의 세포외 부분에 속해야 한다. 각각의 SNP에 대해, 본 발명자들은 공통 번역에서 영향을 받은 아미노산의 위치를 추출하고, 이것을 Uniprot 데이터베이스로부터의 세포외로 주석이 표시된 도메인과 비교하였다. Uniprot 데이터베이스는 www.uniprot.org/downloads로부터 다운로드하였다. 모든 단백질의 도메인에 대한 특성화 결여로 인해 많은 거짓 음성이 가능하다. 1167개 유전자의 총 3288개의 SNP가 세포외로 주석이 표시되었다 (표 8).
SNP의 펩티드 컨텍스트의 주석:
분석된 대립유전자의 펩티드 컨텍스트는 이들 서열을 인식하는 항체를 생성하려고 할 때 중요할 가능성이 있다. 본 발명자들은 SNP에 의해 암호화되는 아미노산을 선행하며 플랭킹되는 10개의 아미노산을 참조로 포함한다 (총 21개의 아미노산 서열). 공통 아미노산 서열에 대해 uniprot 데이터베이스를 사용하였다. 본 발명자들은, 잘못된 서열을 포함하지 않도록 하기 위해, uniprot 데이터베이스 서열이 예측된 위치에서 SNP에 의해 암호화되는 아미노산과 일치하지 않은 임의의 충돌을 주석 표시하였다. 이들 21개의 아미노산 서열은 Bepipred와 같은 B-세포 에피토프 예측 프로그램에 대한 입력으로서 유용할 수 있다.
암-특이적 주석:
LOH를 겪는 종양의 비율
제안된 요법으로부터 혜택을 받을 수 있는 종양을 갖는 환자를 찾기 위해서는, iCAR 표적이 많은 양의 종양에서 이형접합성 (LOH) 상실을 겪는 SNP이어야 할 것이다. 분절 카피 수 파일을 cbio 암 게놈학 포털 http://www.cbioportal.org/에서 다운로드하였다8. 예로서, 모든 SNP에 대해 LOH를 겪는 포도막 흑색종 종양의 비율을 도 12에 도시하였다.
후보 SNP를 보유한 염색체 상의 잠재적인 유발자 변경
게놈 표적 요법의 가능한 내성 메커니즘 중 하나는 의도된 게놈 변경 중 하나가 암 세포의 일부에만 존재하는 경우이다. 종양 발생의 가장 초기 단계에 존재할 가능성이 있는 표적을 식별하려고 시도하는 메커니즘 하나는 각각의 종양에 대한 유발자 사건을 식별하는 것이다. 종양 억제 유전자 불활성화의 가장 빈번한 메커니즘은 돌연변이되지 않은 염색체의 돌연변이 및 후속 LOH이다. 본 발명자들은 각각의 종양 유형에서 이 과정을 겪을 가능성이 있는 유발자 유전자, 특히 종양 억제 유전자 (TSG)를 찾기 위해 시도하였다. 본 발명자들은 이 분석에서의 모든 종양에 대한 MUTSIG 2.0 실행 결과를 사용하여 각각의 종양 유형에서 현저하게 돌연변이된 유전자를 식별하였다. 본 발명자들은 현저하게 돌연변이된 유전자 중 하나가 TP53, PTEN, APC, MLL3, MLL2, VHL, CDKN2A, RB1을 비롯한 "홀마크" 종양 억제 유전자의 목록에 포함되어 있는지 여부에 주석을 표시하였다. 마지막으로, 유발자 유전자, TSG 및 "홀마크" TSG의 목록은, 이들이 SNP와 동일한 염색체에 속하는 경우, SNP에 주석이 표시되었다.
후속적으로 LOH를 겪는 유발자 유전자의 돌연변이는 종양 진화 초기에 발생하기 쉬운 사건을 표시할 수 있는 하나의 메커니즘이고, 종양 억제 유전자를 포함하는 게놈 분절의 초점 결손은 또 다른 메커니즘이다. 본 발명자들은 GISTIC 알고리즘을 사용하여 평균보다 높은 비율로 게놈 결실을 겪는 DNA 영역을 식별하였다. GISTIC 알고리즘은 이들 영역에서 음의 선택적 압력을 나타내는 염색체 아암을 따라 통계적 유의성의 "피크"를 식별한다. 각각의 SNP에 대해, 본 발명자들은 SNP가 속한 염색체 상의 결실 피크 수를 기록하였다. 본 발명자들은 또한 이들 피크 중 임의의 것의 최저 q-값을 기록하였다. q-값이 낮을수록 선택 압력이 강함을 암시한다.
후보 SNP 순위를 매기기 위한 누적 점수:
후보 SNP에 대한 연속적인 "점수"를 제공하기 위해, 본 발명자들은 더 양호한 SNP 후보와 관련이 있는 몇 가지 상이한 메트릭을 조합하였다. 점수는 다음 중 각각의 백분위 점수의 곱으로 이루어진다:1. 해당 SNP에서 LOH를 갖는 종양의 비율 (높을수록 양호함) 2. 대립유전자의 유병률 (높을수록 양호함) 3. 조직 전체에 걸친 발현 값의 표준 편차 대 중간값의 비 (낮을수록 양호하고, 더 일관성이 있음) 4. 염색체에 종양 억제 유전자가 존재하는지 여부 (갖는 것이 갖지 않는 것보다 더 좋음).
설명을 위해, 이론적 SNP의 점수를 계산한다. SNP의 32%만이 염색체에 종양 억제 유전자를 갖는 경우, 이를 갖는 것에 대한 백분위 점수는 0.68일 것이다. 대립유전자가 0.49의 부수적 대립유전자 분율 (여기서 0.5가 가능한 최고 값임)을 갖는 경우, 백분위 점수는 0.99일 것이다. LOH의 비율이 0.10이고 SNP의 75%가 이보다 많은 LOH를 가진 경우, 백분위 점수는 0.25일 것이다. 이 SNP를 보유하는 유전자에 대해 중간값에 대한 조직 전체에 걸친 발현 값의 표준 편차의 비가 1.3이고, 이것이 다른 유전자의 90%보다 우수한 경우, 백분위 점수는 0.9이다. 이 경우 이 SNP의 총점은 0.68*0.99*0.25*0.9=0.15일 것이다.
0.4 초과의 점수를 갖는 SNP는 "탑 히트 (top-hit)"로 간주되었다.
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실시예 3. KICH 샘플에서의 HLA LOH의 검증을 위한 DNA 시퀀싱 분석
라이브러리 제조 및 시퀀싱
목적- 가상 실험 분석에 기초하여, KICH 암이 HLA LOH 예측의 습식 검증을 위한 제1 종양 유형으로 선택되었다. 목표는 정상 조직으로부터 유래한 DNA에 기초하여 각각의 환자에 대한 HLA 유전자형을 식별한 다음, HLA 대립유전자 중 하나의 상실을 식별하기 위해 암 조직에서 HLA 동종이인자형을 분석하는 것이었다.
이를 위해, 6개의 냉동된 일치된 KICH 샘플 (정상 및 암)인 RC-001-RC003, TNEABA1l, TNEABNWE, 2rDFRAUB, 2RDFRNQG, IOWT5AVJ, IOWT5N74로부터 유래한 DNA에 대해 HLA 동종이인자형을 측정하였다. 또한, 2개의 DNA 일치된 샘플인 OG-001-OG-002 (정상 및 암)를 분석하였다. 샘플의 HLA 타이핑을 식별하기 위해 DNA 라이브러리를 제조하여 서열 분석을 수행하였다. 6개의 냉동된 일치된 KICH 샘플 (정상 및 종양)로부터 DNA를 추출하고, 하기에 기술된 바와 같이 라이브러리를 제조하였다.
Genotypic Technology Pvt. Ltd. (Bangalore, India)에서 TruSight® HLA v2 시퀀싱 패널 (Illumina, San Diego, California, U.S.A.)을 사용하여 TruSight HLA 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다.
간략하게 설명하면, TruSight HLA 시퀀싱 키트에 제공된 프라이머를 사용하여 HLA 앰플리콘을 생성하였다. 아가로스 겔에서 앰플리콘을 확인한 후, 키트에 제공된 샘플 정제 비드를 사용하여 앰플리콘을 세척하였다. 앰플리콘을 정규화하고 태그먼트화 (Tagmentation) 반응에 의해 단편화하였다. 태그먼트화 후 각각의 개별 샘플의 상이한 앰플리콘을 수집하고 농축 PCR을 진행하였다. Nextera XT Index Kit v2 (Illumina)를 사용하여 농축 PCR 동안 샘플의 바코딩을 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 샘플 정제 비드를 사용하여 정제한 후 라이브러리의 품질 관리 점검을 수행하였다. 라이브러리를 Qubit 형광계 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 의해 정량하고 그의 단편 크기 분포를 Agilent 바이오분석기 (Bioanalyzer)에서 분석하였다.
Illumina 어댑터 서열:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [i5] TCGTCGGCAGCGTC
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [i7] GTCTCGTGGGCTCGG
[i5, i7] - 샘플-특이적 시퀀싱 데이터를 식별하는 고유한 이중 인덱스 서열
하기의 표는 상기 샘플들의 HLA 유전자형을 나타낸다.
하기에서 볼 수 있듯이, 본 발명자들은 상기 분석으로부터 상실된 대립유전자를 유추할 수 있으며, 예를 들어, 환자 #RC001은 종양 샘플에서 HLA-A30 대립유전자의 상실을 나타내고 HLA-32에 대해 반접합성이 되며; 환자 #RC003은 종양 샘플에서 HLA-1을 상실하고 HLA-30에 대해 반접합성이 된다. 식별된 상실 대립유전자는 각각의 환자에 대한 관련 iCAR을 결정한다. 종양 샘플이 정상 세포로 오염된 경우는, 이 방법에서 명확한 HLA 대립유전자 상실을 나타낼 수 있다.
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진유전체 시퀀싱
HLA 시퀀싱 외에도, 본 발명자들은 HLA-LOH를 확인하고 게놈 전체에 걸쳐 추가적인 LOH 사건을 식별하기 위해 진유전체 시퀀싱을 수행하였다.
Illumina 페어드 엔드 원시 판독 (paired end raw read) (150X2, HiSeq)은 FastQC를 사용하여 품질을 확인하였다. 최소 판독 길이 50 bp 및 최소 염기 품질 30의 파라미터를 사용하여, 어댑터 클리핑 (clipping) 및 저품질 염기 트리밍 (trimming)을 위한 Trim Galore 소프트웨어로 Illumina 원시 판독을 처리하였다. 처리된 판독은 Bowtie2를 사용하여 기준 인간 게놈 (hg19)에 정렬되었다. 이어서, 각각의 샘플에 대한 정렬된 .bam 파일을 처리하여 최종 PCR 복제물이 제거된 .bam 파일을 획득하고 Qualimap을 사용하여 정렬 품질을 확인하였다.
SAMtool 및 BCFtool을 사용하여 변이체를 식별하였다. 이 경우, 각각의 쌍의 샘플 (각각의 정상 및 종양 쌍)의 변이체를 식별하기 위해 공동 유전형 분석을 수행한다. 따라서 각각의 쌍에 대해 병합된 .vcf가 생성된다. > 20의 판독 심도 임계 값 및 > 30의 매핑 품질을 사용하여 이들 병합된 .vcf 파일 각각으로부터 잠재적인 변이체를 식별한다. 필터링된 병합된 .vcf의 각각의 쌍으로부터, 샘플에 관한 .vcf 파일을 생성하였다. 필터링된 변이체에 대해, Variant Studio를 사용하여 유전자, 단백질 변화 및 변이의 영향에 대해 추가로 주석을 표시하였다.
하기 표는 상기 샘플들에 대한 염색체 상실 정도를 기술한다. RC001, RC002 및 RC003은 HLA 유전자를 암호화하는 6번 염색체를 비롯한 광범위한 염색체 상실을 나타내며, 따라서 이들 샘플의 경우, 1, 2, 3, 4 (RC002의 경우), 5, 6, 8 (RC003의 경우), 9 (RC001, RC002), 10 (RC001, RC003), 11 (RC003), 13 (RC001, RC003), 14 (RC002), 17 (RC001, RC003), 19 (RC001), 21 (RC001, RC003), 22(RC001, RC002)번 염색체에 암호화된 많은 다른 표적뿐만아니라, HLA를 iCAR 표적으로 사용할 수 있다.
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RC001에 대해, 도 14는 17번 염색체에 암호화된 종양 억제 단백질 TP53에 인접한 염색체 영역의 상실을 도시한다. iCAR 표적으로 식별된 17번 염색체에 암호화된 유전자를 사용하여 환자 RC001을 치료할 수 있다.
약어: ADP, 아데노신 디포스페이트; ALL, 급성 림프구성 백혈병; AML, 급성 골수성 백혈병; APRIL, 증식 유도 리간드; BAFF, TNF 패밀리의 B 세포 활성화 인자; BCMA, B 세포 성숙 항원; BCR, B 세포 수용체; BM, 골수; CAIX, 탄산 탈수 효소 IX; CAR, 키메라 항원 수용체; CEA, 암배 항원; CLL, 만성 림프성 백혈병; CNS, 중추 신경계; CSPG4, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4; DC, 수지상 세포; ECM, 세포외 매트릭스; EGFR, 표피 성장 인자 수용체; EGFRvIII, EGFR의 변이체 III; EphA2, 에리트로포이에틴-생산 간세포 암종 A2; FAP, 섬유아세포 활성화 단백질; FR-α, 엽산 수용체-알파; GBM, 다형 교모세포종; GPI, 글리코실포스파티딜이노시톨; H&N, 두경부; HL, 호지킨 림프종; Ig, 면역글로불린; L1-CAM, L1 세포 부착 분자; MM, 다발성 골수종; NB, 신경모세포종; NF-KB, 핵 인자-KB; NHL, 비호지킨 림프종; NK, 자연 살해; NKG2D-L, NKG2D 리간드; PBMC, 말초 혈액 단핵 세포; PC, 원형질 세포; PLL, 전림프구성 백혈병; PSCA, 전립선 줄기 세포 항원; PSMA, 전립선-특이적 막 항원; RCC, 신장 세포 암종; ROR1, 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1; TCL, T 세포 백혈병/림프종; Th2, T 헬퍼 2; TNBC, 삼중 음성 유방암; TNFR, 종양 괴사 인자 수용체; VEGFR-2, 혈관 내피 성장 인자-2.
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실시예 4. 단백질 수준에서의 LOH의 검증
대립유전자 특이적 항체를 사용하여 정상 세포 대 종양 세포 샘플의 차별적 염색에 의해 단백질 수준에서 LOH를 검출할 수 있다. 예를 들어, 암 샘플에서의 HLA-LOH의 검증은 환자의 HLA 동종이인자형에 특이적인 상업적 HLA 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 하기 표 11은 이용가능한 대립유전자-특이적 항체에 대한 예를 상세히 기술한다.
샘플은 하기의 IHC 프로토콜에 기술된 바와 같이 면역 조직 화학 (IHC) 염색을 거친다.
Figure pct00045
IHC 프로토콜
냉동 조직 샘플 -
냉동 조직은 종종 포르말린계 용액에 고정되고 시료의 냉동절단을 가능하게 하는 OCT (최적 절단 온도 화합물 (Optimal Cutting Temperature compound))에 포매된다. OCT 내의 조직은 -80℃에서 냉동 상태로 유지된다. 냉동 블록은 절단 전에-80℃에서 제거되고, 저온 챔버에서 평형화되고, 얇은 절편 (종종 5-15 μm 두께)으로 절단된다. 절편을 조직학 슬라이드에 장착한다. 슬라이드는 -20℃ 내지 -80℃에서 저장될 수 있다. IHC 염색 전에 슬라이드를 실온 (RT)에서 10-20분 동안 해동시킨다.
파라핀-포매된 조직 -
조직을 포름알데히드 고정 용액에 포매한다. 파라핀 왁스를 첨가하기 전에, RT에서 특정 횟수 및 지속시간 동안, 증가하는 농도의 에탄올 (70%, 90%, 100%) 및 자일렌에 점진적으로 침지시킴으로써 조직을 탈수시킨다. 이어서, 조직을 파라핀 왁스에 포매한다.
파라핀-포매된 조직을 마이크로톰에서 5-15 μm 두께의 절편으로 절단하고, 56℃ 수조에 부유시킨 후 조직학 슬라이드에 장착한다. 슬라이드는 RT에서 유지될 수 있다.
IHC 염색 전에, 파라핀-포매된 절편은 재수화 단계를 필요로 한다. 재수화 - 자일렌에 침지 (2 X 10분)시킴으로써 절편을 재수화시키고, 감소하는 농도의 에탄올을 첨가한다 (100% X2, 각각 10분간 95% 에탄올 - 5분간 70% 에탄올 - 5분간 50% 에탄올 - 5분간 dH2O에서 세정).
면역 형광 검출:
프로토콜:
1. 세척 완충액 (PBSX1)에서 10분 동안 슬라이드를 재수화시킨다. 세척 완충액을 제거한다.
2. 필요한 경우 항원 복구를 수행한다 (열-유도 항원 복구 또는 효소 복구).
3. 세포내 항원의 경우, 투과화를 수행한다 (슬라이드를 PBSX1 중 0.1% 트리톤 X-100에서 RT에서 10분 동안 배양한다).
4. 차단 - RT에서 30분 동안 차단 완충액에서 조직을 차단한다. 차단 완충액은 검출 방법에 의해 결정되며, 일반적으로 PBSX1 중 5% 동물 혈청 또는 PBSX1 중 1% BSA이다.
5. 1차 항체 - 항체 제조사의 지시에 따라, 배양 완충액 (예를 들어 PBS 중 1% 당나귀 혈청, 1% BSA이며, 다른 배양 완충액이 사용될 수도 있음)에 1차 항체를 희석한다. 희석된 1 차 항체에서 4℃에서 밤새 조직을 배양한다. 1차 항체는 상기 상세히 기술된 단일클론 항-HLA-A, 항-HLA-B 또는 항-HLA-C 대립유전자-특이적 항체일 수 있다.
ㆍ 접합된 1차 항체가 사용되는 경우, 빛으로부터 보호하고 단계 8로 진행한다.
ㆍ 음성 대조군으로서, 1차 항체 없이 배양 완충액만으로 조직을 배양한다.
ㆍ 또한, 실험에 사용된 단일클론 항체의 이소타입 일치된 대조군을 수행한다.
ㆍ
6. 세척 - 세척 완충액에서 슬라이드를 세척한다 (3 X 5-15분).
7. 2차 항체 - 항체 제조사의 지시에 따라, 배양 완충액에 2차 항체를 희석한다. 희석된 2차 항체에서 RT에서 30-60분 동안 조직을 배양한다. 빛으로부터 보호한다.
8. 세척 - 세척 완충액에서 슬라이드를 세척한다 (3 X 5-15분).
9. DAPI 염색 - DAPI 배양 완충액을 희석한다 (약 300 nM - 3μM). 각각의 절편에 300 μl의 DAPI 용액을 첨가한다. RT에서 5-10분 동안 배양한다.
10. 세척 - X1 PBS로 슬라이드를 1회 세척한다.
11. 안티페이드 장착 매체 (antifade mounting media)로 장착한다.
12. 슬라이드를 빛으로부터 보호한다.
13. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화한다.
발색 검출:
프로토콜:
1. 세척 완충액 (PBSX1)에서 10분 동안 슬라이드를 재수화시킨다. 세척 완충액을 제거한다.
2. 필요한 경우 항원 복구를 수행한다 (상기 참조).
3. HRP 시약의 경우, 메탄올 중 3.0% 과산화수소로 적어도 15분 동안 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단한다.
4. 절편을 dH2O에 5분 동안 침지시킴으로써 이를 세척한다.
5. 세포내 항원의 경우, 투과화를 수행한다 (슬라이드를 PBSX1 중 0.1% 트리톤 X-100에서 RT에서 10분 동안 배양한다).
6. 차단 - RT에서 30분 동안 차단 완충액에서 조직을 차단한다. 차단 완충액은 검출 방법에 의해 결정되며, 일반적으로 PBSX1 중 5% 동물 혈청 또는 PBSX1 중 1% BSA이다.
7. 1차 항체 - 항체 제조사의 지시에 따라, 배양 완충액 (예를 들어 PBS 중 1% 당나귀 혈청, 1% BSA이며, 다른 배양 완충액이 사용될 수도 있음)에 1차 항체를 희석한다. 희석된 1 차 항체에서 4℃에서 밤새 조직을 배양한다.
8. 세척 - 세척 완충액에서 슬라이드를 세척한다 (3 X 5-15분).
9. 2차 항체 - HRP-접합된 2차 항체에서 RT에서 30-60분 동안 조직을 배양한다.
10. 세척 - 세척 완충액에서 슬라이드를 3 X 5-15분 세척한다.
11. 제조사 지침에 따라 ABC-HRP 시약을 첨가한다. RT에서 60분 동안 배양한다.
12. 제조사 지침에 따라 DAB 용액 (또는 다른 색소원)을 제조하고 조직 절편에 적용한다. 발색 반응은 에피토프 부위를 갈색으로 만든다 (일반적으로 수초 내지 10분). 신호 강도가 이미징에 적합한 경우 다음 단계로 진행한다.
13. 세척 - 세척 완충액에서 슬라이드를 세척한다 (3 X 5-15분).
14. dH2O에서 슬라이드를 세척한다 (2 X 5-15분).
15. 핵 염색 - 헤마톡실린 용액을 첨가한다. RT에서 5분 동안 배양한다.
16. 조직 절편을 탈수시킨다 (95% 에탄올 - 2 X 2분. 100% 에탄올 - 2 X 2분. 자일렌 - 2 X 2분).
17. 안티페이드 장착 매체 (antifade mounting media)로 장착한다.
18. 명시야 조명 (bright-field illumination)을 사용하여 슬라이드를 시각화한다.
실시예 5. CAR-T 설계 및 구축
본 연구의 목적은 CAR-T 요법의 표적-상 '종양-외' 효과를 억제하는 합성 수용체를 생성하는 것이다. 이를 위해 활성화 및 억제성 CAR로 구성된 CAR 구조체의 라이브러리를 확립하였다.
구조체의 제1 세트는 HLA I형 서열 (HLA-A2)에 대해 지시된 억제성 CAR 및 종양 항원 (CD19)에 대해 지시된 활성화 CAR을 포함하였다. 개념의 증명을 위해 사용될 다음 구조체 세트는 CD19에 대해 지시된 활성화 CAR 서열 및 CD20에 대해 지시된 억제성 CAR 서열을 포함한다. 미래 생물 정보학 분석에 의해 식별된 표적 항원에 대해 지시된 추가적인 구조체를 구축한다. 표적 후보는 제시된 기준에 따라 우선 순위가 결정된다 (예시적인 기준은 표적 발현 패턴, 표적 발현 수준, 항원성 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않음). CD19 aCAR, CD20 iCAR 및 HLA-A2 iCAR은 도 15 및 도 21에 기술된 대로 구축되었다.
iCAR 구조체는 상업적 DNA 합성을 사용하여 설계 및 합성되었다. PD-1 (아미노산 145-288)의 제1 주석이 표시된 세포외 도메인까지의 막횡단 및 세포내 도메인을 HLA-A2 scFv 하류에 융합시켰다 (HLA-A2를 암호화하는 DNA 서열은 항-HLA-A2를 생산하는 하이브리도마 BB7.2 (ATCC cat #: HB-82)로부터 회수하였음).
CTLA4 (아미노산 161-223) 또는 추가적인 음성 면역 조절인자 (예를 들어 2B4, LAG-3 및 BTLA-4)로부터 유래한 다른 서열을 갖는 유사한 구조체를 설계하고 이들의 신호전달 서열을 HLA-A2 scFv의 하류에 융합시킨다.
iCAR 검출 및 분류를 위해, 리포터 유전자 (예를 들어, eGFP)를 IRES 서열을 통해 iCAR 서열의 하류에 통합시킨 후, 도 15에 도시된 바와 같이 P2A 서열에 의해 분리된 항생제 내성 유전자 (즉, 하이그로마이신)를 추가하였다.
aCAR 구조체의 경우, CD19 scFV를 CD8 힌지 서열로 구성된 2세대 CAR 구조체에 융합시킨 후, CD28 막횡단 및 41BB 공동자극 1 및 CD3ζ를 추가하였다. 다른 신호전달 또는 구조적 요소로 구성된 추가적인 aCAR 구조체를 또한 설계 및 구축한다 (예를 들어, CD28 힌지, CD28 신호전달 도메인 또는 CD28 및 41BB 신호전달 도메인 둘 모두). aCAR 검출 및 분류를 위해, RFP 리포터 유전자를 IRES 서열을 통해 aCAR 서열의 하류에 통합시킨 후, P2A 서열에 의해 분리된 항생제 내성 유전자 (즉, 퓨로마이신 내성)를 추가하였다 (도 15).
aCAR 및 iCAR 서열 모두 렌티바이러스 전달 벡터로 클로닝한 후 HEK-293T 패키징 세포를 사용하여 바이러스 입자 생산에 사용하였다.
실시예 6. 효과기 세포의 제조
CD19 CAR 활성화 조절에 대한 iCAR 구조체의 효과를 연구하기 위해, 하기 표 12에 상세히 기술된 바와 같이 재조합 저캇 효과기 세포를 구축하였다. 저캇 (ATCC TIB152), CD4+ T-세포주 및 저캇-NFAT (BPS Biosciences로부터 구입한 저캇 세포주, NFAT 반응 요소의 제어하에 반딧불이 루시페라제 단백질을 발현하도록 조작됨)를 레트로넥틴-코팅된 (Takara) 렌티바이러스 벡터 결합된 플레이트를 사용하여 또는 폴리브렌의 존재하에 형질도입하였다. 형질도입된 세포에 추가로 항생제 선택을 실시하여 표 12에 기술된 세포주를 수득하였다. 선택 후, 세포에 유세포 분석을 실시하여 각각의 구조체에 암호화된 리포터 단백질의 발현을 확인하였다.
Figure pct00046
또한, 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액으로부터 유래한 활성화된 T-세포를, 상이한 감염다중도 (MOI)로, aCAR, iCAR 또는 둘 모두를 암호화하는 바이러스 입자로 형질도입한다. 리포터 유전자 발현에 기초한 FACS 선택은 상이한 수준의 aCAR, iCAR 또는 둘 모두를 발현하는 세포 집단의 분류 및 선택에 사용된다.
실시예 7. 표적 세포의 제조
표적-외 세포에 대한 상기 aCAR의 활성을 억제하는데 있어서의 iCAR 구조체의 기능성을 시험하기 위해 시험관내 재조합 시스템을 확립하였다. 이를 위해, 상기 aCAR 에피토프, iCAR 에피토프 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포를 생산하였다. 상기 aCAR 에피토프를 발현하는 재조합 세포는 '표적-상' '종양-상' 세포를 나타내는 반면, aCAR 및 iCAR 에피토프 둘 모두를 발현하는 세포는 '표적-상' '종양-외' 건강한 세포를 나타낸다.
본 발명자들의 제1 iCAR/aCAR 세트는 각각 HLA-A2 및 CD19에 기초한 것이므로, HLA-A2, CD19 또는 둘 모두를 발현하는 재조합 세포가, 세포주 (예를 들어, 헬라 (Hela), ATCC CRM-CCL-2,헬라-루시페라제-GenTarget SCO32-Bsd 또는 라지-ATCC CCL-86)를 이들 유전자를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생산되었다.
재조합 HLA A-2 발현의 검출을 위해 Myc 태그를 삽입하였다. CD20 iCAR/CD19 aCAR로 구성된 제2 iCAR/aCAR 세트에 대해, CD20 또는 CD19 또는 둘 모두를 발현하는 재조합 세포를 구축하였다 (표적 세포는 표 15에 상술됨).
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
분석-
iCAR의 억제 효과는 시험관내 및 생체내 모두에서 시험된다.
시험관내 분석에서, 본 발명자들은 사이토카인 분비 및 세포독성 효과 측정에 중점을 두었으며, 생체내에서는, '표적-상 종양-외' 이종 이식편에 대한 iCAR 억제 및 보호를 평가하였다. 본 발명자들은, 리포터 유전자를 사용하여 T-세포를 iCAR/aCAR 이중 양성으로 분류함으로써, iCAR이 결여된 T-세포가 결과를 오염시키는 것을 제한하였다. iCAR 차단 활성에 대한 음성 대조군으로서, scFv 도메인이 결여된 CAR로 형질도입된 (즉, 모의 형질도입) T-세포를 사용할 수 있다.
실시예 8. 시험관내 분석
루시페라제 세포독성 T 림프구 (CTL) 분석
반딧불이 루시페라제 및 하나 또는 2개의 CAR 표적 항원을 발현하도록 조작된 전술된 Hela-Luc 재조합 표적 세포를 사용하여 분석을 수행한다. 시험관내 루시페라제 분석은 Bright-Glo 루시페라제 분석 제조사 프로토콜 (Promega) 및 판독값으로서의 생물 발광에 따라 수행한다.
T-세포 (iCAR 및 pCAR 둘 모두 또는 iCAR 및 aCAR 또는 aCAR 또는 모의 CAR로 형질도입됨)는 HLA-A2, CD19, 또는 CD19 및 HLA-A2 둘 모두, 또는 CD20, 또는 CD20 및 CD19 둘 모두를 발현하는 재조합 표적 세포와 함께 상이한 효과기 대 표적 비로 24-48시간 동안 배양된다. 세포 살해는 Bright-Glo 루시페라제 시스템을 사용하여 정량한다.
'종양-외' 세포독성은, iCAR/aCAR 발현 수준에 따라 형질도입된 T 세포 집단을 분류하거나, 또는 이들의 CD19, HLA-A2 또는 CD20 발현 수준에 따라 재조합 표적 세포의 하위 집단을 선택함으로써, 최적화한다. iCAR 형질도입된 T-세포가 시험관내에서 '종양-상' 과 '종양-외' 세포를 구별할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 1:1 이상의 비로 '종양-상'과 '종양-외'의 혼합물과 함께 배양된 형질도입된 T-세포의 살해 효과를 시험한다. '종양-상' 재조합 세포는 루시페라제 발현에 의해 "종양-외" 재조합 세포와 구별된다 (하나의 세포 집단만이 특정시간에 루시페라제 유전자를 발현하도록 조작됨). 24-48시간의 공동 배양 후 살해를 정량한다.
카스파제 3 활성 분석 - 항-활성화된 카스파제 3 (CASP3)에 의한 CTL 유도된 세포자멸사의 검출.
세포독성 T-세포가 표적 세포를 살해하는 경로 중 하나는 Fas 리간드를 통해 세포자멸사를 유도하는 것이다. 카스파제의 순차적 활성화는 세포자멸사의 실행 단계에서 중요한 역할을 한다. 프로-카스파제 3에서 카스파제 3으로의 절단은 형태적 변화 및 촉매 활성의 발현을 초래한다. 카스파제 3의 절단된 활성화 형태는 단일클론 항체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
형질도입된 T-세포는, CFSE 또는 다른 세포 추적 염료 (예를 들어, CellTrace Violet)로 이전에 표지된 '종양-상' 또는 '종양-외' 재조합 세포와 함께 2-4시간 동안 공동 배양된다. 내부 염색 키트 (예를 들어 Miltenyi 또는 BD bioscience)에 의한 세포 투과화 및 고정 후, 활성화된 CASP3는 특정 항체 염색 (BD bioscience)에 의해 검출되고, 세포자멸사 표적 세포는 유세포 분석에 의해 검출되고 정량된다.
시간 경과 현미경 CTL
형질도입된 T 세포를 '종양-상' 또는 '종양-외' 세포와 함께 최대 5일 동안 배양한다. 시간 경과 현미경을 사용하여 살해를 시각화한다. 대안적으로, 종점 시점에서의 표적 세포 수를 측정하기 위해 생존가능한 세포 수 염색 및 CountBright 비드 (Invitrogen)를 사용한 유세포 분석을 수행한다.
시험관내에서 표적을 식별함에 있어서의 aCAR/iCAR 형질도입된 T 세포의 효력을 입증하기 위해, 각각의 재조합 표적 세포 ('종양-상' 또는 '종양-외')를 상이한 리포터 단백질 (예를 들어 GFP 및 mCherry)로 표지한다. 하나 또는 2개의 표적 항원 (표적 세포)을 발현하는 재조합 세포의 혼합물과 함께 형질도입된 T-세포 (효과기 세포)를 상이한 E/T 비율로 공동 배양한다. 각 세포주의 운명을 현미경 이미징으로 관찰한다.
사이토카인 방출
T-세포 활성화시, 세포는 사이토카인을 분비하고, 이는 T-세포 활성화 및 억제를 평가하기 위해 정량되고 사용될 수 있다. 사이토카인은 세포내에서 유세포 분석에 의해 또는 ELISA 또는 세포질 비드 어레이 (CBA)에 의한 배지 내의 분비된 단백질의 측정에 의해 검출될 수 있다.
ELISA에 의한 분비된 사이토카인의 정량
iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T-세포 (저캇 또는 1차 T-세포)와 iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 항원 둘 모두를 세포 표면에 발현하는 변형된 표적 세포의 공동 배양 후, 조정 배지를 수집하고, 사이토카인 ELISA (제조사 지침 (예를 들어 BioLegened 또는 이와 유사한 것)에 따라 IL-2, INFγ 및/또는 TNFα) 및 세포질 비드 어레이 (Miltenyi 또는 이와 유사한 것)에 의해 사이토카인의 농도를 측정한다.
IL-2 ELISA에 의해 측정된 iCAR 특이적 억제
도 16a에 도시된 바와 같이, 저캇 CD19 aCAR 및 저캇 CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR 효과기 세포를 라지, 라지-HLA-A2 및 Thp1 표적 세포와 공동 배양하고, ELISA에 의한 IL-2 측정을 위해 상응하는 상층액을 수집하였다. CD19를 발현하는 라지 표적 세포 ('종양')와 저캇 CD19-aCAR/HLA-A2-iCAR의 배양은 IL-2 분비를 나타내었지만, CD19 및 HLA-A2 둘 모두를 발현하는 라지-HLA-A2 표적 세포 ('종양-외')와 이들 효과기 세포의 배양은 80% 초과의 IL-2 분비 억제를 초래하였다. 반대로, CD19 aCAR 저캇 세포를 라지 또는 라지-HLA-A2 표적 세포와 함께 배양한 경우 IL-2 분비는 영향을 받지 않았다 (도 16b). 이 결과는, 하기에 기술된 NFAT 활성화 분석과 함께, 상기 iCAR 구조체가 종양 세포에서 발현되지 않는 항원을 발현하는 정상 세포를 특이적으로 보호하는 효능을 나타낸다.
유세포 분석에 의한 사이토카인 방출의 정량
사이토카인 세포내 축적을 가능하게 하기 위해, 세포 표면에 iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 표적 항원 둘 모두를 발현하는 재조합 표적 세포와 함께 6-24시간 동안 공동 배양된, iCAR 또는 aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T-세포 (저캇 또는 1차 T-세포)에 골지 수송 차단자 (예를 들어, 브레펠딘 A, 모넨신)를 적용한다. 이어서, T-세포를 내부 염색 키트 (예를 들어 Miltenyi)에 의해 투과화 및 고정시키고, 항 CD3 및 CD8로, IL-2 및/또는 INFγ 및/또는 TNFα에 대해 염색한다.
세포 계측 비드 어레이 (Cytometric Bead Array (CBA)) 분석에 의해 측정된 사이토카인 분비
세포 계측 비드 어레이 (CBA)는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 비롯한 다양한 가용성 세포내 단백질을 측정하는데 사용된다.
세포 표면 상에 iCAR 및 aCAR 둘 모두 또는 aCAR 또는 iCAR 표적 항원을 발현하는 변형된 표적 세포로, aCAR 또는 aCAR 및 iCAR 구조체 (효과기 세포) 둘 모두로 형질 도입된 T-세포 (1차 T-세포 또는 저캇 세포)를 자극한다 (도 17a). 수시간의 공동 배양 후 효과기 세포는 효과기 상태를 나타내는 사이토카인을 생산하고 분비한다. 반응 상층액을 수집하고, 분비된 IL-2를 다중 CBA 분석에 의해 측정하고 정량하였다.
도 17b에 도시된 바와 같이, 두 표적 항원 모두를 발현하는 표적 세포와 공동 배양된 aCAR/iCAR 형질도입된 저캇 T 세포에 대해, IL-2 분비의 특이적 억제가 입증되었다. 이중 CAR (aCAR/iCAR) 형질도입된 세포가 두 표적 항원 모두를 발현하는 표적 세포와 공동 배양된 경우, 동일한 효과기 세포와 하나의 표적만을 발현하는 표적 세포의 공동 배양으로부터 생성된 IL-2 분비와 비교하여, IL-2 분비에 있어 86%의 감소가 나타났다.
NFAT 활성화 분석
NFAT 활성화에 의해 측정된 T-세포 활성화의 측정을 위해, 표 12에 상술된 바와 같이, 저캇-NFAT 세포를 aCAR 및 iCAR의 상이한 조합으로 형질도입하였다. 표 13에 기술된 바와 같이, CD19 aCAR, HLA-A2 iCAR 또는 둘 모두를 발현하는 효과기 저캇-NFAT 세포주를 CD19 (라지 세포-'표적-상') CD19 및 HLA-A2 (라지-HLA-A2 '종양-외') 둘 모두 또는 HLA-A2 (Thp1 '종양-외')와 공동 배양하였다. 양성 대조군으로서, NFAT 신호전달에 필요한 칼슘 방출을 유발하는 PMA 및 이오노마이신의 존재하에 효과기 세포를 자극하였다. 16시간의 37℃ 배양 후, 제조사의 지시에 따라 BPS Biosciences 키트인 "One step luciferase assay system"을 이용하여 루시페라제를 정량하였다. 예측한 바와 같이, CD19-CAR 구조체를 발현하는 저캇 NFAT 세포주는 CD19를 발현하는 라지 세포주의 존재하에 특이적으로 활성화된 반면, CD19를 발현하지 않는 Thp1 세포주와 이들 세포를 공동 배양한 경우, 활성화가 나타나지 않았다 (도 18).
CD19 aCAR 유도된 NFAT 활성화에 대한 HLA-A2 iCAR의 억제 효과는 도 21에서 확인할 수 있다. CD19 aCAR 및 HLA-A2 iCAR 둘 모두를 발현하는 저캇-NFAT-세포주는, CD19 및 HLA-A2를 발현하는 라지-HLA-A2와 공동 배양된 경우, CD19만을 발현하는 라지 세포에 의해 유도된 활성화와 비교하여 특이적으로 억제되었다. 대조적으로, CD19-CAR만을 발현하는 저캇-NFAT 세포주는 라지 및 라지-A2 세포주 둘 모두에 의해 유사하게 활성화되었다. 이들 조건에서, NFAT 활성화 억제는 약 30%로 계산되었다 (도 19).
상이한 E/T 비의 효과를 시험하였다. 10:1, 5:1, 1:1의 E/T 비로 분석을 여러 번 반복하였다. 도 20에 제시된 결과는 더 높은 E/T 비에서 증가된 억제 효과가 얻어질 수 있음을 나타낸다. 결과는 '종양-외' 표적 세포와 각각의 효과기 세포주의 공동 배양으로부터의 평균 발광 값 대 '표적-상' 제시 세포와의 공동 배양으로부터의 평균 값의 비로서 제시된다. 나타난 바와 같이, CD19 aCAR 및 HLA-A2 둘 모두를 발현하는 저캇-NFAT-세포주는, CD19 및 HLA-A2 단백질을 발현하는 라지-HLA-A2와 공동 배양된 경우 특이적으로 억제되었지만, 이 세포주가 CD19만을 발현하는 라지 세포주와 함께 공동 배양된 경우에는 억제가 검출되지 않았다. 반대로, CD19 aCAR을 발현하는 저캇-NFAT 세포주는, 공동 배양된 CD19 발현 표적 세포주 (라지 또는 라지-HLA-A2)와 관계없이 동일하게 활성화되었다.
CD107a 염색에 의해 측정된 T-세포 탈과립 분석
T 세포의 탈과립화는 리소좀 관련 막 단백질 (LAMP-1) 인 CD107a의 표면 발현에 의해 식별될 수 있다. LAMP-1의 표면 발현은 CD8 T 세포 세포독성과 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 이 분자는 리소좀의 내강 측에 위치한다. 활성화시, CD107a는 활성화된 림프구의 세포막 표면으로 전달된다. CD107a는 세포 표면에서 일시적으로 발현되고 식작용 경로를 통해 신속하게 재내재화된다. 따라서, CD107a 검출은 세포 자극 동안의 항체 염색 및 모넨신의 첨가 (세포 이물 흡수된 CD107a 항체 복합체의 산성화 및 후속 분해를 방지하기 위함임)에 의해 최대화된다.
형질도입된 T 세포는 모넨신의 존재하에 표적 세포와 함께 6-24시간 동안 배양되고, CD8 T 세포 상에서의 CD107a 발현이 T 세포 표면 마커 (CD3, CD8)에 대한 접합된 항체 및 CD107a에 대한 접합된 항체를 사용하여 유세포 측정에 의해 측정된다.
살해 가능성에 대한 마커로서의 과립화 (CD107a). 세포용해 T 세포의 가장 중요한 기능은 표적 세포를 살해하는 능력이다. 세포독성 CD8+ T 림프구는 두 가지 주요 경로, 즉 세포자멸사의 퍼포린-그랜자임-매개 활성화 및 세포자멸사의 fas-fas 리간드-매개 유도를 통해 표적 세포의 살해를 매개한다. 이들 경로의 유도는 반응하는 CD8+ T 세포로부터의 세포용해 과립의 방출에 의존한다. 탈과립은 퍼포린-그랜자임-매개 살해의 전제 조건이며, 반응하는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 즉각적 용해 기능에 필요하다. 세포독성은 효과기 CD8+ T 세포에 의한 단백질의 데 노보 합성을 필요로 하지 않으며; 대신에, 세포질 내에 위치한 사전-형성된 용해 과립은 표적 세포를 향해 극성 방식으로 방출된다. 용해 과립은 퍼포린 및 그랜자임을 비롯한 다양한 단백질로 구성된 조밀한 코어를 포함하는 막-결합된 분비형 리소좀이다. 과립 코어는 CD107a (LAMP-1), CD107b (LAMP-2), 및 CD63 (LAMP-3)을 비롯한 많은 리소좀-관련 막 당단백질 (LAMP)을 포함하는 지질 이중층으로 둘러싸여 있다. 탈과립화 과정 동안, 용해 과립 막은 활성화된 CD8+ T 세포의 원형질 막과 병합되고, 이어서 과립의 내용물은 CD8+ T 세포와 표적 세포 사이의 면역학적 시냅스로 방출된다. 이 과정의 결과로, CD107a, CD107b 및 CD63 당단백질을 포함하는 과립 막이, 반응하는 CD8+ T 세포의 원형질 막에 통합된다. 콜히친과 같은 탈과립화 억제제가 CD107a 및 CD107b의 세포-표면 발현을 극적으로 감소시키기 때문에, 활성화된 T 세포의 세포 표면 상에서의 CD107a 및 CD107b의 고수준 발현은 탈과립을 필요로 한다. 중요하게도, 이들 단백질은 휴지 T 림프구의 표면에서는 거의 발견되지 않는다. 따라서, 반응하는 세포를 CD107a 및 CD107b에 대한 항체로 표지하고 유세포 분석에 의해 이들의 발현을 측정하면 CD8+ T 세포의 탈과립화를 직접 식별할 수 있다 (문헌 [Betts and Koup, 2004]).
실험 설정:
iCAR+aCAR/aCAR 구조체로 형질도입된 PBMC (효과기 세포)를 PMA+이오노마이신 (양성 대조군) 또는 세포 표면에 iCAR+aCAR/ aCAR/ iCAR 항원을 발현하는 변형된 표적 세포로 자극한다. 수시간의 공동 배양 동안, 효과기 세포는 탈과립화되고, CD107a가 세포 표면에서 검출될 수 있다. 이 발현은 일시적이며 CD107a는 식작용 경로를 통해 신속하게 재내재화된다. 따라서, CD107a 검출은 세포 자극 동안의 항체 염색 및 모넨신의 첨가 (세포 이물 흡수된 CD107a 항체 복합체의 산성화 및 후속 분해를 방지하기 위함임)에 의해 최대화된다. 최적의 사이토카인 발현을 위해서는 BFA가 요구된다.
실시예 9. 생체내 모델
인간 이종 이식 마우스 모델에서의 생체내 CTL 분석
aCAR 및 iCAR 구조체 둘 모두를 발현하는 T-세포가 동일한 유기체 내에서 표적 세포와 '표적-외' 세포를 구별하고 '표적-외' 세포를 살리면서 표적 세포를 효과적으로 살해할 수 있는지 여부에 대한 시험이 생체내 CTL 분석에 의해 평가된다.
iCAR 또는 aCAR 또는 iCAR 및 aCAR 둘 모두를 갖는 형질도입된 T 세포를 천연 NOD/SCID/γc- 또는 유사한 마우스에 i.v. 주사한다. 수시간 후에, iCAR, aCAR 또는 둘 모두를 발현하는 표적 세포를 주사한다. 이들 표적은 CFSE/CPDE 또는 유사한 세포 추적 염료로 상이한 농도 (고, 중, 저)로 표지되며, 이는 이들을 추가로 구별할 수 있게 한다. 표적 주사 후 18시간에, 마우스를 희생시키고, 비장을 수확하고, 특정 표적의 제거를 FACS에 의해 평가한다. 하기 방정식에 따라 특이적 살해 백분율을 계산한다:
Figure pct00051
인간 이종 이식 마우스 모델에서의 종양 성장 동역학
NOD/SCID/γc- 또는 유사한 마우스에 종양 세포를 접종한다. 접종은 i.p/i.v. 또는 s.c일 수 있다. 상기 종양 세포는 iCAR 표적, aCAR 표적 또는 둘 모두를 발현한다. 가능한 aCAR 종양 세포주의 일례는 CD19 양성 NALM 6 (ATCC, 인간 BALL 세포주)일 수 있다. 상기 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 종양 세포 (즉, '종양-외' 세포)의 예는 iCAR 에피토프 (예를 들어, HLA-A2)를 발현하여 건강한 세포를 나타내도록 조작된 NALM 6이다. NALM 6 및 NALM 6-HLA-A2는 용이한 검출을 위해 리포터 유전자 (예를 들어 반딧불이 루시페라제)를 발현하도록 또한 조작될 수 있다. 표적 세포의 가능한 모든 조합으로 접종된 여러 연구군으로 마우스를 나눈다. 예로서, 한 군에는 NALM 6 세포를 주사하고 다른 군에는 iCAR 에피토프를 발현하는 NALM-6을 주사한다. 며칠 후, 종양이 이미 확립되었을 때, 마우스에 aCAR, 또는 aCAR/iCAR, 또는 iCAR로 형질도입된 T-세포를 정맥내 주입한다. 또한, 형질도입되지 않은 T-세포의 대조군, T-세포가 없는 대조군, 및 신호전달 도메인 없이 형질도입된 T-세포의 대조군이 포함된다. 종양이 실험 종점, 즉 최대 허용 종양 부피에 도달할 때까지 마우스를 모니터링한다. 기계적 수단 (캘리퍼)을 사용하여 종양 부피를 측정함으로써 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용함으로써 모니터링을 수행한다. 종점 날짜에, 마우스를 희생시키고, 종양 부담을 정량하고, 침윤성 T-세포 집단을 FACS에 의해 분석한다. iCAR 구조체를 발현하는 T-세포가 동일한 유기체 내에서 표적 세포와 '표적-외' 세포를 구별할 수 있는지를 시험하기 위해, 마우스에 몇 가지 비의 '종양-상'/ '종양-외' NALM-6 세포의 몇 가지 가능한 혼합물을 주사한 후, aCAR 단독 또는 aCAR 및 iCAR 둘 모두를 발현하는 형질도입된 T-세포를 주사한다. 마우스 희생시, 비장 및 골수에서의 '종양-상' 및 '종양-외' 세포의 존재를 2개의 마커, 즉 CD19 및 iCAR 에피토프에 대한 유세포 분석에 의해 분석한다.
형질전환 마우스 모델에서의 독성 및 종양 성장 동역학
인간 aCAR 및 iCAR 표적을 발현하는 형질전환 마우스를 또한 사용하여 형질도입된 T-세포의 효능을 결정한다. 이들 설정하에서, 마우스는 완전한 기능성 면역계를 가지며, iCAR/aCAR 형질도입된 T-세포의 잠재적 독성이 평가될 수 있다. 상기 CAR 구조체는 인간 항원과 일치된 scFv를 포함하는 반면, 신호전달 도메인은 쥐 T-세포를 활성화 또는 억제하도록 변형된다. 이러한 모델의 일례는 인간 HLA-A2 분자만을 발현하는 HHD-HLA-A2 마우스인 반면 다른 모든 단백질은 단지 쥐이다. CD19 aCAR의 scFv는 이 경우 쥐 CD19 상동물에 대해 지시된다. HLA 분자가 결여된 인간 표적 세포 (예를 들어, LCL 721.221 세포 또는 C1R-neoATCC® CRL-2369™ 또는 이와 유사한 것)를 사용한다. 쥐 CD19를 발현하도록 표적을 변형한다. 이 시스템은 효능 및 독성 문제를 모니터링할 수 있게 한다.
mAbs 생산
상이한 종양에서 식별된 여러 쌍의 보존된 대립유전자 변이체 및 상실된 대립유전자 변이체가 선택되며, 이들의 폴리펩티드 생성물은 mAb 생산 기술을 사용한 변이체 특이적 mAb의 생성에 적합하다. 후보 mAb의 판별력은 선택된 대립유전자를 발현하는 재조합 세포주에 대한 결합에 의해 측정되는, 이중 염색 및 유세포 분석 실험 또는 면역 조직 화학에 의해 분석된다.
모든 표제 및 섹션 지정은 명확성 및 참고 목적으로만 사용되며 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 당업자라면 본원에 기술된 본 발명의 사상 및 범위에 따라 적절한 경우 상이한 표제 및 섹션으로부터의 다양한 측면을 조합하는 유용성을 이해할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적인 공보 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 원용에 의해 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 원용에 의해 본원에 포함된다.
당업자라면 자명할 바와 같이, 본원의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 대한 많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 특정한 구현예 및 실시예는 단지 예로서 제공되며, 본원은 청구범위에 의해 자격이 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 첨부된 청구범위의 조건에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ImmPACT-Bio Ltd. Gavish-Galilee Bio Applications, Ltd. Gross, Gideon Gibson, Will Dahary, Dvir Beiman, Merav <120> A UNIVERSAL PLATFORM FOR CAR THERAPY TARGETING A NOVEL ANTIGENIC SIGNATURE OF CANCER <130> 120575-5003-WO <150> 62/564,454 <151> 2017-09-28 <150> 62/649,429 <151> 2018-03-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 aCAR_IRES_RFP_P2A_Puro Synthetic DNA <400> 1 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300 caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420 ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480 ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt 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agtggtgccc 1920 atcctggtgg agctggacgg cgatgtgaat ggccacaagt ttagcgtgtc cggagaggga 1980 gagggcgacg caacctacgg caagctgaca ctgaagttca tctgcaccac aggcaagctg 2040 cccgtgcctt ggccaaccct ggtgaccaca ctgacatacg gcgtgcagtg tttttctcgc 2100 tatcccgacc acatgaagca gcacgatttc tttaagagcg ccatgcctga gggctacgtg 2160 caggagcgga ccatcttctt taaggacgat ggcaactata agaccagagc cgaggtgaag 2220 ttcgagggcg acacactggt gaacaggatc gagctgaagg gcatcgactt taaggaggat 2280 ggcaatatcc tgggccacaa gctggagtac aactataatt cccacaacgt gtacatcatg 2340 gccgataagc agaagaacgg catcaaggtc aatttcaaga tcagacacaa tatcgaggac 2400 ggctctgtgc agctggccga tcactaccag cagaacaccc caatcggcga cggacccgtg 2460 ctgctgcctg ataatcacta tctgtctaca cagagcgccc tgtccaagga ccccaacgag 2520 aagagggatc acatggtgct gctggagttt gtgaccgcag caggaatcac actgggaatg 2580 gacgagctgt ataagggcag cggcgccacc aacttctccc tgctgaagca ggcaggcgac 2640 gtggaggaga atccaggacc tatggataga agcggcaagc cagagctgac cgccacatcc 2700 gtggagaagt tcctgatcga gaagtttgac tctgtgagcg atctgatgca gctgtccgag 2760 ggagaggagt ccagggcctt ctcttttgat gtgggcggca ggggatacgt gctgagggtg 2820 aatagctgcg ccgacggctt ctataaggat agatacgtgt atagacactt tgcctccgcc 2880 gccctgccaa tcccagaggt gctggacatc ggcgagtttt ccgagtctct gacctactgt 2940 atcagccgga gagcccaggg agtgaccctg caggatctgc ctgagacaga gctgccagcc 3000 gtgctgcagc cagtggcaga ggctatggac gcaatcgccg ccgccgacct gtctcagaca 3060 agcggcttcg gcccttttgg cccacagggc atcggccagt acaccacatg gagggacttc 3120 atctgcgcca tcgccgatcc tcacgtgtat cactggcaga ccgtgatgga cgatacagtg 3180 agcgcctccg tggcacaggc cctggacgag ctgatgctgt gggccgagga ttgtccagag 3240 gtgcgccacc tggtgcacgc agactttggc agcaacaatg tgctgaccga taatggccgg 3300 atcacagccg tgatcgactg gtccgaggcc atgttcggcg attctcagta cgaggtggcc 3360 aacatcttct tttggaggcc ttggctggcc tgcatggagc agcagacccg ctattttgag 3420 aggcgccacc ctgagctggc cggctctcca cggctgagag catacatgct gcgcatcggc 3480 ctggaccagc tgtatcagag cctggtggat ggcaatttcg acgatgcagc atgggcacag 3540 ggccggtgcg acgcaatcgt gagatccggc gccggcaccg tgggccggac acagatcgca 3600 cggcggagcg ccgccgtgtg gaccgacgga tgcgtggagg tgctggccga ttctggcaac 3660 aggcgcccaa gcacaaggcc ccgcgccaag gagtga 3696 <210> 10 <211> 420 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A2 iCAR Synthetic Protein <400> 10 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 35 40 45 Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His 50 55 60 Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 65 70 75 80 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 85 90 95 Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 100 105 110 Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala 115 120 125 Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 130 135 140 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 165 170 175 Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 180 185 190 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 195 200 205 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 225 230 235 240 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 245 250 255 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 260 265 270 Leu Glu Ile Lys Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro 275 280 285 Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly 290 295 300 Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu 305 310 315 320 Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg 325 330 335 Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser 340 345 350 Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu 355 360 365 Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val 370 375 380 Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala 385 390 395 400 Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys 405 410 415 Ser Trp Pro Leu 420

Claims (66)

  1. 효과기 면역 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지 또는 약화시킬 수 있는 억제성 키메라 항원 수용체 (iCAR) 또는 보호 키메라 항원 수용체 (pCAR)를 제조하기 위한 표적을 식별하는 방법으로서, 상기 표적은 하기를 포함하는 방법에 의해 식별되는, 방법:
    (i) 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 단백질을 암호화하는 적어도 2개의 발현된 대립유전자를 갖는 유전자를 식별하는 단계;
    (ii) 상기 발현된 대립유전자 중 적어도 하나가 세포외 다형성 에피토프 기준 서열에 비해 세포외 다형성 에피토프 서열에서의 아미노산 서열 변화를 나타내는 것을 확인하는 단계;
    (iii) 상기 유전자가 종양 유형에서 이형접합성 상실 (LOH)을 겪는 염색체 영역에 위치하는 것을 확인하는 단계; 및
    (iv) 상기 유전자가, 염색체 영역이 LOH를 겪는 것으로 밝혀진 종양 유형의 기원 조직에서 발현되는 것을 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LOH 위치는 치환, 결실 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LOH 위치는 SNP인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA 유전자인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-G, HLA-E, HLA-F, HLA-K, HLA-L, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA_DQ, 또는 HLA-DR 유전자인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-A 유전자인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-B 유전자인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-C 유전자인, 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-G 유전자인, 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-E 유전자인, 방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-F 유전자인, 방법.
  12. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-K 유전자인, 방법.
  13. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-L 유전자인, 방법.
  14. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DM 유전자인, 방법.
  15. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DO 유전자인, 방법.
  16. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DP 유전자인, 방법.
  17. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DQ 유전자인, 방법.
  18. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 HLA-DR 유전자인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA4, ADAM30, AQP10, ASTN1, C1orf101, CACNA1S, CATSPER4, CD101, CD164L2, CD1A, CD1C, CD244, CD34, CD46, CELSR2, CHRNB2, CLCA2, CLDN19, CLSTN1, CR1, CR2, CRB1, CSF3R, CSMD2, ECE1, ELTD1, EMC1, EPHA10, EPHA2, EPHA8, ERMAP, FCAMR, FCER1A, FCGR1B, FCGR2A, FCGR2B, FCGR3A, FCRL1, FCRL3, FCRL4, FCRL5, FCRL6, GJB4, GPA33, GPR157, GPR37L1, GPR88, HCRTR1, IGSF3, IGSF9, IL22RA1, IL23R, ITGA10, KIAA1324, KIAA2013, LDLRAD2, LEPR, LGR6, LRIG2, LRP8, LRRC52, LRRC8B, LRRN2, LY9, MIA3, MR1, MUC1, MXRA8, NCSTN, NFASC, NOTCH2, NPR1, NTRK1, OPN3, OR10J1, OR10J4, OR10K1, OR10R2, OR10T2, OR10X1, OR11L1, OR14A16, OR14I1, OR14K1, OR2AK2, OR2C3, OR2G2, OR2G3, OR2L2, OR2M7, OR2T12, OR2T27, OR2T1, OR2T3, OR2T29, OR2T33, OR2T34, OR2T35, OR2T3, OR2T4, OR2T5, OR2T6, OR2T7, OR2T8, OR2W3, OR6F1, OR6K2, OR6K3, OR6K6, OR6N1, OR6P1, OR6Y1, PDPN, PEAR1, PIGR, PLXNA2, PTCH2, PTCHD2, PTGFRN, PTPRC, PTPRF, PVRL4, RHBG, RXFP4, S1PR1, SCNN1D, SDC3, SELE, SELL, SELP, SEMA4A, SEMA6C, SLAMF7, SLAMF9, SLC2A7, SLC5A9, TACSTD2, TAS1R2, TIE1, TLR5, TMEM81, TNFRSF14, TNFRSF1B, TRABD2B, USH2A, VCAM1, 및 ZP4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCG5, ALK, ASPRV1, ATRAID, CD207, CD8B, CHRNG, CLEC4F, CNTNAP5, CRIM1, CXCR1, DNER, DPP10, EDAR, EPCAM, GPR113, GPR148, GPR35, GPR39, GYPC, IL1RL1, ITGA4, ITGA6, ITGAV, LCT, LHCGR, LRP1B, LRP2, LY75, MARCO, MERTK, NRP2, OR6B2, PLA2R1, PLB1, PROKR1, PROM2, SCN7A, SDC1, SLC23A3, SLC5A6, TGOLN2, THSD7B, TM4SF20, TMEFF2, TMEM178A, TPO, 및 TRABD2A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ACKR2, ALCAM, ANO10, ATP13A4, BTLA, CACNA1D, CACNA2D2, CACNA2D3, CASR, CCRL2, CD200, CD200R1, CD86, CD96, CDCP1, CDHR4, CELSR3, CHL1, CLDN11, CLDN18, CLSTN2, CSPG5, CX3CR1, CXCR6, CYP8B1, DCBLD2, DRD3, EPHA6, EPHB3, GABRR3, GP5, GPR128, GPR15, GPR27, GRM2, GRM7, HEG1, HTR3C, HTR3D, HTR3E, IGSF11, IL17RC, IL17RD, IL17RE, IL5RA, IMPG2, ITGA9, ITGB5, KCNMB3, LRIG1, LRRC15, LRRN1, MST1R, NAALADL2, NRROS, OR5AC1, OR5H1, OR5H14, OR5H15, OR5H6, OR5K2, OR5K3, OR5K4, PIGX, PLXNB1, PLXND1, PRRT3, PTPRG, ROBO2, RYK, SEMA5B, SIDT1, SLC22A14, SLC33A1, SLC4A7, SLITRK3, STAB1, SUSD5, TFRC, TLR9, TMEM108, TMEM44, TMPRSS7, TNFSF10, UPK1B, VIPR1, 및 ZPLD1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANTXR2, BTC, CNGA1, CORIN, EGF, EMCN, ENPEP, EPHA5, ERVMER34-1, EVC2, FAT1, FAT4, FGFRL1, FRAS1, GPR125, GRID2, GYPA, GYPB, KDR, KIAA0922, KLB, MFSD8, PARM1, PDGFRA, RNF150, TENM3, TLR10, TLR1, TLR6, TMEM156, TMPRSS11A, TMPRSS11B, TMPRSS11E, TMPRSS11F, UGT2A1, 및 UNC5C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM19, ADRB2, BTNL3, BTNL8, BTNL9, C5orf15, CATSPER3, CD180, CDH12, CDHR2, COL23A1, CSF1R, F2RL2, FAM174A, FAT2, FGFR4, FLT4, GABRA6, GABRG2, GPR151, GPR98, GRM6, HAVCR1, HAVCR2, IL31RA, IL6ST, IL7R, IQGAP2, ITGA1, ITGA2, KCNMB1, LIFR, LNPEP, MEGF10, NIPAL4, NPR3, NRG2, OR2V1, OR2Y1, OSMR, PCDH12, PCDH1, PCDHA1, PCDHA2, PCDHA4, PCDHA8, PCDHA9, PCDHB10, PCDHB11, PCDHB13, PCDHB14, PCDHB15, PCDHB16, PCDHB2, PCDHB3, PCDHB4, PCDHB5, PCDHB6, PCDHGA1, PCDHGA4, PDGFRB, PRLR, SEMA5A, SEMA6A, SGCD, SLC1A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC23A1, SLC36A3, SLC45A2, SLC6A18, SLC6A19, SLCO6A1, SV2C, TENM2, TIMD4, 및 UGT3A1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 BAI3, BTN1A1, BTN2A1, BTN2A2, BTN3A1, BTN3A2, BTNL2, CD83, DCBLD1, DLL1, DPCR1, ENPP1, ENPP3, ENPP4, EPHA7, GABBR1, GABRR1, GCNT6, GFRAL, GJB7, GLP1R, GPR110, GPR111, GPR116, GPR126, GPR63, GPRC6A, HFE, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB5, HLA-E, HLA-F, HLA-G, IL20RA, ITPR3, KIAA0319, LMBRD1, LRFN2, LRP11, MAS1L, MEP1A, MICA, MICB, MOG, MUC21, MUC22, NCR2, NOTCH4, OPRM1, OR10C1, OR12D2, OR12D3, OR14J1, OR2B2, OR2B6, OR2J1, OR2W1, OR5V1, PDE10A, PI16, PKHD1, PTCRA, PTK7, RAET1E, RAET1G, ROS1, SDIM1, SLC16A10, SLC22A1, SLC44A4, TAAR2, TREM1, TREML1, 및 TREML2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 AQP1, C7orf50, CD36, CDHR3, CNTNAP2, DPP6, EGFR, EPHA1, EPHB6, ERVW-1, GHRHR, GJC3, GPNMB, GRM8, HUS1, HYAL4, KIAA1324L, LRRN3, MET, MUC12, MUC17, NPC1L1, NPSR1, OR2A12, OR2A14, OR2A25, OR2A42, OR2A7, OR2A2, OR2AE1, OR2F2, OR6V1, PILRA, PILRB, PKD1L1, PLXNA4, PODXL, PTPRN2, PTPRZ1, RAMP3, SLC29A4, SMO, TAS2R16, TAS2R40, TAS2R4, TFR2, THSD7A, TMEM213, TTYH3, ZAN, 및 ZP3로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM18, ADAM28, ADAM32, ADAM7, ADAM9, ADRA1A, CDH17, CHRNA2, CSMD1, CSMD3, DCSTAMP, FZD6, GPR124, NRG1, OR4F21, PKHD1L1, PRSS55, SCARA3, SCARA5, SDC2, SLC10A5, SLC39A14, SLC39A4, SLCO5A1, TNFRSF10A, 및 TNFRSF10B로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA1, AQP7, ASTN2, C9orf135, CA9, CD72, CNTNAP3B, CNTNAP3, CRB2, ENTPD8, GPR144, GRIN3A, IZUMO3, KIAA1161, MAMDC4, MEGF9, MUSK, NOTCH1, OR13C2, OR13C3, OR13C5, OR13C8, OR13C9, OR13D1, OR13F1, OR1B1, OR1J2, OR1K1, OR1L1, OR1L3, OR1L6, OR1L8, OR1N1, OR1N2, OR1Q1, OR2S2, PCSK5, PDCD1LG2, PLGRKT, PTPRD, ROR2, SEMA4D, SLC31A1, TEK, TLR4, TMEM2, 및 VLDLR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCC2, ADAM8, ADRB1, ANTXRL, ATRNL1, C10orf54, CDH23, CDHR1, CNNM2, COL13A1, COL17A1, ENTPD1, FZD8, FGFR2, GPR158, GRID1, IL15RA, IL2RA, ITGA8, ITGB1, MRC1, NRG3, NPFFR1, NRP1, OPN4, PCDH15, PKD2L1, PLXDC2, PRLHR, RET, RGR, SLC16A9, SLC29A3, SLC39A12, TACR2, TCTN3, TSPAN15, UNC5B, 및 VSTM4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 AMICA1, ANO1, ANO3, APLP2, C11orf24, CCKBR, CD248, CD44, CD5, CD6, CD82, CDON, CLMP, CRTAM, DCHS1, DSCAML1, FAT3, FOLH1, GDPD4, GDPD5, GRIK4, HEPHL1, HTR3B, IFITM10, IL10RA, KIRREL3, LGR4, LRP4, LRP5, LRRC32, MCAM, MFRP, MMP26, MPEG1, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MS4A4A, MS4A6A, MTNR1B, MUC15, NAALAD2, NAALADL1, NCAM1, NRXN2, OR10A2, OR10A5, OR10A6, OR10D3, OR10G4, OR10G7, OR10G8, OR10G9, OR10Q1, OR10S1, OR1S1, OR2AG1, OR2AG2, OR2D2, OR4A47, OR4A15, OR4A5, OR4C11, OR4C13, OR4C15, OR4C16, OR4C3, OR4C46, OR4C5, OR4D6, OR4A8P, OR4D9, OR4S2, OR4X1, OR51E1, OR51L1, OR52A1, OR52E1, OR52E2, OR52E4, OR52E6, OR52I1, OR52I2, OR52J3, OR52L1, OR52N1, OR52N2, OR52N4, OR52W1, OR56B1, OR56B4, OR5A1, OR5A2, OR5AK2, OR5AR1, OR5B17, OR5B3, OR5D14, OR5D16, OR5D18, OR5F1, OR5I1, OR5L2, OR5M11, OR5M3, OR5P2, OR5R1, OR5T2, OR5T3, OR5W2, OR6A2, OR6T1, OR6X1, OR8A1, OR8B12, OR8B2, OR8B3, OR8B4, OR8D1, OR8D2, OR8H1, OR8H2, OR8H3, OR8I2, OR8J1, OR8J2, OR8J3, OR8K1, OR8K3, OR8K5, OR8U1, OR9G1, OR9G4, OR9Q2, P2RX3, PTPRJ, ROBO3, SIGIRR, SLC22A10, SLC3A2, SLC5A12, SLCO2B1, SORL1, ST14, SYT8, TENM4, TMEM123, TMEM225, TMPRSS4, TMPRSS5, TRIM5, TRPM5, TSPAN18, 및 ZP1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANO4, AVPR1A, BCL2L14, CACNA2D4, CD163, CD163L1, CD27, CD4, CLEC12A, CLEC1B, CLEC2A, CLEC4C, CLEC7A, CLECL1, CLSTN3, GPR133, GPRC5D, ITGA7, ITGB7, KLRB1, KLRC2, KLRC3, KLRC4, KLRF1, KLRF2, LRP1, LRP6, MANSC1, MANSC4, OLR1, OR10AD1, OR10P1, OR2AP1, OR6C1, OR6C2, OR6C3, OR6C4, OR6C6, OR6C74, OR6C76, OR8S1, OR9K2, ORAI1, P2RX4, P2RX7, PRR4, PTPRB, PTPRQ, PTPRR, SCNN1A, SELPLG, SLC2A14, SLC38A4, SLC5A8, SLC6A15, SLC8B1, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B7, SLCO1C1, SSPN, STAB2, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R20, TAS2R30, TAS2R31, TAS2R42, TAS2R43, TAS2R46, TAS2R7, TMEM119, TMEM132B, TMEM132C, TMEM132D, TMPRSS12, TNFRSF1A, TSPAN8, 및 VSIG10로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP4B, ATP7B, FLT3, FREM2, HTR2A, KL, PCDH8, RXFP2, SGCG, SHISA2, SLC15A1, SLITRK6, 및 TNFRSF19로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ADAM21, BDKRB2, C14orf37, CLEC14A, DLK1, FLRT2, GPR135, GPR137C, JAG2, LTB4R2, MMP14, OR11G2, OR11H12, OR11H6, OR4K1, OR4K15, OR4K5, OR4L1, OR4N2, OR4N5, SLC24A4, 및 SYNDIG1L로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ANPEP, CD276, CHRNA7, CHRNB4, CSPG4, DUOX1, DUOX2, FAM174B, GLDN, IGDCC4, ITGA11, LCTL, LTK, LYSMD4, MEGF11, NOX5, NRG4, OCA2, OR4F4, OR4M2, OR4N4, PRTG, RHCG, SCAMP5, SEMA4B, SEMA6D, SLC24A1, SLC24A5, SLC28A1, SPG11, STRA6, TRPM1, 및 TYRO3로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP2C2, CACNA1H, CD19, CDH11, CDH15, CDH16, CDH3, CDH5, CNGB1, CNTNAP4, GDPD3, GPR56, GPR97, IFT140, IL4R, ITFG3, ITGAL, ITGAM, ITGAX, KCNG4, MMP15, MSLNL, NOMO1, NOMO3, OR2C1, PIEZO1, PKD1, PKD1L2, QPRT, SCNN1B, SEZ6L2, SLC22A31, SLC5A11, SLC7A6, SPN, TMC5, TMC7, TMEM204, TMEM219, 및 TMEM8A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCC3, ACE, AOC3, ARL17B, ASGR2, C17orf80, CD300A, CD300C, CD300E, CD300LF, CD300LG, CHRNB1, CLEC10A, CNTNAP1, CPD, CXCL16, ERBB2, FAM171A2, GCGR, GLP2R, GP1BA, GPR142, GUCY2D, ITGA2B, ITGA3, ITGAE, ITGB3, KCNJ12, LRRC37A2, LRRC37A3, LRRC37A, LRRC37B, MRC2, NGFR, OR1A2, OR1D2, OR1G1, OR3A1, OR3A2, OR4D1, OR4D2, RNF43, SCARF1, SCN4A, SDK2, SECTM1, SEZ6, SHPK, SLC26A11, SLC5A10, SPACA3, TMEM102, TMEM132E, TNFSF12, TRPV3, TTYH2, 및 TUSC5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제5항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 APCDD1, CDH19, CDH20, CDH7, COLEC12, DCC, DSC1, DSG1, DSG3, DYNAP, MEP1B, PTPRM, SIGLEC15, 및 TNFRSF11A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABCA7, ACPT, BCAM, C19orf38, C19orf59, C5AR1, CATSPERD, CATSPERG, CD22, CD320, CD33, CD97, CEACAM19, CEACAM1, CEACAM21, CEACAM3, CEACAM4, CLEC4M, DLL3, EMR1, EMR2, EMR3, ERVV-1, ERVV-2, FAM187B, FCAR, FFAR3, FPR1, FXYD5, GFY, GP6, GPR42, GRIN3B, ICAM3, IGFLR1, IL12RB1, IL27RA, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIRREL2, KISS1R, LAIR1, LDLR, LILRA1, LILRA2, LILRA4, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LINGO3, LPHN1, LRP3, MADCAM1, MAG, MEGF8, MUC16, NCR1, NOTCH3, NPHS1, OR10H1, OR10H2, OR10H3, OR10H4, OR1I1, OR2Z1, OR7A10, OR7C1, OR7D4, OR7E24, OR7G1, OR7G2, OR7G3, PLVAP, PTGIR, PTPRH, PTPRS, PVR, SCN1B, SHISA7, SIGLEC10, SIGLEC11, SIGLEC12, SIGLEC5, SIGLEC6, SIGLEC8, SIGLEC9, SLC44A2, SLC5A5, SLC7A9, SPINT2, TARM1, TGFBR3L, TMC4, TMEM91, TMEM161A, TMPRSS9, TNFSF14, TNFSF9, TRPM4, VN1R2, VSIG10L, VSTM2B, 및 ZNRF4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ABHD12, ADAM33, ADRA1D, APMAP, ATRN, CD40, CD93, CDH22, CDH26, CDH4, FLRT3, GCNT7, GGT7, JAG1, LRRN4, NPBWR2, OCSTAMP, PTPRA, PTPRT, SEL1L2, SIGLEC1, SIRPA, SIRPB1, SIRPG, SLC24A3, SLC2A10, SLC4A11, SSTR4, 및 THBD로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 CLDN8, DSCAM, ICOSLG, IFNAR1, IFNGR2, IGSF5, ITGB2, KCNJ15, NCAM2, SLC19A1, TMPRSS15, TMPRSS2, TMPRSS3, TRPM2, 및 UMODL1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 CACNA1I, CELSR1, COMT, CSF2RB, GGT1, GGT5, IL2RB, KREMEN1, MCHR1, OR11H1, P2RX6, PKDREJ, PLXNB2, SCARF2, SEZ6L, SSTR3, SUSD2, TMPRSS6, 및 TNFRSF13C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제1항에 있어서, 상기 세포외 다형성 에피토프를 포함하는 상기 유전자는 ATP6AP2, ATP7A, CNGA2, EDA2R, FMR1NB, GLRA4, GPR112, GUCY2F, HEPH, P2RY10, P2RY4, PLXNA3, PLXNB3, TLR8, VSIG4, 및 XG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 유방 종양, 전립선 종양, 난소 종양, 자궁경부 종양, 피부 종양, 췌장 종양, 결장직장 종양, 신장 종양, 간 종양, 뇌 종양, 림프종, 백혈병, 폐 종양 및 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 부신 종양, 신장 종양, 흑색종, DLBC, 유방 종양, 육종, 난소 종양, 폐 종양, 방광 종양 및 간 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 부신 종양은 부신피질 암종인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 신장 종양은 비염색 신장 세포 암종인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 흑색종은 포도막 흑색종인, 방법.
  47. 안전한 효과기 면역 세포로서, (i) 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 iCAR 또는 pCAR 및 (ii) 활성화 키메라 항원 수용체 (aCAR)를 발현하는, 안전한 효과기 면역 세포.
  48. 제47항에 있어서, 상기 aCAR은 종양-관련 항원 또는 비다형성 세포 표면 에피토프에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하는, 안전한 효과기 면역 세포.
  49. 제47항에 있어서, 상기 aCAR은 종양-관련 단백질, 표 1에 열거된 CAR 표적, 상기 iCAR이 또한 발현되는 종양 조직에서 발현되는 임의의 세포 표면 단백질에 대해 지시되거나, 또는 이에 특이적으로 결합하는, 안전한 효과기 면역 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 비다형성 세포 표면 에피토프는 CD19, CD20, CD22, CD10, CD7, CD49f, CD56, CD74, CAIX Igκ, ROR1, ROR2, CD30, LewisY, CD33, CD34, CD38, CD123, CD28, CD44v6, CD44, CD41, CD133, CD138, NKG2D-L, CD139, BCMA, GD2, GD3, hTERT, FBP, EGP-2, EGP-40, FR-α, L1-CAM, ErbB2,3,4, EGFRvIII, VEGFR-2, IL-13Rα2, FAP, Mesothelin, c-MET, PSMA, CEA, kRas, MAGE-A1, MUC1, MUC16, PDL1, PSCA, EpCAM, FSHR, AFP, AXL, CD80, CD89, CDH17, CLD18, GPC3, TEM8, TGFB1, NY-ESO-1, WT-1 및 EGFR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안전한 효과기 면역 세포.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는 자가 또는 보편적인 (동종이계) 효과기 세포인, 안전한 면역 효과기 세포.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안전한 효과기 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포 및 사이토카인-유도 살해 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안전한 면역 효과기 세포.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iCAR 또는 pCAR의 발현 수준은 상기 aCAR의 발현 수준 이상인, 안전한 면역 효과기 세포.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iCAR 또는 pCAR은 제1 벡터에 의해 발현되고 상기 aCAR은 제2 벡터에 의해 발현되는, 안전한 면역 효과기 세포.
  55. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iCAR 또는 pCAR 및 상기 aCAR은 모두 동일한 벡터에 의해 발현되는, 안전한 면역 효과기 세포.
  56. 제55항에 있어서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는, 안전한 면역 효과기 세포.
  57. 제55항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 iCAR 또는 pCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드를 포함하는, 안전한 면역 효과기 세포.
  58. 제57항에 있어서, 상기 바이러스성 자가-절단 2A 펩티드는 토세아 아시그나 바이러스 (TaV)로부터의 T2A, 구제역 바이러스 (FMDV)로부터의 F2A, 에퀸 리니티스 A 바이러스 (ERAV)로부터의 E2A 및 돼지 테스코바이러스-1 (PTV1)로부터의 P2A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 안전한 면역 효과기 세포.
  59. 제55항에 있어서, 상기 aCAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 가요성 링커를 통해 상기 iCAR 또는 pCAR에 연결되는, 안전한 면역 효과기 세포.
  60. 제47항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 aCAR은 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 적어도 하나의 신호전달 요소를 포함하는, 안전한 면역 효과기 세포.
  61. 제60항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는, 예를 들어 CD3ζ 또는 FcRγ 사슬의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)와 상동성인, 안전한 면역 효과기 세포.
  62. 제60항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 활성화 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), 예를 들어 KIR2DS 및 KIR3DS와 상동성인, 안전한 면역 효과기 세포.
  63. 제60항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 어댑터 분자, 예를 들어 DAP12와 상동성인, 안전한 면역 효과기 세포.
  64. 제60항에 있어서, 효과기 면역 세포를 활성화 또는 공동자극하는 상기 적어도 하나의 신호전달 요소는 CD27, CD28, ICOS, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40) 또는 GITR의 공동자극 신호전달 요소와 상동성인, 안전한 면역 효과기 세포.
  65. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 iCAR을 발현하는 안전한 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  66. LOH를 특징으로 하는 종양을 갖는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 안전한 효과기 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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