KR20200080270A - 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체 - Google Patents

종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR20200080270A
KR20200080270A KR1020207014565A KR20207014565A KR20200080270A KR 20200080270 A KR20200080270 A KR 20200080270A KR 1020207014565 A KR1020207014565 A KR 1020207014565A KR 20207014565 A KR20207014565 A KR 20207014565A KR 20200080270 A KR20200080270 A KR 20200080270A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
domain
cells
seq
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020207014565A
Other languages
English (en)
Inventor
미첼 호
난 리
단 리
Original Assignee
더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 filed Critical 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority to KR1020257031862A priority Critical patent/KR20250143360A/ko
Publication of KR20200080270A publication Critical patent/KR20200080270A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K40/4255—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4261—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7153—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for colony-stimulating factors [CSF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/844—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 상피 성장 인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 암호화하는 구조체가 서술된다. 암호화하는 CARs은 CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region), CD8α 막통과 부위 (CD8α transmembrane region), 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain), 및 CD3ζ시그날링 도메인 (CD3ζsignaling domain)에 융합된 글라이피칸-3-특이 ((glypican-3) (GPC3)-specific)), GPC2-특이 또는 메소텔린-특이 (mesothelin-specific) 단일클론 항체와 같은, 종양 항원 특이 단일클론 항체를 포함한다. 공개되는 CARs 및 huEGFRt를 동시-발현하는 분리된 T 세포와 같은, 분리된 숙주 세포도 또한 서술 된다. 공개되는 CAR 구조체로 형질도입된 T 세포는 암 면역 치료에 사용될 수 있다.

Description

종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체
이 공개는 종양 항원 (tumor antigens)에 특이적인 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptors), 및 이들의 암 면역치료를 위한 사용에 관한 것이다.
관련된 특허 출원과의 교차 참고
이 출원은 2017 년 11월 10 일에 제출된 미국 가출원 번호 62/584,421, (U.S. Provisional Application No. 62/584,421) 장점을 청구하며, 이는 여기에 그 전문이 참고 문헌으로 병합되었다.
정부 지원에 대한 사사
본 발명은 국가 보건 연구원, 국가 암 연구원, (National Institutes of Health, National Cancer Institute)로부터 지원받은 프로젝트 번호 Z01 BC010891 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가진다.
키메릭 항원 수용체(CARs)는 종양 항원에 특이적인 항체 단편으로 구성된 것으로, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 및 T-세포 시그널링(signaling) 잔기에 융합된 것이다. 수용체는, T 세포 표면에서 발현되었을 때는, 타겟에의 결합을 중재하고 및 T-세포를 활성화시켜, 궁극적으로는 타겟 세포의 용해를 유도한다. CARs는 혈핵 암 (hematological malignancies)을 치료하는 가장 전망이 좋은 접근방법 중에 하나로 대두되고 있다 (Kochenderfer et al., Blood 119:2709-2720, 2012; Kochenderfer 및 Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol 10:267-276, 2013; Porter et al., New Engl J Med 365:725-733, 2011; Maude et al., New Engl J Med 371:1507-1517, 2014; Grupp et al., New Engl J Med 368:1509-1518, 2013). CD19-타겟하는 CARs인, 아식캅타젠 실로루셀 (axicabtagene ciloleucel) (YescartaTM) 및 티사겐렉루셀 (tisagenlecleucel) (KymriahTM), 두 개가 미국에서 B-세포 비-호지킨스 림프종 (B-cell non-Hodgkin lymphoma) 및 B-세포 급성 림프모구 백혈병 (B-cell acute lymphoblastic leukemia) 치료에 각각 사용되도록 허가되었다. 고형 종양의 치료에서 여러가지 CAR T 세포 치료법을 검사하기 위하여 임상 시험이 현재 진행 중이다 (Yu et al., J Hematol Oncol 10(1):78, 2017).
요약
여기서 공개되는 것은 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 상피 성장 인자 수용체(truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt) 둘 다를 암호화하는 핵산 구조체 (nucleic acid constructs) 이다. 암호화하는 CARs는 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region), 막통과 부위 (transmembrane region), 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain) 및 세포내 시그널링 도메인 (intracellular signaling domain)에 융합된 종양 항원-특이 단일클론 항체 단편 (tumor antigen-specific monoclonal antibody fragment)을 포함한다. huEGFRt는 두 개의 EGFR 세포외 도메인 (extracellular domains)((도메인 III (Domain III) 및 도메인 IV (Domain IV)) 및 EGFR 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함하나, 두 개의 막에서 먼 세포외 도메인 (membrane distal extracellular domains) 및 모든 세포내 도메인 (intracellular domains )은 포함하지 않는다. 공개되는 CARs 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 T 림프구 (T lymphocytes)와 같은, 분리된 세포도 공개된다. CAR 구조체가 형질도입 (transduced)된 T 세포는 암 면역 치료에 사용될 수 있다.
여기서 제공되는 것은 CAR 및 huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자이다. 어떤 실시예에서, 핵산 분자에는 5' 에서 3' 방향으로 첫 번째 시그날 서열(first signal sequence)을 암호화 하는 핵산; 항원-특이 항체(antigen-specific antibody) 또는 이의 항원-결합 단편 (antigen-binding fragment)을 암호화 하는 핵산; 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)를 암호화 하는 핵산; 막통과 도메인(transmembrane domain)을 암호화 하는 핵산; 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)을 암호화 하는 핵산 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 암호화 하는 핵산; 자가-절단 2A 펩티드 (self-cleaving 2A peptide)를 암호화 하는 핵산; 두 번째 시그날 서열(second signal sequence)을 암호화 하는 핵산; 및 huEGFRt를 암호화 하는 핵산을 포함한다. 어떤 실시예시에서는, 첫 번째 및/또는 두 번째 시그날 서열은 과립-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss)이고, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)은 CD8a 힌지 부위 (CD8a hinge region)이고, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 은 CD8a 막통과 도메인이고, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)이고, 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3z 시그날링 도메인(CD3z signaling domain) 이다. 어떤 실시예시에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, 글리피칸-3 (glypican-3) (GPC3), GPC2 또는 메소텔린 (mesothelin)과 같은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. 또한 여기서 공개되는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 벡터 (viral vector)와 같은 벡터(vector)를 제공한다. 특히 제한적이지 않은 실시예시에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector) 이다. 더 나아가 제공되는 것은 여기서 공개된 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포이다.
또한 제공되는 것은 CAR 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 분리된 숙주 세포이다. 어떤 실시예에서, CARs은 항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region), 막통과 부위 (a transmembrane region), 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain) 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 포함하며; 및/또는 huEGFRt는 인간 EGFR으로부터의 도메인 III (Domain III), 도메인 IV (Domain IV) 및 EGFR 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함하나, 상피 성장 인자(EGF) 결합 도메인((epidermal growth factor) (EGF)-binding domain) 및 세포질내 도메인 (cytoplasmic domain)은 포함하지 않는다. 어떤 실시예시에서, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)는 CD8a 힌지 부위 (CD8a hinge region)를 포함하고, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 은 CD8a 막통과 도메인을 포함하고, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 포함하고, 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3z 시그날링 도메인(CD3z signaling domain)을 포함한다. 어떤 실시예시에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, 글라이피칸-3 (glypican-3) (GPC3), GPC2 또는 메소텔린 (mesothelin)과 같은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
여기서 공개된 분리된 숙주 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 조성물이 더 나아가 제공된다. 어떤 실시예에서, 분리된 숙주세포는 T-림프구이다.
더 나아가 여기서 공개되는 분리된 숙주 세포를 개체에게 투여하여, GPC3-양성 암 (GPC3-positive cancer), GPC2-양성 암 (GPC2-positive cancer) 또는 메소텔린-양성 암 (mesothelin-positive cancer)을 치료하는 방법을 제공한다. 어떤 실시예에서, 분리된 숙주 세포는 자생 T 림프구 (autologous T lymphocytes)와 같은 T 림프구이다.
본 발명의 선행 및 다른 목표, 특성, 및 장점은 수반되는 도면들을 참조로 진행되는 하기의 상세한 서술로 좀더 분명 해질 것이다.
도 1은 종양-타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체 (CARs)를 만들어내는 렌티바이러스 구조체 (lentiviral construct)의 계획도다. 렌티바이러스 구조체는 CAR 암호화 부위 (CAR coding region) 및 절단된 인간 상피 성장인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 암호화하는 부위를 포함하며, 각각에는 과립대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss)이 선행된다. 두 부위는 자가-절단 T2A 서열 (self-cleaving T2A sequence)에 의해 나뉘어져 있어, 이 구조체가 발현되면 CAR는 huEGFRt로 부터 쪼개진다. 구조체의 발현은 인간 연장 인자 1a (EF1a) 프로모터 ((human elongation factor 1a (EF1a) promoter))에 의해 유도된다. CAR는 항원-결합 부위 (antigen-binding region), CD8a 힌지 부위 (CD8a hinge region), CD8a 막통과(TM) 부위 ((CD8a transmembrane (TM) domain)), 4-1BB 동시-자극 부위 (4-1BB co-stimulatory region) 및 CD3z 시그날링 도메인 (CD3z signaling domain)을 포함한다. huEGFRt는 두 개의 세포외 도메인 (extracellular domains) (도메인 III 및 도메인 IV) 및 TM 도메인을 포함한다.
도 2A-2C는 CAR.HN3를 암호화하는 pMH288 (도 2A), CAR.hYP7를 암호화하는pMH289 (도 2B) 및 CAR.LH7를 암호화하는 pMH290 (도 2C) 구조체들의 벡터 지도다.
도 3A-3C는 GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 형질도입 (transduction efficiency) 효율을 보여주는 유동 세포분석 플럿이다. 형질도입 효율은 항-huEGFRt 항체인 세툭시맵 (cetuximab)을 사용하여 결정되었다. CAR.HN3 (도 3A) 및 CAR.hYP7 (도 3B)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터는 T 세포를 각각 65% 및 45.4%로 형질 도입시킨다. (도 3C) 대조군 인간 혈청 IgG.
도 4A-4G는 GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 인간 세포주에 대한 세포독성을 보여준다. CAR.hYP7는 GPC3+ G1 세포 (도 4A), GPC3+ Hep3B 세포 (도 4B), GPC3+ HepG2 세포 (도 4C), GPC3+ Huh7 세포(도 4D), GPC3- A431 세포(도 4E), GPC3- T3M4 세포 (도 4F) 및 GPC3- IMR32 세포(도 4G)에 대하여 효능기: 타겟 (effector: target) 비율 1:2, 1.5:1, 5:1 및 16:1로서 테스트하였다. CAR.hYP7은 GPC3-양성 세포주에 대하여는 세포독성이 있었으나 GPC3-음성 세포주에 대하여는 세포독성이 없었다.
도 5는 CAR.hYP7 T 세포가 타겟 GPC-양성 Hep3B, Huh7 및 G1 종양세포에서 인터페론 (interferon)(IFN)-γ 분비를 유도함을 보여주는 그래프다.
도 6는 GPC3-타겟된 T세포로 처치한 마우스에서 Hep3B 종양 억제의 생체발광 이미지(bioluminescence images)를 보여준다. 마우스에 0일에 복강(i.p)으로 4 백만 Hep3B 세포를 주사하였다. 10 일째 날에 마우스에 가짜-주사 (mock-injected) 또는 PBS, 10 백만 CAR.HN3 T 세포 (HN3-10 M), 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-10 M), 20 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-20 M) 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-40 M)를 주사하였다. 종양 크기는 생체발광 이미징으로 측정하였다.
도 7A-7C는 CAR.hYP7 T 세포가 마우스의 Hep3B 이종이식 종양 (Hep3B xenograft tumors)에서 지속적인 항-종양 활성을 가지고 있음을 보여주는 그래프다. (도 7A) Hep3B-종양을 가지고 있는 마우스에서 PBS, 가짜-처치 (mock-treated), 10 백만 CAR.HN3 T 세포, 10 백만 CAR.hYP7 T 세포, 20 백만 CAR.hYP7 T 세포 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로 처치한 후 3 주까지의 종양 부피. (도 7B) PBS, 10 백만 CAR.HN3 T 세포, 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로 처치한 Hep3-종양을 가진 마우스에서 처치 후 7 주에서의 종양 부피. (도 7C) Hep3B-종양을 가진 마우스에서 생존 곡선. 마우스는 Hep3B 접종 후 10일에 PBS, 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포를 주사하였으며 및 생존은 70일 동안 평가되었다. 40 백만 CAR.hYP7 T세포로의 처치는 100% 생존을 초래하였다.
도 8A-8D는 가짜-처치한 (mock-treated) (도 8A) 또는 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 (도 8B) 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포 (도 8C)로 처치한 HepG2 이종이식 NSG (HepG2 xenograft NSG) 마우스에서의 종양 부피를 보여주는 그래프다.
도 9는 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)로 측정한 인간 정상 조직에서의 GPC3 mRNA의 수준을 보여준다. 각 다른 정상 조직에서의 상대적인 GPC3의 수준이 태반에서의 GPC3 발현에 대비하여 비교 되었다.
도10A-10E는 GPC3 CAR T 세포의 제작 및 발현을 보여준다. (도 10A) 성숙된 GPC3의 N-엽 (N-lobe) 및 C-엽 (C-lobe)에 각각 결합된 HN3 및 hYP7 항체의 도식적 구조이다. (도 10B) T2A 리보조말 스키핑 서열 (T2A ribosomal skipping sequence)을 사용하여 huEGFRt와 함께 GPC3 타겟팅 하는 CARs을 발현하는 두개의 시스트론을 갖는 렌티바이러스 구조체 (bicistronic lentiviral construct)의 도식적 도표이다. (도 10C) 렌티바이러스 입자로 형질 도입된 건강한-공여자로부터 유래한 T 세포에서 CAR의 발현은 유동 세포분석을 사용하여 EGFR 발현의 검출로 분석되었다. (도 10D) 가짜 T 세포 (mock T cells) 및 건강한-공여자로부터의 CAR (hYP7) T 세포는 물론 HCC 환자-유래한 CAR (hYP7) T 세포에서의 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 분석. (도 10E) 트리판 불루 제외 에세이 (trypan blue exclusion assay)로 평가한 8명의 다른 건강한 공여자 및 4 명의 다른 HCC 환자에서의 CAR (hYP7) T 세포의 증식.
도 11A-11G는 GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 GPC3-양성 HCC 세포를 실험관 내에서 죽이는 것을 보여주는 그래프다. (도 11A) 루시훼라제 활성 (luciferase activity)으로 측정한 GPC3-음성 타겟 세포 (A431 및 T3M4)가 아닌, GPC3-양성 타겟 세포 (G1)의 용해. 가짜 또는 GPC3-타겟하는 CAR T 세포를 루시훼라제-발현하는 타겟 세포와 함께 제시된 효능제(effector) (E): 타겟 (target) (T) 비율로 24 시간 동안 배양시켰으며, 및 특정한 용해는 발광에-근거한 세포용해 에세이 (luminescent-based cytolytic assay)를 사용하여 측정되었다. (도 11B-11C) 건강한 공여자 (도 11B) 또는 HCC 환자 (도 11C)로부터 유래한 CAR (HN3) T 세포 및 CAR (hYP7) T 세포를 Hep3B 세포와 24 시간 동안 동시 배양 후의 세포용해 활성. (도 11D) 항-CD3/CD28 비드 (anti-CD3/CD28 beads)로 35일 이상 동안 자극시킨 후의 CAR (hYP7) T 세포의 왕성한 증식. (도 11E) CAR (hYP7) T 세포를 Hep3B 세포와 24 시간 동안 동시 배양했을 때 활성화시킨 후 14 일 및 28일째 날에 CAR (hYP7) T 세포의 세포용해 활성. (도 11F) 건강한 공여자-유래한 GPC3-특이 CAR T 세포를 HepG2 및 Huh-7 세포와 24 시간 동안 동시 배양한 후의 세포용해 활성. (도 11G) 인큐사이트 줌 (IncuCyte zoom)을 사용하여 측정한 GPC3-타겟하는 CAR T 세포-매개한 HepG2 세포의 살해. HepG2는 CAR T 세포와 E:T 비율 2:1로 140 시간까지 배양시켰다.
도 12는 GPC3-CARs로 재방향화 된 (redirected) T 세포의 사이토카인/케모카인 (cytokine/chemokine) 프로화일 및 다중기능성 (polyfunctionality)을 보여준다. Hep3B 및 HepG2 세포를 GPC3-타겟하는 CAR T 세포와 여러가지 E:T 비율로 24 시간 동안 동시 배양 시켰으며 및 루미넥스 (Luminex)를 사용하여 상등액에서 제시된 사이토카인/케모카인 수준이 측정되었다. 바(bars)는 왼쪽에서부터 오른쪽이다: 가짜, hYP7 및 HN3. 평균 및 SD 를 보여준다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 13A-13F는 GPC3 타겟팅이 Wnt/b-카테닌 시그날링 (Wnt/b-catenin signaling)을 억제시켜 HCC 세포 사멸을 유도함을 보여준다. (도 13A) CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포에서 처치 6 시간 후에 β-카테닌 (b-catenin) 발현을 억제시키고 및 세포사멸 마커들 ((쪼개진 PARP 및 쪼개진 카스페이즈-9 (cleaved caspase-9)의 발현을 증가시켰다. (도 13B) CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포에서 β-카테닌 (b-catenin)의 발현을 시간-의존적인 방식 (time-dependent manner)으로 억제하였다. (도 13C) 크리스퍼/카스9 (CRISPER/Cas9)-매개하는 GPC3 적출 (GPC3 knockout) 후 Hep3B 세포에서 GPC3 단백질 발현. (도 13D) GPC3의 엑손 5 (exon 5)를 타켓팅하는 sgRNA5-2의 항종양 활성. 무흉선 nu/nu 누드 마우스 (Athymic nu/nu nude mice)에 5 x 106 Hep3B 세포를 피하로 접종시켰다. 종양이 평균 부피 150 mm3에 도달했을 때, 마우스는 sgRNA5-2 플라즈미드 또는 빈 벡터 (empty vector)로 종양내 주사로 매 2틀마다 6 번 처치하였다. (도 13E) GPC3 적출 (knockout)은 마우스 종양에서 β-카테닌 (β-catenin)의 발현을 감소시켰다. (도 13F) sgRNA5-2 플라즈미드 또는 빈 벡터 대조군으로 처치하기 전 및 후에 혈청 AFP 수준. 평균 및 SD를 보여준다. *p < 0.05; **p < 0.01.
도 14A-14F는 CAR (hYP7) T 세포가 Hep3B 복강 전파 이종이식 마우스 모델 (Hep3B peritoneal dissemination xenograft mouse model)에서 종양을 박멸함을 보여준다. (도 14A) 실험 도식도. 종양 세포 접종 후 12째 날에 Hep3B 종양-소유하는 NSG 마우스는 가짜 T 세포, 5 x 106 CAR (HN3) T 세포, 5 x 106 CAR (hYP7) T 세포, 10 x 106 CAR (hYP7) T 세포 또는 20 x 106 CAR (hYP7) T 세포를 복강 주사로 처치되었다. 종양에 대한 부담 (tumor burden)은 생체발광 이미징으로 모니터 되었다. (도 14B) CAR (hYP7) T 세포는 높은 용량 (20 백만 세포)에서는 확립된 Hep3B 이종이식을 퇴행시켰으며 및 낮은 용량 (5 백만 또는 10 백만 세포)에서는 종양 성장을 억제하였다. (도 14C) 도 14B에서 처치한 마우스에서 평균 광자 수(photon count) 로서의 종양 생체발광 (bioluminescence). (도 14D) 5 백만 또는 20 백만 CAR (hYP7) T 세포로 처치한 후의 종양-소유 마우스의 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선. (도 14E) CAR T 처치 후 2 주 또는 6 주에 (도 14B)에 보여준 그룹으로부터 수집된 혈청내의 알파 태아단백질 (Alpha fetoprotein) 수준. 엘라이자 분석 (ELISA analysis)을 위하여 각 그룹으로부터 다른 세 마리의 혈청이 수집되었다. (도 14F) 드롭렛 디지털 PCR (droplet digital PCR) (ddPCR)로 측정한 처치 3 주 후의 이종이식 종양 조직에서 CAR T 세포 잔존율. 값은 평균± SD. 를 대표한다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 15A-15D는 CAR (hYP7) T 세포가 HepG2 복강 전파 이종이식 마우스 모델 (HepG2 peritoneal dissemination xenograft mouse model)에서 종양 세포를 제거함을 보여준다. (도 15A) 실험 도식도. HepG2 종양-소유하는 NSG 마우스를 가짜 T 세포 (Mock T cells) 또는 20 x 106 CAR (hYP7) T 세포의 복강 주사로 처치하였다. (도 15B) CAR (hYP7) T 세포는 강력한 항종양 활성을 보여주며 및 HepG2 이종이식 종양의 박멸을 매개하였다. (도 15C) 도 15B에서 처치된 마우스에서 평균 광자 수 (mean photon count)로서의 종양 생체발광. (도 15D) ddPCR로 측정한 처치 5 주 후의 이종이식 종양 조직 및 마우스 비장에서의 CAR T 세포 잔존율.
도 16A-16D는 Hep3B 동소 이종이식 마우스 모델 (Hep3B orthotopic xenograft mouse model)에서 CAR (hYP7) T 세포에 의한 HCC 박멸을 보여준다. (도 16A) 실험 도식도. Hep3B 동소 종양 (Hep3B orthotopic tumor)을 소유하고 있는 NSG 마우스에 복강으로 또는 정맥주사로 20 x 106 CAR (hYP7) T 세포를 21째 날에 주사하였다. 일 주일마다 마우스 이미지를 찍었다. (도 16B) 꼬리 정맥을 통해 CAR (hYP7) T 세포로 처치된 마우스는 종양 박멸을 보여주었으며, 반면에 복강으로의 처치는 종양 성장 억제 결과를 보여준다. (도 16C) 도 16B에서 처치된 마우스에서 평균 광자 수 (mean photon count)로서의 종양 생체발광. (도 16D) ddPCR로 측정한 처치 5 주 후의 종양 조직 및 마우스 비장에서의 CAR T 세포 잔존율.
도 17은 GPC3-타겟된 (HN3 및 hYP7) 저켓 CAR T 세포 (Jurkat CAR T cells)의 GPC3-인간 Fc (hFc) 융합 단백질에의 결합을 보여주는 일련의 유동 세포분석 플럿 (flow cytometry plots) 및 스케차드 플럿 (Scatchard plots)이다.
도 18는 GPC3-타겟된 CAR T 세포를 Hep3B 및 HepG2 종양 세포 둘 다와 24 시간 동안 배양한 후 루미넥스 (Luminex)로 측정한 사이토카인 및 케모카인 분비의 차이를 보여주는 일련의 그래프다. 바는 왼쪽으로부터 오른 쪽으로: 가짜 (Mock), hYP7 및 HN3이다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
도 19A-19B는 GPC3-타겟된 CAR T 세포로 처치한 후 Hep3B 및 HepG2 종양 이종이식 마우스 (xenograft mice)의 체중을 보여준다. (도 19A) PBS, 가짜 T- 세포 (mock T-cells), CAR (hYP7) T 세포 또는 CAR (HN3) T 세포로 복강 주사 후의 Hep3B 종양 모델 마우스의 체중. (도 19B) 20 백만 가짜 T-세포 또는 CAR (hYP7) T 세포를 복강으로 주사한 후의 HepG2 종양 모델 마우스의 체중.
서열 목록 (SEQUENCE LISTING)
수반하는 서열 목록에서 목록화 되어 있는 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822.에서 정의된 대로 핵산 염기의 표준 글자 약어, 및 아미노산의 세 글자 코드를 사용하여 보여준다. 각 핵산 서열의 단지 한 줄기만 보여주나, 상호 보완적인 줄기도 보여진 줄기에 참조하여 포함되는 것으로서 이해된다. 서열 목록은 ASCII 텍스트 파일 (ASCII text file) 로서 제출되었으며, 2018년 10월 29일에 59.3 KB가 작성되었고, 이는 여기서 참고문헌으로 병합되었다. 수반되는 서열 목록에서:
서열번호 1은 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 2는 GMCSFRss의 아미노산 서열.
서열번호 3은 CD8 a 힌지 (CD8a hinge)를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 4는 CD8 a 힌지의 아미노산 서열.
서열번호 5는 CD8 a 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 6는 CD8 a 막통과 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 7은 4-1BB를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 8은 4-1BB의 아미노산 서열.
서열번호 9는 CD3z를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 10은 CD3z 의 아미노산 서열.
서열번호 11은 자가-절단 T2A 펩티드(self-cleaving T2A peptide)를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 12는 자가-절단 T2A 펩티드(self-cleaving T2A peptide)의 아미노산 서열.
서열번호 13은 huEGFRt를 암호화하는 핵산 서열.
서열번호 14는 huEGFRt의 아미노산 서열.
서열번호 15는 하기의 특징을 가진, CAR.hYP7를 암호화하는 핵산 서열:
뉴클레오타이드 1-66 = GMCSFRss 코딩서열 (coding sequence)
뉴클레오타이드 67-72 = NdeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 73-807 =인간화된 YP7 scFv (humanized YP7 scF) 코딩 서열
뉴클레오타이드 808-813 = SpeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 814-948 = CD8α힌지 부위 (CD8α hinge region) 코딩 서열
뉴클레오타이드 949-1011 = CD8α막통과 도메인 (transmembrane domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 1012-1137 = 4-1BB 동시-자극 도메인 (co-stimulatory domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 1138-1473 = CD3ζ시그날링 도메인 (signaling domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 1474-1527 = T2A 코딩 서열
뉴클레오타이드 1528-1593 = GMCSFRss 코딩 서열
뉴클레오타이드 1594-2598 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 16은, 하기의 특징을 가진 CAR.hYP7의 아미노산 서열:
잔기 1-22 = GMCSFRss
잔기 23-24 = HM (NdeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 25-269 = 인간화된 YP7 scFv (humanized YP7 scFv)
잔기 270-271 = TS (SpeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 272-316 = CD8α 힌지 부위 (CD8 αhinge region)
잔기 317-337 = CD8α 막통과 도메인 (CD8αtransmembrane domain)
잔기 338-379 = 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)
잔기 380-491 = CD3ζ 시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)
잔기 492-509 = 자가-절단 T2A 펩티드 (self-cleaving T2A peptide)
잔기 510-531 = GMCSFRss
잔기 532-866 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 17은 하기의 특징을 가진, CAR.HN3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열:
뉴클레오타이드 1-66 = GMCSFRss 코딩 서열 (coding sequence)
뉴클레오타이드 67-72 = NdeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 73-420 = HN3 코딩 서열
뉴클레오타이드 421-426 = SpeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 427-561 = CD8α 힌지 부위 (CD8αhinge region) 코딩서열
뉴클레오타이드 562-624 = CD8α막통과 도메인 (transmembrane domain) 코딩서열
뉴클레오타이드 625-750 = 4-1BB 동시-자극 도메인 (co-stimulatory domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 751-1086 = CD3ζ시그날링 도메인 (signaling domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 1087-1140 = T2A 코딩 서열
뉴클레오타이드 1141-1206 = GMCSFRss 코딩 서열
뉴클레오타이드 1207-2211 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 18은 하기의 특징을 가진 CAR.HN3의 아미노산 서열:
잔기 1-22 = GMCSFRss
잔기 23-24 = HM (NdeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 25-140 = HN3 단일-도메인 항체 (HN3 single-domain antibody)
잔기 141-142 = TS (SpeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 143-187 = CD8 α힌지 부위 (CD8αhinge region)
잔기 188-208 = CD8α 막통과 도메인 (CD8αtransmembrane domain)
잔기 209-250 = 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)
잔기 251-362 = CD3ζ시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)
잔기 363-380 = 자가-절단 T2A 펩티드 (self-cleaving T2A peptide)
잔기 381-402 = GMCSFRss
잔기 403-737 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 19는 하기의 특징을 가진, CAR.LH7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열:
뉴클레오타이드 1-66 = GMCSFRss 코딩서열 (coding sequence)
뉴클레오타이드 67-72 = NdeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 73-432 = LH7 코딩 서열
뉴클레오타이드 433-438 = SpeI 제한효소 부위
뉴클레오타이드 439-573 = CD8α 힌지 부위 (CD8αhinge region) 코딩 서열
뉴클레오타이드 574-636 = CD8α 막통과 도메인 (transmembrane domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 637-762 =4-1BB 동시-자극 도메인 (co-stimulatory domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 763-1098 = CD3ζ 시그날링 도메인 (signaling domain) 코딩 서열
뉴클레오타이드 1099-1152 = T2A 코딩 서열
뉴클레오타이드 1153-1218 = GMCSFRss 코딩 서열
뉴클레오타이드 1219-2223 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 20은 하기의 특징을 가진, CAR.LH7의 아미노산 서열:
잔기 1-22 = GMCSFRss
잔기 23-24 = HM (NdeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 25-144 = LH7 단일-도메인 항체 (LH7 single-domain antibody)
잔기 145-146 = TS (SpeI 제한효소 부위에 의해 암호화)
잔기 147-191 = CD8α힌지 부위 (CD8αhinge region)
잔기 192-212 = CD8α막통과 도메인 (CD8αtransmembrane domain)
잔기 213-254 = 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)
잔기 255-366 = CD3ζ시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)
잔기 367-384 = 자가-절단 T2A 펩티드 (self-cleaving T2A peptide)
잔기 385-406= GMCSFRss
잔기 407-741 = huEGFRt 코딩 서열.
서열번호 21은 YP7 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 22는 YP7 VH 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 23은 YP7 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 24는 YP7 VL 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 25는 hYP7 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 26은 hYP7 VH 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 27은 hYP7 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 28은 hYP7 VL 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 29은 HN3 단일-도메인 항체 (HN3 single-domain antibody)의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 30은 HN3 단일-도메인 항체 (HN3 single-domain antibody)의 아미노산 서열.
서열번호 31은 LH7 단일-도메인 항체 (LH7 single-domain antibody)의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 32는 LH7 단일-도메인 항체 (LH7 single-domain antibody)의 아미노산 서열.
서열번호 33은 LH4 단일-도메인 항체 (LH4 single-domain antibody)의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 34는 LH4 단일-도메인 항체 (LH4 single-domain antibody)의 아미노산 서열.
서열번호 35은 LH6 단일-도메인 항체 (LH6 single-domain antibody)의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 36은 LH6 단일-도메인 항체 (LH6 single-domain antibody)의 아미노산 서열.
서열번호 37은 YP218 VH 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 38은 YP218 VH 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 39는 YP218 VL 도메인의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 40은 YP218 VL 도메인의 아미노산 서열.
서열번호 41은 SD1 단일-도메인 항체 (SD1 single-domain antibody)의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 42는 SD1 단일-도메인 항체 (SD1 single-domain antibody)의 아미노산 서열.
서열번호 43-51은 sgRNA 서열.
I. 약어 (Abbreviations)
ADCC 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity)
CAR 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor)
CDR 상보성 결정 부위 (complementarity determining region)
CTL 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte)
ddPCR 작은방울 디지털 PCR (droplet digital PCR)
DMEM 둘벡코의 수정된 이글 배지 (Dulbecco’s modified Eagle medium)
EF1 연장 인자 1 알파 (elongation factor 1 alpha)
EGF 상피 성장 인자 (epidermal growth factor)
EGFR 상피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor)
ELISA 효소-링크된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay)
FACS 형광 활성화 세포 분류 (fluorescence activated cells sorting)
FBS 태아 소 혈청 (fetal bovine serum)
GPC2 글라이피칸-2 (glypican-2)
GPC3 글라이피칸-3 (glypican-3)
GMCSFRss 과립-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열 (granulocyte- macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence)
HCC 간세포 종양 (hepatocellular carcinoma)
HLA 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen)
huEGFRt 인간 절단된 상피 성장 인자 수용체 (human truncated epidermal growth factor receptor)
IFN 인터페론 (interferon)
Ig 면역글로불린 (immunoglobulin)
IL 인터루킨 (interleukin)
i.p. 복강 내의 (intraperitoneal)
ITAM 면역수용체 타이로신-근거한 활성 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif
PBMC 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell)
PBS 인산염-버퍼된 식염수 (phosphate-buffered saline)
scFv 단쇄 가변 단편 (single-chain variable fragment)
TM 막통과 (transmembrane)
VH 또는 VH 가변 중 (variable heavy)
VL 또는 VL 가변 경 (variable light)
YST 난황낭 종양 (yolk sac tumor)
II. 용어 및 방법 ( Terms and Methods)
달리 기록하지 않는 한, 기술적인 용어들은 일상적인 사용법에 따라 사용된다. 분자생물학에서의 공통 용어들의 정의는 벤자민 레윈 (Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)); 켄드루 등 ((Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)); 및 로버트 A. 메여 ((Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)) 에서 찾아 볼 수 있다.
본 공개의 여러가지 실시예의 검토를 촉진하기 위하여, 특별한 용어에 대한 하기의 설명이 제공된다:
4-1BB: T 세포 수용체 (TCR)-활성화된 림프구 ((T cell receptor (TCR)-activated lymphocytes)) 및 자연 살상 세포를 포함하는 다른 세포에 의해 발현되는 동시-자극되는 분자. 4-1BB의 결찰 (ligation)은 사그날링 케스케이드 (signaling cascade)를 유도하며 이는 사이토카인 생산, 항-세포사멸 분자의 발현 및 증강된 면역 반응의 결과를 가져온다.
급성 림프모구 백혈병 (Acute lymphoblastic leukemia) (ALL): 과도한 림프아세포 생산이 특징인 급성 형태의 백혈병. ALL은 어린이에서 가장 흔하며, 나이 2-5세에서 최대이다.
항체 (Antibody): 항원의 에피톱 (epitope)을 인식하고 및 결합하는 (특이적으로 인식하고 및 결합하는 것과 같은) 가변 부위를 적어도 하나 포함하는 폴리펩티드 리간드 (polypeptide ligand). 포유류의 면역글로브린 분자는 중쇄 (H) ((heavy (H) chain) 및 경쇄 (L) ((light (L) chain))로 구성되며, 이들 각각은 가변 중 (VH) 부위 ((variable heavy (VH) region)) 및 가변 경 (VL) 부위 ((variable light (VL) region))라고 각각 불리는 가변 부위 (variable region)를 가진다. VH 부위 및 VL 부위는, 함께, 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 책임이 있다. 포유류의 면역글로블린에는 다섯가지 주된 중쇄 부류 (heavy chain classes) ((또는 동형체 (isotypes))가 있으며, 이는 항체 분자의 기능적 활성을 결정한다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 포유류에서 발견되지 않는 항체 동형체에는 IgX, IgY, IgW 및 IgNAR이 포함된다. IgY는 주로 새 및 파충류에서 생산되는 항체이며, 및 포유류 IgG 및 IgE와 기능적으로 어느정도 유사성을 가진다. IgW 및 IgNAR 항체는 연골어류 (cartilaginous fish)에서 생산되며, 반면에 IgX 항체는 양서류에서 발견된다.
항체 가변 부위는 “골조 (framework)” 부위 및 “상보성 결정 부위 “(complementarity determining regions)” 또는 “CDRs” 이라고 알려진 고가변 부위 (hypervariable regions)를 함유한다. CDRs은 항원의 에피톱에의 결합에 주로 책임진다. 항체의 골조 부위는CDRs이 3차원 공간에 자리잡고 및 정렬하도록 한다. 주어진 CDR의 아미노산 서열 경계는, 카벳 등 ((Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991; the “Kabat” numbering scheme)), 초티아 등((Chothia et al. (Chothia　and Lesk, J Mol Biol 196:901-917, 1987 ; 초티아 등 (Chothia　et al., Nature 342:877, 1989); 및 알-라지카니 등 ((Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; the “Chothia” numbering scheme) 참조)), 및 임뮤노젠틱스 데이터베이스 ((the ImMunoGeneTics (IMGT) database (Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001; the “IMGT” numbering scheme 참조))에 의해 서술된 것을 포함하는, 잘 알려진 번호부여 계획도 (numbering scheme) 여러 것들 중 어느 것을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 카벳 및 IMGT 데이터 베이스 (Kabat and IMGT databases)는 언라인 (online)으로 유지된다.
“단일-도메인 항체 (single-domain antibody)”는 추가적인 항체 도메인 없이, 항원 또는 항원의 에피톱에 특별히 결합할 수 있는 능력이 있는 단일 도메인 (가변 도메인)을 가진 항체를 의미한다. 단일-도메인 항체에는, 예를 들어, VH 도메인 항체(VH domain antibodies), VNAR 항체(VNAR antibodies), 카멜리드 VHH 항체 (camelid VHH antibodies), 및 VL 도메인 항체 (VL domain antibodies)가 포함된다. VNAR 항체들은 수염 상어 (nurse sharks), 우베공 상어 (wobbegong sharks), 곱상어(spiny dogfish) 및 죽 상어(bamboo sharks)와 같은 연골 어류에서 생산된다. 카멜리드 (Camelid) VHH 항체들은, 낙타 (camel), 라마(llama), 알파카 (alpaca), 단봉낙타(dromedary), 및 과나코 (guanaco)를 포함하는 몇 가지 종에서 생산되며, 이들은 경쇄가 자연적으로 없는 중쇄 항체를 생산한다.
“단일클론 항체 (monoclonal antibody)”는 림프구의 단일 클론 (single clone)에 의해 또는 단일 항체의 코딩 서열이 형질도입 된 세포에 의해 생산되는 항체이다. 단일클론 항체는 이 분야 기술 전문가에게 알려진 방법으로 생산된다. 단일클론 항체에는 인간화된 단일클론 항체가 포함된다.
“키메릭 항체 (chimeric antibody)”는 인간과 같은 한 종에서부터 온 골조 잔기 (framework residues), 및 다른 종으로부터의 CDRs (일반적으로 항원결합으로 언급된다)을 가진다.
“인간화 (humanized)” 항체는 인간 골조 부위 (human framework region) 및 비-인간 (예를 들어, 마우스, 토끼, 쥐, 상어, 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 또는 그 이상의 CDRs을 포함하는 면역글로불린이다. CDRs을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 “공여자 (donor)”라고 불리며, 및 골조를 제공하는 인간 면역글로불린은 “수용자 (acceptor)”로 불린다.
한 실시예에서, 모든 CDRs는 인간화된 면역글로불린에 있는 공여자 면역글로불린으로부터이다. 고정 부위 (constant regions)는 있을 필요는 없으나, 만약 있다면, 이들은 인간 면역글로불린 고정 부위와 상당히 동일하여야 만한다, 즉 적어도 85-90%, 약 95%와 같은 또는 좀더 동일 하여야 한다. 그러므로, 인간화된 면역글로불린의 모든 부분은, 가능한 한 CDRS을 제외하고, 해당하는 자연상태의 인간 면역글로불린 서열과 상당히 동일 하다. 인간화된 항체는 CDRs를 제공하는 공여자 항체와 같은 항원에 결합한다. 인간화된 또는 단일클론 항체는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 영향을 상당히 주지 않는 추가의 보존된 아미노산 치환체를 가질 수 있다.
결합 친화력 (Binding affinity): 항원에 대한 항체의 친화력. 한 실시예에서, 친화력은 프랑켈 등에 (Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 197) 의해 서술 된 스케차드 방법 (Scatchard method)을 수정하여 계산된다. 다른 실시예에서, 결합 친화력은 항원/항체 해리 비율로 측정된다. 다른 실시예에서, 높은 결합 친화력은 경쟁적 방사성면역에세이 (competition radioimmunoassay)로 측정된다. 다른 실시예에서, 결합 친화력은 ELISA로 측정된다. 다른 실시예에서, 결합 친화력은 유동 세포분석으로 측정된다. 항원 (GPC3와 같은)에 “특별히 결합하는” 항체는 항원에 높은 친화력을 가지고 결합하는 항체이며 및 다른 관계없는 항원에는 의미있게 결합하지는 않는다.
유방암 (Breast cancer): 유방, 보통 관 (duct) (젖꼭지로 우유를 전달하는 튜브) 및 소엽 (lobules) (우유를 만드는 샘) 조직에 형성되는 암의 타입. 3중 음성 유방암 (Triple negative breast cancer)은 암세포가 에스트로겐 수용체 (estrogen receptors), 프로제스트론 수용체 (progesterone receptors) 또는 상당한 수준의 HER2/neu 단백질을 발현하지 않는 암세포인 유방암의 한 타입의 의미한다. 3중 음성 유방암은 또한 ER-음성 (ER-negative) PR-음성 (PR-negative) HER2/neu음성 (HER2/neu-negative) 유방암이라고도 불린다.
화학요법 치료제 (Chemotherapeutic agent): 비정상 세포 성장의 특징이 있는 질병의 치료에 치료적으로 유용한 용도를 가진 어느 화학 물질. 그러한 질병에는 종양 (tumors), 신생물 (neoplasms), 및 암(cancer)은 물론 건선 (psoriasis)과 같은 과다형성적 성장의 특징을 가진 질병도 포함된다. 한 실시예에서, 화학요법 치료제는 방사성 화합물이다. 이 분야기술 전문가는 유용한 화학요법 치료제를 쉽게 동정할 수 있다 ((예를 들어, 슬라팩 및 쿠훼 (Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition); 페리 등 (Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., ⓒ 2000 Churchill Livingstone, Inc); 발트져 L., 베케리, R. (Baltzer, L., Berkery, R. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995); 휘셔 D.S., 노브프, M.F., 두리바게 (Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993) 참조)). 복합 화학요법치료는 암을 치료하기 위하여 하나 이상의 치료제를 투여한다. 한 실시예시는 방사성 또는 화학적 화합물과 함께 사용한 CAR T 세포의 투여이다.
키메릭 항원 수용체 (Chimeric antigen receptor) (CAR): 항원-결합 부분 (단일 도메인 항체 또는 scFv 와 같은) 및 T 세포 수용체로부터의 시그날링 도메인 (예를 들어, CD3ζ)을 포함하는 키메릭 분자. 전형적으로, CARs는 항원-결합 잔기, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 및 세포내 도메인 (intracellular domain)으로 구성된다. 세포내 도메인은 전형적으로, CD3ζ 또는 FcεRIγ와 같은 면역수용체 타이로신-근거한 활성 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif) (ITAM)를 가진 시그날링 체인 (signaling chain)을 포함한다. 어떤 경우에는, 내부도메인 (endodomain)은 더 나아가 CD28, 4-1BB (CD137), ICOS, OX40 (CD134), CD27 및/또는 DAP10와 같은 적어도 하나의 추가적인 동시-자극 도메인 (co-stimulatory domain)의 세포내 도메인을 포함한다.
담관암 (Cholangiocarcinoma): 간의 담관 벽에 있는 세포에 전개되는 암의 타입.
상보성 결정 부위 Complementarity determining region (CDR): 항체의 결합 친화력 및 특이성을 결정하는 고도가변성 (hypervariable) 아미노산 서열 부위. 포유류 면역글로블린의 경쇄 및 중쇄는 각각, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3로 지정된 세 개의 CDRs를 갖는다.
보존적 변이 (Conservative variant): “보존적 (conservative)” 아미노산 치환은, GPC3에 대한 항체와 같은, 단백질의 친화력에 상당한 영향을 주지 않거나 또는 감소시키지 않는 치환이다. 한 실시예시로, GPC3에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 최대로 약 1개, 최대로 약 2개, 최대로 약 5개, 및 최대로 약 10개, 또는 최대로 약 15개의 보존적 치환을 포함할 수 있으며 및 GPC3 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. “보존적 변이(conservative varient)”라는 용어는 또한 변이체가 활성을 유지한다면, 비-치환된 모 아미노산 (parent amino acid) 대신 치환된 아미노산을 사용함을 포함한다. 비-보존적 치환 (non-conservative substitutions)은 단백질의 활성을 감소시키는 그런 것이다.
기능적으로 비슷한 아미노산을 제공하는 보존적 (conservative) 아미노산 치환표는 비분야 기술 통상 전문가에게는 잘 알려져 있다. 하기의 여섯 그룹은 서로 간에 보존적인 치환이라고 간주되는 아미노산의 예들이다.
1) 알라닌 (Alanine) (A), 세린 (Serine) (S), 트레오닌 (Threonine) (T);
2) 아스파르틱 에시드 (Aspartic acid) (D), 글루타믹 에시드 (Glutamic acid) (E);
3) 아스파라긴 (Asparagine) (N), 글루타민 (Glutamine) (Q);
4) 아르기닌 (Arginine) (R), 라이신 (Lysine) (K);
5) 아이소루이신 (Isoleucine) (I), 루이신(Leucine) (L), 메티오닌(Methionine) (M), 발린(Valine) (V); 및
6) 페닐알라닌 (Phenylalanine) (F), 타이로신 (Tyrosine) (Y), 트립토판 (Tryptophan) (W).
여기서 어떤 실시예는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30 또는 서열번호 32에 대비하여 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이 하, 4 개 이하, 3 개 이하, 2개 이하, 또는 하나 이하의 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 제공한다.
세포독성 제제 (Cytotoxic agent): 세포를 죽이는 약물 또는 화합물.
세포독성 (Cytotoxicity): 한 생물체의 나머지 세포에는 반대로, 타겟으로 하려는 세포에 독성인 분자.
디제네레이트 변이 (퇴보성 변이) (Degenerate variant): 유전자 암호 결과 때문에 디제네레이트 서열을 포함하는 폴리 펩티드를 암호화는 폴리펩티드. 자연에는 20개의 아미노산이 있으며, 이들 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 폴리펩티드의 아미노산이 변하지 않는 한, 모든 디제네레이트 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
섬유조직형성 소원형 세포 종양 (Desmoplastic small round cell tumor) (DRCT): 어린이시절, 특히 남자아이에서 주로 일어나는 연조직 육종(사르코마). DRCT는 주로 복부에 덩어리로 나타나는 공격적이며 및 드문 타입의 암이다, 그러나 이는 또한 림프절, 복부 내벽 (lining of the abdomen), 횡경막, 비장, 간, 흉벽 (chest wall), 두개골 (skull), 척추, 장, 방광, 뇌, 폐, 고환, 난소 및 골반 에서도 발견된다.
에피톱 (Epitope): 항원성 결정인자. 이들은 항원성이 있는, 즉 특정한 면역 반응을 끌어내는 분자의 특별한 화학적 그룹 또는 펩티드 서열이다. 항체는 폴리펩티드의 특정한 항원성 에피톱에 특이적으로 결합한다.
어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma): 뼈 또는 연조직에서 발견되는 드문 타입의 악성 종양. 어윙씨 육종은 작고, 파랗고, 둥근 세포 종양이다.
골조 부위 (Framework region): CDRs 사이에 끼어 있는 아미노산 서열. 골조 부위는 가변 경 (variable light) 및 가변 중 (variable heavy) 골조 부위를 포함한다. 골조 부위는 항원 결합을 위해 CDRs을 적절한 방향으로 붙잡는 역할을 한다.
융합 단백질 (Fusion protein): 두개의 다른 (이질의) 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 단백질.
글라이피칸-2 (Glypican-2) (GPC2): GPI 앵커 (anchor)로 세포 표면에 붙는 헤파란 설페이트(HS) 프로테오글라이칸 ((heparan sulfate (HS) proteoglycans))의 6개-멤버 글라이피칸 부류 (glypican family)의 한 멤버(Filmus et al., Genome Biol 9:224, 2008). GPC2는 신경계에서 유일하게 발현되며 (Stipp et al., J Cell Biol 124:149-160, 1994), 세포 부착에 관여하며 및 축색돌기(axon)의 성장 및 유도 (guidance)를 조절하는 것으로 여겨진다. 그외에, GPC2 mRNA는 신경아세포종 (neuroblastoma) 및 다른 소아암에서 높이 발현된다 (Orentas et al., Front Oncol 2:194, 2012). GPC2 또한 세레브로글라이칸 프로테오글라이칸 (cerebroglycan proteoglycan) 및 글라이피칸 프로테오글라이칸 2 (glypican proteoglycan 2)로도 알려졌다. GPC2의 유전체, mRNA, 단백질 서열들이 공공적으로 얻을 수 있다 (예를 들어, NCBI Gene ID 221914 참조).
GPC2-양성 암 (GPC2-positive cancer): GPC2를 과발현 하는 암. GPC2-양성 암의 실시예시에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 신경아세포종 (neuroblastoma), 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 배아형 횡문근육종 (embryonal rhabdomyosarcoma), 폐포 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma), 어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma), 섬유조직형성 소원형 세포 종양 (desmoplastic small round cell tumor) 또는 골육종 (osteosarcoma)이 포함 된다.
글라이피칸-3 (Glypican-3) (GPC3): 글라이코실포스파티딜이노시톨 앵커(glycosylphosphatidylinositol anchor)로 세포 표면에 부착되어 있는 헤파란 셀페이트(HS) 프로테오글라이칸 ((heparan sulfate (HS) proteoglycans))의 글라이피칸 부류 (glypican family)의 한 멤버 (Filmus and Selleck, J Clin Invest 108:497-501, 2001). GPC3 유전자는 약 70 kD의 코아 단백질을 암호화하며, 이는 후린 (furin)에 의해 쪼개져 N-말단 40 kD 단편 및 C-말단 30 kD 단편을 생산한다. 두 개의 HS 체인은 GPC3의 C-말단 부분에 부착된다. GPC3 및 다른 글라이피칸 부류 단백질은 세포 분열 및 세포 성장 조절에 한 역할을 한다. GPC3는 HCC 및 흑색종 (melanoma), 폐의 편평상피암 (squamous cell carcinomas of the lung), 및 난소의 투명세포암 (clear cell carcinomas of the ovary)을 포함하는 인간의 다른 암에서 높이 발현 되어 있으나 (Ho and Kim, Eur J Cancer 47(3):333-338, 2011), 정상 조직에서는 발현 되지 않는다. GPC3는 또한 SGB, DGSX, MXR7, SDYS, SGBS, OCI-5, SGBS1 및 GTR2-2 라고도 알려졌다.
인간 GPC3 에는 4 개의 알려진 동형체 (isoforms)가 있다 (동형체 1-4). 4 개의 GPC3 동형체의 핵산 및 아미노산 서열이, 유전자 은행 접근 번호 (GenBank Accession numbers): NM_001164617 및 NP_001158089 (동형체 1); NM_004484 및 NP_004475 (동형체 2); NM_001164618 및 NP_001158090 (동형체 3); 및 NM_001164619 및 NP_001158091 (동형체 4)를 포함하여, 알려졌다.
GPC3-양성 암 (GPC3-positive cancer): GPC3를 과발현 하는 암. GPC3-양성 암에는, 이것에 만 국한하지 않으나, HCC, 흑색종 (melanoma), 난소 투명-세포 암 (ovarian clear-cell carcinomas), 난황 낭종암( yolk sac tumors) (YST), 신경아세포종 (neuroblastoma), 간아세포종(hepatoblastoma), 윌름씨 종양 (Wilms' tumors), 폐의 편평상피암 (squamous cell carcinoma of the lung), 고환 비정상파종성 생식세포 종양 (testicular nonseminomatous germ cell tumors), 지방육종 (liposarcoma), 자궁경부 상피내 종양 (cervical intraepithelial neoplasia), 부신의 선종 (adenoma of the adrenal gland), 신경집종 및 배아성 종양 (schwannoma and embryonal tumors) (Ho and Kim, Eur J Cancer 47(3):333-338, 2011; Baumhoer et al., Am J Clin Pathol 129(6):899-906, 2008; Saikali and Sinnett, Int J Cancer 89(5):418-422, 2000)이 포함된다.
HAMA (인간 항-쥐 항체) 반응((HAMA (human anti-murine antibody) response)): 환자에게 투여된 쥐 항체의 변이 부분 및 고정 부분에 대한 인간 개체에서의 면역 반응. 반복적인 항체 투여는 환자의 혈청으로부터의 항체 제거 비율의 증가를 초래할 수 있으며 및 또한 환자에서 알레르기 반응 (allergic reactions)을 일으킬 수 있다.
간세포암 (Hepatocellular carcinoma) (HCC): 바이러스성 간염, 간 독소 (liver toxins), 또는 간 경화 (자주 알코올 중독으로부터 야기)의 결과로부터 오는 염증성 간을 가진 환자에서 전형적으로 일어나는 간의 일차 악성 종양. HCC는 또한 악성 간암 (malignant hepatoma)으로도 불린다.
이종형질 (Heterologous): 별개의 유전적 소스 또는 종 으로부터 기원한 것.
면역 반응 (Immune response): B 세포, T 세포, 또는 단세포(monocyte)와 같은, 면역 체계 세포들의 자극에 대한 반응. 한 실시예에서는, 반응은 특별한 항원 (“항원-특이 반응 (antigen-specific response)”)에 대하여 특이적이다. 한 실시예에서는, 면역 반응은, CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응과 같은 T- 세포 반응이다. 다른 실시예에서는, 반응은 B-세포 반응이며, 및 특이적인 항체 생산의 결과를 가져온다.
분리된 (Isolated): 핵산, 단백질 (항체를 포함하는)과 같은, “분리된 (isolated)” 생물학적 성분은, 자연적으로 있는 성분들, 즉, 다른 크로모좀성 및 크로모좀-외성 DNA 및 RNA, 단백질 및 소기관이 있는 주위 환경 (세포와 같은)에 있는 다른 생물학적 성분으로부터 상당히 분리되었거나 또는 정제된 것이다. 핵산 및 단백질이 “분리되었다”는 핵산 및 단백질이 표준 정제 방법으로 정제되었음을 포함한다. 이 용어는 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되어 제조된 핵산 및 단백질은 물론 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다.
라벨 (Label): 분자의 검출을 촉진시키기 위하여, 항체 또는 단백질과 같은 다른 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물. 특이적이고, 비-제한적인 라벨의 예에는 형광 태그 (fluorescent tags), 효소적 연결체(enzymatic linkages), 및 방사성 동위원소(radioactive isotopes)가 포함된다. 한 실시예시에서, “라벨된 항체 (labeled antibody)”는 항체에 다른 분자가 병합된 것을 의미한다. 예를 들어, 라벨은 방사성으로 라벨된 아미노산의 병합 또는 마크가된 아비딘 (marked avidin)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 잔기 (biotinyl moieties)의 폴리펩티드에 붙이는 것과 같은, 검출 가능한 마커이다 ((예를 들어, 스트랩타비딘 (streptavidin) 포함하는 형광 마커 또는 광학적으로 또는 비색적 방법으로 검출될 수 있는 효소적 활성). 폴리펩티드 및 당단백질의 라벨링의 여러가지 방법들은 이 분야 기술에서 잘 알려져 있으며 및 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 라벨의 실시예시에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 다음이 포함된다: 방사성동위원소 (radioisotopes) 또는 방사성뉴클레오타이드 (radionucleotides) (35S, 11C, 13N, 15O, 18F, 19F, 99mTc, 131I, 3H, 14C, 15N, 90Y, 99Tc, 111In 및 125I과 같은), 형광 라벨 ((풀루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate) (FITC), 로다민 (rhodamine), 란타나이드 포스포아 (lanthanide phosphors) 와 같은)), 효소적 라벨 ((호스레데쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase), 베타-갈라토시데이즈(beta-galactosidase), 루시훼라제(luciferase), 알카라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)와 같은)), 화학발광 마커(chemiluminescent markers), 바이오티닐 그룹 (biotinyl groups), 2차 리포터에 의해 인식되는 미리결정된 폴리펩티드 에피톱 (predetermined polypeptide epitopes recognized by a secondary reporter) ((루이신 짚퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequences), 2차 항체를 위한 결합부위 (binding sites for secondary antibodies), 금속 결합 도메인 (metal binding domains), 에피톱 태그(epitope tags)와 같은)), 또는 가도리니움 킬레이트(gadolinium chelates)와 같은 자석 제제(magnetic agents). 어떤 실시예에서는, 라벨은 잠재적인 입체 방해를 감소시키기 위해 여러가지 길이의 간격자 팔 (spacer arms)이 부착된다.
링커 (Linker): 어떤 경우에, 링커는 항체결합 단편 내의 펩티드이며 (Fv 단편과 같은) 이는 가변 중쇄를 가변 경쇄에 간접적으로 붙이는 역할을 한다. “링커 (Linker)”는 또한 항체와 같은, 타겟팅 잔기를 세포 독소(cytotoxin) 또는 검출가능한 라벨 (detectable label)과 같은, 효능 분자 (effector molecule)에 연결하도록 하는 펩티드를 의미할 수도 있다.
“접합하는 (conjugating),” “붙이는 (joining),” “결합하는 (bonding)” 또는 “연결하는 (linking)”이라는 용어는 두 개의 폴리펩티드를 하나의 연속적인 폴리펩티드 분자로 만들거나, 또는 공유적으로 방사성핵종 (radionuclide) 또는 다른 분자를 scFv와 같은 폴리펩티드에 붙이는 것을 의미한다. 특별한 문맥에서, 이 용어들은 항체와 같은 잔기인, 리간드를 효능 분자에 연결하는 의미를 포함한다. 연결은 화학적인 방법 또는 재조합적인 방법에 의할 수 있다. “화학적인 방법 (chemical means)”은 항체 잔기와 효능 분자사이에 반응으로 두 분자사이에 공유결합이 형성되어 한 분자가 형성되는 것을 의미한다.
폐암 (Lung cancer): 폐의 조직에서, 보통 공기 통과 내벽의 세포에, 형성되는 암. 두가지 주 타입은 소 세포 폐암 (small cell lung cancer) 및 비-소 세포 폐암 (non-small cell lung cancer) (NSCLC)이다. 이들 타입은 현미경 하에서 어떻게 보이는가에 근거하여 진단된다.
포유류 (Mammal): 이 용어는 인간 및 비-인간 포유류 둘 다 포함된다. 비슷하게, 개체(subject)” 라는 용어는 인간 및 수의과적 개체 둘 다 포함된다.
흑색종 (Melanoma): 멜라닌세포 (melanocytes) (멜라닌 색소를 만드는 세포)에 기원하는 암의 형태. 멜라닌세포는 주로 피부에서 발견되나, 또한 장 및 눈에도 존재한다. 피부의 흑색종에는 얇은 확산 흑색종 (superficial spreading melanoma), 결절 흑색종 (nodular melanoma), 말단 흑자흑색종 (acral lentiginous melanoma), 및 악성 흑색종 (lentigo maligna) (melanoma)이 포함된다. 상기 어느 타입도 멜라닌을 생산할 수 있거나 또는 무멜라닌적이 될 수 있다. 비슷하게, 어느 서브타입도 섬유조직형성 (향신경성으로 두꺼운 섬유 적인 반응)을 보일 수 있으며 이는 공격적인 행위의 마커이며 및 국부적으로 재발하는 경향이 있다. 다른 흑색종에는 투명 세포 육종 (clear cell sarcoma), 점막의 흑색종 (mucosal melanoma) 및 포도막 흑색종 (uveal melanoma)이 포함된다.
메소텔린 (Mesothelin): 40 kDa의 세포-표면의 글라이코실포스파티딜이노시톨 (GPI)-연결된 당단백질 ((glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked glycoprotein)). 인간 메소텔린 단백질은 70 kD 전구체로서 합성되고 이는 단백질가수분해로 처리된다. 메소텔린의 30 kD 아미노 말단은 분비되고 및 다형핵거대세포 증강 인자 (megakaryocyte potentiating factor) (Yamaguchi et al., J. Biol. Chem. 269:805 808, 1994)로 불린다. 40 kD 카복실 말단은 성숙된 멜소텔린으로서 막에 결합된 채로 남아 있다 (Chang et al., Natl. Acad. Sci. USA 93:136 140, 1996). 예시적인 메소텔린의 핵산 및 아미노산 서열은 PCT Publication No. WO 97/25,068; U.S. Patent No. 6,083,502; Chang and Pastan, Int. J. Cancer 57:90, 1994; Chang and Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:136, 1996; Brinkmann et al., Int. J. Cancer 71:638, 1997; 및 Chowdhury et al., Mol. Immunol. 34:9, 1997에 서술되어 있는 대로이다. 메소텔린은 세포내에는 물론이고 분비되고 및/또는 분리된 세포외 메소텔린 단백질으로 남아있는 메소텔린 단백질 또는 폴리펩티드로 불린다.
메소텔린-양성 암 (Mesothelin-positive cancer): 메소텔린을 과발현 하는 암. 메소텔린-양성 암에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 중피종 (mesothelioma), 전립선 암 (prostate cancer), 폐암 (lung cancer), 위암 (stomach cancer), 편평상피 암 (squamous cell carcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 3 중 음성 유방암 (triple negative breast cancer) 및 난소 암 (ovarian cancer)이 포함된다.
중피종 (mesothelioma): 내장을 덮는 두꺼운 시트 (sheet) 같이 자라는 흉막 및 복막의 내층 세포로부터 유래한 신종양의 한 타입이며 및 방추 세포 (spindle cells) 또는 입방세포 (cuboidal cells)로 라인된 (lined) 분비기관 모양의 공간을 포함할 수 있는 섬유성 조직 (fibrous tissue)으로 구성된다. 중피종은 자주 폐, 심장 또는 복부를 덮는(lining) 조직에서 기원한다. 어떤 경우에는, 중피종은 석면 노출이 원인이 된다.
신조직형성, 악성종양, 암 또는 종양 (Neoplasia, malignancy, cancer or tumor): 신생물 (neoplasm)은 과도한 세포 분열의 결과로 온 조직 또는 세포의 과도한 성장이다. 신생적 성장은 종양을 생산할 수 있다. 각 개인에서 종양의 양은 “종양 부담(tumor burden)” 이며 이는 종양의 수, 부피 또는 무게로 측정될 수 있다. 전이되지 않은 종양은 “양성 (benign)”을 의미한다. 주변 조직으로 침투한 종양 및/또는 전이될 수 있는 종양은 “악성 (malignant)”을 의미한다.
신경아세포종 (neuroblastoma): 배아 신경 크레스트 세포 (embryonic neural crest cells)로부터 일어나는 고형 종양이다. 신경아세포종은 보통 부신 (adrenal glands) 내 및 주변에서 일어나지만, 복부(abdomen), 가슴 (chest), 목 (neck) 또는 척추 근처의 신경 조직(nerve tissue near the spine)과 같은 교감 신경 조직이 발견되는 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 신경아세포종은 전형적으로 5 세 이하의 어린이들에서 일어난다.
작동가능하게 연결된 (Operably linked); 첫 번째 핵산 서열이 기능적인 상관관계에서 두 번째 핵산 서열에 놓여 졌을 때 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 만약 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면 이 프로모터는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며 및, 두 단백질-코딩 부위 연결이 필요한 곳에서는, 같은 리딩 프레임이다.
골육종 (Osteosarcoma): 뼈에서 발견되는 암적인 종양 타입. 골육종은 간엽 세포 기원의 원시적으로 변환된 세포로부터 일어나는 공격적인 암이다. 이 타입의 암은 어린이와 ??은 층 어른에서 가장 흔하다.
난소암 (Ovarian cancer): 난소 (난자, 또는 에그가 형성되는 여성의 생식 샘 쌍 중에 하나)의 조직에서 형성되는 암. 대부분의 난소암은 난소 상피세포 암종 (난소의 표면의 세포에서 시작하는 암) 또는 악성 생식세포 암 (에그 세포에서 시작되는 암)이다.
난소 투명 세포 암종 (Ovarian clear cell carcinoma): 상피세포 난소 암중 난소 악성 종양의 5% 미만으로 일어나는 뚜렷한 조직병리학적 아형. 현미경 하에서 볼 때, 이런 타입의 종양의 세포 내부는 투명하게 보인다.
췌장 암 (Pancreatic cancer): 췌장의 조직에서 악성 (암) 세포가 발견되는 질병. 외분비 암이라고도 불린다.
소아 암 (Pediatric cancer): 어린이 나이 0세에서 14세에서 일어나는 암. 소아암의 주된 타입에는, 예를 들어, 신경아세포종 (neuroblastoma), 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia) (ALL), 배아형 횡문근육종 (embryonal rhabdomyosarcoma) (ERMS), 폐포 횡문근육종 (alveolar rhabdomyosarcoma) (ARMS), 어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma), 섬유조직형성 소 원형 세포 종양 (desmoplastic small round cell tumor) (DRCT), 골육종 (osteosarcoma), 뇌 및 다른 CNS 종양 (brain and other CNS tumors), 윌름씨 종양 (Wilm’s tumor), 비-호츠킨스 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 및 망막아종 (retinoblastoma)이 포함된다.
약학적 제제 (Pharmaceutical agent): 개체 또는 세포에 적절히 투여되었을 때 바람직한 치료적 또는 예방적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물.
약학적으로 허용 가능한 담체 (Pharmaceutically acceptable carriers): 유용할 만한 약학적으로 허용 가능한 담체 (carrier)는 전통적인 것이다. 레밍톤의 약학적 과학 ( Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975) 에서는 여기서 공개되는 조성물의 약학적인 전달에 적절한 조성물 및 제형을 서술하고 있다.
일반적으로, 담체의 성질은 적용되는 투여의 특정한 방법에 의존될 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 보통, 물, 생리 식염수, 균형된 염 용액, 수용성 덱스트로즈, 글리세롤 및 이와 비슷한 매체 (vehile)와 같은 약학적 및 생리적으로 수용가능한 액체를 포함하는 주사가능한 액체를 포함한다. 고체 조성물 (분말, 환, 타블렛, 또는 캡슐 형태)을 위하여, 전통적인 비-독성 고체 담체에는, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨(mannitol), 락토즈 (lactose), 전분 (starch), 또는 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate)가 포함될 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 추가하여, 투여될 약학적 조성물은 미량의, 습윤 또는 유화제, 방부제, 및 pH 버퍼링 제제 및 이와 비슷한 것, 예를 들어, 소듐 아세테이트 (sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트 (sorbitan monolaurate)와 같은 비-독성 보조물질을 포함할 수 있다.
질병의 예방, 치료 또는 완화 (Preventing, treating or ameliorating a disease): 질병의 “예방 (Preventing)”은 질병의 완전 전개를 억제함을 의미한다. “치료 (Treating)”는 질병이 전개되기 시작한 후에, 종양 부담의 감소 또는 전이 (metastases) 크기의 수 감소와 같은, 질병의 징후 또는 증상 또는 병리적 컨디션을 완화시키는 치료적 중재를 의미한다. “완화(Ameliorating)”는 암과 같은 질병의 징후 또는 증상의 수 또는 심각도의 감소를 의미한다.
전립선 암 (Prostate cancer): 전립선 (prostate) (방광 아래 및 직장 앞에서 발견되는 남성 생식계에 있는 샘)의 조직에 형성되는 암, 전립선 암은 보통 노인 남성에서 일어난다.
정제된 (Purified): 정제된이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하는 것은 아니다; 오히려, 이는 상대적인 용어를 의도한다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 펩티드 제제는 세포내 자연적인 환경에 있는 펩티드 또는 단백질 보다 좀더 강화되어 있는 펩티드 또는 단백질이 있는 그런 것이다. 한 실시예에서, 한 제제는 단백질 또는 펩티드가 그 제제의 총 펩티드 또는 단백질 함량의 적어도 50%를 대표하도록 정제된다. 상당한 정제는 다른 단백질 또는 세포 성분으로부터 정제됨을 나타낸다. 상당히 정제된 단백질은 적어도60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 순수하다. 그러므로, 한 특정한, 비-제한적인 실시예시에서, 상당히 정제된 단백질은 다른 단백질 또는 세포 성분이 90%는 없는 것이다.
재조합 (Recombinant): 재조합 핵산은 자연적으로 일어나는 것이 아닌 서열을 갖거나 또는 달리 떨어져 있는 두 단편의 서열의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 가진 서열이다. 이 인공적 조합은 자주 화학적 합성에 의해서 성취되거나 또는 분리된 핵산 단편을, 예를 들어, 유전공학적 기술에 의해, 인공적으로 조작하여 성취된다.
횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma) (RMS): 골격근에 기원한 연조직 악성 종양. 횡문근육종의 가장 흔한 주된 부위는 머리와 목 ((예를 들어, 뇌척수막외 (parameningeal), 궤도(orbit), 인두 (pharyngeal) 등)), 비뇨 생식관 (genitourinary tract), 및 사지 (extremities)이다. 다른 덜 흔한 주된 부위는 몸통 (trunk), 가슴 벽 (chest wall), 복부 (abdomen) ((복막후강 (retroperitoneum) 및 담도(biliary) 관을 포함하는)), 및 회음/항문 부위 (perineal/anal region)를 포함한다. 적어도 두가지 타입의 RMS가 있다; 가장 흔한 형태는 폐포 (alveolar) RMS (ARMS) 및 배아성 조직학적 (embryonal histological) RMS (ERMS)이다. 횡문근육종을 가진 어린이들의 대략 20%는 ARMS 아형타입이다. 이 아형타입의 빈도의 증가가 사춘기에서 주목되었으며 및 주된 부위가 사지, 몸통, 및 회음/항문 부위가 관여하는 환자에서 주목되었다. ARMS는 크로모좀 13에 있는FKHR 및 PAX family 멤버가 관련되는 융합된 유전자를 암호화하는 크로모좀 전좌 (chromosomal translocations)와 연관된다. 배아성 아형은 어린이들에서 가장 자주 관찰되는 아형으로 어린시절의 횡문근육종의 대략 60-70%에 해당한다. 배아성 조직을 가진 종양은 어느 주 부위 (primary site)에서 일어날 수 있으나, 전형적으로 머리와 목 부위 또는 비뇨생식기 관에서 일어난다. ERMS는 진단되는 나이가 좀더 어리고, 이형성의 손실, 및 변경된 유전체 각인 (genomic imprinting)의 특징이 있다.
샘플 (또는 생물학적 샘플) ((Sample (or biological sample)): 개체로부터 얻은 유전체 DNA, RNA (mRNA 포함), 단백질 또는 이들의 조합을 함유하는 생물학적 표본. 실시예시에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 말초 혈액 (peripheral blood), 조직, 세포, 소변, 타액, 조직 생검 (tissue biopsy), 정밀 주사바늘 흡입물 (fine needle aspirate), 외과적 표본 (surgical specimen), 및 부검 재료 (autopsy material)가 포함된다. 한 실시예시에서, 샘플은 종양 조직 생검과 같은 종양 생검을 포함한다.
서열 상동성 (Sequence identity): 두 아미노산 또는 핵산 서열 사이에 유사성 (similarity)은 두 서열사이의 유사성 (similarity)의 용어로 표현되며, 그렇지 않으면 서열 상동성으로 불린다. 서열 상동성은 자주 퍼센트 상동성 ((또는 유사성 (similarity)또는 호모로지(homology))의 용어로 측정된다; 퍼센트가 더 높을수록 두 서열은 더 유사하다. 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 호모로그 (homologs) 또는 변이체 (variants)는 표준 방법을 사용하여 병렬 (alined) 시켰을 때 상대적으로 높은 정도의 서열 상동성을 소유할 것이다.
비교를 위해 서열을 병렬하는 방법은 이 분야 기술에서 잘 알려져 있다. 여러가지 프로그램 및 병렬 알고리즘은: 스미스 및 워터만 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981); 니들만 및 운쉬 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970); 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988); 히긴스 및 샵 (Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988); 히긴스 및 샵 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989); 코르펫 등(Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988); 및 피어슨 및 리프만 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988)에 서술되어 있다. 알트슐 등은 (Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994), 서열 병렬 방법 (sequence alignment methods) 및 호모로지 계산 (homology calculations)의 상세한 고려점을 제시한다.
NCBI의 기본 국소 병렬 탐색 툴(NCBI Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990)이 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx과 연결하여 사용을 위해 국가 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷을 포함하는 여러 소스로부터 얻을 수 있다. 이 프로그램을 사용하여 서열 상동성을 어떻게 결정하는가에 대한 서술은 인터넷상에서 NCBI 웹사이트에서 얻을 수 있다.
GPC3 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 VL 또는 VH의 호모로그 (상동체) 및 변이체는, NCBI 블라스트 2.0 (NCBI Blast 2.0), 디폴트 계수 대한 갭된 블라스트피 세트 (gapped blastp set to default parameters)를 사용하여 항체의 아미노산 서열에 대해 전장 병렬로 세었을 때 전형적으로 적어도 약 75%, 예를 들어, 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 소유하는 특징을 가진다. 30 아미노산 서열보다 큰 아미노산의 비교를 위해, 디폴트 계수에 대하여 디폴트 BLOSUM62 매트릭스세트 (default BLOSUM62 matrix set) ((갭 존재 비용 11, 잔기 갭 당 비용 1 (gap existence cost of 11, and a per residue gap cost of 1))를 사용하여 블라스트 2 서열 기능 (Blast 2 sequences function)이 적용되었다. 짧은 펩티드(대강 30 아미노산 이하)를 병렬할 때는, 디폴트 계수에 대하여 PAM30 매트릭스 세트 (PAM30 matrix set) ((열린 갭 9, 연장 갭 1 페널티 (open gap 9, extension gap 1 penalties))를 적용하여, 블라스트 2 서열 기능을 사용하여 수행되었다. 참조 서열과 좀 더 큰 유사성을 가진 단백질을 이 방법으로 평가하였을 때, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성과 같은, 증가되는 퍼센트 상동성을 보여줄 것이다. 전체 서열보다 적은 서열이 서열 상동성을 위해 비교 될 때는, 호모로그 및 변이체는 10-20 아미노산의 짧은 윈도우에 대하여 전형적으로 적어도 80% 서열 상동성을 소유할 것이며, 및 참조 서열과의 유사성에 따라 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 서열 상동성을 소유할 수 있다. 그러한 짧은 윈도우에 걸친 서열 상동성을 결정하는 방법은 인터넷 상에서 NCBI 웹사이트 (website)에서 얻을 수 있다. 이 분야 기술 전문가는 이러한 서열 상동성 범위가 단지 지표를 제공할 뿐이라는 것을 알 것이다; 제공된 범위 밖에 있는 것에서도 강하게 의미 있는 호모로그가 얻어질 수 있다는 것이 전적으로 가능하다.
편평상피세포 암 (Squamous cell carcinoma): 피부, 눈, 여러가지 내부 기관, 및 속이 빈 기관 (hollow organ) 및 어떤 분비샘 (gland) 관의 내벽의 표면을 형성하는 편평상피세포, 얇고, 평편한 세포에서 기원한 암의 유형. 편평상피세포 암은 또한 표피모양 암 (epidermoid carcinoma) 으로도 불린다. 편평상피세포 암의 한 유형은 폐의 편평상피 세포 암이다. 편평상피세포 암은 피부암에서 가장 흔한 유형이다.
위암 (Stomach cancer): 위 내벽 조직에서 형성되는 암. 또한 가스트릭 켄서 (gastric cancer)라고도 불린다.
개체 (Subject): 살아있는 다-세포 척추 생물체로, 인간 및 비-인간 포유류를 포함하는 인간 및 수의과적 개체 둘 다를 포함하는 카테고리.
합성적 (Synthetic): 실험실에서 인공적인 방법으로 생산되는 것으로, 예를 들어 합성 핵산 또는 단백질 (예를 들어, 항체)은 실험실에서 화학적으로 합성될 수 있다.
치료적으로 효과적인 양 (Therapeutically effective amount): 치료할 개체에서 바람직한 효과를 달성하기에 충분한 특정한 물질의 양. 예를 들어, 이는 종양의 성장을 방해 또는 억제하는데 필요한 양이 될 수 있다. 한 실시예에서, 치료적으로 효과적인 양은 종양을 제거하거나, 크기를 줄이거나, 또는 전이를 예방하는데 필요한 양이다. 개체에게 투여될 때는, 용량은 일반적으로 바람직한 실험관 내 효과를 보여준 타겟 조직 농도 (예를 들어, 종양에서)를 달성할 양이 사용될 것이다.
벡터 (Vector): 숙주 세포에 도입되는 것으로서의 핵산 분자로, 이로써 형질전환 된 숙주세포가 생산된다. 벡터는 복제 기원점과 같은, 숙주 세포에서 이의 복제를 허락하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 또는 그 이상의 선택 마커 유전자 및 이 분야 기술에서 알려진 다른 유전적 요소들을 포함할 수 있다.
달리 설명되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 이 공개가 속하는 기술 분야의 통상 전문가 중 하나에 의해 공통으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 단수 용어 a,” “an,” 및 “the”는 달리 내용에서 명확하게 제시하지 않는 한, 복수의 관계항을 포함한다. “A 또는 B를 포함한다 (Comprising A or B)”는 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 이는 더 나아가, 핵산 또는 폴리펩티드에 주어진, 모든 염기 크기 및 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이라는 것이 이해되어야 하며, 및 서술을 위해 제공된다. 여기서 서술된 것과 비슷하거나 또는 똑같은 방법 및 재료들이 본 공개를 실시하거나 또는 테스트하기 위하여 사용될 수 있다 하더라도, 적절한 방법 및 재료들이 하기에 서술된다. 모든 논문, 특허 출원서, 특허, 및 여기서 언급된 다른 참고문헌들은 그 전문이 참고문헌으로 병합되었다. 분쟁이 있을 경우, 용어의 설명을 포함한, 현재의 설명서가 조절할 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 실시예시는 단지 보여주기 위한 것일 뿐이며 및 제한하려는 의도는 아니다.
III. 몇가지 실시예의 요약 (Overview of Several Embodiments)
여기서 공개되는 것은 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 상피 성장 인자 수용체 (human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt) 둘 다를 암호화하는 핵산 분자이다. 암호화하는 CARs 은 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region), 막 통과 부위 (transmembrane region), 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain) 및 세포내 시그날 도메인 (intracellular signaling domain)에 융합된 종양 항원-특이 단일클론 항체를 포함한다. huEGFRt는 두 개의 EGFR 세포외 도메인 (도메인 III 및 도메인 IV) 및 막통과 도메인을 포함하나, 두 개의 막에서 먼 세포외 도메인 (membrane distal extracellular domains) (도메인 1 및 도메인 II) 및 모든 세포내 도메인 ((막 인접 도메인 (juxtamembrane domain), 타이로신 키나제 도메인 t(yrosine kinase domain) 및 C-말단 꼬리 (C-terminal tail))은 없다. 공개되는 CARs 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 T-림프구와 같은 분리된 세포도 또한 제공된다. CAR 구조물로 형질도입된 T-세포는 암 면역치료제로서 사용될 수 있다.
여기서 제공되는 것은 CAR 및 huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자이다. 어떤 실시예에서, 핵산 분자에는 5' 에서 3' 방향으로 첫 번째 시그날 서열(first signal sequence)을 암호화 하는 핵산; 항원-특이 항체(antigen-specific antibody) 또는 이의 항원-결합 단편 (antigen-binding fragment)을 암호화 하는 핵산;세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)를 암호화 하는 핵산; 막통과 도메인(transmembrane domain)을 암호화 하는 핵산; 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)을 암호화 하는 핵산 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 암호화 하는 핵산; 자가-절단 2A 펩티드 (self-cleaving 2A peptide)를 암호화 하는 핵산; 두 번째 시그날 서열(second signal sequence)을 암호화하는 핵산; 및 huEGFRt를 암호화 하는 핵산을 포함한다.
첫 번째 및 두 번째 시그날 (신호) 서열은 이 분야 기술에서 알려진 어느 적절한 신호 서열이 될 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 시그날 (신호) 서열은 같은 신/호 서열이 될 수 있거나 또는 다른 신호 서열이 될 수 있다. 어떤 실시예에서, 첫 번째 및/또는 두 번째 시그날 (신호) 서열은 과립대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열(granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss) 이다.
어떤실시예에서, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)은 CD8α힌지 부위 (CD8αhinge region), CD28 힌지 부위 또는 IgG1, IgG4 또는 IgD와 같은 다른 면역글로블린 분자로부터의 서열 (예를 들어, 면역글로블린 분자로부터의 CH2 및/또는 CH3 도메인)을 포함한다. 힌지 부위 (hinge region)는 이 분야기술에서는 때로는 “공간 부위 (spacer region)”를 의미한다.
어떤 실시예에서, 막통과 도메인 (transmembrane domain)은 CD8α CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154 막통과 도메인을 포함한다. 막통과 도메인은 또한 T 세포 수용체의 알파(alpha), 베타 (beta) 또는 제타 (zeta) 체인 (chain)의 막통과 도메인 부위일 수 있다.
어떤 실시예에서, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB (CD137, TNFRSF9), CD28, ICOS, OX40 (CD134), CD27, CD30, CD40, PD-1, 림프구 기능-연관된 항원 1 (lymphocyte function-associated antigen 1) (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 또는 DAP10 동시-자극 도메인 (DAP10 co-stimulatory domain)을 포함한다. 어떤 실시예에서, 세포내 동시-자극 도메인은 4-1BB 및 CD28를 포함한다.
어떤 실시예에서, 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 면역수용체 타이로신-근거한 활성 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) (ITAM)를, 예를 들어, CD3ζ또는 FceRIγ시그날링 도메인(CD3 signaling domain)을, 가진 도메인이다.
한 특정한 실시예시에서, 첫 번째 및 두 번째 시그날 (신호) 서열은 GMCSFRss를 포함하고, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)는 CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region)를 포함하고, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 은 CD8α 막통과 도메인을 포함하고, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 포함하고, 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3ζ 시그날링 도메인 (CD3z signaling domain)을 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD8α 힌지를 암호화하는 핵산은 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, CD8α 힌지를 암호화하는 핵산은 서열번호 3의 서열을 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD8α막통과 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 5와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, CD8α막통과 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호 5의 서열을 포함한다.
어떤 실시예시에서, 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 7과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 4-1BB 동시-자극 도메인 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 7의 서열을 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD3z ζ시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)을 암호화하는 핵산은 서열번호 9와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, CD3z 시그날링 도메인 암호화하는 핵산은 서열번호 9의 서열을 포함한다.
어떤 실시예시에서, 첫 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 및 두 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 각각은 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 첫 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 및 두 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 각각은 핵산은 서열번호 1의 서열을 포함한다.
어떤 실시예시에서, 자가-절단 2A 펩티드는 도세아 아시그나 바이러스 2A (thosea asigna virus 2A) (T2A) 펩티드이다. 다른 실시예시에서, 자가-절단 2A 펩티드는 족구 질병 바이러스 2A (foot and mouth disease virus 2A) (F2A) 펩티드, 말 비염A 바이러스 2A (equine rhinitis A virus 2A)(E2A) 펩티드, 또는 돼지 태초바이러스-1 2A (porcine teschovirus-1 2A)(P2A) 펩티드이다. 특정한 실시예시에서, 자가-절단 T2A 펩티드를 임호화하는 핵산은 서열번호 11과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 자가-절단 T2A 펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 11의 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, huEGFRt를 암호화하는 핵산은 서열번호 13 과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, huEGFRt를 암호화하는 핵산은 서열번호 13의 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서, 핵산분자는 더 나아가 첫 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산의 5’에 인간 연장 인자 1α(human elongation factor 1α)(EF1a) 프로모터 서열을 포함한다. 그러나, 어느 적절한 프로모터 서열이든 이 분야 기술 전문가에 의해 선택될 수 있다.
어떤 실시예에서, 항원-결합 단편은 단일-체인 가변 단편 (single-chain variable fragment)(scFv) 또는 단일-도메인 항체이다.
어떤 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 특별히 종양 항원에 결합한다. 특별한 실시예시에서, 종양 항원은 GPC3, GPC2 또는 메소텔린(mesothelin) 이다.
종양 항원이 GPC3인 어떤 실시예에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 25 (hYP7 VH 도메인 뉴크레오타이드 서열)의 가변 중 (VH) 도메인 ((variable heavy (VH) domain)) 상보성 결정 부위 1 (complementarity determining region 1) (CDR1), CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함하며 및 서열번호 27의 (hYP7 VL 도메인 뉴크레오타이드 서열) 가변 경 (VL) 도메인 ((variable light (VL) domain)) CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특정한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 25의 91-105, 148-204 및 301-318 뉴클레오타이드를 포함하고; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 27의 70-120, 166-186 및 283-309 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 25의 76-99, 151-180 및 295-318 뉴클레오타이드를 포함하고; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 27의 79-114, 166-174 및 283-309를 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 72-807 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
종양 항원이 GPC3인 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 29 ((HN3 단일-도메인 항체 (HN3 single-domain antibody) 뉴클레오타이드 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 29의 91-105, 148-195 및 286-315 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 29의 76-99, 151-171 및 286-315를 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 17의 73-420 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또 다른 실시예시에서, 종양 항원이 GPC3 일 때, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은, 그 전문이 참고문헌에 병합되어 있는 WO 2013/181543 또는 WO 2012/145469에 공개된, GPC3-특이 단일클론 항체의 CDR 핵산 서열을 포함한다.
종양 항원이 GPC2인 어떤 실시예에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 31 ((LH7 단일-도메인 (LH7 single-domain) 항체 뉴크레오타이드 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 91-105, 148-195 및 286-327을 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 76-99, 151-171 및 286-327을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 19의 뉴클레오타이드 73-432 서열을 포함한다.
종양 항원이 GPC2인 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 33 ((LH4 단일-도메인 (LH4 single-domain) 항체 뉴크레오타이드 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 33의 뉴클레오타이드 91-105, 148-195 및 286-327를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 33의 뉴클레오타이드 76-99, 151-171 및 286-327을 포함한다
종양 항원이 GPC2인 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 35 ((LH6 단일-도메인 (LH6 single-domain) 항체 뉴크레오타이드 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 35의 뉴클레오타이드 91-105, 148-198 및 289-330를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 35의 뉴클레오타이드 76-99, 151-174 및 289-330를 포함한다.
또 다른 실시예시에서, 종양 항원이 GPC2 일 때, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 리 등에서 (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32): E6623-E6631, 2017) 공개된 GPC2- 특이 단일클론 항체의 CDR 핵산 서열을 포함한다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인 어떤 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 37 (YP218 VH 도메인 뉴크레오타이드 서열)의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함하며 및 서열번호 39 (YP218 VL 도메인 뉴크레오타이드 서열)의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 37의 뉴클레오타이드 91-108, 101-204 및 298-36? 포함하며; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 39의 뉴클레오타이드 70-102, 148-168 and 265-303를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 37의 뉴클레오타이드 79-102, 154-177 및 292-336을 포함한다; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 39의 뉴클레오타이드 79-96, 148-156 및 265-303을 포함한다.
다른 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 37의 뉴클레오타이드 79-102, 154-177 및 292-336을 포함하고; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열번호 39의 뉴클레오타이드 79-96, 148-156 및 265-303를 포함한다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열 번호 41 (SD1 단일-도메인 항체 뉴크레오타이드 서열)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 41의 뉴클레오타이드 91-105, 151-198 및 295-306를 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열은 각각 서열 번호 41의 뉴클레오타이드 78-105, 151-174 및 289-309를 포함한다. 더 나아가 여기서 제공하는 것은 여기서 공개되는 CAR-암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터이다. 어떤 실시예에서, 벡터는, 이것에 만 국한하지 않으나, 렌티바이리스 벡터 (lentiviral vector) 와 같은, 바이러스성 벡터이다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인 또 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은, 각각 그 전문이 참고문헌에 병합되어 있는, WO 2014/031476, WO 2014/052064, U.S. 특허 No. 8,460,660, U.S. 특허 No. 6,809,184 또는 U.S. 특허 No. 7,081,518에 공개된, 메소텔린-특이 단일클론 항체의 CDR 핵산 서열을 포함한다.
또한 제공되는 것은 여기서 공개되는 CAR-암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이다. 어떤 실시예에서, 분리된 숙주세포는 T 림프구이다.
본 공개는 더 나아가 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 상피 성장인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 동시-발현하는 숙주 세포를 제공한다. 어떤 실시예에서, CAR는 항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region), 막통과 도메인 (transmembrane domain), 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain) 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 포함한다; 및/또는 huEGFRt는 도메인 III 및 도메인 IV 및 인간 EGFR으로부터의 막통과 도메인을 포함하나, 상피 성장 인자(EGF)-결합 도메인 및 세포내 도메인 (cytoplasmic domain)은 포함하지 않는다.
어떤 실시예에서, 세포외 힌지 부위는 CD8a 힌지 부위 (CD8αhinge region), CD28 힌지 부위 또는 IgG1, IgG4 또는 IgD와 같은 다른 면역글로블린 분자로부터의 서열 (예를 들어, 면역글로블린 분자로부터의 CH2 및/또는 CH3 도메인)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 막통과 도메인 (transmembrane domain)은 CD8α CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154 막통과 도메인을 포함한다. 막통과 도메인은 또한 T 세포 수용체의 알파(alpha), 베타 (beta) 또는 제타 (zeta) 체인 (chain)의 막통과 도메인 부위일 수 있다.
어떤 실시예에서, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB (CD137, TNFRSF9), CD28, ICOS, OX40 (CD134), CD27, CD30, CD40, PD-1, 림프구 기능-연관된 항원 1 (lymphocyte function-associated antigen 1) (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 또는 DAP10 동시-자극 도메인 (DAP10 co-stimulatory domain)을 포함한다.
어떤 실시예에서, 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 ITAM를, 예를 들어, CD3zζ 또는 FceRIγ 시그날링 도메인을 가진 도메인이다.
특별한 실시예에서, 세포외 힌지 부위는 CD8α힌지 부위를 포함하고, 막통과 도메인은 CD8α막통과 도메인을 포함하고, 세포내 동시-자극 도메인은 4-1BB 동시-자극 도메인을 포함하고 및 세포내 시그날링 도메인은 CD3ζ시그날링 도메인을 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD8α힌지 부위의 아미노산 서열은 서열번호 4 와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다: 특정한 실시예시에서, CD8α 힌지 부위의 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD8α 막통과 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 6와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정한 실시예시에서, CD8a 막통과 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 6를 포함한다.
어떤 실시예시에서, 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)의 아미노산 서열은 서열번호 8과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정한 실시예시에서, 4-1BB 동시-자극 도메인 아미노산 서열은 서열번호 8을 포함한다.
어떤 실시예시에서, CD3ζ시그날링 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 10와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특정한 실시예시에서, CD3ζ시그날링 도메인 아미노산 서열은 서열번호 10을 포함한다.
어떤 실시예시에서, huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일 하다. 특정한 실시예시에서, huEGFRt 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함한다.
어떤 실시예에서, 항원-결합 단편은 scFv 또는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody) 이다.
어떤 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 종양 항원에 특정하게 결합한다. 어떤 실시예시에서, 종양 항원은 GPC3, GPC2 또는 메소텔린(mesothelin) 이다.
종양 항원이 GPC3인 어떤 실시예에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 26 (hYP7 VH 도메인)의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며 및 서열번호 28의 (hYP7 VL 도메인)의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특정한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 26의 31-35, 50-68 및 101-106 잔기를 각각 포함하고; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 28의 24-40, 56-62 및 95-103 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 26의 26-33, 51-60 및 99-106 잔기를 각각 포함하고; 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 28의 27-38, 56-58 및 95-103 잔기를 각각 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 16의 25-269 잔기를 포함한다.
종양 항원이 GPC3인 다른 실시예에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 30 ((HN3 단일-도메인 항체 서열)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 30의 31-35, 50-65 및 96-105 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 30의 26-33, 51-57 및 96-105 잔기를 각각 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18의 25-140 잔기를 포함한다.
또 다른 실시예시에서, 종양 항원이 GPC3 일 때, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은, 그 전문이 참고문헌에 병합되어 있는 WO 2013/181543 또는 WO 2012/145469에 공개된, GPC3-특이 단일클론 항체의 CDR 서열을 포함한다.
종양 항원이 GPC2인 어떤 실시예에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 32 (LH7 단일-도메인 항체 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 32의 26-33, 51-57 및 96-109 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 32의 31-35, 50-65 및 96-109 잔기를 각각 포함한다. 한 비-제한적인 실시예시에서, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 20의 25-144 잔기를 포함한다.
종양 항원이 GPC2인 다른 실시예시에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 34 ((LH4 단일-도메인 항체 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 34의 31-35, 50-65 및 96-109 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 34의 26-33, 51-57 및 96-109 잔기를 각각 포함한다.
종양 항원이 GPC2인 다른 실시예시에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 36 ((LH6 단일-도메인 항체 서열))의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 36의 31-35, 50-66 및 97-110 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 36의 26-33, 51-58 및 97-110 잔기를 각각 포함한다.
또 다른 실시예시에서, 종양 항원이 GPC2 일 때, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은 리 등에서 (Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32): E6623-E6631, 2017) 공개된 GPC2- 특이 단일클론 항체의 CDR 서열을 포함한다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인 어떤 실시예시에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 38 (YP218 VH 도메인)의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며 및 서열번호 40 (YP218 VL 도메인)의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 38의 31-36, 51-68 및 100-112잔기를 각각 포함하며 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 40의 24-34, 50-56 및 89-101 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 38의 27-34, 52-59 및 98-112 잔기를 각각 포함하고 및/또는 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열번호 40의 27-32, 50-52 및 89-101 잔기를 각각 포함한다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인 다른 실시예시에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열 번호 42 (SD1 단일-도메인 항체 서열)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. CDR 서열은 IMGT, Kabat 또는 Chothia와 같은 어느 잘-알려진 숫자 매김 도식도 (numbering schemes)를 사용하여 결정될 수 있다. 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 42의 31-35, 51-66 및 99-102 잔기를 각각 포함한다. 다른 특별한 실시예시에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 42의 26-35, 51-58 and 97-103 잔기를 각각 포함한다.
종양 항원이 메소텔린 (mesothelin)인, 또 다른 실시예시에서, 항체-결합하는 단편의 아미노산 서열은, 각각 그 전문이 참고문헌에 병합되어 있는, WO 2014/031476, WO 2014/052064, U.S. 특허 No. 8,460,660, U.S. 특허 No. 6,809,184 또는 U.S. 특허 No. 7,081,518에 공개된, 메소텔린-특이 단일클론 항체의 CDR 핵산 서열을 포함한다.
어떤 실시예에서는, 분리된 숙주 세포는 T 림프구이다. 어떤 실시예시에서, T 림프구는 자생 T 림프구 (autologous T lymphocyte) 다. 다른 실시예시에서, T 림프구는 동종이형 T 림프구 (allogeneic T lymphocyte) 다.
또한 여기서 제공되는 것은 여기서 공개되는 분리된 (CAR-발현하는) 숙주세포 및 약학적으로 허용가능한 담체 (carrier)를 포함하는 조성물이다.
더 나아가 제공되는 것은 개체에서 GPC3-양성 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서, 그 방법에는 여기서 공개된 대로 GPC3-타겟하는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주세포를 개체에게 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하거나, 또는 여기서 공개된 대로, GPC3-타겟하는 CAR 및 huEGFRt를 동시-발현하는 분리된 숙주 세포를 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, GPC3-양성 암은 간세포 암 (hepatocellular carcinoma), 흑색종 (melanoma), 난소 투명-세포 암 (ovarian clear-cell carcinoma), 난황 낭 종양 (yolk sac tumor), 신경아세포종 (neuroblastoma), 간아세포종(hepatoblastoma) 또는 윌름씨 종양 (Wilms’tumor)이다.
또한 제공되는 것은 개체에서 GPC2-양성 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서, 그 방법은 여기서 공개된 대로 GPC2-타겟하는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주세포를 개체에게 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하거나, 또는 여기서 공개된 대로, GPC2-타겟하는 CAR 및 huEGFRt를 동시-발현하는 분리된 숙주 세포를 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, GPC2-양성 암은 신경아세포종 (neuroblastoma), 급성 림프아세포 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 배아성 횡문근육종 (embryonal rhabdomyosarcoma), 폐포 횡문근육종 (alveolar rhabdomyosarcoma), 어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma), 섬유조직성 소원형 세포 종양 (desmoplastic small round cell tumor) 또는 골육종 (osteosarcoma)이다.
더 나아가 제공되는 것은 개체에서 메소텔린-양성 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서는, 그 방법은 여기서 공개된 대로 메소텔린-타겟하는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주세포를 개체에게 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하거나, 또는 여기서 공개된 대로, 메소텔린 -타겟하는 CAR 및 huEGFRt를 동시-발현하는 분리된 숙주 세포를 치료적으로 효과 있는 양으로 투여하는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, 메소텔린-양성 암은 중피종 (mesothelioma), 전립선 암 (prostate cancer), 폐암 (lung cancer), 위암 (stomach cancer), 편평상피 암 (squamous cell carcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 3 중 음성 유방암 (triple negative breast cancer) 또는 난소 암 (ovarian cancer)이다.
치료하는 방법의 어떤 실시예에서, 분리된 숙주 세포는 T 림프구이다. 어떤 실시예시에서, T 림프구는 자생적 T 림프구이다. 다른 실시예에서, T 림프구는 동종이형 T 림프구(allogeneic T lymphocytes) 다.
여기 한 실시예에서, 제공되는 것은 5' 에서 3' 방향으로 첫 번째 GMCSFRss를 암호화 하는 핵산; 항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산; CD8α힌지 부위를 암호화 하는 핵산; CD8α 막통과 도메인을 암호화 하는 핵산; 4-1BB 동시-자극 도메인을 암호화 하는 핵산, CD3ζ 시그날링 도메인을 암호화 하는 핵산; 자가-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산; 두 번째 GMCSFRss을 암호화하는 핵산; 및 huEGFRt를 암호화 하는 핵산을 포함하는 CAR를 암호화하는 핵산 분자이다. 어떤 실시예에서, 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 73-807 서열, 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 73-420, 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 73-432를 포함한다. 특별한 실시예시에서, 핵산 분자는 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 19과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 특별한 비-제한적인 실시예시에서, 핵산 분자는 서열번호 15, 서열번호 17, 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
여기 한 실시예에서, 제공되는 것은 CAR 및 huEGFRt를 동시-발현하는 분리된 숙주이며, 여기서 CAR는 항원-특이적 항체 또는 이의 항원-결합하는 단편, CD8힌지 부위, CD8α막 통과 도메인, 4-1BB 동시-자극 도메인 및 CD3ζ 시그날링 도메인을 포함하고; 및 huEGFRt는 도메인 III, 도메인 IV 및 인간 EGFR로부터의 막통과 도메인을 포함하며, 그러나 EGF-결합 도메인 및 세포질 도메인 (cytoplasmic domain)은 없다. 어떤 실시예시에서, 항원-결합하는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 16의 25-269 잔기, 서열 번호 18의 25-140 잔기, 또는 서열번호 20의 25-144 잔기를 포함한다. 특별한 실시예시에서, CAR의 아미노산 서열은 서열번호 16의 25-491 잔기, 서열 번호 18의 25-362 잔기, 또는 서열번호 20의 25-366 잔기와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하며, 및 huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 다른 특별한 실시예시에서, CAR의 아미노산 서열은 서열번호 16의 잔기 25-491, 서열번호 18의 잔기 25-362, 또는 서열번호 20의 잔기 25-366에 대비하여 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하 또는 1 이하의 아미노산 치환을 포함하며 및 huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14에 대비하여 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하 또는 1 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 특별한 비-제한적인 실시예시에서, CAR의 아미노산 서열은 서열번호 16의 잔기 25-491, 서열번호 18의 잔기 25-362 또는 서열번호 20의 잔기 25-366를 포함하고, 및 huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함한다.
IV. 종양 항원에 특이적인 항체 (Antibodies Specific for Tumor Antigens)
여기서 공개되는 CARs는 적절한 종양 항원-특이적인 단일클론 항체 (monoclonal antibody) 또는 이의 항원-결합 단편을 선택함으로서 특정한 항원을 발현하거나 또는 과발현하는 종양 세포를 타겟 할 수 있다. 어떤 실시예에서, CAR의 항원-결합하는 부분은 단일클론 항체의 항원-결합 단편이다. 특별한 실시예시에서, 항원-결합 단편은 scFv 또는 단일-도메인 (VH 도메인) 항체 ((single-domain (VH domain) antibody)) 이다. 여기서 공개되는 CARs가 어느 항원-특이 항체 (또는 이의 항원-결합하는 단편)와 같이 사용될 수 있다 하더라도, 예시적인 항체에는 GPC3-특이적인, GPC2-특이적인 및 메소텔린 (mesothelin)-특이적인 단일클론 항체 (monoclonal antibodies)이다.
A. GPC3-특이적인 항체 (GPC3-specific antibodies)
여기서 공개되는 CAR 구조물은 어느 GPC3-특이 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하게 조작되게(engineered) 할 수 있다. 이것에 만 국한하지 않으나, PCT Publication No. WO 2013/181543에 공개된 YP6, YP7, YP8, YP9 및 YP9.1, 및 그 전문이 참고 문헌으로 여기에 병합된 WO 2012/145469에 공개된 HN3를 포함하는, 몇 가지 GPC3-특이 단일클론 항체가 이 분야 기술에서 알려졌다. 여기 어떤 실시예에서, CAR은 GPC3-특이 단일클론 항체 YP7 (WO 2013/181543에 공개됨)의 CDR 서열 또는 이의 인간화된 형태 (humanized version)를 포함하는 항원-결합단편을 포함한다. YP7 및 인간화된 YP7 (humanized YP7) (hYP7)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 하기에 제공된다. 표 1A-1D는 YP7 및 hYP7 둘 다의 CDR1, CDR2 및 CDR3 위치를 제시한다. 다른 실시예에서, CAR은 GPC3-특이 항체 HN3 (WO 2012/145469에 공개)의 CDR을 포함하는 단일도메인 단일클론 항체 (single-domain monoclonal antibody)를 포함한다. HN3의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 하기에 제공된다. 표 2A-2B는 HN3에서 CDR1, CDR2 및 CDR3의 위치를 표시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
B. GPC2 -특이 항체 (GP2-specific antibodies)
여기서 공개되는 CAR 구조물은 어느 GPC2-특이 단일클론 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하도록 또한 제작 (engineered) 될 수 있다. 여기에 어떤 실시예에서, CAR는 GPC2-특이 단일-도메인 단일클론 항체 (single-domain monoclonal antibody) LH7, LH4, LH6, LH1, LH2 또는 LH3의 CDR 서열을 포함하는 항원-결합하는 단편을 포함한다 LH3 ((리 등에서 공개 됨(Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32):E6623-E6631, 2017)). LH7, LH4 및 LH6 의 핵산 및 아미노산 서열이 하기에 제공된다. 표 3A-5B는 LH7, LH4 및 LH6를 위한 CDR1, CDR2 및 CDR3의 위치를 표시한다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
C. 메소텔린-특이 항체 (Mesothelin-specific antibodies)
여기서 공개되는 CAR 구조물은 또한 어느 메소텔린-특이 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합하는 단편을 포함하도록 제작될 수 있다. 이것에 만 국한하지 않으나, 각각의 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합된 PCT Publication No. WO 2014/031476에 공개된 YP218, YP223, YP3, YP158 및 YP187, PCT Publication No. WO 2014/052064에 공개된 SD1, U.S. 특허 No. 8,460,660에 공개된 HN1, U.S. 특허 No. 6,809,184에 공개된 SS, 및 U.S. 특허 No. 7,081,518에 공개된 SS1를 포함하는, 이분야 기술에서 몇 가지 메소텔린-특이 단일클론 항체가 알려졌다.뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 YP218 및 SD1이 아래에 제공된다. 표6A-7B는 YP218 및 SD1의 위치를 표시한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
V. 키메릭 항원 수용체 (Chimeric Antigen Receptors) ( CARs )
여기서 공개되는 것은 CARs (또한 키메릭 T 세포 수용체, 인공 T 세포 수용체 또는 키메릭 면역수용체라고도 알려진다) 및 CARs을 발현하도록 제작된 T 세포 이다. 일반적으로, CARs은 결합 잔기 (binding moiety), 세포외 힌지/공간 요소 (extracellular hinge/spacer element), 막통과 부위 (transmembrane region) 및 시그날링 (신호전달) 기능을 수행하는 세포내 도메인 (intracellular domain that performs signaling functions)을 포함한다 (Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol 2010:956304, 2010; Dai et al., J Natl Cancer Inst 108(7):djv439, 2016). 많은 경우에, 결합 잔기는 scFv 또는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)와 같은 단일클론 항체의 항원 결합 단편이다. 공간/힌지 부위는 전형적으로 IgG1, IgG4, IgD 및 CD8 도메인과 같은 IgG 아부류 (subclass)로부터의 서열을 포함한다. 막통과 도메인은 CD3ζ, CD4, CD8 또는 CD28와 같은 여러가지 다른 T 세포 단백질로부터 유래 될 수 있다.
전체 세포내 T 세포 시그날링(신호전달) 도메인이 CAR에 적용될 수 있으나, 많은 경우에 전체 체인을 다 사용할 필요는 없다. 세포내 T 세포 시그날링 (신호전달) 도메인의 절단된 부분의 정도에 있어서, 그러한 절단된 부위가 상응하는 T 세포 효능제 기능 신호(effector function signal)를 전달하는 한 이를 온전한 체인을 대신하여 사용할 수 있다. CAR에 사용을 위한 세포내 T 세포 시그날링 도메인의 실시예시에는 T 세포 수용체 (T cell receptor) (TCR)의 세포질내 서열 (cytoplasmic sequences) 및 항원 수용체 결합 이후에 신호 전달의 시작과 함께 작용하는 동시-자극 분자 (co-stimulatory molecules)는 물론, 이들 서열의 어느 유도체 또는 변이체 및 같은 기능적 능력을 갖는 어느 합성 서열을 포함한다. CARs을 만들기 위하여 몇가지 다른 세포내 도메인이 사용되었다. 예를 들어, 세포내 도메인은 CD3 ζ또는 FcRIγ 와 같은, ITAM을 갖는 시그날링 체인으로 구성 될 수 있다. 어떤 경우에는, 세포내 도메인은 더 나아가 적어도 추가로 하나의 동시-자극 도메인의 세포내 일부분을 포함한다. 동시-자극 도메인은 동시자극 분자 (costimulatory molecule)의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 한 부분을 의미한다. 동시자극 분자는 항원 수용체들 또는 림프구가 항원에 효과적으로 반응하기 위하여 요구되는 이들의 리간드가 아닌 다른 세포 표면 분자이다. 동시-자극 분자에는, 예를 들어, CD28, 4-1BB (CD137, TNFRSF9), OX-40 (CD134), ICOS, CD27 및/또는 DAP10 가 포함된다.
CAR은 또한, 예를 들어, 항원-결합 도메인에 N- 말단에, 시그날 펩티드 서열 (signal peptide sequence)을 포함할 수 있다. 시그날 펩티드 서열은, 과립대식세포 콜로니-자극 인자 수용체(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor) (GMCSFR), 면역글로블린 경쇄 카파 (immunoglobulin light chain kappa), 또는 IL-2로부터의 시그날 서열과 같은, 어느 적절한 시그날 펩티드 서열이 될 수 있다. 시그날 펩티드 서열이 세포 표면에서 CAR의 발현을 촉진 할 수 있는 반면에, 발현된 CAR에 시그날 펩티드 서열의 존재는 CAR가 기능하기 위하여는 필요하지 않다. CAR가 세포 표면에 발현 된 후, 시그날 펩티드 서열은 CAR로부터 쪼개져 떨어질 수 있다. 따라서, 어떤 실시예에서, CAR은 시그날 펩티드 서열이 없다.
여기서 공개된 CARs 는 절단된 형태의 인간 EGFR (huEGFRt; 하기 VI 에서 좀더 상세히 논의됨)를 또한 발현하는 구조체 (렌티바이러스 벡터와 같은)로부터 발현된다. CAR 및 huEGFRt는 자가-절단 펩티드 서열 (T2A와 같은)에 의해 분리되어 있어 형질도입 된 세포에서 발현되면, CAR은 huEGFRt로부터 쪼개진다 (도 1 참조).
여기서 공개된 어떤 실시예에서, CAR 구조체는 하기의 아미노산 서열을 N-말단에서 C-말단 방향으로 암호화한다:
Figure pct00035
여기서 공개된 CARs 발현하는 T 세포는 종양 세포와 같은 특정한 세포 타입, 예를 들어, GPC3-양성, GPC2-양성 또는 메소텔린 (mesothelin)-양성 종양 세포를 타겟 하는데 사용될 수 있다. CARs 발현하는 CTLs은 HLA 제한을 받지 않기 때문에 CARs 발현하는 T 세포의 사용은 표준 CTL-근거한 면역치료보다 좀 더 보편적이다 및 그러므로 타겟 항원을 발현하는 종양을 가진 어느 환자를 위해서도 사용될 수 있다.
따라서, 여기서 제공되는 것은 GPC3-특이 항체, GPC2-특이 항체, 메소텔린(mesothelin)-특이 항체와 같은 종양-특이 항체 (tumor-specific antibody) (또는 이의 결합 단편)를 포함하는 CARs이다. 또한 CARs를 암호화하는 분리된 핵산 분자 및 벡터, 및 CARs를 발현하는 T 림프구와 같은 숙주 세포가 제공된다. GPC3-특이, GPC2-특이 또는 메소텔린-특이 단일클론 항체를 포함하는 CARs를 발현하는 T 세포는 GPC3, GPC2 및 메소텔린을 각각 발현하는 암의 치료에 사용될 수 있다.
VI. 절단된 인간 EGFR (Truncated Human EGFR ) ( huEGFRt )
인간 상피 성장 인자 수용체는 4개의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세 개의 세포내 도메인을 포함한다. EGFR 도메인들은 다음의 N-말단에서 C-말단 순서로 발견 된다: 도메인 I-도메인 II-도메인 III-도메인 IV-막통과 (TM) 도메인- 막 옆 도메인 (juxtamembrane domain)-타이로신 키나제 도메인-C-말단 꼬리. 도메인 I 및 도메인 III 는 리간드 결합에 참여하는 루이신-풍부 도메인 (leucine-rich domains) 이다. 도메인 II 및 도메인 IV 는 시스테인-풍부 도메인 (cysteine-rich domains)이며 및 EGFR 리간드와 접촉하지 않는다. 도메인 II는 다른 EGFR 부류 멤버들로부터 유사한 도메인을 가진 호모- 및 헤테로-다이머 형성을 중재하며, 도메인 IV는 도메인 II 와 다이설파이드 결합 (disulfide bonds)을 형성 할 수 있다. EGFR TM 도메인은 세포 막을 통해 한번 통과하게 하며 및 단백질 이배체 (protein dimerization)에 한 역할을 할 수 있다. 세포 내 도메인은 막 옆 도메인, 타이로신 키나제 도메인 및 C-말단 꼬리를 포함하며, 이 는EGFR 신호 전달을 매개한다 (Wee and Wang, Cancers 9(52), doi:10.3390/cancers9050052; Ferguson, Annu Rev Biophys 37:353-373, 2008; Wang et al., Blood 118(5):1255-1263, 2011).
절단된 형태의 인간 EGFR은, 여기서는 “huEGFRt”라고 불리며, 도메인 III, 도메인 IV 및 TM 도메인 만을 포함한다. 그러므로, huEGFRt 는 도메인 I, 도메인 II 및 세포내 도메인 세 개 모두는 없다. huEGFRt 은 EGF에 결합할 능력이 없으며 및 신호전달 활성도 없다. 그러나 이 분자는, FDA-허가된 세툭시맵 (cetuximab) (PCT Publication No. WO 2011/056894, 참고문헌으로 여기에 병합됨)과 같은 특정한 EGFR-특이 단일클론 항체에 결합할 능력은 유지하고 있다.
huEGFRt 및 여기서 공개된 종양 항원-특이 CAR 둘 다를 암호화하는 구조체 (렌티바이러스 벡터와 같은)를 T 세포에 형질도입하면 라벨된 EGFR 단일클론 항체 세툭시맵 (cetuximab) (ERBITUXTM)을 사용하여 형질도입된 T 세포의 선택을 하게 한다. 예를 들어, 세툭시맵 (cetuximab)은 바이오틴으로 라벨 될 수 있으며 및 형질도입된 T 세포는, 상업적으로 구할 수 있는 (Miltenyi Biotec으로부터와 같은), 항-바이오틴 마그네틱 비드 (magnetic beads)를 사용하여 선택될 수 있다. huEGFRt의 동시-발현은 또한 적응적으로 전달되는 CAR-발현하는 T-세포를 생체 내에서 추적하게 한다. 더 나아가, huEGFRt를 발현하는 T 세포에의 세툭시맵의 결합은 ADCC 효능 세포 (effector cells)의 세포 독성을 유도하며, 이로써, 치료 종료 시점에서와 같은, 형질도입된 T 세포의 생체 내에서 제거 기전을 제공한다.
여기에 어떤 실시예에서, huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 어떤 실시예시에서, huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 13의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 서열번호 13의 뉴크레오타이드로 구성된다. 어떤 실시예에서, huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 어떤 실시예시에서, huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하거나 또는 서열번호 14로 구성된다. 다른 실시예에서, huEGFRt의 아미노산 서열은 서열번호 14에 대비하여 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 2 개 이하, 1 개 이하의 아미노산 치환을 포함한다. 어떤 실시예시에서, 아미노산 치환은 보존적 치환 (conservative substitutions) 이다.
VII. CAR-발현하는 세포 조성물 (CAR-Expressing Cell Compositions)
하나 또는 그 이상의 약학적으로 또는 생리적으로 허용할 만한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된 CAR-발현하는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. CAR-발현하는 세포는 CD3+ T 세포와 같은 T 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 와 같은 T 세포, 및/또는 NK 세포가 될 수 있다. 그러한 조성물은 중성으로 완충된 식염수, 인산염으로 완충된 식염수 및 이와 유사한 것과 같은 버퍼; 글루코즈 (glucose), 만노즈 (mannose), 슈크로즈(sucrose), 덱스트란(dextrans), 또는 만니톨 (mannitol)과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글라이신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 킬레이팅 제제; 아쥬벤트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드); 및 방부제를 포함할 수 있다. 세포들은 수여자에게 자기유래 (autologous)일 수 있다. 그러나, 세포는 또한 이종(heterologous) (동형이종)일 수 있다.
세포에 관한 한, 세포에 도입하기 위하여, 예를 들어, 완충된 식염수 및 이와 유사한 것과 같은, 여러가지 수용성 담체가 사용될 수 있다. 이러한 용액들은, 멸균되고 및 일반적으로 바람직하지 않은 물질은 없다. 이러한 조성물들은, 전통적으로 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 생리적 조건에 근접하기 위하여, pH 조절 및 완충제, 독성 조절 제제 및 이와 유사한 것과 같은, 예를 들어, 소듐 아세테이트(sodium acetate), 소듐 클로라이드 (sodium chloride), 포타슘 클로라이드 (potassium chloride), 칼슘 클로라이드 (calcium chloride), 소듐 락테이트(sodium lactate) 및 이와 유사한 것과 같은, 약학적으로 허용할 만한 보조 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제형에서의 농도는 널리 다양 할 수 있으며, 및 액체 부피, 점성, 체중 및 이와 유사한 것에 근거하여 선택된 특정한 투여 방식 및 개체의 요구에 맞추어 주로 선택될 수 있을 것이다.
투여될 조성물의 정확한 양은 개인별 나이, 체중, 종양 크기, 전이 정도, 및 환자(개체)의 커디션의 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 이는 일반적으로 여기서 서술된 CAR-발현하는 T 세포 (및/또는 NK 세포)를 포함하는 약학적 조성물은, 105에서 106 세포/kg 체중 용량과 같이, 104에서 109 세포/kg 체중의 용량으로, 이 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 투여될 수 있다고 말할 수 있다. 예시적인 용량은 약 5 x 106 세포/kg에서약 7.5 x 107 세포/kg까지와 같이, 약 2.5 x 107 세포/kg와 같이, 또는 약 5.0 x 107 세포/kg과 같이, 106 세포/kg에서 약 108 세포/kg의 용량이다.
조성물은 이러한 용량으로 한번 또는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같이 여러 번 투여될 수 있다. 조성물은 면역치료에서 공통적으로 알려진 주입 기술 (infusion technology)을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조). 조성물은 매일, 매주, 두달마다, 또는 한달마다 투여될 수 있다. 어느 비-제한적인 실시예시에서, 조성물은 정맥주사 투여를 위해 제형화 되며 및 여러 번 투여된다. 투여 양 및 회수는, 임상시험으로 적절한 용량이 결정될 수 있다하더라도, 개체의 컨디션, 및 개체의 질병의 타입 및 심각성과 같은 인자들에 의해 결정될 것이다.
어떤 실시예에서, CAR-암호화하는 핵산 분자는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포에 도입되며, 및 개체는 초기 세포 투여를 받으며, 및 이어서 한번 또는 그 이상의 세포 투여를 받으며, 여기서 후속의 한번 또는 그 이상의 세포 투여는 전 투여 후에 15일 이하, 예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 일과 같은 후에 투여된다. 한 실시예에서, 개체 (예를 들어, 인간)에게 CAR-발현하는 세포의 한번 이상의 투여는 일주일 당으로 투여된다, 예를 들어, 공개되는 CAR-발현하는 세포의 2, 3, 또는 4의 투여는 일주일 당으로 투여된다. 한 실시예에서, 개체는 일주일당 한번 이상의 (예를 들어, 일주일에 2, 3, 또는 4 번 투여) (또한 사이클이라고도 불림) CAR-발현하는 세포의 투여를 받고, 이어서 일주일 동안 CAR-발현하는 세포의 투여를 받지 않고, 및 그후 추가로 한번 또는 그 이상의 CAR-발현하는 세포가 개체에게 투여된다 (예를 들어, 일주일 당 한번 이상의 CAR-세포의 투여). 다른 실시예에서, 개체 (예를 들어, 인간)는 한번 이상의 사이클의 CAR-발현하는 세포를 받으며, 및 각 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 이하이다. 한 실시예에서, CAR-발현하는 세포는 매 이틀마다 일주일당 3 번 투여된다. 다른 실시예에서는, CAR-발현하는 세포는 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주 또는 그 이상의 주 동안 투여된다. 환자에게 투여될 상기 투여의 용량은 치료될 컨디션 및 치료받을 수혜자의 정확한 성질에 따라 달라질 것이다. 인간에의 투여를 위한 용량의 범위는 이 분야 기술에-허용되는 관행에 따라 수행될 수 있다.
어떤 실시예에서, CAR-발현하는 T세포는 생체 내에서 복제할 수 있어 장기간 동안 지속되는 결과로서 지속적인 종양 조절을 이끌어 낼 수 있다. 여러가지 관점에서, 개체에 투여된 T 세포, 또는 이들 세포의 후손들은 개체에게 T 세포를 투여한 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 또는 수년 동안 개체에서 지속된다. 다른 실시예에서, 세포 및 이들의 후손들은 개체에 CAR-발현하는 T세포를 투여한 후 6개월 미만, 5개월, 4개월, 3 개월, 2 개월, 또는 1 개월 미만, 예를 들어, 3 주, 2 주, 1 주 동안 존재한다.
주제의 조성물의 투여는, 주사 (injection), 섭취 (ingestion), 주입 (transfusion), 이식 (implantation) 또는 이식 (transplantation)을 포함하는 어느 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 공개되는 조성물은 환자에게 동맥을 경과하여 (trans-arterially), 피하로 (subcutaneously), 피부내로 (intradermally), 종양내로 (intratumorally), 결절내로(intranodally), 척수내로 (intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥(i.v.)주사로 (intravenous (i.v.) injection), 또는 복강내로(intraperitoneally) 투여될 수 있다. 어떤 실시예에서, 조성물은 환자에게 피부내 또는 피하 주사로 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 i.v. 주사로 투여된다. 조성물은 또한 종양 또는 림프 결절에 직접적으로 주사 될 수 있다.
어떤 실시예에서, 개체는 백혈구성분채집술 (leukapheresis)을 거칠 수 있으며, 여기서는 백혈구가 수집되고, 강화되거나 또는 관심있는 세포를, 예를 들어 T 세포 또는 NK세포를 선택 및/또는 분리하기 위하여 생체 밖에서 고갈된다. 이들 분리된 세포는 이 분야 기술에서 알려진 방법으로 확장될 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 CAR 구조체가 도입될 수 있도록 처치되어, 이로서 CAR를 발현하는 자가 생성 세포가 만들어 질 수 있다. 여기 어떤 실시예에서는, CAR-발현하는 세포는 CAR및 절단된 형태의 인간 EGFR (huEGFRt)을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vectors)를 사용하여 만들어 진다. huEGFRt의 동시-발현은, 상기 IV 부분에서 서술된 대로 huEGFRt를 인식하는 항체 ((예를 들어, 세툭시맵 (cetuximab), 참고문헌으로 병합되어 있는 PCT Publication No. WO 2011/056894 참조))를 사용하여 CAR 발현하는 T 세포를 선택하고 및 정제하도록 한다.
어떤 실시예에서, T 세포는 말초혈액 림프구로부터 적혈구를 용해시키고 및 예를 들어, 퍼콜 구배 (PERCOLL™ gradient) 또는 역류 원심분리 용출(counterflow centrifugal elutriation)로 단핵구를 고갈시켜 분리된다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정한 아형집단은 더 나아가 양성적 또는 음성적 선택 기술로 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 같은 항-CD3/항-CD28(예를 들어, 3×28)-접합된 비드 (conjugated beads)와 바람직한 T 세포의 양성적 선택에 충분한 시간 기간 동안 배양시켜 분리될 수 있다, U.S. Published Application No. US20140271635 A1 참조. 비-제한적인 실시예시에서, 시간 기간은 약 30 분이다. 다른 비-제한적인 실시예시에서, 시간 기간은 30 분에서 36 시간 또는 더 긴 범위 및 이 사이의 모든 정수 값이다. 더 나아가 비-제한적인 실시예시에서, 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 시간, 10에서 24 시간, 24 시간 또는 더 긴 시간이다. 면역력이 약화된 개인으로부터의 분리와 같은, 다른 세포 타입에 비교하여 T세포가 적을 때와 같은 어느 경우에 더 긴 배양 시간이 사용될 수도 있다. 더 나아가, 더 긴 배양 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 단순히 배양 시간을 짧게 하거나 또는 길게 하여 T 세포를 CD3/CD28 비드에 결합하게 하고 및/또는 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가 또는 감소시켜 (여기서 더 나아가 서술된 대로), T 세포의 아형집단이 배양 시작점 또는 이 과정 중 다른 시점에서 선호적으로 선택되거나 또는 아닐 수 있게 할 수 있다. 추가로, 비드나 또는 다른 표면에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시켜, T 세포의 아형집단이 배양 시작점 또는 다른 바람직한 시점에서 선호적으로 선택되거나 또는 아닐 수 있게 할 수 있다. 또한 몇 차례 선택 과정이 사용될 수도 있다.
음성적 선택에 의한 T 세포의 집단의 강화는 음성적으로 선택되는 세포에 유일한 표면 마커들에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 방법은 음성적인 자석 면역 흡착 (negative magnetic immunoadherence)을 통하거나 또는 음성적으로 선택되는 세포에 존재하는 세포 표면 마커들에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 유동 세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성적 선택으로 CD4+ 세포를 강화시키기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체들을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 사이토카인 (cytokines)을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수도 있다. 세포 발현을 스크리닝 하는 방법들은 PCT Publication No. WO 2013/126712에 공개되어 있다.
양성적 또는 음성적 선택으로 바람직한 세포 집단을 분리하기 위하여, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도는 세포와 비드의 접촉이 최대가 될 수 있도록 다양하게 변화시킬 수 있다. 어떤 실시예에서, 10억 세포/ml (1 billion cell/ml)의 농도가 사용된다. 더 나아간 실시예에서, 1 억 세포/ml 가 사용된다. 다른 실시예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 백만 세포/ml 농도의 세포가 사용된다. 이론에 억매이지 않고, 높은 농도의 사용은 증가된 세포의 수율, 세포 활성화 및 세포 확장의 결과가 될 수 있다. 더 낮은 농도의 세포도 또한 사용될 수 있다. 이론에 억매이지 않고, T 세포 및표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합을 상당히 희석시켜, 입자와 세포 사이의 상호 작용을 최소화한다. 이는 입자에 결합될 바람직한 항원을 높은 양으로 발현하는 세포를 선택하게 한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28를 발현하며 및 희석된 농도에서는 CD8+ T 세포 보다 좀더 효율적으로 포획된다. 어떤 실시예에서, 사용된 세포의 농도는 5×106/ml이다. 다른 실시예에서, 사용된 농도는 약 1×105/ml에서 1×106/ml, 및 이사이 어는 정수 값이 될 수 있다.
VIII. 치료 방법 (Methods of Treatment)
여기서 제공되는 것은 여기서 공개되는 종양-타겟 하는 CAR T 세포의 치료적으로 효과적인 양을 개체에 투여하여 개체에서 암을 치료하는 방법이다. 또한 여기서 제공되는 것은 여기서 공개되는 종양-타겟 하는 CAR T 세포의 치료적으로 효과적인 양을 개체에 투여하여 개체에서 종양의 성장 또는 전이를 억제시키는 방법이다.
특히 제공되는 것은 개체에서 GPC3-양성 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서, 그 방법에는 개체에게 GPC3-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하거나, 또는 GPC3-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하는 것이 포함된다. 어떤 실시예에서, GPC3-양성 암은 HCC, 흑색종, 난소 투명-세포 종양, YST, 신경아세포종, 간아세포종, 또는 윌름씨 종양 (Wilms’ tumor) 이다.
또한 제공되는 것은 개체에서 GPC2-양성 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서, 그 방법에는 개체에게 GPC2-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하거나, 또는 GPC2-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하는 것이 포함된다. 어떤 실시예에서, GPC2-양성 암은 신경아세포종, 급성 림프아구성 백혈병, 배아형횡문근육종, 폐포 횡문근육종, 어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma), 섬유조직형성 소원형 세포 종양 (desmoplastic small round cell tumor) 또는 골육종이다.
더 나아가 제공되는 것은 개체에서 메소텔린-양성 (mesothelin-positive) 암을 치료하는 방법이다. 어떤 실시예에서, 그 방법에는 개체에게 메소텔린-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하거나, 또는 메소텔린-타겟된 CAR 및 huEGFRt를 동시에 발현하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 투여하는 것이 포함된다. 어떤 실시예에서, 메소텔린-양성 암은 중피종 (mesothelioma), 전립선암, 폐암, 위암, 편평상피암 (squamous cell carcinoma), 췌장암, 담관암, 3중음성 유방암 또는 난소 암이다.
여기서 공개된 방법의 어떤 실시예에서, 분리된 숙주세포는 T 림프구이다. 어떤 실시예시에서, T 림프구는 자가 T 림프구 (autologous T lymphocytes) 이다.
치료적으로 효과 있는 양의 CAR-발현하는 T 세포는 질병의 심각도, 질병의 유형, 및 환자 건강의 일반적인 상태에 달려있다. 치료적으로 효과 있는 양의 CAR-발현하는 T 세포 및 이의 조성물은 증상의 객관적인 완화 또는 의사 또는 자격 있는 다른 관찰자에 의해 주목되는 바와 같은 객관적으로 동정할 만한 개선을 제공하는 그런 것 (종양 부피 및 전이의 감소와 같은)이다.
여기서 공개되는 CAR-발현하는 T 세포 및 조성물의 투여는 또한 다른 항암제 투여 또는 치료적 처치 (종양의 외과적 제거와 같은)와 수반될 수 있다. 어느 적절한 항암제가 여기서 공개되는 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 예시적인 항암제제에는, 이것에 만 국한하지 않으나, 예를 들어, 유사분열 억제제 (mitotic inhibitors), 알킬레이팅 제제 (alkylating agents), 항-대사제 (anti-metabolites), 인터칼레이팅 항생제 (intercalating antibiotics), 성장 인자 억제제 (growth factor inhibitors), 세포주기 억제제 (cell cycle inhibitors), 효소, 토포이소메레이즈 억제제 (topoisomerase inhibitors), 항-생존 제제 (anti-survival agents), 생물학적 반응 조절제 (biological response modifiers), 항-홀몬제 (anti-hormones) ((예를 들어, 항-안드로젠 (anti-androgens)) 및 항-혈관형성 제제 (anti-angiogenesis agents) 와 같은 화학요법치료제가 포함된다. 다른 항암 처치에는 방사성 치료법 및 타겟하는 암세포에 특이적인 다른 항체들이 포함된다.
비-제한적인 알킬레이팅 제제의 실시예시에는 나이트로젠 머스타드 (nitrogen mustards) ((메클로로에타민 (mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜파란(melphalan), 우라실 머스타드(uracil mustard) 또는 클로람부실 (chlorambucil) 과 같은)), 알킬 설포네이트 (alkyl sulfonates) ((부설판 (busulfan)과 같은)), 니트로조우레아 (nitrosoureas)((카무스틴 (carmustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 또는 다카바진 (dacarbazine) 과 같은)) 가 포함된다.
비-제한적인 항대사제의 실시예시에는 엽산 유사체 (folic acid analogs) ((메토트랙세이트(methotrexate)와 같은)), 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogs) ((5-FU 또는 시타라빈(cytarabine) 과 같은)), 및 머르캅토퓨린(mercaptopurine) 또는 티오구아닌 (thioguanine)과 같은 퓨린 유사체(purine analogs)가 포함된다.
비-제한적인 천연물 산물에는 빈카 알카로이드(vinca alkaloids)((빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 또는 빈데신 (vindesine)과 같은)), 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxins) ((에토포사이드 (etoposide) 또는 테니포사이드 (teniposide)과 같은)), 항생제 ((닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 필리카미이신(plicamycin), 또는 마이토마이신 C (mitomycin C)와 같은)), 및 효소 (L-아스파라기네이즈 (L-asparaginase)와 같은))가 포함된다.
비-제한적인 다양한 제제에는 백금 배위 컴플랙스 (platinum coordination complexes) ((시스-디아민-디클로롤플라티눔 II (cis-diamine-dichloroplatinum II) 시스플라틴(cisplatin)으로도 알려짐과 같은)), 치환된 우레아 (substituted ureas) ((하이드록시우레아(hydroxyurea)와 같은)), 메틸 하이드라진 유도체 (methyl hydrazine derivatives) ((프로카바진(procarbazine)과 같은)), 및 부신피질 억제제 (adrenocortical suppressants) ((미토탠 (mitotane) 및 아미노글루테티미드) (aminoglutethimide)와 같은)) 이 포함된다.
비-제한적인 홀몬 및 길항제의 실시예시에는 아드레노코르티코스테로이드 (adrenocorticosteroids)((프레드니손(prednisone) 과 같은)), 프로제스틴 (progestins)((하이드록시프로제스테론 카프로네이트(hydroxyprogesterone caproate) 메드옥시프로제스테론 아세테이트 (medroxyprogesterone acetate), 및 마제스트롤 아세테이트(magestrol acetate) 와 같은)), 에스트로겐 (estrogens) ((디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestroll) 및 에티닐에스트라디올(ethinyl estradiol)과 같은)), 항에스트로겐 (antiestrogens) (타목시펜 (tamoxifen)과 같은)), 및 안드로젠 (androgens) ((테스테론 프로피오네이트(testerone proprionate) 및 플루옥시메스테론(fluoxymesterone)과 같은)) 이 포함된다. 가장 보편적으로 사용되는 화학요법 약물에는 아드리아마이신 (Adriamycin), 알케란(Alkeran), 아라-C (Ara-C), BiCNU, 부설환(Busulfan), CCNU, 카보플라티눔 (Carboplatinum), 시스플라티눔(Cisplatinum), 사이토잔 (Cytoxan), 다우노루비신 (Daunorubicin), DTIC, 5-FU, 플루다라빈 (Fludarabine), 하이드레아 (Hydrea), 이다루비신 (Idarubicin), 이포스파마이드 (Ifosfamide), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 미트라마이신 (Mithramycin), 마이토마이신 (Mitomycin), 미토잔트론(Mitoxantrone), 나이트로젠 머스타드 (Nitrogen Mustard), 탁솔 (Taxol) ((또는 도세탁셀 (docetaxel)과 같은 다른 탁산 (other taxanes)), 벨반 (Velban), 빈크리스틴(Vincristine), VP-16 가 포함되고, 반면에 좀 더 새로운 약물에는 겜시타빈(Gemcitabine) ((겜자 (Gemzar)),　 허셉틴(Herceptin), 이리노테칸 (Irinotecan) ((켐토사(Camptosar, CPT-11)), 루사타틴(Leustatin), 나벨빈(Navelbine), 리툭산 STI-571 (Rituxan STI-571),　탁소테레(Taxotere), 토포테칸(Topotecan) ((하이캄틴(Hycamtin)), 젤로다 (Xeloda )((카페시타빈 (Capecitabine)), 제벨린(Zevelin) 및 칼시트리올 (calcitriol)이 포함된다.
비-제한적인 사용될 수 있는 면역 조절제의 실시예시에는 AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), 브로피리민 (bropirimine) (Upjohn), 감마 인터페론(gamma interferon) (Genentech), GM-CSF ((과립대식세포 콜로니 자극 인자 (granulocyte macrophage colony stimulating factor; Genetics Institute)), IL-2 (Cetus or Hoffman-LaRoche), 인간 면역 글로부린(human immune globulin) (Cutter Biological), IMREG (Imreg of New Orleans, La.로부터), SK&F 106528, 및 TNF ((종양괴사인자 (tumor necrosis factor; Genentech)) 가 포함된다.
어떤 유형의 암에 대하여 보통적인 다른 치료에는 외과적 처치, 예를 들어, 암 또는 그의 일부의 외과적인 제거이다. 다른 치료의 실시예시에는, 종양 제거를 도와주거나 또는 외과적으로 제거하기 전에 종양을 줄이기 위하여 방사성 치료, 예를 들어, 방사성 물질 또는 에너지 (외부적이 빔 치료 와 같은)를 종양 부위에 투여하는 것이다.
하기의 실시예시들이 어떤 특정한 양상 및/또는 실시예를 보여주기 위하여 제공된다. 이러한 실시예시들은 그 특정한 양상 또는 서술된 실시예 만으로 공개를 제한 하려는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예시
실시예시 1: CAR-발현하는 렌티바이러스 구조체 (CAR-Expressing Lentivirus Constructs)
이 실시예시는 종양-타겟하는 키메릭 항원 수용체 (tumor-targeting chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 EGFR ((huEGFRt)을 암호화하는 3 개의 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vectors)의 제조를 서술한다.
GPC3 또는 GPC2를 타겟하는 3 개의 CAR 구조체를 제조하기 위하여 pWPT 백본 렌티바이러스 벡터 (pWPT backbone lentiviral vector) (Addgene)가 사용되었다. 이 벡터는 또한 huEGFRt를 암호화하며, 이는 FDA-허가된 항-EFGR 항체인 세툭시맵 (cetuximab)으로 인식될 수 있어 CAR T 세포를 라벨링 시키고 및 제거시킨다. 도 1은 종양-타겟하는 CARs을 제조하기 위한 렌티바이러스 구조체의 계획도를 제공한다. 렌티바이러스 구조체는 CAR 코딩 부위 및 huEGFRt를 암호화하는 부위를 포함하며, 각각은 과립대식세포 콜로니 지극 인자 수용체 신호서열 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss)을 앞에 지니고 있다. 이 두 부위는 자가-절단 T2A 서열에 의해 분리되어 있어, 구조체가 발현되면, CAR은 huEGFRt 로부터 쪼개진다. 구조체의 발현은 인간 연장 인자 1α(EF1α) 프로모터 ((human elongation factor 1)(EF1) promoter))에 의해 유도된다. CAR은 항원-결합 부위 (antigen-binding region), CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region), CD8α 막통과 (TM) 도메인 ((CD8 transmembrane (TM) domain)), 4-1BB 동시-자극 부위 (4-1BB co-stimulatory region) 및 CD3ζ 시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)이 포함한다. huEGFRt에는 두 개의 세포외 도메인 (도메인 III 및 도메인 IV) 및 TM 도메인이 포함된다.
CAR 구조체의 두 개는 GPC3를 타겟 한다. 렌티바이러스 벡터 pMH228는 GPC3-특이 단일-도메인 단일클론 항체 HM3 (여기에 참고문헌으로 병합된 WO 2012/145469에 공개)를 암호화한다. pMH288의 벡터 지도가 도 2A에 보여준다; CAR.HN3의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 여기에 서열번호 17 및 18로 제시된다. 두 번째 GPC3-특이 CAR은 렌티바이러스 벡터 pMH289 로부터 발현되며, 이는 마우스 GPC3-특이 항체 YP7의 인간화된 scFv를 암호화한다. 마우스 항체 YP7은 WO 2013/18154에 공개되었으며, 이는 여기서 참고 문헌으로 병합되어 있다. pMH289의 벡터 지도가 도 2B에 보여 진다; CAR.hYP7의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 여기에 서열번호 15 및 16으로 제시된다. 세 번째 CAR구조체는 GPC2를 타겟으로 하며 및 렌티바이러스 벡터 pMH290에 의해 암호화 되며, 이는 GPC2-특이 단일-도메인 단일클론 항체 LH7 ((Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 114(32):E6623-E6631, 2017)에 공개 됨))를 암호화 한다. pMH290의 벡터 지도가 도2C에 보여 진다; CAR.LH7의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 여기서 서열번호 19 및 20으로 제시된다. HN3, 인간화된 YP7 (hYP7) 및 LH7의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 상기 IV 부분에 제공 되었으며, 및 서열번호 25-32로 제시 되었다.
실시예시 2: 재료 및 방법 (Materials and Methods)
이 실시예시는 렌티바이러스 생산 및 적정방법, T 세포 활성화 및 형질도입 방법, 및 실시예시 3에서 서술된 연구와 관계되는 기능적 에세이를 서술한다.
렌티바이러스 생산, 농축 및 적정 (Lentivirus production, concentration and titration)
293T 세포를 형질도입 (transfection) 18-24 시간전에 10 cm 접시 (7.0×106 세포/접시)에 접종하여 형질도입 시점에서 단일층의 세포 밀도가 최적 90% 집합체에 도달되도록 하였다. 형질도입 약 30-60 분전에, 세포 상등액은 제거하고 및 5 ml의 완전 배지 (complete medium) ((둘벡코의 수정된 이글 배지 (Dulbecco’s modified Eagle medium; DMEM)) 플러스 혈청 및 항생제로 대치 하였다.
각 접시를 위하여, 총 16 μg의 DNA ((8 μg 렌티벡터 플라즈미드, 2 μg 엔벨롭핑 플라즈미드 MD2G (enveloping plasmid MD2G) 및 6 μg 팩키징 플라즈미드 (packaging plasmid) PAX2))를 500 μl의 혈청-없는 DMEM 배지에 희석시키고 및 볼텍스하여 살살 섞었다. 별도로, 48 μl 칼훽틴™ (CalFectin™)(SignaGen Laboratories; DNA:CalFectin™ = 1:3)을 500 μl의 혈청-없는 DMEM 배지에 희석 시키고 및 살살 섞었다. 희석된 칼휄틴 (CalFectin™)시약을 그후 바로 희석된 DNA 용액과 섞고 및 칼훽틴-DNA 혼합체가 형성되도록 볼텍스 하였다. 혼합물은 10 분 동안 실온에서 배양시켰다. 다음에는, 칼훽틴-DNA 혼합체를 각 접시에 있는 배지에 한 방울씩 첨가시키고 및 플레이트를 살살 돌려서 균질화 시켰다.
형질 도입 후 48-72시간에 세포 상등액으로부터 바이러스를 수집하였다. 상등액은 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리시키고 및 그후 0.45 μm 휠터를 통해 휠터 시켰다. 렌티바이러스를 농축시키기 위해, 투명하게 한 상등액을 멸균된 용기로 옮기고 및 3 부피의 투명하게 한 상등액을 1 부피의 렌티-X 농축제 (Lenti-X Concentrator) (Clontech)와 합쳤다. 혼합물은 4°C에서 30 분에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 샘플은 그후 1,500 x g에서 45 분 동안 4oC에서 원심분리시켜, 회백색 침전물이 형성 되었다. 상등액은 제거시키고 및 침전물은 다시 원래 부피의 1/10에서 1/100의 부피의 완전 DMEM을 사용하여 재 현탁 시켰다.
렌티바이러스 적정 (Lentivirus titration)
293 T 세포는 웰당 1 ml의 성장 배지 (10% FBS가 보충된 DMEM)가 있는 12-웰 플레이트에 1에서 5 x 105 세포/웰의 밀도로 접종시켰다. 한 웰은 세포 수를 세기 위해 사용되었으며 및 다른 웰은 비-형질도입된 대조군 (NI)으로 사용되었다. 다른 웰들은 500 μl, 100 μl, 50 μl, 20 μl 또는 10 μl의 거친 상등액 (농축되지 않은)으로 두 개씩으로 형질 도입시켰다. 각 웰당 부피는 성장 배지로 500 μl로 맞추었다. 농축된 바이러스 샘플들을 위하여, 세포는 500 μl의 새로운 성장 배지에 1 μl, 0.1 μl, 0.01 μl, 0.001 μl 또는 0.0001 μl의 벡터로 형질도입 시켰다.
3 일 후에, 세포들은 1ml PBS로 세척시키고 및 웰 당 200 μl의 트립신/EDTA (trypsin/EDTA)를 첨가시키고 37oC에서 1 분 동안 배양시켜 분리시켰다. 성장 배지 (800 μl)를 각 웰에 첨가시켜 세포를 다시 현탁 시켰다. 이 단계는 트립신 및 EDTA를 불활성화 시킨다. 세포는 그후 5-ml FACS 튜브에 옮기고, 500 x g 및 4°C에서 5 분 동안 원심분리 시켰으며 및 상등액은 제거되었다. 세포는 FACS 버퍼 ((PBS에 있는 5% BSA, 0.01% 소듐 아자이드(sodium azide))에 있는 1 μg/ml 세툭시맵 (cetuximab)으로 얼음 위에서 1 시간 동안 염색시켰다. 세포는 PBS 로 1 X 세척시키고, 500 x g 및 4°C에서 5 분 동안 원심분리 시키고 및 침전물은 적절한 풀루오로크롬 (fluorochrome)이 있는 2차 항체에 재현탁 시켰다. 2차 항체는 FACS 버퍼에서 또한 희석시켰다.
세포는 얼음위에서 1 시간 동안 염색시켰으며 및 그후 PBS에서 1X 세척시키고, 이어서 500 x g 및 4°C에서 5 분 동안 원심분리 시켰다. 침전물은 500 μl of PBS에 있는 1% 포름알데하이드 (formaldehyde)에 재현탁 시키고 및 실온에서 5 분 동안 배양시켰다. 이 단계는 세포를 고정시키고 및 벡터 입자를 불활성화 시킨다.
고정된 세포는 PBS로 1X 세척시키고 및 500 x g 및 4°C에서 5 분 동안 원심분리 시켰다. 침전물은 1 ml PBS에 재현탁 시켰다. 세포는 유동 세포분석을 사용하여 CAR 발현이 분석되었다.
T 세포 활성화 및 형질도입 프로토콜 (T cell activation and transduction protocol)
DYNABEADSTM 인간 T-활성제 (Human T-Activator) CD3/CD28 (Life Technologies)를 바이알에 재현탁시키고 및 바람직한 부피를 튜브에 옮겼다. 1 ml의 PBS 또는 성장 배지를 첨가시키고 및 5 초 동안 볼텍스하여 섞었다. 바이알은 원심분리 시키고 및 상등액은 버렸다. 세척시킨 DYNABEADSTM는 바이알로부터 취한 초기 비드 부피와 같은 부피의 배지(RPMI1640+10% FBS)에 재현탁 시켰다.
얼린 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs)는 녹이고 및 성장배지 (RPMI1640 + 10% FBS)에 재현탁 시켰다. 세포수는 트리판 불루 시약 (trypan blue reagent)을 사용하여 세었다. 세포 (1×106)는 1ml 배양 배지로 24-웰 플레이트에 접종시켰다. DYNABEADSTM 인간 T-활성제 (Human T-activator) CD3/CD28를 비드-대비-세포 비율이 2:1에서 첨가시키고 및 50 U/ml IL-2를 첨가시켰다.
24 시간 배양 후에, PBMCs는 렌티바이러스 (MOI 가 5)와 함께 10 μg/mL 프로타민 설페이트 (protamine sulfate) 존재 하에 1000g에서 60분 조건에서 스핀접종되었다. 세포는 그 후 다시 바이러스 상등액에 재현탁시키고 및 50 U/ml IL-2를 유지시키면서 하룻밤 동안 배양시켰다.
다음 날, 세포는 윈심분리시키고 및 100 IU/mL의 IL-2가 첨가된 새로운 RPMI1640 + 10% FBS 배지에 재현탁시켰다.
다음 10일 동안, 배양은 세포 크기 및 모양을 주목하여 매일 점검되었다. 세포 줄어듬 및 감소된 증식율은 고갈된 세포 배양에서 전형적으로 관찰되었다. 완전한 재-현탁 후에 세포는 매 이틀마다 세었다. 세포의 밀도가 2.0 × 106 세포/ml를 넘거나 배지가 황색으로 바뀔 때, 배양은 100 U/ml IL-2를 함유하는 배양배지에서 0.5-1 × 106 세포/ml의 밀도로 다시 나누어졌다. 세포 성장 키네틱스 및 부피가 세포가 활성화로부터 휴지기로 들어갔다는 것을 제시할 때, 세포는 기능 에세이에 사용되거나 또는 저온보관에 사용 되었다.
기능 에세이 (Functional assay)
루시훼라제 (Luciferase) 발현하는 타겟 세포 (2×103)를 50μl 배양 배지에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종시켰다. CAR T 세포 (효능 세포, effector cells)는 효능 (E)/타겟 (T) ((Effector (E)/Target (T))의 다른 비율로 제조되었다. 50 μl의 CAR T 세포가 각 웰에 첨가되었으며 및 37oC에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 각 효능제:타겟 (E:T) 비율은 삼중 샘플에서 수행 되었다. 다음 날, ELISA로 사이토카인의 수준을 측정하기 위하여 상등액이 수집되었으며 및 -20oC에 보관되었다. 종양 세포를 용해시키기 위하여 스테디 Glo 루시훼라제 시약 (Steady Glo luciferase reagent) (Promega)이 각 웰에 첨가되었으며 및 플레이트는 적어도 5 분 동안 빛으로부터 보호하면서 실온에서 배양시켰다. 발광은 빅터 (Victor) (PerkinElmer)로 측정되었다. 결과는 종양 혼자만 있는 웰에서의 루시훼라제 활성을 근거로하여 퍼센트 킬링으로 분석 (percent killing) 되었다:[% 킬링 (killing)=100-((효능제 및 타겟세포가 있는 웰로부터의 RLU)/(타켓 세포가 있는 웰로부터의 RLU)X100)].
실시예시 3: GPC3-타겟된 CARs는 GPC3-발현하는 세포 주의 세포독성을 유도하며 및 동물 모델에서 GPC3-양성 종양의 종양 부피를 감소시킨다
이 실시예시는 CAR.HN3 및 CAR.hYP7를 발현하는 T 세포의 실험관 내 및 생체 내 세포 독성을 서술한다.
렌티바이러스 벡터 pMH288 (CAR.HN3 발현하는) 및 pMH289 (CAR.hYP7 발현하는)의 T 세포 형질도입 효율이 항-huEGFRt 항체 세툭시맵을 사용하여 유동 세포분석 (flow cytometry)으로 평가되었다. CAR.HN3 (도 3A) 및 CAR.hYP7 (도 3B)를 암호화하는 렌티바이러스 벡터는 각각 T 세포의 65 % 및 45.4 %를 형질 도입시켰다. 인간 혈청 IgG가 대조군으로 사용되었다(도 3C).
GPC3+ G1 세포, Hep3B 세포 HepG2 세포 및 Huh7 세포, 및 GPC3- A431 세포, T3M4 세포 및 IMR32 세포를 포함한 몇몇의 인간 세포 주에서 CAR.hYP7 T 세포의 세포독성이 검사 되었다. 각 세포주를 위해, 효능제: 타겟의 비율은1:2, 1.5:1, 5:1 및 16:1가 사용되었다. CAR.hYP7 T 세포는 모든 GPC3-양성인 세포주에 (도 4A-4D)에는 세포독성이 있었으나, GPC3-음성인 세포 주 (도 4E-4G) 에서는 세포독성이 없었다.
CAR.hYP7 T 세포로의 처치가 배양에서 GPC3-양성인 세포의 IFN-γ 생산을 유도하는지 결정하기 위하여 다른 연구가 수행되었다. Hep3B, Huh7 및 G1 세포를 가짜-처치 (mock-treat) 또는 CAR.hYP7 T 세포로 처치시켰다. 도 5에서 보여준 대로, CAR.hYP7 T 세포는 세 개의 모든 타겟 GPC3-양성 종양세포에서 IFN-γ 분비를 유도 한다.
GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 마우스에서 GPC3-양성 종양 성장을 억제시키는 능력이 있는지를 검사하기 위한 연구가 수행되었다. 마우스는 i.p.로 0 일째 날에에 4백만 Hep3B 세포가 주사 되었다. 10 일째 날에, 마우스는 가짜로-주사되거나 (mock-injected) 또는 PBS, 10 백만 CAR.HN3 T 세포 (HN3-10 M), 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-10 M), 20 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-20 M) 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-40 M)로 주사되었다. 종양의 크기는 생물발광 이미징으로 (bioluminescence imaging) 측정되었다. CAR.hYP7 T로의 처치는 (검사된 모든 농도에서) PBS-처치한 동물이나 가짜로-처치된 동물과 비교하여 상당한 종양 부피의 감소의 결과를 보였다 (도 6).
마우스에 Hep3B 이종이식된 종양 (xenograft tumors)에 대해서도 CAR.hYP7 T 세포의 항-종양 효과의 지속성이 평가되었다. 마우스는 4 백만 Hep3B 세포로 0 일에 i.p.로 주사되었다. 10일 째 날에, 마우스는 가짜로-주사되거나 또는 PBS, 10 백만 CAR.HN3 T 세포 (HN3-10 M), 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-10 M), 20 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-20 M) 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포 (hYP7-40 M)로 주사되었다. 첫 번째로, 종양 부피는 처치 후 3 주까지 측정되었다. PBS-처치된, 가짜로-처치된 및 CAR-HN3로-처치된 마우스에서는 시간이 지남에 따라 종양이 꾸준히 증가되었다. 반면에, 10백만 및 20 백만 CAR.hYP7 T 세포의 용량에서는, 종양 부피는 3 주 동안에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었으며, 40 백만 CAR.hYP7 T 세포의 용량에서는, 종양 부피는 상당히 감소되었다 (도 7A). 두 번째 연구는 Hep3B 종양-소유하는 마우스에서 항-종양 활성을 7 주에 걸쳐 평가하였다. 이 연구는 PBS, 10 백만 CAR.HN3 T 세포, 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로 처치한 마우스에 대하여 평가하였다. 결과는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포의 용량은 종양 부피의 감소의 결과를 보였으며 및 감소된 종양 부피는 연구하는 7 주에 걸쳐 유지되는 결과를 보였다 (도 7B). Hep3B-종양 소유 마우스의 생존은 Hep3B 세포 접종 후 70일까지 또한 평가되었다. 이 연구는 PBS, 10 백만 CAR.hYP7 T 세포 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로 주사된 마우스를 추적하였다. 10 백만 및 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로의 처치는 50% 및 100% 생존을 각각 유도하였다. PBS-처치된 마우스는 하나도 생존하지 않았다 (도 7C).
다음에는, CAR.hYP7 T 세포가 다른 GPC3-양성 종양 모델에서 검사 되었다. HepG2 이종이식된 NSG 마우스에서 가짜로-처치 또는 10 백만 또는 40 백만 CAR.hYP7 T 세포로 처치되었다. 도 8A-8D에서 보여준 대로, 이 두 어느 용량의 CAR.hYP7 T 세포로의 처치에서 20일의 연구 기간동안 종양 부피의 감소의 결과를 보였다.
실시예시 4: GPC3-타겟하는 CAR 연구를 위한 재료 및 방법 (Materials and methods for GPC3-targeted CAR studies)
이 실시예시는 실시예시 5에서 서술된 연구를 위한 실험적 과정을 제공 한다.
세포 배양 (Cell culture)
인간 HCC 세포 주 Hep3B는 국가 암연구소 ((National Cancer Institute (NCI), Bethesda, Maryland))로부터 얻었다. HepG2 ((간아세포종 (hepatoblastoma)), A431 ((상피 종양 (epidermal carcinoma)), 및 HEK-293T 세포주는 미국 타입 배양 수집 (American Type Culture Collection)(ATCC)으로부터 구입하였다. G1은 인간 GPC3를 안정적으로 발현하는 형질도입된 A431 세포 주이다. Hep3B 및 HepG2는 NCI Frederick (Day et al., Pigment Cell Melanoma Res 22: 283-295, 2009)으로부터 얻은 반딧불 루시훼라제 (firefly luciferase)를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입 시켰다. 루시훼라제-발현하는 Huh-7 세포 주, HCC 세포 주는 베일러 의과 대학 (Baylor College of Medicine)으로부터 얻었다. 상기 언급된 세포 주들은 10% FBS, 1% L-글루타민 (L-glutamine), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)으로 보충된 DMEM에서 37oC에서 5% CO2로 가습화 된 대기 (humidified atomosphere)에서 배양되었다. T3M4 (인간 췌장 암 세포 주) 세포는 NCI로부터 얻었으며 및 루시훼라제를 발현하도록 제작되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (Peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs)는 건강한 공여자의 혈액으로부터 피콜 (Ficoll) (GE Healthcare)로 제조사의 안내에 따라 분리되었다. HCC 환자로부터 유래된 PBMCs는 NCI로부터 얻었다. 저켓 세포 (Jurkat cells)는 또한 ATCC로부터 구입했다. 이들 세포들은 10% FBS, 1% L-글루타민 (L-glutamine), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)으로 보충된 RPMI-1640에서 37oC에서 5% CO2로 가습화 된 대기 (humidified atomosphere)에서 배양되었다. 모든 세포주들은 형태 및 성장속도로 진짜임이 입증이 되었으며 및 마이코플라즈마 (mycoplasma)는 없었다.
GPC3-타겟된 CARs의 제작 (Generation of GPC3-targeted CARs)
hYP7로부터의 GPC-특이 scFv 및 단일 도메인 항체 단편 HN3는 EF-1α 프로모터-근거한 렌티바이러스 발현 벡터 pWPT (Addgene)에 각각 프레임이 맞게 서브클론 (subcloned) 되었다. 이 구조체들은 도 10B에서 (또한 실시예시 1 참조) 제시된 대로 CD8α 힌지 (CD8α hinge) 및 막통과 부위 (transmembrane regions), 4-1BB 동시자극 도메인 (4-1BB costimulatory domain), 세포내 CD3ζ(intracellular CD3ζ), 자가-절단 T2A 서열(self-cleaving T2A sequence), 및 huEGFRt를 암호화하는 발현 카셋트 (expressing cassettes)를 함유한다. 최종 구조체는 서열 분석으로 확인되었다.
렌티바이러스 생산, T-세포 형질도입 및 확장 (Lentivirus production, T-cell transduction and expansion)
재조합 GPC3-CAR 렌티바이러스 벡터들은 에드젠 (Addgene) 으로부터 구한 패캐징 플라즈미드 psPAX2 (packaging plasmid psPAX2)와 엔벨롭핑 플라즈미드 pMD2.G (enveloping plasmid pMD2.G)를 함께 HEK-293T에 칼홱틴 (Calfectin) (SignaGen)을 사용하여 형질도입 시켜 생산되었다. 렌티바이러스 입자는 형질도입 72 시간 후에 상등액으로부터 수집되었으며 및 렌티-X 농축기로 (Lenti-X concentrator) (Clontech) 제조사의 안내에 따라 100-배 농축시켰다. PBMCs는 오클라호마 혈액 연구소 (Oklahoma Blood Institute)로부터 구입하였으며 및 항-CD3/항-CD28 항체-코팅된 비드 (anti-CD3/anti-CD28 antibody-coated beads)(Invitrogen) 로 비드 대 세포의 비율이 2:1로 제조사의 안내에 따라 사용하여 IL-2 존재 하에서 24 시간 동안 자극시켰다. CAR T 세포는 이전에 서술된 대로 생산되었다 (Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A 114: E6623-E6631, 2017). 시간이 지남에 따라 T 세포의 수를 추적하기 위하여, 트리판 블루를 사용하여 생존 세포의 수를 세었다.
유동 세포분석 (Flow cytometry)
T 세포에서 GPC3 CARs의 형질도입 효율은 항-EGFR 인간 단일클론 항체 세툭시맵 (cetuximab) (Erbitux) 및 염소-항-인간 IgG-파이코에리틴 (goat-anti-human IgG-phycoerythrin) (PE) 또는 알로파이코시아닌 (APC)-접합된 항체 (allophycocyanin (APC)-conjugated antibody) (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출되었다. 저켓 T 세포 (Jurkat T cells)에서의 CAR 발현은 GPC3-hFc 융합 단백질 (GPC3-hFc fusion protein) 및 염소-항-인간 IgG-PE-접합된 항체 (goat-anti-human IgG-PE-conjugated antibody)를 사용하여 측정되었다. PE-접합된 항-CD3, 항-CD4, 및 항-CD8 항체들은 이바이오사이언스 (eBioscience)에서 구했다. 데이터 수집은 FACSCanto II　(BD Biosciences)를 사용하여 수행 되었으며 및 플로조 소프트웨어 (FlowJo software) (Tree Star)를 사용하여 분석 되었다.
세포독성 에세이 (Cytotoxicity assay)
GPC3-특이 CARs로 형질도입된 T 세포의 세포독성은 이전에 서술된 대로 (Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A 114: E6623-E6631, 2017) 루시훼라제-근거한 에세이로 측정되었다. 간략하게, CAR T 세포 및 루시훼라제-발현하는 GPC3-양성 ((G1, Hep3B, HepG2, Huh-7) 및 GPC3-음성 (A431, T3M4) 종양 세포는 24 시간 동안 효능제 대비 타겟 (E:T) 비율을 다르게하여 배양시켰다. 루시훼라제 활성은 루시훼라제 에세이 시스템 (Promega)을 사용하여 빅토 (Victor) (PerkinElmer)에서 측정되었다. CAR-발현하는 T 세포의 세포독성은 또한 인큐사이트-FLR 플렛폼 (IncuCyte-FLR-Platform) (Essen BioScience)를 사용하여 검사하였다. 간략하게, T 세포는 GFP-발현하는 HepG2 종양세포에 E:T 비울 2:1 로 첨가 시켰다. 이미지는 매 2 분다 140 시간 동안까지 얻었다. 생존세포의 수는 GFP 발현에 근거하여 정량화 되었다. 세포 죽임 활성 (cell killing activity)은 인큐사이트 줌 간세포 이미징 시스템 (IncuCyte Zoom liver cell imaging system)을 사용하여 분석되었다.
사이토카인 에세이 (Cytokine assay)
T 세포와 종양 세포를 동시-배양한 24 시간 후에 사이토카인 수준을 인간 사이토카인 22-프렉스 판넬 (human cytokine 22-plex panel) ((그랜자임 B (granzyme B), GM-CSF, IFN-g, TNF-a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, CCL-3, CCL-4, CCL-19, CCL-20, CX3CL1, CXCL-11, CXCL-8))을 사용하여 루미넥스 시스템 (Luminex system) (Thermo Fisher Scientific)에서 분석되었다.
단일-세포 사이토카인 프로화일링에 의한 T 세포 다기능성 평가 (T cell polyfunctionality evaluation by single-cell cytokine profiling)
저온보관된 CAR T 세포 생산물을 녹이고 및 IL-2 (10 ng/ml)가 있는 완전 RPMI 1640 배지에서 배양시켰다. 하룻밤 동안 회복시킨 후, 생존 CAR T 세포는 피콜 (Ficoll)을 사용하여 강화시켰다. CD4+/CD8+ T 세포 서브셋트 (subset)는 항-CD4 (anti-CD4) 또는 항-CD8 마이크로비드 (anti-CD8 microbeads) (Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리되었으며, 및 Hep3B 또는 G1 세포로 1:1의 비율로 20 시간 동안 자극시켰다. 다음에는, 이전에 서술된 대로의 방법 (Ma et al., Cancer Discov 3: 418-429, 2013; Rossi et al., Blood 132: 804-814, 2018; Xue et al., J Immunother Cancer 5: 85, 2017)을 사용하여 단일 세포 기능적 프로화일 (single cell functional profile)이 결정되었다. 프로화일은 효능제성 (effector) ((그랜자임 B (granzyme B), IFN-g , CCL-3, Perforin, TNF-a, TNF-b)), 자극성 (stimulatory) (GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, IL-21), 조절성 (regulatory) (IL-4, IL-10, IL-13, IL-22, TGF-b1, sCD137, sCD40L), 화학친화성 (chemoattractive) (CCL-11, IP-10, CCL-4 , RANTES), 및 염증성 (inflammatory) (IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F, MCP-1, MCP-4) 그룹으로 분류 되었다. 다기능성 CAR 생산 T 세포는 생산된 각 단백질의 양으로 커플된 세포당 미리지정된 펜넬로부터 적어도 2 단백질을 동시-분비하는 세포로 정의된다. 더 나아가, 각 샘플의 PSI는 미리 지정된 형식 (prespecified formula) (Ma et al., Cancer Discov 3: 418-429, 2013)을 사용하여, 다기능적 세포의 퍼센트로서 정의 되고, 그런 세포들에서 분비되는 단백질의 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity) (MFI)를 곱하여 계산 되었다.
면역조직화학 (Immunohistochemistry)
인간 HCC 조직 및 정상 조직 마이크로에레이는 US 바이오멕스 (US Biomax)로부터 구입되었으며, 및 항-GP3 항체 YP7 (anti-GPC3 antibody YP7)로 면역염색을 하였다. 모든 조직 샘플은 염색을 위하여 히스토서브회사 (Histoserv Inc. )(Germantown, MD)로 보내졌다.
인간 정상 조직 cDNA 어레이 (Human Normal Tissue cDNA Array)
인간 정상 조직 어레이 (tissue array)는 오리젠(Origene)으로부터 구입했다. 이 판넬은 사람의 다른 위치에 있는 모든 주된 정상 조직을 커버하는 48 샘플을 함유한다. GPC3 프라이머 (GPC3 primer) 및 RT2 SYBR 그린 qPCR 매스터믹스 (RT2 SYBR Green qPCR Mastermix)는 퀴아젠(Qiagen)으로부터 구입하였다. 실시간 정량 (Real-time quantification)은 Applied Biosystems 7900HT 실시간 PCR 시스템에서 수행되었다. 결과는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 분석되었다.
웨스턴 블럿팅 (Western Blotting)
세포는 얼음으로-차게한 용해 버퍼 (ice-cold lysis buffer) (Cell Signaling Technology)로 용해시키고, 및 10,000g에서 10분 동안 4°C에서 원심분리 시켜 투명하게 하였다. 단백질 농도는 제조사의 설명서에 따라 비신초니닉 에시드 에세이 (Bicinchoninic acid assay) (Pierce)로 측정하였다. 전기영동을 위해 20 μg의 세포 용해액을 4-20% SDS-PAGE 겔에 올렸다. 항-GPC3 항체 YP7은 PCT Publication No. WO 2013/181543 및 Phung et al. (MAbs 4(5):592-599, 2012)에 서술되어 있다. 항-활성-β-카테닌 항체 (anti-active-β-catenin antibody)는 밀리포아 (Millipore)로부터 구했다. 모든 다른 항체는 셀 시그날링 테그널로지 (Cell Signaling Technology)로부터 구했다.
크리스퍼 / 카스9 -매개하는 GPC3 편집 ( CRISPR / Cas9 -mediated editing of GPC3 )
GPC3의 다른 엑손을 타겟팅하는 sgRNAs는 하기의 표에 목록화 되어 있다. 렌티크리스퍼v2 (lentiCRISPRv2) 발현 벡터는 아드젠 (Addgene)(plasmid #52961)의 생산물이다. 간략하게, 벡터는 BsmBI으로 소화시키고 및 겔 추출 키트 (Gel Extraction Kit) (Qiagen)를 사용하여 겔 정제시켰다. 이전에 서술된 대로 프로토콜에 따라 (Sanjana et al., Nat Methods 11: 783-784, 2014; Shalem et al., Science 343: 84-87, 2014), 각 타겟 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드 쌍을 어닐시키고 (annealed) 및 직선화시킨 렌티크리스퍼v2 벡터에 붙여 gRNA-발현 플라즈미드를 제조시켰다. GPC2를 타켓팅하는 sgRNA는 대조군으로 사용되었다.
Hep3B는 gRNA-발현하는 플라즈미드 (gRNA-expressing plasmids)로 리포훽타민2000 (LIPOFECTAMINE 2000) (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 형질도입 시켰다. 세포는 그후 37oC에서 형질도입 후 72 시간 동안 배양시켰다. 다른 gRNA-발현하는 플라즈미드의 세포 증식에 대한 효과는 크리스탈 바이올렛 에세이 (crystal violet assay)를 사용하여 결정하였다.
Figure pct00036
AFP 에세이 (AFP assay)
혈청 AFP 수준은 효소-연결된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay) (GenWay Biotech)를 사용하여 제조사의 안내에 따라 측정하였다.
작은방울 디지털 PCR (Droplet digital PCR)
T 세포로부터의 유전체 DNA는 후렉시진 DNA키트 (FlexiGene DNA kit)(QIAGEN)를 사용하여 분리되었다. 작은 방울 디지털 PCR은 QX200 작은방울 디지털 PCR 시스템(QX200 droplet digital PCR system) (Bio-Rad)에서 제조사의 아내에 따라 수행되었다.
동물 연구 (Animal Studies)
5 주-령의 여성 NOD/SCID (NSG) 마우스 (NCI Frederick)를 케이지에 넣고 (housed) 허가된 프로토콜에 하에서 처치되었다. 확립된 복강내 (intraperitoneal) (i.p.) Hep3B 및 HepG2 모델을 위하여, 3 백만 루시훼라제-발현하는 Hep3B 또는 2 백만 루시훼라제-발현하는 HepG2 종양 세포를 마우스의 복강내 (i.P.)로 주사하였다. 숙주의 림프구 부분 (lymphocyte compartments) 을 고갈시키기 위하여, CAR T 세포 융합 24시간 전에 모든 마우스에 200 mg/kg 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)를 복강 (i.p.)으로 주사하였다. Hep3B 모델을 위하여, 마우스는 무작위로 6 그룹으로 나누고 및 개별적으로 여러 다른 CAR T 세포로 다음과 같이 단지 한번 i.p.를 통해 주사하였다: (a) T 세포 없이 식염수만 (PBS); (b) 5 백만 비-형질도입된 T 세포 (non-transduced T cells) (가짜, Mock); (c) 5 백만 CAR (HN3) T 세포; (d) 5 백만 CAR (hYP7) T 세포; (e) 10 백만 CAR (hYP7) T 세포; 또는 (f) 20 백만 CAR (hYP7) T 세포. HepG2 모델을 위하여, 마우스는 가짜 (mock) 및 CAR (hYP7)를 포함하는 2 그룹으로 무작위로 나누었다. 확립된 같은 자리 Hep3B 모델을 (orthotopic Hep3B model) 위하여, 마우스는 간에 0.5 백만의 루시훼라제-발현하는 Hep3B 세포로 접종시켰다. 종양 획립 3 주 후에, 마우스는 CAR (hYP7) T 세포를 복강내로 또는 정맥주사로 한번 주입시켰다. 종양 성장 및 HCC 이종이식을 보유하고 있는 마우스의 생존을 검사하기 위하여, 모든 마우스에 3 mg의 D-루시훼린(D-luciferin) (PerkinElmer)을 i.p.로 주사하였으며 및 제노겐 IVIS 루미나 (Xenogen IVIS Lumina) (PerkinElmer)를 사용하여 10 분 후 매주 이미지화 하였다. 각 마우스에서 생체 발광 신호 흐름 (bioluminescence signal flux)을 초당 입방센티미터당 스테라디안 (steradian) 당 양자 (photons/s/cm2/sr)로서 분석하기 위하여 살아있는 이미지 소프트웨어 (Living Image software)가 사용되었다. 마우스는 생체 발광 신호가 5 ×1010에 도달되었을 때 안락사 시켰다.
HCC 종양 세포 성장에의 GPC3 적출 (GPC3 knockout) 효과를 측정하기 위하여, 2 백만 Hep3B 세포를 피하로 누드 마우스에 주사하였다. 종양이 형성되고 및 크기가 100 mm3에 도달되었을 때, 치료는 sgRNA5-2-발현하는 플라즈미드 (sgRNA5-2-expressing plasmid) 또는 빈 벡터 (empty vector)로 매 이틀마다 총 5번 종양내로 주사하여 시작되었다. 종양 크기는 일주일에 두 번 칼리퍼 (caliper)로 측정되었다. 종양 부피는 mm3 로 식:(a) × (b2) × 0.5 로 계산되었으며, 여기서 “a”는 종양 길이 및 “b”는 종양 넓이로 mm로 계산되었다.
독성학적 분석 (Toxicological analysis)
각 그룹으로부터의 세 마리 NSG 마우스가 독성학적 연구를 위해 선택되었다. 샘플들은 완전한 혈액 카운트 (completed blood counts) (CBC), 광범위한 혈청 화학(comprehensive serum chemistry) (VetScan, Abaxis Veterinary Diagnostics, Union City, CA) 및 내부 기관 무게를 위해 가공되었다. 이 분석들은 NCI-Frederick, MD 에 있는 병리/조직학기술 연구실 (Pathology/Histotechnology Laboratory)에 의해 수행 되었다.
통계 (Statistics)
모든 실험들은 결과의 재생산성을 결정하기 위하여 최소 3 번 반복되었다. 데이터는 프리즘 (Prism)(GraphPad Software) 소프트웨어를 사용하여 분석되었으며 및 평균 (mean)± SEM으로서 표시된다. 결과는 쌍이 아닌 스튜던트 t 테스트 (unpaired Student’s t test)(2-tailed)를 사용하여 분석되었다. P 값 <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주된다. 모든 통계적 분석은 프리즘 소프트웨어 (Prism software) 로 수행되었다.
실시예시 5: 간세포 종양 치료를 위한 글리피칸 3-타겟하는 키메릭 항원 수용체 T 세포 (Glypican 3-targeted chimeric antigen receptor T cells for treatment of hepatocellular carcinoma)
이 실시예시는 huEGFRt 및 항-GPC3 항체 hYP7 (anti-GPC3 antibody hYP7)의 결합 단편을 발현하는 T 세포가 간세포암의 마우스 모델에서 상당한 항-암 활성 및 왕성한 T 세포 활성화 및 확장을 보인다는 발견을 서술한다.
HCC 및 정상 조직에서 GPC3 발현 (GPC3 expression in HCC and normal tissues)
종양 및 정상조직에서 GPC3 발현을 분석하기 위하여, HCC가 있는 환자로부터의 46 쌍의 종양 및 인접한 비-종양 조직 (간 경화 및 간염)을 면역조직화학적으로 검사하기 위하여 YP7 항체가 사용되었다. GPC3 단백질은 메치된 종양-인접 조직에서 단지 2% (1/46)인 것에 비교하여 일차 HCC에서 50% (23/46)로 높게 발현되었다. 강한 GPC3 염색은 24 내지 40의 추가 HCC 조직 케이스 (60%)에서 발견되었으나, 어느 정상 간 조직에서는 보이지 않았다. CAR T-세포 치료에 대한 우려는 정상 조직에서 항원이 발현되기 때문에 타겟에 (on-target), tumor 이외(off-tumor)에의 독성의 잠재력이다. 여기서, GPC3 발현은 30 타입의 인간 정상 조직에서 분석되었다. 주목할 만하게도, GPC3 단백질은 뇌, 심장, 폐, 위, 소장, 대장, 신장, 췌장 비장, 신경 및 피부 포함하는 모든 필수적인 정상 조직에서는 없었다. 모든 정상 조직중에, 낮은 수준의 GPC3 단백질 발현은 고환에서만 검출되었다. GPC3 mRNA 수준이 또한 인간 정상 조직 에레이에서 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)로 또한 결정되었다. 단백질 프로화일과 일치하게, GPC3 mRNA 발현도 태반 이외에는 주된 정상 조직에서 발견되지 않았으며 (도 9), 이는 인간 태반에서 GPC3 발현되는 이전의 보고 (Khan et al., Histol Histopathol 16: 71-78, 2001)와 일치한다. 그후 GPC3의 세포 표면 발현이 암 세포주 판넬에서 유동 세포분석으로 조사되었다. YP7은 HCC 세포주 (Hep3B, HepG2 및 Huh-7)에 강하게 결합함은 물론 GPC3 과발현하는-A431 세포주 (G1)에서도 강하게 발현됨을 보였다. 반대로, YP7은 A431 및 T3M4 세포에는 결합하지 않음을 보였으며, YP7 항체에 의한 GPC3 발현 검출은 매우 종양 특이적임을 보여준다.
GPC3-특이 CAR T 세포 생성 (Generation of GPC3-specific CAR T cells)
인간 단일 도메인 항체 HN3는 GPC3의 N-엽 (N-lobe)을 인식한다 (도 10A) (Feng et al., Proc Natl Acad Sci U S A 110: E1083-1091, 2013). GPC3의 C-엽 (C-lobe)을 타겟하는 YP7 항체 (hYP7)는 면역원성의 위험성을 감소시키기 위하여 또한 인간화 되었다 (Zhang and Ho, Sci Reports 6: 33878, 2016). HN3 또는 hYP7 항체의 가변 부위는 4-BB 및 CD3z 내부도메인을 가진 CAR 발현 카셋트를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 프레임에 맞게 클론 되었다 (도 10B) (또한 실시예시 1 참조). 세포 추적 및 절제를 촉진하기 위하여, 잘라진 인간 상피 성장 인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)가 구조체에 병합되었고 및 CAR로부터 T2A 리보조말 스킵 서열 (T2A ribosomal skip sequence)에 의해 분리 되어있다. huEGFRt는 리간드 결합에 필수적인 도메인 및 타이로신 키나제 활성은 없으나 항-EGFR 단일클론 항체 세툭시맵 (cetuximab)의 결합 에피톱은 유지하고 있다 (Wang et al., Blood 118: 1255-1263, 2011). 도 2B에서 보여준 바와 같이, CAR 플라즈미드들은 건강한 공여자 또는 HCC 환자로부터의 일차 T 세포 (primary T cells)에 형질도입 시키고, 실험관 내에서 10-12 일 동안 확장시키고, 및 그후 HCC 세포 및 동물 모델에서 검사되었다. GPC3-타겟하는 CARs의 발현은 유 동 세포분석으로 결정되었다. 재조합 GPC3-인간 Fc(hFc) 융합 단백질로 검출된 바와 같이 두 CARs은 인간 저켓 T 세포 (human Jurkat T cells)의 표면에서 효과적으로 발현되었다. 추가로, 인간 1차 T 세포에서 CARs의 발현은 세포 표면 huEGFRt 발현을 통해 보여 졌다. 도 10C에서 보여 진 대로, CAR (HN3) 및 CAR (hYP7)의 형질도입 효율은 각각 76% 및 58% 였다. 실험관 내에서 11일 동안 확장시킨 후, 건강한 공여자로부터 유래된 CAR(hYP7) T 세포의 99% 이상이 CD3-양성이 되었으며, 이는 비슷한 빈도의 CD4+ (43%) 및 CD8+ (56%) T 세포 서브셋트(subsets)으로 포함되었다 (도 10D). 주목할 만하게도, HCC 환자-유래한 CAR (hYP7) T 세포에서 CD4+ T 세포 (14.9%)의 비율은 CD8+ T 세포 (57.2%)보다 상당히 더 낮았다. 놀랍게도, HCC 환자-유래한 CAR (hYP7) T 세포에서 ‘이중 음성 (double negative)’ (DN) T 세포로 알려진 CD3+CD4-CD8- T 세포가 27.9%로 검출되었다. 도 10E에서 보여 진 대로, 8 명의 다른 건강한 공여자로부터의 CAR (hYP7) T 세포는 항-CD3/CD28 비드로 초기 프라이밍 (initial priming)을 한 후에 11일에 걸쳐 15에서 60 배 확장을 보였다. 그에 비해, 4 명의 HCC 환자로부터의 CAR (hYP7) T 세포는 활성화 이후 11일에 단지 5에서 25 배만 확장되었다. 종합해보면, HN3 및 hYP7 항체에 근거한 CAR T 세포는 이들의 발현 수준, GPC3에 대한 결합능, 형질도입 효율 및 CD4+/CD8+ T 세포 비율에서 비슷한 값을 가진다. HCC 환자로부터 유래된 1차 T 세포는 CARs을 발현할 수 있고 및 배양에서 확장될 수 있다.
GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 실험관 내 항종양 활성( In vitro antitumor activity of GPC3-targeted CAR T cells)
GPC3를 타겟팅하는 T 세포가 GPC3-양성 종양 세포를 특이적으로 인식하고 및 죽일수 있는지를 결정하기 위하여, 루시훼라제-발현하는 (luciferase-expressing) 종양 세포를 사용하여 세포 용해 (cytolytic assay) 에세이가 확립되었다. 도 11A에서 보여 진 대로, GPC3-과발현하는 A431 (G1) 세포는 CAR (HN3) 및 CAR (hYP7) T 세포 둘 다에 의해 용량-의존적인 방식으로 효율적으로 용해되었다. 반면에, 두 CAR T 세포 모두 A431 및 T3M4를 포함한 GPC3-음성 세포에 대하여서는 최소의 용해 활성을 보였으며, 이는 CAR T 세포의 특이성을 제시한다. 건강한 공여자들 및 HCC 환자로부터 유래된 GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 용해 능력이 또한 비교 되었다. CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포에 대하여 여러 E:T 비율에서 CAR (HN3) T 세포보다 더 높은 용해 활성을 가진 것으로 나타났다 (도 11B 및 도 11C). E:T 비율 5 에서, HCC환자-유래한 CAR (hYP7) T 세포의 용해 활성은 Hep3B 세포에 대하여 평균 50%로서, 30% 에서 70%의 범위에 있었으며(도 11C), 이는 건강한 공여자-유래한 CAR (hYP7) T 세포의 평균 활성 (90%)보다 더 낮다 (도. 11B). 비교하여, 어느 기원의 가짜 T 세포로 처치된 Hep3B 세포에서는 최소의 세포 용해가 관찰되었다. 흥미롭게도, CAR (hYP7) T 세포는 항-CD3/CD28 비드로 초기활성을 통해 장기간 동안 확장에 들어갈 수 있었다 (도 11D). CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포에서 14일 또는 28일에 비슷한 수준의 세포 죽음을 유도하였다. Hep3B 세포에 추가하여, HepG2 및 Huh-7를 포함하는 다른 HCC 세포 주에 대하여 GPC3 CAR T 세포가 검사 되었다. 도 11F에서 보여준 대로, HepG2 및 Huh-7 세포는 높은 GPC3 수준을 발현하는 Hep3B 보다 더 적은 정도로 CAR (HN3) 및 CAR (hYP7) T 세포에 의해 용해되었다. GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 장기간 동시배양 동안에 종양 세포 용해의 증가 결과를 가져올 수 있는가를 결정하기 위하여, CAR (HN3) 또는 CAR (hYP7) CAR T 세포를 HepG2 와 E:T 비율 2:1 로 140 시간 이상 동안 배양시켰다. 처음에는, 가짜 T 세포와 비교하여 두 CAR T 세포 어느것도 HepG2 세포를 죽이지 않았다. 40 시간 및 그후에, CAR (hYP7) T 세포는 CAR (HN3) T 세포에 비교하여 HepG2 세포를 제거하는데 상당히 좀더 강력 했다 (도 11G). 종합적으로, GPC3-양성 종양 세포와 동시 배양할 때, CAR (hYP7) T 세포는 CAR (HN3) T 세포보다 좀더 나은 세포용해성 능력을 보여주었다.
GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 실험관 내 다중 사이토카인 및 케모카인 프로화일 ( In vitro multiplex cytokine and chemokine profiles of GPC3-targeted CAR T cells)
GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 항원-특이적인 방식으로 GPC3-양성 종양 세포를 인식할 수 있다는 것이 확립되었으므로, Hep3B 또는 HepG2세포에 노출시킨 후 CAR (HN3) 또는 CAR (hYP7) T 세포로부터의 사이토카인 및 케모카인 프로화일에 대한 4-BB의 효과를 결정하는 연구가 수행되었다. 도 12A에서 보여준 대로, GPC3-양성 종양 세포 존재에서는 가짜 T 세포 보다는 GPC3-특이 CAR T 세포에 의해서 더 많은 양의 모든 사이토카인이 생산되었다. Hep3B 또는 HepG2세포와 24 시간 동안 동시-배양시켰을 때, CAR T 세포 두 개 다는 상당히 높은 수준의 그랜자임 B (granzyme B) (2500-13000 pg/mL)를 분비하였다 (도. 12A). 4-1BB 동시-배양이 높은 수준의 Th1 사이토카인 (GM-CSF, IFN-γ, TNF-α 및 IL-12), 및 Th2 사이토카인 (IL-5 및 IL-13)을 유도하는 것이 또한 측정되었으며, 이는 Th1/Th2 표현형과 일치한다. 그러나, GPC3-특이 CAR T 세포는 단지 아주 낮은 수준의 IL-21 (<10 pg/mL) 만을 발현하며, 이는 Th17 세포에 의해 생산된다 (도 18). 사이토카인들 이외에, CAR (HN3) 및CAR (hYP7) T 세포는 림프구를 종양세포로 침투시키는 것을 촉진할 수 있는 CCL-3 및 CCL-4 케모카인 (chemokines) (400-2225 pg/mL)을 매우 높은 수준으로 분비하였다. 이 연구에서 분석된 사이토카인 및 케모카인의 완전한 판넬은 도 18에 보여준다. 전체적으로, CAR (hYP7) T 세포는 CAR (HN3) T 세포보다 상당히 더 많은 사이토카인 및 케모카인을 생산하며, 이는 이 두 CARs 사이에 항종양 활성에 차이가 있는 것과 일치한다.
단일 세포 근거한 GPC3-타겟하는 CAR T 세포의 다기능성 분석 (Single cell based polyfunctionality analysis of GPC3-targeted CAR T cells)
최근의 연구들은 단일 세포 수준에서 다중의 사이토카인/케모카인을 동시-생산할 수 있는, “다기능 (polyfunctional)” T 세포라고 불리는, T 세포가 암세포에 대한 강력하고 지속적인 세포 면역성을 전개하는데 기여하는 주요한 효능 세포라는 것을 보여주었다 (Ahmadzadeh et al., Blood 114: 1537-1544, 2009; Baitsch et al., J Clin Invest 121: 2350-2360, 2011). 우리의 CAR T 세포 생산물의 다기능성을 측정하기 위하여, 고-함량-단일-세포 다중 사이토카인 분석 (high-content single-cell multiplex cytokine analysis)을 적용하였으며 (Lu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 112: E607-615, 2015; Ma et al., Cancer Discov 3: 418-429, 2013), 이는 실험관 내에서 GPC3 항원으로 자극할 때 2개 또는 그 이상의 사이토카인을 생산하는 다기능 T 세포의 서브셋트를 동정하게 한다. 32-개 판넬 (32-plex panel)에는 T 세포의 주요 면역 요소들이 포함되어 있다. Hep3B 세포-자극된 CAR T 세포는 가짜 T 세포에 비교하여 다기능 세포의 퍼센트가 증가됨을 보여주었다. Hep3B 세포로 자극되었을 때, CAR (hYP7) T 세포는 CAR (HN3) T 세포보다 훨씬 더 높은 다기능성을 가졌다. 비슷하게, A431 세포 자극에 비교하여 G1 세포에 의해 자극되었을 때, CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포에서 강화된 다기능성이 관찰되었다. 또한 CD8+ T 세포가 CD4+ T 세포보다 좀더 다기능적임이 주목되었다. 더욱이, 다기능성 T 세포의 총체적 영향을 정량하기 위하여 이전에 서술된 다기능성 지수 (polyfunctional strength index) (PSI)가 사용되었다 (Ma et al., Cancer Discov 3: 418-429, 2013).샘플의 PSI는 다기능 세포의 퍼센트를 이들 세포에 의해 분비되는 사이토카인의 평균 신호 강도를 곱한 것으로 정의한다. 샘플의 전체적인 다기능성에 각 그룹의 기여도를 밝히기 위하여 PSI은 사이토카인 기능, -효능제, 자극제적, 조절제적, 및 염증적-에 의해 분류되었다. 효능제 사이토카인이 모든 다기능성 CD4+ CAR (hYP7) T 세포 및 대부분의 CD8+ CAR (hYP7) T 세포에 기여하는 반면에, Hep3B 세포에 의해 자극된 CD8+ CAR (hYP7) T 세포에서 조절제적 사이토카인 sCD137의 작은 퍼센트가 관찰되었다. 더 나아가, G1 세포로 동시-배양되었을 때, 효능제 및 화학친화력 분자 (chemoattractive molecules) (CCL-3 및 CCL-4와 같은)가 CD8+ CAR (hYP7) T 세포에 의해 좀더 생산되며, 이는 루미넥스 에세이 (Luminex assays)를 사용한 사이토카인 방출 측정과 일치한다. 한 샘플 내에서 모든 다기능 세브셋트를 구별하기 위하여, 다기능 히트 맵 시각화 (heat map visualization)가 사용되었다. Hep3B 또는 G1 세포로 자극되었을 때 CAR (hYP7) T 세포는 CAR (HN3) T 세포에 비교하여 가장 잘 발현되는 기능 그룹의 빈도수가 더 많다. 그랜자임 B (granzyme B), INF-γ, 퍼포린 (perforin) 및 sCD137을 함유하는 4-개 그룹 (4-plex group)은 Hep3B 자극 시 CD8+ CAR (hYP7) T 세포에 의해 발현되었다. G1-자극된 CD8+ CAR (hYP7) T 세포는 좀더 다기능적이었으며 및 그랜자임 B (granzyme B), INF-γ, CCL-3, CCL-4, 퍼포린 (perforin), TNF-α및 sCD137를 함유하는 7-개 그룹 (7-plex group)을 분비한다. 종합하면, CAR (hYP7)는 다기능 T 세포, 특히 CD8+ 세포독성 T 세포의, 좀더 탄탄한 활성 및 확장을 자극한다.
GPC3-타겟하는 CAR T 세포 처치에 대한 Wnt 시그날링의 효과 (The effect of Wnt signaling on GPC3-targeted CAR T-cell treatment)
이전의 연구들에서 GPC3가 Wnt 리간드와 상호작용하고 및 Wnt/Frizzled 결합을 촉진시킴으로써 HCC 세포 증식을 촉진하는 것이 알려졌다 (Capurro et al., Cancer Res 65: 6245-6254, 2005; Gao et al., Hepatology 60: 576-587, 2014; Gao et al., Nat Comm 6: 6536, 2015). GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 Wnt 시그날링에 영향을 줄 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 활성- 및 총 β-카테닌 (β-catenin) 수준이 측정되었다. 도 13A에서 보여준 대로, CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포와 E:T 비율 10:1로 동시-배양 6 시간 후에 가짜 T 세포에 비교하여 활성-β-카테닌 및 총 β-카테닌의 발현을 의미있게 감소 시켰다. 활성-β-카테닌 발현의 감소는 Hep3B 세포에서 CAR (hYP7) T 세포 처치 2 시간에 시작되기도 하였다 (도 13B). 그 외에, 쪼개진-폴리(ADP 라이보즈)폴리머레이즈 ((cleaved-Poly (ADP ribose) polymerase)) (PARP) 및 쪼개진 카스파 제-9 (caspase-9)의 발현의 증가로 증명되는 바와 같이 CAR (hYP7) T 세포는 Hep3B 세포의 사멸을 유도하였다. 그러나, CAR (HN3) T 세포는 β-카테닌 발현을 억제하지도 않았으며 및 배양 6 시간 후에 Hep3B 세포의 사멸을 유도하지도 않았다.
GPC3를 타겟팅하는 것이 Wnt 시그날링의 억제를 거쳐 HCC 종양 성장을 하향 조절하는지 여부를 더 나아가 조사하기 위하여, Hep3B 세포에서 GPC3 유전자를 유전적으로 편집하기 위하여 크리스퍼/카스9 기술 (CRISPR/Cas9 technique)이 사용되었다. GPC3의 다른 엑손을 타겟팅 하는 작은 안내 RNA (small guiding RNA) (sgRNA)를 암호화하는 구조체로 세포에의 형질도입은 GPC3 단백질의 상당한 감소를 야기했으며, 특히 엑손 5-타겟된 sgRNA (exon 5-targeted sgRNA) (5-2)는 GPC3 발현을 95% 이상 감소시켰다 (도 13 C). 5-2 sgRNA 처치는 활성-β-카테닌 및 총 β-카테닌의 발현을 하향조절 하였으며 (도 13C), 및 급격한 세포 죽음의 결과를 가져왔다. 그러므로, CAR (hYP7) T 세포 및 크리스퍼/카스9 (CRISPR/Cas9)-매개하는 GPC3의 유전자 편집 둘 다 HCC 세포에서 Wnt/β-카테닌 시그날링 (Wnt/β-catenin signaling)을 억제한다. 실험관 내 실험에 이어서, 크리스퍼/카스9 플렛폼 (CRISPR/Cas9 platform)으로 GPC3 타겟팅이 마우스에서 HCC 종양 성장을 지연시키는지 여부가 검사 되었다. Hep3B 세포가 누드 마우스에 피하로 접종되었다. 종양 접종 4 주 후, 마우스는 빈 플라즈미드 (empty plasmid) 또는 5-2 sgRNA를 암호화하는 플라즈미드로 정맥으로 주사 되었다. 도 13D에서 보여준 대로, 종양 성장은 빈 플라즈미드로 처치한 마우스와 비교하여 5-2 sgRNA 플라즈미드로 처치한 마우스에서 눈에 띄게 억제되었다. 중요하게, 5-2 sgRNA 처치는 또한 종양에서 활성-β-카테닌 및 총 β-카테닌 단백질 수준을 감소시키는 결과를 가져왔다(도 13E). 알파 태아단백질 (Alpha fetoprotein) (AFP)은 과거 몇 십년 동안 HCC의 바이오마커로 가장 널리 사용되어 왔다 (IuS, Vopr Med Khim 10: 90-91, 1964). 혈청 농도 20 ng/mL은 HCC 환자를 건강한 어른과 구별하는 절단값 (cut-off value)으로 보통 사용된다 (Trevisani et al., J Hepatol 34: 570-575, 2001). 높은 AFP 농도 (≥ 400 ng/mL)를 가진 HCC 환자는 더 큰 종양 크기를 가지며, 덩어리 형 또는 퍼진 형 (massive or diffuse types), 및 낮은 평균 생존율을 갖는 경향이 있다 (Fujioka et al., Hepatology 34: 1128-1134, 2001; Tangkijvanich et al., J Clin Gastroenterol 31: 302-308, 2000). 혈청 AFP는 크리스퍼/카스9-매개하는 GPC3 편집 전 및 후에 측정되었다. 도 13에서 보여준 대로, AFP 혈청 수준은 빈 플라즈미드로 주사 된 마우스에서 보다 5-2 sgRNA로 주사 된 마우스에서 의미있게 더 낮았으며, AFP 수준과 종양 크기 사이에 양성 관계가 있음을 보여준다. 전체적으로, 데이터는 GPC3 타겟팅은 Wnt/β-카테닌 시그날링 (Wnt/β-catenin signaling)을 억제함으로써 HCC 종양 성장을 억제할 수 있음을 제시한다.
이종이식된 마우스 모델에서 CAR (hYP7) T 세포는 HCC 종양 퇴행을 하게한다 (CAR (hYP7) T cells enable HCC tumor regression in xenograft mouse models)
생체내에서, GPC3-특이 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위하여, NSG 마우스에 루시훼라제-발현하는 Hep3B 세포 (Hep3B-luc)를 복강으로 주사했다. 12 일 후에, 가짜 또는 CAR T 세포의 단일 주입이 복강으로 투여되었다 (도 14A). 처치 2 주 후에, 가짜 T 세포로-처치된 그룹과 비교하여 다른 용량의 CAR (hYP7) T 세포를 가진 그룹은 모두 감소된 종양 부담을 보였다 (도 14B 및 도 14C). CAR (HN3) T 세포는 실험관 내에서 Hep3B 세포에 대하여 중간 정도의 세포독성 활성을 보였지만, CAR (HN3) T 세포로 처치된 마우스에서는 의미있는 종양 성장 억제가 관찰되지 않았다. 현저하게도, 5 백만 CAR (hYP7) T 세포로 처치된 그룹에서의 단지 50% 생존과 비교하여, 20 백만 CAR (hYP7) T 세포를 받은 NSG 마우스는 70일까지 재발 없이 100% 생존했다 (도 14D). GPC3-타겟하는 CAR T 세포가 처음에는 체중 손실을 야기했으나, 마우스는 점차적으로 체중을 다시 회복했다 (도 19A). 더욱이, 5 백만 (평균: 400 ng/mL) 또는 10 백만 (평균: 3 00 ng/mL) CAR (hYP7) T 세포로 처치한 마우스에서 혈청 AFP 수준은 처치 2 주 후에 가짜-T 세포로 처치한 마우스(평균: 20000 ng/mL)에서보다 의미 있게 더 낮았다 (도 14E). 주목할 만하게도, 20 백만 CAR (hYP7) T 세포로 처치된 마우스에서 AFP 수준은 25-78 ng/mL 범위 수준에 있었으며, 이는 인간 성인에서 절단 값 (cut-off value) (20 ng/mL)에 가까웠다.
유전적으로 수정된 T 세포의 생체 내에서의 탄탄한 확장 및 지속성은 또한 암을 가진 환자에서 지속될 만한 임상적 차도의 결정적 예측변수로 간주된다. 주입된 CAR T 세포의 지속성을 이해하기 위하여, CAR-특이 앰플리머 (amplimers)를 사용하여 작은방울 디지털 PCR (droplet digital PCR) (ddPCR)을 사용하여 CAR T 세포의 퍼센트가 평가되었다. 도 14F에서 보여준 대로, 3 주 처치 후에 5 백만 CAR (hYP7) 그룹에서 22.1%의 CAR 발현이 발견되었으며, 반면에 5 백만 CAR (HN3) 그룹에서는 단지 1.3% CAR 만 검출되었다. 더욱이, 10 백만 CAR (hYP7) 그룹에서는 26.5%의 CAR 통합이 검출되었으며, 종양 부담과 시간에 따른 T 세포 지속성 사이에 역 상관관계를 보여준다. 반대로, 10 백만 CD19 CAR T 세포-처치된 마우스에서는 단지 2.2%의 CAR 발현만이 검출되었으며, 이는 종양 항원 인식이 생체 내에서 주입된 T 세포의 생존을 유도함을 제시한다.
Hep3B 복강 전파 마우스 모델로부터, 마우스가 간 및 다른 조직 및 복부 내강에 있는 기관에 종양 병변이 전개됨이 발견되었다. 흥미롭게도, 5 백만 CAR (hYP7) T 세포로 처치된 마우스에서 Hep3B 종양이 국소적으로 자랐으며 및 마우스 간으로부터 먼 지방 조직에 국한되었으며, CAR (hYP7) T 세포는 종양이 간에서 접종되고 자라는 것을 방지하고 및 신장, 폐 및 심장과 같은 다른 기관으로 종양이 퍼지는 것을 방지함을 제시한다.
CAR (hYP7) T 세포의 효율은 또한 HepG2 복강 접종된 이종이식 마우스 모델 (xenograft mouse model)에서 평가되었다. NSG 마우스는 루시훼라제-발현하는 HepG2 세포 (HepG2-luc)로 복강 내로 주사 되었으며, 이어서 12 일 후에 20 백만 CAR (hYP7) T 세포로 주사 되었다 (도 15A). 도 15B 및 도 15C에서 보여 진 대로, 가짜 T 세포로 처치된 마우스에서보다 21 째 날에 종양 유입은 훨씬 더 낮으면서, CAR (hYP7) T 세포는 종양 부담을 배경 수준으로 감소하고, 더 나아가 CAR (hYP7) T 세포의 아주 우수한 항종양 효율을 보여준다. CAR (hYP7) T 세포로 처치된 마우스는 일시적인 체중 감소를 가지나 기본 수준으로 되돌아오며 및 그 후에 안정적으로 남아 있으며(도 19B), 일시적인 사이토카인 방출 증상 (transient cytokine release syndrome)과 일치한다. CAR (hYP7) T 세포로 처치 5 주 후에, 종양 및 마우스 비장으로부터 얻은 유전체 DNA에서 ddPCR로 5.6% 및 19.5%의 CAR 발현이 각각 검출되었다 (도. 15D). 반대로, CD19 CAR T 세포는 어느 조직에도 유전자 삽입의 징후를 보이지 않았다. 더 나아가, Hep3B 복강 이종이식 마우스 모델에서의 관찰과 비슷하게, 인간 HepG2 세포는 마우스 간으로 이동하였으며, CAR (hYP7) T 세포는 종양 세포의 퍼짐을 제한하였다.
CAR (hYP7) T 세포의 항종양 활성은 더 나아가 임상적 관련성이 좀더 있는 같은 자리 이식 HCC 마우스 모델 (orthotopic HCC mouse model)에서 조사되었다. 50만 Hep3B-luc 세포가 NSG 마우스 간에 주사 되었으며, 및 종양 이식은 생체발광이미징 (bioluminescent imaging)으로 확인되었다 (도 16A). 21일째 날에 CAR (hYP7) T 세포는 복강으로 또는 정맥으로 마우스에 주입되었다. CAR (hYP7) T 세포의 투여 두 루트 모두는 대조 그룹에 비교하였을 때, 종양 크기의 감소를 유도하고 및 종양 성장을 의미 있게 억제시켰으나, 마우스에 정맥으로의 CAR T 세포 (hYP7 IV) 주사가 복강으로의 CAR T 세포 (hYP7 IP) 주사보다 더 큰 종양 퇴행을 가져오는 결과가 되었다 (도 16B-16C). 이 연구의 끝에, hYP7 IV 그룹에서 4 마리 마우스 중 3 마리가 간 종양이 없었으며, 반면에 가짜 T 세포 그룹의 모든 마우스는 커다란 종양을 가지고 있었다. 도 16D에서 보여준 것과 같이, CAR T 세포 주입 5 주 후에, hYP7 IV 그룹으로부터의 마우스 비장에서는 30.3%의 CAR가 검출되었으며, hYP7 IP 그룹으로부터의 마우스 비장에서는 단지 8.6%의 CAR가 존재하였고, 이는 마우스에서 각각의 투여 루트의 항종양 효율과 일치 하였다. 더욱이, 발광 이미징은 Hep3B 세포가 마우스 간에서 자라고, 및 CAR (hYP7) T 세포 주입은 극적으로 종양 성장을 억제하거나 또는 마우스에서 종양세포를 완전히 제거시키는 것을 보여주었다. 마지막으로, CAR (hYP7) T 세포 처치의 부작용 효과를 평가하기 위하여 독성학적 연구가 수행되었다. hYP7 정맥주사 그룹에 있는 마우스는 백혈구 세포 및 호중구성 백혈구 (neutrophils)가 증가함을 보였으며, 이는 생체 내에서 빠른 면역 반응에 관여될 수 있다 (표 8). 그 외에, 꼬리 정맥을 통하여 CAR (hYP7) T 세포를 받은 마우스 한 마리에서 알라닌 아미노트란스훼라제 (alanine aminotransferase) (ALT) 활성이 상승되었다; 그러나, 마우스 부검에서 간 손상의 대략적인 증거는 없었다. 처치된 마우스의 모든 기관들의 무게는 폐를 제외하고는 대조군 그룹의 기관들과 비슷했다. 측정된 다른 계수들에서 다른 의미 있는 차이는 보이지 ?附年?. 종합해 보면, 이러한 결과들은 CAR (hYP7) T 세포가 마우스에서 HCC 종양의 완전 퇴행을 유도할 수 있음을 보여준다.
Figure pct00037
Figure pct00038
공개된 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예의 관점에서, 제시된 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시예시들 일뿐 인 것을 인식하여야 하며 및 본 발명의 범위를 제한하려는 것을 간주되어서는 안 된다. 오히려 본 발명의 범위는 하기의 청구항에서 정의된다. 우리는 그러므로 우리의 발명은 이 청구항의 범위 및 정신 내에 있는 모든 것을 청구한다.
<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS TARGETING TUMOR ANTIGENS <130> 2020FPI-04-007/US <150> US 62/584,421 <151> 2017-11-10 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (GMCSFRss) <400> 1 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atccca 66 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide (GMCSFRss) <400> 2 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 3 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (CD8alpha hinge) <400> 3 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgac 135 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (CD8alpha hinge) <400> 4 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (CD8alpha TM) <400> 5 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 acc 63 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (CD8alpha TM) <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 7 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (4-1BB) <400> 7 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 8 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (4-1BB) <400> 8 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (CD3zeta signaling domain) <400> 9 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (CD3zeta signaling domain) <400> 10 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (T2A) <400> 11 gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide (T2A) <400> 12 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 13 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (huEGFRt) <400> 13 cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60 acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120 gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180 attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240 aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300 ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360 aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420 acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480 agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540 ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600 gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660 gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720 cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780 acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840 ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900 gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960 ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005 <210> 14 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (huEGFRt) <400> 14 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 180 185 190 Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 195 200 205 Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln 210 215 220 Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly 225 230 235 240 Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro 245 250 255 His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr 260 265 270 Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His 275 280 285 Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro 290 295 300 Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala 305 310 315 320 Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 325 330 335 <210> 15 <211> 2601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (pMH289) <400> 15 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacata tggaggtgca gcttgttgag tctggtggag gattggtgca gcctggaggg 120 tcattgagac tctcatgtgc agcctctgga ttcaccttca ataagaatgc catgaattgg 180 gtccgccagg ctccaggaaa gggtttggaa tgggttggcc gcataagaaa taaaactaat 240 aattatgcaa catattatgc cgattcagtg aaagccaggt ttaccatctc cagagatgat 300 tcaaagaact cactctatct gcaaatgaac agcttgaaaa ccgaggacac agccgtgtac 360 tattgtgtgg ctggtaactc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420 gcaggcggag gcggatcagg tggtggcgga tctggaggtg gcggaagcga cattgtgatg 480 acccagtctc cagactccct agctgtgtca ctgggagaga gggccactat caactgcaag 540 tccagtcaga gccttttata tagcagcaat caaaagaact acttggcctg gtaccaacag 600 aaaccagggc agcctcctaa actgctgatt tactgggcat ccagtaggga atctggggtc 660 cctgatcgct tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 720 caggctgaag acgtggcagt ttattactgt cagcaatatt ataactatcc gctcacgttc 780 ggtcagggga ccaagttgga gatcaaaact agtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca 840 acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 900 gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgacat ctacatctgg 960 gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac caaacggggc 1020 agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080 gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgagggca gaggaagtct tctaacatgc 1500 ggtgacgtgg aggagaatcc cggccctatg cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt 1560 gagttaccac acccagcatt cctcctgatc ccacgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt 1620 ggtgaattta aagactcact ctccataaat gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc 1680 acctccatca gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca 1740 catactcctc ctctggatcc acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca 1800 gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac 1860 ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa catggtcagt tttctcttgc agtcgtcagc 1920 ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga taagtgatgg agatgtgata 1980 atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa actggaaaaa actgtttggg 2040 acctccggtc agaaaaccaa aattataagc aacagaggtg aaaacagctg caaggccaca 2100 ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc gagggctgct ggggcccgga gcccagggac 2160 tgcgtctctt gccggaatgt cagccgaggc agggaatgcg tggacaagtg caaccttctg 2220 gagggtgagc caagggagtt tgtggagaac tctgagtgca tacagtgcca cccagagtgc 2280 ctgcctcagg ccatgaacat cacctgcaca ggacggggac cagacaactg tatccagtgt 2340 gcccactaca ttgacggccc ccactgcgtc aagacctgcc cggcaggagt catgggagaa 2400 aacaacaccc tggtctggaa gtacgcagac gccggccatg tgtgccacct gtgccatcca 2460 aactgcacct acggatgcac tgggccaggt cttgaaggct gtccaacgaa tgggcctaag 2520 atcccgtcca tcgccactgg gatggtgggg gccctcctct tgctgctggt ggtggccctg 2580 gggatcggcc tcttcatgtg a 2601 <210> 16 <211> 866 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (hYP7-CAR) <400> 16 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Asn Lys Thr Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 100 105 110 Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Gly Asn Ser Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys 180 185 190 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 195 200 205 Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 225 230 235 240 Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr 245 250 255 Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Ser Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 340 345 350 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 355 360 365 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 405 410 415 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 420 425 430 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 435 440 445 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 450 455 460 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser 485 490 495 Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu 500 505 510 Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu 515 520 525 Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys 530 535 540 Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys 545 550 555 560 Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly 565 570 575 Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile 580 585 590 Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp 595 600 605 Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile 610 615 620 Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser 625 630 635 640 Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp 645 650 655 Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr 660 665 670 Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile 675 680 685 Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys 690 695 700 His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp 705 710 715 720 Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys 725 730 735 Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu 740 745 750 Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr 755 760 765 Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile 770 775 780 Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu 785 790 795 800 Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His 805 810 815 Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu 820 825 830 Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met 835 840 845 Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu 850 855 860 Phe Met 865 <210> 17 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (pMH288) <400> 17 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacata tgcaggtgca gctggtgcag tctgggggag gcttggtaca gcctggaggg 120 tccctgagac tctcctgtgc agcctcttat ttcgatttcg attcttatga aatgagctgg 180 gtccgccagg ctccagggaa gggcctagag tggattggga gtatctatca tagtgggagc 240 acctactaca acccgtccct caagagtcga gtcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 300 acgctgtatc tgcaaatgaa caccctgaga gccgaggaca cagccacgta ttactgtgcg 360 agagtaaata tggaccgatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 actagtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 480 cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 540 gggctggact tcgcctgtga catctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 600 cttctcctgt cactggttat caccaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 660 caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 720 ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 780 cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 840 gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 900 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 960 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1020 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1080 cctcgcgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 1140 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 1200 atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 1260 aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 1320 ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 1380 ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 1440 gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 1500 caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 1560 tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 1620 gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 1680 agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 1740 cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 1800 ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 1860 aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 1920 acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 1980 gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 2040 gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 2100 ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 2160 ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 2214 <210> 18 <211> 737 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (HN3-CAR) <400> 18 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Thr Thr 130 135 140 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 145 150 155 160 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 165 170 175 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 180 185 190 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 195 200 205 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 210 215 220 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 225 230 235 240 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 245 250 255 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 260 265 270 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 275 280 285 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 290 295 300 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 325 330 335 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 340 345 350 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu 355 360 365 Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu 370 375 380 Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu 385 390 395 400 Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp 405 410 415 Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr 420 425 430 Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp 435 440 445 Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu 450 455 460 Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro 465 470 475 480 Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg 485 490 495 Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu 500 505 510 Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly 515 520 525 Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile 530 535 540 Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile 545 550 555 560 Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His 565 570 575 Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys 580 585 590 Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys 595 600 605 Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys 610 615 620 Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys 625 630 635 640 Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp 645 650 655 Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn 660 665 670 Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu 675 680 685 Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly 690 695 700 Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val 705 710 715 720 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe 725 730 735 Met <210> 19 <211> 2226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (pMH290) <400> 19 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacata tgcaggtgca gctggtgcag tctgggggag gcttggtaca gcctggaggg 120 tccctgagac tctcctgtgc agcctctgat ttctatttct atgattatga aatgagctgg 180 gtccgccagg ctccagggaa gggtctggag tggattggga ctgtctccta tagtgggagc 240 acctactaca acccgtccct caagagtcga gtcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 300 acgctgtatc tgcaaatgaa caccctaaga gccgaggaca cagccatgta ttactgtgcg 360 agaggttaca gctatgatga ctcccgatat tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 420 accgtctcct caactagtac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 480 atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 540 gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gacatctaca tctgggcgcc cttggccggg 600 acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcaccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 660 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 720 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 780 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 840 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 900 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 960 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1020 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1080 caggccctgc cccctcgcga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag 1140 aatcccggcc ctatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 1200 gcattcctcc tgatcccacg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 1260 tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 1320 gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 1380 gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 1440 caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 1500 ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 1560 ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 1620 aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 1680 accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 1740 gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 1800 aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 1860 gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 1920 aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 1980 ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 2040 tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 2100 tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 2160 actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 2220 atgtga 2226 <210> 20 <211> 741 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (LH7-CAR) <400> 20 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Met Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 35 40 45 Ser Asp Phe Tyr Phe Tyr Asp Tyr Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Val Ser Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Asp Ser 115 120 125 Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 145 150 155 160 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 165 170 175 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 180 185 190 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 195 200 205 Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 210 215 220 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 225 230 235 240 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 245 250 255 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 260 265 270 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 275 280 285 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 290 295 300 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 305 310 315 320 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 325 330 335 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 340 345 350 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly 355 360 365 Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro 370 375 380 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 385 390 395 400 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 405 410 415 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 420 425 430 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 435 440 445 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 450 455 460 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 465 470 475 480 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 485 490 495 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 500 505 510 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 515 520 525 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 530 535 540 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 545 550 555 560 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 565 570 575 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 580 585 590 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 595 600 605 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 610 615 620 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 625 630 635 640 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 645 650 655 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 660 665 670 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 675 680 685 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 690 695 700 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 705 710 715 720 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 725 730 735 Ile Gly Leu Phe Met 740 <210> 21 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (YP7 VH domain) <400> 21 gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga atggtgcagc ctgaagggtc attgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aagaatgcca tgaattgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaaata aaactaataa ttatgcaaca 180 tattatgccg attcagtgaa agccaggttt accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240 ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaatt gaggacacag ccatgtacta ttgtgtggct 300 ggtaactcgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 22 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (YP7 VH domain) <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Asn Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Ala Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 23 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (YP7 VL domain) <400> 23 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagttgtgt caattggaga gaaggttact 60 atgacctgca agtccagtca gagcctttta tatagcagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccagtagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataactat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (YP7 VL domain) <400> 24 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (hYP7 VH domain) <400> 25 gaggtgcagc ttgttgagtc tggtggagga ttggtgcagc ctggagggtc attgagactc 60 tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat aagaatgcca tgaattgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg gtttggaatg ggttggccgc ataagaaata aaactaataa ttatgcaaca 180 tattatgccg attcagtgaa agccaggttt accatctcca gagatgattc aaagaactca 240 ctctatctgc aaatgaacag cttgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ttgtgtggct 300 ggtaactcgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 26 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (hYP7 VH domain) <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Asn Lys Thr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Ala Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 27 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (hYP7 VL domain) <400> 27 gacattgtga tgacccagtc tccagactcc ctagctgtgt cactgggaga gagggccact 60 atcaactgca agtccagtca gagcctttta tatagcagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactgctga tttactgggc atccagtagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtc tgcaggctga agacgtggca gtttattact gtcagcaata ttataactat 300 ccgctcacgt tcggtcaggg gaccaagttg gagatcaaa 339 <210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (hYP7 VL domain) <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 29 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (HN3) <400> 29 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctcttattt cgatttcgat tcttatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctagagtg gattgggagt atctatcata gtgggagcac ctactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca ccctgagagc cgaggacaca gccacgtatt actgtgcgag agtaaatatg 300 gaccgatttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcaag t 351 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (HN3) <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ser 115 <210> 31 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (LH7) <400> 31 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgattt ctatttctat gattatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg gattgggact gtctcctata gtgggagcac ctactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca ccctaagagc cgaggacaca gccatgtatt actgtgcgag aggttacagc 300 tatgatgact cccgatattt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (LH7) <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Tyr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Asp Ser Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (LH4) <400> 33 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctcttcttt ctatttcgat gattatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ccctggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca ccctgagagc cgaggacaca gccacgtatt actgtgcgag gggatattgt 300 agtggtggta gctgctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (LH4) <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Phe Tyr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (LH6) <400> 35 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgattt ctatttcgat gattatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtggtgg cacatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acagccacat attactgtgc gagaggttac 300 agttatgacg actcccgata ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (LH6) <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Tyr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Ser Tyr Asp Asp Ser Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (YP218 VH domain) <400> 37 cagcagcagc tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc 60 acctgcaaag cctctggatt cgacctcggt ttctactttt acgcctgttg ggtccgccag 120 gctccaggga agggcctgga gtggatcgca tgcatttata ctgctggtag tggtagcacg 180 tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aagcctcgtc gaccacggtg 240 actctgcaaa tgaccagtct ggcagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagatct 300 actgctaata ctagaagtac ttattatctt aacttgtggg gcccaggcac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 38 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (YP218 VH domain) <400> 38 Gln Gln Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Leu Gly Phe Tyr 20 25 30 Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Ala Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (YP218 VL domain) <400> 39 gacgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaagtgcc aggccagtca gaggattagt agttacttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggcagcgtc ccaagctcct gatctttggt gcatccactc tggcatctgg ggtcccctcg 180 cggttcaaag gcagtggatc tgggacagaa tacactctca ccatcagcga cctggagtgt 240 gccgatgctg ccacttacta ctgtcagagt tatgcttatt ttgatagtaa taattggcat 300 gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc 330 <210> 40 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (YP218 VL domain) <400> 40 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser 85 90 95 Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val 100 105 110 <210> 41 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide (SD1) <400> 41 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgattt cgatttcgct gcttatgaaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccaggacaag gccttgagtg ggtggcaatt atatcacatg atggaatcga taaatactac 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acagccacgt attactgttt aaggcttggt 300 gctgtaggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcaagt 339 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide (SD1) <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Asp Phe Ala Ala Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Ser His Asp Gly Ile Asp Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Leu Arg Leu Gly Ala Val Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ser <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 gcagtctctg gaagaaggag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 tggtgacagg tggcgtccgg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 cggttttcca aggtgagttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 ggtcacgtct tgctcctcgg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 gacatcaatg agtgcctccg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 gataataagc agatctatat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 cgttttccgc cacagggcta 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 agggtgtcgt tttccgccac 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 gaggcagagc aggtagtcag 20

Claims (68)

  1. 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR)를 암호화하는 핵산 분자로서 5'에서 3' 방향으로:
    첫 번째 과립대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열(a granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss)을 암호화하는 핵산;
    항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산;
    세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)를 암호화하는 핵산;
    막통과 부위 (transmembrane region)를 암호화하는 핵산;
    세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)을 암호화하는 핵산;
    세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 암호화하는 핵산;
    자가-절단 2A 펩티드(self-cleaving 2A peptide)를 암호화하는 핵산;
    두 번째 GMCSFRss을 암호화하는 핵산; 및
    절단된 인간 상피 성장 인자 수용체(truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 암호화하는 핵산;
    을 포함하는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)는 CD8aα 힌지 부위 (CD8a hinge region) 또는 CD28 힌지 부위 (CD28 hinge region)를 포함하는, 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 막통과 부위 (transmembrane region)는 CD8α 막통과 도메인 또는 CD28 막통과 도메인을 포함하는, 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB, CD28, ICOS, OX40, CD27 또는 DAP10 동시-자극 도메인을 포함하는, 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3ζ또는 FcεRIγ 시그날링 도메인인, 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)은 CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region)를 포함하고, 막통과 도메인 (transmembrane domain) 은 CD8α 막통과 도메인을 포함하고, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 포함하고, 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3ζ 시그날링 도메인(CD3ζ signaling domain)을 포함하는, 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 CD8α 힌지 (CD8α hinge)를 암호화하는 핵산은 서열번호 3의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 CD8α 막통과 도메인 (CD8α transmembrane domain)를 암호화하는 핵산은 서열번호 5의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 동시-자극 도메인(4-1BB co-stimulatory)을 암호화하는 핵산은 서열번호 7의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3ξ 시그날링 도메인 (CD3ξ signaling domain)을 암호화하는 핵산은 서열번호 9의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산 및 두 번째 GMCSFRss를 암호화하는 핵산은 각각 서열번호 1의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가-절단 2A 펩티드 (self-cleaving 2A peptide)는 T2A 펩티드이고 및 자가-절단 2A 펩티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 11의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 huEGFRt를암호화하는 핵산은 서열번호 13의 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 연장 인자 1α(human elongation factor 1α)(EF1α) 프로모터 서열을 첫 번째 GMCSFRss을 암호화하는 핵산의 5’에 더 포함하는, 핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단일-체인 가변 단편 (single-chain variable fragment) (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)인, 핵산 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 특이적으로 종양 항원에 결합하는, 핵산 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양 항원은 글라이피칸-3 (glypican-3) (GPC3) 인, 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체-결합 단편 (antibody-binding fragment)을 암호화하는 핵산은 서열번호 25의 가변 중 (VH) 도메인 상보성 결정 부위 (variable heavy (VH) domain complementarity determining region) 1 (CDR1), CDR2 및 CDR3의 핵산 서열 및 서열번호 27의 가변 경 (VL) 도메인 (variable light (VL) domain) CDR1, CDR2 및 CDR3의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  19. 제17항에 있어서, 여기서 항체-결합 단편 (antibody-binding fragment)을 암호화하는 핵산은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 73-807 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  20. 제17항에 있어서, 여기서 항체-결합 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  21. 제17항에 있어서, 여기서 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 17의 뉴클레오타이드 73-420 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  22. 제16항에 있어서, 여기서 종양 항원이 글라이피칸-2 (glypican-2) (GPC2)인, 핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서, 여기서 항체-결합 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  24. 제22항에 있어서, 여기서 항체-결합하는 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 19의 73-432 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  25. 제16항의 핵산 분자에 있어서, 여기서 종양 항원이 메소텔린 (mesothelin) 인, 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제25항의 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터인, 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 상기 벡터는 렌티 바이러스 벡터인, 벡터.
  29. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  30. 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 상피 성장 인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 동시-발현하는 분리된 숙주 세포로서, 여기서:
    CAR은 항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region), 막통과 도메인 (transmembrane domain), 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain) 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)을 포함하고; 및
    huEGFRt는 인간 EGFR로부터의 도메인 III (Domain III), 도메인 IV (Domain IV) 및 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함하나, 상피 성장 인자 (EGF)-결합 도메인 (epidermal growth factor (EGF)-binding domain) 및 세포질내 도메인 (cytoplasmic domain)은 포함하지 않는, 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)는 CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region) 또는 CD28 힌지 부위 (CD28 hinge region)를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 막통과 도메인 (transmembrane domain) 은 CD8α 막통과 도메인 또는 CD28 막통과 도메인을 포함하는, 분리된 숙주세포.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB, CD28, ICOS, OX40, CD27 또는 DAP10 동시-자극 도메인을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3ζ 또는 FcεRIγ 시그날링 도메인을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 힌지 부위 (extracellular hinge region)는 CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region)를 포함하고, 막통과 도메인 (transmembrane domain)은 CD8α 막통과 도메인을 포함하고, 세포내 동시-자극 도메인 (intracellular co-stimulatory domain)은 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 포함하고, 및 세포내 시그날링 도메인 (intracellular signaling domain)은 CD3ξ 시그날링 도메인 (CD3ξ signaling domain)을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 CD8α 힌지 부위는 (CD8α hinge region)은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 CD8α 막통과 도메인(CD8a transmembrane domain)은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3ζ 시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 huEGFRt는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단일-체인 가변 단편 (single-chain variable fragment) (scFv) 또는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)인, 분리된 숙주 세포.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 특이적으로 종양 항원에 결합하는, 분리된 숙주 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 종양 항원은 글라이피칸-3 (glypican-3) (GPC3)인, 분리된 숙주 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항원-결합 단편 (antigen-binding fragment)의 아미노산 서열은 서열번호 26의 가변 중 (VH) 도메인 상보성 결정 부위 (variable heavy (VH) domain complementarity determining region) 1 (CDR1), CDR2 및 CDR3의 서열 및 서열번호 28의 가변 경 (VL) 도메인 (variable light (VL) domain) CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  45. 제43항에 있어서, 항체-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 16의 잔기 25-269를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  46. 제43항에 있어서, 상기 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 30의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  47. 제43항에 있어서, 항체-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 18의 잔기 25-140를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  48. 제42항에 있어서, 상기 종양 항원은 글라이피칸-2 (glypican-2) (GPC2)인, 분리된 숙주 세포.
  49. 제48항에 있어서, 상기 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 32의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  50. 제48항에 있어서, 상기 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 20의 잔기 2-144를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  51. 제42항에 있어서, 상기 종양 항원은 메소텔린인 (mesothelin)인, 분리된 숙주 세포.
  52. 제29항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 림프구 (T lymphocyte) 인, 분리된 숙주 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 T 림프구 (T lymphocyte)는 자가 T 림프구(autologous T lymphocyte) 또는 동종이형 T 림프구 (allogeneic T lymphocyte) 인, 분리된 숙주 세포.
  54. 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항의 분리된 숙주 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 조성물, .
  55. 개체에서 GPC3-양성 암을 치료하는 방법으로서, 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포를 치료적으로 효과 있는 양을 투여 하거나, 또는 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항의 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양의 투여를 포함하는, 방법.
  56. 제55항의 방법에 있어서, 여기서 GPC3-양성인 암은 간세포 암 (hepatocellular carcinoma) (HCC), 흑색종 (melanoma), 난소 투명-세포 암 (ovarian clear-cell carcinoma), 난황 낭 종양 (yolk sac tumor), 신경아세포종 (neuroblastoma), 간아세포종 (hepatoblastoma) 또는 윌름씨 종양 (Wilms’ tumor)인, 방법.
  57. 개체에서 GPC2-양성 암을 치료하는 방법으로서, 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 개체에게 투여하거나, 또는 제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항의 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양의 투여를 포함하는, 방법.
  58. 제57항의 방법에 있어서, GPC2-양성 암은 신경아세포종 (neuroblastoma), 급성 림프아세포 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia), 배아성 횡문근육종 (embryonal rhabdomyosarcoma), 폐포 횡문근육종 (alveolar rhabdomyosarcoma), 어윙씨 육종 (Ewing’s sarcoma), 섬유조직성 소원형 세포 종양 (desmoplastic small round cell tumor) 또는 골육종 (osteosarcoma)인, 방법.
  59. 개체에서 메소텔린-양성 (mesothelin-positive)인 암을 치료하는 방법으로서, 제25항의 핵산 분자를 포함하는 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양을 개체에게 투여하거나, 또는 제51항의 분리된 숙주 세포의 치료적으로 효과 있는 양의 투여를 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 여기서 메소텔린-양성 암은 중피종 (mesothelioma), 전립선 암 (prostate cancer), 폐암 (lung cancer), 위암 (stomach cancer), 편평상피 암 (squamous cell carcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 3 중 음성 유방암 (triple negative breast cancer) 또는 난소 암 (ovarian cancer)인, 방법.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 숙주 세포는 T 림프구 (T lymphocyte) 인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 T 림프구 (T lymphocyte)는 자가 T 림프구 (autologous T lymphocyte) 또는 동종이형 T 림프구 (allogeneic T lymphocyte) 인, 방법.
  63. 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR)를 암호화하는 핵산 분자로서, 5’에서 3’ 방향으로:
    첫 번째 과립대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 시그날 서열(a granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor signal sequence) (GMCSFRss)을 암호화하는 핵산;
    항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산;
    CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region)를 암호화하는 핵산;
    CD8α 막통과 도메인 (CD8α transmembrane domain)을 암호화하는 핵산;
    4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain)을 암호화하는 핵산;
    CD3zζ 시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)을 암호화하는 핵산;
    자가-절단 2A 펩티드(self-cleaving 2A peptide)를 암호화하는 핵산;
    두 번째 GMCSFRss을 암호화하는 핵산; 및
    절단된 인간 상피 성장 인자 수용체(truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 암호화하는 핵산;
    을 포함하는, 핵산 분자.
  64. 제63항에 있어서, 항체-결합 단편을 암호화 하는 핵산은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열 73-807, 서열번호 17의 뉴클레오타이드 73-420, 또는 서열번호 19의 73-432 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 분자.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19를 포함하는, 핵산 분자.
  66. 키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor) (CAR) 및 절단된 인간 성장 인자 수용체 (truncated human epidermal growth factor receptor) (huEGFRt)를 동시에 발현하는 분리된 숙주 세포로서, 여기서:
    CARs은 항원-특이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, CD8α 힌지 부위 (CD8α hinge region), CD8α 막통과 도메인 (CD8α transmembrane domain), 4-1BB 동시-자극 도메인 (4-1BB co-stimulatory domain), 및 CD3ζ 시그날링 도메인 (CD3ζ signaling domain)을 포함하고; 및
    huEGFRt는 인간 EGFR으로부터의 도메인 III (Domain III), 도메인 IV (Domain IV) 및 EGFR 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함하나, 상피세포 성장인자(EGF) 결합 도메인((epidermal growth factor) (EGF)-binding domain) 및 세포질내 도메인 (cytoplasmic domain)은 포함하지 않는, 분리된 숙주 세포.
  67. 제66항에 있어서, 상기 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 서열번호 16의 잔기 25-269, 서열번호 18의 잔기25-140, 서열번호 20의 잔기 25-144를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 CAR의 아미노산 서열은 서열번호 16의 잔기 25-491, 서열번호 18의 잔기 25-362, 서열번호 20의 잔기 25-366을 포함하고, 및 huEGFRt 아미노산 서열은 서열번호 14를 포함하는, 분리된 숙주 세포.
KR1020207014565A 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체 Ceased KR20200080270A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020257031862A KR20250143360A (ko) 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762584421P 2017-11-10 2017-11-10
US62/584,421 2017-11-10
PCT/US2018/059645 WO2019094482A1 (en) 2017-11-10 2018-11-07 Chimeric antigen receptors targeting tumor antigens

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020257031862A Division KR20250143360A (ko) 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200080270A true KR20200080270A (ko) 2020-07-06

Family

ID=64746620

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020257031862A Pending KR20250143360A (ko) 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체
KR1020207014565A Ceased KR20200080270A (ko) 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020257031862A Pending KR20250143360A (ko) 2017-11-10 2018-11-07 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11802163B2 (ko)
EP (1) EP3707160A1 (ko)
KR (2) KR20250143360A (ko)
CN (2) CN111683962B (ko)
WO (1) WO2019094482A1 (ko)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI809130B (zh) 2018-06-22 2023-07-21 美商凱特製藥公司 嵌合跨膜蛋白及其用途
WO2020257823A2 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Kite Pharma, Inc. TGF-β RECEPTORS AND METHODS OF USE
CN120484131A (zh) * 2019-07-19 2025-08-15 费城儿童医院 包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖2结合结构域的嵌合抗原受体
WO2021119539A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Senti Biosciences, Inc. Method and compositions for regulated armoring of cells
US12606635B2 (en) 2020-03-12 2026-04-21 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Glypican-2-binding moieties, chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2022035794A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-1 (gpc1) for treating solid tumors
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
CN115181751A (zh) * 2021-04-02 2022-10-14 苏州博腾生物制药有限公司 靶向白蛋白的嵌合抗原受体及其使用方法
US20240218055A1 (en) 2021-04-29 2024-07-04 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
WO2022236049A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Senti Biosciences, Inc. Chimeric antigen receptors and methods of use
CN115340610A (zh) * 2021-05-12 2022-11-15 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 双特异性car t细胞及其应用
WO2022261061A1 (en) * 2021-06-08 2022-12-15 Kite Pharma, Inc. Gpc3 binding molecules
US20240270851A1 (en) 2021-06-09 2024-08-15 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
US20250043021A1 (en) * 2021-07-07 2025-02-06 Triumvira Immunologics Usa, Inc. Gpc3 t cell-antigen couplers and uses thereof
CN113527515A (zh) * 2021-07-14 2021-10-22 南京蓝盾生物科技有限公司 一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体及其应用
WO2023076881A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CN118556086A (zh) 2021-11-09 2024-08-27 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（gpc3）的含有igg4铰链的嵌合抗原受体及其用途
US20250000906A1 (en) * 2021-11-16 2025-01-02 Sotio Biotech Inc. Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients
EP4448566A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-mesothelin polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
CA3251361A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigenic receptors targeting GPC2 containing a hinge and a CD28 transmembrane and their use
US20250281538A1 (en) * 2022-05-02 2025-09-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions targeting gpc2 and gpc3 and their use for treating solid tumors
AU2023269784A1 (en) * 2022-05-10 2024-11-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cxcr3 overexpression in car-nk cells primes migration/homing into the tumor microenvironment
CN119278218A (zh) * 2022-06-24 2025-01-07 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 靶向gpc3的抗体及其用途
WO2023246578A1 (zh) * 2022-06-24 2023-12-28 成都科伦精准生物科技有限公司 特异性结合gpc3的嵌合抗原受体及其应用
CN119451992A (zh) * 2022-06-29 2025-02-14 克里斯珀医疗股份公司 靶向gpc-3的嵌合抗原受体和表达其的免疫细胞用于治疗用途
WO2024026455A2 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Shoreline Biosciences, Inc. Methods and compositions for generating chimeric antigen receptor-monocytes/macrophages
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
CN116731196A (zh) * 2022-10-19 2023-09-12 南京凯玛生物科技有限公司 靶向肝细胞癌的car-巨噬细胞的制备方法及其应用
CN116003638B (zh) * 2023-01-20 2023-09-05 北京基因启明生物科技有限公司 一种有效杀伤胆管型肝癌的CAR-iNKT细胞技术
WO2024238346A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies that specifically bind the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein and compositions and uses thereof
CN119431566B (zh) * 2023-07-28 2026-03-17 南方医科大学 一种抗denv ns1蛋白的单克隆抗体6g2及其制备方法和应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69726404T2 (de) 1996-01-05 2004-09-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mesothelinantigen, verfahren und testsatz zur targetierung
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
DK1180123T3 (da) 1999-05-27 2008-10-13 Us Gov Health & Human Serv Immunkonjugater, der har höj bindingsaffinitet
US8460660B2 (en) 2009-03-24 2013-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies
DK2496698T3 (en) 2009-11-03 2019-04-15 Hope City TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRUNCATED T-CELL SELECTION
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9402865B2 (en) 2011-01-18 2016-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
CN105968209B (zh) 2011-04-19 2021-08-03 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
JP5626550B2 (ja) 2011-07-29 2014-11-19 東芝ライテック株式会社 ソケット、ランプ装置および照明器具
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
JP6850528B2 (ja) * 2012-02-13 2021-03-31 シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
WO2013126712A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
SG11201407972RA (en) 2012-06-01 2015-01-29 Us Health High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
CA2881981A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
US9409992B2 (en) 2012-08-21 2016-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
CN104955845B (zh) 2012-09-27 2018-11-16 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法
DK2958943T3 (da) 2013-02-20 2019-12-09 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af humaniseret anti-EGFRvIII kimær antigenreceptor
TW201446794A (zh) 2013-02-20 2014-12-16 Novartis Ag 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
CN104140974B (zh) 2013-05-08 2017-09-29 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
US10144770B2 (en) 2013-10-17 2018-12-04 National University Of Singapore Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
CA2945320A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Drug regulated transgene expression
ES2928000T3 (es) 2014-06-06 2022-11-14 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Receptores de antígeno quimérico dirigidos a mesotelina y usos de los mismos
US20180133252A9 (en) 2014-09-09 2018-05-17 Unum Therapeutics Inc. Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
PT3294764T (pt) * 2015-05-15 2021-02-15 Hope City Composições de recetores de antigénios quiméricos
WO2017027291A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific car t-cells for solid tumor targeting
WO2017044699A1 (en) 2015-09-10 2017-03-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 chimeric antigen receptors
CN105949324B (zh) 2016-06-30 2019-08-27 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途
EP3494135A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20210371542A1 (en) 2021-12-02
CN120608077A (zh) 2025-09-09
WO2019094482A1 (en) 2019-05-16
EP3707160A1 (en) 2020-09-16
CN111683962B (zh) 2025-05-16
CN111683962A (zh) 2020-09-18
KR20250143360A (ko) 2025-10-01
US11802163B2 (en) 2023-10-31
US20230406953A1 (en) 2023-12-21
WO2019094482A9 (en) 2020-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230406953A1 (en) Chimeric antigen receptors targeting tumor antigens
TWI878150B (zh) 嵌合抗原及t細胞受體以及使用方法
CN113039205B (zh) 靶向cll1的抗体及其应用
KR102713223B1 (ko) 항-pd-l1 항체
KR20180114218A (ko) 항-lag-3 항체
JP2020517302A (ja) Ｃｄ１９に対するヒト化抗原結合ドメイン及び使用方法
CN105073776A (zh) 用于治疗表达紧密连接蛋白的癌症疾病的制剂
KR20230024911A (ko) 항-her2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
US20190284262A1 (en) T cell receptor-like antibodies specific for foxp3-derived peptides
US20250017962A1 (en) Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-3 (gpc3) and use thereof
JP6800751B2 (ja) 骨髄増殖性又はリンパ球増殖性疾患に対抗するための手段及び方法
JP2021500854A (ja) Ｓｔｒｅｐ−タグ特異的結合タンパク質およびその使用
KR20230084155A (ko) 면역치료 조성물
AU2018370120A1 (en) Methods for selective expansion of d3 yd T-cell populations and compositions thereof
WO2024217585A1 (zh) 靶向ror1的抗体及其应用
WO2025195483A1 (en) Mesothelin targetting antibodies, chimeric antigen receptors, and uses thereof
TWI904917B (zh) Ｔａｃｉ結合分子
US20250281538A1 (en) Compositions targeting gpc2 and gpc3 and their use for treating solid tumors
WO2024035341A1 (en) Cd30 antigen-binding molecules
HK40119948A (zh) 与eva1蛋白质结合的人源化抗体或其功能性片段、抗体药物缀合物和嵌合抗原受体
WO2021170146A1 (zh) 新型抗cd19抗体和cd19-car-t细胞的制备及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

A201 Request for examination
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

E601 Decision to refuse application
E801 Decision on dismissal of amendment
P12-X000 Request for amendment of application rejected

St.27 status event code: A-2-2-P10-P12-nap-X000

PE0601 Decision on rejection of patent

St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601

A16 Divisional, continuation or continuation in part application filed

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-0-1-A10-A16-DIV-PA0104 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

A18 Application divided or continuation or continuation in part accepted

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-0-1-A10-A18-DIV-PA0104 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

PA0104 Divisional application for international application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A18-div-PA0104

St.27 status event code: A-0-1-A10-A16-div-PA0104