KR20200088061A - 혈관형성을조절하는인테그린에대한키메라성및인간화항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 α5β1 인테그린을 특이적으로 인식하는 키메라성 및 인간화 항체, 및 조직내서 혈관형성을 감소시키거나 저해 하기 위해 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 항체 및 그 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물의 치료상 허용가능
한 투여량을 결정하는 방법이 제공된다.

Description

혈관형성을조절하는인테그린에대한키메라성및인간화항체{Chimeric and humanized}

본 발명은 α5β1 인테그린을 특이적으로 인식하는 키메라성 및 인간화 항체, 그리고 조직 내 혈관형성을 감소 또는 저해하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 항체의 치료학적으로 허용가능한 투여량을 결정하는 방법,그리고 그를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

혈관형성 (angiogenesis)은 그것에 의해 새로운 혈관이 형성되는 공정이다. 혈관신생 (neovascularization)이라고도 불리는 혈관형성은 통상적으로 배아발생 및 발달과정 동안 일어나고, 상처 치료 및 태반 발달과정 동안에는 완전히 발달된

유기체에서 일어난다. 게다가, 혈관형성은 혈관신생으로 인한 당뇨 망막병증 (diabetic retinopathy) 및 황반변성(macular degeneration)과 같은 안구 질환; 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환과 같은 조직 염증 관련 조건; 그리고 성장

종양 내 혈관 형성이 신체 구석구석까지 종양 세포가 전이하는 경로를 제공할 뿐 아니라 종양 세포에 산소와 영양분을 제공하는, 암을 포함한 다양한 병적 조건에서 일어난다. 전세계 수 백만명의 사람들이 이들 질병으로 고생하고 있기 때문에,

상기 바람직하지 않은 혈관형성을 탐지하고 저해하는 방법들을 개발하기 위해 혈관형성과 관련된 메커니즘을 이해하는데 상당한 노력이 기울여져 왔다.

혈관형성은 하나 이상의 알려진 성장 인자들에 의한 자극에 대해 반응하여 일어나고, 또한 아직 특정되지 않은 인자들로서 다른 것과 관련할 수도 있다. 성숙 혈관에 정렬하고 있는 세포인 내피세포는 통상 증식하지 않는다. 그러나, 적절한 자

극에 반응하여, 내피세포가 활성화되고 증식하기 시작하며 미혈관 조직(unvascularized tissue)으로 이동하여 새로운 혈관을 형성한다. 어떠한 경우에는, 전구 세포가 활성화되어 새로운 혈관을 형성하는 내피세포로 분화된다.

혈관은 세포외 기질에 의해 둘러싸여 있다. 성장 인자들에 의한 자극 외에, 혈관형성은 내피세포 상호간 뿐 아니라 상기 세포외 기질과의 상호작용에 의존한다. 성장 인자들에 의한 내피세포의 활성화, 세포외 기질로의 이동, 그리고 세포외 기

질 및 내피세포간의 상호작용은 내피세포에 의해 발현되는 세포 표면 수용체에 의존한다. 성장 인자 수용체 및 인테그린을포함하는 이들 세포 표면 수용체는 특정 분자들과 특이적으로 상호작용한다.

연령-관련 황반 변성 및 당뇨 망막병증과 같은 병적 조건에서, 망막에 대한 산소 유용성의 감소는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 혈관형성 성장 인자의 분비를 자극하는 저산소 조건을 유발한다. 이러한 분비는 내피세포의 안구 조직으로의 비정상적 이동과 증식을 유도한다. 이로 인해 안구 조직의 혈관형성이 나타나고, 각각이 시력에 좋지 않은 영향을 미치고 실명에 이를 수 있는 각막 반흔, 망막 박리 및 맥락막 내 체액 축적을 유도할 수 있다.

혈관형성은 또한 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 그리고 궤양성 대장염 및 크론 병 (Crohn's disease)과 같은 염증성장 질환을 포함하는 염증 질환의 진행 및 악화와 관련이 있다. 염증성 관절염 질환에서, 예를 들면 관절을 둘러싸고 있는

부위로의 림프구 유입은 윤활 내층 (synovial lining)에서 혈관형성을 자극한다. 이와 같이 증가된 혈관구조는 관절 내 연골 및 뼈의 파괴를 촉진하는 백혈구의 보다 큰 유입을 위한 수단을 제공한다. 염증성 장 질환에서 발생하는 혈관형성은 장

에 유사한 영향을 미친다.

심장 동맥 내 죽상경화판 (atherosclerotic plaque)으로의 모세혈관의 성장은 성장인자 유도 혈관형성과 관련된 또 다른 병적 조건을 제시한다. 혈관신생 판으로의 과다한 혈류량으로 인해 피로 채워진 판의 파열과 출혈이 나타날 수 있고, 응혈

(blood clot)을 방출하여 심근경색에 이를 수 있다.

암, 안구 질환 및 염증성 질환과 같은 다양한 질환들에서 혈관형성의 관여는 이들 질병을 치료하는 수단으로서 혈관형성을 특이적으로 저해하기 위한 방법을 규명하는 노력을 이끌어내고 있다. 암 환자들에게, 표적 종양 세포 뿐 아니라 환자 내

에서 정상적으로 증식하는 세포, 예를 들면 혈액세포, 상피세포, 및 소장강 (intestinal lumen) 세포내층에 손상을 주거나 죽이는 현재 사용되는 화학치료와 같은 방법들에 대하여 상기 치료방법은 실질적인 이점을 제공할 수 있다. 화학치료제에 의한 상기 비특이적 죽임은 잘해도 좋지 않은 부작용을 보이고, 종종 받아들일 수 없는 환자 발병률 또는 사망률을 이르게 할 수 있다. 사실, 암 치료와 관련된 바람직하지 않은 부작용들은 종종 환자가 받을 수 있는 치료에 제한을 가한다.

본 발명은 기존의 항-α5β1 인테그린 항체에 대하여 개선된 특성을 갖는 키메라성 및 인간화 항-α5β1 인테그린 항체들을 제공한다. 본 발명은 또한 신규한 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 혈관형성에 의해 악화된 조직에 대한 질병 상태

나 손상을 치료하기 위한 개선된 방법을 제공한다.

본 발명의 키메라성 및 인간화 항체는 기존의 형태보다 보다 긴 반감기를 가지며, 인간에 투여시 덜 항원성을 나타낸다.

상기 개선은 도 2 에서 도식적으로 묘사되어 있으며, 뮤린 항-α5β1 인테그린 (ⅡA1) 항체의 골격 및 불변부위를 변경하여 이를 인간화하는 것을 포함한다.

인간화 항체는 통상 인간 치료에 사용되는데 3 가지 이상의 잠재적인 장점을 갖는다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예컨대, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 에 의하여 목

적 세포를 보다 효율적으로 파괴한다. 둘째로, 인간 면역 체계는 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않아야 한다. 셋째로, 더 적고, 보다 적은 빈도의 약을 투여 하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사할 것이다.

구조상, 인간화 항체는 통상 인간 기원의 불변부위 및 골격부위 (FR), 및 항-α5β1 인테그린 항체를 생성하는 동물의 항체로부터 유래된 상보적 도메인 부위 (CDRs) 를 갖는다.

구조상, 키메라성 항체는 항-α5β1 인테그린 항체를 생성하는 동물의 항원으로부터 유래된 가변-사슬 부위, 및 인간 유래의 불변 사슬을 갖는다.

기능상, 키메라성 및 인간화 항-α5β1 인테그린 항체 모두는 α5β1 인테그린을 특이적으로 인식하고, α5β1 인테그린이 그의 수용체와 상호작용하는 것을 방해한다.

인간화 및 키메라성 항-α5β1 인테그린 항체를 제조하기 위한 다양한 방법이 본원에서 제공되고 있다. "인간화" 항체는 통상 인간의 불변 및/또는 가변 부위 도메인 또는 특이 변이를 갖는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 기타 종들로부터의

키메라성 또는 돌연변이 단일클론 항체이다. "인간화" 및 "키메라성" 항-α5β1 인테그린 항체를 생성하기 위한 기술은 당해 기술분야의 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원에서 인용한 참고문헌 및 특허에서 찾을 수 있다.

재조합 키메라성 및 인간화 항-α5β1 인테그린 항체, 및 그것으로부터 유도된 Fab 절편 제조.본 발명의 항체는 α5β1 인테그린으로 동물에 면역화하거나, 그것으로부터 유도된 펩티드로 항-α5β1 항체 제조를 유도하기 위하여 제조하였다. 상기 항체를 발현하는 임파 조직을 단리하고 항-α5β1 인테그린 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 핵산을 정제하였다. 다음에, 상기 정제된 핵산을 (종래 기술로 잘 알려진 방법에 따라) 재조합적으로 조작하여 α5β1 인테그린을 인식할 수 있는 특이성 키메라성, 인간화, 단쇄, Fab 또는 Fab2 항체를 제조하였다.

상기 재조합 조작된 핵산은 항-α5β1 인테그린 항체 생산 세포를 만드는데 사용되었다. 상기 세포는 그것의 수용체에 결합으로 부터 α5β1 인테그린을 저해하거나 방지하는 단일 클론 항체를 생산하여, 민감한 조직내의 혈관생성의 저해를 초래

하였다.

A 생산 세포 및 핵산 인코딩, 항-α5β1 인테그린 항체의 제조

재조합 키메라성 및 인간화 항-α5β1 인테그린 항체를 제조하기 위해서 상기 핵산 인코딩 비-인간 항-α5β1 인테그린 항체는 먼저 단리되어야 한다. 상기는 전형적으로 동물, 예를들어 마우스에 제조된 α5β1 인테그린 또는 그것으로부터 유도

된 항원의 펩티드로 동물에 면역화시킴으로써 수행된다.

전형적으로 마우스들은 한마리당 약 50 ㎍ 의 단백질 항체로 복강내로 두번 주입하여 면역화시킨다. 면역화된 마우스의 혈청은 상기 폴리펩티드를 발현하는 임의 숙주 시스템상에 면역조직학 또는 면역세포학 및 발현된 폴리펩티드를 ELISA법

에 의해 항체 활성에 관해 시험될 수 있다. 면역조직학으로, 본 발명의 활성 항체는 아비딘-과산화효소 및 발색 과산화효소 물질에 이어 비오틴(biotin) 콘쥬게이트된 항-마우스 면역글로불린을 이용하여 확인할 수 있다.

상기 시약의 제조는 예를 들어 Zymed CorpSan Francisco, Calif에서 판매되고 있다. 본 발명에 따른 확인가능한 활성항체를 포함하는 혈청을 가진 마우스는 삼일후에 죽일 수 있고 그것의 비장은 융합 및 하이브리도마 제조를 위해 제거된

다. 상기 하이브리도마의 양성(positive) 상층액은 종래 기술에서 사용되는 일반적인 분석 방법, 예를들어 웨스턴 블럿(Western blot) 분석법을 이용하여 확인할 수 있다.

이후, 요구되는 항체 사슬을 코딩하는 핵산은 예를 들어, 중쇄와 경쇄 유전자의 PCR 증폭용 주형으로서 하이브리도마 mRNA 또는 비장의 mRNA를 사용함으로써 단리될 수 있다[Huse, 등., Science 246:1276 (1989)]

항체 및 세포내 항체 둘 모두 제조하기 위한 핵산은 상기 기술을 이용하여 뮤린의 단일클론 하이브리도마로부터 유도될수 있다[Richardson J H, 등., Proc Natl Acad Sol USA 92:3137-3141 (1995); Biocca S, 등., Biochem and Biophys

Res Comm, 197:422- 427 (1993) Mhashilkar, A M, 등., EMBO J 14:1542-1551 (1995)] 상기 하이브리도마는 항체 구축을 위해 잘 특성화된 시약의 믿을만한 공급원을 제공하고 그것의 에피토프(epitope)의 반응성 및 친화성이 특성화된

후 특히 유용하다. 단리된 세포로부터 핵산의 단리는 추가로 [Clackson, T, 등., Nature 352:624-628 (1991) (비장) 및 Portolano, S, 등., supra; Barbas, C F, 등., supra; Marks, J D, 등., supra; Barbas, C F, 등., Proc Natl Acad Sci

USA 88:7978-7982 (1991) (인간 말초 혈관 임파구)]에서 논의되었다.

B 재조합 항체의 제조 비인간(예를 들어, 뮤린)의 인간화형 형태는 면역글로불린과 면역글로불린 사슬 또는 비-인간 면연글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 그것의 절편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하기서열 (subsequences)의 키메라성 분자이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 부위(CDR)를 형성하는 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 수용력을 가진 비인간 종(공여자 항체) 예컨대, 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체 되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)를 포함한다. 일부 예는, 인간 면역글로블린의 Fv 골격 잔기가 상응하는 비 인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 이식자와 삽입된 CDR 또는 골격 서열내 모두에서 이식자 항체를 찾을 수 없는 잔기가

포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나, 전형적으로 두개, 가변 도메인 모두를 포함할 것 이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR부위는 비인간 면역글로블린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR

부위는 면역글로불린의 것과 일치하는 서열이다. 또한, 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변부위(Fc)의 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린을 최소한 포함하는 것이 최적일 것이다[Jones 등., Nature, 321:522-525 (1986); Riechnann 등.,

Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr Op Struct Biol., 2:593-596 (1992)] 인간화 항체를 생성하는 방법은 종래 기술에 잘 공지되어있고 완전하게 설명되어있다 (예를 들어, Queen 등., US 특허번호: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180, 370 (이것의 각각은 전체로서 참고문헌으로 포함됨)참조)

항체는 하기를 포함하는 종래 기술에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화 할 수 있는데, 예를 들어 CDR-이식 (EP239,400; PCT 출원 WO 91/09967; US 특허 번호. 5,225,539; 5,530, 101 및 5,585,089), 덧붙임(veneering) 또는 재 생술(resurfacing) (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Mol Immunol., 28:489-498 (1991); Studnicka 등., Prot Eng 7805-814 (1994); Roguska 등., Proc Natl Acad Sci. 91:969- 973 (1994), 및 사슬 섞기(chain shuffling) (US 특허 5,565,332 호), 여기의 모든 것은 전체로서 참고 문헌으로 포함되었다.

수많은 방법은 재조합 키메라성 항체 제조에 대해 기재하고 있다. 키메라성 항체를 형성하기 위해 단백질 이황화 결합을 통해 연결된 항체 도메인의 제어된 재배열을 이용할 수 있다(Konieczny 등., Haematologia, 14(1):95-99, 1981) 재조합

DNA 기술은 또한 마우스 항체의 경쇄와 중쇄 가변 부위 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을 코딩하는 DNA 서열 간의 유전자 융합을 구축하는데 사용될 수 있다(Morrison 등., Proc Natl Acad Sci USA, 81(21): 6851-6855,

1984; Morrison, Science 229:1202-1207 (1985); Oi 등., BioTechniques 4:214-221 (1986); Gillies 등., J Immunol. Methods 125:191-202 (1989); US 특허 5,807,715 호; 4,816,567 호; 및 4,816,397 호 참조, 본원에 참고문헌으로 전체로서 포함)

뮤린의 단일클론 항체의 항원 결합 부분 또는 상보성 결정 부위를 코딩하는 DNA 서열은 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 골격을 코딩하는 DNA 서열로 분자적 방법으로 이식할 수 있다(Jones 등., Nature, 321(6069):522-525, 1986;

Riechmann 등., Nature, 332(6162):323-327, 1988) 상기 발현된 재조합 생성물은 "새로운 형태의" 또는 인간화 항체 라고 불리고, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 및 뮤린의 단일클론 항체의 항원 인식 부위, CDR의 골격을 포함한다.

또다른 인간화 항체 제조 방법은 참고문헌으로 포함된 US 특허 5,639,641 호에 기재되어있다. 상기 방법은 재생술을 통해, 다양한 부위의 인간 표면에 표시되기 때문에 향상된 치료 효능을 가진 인간화된 설치류 항체를 제공한다. 방법에 있

어: (1) 한 장(pool)의 중쇄 및 경쇄의 가변부위의 위치 배열은 한 세트의 위치가 노출된 중쇄 및 경쇄 가변 부위 골격 표면을 제공하기 위해 생성되며, 여기서 모든 가변 부위를 위한 배열 위치는 최소한 약 98% 동일하고; (2) 한 세트의 아미노산

잔기가 노출된 중쇄 및 경쇄의 가변 부위 골격 표면은 설치류 항체(또는 그것의 골격)로 정의되었고; (3) 한 세트의 아미노산잔기가 노출된 중쇄 및 경쇄의 가변 부위 골격 표면은 한 세트의 아미노 잔기가 노출된 표면의 설치류의 것과 거의 동일

하다고 확인되었고; (4) 상기 설치류 항체의 상보성 결정 부위의 임의 잔기에서 5Å 의 원자 이내의 아미노산을 제외하고,단계(2)에서 정의된 한 세트의 아미노산 잔기가 노출된 중쇄 및 경쇄 가변부위 골격 표면의 집합은 단계(3)에서 정의된 한

세트의 아미노산 잔기가 노출된 중쇄 및 경쇄 가변부위 골격 표면으로 대체되고; 및 (5) 결합 특이성을 가진 상기 인간화 설치류 항체가 제조된다.

유사한 인간화 항체의 제조 방법은 각가 여기에 참고 문헌인 US 특허 5,693,762 호; 5,693,761 호; 5,585,089 호; 및 5,530, 101 호에 기재되어 있다. 상기 방법은 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR's), 및 공여자 면역글로불린 및 받아들인

인간 면역글로불린의 골격 부위에 추가 가능한 아미노산를 가진 인간화 면역글로블린을 제조하는 것과 관련된다. 각각의 인간화 면역글로불린 사슬은 통상적으로 상기 CDR's 이 추가되고, CDR's와 상호작용할수 있는 공여자 면역글로불린 골격

의 아미노산, 예컨대, 분자 모델링으로 예측되듯이, 공여자 면역글로불린내의 CDR에 바로 근접하거나 3Å 이내에 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하여 결합 친화성에 효과적이다. 상기 경쇄 및 중쇄는 미국 특허 5,693,762 호; 5,693, 761 호;

5,585,089 호 및 5,530,101 호에 기재된 다양한 위치 기준 중 임의로 하나를, 임로 혼합하여 또는 모두를 사용함으로써 고안될 수 있다. 무손상 항체로 혼합될 때, 상기 인간화 면역글로불린은 실질적으로 인체에서 비 항체적이고 원래 항원에

대해 공여자 면역글로불린으로서 동일한 친화성을 실질적으로 보유한다.

추가된 인간화 항체 제조 방법은 참고 문헌으로 포함된 미국 특허 5,565,332 호 및 5,733,743 호에 기재되어있다. 상기 방법은 여기에 상세하게 설명된 파지미드 라이브러리으로 인간화 항체의 개념과 결합했다. 일반적인 판단으로, 상기 방법

은 항체의 항원 결합 부위의 서열 및 중요한 항원에 직접 대응하는 항체의 개체수를 이용하였다. 따라서 단일 설치류 항체를 위해, 상기 항체의 항원 결합 부위의 부분을 포함하는 서열은 완전한 항원 결합 부위를 조합하여 만들어낼 수 있는 인간

항체의 서열의 다양한 레퍼토리와 결합할 수 있다

상기 방법에 의해 만들어진 항원 결합 부위는 CDR 이식에 의해 생성된 것과 다르고, 여기서 단지 본래 설치류 항원의 서열의 부분만이 비슷한 방법으로 항원과 접촉될 것이다.

상기 선택된 인간 서열은 서열상 다를 것이고 본래 결합 부위의 것에서 항원과 다른 방법으로 접촉할 수 있다. 그러나, 항원에 보내 서열의 일부의 결합, 및 항원의 모양 및 그것의 항원 결합 부위에 의한 강제되는 제약은 동일 부위 또는 상기 항

원의 에피토프에 인간 서열의 신규한 접촉을 이루게 될 것이다. 따라서 상기 방법은 "에피토프 모양 선택(epitope imprinted selection)" (EIS)라고 불리워진다.

동물 항체로 시작하여, 한 공정은 부분적인 인간 항체인 항체의 선택을 초래한다. 상기 항체는 직접적인 치료 또는 몇몇의 중요 잔기의 변경 후에 사용되는 인간 항체의 서열과 충분히 유사할 수 있다. 인간 서열로 선택된 항체의 설치류의 구성

성분 간 서열 상이성은 인간의 서열 잔기와 다른 그것의 잔기로 대체함으로써, 예를 들어, 개별적인 잔기의 지정부위돌연 변이(site directed mutagenesis), 또는 완전한 루프의 CDR 이식에 의해 최소화할 수 있다. 그러나, 완전한 인간 서열의

항체 또한 생성될 수 있다. 따라서, EIS는 개별적으로 동물 또는 부분적 인간 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 부분적으로 또는 완전한 인간 항체 제조 방법을 제공한다. EIS에서, 항체 절편의 레파토리는 실 모양의 파지의 표면 및 항원에

파지의 결합함으로써 선택된 항원 결합 활성을 가진 단편을 코딩하는 유전자상에 나타낼수 있다.

본 발명에서 사용하기 위해 계획된 추가적 인간 항체의 방법은 본원에 각각참고문헌으로 포함된 미국 특허 5,750,078호; 5,502,167 호, 5,705,154 호; 5,770,403 호; 5,698,417 호; 5,693,493 호; 5,558,864 호; 4,935, 496 호; 및

4,816,567 호에 기재되어있다.

단쇄 항체의 제조에 관해 설명된 기술은(미국특허 4,946,778 호)은 α5β1 인테그린의 단쇄 인간화 항체를 제조를 하기 위해 적용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 구현예는 본원에 기술된 치료용 항체를 포함한 약제학적 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 상기 치료 성분의 흡수 또는 국소성 (localization) 을 강화시키거나, 염증을 감소시키거나 또는 그 반대로 국부적 완화를 제공하는

작용제를 포함할 수 있다.

α5β1 인테그린 발현에 관련된 혈관형성을 감소시키거나 저해하는데 유용한 본 발명의 항체 또는 상기 항체들을 함유한 약제학적 조성물은 적어도 부분적으로 혈관형성이 특징인 임의의 병리학적 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 작용제를, 예를 들어, 경구적 또는, 정맥내, 근육내, 피하, 안와내(intraorbital), 관절낭내 (intracapsular), 활막내(intrasynovial), 복강내 (intraperitoneal), 수조내 (intracisternal) 또는, 예를 들어 스킨 패치 (skin patch) 또는 경피 이온영동법 (transderma1 iontophoresis) 를 이용한 피부를 통한 수동 또는 능동 흡수를 포함한 비경구적인 것을 포함하는

다양한 경로로 투여할 수 있다는 것은 당업계의 숙련된 자에게 자명할 것이다. 게다가, 상기 항체는 주사, 좌약을 통한 삽관 (intubation) 으로 경구적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있는데, 이때 삽관은, 예를 들어, 상기 항체를 함유한 연고

(ointment) 또는 분말의 직접 적용에 의한, 수동적인 것일 수 있고, 또는, 예를 들어 비강 분무액 또는 흡입제를 사용한, 능동적인 것일 수 있다. 상기 항체는 또한, 바람직할 경우, 국소적 분무액으로 투여될 수 있는데, 이런 경우 상기 조성물 중 한성분은 적절한 분사제 (propellant) 이다. 상기 약제학적 조성물은 또한, 바람직할 경우, 리포솜, 미세구 또는 기타 중합체 매트릭스 내로 통합될 수 있다(Gregoriadis, Liposome Technology, Vol 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla 1984), 이는 참조로서 본원에 포함됨) 리포솜, 예를 들어 인지질 또는 기타의 지질로 이루어진 것들은, 비교적 제조 및 투여가 용이한, 비독성의 생리학적으로 허용가능한 대사성 담체들이다.

α5β1 인테그린 발현에 관련된 혈관형성은, 예를 들어, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy) 에 걸린 개인의 망막에서, 국부적으로 발생하거나 또는, 예를 들어, 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 또는 전이성 악성 종양에 걸린 개인에

서, 좀 더 전신적으로 발생할 수 있다. 혈관형성 부위가 국부적이거나 또는 보다 전신적으로 산재할 수 있기 때문에, 당업계의 숙련된 자는, 부분적으로는, 이 요인에 기초하여 본 발명의 치료용 항체의 특정 투여 경로 및 투여 방법을 선택할 것

이다.

예를 들어, α5β1 인테그린 발현에 관련된 혈관형성이 망막에 국부적으로 존재하는 당뇨병성 망막증에 걸린 개인에서는, 상기 작용제를, 눈에 직접 투여할 수 있는 점안액으로 사용하기에 편리한 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 이와 비교

하여, 전이성 암종에 걸린 개인에서는, 상기 작용제를, 정맥내로, 경구적으로 또는 상기 작용제를 전신적으로 분포시키는 또 다른 방법으로 투여될 수 있는 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 다양한 경로로, 예를 들

어, 정맥내로, 경구적으로 또는 치료될 부위에 직접, 예를 들어 신생 (neoplastic) 종양 내로 직접 투여될 수 있고; 병리학적 상태가 눈을 포함하는 경우, 점안액을 통해; 또는 상기 상태가 관절을 포함하는 경우 활막내로 투여될 수 있다.

치료용 항체는 한 개인에서 유효량으로 투여되는데, 이는 α5β1 인테그린이 그의 특이적 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 방해하기에 충분한 양이다. 일반적으로, 작용제 길항제는 체중 1 ㎏ 당 약 00001 내지 100 ㎎ 의 양으로 투여되나, 이는 적용에 따라 다소 다양할 것이다. 당업자는, 상기 논의한 효능 시험의 결과를 기초로, 주어진 치료를 위한 유효한 투여 범위를 결정할 수 있을 것이다. 투여될 양의 견적은, 예를 들어 상기 작용제가 국부적으로 투여될 예정인 경우 등 경우에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 항체를 투여하는 바람직한 방법은, 피내로의, 정맥내로의 또는 상해를 입은 관절 또는 조직내로의 직접 주사에 의한 것이다. 예를 들어, 망막 조직이 손상된 경우, 본 발명의 치료용 항체를 상해를 입은 눈 내로 유리체내로

(intravitreally) 주사할 수 있다. 본 발명의 놀라운 결과는, (두 눈이 상해를 입었다고 가정할 때) 한쪽 눈에 행해진 치료가 양쪽 눈에 임상적으로 유리한 효과를 초래한다는 것이다. 새로이 형성된 혈관은 "누설성"으로서, 상기 첫번째 눈에 가해진항체가, 이들이 수송되는 혈류 내로 통과하여 상기 두번째 눈으로 이동되게 하는 것으로 보인다. 이러한 방식으로 상기 눈에 가할 때, 투여량은 바람직하게는 5 μM 미만, 좀 더 바람직하게는, 05 내지 2 μM 및 가장 바람직하게는 01 내지 10

μM 이다. 지시가 있는 경우, 치료는, 주어진 영역 또는 기간에 걸쳐, 복수 투여 형태를 취할 수 있다. 복수 형태로의 투여는 모두 동일할 수 있으며, 또는 독립적으로 결정되고 적용될 수 있다. 이 결과는 또한, 유효량의 치료용 항체를 (예를 들어 정맥내 주사로) 전신에 적용하는 것을 포함하는, 손상된 조직의 신생혈관형성이 저해되거나 예방되는 신생혈관형성 (neoangiogenesis) 에 관련된 상해를 치료하는 추가적인 방법을 유발하였다.

본 명세서에 인용된 모든 발행물 및 특허출원은 각 개개의 발행물 또는 특허출원이 참조로서 포함된다고 구체적으로 개별적으로 지시된 것처럼 참조로서 본원에 포함된다.

상기 본 발명을 명쾌함 및 이해를 위해 설명 및 예를 통해 다소 상세히 기술하였으나, 본 발명의 교시의 관점에서, 첨부된 청구항의 취지 및 영역을 벗어나지 않고서 특정 변화 및 변경을 이에 가할 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다.

상기 제공된 명세로부터 이해할 수 있듯이, 본 발명은 적용 분야가 다양하다. 따라서, 하기 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명에 대한 제한으로 파악되려는 의도는 없다. 당업계의 숙련된 자들은 중대하지 않

은 다양한 매개 변수들을 변화시키거나 변경하여 본질적으로 유사한 결과를 산출할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다.

실시예 1 - 마우스 IIA1 항-α5β1 인테그린으로부터 M200 키메라성 구축

이 실시예는 키메라성 항체 M200 의 구축에 대하여 기술한다.

A IIA1 및 200-4 VH 및 VL 도메인의 출발 DNA 서열 IIA1 하이브리도마 cDNA 로부터 다양한 마우스 항-인간 α5β1 인테그린 항체, IIA1 (Pharmingen, San Diego CA) 의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 도메인을 클로닝하고 상기 200-4 항체의 초기 구축물의 일부로서 서열분석하였다. 도 3 은 상기 IIA1 VH (서열번호: 13) 및 VL (서열번호: 14) 도메인들의 cDNA 서열을 보여준다. IIA1 으로부터의 200-4 마우스/인간

키메라성 IgG4 항체 구축 동안, IIA1 VH 및 VL 둘 다의 4 개 골격 영역들 내로 침묵 XhoI 제한효소 절단부위 (CTCGAG) (서열번호: 33) 들을 도입하였다. 발현 구축물들인 DEF38 IIA1/인간 G4 키메라성 및 NEF5 IIA1/K 키메라성에서 발견된

것으로서의 이들 침묵 XhoI 부위들을 포함한 200-4 VH (서열번호: 15) 및 VL (서열번호: 17) DNA 서열들을 도 4 에 나타내었다. 이들 200-4 VH 및 VL 서열들을 이후의 모든 재조합 DNA 조작의 출발 지점으로 사용하였다.

B M200 VH 및 VL 소형-엑손 설계 발현 플라스미드 DEF38 IIA1/인간 G4 키메라성 및 NEF5 IIA1/K 키메라성 내의 200-4 VH 및 VL 도메인을, 인트론의

개입 없이, 침묵 XhoI 부위들을 통해 이들의 인접 불변 도메인들에 직접 융합시킨다. 게놈 DNA 에 기초한 목적하는 항체 발현 벡터에 융화될 수 있는 이들 가변 도메인들을 제조하기 위하여, 상기 가변 코딩 영역의 3' 말단에 있는 기능성 공여체

접착 부위를 재생성하는 '소형-엑손'을 설계하는 것이 필요하였다. 서열 비교를 통하여, IIA1 의 VH 및 VL 영역들이 각각 마우스의 JH4 및 JK1 분절 (segment) 을 이용한다는 것이 밝혀졌으며; 따라서 상기 소형-엑손들을, 상기 VH 및 VL 도메

인 내의 마지막 아미노산 다음에 천연 뮤린 JH4 및 JK1 공여체 접합 부위를 재생성하도록 설계하였다. 또한, 상기 XhoI 부위를 제거하여 본래의 IIA1 하이브리도마에서 발견되는 것과 같은 골격 4 개 서열들을 복구하였다. 상기 소형-엑손들을

하기 제한효소 절단부위들의 측면에 위치시켰다: VH 소형-엑손에 대하여는 5' 및 3' XbaI 부위 (TCTAGA) (서열번호:34) 및, VL 소형-엑손에 대하여는 5' MluI (ACGCGT) (서열번호: 35) 및 3' XbaI (TCTAGA) (서열번호: 34)

재조합 항체 가변 도메인은 경우에 따라 원치 않는 대안적인 mRNA 접합 부위를 포함하고 있는데, 이들은 그 후 번갈아 접합된 mRNA 종을 야기할 수 있다. 이러한 부위는, 이론상, 뮤린의 가변 도메인에 존재하면서 이종 발현 세포 및/또는 키

메라성 불변 영역으로부터의 신규 수용체 부위에서만 활성일 수 있다. 코딩된 아미노산 서열은 변하지 않게 두면서 잠재적인 대안적 접합 부위를 제거하는 코돈 축퇴법 (codon degeneracy) 을 이용하여, 이러한 원치 않는 대안적 접합을 제거할

수 있다. 상기 M200 VH 및 VL 소형-엑손 내의 임의의 잠재적 대안적 접합 부위를 검출하기 위하여, 덴마크의 기술 대학(Technical University) 의 Center for Biological Sequence Analysis 로부터의 접합 부위 예측 프로그램 (http://

wwwcbsdtudk/services/NetGene2/) 을 이용하여 상기 초기의 설계물들을 분석하였다. 두 200-M 소형-엑손 모두에 대하여, 올바른 공여체 접합 부위들이 동정되었으나; 잠재적 대안적 공여체 접합 부위는 VH 소형-엑손의 CDR3 및 VL 소

형-엑손의 CDR1 에서 검출되었다. 이들 접합 부위들이 사용될 가능성을 제거하기 위하여, 상기 소형-엑손 고안물에 대하여 단일 침묵 염기쌍 변화를 가하였다. 상기 VH 고안물의 경우, 글리신 100 (Kabat 넘버링) 에서 GGT 를 GGA 으로 침묵

코돈 변화시켰고; VL 고안물에 대하여는, 발린 29 에서 GTA 를 GTC 으로 침묵 코돈 변화시켰다. 두 경우 모두에서, 이들 침묵 변화로, 상기 V-유전자들에서 잠재적인 이차적 접합 공여체 신호가 제거되었다.

플랭킹 제한효소 절단부위, 뮤린 공여체 접합 부위를 포함하고, 200-4 XhoI 부위가 제거되었으며 잠재적 대안적 공여체 접합 부위가 제거된 M200 VH 및 VL 소형-엑손 (서열번호: 19, 21) 에 대한 최종 고안물을 도 5 에 나타내었다.

C M200 VH 소형-엑손 및 플라스미드 p200-M-H 구축 출발 지점으로서 200-4 발현 플라스미드 DEF38 IIA1/인간 G4 키메라성을 사용한 PCR-기반 변이로써, 도 5A 에서 보여지는 것과 같은, 설계된 M200 VH 용 소형-엑손을 구축하였다. 요약하면, 프라이머 #110 (5' TTTTCTAGACCACCATGGCTGTCCTGGGGCTGCTT-3') (서열번호: 36) (이는 상기 200-4 VH 신호 서열의 5' 말단에 아닐링하여 Kozak 서열 및 XbaI 부위를 부가한다) 및 프라이머 #104 (5'-TTTTCTAGAGGTTGTGAGGAC

TCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3') (서열번호: 37) (이는 상기 200-4 VH 의 3' 말단에 아닐링하여 XbaI 부위를 부가한다) 를 사용하여, DEF38 IIA1/인간 G4 키메라성로부터 상기 200-4 VH 영역을 증폭시켰다. 상기 469 bp PCR 절편을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고 DNA 서열분석으로 확인하여 플라스미드 p200M-VH-21을 생성시켰다. 그 후 이 중간체 플라스미드를, CDR3 내의 잠재적 변이 접합 부위를 제거하고 상기 VH 코딩 영역의 3' 말단에 뮤린 JH4 공여체 접합 부위를 부가시키는 두번째 PCR 변이 반응에 사용하였다. 상기 M200 VH 의 CDR3 내의 글리신 100 (Kabat 넘버링) 에서 GGT 에서 GGA 로의 코돈 변화를 이끄는 두 상보적 프라이머, #111 (5'-TGGAACTTACTACGGAATGACTA CGACGGGG-3') (서열번호: 38) 및 #112 (5'-CCCCGTCGTAGTCATTCCGTAGTAAGTTCCA-3') (서열번호: 39) 를 설계하였다. 프라이머 #110 및 #112 를 PCR 반응에 사용하여 상기 M200 VH 소형-엑손의 5' 말단으로부터 395 bp 절편을 생성하였고, 프라이머 #111 및 #113 (5'-TTTTCTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3') (서열번호: 40) 를 이용한 별개의 PCR 반응으로, M200 VH 소형-엑손의 3' 말단으로부터 101 bp 절편을 생성하였다. 상기 두 PCR 생성물을 15% 저융점 아가로스 상에서 겔 정제한 후, 수합하고, 프라이머 #110 및 #113 을 사용하여 최종 PCR 반응에서 접합시켰다. 최종적인 465 bp PCR 생성물을 정제하고, XbaI 으로 절단한 후, XbaI 로 절단되고 쉬림프 알카리성 인산분해효소 (shrimp alkaline phosphatase) 처리된 벡터 pHuHCg4D 내로 클로닝시켰다. 최종 플라스미드인 p200-M-H (도 6) 을 DNA 서열분석하여, 상기 XbaI 부위들 사이의 200-M VH 소형-엑손에 대한 올바른 서열인지 확실히 하고 XbaI-XbaI 삽입의 올바른 배향을 입증하였다.

D M200 VL 소형-엑손 및 플라스미드 p200-M-L 구축 출발 지점으로서 200-4 발현 플라스미드 NEF5 IIA1/K 을 사용한 PCR-기반 변이로써, 도 5B 에서 보여지는 바와 같은 설계된 M200 VL 용 소형-엑손을 구축하였다. 프라이머 #101 (5' TTTACGCGTCC

ACCATGGATTTTCAGGTGCAGATT-3') (서열번호: 41) (이는 상기 신호 서열의 5' 말단에 아닐링하여 Kozak 서열 및 MluI 부위를 부가한다), 및 프라이머 #102 (5'-TTTTCTAGATTAGGAAAG TGCACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3') (서열번호: 42) (이는 200-4 VL 의 3' 말단에 아닐링하여 XbaI 부위를 부가한다) 를 사용하여 NEF5-IIA1-K 로부터 VL 영역을 증폭시켰다. 상기 432 bp PCR 절편을 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고 DNA 서열분석으로 확인하여 플라스미드 p200M-VL-33 을 생성하였다. 이 중간체 플라스미드를 그 후 두번째 PCR 변이 반응에 사용하여 CDR1 내의 잠재적 변이 접합 부위를 제거하고 VL 코딩 영역의 3' 말단에 마우스 JK1 공여체 접합 부위를 부가하였다. 두 상보적 프라이머들인 #114 (5'- TGCCAGTTCAAGTGTCAGTTCCAATTACTTG-3') (서열번호: 43) 및 #115 (5'-

CAAGTAATTGGAACTGACACTTGA ACTGGCA-3') (서열번호: 44) 를, VL 도메인의 CDR1 내의 발린 29 (Kabat 넘버링) 에서 GTA 의 GTC 으로의 코돈 변화를 이끌도록 설계하였다. 프라이머 #101 및 #115 를 PCR 반응에 사용하여 VL 소

형-엑손의 5' 말단으로부터 182 bp 절편을 생성하였고, 프라이머 #114 및 #116 (5'-TTTTCTAGACTTTGGATTCTACTTAC GTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC-3') (서열번호: 45) 을 이용한 별개의 PCR 반응으로 VL 소형-엑손의 3' 말단으로부터 280 bp 절편이 생성되었다. 상기 두 PCR 생성물을 15% 저융점 아가로스 상에서 겔 정제한 후, 수합하고, 프라이머 #101 및 #116 을 사용하여 최종 PCR 반응에서 접합시켰다. 최종적인 431bp PCR 생성물을 정제하고, MluI 및 XbaI 으로 절단한 후, MluI 및 XbaI 로 절단된 경쇄 발현 벡터 pHuCkappargptdE내로 클로닝시켰다. 상기 MluI 및 XbaI 부위 사이의 상기 VL 소형-엑손에 대한 올바른 서열인지 확실히 하기 위하여, 최종

플라스미드인 p200-M-L (도 7) 을 DNA 서열분석하였다.

E 플라스미드 p200-M-H 및 p200-M-L 의 조합 및 이를 통한 최종 발현 플라스미드 p200-M 의 제조단일 플라스미드로부터 M200 을 발현하기 위하여, p200-M-H 및 p200-M-L 을 EcoRI 로 절단하고, p200-M-H 의 전체 IgG4 중쇄 유전자를 가진 EcoRI 절편을 EcoRI로 선형화된 p200-M-L 내로 연결시켜 플라스미드 p200-M (도 8) 을

생성시켰다. Endotoxin-Free Plasmid Maxi-prep Kit (Qiagen) 를 사용하여 E coli 배양물 25 ℓ 로부터 내독소(endotoxin) 가 없는 대규모의 p200-M 플라스미드 표본 (preparation) 을 준비하였다. 효소 BamHI, XbaI 및 FspI 를 이용하여 제한효소 매핑으로 상기 플라스미드 구조를 입증하였다. M200 VH, VL, Cκ, 및 Cγ4 에 대한 전체 코딩 영역은 DNA 서열분석으로 증명되었다. 완전한 M200 중쇄 (서열번호: 23) 및 M200 경쇄 (서열번호: 24) 에 대한 DNA 서열은 도9 에 나와 있다. 완전한 M200 중쇄 (서열번호: 25) 및 M200 경쇄 (서열번호: 26) 에 대한 대응 아미노산 서열은 도 10 에나와 있다.

실시예 2 - M200 으로부터 Fab 절편 F200 생성

이 실시예는 Fab 절편 F200 을 제조하는 것을 기술한다.

Fab 절편은 M200 IgG 출발 물질로부터 효소적 절단에 의하여 생성된다. 상기 출발 IgG 의 완충액을 20 mM 인산나트륨,20 mM N-아세틸 시스테인 pH 70 으로 교체한다. 가용성 파파인 효소 (papain enzyme) 를 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에

서 4 시간동안 회전시킨다. 효소 절단 후, 혼합물을 단백질 A 컬럼에 통과시켜 Fc 절편을 제거하고 절단되지 않은 IgG 를제거한다. 소듐 테트라티오네이트를 10 mM 가 되도록 첨가하고, 실온에서 30 분간 인큐베이션한다. 마지막으로, 이 표본

의 완충액을 20 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 74 으로 교체하여 F200 용액을 산출한다.

이는 Fab 절편이기 때문에, F200 경쇄 DNA 및 아미노산 서열은 M200 경쇄와 동일하다. 완전한 F200 중쇄 DNA (서열번호: 27) 및 아미노산 (서열번호: 28) 서열이 도 11 에 나와 있다.

실시예 3 - M200 에 의한 시험관내 내피세포 (endothelial ) 증식 저해

이 실시예는 M200 항체가 내피세포 증식에 미치는 영향에 대해 기술한다.

M200 은 α5β1 인테그린에 고도로 특이적인 기능적 단클론성 차단 항체이다.

HUVEC 를 96-웰 플레이트에 도 14 에 나와 있는 농도의 다양한 항체 (M100, M200, 항-VEGF 또는 대조군 IgG) 의 존재하에서 웰당 5000 세포의 농도로 접종하였다. 플레이트를 10 ㎍/㎖ 피브로넥틴 또는 01% 폴리-L-리신 (PLL) 둘 중 하

나로 예비-처리하고, 2% 열 변성 BSA 로 차단시켰다. 세포를, 약 2 ng/㎖ 의 VEGF, bFGF 또는 둘 다를 함유한 무혈청 한정 배지에서 증식시켰다. 플레이팅 4 일 후, 테트라졸륨염, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨

브로마이드) 검정을 사용하여 전체 세포 생존성을 평가하였다 (예컨대 Wasserman & Twentyman, "Use of acolorimetric microtiter (MTT) assay in determining the radiosensitivity of cells from murine solid tumors," Int J

Radiat Oncol Biol Phys 15(3):699-702 (1988); Romijn, JC, Verkoelen, CF, Schroeder, FH, "Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of

hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects," Prostate 12(1):99-110 (1988) 참조) 바탕 데이타를 제하고 항체가 결여된 대조군에 대하여 표준화하였다. 각 데이타 점을 3 배수로 수집하였고, 나타낸 데

이타는 3 개 개별 실험을 대표한다.

도 14 에 나타난 바와 같이, HUVEC 성장은 PLL 및 섬유결합소 (fibronectin) (040 nM; 최대 저해율 80%) 모두에 대해 투여량 의존적 방식으로 M200 에 의해 저해되며, 대조군 IgG 은 아무 영향이 없었다. 더욱이, M100 (M200 이 유도되는

마우스 항체) 는 세포 성장 저해에 대해 동일한 능력을 나타낸다.

중요하게는, 도 14 에 나타낸 바와 같이, 고친화성, 관능 차단 항-VEGF mAb, HuMV833 (KD = 584 ×10-11 nM) 은, 모든 시험된 조건 하에 현저히 더 적은 HUVEC 성장 저해를 나타낸다 (45 nM; 최대 저해율 40%) M200 및 HuMV833 를

함께 사용한 세포에 대한 시도는 증가된 저해 응답성을 초래하지 않았다.

도 15A 에 나타낸 데이터에 대해, 더 높은 농도의 VEGF (50 ng/ml) 가 상기 기재된 바와 같은 섬유결합소에 대한 HUVEC 증식 검정에 포함되었다. 도 15A 에 나타낸 바와 같이, VEGF 에 의해 자극된 섬유결합소 상에서의 HUVEC 증식

은 M200 에 의해, HuMV833 에 의한 것과 비슷한 정도로 저해된다. 이에 따라, M200-중재 세포증식 억제 효과는 상승된, 성장 자극 수준의 VEGF (50 ng/ml) 에서조차 명백했다.

두 가지의 고친화성 항체는 M200 유전자형 영역에 대해 상승했으며, M200 의 α5β1 인테그린에 대한 결합을 차단하도록 결정되었다. 2 개의 항-유전자형 mAbs (10 ㎍/ml) 이 상기 기재된 HUVEC 증식 검정에 포함되며, HUVEC 성장의

M200-의존성 저해에 대한 영향을 평가했다. 두 mAb 가 모두 HUVEC 증식을 저해하는 M200 (1 ㎍/ml) 의 용량을 저해 할 수 있다. 15B 에 나타낸 바와 같이, M200 의 저해 활성은 M200 에 대한 항-유전자형 mAbs 에 의해 완전히 역전되었

다.

총괄하면, 상기 결과는 M200 가 일부 측면에서 여전히 상이한 항-VEGF 항체 HuMV833 의 것과 중복되는 메카니즘을 통해 HUVEC 증식을 저해한다는 것을 시사한다.

실시예 4 - 상피 세포 생존에 대한 M200 영향 본 실시예는 상피 세포 생존에 대한 M200 항체의 영향을 기술한다.

특정 인테그린에 대한 항체는 시험관내 및 생체 내에서의 세포 사멸을 유도할 수 있다. 최근, 아넥신 V 염색, 캐스파아제 -3 절단 및 DNA 분절화로 측정된 바에 의하면 배양된 인간 상피 세포 내에서 기능 차단성 α5β1 mAb 가 세포사멸

(apoptosis)을 촉진하는 것으로 나타났다 (Kim, 등, 2002)

유사한 아넥신 V 염색이 M200 또는 HuMV833 에 노출되어 성장한 HUVEC 상에서 수행되었다. 혈청이 없는 배지(VEGF 및 bFGF 을 함유하나, 표시된 곳에서는 제외) 중에서 성장한 HUVEC 은 M200 (10 ㎍/ml), HuMV833 (10 ㎍/ml)

또는 스타우로스포린 (5 μM, 양성 대조군) 의 존재 하에 성장했다. 세포 사멸은 Annexin V-alexa488 (녹색) 및 Hoechst 33258 (청색) 로 염색한 후, 형광 현미경 (형광 현미경 영상은 도 16A 에 나타냈다) 으로 관찰해 평가했다. 동시에, 세포

사멸은 플레이팅 후 16 시간 째에 유세포분석으로 평가했다(도 16B)

도 16A 및 16B 에 나타낸 바와 같이, M200 로 시도한 세포는 증가된 아넥신 V 염색을 나타낸 반면, HuMV833 로 시도 한 것은 그렇지 않았다. 이에 따라, M200 는, HuMV833 와는 대조적으로, 상피 세포에서의 세포 사멸을 촉진하는 것으로

나타났다.

또한, M200 의 영향을 노화 세포 대 증식 세포에 대해 비교했다. HUVEC 를 플레이팅한 후, 혈청 및 성장 인자의 존재 하에 (가운데 패널), 융합되도록 성장하거나 (좌측 패널) 또는 대수기 (log phase) 성장 후 혈청 및 성장 인자의 제거시 (우측

패널) 증식하도록 했다. 각각의 경우, 세포는 비처리 (대조군) 하거나 또는 M200 (10 ㎍/ml) 또는 스타우로스포린 (5 μM)과 16 시간 동안 인큐베이션한 후 Annexin V-alexa488 로 염색했다.

도 17 에 나타낸 바와 같이, M200 은 분열하는 HUVEC 에서 세포 사멸을 유도했으나, 접촉 저해 또는 성장 인자 제거로 인해 HUVEC 이 노화하게 되지는 않았다. 상기 결과는, M200 가 증식하는 상피 세포 내에서 선택적으로 세포 사멸을 촉진한다는 것을 시사한다.

실시예 5 - 시험관내 관 형성 F200 의 저해 본 실시예는 F200 에 의한 시험관내 혈관형성 저해를 증명하는 관 형성 검정을 기재한다. HUVEC 을 인간 혈청 및 성장

인자의 혼합물 (도 18A 에서의 검정은, 001 mg/ml rTGF-α 또는 01 mg/ml 의 VEGF 및 HGF 로 보충된 배지를 포함하며; 도 18B 에서의 검정은 01 mg/ml VEGF 단독으로만 보충된 배지를 포함하며; 도 18C 에서의 검정은 01mg/ml bFGF

단독으로만 보충된 배지를 포함한다) 과 함께 단일 세포 현탁물로서 혼합해 피브린 덩어리 (피브리노겐 및 α-트롬빈으로

부터 제조) 로 만들었다. 시험용 항체를 표시된 농도로 배지에 첨가했다. 96 시간에 걸쳐, 단독적인 세포 HUVEC 은 이동하기 시작했으며, 다른 세포 및 매트릭스와 접촉하여, 삭상조직 (cord) 및 최종적으로는 3 차원적 관형 구조를 형성한다.

관 형성의 정도는 6 일후 4% 포름알데히드로 고정하고 Alexa488∼phalloidin 으로 염색해 정량했다. 도 18 에 도시된 평균 형광의 영상 및 그래프로 나타낸 바와 같이, 관 형성은 F200 의 존재 하에 현저히 저해되었다. 관 형성 저해는 성장 인

자, VEGF, HGF 및 상기 두 가지와 rTGFα 의 혼합물의 존재 하에 관찰되었다.

실시예 6 - M200 및 F200 에 의한 원시안에서의 CNV 의 생체내 저해

본 실시예는 원시안의 황반에 대한 레이저 외상 후 혈관 발생에 대한 M200 및 F200 Fab 의 영향을 기재한다. 동물 모델에서의 맥락막 혈관신생의 연구를 기재하는 배경기술의 문헌에는 하기가 포함된다: S Ryan, "The Development of an

Experimental Model of Subretinal Neovascularization in Disciform Macular Degeneration," Transactions of the American Ophthalmological Society 77: 707-745 (1979); SJ Ryan, "Subretinal Neovascularization: Natural

History of an Experimental Model,"Archives of Ophthalmology 100: 1804-1809 (1982); MJ Tolentino 등.,

"Angiography of Fluoresceinated Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Antibody and Dextrans in Experimental Choroidal Neovascularization," Archives of Ophthalmology 118: 78-84 (2000)

Claims (7)

1. 하기 단계를 포함하는 pH-민감성 항-α5β1 인테그린 항체의 정제방법:
   (a) 기질에 결합한 항체 친화성 매트릭스 상에 항체를 흡수시키는 단계; 및
   (b) 약 30 내지 약 55의 pH를 갖는 용출 용액을 사용하여 기질-결합 항체 친화성 매트릭스로부터 항체를 용출시키는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 추가로 하기 단계를 포함하는 방법: (c) 정제된 항체를 회수하는 단계.
3. 제 1 항에 있어서, 용출 용액의 pH 가 약 33 내지 약 55 인 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 용출 용액의 pH 가 약 35 내지 약 55 인 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 용출 용액의 pH 가 약 35 내지 약 42 인 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 용출 용액의 pH 가 약 42 내지 약 55 인 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 2-6, 16 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 가진 중쇄 가변영역 및 서열 번
   호: 8-12, 18 및 22로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 경쇄 가변영역을 포함하는 방법.

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