KR20200076713A - 암 줄기세포의 저감에 있어서의 wnt5a 펩티드 - Google Patents

암 줄기세포의 저감에 있어서의 wnt5a 펩티드 Download PDF

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Abstract

WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드로서, 상기 펩티드는 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위함이다.

Description

암 줄기세포의 저감에 있어서의 WNT5A 펩티드
본 발명은 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 WNT5A-유래된 펩티드에 관한 것이다.
원발성 종양은 암 환자의 사망 원인으로 드물다. 대부분의 경우에, 사망은 원발성 종양의 외과적 제거에 뒤이은 상이한 무반복(recurrence-free) 생존 기간 이후 암 재발의 결과이다. 유방암, 결장암 또는 전립선암 환자의 현재 치료는 수술, 화학요법 약물, 내분비 치료 및 일부 신규한 생물학적 치료를 포함한다. 후자의 치료 방식은 주로 증식성 암 세포를 표적한 것이며, 결국 암의 성장을 표적한 것이다. 이러한 치료는 원발성 종양 자체 및 수술 후 남아있는 대부분의 종양 세포에 대하여 우수한 효과를 가지지만, 많은 비율의 환자들은 그 이후에 반복성(recurrent) 질환을 발현시킨다.
이러한 암 재발에 대한 근본적인 원인은 '줄기-유사의(stem-like)' 특성을 갖는 종양 세포의 하위 집합의 존재 때문이다. 비-악성 줄기세포와 구별되는 이러한 종양-개시 세포는 낮은 증식 속도, 높은 자기-재생 능력, 다능성(multipotency 또는 pluripotency), 활발하게 증식하는 종양 세포로 분화하는 능력을 나타내며, 또한 화학요법 또는 방사선에 대한 내성을 특징으로 한다. 이러한 줄기-유사의 세포는 또한 암 줄기세포(Cancer Stem Cell, CSC)라고도 한다. CSC의 제거는 어쩌면 암 질환을 근절할 수 있다고 여겨지고, 결국 이러한 질환의 재발을 근절할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 암 연구에서 근본적인 문제는 반복성 질환의 원인이 되는 CSC의 식별 및 표적이다. 종양 마커는 하나 이상의 암 유형의 존재에 의해 상승될 수 있는 혈액, 소변, 또는 신체 조직에서 발견되는 바이오마커이다. 각 특정한 암을 나타내는 많은 상이한 종양 마커가 있으며, 종양 마커는 암의 존재 진단을 위해 사용되고, 암의 특정한 유형을 구체화하기 위해 사용된다. 따라서, 종양 마커의 상승된 수준은 암을 나타낼 수 있다.
치료제, 즉 자기-재생 및 CSC로의 분화와 관련된 배아의 신호 전달 경로에 영향을 미치는 소형 분자, siRNA 또는 항체의 전달과 같은, CSC를 죽이는 문제를 극복하기 위해 많은 상이한 시도가 이루어졌다. 그러나, 현재 CSC를 제거하려는 시도에는 많은 단점이 있다. 첫째, 마커가 암의 유형마다 상이하며, 모든 암에 사용할 수 있는 보편적인 마커가 없다. 둘째, 급성 골수성 백혈병 및 일부 고형 종양으로부터 알려진 특정 종양 내에 생물학적으로 구별되는 CSC가 존재할 수 있다. 마지막으로, CSC는 정상 줄기세포와 동일한 발현 프로파일을 갖기 때문에, 약물을 CSC로 표적할 때 정상 줄기세포에 영향을 미칠 위험이 있다.
따라서, 이러한 배경에서 본 발명의 목적은 CSC의 생존으로 인한 암 질환의 재발을 예방하거나 현저하게 지연시키기 위한 비독성의 안전한 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 양태에서, 암의 재발을 예방하거나 지연시키는 목적은 SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체에 의해 달성되며, 상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, 상기 펩티드는 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 맥락에서 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)은 동일한 의미를 가진다. CSC의 제거는 어쩌면 상기 언급한 암 질환을 근절할 수 있다고 여겨지고, 결국 이러한 암 질환의 재발을 근절할 수 있다고 여겨지므로, 현재 CSC에 의해 반복성 질환이 야기될 수 있는 것으로 여겨지고, 결국 암 줄기세포의 저감 또는 근절은 암의 반복을 지연시키거나 예방할 것으로 생각된다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 펩티드는 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 CSC의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 것이며, 상기 암은 전립선암, 유방암, 결장암, 난소암, 갑상선암, 간암 또는 혈액암으로 구성된 목록으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 환자의 암 세포에서의 단백질 WNT5A의 발현은 주변 비-암 세포에서의 발현의 35% 이하이다. 검출 및 정량을 위해 2차 항체와 조합되고 WNT5에 대해 지시된 특정 1차 항체를 사용한 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)에 의해, WNT5의 발현 수준이 암 세포 및 비-암 세포 모두에서 측정된다.
유방암, 결장암 및 전립선암 종양에서 WNT5A의 낮은 발현은 증가된 질환 반복 횟수 및 단축된 환자의 생존 시간과 상관 관계가 있다. 그러나, WNT5A 신호 전달의 이러한 효과는 암 세포 증식에 대한 효과에 원인이 있다고 할 수 없으며, 상승된 β-카테닌 신호 전달을 가진 종양에서는 종종 없거나 제한적이다 [(Dejmek et al., The Expression and Signaling Activity of Wnt-5a/DDR1 and Syk Play Distinct but Decisive Roles in Breast Cancer Patient Survival. Clinical Cancer Research. 11:520-528, 2005, S
Figure pct00001
fholm et al., The Wnt-5a-derived hexapeptide Foxy-5 inhibits breast cancer metastasis in vivo by targeting cell motility.
Clinical Cancer Research 14(20):6556-6563, 2008, Mehdawi et al., Non-canonical WNT5A signaling up-regulates the expression of the tumour suppressor 15-PGDH and induces differentiation of colon cancer cells, Molecular Oncology 10:1415-1429, 2016, Canesi et al., Treatment with the Wnt5a-mimicking peptide Foxy5 effectively reduces the metastatic spread of Wnt5a-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS ONE doi.org/10.1371/journal.pone.084418, 2017)].
WNT5A 단백질 및 Foxy-5라고 불리는 WNT5A 헥사펩티드는 in vitro 실험에서 PGE2 생성 효소 COX-2의 발현을 감소시키며, 결장암 세포에서 PGE2 및 15-PGDH 분해 효소 리폭신(lipoxin)을 상향 조절하는 것으로 나타났다 [(Mehdawi et al., 2016)]. 이러한 실험 in vitro 연구에서, 논문 저자는 또한 재조합 WNT5A 및 Foxy-5 펩티드 모두가 β-카테닌 신호 전달의 저감을 유도한다는 것을 보여주었다. 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 이러한 in vitro 조건 동안 CSC 수의 저감을 전혀 검출할 수 없었다.
당업자는 암 또는 종양을 진단하는 방법, 종양 성장을 측정하는 방법, 종양 조직을 정상 조직으로부터 구분하거나 구별하는 방법 및 WNT5A의 양을 측정하는 방법을 알고 있다. 암은 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 영상으로 진단될 수 있다. WNT5A 단백질의 낮은 발현은 주변 비-암 세포에서의 WNT5A 발현의 35%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1%일 수 있거나, 또는 WNT5A의 발현이 없을 수 있다.
약물은 대규모로 생산되어야하기 때문에, 전장 WNT5A 단백질은 약물 후보 물질로서 몇 가지 단점이 있다. 큰 단백질인 WNT5A 단백질이기 위해서는 정확한 1차 아미노산 서열을 생성하기 위한 복잡하고 긴 합성 및 번역 후 변형이 필요하며, 또한 WNT5A는 체내 분포를 제한할 수 있는 헤파란 설페이트 결합 도메인(heparan sulphate-binding domain)을 갖는다. 따라서, WNT5A의 효과를 모방하는 더 작은 펩티드가 더욱 바람직하다. 아미노산 서열 XDGXEL을 포함하는 WNT5A 펩티드는 또한 WNT5A 모방 효과를 포함한다. 길이가 변하고 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 펩티드는 합성적으로, 예컨대 액상 또는 고체상 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다. 길이가 변하는 펩티드는 20개 이하의 아미노산, 및 보다 바람직하게는 10개 이하의 아미노산을 갖는다. 가장 바람직하게는, 펩티드는 6개의 아미노산으로 이루어진 헥사펩티드이다. 한 구현예에서 아미노산 서열은 XDGXEL이며, 여기서 1번 위치의 X는 M 또는 노르류신(norleucine)이며, 4번 위치의 X는 C 또는 A이다. 유리하게, 본 발명에 따른 WNT5A 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드이다:
MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),
GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),
EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),
SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),
TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),
KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),
NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),
CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),
LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),
RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),
GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),
QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),
TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16), 및
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),
또는 이의 포르밀화된 유도체.
바람직한 구현예에서, WNT5A 펩티드는 MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3)이다. 보다 바람직한 구현예에서, 1번 위치의 메티오닌(methionine) 은 포르밀화된 메티오닌 (N- 포르밀 메티오닌)으로 유도된다. 상기 포밀화된 헥사펩티드는 Foxy-5로 표시된다. 하나의 아미노산의 변형/유도화 (포르밀화)는 펩티드의 효과를 향상시키며, in vivo 분해에 대해 더욱 효과적이고 내성을 갖도록 만든다.
또 다른 구현예에서, CSC의 성장 또는 니치(niche)는 활성 β-카테닌, 증가된 COX-2 및 저감된 15-PGDH 발현에 의해 유리하게 되는 것으로 생각된다. 검출 및 정량을 위해 2차 항체와 매칭되어 결합하며, 활성 β-카테닌, COX-2 또는 15-PGDH에 대해 지시되는 1 차 및 특이적 항체를 사용한 IHC에 의하여, 활성 β-카테닌 신호 전달뿐만 아니라 증가된 COX-2 및 저감된 15-PGDH 발현이 가장 쉽게 측정된다.
추가의 구현예에서, 표적화된 암 세포는 정상 주변 조직과 비교하여 35%, 40%, 50%, 65%, 70%, 90% 또는 100% 이상의 증가된 β-카테닌 신호 전달 수준 또는 증가된 COX-2 발현, 및/또는 정상 주변 조직과 비교하여 35%, 40%, 50%, 65%, 70%, 90% 또는 최대 100%까지 저감된 15-PGDH 발현을 가진다. 정상 주변 조직은 암 세포와 동일한 유형의 정상 세포로 구성된, 아주 가까이에 있는 주변 조직으로 이해되어야 한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 펩티드는 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 CSC의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 것으로 생각되며, 예방, 저감 또는 제거는 다음의 단계를 포함한다: 암의 진단 직후 및/또는 수술 중 및/또는 수술에 의한 종양 제거 후, 유효량의 펩티드를 투여하며, 임의로 상기 단계는 2주 이상 동안 적어도 주 3회로 반복된다. 상기 펩티드를 이용한 암 줄기세포의 치료 기간은 4, 6, 8, 12주 또는 최대 1, 2 또는 3개월 이상일 수 있다. Foxy-5는 화학요법의 세포독성 효과를 손상시키지 않으므로, 치료 기간 동안 상기 펩티드는 종양 억제 화학요법 약물이 또한 투여될 수 있다. 종양 억제 화학요법 약물은 일반적으로 매우 강한 독성이 있으며, 종양 세포뿐만 아니라 건강한 세포를 또한 파괴한다. 종양 억제 화학요법 약물의 독성으로 인해, 부작용이 모든 긍정적인 효과를 능가하므로, 모든 암 세포나 CSC를 파괴 또는 제거하기에 충분히 길거나 충분히 높은 투여량을 투여할 수 없다.
종양 억제 약물로 치료한 후 상기 펩티드 투여의 이점은 펩티드 건강한 세포에게 무독성인 반면, 종양 억제 화학요법으로 치료한 후 남은 내성이 있는 CSC 수를 제거하거나 저감시킨다는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 종양 억제 화학요법 약물 및 펩티드의 투여는 동시에 투여될 수 있거나, 펩티드는 화학요법이 시작될 때까지 또는 종양 억제 화학요법 치료의 끝에 이어서 원발성 종양의 외과적 제거 이전, 도중 및 이후에 투여될 수 있다고 생각된다.
따라서, 이러한 조합의 치료는 부작용을 증가시킴 없이 개선된 암 치료를 야기할 수 있다.
조합하여 투여하는 것은 진행중인 치료 기간이 단축될 수 있으므로, 환자의 순응도에 대해 유리할 수 있다.
금전적 관점에서 펩티드는 비싸기 때문에, 순차적인 투여 즉, 종양 억제 화학요법 약물 이전 또는 이후에 펩티드를 투여하는 것이 보다 효율적일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체를 제공하며, 상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이며, 암을 진단받은 환자의 CSC의 저감 또는 제거에 사용하기 위함이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 다음의 번호가 매겨진 목적을 제공한다:
1. SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체로서,
상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며,
여기서 X는 임의의 아미노산이고,
상기 펩티드는 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체.
2. 제1목적에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 결장암, 난소암, 갑상선암, 간암 또는 혈액암으로 구성되는 목록으로부터 선택되는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
3. 제1목적 또는 제2목적 중 어느 한 목적에 있어서, 암 세포에서의 단백질 WNT5A의 발현은 주변 비-암 세포에서의 발현의 35% 이하인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
4. 제1목적 내지 제3목적 중 어느 한 목적에 있어서, 1번 위치의 X는 M 또는 노르류신이며, 4번 위치의 X는 C 또는 A인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
5. 제1목적 내지 제4목적 중 어느 한 목적에 있어서, 상기 펩티드는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드:
MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),
GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),
EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),
SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),
TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),
KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),
NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),
CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),
LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),
RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),
GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),
QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),
TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16), 및
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),
또는 이의 포르밀화된 유도체.
6. 제1목적 내지 제7목적 중 어느 한 목적에 있어서, 상기 펩티드는 MDGCEL (SEQ ID NO: 3)인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체.
9. 제1목적 내지 제8목적 중 어느 한 목적에 있어서, 암 세포는 상승된 β-카테닌을 나타내는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
10. 제1목적 내지 제9목적 중 어느 한 목적에 있어서, β-카테닌 신호 전달은 주변-비 암 세포에서의 β-카테닌 신호 전달의 35% 이상이 상승된 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
11. 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한, 하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물과 조합된, SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체의 조합물로서,
상기 펩티드는 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며,
여기서 X는 임의의 아미노산이고,
상기 펩티드 및 상기 종양 억제 화학요법 약물은 조합되거나 분리되고 및/또는 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 조합물.
12. 제11목적에 있어서, 상기 종양 억제 약물은 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린(leucovorin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin) (FOLFOX), 에피루비신(epirubicin)이나 독소루비신(doxorubicin)과 같은 안트라사이클린(anthracycline), 또는 도세탁셀(docetaxel)이나 파클리탁셀(paclitaxel)과 같은 탁산(taxane)의 조합인 것인 조합물.
13. 제11목적에 있어서, 상기 종양 억제 약물은 결장암을 진단받은 환자의 치료에 사용하기 위한 5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴 (FOLFOX)의 조합인 것인 조합물.
14. 제11목적에 있어서, 상기 종양 억제 약물 치료은 유방암을 진단받은 환자의 치료에 사용하기 위한 에피루비신이나 독소루비신과 같은 안트라사이클린, 도세탁셀이나 파클리탁셀과 같은 탁산의 조합인 것인 조합물.
다음의 설명된 도면은 상세히 설명된 명세서를 뒷받침하는 것이다. 본 발명은 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1은 실시예 1 내지 3에서 설명된 동물 실험의 개략적 개요이다.
도 2는 면역조직화학 (IHC)에 의해 가시화된 결장암 조직에서 ALDH 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 사진이 제공된다. 각각의 이러한 슬라이드로부터, 4개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 ALDH 염색을 점수 매겼다. 염색된 세포 퍼센트에 대해 다음의 점수가 사용되었다; 양성 염색된 세포 <5%에 대해 0, 5-25%의 양성 세포에 대해 1, 26-50%의 양성 세포에 대해 2, 51-75%의 양성 세포에 대해 3, >75%의 양성 세포에 대해 4.
염색 강도에 대해, 염색된 영역을 다음과 같이 점수 매겼다; 약한 염색에 대해 1, 중간 염색에 대해 2, 및 강한 염색에 대해 3. 각각의 박스에 대해 최종 점수는 양성으로 염색된 세포의 퍼센트에 대한 점수와 염색 강도에 대한 점수를 곱함으로써 얻었다. 최종적으로, 각각의 종양에 대한 4개의 박스로부터 평균값을 얻었다. 그 다음 본 연구에서 제시된 모든 IHC 분석에 대해 동일한 스코어링(scoring) 프로토콜이 사용되었다.
도 3은 IHC에 의해 가시화된 결장암 조직에서 (DCAMKL1라고도 명명된) Dck1 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 사진이 제공된다. 도 2에서 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 4개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 Dck1 (DCAMKL1) 염색을 점수 매겼다.
도 4는 비히클이 처리된 대조군 마우스로부터의 종양과 비교하여, 결장암 제노그래프(xenograph) 조직에서 ALDH 및 Dck1 (DCAMKL1) mRNA 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다
도 5는 IHC에 의해 가시화된 결장암 조직에서 Cox-2 및 15-PGDH 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 도 1에서 IHC 염색에 대해 상세히 설명된 바와 같이, 정확하게 IHC 염색을 점수 매겼다.
도 6은 IHC에 의해 가시화된 HT-29 결장암 조직에서 활성 β-카테닌 핵 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 도 1에서 IHC 염색에 대해 상세히 설명된 바와 같이, 정확하게 IHC 염색을 점수 매겼다. 오른쪽 하단의 패널에서, 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물 모두에 대한 종양의 크기가 제시된다.
도 7은 IHC에 의해 가시화된 Caco-2 결장암 조직에서 활성 β-카테닌 핵 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 도 2에서 IHC 염색에 대해 상세히 설명된 바와 같이, 정확하게 IHC 염색을 점수 매겼다. 오른쪽 하단 패널에서, 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물 모두에 대한 종양의 크기가 제시된다.
도 6 및 7은 각각 HT-29 및 Caco-2 결장암 제노그래프 조직에서 종양 부피에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 추가적으로 보여준다. 결장암이 상승된 β-카테닌 신호 전달을 가진다는 사실은 종양 부피의 변화와의 관계를 결정함으로써 각각 도 6 및 7에서 요약된 효과를 검증할 수 있게 한다. 도면은 대조군 (비히클이 처리된) 마우스로부터의 종양 부피와 비교하여, 종양에서 유래된 HT29 및 Caco-2의 종양 부피에 대한 Foxy-5 치료의 효과를 요약한다.
도 2B는 도 2에서와 같이 반복되고 확장된 분석에 기초하며, 면역조직화학 (IHC)에 의해 가시화된 결장암 제노그래프 조직에서 ALDH 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 비히클 (식염수) 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 무작위로 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 ALDH 염색을 점수 매겼다. 염색된 세포 퍼센트에 대해 다음의 점수가 사용되었다; 양성 염색된 세포 <5%에 대해 0, 5-25%의 양성 세포에 대해 1, 26-50%의 양성 세포에 대해 2, 51-75%의 양성 세포에 대해 3, >75%의 양성 세포에 대해 4.
염색 강도에 대해, 염색된 영역을 다음과 같이 점수 매겼다; 약한 염색에 대해 1, 중간 염색에 대해 2, 및 강한 염색에 대해 3. 각각의 박스에 대해 최종 점수는 양성으로 염색된 세포의 퍼센트에 대한 점수와 염색 강도에 대한 점수를 곱함으로써 얻었다. 최종적으로, 각각의 종양 샘플에 대한 6개의 박스로부터 평균값을 얻었다. 그 다음 본 연구에서 제시된 모든 IHC 분석에 대해 동일한 스코어링(scoring) 프로토콜이 사용되었다.
도 3B는 도 3에서와 같이 반복되고 확장된 분석에 기초하며, IHC에 의해 가시화된 결장암 제노그래프 조직에서 (DCAMKL1라고도 명명된) Dck1 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 도 2에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대한 염색 강도에 대해 Dck1 염색을 점수 매겼다.
도 5B는 도 5에서와 같이 반복되고 확장된 분석에 기초하며, IHC에 의해 가시화된 결장암 제노그래프 조직에서 Cox-2 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 도 2에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 Cox-2 염색을 점수 매겼다.
도 5C는 도 5에서와 같이 반복되고 확장된 분석에 기초하며, IHC에 의해 가시화된 결장암 제노그래프 조직에서15-PGDH 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 도 2에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 15-PGDH 염색을 점수 매겼다.
도 8은 각각 도 6 및 7에서와 같이 반복되고 확장된 분석에 기초하며, IHC에 의해 가시화된 HT-29 및 Caco-2 결장암 제노그래프 조직에서 활성 β-카테닌 핵 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과에 대해 보여준다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 도 2에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 활성 β-카테닌 핵 염색을 점수 매겼다.
도 9는 IHC에 의해 가시화된 HT-29 및 Caco-2 결장암 제노그래프 조직에서 Ascl2 단백질 발현에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과를 보여준다. Ascl2 단백질은 CSC 니치를 촉진하는 것으로 보이는 β-카테닌 신호 전달에 의해 활성화된 전사 인자이다. 식염수 및 Foxy-5으로 처리된 동물의 대표 이미지가 제공된다. 도 2에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 이러한 슬라이드로부터, 6개 박스를 염색된 조직 위에 놓았고 이들 각각에 대해 염색 강도를 곱한 염색된 세포의 퍼센트로서 Ascl2 염색을 점수 매겼다.
도 10은 FOLFOX-유도된 세포독성에 대한 Foxy-5 효과의 부재를 보여준다. 결장암 HT29 세포는 각각 FOLFOX 단독 (녹색 삼각형), 5-FU 단독 (주황색 삼각형), 옥살리플라틴 단독 (검은색 사각형), Foxy-5 단독 (빨간색 사각형), 또는 FOLFOX + Foxy-5 (파란색 원형)으로 처리되었다. 이러한 상이한 치료의 세포독성 효과는 CellTiter-Blue™ 형광 세포 생존력 분석에 의해 평가되었다. HT29에서 이러한 상이한 치료의 용량-반응 곡선은 도면에 요약되어 있다. 데이터는 정규화되며 평균 ± SEM으로서 보여진다.
Wnt (Wingless-related integration site) 단백질 패밀리는 신체 축 패턴화, 세포 증식 및 이동과 같은 배아 발달에서 역할을 하는 고도로 보존된 단백질을 포함한다. Wnt 신호 전달 경로는 각각 표준(canonical) 또는 비-표준이며, 세포에서 표준 신호를 통한 유전자 전사 및 증가된 증식의 조절, 또는 상이한 비-표준 신호 전달 경로의 활성화를 통한 몇몇의 비-증식성 기능의 조절을 주로 유발한다. 성인의 골수, 피부 및 내장의 조직 재생에서 Wnt 단백질이 추가로 관여된다. Wnt 신호 전달 경로에서 유전적 돌연변이는 유방암, 전립선암, 교모세포종, 제2형 당뇨병 및 기타 질환을 유발할 수 있다.
표준 Wnt 경로는 β-카테닌을 활성화하며, 정상 줄기세포의 자기-재생 조절에 필수적이고, 표준 Wnt 신호 전달의 파괴는 종양 형성과 관련되어 있다. 대조적으로, 비-표준 Wnt 신호 전달은 β-카테닌 신호 전달의 증가 없음을 특징으로 하며, 배아의 패턴화, 낭배 형성, 및 기관 형성에서의 역할에 대해 연구되어 왔다. 또한, 비-표준 Wnt는 표준 신호 전달에 길항하기 위하여 제안된다. WNT5A는 비-표준 Wnt 리간드의 예이다. WNT5A는 급성 골수성 백혈병 (AML), 결장암, 유방암, 전립선암, 및 난소 암종에서 종양-억제성이다. 연구 문헌 [Borcherding et al., Paracrine WNT5A signalling inhibits expansion of tumour-initiating cells, Cancer Research 75:1972-1982, 2015]에 의해, WNT5A 동형접합 마우스 모델에서 WNT5A의 과발현은 유방 CSC의 저감된 수와 상관 관계가 있는 것으로 나타났으며, WNT5A의 이형접합 손실은 유방암 환자의 짧은 생존과 상관 관계가 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 원발성 악성 흑색종에서 WNT5A의 높은 발현이 단축된 생존 시간과 관련이 있다는 사실에 의해 예시된 바와 같이, WNT5A는 악성 흑색종, 위암뿐만 아니라 몇몇 다른 암 유형에서 반대 효과를 갖는다.
WNT5A는 신체 내 많은 정상 세포에 의해 발현된 단백질이다. WNT5A는 세포로부터 분비되며, 주로 Frizzled 수용체와 관련된 수용체 복합체에 결합 및 활성화함으로써 동일 또는 인접 세포에 작용을 가한다. WNT5A 단백질은 Frizzled 5로 불리는 수용체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. Frizzled 5 수용체가 활성화되면, 세포 내 일련의 신호 전달 사건이 활성화되는데, 첫 사건 중 하나는, 세포 내부 칼슘 생성을 짧게(short-lived) 증가시키는 것, 소위 칼슘-신호이다. 칼슘-신호는 결국 일련의 다가오는 신호 전달 사건을 유발하여 접착 및 이동과 같은 세포의 기능을 변화시킨다. 따라서, 이러한 Frizzled 수용체의 활성화는 세포 내 신호 전달 사건을 유발하여 인접 세포에 대한 세포의 접착이 증가되는 결과를 야기하며, 주변 결합 조직에 대한 접착이 증가하여 종양 세포가 림프절 및 혈관과 같은 인근 구조로 이동하는 능력이 감소되는 결과를 야기시킨다. 예를 들어, 건강한 유방 상피 세포에서 WNT5A는 고도로 발현되며 세포와 주변 기저막 사이에 대한 견고한 접착을 보장하여 세포의 이동을 제한한다.
내인성 WNT5A의 발현이 결여된 암 조직에서 WNT5A 신호 전달을 재구성하기 위하여, 소형 펩티드, 즉 WNT5A 분자의 아미노산 서열로부터 유래된 20개 이하의 아미노산이 개발되었고 추가로 변형되었다. 이러한 펩티드의 예로 Foxy-5가 있으며, 이는 동일한 신호 전달 사건 및 기능적 반응을 유발한다는 점에서 진정한 WNT5A 작용제(agonist)이고, WNT5A와 비교하면, 훨씬 단순한 분자이며 전신으로 투여할 수 있고 여전히 종양 조직에 도달할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 신호 전달 특성은 세포에서 WNT5A 또는 Foxy-5 펩티드가 주로 Frizzled 수용체 단백질 (Fz)에 결합한 뒤 세포 내 신호 전달 캐스케이드가 후속하여 결국 CSC의 저감 또는 제거를 유발하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 주변 비-암 세포는 형태학적으로 종양이 발생한 것과 동일한 유형의 정상적인 세포를 의미하며, 종양 조직을 에워싸거나 둘러싸고 있다.
실시예
실시예 1
2개의 상이한 인간 결장암 세포 유형 HT29 및 Caco-2 세포로부터의 종양을 면역조직화학 (IHC) 및 mRNA로 검사하였다 (도 1 참조).
0일: HT29 또는 Caco-2 결장암 세포의 피하 주사를 누드 마우스에 주사하였다.
마우스에서 종양이 자리잡게 된 7일 후, 비히클 (식염수) 단독 (gr 1) 또는 Foxy-5 (2μg/g; gr 2)를 복강내(I.P) 주사하였다.
9-23일에 종양 성장 및 동물 체중을 모니터링한 뒤 - 2일마다 각각 비히클 단독 (gr 1) 또는 Foxy-5 (2μg/g; gr 2)를 8회 I.P. 주사하였다.
(하나는 고정되며 다른 하나는 -80℃에서 동결된 두 부분으로 나누어진) (Caco-2 및 HT29 유래된) 2개 종양의 유형을 이들의 COX-2, 15PGDH, β-카테닌, Ascl2, ALDH 및 Dckl1의 단백질 발현과 ALDH 및 Dckl1의 mRNA 함량으로 분석하였다 (ALDH는 일반적인 줄기세포 마커이며, 결장 CSC에 대한 특이적 마커이다).
Foxy-5는 결장암에서 유래된 Caco-2 및 HT29 모두에서 2개의 줄기세포 바이오마커의 발현을 현저하게 저감시키는 것으로 나타났다 (도 2 내지 4 참조).
실시예 2
도 2-4에서 요약된 결과를 추가적으로 검증하기 위하여, 발명자들은 본 실험에서 감소된 CSC 수의 원인이 되는 가능한 메커니즘을 분석했다. 결장암에서 효소 사이클로옥시나아제-2 (COX-2)는 종종 상향 조절된다. COX-2 활성은 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 생성 및 방출을 유도한다. PGE2는 암 진행을 촉진시키며 결장 CSC의 확장을 선호하는 것으로 나타났다. [(Wang et al., Prostaglandin E2 promotes colorectal cancer stem cell expansion and metastasis in mice. Gastroenterology 149:1884-1895, 2015)]. 표준 WNT-신호 전달 경로의 교란이 결장 종양의 개시를 설명하는 것으로 여겨지지만, 대부분의 결장 종양에서 발생하는 사이클로옥시나아제-2 (COX-2)의 증가된 발현은 결장암 발생 동안 결정적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 증가된 COX-2 발현은 주요 대사 산물인 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 풍부함을 증가시킨다. 본 연구에서 Foxy-5을 사용한 동물 치료는 PGE2 생성 효소 COX-2의 발현의 감소를 야기했을 뿐만 아니라 (도 5 및 5B 참조), PGE2 분해 효소 15-PGDH의 증가를 야기했다 (도 5 및 5C 참조). 이러한 데이터는 Foxy-5 펩티드를 이용한 치료가 독특한 이중 작용에 의해 종양 내 PGE2의 수준의 저감을 유발시킬 수 있고, 결국 관찰된 CSC의 저감을 설명할 수 있다는 것을 입증한다 (도 2-4 및 2B-3B).
실시예 3
HT-29 또는 Caco-2 결장암 조직에서 β-카테닌 신호 전달에 대한 Foxy-5 치료의 in vivo 효과는 관찰된 CSC의 감소된 수에 대한 또 다른 가능한 설명일 수 있다. Foxy-5 치료의 결과로서, 저감된 활성 β-카테닌 핵 발현량은 결장암 종양에서 유래된 Caco-2 및 HT29 모두에서 관찰되었다 (도 7 및 8 참조). Foxy-5-저감된 β-카테닌 신호 전달의 관찰은 종양 부피의 저감에 의해 입증되었다 (도 6 및 7). 본 연구에 대한 정수는, Foxy-5-유도된 β-카테닌 다운스트림 표적 Ascl2 (암 줄기세포 니치를 촉진시키는 전사 인자)의 저감이, CSC 수를 저감시키는 Foxy-5 치료능이 저감된 β-카테닌/Ascl2 신호 전달에 또한 의존한다는 것 역시 관찰되었다는 사실에 있다 (도 6-9 참조). 결과적으로, Foxy-5 펩티드는 CSC를 촉진하는 2개의 분리된 신호 전달경로에서 저감을 유발하는 3개의 상이한 요소 (COX-2, 15-PGDH 및 β-카테닌)를 표적하는 능력에 의해 CSC 수를 저감시키는 독특한 특성을 나타낸다.
실시예 4
본 실험의 목적은 FOLFOX의 세포독성 효과에 대한 Foxy-5 펩티드의 in vitro 효과를 평가함으로써, Foxy-5 및 FOLFOX의 동시 치료 가능성을 시험하는 것이었다. FOLFOX는 2개의 화학요법제인 5-FU 및 옥살리플라틴 및 폴리닌산의 조합으로부터 구성되며, 또한 후자는 화학요법제가 아닌 류코보린으로 불리지만 인간 HT29 결장암 세포에 대한 5-FU효과를 강화시키는 데 사용된다. FOLFOX는 결장암 환자의 치료에서 가장 일반적으로 사용되는 화학요법이다.
초기 실험은 단일요법으로서 Foxy-5 펩티드, 옥살리플라틴, 및 5-FU의 세포독성 효과를 평가하는 것이었다 (도 10). 결과는 폴리닌산으로서 세포 생존력에 대한 Foxy-5 펩티드의 세포독성 효과가 없어서 결과적으로 IC50 값이 측정될 수 없었음을 확인하였다. 반면 옥살리플라틴 및 5-FU의 IC50 값은 용량-반응곡선으로부터 각각 3.4 및 6.8 μM인 것으로 계산되었다.
조합 결과는 Foxy-5 펩티드가 세포 생존력에 대한 FOLFOX의 억제 효과를 향상시키거나 저감시키지 않음을 나타낸다. FOLFOX 단독 치료의 IC50 값은 1.5 μM이었고, Foxy-5 펩티드 및 FOLFOX으로 결합된 치료는 동일한 IC50 값을 나타냈으며, 이는 도 10에서 겹쳐지는 용량-반응 곡선에서도 명백하다.
결론적으로, Foxy-5의 추가는 인간 HT29 결장암 세포의 생존력에 대한 FOLFOX 치료의 효과를 바꾸지 않았으므로, 상호작용은 예상될 수 없다. 따라서, Foxy-5이 FOLFOX 치료의 세포증식 억제 효과를 저감시킬 것이라는 암시가 없다.
SEQUENCE LISTING <110> WNTRESEARCH AB <120> WNT5A peptides in reduction of cancer stem cells <130> xxx <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens WNT5A <400> 1 Met Lys Lys Ser Ile Gly Ile Leu Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly Met Ala Gly Ser Ala 1 5 10 15 20 Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu Ala Ile Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val 21 25 30 35 40 Ile Glu Ala Asn Ser Trp Trp Ser Leu Gly Met Asn Asn Pro Val Gln Met Ser Glu Val 41 45 50 55 60 Tyr Ile Ile Gly Ala Gln Pro Leu Cys Ser Gln Leu Ala Gly Leu Ser Gln Gly Gln Lys 61 65 70 75 80 Lys Leu Cys His Leu Tyr Gln Asp His Met Gln Tyr Ile Gly Glu Gly Ala Lys Thr Gly 81 85 90 95 100 Ile Lys Glu Cys Gln Tyr Gln Phe Arg His Arg Arg Trp Asn Cys Ser Thr Val Asp Asn 101 105 110 115 120 Thr Ser Val Phe Gly Arg Val Met Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr Ala Phe Thr Tyr Ala 121 125 130 135 140 Val Ser Ala Ala Gly Val Val Asn Ala Met Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser 141 145 150 155 160 Thr Cys Gly Cys Ser Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp Trp Leu Trp Gly 161 165 170 175 180 Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Lys Glu Phe Val Asp Ala Arg 181 185 190 195 200 Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys Gly Ser Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu 201 205 210 215 220 His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys 221 225 230 235 240 His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln Leu Ala Asp Phe Arg 241 245 250 255 260 Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Asp Ser Ala Ala Ala Met Arg Leu Asn Ser 261 265 270 275 280 Arg Gly Lys Leu Val Gln Val Asn Ser Arg Phe Asn Ser Pro Thr Thr Gln Asp Leu Val 281 285 290 295 300 Tyr Ile Asp Pro Ser Pro Asp Tyr Cys Val Arg Asn Glu Ser Thr Gly Ser Leu Gly Thr 301 305 310 315 320 Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu Met Cys Cys 321 325 330 335 340 Gly Arg Gly Tyr Asp Gln Phe Lys Thr Val Gln Thr Glu Arg Cys His Cys Lys Phe His 341 325 350 355 360 Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Lys Lys Cys Thr Glu Ile Val Asp Gln Phe Val Cys Lys 361 365 370 375 380 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is methionine or nor-leucin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in position 4 is cysteine or alanine <400> 2 Xaa Asp Gly Xaa Glu Leu 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu 1 5 10 15 Leu <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys 1 5 10 15 Glu Leu <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly 1 5 10 15 Cys Glu Leu <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu 1 5 10 15 20

Claims (15)

  1. SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체로서,
    상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며,
    여기서 X는 임의의 아미노산이고,
    상기 펩티드는 환자의 암 반복(recurrence) 또는 재발(relapse)의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 결장암, 난소암, 갑상선암, 간암 또는 혈액암으로 구성되는 목록으로부터 선택되는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포에서의 단백질 WNT5A의 발현은 주변 비-암 세포에서의 발현의 35% 이하인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1번 위치의 X는 M 또는 노르류신이며, 4번 위치의 X는 C 또는 A인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드:
    MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),
    GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),
    EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),
    SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),
    TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),
    KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),
    NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),
    CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),
    LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),
    RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),
    GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),
    QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),
    TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),
    GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16), 및
    LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),
    또는 이의 포르밀화된 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 MDGCEL (SEQ ID NO: 3)인 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체.
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 예방, 저감 또는 제거는 다음의 단계를 포함하는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드:
    a) 암의 진단 직후 및/또는 수술 중 및/또는 수술에 의한 종양 제거 후, 유효량의 펩티드를 투여하는 단계로서, 여기서 임의로 단계 a)는 2주 이상 동안 적어도 주 3회로 반복되는 단계.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물과 조합하여 사용하기 위한 것이고,
    예방, 저감 또는 제거는 다음의 단계를 포함하는 것인, 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한 펩티드:
    a) 유효량의 종양 억제 화학요법 약물을 투여하는 단계;
    b) 상기 하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물로 치료하기 전, 치료와 동시에 및/또는 치료 이후, 유효량의 펩티드를 투여하는 단계로서, 임의로 여기서 단계 b)는 2주 이상 동안 적어도 주 3회로 반복되는 단계.
  9. 하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물과 조합된, SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체로서,
    상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며,
    여기서 X는 임의의 아미노산인 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체.
  10. 환자의 암 반복 또는 재발의 예방에 사용하거나 암을 진단받은 환자의 암 줄기세포의 저감 또는 제거에 사용하기 위한, 하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물과 조합된, SEQ ID NO: 1에 따른 WNT5A 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 이의 포르밀화된 유도체의 조합물로서,
    상기 펩티드는 20개 이하의 아미노산 길이를 가지고 아미노산 서열 XDGXEL (SEQ ID NO: 2)을 포함하며,
    여기서 X는 임의의 아미노산이고,
    상기 펩티드 및 상기 종양 억제 화학요법 약물은 조합되거나 분리되고 및/또는 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 조합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 종양 억제 화학요법 약물은 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린 및 옥살리플라틴 (FOLFOX) 또는 안트라사이클린 또는 탁산의 조합인 것인 조합물.
  12. 제10항 및 제11항에 있어서, 안트라사이클린은 에피루비신 또는 독소루비신이거나, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀인 것인 조합물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 종양 억제 화학요법 약물은 결장암을 진단받은 환자의 치료에 사용하기 위한 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린 및 옥살리플라틴 (FOLFOX)의 조합인 것인 조합물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 종양 억제 화학요법 약물은 유방암을 진단받은 환자의 치료에 사용하기 위한 안트라사이클린 또는 탁산인 것인 조합물.
  15. 제10항 및 제14항에 있어서, 안트라사이클린은 에피루비신 또는 독소루비신이거나, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀인 것인 조합물.
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