KR20200080749A

KR20200080749A - N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20200080749A
Application number: KR1020180170531A
Authority: KR
Inventors: 김진환; 임형권; 최형안; 이은빈; 이상연
Original assignee: 주식회사 폴루스
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-07-07
Also published as: WO2020138951A1; EP3904520A1; EP3904520A4; US20220119792A1

Abstract

본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 핵산 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트에 있어서, 상기 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 시스테인 프로테이즈 인식서열이 삽입되어 시스테인 프로테이즈에 의해 N-말단의 메티오닌이 절단되는 것을 특징으로 하는 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법{Gene Expression Cassette for Expressing a Target Protein of which Methionine at the N-terminus is Cleaved and Method for Producing the Target Protein Using the Same}

본 발명은 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 목적 단백질을 코딩하는 핵산; 및 시스테인 프로테이즈 (cysteine protease)를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트에 있어서, 상기 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 시스테인 프로테이즈 인식서열이 삽입되어 시스테인 프로테이즈에 의해 N-말단의 메티오닌이 절단되는 것을 특징으로 하는 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질의 생산은 인간 및 동물용 약학 제제, 효소 및 기타 특정 화학물질의 제조를 위해 활용될 수 있다. 발현 숙주로서 박테리아 세포, 진균류 세포, 포유류 세포를 사용하는 재조합 DNA 기법은 다량의 폴리펩티드 생산을 위해 특히 유용한 수단으로 이용되고 있다.

일반적으로, 목적 단백질의 재조합 생산은 단백질을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 경우 유전자의 발현을 조절하는 신호를 포함하는 발현벡터를 숙주 세포로 트랜스펙션 (transfection) 시키는 과정을 포함한다. 트랜스펙션 된 세포는 재조합 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 성장하고, 발현된 목적 단백질을 회수하는 공정을 통해 목적 단백질을 생산하게 된다.

이와 같이 생산된 단백질은 전통적 방식인 화학적 합성 의약품에 비해 부작용이 적고, 인체 내에서 질병에 대항하는 효과가 뛰어나 임상 시험 성공률이 높은 장점을 가지고 있다. 그러나 산업적으로는 DNA 조작 기술, 대량 발효기술, 고도의 단백질 정제기술 등 첨단기술을 요구한다. 1982년에서 1991년 사이에 5대 단백질 의약품(인슐린, 인간성장호르몬, 인터페론, EPO, G-CSF)가 출시된 이래, 재조합 단백질 치료제에 대한 지속적인 연구가 진행되고 있다.

한편, 인간 헤모글로빈, 인터루킨-2, 성장 호르몬 등과 같은 재조합 단백질에서 번역 개시자인 N-포밀-메티오닌 또는 메티오닌(Met)을 제거하는 것은 재조합 단백질의 기능과 안정성에 중요한 역할을 한다. 따라서, 천연 단백질의 N-말단에서 Met을 제거한 단백질을 제조하기 위한 여러 시도가 있어 왔다. 첫째, 시아노겐 브로마이드는 극한 산성 조건에서 Met을 절단하는데 사용되지만, 이는 내부에 Met 잔기가 없는 단백질에만 적용될 수 있다(Boix et al., 1996). 둘째, 프로테이즈 특이적 올리고펩티드를 표적 단백질 앞에 도입한 후, 각각의 프로테이즈, 예를 들어 인자 Xa, 엔테로카이네이즈 및 카텝신 C에 의해 제거하는 방법이 있다(Belagaje et al. 1997). 셋째, 단백질의 N-말단 Met은 에어로모나스 프로테오리티카(Aeromonas proteolytica)의 아미노펩티데이즈에 의해 in vitro에서 제거될 수 있다(Shapiro et al., 1988; Notomista et al., 1999). 넷째, 목적 단백질 앞에 신호 펩티드를 도입하여 분비하는 동안 생체 내에서 처리하는 방법이 있으나, 이는 수율이 매우 낮다는 문제점이 있다(배양액 1리터 당 1~5mg, Huang et al. 1998).

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 N-말단 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 고수율로 생산하기 위한 신규한 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 시스테인 프로테이즈 인식서열을 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 삽입하고, 시스테인 프로테이즈와 함께 발현시키는 경우, 높은 효율로 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질이 생산되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

Boix, E. et al., 1996. Role of the N terminus in RNase A homologues: Differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol. 257 992~1007. Belagaje, R.M. et al., 1997. Increased production of low molecular weight recombinant proteins in Escherichia coli. Protein Sci. 6 1953~1962. Shapiro, R. et al., 1988. Expression of Met-(-1) angiogenin in Escherichia coli: Conversion to the authentic less than Glu-1 protein. Anal. Biochem. 175 450-461. Notomista, E. et al., 1999. Effective expression and purification of recombinant on-conase, an antitumor protein. FEBS Lett. 463 211-215. Huang, H.C. Wet al., 1998. The Rana catesbeiana rcr gene encoding a cytotoxic ribonuclease. Tissue distribution, cloning, purification, cytotoxicity, and active residues for RNase activity. J. Biol. Chem. 273 6395-6401.

본 발명의 목적은 N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산할 수 있는 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 목적 단백질을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 핵산; 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트로, 상기 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 시스테인 프로테이즈 인식서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법을 제공한다:

(a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명에 따른 유전자 발현 카세트를 이용하면, 목적 단백질과 함께 도입된 시스테인 프로테이즈에 의해 목적 단백질 N-말단의 메티오닌이 절단되어, 별도의 메티오닌 제거 과정을 거치지 않고 메티오닌이 제거되기 때문에, 목적 단백질 생산 공정을 단순화하면서도 높은 수율로 활성을 갖는 목적 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP3 벡터 제작에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 pAPT-Y 벡터 제작에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pAPT-Y-tag-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3 벡터 제작에 대한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 유전자 발현 카세트의 구성도이다.
도 5는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 발현 벡터의 개열지도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP 벡터에 의한 성숙 성장 호르몬 단백질 발현을 SDS-PAGE를 이용하여 정성적으로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pAPT-Y-tag-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3 벡터에 의한 성숙 성장 호르몬 단백질 발현을 SDS-PAGE를 이용하여 정성적으로 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP3 벡터에 의한 성숙 성장 호르몬 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 정성적으로 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pAPT-Y-tag-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3 벡터에 의한 성숙 성장 호르몬 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 정성적으로 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP3 벡터에 의해 발현된 성숙 성장 호르몬 단백질의 N-말단 시퀀싱을 이용하여 펩티드를 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 H6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 역방향 캐스페이즈-3를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트인 H6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 DH6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 AH6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 NH6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 KH6-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 HAK-DEVD-hGH를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 발현 카세트 중 하나인 Lacuv5 프로모터 하위의 역방향 캐스페이즈-3를 클로닝한 DNA에 대해 시퀀싱을 이용하여 DNA 서열 및 단백질 서열 일치를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 N-말단 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 재조합 미생물에서 생산하기 위하여, 시스테인 프로테이즈 인식서열을 목적 단백질 N-말단 메티오닌 하위에 도입하고 시스테인 프로테이즈를 추가로 선별하여, 이를 미생물 내에서 함께 발현시킬 수 있는 유전자 발현 카세트를 개발하고, N-말단 메티오닌 절단에 의해 단백질 활성을 보이는 대표적인 목적 단백질로 인간 성장 호르몬을 이용하여 상기 유전자 발현 카세트의 효과를 검증한 결과, 별도의 메티오닌 절단 공정 없이 효과적으로 N-말단 메티오닌이 절단된 성숙 인간 성장 호르몬이 높은 수율로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 목적 단백질을 코딩하는 핵산; 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트로, 상기 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 시스테인 프로테이즈 인식서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 목적 단백질을 코딩하는 핵산 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산은 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있으며, 상기 프로모터는 T3 프로모터, T5 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, trp 프로모터, 아라비노스 프로모터, Lacuv5 프로모터 및 LacI 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 시스테인 프로테이즈는 역방향 캐스페이즈-3(reverse caspase-3), 역방향 캐스페이즈-6 (reverse caspase-6, NCBI Accession No. P55212.2) 또는 역방향 캐스페이즈-9 (reverse caspase-9, NCBI Accession No. BAA82697.1)일 수 있으며, 바람직하게는 역방향 캐스페이즈-3(reverse caspase-3)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열은 DEVD, VEID, VEHD 또는 LEHD 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 시스테인 프로테이즈가 역방향 캐스페이즈-3(reverse caspase-3)인 경우 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열은 DEVD인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 시스테인 프로테이즈가 역방향 캐스페이즈-6 (reverse caspase-6)인 경우 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열은 VEID 또는 VEHD인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 시스테인 프로테이즈가 역방향 캐스페이즈-9 (reverse caspase-9)인 경우 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열은 LEHD인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 목적 단백질의 발현 효율을 향상시키기 위하여, 상기 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 번역 개시 코돈 상위에 인핸서가 삽입될 수 있으며, 상기 인핸서는 A/U-rich 서열인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 목적 단백질은 인간 헤모글로빈, 인터루킨-2, 인터페론-베타 또는 인간 성장 호르몬 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, N-말단 메티오닌 절단 또는 N-말단의 특정 서열이 절단되어 활용되는 모든 재조합 단백질에 적용될 수 있을 것이다.

본 발명에서, 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열의 N-말단에는 태그가 추가로 결합될 수 있으며, 상기 태그는 His tag, DH6 tag, AH6 tag, NH6 tag, KH6 tag, HAK tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB 및 Xpress epitope로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 상기 태그는 그 종류에 따라 목적 단백질의 발현량이나 시스테인 프로테이즈에 의한 절단 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 인간 성장 호르몬을 목적 단백질로 발현하는 경우, DH6 또는 KH6를 결합하였을 때 가장 높은 수율로 N-메티오닌 절단된 인간 성장 호르몬이 제조되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 특성은 태그 종류에 따라 단백질 번역 안정성에 대한 기여도가 다르고, 캐스페이즈의 접근성 및 목적 단백질-캐스페이즈간의 구조적 안정성에 대한 기여도가 다르기 때문인 것으로 판단되며, in silico 분석 결과에 따르면 mRNA의 5'부분 헤어핀 구조의 차이에 의해 mRNA수명에 차이가 있으며, 그에 따라 발현량의 차이가 발생하는 것으로 예상된다.

본 발명에서 사용할 수 있는 태그와 시스테인 프로테아제 인식서열을 포함하는 핵산 서열은 하기 표 1과 같으나, 이는 본 발명에 따른 일부 실시예를 나열한 것으로, 상기 핵산 서열에 한하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 한편, 하기 서열에서 5'의 3개의 핵산 서열은 목적단백질의 첫번째 아미노산인 메티오닌을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

	서열(5'->3')
MRGS-H6-DEVD	ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-H6-DEVD	ATGCATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-DH6-DEVD	ATGGACCATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-AH6-DEVD	ATGGCCCATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-NH6-DEVD	ATGAACCATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-KH6-DEVD	ATGAAACATCACCATCACCATCACGACGAGGTGGAT
M-HAK-DEVD	ATGCACGCAAAAGCGCACGCCCACGCACACGCGCATGGCCACGCTCATGACGAGGTGGAT

본 발명의 일 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 T7 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌과 태그 서열 H6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 페닐알라닌 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 T7 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 H6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 DH6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 AH6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 NH6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 KH6, 시스테인 프로테이즈 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서 상기 유전자 발현 카세트는 제1 프로모터인 tac 프로모터 하에 인간 성장 호르몬의 N-말단 첫번째 아미노산 서열인 메티오닌이 태그인 HAK, 시스테인 프로테아제 인식서열인 DEVD, 인간 성장 호르몬의 두번째 아미노산 서열부터 마지막 아미노산 서열까지 작동 가능하도록 연결되어 있는 제1 유전자 구조와 제2 프로모터인 Lacuv5 프로모터 하에 시스테인 프로테이즈인 역방향 캐스페이즈-3가 작동 가능하도록 연결되어 있는 제2 유전자 구조를 포함하는 형태로 제작될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 유전자 발현 카세트는 pAPT 벡터, pETDuet(pETDuet-1) 벡터, pET24a(+) 벡터, pQE30 벡터, pMAL-c2x 벡터, pTrc99a 벡터, pBAD 벡터, pUC18 벡터 및 pUC1벡터로 구성된 군에서 선택되는 벡터에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 대장균, 코리레박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) 또는 효모에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용가능한 대장균으로는 K-12 W3110, B strain C41(DE3), B strain Rosetta2(DE3)를 포함하여 목적 단백질의 과발현 유도가 가능한 K-12 계열과 B 계열의 모든 대장균 중에서 선택 가능하고, 상기 효모로는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 이용할 수 있으나, 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트가 도입 가능한 재조합 미생물의 범위는 재조합 단백질의 생산을 위해 당업계에서 활용가능한 미생물의 범위를 모두 포함하는 것으로, 상기 예시적 기재에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다:

(b) 상기 생성된 목적 단백질을 회수하는 단계.

본 발명에서, 상기 생성된 목적 단백질은 바람직하게는 성숙 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 할 수 있으나, 그 밖에 N-말단 메티오닌이 절단된 인간 헤모글로빈 또는 인터루킨-2를 생산하고자 하는 목적 단백질로 할 수 있으며, 이외에도 N-말단 메티오닌 또는 N-말단 폴리펩티드의 절단이 요구되는 단백질은 무엇이든지 목적 단백질로 활용할 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유전자 발현 카세트" 또는 단순히 "발현 카세트"라 함은 서열과 상용성인 숙주에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소가 있는, 재조합적으로 또는 합성적으로 만들어진 핵산 구축물이다. 발현 카세트는 적어도 프로모터 및 선택적으로 전사 종결 신호를 포함한다. 전형적으로, 유전자 발현 카세트는 전사될 핵산(예컨대, 목적 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 이종 핵산) 및 프로모터를 포함한다. 발현을 수행하는데 요구되거나 이에 도움을 주는 추가의 인자 또한 같이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로모터(또는 프로모터 영역)"은 이것이 작동가능하게 연결된 DNA의 전사를 제어하는 유전자의 DNA의 일부분을 의미한다. 프로모터 영역은 RNA 중합효소가 인식, 결합 및 전사를 개시하기 위해 충분한 DNA의 특정 서열을 포함한다. 또한, 이러한 프로모터 영역은 RNA 폴리머레이즈 (RNA polymerase)의 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조절하는 서열을 포함한다. 프로모터는 조절의 성질에 따라서 구성성(constitutive)이거나 시스(cis) 작용 또는 트랜스(trans) 작용 인자에 의해 조절될 수 있다.

본 발명에서 용어 "작동가능하도록 연결된"이란 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 신호 서열 또는 일련의 전사 인자 결합 부위)과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하고, 이때 발현 조절 서열은 이종 핵산 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 준다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 유전자 조작의 결과로서 형성될 수 있는 임의의 물질(예를 들어, 벡터 또는 미생물)을 의미한다.

본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 (CaCl₂) 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다. 염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 미생물은 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

아울러, 본 발명에서 도입된 유전자 발현 카세트는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. N-말단 메티오닌이 절단된 목적 단백질의 과발현 시스템 구축

1-1. 목적 단백질의 과발현 유도를 위한 유전자 프로모터 선별

시스템 구축을 위해 분자생물학 연구에서 일반적으로 사용하는 이소프로필 베타-D-1-시오갈락토피라노시드 (Isopropyl-βIPTG) 반응성 유전자 프로모터를 선별하였다. 강력한 유전자 발현 유도 및 조절이 가능하다고 알려진 프로모터 3종 (tac, T7, Lacuv5)을 선정하였다.

1-2. 목적 단백질의 과발현 유도 및 N-말단 메티오닌 절단을 위한 합성 태그 선별

목적 단백질 N-말단 메티오닌 하위에 히스티딘 5개 (5x-histidine, H5) 및 특정 아미노산 1개 그리고 시스테인 프로테이즈 인식서열 (DEVD)이 결합된 태그를 기본 합성 태그 구조 (MHHHHHX_aa)로서 선별하였다. Xaa에는 라이신 (lysine), 아르기닌 (arginine), 히스티딘이 해당될 수 있으며 또한 삭제될 수도 있다. 또한, 기본 합성 태그 N-말단에 특정 아미노산을 추가하여 MX_aaX_aaX_aaX_aaHHHHHX_aa 형태의 태그를 사용하였으며 구체적으로는 4종류 태그 (aspartate-6x-histidine, DH6; alanine-6x-histidine, AH6; asparagine-6x-histidine, NH5; lysine-6x-histidine, KH6)를 제작하였으며, 히스티딘(histidine)과 알라닌 (alanine), 라이신 (lysine)을 조합한 복합 히스티딘 합성 태그 (histidine-alanine-lysine-(4x-alanine-histidine)-glycine-histidine-alanine-histidine, HAK)도 제작하였다.

1-3. N-말단 메티오닌 절단을 위한 시스테인 프로테이즈 선별

시스테인 프로테이즈의 소단위 (subunit)를 재정립하여 대장균에서도 단백질 활성을 갖도록 연구한 논문(Srinivasa M. Srinivasula et al., J Biol Chem., 1998 Apr 24;273(17):10107-11)을 참조하여 역방향 캐스페이즈-3 (reverse caspase-3, rev-CASP3) 유전자를 선정하였다. 본 발명에서 사용한 역방향 캐스페이즈-3의 아미노산 서열과 핵산 서열은 다음과 같다.

서열번호 1: 역방향 캐스페이즈-3의 아미노산 서열

MIETDSGVDD DMACHKIPVE ADFLYAYSTA PGYYSWRNSK DGSWFIQSLC AMLKQYADKL 60

EFMHILTRVN RKVATEFESF SFDATFHAKK QIPCIVSMLT KELYFYHDEV DGENTENSVD 120

SKSIKNLEPK IIHGSESMDS GISLDNSYKM DYPEMGLCII INNKNFHKST GMTSRSGTDV 180

DAANLRETFR NLKYEVRNKN DLTREEIVEL MRDVSKEDHS KRSSFVCVLL SHGEEGIIFG 240

TNGPVDLKKI TNFFRGDRCR SLTGKPKLFI IQACRGTELD CGIETD

서열번호 2: 역방향 캐스페이즈-3의 핵산 서열

atgatcgaaa ccgatagcgg tgttgatgat gatatggcct gtcataaaat tccggttgaa 60

gccgattttc tgtatgcata tagcaccgca ccgggttatt atagctggcg taatagcaaa 120

gatggcagct ggtttattca gagcctgtgt gcaatgctga aacagtatgc agataaactg 180

gaattcatgc acattctgac ccgtgttaat cgtaaagttg caaccgaatt tgaaagcttt 240

agctttgatg caaccttcca tgccaaaaaa caaattccgt gtattgttag catgctgacc 300

aaagaactgt atttctatca cgatgaagtg gatggcgaaa ataccgaaaa tagcgttgat 360

agcaaaagca tcaaaaacct ggaaccgaaa attatccatg gtagcgaaag catggatagc 420

ggtattagcc tggataacag ctataaaatg gattatccgg aaatgggcct gtgcatcatt 480

atcaacaaca aaaactttca caagagcacc ggtatgacca gccgtagcgg caccgatgtt 540

gatgcagcaa atctgcgtga aacctttcgc aatctgaaat atgaagtgcg caataagaat 600

gatctgacgc gtgaagaaat tgtggaactg atgcgtgatg ttagcaaaga agatcatagc 660

aaacgtagca gctttgtttg tgttctgctg agccatggtg aagaaggtat tatctttggc 720

accaatggtc cggttgatct gaaaaaaatc accaactttt ttcgtggtga tcgttgtcgt 780

agcctgaccg gtaaaccgaa actgtttatc attcaggcat gtcgtggcac cgaactggat 840

tgtggtattg aaaccgatta a

1-4. 목적 단백질 과발현 시스템 구축

실시예 1-1, 1-2, 1-3을 통해 선별한 인자들을 이용하여 목적 단백질 과발현 시스템을 구축하였다. 해당 시스템을 증명하기 위해 성장 호르몬 단백질 (human growth hormone, hGH)을 대상으로 유전자 발현 카세트를 설계 및 제작하였다. 본 발명에서 사용한 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열과 핵산 서열은 다음과 같다.

서열번호 3: 인간 성장 호르몬 아미노산 서열

FPTIPLSRLF DNAMLRAHRL HQLAFDTYQE FEEAYIPKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT 60

PSNREETQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QFLRSVFANS LVYGASDSNV YDLLKDLEEG 120

IQTLMGRLED GSPRTGQIFK QTYSKFDTNS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV 180

QCRSVEGSCG F

서열번호 4: 인간 성장 호르몬 핵산 서열

tttccgacca ttccgctgag ccgtctgttt gataatgcaa tgctgcgtgc acaccgtctg 60

caccagctgg catttgatac ctatcaagaa tttgaagaag cgtatatccc gaaagagcag 120

aaatatagct tcctgcagaa tccgcagacc agcctgtgtt ttagcgaaag cattccgaca 180

ccgagcaatc gtgaagaaac ccagcagaaa agcaatctgg aactgctgcg tattagcctg 240

ctgctgattc agagctggct ggaaccggtg cagtttctgc gtagcgtttt tgcaaatagc 300

ctggtttatg gtgcaagcga tagcaatgtt tatgatctgc tgaaagatct ggaagaaggt 360

attcagaccc tgatgggtcg tctggaagat ggttcaccgc gtaccggtca gatctttaaa 420

cagacctata gcaaattcga taccaacagc cataatgatg atgccctgct gaaaaactat 480

ggtctgctgt attgtttccg caaagatatg gataaagtgg aaacctttct gcgcattgtt 540

cagtgtcgta gcgttgaagg tagctgtggt ttttaa

한편, pETDuet-1 플라스미드 (EMD Millipore Corp.) 와 pAPT 플라스미드 (AP Tech.)를 클로닝 (cloning)을 위한 벡터로서 사용하였다.

히스티딘 6개와 역방향 캐스페이즈-3 인식서열이 결합된 기본 합성 태그 (H6-DEVD)가 성장 호르몬 단백질을 암호화하는 DNA에 결합하도록 PCR을 수행하여 DNA 절편 (H6-DEVD-hGH)을 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편과 제한효소 NcoⅠ/HindⅢ로 절단된 pETDuet-1 플라스미드는 겔 추출을 통하여 정제한 다음, 상동재조합 (homologous recombination) 방식으로 클로닝하였다. 역방향 캐스페이즈-3를 암호화하는 DNA 절편을 삽입하기 위해, 1차 클로닝을 완료한 플라스미드를 제한효소 NdeⅠ/XhoⅠ로 절단한 다음, 상동재조합 방식으로 2차 클로닝하였다. 완성된 플라스미드는 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP3 이며, 제작 모식도는 도 1에 나타내었고, 클로닝을 완료한 결과는 도 11과 도 12에 나타내었다.

pAPT 플라스미드의 경우, 단백질 번역 효율을 증가시키기 위한 인핸서 (enhancer)로서 A/U-rich 서열 (GCTCTTTAACAATTTATCAGATCCAATAGGAGGAACAAT)을 번역 개시 코돈 상위에 삽입하였으며 해당 플라스미드를 pAPT-Y로 명명하였다. pAPT-Y 클로닝에 대한 모식도는 도 2에 나타내었다.

도 3과 같이, PCR을 통해 6종류 태그가 결합된 성장 호르몬 단백질을 암호화하는 DNA를 증폭한 다음, 제한효소 EcoRⅠ/BamHⅠ으로 절단된 pAPT-Y 플라스미드에 상동재조합 방식으로 1차 클로닝하였다. 또한 역방향 캐스페이즈-3가 발현할 수 있도록 Lacuv5 프로모터와 역방향 캐스페이즈-3를 암호화하는 DNA를 1차 클로닝이 완료된 플라스미드에 상기 방식으로 2차 클로닝하였다.

이를 통해 pETDuet-H6-DEVD-hGH-T7-rev-CASP3, pAPT-Y-H6-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3, pAPT-Y-DH6-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3, pAPT-Y-AH6-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3, pAPT-Y-NH6-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3, pAPT-Y-KH6-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3, pAPT-Y-HAK-DEVD-hGH-Lacuv5-rev-CASP3 플라스미드를 확보하였으며 그 모식도를 도 4에 나타내었다. 클로닝을 완료한 결과는 도 13, 도 14, 도 15, 도 16, 도 17, 도 18, 도 19에 나타내었다. 제작한 벡터의 정보는 도 5와 같다.

실시예 2. N-말단 메티오닌이 절단된 목적 단백질의 과발현 시스템 평가

2-1. N-말단 메티오닌이 절단된 성숙 성장 호르몬 단백질 발현양 평가

형질전환이 가능하도록 제작된 대장균(Escherichia coli K-12 W3110 또는 Escherichia coli C41(DE3) 또는 Escherichia coli Rosetta2(DE3))을 1.0x10⁶ cells 이상이 되도록 20 μL씩 튜브에 분주하고 앞서 제작한 플라스미드 10 ng을 각각 섞은 다음, 얼음 위에 5분 방치하였다. 대장균-DNA 혼합물을 전기천공법 (electroporation) 용도의 0.2 cm 큐벳(cuvette)에 옮긴 다음, 2.5 kV 전류를 가하고 SOC 배지(super optimal broth with catabolite repression) 500 μL를 혼합한 후 37 ℃에서 30분간 배양하였다. 카나마이신 (kanamycin) 항생제를 100 μg/mL 함유한 LB (Luria-Bertani) 고체 배지 (agar plate)에 상기 배양액 100 μL를 도말한 다음, 37 ℃에서 16시간 정치 배양하여 형질전환을 완료하였다. 카나마이신에 대해 내성을 보이는 균주를 임의로 선별하여 5 mL LB 액체 배지에 접종한 후(100 μg/mL), 37 ℃에서 배양하였다. 600 nm 파장에서 상기 배양액의 광학 밀도 (optical density, OD)를 측정하였을 때 값이 0.8~1.3인 경우, 1 mM IPTG (Isopropyl β를 배양액에 첨가하여 성장 호르몬 단백질과 역방향 캐스페이즈-3 발현을 3시간 동안 유도하였다. SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)와 Bio-Rad Image Lab software version 5.2.1을 이용하여 성장 호르몬 단백질과 역방향 캐스페이즈-3의 발현양을 계산하였다.

역방향 캐스페이즈-3의 부재로 N-말단 메티오닌이 유지되는 균주와 비교하였을 때, 역방향 캐스페이즈-3가 함께 발현하면 N-말단 메티오닌이 제거된 성장 호르몬 단백질 발현이 유도되는 것을 확인하였다(도 6, 도 7 참조). 도 7에서 발현된 성장 호르몬 단백질 중 가장 높은 발현율을 가진 균주를 합성 태그에 따라 분석했으며 그 결과는 표 2에 나타내었다. 역방향 캐스페이즈-3의 경우, 1.0~1.3 % 발현율을 보였다.

tag	Expression Rate ( % )
tag	M-tag- hGH	Cleaved hGH
H6	1.0	41.4
DH6	1.0	52.1
AH6	1.1	45.9
NH6	1.2	47.2
KH6	1.6	51.1
HAK	1.2	27.1

2-2. N-말단 메티오닌 및 합성 태그의 절단 여부 평가 1

N-말단 메티오닌 절단 여부를 확인하고자 성장 호르몬 단백질과 합성 태그에 대해 웨스턴 블롯 (western blot)을 수행하였다.

상기 IPTG에 의해 단백질 발현이 유도된 세포를 확보한 후, 세포 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM EDTA)와 초음파분쇄기 (sonicator)를 이용하여 20 % 강도 (amplitude)로 10초씩 열 번의 세포 파쇄를 진행하였다. 파쇄된 세포는 4 ℃에서 12,000 xg로 30분 동안 원심분리하여 수용성 단백질 (soluble protein)과 불수용성 단백질 (insoluble protein 또는 inclusion body)을 확보하였다. 4~12 % Bis-Tris 겔에 상기 SDS-PAGE와 동일한 조건으로 전체 단백질과 수용성, 불수용성 단백질을 로딩(loading)하여 단백질 전기영동을 수행한 후, PVDF 멤브레인 (polyvinylidene fluoride membrane)을 이용하여 단백질 트랜스퍼를 진행하였다. 상기 멤브레인에 불특정 결합을 낮추기 위해 블로킹 (blocking)을 수행하고 1차 항체 anti-His, anti-hGH, anti-CASP3 결합을 유도하였다. 형광 인자가 결합된 2차 항체를 반응시킨 후, Odyssey Infrared Imaging System을 통해 성장 호르몬 단백질과 합성 태그, 그리고 역방향 캐스페이즈-3 유무를 확인하였다. 웨스턴 블롯 결과는 Li-COR Image studio analysis software version 3.1을 이용하여 분석하였다.

역방향 캐스페이즈-3의 부재로 N-말단 메티오닌이 유지되는 균주와 비교하였을 때, 역방향 캐스페이즈-3가 함께 발현하면 성장 호르몬 단백질의 N-말단 메티오닌 및 합성 태그 중 96.12 %가 절단되는 것을 확인하였다(도 8 참조). 이러한 결과는 합성 태그의 종류에 상관없이 동일하게 나타났으며 도 9의 경우 합성 태그가 99.30 % 이상 절단되는 것을 확인하였다.

2-3. N-말단 메티오닌 및 합성 태그의 절단 여부 평가 2

N-말단 메티오닌 절단 여부를 확인하고자 성장 호르몬 단백질과 합성 태그에 대해 N-말단 시퀀싱 (N-terminal sequencing)을 수행하였다. 실시예 2-2.의 불수용성 단백질을 4-12 % Bis-Tris 겔에 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하고 Coomassie blue 염색을 통해 성장 호르몬 단백질을 확인 및 확보하였다. 상기 확보한 단백질에 트립신을 처리 (trypsin based enzymatic digestion)한 후 액체 크로마토그래피 질량분광법 (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)을 통해 N-말단 시퀀싱을 수행하였다. 이때 사용한 액체 크로마토그래피 컬럼 (column)은 Acclaim RSLC 120, C18, 2.2 μm Analytical (2.1 mm x 25 cm; 2.2 μm packing C18)이며 이동상 A(mobile phase A)는 0.1% formic acid in water, 이동상 B(mobile phase B)는 0.1% formic acid in acetonitrile을 사용하였고 UV 214 nm에서 분석하였다. 질량분석은 Thermo Q-Exactive Plus- Quad-Orbitrap MS system을 이용하여 300-1,900 m/z 범위에서 진행하였다.

역방향 캐스페이즈-3의 부재로 N-말단 메티오닌이 유지되는 균주의 경우, 합성 태그가 결합된 형태인 'GSHHHHHHDEVDFPTIPLSR' 서열을 확인하였고 역방향 캐스페이즈-3가 함께 발현된 균주의 경우, 성장 호르몬 단백질의 N-말단 메티오닌 및 합성 태그가 절단된 형태인 'FPTIPLSR' 서열을 확인하였다(도 10 참조).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> POLUS Inc. <120> Gene Expression Cassette for Expressing a Target Protein of which Methionine at the N-terminus is Cleaved and Method for Producing the Target Protein Using the Same <130> P18-B299 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 286 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Glu Thr Asp Ser Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys 1 5 10 15 Ile Pro Val Glu Ala Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly 20 25 30 Tyr Tyr Ser Trp Arg Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser 35 40 45 Leu Cys Ala Met Leu Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His 50 55 60 Ile Leu Thr Arg Val Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Thr Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val 85 90 95 Ser Met Leu Thr Lys Glu Leu Tyr Phe Tyr His Asp Glu Val Asp Gly 100 105 110 Glu Asn Thr Glu Asn Ser Val Asp Ser Lys Ser Ile Lys Asn Leu Glu 115 120 125 Pro Lys Ile Ile His Gly Ser Glu Ser Met Asp Ser Gly Ile Ser Leu 130 135 140 Asp Asn Ser Tyr Lys Met Asp Tyr Pro Glu Met Gly Leu Cys Ile Ile 145 150 155 160 Ile Asn Asn Lys Asn Phe His Lys Ser Thr Gly Met Thr Ser Arg Ser 165 170 175 Gly Thr Asp Val Asp Ala Ala Asn Leu Arg Glu Thr Phe Arg Asn Leu 180 185 190 Lys Tyr Glu Val Arg Asn Lys Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Ile Val 195 200 205 Glu Leu Met Arg Asp Val Ser Lys Glu Asp His Ser Lys Arg Ser Ser 210 215 220 Phe Val Cys Val Leu Leu Ser His Gly Glu Glu Gly Ile Ile Phe Gly 225 230 235 240 Thr Asn Gly Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Thr Asn Phe Phe Arg Gly 245 250 255 Asp Arg Cys Arg Ser Leu Thr Gly Lys Pro Lys Leu Phe Ile Ile Gln 260 265 270 Ala Cys Arg Gly Thr Glu Leu Asp Cys Gly Ile Glu Thr Asp 275 280 285 <210> 2 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgatcgaaa ccgatagcgg tgttgatgat gatatggcct gtcataaaat tccggttgaa 60 gccgattttc tgtatgcata tagcaccgca ccgggttatt atagctggcg taatagcaaa 120 gatggcagct ggtttattca gagcctgtgt gcaatgctga aacagtatgc agataaactg 180 gaattcatgc acattctgac ccgtgttaat cgtaaagttg caaccgaatt tgaaagcttt 240 agctttgatg caaccttcca tgccaaaaaa caaattccgt gtattgttag catgctgacc 300 aaagaactgt atttctatca cgatgaagtg gatggcgaaa ataccgaaaa tagcgttgat 360 agcaaaagca tcaaaaacct ggaaccgaaa attatccatg gtagcgaaag catggatagc 420 ggtattagcc tggataacag ctataaaatg gattatccgg aaatgggcct gtgcatcatt 480 atcaacaaca aaaactttca caagagcacc ggtatgacca gccgtagcgg caccgatgtt 540 gatgcagcaa atctgcgtga aacctttcgc aatctgaaat atgaagtgcg caataagaat 600 gatctgacgc gtgaagaaat tgtggaactg atgcgtgatg ttagcaaaga agatcatagc 660 aaacgtagca gctttgtttg tgttctgctg agccatggtg aagaaggtat tatctttggc 720 accaatggtc cggttgatct gaaaaaaatc accaactttt ttcgtggtga tcgttgtcgt 780 agcctgaccg gtaaaccgaa actgtttatc attcaggcat gtcgtggcac cgaactggat 840 tgtggtattg aaaccgatta a 861 <210> 3 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 4 <211> 576 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tttccgacca ttccgctgag ccgtctgttt gataatgcaa tgctgcgtgc acaccgtctg 60 caccagctgg catttgatac ctatcaagaa tttgaagaag cgtatatccc gaaagagcag 120 aaatatagct tcctgcagaa tccgcagacc agcctgtgtt ttagcgaaag cattccgaca 180 ccgagcaatc gtgaagaaac ccagcagaaa agcaatctgg aactgctgcg tattagcctg 240 ctgctgattc agagctggct ggaaccggtg cagtttctgc gtagcgtttt tgcaaatagc 300 ctggtttatg gtgcaagcga tagcaatgtt tatgatctgc tgaaagatct ggaagaaggt 360 attcagaccc tgatgggtcg tctggaagat ggttcaccgc gtaccggtca gatctttaaa 420 cagacctata gcaaattcga taccaacagc cataatgatg atgccctgct gaaaaactat 480 ggtctgctgt attgtttccg caaagatatg gataaagtgg aaacctttct gcgcattgtt 540 cagtgtcgta gcgttgaagg tagctgtggt ttttaa 576

Claims

목적 단백질을 코딩하는 핵산 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트로, 상기 목적 단백질 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌(Met)과 두번째 아미노산 사이에 시스테인 프로테이즈 인식서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제 1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 핵산 및 시스테인 프로테이즈를 코딩하는 핵산은 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제 2항에 있어서, 상기 프로모터는 T3 프로모터, T5 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, trp 프로모터, 아라비노스 프로모터, Lacuv5 프로모터 및 LacI 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열은 DEVD, VEID, VEHD 또는 LEHD 인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 프로테이즈는 역방향 캐스페이즈-3 (reverse caspase-3), 역방향 캐스페이즈-6 (reverse caspase-6) 또는 역방향 캐스페이즈-9 (reverse caspase-9)인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 번역 개시 코돈 상위에 인핸서가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제6항에 있어서, 상기 인핸서는 A/U-rich 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인간 헤모글로빈, 인터루킨-2, 인터페론-베타 또는 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 시스테인 프로테이즈 인식서열의 N-말단에 태그가 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제9항에 있어서, 상기 태그는 His tag, DH6 tag, AH6 tag, NH6 tag, KH6 tag, HAK tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB 및 Xpress epitope로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 카세트.
제1항 내지 10항 중 어느 한 항의 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 벡터.
제11항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 pAPT 벡터, pETDuet(pETDuet-1) 벡터, pET24a(+) 벡터, pQE30 벡터, pMAL-c2x 벡터, pTrc99a 벡터, pBAD 벡터, pUC18 벡터 및 pUC19벡터로 구성된 군에서 선택되는 벡터에 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 유전자 발현 카세트가 도입된 재조합 미생물.
제13항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) 또는 효모인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산방법:
(a) 제14항의 재조합 미생물을 배양하여 N-말단의 첫번째 아미노산인 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 목적 단백질을 회수하는 단계.
제15항에 있어서, 상기 생성된 목적 단백질은 성숙 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 생산방법.