KR20200075865A - 신경변성 질환에 대한 유전자 요법 - Google Patents

신경변성 질환에 대한 유전자 요법 Download PDF

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아사 아벨리오비치
로라 헤크만
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프리베일 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 일부 측면에서 신경변성 질환 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환)의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 1개 이상의 억제 핵산 (예를 들어, C9orf72, TMEM106B, ATNX2, RPS25 등을 표적화함), 야생형 C9orf72 단백질 또는 그의 부분, 또는 상기 중 임의의 조합을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 발현 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 이러한 발현 구축물을 투여함으로써 ALS/FTD를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

신경변성 질환에 대한 유전자 요법
관련 출원
본 출원은 "신경변성 질환에 대한 유전자 요법"이라는 발명의 명칭으로 2018년 10월 8일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/742,723 및 "신경변성 질환에 대한 유전자 요법"이라는 발명의 명칭으로 2017년 10월 23일에 출원된 62/575,795를 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전두측두엽 치매 (FTD)는 인간에서 C9orf72 유전자 내의 헥사뉴클레오티드 반복 영역의 확장과 연관된 신경변성 질환이다. 일반적으로, C9orf72 반복 영역의 확장과 연관된 병리상태는 C9orf72 단백질의 감소된 발현 및 독성 RNA 뭉침(foci)의 축적으로 인한 기능 획득에 의해 야기된다. 현재, ALS/FTD에 대한 치료 옵션은 제한적이다.
본 개시내용의 측면은 신경변성 질환, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환의 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 C9orf72 유전자의 디펩티드 반복 영역의 확장을 특징으로 하는 ALS/FTD를 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72 및/또는 아탁신 2 (ATXN2) 및/또는 리보솜 단백질 25 (RPS25)의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, ATXN을 표적화하는 억제 핵산은 서열식별번호(SEQ ID NO): 10-25 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, C9orf72를 표적화하는 억제 핵산은 서열식별번호: 37-50 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 코돈-최적화된 C9orf72 단백질 (또는 그의 부분)을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 51에 제시된 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72 및/또는 ATXN2 및/또는 RPS25, 및 야생형 C9orf72 단백질 (예를 들어, 병원성 디펩티드 반복부 확장이 결여된 C9orf72 단백질)의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 3 또는 그의 부분에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 4에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 아탁신 2 (ATXN2)의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 막횡단 단백질 106B (TMEM106B)의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 RPS25의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같음)을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산 및 β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, GBA 단백질은 GBA1 단백질 (예를 들어, GBA1 유전자 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 단백질)이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 ATXN2의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산 및 β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, GBA 단백질은 GBA1 단백질 (예를 들어, GBA1 유전자 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 단백질)이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 TMEM106B의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산 및 β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, GBA 단백질은 GBA1 단백질 (예를 들어, GBA1 유전자 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산, 제2 억제 핵산, 제3 억제 핵산 등)은 C9orf72의 디펩티드-반복 영역을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 디펩티드-반복 영역을 포함하는 C9orf72 mRNA 전사체)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 디펩티드-반복 영역은 1개 이상의 GGGGCC 반복부 또는 1개 이상의 CCCCGG 반복부 (예를 들어, C9orf72의 디펩티드 반복 영역)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디펩티드-반복 영역은 23개 이상 (예를 들어, 23 내지 10,000 사이의 임의의 정수, 예를 들어 24, 25, 30, 50, 100, 1000, 5000 또는 10,000개)의 GGGGCC 반복부 (예를 들어, C9orf72의 센스 가닥 디펩티드 반복 영역), 또는 23개 이상 (예를 들어, 23 내지 10,000 사이의 임의의 정수, 예를 들어 24, 25, 30, 50, 100, 1000, 5000 또는 10,000개)의 CCCCGG 반복부 (예를 들어, C9orf72의 안티센스 가닥 디펩티드 반복 영역)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산은 디펩티드-반복 영역이 아닌 C9orf72의 영역을 코딩하는 핵산 (예를 들어, C9orf72 디펩티드-반복 영역의 외부에 있는 핵산의 부분)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 1개 핵산 (예를 들어, 디펩티드-반복 영역에 인접한) 내지 디펩티드-반복 영역의 약 500개 핵산 내에 있는 단리된 핵산 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 C9orf72 단백질을 코딩하는 유전자의 인트론 영역을 표적화한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산, 제2 억제 핵산, 제3 억제 핵산 등)은, 예를 들어 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 ATXN2를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, ATXN2 mRNA 전사체)에 결합한다. 일부 실시양태에서, ATXN2를 표적화하는 억제 핵산은 ATXN2를 코딩하는 핵산 서열의 비번역 영역 (예를 들어, 5'UTR, 3'UTR 등)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산, 제2 억제 핵산, 제3 억제 핵산 등)은, 예를 들어 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 TMEM106B를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, TMEM106B mRNA 전사체)에 결합한다. 일부 실시양태에서, TMEM106B를 표적화하는 억제 핵산은 TMEM106B를 코딩하는 핵산 서열의 비번역 영역 (예를 들어, 5'UTR, 3'UTR 등)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산, 제2 억제 핵산, 제3 억제 핵산 등)은, 예를 들어 서열식별번호: 60에 제시된 바와 같은 RPS25를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, RPS25 mRNA 전사체)에 결합한다. 일부 실시양태에서, RPS25를 표적화하는 억제 핵산은 RPS25를 코딩하는 핵산 서열의 비번역 영역 (예를 들어, 5'UTR, 3'UTR 등)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산 및/또는 제2 억제 핵산)은 siRNA, shRNA, miRNA 및 dsRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 miRNA 스캐폴드 서열, 예를 들어 miR-155 스캐폴드 서열이 플랭킹된 억제 핵산 서열을 포함하는 인공 miRNA (amiRNA)이다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산 (예를 들어, 제1 억제 핵산 및/또는 제2 억제 핵산)은 발현 구축물의 비번역 영역에 위치한다. 일부 실시양태에서, 비번역 영역은 인트론, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 또는 3' 비번역 영역 (3'UTR)이다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 1개 이상의 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA pol III 프로모터 (예를 들어, U6 또는 H1), RNA pol II 프로모터, 닭-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물에는 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹되어 있다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물에 플랭킹된 ITR 서열 중 하나는 기능적 말단 분해 부위가 결여되어 있다.
본 개시내용은 일부 측면에서 변형된 "D" 영역을 갖는 ITR (예를 들어, 야생형 AAV2 ITR (서열식별번호: 32)에 비해 변형된 D 서열)을 포함하는 rAAV 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 D 영역을 갖는 ITR은 rAAV 벡터의 5' ITR이다. 일부 실시태양에서, 변형된 "D" 영역은, 예를 들어 서열식별번호 29에 제시된 바와 같은 "S" 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역을 갖는 ITR은 rAAV 벡터의 3' ITR이다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역은 "D" 영역이 ITR의 3' 말단에 (예를 들어, 벡터의 트랜스진 삽입물 기준으로 ITR의 외부 또는 말단 단부에) 위치하는 3'ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역은 서열식별번호: 29 또는 30에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)은 TRY 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, TRY 영역은 서열식별번호: 31에 제시된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 1-62 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함한다 (또는 아미노산 서열을 코딩함).
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV) (예를 들어, 1개 이상의 억제 핵산을 코딩하는 단리된 핵산 서열 및/또는 1개 이상의 단백질, 예컨대 야생형 C9orf72 및/또는 GBA1을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 트랜스진, AAV ITR이 플랭킹됨) 또는 바큘로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일 가닥 (예를 들어, 단일 가닥 DNA)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포 등) 또는 원핵 세포 (예를 들어, 박테리아 세포)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 캡시드 단백질 및 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질, AAVrh.10 캡시드 단백질 또는 AAV-PHP.B 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입시킨다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 신경변성 장애 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 조성물 또는 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, CNS에 대한 직접 주사는 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 대한 직접 주사, 예를 들어 수조내 주사, 뇌실내 주사, 요추내 주사 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사, 대수조내 주사 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 대류 증강 전달 (CED)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약 30 내지 약 5000개 (예를 들어, 30 내지 5000 사이의 임의의 정수개)의 GGGGCC 디펩티드 반복부 및/또는 약 30 내지 5000개 (예를 들어, 30 내지 5000 사이의 임의의 정수개)의 CCCCGG 반복부를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 5000개 초과의 GGGGCC 디펩티드 반복부 및/또는 CCCCGG 반복부를 갖는 것을 특징으로 한다.
도 1은 C9orf72의 반복부 확장을 표적화하는 억제 핵산, 막횡단 단백질 106B (TMEM106B)를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 코딩 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다.
도 2는 C9orf72의 반복부 확장을 표적화하는 억제 핵산 및 β-글루코세레브로시다제 (GBA1) 코딩 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다.
도 3은 C9orf72의 반복부 확장을 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 코딩 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다.
도 4는 pol III (H1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다. 3'UTR의 "D" 서열은 "외부" 위치에 위치한다.
도 5는 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다. 3'UTR의 "D" 서열은 "외부" 위치에 위치한다.
도 6은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 7은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 각각의 1개가 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 2개의 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 8은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 9는 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 ATXN2 (예를 들어, ATNX2를 코딩하는 유전자)를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다. rAAV 벡터는 발현 구축물에 플랭킹된 AAV 역전된 말단 반복부를 추가로 포함한다. 3'UTR의 "D" 서열은 "외부" 위치에 위치한다.
도 10은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 11은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 12는 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 13은 RNA pol III (예를 들어, H1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 14는 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 15는 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 2개의 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 16은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 2개의 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 17은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 C9orf72를 표적화하는 2개의 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 18은 ITR의 "외부"에 (예를 들어, 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물 기준으로 ITR의 말단에 근접하게) 위치하는 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터 (상단) 및 벡터의 "내부"에 (예를 들어, 벡터의 트랜스진 삽입물에 근접하게) ITR을 갖는 야생형 rAAV 벡터를 도시하는 개략도이다.
도 19a-19b는 시험관내 C9orf72 발현 및 녹다운 검정에 대한 대표적인 데이터를 보여준다. 도 19a는 rAAV 벡터에 의한 내인성 C9orf72의 통계적으로 유의한 침묵을 나타내는 대표적인 데이터를 보여준다. 도 19b는 rAAV 벡터에 의한 형질감염 후 야생형 C9orf72 발현의 통계적으로 유의한 증가를 나타내는 대표적인 데이터를 보여준다.
도 20은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 RPS25를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
도 21은 pol II (CBA) 프로모터에 작동가능하게 연결된 RPS25를 표적화하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시하는 개략도이다.
본 개시내용의 측면은 신경변성 질환, 예컨대 ALS/FTD, 파킨슨병, 알츠하이머병, 리소솜 축적 질환 및 루이 소체 치매의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 부분적으로 대상체에서 ALS/FTD-연관 유전자 산물 (예를 들어, C9orf72, ATXN2, TMEM106B, 상기 유전자를 표적화하는 억제 핵산 등) 및 그의 조합을 코딩하는 발현 구축물에 기초한다. 유전자 산물은 단백질, 단백질의 단편 (예를 들어, 부분), ALS/FTD-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 ALS/FTD-연관 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 ALS/FTD-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 (예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)이다.
ALS/FTD-연관 유전자는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 또는 ALS 및 FTD (ALS/FTD)와 유전자적으로, 생화학적으로 또는 기능적으로 연관된 유전자 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, C9orf72 유전자 내 23개 초과의 GGGGCC 헥사뉴클레오티드 반복부를 갖는 개체는 반복 영역 확장을 갖지 않는 개체와 비교하여 ALS/FTD가 발생할 증가된 위험을 갖는 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 야생형 또는 비-돌연변이체 형태의 ALS/FTD-연관 유전자 (또는 그의 코딩 서열)를 코딩한다. 일반적으로, "야생형" 또는 "비-돌연변이체" 형태의 유전자는 정상 또는 비-병원성 활성과 연관된 단백질 (예를 들어, 신경변성 질환의 발병 또는 진행을 일으키는 반복 영역 확장과 같은 돌연변이 또는 변화가 결여된 단백질)을 코딩하는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
단리된 핵산 및 벡터
단리된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 1개 이상의 ALS/FTD-연관 유전자, 예를 들어 C9orf72 (예를 들어, C9orf72의 디펩티드-반복 영역), ATXN2, TMEM106B, RPS25 등을 표적화하는 1개 이상의 억제 핵산을 코딩하는 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)을 제공한다. 억제 핵산은 유전자의 센스 가닥 (예를 들어, 유전자로부터 전사된 mRNA), 유전자의 안티센스 가닥 (예를 들어, 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 유전자의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다 (예를 들어, 유전자로부터 전사된 mRNA)를 표적화할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 억제 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 10개 초과의 억제 핵산을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 각각의 1개 이상의 억제 핵산은 상이한 유전자 또는 유전자의 부분을 표적화한다 (예를 들어, 제1 miRNA는 유전자의 제1 표적 서열을 표적화하고, 제2 miRNA는 제1 표적 서열과 상이한 유전자의 제2 표적 서열을 표적화함). 일부 실시양태에서, 각각의 1개 이상의 억제 핵산은 동일한 유전자의 동일한 표적 서열을 표적화한다 (예를 들어, 단리된 핵산은 동일한 miRNA의 다중 카피를 코딩함).
본 개시내용의 측면은 C9orf72 단백질 (예를 들어, C9orf72 mRNA 전사체의 디펩티드-반복 영역)을 표적화하는 1개 이상의 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 디펩티드-반복 영역은 헥사뉴클레오티드 반복 서열 GGGGCC의 5개 이상의 중합체 단위 (예를 들어, GGGGCC 반복 서열의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000개 또는 그 초과의 반복부를 포함하는 영역)에 의해 코딩된다.
일반적으로, C9orf72 단백질은 소형 GTPase, 예컨대 Rab에 대한 교환 인자로서 수반되는 것으로 생각되는 뉴런 및 시냅스전 말단의 세포질에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 인간에서, C9orf72 유전자는 염색체 9 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, C9orf72 유전자는 NCBI 참조 서열 NP_060795.1로 나타내어지는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, C9orf72 유전자는 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 코딩한다.
C9orf72를 표적화하는 억제 핵산은 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역 (예를 들어, 표적 유전자, 예컨대 C9orf72, 또는 표적 유전자의 부분, 예를 들어 C9orf72의 디펩티드 반복 영역, 또는 디펩티드-반복 영역의 외부 영역에 혼성화하는 억제 핵산의 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 약 6 내지 30, 약 8 내지 20 또는 약 10 내지 19개 뉴클레오티드 길이인 C9orf72와의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 C9orf72 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드와 상보적이다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산에 의해 표적화된 (예를 들어, 결합된) C9orf72 서열은 C9orf72의 디펩티드-반복 영역 (이를 기준으로 5' 또는 3'로) 1개 뉴클레오티드 내지 500개 뉴클레오티드 (예를 들어, 1 내지 500 사이의 임의의 정수개의 뉴클레오티드) 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 C9orf72 단백질을 코딩하는 유전자의 인트론 영역 (예를 들어, 비-단백질 코딩 영역)을 표적화한다.
본 개시내용의 측면은 TMEM106B 단백질 (예를 들어, TMEM106B 유전자의 유전자 산물)을 표적화하는 1개 이상의 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. TMEM106B 단백질은 수상돌기 형태발생 및 리소솜 트래픽킹의 조절에 수반되는 단백질인 막횡단 단백질 106B를 지칭한다. 인간에서, TMEM106B 유전자는 염색체 7 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, TMEM106B 유전자는 NCBI 참조 서열 NP_060844.2로 나타내어지는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, TMEM106B 유전자는 서열식별번호: 7에 제시된 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 코딩한다.
TMEM106B를 표적화하는 억제 핵산은 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역 (예를 들어, 표적 유전자, 예컨대 TMEM106B에 혼성화하는 억제 핵산의 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 약 6 내지 30, 약 8 내지 20 또는 약 10 내지 19개 뉴클레오티드 길이인 TMEM106B와의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 TMEM106B 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드와 상보적이다.
본 개시내용의 측면은 ATXN2 단백질 (예를 들어, SCA2 유전자로도 지칭되는 ATXN2 유전자의 유전자 산물)을 표적화하는 1개 이상의 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. ATXN2 단백질은 폴리(A)-결합 단백질과의 상호작용을 통해 mRNA 번역을 조절하는데 수반되는 단백질인 아탁신 2를 지칭한다. 인간에서, ATXN2 유전자는 염색체 12 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, ATXN2 유전자는 NCBI 참조 서열 NP_002964.3으로 나타내어지는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, ATXN2 유전자는 서열식별번호: 9에 제시된 서열을 포함하거나 또는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 코딩한다.
ATXN2를 표적화하는 억제 핵산은 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역 (예를 들어, 표적 유전자, 예컨대 ATXN2에 혼성화하는 억제 핵산의 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 약 6 내지 30, 약 8 내지 20 또는 약 10 내지 19개 뉴클레오티드 길이인 ATXN2와의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 ATXN2 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드와 상보적이다.
본 개시내용의 측면은 리보솜 단백질 s25 (RPS25) (예를 들어, RPS25의 유전자 산물)를 표적화하는 1개 이상의 간섭 핵산 (예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. RPS25 단백질은 단백질 합성에 수반되는 단백질 복합체인 s40 리보솜의 서브유닛인 리보솜 단백질을 지칭한다. 인간에서, RPS25 유전자는 염색체 11 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, RPS25 유전자는 NCBI 참조 서열 NP_001019.1로 나타내어지는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, RPS25 유전자는 서열식별번호: 60에 제시된 서열을 포함한다.
RPS25를 표적화하는 억제 핵산은 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역 (예를 들어, 표적 유전자, 예컨대 RPS25에 혼성화하는 억제 핵산의 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 약 6 내지 30, 약 8 내지 20 또는 약 10 내지 19개 뉴클레오티드 길이인 RPS25와의 상보성 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 RPS25 서열의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오티드와 상보적이다.
본 개시내용의 측면은 1개 이상의 억제 핵산 (예를 들어, C9orf72의 디펩티드 반복 영역을 표적화하는 억제 핵산, C9orf72의 비-디펩티드 반복 영역을 표적화하는 억제 핵산, 및/또는 TMEM106B를 표적화하는 억제 핵산, 및/또는 ATXN2를 표적화하는 억제 핵산, 및/또는 RPS25를 표적화하는 억제 핵산 등)을 코딩하는 제1 유전자 산물 및 단백질, 예컨대 야생형 C9orf72 단백질 또는 GBA 단백질을 코딩하는 제2 유전자 산물을 포함하는 발현 구축물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 TMEM106B의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 ATXN2의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산 및 RPS25의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산 및 β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, GBA 단백질은 GBA1 단백질 (예를 들어, GBA1 유전자 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산 및 야생형 C9orf72 단백질 (예를 들어, 병원성 디펩티드 반복부 확장이 결여된 C9orf72 단백질)을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질을 코딩하는 핵산 서열 또는 그의 부분은 코돈-최적화된 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 3에 제시된 핵산 서열 또는 그의 부분에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 야생형 C9orf72 단백질은 서열식별번호: 4에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 C9orf72를 코딩하는 단리된 핵산은 서열식별번호: 51에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 제1 유전자 산물 (예를 들어, C9orf72 단백질 또는 GBA 단백질을 코딩하는 핵산 서열) 및 제2 유전자 산물 (예를 들어, C9orf72, ATXN2, TMEM106B 등을 표적화하는 억제 RNA)의 발현 순서가 일반적으로 역전될 수 있다는 것 (예를 들어, 억제 RNA가 제1 유전자 산물이고, 단백질 코딩 서열이 제2 유전자 산물임)을 인식한다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 유전자 (예를 들어, C9orf72, TMEM106B, ATXN2, GBA1 등)의 단편 (예를 들어, 부분)이다. 단백질 단편은 단백질 (예를 들어, C9orf72 단백질, GBA 단백질 등)의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 99%를 차지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 C9orf72 단백질 또는 GBA 단백질의 50% 내지 99.9% (예를 들어, 50% 내지 99.9% 사이의 임의의 값)를 차지한다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물 (예를 들어, 억제 RNA)은 표적 유전자의 부분에 혼성화한다 (예를 들어, 표적 유전자, 예를 들어 C9orf72, ATXN2 또는 TMEM106B의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드에 상보적임).
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 모노시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 제1 유전자 산물 및 제2 유전자 산물을 포함하는 단일 융합 단백질을 코딩함). 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 폴리시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 2개의 별개의 유전자 산물, 예를 들어 2개의 상이한 단백질 또는 단백질 단편을 코딩함).
폴리시스트론 발현 벡터는 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 프로모터를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 내인성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 (예를 들어, CNS-특이적 프로모터) 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 (CBA 프로모터), CAG 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2]에 기재된 바와 같음), CD68 프로모터, 또는 JeT 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Tornøe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32, 또는 Karumuthil-Melethil et al. (2016) Human Gene Therapy 27(7):509-521]에 기재된 바와 같음)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA pol II 프로모터 또는 RNA pol III 프로모터 (예를 들어, U6, H1 등)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 제1 유전자 산물, 제2 유전자 산물 또는 제1 유전자 산물 및 제2 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 인자 결합 서열, 인트론 스플라이스 부위, 폴리(A) 부가 부위, 인핸서 서열, 리프레서 결합 부위 또는 상기의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 1개 이상의 추가의 조절 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. IRES 부위의 예는, 예를 들어 문헌 [Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열은 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 자기-절단 펩티드의 예는 T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A 및 BmIFV 2A, 및 문헌 [Liu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193]에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 펩티드는 T2A 펩티드이다.
병리학적으로, ALS 및 FTD와 같은 장애는 C9orf72 유전자로부터 유래된 반복부-연관 비-ATG (RAN) 번역 단백질로 주로 구성된 단백질 응집체의 축적과 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 핵산은 C9orf72 단백질 (예를 들어, 병원성 디펩티드-반복부 확장을 갖는 유전자에 의해 코딩되는 C9orf72 단백질)의 발현을 감소시키거나 방지하는 억제 핵산을 포함한다. 억제 핵산을 코딩하는 서열은 발현 구축물의 비번역 영역 (예를 들어, 인트론, 5'UTR, 3'UTR 등)에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산은 발현 구축물의 인트론, 예를 들어 제1 유전자 산물을 코딩하는 서열의 상류의 인트론에 위치한다. 억제 핵산은 이중 가닥 RNA (dsRNA), siRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 인공 miRNA (amiRNA), 또는 RNA 압타머일 수 있다. 일반적으로, 억제 핵산은 표적 RNA (예를 들어, mRNA)의 약 6 내지 약 30개 (예를 들어, 6 내지 30 사이의 임의의 정수개)의 인접 뉴클레오티드에 결합한다 (예를 들어, 이와 혼성화함). 일부 실시양태에서, 억제 핵산 분자는 miRNA 또는 amiRNA, 예를 들어 C9orf72 (병원성 C9orf72 단백질을 코딩하는 유전자)를 표적화하는 miRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 그것이 혼성화하는 C9orf72 mRNA의 영역과의 어떠한 미스매치도 포함하지 않는다 (예를 들어, miRNA는 "완벽함"). 일부 실시양태에서, miRNA는 그것이 혼성화하는 C9orf72 mRNA의 영역과의 2 내지 20개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 미스매치, 예컨대 "돌출부"를 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA는 그것이 혼성화하는 C9orf72 mRNA의 영역과 20개 초과의 미스매치를 포함한다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산은 shRNA (예를 들어, C9orf72를 표적화하는 shRNA)이다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 miRNA (예를 들어, C9orf72를 표적화하는 miRNA)이다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물의 1개 이상의 억제 RNA의 발현은 1개 이상의 RNA pol III 프로모터, 예를 들어 H1 프로모터 또는 U6 프로모터에 의해 구동된다. 각각의 억제 RNA는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
일부 실시양태에서, 억제 핵산은 인공 마이크로RNA (amiRNA)이다. 마이크로RNA (miRNA)는 전형적으로 식물 및 동물에서 발견되는 소형 비-코딩 RNA를 지칭하고, 유전자 발현의 전사 및 번역후 조절에서 기능한다. MiRNA는 RNA 폴리머라제에 의해 전사되어 프리-miRNA로 지칭되는 헤어핀-루프 구조를 형성하고, 이는 후속적으로 효소 (예를 들어, 드로샤, 파샤, 스플라이세오솜 등)에 의해 프리-miRNA 헤어핀 구조로 프로세싱되고, 이는 이어서 다이서에 의해 프로세싱되어 miRNA/miRNA* 듀플렉스 (여기서 *는 miRNA 듀플렉스의 패신저 가닥을 나타냄)를 형성하고, 이들 중 한 가닥은 이어서 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제 RNA는 C9orf72 (예를 들어, C9orf72의 디펩티드-반복 영역 또는 C9orf72의 비-디펩티드-반복 영역), ATXN2 또는 TMEM106B를 표적화하는 miRNA이다.
일부 실시양태에서, C9orf72를 표적화하는 억제 핵산은 miRNA/miRNA* 듀플렉스를 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA 가닥은 서열식별번호: 24 또는 25, 37 또는 38, 40 또는 41 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA* 가닥은 서열식별번호: 24 또는 25, 37 또는 38, 40 또는 41에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, TMEM106B를 표적화하는 억제 핵산은 miRNA/miRNA* 듀플렉스를 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA 가닥은 서열식별번호: 1 또는 7에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA* 가닥은 서열식별번호: 1 또는 7에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, ATXN2를 표적화하는 억제 핵산은 miRNA/miRNA* 듀플렉스를 포함한다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA 가닥은 서열식별번호: 10-23 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 miRNA* 가닥은 서열식별번호: 10-23 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어진다.
인공 마이크로RNA (amiRNA)는 천연 miRNA를 변형하여 프리-mRNA의 천연 표적화 영역을 관심 표적화 영역으로 대체함으로써 유도된다. 예를 들어, 자연 발생적으로 발현된 miRNA는 스캐폴드 또는 백본 (예를 들어, 프리-miRNA 스캐폴드)으로서 사용될 수 있고, 스템 서열은 관심 유전자를 표적화하는 miRNA의 것으로 대체된다. 인공 전구체 마이크로RNA (프리-amiRNA)는 보통 하나의 단일 안정한 소형 RNA가 우선적으로 생성되도록 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scAAV 벡터 및 scAAV는 amiRNA를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, amiRNA의 프리-miRNA 스캐폴드는 프리-MIR-21, 프리-MIR-22, 프리-MIR-26a, 프리-MIR-30a, 프리-MIR-33, 프리-MIR-122, 프리-MIR-375, 프리-MIR-199, 프리-MIR-99, 프리-MIR-194, 프리-MIR-155 및 프리-MIR-451로 이루어진 군으로부터 선택된 프리-miRNA로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, amiRNA는 C9orf72, ATNX2 또는 TMEM106B를 표적화하는 핵산 서열 및 예를 들어 문헌 [Fowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48]에 기재된 바와 같은 eSIBR amiRNA 스캐폴드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 신경변성 질환 (예를 들어, ALS/FTD)의 치료를 위한 억제 RNA의 조합을 포함하는 발현 구축물에 관한 것이다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 발현 구축물은 C9orf72를 표적화하는 억제 RNA 및 막횡단 단백질 106B (TMEM106B)를 표적화하는 억제 RNA를 포함한다. 단리된 핵산이 억제 핵산의 서열을 코딩하는 순서는 달라질 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산은 5' 말단에서 3' 말단으로, C9orf72 및 TMEM106B 또는 TMEM106B 및 C9orf72를 표적화하는 shRNA를 코딩할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 그 자체로 또는 벡터의 일부로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 플라스미드)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터 (예를 들어, AAV ITR이 플랭킹된 트랜스진을 코딩하는 발현 구축물)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일 가닥 (예를 들어, 단일 가닥 DNA)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터 (예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터)이다.
전형적으로 rAAV 벡터는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹된 트랜스진을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 트랜스진은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 2개의 ITR 서열 각각은 전장 ITR (예를 들어, 대략 145 bp 길이이고, 기능적 Rep 결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 함유함)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 ITR 중 하나는 말단절단된다 (예를 들어, 단축되거나 전장이 아님). 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 기능적 말단 분해 부위 (trs)가 결여되고, 자기-상보적 AAV 벡터 (scAAV 벡터)의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은, 예를 들어 문헌 [McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8]에 기재된 바와 같은 ΔITR이다.
본 개시내용의 측면은 야생형 AAV ITR에 비해, 예를 들어 야생형 AAV2 ITR (예를 들어, 서열식별번호: 32)에 비해 1개 이상의 변형 (예를 들어, 핵산 부가, 결실, 치환 등)을 갖는 ITR을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)에 관한 것이다. 야생형 AAV2 ITR의 구조가 도 18에 제시된다. 일반적으로, 야생형 ITR은, 2개의 교차 아암 (각각 B/B' 및 C/C'로 지칭되는 서열에 의해 형성됨), 보다 긴 스템 영역 (서열 A/A'에 의해 형성됨), 및 "D" 영역으로 지칭되는 단일-가닥 말단 영역으로 이루어진 회문식 이중 가닥 T 형상의 헤어핀 구조를 형성하도록 자기 어닐링하는 125개의 뉴클레오티드 영역을 포함한다 (도 18). 일반적으로, ITR의 "D" 영역은 A/A' 서열에 의해 형성된 스템 영역과 rAAV 벡터의 트랜스진을 함유하는 삽입물 사이에 위치한다 (예를 들어, ITR의 말단 기준으로 ITR의 "내부"에 또는 rAAV 벡터의 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물에 근접하게 위치함). 일부 실시양태에서, "D" 영역은 서열식별번호: 30에 제시된 서열을 포함한다. "D" 영역은, 예를 들어 문헌 [Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)]에 개시된 바와 같이, 캡시드 단백질에 의한 rAAV 벡터의 캡시드화에서 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다.
본 개시내용은 부분적으로 ITR의 "외부"에 (예를 들어, 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물 기준으로 ITR의 말단에 근접하게) 위치하는 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터가 비변형된 (예를 들어, 야생형) ITR로 ITR을 갖는 rAAV 벡터보다 AAV 캡시드 단백질에 의해 효율적으로 캡시드화된다는 놀라운 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열 (예를 들어, "외부" 위치에 있는 "D" 서열)을 갖는 rAAV 벡터는 야생형 ITR 서열을 갖는 rAAV 벡터에 비해 감소된 독성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30)에 비해 적어도 1개의 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30)에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30)에 비해 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 핵산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30)에 대해 약 10% 내지 약 99% (예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 문헌 [Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80]에 기재된 바와 같은 "S" 서열로도 지칭되는 서열식별번호: 29에 제시된 서열을 포함한다.
본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터는, 문헌 [Francois, et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virol]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 "TRY" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TRY 서열은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터의 ITR (예를 들어, 5' ITR)과 발현 구축물 (예를 들어, 트랜스진-코딩 삽입물) 사이에 위치한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터를 포함하는 바큘로바이러스 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바큘로바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43 및 Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896]에 기재된 바와 같은 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포이다.
rAAV
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터)에 관한 것이다. 용어 "rAAV"는 일반적으로 1개 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAV10으로부터 선택된 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 비-인간 숙주로부터의 캡시드 단백질, 예를 들어 레서스 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAVrh.10, AAVrh.39 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 야생형 캡시드 단백질의 변이체인 캡시드 단백질, 예컨대 그것이 유도된 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과 (예를 들어, 15, 20, 25, 50, 100개 등)의 아미노산 치환 (예를 들어, 돌연변이)을 포함하는 캡시드 단백질 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 특히 CSF 공간 내로 또는 직접 뇌 실질 내로 도입될 때 CNS를 통해 용이하게 확산된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 가로지를 수 있는 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 또는 AAVrh.10 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 문헌 [Deverman et al. (2016) Nature Biotechnology 34:204-209]에 기재된 바와 같이, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 AAV9 변이체, 예를 들어 AAV-PHP.B 혈청형을 포함한다. 일반적으로, rAAV의 생산은, 예를 들어 문헌 [Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8 및 Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 rAAV (예를 들어, AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화되어 rAAV 캡시드 입자를 형성하는 재조합 rAAV 게놈을 포함하는 것)는 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템 (BEVS)에서 생산된다. BEVS를 사용하는 rAAV의 생산은, 예를 들어 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43, Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896], 미국 특허 번호 8,945,918, 미국 특허 번호 9,879,282 및 국제 PCT 공개 WO 2017/184879에 기재되어 있다. 그러나, rAAV는 임의의 적합한 방법을 사용하여 (예를 들어, 재조합 rep 및 cap 유전자를 사용하여) 생산될 수 있다.
제약 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 제거하지 않고 비교적 비독성인 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭하며, 예를 들어 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 그것이 함유된 조성물의 성분 중 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 본 발명 내에서 유용한 화합물을 환자 내에 또는 환자에게 운반 또는 수송하여 그의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 본 발명의 실시에 사용되는 제약 조성물에 포함될 수 있는 추가의 성분은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 임의의 경로, 예컨대 경장 (예를 들어, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 경막내, 대수조내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소 (분말, 연고, 크림 및/또는 점적제에 의해서와 같이), 점막, 비강, 협측, 설하에 의해; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 구강 스프레이, 비강 스프레이 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 구체적으로 고려되는 경로는 경구 투여, 정맥내 투여 (예를 들어, 전신 정맥내 주사), 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 이환 부위에 대한 직접 투여이다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 작용제의 성질 (예를 들어, 위장관 환경에서의 그의 안정성) 및/또는 대상체의 상태 (예를 들어, 대상체가 경구 투여를 허용할 수 있는지의 여부)를 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이다.
방법
본 개시내용은 부분적으로 대상체에서 신경변성 질환 (예를 들어, ALS/FTD 등)을 치료하기 위해 함께 작용하는 (예를 들어, 상승작용적으로) 1개 이상의 ALS-FTD-연관 유전자 산물 (또는 그의 조합)의 발현을 위한 조성물에 기초한다. 본원에 사용된 "치료하다" 또는 "치료하는"은 (a) 신경변성 질환 (예를 들어, ALS/FTD, 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매, 리소솜 축적 질환 등)의 발병을 예방하거나 지연시키는 것; (b) 신경변성 질환의 중증도를 감소시키는 것; (c) 신경변성 질환에 특징적인 증상의 발생을 감소시키거나 예방하는 것; 및/또는 (d) 신경변성 질환에 특징적인 증상의 악화를 예방하는 것을 지칭한다. 예를 들어, ALS/FTD의 증상은, 예를 들어 운동 기능장애 (예를 들어, 마비, 떨림, 경직, 동작 둔화, 보행 곤란), 인지 기능장애 (예를 들어, 치매, 우울증, 불안증), 감정 및 행동 기능장애를 포함한다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 신경변성 질환은 ALS/FTD, 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 CNS에 직접적으로, 예를 들어 대상체의 뇌 및/또는 척수 내로의 직접 주사에 의해 투여된다. CNS-직접 투여 양식의 예는 뇌내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사 및 상기의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS 내로의 직접 주사는 대상체의 중뇌, 선조체 및/또는 뇌 피질에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 제1 유전자 산물, 제2 유전자 산물 및 적용가능한 경우 제3 유전자 산물의 발현)을 유발한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물은 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 직접 투여된다. 일부 실시양태에서, CSF 내로의 직접 주사는 대상체의 척수 및/또는 CSF에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 제1 유전자 산물, 제2 유전자 산물 및 적용가능한 경우 제3 유전자 산물의 발현)을 유발한다. 대상체의 CSF에 대한 직접 투여의 예는 수조내 주사, 뇌실내 주사, 요추내 주사 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사는 대류 증강 전달 (CED)을 포함한다. 대류 증강 전달은 뇌를 외과적으로 노출시키고, 뇌의 표적 영역 내로 직접 소-직경 카테터를 배치한 후, 이어서 대상체의 뇌로 직접 치료제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 rAAV)를 주입하는 것을 포함하는 치료 전략이다. CED는, 예를 들어 문헌 [Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 말초로, 예를 들어 말초 주사에 의해 투여된다. 말초 주사의 예는 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 복강내 주사 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 동맥내 주사, 예를 들어 대상체의 경동맥 내로의 주사이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 대상체의 CNS에 직접적으로 및 말초로 둘 다로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체에게 동맥내 주사 (예를 들어, 경동맥 내로의 주사) 및 실질내 주사 (예를 들어, CED에 의한 실질내 주사)에 의해 조성물을 투여한다. 일부 실시양태에서, CNS에 대한 직접 주사 및 말초 주사는 동시이다 (예를 들어, 동시에 일어난다). 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 전에 (예를 들어, 1분 내지 1주 또는 그 초과 전에) 이루어진다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 후에 (예를 들어, 1분 내지 1주 또는 그 초과 후에) 이루어진다.
대상체에게 투여되는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)의 양은 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV는 약 109 게놈 카피 (GC)/kg 내지 약 1014 GC/kg (예를 들어, 약 109 GC/kg, 약 1010 GC/kg, 약 1011 GC/kg, 약 1012 GC/kg, 약 1012 GC/kg, 또는 약 1014 GC/kg)의 역가로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 CSF 공간으로의 주사에 의해 또는 실질내 주사에 의해 높은 역가로 (예를 들어, >1012 게놈 카피 GC/kg (rAAV)) 투여된다.
본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 대상체에게 1회 또는 다수회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20회 또는 그 초과) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게, 예를 들어 주입 펌프를 통해 연속적으로 (예를 들어, 만성적으로) 투여된다.
실시예
실시예 1: rAAV 벡터
삼중-플라스미드 형질감염을 위해 세포, 예컨대 HEK293 세포를 사용하여 AAV 벡터를 생성한다. ITR 서열은 각각의 관심 트랜스진에 대한 프로모터/인핸서 요소, 3' 폴리A 신호, 및 번역 후 신호, 예컨대 WPRE 요소를 포함하는 발현 구축물에 플랭킹된다. 예를 들어, 단일 발현 카세트 또는 개별 발현 카세트를 사용한 발현에 의해 C9orf72 단백질 또는 GBA1 단백질 및 1개 이상의 억제 핵산 (예를 들어, C9orf72 및/또는 TMEM106B를 표적화하는 억제 핵산)과 같은 다중 유전자 산물이 동시에 발현될 수 있다. 발현되는 유전자의 상류에 효율적으로 스플라이싱되는 짧은 인트론 서열의 존재는 발현 수준을 개선시킬 수 있다. 이들 서열 내에 억제 RNA (예를 들어, miRNA, shRNA 등) 및 다른 조절 RNA가 잠재적으로 포함될 수 있다. 본 개시내용에 의해 기재된 발현 구축물의 예는 도 1-17 및 20-21 및 하기 표 1에 제시된다.
표 1.
Figure pct00001
실시예 2: ALS/FTD 세포 내로의 바이러스 형질도입의 세포 기반 검정
예를 들어 ALS/FTD 환자로부터의 섬유모세포, 단핵구 또는 hES 세포, 또는 환자-유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로서 C9orf72의 반복부 확장을 특징으로 하는 세포를 수득한다. 이들 세포는 RNA 뭉침 및 RAN 번역된 단백질을 축적한다.
이러한 세포 모델을 사용하여, 세포 병리학을 RAN 단백질과 같은 단백질 응집체의 축적에 관하여 항-RAN 단백질 항체로 정량화한 후, 이어서 형광 현미경검사를 사용하여 영상화한다. 웨스턴 블롯팅 및/또는 ELISA를 사용하여 RAN 단백질의 비정상적인 축적을 정량화한다.
활성 및 기능을 확인하고 정량화하기 위해, AAV 벡터의 형질도입의 발현과 관련하여 치료 종점 (예를 들어, ALS/FTD-연관 병리상태의 감소)을 측정한다. 예를 들어 정량적 RT-PCT (qRT-PCR)을 사용하여 내인성 (예를 들어, 병원성, 반복부 확장-함유) C9orf72 mRNA 수준의 감소를 정량화할 수 있다.
실시예 3: 시험관내 연구
본 실시예는 본 개시내용에 의해 기재된 C9orf72 rAAV 벡터의 시험관내 시험을 기재한다. 포유동물 세포에서 C9orf72 녹다운 및 과다발현의 효과를 연구하였다. 시험된 구축물의 예가 표 2에 열거되어 있다.
Figure pct00002
정량적 PCR (qPCR) 및 ELISA에 의해 유전자 녹다운 및 과다발현을 검정하였다. 도 19a는 rAAV 벡터에 의한 C9orf72의 통계적으로 유의한 침묵을 나타내는 대표적인 데이터를 보여준다. 도 19b는 rAAV 벡터에 의한 형질감염 후 야생형 C9orf72 발현의 통계적으로 유의한 증가를 나타내는 대표적인 데이터를 보여준다.
서열
일부 실시양태에서, 1개 이상의 유전자 산물 (예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 유전자 산물)을 코딩하는 발현 카세트는 서열식별번호 1-62 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다 (또는 이를 코딩함). 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 서열식별번호: 1-62 중 어느 하나의 부분 (예를 들어, 단편)을 포함하거나 이로 이루어진다 (또는 이에 의해 코딩됨). 일부 실시양태에서, 하기 서열 내의 "T" 뉴클레오티드는, 예를 들어 RNA 분자와 관련하여 "U" 뉴클레오티드로 대체된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 서열의 "부분"이 플라스미드 백본 (예를 들어, 복제 기점 서열, 선택 마커 서열 등)이 결여된 발현 카세트의 서열 (예를 들어, ITR을 코딩하는 서열, 간섭 RNA, 코딩 서열, 조절 서열 등)일 수 있음을 인지할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Prevail Therapeutics, Inc. <120> GENE THERAPIES FOR NEURODEGENERATIVE DISEASE <130> P1094.70005WO00 <140> NOT YET ASSIGNED <141> 2018-10-23 <150> 62/742723 <151> 2018-10-08 <150> 62/575795 <151> 2017-10-23 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480 caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540 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<223> Synthetic Polynucleotide <400> 60 tctcattaga agtgaggcgg ggccggccaa atcgaatgga caccgggtaa ttagcagggt 60 tacccagata ctccagcacc tctttcccgt cggccgtgta cctgccattc acgtccatgc 120 cattgatggc cagcactgca tgacccactg cagaggtgaa gctaacggtc agcgaaggtg 180 cagcccgggg attccgccga ggggacaagg gacccgacac aacccctttt cccccaaccc 240 cgcacctaca accagcccac ttctacagca ctggggccct cccacccccg cacccgccac 300 gggcccgagc ctagcccacc tcggatgccg tcccgctggc cgaaagcaac caacacacgc 360 tcatcgtgta gcttgagcag cagatccagc ggataactga aagttttctc agcctcagcc 420 cgtggcgcgt agctgtccaa ctggtaaatc aagccgccag ctttgttcac cacatacaca 480 ctaaaaatcg ccatcgctgc cttgccgctc ggaaactggt attcagcctc tacccgacgg 540 cccctccccg gaaccgcatc acagcacttg ccgccggccc caccccagcc tcctcctcct 600 cctcctcctc ctcccgcgcc ccccgtgcag ccacctgctg cacttgcgca ctgggagcga 660 cacgctcggg cataagtagt gccgaaaagt tagctgccga gacctggtgg attgcttttc 720 gtttatcagt gcaggaaaac agcgctatag tactgcgtca caactagcgc agactccggc 780 agtatttagg cggtgcggct tgggaactag aatccacttc 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cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 3720 attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 3780 catgctgggg agagatccac gataacaaac agcttttttg gggtgaacat attgactgaa 3840 ttccctgcag gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg 3900 caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3960 gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttcct 3996 <210> 62 <211> 3994 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 62 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa 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cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 3000 ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 3060 ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 3120 tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 3180 acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 3240 ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 3300 caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 3360 ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 3420 tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 3480 ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 3540 cgcatcgata ccgtcgacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 3600 gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 3660 tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 3720 tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 3780 tgctggggag agatccacga taacaaacag cttttttggg gtgaacatat tgactgaatt 3840 ccctgcaggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca 3900 aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga 3960 gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcct 3994

Claims (90)

  1. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV2 ITR (서열식별번호: 32)에 비해 변형된 "D" 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 억제 핵산이 C9orf72의 디펩티드-반복 영역의 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 단리된 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 24에 제시된 핵산 서열 또는 그의 부분을 포함하는 억제 RNA인 단리된 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 25에 제시된 서열 또는 그의 부분을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 영역이 발현 구축물 기준으로 ITR의 외부에 위치하는 "D" 서열인 단리된 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 서열을 포함하는 ITR이 3' ITR인 단리된 핵산.
  7. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 TMEM106B의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV2 ITR (서열식별번호: 32)에 비해 변형된 "D" 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 7에 제시된 서열의 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 단리된 핵산.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 33 또는 34에 제시된 핵산 서열을 포함하는 억제 RNA인 단리된 핵산.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 35 또는 36에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 영역이 발현 구축물 기준으로 ITR의 외부에 위치하는 "D" 서열인 단리된 핵산.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 서열을 포함하는 ITR이 3' ITR인 단리된 핵산.
  13. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 ATXN2의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV2 ITR (서열식별번호: 32)에 비해 변형된 "D" 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 9에 제시된 서열의 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 단리된 핵산.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 억제 핵산이 서열식별번호: 10-23 중 어느 하나에 제시된 핵산 서열을 포함하는 억제 RNA인 단리된 핵산.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 영역이 발현 구축물 기준으로 ITR의 외부에 위치하는 "D" 서열인 단리된 핵산.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 "D" 서열을 포함하는 ITR이 3' ITR인 단리된 핵산.
  18. (i) C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 제1 억제 핵산, 및
    (ii) TMEM106B 또는 ATXN2의 발현 또는 활성을 억제하는 제2 억제 핵산
    을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산.
  19. 제1항에 있어서, 제1 억제 핵산이 C9orf72 mRNA 전사체의 디펩티드-반복 영역에 결합하고, 임의로 여기서 디펩티드-반복 영역이 1개 이상의 GGGGCC 반복부 또는 1개 이상의 CCCCGG 반복부를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 제1 억제 핵산 및 제2 억제 핵산이 각각 독립적으로 siRNA, shRNA, miRNA 및 dsRNA로부터 선택된 것인 단리된 핵산.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 억제 핵산 및/또는 제2 억제 핵산이 발현 구축물의 비번역 영역 내에 위치하고, 임의로 여기서 비번역 영역이 인트론, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 또는 3' 비번역 영역 (3'UTR)인 단리된 핵산.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 C9orf72 단백질 코딩 서열 또는 β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하고, 임의로 여기서 GBA 단백질이 GBA1 단백질인 단리된 핵산.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 프로모터를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 각각의 1개 이상의 프로모터가 독립적으로 RNA pol III 프로모터 (예를 들어, U6, H1 등), 닭-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터인 단리된 핵산.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물에 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹되고, 임의로 여기서 ITR 서열 중 하나에 기능적 말단 분해 부위가 결여된 것인 단리된 핵산.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1-28 또는 33-36 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 그의 부분을 갖는 단리된 핵산.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  28. 제26항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터이고, 임의로 여기서 바이러스 벡터가 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV) 또는 바큘로바이러스 벡터인 벡터.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  30. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제26항의 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  32. 제31항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있고, 임의로 여기서 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질, AAVrh.10 캡시드 단백질 또는 AAV-PHP.B 변이체인 rAAV.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입시키는 rAAV.
  34. 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터, 제29항의 조성물 또는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 신경변성 질환이 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 신경변성 질환이 ALS 및/또는 FTD인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함하고, 임의로 여기서 직접 주사가 뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사, 대수조내 주사 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 직접 주사가 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 대한 직접 주사이고, 임의로 여기서 직접 주사가 수조내 주사, 뇌실내 주사 및/또는 요추내 주사인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 약 30 내지 약 5000개의 GGGGCC 디펩티드 반복부 및/또는 약 30 내지 5000개의 CCCCGG 반복부를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  40. (i) C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산, 및
    (ii) β-글루코세레브로시다제 (GBA) 단백질, 임의로 GBA1 단백질인 GBA 단백질
    을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 억제 핵산이 C9orf72 mRNA 전사체의 디펩티드-반복 영역에 결합하고, 임의로 여기서 디펩티드-반복 영역이 1개 이상의 GGGGCC 반복부 또는 1개 이상의 CCCCGG 반복부를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 억제 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA 또는 dsRNA인 단리된 핵산.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 억제 핵산이 발현 구축물의 비번역 영역에 위치하고, 임의로 여기서 비번역 영역이 인트론, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 또는 3' 비번역 영역 (3'UTR)인 단리된 핵산.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 프로모터를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 각각의 1개 이상의 프로모터가 독립적으로 RNA pol III 프로모터 (예를 들어, U6, H1 등), 닭-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터인 단리된 핵산.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물에 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹되고, 임의로 여기서 ITR 서열 중 하나에 기능적 말단 분해 부위가 결여된 것인 단리된 핵산.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2에 제시된 서열 또는 그의 부분을 갖는 단리된 핵산.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  49. 제47항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터이고, 임의로 여기서 바이러스 벡터가 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV) 또는 바큘로바이러스 벡터인 벡터.
  50. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 벡터 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  51. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제47항의 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  53. 제52항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있고, 임의로 여기서 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질, AAVrh.10 캡시드 단백질 또는 AAV-PHP.B 캡시드 단백질인 rAAV.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입시키는 rAAV.
  55. 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 벡터, 제50항의 조성물 또는 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 신경변성 질환이 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 신경변성 질환이 ALS 및/또는 FTD인 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함하고, 임의로 여기서 직접 주사가 뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 직접 주사가 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 대한 직접 주사이고, 임의로 여기서 직접 주사가 수조내 주사, 뇌실내 주사 및/또는 요추내 주사인 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 약 30 내지 약 5000개의 GGGGCC 디펩티드 반복부 및/또는 약 30 내지 5000개의 CCCCGG 반복부를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  61. (i) C9orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산, 및
    (ii) 야생형 C9orf72 단백질
    을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 단리된 핵산.
  62. 제61항에 있어서, 억제 핵산이 C9orf72 mRNA 전사체의 디펩티드-반복 영역에 결합하고, 임의로 여기서 디펩티드-반복 영역이 1개 이상의 GGGGCC 반복부 또는 1개 이상의 CCCCGG 반복부를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 억제 핵산이 siRNA, shRNA, miRNA 또는 dsRNA인 단리된 핵산.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 억제 핵산이 발현 구축물의 비번역 영역에 위치하고, 임의로 여기서 비번역 영역이 인트론, 5' 비번역 영역 (5'UTR) 또는 3' 비번역 영역 (3'UTR)인 단리된 핵산.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 프로모터를 추가로 포함하고, 임의로 여기서 각각의 1개 이상의 프로모터가 독립적으로 RNA pol III 프로모터 (예를 들어, U6, H1 등), 닭-베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터 또는 JeT 프로모터인 단리된 핵산.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물에 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹되고, 임의로 여기서 ITR 서열 중 하나에 기능적 말단 분해 부위가 결여된 것인 단리된 핵산.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, C9orf72 단백질이 서열식별번호: 3에 제시된 서열 또는 그의 부분에 의해 코딩되는 것인 단리된 핵산.
  68. 제67항에 있어서, 야생형 C9orf72 단백질이 서열식별번호: 4에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 단리된 핵산.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 서열식별번호: 5에 제시된 서열 또는 그의 부분을 갖는 단리된 핵산.
  70. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  72. 제70항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터이고, 임의로 여기서 바이러스 벡터가 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV)인 벡터.
  73. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항의 벡터 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  74. 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  75. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제70항의 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  76. 제75항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있고, 임의로 여기서 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질, AAVrh.10 캡시드 단백질 또는 AAV-PHP.B 캡시드 단백질인 rAAV.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입시키는 rAAV.
  78. 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항의 벡터, 제73항의 조성물 또는 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 신경변성 질환이 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머병, 고셔병, 파킨슨병, 루이 소체 치매 또는 리소솜 축적 질환인 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 신경변성 질환이 ALS 및/또는 FTD인 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함하고, 임의로 여기서 직접 주사가 뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 직접 주사가 대상체의 뇌척수액 (CSF)에 대한 직접 주사이고, 임의로 여기서 직접 주사가 수조내 주사, 뇌실내 주사 및/또는 요추내 주사인 방법.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 약 30 내지 약 5000개의 GGGGCC 디펩티드 반복부 및/또는 약 30 내지 5000개의 CCCCGG 반복부를 갖는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  84. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 C9Orf72의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 억제 핵산은 서열식별번호: 24, 25 및 37-49 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  85. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 ATXN2의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 억제 핵산은 서열식별번호: 10-23 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  86. AAV 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 TMEM106B의 발현 또는 활성을 억제하는 억제 핵산을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 억제 핵산은 서열식별번호: 33-36 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  87. 서열식별번호: 51-58 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터.
  88. C9orf72 단백질을 코딩하는 발현 구축물을 포함하며, 여기서 발현 구축물은 서열식별번호: 50에 제시된 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  89. 제87항에 있어서, 발현 구축물에 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR)가 플랭킹된 것인 단리된 핵산.
  90. 제88항에 있어서, ITR 중 적어도 하나가 야생형 AAV2 ITR (서열식별번호: 32)에 비해 변형된 "D" 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
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