KR20200074924A - 심장 섬유증 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 질환 발생 후 진단이 되는 심장 섬유증에서 근섬유아세포를 선택적으로 사멸시킴으로써 섬유증 기질을 용해하고 정상적 조직으로 복귀시키는 효과가 있는바, 현재까지 비가역적 질환 진행으로 간주되어 치료제가 개발되지 못했던 심장 섬유증 및 수축기성 심부전과 이완기성 심부전의 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

심장 섬유증 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating Cardiac Fibrosis}
본 발명은 심장 섬유증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
섬유증 치료에서 회귀(regression)는 섬유증 정도가 발생된 시점보다 감소된 상태를 정의되며, 복귀(reversal 또는 reversibility)는 정상 조직구조로 완전히 회복됨을 의미한다.
서구 사회의 사망원인의 약 45%에 해당하는 섬유증 질환은 임상적으로 질병이 상당히 진행된 후에 진단이 가능한 문제(G. Garrison, S.K. Huang, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 48:550558(2013); 및 Rosenbloom J, et al. Biochim Biophys Acta., 1832(7):1088-1103(2013))로 예방적 치료의 한계와 더불어 현재까지 진행성 및 기 생성된 섬유증을 직접 해결하는 효과적인 치료 수단도 없는 심각한 질환 분야이다(Rosenbloom J, Mendoza FA, et al., Biochim Biophys Acta, 1832(7):1088-1103(2013)). 섬유증을 일으키는 병인과 발현되는 질환의 형태들은 다양하지만 섬유증 기전의 중심에 근섬유아세포(myofibroblast, MyoFB), 즉 활성화된 섬유아세포(activated fibroblast)가 병리적 활성 세포로 작용하여 모든 섬유성 질환의 진행을 지배하는 것이 알려졌다(Dufferield JS, et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis, 8:241-276(2013)).
특히 심장은 섬유증에 인한 심근 조직의 구조적 리모델링이 심장의 운동 기능에 직접 영향을 주는 대표적 인체 기관이다. 심장은 운동 기능의 핵심 역할을 하는 심근세포(cardiomyocyte)와 섬유아세포(fibroblast) 및 혈관 관련 내피세포(endothelial cell)등 다양한 세포들로 이루어진 근육 조직이다. 심장 근육의 볼륨의 대부분은 심근 세포로 구성되어 있지만 심장 조직의 세포들의 50% 이상은 섬유아세포들이 차지한다. 섬유아세포의 기능은 세포외 간질(ECM)의 생산 및 분비로 심장 근육 세포의 효율적인 수축과 이완을 지지해주는 정교한 구조물을 만들어 주며, 심근 조직내 미세환경에서 적절한 힘의 전달, 전기적 신호 전송, 세포간의 교신 및 대사 물질의 교환 등을 촉진시키는 역할을 한다(F.G. Spinale, Physiol Rev. 87: 12851342(2007)). 하지만 심장 벽에 스트레스의 증가, 손상 및 질병 등으로 섬유증이 일어나면 섬유성 세포외 간질의 과잉축적으로 심장조직의 경직화에 따른 심장 기능의 변화를 초래한다(Schroer AK, et al.,J Cell Sci.128(10):1865-1875(2015)). 심장 섬유증에서도 섬유증의 원인성 세포인 근섬유아세포(myofibroblast)가 심장 손상 등 병리적 환경에서 생성되는데 심장 조직에 상주하는 섬유아세포, 혈관 내피 세포와 골수 세포로부터 분화를 통해 유래된다. 근섬유아세포의 원천세포들은 상이할 수 있으나, 분화된 근섬유아세포는 섬유성 콜라겐 등 세포외 간질의 과잉 생산과 분비를 하며 세포 내의 알파 평활근 액틴(α-SMA)의 발현으로 수축성 세포의 공통된 특성이 나타난다(Kendall RT, Feghali-Bostwick CA, Front Pharmacol.,5:123(2014)). 근섬유아세포의 분화와 활성화에는 손상된 심장 근육 세포와 염증성 면역 세포에서 분비되는 섬유증 유발 성장인자와 싸이토카인들인 TGF-β, 안지오텐신-II(ANG-II), 엔도세린-I(ET-1), IL-6 싸이토카인, 결합조직 성장인자(CTGF), 피브리노넥틴 외 도메인(EDA)등이 관여한다(Frangogiannis NG, Nat Rev Cardiol. 11(5):255-65(2014)). 만성 질환 상태에서는 근섬유아세포가 자체적으로 지속적 증식과 활성화로 섬유증 과정의 악순환이 촉진된다. 이들 요인들에는 세포외 기질의 과잉 생산에 따른 조직의 경직화가 기계적 자극을 통해 근섬유아세포에서 TGF-β1, ANG-II의 자가 분비와 ANG-II type I 수용체의 발현, 사멸방지 유전자를 활성화로 새로운 분비 세포의 기능을 갖게 한다(Wynn TA, Ramalingam TR. Nat Med 18:1028-1040(2012). 세포 사멸의 기능이 상실된 근섬유아세포의 지속적 증식과 활성은 조직 리모델링을 일으키는 세포외 기질의 생산과 축적뿐 아니라 염증성 세포의 기능도 한다. 유해산소, 신호 전달을 하는 지방물질, TNF-α등의 싸이토카인 분비를 통해 손상 조직내의 염증화와 MCP-1등의 케모카인 분비를 통해 염증성 면역 세포들의 유입을 촉진시켜 반응성 섬유증(reactive fibrosis) 과정을 진행시킨다(Van Linthout S, et al.,Cardiovasc Res. 102(2):258-269(2014)). 근섬유아세포의 지속적 활성이 유발하는 심장에서 섬유증 조직의 발생하고 다양한 병적인 유해 효과들을 일으킨다. 1) 섬유성 콜라겐으로 감싸인 주변 심장 근육 세포들이 위축되어 다양한 크기로 존재하고 근육 세포의 운동부하를 감소시킨다(Drakos SG, et al. J Am Coll Cardiol. 27;56(5):382-391(2010)). 2) 수동적 조직 경직도의 증가는 분비된 콜라겐 1형의 교차 결합과 근섬유아세포의 간극 결합으로 수축성 섬유 조직이 생성되고 심장의 이완기 기능 이상을 일으킨다(LoB. et al. Hypertension 60:677683(2012)). 3) 혈관 주위의 섬유증은 관상 동맥 혈관들의 수축과 이완 작용의 이상이 심장 근육 내 산소 공급의 감소를 일으켜서 정상적 에너지 대사의 저해로 심근 세포들이 사멸된다(Coen, M., Gabbiani, G. & Bochaton-Piallat, M. L. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 31: 23912396(2011)). 따라서 이러한 섬유성 리모델링이 지속되면 심장 기능이 이완기성 심부전에서 심장 근육 세포의 위축과 세포 사멸이 발생하면서 수축성 심부전 질환으로 이완되는 과정을 보인다(Kamalov G, Zhao W, et al. J Cardiovasc Pharmacol. 62(6):497-506(2013)).
심장 조직의 섬유증 형태는 심근 경색증처럼 심장 과량의 근육 세포의 괴사가 일어나면 신속한 심장 파열 방지를 위한 상처 조직을 생성하는 대체 섬유증(replacement fibrosis)과 다양한 질병 조건들에 기인하여 서서히 퍼지는 반응성 섬유증(reactive fibrosis)인 간질 및 혈관주위 섬유증(interstitial and perivascular fibrosis)으로 구분될 수 있다(Bharath Ambale-Venkatesh and Joao A.C. Lima, Nat. Rev. Cardiol. 12:18-29(2015)). 심장 섬유증이 동반된 심장질환에는 1) 유전자 이상과 관련된 심근 비대증, 2) 고혈압, 만성 신장 질환, 당뇨 및 비만 등의 만성 대사성 질환 관련 심장병, 3) 심장 판막증, 4) 사르코이드증, 자가면역성 심근염 및 심장 이식 관련 거부 반응 등의 염증성 질환의 심장병, 5) 관상동맥 기능 부전, 대동맥 협착증 및 비 허혈성 확장형 심근증 등의 구조적 심장병, 6) 샤가스병 및 바이러스성 심근염 등의 전염성 질환, 7) 청색성 심장병, 할로씨 사장, 대 혈관 전위 및 단심실 등의 선천성 심장병, 8) 뒤센형과 베커형 근퇴행위축증(Duchenne and Becker muscular dystrophy) 및 파부리병(Fabry disease)등의 유전성 질환의 심장병, 9) 흡연, 알코올 섭취 및 항암제 등의 약물에 의한 독성 노출과 자연적 노화 과정에서 발생하는 심장병이 포함된다(Schelbert EB, Fonarow GC, J Am Coll Cardiol. 63(21):2188-2198(2014); Collier P1,et al., QJM. 105(8):721-724(2012); Maron BJ, Maron MS, Lancet. 381(9862):242-255(2013); Kong P, Christia P, et al. Cell Mol Life Sci. 71(4):549-574(2014); 및 Mavrogeni S, Markousis-Mavrogenis G, et al. World J Cardiol.(7):410-414(2015)). 또한 유병 인자의 종류와 상관없이 섬유증이 진행되면 심장은 심실의 경직화와 이에 따른 수축기와 이완기성 심장 기능 이상과 같은 심부전에 대한 인과관계를 보인다(Weber KT, Sun Y, et al. Nat Rev Cardiol. 10(1):15-26(2013)). 최근 심부전은 심장 기능 이상에 따라 임상적으로 두 개의 범주로 구분하며, 좌심실의 섬유성 경직이 직접적 원인인 정상적 심장 박출 계수(ejection fraction)와 비정상적 이완기 기능이 나타나는 이완기성 심부전(Heart Failure with Preserved Ejection Fraction, HFpEF), 및 심장 근육 세포의 소실이 원인인 감소된 박출 계수, 수축기 기능 이상과 심장 확장증이 나타나는 수축기성 심부전(Heart Failure with Reduced Ejection Fraction, HFrEF)이 있다(Burchfield JS, Xie M, Hill JA, et al. Circulation. 128(4):388-400(2013); 및 Butler J, Fonarow GC, et al. JACC Heart Fail. 2(2):97-112(2014)). 이완기성 심부전의 위험 인자들에는 노화, 당뇨 및 대사성 질환, 심장 비대증, 관상 동맥 질환 및 고혈압 등이 있으며, 이들 요인들이 심장 섬유증을 일으켜 이완성 심부전을 진행시킨다. 또한 수축기성 심부전의 경우는 심근경색등 세포 사멸이 주요 원인이지만 대체성 섬유증 이외에도 간질성 섬유증의 확산이 중증도의 증가와 비례하고, 질병을 악화시키는 요인으로 작용함이 보고되었다(Borlaug BA, Nat Rev Cardiol.11(9):507-515(2014)).
심장 섬유증에 대한 예방 연구는 HGF(hepatohepa growth factor)의 과발현 형질전환 쥐 또는 TGF-β의 보조 인자인 엔도글린(endoglin) 유전자가 결핍된 형질전환 쥐에서 압력 과부하로 유도된 심부전 모델에서 보고되었다. 각각의 형질전환 모델 쥐에서 혈관 내피 세포들이 근섬유아세포로 교차분화(endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)가 저해되어 심장 섬유증과 심부전으로 진행되는 심장 기능의 악화를 예방시키는 효과가 보였지만, 이미 생성된 섬유증의 치료 효과에 대한 검증은 없었다(Okayama K, Azuma J, et al. Hypertension. 59(5):958-965(2012); 및 Kapur NK,et al. Circulation. 125(22):2728-2738(2012)).
섬유증 치료는 과잉 축적된 섬유증 조직 제거와 손상된 조직 기능의 회복 등 질병의 가역적 복귀를 촉진하는 치료 수단이 필요하다. 섬유증 질환의 치료에서 근섬유아세포의 노화와 사멸의 조절은 효과적인 치료 표적의 가능성이 많은 연구 결과를 통해 제시되고 있다(Darby IA, et al. Clin Cosmet Investig Dermatol. 7:301-311(2014)). 생체 내 조직 손상의 치유 과정에서 정상적 조직 구조 및 기능의 회복은 활성화된 근섬유아세포들이 노화와 세포 사멸로 사라지면서 개시된다. 축적된 세포외 섬유성 간질의 용해와 소거는 거식 세포와 섬유아세포에서 콜라겐 분해 효소들의 분비와 청소 작용으로 손상 후 복원이 일어난다(Wynn TA, Ramalingam TR. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat Med.18:1028-40(2012)). 하지만 섬유증의 가역적 치료와 회복이 될 수 있는 가능성은 항바이러스 치료를 받은 환자 중 간경화 증상이 가역적 회복 일어난 보고와 심부전 환자에게 좌심실 보조 장치를 사용하는 과정에서 드물게 심장 섬유증에 의한 근육 구조의 리모델링이 역전되어 심장 기능이 개선되는 경우에 대한 보고가 있다(Sun M, Kisseleva T, Clin Res Hepatol Gastroenterol. 39 Suppl 1:S60-63(2015); 및 Jeff M. Berry, et al. Circ Res.109:407417(2011)). 이 사실들은 이제까지 섬유증이 가역적 치료가 불가능하다는 인식에 대한 새로운 도전이며 섬유증에 새로운 치료 전략을 제시한다. 따라서 진행형 및 기 생성된 섬유증의 치료는 섬유증의 발생과 진행을 시키는 병원성 세포인 근섬유아세포의 증식 억제와 세포 사멸을 유도하는 방법들을 통해 섬유성 세포외 간질의 생성과 분해를 조절하고 정상 조직으로 회복시킬 수 있는 치료 수단의 개발이 요구된다.
본 발명에서 사용한 CCN5는 CCN족에 속하는 기질세포 단백질이며, CCN족에는 6종류의 단백질이 알려져 있으며 혈관계 질환, 혈관 신생, 종양 생성, 섬유증 질환 유발, 세포 분화 및 생존과 같은 세포 기능 조절에 다양한 역할을 하는 것이 보고되었다(Perbal B. Lancet, 363:62-4(2004)). CCN5는 다른 CCN족 단백질과 다르게 C-말단 도메인이 없으며 WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L 등 다른 이름이 있으며 250개의 아미노산 서열의 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. CCN5는 N-말단에 22개의 아미노산 분비 유도 서열이 있어 세포 밖으로 분비되어 신호 전달 단백질의 기능을 한다(Russo JW, et al.. J Cell Commun Signal.4(3):119-130(2010)).
본 발명에 사용된 유전자 치료법은 심혈관계 질환에서 질병 기전의 유전자 수준의 이해, 치료용 유전자 발굴, 유전자 운반 벡터의 디자인과 포장 기술 및 전달 기법의 비약적 발전으로 대동물에서의 전임상 실험과 환자 대상의 임상 실험들에서 다양하게 사용되고 있다(Mason D, et al. J Control Release. 215:101-111(2015)). 유전자 벡터는 비 바이러스성 벡터의 경우 SDF-1 유전자 벡터를 심장 상처 부위에 직접 주입하는 전달 방법으로 심근 경색 환자의 심장 기능 향상을 위한 임상 II 상 결과가 보고되었다. 또한 바이러스 벡터의 경우 아데노 바이러스(Ad: adenovirus)와 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus)를 이용한 유전자 전달 치료법이 심근에 직접 주입하는 방법과 삽입관을 이용하여 관상동맥과 정맥에 국소적으로 주입하는 전달되는 기술이 사용되었다(Chung ES, Miller L, et al. Eur Heart J. 36(33):2228-2238(2015)). 환자 대상으로 심장근육의 수축력 회복과 기능 향상을 위해 AAV1-SERCA2a의 유전자 치료가 임상 IIb를 종료하였고, AAV9-S100A1와 Ad5-Adenylyl-cyclase 6 임상단계에 있으며 바이러스 벡터에 의한 심각한 부작용의 발생은 없었다(Rincon MY, et al. Cardiovasc Res. 108(1):4-20(2015)). 따라서 본 발명을 통해 CCN5 단백질이 섬유증의 병원성 세포인 근섬유아세포의 선택적 사멸화 기전을 통해 다양한 원인에서 유발된 기 생성된 심장 섬유증을 유전자 전달법을 통해 치료하는 효과를 규명하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장질환을 가역적으로 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, CCN5 유전자 또는 CCN5 단백질이 근섬유아세포를 선택적으로 사멸하여 심장 섬유증을 현저하게 감소시켜 진행형 또는 이미 생성된 심장 섬유증의 치료가 가능하고, 심장 섬유증을 동반하는 수축기성 심부전(HFrEF) 또는 이완기성 심부전(HFpEF)에 치료 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 CCN5 단백질 또는 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체(gene carrier)를 포함하는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) CCN5 단백질; 또는 (b) CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체(gene carrier)를 유효성분으로 포함하는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장질환을 가역적으로 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, CCN5 유전자 또는 CCN5 단백질이 근섬유아세포를 선택적으로 사멸하여 심장 섬유증을 현저하게 감소시켜 진행형 또는 이미 생성된 심장 섬유증의 치료가 가능하고, 심장 섬유증을 동반하는 수축기성 심부전(HFrEF) 또는 이완기성 심부전(HFpEF)에 치료 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 심장 섬유증은 진행형 심장 섬유증 또는 이미 생성된 심장 섬유증이다. 상술한 바와 같이, 최근 섬유증을 가역적으로 치료할 수 있는 가능성이 보고되고 있으며, 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 본 발명의 조성물에 의하여 근섬유아세포가 선택적으로 사멸되고, 이에 의하여 기 생성된 섬유증이 회복된바, 진행형 심장 섬유증 또는 이미 생성된 심장 섬유증에 대하여 치료 효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 중요한 특징은 본 발명의 조성물이 근섬유아세포(myofibroblast)-특이적 사멸을 유도하는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 CCN5 단백질은 서열목록 제1서열에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 발명의 유효성분인 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체는 CCN5 유전자를 심장에 전달하는 유전자 전달 시스템에 이용된다. 본 명세서의 용어 “유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)과 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 “유전자 전달”은 “유전자의 확산(spread)”과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 발명의 유전자 전달 시스템을 제조하기 위해, CCN5 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(예컨대, CCN5 단백질 유전자)은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재할 수 있다. 상기 발현 컨스트럭트에서, CCN5 단백질 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서의 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, CCN5 단백질 유전자 서열에 결합된 프로모터는, 본 발명의 일 구현 예에 따르면 동물 세포, 다른 구현 예에 따르면 포유동물 세포에서 작동하여 CCN5 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus)프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구현 예에 따르면, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
본 발명의 유전자 담체는 다양한 형태로 제작할 수 있는데, 바이러스성 담체 또는 비-바이러스성 담체 형태로 제작할 수 있고, 보다 구체적으로 (i) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ii) 플라스미드, (iii) 바이러스 벡터, 및 (iv) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.
본 발명의 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 통산적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Re. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds), Humana Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편이성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편 E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J.R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서 본 발명의 CCN5 단백질 유전자는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 한편, 세포 내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/ 또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역, 바람직하게는 E3 영역에 삽입된 것이다. 또한, “프로모터-목적 뉴클레오타이드 서열-폴리 A 서열-IRES-CCN5 단백질유전자가 IRES(internal ribosome entry site)에 의해 연결된 바이시스트론(bicistronic) 발현 시스템에 의해서도 발현될 수 있다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2kb를 추가적으로 패킹할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형(세로타입, serotype) 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브 그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기위한 가장 바람직한 출발 물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주 세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.
레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, CCN5 단백질 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생성하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). CCN5 단백질 유전자, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포즈에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicholas and Rubinstein “Retroviral vectors”, In: Vector: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), StonehamL Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376(1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특징을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al.,Viology, 162:483-486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 심부전의 치료제로서 임상 2상을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(CCN5 단백질 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945(1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다.
AAV 바이러스는 9개의 상이한 세로타입(AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9)을 갖는다. 이 중에서, AAV1, AAV6, AAV8 또는 AAV9가 본 발명의 아데노-관련 바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다.
다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스(Puhlmann M et al., Human gene therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, “Mammalian expression vectors,” In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, “Vectors for gene transfer drived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes,” In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)). 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)) 로부터 유래된 벡터들도, CCN5 단백질 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 생성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamne (Gibco BRL)이 있다. CCN5 단백질 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 CCN5 단백질 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서, 유전자 담체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 본 발명의 약제학적 조성물의 주입 방법은 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다, 바이러스 벡터를 이용한 숙주세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biolo. 7:2745-2752(1987)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980);Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acat, 721:185-190(1982); 및 Nicolau ey al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
본 발명에서 이용 가능한 유전자 담체에 대한 자세한 내용은 미국 공개특허 제2013/0287739호에 상세하게 개시되어 있으며, 본 발명의 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 유전자 담체는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 리포좀 및 니오좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 유전자 담체는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)이고, 본 발명의 어떠한 구현 예에 따르면, 본 발명의 아데노-관련 바이러스는 아데노-관련 바이러스 세로타입(serotype) 1, 6, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 특정 구현 예에 따르면, 본 발명의 유전자 담체는 아데노-관련 바이러스 세로타입 9이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 근섬유아세포(myofibroblast)-특이적 사멸을 유도하거나 섬유아세포의 근섬유아세포로의 분화를 억제하는바, 심장 섬유증을 동반하는 수축기성 심부전(Heart Failure with reduced Ejection Fraction) 또는 심장 섬유증을 동반하는 이완기성 심부전(Heart Failure with Preserved Ejection Fraction)의 치료에 효과가 있다.
하기 실시 예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 수축기성 심부전 모델인 압력 과부하 모델과 근퇴행위축성 심장병 모델 및 이완기성 심부전 동물(Aortic banding- Ischemia-reperfusion-Debanding,AID) 모델에서 AAV9-CCN5의 유전자 치료를 통해 질환 심장에 CCN5를 발현시킴으로써 심장 섬유증을 가역적으로 치료하고 수축기성 및 이완기성 심장기능의 저하 방지 또는 치료시켰다. 또한 본 발명의 조성물은 심장의 수축력을 일으켜 혈액 순환의 펌프 기능을 담당하는 SERCA2a 단백질 역시 증가시키는바, 수축기성 심부전에 대한 직접적 치료 효과도 예측할 수 있고, 따라서 이완기성 심부전과 수축기성 심부전 증상이 공존하는 경우에도 치료 효과를 예측할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환은 심근 비대증, 만성 대사성 질환에 의한 심장병, 심장 판막증, 염증성 심장 질환, 구조적 심장병, 전염성 병원체 감염에 의한 심장병, 선천성 심장병, 유전성 질환에 의한 심장병, 흡연, 알코올 섭취 또는 약물(예컨대 항암제)의 독성 노출에 의한 심장병, 및 노화에 의한 심장병을 포함한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 심장 섬유증 질환은 심근 비대증; 고혈압, 만성 신장질환, 당뇨 또는 비만 등의 만성 대사성 질환에 의한 심장병; 심장 판막증; 사르코이드증, 자가면역성 심근염, 심장이식 거부반응 등의 염증성 심장 질환; 관상동맥 기능부전, 대동맥 협착증, 비 허혈성 확장형 심근증 등의 염증성 심장질환; 샤가스병, 바이러스성 심근염 등의 전염성 병원체 감염에 의한 심장병; 청색성 심장병, 할로씨 사장, 대 혈관 전위, 단심실 등의 선천성 심장병; 뒤센형 근위축증(Duchenne muscular dystrophy), 베커형 근위축증(Becker muscular dystrophy), 파부리병(Fabry disease) 등의 유전성 질환에 의한 심장병; 흡연, 알코올 섭취 또는 약물의 독성 노출에 의한 심장병; 및 노화에 의한 심장병으로 구성된 군으로부터 선택되는 심장 질환이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 주입량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, CCN5 단백질 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 기준으로 하였을 때 0.0001 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중)으로 주입할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 상기 비경구 주입는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 주입, 조직에 직접 주입하는 방법 등을 포함한다.
상기 약제학적 조성물의 제형은 사용밥법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(suspensions), 침제(Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pill)등으로 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 것은 상기 CCN5 단백질 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체 자체뿐만 아니라, 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물이다.
본 명세서의 용어, “약제학적으로 허용 가능한 염”은 소망하는 약리학적 효과, 즉 근섬유아세포의 분화를 억제하고 근섬유아세포를 선택적 사멸하는 활성을 갖는 본 발명의 유효 성분의 염을 나타낸다. 이러한 염은 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드 및 하이드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스프르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 생성된다. 본 명세서의 용어, “약제학적으로 허용 가능한 수화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 CCN5의 수화물을 나타낸다. 본 명세서의 용어, “약제학적으로 허용 가능한 용매화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 본 발명의 유 효성분의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) CCN5 단백질 또는 CCN5 유전자를 포함하는 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 CCN5 단백질 또는 CCN5 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환 치료용 약제학적 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 CCN5 단백질 또는 CCN5 유전자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면, CCN5 단백질 또는 CCN5 유전자를 포함하는 세포는 심장으로부터 유래한 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 시용되는 용어 “시험 물질”은 CCN5 단백질 유전자의 발현량 또는 CCN5 단백질의 양에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학 물질, 뉴클레오타이드, 안티-센스RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이어, 시험 물질이 처리된 세포에서 CCN5 유전자의 발현량 또는 CCN5단백질의 양을 측정한다. 측정 결과, CCN5 유전자의 발현량 또는 CCN5 단백질의 양이 증가-조절(up-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시험 물질은 심장 섬유증 치료제; 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료제로 판정할 수 있다.
CCN5 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufman et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC Press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) 등을 이용하여 실시할 수 있다.
RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시험 물질을 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, CCN5 단백질 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭산물을 전기영동하고, 생성된 밴드를 분석하여 CCN5 단백질 유전자의 발현양 변화를 측정한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) CCN5 단백질; 또는 (b) CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체(gene carrier)를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하여 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상술한 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 방법으로서, 상기 본 발명의 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 심장 섬유증 또는 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 질환 발생 후 진단이 되는 심장 섬유증에서 근섬유아세포를 선택적으로 사멸시킴으로써 섬유증 기질을 용해하고 정상적 조직으로 복귀시키는 효과가 있는바, 현재까지 비가역적 질환 진행으로 여겨져 치료제가 개발되지 못했던 심장 섬유증 및 심장 섬유증을 동반하는 심장 질환 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 인간(A)과 마우스(B)의 심부전 질환 심장조직에서 CCN5 단백질의 발현량의 변화를 CCN5와 GAPDH 항체로 확인한 결과이다(**P<0.01).
도 2는 AAV9-CCN5를 실험 쥐의 꼬리 정맥으로 주입한 후 4주 뒤에 심장조직에서 CCN5 단백질을 발현시키는 양을 보여준다(n=6,*P<0.05).
도 3a-3e는 기 생성된 심장 섬유증에 대한 AAV9-CCN5의 가역적 치료 효과와 심장 기능 보호 효과를 압력 과부하 모델 실험 쥐에서 보여준다. 도 3a는 가역적 치료 효과를 보기 위한 압력 과부하 모델 유도 및 AAV-CCN5 유전자 치료 주입의 실험 스케쥴을 표시하였다. 도 3b 상단은 심장 조직의 섬유증 정도를 Masson-Trichrome 염색법을 사용하여 확인하였다. 간질 조직(interstitial tissue) 섬유증 이고 하단은 혈관 주위 조직(perivascular tissue) 섬유증이며 각각의 조직에서 섬유증 범위를 퍼센트를 점으로 표시하였다. 도 3c는 형광 염색법을 이용하여 심장 조직의 단면을 α-SMA(근섬유아세포의 표적단백질) 항체로 염색한 결과이다. 왼쪽의 대표 그림은 간질 조직(interstitial tissue)을, 오른쪽의 대표 그림은 혈관 주위의 조직(perivascular tissue)을 나타낸다. 하단은 α-SMA 발현하는 세포의 정도를 분석하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 3d는 유동 세포 계측법으로 측정한 결과이다(FACS, n=3, *P<0.05, **P<0.01). 도 3e는 심초음파 검사법을 통해 심장의 단축 분획률(FS)과 종말 수축기(LVIDs) 및 이완기 좌심실 내강지름(LVIDd)을 측정하였다(n=16, *P<0.05).
도 4a-4c는 AAV9-CCN5와 CCN5 단백질이 근섬유아세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 생체 내와 세포 수준에서 보여준다. 도 4a는 압력 과부하 쥐 모델에서 실험 스케쥴이고, 도 4b는 심장 조직 절편을 TUNEL 염색법(붉은색)과 근섬유아세포의 특이 단백질인 α-SMA 항체(초록색)로 동시에 염색한 결과이다. 도 4c는 도 4b의 실험군 별로 근섬유아세포의 세포 사멸 정도를 정량적으로 나타내었다(n=3, **P<0.01).
도 4d-4f는 심근세포(Myo), 섬유아세포(FB), 근섬유아세포(MyoFB)가 대조 세포 배양액과 CCN5 단백질이 포함된 세포 배지에서 48시간동안 배양한 후 실험한 결과이다. 도 4d 는 DAPI로 염색한 결과로 화살표는 피크노시스된 핵(pyknotic nuclei)이고, 오른쪽 도면은 피크노시스된 핵의 숫자를 그래프로 나타내었다. 도 4e의 동일 조건에서 배양된 세포들을 TUNEL 염색을 한 결과로 화살표는 TUNEL을 나타내는 핵이고, 오른쪽 도면은 TUNEL 형광을 나타내는 핵의 숫자를 세어 그래프로 나타내었다(n=3, **P<0.01). 도 4f는 섬유아세포와 근섬유아세포들이 대조 배지(CM-Con)과 CCN5 단백질이 포함된 배지(CM-CCN5)에 48시간동안 배양된 후 세포유동 측정법(FACS)으로 분석한 결과를 나타낸다(n=3, **P<0.01).
도 5a-5e는 CCN5 단백질이 근섬유아세포의 선택적 세포 사멸의 기전을 보여준다(n=3, **P<0.01). 도 5a는 섬유아세포와 근섬유아세포에 대조 배지(CM-Con) 또는 CCN5 단백질이 포함된 배지(CM-CCN5)을 넣고 1일 또는 2일간 배양한 후, 세포로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다. 도 5b는 상기 세포에서 항-싸이토크롬 C(cytochrome C)의 항체를 사용하여 면역화학법을 실시한 결과이다. 도 5c는 상기 세포에서 NF-κB, 비멘틴, α-SMA 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다. 도 5d-5e는 섬유아세포와 근섬유아세포에서 NF-κB 리포터 분석과 NF-κB 항체로 형광 염색한 결과이다.
도 6은 CCN5 단백질을 과발현시키는 세포 제작(A)과 조건 배양액으로 분비 및 활성(B)을 보여준다.
도 7은 랫트의 심장 조직에서 심장 근육 세포와 섬유아세포의 분획과 분획된 섬유아세포를 TGF-β 처리 후 근섬유아세포 분화 유도 및 CCN5 단백질이 분화에 미치는 영향을 보여준다.
도 8은 AAV9-CCN5가 TGF-β의 신호 전달에 미치는 영향을 대조군과 압력 과부화 모델 쥐에서 보여준다(n=3, **P<0.01).
도 9a-9c는 AAV9-CCN5와 CCN5 단백질이 TGF-β의 활성으로 혈관 내피 세포 유래 섬유아세포(EndoMT)로 교차 분화되고 근섬유아세포로 진행되는 결과에 미치는 효과를 생체 내와 세포 수준에서 보여준다, 도 9a 는 Scl-Cre-ERT; R26RstopYFP 이중 형질전환 마우스모델의 AAV-CCN5 유전자 주입 및 위장수술/대동맥 교차 협착 수술의 스케쥴을 나타낸다. 도 9b-9c 는 수술 8주 후 상기 마우스 모델의 심장 조직을 샘플링하여 면역화학법을 수행한 결과이다(n=3, *P<0.05, **P<0.01). 도 9d는 인간 관상동맥 내피 세포(HCAEC)에 TGF-β를 처리하고 대조 배지와 CCN5 단백질을 포함하는 배지에 48시간 동안 배양한 후, 면역화학법을 수행하여 항 VE-카데린과 항-비멘틴 항체로 염색한 결과이다. 도 9e는 배양된 인간 관상동맥 내피 세포(HCAEC)를 동일 넓이로 긁어낸 후 9d와 동일 배지 조건에서 배양한 후 세포 고정과 DAPI로 염색하고 세포의 이동 정도를 측정한 결과를 나타내었다(n=4, *P<0.05, **P<0.01). 도 9f 는 qRT-PCR로 α-SMA, 콜라겐 I, 콜라겐 III, Tie2 와 CD31의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다(n=6, *P<0.05, **P<0.01).
도 10a-10f는 AAV9-CCN5와 CCN5 단백질이 TGF-β의 활성으로 섬유아세포에서 근섬유아세포로 교차 분화하는 결과에 미치는 효과를 생체 내와 세포 수준에서 보여준다. 도 10a 는 8주령 마우스 모델의 AAV-CCN5 유전자 주입 및 위장 수술/대동맥 교차 협착 수술의 스케쥴을 나타낸다. 도 10b는 수술 8주 후 상기 마우스 모델의 심장 조직을 샘플링하여 면역화학법을 수행한 결과이다. 도 10c는 비멘틴을 발현하는 세포 중에서 동시에 α-SMA를 발현하고 있는 세포를 그래프로 나타낸 것이다(n=3, P<0.05, **P<0.01). 도 10d는 섬유아세포에 TGF-β를 처리하고 CCN5 단백질을 포함하는 배지에 48시간 배양한 후, DAPI와 면역화학법을 수행하여 항-α-SMA 항체 항체로 염색한 결과이다. 도 10e는 콜라겐 젤 수축법을 이용하여 CCN5의 TGF-β에 의한 근섬유아세포의 분화 억제를 확인한 결과이고(n=3, P<0.05, **P<0.01), 도 10f는 정량적 qRT-PCR을 수행하여 α-SMA와 콜라겐 I의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다(n=6, P<0.05, **P<0.01).
도 11은 AAV9-CCN5가 심장 섬유증에 대한 가역적 치료 효과와 심장 기능 보호를 근퇴행위축성(DMD) 모델 실험 쥐에서 보여준다. 도 11의 a는 가역적 치료효과를 보기위한 고령화 근퇴행위축성 모델 쥐 유도 및 AAV9-CCN5 유전자 치료 주입의 실험 스케쥴을 표시하였다. 도 11의 b 및 c는 심장 조직의 섬유증 정도를 Masson-Trichrome 염색법을 사용하여 확인하였다. 각 실험군의 섬유증 범위는 퍼센트 막대그래프로 표시하였다(n=3~4, p<0.001).
도 12는 근퇴행위축증(DMD) 모델 쥐에서 AAV9-CCN5의 심장 기능 개선에 대한 측정 결과를 나타낸다. 도 12의 a는 심실 단축률을 측정한 결과를 나타내며(n=3~7, p<0.005) 도 12의 b는 심장의 혈액동력학 기능을 측정한 결과로 평균 수축 종말 압력과 부피 상관계수(end-systolic pressure-volume relationship, ESPVR)로 표시하였다(n=6~7,p<0.05).
도 13은 근퇴행위축증(DMD) 모델 쥐에서 AAV9-CCN5에 의한 섬유증 관련 단백질 발현의 변화를 웨스턴 블롯법으로 확인하였다.
도 14는 근퇴행위축증(DMD) 모델 쥐에서 AAV9-CCN5에 의한 섬유증 관련 유전자 발현의 변화를 qRT-PCR법으로 확인하였다.
도 15은 AAV9-CCN5가 기 생성된 심장 섬유증에 대한 가역적인 치료와 심장 수축력에 미치는 영향을 AID(Aortic banding- Ischemia-reperfusion-Debanding) 심부전 랫트 모델에서 보여준다. 도 15의 A는 가역적 치료 효과를 보기위해 AID 랫트 모델 유도 및 AAV-CCN5 유전자 치료 주입의 실험 스케쥴을 표시하였다. 도 15의 B 상단은 세포 간질의 심장 섬유증 정도를 Masson-Trichrome 염색법을 사용하여 확인하였다. 하단은 혈관주변 부위의 심장 섬유증 정도를 보여준다. 도 15의 C는 심장절편에서 심장 섬유증이 일어난 상대적인 면적을 나타낸다(n=5-8. p <0.05, B-C).
도 16은 AID 랫트 모델에서 AAV9-CCN5의 심장 기능 개선에 대한 측정 결과를 나타낸다 도 16의 A는 심장 초음파 분석을 통하여 얻는 심실의 단축률을 나타낸다(n=5-8, **P<0.01). 도 16의 B는 AAV9-CCN5가 AID 랫트 모델에서 심장 기능에 대한 효과를 압력-볼륨 루프 분석결과로 보여준다. 도 16의 C는 AAV9-CCN5를 혈액 동력학 분석의 대표적인 결과인 ESPVR (End-Systolic Pressure-Volume Relations) 값과 EDPVR(End-Diastolic Pressure-Volume Relations) 값을 보여준다(n=6, p <0.05, B-C). AAV9-CCN5가 AID 랫트 모델에서 심장 기능에 대한 효과를 혈역학적, 압력-볼륨 루프 분석 결과로 보여준다. ESPVR의 값은 심장의 수축기 기능을 나타내고, EDPVR(End-Diastolic Pressure-Volume Relations)의 값은 심장의 이완기 기능을 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
모든 동물 실험들은 광주 과학 기술원과 마운트 시나이 의학 대학의 동물보호와 사용 위원회의 승인과 규정에 따라 수행하였다. 실험 분석은 NIH의 동물 보호와 사용에 관한 기준 지침을 준수하였다.
실험방법
대동맥 교차 협착(TAC; Transverse aortic constriction)에 의한 압력 과부하 동물 모델(심부전 모델) 제작
Jackson Laboratory의 8-10주령의 C57BL/6 수컷 마우스(무게 25-30g)를 연구에 사용하였다. 마우스의 마취는 95 mg/kg 케타민과 5 mg/kg 자일리진으로 만들어진 용액을 사용하여 복강 내 주사로 수행하였다. 마우스는 산소호흡기를 이용하여 0.2의 일 호흡량과 분당 11숨의 호흡 속도로 호흡시켰다(Harvard Apparatus). 대동맥 궁이 보이도록 근위 복장 뼈 부위를 세로로 2-3mm 절개하였다. 무명 동맥과 왼쪽 총경동맥 사이에 27-게이지의 침을 놓고 횡 방향의 대동맥 궁을 묶었다. 침은 즉시 제거하고, 절개한 부위를 덮어 마무리하였다.
유전적 근퇴행위축증 동물에서 심부전 모델
C57BL/10ScSn (Dmdmdx/Utrntm1Jrs)를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. 근퇴행위축성 심장 질환을 확실히 유발시키기 위해 9개월령 이상의 노화된 MDX/UTRN (+/-) 수컷 쥐를 실험에 사용하였다. 수컷 쥐는 인간의 X 염색체 관련 선천성 유전 질환인 뒤센형 근퇴행위축증과 임상적 연관성을 나타내는 모델이다.
압력 과부하와 허혈-재관류 복합의 심부전 모델(AID모델) 제작
랫트(rat)에서 압력 과부하와 허혈-재관류(Ischemia-reperfusion)를 동시에 실시한 복합적인 심부전 모델을 이용하였다. 체중이 180-200 그램인 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫을 이용하였다. 개흉술(Thoracotomy)로 2번째 늑간을 열고, 상행 대동맥을 외경이 0.965 mm 인 PE-50 튜브와 같이 4-0 봉합선으로 묶은 다음, PE-50 튜브를 뽑아내었다. 이 시술로 심장에 압력 과부하가 주어진다. 2개월 후에 좌전하행 관상 동맥을 30분 동안 결절한 다음 재관류 되도록 하였다. 자세히 설명하면 좌심장 끝에서 4 mm 아래 지점에 6-0 봉합선으로 혈관을 완전히 결절한 다음 30분 후에 풀어주었다. 다시 1개월 후에 상행 대동맥을 묶은 봉합선을 다시 완전히 풀어주었다. 총 4개월에 소요되어 만들어지는 이 복합 심부전 모델을 AID(Aortic banding-Ischemia-reperfusion-Debanding) 라고 부른다.
심장 기능분석-경흉부, 심초음파 및 생체 혈액 동력학
모델 마우스 실험동물을 케타민(ketamine)을 100ug/g의 농도로 복강주사를 통해 마취를 하였다. 2차원 영상과 M-모드 투사(tracing)는 심실 단축률과 치수(dimentions)들을 결정하기 위해 15.0 MHz 전환기(GE Vivid 7 Vision)를 사용하여 왼쪽 심실 유두근(left-ventricular papillary muscle)의 단축으로 대해 기록하였다. 랫트에서는 기관지 절개를 통해 관을 삽입한 후 이소플루레인(isoflurane) 을 통해 마취를 하였다. 심장을 정공 흉부절개를 시행하여 Seven sonomicrometer crystals(Sonometrics, London, Ontario, Canada)을 이용하여 좌심실 심외막에 매듭으로 연결하였다. Millar SP-671 압력 전환기를 좌심실의 전벽을 통해 삽입하였다. 데이터는 상용 소프트웨 SonoLab을 사용하여 수집하였고 혈액 동력학 측정은 하대정맥 및 대동맥의 임시 폐쇄 후 전부하 와 후부하 압력의 범위에서 실시하였다. 심장 기능 데이터는 MATLAB(v7.0, The MathWorks, Natick, MA)에서 작성된 일련의 알고리즘을 통해 분석하였다. 심초음파 실험은 실험의 정확도를 높이기 위해 동일 실험자에 의해 모든 실험 기간동안 진행하였다. 실험의 정확도를 높이기 위해 550 bpm의 최소 심장 박동이 필요하였는데 이는 심장 기능의 서맥 관련 과소평가를 최소화한 상태에서 구조적, 기능적 평가를 포함하기 위해 실시하였다. 측정 수치는 각 마우스당 3번 실시하였으며 평균값을 구한 수치로 표시하였다. 생체 혈액 동력학 분석은 1.2F-압력-볼륨 전도카테터(1.2Fr pressure-volume (PV) conductance catheter, Scisense, Ontario, Canada)를 사용하여 수행하였다. 마우스의 마취는 urethane (1 mg/g), etomidate (10 μg/g) 및 morphine (1 μg/g)의 복합액을 복강주사를 통해 하였으며 기관지 절개로 관 삽입을 하여 분당 125의 호흡과 7ul/g의 호흡량을 기계적 환기로 시켰다. PV 카테터는 정점을 찌르는 접근으로 좌심실안에 위치시켰으며 PV 데이터는 IOX2 software (EMKA technologies)를 사용하여 분석하였다. 심장 스트레스 도전(Cardiac stress challenge)은 생리 식염수에 dobutamine을 혼합하여 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml 및 1 mg/ml로 농도를 증가하여 주입하였으며, 혈액 동력학 매개 변수가 정상화하기 위해 주입 실험 별로 10분의 시간 간격으로 오른쪽 경정맥 안에 삽입된 중심정맥 카테터를 통해 주입되었다.
아데노-관련 바이러스 벡터(AAV) 제작과 주입
자가 보완적인 AAV(serotype 9)를 제작하기 위해 pds-AAV2-EGFP 벡터에 인간CCN5 유전자를 클로닝하였다. 바이러스 패키징 저해를 막기 위해, AAV 벡터제작 시, eGFP 시퀀스를 제조하였다. 재조합 AAV는 293T 세포를 이용해 제작하였다. 세포 배양액에 있는 AAV 입자들을 모아서 황산 암모늄(ammonium sulfate)으로 석출시키고 이는 이오딕사놀 그래디언트(iodixanol gradient)를 이용한 초원심 분리를 통해 정제하였다. 원심분리를 사용하여 이오딕사놀을 Lactate Ringer’s 용액과 교환하는 다수의 희석과 농측 공정을 거쳐서 AAV 입자들을 농축화하였다. AAV 농도는 정량적 RT-PCR과 SDS-PAGE를 이용하여 수치화하였다. AAV-VLP와 AAV-CCN5는 모델 마우스와 랫트의 꼬리정맥에 5X1010_ 1X1011바이러스 유전체들을 주입하였다.
재조합 활성 CCN5 발현
CCN5 단백질을 만들기 위해, pcDNA3.1-CCN5HA 플라스미드를 이용하였다. HEK293 세포를 5x105으로 60 mm의 배양접시에 깔고, 1일간 세포를 안정화 시켰다. 그 이후, pcDNA3.1-CCN5HA를 리포팩틴을 이용하여 감염시켰다. 리포펙틴을 제거하기 위하여 4시간 후에 혈장이 제거된 조건 배양액(conditioned media, CM)으로 교환해주었다. 그 후, 24시간 동안 배양한 후 얻어진 분비된 CCN5를 CM-CCN5라고 하고, 이를 실험에 사용하였다. CCN5 단백질의 발현은 웨스턴 블롯으로 확인하였고, 이는 CCN5에 태깅 되어 있는 HA 항체를 이용하여 확인하였다.
상주 섬유아세포 분리
수컷 8주령 랫트(다물 사이언스)에 이소플루란(isoflurane)을 이용해 호흡마취 시킨 후 심장을 적출하였다. 대동맥 캐뉼라를 대동맥에 삽입한 후, 랑겐돌프 (Langendorff Apparatus)에 재빨리 매달고 심장에 붙어있는 불필요한 조직을 제거하였다. 정속관류를 이용하여 100% O2로 포화된 37℃의 생리액(Tyroid buffer; 조성: 125 mM/L NaCl, 5 mM/L KCl, 12.5 mM/L HEPES, 11 mM/L 글루코오스, 10 mM/L BDM, 5 타우린, 2.4 MgCl2)으로 관류시켰다. 생리액을 이용하여 충분히 피가 제거되고 나면, 100%로 포화된 37℃의 엔자임 용액(콜라겐분해효소 II 300 μg/ml, 히알루론산 80 μg/ml)을 50분 동안 관류시켜 심장조직을 분해하였다. 이 과정을 통해서 심장 조직이 분해되고 나면 여러 번의 피펫팅을 수행한 뒤, 70 μm의 세포 거름망을 통해 완전히 분해되지 않은 조직과 단일 세포를 분리하였다. 심근 세포와 심장을 구성하는 다른 세포들(섬유아세포, 내피 세포 및 평활근 세포)의 가장 큰 차이는 세포의 크기이다. 이 특징을 이용하여 걸러진 세포용액을 25 g 3분 동안 원심분리기하여 심근 세포를 분리하였다. 상층액을 걷어서 250 g 10분 동안 원심분리하여 섬유아세포, 내피 세포 및 평활근 세포들을 분리하였다. 이렇게 얻어진 세포는 DMEM(Low glucose/10% FBS/1% 항생제)가 포함된 배양액에 섞어서 배양 접시에 깔아준 후 37℃ 5% CO2인 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 섬유아세포는 다른 세포들과 다르게 짧은 시간 안에 배양 접시에 붙어 안정화되는 특징을 가지고 있다. 따라서 4시간 후 배지를 교체하여 그 사이 배양 접시에 붙어서 안정화된 세포인 섬유아세포를 제외한 다른 세포들을 제거하였다. 다음날 배지를 교체한 후에는 이틀마다 배지를 교체하며 섬유아세포를 배양하였다(Skrzypiec-Spring, et al. J Pharmacol Toxicol Methods 55: 113-126(2007)).
섬유아세포를 근섬유아세포로 분화 유도
랫트의 심장에서 분리한 상주 섬유아세포에 10 ng/m TGF-β(Peprotech)를 처리하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 이틀 동안 배양하였다. 근섬유아세포로 분화를 확인하기 위해서 마커 단백질인 α-SMA를 면역화학법을 통해 확인하였다(Kovacic JC, et al. Circulation. Apr10;125(14):1795-1808(2012)).
CCN5의 섬유아세포와 내피세포의 근섬유아세포와 중간엽 세포로 교차분화의 면역형광 염색법
섬유아세포와 내피 세포(HCAEC)를 16 mm 커버 슬립에다 깔고 하룻밤 동안 배양하여 안정화 시킨 뒤, 10 ng/ml의 TGF-β와 CCN5를 처리하여 48시간 배양하였다. 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하고, 0.5% Triton X-100 용액으로 세포막 침투가능화를 시킨 후, 5% BSA 용액으로 블로킹하였다. 항-VE-카데린(Cell Signaling Technology), 항-비멘틴(Santa Cruz) 또는 항-α-SMA(Sigma) 항체로 반응시키고, 이차 항체는 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594(Invitrogen)을 사용하였다. DAPI를 이용하여 핵을 염색하였다. 면역화학법을 수행한 세포는 형광현미경(Olympus)을 이용하여 분석하였다(Okayama K, et al. Hypertension. 59:958-965(2012)).
콜라겐 젤 격자 분석
콜라겐 젤 수축법은 1x10 cells/mL 섬유아세포들과 1.2 mg/mL 콜라겐 용액(Invitrogen)을 섞고 1N NaOH(~20 μL)를 넣어 콜라겐 용액의 pH를 중성화시켰다. 피펫팅으로 간단히 섞은 후 콜라겐 젤 현탁액은 24-웰 플레이트에 500 μL씩 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 중합반응을 시켰다. 콜라겐 젤이 생성된 후 DMEM 배지에서 대조군 및 TGF-β 단독, 또는 CCN5과 병용 처리군을 각각 배양하였다. 48시간 후에 콜라겐 젤의 수축 정도를 관찰하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석한다(Dobaczewski M, et al. Circ Res.107:418-428 (2010)).
혈관 내피세포를 중간엽세포로 분화 유도(EndMT)
인간 관상 동맥 내피세포(HCAEC)를 이용하여 EndMT를 유도하였다. HCAEC는 Lonza를 통해서 구입하였으며 EGM-2(Lonza) 배양액을 사용하여 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. HCAEC는 인체 유래 세포로 구입 당시 계대 배양 횟수 3의 세포를 받아 실험에는 계대 배양 횟수 5에서 7 사이의 세포를 이용하였다. HCAEC 세포를 이용한 EndMT를 유도하기 위해서는 배양 시 세포의 밀도, 배양액의 교체 등을 통해 세포의 상태를 잘 유지하는 것이 중요하다. HCAEC를 배양 접시에 깔아준 후, 약 12시간 정도 안정화 시켜준 뒤에 10 ng/ml TGF-β를 처리하고 3일동안 배양하였다. EndMT를 유도하는 동안 배양액의 교체는 하지 않으며, 3일이 지난 후 HCAEC가 중간엽 세포로의 교차 분화가 일어났는지 확인하기 위하여 면역 세포 화학법, 정량적-PCR을 수행하였다. HCAEC의 마커 유전자로는 Tie2와 VE-카데린(CD31)을 사용하고, 중간엽 세포의 마커 유전자로는 비멘틴, α-SMA, 콜라겐 I, 콜라겐 III과 FSP-1을 사용하였다(Medici D, et.al. Biochem J 437:515-520(2012)) 및 Zeisberg EM, et al. Nat Med.13: 952-961(2007)).
시험관 세포이동 분석
세포의 이동 능력을 측정하기 위해 스크래치 분석을 수행하였는데 12-웰 플레이트에 HCAEC를 깔고 하룻밤 동안 세포가 안정화 되도록 하였다. 다음날, 배양액을 교체하고, 200 μL의 팁을 이용하여 세포에 스크레치를 만들었다. 생리 식염수로 긁어진 세포를 세척한 후, CM-Con 또는 CM-CCN5와 함께 10 ng/ml의 TGF-β를 처리하여 배양하였다. 48시간 후, 세포를 DAPI로 염색하고 형광현미경으로 분석하였다. MetaMorph 소프트웨어를 이용하여 세포가 이동한 거리를 분석하였다(Widyantoro B, et al. Circulation 121:2407-2418(2010)).
NF-B 리포터 유전자 분석
랫트의 섬유아세포와 근섬유아세포를 6-웰 플레이트 안에 3x105 세포수로 놓은 후 NF-B 리포터 플라스미드(pBIIx), pRenilla와 다른 플라스미드(empty pcDNA3 벡터와 pcDNA-hCCN5)를 리포펙타민 2000(Invitrogen)으로 형질주입을 하였다. 48시간 후 세포들을 수동적 용해 완충액으로 파쇄한 후 4℃에서 14000 rpm으로 원심 분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 루시퍼레이즈 활성은 Dual-luciferase reporter assay system(Promega)을 이용하여 측정하였다.
세포 사멸 TUNEL 분석
배양한 심근세포, 섬유아세포와 근섬유아세포를 유리 커버슬립에 깔고 DeadEnd Fluorometric TUNEL kit(Promega)를 이용하여 염색하였다. 세포사멸에 의해 DNA 분절이 일어난 것을 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용해 확인할 수 있었다. TUNEL 형광을 확인하기 위해 Fluoview FV 1000 공초첨 현미경을 사용하였다(Oberhaus SM. Methods Mol Biol.218:85-96(2003)).
조직 형광면역 화학법
마우스심장조직은 OCT compound(Tissue-Tek)을 이용하여 저온 보존한 후, 6 μm 두께로 잘랐다. 조직을 고정한 후, 아세톤-메탄올을 이용해 -20℃에서 20분간 반응하여 침투 가능한 세포막이 되도록 하였다. 조직은 PBS를 이용하여 재수화시키고, 5% BSA 용액으로 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 항-α-SMA, 항-GFP 및 항-비멘틴 항체를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 생리 식염수로 일차 항체와 반응시킨 조직을 세척하고, 형광 Alexa546 또는 Alexa488이 연결되어 있는 이차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 형광 면역화학법으로 실험한 심장조직은 Fluoview FV 1000 공초점 현미경을 이용해 결과를 확인하였다.
조직병리학적 염색(Masson-Trichrome 염색법)
모델 동물들로 부터 심장근육을 취한 후 즉시 Fisher Healthcare (Pittsburgh, PA),로부터 구입한 적정 절단 온도로 포매용액에 담근 후 신선하게 동결하고 8um의 두께로 절편하였다. 절편된 샘플은 섬유증 정도를 확인하기 위해 Masson-Trichrome(Abcam) 염색을 한 후 광학 현미경을 통해 관찰하였다.
유동 세포 계측법
분리한 섬유아세포 층은 0.2%의 소 태아 혈장(FBS)이 포함된 생리 식염수를 이용하여 세척하고, 2.5% 포름알데히드 용액으로 고정하였다. 0.5%의 Triton X-100 용액으로 세포막 침투 가능화를 한 후, FITC가 연결되어 있는 α-SMA 항체(Abcam)를 이용하여 반응시켰다. 배양한 섬유아세포와 근섬유아세포는 0.2% FBS 용액으로 세척하고, PE가 연결된 Annexin 항체(ebebioscienc)를 이용하여 반응시켰다. 염색된 세포는 Guava easyCye HT(Millipore)를 이용해 분석하였다(Saada JI, et al. J Immunol 177:5968-79(2006)).
웨스턴 블롯 분석
세포와 조직 균질액은 단백질을 SDS-PAGE 젤을 이용하여 크기별로 분리하고 이를 PVDF 막(Millipore)로 옮겼다. 단백질의 발현을 확인하는 것은 기본 실험 프로토콜을 따라서 수행하였다(Kawaki et al., 2011). 준비된 막은 항-CCN2, 항-CCN5(Lifespan biosciences), 항-SERCA2a(21st Century Biochemicals), 항-Smad4, 항-p-Smad2, 항-Smad2/3(Cell signaling), 항-Smad7(Lifespan biosciences), 항-LOX(Abcam), 항-α-액티닌, 항-α-SMA(Sigma), 항-비멘틴, 항-Bcl-2(Santa Cruz)와 Caspase antibodies kit(Cell signaling) 항체와 함께 인큐베이션 하였다.
정량적 RT-PCR
QuantiTect SYRB Green real time PCR Kit(Qiagen Ltd)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였고 이를 통해 전사수준을 분석하였다. 트리졸(gibco BRL)을 사용하여 심장조직으로부터 RNA를 분리하여 이를 cDNA로 합성하였다. 다양한 Quantitative real-time PCR 조건은 37 사이클: 94℃ 10초, 57℃ 15초, 72℃ 5초였다. 실험에 사용된 프라이머의 정보는 하기 표 1과 같다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
마우스 TGF-β1 5′-CAACAATTCCTGGCGTTACCTTGG3′ 5′-GAAAGCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3′
마우스 TGF-β2 5′-CGAGCAGCGGATTGAACTGT-3′ 5′-TTGTGGTGAAGCCACTCCTG-3′
마우스 IL-10 5′-TGAGGCGCTGTCGTCATCGATTTCTCCC-3′ 5′-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3
마우스
Galectin 3		 5′-TTGAAGCTGACCACTTCAAGGTT-3′ 5'-AGGTTCTTCATCCGATGGTTGT-3'
마우스 CCN2 5′-CTCCTACTACGAGCTGAACCAG-3′ 5′-CCAGAAAGCTCAAACTTGACAGGC-3′
마우스
Collagen 1A		 5′-CCCAAGGAAAAGAAGCACGTC-3′ 5′-AGGTCAGCTGGATAGCGACATC-3′
마우스
Collagen 3A		 5′-TGGTAGAAAGGACACAGAGGC-3′ 5′-TCCAACTTCACCCTTAGCACC-3′
마우스
Fibronectin		 5′-TTAAGCTCACATGCCAGTGC-3′ 5′-TCGTCATAGCACGTTGCTTC-3′
인간 α-SMA 5′-GCCCAGCCAAGCACTGTCAGGA-3′ 5′-TCCCACCATCACCCCCTGATGTC-3′
인간 Collagen I 5′-CTTGCTTGAAGACCCATGGC-3′ 5′-TTGGCAGTCTGAGAACCCCA-3′
인간
Collagen III		 5′-AAAACGCAAGGCTGTGAGACT-3′ 5′-TTTTGTCGGTCACTTGCACTG-3′
인간 Tie2 5′-GCAATGAAGCATGCCACCCTGG-3′ 5′-GGTAGCGGCCAGCCAGAAGC-3′
인간 CD31 5′-GCGAGTCATGGCCCGAAGGC-3′ 5′-GGTGGTGCTGACATCCGCGA-3′
랫트 α-SMA 5’-TCTGTCTCTAGCACACAACTGTGAATG-3′ 5′-TTGACAGGCCAGGGCTAGAAGGG-3′
랫트 Collagen I 5′-AATGCACTTTTGGTTTTTGGTCACGT-3′ 5′-CAGCCCACTTTGCCCCAACCC-3′
랫트 MMP2 5′-ACCGTCGCCCATCATCAA-3′ 5′-TTGCACTGCCAACTCTTTGTCT-3′
랫트 MMP3 5′-TGGACCCTGAGACCTTACCA-3′ 5′-TGGAAGAGACGGCCAAAATGA-3′
랫트 MMP9 5′-TCGAAGGCGACCTCAAGTAGT-3′ 5′-TTCGGTGTAGCTTTGGATCCA-3′
랫트 TIMP2 5′-CGTGTCCCAGGGCACAATAA-3′ 5′-TGTTCAAAGGACCTGACAAGG-3′
랫트 TIMP3 5′-CGTGTCCCAGGGCACAATAA-3′ 5′-GATGCAGGCGTAGTGTTTGG-3′
랫트 TIMP4 5′-CACGTCTGCCACTCTGCTTT-3′ 5′-ATCCTTGGCCTTCTCGAACC-3′
5′-TAACGAACGAGACTCTGGCAT-3′ 5′-CGGACATCTAAGGGCATCACAG-3′
18S RNA
통계처리
데이터는 평균 ± SD 값으로 표현하였다. 그룹 평균은 스튜던트 테스트 또는 본페로니(Bonferroni) 사후 테스트를 구비한 한 방향 ANOVA(Statview, V5.0, SAS)를 사용하여 비교하였다. P<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
A. 대동맥 교차 협착(TAC; Transverse aortic constriction)에 의한 압력 과부하 동물 모델
심부전 심장조직에서의 CCN5 단백질 발현 감소
심장 이식 수술 시 제공된 심부전 환자의 심장 조직과 정상인의 심장 조직(표 1)에서 얻은 단백질을 웨스턴 블롯 방법으로 비교한 결과 CCN5 단백질 발현 양이 심부전 환자에서 약 24% 감소된 결과를 보였다(도 1의 A). 압력 과부하로 유도된 심부전 마우스 모델에서 CCN5의 발현은 액 90% 정도 감소하였다(도 1의 B). 이 실험 결과, 심부전 상태에서 심장조직의 CCN5의 감소된 발현은 사람과 마우스에서 동일하게 나타나며, 이는 사람과 마우스의 임상적 상관성을 나타낸다. CCN5 단백질 추출물은 15 μg이 전기 영동법에 사용되었고 CCN5와 GAPDH 항체로 확인하였다(**P<0.01).
CCN5 유전자 전달에 의한 심장 섬유증의 가역적 회복
제작한 AAV9-CCN5 및 대조 바이러스 벡터 AAV9-VLP를 마우스의 꼬리 정맥에 AAV-CCN5를 두 개의 농도로 주입하고, 유효 농도 결정을 4주 후 웨스턴 블롯을 수행하여 주입된 AAV-CCN5가 심장 특이적으로 발현하는 것을 확인하여 심장 섬유증과 근섬유아세포의 병리적 활성관계를 연구하였다(n=6, Error brs=S.D., *P<0.05, 도 2). TAC로 유도한 압력 과부하 심장 질환 모델은 TAC 시술 후 8주 경과 시 심장 섬유증이 발생하는 것을 확인하였다. 심장 섬유증이 유발된 실험 쥐에 꼬리 정맥을 통해 AAV-CCN5와 대조군인 AAV-VLP를 5X1010농도의 바이러스 유전체를 각각 주입하였다(n-=16.도 3a). CCN5 유전자 전달 후 8주가 더 경과된 후에 심장 섬유증의 치료 효과를 확인하기 위해 심장 조직을 샘플링하여 조직 섬유증 정도를 Masson-Trichrome 염색법을 통해 정량화하였다. 또한 각 실험군의 심장을 분리하여 랑겐돌프(langendorff) 정속 관류 시스템을 이용하여 섬유아세포들을 분리하여 α-SMA를 발현하는 세포의 정도를 유동 세포 계측법(flow cytometry)로 측정하였다.
그 결과, 간질 조직과 혈관 주위 조직에서 이미 진행된 섬유증의 범위가 CCN5를 주입한 군에서 위장 수술 군(Sham)과 유사한 정도로 감소가 일어나 정상조직으로 회복된 정도의 가역적 치료효과를 보였다(도 3b-3c). 또한, 심장 섬유증 상태에서 증가된 근섬유아세포들의 양이 AAV9-CCN5 주입 군에서 위장 수술군과 유사한 근섬유아세포 양으로 감소가 일어났다(도 3d). 이들 결과들은 CCN5가 섬유증이 진행된 심장 조직에서 섬유증 기질의 분해와 정상 조직구조의 가역적 회복을 나타내는 치료 효능이 있음을 입증한다. 또한, 상기 CCN5의 심장 섬유증에 대한 가역적 치료는 모든 섬유성 질환의 발병과 진행의 병적 실행 세포인 근섬유아세포의 증식이 CCN5에 의해 감소되는 것과 관련이 있음을 확인하였다.
심장 섬유증의 치료와 심장 기능의 보호 효과에 대한 관계를 심초음파 검사를 통해 검사하였다. 심장의 단축 분획률(FS) 감소 방지와 과 종말 수축기(LVIDs) 및 이완기 좌심실 내강지름(LVIDd)의 증가 억제가 대조 바이러스 주입군(AAV-VLP) 비해 CCN5 치료군(AAV-CCN5)에서 현저히 억제되는 효과를 나타내었다. 따라서 CCN5 단백질이 기 생성된 심장 섬유증의 치료를 통해 심부전 상태의 심장 기능의 악화를 방지하는 효과를 발휘하여 수축기성 심부전 치료효과를 보였다.(n=16, Error bars=S.D. *P < 0.05,도 3e)
CCN5 유전자 전달에 의한 근섬유아세포의 선택적 사멸
상기 심장 섬유증의 회복이 근섬유아세포의 세포사멸로 인한 것인지 상관성 분석을 하였다. 압력 과부하 쥐 모델 유도와 동시에 AAV9-CCN5와 AAV9-VLP를 주입하고(도 4a), 2주가 지나서 심장 조직 절편을 TUNEL 염색법(붉은색)과 근섬유아세포의 특이 단백질인 α-SMA 항체(초록색)로 동시에 염색을 하여(도 4b), 근섬유아세포의 세포 사멸 여부를 확인하였다. 그 결과, 위장 수술 군에서는 두 가지 염색법에 반응하는 세포(세포 사멸이 일어난 근섬유아세포)가 거의 없고, 질환 동물 군에서 AAV9-VLP를 주입한 대조군에서 약 9%이고, AAV9-CCN5군은 약 72%로 나타나(n=3), AAV9-CCN5을 주입한 질환 모델 군에서는 현저하게 많은 것을 확인하였다(도 4b-4c). 따라서 심장 섬유증 악화와 근섬유아세포의 증식이 비례하고, 심장 섬유증이 진행된 동물 모델에서 주입된 AAV9-CCN5의 가역적 치료 효과가 근섬유아세포의 세포 사멸에 기인하는바, CCN5 유전자 주입에 의한 섬유증 치료 효과와 세포사멸로 인한 근섬유아세포의 감소가 직접적 연관됨을 확인할 수 있었다.
더불어, CCN5 가 근섬유아세포를 선택적으로 사멸시키는지 여부를 확인하였다(도 4d-4f). 실험에 사용된 심장 근육 세포 및 섬유아세포는 랫트 심장으로부터 획득하였으며, 근섬유아세포는 섬유아세포에 TGF-β를 처리하여 유도하였다. 랫트 심장 근육 세포, 섬유아세포 및 근섬유아세포를 CM-Con 또는 CM-CCN5 배지에서 배양하고 48시간 후에 DAPI로 피크노시스된 핵(pyknotic nuclei) 염색, 세포 사멸을 측정하는 TUNEL 염색 및 항-아넥신-V(annexin-V: 세포사멸 마커) 항체를 이용해 염색하여 유동 세포 계측법(flow cytometry)을 수행하였다(n=3, Error brs=S.D., **P<0.01). 그 결과, CM-CCN5 배지에서 배양한 근섬유아세포의 경우만, 피크노시스가 증가하고, TUNEL 형광을 나타내는 핵의 숫자가 증가하였으며, 아넥신-V-양성 근섬유아세포의 수가 현저하게 증가함을 확인하였다. 이러한 결과들은 CCN5가 심장 섬유증의 병적 실행 세포인 근섬유아세포만을 선택적으로 세포 사멸을 일으키는 동물 실험 결과와 동일한 결과를 나타낸다.
두 결과를 종합하면 CCN5가 심장 섬유증 질환 모델에서 근섬유아세포의 세포사멸을 유도하고, 심장 근육 세포나 섬유아세포에는 영향을 주지 않는 선택적 기전을 보임을 알 수 있다.
CCN5 단백질의 선택적 세포사멸(intrinsic apoptosis pathway)기전 규명
TGF-β 있는 조건에서 섬유아세포로부터 분화된 근섬유아세포에 CM-Con 또는 CM-CCN5를 넣고 1일 또는 2일간 배양한 후, 세포로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 5의 A). 항체는 세포 사멸에 관련된 단백질인 항-Bcl2, 항-BAX, 항-Pro-Caspase3, 항-Cleaved Caspase3, 항-Pro-Caspase7, 항-Cleaved Caspase7, 항-Pro-Caspase8, 항-Cleaved Caspase8, 항-Pro-Caspase9, 항-Cleaved Caspase9 및 항-GAPDH의 항체를 사용하였다. CCN5 단백질이 처리된 군에서 세포 사멸 방지 단백질인 BCL-2의 발현이 상당히 감소되고, 세포 사멸 촉진 단백질인 BAX의 발현과 카스파아제 3, 7, 9(caspase3, 7, 9)는 시간에 따라 증가됨을 확인하였다.
또한, 근섬유아세포를 웨스턴 블롯의 세포 배양 시와 동일한 조건으로 2일간 CM-Con 또는 CM-CCN5를 처리한 후, 항-싸이토크롬 C(cytochrome C)의 항체를 사용하여 면역화학법을 실시하였다(도 5의 B). 도 5B의 화살표는 세포 사멸이 일어나 싸이토크롬 C가 미토콘드리아 내에서 세포질로 나온 것을 의미하는바, 형광 면역화학법을 통해서도 CCN5 단백질의 처리에 의한 근섬유아세포의 세포 사멸을 확인하였다.
더불어, 상기 웨스턴 블롯 및 면역화학법과 동일한 조건으로 섬유아세포 및 유도된 근섬유아세포에서의 NF-κB, 비멘틴, α-SMA 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행한 결과 세포 사멸에 저항성을 갖게 하는 NF-κB의 핵안에서 발현이 근섬유아세포에서 특이적으로 높음을 확인하였고(도 5의 C), 섬유아세포와 근섬유아세포에서 NF-κB 리포터 분석과 NF-κB 항체로 형광 염색한 결과, CCN5 단백질 처리 군에서 NF-κB의 핵 안으로 이동이 완벽하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5의 D-E). 이러한 결과들은 CCN5 단백질의 근섬유아세포 선택적 세포 사멸 유도가 NF-κB의 핵내 이동 억제 기전에 의한 것임을 증명한다(n=3, Error brs =S.D., **P<0.01).
CM-CCN5의 발현 및 활성 확인
CCN5를 세포에서 분비되는 단백질로 과발현시키기 위해 HA-태깅된 Ad-CCN5 플라스미드를 HEK293 세포에 주입하여 24시간 배양을 한 후, 무혈청 세포 배양액에 분비된 단백질을 획득하여 사용하였다(도 6의 A). 배양액과 세포를 분리하여 HA 항체를 이용하여 CCN5의 발현과 분비된 양을 확인하였으며, 세포질 표적 단백질인 GAPDH 항체로 배양액에 분비된 CCN5가 세포질과 오염되지 않았음을 확인하였다.
본 발명에 사용된 재조합 CCN5가 기능적으로 작동하는지 여부를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 신생아 랫트의 심장 근육 세포를 분리하여 12시간 동안 혈장이 제거된 배지에서 배양한 후 100 μM의 페닐에프린을 24시간 동안 처리하였다. 페닐에프린은 심장 세포 비대화를 유도한다. 200 ng/ml 농도의 CM-CCN5를 페틸에프린과 동시 처리하여 동시 처리군에서 심장 세포 비대화가 억제되는지 여부를 α-액틴 항체를 사용하여 형광 면역화학법으로 관찰하였다. 세포 표면적은 메타모르프(MetaMorph) 프로그램을 사용하여 측정하였다(n=50, Error brs=S.D., **P<0.01). 그 결과, 재조합 CCN5은 페닐에프린이 유도하는 심장 근육 세포의 비대를 완벽하게 억제하였고, 따라서 본 발명에 사용된 재조합 CCN5가 기능적으로 작동함을 확인하였다(도 6의 B).
근섬유아세포(MyoFB)로의 분화 확인
랫트의 심근세포(Myo), 섬유아세포(FB) 및 TGF-β가 존재하는 상태에서 분화된 근섬유아세포(MyoFB)들이 각각 잘 분리 및 분화된 것을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였으며, 항-α-액티닌, 항-비멘틴, 항-α-SMA 와 항-GAPDH의 항체를 이용하여 확인하였다. 섬유아세포가 근섬유아세포로 교차 분화된 후에도 섬유아세포의 마커 단백질인 비멘틴이 사라지지 않았다. 따라서 근섬유아세포에서 비멘틴과 α-SMA가 모두 발현하고 있는 것을 확인하여 근섬유아세포들이 분리 및 분화된 것을 확인함으로써 실험의 신뢰도를 높일 수 있었다(도 7).
심장에서 발현시킨 CCN5에 의한 섬유증 신호전달 억제
위장 수술 또는 대동맥 교차 협착 수술(TAC) 후 8주 경과된 마우스 모델에 마리당 5X1010 바이러스 유전자 운반자, AAV9-VLP혹은 AAV9-CCN5를 주입하고 추가 8주 후 희생된 모델 주의 심장에서 웨스턴 블롯을 이용하여 섬유증 신호 전달에 관련된 단백질의 발현을 확인하였다(n=3, 도 8의 A-B). 심장 조직에서 추출한 단백질은 50μg의 농도로 사용하였고, 항-SERCA2a, 항-CCN5, 항-Smad4, 항-p-Smad2, 항-Smad7, 항-CCN2, 항-LOX와 항-GAPDH 항체를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 대조군에서는 TGF-β 신호 전달의 활성화에 관여하는 Smad2가 인산화되었지만, CCN5 주입 군에서는 p-Smad2의 발현이 저해되었다. 또한, TGF-β 신호 전달을 억제하는데 관여하는 Smad7은 CCN5 그룹에서만 발현하였다. 섬유증 진행 억제에 중요한 약물표적인 LOX(Lysyl oxidase) 효소는 섬유증 과정에서 분비된 콜라겐을 가교하여 중합시키는 효소로 조직 외부 환경을 경화시키는데 핵심적인 역할을 하는데, 대조군에서는 증가하였지만, CCN5 주입 군에서는 상당히 감소하는 것을 확인하였다. 더불어, 심장의 수축력을 일으켜 혈액순환의 펌프 기능을 담당하는 SERCA2a 단백질의 증가 결과에 의해 수축기의 심장 기능 개선 효과도 예측할 수 있었다.
동일한 심장 조직을 사용하여 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하여 정량적 RT-PCR 기법으로 섬유증 신호 전달에 관련된 mRNA의 발현 정도를 확인하였다(도 8B). TGF-β1, TGF-β2, CCN2, Galectin 3, 콜라겐 1A, 콜라겐 3A1 및 피브로넥틴에 대한 mRNA를 측정하였다. 정량적 RT-PCR을 이용해 심장 섬유증의 표적 유전자들을 분석한 결과, TGF-β 종류, CCN2 및 갈렉틴3(Galectin3) 등 섬유증 신호 전달을 직접하는 유전자와 이들의 전사 기전을 통해 증가된 섬유증 단백질 유전자들이 대조군에서는 모두 증가한 반면, CCN5 주입 군에서는 감소한 것을 확인하였다(n=3, **P<0.01).
CCN5에 의한 내피세포의 근섬유아세포로 교차분화 억제
최근 연구에 결과 심장 섬유증 과정에서 증식되는 섬유아세포가 내피세포로부터 교차 분화(EndoMT)를 통해 일정 부분 생성되고 근섬유아세포의 생성을 촉진시키는 결과들이 밝혀졌는바, CCN5가 이러한 교차 분화를 억제하는지 여부를 Scl-Cre-ERT; R26RstopYFP 이중 형질전환 마우스 모델을 이용하여 확인하였다.
Scl-Cre-ERT; R26RstopYFP 이중 형질전환 마우스 모델에 타모시펜을 5일 동안 처리하고, 4주 후 마리당 5X1010 바이러스 유전자 운반자, AAV9-VLP 또는 AAV9-CCN5를 주입하고, 동시에 위장 수술 또는 대동맥 교차 협착 수술(TAC)을 수행하였다(도 9a). TAC 수술 8주 후 심장 조직을 샘플링하여 면역화학법을 수행하였다(도 9b-9c). 심장 조직의 단면을 항-YFP(녹색)와 항-비멘틴(적색)의 항체로 염색하여, 타모시펜 유도된 YFP와 섬유아세포의 표적 유전자인 비멘틴을 동시에 발현하는 세포를 측정하였다. YFP와 비멘틴을 동시에 발현하는 세포는 내피 세포가 중배엽 세포로 전환이 일어난 세포라고 할 수 있다. 그 결과, AAV-VLP 주입군에서 약 8.5%의 세포가 YFP와 비멘틴을 동시에 발현하였지만, AAV-CCN5 주입군에서는 약 1%의 세포만이 YFP와 비멘틴을 동시에 발현하고 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 CCN5가 다양한 전구 세포들로부터 섬유증의 원인 세포인 근섬유아세포로의 교차 분화와 증식을 억제하는 능력이 있음을 입증하는 것이다.
또한, 조직과 장기의 손상 부위에 따라 섬유아세포와 원주상피세포(pericyte) 이외에도 내피 세포가 섬유아세포로 교차 분화되어 TGF-β 같은 섬유증 촉진 인자들에 의해 근섬유아세포로 최종 분화하는바, 내피 세포가 TGF-β에 의해 중배엽 세포로 교차 분화시키는 것을 CCN5가 억제하는지 여부를 확인하였다(도 9d). 내피 세포를 교차 분화를 통한 중배엽 세포로 유도하기 위해 인간 관상동맥 내피 세포(HCAEC, Human Coronary Artery Endothelial Cells)에 10 ng/ml의 TGF-β2를 72시간 처리하였다. 상기 세포를 대조 배지(CM-Con) 및 200 ng/ml CCN5(CM-CCN5)를 포함하는 배지에 배양하여 결과를 관찰하였다. 면역화학법을 수행하여 항 VE-카데린과 항-비멘틴 항체로 염색하였고, 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였다. 그 결과, 인간 관상동맥 내피 세포(HCAEC)에 TGF-β를 처리한 경우 근섬유아세포의 표지인자인 α-평활근 액틴(α-SMA)과 비멘틴(vimentin)이 모두 발현이 되었고, CCN5를 동시 처리한 군에서는 발현의 억제가 일어났다.
더불어, 내피 세포가 교차 분화를 거치게 되면 근섬유아세포가 같은 특성이 생겨 상처 부위로 이동할 수 있는 능력을 갖게 되는데 CCN5가 이를 억제하는지 여부를 유동 세포 계측법을 이용하여 확인하였다(도 9e). HCAEC를 배양 접시에 깔고 안정화 시킨 후 200 μL의 피펫팁을 이용하여 스크래치를 만든 뒤, 상기 도 9d의 면역화학법과 같은 조건으로 배양하였다. 48시간 후, 세포를 고정하고 DAPI로 염색하여 세포가 이동한 정도를 측정하였다. 그 결과, TGF-β를 처리한 그룹은 대조군에 비해 세포 이동 능력이 증가하였고, TGF-β와 CCN5를 동시에 처리한 군에서는 세포 이동이 일어나지 않았다. 또한, 내피 세포를 상기 도 9d의 면역화학법과 같은 조건으로 배양하여 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하고 정량적 RT-PCR을 수행하여 α-SMA, 콜라겐 I, 콜라겐 III, Tie2 와 CD31의 mRNA 발현 정도를 측정하여 유전자 발현을 분석하였다(도 9f). 그 결과, CCN5 동시 처리 군에서의 TGF-β에 의해 유도된 근섬유아세포 관련 유전자인 α-SMA, 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 발현 및 내피 세포 고유의 Tie2, CD31 유전자의 발현이, TGF-β를 처리하지 않은 대조군과 유사하게 나타났다(n=6, Error brs=S.D., *P<0.05, **P<0.01). 따라서 CCN5는 내피 세포의 중배엽 세포로 교차 분화되는 기전을 억제하여 섬유증을 억제할 수 있음을 밝혔다
CCN5에 의한 섬유아세포의 근섬유아세포로 분화 억제
CCN5가 섬유아세포의 근섬유아세포로의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 8주령 마우스 모델에 마리당 5X1010 바이러스 유전자 운반자, AAV9-VLP 혹은 AAV9-CCN5를 주입하고, 동시에 위장 수술 또는 대동맥 교차 협착 수술(TAC)을 수행한 후, 8주 뒤에 심장 조직을 사용하여 면역화학법을 수행하였다(도 10a). 심장 조직의 단면을 항-비멘틴(적색)과 항-α-SMA(녹색)의 항체로 염색하였다. 비멘틴과 α-SMA를 동시에 발현하는 세포는 근섬유아세포로 전환이 일어난 세포라고 할 수 있다(도 10b). 비멘틴을 발현하는 세포 중에서 동시에 α-SMA를 발현하고 있는 세포를 분석하고 이를 그래프로 나타내었다(n=3, Error brs=S.D., **P<0.01). 그 결과, AAV9-VLP 주입 군에서 약 17%의 세포에서 α-SMA와 비멘틴을 동시에 발현하고 있었지만, AAV9-CCN5를 주입한 주입 군에서는 약 4%의 세포가 α-SMA와 비멘틴을 동시에 발현하고 있음을 확인하였다. 이는 심장에서 CCN5의 발현 증가가 섬유증 발생의 원인인 섬유아세포가 근섬유아세포로 분화와 증식이 일어나는 병리 기전을 효과적으로 억제하는 결과이다(n=3, Error brs=S.D., **P<0.01,도 10c).
재조합 CCN5 단백질 역시 섬유아세포의 TGF-β에 의한 근섬유아세포의 분화를 억제하는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 섬유아세포를 근섬유아세포로 분화 유도하기 위하여 10ng/ml TGF-β를 48시간 처리하였다. 상기 세포를 대조군 배지 및 200 ng/ml CCN5 배지에 각각 배양하여 결과를 관찰하였다. 항-α-SMA 항체로 염색하였고, 핵은 DAPI로 염색하여 면역화학법을 수행하였다. CCN5 동시 처리군에서 근섬유아세포의 수축력을 제공하는 α-평활근 액틴의 단백질 발현양 증가가 억제되는 것을 확인하였다(도 10d).
TGF-β는 콜라겐 젤의 수축력을 증가시키는바, 콜라겐 젤 수축법을 이용하여 CCN5의 TGF-β에 의한 근섬유아세포의 분화 억제를 확인하였다(도 10d). 섬유아세포와 콜라겐을 이용하여 콜라겐 격자 젤을 만들고, 이를 도 10d 관련 실험에서와 같은 조건으로 배양한 후, 48시간 후 콜라겐 젤의 크기를 측정하한 결과, CCN5처리 군에서 TGF-β가 일으키는 콜라겐 젤의 수축력이 상당히 감소됨을 확인하였다.
정량적 RT-PCR을 수행하여 α-SMA와 콜라겐I의 mRNA 발현 정도를 측정하였다(도 10f). 섬유아세포를 도 10d 관련 실험에서와 같은 조건으로 배양하여 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하고 정량적 RT-PCR을 수행하여 α-SMA와 콜라겐 I의 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, TGF-β 유도 근섬유아세포의 특이적인 전사기전인 α-평활근 액틴과 콜라겐 I 유전자의 발현이, CCN5 동시 처리 군에서 섬유아세포와 유사한 수준으로 억제되는 것이 규명하였다(n=6, Error brs=S.D., *P<0.05, **P<0.01). 따라서 CCN5가 TGF-β에 의한 근섬유아세포로 분화와 생성을 효과적으로 저해하는 것을 입증하였다.
B. 유전적 근퇴행위축증 심부전 모델 (DMD model)
AAV-CCN5의 DMD모델에서 심장 섬유증의 치료효과
근퇴행위축증 모델동물인 고령화된 MDX/UTRN (+/-) 쥐에서 AAV-CCN5의 치료효과를 실험하기 위해 도 11의 A 스케쥴로 실시하였다. 섬유증의 정도를 Masson-Trrichrome염색법을 사용하여 심장근육의 냉동절단법을 통해 확인하였다.(도 11의 B). 심장 섬유증 범위를 측정한 결과, AAV-VLP 주입군(10.14%+/-5.11) 비교하여 AAV-CCN5 주입군(3.39%+/-0.58)에서 섬유증 범위가 평균 2.6배 감소하는 결과를 나타냈다(도 11의 B). AANV-CCN5를 주입한 심장에서 간질성 섬유증의 축적 억제는 구조적 리모델링의 개선 효과와 심장 근육의 조직 배열을 정상화 시키는 치료 효과가 보였다(n=3~4, p<0.001).
AAV-CCN5의 DMD모델에서 심장기능의 개선치료
AAV-VLP과 AAV-CCN5 주사 8주 후에 심초음파 검사를 실시하였다. 심실 단출률을 측정한 결과 정상 (SHAM WT(+/-)군에서 58.70% ± 1.05 (n=3), AAV-VLP 군에서 45.75% ± 1.29(n=7), AAV-CCN5 군에서 53.88%± 1.21(n=6)로 CCN5의 상당한 심실 단축의 치 료효과를 나타내었다.(p<0.005,도 12의 A). 또한 심장의 혈액 동력학 기능을 측정한 결과 평균 수축 종말 압력과 부피 상관계수(end-systolic pressure-volume relationship ,ESPVR) 가 AAV-VLP 주입군에서 3.54 ± 2.49 (n=7) 인 반면 AAV-CCN5 주입군에서 6.10 ± 2.25 (n=6)로 증가 되었으며 이 결과는 과발현된 CCN5 단백질이 심장의 종말 수축기 탄성과 수축력을 개선시키는 치료 효과를 입증하는 것이다(p<0.05, 도 12의 B).
AV-CCN5의 심장 섬유증 관련 유전자 발현의 억제효과
근퇴행위축증 모델 동물에서 정상 쥐와 AAV-VLP와 AAV-CCN5가 주입된 고령화된 MDX/UTRN (+/-) 쥐에서 심근 수축 관련 SERCA2a, 섬유증 관련 유전자들인 Col1A2, FAP(Fibroblast Activating Protein), p-SMAD와 α-SMA 그리고 CCN5 단백질을 웨스턴 블롯을 하였다. AAV-CCN5 주입군에서 심장 수축에 중요한 SERCA2a단백질의 발현이 증가되고 섬유증 지표 단백질들인 Col1A2, FAP(Fibroblast Activating Protein), p-SMAD와 α-SMA들의 발현이 감소되었다(도 13). 유전자 수준의 발현을 qRT-PCR법을 이용하여 확인한 결과, AAV-CCN5 주입군에서 Col1A2,TGF-β1의 발현이 감소되고 항염증성 싸이토카인인 IL-10 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인 하였다(도 14). 따라서 AAV-CCN5 주입군에서 단백질 및 유전자 발현의 실험을 통해 과발현 시킨 CCN5 단백질이 심장 섬유증 치료에 효과가 있음을 규명하였다.
C. AID (Aortic banding- Ischemia-reperfusion-Debanding)심부전 모델
CCN5 유전자 전달에 의한 심장 섬유증 치료효과
본 발명에서 사용한 이완기성 심부전 모델은 랫트에서 AID(Aortic banding- Ischemia-reperfusion-Debanding)수술법을 통해 제작된 모델이다. 이 모델은 심부전 연구에 일반적으로 사용되는 압력 과부화 모델보다 심부전 환자의 상황을 잘 반영하고 있다. 즉, 많은 심부전 환자들은 고혈압 등에 인한 압력 과부하와 협심증이나 심근경색 등으로 인한 허혈을 동시에 경험한 경우가 많은데, 수술적 방법이나 약물 치료로 압력 과부하가 제거되고 관상동맥의 재관류가 달성된 상황이지만 여전히 심장의 상태가 나아지지 않고 심부전으로 진행되는 것이다(도 15의 A). 본 발명자들은 AID 모델의 심장에서 심장 섬유증이 심하게 진행되어있고, 이것으로 인해 심장의 이완기 기능이 크게 저하되어 있는 것을 발견하였다. 반면에 심장의 수축기 기능의 저하는 통계적 유의성을 가질 만큼 충분하게 크지 않았다. 따라서 AID 모델은 심부전 환자의 상황을 보다 잘 재현하고 있고, 심부전 중에서도 특히 이완기 심부전(Heart failure with Preserved Ejection Fraction)의 특징을 잘 가지고 있다. 상기 AID 심부전 랫트 모델을 대조군과 치료군으로 나눈 후, 마리당 1X1011 AAV9-CCN5 바이러스 유전체를 꼬리정맥으로 주입한 다음 2개월 후에 분석하였다. 심장절편을 Masson-Trichrome으로 염색하여 현미경하에서 관찰하였다. 심장 섬유증시 분비되는 콜라겐은 Masson-Trichrome 염색에 의해 청색으로 염색하였다.
그 결과, AID 랫트에서 간질성(Interstitial) 및 혈관 주변(Perivascular) 부위에 현저한 심장 섬유증이 진행되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 AAV-CCN5를 주입한 랫트에는 수술을 실시하지 않은 랫트와 유사한 정도의 심장 섬유증이 치료 된것을 보여주었다(n=5-8. p <0.05,도 15의 B-C).
혈액동력학 분석을 이용한 심장의 수축과 이완 기능 확인
AAV-CCN5를 이용하여 심근 세포에 CCN5를 과발현시키면 AID 모델에서 심장 초음파 분석을 통하여 얻은 심실 단축력(fractional shortening)은 실험군 사이의 유의미한 차이를 보여주지 못하였지만 정상에 가까운 기능을 나타내었다(도 16의 A). 혈액동력학 분석을 통하여 AID 심부전 모델에서의 CCN5 효과를 확인하였다. 이 분석에서 ESPVR의 값은 심장의 수축기 기능(수축력, Contractility)과 비례하고, EDPVR(End-Diastolic Pressure-Volume Relations)의 값은 심장의 이완기 기능(순응도, Compliance)과 반비례한다. 실험 결과는 AID 랫트에서 AAV-CCN5 주입군에서 미미한 ESPVR(End-Systolic Pressure-Volume Relations)의 저하와 현저한 EDPVR의 증가를 보여주었다(n=6, p <0.05, 도 16의 B-C). 이것은 정상 랫트와 비교하여 AID 랫트는 수축력의 저하는 크지 않으나 이완기 기능이 현저하게 저하되어 있다는 것을 의미한다. 이러한 이완기 기능의 저하가 AAV-CCN5를 주입한 랫트에서 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 CCN5 단백질을 과발현한 AID 모델 랫트에서 저하된 이완기 심장기능을 회복시킬 수 있다는 것을 의미한다.
결과분석 및 추가논의
섬유증 질환은 비가역적 질환 진행이 일어나지만 질환 발생 후 진단이 되는 문제가 있으며 현재까지 회복적 치료제 개발이 성공하지 못한 분야이다. 섬유증 질환의 특징은 조직 및 장기의 종류와 상관없이 병원성 실행 세포인 근섬유아세포가 질환의 생성과 진행의 핵심적 역할을 수행한다. 근섬유아세포는 정상적 상처 치유 과정에서 일시적으로 유도되고 소멸되는 세포의 특징을 갖고 있지만, 섬유증 질환 상태에서는 세포 사멸 방지 기전의 획득으로 지속적인 증식 기능과 활성을 보유한다. 이와 같은 근섬유아세포의 지속적 활성은 섬유증이 진행되는 질환들에서 공통적인 질환 경로로 나타난다. 병원성 근섬유아세포는 섬유성 세포외 간질을 과잉생산과 축적을 하는 분비 세포의 기능과 염증성 면역 세포의 유입과 염증성 물질을 자가 분비하는 염증 세포의 기능 그리고 주변 세포와 비정상적 연결과 주변 분비 물질의 분비로 조직 구성 세포들의 기능을 교란하는 신호 전달 세포 기능 등을 한다. 결국 근섬유아세포의 지속적 증식과 활성화는 조직 리모델링을 일으키는 섬유증의 원인뿐만 아니라 염증성 세포의 기능을 통해 반응성 섬유증 과정을 촉진시키는 역할을 한다..
본 발명의 연구를 통해 CCN5 단백질이 심장 섬유증 과정의 중심 세포인 근섬유아세포의 선택적 사멸을 시키는 것을 세포 수준과 질환 상태의 생체 수준에서 최초로 밝혔다. CCN5 단백질이 근섬유아세포의 지속적인 병리적 활성을 제어하고 선택적 사멸을 촉진하여 기 생성된 심장 섬유증을 인체 내 물질로 가역적 치료를 하는 방법을 제공할 수 있다. 특히 이제까지 치료적 목적으로 근섬유아세포의 세포 사멸을 조절하는 약제의 개발은 성공한 사례가 없지만, CCN5 단백질의 근섬유아세포의 선택적 세포 사멸은 정상적인 조직의 상처 치유 과정의 해소기(resolution period)에 일어나는 인체 모방 기전의 특징을 갖는다. 이러한 사실은 전구세포인 섬유아세포나 심근세포에는 영향을 주지 않고 병원성 근섬유아세포만 사멸 시키는 기전은 부작용을 최소화 시킬 수 새로운 생체 모방적 치료 수단임을 의미한다. 따라서 본 발명을 통해 기 생성된 섬유증 치료에 CCN5 단백질 활성으로 섬유증 기질의 용해와 정상적 조직구조의 복귀를 시킴으로써, 심장 섬유증을 포함한 난치병인 섬유증 질환에 새로운 치료법을 제공할 수 있다.
CCN5는 기질세포성(matricellular) 단백질로 세포 밖으로 분비되어 치료활성을 나타내기 때문에 CCN5는 단백질 제제, 유전자 치료제, 유전자가 증폭된 세포치료제등의 약물전달 방법으로 다양한 질환 상태와 광범위한 부위에 대한 치료를 할 수 있는 잠재성을 갖고 있다. 이런 특징들에 근거하여 심장 섬유증이 상당히 진행된 다양한 동물 모델들에서 AAV9-CCN5 유전자 전달을 통해 심장에서 CCN5를 발현시킨 결과 기 생성된 섬유성 조직이 가역적으로 치료되는 것을 확인하였다. CCN5의 가역적 치료 기전은 세포 실험과 동일하게 선택적으로 근섬유아세포의 사멸 유도를 통해 생체 내에서 치료 효과를 재현하였다. 특히 심근 조직의 간질성 섬유증과 혈관주위 섬유증을 치료하는 것을 통해 심장 섬유증에 대한 치료 효능을 입증하였다. 또한 단백질과 유전자 분석을 통한 CCN5의 치료 효과의 결과에서 콜라겐의 교차 결합을 시켜 경직도를 증가시키는 LOX 효소의 감소(Rosin NL, et al. Am J Pathol. 185(3):631-642(2015)), TGF-β 신호 전달의 억제자인 Smad7 단백질의 발형 증가(Wei LH, Huang XR, et al. Cardiovasc Res. 1;99(4):665-73(2013)), 염증성 면역세포 유입과 근섬유아세포의 증식을 촉진하는 Galectin-3의 감소(Ho JE, Liu C, et al. J Am Coll Cardiol. 60(14):1249-1256(2012)), TGF-β1, 2의 발현 감소는 각각이 섬유증 치료의 약물 표적이란 점에서 CCN5의 치료 기전이 강력함을 보여주었다. 따라서 CCN5 단백질은 다양한 심장 섬유증 질환들의 치료에 효과적 치료수단을 제공할 수 있다.
심장 섬유증을 동반하는 심장 기능이상은 이완기성 심부전(HFpEF)의 가장 큰 질병 요인이다. 심실의 경직화는 심장 근육의 이완 기능의 이상, 세포외 간질 조직의 증가로 심장 근육 세포의 위축과 심장 혈관의 수축과 이완의 문제를 초래한다. 이 결과 저산소 상태의 유발과 세포의 에너지 대사의 방해, 그리고 염증 세포의 지속적 유입으로 심장 근육 세포의 괴사를 진행 시키며 이완기성 심부전(HFpEF)이 수축기성 심부전(HFrEF)으로 진행된다. 또한 수축기성 심부전(HFrEF)에서 심근경색과 같이 대량의 심근 세포 사멸이 일어나는 경우에도 손상 부위의 대체적(replacement) 섬유증이 일어나지만 경계 부위와 원거리 조직에서는 간질성 섬유증이 진행된다. 결과적으로 심장 섬유증은 수축기성 심부전 상태를 악화 시키는 위험 요인으로 작용 할 수 있다. 본 발명에서 CCN5 단백질이 압력 과부하(TAC) 모델과 희귀 질환인 근퇴행위축증 심장병 모델(DMD)에서 심장 섬유증의 가역적 치료와 수축기 심부전의 회복 및 보호 효과를 생체 모델을 통해 규명하였다. 또한 이완기성 심부전이 발생하는 랫트 AID 모델 실험을 통하여 CCN5 단백질이 심장 섬유증과 가역적 치료와 이완기성 심장기능 저하를 회복시킬 수 있었다. 이 결과는 CCN5 단백질이 심장 섬유증의 가역적 치료 또는 심장 섬유증을 동반하는 수축기성 심부전(HFrEF)와 이완기성 심부전(HFpEF)의 치료제 개발이 가능함을 본 발명을 통해 입증한 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (8)

  1. CCN5 단백질을 유효성분으로 포함하는 뒤센형 근위축증(Duchenne muscular dystrophy) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 담체(gene carrier)를 유효성분으로 포함하는 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 섬유화된 심장 근육 조직을 정상 조직으로 회복하는 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CCN5 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 CCN5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 유전자 담체는 플라스미드, 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus), 렌티 바이러스(lentivirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 리포좀 및 니오좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전자 담체는 아데노-관련 바이러스인 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 아데노-관련 바이러스는 아데노-관련 바이러스 세로타입(serotype) 1, 6, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 뒤센형 근위축증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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