KR20200083343A - Cxcl12 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

Cxcl12 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CXCL12(SDF-1)의 발현을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 다낭신(PKD)의 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신 진단용 키트 및 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 다낭신 마커 CXCL12(SDF-1)를 이용함으로써 환자의 소변 등 비침습적 방법으로 수득한 시료로부터 초기에 다낭신을 진단할 수 있다.

Description

CXCL12 검출용 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물 및 이의 이용{Composition for diagnosing polycystic kidney disease comprising agent for detecting CXCL12 and use thereof}
본 발명은 CXCL12(SDF-1)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 다낭신(PKD)의 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신의 진단용 키트 및 CXCL12(SDF-1)을 검출하는 제제를 이용한 ADPKD의 예방 또는 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다
다낭신 또는 다낭포성 신장 질환은 액체로 채워진 여러 개의 낭종으로 인해 신장이 벌집 모양으로 변형되는 유전 질환으로, 상염색체 우성 다낭신(ADPKD), 상염색체 열성 다낭신(ARPKD) 등으로 분류된다.
상염색체 우성 다낭신(ADPKD, 이하 "다낭신"이라 한다)은 신장에서 가장 흔한 유전성 신장질환으로, 1000명당 1명 꼴의 발병률을 보인다. 다낭신 환자는 양쪽 콩팥에 다수의 낭종이 발생하고, 낭종의 크기와 수가 증가하여 결국에는 50-60대에 신장 기능이 정지하여 죽음에 이르게 된다. 낭종의 진행은 낭종 표피 세포의 증식이 일어난 후 낭종 안으로 낭종액이 차게 되면서 낭종의 크기가 커지게 되며 진행된다.
다낭신은 국내 투석 환자의 원인 중 약 2%를 차지하여, 당뇨, 고혈압, 사구체 신염 다음으로 흔하게 나타난다. 다낭신은 양쪽 콩팥의 구조적, 기능적 결함을 가져올 뿐만 아니라, 각종 신장의 합병증을 동반할 수 있기 때문에 비교적 질환의 초기 단계에서부터 관리가 필요하다.
다낭신의 원인 유전자는 PKD1과 PKD2 유전자로, 각각 polycystin-1과 polycystin-2라는 단백질을 코딩한다. 다낭신 진단 환자의 85%는 PKD1 유전자의 결함, 나머지 15%는 PKD2 유전자의 결함이 원인인 것으로 알려져 있다.
현재 다낭신의 완치 방법은 알려져 있지 않으며, 최근 치료 방향은 합병증에 의한 질병 이환 및 사망을 감소 시키는 방향으로 연구가 진행되고 있으며, 이를 위해 비침습적인 방법으로 초기에 다낭신을 진단할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
본 발명의 목적은 CXCL12(SDF-1)을 검출하는 제제를 포함하는 다낭신의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 다낭신의 진단 키트 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CXCL12(SDF-1)의 양을 측정하는 단계를 포함하는 다낭신의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 다낭신 환자의 낭종 표피 세포 및 낭종액(cyst fluid)에서 케모카인의 일종인 스트로마세포 유래인자-1(SDF-1, CXCL12)의 발현이 증가함을 확인하여 다낭신에 대한 바이오마커로서의 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 다낭신 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다낭신 진단용 키트, 및 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 다낭신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포에 후보 물질을 처리하여 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 조사하는 단계를 포함하는, 다낭신의 경감 또는 치료용 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명이 제공하는 다낭신 진단용 조성물은, CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질을 검출하는 제제를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 다낭신 유전자의 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 상기 "다낭신"은 다낭포성 신장질환 또는 다낭성 신장질환을 의미하며, 예를 들어 상염색체 우성 다낭성 신장질환 또는 상염색체 열성 다낭성 신장질환일 수 있으며, 일 예에서, 상염색체 우성 다낭성 신장질환일 수 있다.
본 명세서에서 "발현량"은 유전자의 mRNA 전사량 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 번역량을 모두 포함한다. 본 명세서에서 "유전자의 발현"이란 mRNA의 전사와 단백질의 번역을 모두 포함한다.
본 명세서에서 "정상인"은 다낭신 환자가 아닌 개체를 의미한다.
C-X-C 모티프 케모카인 12(CXCL12) 유전자는 케모카인의 일종인 스트로마세포 유래인자-1 (SDF-1) 단백질을 암호화하는 유전자로서, 인간 염색체 10번 위치에 존재한다. CXCL12는 직접적으로 암세포의 생존, 증식 및 이동을 조절하고 간접적으로는 혈관의 생성 및 면역 세포를 통해 종양 발생 과정에 영향을 주는 것으로 알려져 있으나, 다낭신 환자의 낭종액에서 CXCL12(SDF-1)을 측정한 예는 없다.
상기 mRNA를 검출하는 제제는 mRNA의 발현량을 측정할 수 있는 것이면 당업자가 자유롭게 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, CXCL12 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 CXCL12(SDF-1) 단백질을 검출하는 제제는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제라면 제한 없이 선택하여 이용할 수 있으며, 예를 들어, 상기 CXCL12(SDF-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 압타머 및 뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 또는 상기 4종의 제제일 수 있다. 상기 단백질의 발현 여부를 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
일 예에서, 다낭신 환자로부터 분리된 시료, 예를 들어, 신장 낭종 표피세포, 낭종액, 및 상기 신장 낭종 표피 세포의 배양액로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 시료에서 측정되는 CXCL12 유전자 발현량은 대조군에서의 CXCL12 발현량을 1로 두었을 때, 1.5 내지 30배, 1.5 내지 20배, 1.5 내지 15배, 1.5 내지 10배, 1.5 내지 9배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 2 내지 15배 2 내지 10배, 2 내지 9배, 2.5 내지 30배, 2.5 내지 20배, 2.5 내지 15배, 2.5 내지 10배, 2.5 내지 9배일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 CXCL12 발현량은 CXCL12 유전자의 mRNA 농도 또는 GAPDH의 mRNA 발현량 대비 CXCL12 유전자의 mRNA 발현량으로 나타내어 질 수 있다.
일 예에서, 다낭신 환자로부터 분리된 시료, 예를 들어, 신장 낭종 표피세포, 낭종액 및 상기 신장 낭종 표피세포의 배양액으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 시료에서 측정되는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 농도는 대조군 대비 2 내지 3000배, 2 내지 2500배, 2 내지 2000배, 2 내지 1500배, 5 내지 3000배, 5 내지 2500배, 5 내지 2000배, 5 내지 1500배, 10 내지 3000배, 10 내지 2500배, 10 내지 2000배, 10 내지 1500배, 100 내지 3000배, 100 내지 2500배, 100 내지 2000배, 100 내지 1500배일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자로부터 분리된 신장 표피세포에서 전체 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 통해 cDNA를 제작하고, 해당 cDNA를 주형으로 하여 다시 PCR을 수행하여 건강군과 환자군의 CXCL12(SDF-1) mRNA 발현량을 비교하였다. PCR 후 각 시료를 전기영동하여 밴드 세기를 비교한 결과, 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 낭종 표피 세포들에게서 CXCL12(SDF-1)의 mRNA 발현량이 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 높게 나타났다. 따라서 CXCL12 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 CXCL12(SDF-1) 단백질은 다낭신, 바람직하게는 상염색체 우성 다낭신 진단용 바이오마커로서 활용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자로부터 추출된 낭종액에서 CXCL12(SDF-1) 단백질의 양을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 대조군인 혈장에 비해 환자 3인의 샘플 모두에서 통계적으로 유의미하게 낭종액 내 CXCL12(SDF-1) 단백질의 양이 증가하였다.
따라서 세포 증식과 관련 있는 케모카인인 CXCL12(SDF-1)이 상염색체 우성 다낭신 환자의 신장 낭종 표피 세포에서 발현량이 증가함이 확인되었으며, 특히 낭종 표피 세포에서 분비된 CXCL12(SDF-1)이 낭종액에 축적이 되고 이로 인해 낭종 세포의 증식이 증가함을 유추할 수 있다.
본 발명에서 검출 대상이 되는 CXCL12 유전자 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질은, CXCR4와 결합 및/또는 CXCR4를 활성화하여, mTOR 신호전달경로를 활성화하는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 다낭신 환자와 정상 신장 낭종 표피세포 내 CXCR4 및 CXCR7 단백질 발현량을 Western blot으로 확인한 결과, 다낭신 환자에서는 CXCR4 단백질의 발현량이 현저히 증가하였다 (도 3a). 따라서 다낭신 환자에서 CXCL12는 CXCR4에 작용함을 유추할 수 있다.
일 실시예에서, 다낭신 환자로부터 유래한 신장 낭종 표피세포에 재조합 CXCL12 및/또는 AMD3100(CXCR4 길항제)를 처리한 결과, CXCL12만 처리하였을 때에는 mTOR 신호전달 경로의 단백질이 인산화되어 mTOR 신호전달경로가 활성화 되었으나, CXCL12와 AMD3100을 동시에 처리한 경우, CXCL12와 AMD3100을 모두 처리하지 않은 시료와 유사한 단백질 발현 패턴을 보여, mTOR 신호전달경로가 활성화되지 않음을 확인하였다. 따라서, CXCL12가 mTOR 신호전달경로를 활성화하기 위해서는 CXCR4가 필요함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일 예는 CXCL12 유전자 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 다낭신 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 진단용 키트는 상기 CXCL12 유전자 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 CXCL12 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, ELK3 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트튜브 또는 다른 적절한 컨테이너(container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제(Taq-polymerase) 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도를 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리 비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(4-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 CXCL12 유전자 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 시료는 환자의 조직, 혈액, 세포, 혈장, 혈청, 뇨, 낭종액, 세포 배양액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 시료는 환자의 신장 조직, 혈액, 세포, 및 상기 세포의 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상 또는 네 종류의 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은, 환자로부터 분리된 시료로부터 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도를 건강 대조군 시료 내 CXCL12 유전자의 mRNA 또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 CXCL12 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 방법은, 예를 들어 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응, 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR), RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하는 것일 수 있다.
상기 역전사효소 중합효소 연쇄반응은, 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 CXCL12 유전자의 mRNA 발현 여부 및 발현 정도를 확인 가능하고, 이를 대조군과 비교함으로써 다낭신의 발병 또는 진행 정도를 진단할 수 있다. 구체적으로, CXCL12 유전자의 mRNA 발현량이 대조군보다 높게 나타나는 경우, 다낭신이 발병한 것으로 진단할 수 있다.
상기 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량을 측정하는 방법은, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로, 상기 단백질 발현 정도 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 다낭신 마커인 CXCL12(SDF-1) 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 다낭신의 발병 및/또는 진행 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, CXCL12(SDF-1) 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간 섬유화 또는 간 경화 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명이 제공하는 다낭신 진단에 관한 정보를 제공하는 방법은, 상기 환자 시료에서의 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량을 건강 대조군의 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도와 비교하는 단계 이후 환자 시료에서의 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량이 정상군보다 높은 경우 다낭신 환자로 결정 및/또는 분류하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 검출 방법을 통하여 다낭신의 발병 여부, 다낭신 환자의 낭종 형성 및 진행 상황을 진단할 수 있다. 즉, 환자의 CXCL12 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현 정도를 건강 대조군에서의 CXCL12 및/또는 SDF-1 발현 정도와 비교함으로써 환자의 CXCL12 및/또는 SDF-1 발현 정도가 건강 대조군에서보다 더 높게 나타나면, 다낭신이 발병 또는 진행된 것으로 진단할 수 있다. 다낭신 환자와 대조군에서 CXCL12 유전자의 mRNA 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량은, 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자의 낭종 표피 세포 내 CXCL12 유전자의 mRNA양을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과, 건강 대조군에서는 밴드가 희미하게 나타난 반면, 환자 3명 모두에게서 대조군에 비해 선명한 밴드가 나타났다. 구체적으로, CXCL12의 밴드 강도(band intensity)를 GAPDH의 intensity로 나눈 후, normalization을 진행한 결과, 대조군인 RPTEC의 밴드 강도 차이를 1로 두었을 때, 각 환자들의 밴드 강도 차이는 각각 2.73, 6.73, 및 8.86으로 나타나 다낭신 환자의 CXCL12의 발현량이 정상군에 비해 급격히 증가하였음을 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다낭신 환자의 낭종액 내 SDF-1 발현량을 ELISA로 측정한 결과, 대조군인 혈장에서는 SDF-1의 양이 786.7 pg/mL로 나타난 반면, 환자군은 각각 2876.4 pg/mL, 2197.6 pg/mL, 및 2409.7 pg/mL로 나타났다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 다낭신 환자로부터 분리된 시료에 다낭신 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계 및 CXCL12 유전자 및/또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 다낭신 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 다낭신 치료제란 다낭신의 진행을 완화하거나 중단시키는 물질을 포함한다.
구체적으로, 다낭신 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 CXCL12 및/또는 SDF-1의 발현 증감을 비교하는 방법으로 다낭신 치료제를 스크리닝하는 데 유용하게 사용할 수 있다. CXCL12 유전자의 mRNA 또는 CXCL12(SDF-1) 단백질 농도를 직간접적으로 감소시키는 물질은 다낭신의 치료제로 선택 및/또는 분류될 수 있다. 즉, 다낭신 치료제 후보 물질의 존재 하에 본 발명의 마커 CXCL12 및/또는 SDF-1의 발현 정도를 측정하여 양자를 비교한 후, 다낭신 치료제 후보 물질이 존재할 때의 CXCL12 및/또는 SDF-1의 발현 정도가 다낭신 후보 물질의 부재 하에서의 CXCL12 및/또는 SDF-1의 발현 정도보다 감소시키는 물질을 다낭신의 치료제로 예측할 수 있다.
본 발명이 제공하는 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 진단용 조성물은 저비용으로 다낭신의 조기 진단 및 이에 따른 병증의 관리에 유용하게 이용될 수 있다. 특히 향후 환자의 신장 낭종 크기 증식을 억제할 수 있는 치료제 개발을 위한 타겟으로 적용 가능하다.
본 발명이 제공하는 CXCL12(SDF-1)의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 이용하여 환자 낭종의 증식을 유추할 수 있으며, 이를 추적 관찰함으로써 향후 환자의 낭종 증식에 따른 발병 진행 정도를 예측할 수 있는 바이오마커로 활용 가능하고, 이를 통해 환자 개인 맞춤형 치료를 제공할 수 있다.
도 1a은 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 낭종 표피 세포들에서 CXCL12(SDF-1)의 mRNA 발현량 증가를 RT-PCR로 확인한 전기영동 결과 사진이다.
도 1b는 상기 도 1a에서 나타낸 상염색체 우성 다낭신 환자들의 전기영동 결과 나타난 band의 intensity를 대조군인 RPTEC의 intensity로 나눈 후, normalization을 진행한 표와 그래프이다.
도 1c는 상염색체 우성 다낭신 환자들의 낭종 표피세포(ADPKD)와 대조군(RPTEC) 세포로부터 배양액으로 분비된 CXCL12(SDF-1) 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 상염색체 우성 다낭신 환자의 낭종액(cyst fluid, CF)에서 CXCL12(SDF-1)의 양을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 다낭신 환자와 정상군(대조군) 신장 조직에서의 CXCL12 수용체(CXCR4 및 CXCR7) 또는 mTOR 신호전달 경로의 단백질 인산화를 Western blot으로 분석한 결과이다.
도 3b는 다낭신 환자의 신장 표피 세포에 재조합 CXCL12 및 CXCR4의 길항제인 AMD3100의 처리 여부에 따른 mTOR 신호전달경로의 단백질 인산화를 Western blot으로 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 시료의 준비
다낭신 환자의 신장 조직 샘플은 서울대학교병원으로부터 공급받았다. 상염색체 우성 다낭신 환자로부터 추출된 신장에서 낭종의 일부(직경 1 내지 3cm)를 추출하여 세포 배양을 진행하였다. 세포 배양은 DMEM/10% FBS 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 진행되었다. 대조군 시료로는 ATCC에서 구매한 RPTEC/TERT1 (CRL-4031) 이라는 정상 신장 표피 세포를 사용하였다.
세포의 불멸화를 위해, 1차 배양된 낭종 세포는 lipofectamine 2000 (Invitrogen 사)을 이용해 hTERT를 형질감염(transfection)하였다. 형질감염된 세포들은 G418 (1mg/ml)을 이용해 선별하였다.
실시예 2. 다낭신 환자의 낭종 표피 세포에서 CXCL12 발현량 확인
2-1. RNA 시료 준비
실시예 1에서 배양된 세포로부터 Qiagen사의 RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 세포 내 전체 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 먼저 세포를 1X10^7 개로 수득하여 RLT lysis buffer를 사용하여 cell lysis를 진행하였다. Lysate를 gDNA Eliminator spin column에 옮긴 후 10,000rpm에 30초간 원심분리 후, Flow-through에 동일량의 70% EtOH를 넣어 섞은 후 RNeasy spin column에 옮겨 10,000rpm에 15초간 원심분리하였다. RW1 buffer 700ul를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리 후 RPE buffer 500ul를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리를 수행한 후, Air dry 후 50ul RNase-free water를 column에 넣은 후 10,000rpm에 15초간 원심분리하여 전체 RNA를 추출하였다.
2-2. RT-PCR
추출된 RNA 주형으로, TAKARA 사의 PrimeScript RT-PCR Kit를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)을 통해 cDNA를 제작하였다. Reaction Mixture, Reagent Mixture 및 Thermal condition 정보는 하기와 같다.
(1) Reaction mixture;
Template (RNA) 2ug
Oligo dT primer (2.5uM) 1ul
dNTP (10mM each) 1ul
RNase Free dH2O up to 10ul
Denaturation at 65℃ min
(2) Reagent mixture;
Reaction mixture 10ul
5X PrimeScript Buffer 4ul
RNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ul
PriemScript RTase 0.5ul
RNase Free dH2O 5ul
(3) Thermal condition;
30℃ in
42℃, 30 min
95℃, 5min
4℃, 보관
2-3. 건강군과 환자군의 CXCL12(SDF-1) 발현량 비교
실시예 2-2에서 제작된 cDNA 시료를 주형으로 하여, 하기 표 2에 기재된 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 CXCL12(SDF-1)를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용해 증폭하여 건강군과 환자군의 CXCL12(SDF-1) 발현량을 비교하였다. 대조군으로는 GAPDH 유전자를 사용하였다. GAPDH 유전자의 증폭 및 CXCL12(SDF-1) cDNA의 증폭에 사용된 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 프라이머 서열 (5'>3')
1 CXCL12_forward TCAGCCTGAGCTACAGATGC
2 CXCL12_reverse GCATTGACCCGAAGCTAAAG
3 GAPDH_forward TTGCCATCAATGACCCCTTCA
4 GAPDH_reverse CGCCCCACTTGATTTTGGA
PCR 후 각 시료를 아가로스 젤에서 전기영동하여 각 PCR 산물의 밴드 세기를 통해 mRNA 발현량을 비교하였다. 도 1a에 상염색체 우성 다낭신 환자들의 신장 낭종 표피 세포들에게서 CXCL12(SDF-1)의 mRNA 발현량을 조사한 결과의 사진을 나타내었다. 대조군인 GAPDH의 밴드 세기는 대조군(control)과 상염색체 우성 다낭신 환자들 사이에서 큰 변화를 보이지 않았으나, CXCL12(SDF-1)의 경우, 대조군에서의 밴드가 매우 희미하게 관찰되는 반면, 상염색체 우성 다낭신 환자군에서는 대조군에 비해 진한 밴드 강도(intensity)를 보여 환자군에서 CXCL12(SDF-1)의 mRNA 발현량이 공통적으로 증가하였음이 확인되었다.
도 1b에 상기 도 1a에서 나타낸 상염색체 우성 다낭신 환자들의 전기영동 결과 나타난 band의 intensity를 대조군인 RPTEC의 intensity로 나눈 후, normalization을 진행한 표와 그래프를 나타내었다. 대조군인 RPTEC에서의 fold change를 1로 두었을 때, 환자 3인의 fold change는 각각 2.73, 6.73 및 8.86으로 측정되어 건강군에 비해 다낭신 환자에서 CXCL12의 발현량이 높게 나타나는 것을 정량적으로 확인하였다.
CXCL12(SDF-1) 단백질의 분비가 증가하였음을 확인하기 위해 시판 ELISA 키트를 이용해 환자로부터 분리된 신장 표피 세포와 대조군 RPTEC의 배양액 내 CXCL12 단백질 (SDF-1) 수준을 측정하였다. 도 1c에 각 세포 배양액 내 CXCL12 단백질의 농도 측정 결과 그래프를 나타내었다. 상염색체우성 다낭신 환자로부터 분리된 표피 세포가 배양된 배양액에서 CXCL12 단백질의 발현량이 더 증가하였음을 확인하였다(도 1c). 따라서 다낭신 환자의 신장 낭종 표피세포에서 CXCL12(SDF-1)의 발현 및 분비가 증가함을 알 수 있다.
실시예 3. 다낭신 환자의 낭종액에서 CXCL12(SDF-1)의 양 확인
다낭신 환자의 낭종 표피 세포에서 분비된 CXCL12(SDF-1)이 낭종액에 축적되었는지 여부를 살피기 위해 다낭신 환자의 낭종으로부터 분리된 낭종액에 대해 효소결합면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 공급받은 신장 샘플로부터 주사기를 이용하여 낭종액을 추출하고, R&D System 사의 Human CXCL12/SDF-1 alpha ELISA kit를 이용하여 CXCL12(SDF-1)의 양을 측정하였다. 대조군으로는 건강한 정상인의 혈장을 이용하였다.
도 2에 상염색체 우성 다낭신 환자의 낭종액(cyst fluid)에서 CXCL12(SDF-1)의 양을 ELISA로 측정한 결과 그래프를 나타내었다. ELISA 결과 환자 3 명의 샘플 모두에서 통계적으로 유의미하게 낭종액 내 CXCL12(SDF-1) 단백질의 양이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 대조군은 786.7 pg/mL, 환자의 경우 각각 2876.4 pg/mL, 2197.6 pg/mL, 및 2409.7 pg/mL의 CXCL12(SDF-1) 단백질 농도를 보였다.
따라서 세포 증식과 관련이 있는 케모카인인 CXCL12(SDF-1)이 상염색체 우성 다낭신 환자의 신장 낭종 표피 세포에서 발현량이 증가함이 확인되었으며, 특히 낭종 표피 세포에서 분비된 CXCL12(SDF-1)이 낭종액에 축적이 되고 이로 인해 낭종 세포의 증식이 증가함을 유추할 수 있다.
실시예 4. 다낭신 환자에서 CXCL12의 역할 분석
4-1. mTOR 활성화 분석
CXCL12가 다낭신 환자의 낭종액(RC fluid) 내에서 수행하는 역할을 규명하기 위해, 본 발명자들은 CXCL12의 수용체인 CXCR4와 CXCR7의 발현량을 확인하고, CXCL12가 CXCR4를 통해 mTOR 신호전달 경로를 활성화 시키는 지 확인하기 위해, Western blot을 수행하였다.
Western Blot은 하기의 방법으로 수행되었다. 비환자군(정상군)의 신장 조직과 다낭신 환자의 신장 조직을 균질화 후 RIPA 버퍼를 이용해 세포 용해(cell lysis)를 수행하였다. 상기 신장 조직의 각 단백질 용해물(protein lysates)은 12%(w/v) SDS-PAGE를 수행해 분리하고, PVDF 멤브레인에 트랜스퍼 하였다. 상기 트랜스퍼 완료된 PVDF 멤브레인은 블로킹 버퍼 (3%(w/v) nonfat dray milk in Tris-buffered saline 및 0.1% Twwen20(TBST))에서 1시간 반응 후 1차 항체를 이용해 4
Figure pat00001
에서 밤샘 배양하여 표지하였다. 상기 1차 항체로는 anti-CXC chemokine receptor 4(CXCR4, Abcam), anti-CXC chemokine receptor 7(CXCR7, Abcam), anti-phospho-AKT (Cell signaling technology), anti-AKT(cell signaling Technology), anti-phospho-p70(Cell Signaling Technology), anti-p70 (Cell Signaling Technology), anti-phospho-S6 (Cell Signaling Technology), anti-S6 (Cell Signaling Technology), 및 anti-*?*-actin (Sigma)를 이용하였다.
상기 1차 항체 반응 후 TBST를 이용해 3회 세척 후 퍼옥시다아제 결합된 2차 항체(peroxidase-labeled secondary antibody)를 이용해 1시간 반응을 수행하고, TBST로 3회 세척하였다.
각 표지된 단백질은 ECL(enhanced chemiluminescence) detection system(GE Healthcasre 사)를 이용하여 탐지되었다.
도 3a에 환자와 정상군에서의 CXCR7, CXCR4 및 mTOR 신호전달경로 내 각 단백질의 인산화와 발현량을 확인한 Western blot 결과를 나타내었다.
다낭신 환자에서는 CXCR4의 발현량이 대조군(정상군)에 비해 증가했으며, AKT, p70 및 S6을 포함하는 mTOR 신호전달경로의 단백질 모두 인산화된 단백질이 증가하여, 다낭신 환자에서 상기 단백질들이 활성화되었음을 확인하였다.
4-2. 다낭신 환자의 mTOR 신호전달 경로 활성화에는 CXCR4가 관여함
상기 mTOR 신호전달 경로 내 단백질의 활성화가 CXCR4에 의해 활성화 된 것인지 확인하기 위해, 본 발명자들은 재조합 CXCL12 및 AMD3100(CXCR4 길항제)을 각각 다낭신 환자의 낭종 표피 세포에 처리하여, mTOR 신호전달 경로 내 단백질의 활성화 여부를 Western blot을 이용해 확인하였다. Western blot은 상기 실시예 4-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다.
도 3b에 상기 Western blot 결과를 나타내었다. CXCL12와 AMD3100에서, -는 미처리를, +는 처리되었음을 의미한다. CXCL12만이 처리된 경우에는 mTOR 신호전달 경로 내 단백질의 인산화 증가가 확인되었으나, AMD3100이 함께 처리된 경우에는 CXCL12와 AMD3100이 모두 처리되지 않았을 때와 유사한 단백질 발현 패턴을 나타내어, CXCR4 길항제가 mTOR 신호전달경로의 활성화를 차단함을 확인하였다.
따라서 CXCL12(SDF-1) 단백질은 CXCR4를 통해 mTOR 신호전달 경로를 활성화시켜 다낭신 환자에서의 낭종 성장에 관여하는 것으로 예측할 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition for diagnosing polycystic kidney disease comprising agent for detecting CXCL12 and use thereof <130> DPP20195199KR <150> KR 10-2018-0172217 <151> 2018-12-28 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12_forward <400> 1 tcagcctgag ctacagatgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12_reverse <400> 2 gcattgaccc gaagctaaag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward <400> 3 ttgccatcaa tgaccccttc a 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse <400> 4 cgccccactt gattttgga 19

Claims (9)

  1. 스트로마세포 유래인자-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1) 단백질을 검출하는 제제, 및 상기 CXCL12(SDF-1) 단백질을 암호화하는 C-X-C 모티프 케모카인 12(C-X-C motif chemokine 12, CXCL12) 유전자의 발현을 검출하는 제제로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는, 다낭신의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다낭신은 상염색체 우성 다낭신인, 조성물
  3. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 다낭신의 진단용 키트.
  4. 환자로부터 분리된 시료로부터 CXCL12(SDF-1) 단백질, 및 상기 CXCL12 (SDF-1)단백질을 암호화하는 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 다낭신의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 시료는 신장 조직, 세포, 낭종액, 및 상기 세포의 배양액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 대조군인 정상인으로부터 분리된 시료로부터 CXCL12 유전자, 및 CXCL12(SDF-1) 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계;
    상기 환자로부터 분리된 시료와 대조군의 발현량을 비교하는 단계; 및
    상기 환자 시료에서의 CXCL12 유전자 및 CXCL12(SDF-1) 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 상기 환자를 다낭신 환자로 분류하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다낭신 환자로 분류하는 단계는, 환자 시료에서의 CXCL12 유전자 발현량이 대조군에 비해 1.5 내지 30배 또는 CXCL12(SDF-1) 단백질의 발현량이 대조군에 비해 2배 내지 3000배 인 경우에 다낭신 환자로 분류하는 것인, 방법.
  8. 다낭신 환자로부터 분리된 시료에 다낭신 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    CXCL12 유전자 및 CXCL12(SDF-1) 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 다낭신 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CXCL12 유전자 및 CXCL12(SDF-1) 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량이 후보물질 미처리군에 비해 감소한 경우, 상기 후보 물질을 다낭신 치료제로 분류하는 것인, 다낭신 치료제의 스크리닝 방법.
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