KR20200087198A - 변형된 리간드-게이팅 이온 채널 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 활성을 조정하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 변형된 리간드 결합 도메인 (LBD) 및/또는 변형된 이온 포어 도메인 (IPD)을 갖는 적어도 1개의 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC가 제공된다. 또한, 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 외인성 LGIC 리간드뿐만 아니라 포유동물의 세포의 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하는 방법, 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하는 방법, 및 채널병증을 갖는 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

변형된 리간드-게이팅 이온 채널 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/584,428 및 2018년 9월 11일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/729,716을 우선권 주장한다. 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 일부로 간주 (및 참조로 포함)된다.
기술 분야
본 명세서는 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 활성을 조정하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서는 변형된 리간드 결합 도메인 (LBD) 및/또는 변형된 이온 포어 도메인 (IPD)을 갖는 적어도 1개의 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC를 제공한다. 또한, 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 외인성 LGIC 리간드가 제공된다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 리간드는 채널병증 (예를 들어, 신경 채널병증 또는 근육 채널병증)을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물의 세포의 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하기 (예를 들어, 활성화시키거나 또는 억제하기) 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하기 (예를 들어, 증가시키거나 또는 감소시키기) 위해 사용될 수 있다.
이온 채널은 세포 내의 이온 유동을 매개하며, 이는 그의 생물학적 기능에 중대한 영향을 미친다. 이것의 두드러진 경우는 뉴런 내에서이며, 여기서 이온 채널은 뉴런 내 및/또는 뉴런 사이의 전기적 신호전달을 제어하여 생리학, 감각, 행동, 기분 및 인지에 영향을 미친다.
상이한 LGIC는 별개의 리간드 결합 특성뿐만 아니라 특이적 이온 전도도 특성을 갖는다 (Hille 2001 Ion Channels of Excitable Membranes. pp. 814. Sunderland, MA: Sinauer Associates; Kandel et al. 2000 Principles of Neural Science. USA: McGraw-Hill Co. 1414 pp). 예를 들어, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)는 내인성 리간드 아세틸콜린 (ACh)에 결합하며, 이는 양이온에 대한 전도도를 활성화시키고, 전형적으로 세포를 탈분극시킴으로써, 세포 흥분성을 증가시킨다. 반대로, 글리신 수용체 (GlyR)는 내인성 리간드 글리신에 결합하며, 이는 클로라이드 음이온 전도도를 활성화시키고, 전형적으로 과분극에 의해 및/또는 세포막 저항성의 전기적 단락에 의해 세포의 흥분성을 감소시킨다.
내인성 LGIC 리간드 (예를 들어, 효능제), 예컨대 ACh의 수준은 용이하게 제어되지 않는다.
본 명세서는 LGIC 활성을 조정하기 위한 (예를 들어, 외인성 리간드에 대한 LGIC의 감수성을 증가시키고/거나 내인성 리간드, 예컨대 ACh에 대한 감수성을 감소시키기 위한) 물질 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 LBD 및 IPD를 가지며, 적어도 1개의 변형된 아미노산 (예를 들어, 아미노산 치환)을 갖는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC를 제공한다. 또한, 변형된 LGIC에 결합하고 이를 조정할 수 있는 (예를 들어, 활성화시킬 수 있는) 외인성 LGIC 리간드가 제공된다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 리간드는 채널병증 (예를 들어, 신경 채널병증 또는 근육 채널병증)을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물의 세포의 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하기 (예를 들어, 활성화시키거나 또는 억제하기) 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하기 (예를 들어, 증가시키거나 또는 감소시키기) 위해 사용될 수 있다.
LGIC 활성을 제어할 수 있는 능력을 가짐으로써, 세포 내에서의 이온 수송을 제어할 수 있는 독특하고 실현되지 않은 기회가 제공된다. 예를 들어, 1개 이상의 외인성 LGIC 리간드에 대한 증가된 감수성을 갖는 변형된 LGIC는 외인성 LGIC 리간드의 전달에 기초한 이온 수송 및/또는 세포 흥분성의 시간적 및 공간적 제어를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 LGIC 리간드에 대한 감소된 감수성을 갖는 변형된 LGIC는 변형된 LGIC의 원치않는 활성화를 방지하고, 외인성 리간드가 변형된 LGIC에 걸쳐 선택적 제어를 할 수 있게 한다. 추가로, 변형된 LGIC에 대한 증가된 효력을 갖는 외인성 LGIC 리간드는 내인성 이온 채널에 걸친 변형된 LGIC의 표적화의 선택성을 개선시킨다. 따라서, 본원에 제공된 변형된 LCIG 및 외인성 LGIC 리간드는 의도하지 않은 표적에 대한 소분자로부터의 부작용을 감소시키면서 치료 효과를 달성하는데 유용하다.
본원에 기재된 바와 같이, 변형된 LGIC 내의 1개 이상의 돌연변이는 외인성 LGIC 리간드에 대한 효력을 증진시킬 수 있다. 잔기 L131에서 α7-GlyR의 α7 LBD의 돌연변이 (예를 들어, Leu를 Gly 또는 Ala로 치환시킴)는 α7-GlyR과 비교하여 ACh 효력을 감소시키면서 (-6.4배), 바레니클린 (16배) 및 트로피세트론 (3.6배)에 대한 효력은 증가시켰다. 잔기 G175에서 α7-GlyR의 α7 LBD의 돌연변이 (예를 들어, G175K) 또는 P216에서 α7-GlyR의 α7 LBD의 돌연변이 (예를 들어, P216I)는 ACh, 니코틴, 트로피세트론, 바레니클린, 뿐만 아니라 다른 퀴누클리딘 및 트로판 효능제에 대한 효력을 증진시켰다. 잔기 G175K에서의 돌연변이를, 내인성 효능제 ACh의 효력을 감소시키는 돌연변이 (예를 들어 Y115F)와 조합하면, 트로피세트론에 대한 증가된 효력 (5.5배)과 ACh로부터의 감소된 효력 (-8배)을 갖는 α7-GlyR Y115F G175K가 생산되었다. 추가로, 이들 키메라 채널에서 잔기 77 (예를 들어, Trp를 Phe 또는 Tyr로 치환시킴) 및/또는 79 (예를 들어, Gln을 Gly, Ala 또는 Ser로 치환시킴) 및/또는 131 (예를 들어, Leu를 Gly 또는 Ala로 치환시킴) 및/또는 141 (예를 들어, Leu를 Phe 또는 Pro로 치환시킴)에서의 α7 LBD 내의 돌연변이를, 잔기 G175 (예를 들어, G175K) 또는 P216 (예를 들어, P216I)에서의 효력 증진 돌연변이와 조합하면, 별개의 리간드에 대한 효력이 증가되고/거나 ACh 효력이 감소된다. 예를 들어, 잔기 79에서의 돌연변이 (예를 들어, Gln을 Gly로 치환시킴), 잔기 115에서의 돌연변이 (예를 들어, Tyr을 Phe로 치환시킴), 및 잔기 175에서의 돌연변이 (예를 들어, Gly를 Lys로 치환시킴)를 갖는 α7 nAChR LBD (α7 LBD)를 갖는 키메라 α7-GlyR LGIC는 비변형 키메라 α7-GlyR LGIC와 비교하여 외인성 트로판 LGIC 리간드 화합물 723 (트로판)에 대한 100배 초과의 증가된 감수성, 및 감소된 ACh 감수성 (-15배)을 갖는다. 추가로, 잔기 79에서의 돌연변이 (예를 들어, Gln을 Ala, Gly 또는 Ser로 치환시킴)를 갖는 α7 nAChR LBD (α7 LBD) 및 잔기 298에서의 돌연변이 (예를 들어, Ala를 Gly로 치환시킴)를 갖는 GlyR IPD를 갖는 적어도 1개의 키메라 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC는 외인성 LGIC 리간드, 예컨대 퀴누클리딘 또는 트로판에 대한 거의 20배 증가된 감수성을 갖는다. α7 LBD의 잔기 27에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Arg을 Asp로 치환시킴) 및 잔기 41에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Glu를 Arg으로 치환시킴)는 변형된 키메라 LGIC와 비변형 이온 채널의 회합을 감소시켰다. α7 LBD의 잔기 115에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Tyr을 Phe로 치환시킴), 잔기 139에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Gln을 Gly 또는 Leu로 치환시킴), 잔기 210에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Tyr을 Phe로 치환시킴), 잔기 217에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Tyr을 Phe로 치환시킴), 및/또는 잔기 219에서의 추가의 돌연변이 (예를 들어, Asp를 Ala로 치환시킴)는 내인성 리간드 ACh에 대한 키메라 LGIC의 감수성을 감소시켰다. 이들 키메라 LGIC는 포유동물 내에서 내인성 신호전달 시스템과의 교차 반응성을 최소화하면서 포유동물의 세포 내의 세포 기능에 걸쳐 고도로 선택적인 제어를 가능하게 한다.
일반적으로, 본 명세서의 한 측면은 아미노산 변형을 갖는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 갖는 변형된 LGIC를 특색으로 하며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC를 활성화시킨다. 변형된 LGIC는 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 갖는 키메라 LGIC일 수 있다. LBD는 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD일 수 있다. α7-nAChR LBD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산이 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 131, 139, 141, 175 및 216으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 청구항 3의 변형된 LGIC. 아미노산 치환은 α7 LBD의 잔기 79에서 이루어질 수 있고, 아미노산 치환은 Q79A, Q79G 또는 Q79S일 수 있다. 예를 들어, α7 LBD의 잔기 79에서의 아미노산 치환은 Q79G일 수 있다. IPD는 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, 감마-아미노부티르산 (GABA) 수용체 IPD, 또는 α7-nAChR IPD일 수 있다. IPD는 GlyR IPD일 수 있고, GlyR IPD는 키메라 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환 (예를 들어, A298G 치환)을 포함할 수 있다. IPD는 GABA IPD일 수 있고, GABA IPD는 변형된 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환 (예를 들어, W298A 치환)을 포함할 수 있다. 변형된 LGIC는 Q79G 아미노산 치환을 갖는 α7 LBD, 및 A298G 아미노산 치환을 갖는 GlyR IPD를 포함하는 키메라 LGIC일 수 있다. 외인성 LGIC 리간드는 퀴누클리딘, 트로판, 9-아자비시클로[3.3.1]노난, 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀, 및 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 외인성 LGIC 리간드일 수 있다. 합성 외인성 LGIC 리간드가 트로판인 경우, 트로판은 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 723, 화합물 725, 화합물 737, 또는 화합물 745일 수 있다. 합성 외인성 LGIC 리간드가 퀴누클리딘인 경우, 퀴누클리딘은 PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0456, 화합물 0434, 화합물 0436, 화합물 0354, 화합물 0353, 화합물 0295, 화합물 0296, 화합물 0536, 화합물 0676, 또는 화합물 702일 수 있다. 합성 외인성 LGIC 리간드가 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀인 경우, 리간드는 화합물 765 또는 화합물 770일 수 있다. 합성 외인성 LGIC 리간드가 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난인 경우, 리간드는 화합물 773 또는 화합물 774일 수 있다. 일부 경우에, LBD는 α7 LBD일 수 있고, α7 LBD는 또한 비변형 LGIC에 대한 결합에 비해 이러한 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 또 다른 α7 LBD에 대한 선택적 결합을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 비변형 LGIC는 내인성 LGIC (예를 들어, 내인성 α7-nAChR)일 수 있다. 비변형 LGIC에 대한 감소된 결합을 부여하는 α7 LBD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산은 잔기 27에서의 아미노산 치환 (예를 들어, R27D 치환) 및/또는 잔기 41에서의 아미노산 치환 (예를 들어, E41R 치환)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, IPD는 5HT3 IPD일 수 있고, 5HT3 IPD는 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 5HT3 IPD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산은 잔기 425의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 (예를 들어, R425Q 치환), 429의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 (예를 들어, R429D 치환), 및/또는 433의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 (예를 들어, R433A 치환)을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 갖는 변형된 LGIC를 특색으로 하며, 여기서 LBD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산은 내인성 LGIC 리간드와의 결합을 감소시킨다. 변형된 LGIC는 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 갖는 키메라 LGIC일 수 있다. 내인성 LGIC 리간드는 ACh일 수 있다. 변형된 LGIC는 Ach에 대한 20 μM 초과의 EC50을 가질 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산은 잔기 115, 139, 210, 217 및/또는 219에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산이 잔기 115에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 아미노산 치환은 Y115F 치환일 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산이 잔기 139에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 아미노산 치환은 Q139G 또는 Q139L 치환일 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산이 잔기 210에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 아미노산 치환은 Y210F 치환일 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산이 잔기 217에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 아미노산 치환은 Y217F 치환일 수 있다. 적어도 1개의 변형된 아미노산이 잔기 219에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 아미노산 치환은 D219A 치환일 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC는 L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD를 포함할 수 있다. 변형된 LGIC (예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD를 포함하는 변형된 LGIC)는 또한 내형질 세망 유출 서열을 포함할 수 있다. 내형질 세망 유출 서열은 아미노산 서열 FCYENEV (서열식별번호: 16)를 포함할 수 있다. 예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD를 포함하고, 또한 내형질 세망 유출 서열을 포함하는 변형된 LGIC는 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 LGIC (예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD를 포함하는 변형된 LGIC)는 또한 신호 서열 (예를 들어, CHRNB4 신호 서열)을 포함할 수 있다. CHRNB4 신호 서열은 아미노산 서열 MRRAPSLVLFFLVALCGRGNC (서열식별번호: 17)를 포함할 수 있다. 예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD 및 또한 CHRNB4 신호 서열을 포함하는 변형된 LGIC는 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 LGIC (예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD를 포함하는 변형된 LGIC)는 또한 체세포 표적화 서열 (예를 들어, KCNB1 체세포 표적화 서열)을 포함할 수 있다. KCNB1 체세포 표적화 서열은 아미노산 서열 QSQPILNTKEMAPQSKPPEELEMSSMPSPVAPLPARTEGVIDMRSMSSIDSFISCATDFPEATRF (서열식별번호: 18)를 포함할 수 있다. 예를 들어, L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 α7-nAChR LBD 및 또한 KCNB1 체세포 표적화 서열을 포함하는 변형된 LGIC는 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대한 증가된 효력을 갖는 리간드를 특색으로 하며, 여기서 리간드는 화학식 I을 포함한다:
Figure pct00001
여기서 각각의 X1, X2 및 X3은 독립적으로 CH, CH2, O, NH 또는 NMe일 수 있고; 각각의 n은 독립적으로 0 또는 1일 수 있고; Y = O 또는 S이고; A = 방향족 치환기이고; R = H 또는 피리디닐메틸렌이다. 방향족 치환기는 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산, 또는 4-클로로-벤젠일 수 있다.
일부 경우에, LGIC 리간드는 퀴누클리딘일 수 있고, 화학식 II에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00002
여기서 X3 = O, NH, 또는 CH2이고; Y = O 또는 S이고; A = 방향족 치환기이고; R = H 또는 피리디닐메틸렌이다. 방향족 치환기는 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산, 3-클로로-4-플루오로 벤젠, 또는 1H-인돌일 수 있다. 퀴누클리딘은 PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0456, 화합물 0434, 화합물 0436, 화합물 0354, 화합물 0353, 화합물 0295, 화합물 0296, 화합물 0536, 화합물 0676, 또는 화합물 702일 수 있다.
일부 경우에, LGIC 리간드는 트로판일 수 있고, 화학식 III에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00003
여기서 X2 = NH 또는 NMe이고; X3 = O, NH 또는 CH2이고; Y = O 또는 S이고; A = 방향족 치환기이다. 방향족 치환기는 1H-인돌, 7-메톡시-1H-인돌, 7-메틸-1H-인돌, 5-클로로-1H-인돌, 또는 1H-인다졸일 수 있다. 트로판은 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 723, 화합물 725, 화합물 737, 또는 화합물 745일 수 있다.
일부 경우에, LGIC 리간드는 9-아자비시클로[3.3.1]노난일 수 있고, 화학식 IV에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00004
여기서 X1은 CH일 수 있고, X2는 NH 또는 NMe일 수 있고, X3은 O, NH 또는 CH일 수 있고; Y는 O 또는 S일 수 있고, A는 방향족 치환기일 수 있다. 방향족 치환기는 4-클로로-벤젠일 수 있다. 9-아자비시클로[3.3.1]노난은 화합물 0536일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC에 대한 증가된 효력을 갖는 리간드를 특색으로 하며, 여기서 리간드는 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀일 수 있고, 화학식 V에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00005
여기서 R1은 H, 페닐 2-톨루일; 3-피리딜; 4-피리딜; 트리플루오로메틸; 메톡시; N,N-디메틸아미노; N,N-디에틸아미노; 이미다졸, 피롤, 피라졸, 트리아졸 또는 이속사졸-3-아민일 수 있고, R2는 H, 메틸 또는 페닐일 수 있다. 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀은 바레니클린, 화합물 0765, 화합물 0770, 화합물 0780, 화합물 0782, 화합물 0785, 화합물 0788, 화합물 0782, 화합물 0789, 화합물 0791, 화합물 0793, 화합물 0794, 화합물 0795, 화합물 0798, 화합물 0799, 화합물 0800, 화합물 0801, 화합물 0802, 화합물 0803, 화합물 0804, 화합물 0805, 화합물 0807, 화합물 0808, 화합물 0812, 화합물 0813, 화합물 815, 및 화합물 817일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC에 대한 증가된 효력을 갖는 리간드를 특색으로 하며, 여기서 리간드는 2-(피리딘-3-일)-1,5,6,7,8,9-헥사히드로-5,9-메타노이미다조[4',5':4,5]벤조[1,2-d]아제핀 (예를 들어, 화합물 0786)일 수 있다:
Figure pct00006
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC에 대한 증가된 효력을 갖는 리간드를 특색으로 하며, 여기서 리간드는 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온일 수 있고, 화학식 VI에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00007
여기서 R1은 H 또는 CH3일 수 있고, R2는 H, CH3 또는 방향족 치환기일 수 있고, R3은 O 또는 S일 수 있다. 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온은 화합물 0783, 화합물 0784, 화합물 0790, 또는 화합물 0792일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC에 대한 증가된 효력을 갖는 리간드를 특색으로 하며, 여기서 리간드는 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난일 수 있고, 화학식 VII에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00008
여기서 R은 H, F 또는 NO2일 수 있다. 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난은 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 0773, 또는 화합물 0774일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 포유동물에서 채널병증을 치료하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 포유동물 내의 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합한다. 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 가지며; 외인성 리간드가 포유동물에게 투여된다. 채널병증은 바터 증후군, 브루가다 증후군, 카테콜아민성 다형성 심실성 빈맥 (CPVT), 선천성 고인슐린증, 낭성 섬유증, 드라베 증후군, 간헐성 운동실조증, 지단홍통증, 전신 간질 (예를 들어, 열성 발작을 동반함), 가족성 편마비성 편두통, 섬유근육통, 고칼륨혈성 주기성 마비, 저칼륨혈성 주기성 마비, 램버트-이튼 근무력 증후군, 긴 QT 증후군 (예를 들어, 로마노-워드 증후군), 짧은 QT 증후군, 악성 고열, 점액지질증 유형 IV, 중증 근무력증, 선천성 근긴장증, 시신경척수염, 신경근긴장증, 비증후군성 난청, 선천성 이상근긴장증, 색소성 망막염, 티모시 증후군, 이명, 발작, 삼차 신경통, 또는 다발성 경화증일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 포유동물의 세포 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합한다. 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 가지며; 외인성 리간드가 포유동물에게 투여된다. 조정하는 것은 이온 수송을 활성화시키거나 또는 억제하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포, 또는 면역 세포일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 생체내 투여 또는 생체외 투여일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 포유동물로부터의 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합한다. 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 가지며; 외인성 리간드가 포유동물에게 투여된다. 조정하는 것은 세포의 흥분성을 증가시키거나 또는 세포의 흥분성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 세포는 흥분성 세포일 수 있다. 세포는 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포, 또는 면역 세포일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 생체내 투여 또는 생체외 투여일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 포유동물 내의 세포의 활성을 조정하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것을 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어지며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합한다. 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 LBD, 및 IPD를 포함하는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 가지며; 외인성 리간드가 포유동물에게 투여된다. 조정하는 것은 세포의 활성을 증가시키거나 또는 세포의 활성을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 활성은 이온 수송, 수동 수송, 흥분, 억제, 또는 세포외유출일 수 있다. 세포는 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포, 또는 면역 세포일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 생체내 투여 또는 생체외 투여일 수 있다. 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것은 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산을 투여하는 것 (예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 렌티바이러스를 통함)을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 리간드를 확인하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 본원에 기재된 변형된 LGIC에 대한 1종 이상의 후보 리간드를 제공하는 단계, 및 후보 리간드와 변형된 LGIC 사이의 결합을 검출하여, 그에 의해 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 리간드를 확인하는 단계를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 변형된 LGIC는 동형체성(homomeric) 변형된 LGIC일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 변형된 LGIC를 검출하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 본원에 기재된 1개 이상의 변형된 LGIC 서브유닛을 제공하는 단계, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제를 제공하는 단계, 및 변형된 LGIC와, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제 사이의 결합을 검출하여, 그에 의해 변형된 LGIC를 검출하는 단계를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제는 항체, 단백질 (예를 들어, 분가로톡신), 또는 소분자 (예를 들어, 양전자 방출 단층촬영 (PET) 리간드)를 포함할 수 있다. 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 표지, 또는 양전자 방출 표지)를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물을 특색으로 한다. 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 아미노산 변형을 갖는 LBD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 LBD는 α7-nAChR LBD의 아미노산 치환 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219를 갖는 α7-nAChR LBD일 수 있다. 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 IPD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. IPD는 5HT3 IPD, GlyR IPD, GABA 수용체 IPD, 또는 α7-nAChR IPD일 수 있다. IPD는 5HT3 IPD일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물을 특색으로 한다.
서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 아미노산 변형을 갖는 LBD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 LBD는 α7-nAChR LBD의 아미노산 치환 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219를 갖는 α7-nAChR LBD일 수 있다. 서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 IPD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. IPD는 5HT3 IPD, GlyR IPD, GABA 수용체 IPD, 또는 α7-nAChR IPD일 수 있다. IPD는 아미노산 변형을 갖는 GlyR IPD일 수 있다. 변형된 GlyR IPD는 GlyR IPD의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 문헌은 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물을 특색으로 한다. 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 아미노산 변형을 갖는 LBD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 변형된 LBD는 α7-nAChR LBD의 아미노산 치환 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219를 갖는 α7-nAChR LBD일 수 있다. 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열은 IPD를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. IPD는 5HT3 IPD, GlyR IPD, GABA 수용체 IPD, 또는 α7-nAChR IPD일 수 있다. IPD는 아미노산 변형을 갖는 GABA IPD일 수 있다. 변형된 GABA IPD는 GABA IPD의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 서열식별번호: 33에 제시된 서열을 갖는 합성 핵산 구축물을 특색으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 서열식별번호: 34에 제시된 서열을 갖는 합성 핵산 구축물을 특색으로 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 방법 및 물질은 본원에 기재되어 있으며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예시는 단지 설명을 위한 것이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부 도면 및 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 분명할 것이다.
도 1은 키메라 LGIC의 예시적인 아미노산 서열을 보여준다. 아미노산 잔기 77의 돌연변이 (예를 들어, W77F 또는 W77Y)는 그라니세트론 및 트로피세트론에 대한 감수성을 유발하였다. 아미노산 잔기 79의 돌연변이 (예를 들어, Q79G)는 여러 효능제에 대해 가장 효과적이었다. 아미노산 잔기 131의 돌연변이 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N)는 바레니클린, 트로피세트론, 그라니세트론, 및 ACh에 대한 감수성을 변경시켰다. LBD 돌연변이를 GlyR 또는 GABAC IPD 내의 아미노산 잔기 298에서의 돌연변이와 조합한 경우에 효력이 유의하게 증진되었다. α7 nAChR LBD 돌연변이를 아미노산 잔기 G175 및 P216에서의 돌연변이와 조합한 경우에 효력이 또한 증진되었다. a) 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 1) 및 뮤린 5HT3 IPD (서열식별번호: 3) 성분을 포함하는 α7-5HT3 키메라 수용체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 6). b) 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2) 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5) 성분을 포함하는 α7-GlyR 키메라 수용체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 7). c) 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 1) 및 인간 5HT3 IPD (서열식별번호: 4) 성분을 포함하는 α7-5HT3 키메라 수용체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 8). d) 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 11) 및 인간 GABAC IPD (서열식별번호: 9) 성분을 포함하는 α7-GABAC 키메라 수용체의 아미노산 서열 (서열식별번호: 10). e) 래트 nAChR 서열의 아미노산 서열 (서열식별번호: 12).
도 2는 α7-5HT3 키메라 LGIC 및 도 1에 언급된 위치에서의 LBD 돌연변이를 갖는 키메라 LGIC의 변이체에 대한 트로피세트론에 대한 EC50을 보여준다. Gln79에서의 다수의 돌연변이는 비변형 α7-5HT3 채널 (화살표)에 비해 유사한 또는 개선된 효력을 나타내었다.
도 3은 α7-5HT3 키메라 LGIC에 대한 공지된 nAChR 효능제의 상대 효력을 보여준다. a) 비변형 α7-5HT3 키메라 채널에 대해 정규화된 EC50의 그래프 (로그 스케일). *P<0.05, 통계적으로 유의한 효력 변화가 주목된다 (ANOVA에 이은 던 검정). b) 공지된 nAChR 효능제의 화학 구조.
도 4는 α7-GlyR 키메라 LGIC에 대한 공지된 nAChR 효능제의 상대 효력을 보여준다. a) 비변형 α7-GlyR 키메라 채널에 대해 정규화된 Q79 LBD 돌연변이체에 대한 EC50의 그래프 (로그 스케일). b) 비변형 α7-GlyR 키메라 채널에 대해 정규화된 A298G IPD 돌연변이에 대한 EC50의 그래프 (로그 스케일). c) 비변형 α7-GlyR 키메라 채널에 대해 정규화되고 이중 돌연변이체 채널 α7Q79G-GlyRA298G와 비교된 α7-GlyRA298G에 대한 EC50의 그래프 (로그 스케일). *P<0.05, 통계적으로 유의한 효력 변화가 주목된다 (ANOVA에 이은 던 검정).
도 5는 α7Q79G-5HT3 및 α7Q79G-GlyRA298G에 대한 효력 증진과 가장 부합되는 치환 패턴을 갖는 LGIC 효능제의 개략적인 구조를 보여준다. a) 증진된 효력과 연관된 속성을 나타내는 일반화된 구조. b) (a)에 나타낸 특이적 약물작용발생단은 퀴누클리딘, 트로판, 및 9-아자비시클로[3.3.1]노난 코어 구조이다. c) α7Q79G-GlyRA298G, α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR, α7W77F,Q79G,G175K-GlyR에 대한 높은 효력을 나타내는 예시적인 합성 분자.
도 6은 키메라 LCIG α7 nAChR LBD와 비변형 LBD의 회합을 감소시키는 돌연변이를 보여준다. a) α7-5HT3을 코딩하는 2개의 에피토프 태그부착된 (HA 및 V5) 구축물 (상부) 또는 α7-5HT3-HA 및 α7R21D,E41R-5HT3-V5를 코딩하는 2개의 구축물을 형질감염시키는 전하 역전 개략적 전위 구성 (여기서 2개의 상이한 에피토프 태그부착된 서브유닛 사이의 회합은 서브유닛 계면에서의 전하 역전 돌연변이 때문에 선호되지 않을 것임). b) V5 에피토프 태그를 갖는 α7R21D,E41R-5HT3을 발현하는 HEK 세포에서의 전체 세포 기록은 PNU-282987에 대한 강력한 반응을 나타낸다. c) HEK 세포에서 HA 및 V5 에피토프 태그와 α7-5HT3 LGIC의 회합은 HA 면역침전 (좌측) 또는 총 용해물 단리에 이은, 항-HA (상부) 또는 항-V5 항체 (하부) 중 하나를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 프로빙되었다. HA 및 V5 에피토프를 갖는 채널을 공동-발현하는 세포에서는, 항-HA IP에 이은 항-V5 면역블롯팅이 각각의 유형의 비변형 채널의 공동-면역침전을 나타내지만, LBD α7R21D,E41R-5HT3-V5에서의 전하 역전 돌연변이는 면역침전되지 않았다. α7-5HT3의 MW는 ~48 kD이다 (화살표).
도 7은 키메라 LGIC가 외인성 리간드를 사용하여 제어될 수 있다는 것을 보여준다. 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 통해 α7Q79G-GlyRA298G 키메라 LGIC로 형질도입된 마우스 뇌로부터의 피질 뉴런은 40 pA 전류 주입 (PRE)에 반응하여 활동 전위를 점화시키며, 이는 30 nM 트로피세트론에 의해 강력하게 억제된다. 트로피세트론의 휴약 (WASH) 후, 뉴런 점화가 복원된다.
도 8은 G175K 돌연변이를 갖는 키메라 LGIC에 대한 효능제의 활성을 보여준다. a) 비변형 α7-GlyR 키메라 채널에 대해 정규화된 공지된 효능제에 대한 Q79G G175K LBD 돌연변이체에 대한 EC50의 그래프 (로그 스케일). b) α7-GlyR 키메라 LGIC에서의 돌연변이를 갖는 채널에 대한 ACh 및 트로피세트론에 대한 EC50의 그래프. 트로피세트론에 대한 높은 효력 및 내인성 리간드인 아세틸콜린 (ACh)에 대한 낮은 효력을 갖는 채널을 유발하는 돌연변이가 최적이다 (회색 음영). Unmod.: 비변형 α7-GlyR 키메라 LGIC. c) α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR 키메라 LGIC로 형질도입된 마우스 뇌로부터의 피질 뉴런의 활동 전위. 뉴런은 전류 주입 (PRE)에 반응하여 점화되고, 100 nM 트로피세트론에 의해 강력하게 억제된다. 트로피세트론의 휴약 (WASH) 후, 뉴런 점화가 복원된다.
도 9는 L131G 돌연변이를 갖는 키메라 LGIC에 대한 효능제의 활성을 보여준다. a) 비변형 α7-GlyR 키메라 채널에 대해 정규화된 공지된 효능제에 대한 L131 LBD 돌연변이체에 대한 EC50의 그래프 (로그 스케일). b) α7L131G-GlyR 키메라 LGIC에서의 돌연변이를 갖는 채널에 대한 ACh 및 트로피세트론에 대한 EC50의 그래프. c) 바레니클린에 대한 높은 효력 및 내인성 리간드인 아세틸콜린 (ACh)에 대한 낮은 효력을 갖는 채널을 유발하는 돌연변이를 나타내는 그래프가 최적이다 (회색 음영). Unmod.: 비변형 α7-GlyR 키메라 LGIC. d) 피크로톡신 (PTX)에 의한 짧은 채널 길항작용 후에, Ach 및 바레니클린에 의한 α7L131G-GlyR에서의 돌연변이를 갖는 채널의 활성화를 나타내는 그래프. 실선은 분자 투여의 지속기간을 나타낸다. e) α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 키메라 LGIC로 형질도입된 마우스 뇌로부터의 피질 뉴런의 활동 전위. 뉴런은 전류 주입 (PRE)에 반응하여 점화되고, 심지어 >6배 더 크게 주입된 전류를 사용한 경우에도 10 nM 바레니클린에 의해 강력하게 억제된다. 바레니클린의 휴약 (WASH) 후, 뉴런 점화가 복원된다.
도 10은 바레니클린이 마우스에서 키메라 수용체를 활성화시켜 행동 효과를 유도할 수 있다는 것을 나타내는 그래프를 담고있다. 이러한 경우에, 망상 흑색질에서 일측성으로 VGAT-발현 뉴런 내의 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR을 발현시키고 이어서 바레니클린을 투여하는 것은 반대측 회전을 유도하며, 이는 바레니클린-유도된 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 발현 뉴런의 침묵과 일치한다.
도 11은 예시적인 LGIC 효능제의 화학 구조를 보여준다. a) α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR에 대한 효력 증진과 가장 부합되는 치환 패턴을 갖는 LGIC 효능제의 화학 구조. b) α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR, α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3, 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대한 효력 증진과 가장 부합되는 치환 패턴을 갖는 LGIC 효능제의 화학 구조. c) α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대한 효력 증진과 가장 부합되는 치환 패턴을 갖는 LGIC 효능제의 화학 구조.
도 12는 피질 뉴런 활성의 화학유전학적 교란을 보여준다. a-b) 활동 전위 점화는 감소된 입력 저항성 (a) 및 상승된 기전류 (b)로 인해 강하게 PSAM4-GlyR을 발현하는 뉴런에서 바레니클린에 의해 강하게 억제되었다. c) 피질 층 2/3 뉴런 막 특성은 PSAM4-GlyR 발현 뉴런 및 혼합된 비형질감염 대조군 뉴런에서 유사하였다. d-e) 바레니클린은 PSAM4-5HT3 HC를 발현하는 뉴런을 탈분극시키고 (d) 점화를 도출하였다 (e). f) 피질 층 2/3 뉴런 막 특성은 PSAM4-5HT3 HC 발현 뉴런 및 혼합된 비형질감염 대조군 뉴런에서 유사하였다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 만 휘트니 U-검정, n.s. P>0.05, ***P<0.001.
도 13은 마우스에서의 PSAM4-GlyR 뉴런 침묵을 보여준다. a) SNr에 대해 일측성으로 표적화된 PSAM4-GlyR-IRES-EGFP. 삽도: 일측성 SNr 형질도입을 침묵시키는 것은 향반 회전을 유발한다는 것을 보여주는 개략도. 별표: 비특이적 면역형광. b) 낮은 용량의 복강내 바레니클린은 PSAM4-GlyR을 발현하는 마우스에 대해 향반 회전을 도출하였지만 모의 작업된 또는 EGFP-단독 발현 마우스에서는 그렇지 않았다. c) 5시간 떨어진 바레니클린의 2회 용량은 유사한 비율의 총 회전을 제공하였으며, 이는 화학유전학적 반응의 속성내성이 없음을 나타낸다. d) 화학유전학적 침묵의 지속기간을 각각의 마우스에서 최대 회전에 대해 정규화된 회전 반응의 시간경과에 의해 모니터링하였다. 분홍색 (좁은) 화살표: 암페타민 주사, 청록색 (넓은) 화살표: 바레니클린 주사. 만 휘트니 U-검정, n.s. P>0.05, **P<0.01.
도 14는 초강력한 화학유전학적 효능제 (uPSEM)를 보여준다. a) PSAM4 채널 및 내인성 바레니클린 표적에서의 uPSEM 효능제 EC50, 뿐만 아니라 1 μM ACh에서의 α4β2 nAChR에 대한 IC50의 비교. LED: SNr 회전 검정에서 마우스에 대한 최저 유효 용량. 단위: nM; 괄호: SEM. 볼드체: PSAM4-GlyR에 대한 선택성. b,c) PSAM4-GlyR, α4β2 nAChR, 5HT3-R에 대한 용량 반응 곡선. uPSEM792 (b)는 α4β2 nAChR의 10% 부분 효능제이고, uPSEM817 (c)은 α4β2 nAChR을 억제한다. d) α7 nAChR을 발현하는 HEK 세포에서 uPSEM (2 μM) 및 Ach (10 μM)에 대한 전류 반응. uPSEM은 α7 nAChR을 활성화시키지 않는 반면, ACh는 활성화시킨다. (e) ACh에 대해 정규화된 반응 진폭. f-j) uPSEM792, uPSEM793, uPSEM815, 및 uPSEM817은 활동 전위 (기전류)를 점화시키는데 필요한 전류를 감소시킴으로써 PSAM4-GlyR을 발현하는 피질 뉴런에서의 점화를 강하게 억제한다 (g-j).
도 15는 SNr에서 일측성으로 PSAM4-GlyR을 발현하는 마우스에 대한 생체내 uPSEM 용량 반응을 보여준다. uPSEM792 (a,b), uPSEM793 (c,d), uPSEM815 (e,f), uPSEM817 (g,h)에 대한 행동 반응 및 시간경과. 각각의 마우스에서 최대 회전에 대해 정규화된 회전 반응의 시간경과. 분홍색 (좁은) 화살표: 암페타민 주사, 청색 (넓은) 화살표: uPSEM 주사.
도 16은 PSAM4-GlyR-KirM3M4에 대한 예시적인 아미노산 서열 (서열식별번호: 13)을 보여준다. PSAM4 돌연변이가 강조되어 있다. Kir2.1 (KCNJ2) 내형질 세망 (ER) 유출 서열에 대한 서열은 밑줄표시되고 청색이다.
도 17은 PSAM4-GlyR-B4sig에 대한 예시적인 아미노산 서열 (서열식별번호: 14)을 보여준다. PSAM4 돌연변이가 강조되어 있다. β4 nAChR 서브유닛 (CHRNB4) 신호 서열에 대한 서열은 밑줄표시되고 청색이다.
도 18은 PSAM4-GlyR-Kv2M3M4-soma에 대한 예시적인 아미노산 서열 (서열식별번호: 15)을 보여준다. PSAM4 돌연변이가 강조되어 있다. Kv2.1 (KCNB1) 체세포 표적화 서열에 대한 서열은 밑줄표시되고 청색이다.
도 19는 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 예시적인 구축물을 보여준다. (a) 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 33)을 포함하는 AAV-Syn::PSAM4-GlyR-IRES-EGFP-WPRE 구축물의 플라스미드 지도. (b) 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV-Syn::PSAM4-GlyR-IRES-EGFP-WPRE 구축물의 핵산 서열.
도 20은 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 예시적인 구축물을 보여준다. (a) 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열 (서열식별번호: 34)을 포함하는 AAV-CamkII::PSAM4-GlyR-IRES-EGFP-WPRE 구축물의 플라스미드 지도. (b) 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV-CamkII::PSAM4-GlyR-IRES-EGFP-WPRE 구축물의 핵산 서열.
본 명세서는 변형된 LGIC 및 그를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 LBD 및 IPD를 가지며 적어도 1개의 변형된 아미노산 (예를 들어, 아미노산 치환)을 갖는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC를 제공한다. 일부 경우에, 변형된 LGIC는 키메라 LGIC일 수 있다. 예를 들어, 키메라 LGIC는 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 약리학적 선택성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 외인성 LGIC 리간드의 선택적 결합을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 비변형 LGIC 서브유닛 (예를 들어, 변형이 결여된 LGIC 서브유닛 및/또는 내인성 LGIC 서브유닛)의 감소된 (예를 들어, 최소화 또는 제거된) 결합을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 내인성 LGIC 리간드의 감소된 (예를 들어, 최소화 또는 제거된) 결합을 부여할 수 있다.
본원에 제공된 변형된 LGIC는, 예를 들어 채널병증 (예를 들어, 신경 채널병증 또는 근육 채널병증)을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC, 및 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 외인성 LGIC 리간드는 채널병증을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물의 세포의 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하기 (예를 들어, 활성화시키거나 또는 억제하기) 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 및 외인성 LGIC 리간드는 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하기 (예를 들어, 증가시키거나 또는 감소시키기) 위해 사용될 수 있다.
변형된 LGIC
본원에 사용된 "변형된" LGIC는 적어도 1개의 LGIC 서브유닛을 포함하는 LGIC이다. 변형된 LGIC는 또한 약리학상 선택적인 작동기 모듈 (PSAM)로 지칭될 수 있다. 변형된 LGIC 서브유닛은 LBD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산 (예를 들어, 아미노산 치환) 및/또는 IPD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산 (예를 들어, 아미노산 치환)을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 종 (예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 돼지 또는 원숭이)으로부터의 LGIC의 변형일 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC는 제1 LGIC로부터의 LBD와 제2 LGIC로부터의 IPD의 비-자연 발생 조합을 갖는 적어도 1개의 키메라 LGIC 서브유닛을 포함할 수 있다.
변형된 LGIC (예를 들어, 1개 이상의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하는 LGIC)는 동형체성 (예를 들어, 임의의 수의 동일한 변형된 LGIC 서브유닛을 가짐) 또는 이형체성 (예를 들어, 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛 및 임의의 수의 상이한 LGIC 서브유닛을 가짐)일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 동형체성 변형된 LGIC일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC는 임의의 적합한 수의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC는 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 오량체일 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 LGIC의 변형일 수 있다. LGIC는 리간드의 결합에 반응하여 세포 막을 통해 음이온, 양이온 또는 둘 다를 전도할 수 있다. 예를 들어, LGIC는 리간드의 결합에 반응하여 세포 막을 통해 나트륨 (Na+), 칼륨 (K+), 칼슘 (Ca2+), 및/또는 클로라이드 (Cl-) 이온을 수송할 수 있다. LGIC의 예는 Cys-루프 수용체 (예를 들어, AChR, 예컨대 nAChR (예를 들어, 근육-유형 nAChR 또는 뉴런-유형 nAChR), 감마-아미노부티르산 (GABA; 예컨대 GABAA 및 GABAA-ρ (또한 GABAC로 지칭됨) 수용체, GlyR, GluCl 수용체, 및 5HT3 수용체), 이온성 글루타메이트 수용체 (iGluR; 예컨대 AMPA 수용체, 카이네이트 수용체, NMDA 수용체, 및 델타 수용체), ATP-게이팅 채널 (예를 들어, P2X), 및 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2)-게이팅 채널을 비제한적으로 포함한다. 본원에 기재된 변형된 LGIC가 키메라 LGIC인 경우, 이러한 키메라 LGIC는 임의의 적절한 LGIC로부터 선택된 LBD 및 임의의 적절한 LGIC로부터 선택된 IPD를 포함할 수 있다. LGIC가 다수의 상이한 서브유닛을 포함하는 경우 (예를 들어, 뉴런-유형 nAChR은 α4, β2, 및 α7 서브유닛을 포함함), LBD 및/또는 IPD는 임의의 서브유닛으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, nAChR로부터의 LBD는 α7 LBD일 수 있다. 대표적인 래트 α7 nAChR 아미노산 서열 (LBD와 IPD 둘 다 포함)은 하기와 같다:
서열식별번호: 12
Figure pct00009
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 α7 nAChR로부터의 LBD를 포함할 수 있다. α7 nAChR LBD의 예는 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 α7 nAChR LBD, 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 α7 nAChR LBD, 및 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 α7 nAChR LBD를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, α7 nAChR LBD는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 11에 제시된 인간 α7 nAChR LBD의 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그일 수 있다. 일부 경우에, α7 nAChR LBD는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 11에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 1
Figure pct00010
서열식별번호: 2
Figure pct00011
서열식별번호: 11
Figure pct00012
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 5HT3 수용체로부터의 IPD를 포함할 수 있다. 5HT3 IPD의 예는 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 뮤린 5HT3 IPD, 및 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 5HT3 IPD를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 5HT3 IPD는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4에 제시된 5HT3 IPD의 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그일 수 있다. 일부 경우에, 5HT3 IPD는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 3
Figure pct00013
서열식별번호: 4
Figure pct00014
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 GlyR로부터의 IPD를 포함할 수 있다. GlyR IPD의 예는 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 뮤린 GlyR IPD를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, GlyR IPD는 서열식별번호: 5에 제시된 인간 GlyR IPD의 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그일 수 있다. 일부 경우에, GlyR IPD는 서열식별번호: 5에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 5
Figure pct00015
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 GABA 수용체 (예를 들어, GABAA-ρ, 또한 GABAC로 지칭됨)로부터의 IPD를 포함할 수 있다. GABAA-ρ IPD의 예는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 GABAA-ρ IPD를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, GABAA-ρ IPD는 서열식별번호: 9에 제시된 인간 GABAA-ρ IPD의 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그일 수 있다. 일부 경우에, GABAA-ρ IPD는 서열식별번호: 9에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 9
Figure pct00016
퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 있어서, 2개의 서열을 정렬하고, 2개의 서열 사이의 아미노산 잔기의 동일한 매치의 수를 결정한다. 동일한 매치의 수를 정렬된 영역의 길이 (즉, 정렬된 아미노산 잔기의 수)로 나누고, 이에 100을 곱하여 퍼센트 서열 동일성 값에 도달한다. 정렬된 영역의 길이는 가장 짧은 서열의 전장 크기까지의 하나의 서열 또는 두 서열의 일부분일 수 있는 것으로 인지될 것이다. 단일 서열이 1개 초과의 다른 서열과 정렬될 수 있고, 이에 따라, 각각의 정렬된 영역에 걸쳐 상이한 퍼센트 서열 동일성 값을 가질 수 있는 것으로 또한 인지될 것이다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 2개 이상의 서열을 정렬하는 것은 컴퓨터 프로그램 클러스탈(Clustal)W 및 디폴트 파라미터를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 질의 서열과 1개 이상의 대상 서열 사이의 가장 우수한 매치를 계산하고, 동일성, 유사성 및 상이성이 결정될 수 있도록 이들을 정렬한다. 예를 들어, 문헌 [Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500]을 참조한다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛이 키메라 LGIC 서브유닛인 경우, 키메라 LGIC 서브유닛은 동일한 종으로부터의 LBD 및 IPD 또는 상이한 종으로부터의 LBD 및 IPD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메라 LGIC 서브유닛은 인간 LGIC 단백질로부터의 LBD 및 인간 LGIC 단백질로부터의 IPD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 LGIC 서브유닛은 인간 α7 LBD 및 인간 GlyR IPD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메라 LGIC 서브유닛은 인간 LGIC 단백질로부터의 LBD 및 뮤린 LGIC 단백질로부터의 IPD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 LGIC 서브유닛은 인간 α7 LBD 및 뮤린 5HT3 IPD를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛이 키메라 LGIC 서브유닛인 경우, 키메라 LGIC 서브유닛은, LBD가 상이한 IPD와 융합되어 키메라 채널 서브유닛을 형성할 때 LBD 내의 아미노산의 수가 다양할 수 있도록 LBD와 IPD를 연결하는 다양한 융합 점을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5HTS IPD와 키메라 LGIC 서브유닛을 형성하기 위해 사용된 α7 nAChR LBD의 길이는, GlyR IPD와 키메라 LGIC 서브유닛을 형성하기 위해 사용된 α7 nAChR LBD의 길이와 상이하다 (예를 들어, 도 1a 및 1c를 도 1b와 비교함).
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 LBD 및/또는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 IPD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 α7 LBD, 및 아미노산 잔기 27, 41, 77, 79, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217, 및/또는 219에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 5에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 GlyR IPD, 및 α7-GlyR 키메라 수용체 (예를 들어, 서열식별번호: 7)의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 9에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 GABAC IPD, 및 α7-GABAC 키메라 수용체 (예를 들어, 서열식별번호: 10)의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 1개 초과의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의) 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 변형은 아미노산 치환일 수 있다. 일부 경우에, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 약리학적 선택성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 외인성 LGIC 리간드의 선택적 결합을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 비변형 LGIC 서브유닛 (변형이 결여된 LGIC 서브유닛 및/또는 내인성 LGIC 서브유닛)의 감소된 (최소화 또는 제거된) 결합을 부여할 수 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산은 변형된 LGIC에 내인성 LGIC 리간드의 감소된 (최소화 또는 제거된) 결합을 부여할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 외인성 LGIC 리간드와의 선택적 결합 (예를 들어, 증진된 결합 또는 증가된 효력)을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 외인성 LGIC 리간드와의 결합은 내인성 LGIC 리간드와의 결합에 비해 선택적일 수 있다. 외인성 LGIC 리간드와의 선택적 결합을 갖는 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 LDB (예를 들어, α7 LBD)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 α7 LBD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 아미노산 잔기 77, 79, 131, 139, 141, 175, 및/또는 216에서의 치환일 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 77에서의 트립토판은 소수성 아미노산 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (예를 들어, W77F), 티로신 (예를 들어, W77Y), 또는 메티오닌 (예를 들어, W77M)으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시되고 W77F 치환을 갖는 α7 LBD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 79에서의 글루타민은 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 (예를 들어, Q79A), 글리신 (예를 들어, Q79G), 또는 세린 (예를 들어, Q79S)으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 Q79G 치환을 갖는 α7 LBD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 131에서의 류신은 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 (예를 들어, L131A), 글리신 (예를 들어, L131G), 메티오닌 (예를 들어, L131M), 아스파라긴 (예를 들어, L131N), 글루타민 (예를 들어, L131Q), 발린 (예를 들어, L131V), 또는 페닐알라닌 (예를 들어, L131F)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 175에서의 글리신은 아미노산 잔기, 예컨대 리신 (예를 들어, G175K), 알라닌 (예를 들어, G175A), 페닐알라닌 (예를 들어, G175F), 히스티딘 (예를 들어, G175H), 메티오닌 (예를 들어, G175m), 아르기닌 (예를 들어, G175R), 세린 (예를 들어, G175S), 발린 (예를 들어, G175V)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 216에서의 프롤린은 아미노산 잔기, 예컨대 이소류신 (예를 들어, P216I)으로 치환될 수 있다. 외인성 LGIC 리간드와의 선택적 결합을 갖는 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 IPD (예를 들어, GlyR IPD 또는 GABAA-ρ IPD)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 5에 제시된 GlyR IPD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 α7-GlyR 키메라 수용체 (예를 들어, 서열식별번호: 7)의 아미노산 잔기 298에서의 치환일 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 7의 아미노산 잔기 298에서의 알라닌은 아미노산 잔기, 예컨대 글리신 (예를 들어, A298G)으로 치환될 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 9에 제시된 GABAA-ρ IPD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 α7-GABAA-ρ 키메라 수용체 (예를 들어, 서열식별번호: 10)의 아미노산 잔기 298에서의 치환일 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 10의 아미노산 잔기 298에서의 트립토판은 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 (예를 들어, W298A)으로 치환될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 1개 초과의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의) 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 7에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있고, Q79G 치환 및 A298G 치환을 포함할 수 있다. 변형된 LGIC에 외인성 LGIC 리간드의 선택적 결합을 부여할 수 있는 변형의 추가의 예는 다른 곳에 기재된 변형을 포함한다 (예를 들어, US 8,435,762 참조).
내인성 (예를 들어, 정규) LGIC 리간드에 비해 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 (예를 들어, 증진된 결합 또는 증가된 효력) 변형된 LGIC 서브유닛은 또한, 외인성 리간드에 대한 증진된 효력을 갖는 것으로서 기재될 수 있다. 일부 경우에, 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 외인성 리간드에 대한 적어도 4배 (예를 들어, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 또는 적어도 20배) 증진된 효력을 가질 수 있다. 일부 경우에, 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 외인성 리간드에 대한 약 4배 내지 약 200배 (예를 들어, 약 4배 내지 약 200배, 약 5배 내지 약 180배, 약 6배 내지 약 175배, 약 7배 내지 약 150배, 약 8배 내지 약 125배, 약 9배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 90배, 약 11배 내지 약 75배, 약 12배 내지 약 65배, 약 13배 내지 약 50배, 약 14배 내지 약 40배, 또는 약 15배 내지 약 30배) 증진된 효력을 가질 수 있다. 예를 들어, 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 외인성 리간드에 대한 약 10배 내지 약 100배 증진된 효력을 가질 수 있다. 예를 들어, 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 외인성 리간드에 대한 약 10배 내지 약 20배 증진된 효력을 가질 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 비변형 LGIC 서브유닛과의 감소된 (예를 들어, 최소화 또는 제거된) 결합을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 동일한 변형을 갖는 변형된 LGIC 서브유닛과의 결합은 비변형 LGIC 서브유닛과의 결합에 비해 선택적일 수 있다. 비변형 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 비변형 LGIC 서브유닛과의 감소된 결합을 부여하는 변형이 결여된 LGIC 서브유닛일 수 있거나 또는 비변형 LGIC는 내인성 LGIC 서브유닛일 수 있다. 변형된 LGIC에 비변형 LGIC 서브유닛과의 감소된 결합을 부여하는 변형은 전하 역전 변형일 수 있다. 비변형 LGIC 서브유닛과의 감소된 결합을 갖는 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 LBD (예를 들어, α7 LBD)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 α7 LBD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 아미노산 잔기 27 및/또는 41에서의 치환일 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 27에서의 아르기닌은 아스파르트산 (예를 들어, R27D)으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 41에서의 글루탐산은 아르기닌 (예를 들어, E41R)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 R27D 치환 및 E41R을 갖는 α7 LBD를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 내인성 LGIC 리간드의 감소된 (예를 들어, 최소화 또는 제거된) 결합을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 내인성 LGIC 리간드는 ACh일 수 있다. 내인성 LGIC 리간드의 감소된 결합을 갖는 변형된 LGIC 서브유닛은 임의의 적절한 IPD (예를 들어, GlyR LBD)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 α7 LBD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 아미노산 잔기 115, 131, 139, 210, 217 및/또는 219에서의 치환일 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 115에서의 티로신은 페닐알라닌 (예를 들어, Y115F)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 131에서의 류신은 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌 (예를 들어, L131A), 글리신 (예를 들어, L131G), 메티오닌 (예를 들어, L131M), 아스파라긴 (예를 들어, L131N), 글루타민 (예를 들어, L131Q), 발린 (예를 들어, L131V), 또는 페닐알라닌 (예를 들어, L131F)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 139에서의 글루타민은 글리신 (예를 들어, Q139G) 또는 류신 (예를 들어, Q139L)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 210에서의 티로신은 페닐알라닌 (예를 들어, Y210F)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 217에서의 티로신은 페닐알라닌 (예를 들어, Y217F)으로 치환될 수 있다. 일부 경우에, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 219에서의 아스파르테이트는 알라닌 (예를 들어, D219A)으로 치환될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 3에 제시된 5HT3 IPD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 아미노산 잔기 425, 429, 및/또는 433에서의 치환일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 R425Q 치환, R429D 치환, 및 R433A 치환을 갖는 5HT3 IPD를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 LGIC 서브유닛은 서열식별번호: 4에 제시된 5HT3 IPD를 포함할 수 있고, 아미노산 변형은 아미노산 잔기 420, 424, 및/또는 428에서의 치환일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 R420Q 치환, R424D 치환, 및 R428A 치환을 갖는 5HT3 IPD를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 Q79G 아미노산 치환 및 Y115F 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 1), 및 뮤린 5HT3 IPD (서열식별번호: 3)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-5HT3 LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 6)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 Q79G 아미노산 치환 및 Q139G 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 1), 및 뮤린 5HT3 IPD (서열식별번호: 3)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-5HT3 LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 6)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 Q79G 아미노산 치환 및 Y115F 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 A298G 아미노산 치환을 갖는 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 Q79G 아미노산 치환 및 Q139G 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 A298G 아미노산 치환을 갖는 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 R27D 아미노산 치환, E41R 아미노산 치환, Q79G 아미노산 치환, 및 Y115F 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 A298G 아미노산 치환을 갖는 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 Y115에서의 치환 (예를 들어, Y115F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 139에서의 치환 (예를 들어, Q139L)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 217에서의 치환 (예를 들어, Y217F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N), 139에서의 치환 (예를 들어, Q139L), 및 217에서의 치환 (예를 들어, Y217F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 5HT3 IPD (서열식별번호: 4)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- 5HT3 LGIC 서브유닛을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 175에서의 치환 (예를 들어, G175K)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 139에서의 치환 (예를 들어, Q139L)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 R420Q 치환, R424D 치환, 및 R428A 치환을 갖는 인간 5HT3 IPD (서열식별번호: 4)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- 5HT3 LGIC 서브유닛을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 139에서의 치환 (예를 들어, Q139L) 및 217에서의 치환 (예를 들어, Y217F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 R420Q 치환, R424D 치환, 및 R428A 치환을 갖는 인간 5HT3 IPD (서열식별번호: 4)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- 5HT3 LGIC 서브유닛을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 175에서의 치환 (예를 들어, G175K) 및 115에서의 치환 (예를 들어, Y115F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 175에서의 치환 (예를 들어, G175K) 및 115에서의 치환 (예를 들어, Y115F) 및 79에서의 치환 (예를 들어, Q79G)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 175에서의 치환 (예를 들어, G175K) 및 77에서의 치환 (예를 들어, W77F) 및 79에서의 치환 (예를 들어, Q79G)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 216에서의 치환 (예를 들어, P216I)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 216에서의 치환 (예를 들어, P216I) 및 79에서의 치환 (예를 들어, Q79G)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7- GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 7)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 아미노산 잔기 131에서의 치환 (예를 들어, L131A, L131G, L131M, L131N, L131Q, L131V, 또는 L131F)을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 인간 GABAC IPD (서열식별번호: 9)을 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 10)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 1개 이상의 추가의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 서열은 수송 서열 (예를 들어, 유출 서열 및/또는 신호 서열)일 수 있다. 유출 서열의 예는 ER 유출 서열 (예를 들어, FCYENEV (서열식별번호: 16))을 비제한적으로 포함한다. 신호 서열의 예는 CHRNB4 신호 서열 (예를 들어, MRRAPSLVLFFLVALCGRGNC (서열식별번호: 17))을 비제한적으로 포함한다. 폴리펩티드 서열은 표적화 서열일 수 있다. 표적화 서열의 예는 KCNB1 체세포 표적화 서열 (예를 들어, QSQPILNTKEMAPQSKPPEELEMSSMPSPVAPLPARTEGVIDMRSMSSIDSFISCATDFPEATRF (서열식별번호: 18))을 비제한적으로 포함한다. 1개 이상의 추가의 폴리펩티드 서열은 변형된 LGIC 내 임의의 적절한 위치에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 추가의 폴리펩티드 서열은 말단 (예를 들어, C-말단 또는 N-말단) 폴리펩티드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 추가의 폴리펩티드 서열은 삽입일 수 있다. 일부 경우에, 추가의 폴리펩티드 서열은 치환일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 유출 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC는 ER 유출 서열 (예를 들어, FCYENEV (서열식별번호: 16))을 포함할 수 있다. L131G 치환, Q139L 치환 및 Y217F (예를 들어, 이들 각각은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 잔기 넘버링을 기준으로 함)를 갖는 α7 nAChR LBD, 및 잔기 142와 143 (예를 들어, 서열식별번호: 5에 제시된 잔기 넘버링 기준) 사이에 삽입된 ER 유출 서열을 갖는 GlyR IPD를 함유하는 예시적인 변형된 LGIC가 도 16에 제시된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 신호 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC는 CHRNB4 신호 서열 (예를 들어, MRRAPSLVLFFLVALCGRGNC (서열식별번호: 17))을 포함할 수 있다. 잔기 1-22를 치환하는 CHRNB4 신호 서열, L131G 치환, Q139L 치환 및 Y217F (예를 들어, 이들 각각은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 잔기 넘버링을 기준으로 함)를 갖는 α7 nAChR LBD, 및 GlyR IPD를 함유하는 예시적인 변형된 LGIC가 도 17에 제시된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC는 표적화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC는 KCNB1 체세포 표적화 서열 (예를 들어, QSQPILNTKEMAPQSKPPEELEMSSMPSPVAPLPARTEGVIDMRSMSSIDSFISCATDFPEATRF (서열식별번호: 18))을 포함할 수 있다. L131G 치환, Q139L 치환 및 Y217F (예를 들어, 이들 각각은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 제시된 잔기 넘버링을 기준으로 함)를 갖는 α7 nAChR LBD, 및 잔기 142와 143 (예를 들어, 서열식별번호: 5에 제시된 잔기 넘버링 기준) 사이에 삽입된 KCNB1 체세포 표적화 서열을 갖는 GlyR IPD를 함유하는 예시적인 변형된 LGIC가 도 18에 제시된다. LBD 및/또는 IPD가 본원에 제시된 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1-5 및/또는 9)의 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그인 경우, 특정한 변형된 아미노산 잔기에 대한 언급은 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그 내의 상응하는 아미노산으로 이동할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 서열식별번호: 3에 제시된 뮤린 5HT3 IPD 내의 잔기 425, 429, 및 433은 서열식별번호: 4에 제시된 인간 5HT3 IPD 내의 잔기 420, 424, 및 428에 상응하고, 뮤린 5HT3 IPD 내의 R425Q, R429D, 및 R433A 치환은 인간 5HT3 IPD 내의 R420Q, R424D, 및 R428A 치환에 상응한다.
임의의 방법이 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 펩티드 합성 방법이 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 펩티드 합성 방법의 예는 액체 상 펩티드 합성 및 고체 상 펩티드 합성을 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 단백질 생합성 방법이 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 생합성 방법의 예는 본원에 제공된 인산화-모방 펩티드를 코딩하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 비제한적으로 포함한다. 유사한 변형된 LGIC 서브유닛 (예를 들어, 본질적으로 동일한 변형을 갖고/거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 변형된 서브유닛)은 LBD 사이의 상호 작용을 통해 자기-조립되어 변형된 LGIC를 형성할 것이다.
본 명세서는 또한 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산뿐만 아니라 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산을 발현하기 위한 구축물 (예를 들어, 합성 구축물, 예컨대 플라스미드, 비-바이러스 벡터, 바이러스 벡터 (예컨대 아데노-연관 바이러스, 단순 포진 바이러스, 또는 렌티바이러스 벡터))을 제공한다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 LGIC를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 LGIC로부터의 LBD를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 LGIC로부터의 IPD를 코딩할 수 있다. 본원에 제공된 핵산 서열이 키메라 LGIC를 코딩하는 경우에, 키메라 LGIC는 임의의 적절한 LGIC로부터 선택된 LBD 및 임의의 적절한 LGIC로부터 선택된 IPD를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 핵산 서열은 본원에 기재된 LGIC를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 nAChR (예를 들어, α7 nAChR)을 코딩할 수 있다. 래트 α7 nAChR 아미노산 서열 (LBD 및 IPD 둘 다 포함)을 코딩하는 대표적인 핵산 서열은 하기와 같다.
서열식별번호: 19
Figure pct00017
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 α7 nAChR로부터의 LBD를 코딩할 수 있다. α7 nAChR LBD를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 20에 제시된 핵산 서열, 서열식별번호: 21에 제시된 핵산 서열 및 서열식별번호: 22에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, α7 nAChR LBD를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 20
Figure pct00018
서열식별번호: 21
Figure pct00019
서열식별번호: 22
Figure pct00020
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 5HT3 수용체로부터의 IPD를 코딩할 수 있다. 5HT3 IPD를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 23에 제시된 핵산 서열 및 서열식별번호: 24에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 5HT3 IPD를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 24에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 23
Figure pct00021
서열식별번호: 24
Figure pct00022
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 GlyR로부터의 IPD를 코딩할 수 있다. GlyR IPD를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 5에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, GlyR IPD는 서열식별번호: 5에 제시된 인간 GlyR IPD의 상동체, 오르토로그 또는 파라로그일 수 있다. 일부 경우에, GlyR IPD는 서열식별번호: 25에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 25
Figure pct00023
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열은 GABA 수용체 (예를 들어, GABAA-ρ, 또한 GABAC로 지칭됨)로부터의 IPD를 코딩할 수 있다. GABAA-ρ IPD를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 26에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, GABAA-ρ IPD는 서열식별번호: 26에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 가질 수 있다.
서열식별번호: 26
Figure pct00024
퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 있어서, 2개의 서열을 정렬하고, 2개의 서열 사이의 아미노산 잔기의 동일한 매치의 수를 결정한다. 동일한 매치의 수를 정렬된 영역의 길이 (즉, 정렬된 핵산 잔기의 수)로 나누고, 이에 100을 곱하여 퍼센트 서열 동일성 값에 도달한다. 정렬된 영역의 길이는 가장 짧은 서열의 전장 크기까지의 하나의 서열 또는 두 서열의 일부분일 수 있는 것으로 인지될 것이다. 단일 서열이 1개 초과의 다른 서열과 정렬될 수 있고, 이에 따라, 각각의 정렬된 영역에 걸쳐 상이한 퍼센트 서열 동일성 값을 가질 수 있는 것으로 또한 인지될 것이다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 2개 이상의 서열을 정렬하는 것은 컴퓨터 프로그램 클러스탈W 및 디폴트 파라미터를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 질의 서열과 1개 이상의 대상 서열 사이의 가장 우수한 매치를 계산하고, 동일성, 유사성 및 상이성이 결정될 수 있도록 이들을 정렬한다. 예를 들어, 문헌 [Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500]을 참조한다.
본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 LBD 및/또는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 IPD를 코딩할 수 있도록 적어도 1개의 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 1개 초과의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 초과의) 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 α7 LBD 및 아미노산 잔기 27, 41, 77, 79, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219에서의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩할 수 있다. 아미노산 잔기 27, 41, 77, 79, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219에서의 아미노산 치환을 생성할 수 있는 코돈 번호 27, 41, 77, 79, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및/또는 219에서의 핵산 코돈의 예는 하기 제시된 바와 같을 수 있다.
표 12. LBD 아미노산 치환을 생성하는 코돈 용법
Figure pct00025
예를 들어, 핵산 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖고 α7-GlyR IPD의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 갖는 GlyR IPD를 포함하는 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩할 수 있다. 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 생성할 수 있는 코돈 번호 298에서의 핵산 코돈의 예는 하기 제시된 바와 같을 수 있다.
표 13. GlyR IPD 아미노산 치환을 생성하는 코돈 용법
Figure pct00026
* 넘버링은 서열식별번호: 7에 제시된 잔기 넘버링을 기준으로 한다.
예를 들어, 핵산 서열은 서열식별번호: 9에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖고 α7-GABAC 키메라 수용체의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 갖는 GABAC IPD를 포함하는 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩할 수 있다. 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 생성할 수 있는 코돈 번호 298에서의 핵산 코돈의 예는 하기 제시된 바와 같을 수 있다.
표 14. GABAC IPD 아미노산 치환을 생성하는 코돈 용법
Figure pct00027
* 넘버링은 서열식별번호: 10에 제시된 잔기 넘버링을 기준으로 한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 α7-5HT3 키메라 수용체 (예를 들어, 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 1) 및 뮤린 5HT3 IPD (서열식별번호: 3) 성분을 포함함)를 코딩할 수 있다. 인간 α7 nAChR LBD 및 뮤린 5HT3 IPD를 포함하는 α7-5HT3 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 27에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다.
서열식별번호: 27
Figure pct00028
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 α7-GlyR 키메라 수용체 (예를 들어, 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2) 및 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 포함함)를 코딩할 수 있다. 인간 α7 nAChR LBD 및 인간 GlyR IPD를 포함하는 α7-GlyR 키메라 수용체를 코딩하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 28에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다.
서열식별번호: 28
Figure pct00029
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 10에 제시된 α7-GABAC 키메라 수용체 (예를 들어, 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2) 및 인간 GABAC IPD (서열식별번호: 9)를 포함함)를 코딩할 수 있다. 인간 α7 nAChR LBD 및 인간 GABAC IPD를 포함하는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2) 및 인간 GABAC IPD (서열식별번호: 9) 키메라 수용체를 포함하는 핵산 서열의 예는 서열식별번호: 29에 제시된 핵산 서열을 비제한적으로 포함한다.
서열식별번호: 29
Figure pct00030
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산 서열은 1개 이상의 추가의 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 수송 서열, 예컨대 유출 서열 및/또는 신호 서열, 또는 표적화 서열)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 유출 서열을 코딩하는 핵산 서열의 예는 ER 유출 서열을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, TTTTGCTATGAAAACGAAGTC; 서열식별번호: 30)을 비제한적으로 포함한다. 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열의 예는 CHRNB4 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, ATGAGAAGGGCCCCATCCCTGGTATTGTTTTTTTTGGTAGCTTTGTGCGGGAGGGGGAACTGC; 서열식별번호: 31)을 비제한적으로 포함한다. 표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열의 예는 KCNB1 체세포 표적화 서열을 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, CAAAGCCAACCTATCCTTAACACTAAAGAGAGCGCCGCTCAATCCAAACCCAAAGAAGAGTTGGAAATGGAGTCTATACCTTCACCTGTTGCACCTCTCCCTACTAGGACCGAAGGCGTGATTGACATGCGCTCTATGTCTAGTATAGATAGCTTTATATCCTGCGCCACAGACTTTCCCGAAGCCACTAGGTTC; 서열식별번호: 32)을 비제한적으로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산은 1개 이상의 조절 요소에 연결 (예를 들어, 작동가능하게 연결)될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산은 임의의 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 천연 (즉, 최소) 프로모터 또는 복합 프로모터일 수 있다. 프로모터는 편재성 (즉, 구성적) 프로모터 또는 조절된 프로모터 (예를 들어, 유도성, 조직 특이적, 세포-유형 특이적 (예를 들어, 뉴런 특이적, 근육 특이적, 신경교 특이적), 및 신경 하위유형-특이적)일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산의 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있는 프로모터의 예는 시냅신 (SYN), CAMKII, CMV, CAG, 엔올라제, TRPVl, POMC, NPY, AGRP, MCH, 및 오렉신 프로모터를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산은 뉴런 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산이 구축물 내에 존재하는 경우에, 구축물은 임의의 적절한 구축물일 수 있다. 구축물은 핵산 (예를 들어, DNA, RNA 또는 그의 조합) 구축물일 수 있다. 구축물의 예는 플라스미드, 비-바이러스 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터)를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산을 포함하는 구축물은 변형된 LGIC 서브유닛을 발현할 수 있다. 일부 경우에, 구축물은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES; 예를 들어, 비시스트론 IRES)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 구축물은 검출가능한 마커 (예를 들어, 형광 폴리펩티드, 예컨대 녹색 형광 폴리펩티드 (GFP; 예를 들어, 증강 GFP (EGFP)))를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 구축물은 구축물에 선택 마커 (예를 들어, 항생제 내성 마커, 예컨대 암피실린 내성)를 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 구축물의 예시적인 플라스미드 지도 및 핵산 서열이 도 19에 제시된다. 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 구축물의 또 다른 예시적인 플라스미드 지도 및 핵산 서열이 도 20에 제시된다.
본 명세서는 또한, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 갖는 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)를 제공한다. 본원에 기재된 변형된 LGIC를 갖는 포유동물 세포는 임의의 적절한 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 경우에, 미리 조립된 변형된 LGIC가 세포에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산은 변형된 LGIC 서브유닛이 번역되는 조건 하에 및 다수의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의) 변형된 LGIC 서브유닛이 본원에 기재된 변형된 LGIC 내로 조립될 수 있는 조건 하에 세포에 제공될 수 있다.
LGIC 리간드
본 명세서는 또한 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 제공한다. LGIC 리간드는 또한 약리학상 선택적인 이펙터 분자 (PSEM)로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 외인성 또는 내인성일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 자연 발생 또는 합성일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 정규 또는 비-정규일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 경우에, LGIC 리간드는 외인성 LGIC 효능제이다. LGIC 리간드의 예는 ACh, 니코틴, 에피바타틴, 시티신, RS56812, 트로피세트론, 노르트로피세트론, PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0353, 화합물 0354, 화합물 0436, 화합물 0676, 화합물 702, 화합물 723, 화합물 725, 그라니세트론, 이베르멕틴, 메퀴타진, 프로마진, 바레니클린, 화합물 765, 화합물 770, 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 773, 및 화합물 774를 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 3b, 도 5c, 도 11a, 도 11b, 및 도 11c 참조).
본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 (예를 들어, 비변형 LGIC에 비해) 본원에 기재된 변형된 LGIC에 대한 선택적 결합 (예를 들어, 증진된 결합 또는 증가된 효력)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 내인성 수용체 (예를 들어, 내인성 LGIC)에 결합하지 않고 이를 활성화시키지 않는다. 비변형 LGIC 리간드에 비해 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 변형된 LGIC에 약리학적 선택성을 부여하는 적어도 1개의 아미노산 변형을 갖는 변형된 LGIC)에 선택적으로 결합하고 이를 활성화시키는 LGIC 리간드는 또한, 변형된 LGIC에 대한 증진된 효력을 갖는 것으로서 기재될 수 있다. 일부 경우에, 외인성 LGIC 리간드에 선택적으로 결합하는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛은 변형된 LGIC에 대한 적어도 5배 (예를 들어, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 65배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 85배, 적어도 95배, 적어도 100배, 적어도 125배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 250배, 또는 적어도 300배) 증진된 효력을 가질 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하고 이를 활성화시키는 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 대한 약 10배 내지 약 300배 (예를 들어, 약 10배 내지 약 250배, 약 10배 내지 약 200배, 약 10배 내지 약 150배, 약 10배 내지 약 100배, 약 25배 내지 약 300배, 약 50배 내지 약 300배, 약 100배 내지 약 300배, 약 200배 내지 약 300배, 약 25배 내지 약 250배, 약 50배 내지 약 200배, 또는 약 100배 내지 약 150배) 증진된 효력을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시키는 LGIC 리간드는 25 nM 미만 (예를 들어, 22 nM 미만, 20 nM 미만, 17 nM 미만, 15 nM 미만, 13 nM 미만, 12 nM 미만, 11 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 2 nM 미만 또는 1 nM 미만)의 리간드 효력을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시키는 LGIC 리간드는 15 nM 미만의 리간드 효력을 가질 수 있다. 일부 경우에, LGIC 리간드는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛에 대한 25 nM 미만 (예를 들어, 22 nM 미만, 20 nM 미만, 17 nM 미만, 15 nM 미만, 13 nM 미만, 12 nM 미만, 11 nM 미만, 또는 10 nM 미만)의 EC50을 가질 수 있다. 예를 들어, LGIC 리간드 (예를 들어, 트로피세트론)는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛 (예를 들어, α7Q79G-GlyRA298G)에 대한 약 11 nM의 EC50을 가질 수 있다. 예를 들어, LGIC 리간드 (예를 들어, 노르트로피세트론)는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛 (예를 들어, α7Q79G,Y115F-GlyRA298G)에 대한 약 13 nM의 EC50을 가질 수 있다. 일부 경우에, LGIC 리간드는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛에 대한 20 μM 초과 (예를 들어, 22 μM 초과, 25 μM 초과, 35 μM 초과, 50 초과, 65 μM 초과, 80 μM 초과, 또는 100 μM 초과)의 EC50을 가질 수 있다. 예를 들어, LGIC 리간드 (예를 들어, ACh)는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛 (예를 들어, α7Q79G,Y115F-GlyRA298G)에 대한 100 μM 초과의 EC50을 가질 수 있다.
일부 측면에서, LGIC 리간드는 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 합성 리간드일 수 있고, 퀴누클리딘, 트로판, 9-아자비시클로[3.3.1]노난, 또는 2-페닐-7,8,9,10-테트라히드로-6H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린일 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 화학식 I을 가질 수 있다:
Figure pct00031
여기서 X1 및 X2는 독립적으로 CH, CH2, O, NH, 또는 NMe일 수 있고; 각각의 n은 독립적으로 0 또는 1일 수 있고; Y는 O 또는 S일 수 있고; A는 방향족 치환기일 수 있고; R은 H 또는 피리디닐메틸렌일 수 있다. 방향족 치환기의 예는 4-클로로-벤젠, 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산, 및 4-클로로-벤젠을 비제한적으로 포함한다.
본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 퀴누클리딘일 수 있다. 퀴누클리딘은 화학식 II의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00032
여기서 X3은 O, NH, 또는 CH2일 수 있고; Y는 O 또는 S일 수 있고; A는 방향족 치환기일 수 있고; R은 H 또는 피리디닐메틸렌일 수 있다. 방향족 치환기의 예는 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산, 3-클로로-4-플루오로 벤젠, 4-클로로-벤젠, 및 1H-인돌을 비제한적으로 포함한다. 퀴누클리딘의 예는 화합물 PNU-282987, PHA-543613, 0456, 0434, 0436, 0354, 0353, 0295, 0296, 및 0676을 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 5c, 표 3, 및 표 6 참조).
본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 트로판일 수 있다. 트로판은 화학식 III의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00033
여기서 X2는 NH 또는 NMe일 수 있고; X3은 O, NH, 또는 CH2일 수 있고; Y는 O 또는 S일 수 있고; A는 방향족 치환기일 수 있다. 방향족 치환기의 예는 1H-인돌, 7-메톡시-1H-인돌, 7-메틸-1H-인돌, 5-클로로-1H-인돌, 및 1H-인다졸을 비제한적으로 포함한다. 트로판의 예는 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 737 및 화합물 745를 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 5c, 표 3, 및 표 6 참조).
본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 9-아자비시클로[3.3.1]노난일 수 있다. 9-아자비시클로[3.3.1]노난은 화학식 IV의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00034
여기서 X1은 CH일 수 있고, X2는 NH 또는 NMe일 수 있고, X3은 O, NH, 또는 CH일 수 있고; Y는 O 또는 S일 수 있고; A는 방향족 치환기일 수 있다. 방향족 치환기의 예는 비제한적으로 4-클로로-벤젠이다. 9-아자비시클로[3.3.1]노난의 예는 화합물 0536, 화합물 0749, 화합물 0751, 화합물 0760 및 화합물 0763을 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 5c, 표 3, 및 표 6 참조).
일부 경우에, LGIC 리간드는 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀일 수 있고, 화학식 V에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00035
여기서 R1 = H, 방향족 치환기, 메틸 함유 기, 에틸 함유 기 또는 다른 지방족 기, 알콕시-함유 기 (예를 들어, 메톡시-함유 기, 에톡시-함유 기, 프로폭시-함유 기 및 이소프로폭시-함유 기); 또는 아미노-함유 기이고; R2 = H, 지방족 치환기 (예를 들어, 메틸) 또는 방향족 치환기 (예를 들어, 페닐)이다. R1 기의 예는 페닐, 2-톨루일, 3-피리딜, 4-피리딜, 이미다졸, 피롤, 피라졸, 트리아졸, 이속사졸-3-아민, 트리플루오로메틸, 메톡시, N,N-디메틸아미노, 및 N,N-디에틸아미노를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, R1 및 R2는 연결되어 고리를 형성할 수 있다. 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀의 예는 바레니클린, 화합물 0765, 화합물 0770, 화합물 0780, 화합물 0782, 화합물 0785, 화합물 0788, 화합물 0782, 화합물 0789, 화합물 0791, 화합물 0793, 화합물 0794, 화합물 0795, 화합물 0798, 화합물 0799, 화합물 0800, 화합물 0801, 화합물 0802, 화합물 0803, 화합물 0804, 화합물 0805, 화합물 0807, 화합물 0808, 화합물 0812, 화합물 0813, 화합물 815, 화합물 816, 및 화합물 817을 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 11a, 도 14a, 표 3, 표 9, 표 10, 및 표 11 참조).
일부 경우에, LGIC 리간드는 2-(피리딘-3-일)-1,5,6,7,8,9-헥사히드로-5,9-메타노이미다조[4',5':4,5]벤조[1,2-d]아제핀일 수 있다:
Figure pct00036
2-(피리딘-3-일)-1,5,6,7,8,9-헥사히드로-5,9-메타노이미다조[4',5':4,5]벤조[1,2-d]아제핀의 예는 화합물 0786을 포함한다 (예를 들어, 표 10 및 표 11 참조).
일부 경우에, LGIC 리간드는 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온일 수 있고, 화학식 VI에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00037
여기서 R1 = H 또는 지방족 치환기 (예를 들어, 메틸)이고; R2 = H, 지방족 치환기 (예를 들어, 메틸) 또는 방향족 치환기이고; R3 = O 또는 S이다. 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온의 예는 화합물 0783, 화합물 0784, 화합물 0790, 또는 화합물 0792를 비제한적으로 포함한다 (예를 들어 도 11b, 표 10, 및 표 11 참조). 예를 들어, LGIC는 하기 구조를 갖는 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온일 수 있다:
Figure pct00038
일부 경우에, LGIC 리간드는 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난일 수 있고, 화학식 VII에 제시된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00039
여기서 R = H, F, NO2이다. 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난의 예는 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 0773 및 화합물 0774를 비제한적으로 포함한다 (예를 들어, 도 11c, 표 6, 및 표 9 참조).
사용 방법
본 명세서는 또한, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 사용 방법을 제공한다. 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 리간드의 전달에 기초한 시간적 및/또는 공간적 제어를 갖는 변형된 LGIC를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 본원에 기재된 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 리간드를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 본원에 기재된 변형된 LGIC에 대한 1종 이상의 후보 리간드를 제공하는 단계, 및 후보 리간드와 변형된 LGIC 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 적절한 방법이 후보 리간드와 변형된 LGIC 사이의 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있고, 임의의 적절한 방법이 변형된 LGIC의 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 리간드의 능력은 막 전위 (MP) 검정 (예를 들어, 형광 MP 검정), 방사성 결합 검정, 및/또는 피크 전류 및 지속 전류의 전압 클램프 측정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검정에 의해 측정될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 채널병증 (예를 들어, 신경 채널병증 또는 근육 채널병증)을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 채널병증을 갖는 포유동물은 본원에 기재된 변형된 LGIC를 투여한 다음, 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 채널병증을 갖는 포유동물은 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, R27D 아미노산 치환, E41R 아미노산 치환, Q79G 아미노산 치환 및 Y115F 아미노산 치환을 갖는 인간 α7 nAChR LBD (서열식별번호: 2), 및 A298G 아미노산 치환을 갖는 인간 GlyR IPD (서열식별번호: 5)를 갖는 적어도 1개의 키메라 α7-GlyR LGIC 서브유닛 (서열식별번호: 6)을 포함함)를 투여한 다음, 트로피세트론을 투여함으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 채널병증을 갖는 포유동물은 L131 아미노산 치환 (예를 들어, L131G, L131A, L131M, 또는 L131N) 및 임의로, Q79S 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및/또는 Y217F 아미노산 치환을 갖는 변형된 인간 α7 nAChR LBD (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12)를 포함하는 본원에 기재된 변형된 LGIC를 투여한 다음, 바레니클린, 트로피세트론, 및/또는 화합물 765를 투여함으로써 치료될 수 있다.
임의의 유형의 포유동물은 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 사용하여 치료될 수 있다. 예를 들어, 인간 및 다른 영장류, 예컨대 원숭이는 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 사용하여 치료될 수 있다. 일부 경우에, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 마우스, 및 래트는 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 사용하여 치료될 수 있다.
임의의 적절한 방법이 채널병증을 갖는 포유동물 및/또는 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 채널병증을 갖는 포유동물 및/또는 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물을 확인하기 위해 유전자 검사가 사용될 수 있다.
채널병증을 갖는 포유동물 및/또는 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물로서 확인되면, 포유동물에게 본원에 기재된 변형된 LGIC를 투여하거나 또는 이를 자기-투여하도록 지시할 수 있으며, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 투여하거나 또는 이를 자기-투여하도록 지시할 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 함께 투여될 수 있거나 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 물질 및 방법을 사용하여 채널병증을 갖는 포유동물 및/또는 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물을 치료하는 경우, 채널병증은 임의의 채널병증일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 채널병증은 이상 이온 채널 기능 및/또는 이상 리간드 기능에 의해 유발되거나, 또는 조정된 이온 채널 기능 및/또는 변경된 세포 이온 유동 (예를 들어, 칼슘 이온 유동)에 의해 완화될 수 있는 임의의 질환 또는 장애일 수 있다. 채널병증은 선천성 또는 후천성일 수 있다. 채널병증의 예는 바터 증후군, 브루가다 증후군, 카테콜아민성 다형성 심실성 빈맥 (CPVT), 선천성 고인슐린증, 낭성 섬유증, 드라베 증후군, 간헐성 운동실조, 지단홍통증, 전신 간질 (예를 들어, 열성 발작을 동반함), 가족성 편마비성 편두통, 섬유근육통, 고칼륨혈성 주기성 마비, 저칼륨혈성 주기성 마비, 램버트-이튼 근무력 증후군, 긴 QT 증후군 (예를 들어, 로마노-워드 증후군), 짧은 QT 증후군, 악성 고열, 점액지질증 유형 IV, 중증 근무력증, 선천성 근긴장증, 시신경척수염, 신경근긴장증, 비증후군성 난청, 선천성 이상근긴장증, 색소성 망막염, 티모시 증후군, 이명, 발작, 삼차 신경통, 및 다발성 경화증을 비제한적으로 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 물질 및 방법은 통증 치료, 암 세포 요법, 식욕 제어, 경직 치료, 근육 이상긴장증 치료, 진전 치료, 및 운동 장애 치료를 비제한적으로 포함하는 다른 적용에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 세포의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 사용하여 조정되는 세포의 활성은 임의의 세포 활성일 수 있다. 세포 활성의 예는 능동 수송 (예를 들어, 이온 수송), 수동 수송, 흥분, 억제, 이온 유동 (예를 들어, 칼슘 이온 유동), 및 세포외유출을 비제한적으로 포함한다. 세포 활성은 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 세포의 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하기 (예를 들어, 증가시키기) 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 세포의 흥분성을 조정하기 (예를 들어, 증가시키기) 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 포유동물 내의 임의의 유형의 세포의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 면역 세포 (예를 들어, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 및 단핵구), 내분비 세포, 또는 줄기 세포 (예를 들어, 배아 줄기 세포)일 수 있다. 일부 경우에, 상기 세포는 흥분성 세포일 수 있다. 세포는 생체내 또는 생체외일 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC는 임의의 적절한 방법에 의해 투여될 수 있다. 변형된 LGIC는 변형된 LGIC 서브유닛으로서 또는 미리 조립된 변형된 LGIC로서 투여될 수 있다. 변형된 LGIC는 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산으로서 투여될 수 있다. 변형된 LGIC는 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 네이키드 핵산으로서 또는 임의의 적절한 벡터 (예를 들어, 재조합 벡터)를 사용하여 전달될 수 있다. 벡터는 DNA 기반 벡터, RNA 기반, 또는 그의 조합일 수 있다. 벡터는 분할 세포 또는 비-분할 세포에서 핵산을 발현할 수 있다. 재조합 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 및 단순 포진 벡터), 코스미드, 및 인공 염색체 (예를 들어, 효모 인공 염색체 또는 박테리아 인공 염색체)를 비제한적으로 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 서브유닛을 코딩하는 핵산은 아데노-연관 바이러스 벡터에 의해 발현될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC는 임의의 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어, 세포 내에서의 그의 존재를 확증하기 위함). 일부 경우에, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제는 변형된 LGIC를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC에 결합하기 위해 사용될 수 있는 작용제의 예는 항체, 단백질 (예를 들어, 분가로톡신), 및 소분자 리간드 (예를 들어, PET 리간드)를 비제한적으로 포함한다. 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제는 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 표지, 양전자 방출 표지, 및 효소적 표지)를 포함할 수 있다. 세포에서의 LGIC 발현을 검출하는 방법은 형광 영상화, 자가방사선촬영, 기능적 MRI, PET, 및 SPECT를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는, 채널병증을 치료하기 위해 사용되는 1종 이상의 추가의 작용제/요법과의 조합 요법으로서 채널병증을 갖고/거나 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 채널병증을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용된 조합 요법은 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 투여하고; 아세타졸아미드, 디클로르페나미드, 멕실레틴, 글루코스, 글루콘산칼슘, L-DOPA, 근육 자극, 척추 자극, 뇌 자극, 및/또는 신경 자극으로 치료하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드가, 채널병증을 치료하기 위해 사용되는 추가의 작용제/요법과 조합되어 사용되는 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 작용제는 동시에 또는 독립적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드가 먼저 투여되고, 1종 이상의 추가의 작용제가 두 번째로 투여되거나, 그 반대의 경우도 가능하다. 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드가, 채널병증을 치료하기 위해 사용되는 1종 이상의 추가의 요법과 조합되어 사용되는 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 요법은, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 투여와 동시에 또는 독립적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC; 및 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 1종 이상의 추가의 요법을 수행하기 전, 수행하는 동안, 또는 수행한 후에 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드는 채널병증을 갖거나 채널병증이 발생할 위험이 있는 포유동물에게 투여하기 위한 제약상 허용되는 조성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량이 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 (첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제제화될 수 있다. 제약 조성물은 멸균 용액, 현탁액, 지속-방출 제제, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 및 과립제를 비제한적으로 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체, 충전제 및 비히클은 이온 교환체, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨; 포화 식물성 지방산, 물, 염 또는 전해질의 부분 글리세리드 혼합물, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 비제한적으로 포함한다.
본원에 기재된 변형된 LGIC 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드를 함유하는 제약 조성물은 경구, 비경구 (피하, 두개내, 동맥내, 근육내, 정맥내, 관상동맥내, 피내, 또는 국소 포함), 또는 흡입 투여용으로 설계될 수 있다. 경구로 투여되는 경우, 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 제약 조성물은 환제, 정제, 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균성 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균성 현탁액을 포함한다. 흡입용 조성물은, 예를 들어 흡입기, 네뷸라이저, 및/또는 건조 분말 흡입기를 사용하여 전달될 수 있다. 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 (동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 포함하는 제약상 허용되는 조성물은 국부로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 조성물은 포유동물 (예를 들어, 인간)에 대한 정맥 또는 경구 투여, 또는 상기 포유동물에 의한 흡입에 의해 전신으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 조성물은 포유동물 (예를 들어, 인간)의 표적 조직에 경피, 피하, 근육내, 두개내, 또는 개방 외과적 투여 (예를 들어, 주사)에 의해 국부로 투여될 수 있다.
유효 용량은 채널병증의 중증도, 투여 경로, 대상체의 연령 및 전반적 건강 상태, 부형제 용법, 다른 치유적 치료와의 공동-용법의 가능성, 예컨대 다른 작용제의 사용, 및 치료 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.
투여 빈도는 포유동물에게 유의한 독성을 유발하지 않으면서 채널병증의 증상을 개선시키는 임의의 빈도일 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 1주 약 1회 내지 1일 약 3회, 1개월 약 2회 내지 1일 약 6회, 또는 1주 약 2회 내지 1일 약 1회일 수 있다. 투여 빈도는 일정하게 유지될 수 있거나 또는 치료 지속기간 동안 가변적일 수 있다. 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 조성물을 사용한 치료 과정은 휴약 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 조성물은 2주 기간에 걸쳐 매일 투여한 다음, 2주의 휴약 기간을 가질 수 있으며, 이러한 요법은 수회 반복될 수 있다. 유효량과 같이, 다양한 인자가 특정한 적용을 위해 사용되는 실제 투여 빈도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효량, 치료 지속기간, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 채널병증의 중증도가 투여 빈도의 증가 또는 감소를 필요로 할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 LGIC (예를 들어, 본원에 기재된 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 변형된 LGIC에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 LGIC 리간드의 치료 유효량을 함유하는 조성물을 투여하는데 유효한 지속기간은 포유동물에게 유의한 독성을 유발하지 않으면서 채널병증의 증상을 개선시키는 임의의 지속기간일 수 있다. 예를 들어, 유효 지속기간은 수일 내지 수주, 수개월, 또는 수년으로 달라질 수 있다. 일부 경우에, 채널병증의 치료를 위한 유효 지속기간은 약 1개월 내지 약 10년의 지속기간의 범위일 수 있다. 다수의 인자가 특정한 치료를 위해 사용되는 실제 유효 지속기간에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효 지속기간은 투여 빈도, 유효량, 다수의 치료 작용제의 사용, 투여 경로, 및 치료되는 채널병증의 중증도에 따라 달라질 수 있다.
특정 경우에, 채널병증에 대해 치료되고 있는 포유동물의 증상 및 치료 과정이 모니터링될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 채널병증의 증상을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 효력-증진 리간드 결합 도메인 돌연변이
니코틴성 수용체 효능제와 화학적 유사성을 갖는 51종의 임상적으로 사용되는 약물의 패널에 대하여 돌연변이체 LBD를 갖는 41종의 α7-5HT3 키메라 채널의 패널을 사용하여 스크린을 수행하였다. 돌연변이는 도 1에서 강조된 잔기에서 이루어졌다. 스크린에 의해 공지된 nAChR 효능제 트로피세트론에 대한 효력을 증진시킨 α7 nAChR LBD 내의 Gln79에서의 돌연변이가 밝혀졌다 (도 2). 이들 돌연변이 (Q79A, Q79G, Q79S)는 아미노산 측쇄의 크기를 감소시켰다. 일부 돌연변이체 이온 채널-리간드 조합은 효력에 있어서 최대 12배의 개선을 제공하였다 (표 1, 도 3). 정규 α7 nAChR 효능제, ACh, 니코틴, 에피바티딘, 및 금연 약물 바레니클린은 Q79A, Q79G, 또는 Q79S 돌연변이에 의해 유의한 영향을 받지 않았다. 그러나, α7 nAChR 효능제의 하위세트는 상기 돌연변이 중 일부를 사용한 경우에 증진된 효력을 나타내었다. 시티신, RS56812, 트로피세트론, 노르트로피세트론, 및 PNU-282987은 α7Q79G-5HT3에 대한 유의하게 개선된 효력을 나타내었다. 추가적으로, 노르트로피세트론 및 PNU-282987은 α7Q79A-5HT3 및 α7Q79S-5HT3 각각에 대한 유의하게 증진된 효력을 나타내었다. 일반적으로, 리간드 결합 도메인의 상보적 결합 면과 상호작용하는 연결된 방향족 구조를 갖는 퀴누클리딘 또는 트로판 약물작용발생단에 기초한 효능제는 Gln79를 더 작은 아미노산 잔기 Ala, Gly, 또는 Ser으로 치환한 경우에 개선된 효력을 나타내었다. 대부분의 효능제에 대해, α7Q79G-5HT3이 가장 바람직한 돌연변이체 키메라 이온 채널이었다.
표 1. HEK 세포 내 Gln79에서 돌연변이된 키메라 양이온 채널에 대한 nAChR 효능제의 효력. 평균 EC50, 괄호 안의 SEM (μM).
Figure pct00040
이들 돌연변이된 LBD를 사용하여, 대부분의 이들 리간드에 대해 최대 6배의 증진된 효력을 갖는 α7-GlyR 키메라 채널을 생성하였다 (도 4a). α7-5HT3의 돌연변이와 같이, Gln79에서의 이들 돌연변이는 ACh, 니코틴, 에피바티딘, 바레니클린, 또는 시티신의 효력에 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나, 트로피세트론, 노르트로피세트론, 및 RS56812는 α7Q79G-GlyR에 대한 유의하게 증진된 효력을 나타내었다. α7-5HT3에 대한 LBD 돌연변이와 유사하게, 노르트로피세트론은 α7Q79A-GlyR에 대한 유의하게 증진된 효력을 나타내었고, PNU-282987은 α7Q79S-GlyR에 대한 유의하게 증진된 효력을 나타내었다. 대부분의 효능제에 대해, α7Q79G-GlyR이 가장 바람직한 돌연변이체 키메라 이온 채널이었다.
소분자 스크린에서 관찰되었던 또 다른 관계는 Trp77에서의 돌연변이가, α7W77F-5HT3 (EC50: 1.2 μM), α7W77Y-5HT3 (EC50: 1.1 μM), 및 α7W77F-GlyR (EC50: 0.66 μM) 수용체에서 약물 그라니세트론에 대한 효능제 활성을 부여했다는 것이었다. 그라니세트론은 α7-5HT3 또는 α7-GlyR을 활성화시키지 않는 5HT3 수용체 길항제 그라니세트론이다.
이들 결과는 α7 nAChR LBD에서 Q79의 돌연변이 (A, G, 또는 S로의 돌연변이)가 변형된 LGIC에 대한 공지된 LGIC 리간드의 결합을 증진시켰다는 것을 보여준다.
실시예 2: 효력 증진 이온 포어 도메인 돌연변이
전장 글리신 수용체 채널에서 이전에 확립된 IPD 돌연변이를 갖는 α7-GlyR 채널 (T258S 및 A288G, GlyR 넘버링; α7-GlyR 넘버링에 대한 T268S 및 A298G와 등가임)을, 알로스테릭 효능제 이베르멕틴에 대한 증진된 효력에 대하여 조사하였다. α7-GlyRT268S를 갖는 채널이 실질적인 리간드 없이 개방될 확률을 가진 것으로 밝혀졌으며, 이로써 이들은 리간드-제어된 세포 조작에 부적합하게 되었다. 전장 글리신 수용체에서 이베르멕틴 효력을 증진시키는데 유효한 α7-GlyRA298G에서의 돌연변이는 리간드의 부재 하에 개방 확률의 약간의 변화를 초래하였으므로; 이러한 채널을 공지된 효능제의 패널에 대한 활성에 관하여 조사하였다. 정규 효능제 ACh, 니코틴, 및 에피바티딘에 대해서뿐만 아니라 바레니클린 및 트로피세트론에 대해, 효능제 효력은 α7-GlyRA298G에서 유의하게 증진되지 않았다. α7 nAChR 효능제의 하위세트는 효력에 있어서 4배 이하의 약간의 증가를 나타냈고: RS56812, 시티신, PNU-282987, 및 노르트로피세트론은 유의하게 더 강력하였다. 따라서, IPD A298G 돌연변이의 효과는 리간드 효력을 개선시켰지만, 리간드 구조에 좌우되었고 LBD에서의 돌연변이만큼 유효하지 않았다.
LBD에서의 Q79G 돌연변이 및 α7-GlyR에 대한 A298G IPD 돌연변이를 조사하였다 (표 2). 이중 돌연변이체 키메라 채널인 α7Q79G-GlyRA298G는 a7 nAChR 효능제에 대한 α7-GlyR과 비교하여 최대 18배의 효력 증진을 나타내는 상승작용적 효력 증진을 가져왔다. 이러한 이중 돌연변이체 채널로부터의 증진은 효능제 RS56812, 트로피세트론, 노르트로피세트론, 및 PNU-282987에 대한 개별 돌연변이로부터의 증진보다 더 컸다. 이러한 돌연변이의 조합의 예상외의 구조적 감수성이 추가로 강조되었지만, 다수의 효능제, 예컨대 ACh, 니코틴, 에피바티딘, 바레니클린, 및 시티신은 α7-GlyR과 α7Q79G-GlyRA298G 사이에 유의하게 변화되지 않았다. 따라서, LBD 돌연변이 Q79G와 IPD 돌연변이 A298G의 조합은, 모두는 아니지만 일부 니코틴성 효능제에 대한 효력이 ~10-20배 만큼 크게 증가된 상승작용적 효과를 가져왔다.
표 2. 돌연변이된 키메라 클로라이드 채널에 대한 nAChR 효능제의 효력. 키메라 채널을 발현하는 HEK 세포에서 효능제 활성에 대한 평균 EC50 및 괄호 안의 SEM (μM).
Figure pct00041
이들 결과는 α7 nAChR LBD 내의 Q79의 돌연변이 (A, G, 또는 S로의 돌연변이) 및/또는 GlyR IPD 내의 A298의 돌연변이 (G로의 돌연변이)가 변형된 LGIC에 대한 공지된 LGIC 리간드의 선택적 결합을 추가로 증진시켰다는 것을 보여준다.
실시예 3: 증진된 효력을 나타내는 분자
α7Q79G-GlyRA298G에 의해 증진된 효력을 나타낸 공지된 효능제의 구조 활성 관계에 기초하여, 1개 이상의 방향족 측쇄 치환기를 갖는 퀴누클리딘, 트로판, 또는 9-아자비시클로[3.3.1]노난 약물작용발생단으로 구성된 다양한 합성 분자를 시험하였다. 추가로, 공지된 α7 nAChR 효능제 PHA-543613 (Walker et al. 2006, Wishka et al. 2006)을 또한 시험하였으며, 이는 α7Q79G-GlyRA298G에 대한 예외적인 효력을 나타내었다. 이들 분자는 일반적으로 10배 내지 100배 증진된 효력을 나타냈으며 (표 3), 이는 이들 약물작용발생단의 경우, 소정 범위의 구조적 특색이 α7Q79G-GlyRA298G에 대한 개선된 효력과 양립할 수 있었다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 변형된 LGIC가 합성 퀴누클리딘-함유 및 트로판-함유 LGIC 리간드에 의해 활성화될 수 있다는 것을 보여준다.
표 3. 키메라 채널에 대한 화합물의 효력. 키메라 채널을 발현하는 HEK 세포에서 효능제 활성에 대한 평균 EC50 및 괄호 안의 SEM (μM). 부분은 부분 효능제 활성을 지칭한다.
Figure pct00042
실시예 4: 아세틸콜린 반응성을 감소시키는 돌연변이
α7 nAChR은 다른 nAChR 이소형과 비교하여 ACh에 대한 비교적 낮은 감수성을 가지며, 트로판 및 퀴누클리딘 리간드에 대한 효력 증진 돌연변이는 이들 채널에서의 아세틸콜린의 효력을 실질적으로 변경시키지 않았다. 따라서, 이들 채널의 아세틸콜린 반응성을 감소시키기 위해 키메라 채널을 추가로 변형시켰다. α7Q79G,Y115F-5HT3, α7Q79G,Q139G-5HT3, α7Q79G,Q139G-GlyRA298, α7Q79G,Y115F-GlyRA298G에 대한 일부 효능제의 효력을 단지 약간만 감소시킨 추가의 LBD 돌연변이 Y115F 및 Q139G를 갖는 일부 경우에 아세틸콜린 반응성이 100 μM 초과로 상당히 감소되었다. 예를 들어, α7Q79G,Y115F-GlyRA298G는 노르트로피세트론의 경우에 13 nM의 EC50을 가지며, ACh의 경우에 >100 μM의 EC50을 갖는다 (표 4).
표 4. 낮은 아세틸콜린 반응성을 갖는 돌연변이된 키메라 클로라이드 채널에 대한 nAChR 효능제의 효력. 키메라 채널을 발현하는 HEK 세포에서 활성에 대한 평균 EC50 및 괄호 안의 SEM (μM).
Figure pct00043
이들 결과는 α7 nAChR LBD 내의 Y115F 및/또는 Q139G 돌연변이가 변형된 LGIC에 대한 내인성 LGIC 리간드 Ach의 결합을 감소시켰다는 것을 보여준다.
실시예 5: 내인성 수용체 서브유닛과의 회합을 감소시키는 돌연변이
α7 nAChR의 조립은 LBD들 사이의 상호작용을 통한 5개의 동형체성 서브유닛의 회합에 기초한다 (Celie et al. 2004 Neuron 41: 907-14). 내인성 α7 nAChR 서브유닛과의 바람직하지 않은 회합 및/또는 키메라 채널의 원치 않는 회합을 최소화하기 위해, 아세틸콜린 결합 단백질의 결정 구조를 조사하고 α7 nAChR 수용체 LBD 내에 상동 이온성 아미노산을 또한 갖는 반대 전하를 수반한 인근 서브유닛-간 잔기를 확인함으로써 잠재적 서브유닛-간 염 브릿지를 확인하였다. 전하 역전 돌연변이 (잠재적 염 브릿지의 산성 구성원을 염기성 잔기로 전환시키고, 그의 염기성 파트너를 산성 잔기로 전환시키는 것)는 비변형 서브유닛과의 서브유닛-간 상호작용은 붕괴시키지만, 전하 역전 돌연변이를 갖는 서브유닛 사이의 상호작용은 보존시키도록 설계되었다 (도 6a). 전하 역전 돌연변이를 갖는 키메라 LGIC 서브유닛은 비변형 채널, 예를 들어 내인성 α7 nAChR과 상호작용하지 않으면서 서로 선택적으로 조립될 수 있었다. α7 nAChR LBD 내의 R27D,E41R의 이중 돌연변이는 기능적 채널을 생성하였다 (도 6b). 이들 전하 역전 채널을, 비변형 서열을 갖는 α7-5HT3 채널과 함께 공동-발현시켰을 때 전하 역전 서브유닛이 비변형 채널과 공동-면역침전되지 않은 것으로 나타났다 (도 6c). 키메라 채널 α7R27D,E41R,Q79G,Y115F-GlyRA298G를 제공하기 위해 효력 증진 돌연변이 및 아세틸콜린 차단 돌연변이와 조합하였을 때 일부 효능제가 그의 동족 효능제에 대한 높은 효력을 보유한 것으로 밝혀졌다 (표 4, 우측 칼럼).
이들 결과는 α7 nAChR LBD 내의 R27D 및 E41R 돌연변이가 변형된 LGIC 서브유닛과 다른 변형된 및/또는 내인성 LGIC 서브유닛의 회합을 감소시켰다는 것을 보여준다.
실시예 6: 리간드 효력을 증가시키는 LBD 돌연변이
α7-GlyR 키메라 채널에서 α7 nAChR LBD의 Gly175 및 Pro216에서의 돌연변이를 시험하였다. Gly175에서 Lys로의 돌연변이 (α7G175K-GlyR)는 ACh에 대한 증가된 효력 (5배)을 나타내었다 (표 5). α7G175K-GlyR의 경우에는, 니코틴 효력이 비변형 α7-GlyR 키메라 채널과 비교하여 10배 증진된 것으로 또한 밝혀졌다 (표 5). Pro216에서 Ile로의 돌연변이 (α7P216I-GlyR)는 ACh 효력을 실질적으로 변경시키지 않았다 (표 5). 그러나, α7P216I-GlyR은 비변형 α7-GlyR과 비교하여 >4배 만큼 증가된 니코틴 효력을 나타내었다 (표 5). α7G175K-GlyR 및 α7P216I-GlyR에서의 이들 효력 증진 돌연변이는 또한, 여러 다른 α7-GlyR 효능제의 효력에 최대 30배의 영향을 미쳤다 (표 5). α7G175K-GlyR의 경우에는, 임상적으로 사용되는 약물 트로피세트론, 바레니클린, 시티신, 그라니세트론, 및 에피바티딘에 대하여 α7-GlyR에 비해 10배 초과의 효력 증진이 관찰되었다. α7P216I-GlyR의 경우에는, 효력 증진이 대략 3배였다 (표 5).
표 5. a7GlyR 키메라 채널에서 G175K 및 P216I 돌연변이에 의한 효능제 효력 증진. 단위: μM. 괄호: SEM.
Figure pct00044
nd = 결정되지 않음
ACh를 생산하는 유기체에서 사용하는 경우에는, α7 nAChR LBD로 구성된 이들 채널에서의 내인성 ACh 효력을 감소시키는 것이 중요하다. 돌연변이 G175K는 ACh에 대한 감수성을 감소시킨 다른 돌연변이, 예컨대 Y115F 및 Y210F와 추가로 조합할 수 있었다. α7Y115F,G175K-GlyR의 경우에는, 트로판 또는 퀴누클리딘 코어 구조에 기초한 효능제에 대한 높은 효력이 트로피세트론, 그라니세트론, 노르트로피세트론, PNU-282987, 및 PHA-543613에 대하여 밝혀졌고, 바레니클린 및 시티신에 대해서는 크게 감소된 효력이 밝혀졌다 (표 5). α7G175K,Y210F-GlyR의 경우에는, 대부분의 효능제에 대한 효력이 상당히 감소되었지만, 그라니세트론에 대해서는 효력 증진이 관찰되었다 (표 5).
감소된 ACh 반응성을 갖지만 다른 효능제에 대해서는 높은 효력을 갖는 채널을 개발하기 위해, α7G175K-GlyR을, 특이적 효능제의 효력을 증가시키는 추가의 돌연변이와 조합하였다. W77F와의 조합은 ACh 효력을 감소시켰고, α7W77F,G175K-GlyR은 그라니세트론, 노르트로피세트론 및 트로피세트론에 대하여 α7-GlyR에 비해 증가된 효력을 나타냈지만, PNU282-987, 바레니클린, 시티신 또는 PHA-543613에 대해서는 그렇지 않았다 (표 5). G175K와 Q79G의 조합은 ACh 효력을 감소시켰고, α7Q79G,G175K-GlyR은 노르트로피세트론, PHA-543613 및 트로피세트론에 대하여 증가된 효력을 나타내었다 (표 5). 그러나, 이러한 효력 증진이 다른 효능제, 예컨대 PNU282-987 또는 바레니클린에 대해서는 관찰되지 않았다. α7G175K,Q139L-GlyR은 ACh 효력을 감소시켰고, 노르트로피세트론 및 트로피세트론에 대해서는 효력을 증가시켰다 (표 5).
W77F, Q79G, L141F, Y115F, G175K, 및 Y210F에서의 돌연변이를 다양한 조합으로 혼입시킴으로써, 트로판 및 퀴누클리딘 코어 구조에 기초한 것을 포함하는 합성 효능제를 사용한 경우에 높은 효력을 유지하면서 ACh 효력에 있어서의 추가의 감소가 달성되었다. α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR은 트로피세트론에 대한 강력한 반응을 유지하면서 ACh 반응성을 감소시켰다 (표 5). 이들 돌연변이는 또한, α7Y115F,G175K-GlyR과 비교하여, 뿐만 아니라 α7-5HT3 (내인성 α7 nAChR 활성을 대표함)과 비교하여 다른 트로판 및 퀴누클리딘 코어 구조, 특히 퀴누클리딘 티오우레아 702 및 703뿐만 아니라 트로판 에스테르 723, 725, 726, 736, 737, 738, 및 745에 대한 반응성을 증진시켰다 (표 6). α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR은 또한, 이베르멕틴에 대한 높은 감수성을 나타내었다 (표 5). α7W77F,Q79G,G175K-GlyR은 트로피세트론 및 노르트로피세트론에 대한 높은 효력 반응을 유지하면서 ACh 반응성을 감소시켰다 (표 5). α7W77F,Q79G,G175K-GlyR은 또한, 추가의 트로판-기반 코어 구조, 예컨대 화합물 723 및 725, 뿐만 아니라 임상적으로 사용되는 약물 메퀴타진 및 프로마진에 대한 증진된 효력을 나타내었다 (표 6). α7W77F,G175K,Y210F-GlyR은 ACh 반응성을 감소시켰지만, 그라니세트론에 대한 효력은 현저하게 개선시켰다 (표 5). α7L141F,Y115F,G175K-GlyR은 그라니세트론에 대한 감수성을 부여하면서 ACh 반응성을 감소시켰다 (표 5). α7Q79G,Q139L,G175K-GlyR은 ACh 반응성을 감소시켰지만, 노르트로피세트론에 대한 강력한 반응을 나타내었다 (표 5).
표 6. G175K 및 P216I α7GlyR 키메라 채널에 의한 트로판, 퀴누클리딘 효능제, 9-아자비시클로[3.3.1]노난 효능제, 디아자비시클로[3.2.2]노난 효능제, 및 프로마진의 효력 증진. 인돌 및 인다졸 방향족 (A) 치환기는 3-위치에 부착되었다. 단위: μM.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
nd = 결정되지 않음; 괄호: SEM
α7G175K-GlyR 및 α7P216I-GlyR은 Q79G, Y115F, 및 G175K에서의 돌연변이와 함께, 비-회합 돌연변이 R27D,E41R 뿐만 아니라 GlyR IPD 돌연변이 A298G와 또한 양립되었으며, 이는 그라니세트론, 에피바티딘, 바레니클린, 시티신, PNU-282987, 트로피세트론, 노르트로피세트론, 및 PHA-543613에 대한 리간드 효력을 추가로 증진시켰다 (표 7). 비-회합 돌연변이와의 조합으로 α7R27D,E41R,Q79G,Y115F,G175K를 형성하였을 때 낮은 ACh 반응성을 가지면서 702, 723, 725, 및 726에 대한 효력을 추가로 개선시켰다 (표 6).
표 7. α7GlyR 키메라 채널에서의 G175K 및 A298G 돌연변이뿐만 아니라 α7GABAc (또한 GABAA-ρ로 지칭됨) 채널에서의 W298A에 의한 효능제 효력 증진. 단위: μM.
Figure pct00048
nd = 결정되지 않음; 괄호: SEM
α7Y115F -GlyR 키메라 채널 내의 α7 nAChR LBD의 Gly175에서의 추가의 아미노산 치환이 또한 효능제 효력을 증진시켰다. α7Y115F-GlyR 키메라 채널에서의 트로피세트론에 대한 효력은 추가의 돌연변이를 갖는 경우에 증진되었으며, 이는 G175A (7.1배), G175F (2배), G175H (2.3배), G175K (5.6배), G175M (2.6배), G175R (5.8배), G175S (9.3배), G175V (16.7배)를 포함한다.
표 8. α7GlyR Y115F 키메라 채널에서의 G175 돌연변이에 의한 효능제 효력 증진. 단위: μM.
Figure pct00049
nd = 결정되지 않음; 괄호: SEM
Leu131을 더 작은 아미노산으로 돌연변이시키는 것이 정규 효능제 ACh 및 니코틴의 효력을 감소시키는 것으로 밝혀졌지만, 바레니클린, 트로피세트론 및 여러 다른 효능제의 효력은 현저하게 증가시켰다. α7L131A-GlyR 및 α7L131G-GlyR은 ACh 반응성을 감소시켰고 (6배), 바레니클린 (각각 8배 및 17배) 및 트로피세트론 (각각 2.5배 및 3.6배)에 대한 효력을 증진시켰다 (표 9). α7L131G-5HT3 HC는 ACh 반응성을 감소시켰고 (5배), 바레니클린 (16배) 및 트로피세트론 (2.3배)에 대한 효력을 증진시켰다 (도 9a 및 표 9). α7L131G,Q139L-GlyR 및 α7L131G,Y217F-GlyR은 바레니클린에 대해서는 α7-GlyR에 비해 유사한 효력 증진을 나타냈지만 (21배), ACh 감수성은 감소시켰다 (각각 -11배 및 -13배). α7Q79S,L131G-GlyR은 바레니클린 (89배) 및 트로피세트론 (15배)에 대해서 α7-GlyR에 비해 효력을 추가로 개선시켰다. α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR은 바레니클린에 대해서 α7-GlyR에 비해 효력 면에서 가장 큰 개선을 나타냈고 (387배), 또한 감소된 ACh 효력 (13배)을 나타냈다 (도 9b 및 표 9). α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR은 또한, 화합물 770 (0.001 μM), 화합물 773 (0.00034 μM), 및 화합물 774 (0.00013 μM)에 대해서 극도로 높은 효력을 나타냈다 (도 11). α7Q79S,L131G, Q139L-GlyR은 또한, 바레니클린 (31배) 및 트로피세트론 (3배)에 대해서 α7-GlyR에 비해 효력을 개선시켰지만, ACh 효력은 감소시켰다 (9배) (도 9b 및 표 9). α7L131M-GlyR, α7L131Q-GlyR, 및 α7L131V-GlyR은 ACh 효력을 감소시켰지만, 트로피세트론, 노르트로피세트론, PHA-543613, 및 그라니세트론에 대한 효력은 증진시켰다 (표 9). α7L131F-GlyR은 ACh 효력을 실질적으로 감소시킨 것으로 밝혀졌지만, 다른 효능제에 대한 효력은 개선시키지 않았다 (표 8). α7L131G-GABAC는 ACh 효력을 실질적으로 감소시켰지만, 다른 효능제에 대한 효력은 개선시키지 않았다 (표 9). α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC (표 9)는 바레니클린 효력을 a7-5HT3에 비해 131배 만큼 개선시켰다 (표 1). α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC는 또한, 화합물 770 (0.007 μM), 화합물 773 (0.002 μM), 및 화합물 774 (0.004 μM)에 대한 높은 효력을 나타내었다 (표 8).
표 9. L131 돌연변이를 갖는 키메라 채널에 의한 효능제 효력 증진. 단위: μM.
Figure pct00050
nd = 결정되지 않음; 괄호: SEM
실시예 7: 뉴런에서의 키메라 LGIC
α7Q79G-GlyRA298G 또는 α7Q79G,Y115F,G175K-GlyR 키메라 LGIC를 코딩하는 핵산을 함유하는 AAV 또는 DNA 플라스미드를 마우스 피질 뉴런 내로 형질도입하였다. 저 농도의 트로피세트론 (30 nM 또는 100 nM)을 마우스 피질 뉴런에 투여하였다. 뉴런 활성은 저 농도의 효능제의 적용에 의해 침묵되었다 (도 7 및 도 8c).
α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 키메라 LGIC를 코딩하는 핵산을 함유하는 DNA 플라스미드를 마우스 피질 뉴런 내로 형질감염시켰다. 저 농도의 바레니클린 (10 nM)을 마우스 피질 뉴런에 투여하였다. 뉴런 활성은 저 농도의 효능제의 적용에 의해 침묵되었다 (도 9c).
이들 결과는 변형된 LGIC 활성이 뉴런에서 저 농도의 LGIC 리간드 트로피세트론 및 바레니클린을 사용하여 제어될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8: 요법에서의 바레니클린 및 바레니클린 유도체 및 키메라 LGIC
흡연 약물 바레니클린은 강력한 부분 a4b2 효능제이다. 바레니클린은 또한 보통의 a7 nAChR 효능제 및 5HT3에서의 효능제이다. 이는 탁월한 뇌 침투도를 갖는다.
키메라 채널 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 및 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC는 비변형 키메라 채널 α7-GlyR 및 α7-5HT3과 비교하여 리간드 바레니클린에 대한 증진된 효력 결합을 갖는다. 그러나, 바레니클린은 내인성 이온 채널, 예컨대 α7 nACHR, α4β2 nAChR 및 세로토닌 수용체 3 (5HT3-R)을 활성화시키며, 조작된 채널에서 높은 효력을 갖지만 이들 내인성 표적에서는 저하된 효력을 갖는 바레니클린 유도체를 수득하는 것이 바람직하다.
아세틸콜린 결합 단백질에 결합된 바레니클린의 결정 구조를 사용하여, 분자가 a7 nAChR 서열 내의 L131에 상동인 잔기 V106과 접촉하는 것으로 밝혀졌다. L131G에 대한 돌연변이는 Ach 효력을 5배 감소시키면서 바레니클린 효력을 20배 개선시켰다 (도 9a).
추가로 Ach 효력을 감소시키고 바레니클린 효력을 개선시키는 L131G에 대한 추가의 돌연변이를 생성하였다. 대부분의 경우에, 효력의 변화는 두 분자에 대해 관련되었지만, 하위세트의 돌연변이는 선택적으로 바레니클린 효력을 360배 증진시키고 Ach 효력을 20배 감소시켰다 (도 9b 및 9c). 우측에서 300 uM Ach와 비교하여 10 nM 바레니클린에 대한 반응을 관찰할 수 있다 (도 9d). 이들 키메라 채널은 Ach에서 일시적 변동을 위한 저역 통과 필터로서 작용하는 특징적으로 느린 활성화를 나타낸다. 또한, 채널의 높은 효력에도 불구하고, 이들 리간드를 첨가하기 전에 채널 길항제 피크로톡신의 짧은 적용에 의해 나타난 바와 같이, 채널은 어떠한 리간드 독립적 활성도 갖지 않는다는 것을 주목한다. 리간드 독립적 활성은 이러한 트레이스에서 외향 전류로서 등록될 것이다. 키메라 채널이 피질 뉴런에서 발현되었을 때, 10 nM 바레니클린은 초강력한 뉴런 침묵을 유도하였다 (도 9e).
생체내 활성은 또한 일측성 흑색질 (SNr) 침묵 실험에서도 매우 강력하였다. 침묵 SNr에 대한 반대측 회전이 0.1 mg/kg (mpk) 초과의 용량에서 관찰되었다. 항니코틴 활성에 비해 바레니클린 효력의 10배 개선이 관찰되었다 (도 10).
내인성 바레니클린 활성을 감소시키거나 제거하도록 바레니클린 유도체를 조작하였다. 다양한 키메라 채널에 대해 바레니클린 및 각각의 바레니클린 유도체의 효력을 결정하였다 (표 10).
표 10. 키메라 채널에서 바레니클린 및 바레니클린 유도체의 효력 (EC50, μM), 및 5HT3-R 및 α4β2 nAChR에서의 효능제 효력과의 비교.
Figure pct00051
Figure pct00052
nd = 결정되지 않음; 괄호: SEM
표 10은 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대한 높은 효력과 부합되는 치환 패턴을 갖는 LGIC 효능제의 특이적 화학 구조를 보여준다.
표 10 내의 모든 분자는 α7-GlyR 및 α7-5HT3에 대해 감소된 감수성을 나타낸다 (이들은 α7 nAChR 효력에 대한 프록시로서의 역할을 함). 화합물 780, 화합물 783, 화합물 789, 화합물 790, 화합물 791, 화합물 792, 화합물 793, 화합물 795, 화합물 798, 화합물 802, 화합물 803, 화합물 804, 화합물 805, 화합물 807, 화합물 808, 화합물 812 및 화합물 813은 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대해 30 nM 미만의 효력을 나타낸다. 화합물 780, 화합물 783, 화합물 791, 화합물 792, 화합물 793, 화합물 798, 화합물 802, 화합물 803, 화합물 807 또는 화합물 808은 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대해 10 nM 미만의 효력을 나타낸다. 화합물 792, 화합물 795, 화합물 802, 화합물 808은 α7L131G,Q139L,Y217F-GlyR 또는 α7L131G,Q139L,Y217F-5HT3 HC에 대해 10 nM 미만의 효력을 나타내고, 5HT3-R에 대해 >1 μM 및 α4β2 nAChR에 대해 >10 μM의 효력을 나타낸다.
피질 뉴런 활성의 화학유전학적 교란을 평가하였다. 활동 전위 점화는 감소된 입력 저항성 및 상승된 기전류로 인해 강하게 PSAM4-GlyR을 발현하는 뉴런에서 바레니클린에 의해 강하게 억제되었다. 피질 층 2/3 뉴런 막 특성은 PSAM4-GlyR 발현 뉴런 및 혼합된 비형질감염 대조군 뉴런에서 유사하였다. 바레니클린은 PSAM4-5HT3 HC를 발현하는 뉴런을 탈분극시키고 점화를 도출하였다. 피질 층 2/3 뉴런 막 특성은 PSAM4-5HT3 HC 발현 뉴런 및 혼합된 비형질감염 대조군 뉴런에서 유사하였다. 예를 들어, 도 12를 참조한다.
마우스에서 PSAM4-GlyR 뉴런 침묵을 평가하였다. PSAM4-GlyR-IRES-EGFP는 SNr에 대해 일측성으로 표적화였다. 저 용량의 복강내 바레니클린은 PSAM4-GlyR을 발현하는 마우스에 대해 향반 회전을 도출하였지만 모의 작업된 또는 EGFP-단독 발현 마우스에서는 그렇지 않았다. 5시간 떨어진 바레니클린의 2회 용량은 유사한 비율의 총 회전을 제공하였으며, 이는 화학유전학적 반응의 속성내성이 없음을 나타낸다. 화학유전학적 침묵의 지속기간을 각각의 마우스에서 최대 회전에 대해 정규화된 회전 반응의 시간경과에 의해 모니터링하였다. 예를 들어, 도 13을 참조한다.
초강력한 화학유전학적 효능제를 평가하였다. PSAM4 채널 및 내인성 바레니클린 표적에서의 uPSEM 효능제 EC50, 뿐만 아니라 1 μM ACh에서의 α4β2 nAChR에 대한 IC50을 비교하였다. uPSEM792는 α4β2 nAChR의 10% 부분 효능제이고, uPSEM817은 α4β2 nAChR을 억제하였다. uPSEM792, uPSEM793, uPSEM815, 및 uPSEM817은 활동 전위 (기전류)를 점화시키는데 필요한 전류를 감소시킴으로써 PSAM4-GlyR을 발현하는 피질 뉴런에서의 점화를 강하게 억제하였다. 예를 들어, 도 14를 참조한다.
SNr에서 일측성으로 PSAM4-GlyR을 발현하는 마우스에 대한 생체내 uPSEM 용량 반응을 평가하였다. 예를 들어, 도 15를 참조한다.
내인성 바레니클린 활성을 감소시키거나 제거하도록 바레니클린 유도체를 조작하였다. 다양한 키메라 채널에 대해 바레니클린 및 각각의 바레니클린 유도체의 효력을 결정하였다 (표 11).
표 11. 키메라 채널에서의 바레니클린 및 유도체의 EC50MP (μM), 이와 함께 5HT3-R 및 α4β2 nAChR에서의 효능제 효력의 비교. 마우스에서의 SNr 침묵 회전 검정에서 생체내 효력을 결정하였다. nd: 결정되지 않음. nr: 반응 없음. 값은 평균 ± SEM이다.
Figure pct00053
에톡시 및 프로폭시 화합물 (uPSEM) 815 및 817은 PSAM4-GlyR에서 나노몰 미만의 효력을 나타냈다. uPSEM817 효능제 선택성은 탁월하였으며, 이는 α7-GlyR, α7-5HT3 및 5HT3-R에 비해 PSAM4-GlyR에 대해 5,000배 내지 10,000배 선택성을 가졌다. uPSEM815 및 uPSEM817은 30 μM까지 분명한 α4β2 nAChR 효능작용을 나타내지 않았고, uPSEM 815는 5HT3-R에 비해 PSAM4-GlyR에 대해 >2000배 선택성을 가졌다.
실시예 9: 요법에서의 키메라 LGIC
화학유전학적 도구는 조합된 약물 및 유전자 요법에 대한 매력적인 전략을 제공한다. 이는 약물의 투여에 의해 선택적으로 진입되는 외인성으로 전달된 이온 채널의 사용에 의해 동일한 이온 채널 및 리간드를 사용하는 다양한 적응증에서 상이한 세포 유형 전반에 걸쳐 일관된 방식으로 세포 기능이 조정될 수 있기 때문이다. 내약성이 우수하고 임상적으로 사용되는 약물에 의해 게이팅되는 이온 채널의 확인은 화학유전학을 인간의 치료 용도로 잠재적으로 확장시키는데 특히 매력적이다.
약물 트로피세트론의 경우, 본 발명자들은 이것이 11 nM의 EC50으로 α7Q79G-GlyRA298G를 활성화시킨다는 것을 밝혀냈으며, 이는 그의 치료 표적인 5HT3 수용체에 대해 보고된 10 nM 트로피세트론의 IC50과 유사하다 (Combrink et al. 2009 Pharmacological reports: PR 61: 785-97).
다른 실시양태
본 개시내용이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 설명은 본 개시내용을 예시하고자 한 것이고 그의 범주를 제한하지 않으며, 이는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Howard Hughes Medical Institute <120> MODIFIED LIGAND-GATED ION CHANNELS AND METHODS OF USE <130> 30872-0024WO1 <150> US 62/584,428 <151> 2017-11-10 <150> US 62/729,716 <151> 2018-09-11 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 224 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Arg Cys Ser Pro Gly Gly Val Trp Leu Ala Leu Ala Ala Ser Leu 1 5 10 15 Leu His Val Ser Leu Gln Gly Glu Phe Gln Arg Lys Leu Tyr Lys Glu 20 25 30 Leu Val Lys Asn Tyr Asn Pro Leu Glu Arg Pro Val Ala Asn Asp Ser 35 40 45 Gln Pro Leu Thr Val Tyr Phe Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ile Met Asp 50 55 60 Val Asp Glu Lys Asn Gln Val Leu Thr Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met 65 70 75 80 Ser Trp Thr Asp His Tyr Leu Gln Trp Asn Val Ser Glu Tyr Pro Gly 85 90 95 Val Lys Thr Val Arg Phe Pro Asp Gly Gln Ile Trp Lys Pro Asp Ile 100 105 110 Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Asp Glu Arg Phe Asp Ala Thr Phe His Thr 115 120 125 Asn Val Leu Val Asn Ser Ser Gly His Cys Gln Tyr Leu Pro Pro Gly 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Ser Cys Tyr Ile Asp 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cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtttaac attatggcct taggtcactt 180 catctccatg gggttcttct tctgattttc tagaaaatga gatgggggtg cagagagctt 240 cctcagtgac ctgcccaggg tcacatcaga aatgtcagag ctagaacttg aactcagatt 300 actaatctta aattccatgc cttgggggca tgcaagtacg atatacagaa ggagtgaact 360 cattagggca gatgaccaat gagtttagga aagaagagtc cagggcaggg tacatctaca 420 ccacccgccc agccctgggt gagtccagcc acgttcacct cattatagtt gcctctctcc 480 agtcctacct tgacgggaag cacaagcaga aactgggaca ggagccccag gagaccaaat 540 cttcatggtc cctctgggag gatgggtggg gagagctgtg gcagaggcct caggaggggc 600 cctgctgctc agtggtgaca gataggggtg agaaagcaga cagagtcatt ccgtcagcat 660 tctgggtctg tttggtactt cttctcacgc taaggtggcg gtgtgatatg cacaatggct 720 aaaaagcagg gagagctgga aagaaacaag gacagagaca gaggccaagt caaccagacc 780 aattcccaga ggaagcaaag aaaccattac agagactaca agggggaagg gaaggagaga 840 tgaattagct tcccctgtaa accttagaac ccagctgttg ccagggcaac ggggcaatac 900 ctgtctcttc agaggagatg aagttgccag ggtaactaca tcctgtcttt ctcaaggacc 960 atcccagaat gtggcaccca ctagccgtta ccatagcaac tgcctctttg ccccacttaa 1020 tcccatcccg tctgttaaaa gggccctata gttggaggtg ggggaggtag gaagagcgat 1080 gatcacttgt ggactaagtt tgttcgcatc cccttctcca accccctcag tacatcaccc 1140 tgggggaaca gggtccactt gctcctgggc ccacacagtc ctgcagtatt gtgtatataa 1200 ggccagggca aagaggagca ggttttaaag tgaaaggcag gcaggtgttg gggaggcagt 1260 taccggggca acgggaacag ggcgtttcgg aggtggttgc catggggacc tggatgctga 1320 cgaaggctcg cgaggctgtg agcagccaca gtgccctgct cagaagcccc aagctcgtca 1380 gtcaagccgg ttctccgttt gcactcagga gcacgggcag gcgagtggcc cctagttctg 1440 ggggcagctc tagagcggta ccggatccag gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa 1500 ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca 1560 cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca caggtgatga attcgctagc 1620 gccaccatgc gctgttctcc aggcggcgtg tggctcgccc tggctgcttc ccttctgcac 1680 gttagcctgc agggtgagtt ccagcgcaaa ctgtataagg agcttgttaa gaattataac 1740 cccctggagc ggccggtcgc aaatgattcc cagccactga cagtgtactt cagcctctcc 1800 ttgctgcaga tcatggacgt ggatgaaaag aaccaggtgc tgaccactaa tatttggttg 1860 cagatgtcct ggaccgatca ctacttgcag tggaatgtga gcgaataccc aggtgtaaag 1920 actgtaagat tccctgacgg ccaaatctgg aaaccagata tcctgctgta caacagcgca 1980 gacgaaaggt ttgatgcaac atttcacacc aacgtgggag tcaattcttc aggccactgc 2040 ctgtacctgc cccctggaat cttcaagtcc tcatgctata tcgacgtccg ctggtttccc 2100 ttcgacgtcc agcactgcaa actcaaattc gggagctgga gctacggcgg atggagcctg 2160 gatctgcaaa tgcaggaggc tgacatctct ggttacatcc cgaatgggga gtgggacctt 2220 gtgggaatcc ccggtaaaag aagcgagcga ttttatgaat gctgcaaaga gcccttccca 2280 gatgtcacct tcacagtgac catgcggaga cgcatgggtt attatctgat ccaaatgtat 2340 atcccaagct tgcttatagt gattttgtca tggatctcct tctggattaa tatggacgcc 2400 gctccagcta gggtcggact gggcatcacc acagtgctga caatgactac tcagagctca 2460 ggcagccgag ccagcttgcc caaggtttct tacgtgaagg ccatcgatat ctggatggct 2520 gtctgccttc tgtttgtctt cagcgcactg ctggaatacg ccgctgtcaa ttttgtgtct 2580 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tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc 3480 ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc 3540 atgggagatc cggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 3600 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 3660 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 3720 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 3780 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 3840 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 3900 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 3960 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 4020 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 4080 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 4140 gacaaccact acctgagcac ccagtccaag ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 4200 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 4260 tacaagtaaa ccggtgtcga caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 4320 gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 4380 ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 4440 aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 4500 gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 4560 ctcctttccg gaactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 4620 tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 4680 tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 4740 gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 4800 ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 4860 tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgagcgctgc tcgagagatc tacgggtggc 4920 atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca 4980 ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata 5040 atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta 5100 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agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat 6000 ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 6060 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca 6120 atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 6180 ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 6240 agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 6300 gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 6360 ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 6420 aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 6480 aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 6540 cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 6600 ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 6660 cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 6720 ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 6780 gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 6840 gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 6900 acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 6960 cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 7020 acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 7080 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 7140 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 7200 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 7260 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 7320 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 7380 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 7440 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 7500 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 7560 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 7620 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Claims (160)

  1. 아미노산 변형을 포함하는 리간드 결합 도메인 (LBD), 및
    이온 포어 도메인 (IPD)
    을 포함하는 적어도 1개의 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC.
  2. 제1항에 있어서, 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 포함하는 키메라 LGIC인 변형된 LGIC.
  3. 제1항에 있어서, LBD가 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD인 변형된 LGIC.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산 변형이 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  5. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 77에서 이루어지고, 아미노산 치환이 W77F 및 W77Y로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  6. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 79에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Q79A, Q79G 및 Q79S로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  7. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 115에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y115F 치환인 변형된 LGIC.
  8. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 131에서 이루어지고, 아미노산 치환이 L131A, L131G, L131M 및 L131N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  9. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 139에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Q139G 및 Q139L로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  10. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 175에서 이루어지고, 아미노산 치환이 G175A, G175F, G175H, G175K, G175M, G175R, G175S 및 G175V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  11. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 210에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y210F 치환인 변형된 LGIC.
  12. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 216에서 이루어지고, 아미노산 치환이 P216I 치환인 변형된 LGIC.
  13. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 217에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y217F 치환인 변형된 LGIC.
  14. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 219에서 이루어지고, 아미노산 치환이 D219A 치환인 변형된 LGIC.
  15. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 L131G 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환 및 Y217F 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  16. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 L131M 아미노산 치환 및 Y115F 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  17. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 W77F 아미노산 치환, Q79G 아미노산 치환 및 G175K 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  18. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 Q79G 아미노산 치환, Y115F 아미노산 치환 및 G175K 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  19. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 Y115F 아미노산 치환 및 G175K 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  20. 제4항에 있어서, α7-nAChR LBD가 Q79G 아미노산 치환 및 216I 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  21. 제1항에 있어서, IPD가 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, 감마-아미노부티르산 (GABA) 수용체 IPD 및 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) IPD로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체로부터의 IPD인 변형된 LGIC.
  22. 제21항에 있어서, IPD가 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  23. 제22항에 있어서, IPD가 GlyR IPD이고, 아미노산 치환이 A298G 치환인 변형된 LGIC.
  24. 제22항에 있어서, IPD가 GABA IPD이고, 아미노산 치환이 W298A 치환인 변형된 LGIC.
  25. 제1항에 있어서, 외인성 LGIC 리간드가 변형된 LGIC를 활성화시키고, 외인성 LGIC 리간드가 퀴누클리딘, 트로판, 9-아자비시클로[3.3.1]노난, 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀 및 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 외인성 LGIC 리간드인 변형된 LGIC.
  26. 제25항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 트로판이고, 여기서 트로판은 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 723, 화합물 725, 화합물 737 및 화합물 745로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  27. 제25항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 퀴누클리딘이고, 여기서 퀴누클리딘은 PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0456, 화합물 0434, 화합물 0436, 화합물 0354, 화합물 0353, 화합물 0295, 화합물 0296, 화합물 0536, 화합물 0676 및 화합물 702로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  28. 제25항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 9-아자비시클로[3.3.1]노난이고, 여기서 9-아자비시클로[3.3.1]노난은 화합물 536인 변형된 LGIC.
  29. 제25항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀이고, 여기서 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀은 바레니클린, 화합물 765 및 화합물 770으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  30. 제25항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난이고, 여기서 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난은 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 773 및 화합물 774로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 변형된 LGIC.
  31. 제1항에 있어서, LBD가 α7-nAChR LBD이고, 여기서 α7-nAChR LBD는 비변형 LGIC에 대한 결합에 비해 적어도 1개의 변형된 아미노산을 갖는 또 다른 α7-nAChR LBD에 대한 선택적 결합을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 추가로 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  32. 제31항에 있어서, 비변형 LGIC가 내인성 LGIC인 변형된 LGIC.
  33. 제32항에 있어서, 내인성 LGIC가 내인성 α7-nAChR인 변형된 LGIC.
  34. 제31항에 있어서, 선택적 결합을 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산이 α7-nAChR LBD의 잔기 27 및/또는 잔기 41의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  35. 제34항에 있어서, 적어도 1개의 변형된 아미노산이 R27D 치환 및/또는 E41R 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  36. 제1항에 있어서, IPD가 뮤린 5HT3 IPD이고, 여기서 뮤린 5HT3 IPD는 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 추가로 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  37. 제36항에 있어서, 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 뮤린 5HT3 IPD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산이 뮤린 5HT3 IPD의 잔기 425, 429 및/또는 433의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  38. 제37항에 있어서, 적어도 1개의 변형된 아미노산이 R425Q 치환, R429D 치환 및/또는 R433A 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  39. 제1항에 있어서, IPD가 인간 5HT3 IPD이고, 여기서 인간 5HT3 IPD는 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 적어도 1개의 변형된 아미노산을 추가로 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  40. 제39항에 있어서, 변형된 LGIC에 증가된 이온 전도도를 부여하는 인간 5HT3 IPD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산이 인간 5HT3 IPD의 잔기 420, 424 및/또는 428의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  41. 제40항에 있어서, 적어도 1개의 변형된 아미노산이 R420Q 치환, R424D 치환 및/또는 R428A 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  42. 제1항에 있어서, LBD가 내인성 LGIC 리간드와의 감소된 결합을 갖는 것인 변형된 LGIC.
  43. 제42항에 있어서, 내인성 LGIC 리간드가 아세틸콜린 (ACh)인 변형된 LGIC.
  44. 제43항에 있어서, ACh에 대한 20 μM 초과의 EC50을 갖는 변형된 LGIC.
  45. 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대한 증가된 효력을 가지며, 화학식 I을 포함하는 리간드.
    Figure pct00054

    여기서
    X1, X2 및 X3은 각각 독립적으로 CH, CH2, O, NH 또는 NMe이고;
    각각의 n은 독립적으로 0 또는 1이고;
    Y = O 또는 S이고;
    A = 방향족 치환기이고;
    R = H 또는 피리디닐메틸렌이다.
  46. 제45항에 있어서, 방향족 치환기가 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산 및 4-클로로-벤젠으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  47. 제45항에 있어서, 화학식 II를 갖는 퀴누클리딘인 리간드.
    Figure pct00055

    여기서
    X3 = O, NH 또는 CH2이고;
    Y = O 또는 S이고;
    A = 방향족 치환기이고;
    R = H 또는 피리디닐메틸렌이다.
  48. 제47항에 있어서, 방향족 치환기가 1H-인돌, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로 벤젠, 2,5-디메톡시 벤젠, 4-(트리플루오로메틸) 벤젠, 4-클로로아닐린, 아닐린, 5-(트리플루오로메틸) 피리딘-2-일, 6-(트리플루오로메틸) 니코틴산, 3-클로로-4-플루오로 벤젠 및 1H-인돌로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  49. 제47항에 있어서, 퀴누클리딘이 PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0456, 화합물 0434, 화합물 0436, 화합물 0354, 화합물 0353, 화합물 0295, 화합물 0296, 화합물 0536, 화합물 0676 및 화합물 702로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  50. 제45항에 있어서, 화학식 III을 갖는 트로판인 리간드.
    Figure pct00056

    여기서
    X2 = NH 또는 NMe이고;
    X3 = O, NH 또는 CH2이고;
    Y = O 또는 S이고;
    A = 방향족 치환기이다.
  51. 제50항에 있어서, 방향족 치환기가 1H-인돌, 1H-인다졸, 7-메톡시-1H-인돌, 7-메틸-1H-인돌 및 5-클로로-1H-인돌로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  52. 제50항에 있어서, 트로판이 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 723, 화합물 725, 화합물 737 및 화합물 745로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  53. 제45항에 있어서, 화학식 IV를 갖는 9-아자비시클로[3.3.1]노난인 리간드.
    Figure pct00057

    여기서
    X2 = NH 또는 NMe이고;
    X3 = O, NH 또는 CH이고;
    Y = O 또는 S이고;
    A = 방향족 치환기이다.
  54. 제53항에 있어서, 방향족 치환기가 4-클로로-벤젠, 1H-인돌, 1H-인다졸, 7-메톡시-1H-인다졸로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  55. 제54항에 있어서, 9-아자비시클로[3.3.1]노난이 화합물 0536, 화합물 0749, 화합물 0751, 화합물 0760 및 화합물 0763으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  56. 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대한 증가된 효력을 가지며, 화학식 V를 포함하는 리간드.
    Figure pct00058

    여기서
    R1 = H, 페닐, 2-톨루일; 3-피리딜; 4-피리딜; 트리플루오로메틸; 메톡시; 에톡시; 프로폭시, 이소프로폭시; N,N-디메틸아미노; N,N-디에틸아미노; 이미다졸, 피롤, 피라졸, 트리아졸 또는 이속사졸-3-아민이고;
    R2 = H, 메틸 또는 페닐이다.
  57. 제56항에 있어서, 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀이 화합물 0765, 화합물 0770, 화합물 0780, 화합물 0782, 화합물 0785, 화합물 0788, 화합물 0782, 화합물 0789, 화합물 0791, 화합물 0793, 화합물 0794, 화합물 0795, 화합물 0798, 화합물 0799, 화합물 0800, 화합물 0801, 화합물 0802, 화합물 0803, 화합물 0804, 화합물 0805, 화합물 0807, 화합물 0808, 화합물 0812, 화합물 0813, 화합물 815, 화합물 816 및 화합물 817로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  58. 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대한 증가된 효력을 가지며, 화학식 VII을 포함하는 리간드.
    Figure pct00059

    여기서
    R = H, F 또는 NO2이다.
  59. 제58항에 있어서, 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난이 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 0773 및 화합물 0774로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  60. 포유동물 내의 세포에 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)을 투여하는 단계이며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하고, 상기 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하고, 상기 변형된 LGIC 서브유닛은
    적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 리간드 결합 도메인, 및
    이온 포어 도메인
    을 포함하는 것인 단계; 및
    포유동물에게 외인성 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물에서 채널병증을 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 채널병증이 바터 증후군, 브루가다 증후군, 카테콜아민성 다형성 심실성 빈맥 (CPVT), 선천성 고인슐린증, 낭성 섬유증, 드라베 증후군, 간헐성 운동실조증, 지단홍통증, 전신 간질 (예를 들어, 열성 발작을 동반함), 가족성 편마비성 편두통, 섬유근육통, 고칼륨혈성 주기성 마비, 저칼륨혈성 주기성 마비, 램버트-이튼 근무력 증후군, 긴 QT 증후군 (예를 들어, 로마노-워드 증후군), 짧은 QT 증후군, 악성 고열, 점액지질증 유형 IV, 중증 근무력증, 선천성 근긴장증, 시신경척수염, 신경근긴장증, 비증후군성 난청, 선천성 이상근긴장증, 색소성 망막염, 티모시 증후군, 이명, 발작, 삼차 신경통 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  62. 포유동물 세포에 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)을 투여하는 단계이며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하고, 상기 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하고, 상기 변형된 LGIC 서브유닛은
    적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 리간드 결합 도메인, 및
    이온 포어 도메인
    을 포함하는 것인 단계; 및
    포유동물에게 외인성 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 세포의 세포 막을 가로지르는 이온 수송을 조정하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 조정하는 것이 이온 수송을 활성화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 조정하는 것이 이온 수송을 억제하는 것을 포함하는 것인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 세포가 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포 및 면역 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  66. 제62항에 있어서, 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체내 투여를 포함하는 것인 방법.
  67. 제62항에 있어서, 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체외 투여를 포함하는 것인 방법.
  68. 포유동물 내의 세포에 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)을 투여하는 단계이며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하고, 상기 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하고, 상기 변형된 LGIC 서브유닛은
    적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 리간드 결합 도메인, 및
    이온 포어 도메인
    을 포함하는 것인 단계; 및
    포유동물에게 외인성 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 조정하는 것이 세포의 흥분성을 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 조정하는 것이 세포의 흥분성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  71. 제68항에 있어서, 세포가 흥분성 세포인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 세포가 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포 및 면역 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  73. 제68항에 있어서, 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체내 투여를 포함하는 것인 방법.
  74. 제68항에 있어서, 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체외 투여를 포함하는 것인 방법.
  75. 포유동물 내의 세포에 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)을 투여하는 단계이며, 여기서 외인성 LGIC 리간드는 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하고, 상기 변형된 LGIC는 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하고, 상기 변형된 LGIC 서브유닛은
    적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 리간드 결합 도메인, 및
    이온 포어 도메인
    을 포함하는 것인 단계; 및
    포유동물에게 외인성 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 내의 세포의 활성을 조정하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 조정하는 것이 세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 조정하는 것이 세포의 활성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  78. 제75항에 있어서, 활성이 이온 수송, 수동 수송, 흥분, 억제 및 세포외유출로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  79. 제75항에 있어서, 세포가 뉴런, 신경교 세포, 근세포, 줄기 세포, 내분비 세포 및 면역 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  80. 제75항에 있어서, 포유동물로부터의 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체내 투여를 포함하는 것인 방법.
  81. 제75항에 있어서, 포유동물로부터의 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 생체외 투여를 포함하는 것인 방법.
  82. 제60항, 제62항, 제68항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 LGIC가 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 포함하는 키메라 LGIC인 변형된 LGIC.
  83. 제82항에 있어서, 키메라 LGIC가 동형체성(homomeric) 키메라 LGIC인 방법.
  84. 제60항, 제62항, 제68항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 변형된 LGIC를 투여하는 것이 변형된 LGIC를 코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 변형된 LGIC가 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 10에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 변형된 LGIC가 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 10에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 변형된 LGIC가 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 변형된 LGIC가 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 10에 제시된 서열을 포함하는 것인 방법.
  89. 제60항, 제62항, 제68항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, LBD가 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD인 방법.
  90. 제89항에 있어서, α7-nAChR LBD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산이 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 77에서 이루어지고, 아미노산 치환이 W77F 및 W77Y로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  92. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 79에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Q79A, Q79G 및 Q79S로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  93. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 115에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y115F 치환인 방법.
  94. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 131에서 이루어지고, 아미노산 치환이 L131A, L131G, L131M 및 L131N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  95. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 139에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Q139G 또는 Q139L 치환인 방법.
  96. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 175에서 이루어지고, 아미노산 치환이 G175A, G175F, G175H, G175K, G175M, G175R, G175S 및 G175V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  97. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 210에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y210F 치환인 방법.
  98. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 216에서 이루어지고, 아미노산 치환이 P216I인 방법.
  99. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 217에서 이루어지고, 아미노산 치환이 Y217F인 방법.
  100. 제90항에 있어서, 아미노산 치환이 α7-nAChR LBD의 잔기 219에서 이루어지고, 아미노산 치환이 D219A인 방법.
  101. 제60항, 제62항, 제68항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, IPD가 적어도 1개의 변형된 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, IPD가 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, GABA 수용체 IPD 및 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) IPD로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  103. 제102항에 있어서, IPD가 GlyR IPD이고, 적어도 1개의 변형된 아미노산이 변형된 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 변형된 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환이 A298G 치환인 방법.
  105. 제102항에 있어서, IPD가 GABA IPD이고, 여기서 GABA IPD 내의 적어도 1개의 변형된 아미노산은 변형된 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  106. 제105항에 있어서, 키메라 LGIC의 잔기 298에서의 아미노산 치환이 W298A 치환인 변형된 LGIC.
  107. 제60항, 제62항, 제68항 및 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 LGIC 리간드가 합성 외인성 LGIC 리간드인 변형된 LGIC.
  108. 제107항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 트로판, 퀴누클리딘, 9-아자비시클로[3.3.1]노난, 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난 및 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 트로판이고, 여기서 트로판은 트로피세트론, 슈도-트로피세트론, 노르트로피세트론, 화합물 723, 화합물 725, 화합물 737 및 화합물 745로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  110. 제108항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 퀴누클리딘이고, 여기서 퀴누클리딘은 PNU-282987, PHA-543613, 화합물 0456, 화합물 0434, 화합물 0436, 화합물 0354, 화합물 0353, 화합물 0295, 화합물 0296, 화합물 0536, 화합물 0676 및 화합물 702로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  111. 제108항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 9-아자비시클로[3.3.1]노난이고, 여기서 9-아자비시클로[3.3.1]노난은 화합물 0536, 화합물 0749, 화합물 0751, 화합물 0760 및 화합물 0763으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  112. 제108항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난이고, 여기서 1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난은 3-(1,4-디아자비시클로[3.2.2]노난-4-일)디벤조[b,d]티오펜 5,5-디옥시드, 화합물 0773 및 화합물 0774의 군으로부터 선택된 것인 방법.
  113. 제108항에 있어서, 합성 외인성 LGIC 리간드가 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀이고, 여기서 6,7,8,9-테트라히드로-6,10-메타노-6H-피라지노(2,3-h)벤즈아제핀은 바레니클린, 화합물 0765 및 화합물 0770으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  114. 제1항의 변형된 리간드-게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대한 1종 이상의 후보 리간드를 제공하는 단계; 및
    후보 리간드와 변형된 LGIC 사이의 결합을 검출하여, 그에 의해 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 리간드를 확인하는 단계
    를 포함하는, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 리간드를 확인하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 변형된 LGIC가 제1 LGIC로부터의 LBD 및 제2 LGIC로부터의 IPD를 포함하는 키메라 LGIC인 방법.
  116. 제1항의 1개 이상의 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 서브유닛을 제공하는 단계;
    변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제를 제공하는 단계; 및
    변형된 LGIC와 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제 사이의 결합을 검출하여, 그에 의해 변형된 LGIC를 검출하는 단계
    를 포함하는, 적어도 1개의 변형된 LGIC 서브유닛을 포함하는 변형된 LGIC를 검출하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제가 항체, 단백질 또는 소분자를 포함하는 것인 방법.
  118. 제117항에 있어서, 변형된 LGIC에 선택적으로 결합하는 작용제가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 검출가능한 표지가 형광 표지, 방사성 표지 및 양전자 방출 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 표지를 포함하는 것인 방법.
  120. 제1항의 변형된 LGIC를 포함하는 포유동물 세포.
  121. 제1항의 변형된 LGIC 서브유닛을 발현하는 핵산.
  122. 키메라 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 서브유닛을 포함하는 동형체성 키메라 LGIC이며, 각각의 키메라 LGIC 서브유닛은
    Q79G 아미노산 치환을 갖고, W77F 아미노산 치환, Q139G 아미노산 치환, Y115F 아미노산 치환, G175K 아미노산 치환, Y210F 아미노산 치환, P216I 아미노산 치환, R27D 아미노산 치환 및 E41R 아미노산 치환 중 적어도 1개를 갖는 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 리간드 결합 도메인; 및
    글리신 수용체 이온 포어 도메인
    을 포함하고;
    여기서 트로피세트론 및 그라니세트론으로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드는 키메라 LGIC에 선택적으로 결합하고, 키메라 LGIC는 아세틸콜린 (ACh)에 최소한으로 결합하는 것인 동형체성 키메라 LGIC.
  123. 키메라 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC) 서브유닛을 포함하는 동형체성 키메라 LGIC이며, 각각의 키메라 LGIC 서브유닛은
    L131G 아미노산 치환을 갖고, Q79S 아미노산 치환, Q139L 아미노산 치환, Y217F 아미노산 치환, R27D 아미노산 치환 및 E41R 아미노산 치환 중 적어도 1개를 갖는 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 리간드 결합 도메인; 및
    글리신 수용체 이온 포어 도메인 및 세로토닌 3 수용체 이온 포어 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온 포어 도메인
    을 포함하고;
    여기서 바레니클린 및 트로피세트론으로 이루어진 군으로부터 선택된 리간드는 키메라 LGIC에 선택적으로 결합하고, 키메라 LGIC는 아세틸콜린 (ACh)에 최소한으로 결합하는 것인 동형체성 키메라 LGIC.
  124. 포유동물 내의 세포에 제122항 또는 제123항의 LGIC를 투여하는 단계; 및
    포유동물에게 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물에서 채널병증을 치료하는 방법.
  125. 포유동물 내의 세포에 제122항 또는 제123항의 LGIC를 투여하는 단계; 및
    포유동물에게 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 내의 세포의 흥분성을 조정하는 방법.
  126. 포유동물 내의 세포에 제122항 또는 제123항의 LGIC를 투여하는 단계; 및
    포유동물에게 리간드를 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물 내의 세포의 활성을 조정하는 방법.
  127. 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대해 증가된 효력을 가지며, 화학식 VI을 포함하는 리간드.
    Figure pct00060

    여기서
    R1 = H 또는 CH3이고;
    R2 = H, CH3 또는 방향족 치환기이고;
    R3 = O 또는 S이다.
  128. 제127항에 있어서, 7,8,9,10-테트라히드로-1H-6,10-메타노아제피노[4,5-g]퀴녹살린-2(6H)-온이 화합물 0783, 화합물 0784, 화합물 0790 및 화합물 0792로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리간드.
  129. 변형된 리간드 게이팅 이온 채널 (LGIC)에 대해 증가된 효력을 가지며, 2-(피리딘-3-일)-1,5,6,7,8,9-헥사히드로-5,9-메타노이미다조[4',5':4,5]벤조[1,2-d]아제핀 (화합물 0786)을 포함하는 리간드.
    Figure pct00061
  130. 제15항에 있어서, 변형된 LGIC가 내형질 세망 유출 서열을 추가로 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  131. 제130항에 있어서, 내형질 세망 유출 서열이 아미노산 서열 FCYENEV (서열식별번호: 16)를 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  132. 제131항에 있어서, 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 LGIC.
  133. 제15항에 있어서, CHRNB4 신호 서열을 추가로 포함하는 변형된 LGIC.
  134. 제133항에 있어서, CHRNB4 신호 서열이 아미노산 서열 MRRAPSLVLFFLVALCGRGNC (서열식별번호: 17)를 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  135. 제134항에 있어서, 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 LGIC.
  136. 제15항에 있어서, KCNB1 체세포 표적화 서열을 추가로 포함하는 변형된 LGIC.
  137. 제136항에 있어서, KCNB1 체세포 표적화 서열이 아미노산 서열 QSQPILNTKEMAPQSKPPEELEMSSMPSPVAPLPARTEGVIDMRSMSSIDSFISCATDFPEATRF (서열식별번호: 18)를 포함하는 것인 변형된 LGIC.
  138. 제137항에 있어서, 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 LGIC.
  139. 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물.
  140. 제139항에 있어서, 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 아미노산 변형을 포함하는 리간드 결합 도메인 (LBD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  141. 제140항에 있어서, LBD가 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD이고, 변형된 LBD가 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  142. 제139항에 있어서, 서열식별번호: 27에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 이온 포어 도메인 (IPD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  143. 제142항에 있어서, IPD가 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, 감마-아미노부티르산 (GABA) 수용체 IPD 및 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) IPD로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체로부터의 IPD인 합성 핵산 구축물.
  144. 제143항에 있어서, IPD가 5HT3 IPD인 합성 핵산 구축물.
  145. 서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물.
  146. 제145항에 있어서, 서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 아미노산 변형을 포함하는 리간드 결합 도메인 (LBD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  147. 제146항에 있어서, LBD가 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD이고, 변형된 LBD가 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  148. 제145항에 있어서, 서열식별번호: 28에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 이온 포어 도메인 (IPD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  149. 제148항에 있어서, IPD가 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, 감마-아미노부티르산 (GABA) 수용체 IPD 및 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) IPD로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체로부터의 IPD인 합성 핵산 구축물.
  150. 제149항에 있어서, IPD가 GlyR IPD이고, 여기서 상기 GlyR IPD는 아미노산 변형을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  151. 제150항에 있어서, 변형된 GlyR IPD가 GlyR IPD의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  152. 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물.
  153. 제152항에 있어서, 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 아미노산 변형을 포함하는 리간드 결합 도메인 (LBD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  154. 제153항에 있어서, LBD가 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) LBD이고, 변형된 LBD가 α7-nAChR LBD의 잔기 77, 79, 115, 131, 139, 141, 175, 210, 216, 217 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  155. 제152항에 있어서, 서열식별번호: 29에 제시된 서열에 대해 적어도 75 퍼센트 서열 동일성을 갖는 상기 핵산 서열이 이온 포어 도메인 (IPD)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  156. 제155항에 있어서, IPD가 세로토닌 3 수용체 (5HT3) IPD, 글리신 수용체 (GlyR) IPD, 감마-아미노부티르산 (GABA) 수용체 IPD 및 알파7 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (α7-nAChR) IPD로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체로부터의 IPD인 합성 핵산 구축물.
  157. 제156항에 있어서, IPD가 GABA IPD이고, 여기서 상기 GABA IPD는 아미노산 변형을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  158. 제157항에 있어서, 변형된 GABA IPD가 GABA IPD의 아미노산 잔기 298에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인 합성 핵산 구축물.
  159. 서열식별번호: 33에 제시된 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물.
  160. 서열식별번호: 34에 제시된 서열을 포함하는 합성 핵산 구축물.
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