KR20200088765A - 간질성 방광염의 치료 방법 - Google Patents

간질성 방광염의 치료 방법 Download PDF

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멜라니 켈리
크리스티안 레만
마리 린치
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Abstract

본 출원은, 임의로 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 메틸설포닐메탄(MSM)과 같은 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 투여 또는 사용과 함께, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 베타-카리오필렌과 같은 CB2 표적제 국소 마취제의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

간질성 방광염의 치료 방법
관련 출원에 관한 상호참조
본 출원은 2017년 11월 15일자로 출원된 동시 계류중인 미국 가특허출원 제62/586,516의 우선권 혜택을 청구하며, 이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 간질성 방광염의 치료를 위한 베타-카리오필렌과 같은 CB2 표적제(target agent) 국소 마취제의 사용에 관한 것이다.
간질성 방광염(IC)은 감염 부재 하의 방광의 만성 염증성 장애이다. IC의 증상에는 골반통, 배뇨에 대한 지속적인 충동 및 빈뇨가 포함된다. IC의 유병률 및 발병률은 남성보다 여성이 높은 경향이 있으며, 예를 들어 여성 대 남성 비율은 5:1로 보고되었다.1 IC는 환자의 삶의 질에 심각한 부정적인 영향을 줄 수 있는 질환으로서 인정되고 있다. 그러나, 현재까지 수십 년간의 기초과학 연구에도 불구하고, 명확한 병리생리학은 확인되지 않았으며 표준 치료 옵션은 여전히 부족하다.
간질성 방광염에 대한 현재의 치료는 가장 흔하게 경구 약제 또는 방광 점적주입이다. 펜토산 폴리설페이트(PPS) 및 트리사이클릭 항우울제와 같은 가장 흔하게 사용되는 경구 요법은 IC 환자의 일부분에서 일부 증상을 완화시키는 데 도움이 되는 것으로 밝혀졌지만, 모든 환자가 이러한 접근법에서 치료 효과를 얻는 것은 아니다2. 예를 들어, 한 연구는 PPS 치료의 효과가 환자의 4 분의 1로만 제한된다고 밝혔다.3 PPS 및 트리사이클릭 항우울제 치료와 함께 다른 보조 치료를 1년 이상 시험한 다른 연구는 IC의 증상이 변하지 않았거나 재발하였음을 밝혀냈다.4
약리학적 제제가 방광으로 직접 전달되는 방광내 요법은 환자에게 약간의 완화를 제공하였다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 IC 점적주입에 흔히 사용되는 약리학적 제제 중 하나이며5 FDA의 승인을 받았다. DMSO는 소염 효과와 비만세포를 안정화시키는 능력을 갖는 것으로 보고되었다.2 불행히도, 일부 초기 완화에도 불구하고, IC의 증상 재발은 흔하다. 예를 들어, DMSO 치료는 심각한 IC 환자에서 높은 실패율을 보인다.6 메틸설포닐메탄(MSM; 다른 명칭에는 디메틸 설폰, 메틸 설폰, 설포닐비스메탄, 유기 황, 결정질 디메틸 설폭사이드 및 DMSO2가 포함된다)도 IC의 임상 사례 연구에서 보고되었으며 IC를 앓는 환자 6명 중 4명에서 효과적인 치료제인 것으로서 보고되었다.7 메틸설포닐메탄은 FDA에 의해 GRAS로 지정되었다.
내인성 칸나비노이드 시스템(ECS)은 대사작용, 통증-감각, 신경전달 및 염증을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 생리학적 과정에 관여한다.8 ECS는 칸나비노이드 수용체(칸나비노이드 1(CB1) 수용체와 칸나비노이드 2(CB2) 수용체 둘 다), 내인성 칸나비노이드(EC; 예컨대 N-아라키도노일에탄올아민 또는 아난다미드(AEA) 및 2 아라키도노일글리세롤(2-AG)) 및 엔도칸나비노이드 대사 효소로 구성된다8(a). CB1 수용체는 중추신경계(CNS) 및 비-신경 말초 조직에서 발현된다.9 CB2 수용체는 선택된 CNS 영역 및 장과 방광과 같은 일부 말초 조직에 대해 보고된 제한된 분포로 면역세포에 고도로 국한되어 있다.10 내인성 리간드에 의한 활성화 외에도, 칸나비노이드 수용체는 피토칸나비노이드 및 유도체의 표적이다. 현재까지 CB1 또는 CB2 수용체에 선택적으로 결합하는 몇몇 합성 리간드가 개발되었다.11
면역반응을 조절하는 데 있어 ECS의 역할은 20년 넘게 연구자들에 의해 활발히 연구되어 왔다.12 그러나, 방광과 관련하여 칸나비노이드 수용체의 기능적 역할에 초점을 둔 연구는 소수에 불과하다. 예를 들어, 다발성 경화증 환자의 방광 조절에 미치는 칸나비노이드(경구용 합성 Δ9-테트라하이드로칸나비올(Δ9-THC), 또는 주요 칸나비노이드로서 Δ9-THC 및 칸나비디올(CBD)를 함유하는 칸나비스 추출물)의치료 효과는 CAMS 연구의 조사결과와 함께 보고되었다.13 설치류, 원숭이 및 인간을 포함하는 다양한 종의 방광에 칸나비노이드 수용체 CB1 및 CB2가 존재한다는 증거도 있다.14 또 다른 연구는 방광의 방광염-유도된 염증의 치료에서 치료제로서 합성 칸나비노이드 수용체 리간드 GP1a(선택적 CB2 아고니스트)의 효과를 조사하였다.15 엔도칸나비노이드인 AEA 또는 지방산 에탄올아민인 N-팔미토일에탄올아미드(PEA)의 전신 투여는 래트에서 국소 신경 성장 인자(NGF)-유도된 방광 과다반사 및 배뇨 역치의 감소를 약화시켰다.16 AEA의 효과는 CB1 및 CB2 수용체의 길항작용에 의해 차단되었으며, 이는 엔도칸나비노이드 AEA의 작용이 CB1와 CB2 둘 다에 의해 매개되는 반면, PEA의 효과는 CB2에 의해 크게 좌우된다는 것을 시사한다. 더 이전의 연구는 또한 테레빈유 유도된 방광 과다반사에서 PEA의 칸나비노이드 수용체-매개 효과를 보고하였다.17 탐바로(Tambaro) 등은 LPS-유도된 IC의 모델에서 오르토스테릭(orthosteric) 칸나비노이드 리간드(JWH015)의 사용을 조사하였다.18 실험적 방광염에서 면역반응에 CB2 수용체가 관여하는지를 조사한 몇 가지 기타 연구가 있었다.19
베타-카리오필렌(베타-C)은 CB2 수용체에서 아고니스트로서 작용하는 천연 식이 세스퀴테르페노이드이며, 오레가노 및 계피와 같은 많은 식용 식물뿐만 아니라 대마초에서 풍부한 농도로 발견된다. 베타-C는 염증성 및 신경병성 통증의 마우스 모델에서 진통 및 소염 효과를 나타내며20, 게다가 또한 프로카인에 필적하는 투여량-의존적 국소 마취 작용을 나타낸다.21
전신 방광 염증 모델에서, 베타-C의 투여는 부착성 백혈구의 수를 현저하게 감소시켰고 방광 미세순환에서 기능적 모세혈관의 관류를 내독소 시험투여(challenge) 후에 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 국소 방광 염증 모델에서, 점적주입에 의한 베타-C 투여는 백혈구 부착을 감소시키고 백혈구 롤링(rolling)을 회복시키고 기능적 모세혈관 밀도를 회복시켰다. 베타-C의 경구 투여도 국소 방광 염증 모델에서 백혈구 부착을 감소시키고 대조군 동물에서 기능적 모세혈관 밀도를 증가시켰다. 경구 베타-C 투여는 또한 본 연구에서 사용된 실험적 방광염 모델에서 호흡률, 눈 뜨기, 운동 활동 및 자세 점수를 향상시키고 행동 통증 점수를 감소시키고 통증 회피(pain withdrawal) 역치를 증가시킨 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 출원은 CB2 표적제 국소 마취제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법을 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염의 치료를 위한 CB2 표적제 국소 마취제의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 CB2 표적제 국소 마취제의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 데 사용하기 위한 CB2 표적제 국소 마취제를 포함한다. 본 출원의 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 베타-카리오필렌이다.
따라서, 본 출원은 또한 베타-카리오필렌을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법을 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염의 치료를 위한 베타-카리오필렌의 사용을 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 베타-카리오필렌의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 데 사용하기 위한 베타-카리오필렌을 포함한다.
국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 DMSO 처리의 병용은 부착성 백혈구의 수를 현저히 감소시킨 반면, DMSO 처리 단독만으로는 백혈구 부착을 현저하게 감소시키지 않았다. 5% DMSO 점적주입액 중의 베타-C는 백혈구 부착에 대한 가장 낮은 전체 값을 산출하였다. 마찬가지로, DMSO와 함께 베타-C를 투여하는 것은 방광 미세순환에서 기능적 모세혈관의 관류를 내독소 시험투여 후에 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시킨 반면, DMSO 처리는 그렇지 않았다. 국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 DMSO 점적주입의 병용은 미처리된 군과 비교하여 롤링 유량 수(rolling flux number)를 향상시키고 모세혈관 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 메틸설포닐메탄(MSM)은 DMSO와 유사한 작용을 하지만, 예를 들어 DMSO에 비해 감소된 냄새를 갖기 때문에 유리할 수 있다. 국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 MSM의 경구 투여는 백혈구 부착을 감소시키고 기능적 모세혈관 밀도를 향상시켰다. MSM 점적주입과 병용된 베타-C의 경구 투여는 국소 방광 염증 모델에서 백혈구 부착을 감소시키고 백혈구 롤링을 회복시키고 기능적 모세혈관 밀도를 회복시켰다.
따라서, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 출원의 용도의 일부 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌)는 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제와 함께 병용하기 위한 것이며; 즉, 그 사용은 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 사용을 추가로 포함한다. 본 출원의 일부 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 메틸설포닐메탄(MSM)이다. 일 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다. 다른 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 메틸설포닐메탄(MSM)이다.
본 출원의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적 예들은 본 출원의 실시형태들을 나타내는 한편, 단지 예시로서만 제공되며, 청구범위는 이러한 실시형태들로 제한되지 않아야 하고 설명 전체와 일치하는 가장 광의의 해석을 제공해야 한다.
본 출원의 실시형태는 첨부된 도면을 참조하여 이하 더 상세히 설명할 것이다:
도 1은 베타-카리오필렌(베타-C)으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 CD-1 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(n/mm2)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 2는 베타-카리오필렌(베타-C)으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 CD-1 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링(n/min)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 3은 베타-카리오필렌(베타-C)으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 CD-1 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(mm/mm2)를 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 4는 불량하게 관류되고 감소된 모세혈관상(capillary bed) 크기를 나타내는 LPS-유도된 간질성 방광염을 갖는 암컷 CD-1 마우스의 방광 모세혈관의 현미경 사진이다. 축척 막대는 50 ㎛를 나타낸다.
도 5는 양호한 모세혈관상 확산으로 잘 관류된, 건강한 대조군 암컷 CD-1 마우스의 방광 모세혈관의 현미경 사진이다. 축척 막대는 50 ㎛를 나타낸다.
도 6은 병용 베타-C/DMSO40% 점적주입으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(n/mm2)을 DMSO40% 점적주입 단독으로의 처리(LPS + DMSO), 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 7은 병용 베타-C/DMSO40% 점적주입으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링(n/min)을 DMSO40% 점적주입 단독으로의 처리(LPS + DMSO), 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 8은 병용 베타-C/DMSO40% 점적주입으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(mm/mm2)를 DMSO40% 점적주입 단독으로의 처리(LPS + DMSO), 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 9는 베타-카리오필렌(BCP), 40% DMSO, 또는 BCP와 40% DMSO의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(세포/mm2)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 10은 베타-카리오필렌(BCP), 40% DMSO, 또는 BCP와 40% DMSO의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링(세포/min)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 11은 베타-카리오필렌(BCP), 40% DMSO, 또는 BCP와 40% DMSO의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(cm/cm2)를 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 12는 베타-카리오필렌(BCP) 또는 BCP와 5% DMSO, 40% DMSO 또는 50% DMSO의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(세포/mm2)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 13은 베타-카리오필렌(BCP) 또는 BCP와 5% DMSO, 40% DMSO 또는 50% DMSO의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(cm/cm2)를 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 14는 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(세포/mm2)을 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 15는 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(mm/mm2)를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 16은 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP) 또는 경구 베타-카리오필렌과 메틸설포닐메탄의 병용물로 처리된 LPS-유도된 방광염 모델(LPS + MSM/BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(세포/mm2)을 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 17은 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP) 또는 경구 베타-카리오필렌과 메틸설포닐메탄의 병용물로 처리된 LPS-유도된 방광염 모델(LPS + MSM/BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(mm/mm2)를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 18은 경구 베타-카리오필렌과 방광내 5% 메틸설포닐메탄의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + MSM/BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착(세포/mm2)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 19는 경구 베타-카리오필렌과 방광내 5% 메틸설포닐메탄의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + MSM/BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링(세포/min)을 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 20은 경구 베타-카리오필렌과 방광내 5% 메틸설포닐메탄의 병용물로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + MSM/BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류(mm/mm2)를 건강한 대조군(CON) 및 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS)과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다.
도 21은 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 호흡률의 행동 결과를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 파라미터에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
도 22는 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 눈 뜨기의 행동 결과를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 파라미터에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
도 23은 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 운동 활동의 행동 결과를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 파라미터에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
도 24는 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 자세의 행동 결과를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 파라미터에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
도 25는 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 행동 결과의 총 종합 점수를 건강한 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 군에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
도 26은 경구 베타-카리오필렌으로 처리된 지질다당류(LPS)-유도된 방광염 모델(LPS + BCP)에 대한 암컷 BALB/c 마우스에서 관찰된, 반응(예를 들어, 회피) 전에 전자 폰 프레이 촉공간역치측정을 통해 가해진 힘의 양(그램)을 대조군(CON), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS) 및 경구 베타-카리오필렌(BCP)으로 처리된 건강한 대조군과 비교하여 도시하는 플롯이다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 군에 대해 평균 ± SD가 제시되어 있다.
I. 정의
달리 나타내지 않는 한, 본 섹션 및 다른 섹션에서 설명되는 정의 및 실시형태는 당업자에 의해 적합한 것으로 이해될 수 있는 본원에서 설명되는 본 출원의 모든 실시형태 및 양상에 적용될 수 있는 것으로 의도된다.
본 출원은 당업자가 사용하는 다수의 화학 용어들 및 약어들을 언급한다. 그럼에도 불구하고, 명료성과 일관성을 위해 선택된 용어들의 정의가 제공된다.
본원에서 사용되는 단어 "포함하는"(및 "포함하다(comprise/comprises)"와 같은 '포함하는'의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖다(have/has)"와 같은 '갖는'의 임의의 형태), "포괄하는"(및 "포괄하다(includes/include)"와 같은 '포괄하는'의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다(contains/contain)"과 같은 '함유하는'의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며 추가의 인용되지 않은 성분들 또는 공정/방법 단계들을 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "로 이루어진" 및 이의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수 및/또는 단계의 존재를 명시하고 또한 다른 언급되지 않은 특징, 요소, 성분, 군, 정수, 및/또는 단계의 존재를 배제하는 폐쇄형 용어인 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "으로 본질적으로 이루어진"은 언급된 특징, 요소, 성분, 군, 정수 및/또는 단계뿐만 아니라, 이러한 특징, 요소, 성분, 군, 정수 및/또는 단계의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들의 존재를 명시하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "실질적으로", "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어들은 최종 결과가 현저하게 변하지 않을 정도로 상당량 이탈된 용어 변형을 의미한다. 이러한 정도의 용어들은, 이러한 이탈이 그것이 수식하는 단어의 의미를 부정하지 않는다면 상기 수식된 용어의 적어도 ±5%의 이탈을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 출원에서 사용되는 단수형(원문의 "a", "an" 및 "the")은 내용상 분명히 다르게 표시하지 않는 한 복수형의 지시대상(reference)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 열거된 항목이 개별적으로 또는 조합되어 존재하거나 사용됨을 의미한다. 사실상, 상기 용어는 열거된 항목 "중 적어도 하나" 또는 "의 하나 이상"이 사용되거나 존재하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "CB2 표적제 국소 마취제"는 CB2 수용체에 결합하고/하거나 활성화시키고/시키거나 이의 활성화를 증가시키고 추가로 국소 마취 작용을 갖는 화합물을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "CB2 오르토스테릭 아고니스트 국소 마취제"는 CB2 수용체에서 오르토스테릭 아고니스트로서 작용하고 추가로 국소 마취 작용을 갖는 화합물을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "베타-카리오필렌", "베타-C" 또는 "BCP" 등은 하기의 화학 구조를 갖는 화합물을 가리킨다:
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용어 "약제학적으로 허용가능한"은 대상체, 예를 들어 인간과 같은 포유동물의 치료와 양립가능하다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 위장관을 통한 것이 아닌 방식으로 체내로 흡수되거나 투여되거나 사용되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "장관"은 위장관을 통한 방식으로 체내로 흡수되거나 투여되거나 사용되는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "대상체"는 포유동물을 비롯한 동물계의 모든 구성원을 가리킨다. 일 실시형태에서, 대상체는 이간이다. 본 출원의 다른 실시형태에서, 대상체는 여성이다.
본원에서 사용되고 당업계에서 잘 이해되고 있는 용어 "치료하기 위한", "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 비롯한 유익하거나 목적하는 결과를 얻기 위한 접근법을 가리킨다. 유익하거나 또는 목적하는 임상 결과는, 검출가능한지 또는 검출 불가능한지 여부에 관계 없이, 간질성 방광염의 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 간질성 방광염의 정도의 감쇠, 간질성 방광염의 안정화(즉, 악화되지 않음), 간질성 방광염 진행의 지연 또는 둔화, 간질성 방광염의 질환 상태의 개선 또는 완화, 간질성 방광염의 재발의 감쇠 및/또는 간질성 방광염의 (부분적 또는 전체) 관해를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 본원에서 사용되는 "치료하기 위한", "치료하는" 또는 "치료"는 또한 간질성 방광염의 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 초기 간질성 방광염을 앓는 대상체를 치료하여 진행을 예방하거나 대안적으로 관해 상태의 대상체를 치료하여 재발을 예방한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여된"은 세포 배양물 또는 대상체 내의 세포에 치료 유효량의 CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌) 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제(예: DMSO 또는 MSM)를 투여하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 목적하는 결과를 달성하기 위해 요구되는 투여량에서 및 기간 동안 유효한 양을 의미한다. 예를 들어, 간질성 방광염의 맥락에서, CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌) 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제(예: DMSO 또는 MSM)의 유효량은, 예를 들어 CB2 표적제 국소 마취제 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를 투여하지 않은 간질성 방광염과 비교하여 간질성 방광염을 감소시키는 양이다. "간질성 방광염을 감소시킨다"란, 예를 들어 요로 기능장애, 신경성 염증 및/또는 신경병성 통증과 같은 간질성 방광염의 증상 또는 효과를 감소시키는 것을 의미한다. 유효량은 대상체의 질환 상태; 연령, 성별 및/또는 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 이러한 양에 상응할 CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌) 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 양은 소정의 CB2 표적제 국소 마취제(또는 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제), 약제학적 제형, 투여 또는 사용 경로, 치료될 대상체의 정체 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이나, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "요로 기능장애"는 방광 요로상피 및 요로 상피 세포의 기능장애를 가리킨다.22 요로상피 기능장애는 방광 요로상피 생리학의 다수의 이상을 동반할 수 있으며, 예를 들어 간질성 방광염의 병태생리학의 특징일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "신경성 염증"은 물질 P, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드, 뉴로키닌 A 및 엔도텔린-3과 같으나 이에 한정되지 않는 구심성 뉴런의 감각 신경 말단으로부터의 염증 매개인자의 국소적 방출에 기인하는 염증을 가리키며, 예를 들어 간질성 방광염의 병태생리학의 특징일 수 있다.23 LPS에 의해 자극된 TRPA1 채널도 신경성 염증을 유도할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "신경병성 통증"은 체성감각 신경계에서 발생하는 손상 및/또는 질환에 의해 유발되는 통증을 가리키며, 예를 들어 간질성 방광염의 병태생리학의 특징일 수 있다.24
II. 방법 및 용도
전신 방광 염증 모델에서, 베타-C의 투여는 부착성 백혈구의 수를 현저하게 감소시켰고 방광 미세순환에서 기능적 모세혈관의 관류를 내독소 시험투여 후에 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 국소 방광 염증 모델에서, 점적주입에 의한 베타-C 투여는 백혈구 부착을 감소시키고 백혈구 롤링(rolling)을 회복시키고 기능적 모세혈관 밀도를 회복시켰다. 베타-C의 경구 투여는 또한 국소 방광 염증 모델에서 백혈구 부착을 감소시키고 대조군 동물에서 기능적 모세혈관 밀도를 증가시켰다. 경구 베타-C 투여는 또한 본 연구에서 사용된 실험적 방광염 모델에서 호흡률, 눈 뜨기, 운동 활동 및 자세 점수를 향상시키고 행동 통증 점수를 감소시키고 통증 회피 역치를 증가시킨 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 출원은 CB2 표적제 국소 마취제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법을 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염의 치료를 위한 CB2 표적제 국소 마취제의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 CB2 표적제 국소 마취제의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 데 사용하기 위한 CB2 표적제 국소 마취제를 포함한다.
일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 CB2 오르토스테릭 아고니스트 국소 마취제이다. 다른 실시형태에서, CB2 오르토스테릭 아고니스트 국소 마취제는 베타-카리오필렌이다. 다른 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 베타-카리오필렌이다.
따라서, 본 출원은 또한 베타-카리오필렌을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법을 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염의 치료를 위한 베타-카리오필렌의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 베타-카리오필렌의 용도를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 데 사용하기 위한 베타-카리오필렌을 포함한다.
국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 DMSO 처리의 병용은 부착성 백혈구의 수를 현저히 감소시킨 반면, DMSO 처리 단독만으로는 백혈구 부착을 현저하게 감소시키지 않았다. 5% DMSO 점적주입액 중의 베타-C는 백혈구 부착에 대한 가장 낮은 전체 값을 산출하였다. 마찬가지로, 베타-C와 DMSO의 투여는 방광 미세순환에서 기능적 모세혈관의 관류를 내독소 시험투여 후에 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시킨 반면, DMSO 치료는 그렇지 않았다. 국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 DMSO 점적주입의 병용은 미치료 군과 비교하여 롤링 유량 수(rolling flux number)를 향상시키고 모세혈관 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 메틸설포닐메탄(MSM)은 DMSO와 유사한 작용을 하지만, 예를 들어 DMSO에 비해 감소된 냄새를 갖기 때문에 유리할 수 있다. 국소 방광 염증 모델에서, 베타-C와 MSM의 경구 투여는 백혈구 부착을 감소시키고 기능적 모세혈관 밀도를 향상시켰다. MSM 점적주입과 병용된 베타-C의 경구 투여는 국소 방광 염증 모델에서 백혈구 부착을 감소시키고 백혈구 롤링을 회복시키고 기능적 모세혈관 밀도를 회복시켰다.
따라서, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 출원의 용도의 일부 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌)는 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제와 함께 사용하기 위한 것이며; 즉, 그 사용은 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 사용을 추가로 포함한다. 본 출원의 일부 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 메틸설포닐메탄(MSM)이다. 일 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다. 다른 실시형태에서, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 메틸설포닐메탄(MSM)이다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-카리오필렌)는 선택된 투여 또는 사용 경로에 따라 다양한 형태로 대상체에게 투여되거나 사용된다. 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 예를 들어 장관 또는 비경구 경로에 의해 대상체에게 투여되거나 사용되며, CB2 표적제 국소 마취제는 그에 맞게 제형화된다. 적합한 조성물의 선택 및 제조를 위한 통상적인 절차 및 성분은 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (2000 - 20th edition)] 및 1999년에 발행된 미국약전[The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)]에 기재되어 있다.
장관 투여 또는 사용은 위장관이 관련된 모든 경로, 예를 들어 경구(oral), 구강(buccal), 설하, 비강 및 직장을 포함한다. 본 출원의 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제의 장관 투여 또는 사용은 경구 투여 또는 사용이고; 즉, CB2 표적제 국소 마취제는 경우에 따라 경구 투여되거나 경구 사용을 위한 것이다. 경구 투여 또는 사용에 적합한 제형은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 CB2 표적제 국소 마취제를 포함하는 캡슐의 형태로 경구 투여되거나 경구 사용하기 위한 것이다.
비경구 투여 또는 사용은 방광내, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 경상피, 폐내, 경막내 및 국소 투여 또는 사용 방식을 포함한다. 비경구 투여 또는 사용에 적합한 제형은 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 제조된다. 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제의 비경구 투여 또는 사용은 방광내 투여 또는 사용이며; 즉, CB2 표적제 국소 마취제는 경우에 따라 방광내 투여되거나 또는 방광내 사용을 위한 것이다. 예를 들어, CB2 표적제 국소 마취제가 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 메틸설포닐메탄(MSM)과 함께 투여되거나 또는 사용하기 위한 일부 실시형태에서, 방광내 투여는 CB2 표적제 국소 마취제 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 메틸설포닐메탄(MSM)을 포함하는 수용액의 형태이다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 방광내 사용을 위한 다른 적합한 용매에 용해되어 방광내 투여되거나 사용하기 위한 것이며, 상기 용매는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제의 비경구 투여 또는 사용은 국소 투여 또는 사용이고; 즉, CB2 표적제 국소 마취제는 경우에 따라 국소 투여되거나 국소 사용을 위한 것이다. 국소 투여 또는 사용에 적합한 제형은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제는 국소 크림으로 투여되거나 사용하기 위한 것이다; 즉, 국소 투여 또는 사용은 CB2 표적제 국소 마취제를 포함하는 국소 크림의 형태이다. 이러한 국소 크림은 또한 적합한 비-약제 성분을 함유한다.
간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는, 예를 들어 제제의 정체에 의존할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 적합한 경로 또는 투여형태를 통해 제형화되고 투여되거나 사용된다. 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제가 DMSO인 실시형태에서, 투여 또는 사용은 방광내 투여 또는 사용이다. 정맥내 투여 또는 사용에 적합한 DMSO 제형은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, DMSO는 약 40% 또는 약 50% 디메틸 설폭사이드를 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 다른 실시형태에서, DMSO는 약 1% 내지 약 60% 또는 약 5% 내지 약 50% 디메틸 설폭사이드를 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, DMSO는 약 1% 내지 약 10% 또는 약 5% DMSO를 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, DMSO는 약 35% 내지 약 45% 또는 약 40% DMSO를 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, DMSO는 약 45% 내지 약 55% 또는 약 50% DMSO를 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가의 제제가 MSM인 일부 실시형태에서, 투여 또는 사용은 방광내 투여 또는 사용이다. 방광내 투여 또는 사용에 적합한 MSM 제형은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, MSM은 약 40% 또는 약 50% 메틸설포닐메탄을 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 다른 실시형태에서, MSM은 약 1% 내지 약 60% 또는 약 5% 내지 약 50% MSM을 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, MSM은 약 1% 내지 약 10% 또는 약 5% MSM을 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시형태에서, MSM은 약 35% 내지 약 45% 또는 약 40% MSM을 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, MSM은 약 45% 내지 약 55% 또는 약 50% MSM을 포함하는 수용액으로서 투여되거나 사용된다. 이러한 방광내 점적주입을 위한 제형에서 물이 약제학적으로 허용가능한 물이라는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제가 MSM인 다른 실시형태에서, 투여 또는 사용은 경구 투여 또는 사용이고; 즉, MSM은 경우에 따라 경구 투여되거나 경구 사용을 위한 것이다. 경구 투여 또는 사용에 적합한 제형은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, MSM은 MSM을 포함하는 캡슐의 형태로 경구 투여되거나 경구 사용하기 위한 것이다. 본 출원의 일부 실시형태에서, 캡슐은 MSM 및 CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-C)를 포함한다.
치료 방법은 CB2 표적제 국소 마취제(및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제)를 대상체에게 투여하거나 사용하는 것을 포함하고, 임의로 단일 투여 또는 사용으로 이루어지거나, 대안적으로 일련의 투여 또는 사용을 포함한다. 치료 기간의 길이는 간질성 방광염의 중증도, 대상체의 연령 및/또는 성별, CB2 표적제 국소 마취제의 활성 및/또는 제형, 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 정체 및/또는 제형화 및/또는 이들의 조합과 같은 다양한 요인에 의존한다.
CB2 표적제 국소 마취제가 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제와 함께투여되거나 사용되는 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 시간 및/또는 투여 또는 사용 방식이 각기 다르게 투여되거나(즉, 상이한 투여 또는 사용 경로) 이들은 동일한 약제학적 제제 중에서 함께 및/또는 동시에 투여되거나 사용하기 위한 것이고, 이것은 예를 들어 제제의 정체에 의존할 수 있다.
그것은 CB2 표적제 국소 마취제 및 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제가 시간 및/또는 투여 또는 사용 방식이 각기 다르게 투여되는 실시형태이다.
또 다른 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 동시에 투여되거나 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에 대한 2가지 물질의 동시적 투여 또는 사용은, CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 약리학적 효과가 동시에 대상체에 존재하도록 CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를 제공하는 것을 의미한다. 투여 또는 사용에 대한 정확한 세부사항은 서로의 존재 하에 CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 약동학에 의존할 것이며 CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를 서로 수시간 이내에 투여 또는 사용하거나 CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제를, 약동학이 적합하다면, 심지어 서로를 투여 또는 사용한지 24시간 또는 48시간 이내에 또는 그 이상의 시간 이내에 투여 또는 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 동시적 투여 또는 사용은 CB2 표적제 국소 마취제를 원하는 기간 동안 매일 투여 또는 사용하고 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제(예컨대, DMSO 또는 MSM)를 원하는 기간에 걸쳐 1회 이상의 사이클로서 투여 또는 사용하는 것을 포함하며, 여기서 CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 투여 또는 사용은 동시에 개시될 수 있거나 개시되지 않을 수도 있으며 동시에 완료될 수 있거나 완료되지 않을 수 있다. 적합한 투약 계획의 설계는 당업자에게 일상적인 것이다.
본 출원의 또 다른 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제와 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 비동시적 방식으로 대상체에게 투여되거나 사용하기 위한 것이다.
본 출원의 추가의 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제 및 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 동시적 방식으로 대상체에게 투여되거나 사용되고 이어서 비동시적 방식의 투여 또는 사용이 뒤따르거나 이로 교대되며, 예를 들어 CB2 표적제 국소 마취제 및 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제가 동시적 방식으로 투여 또는 사용되고 이어서 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가의 제제의 투여 없이 CB2 표적제 국소 마취제가 대상체에게 투여되거나 사용된다.
CB2 표적제 국소 마취제 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 투여량은 이들의 약력학적 특성, 투여 또는 사용 방식, 대상체의 연령, 성별, 건강 및/또는 체중, 증상의 성질 및 범위, 치료 빈도 및 병행 치료의 유형(있는 경우) 및 치료될 대상체의 청소율(clearance rate)과 같은 많은 요인에 따라 달라진다. 당업자는 상기 요인들에 기초하여 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 대표적인 예로서, CB2 표적제 국소 마취제의 경구 투여량은 인간 성인에 대해 약 1 mg/일 내지 약 1000 mg/일의 범위일 수 있다. 본 출원의 일 실시형태에서, CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-C)는 경구 투여 또는 사용을 위해 제형화되고 CB2 표적제 국소 마취제는 예를 들어 캡슐당 0.25, 0.5, 0.75, 50.0, 70.0, 75.0, 80.0, 90.0, 100.0, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 mg의 CB2 표적 약제 국소 마취제(예: 베타-C)를 함유하는 캡슐의 형태이다. 다른 실시형태에서, 캡슐은 캡슐당 25 mg의 CB2 표적제 국소 마취제(예: 베타-C)를 함유한다. 대표적인 예로서, 메틸설포닐메탄(MSM)의 경구 투여량은 인간 성인에 대해 1일당 약 4000mg까지의 범위일 수 있다. 본 출원의 일 실시형태에서, MSM의 경구 투여량은 약 1500 mg/일 내지 약 2000 mg/일이다. 본 출원의 다른 실시형태에서, MSM은 경구 투여 또는 사용을 위해 제형화되며, MSM은 예를 들어 캡슐 당 50, 100, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 또는 2000 mg의 MSM을 함유하는 캡슐의 형태이다. CB2 표적제 국소 마취제 및 임의로 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제는 처음에는, 임상 반응에 따라 필요한대로 임의로 조정될 수 있는 적합한 투여량으로 투여되거나 사용될 수 있다.
하기 비제한적인 실시예는 본 출원을 설명한다:
실시예
실시예 1: 결과적인 방광 염증을 갖는 국소 및 전신 염증 동물 모델
I. 재료 및 방법
(a) 동물 모델
동물: 찰스 리버 래버러토리즈사(Charles River Laboratories, Inc.)(미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 암컷 CD-1 및 BALB/c 마우스(20 내지 40g)를 입수하고 1주간의 순응 기간 후에 실험에 사용하였다. 모든 실험 절차는 동물 보호에 대한 캐나다 협회의 지침(Guidelines of the Canadian Council on Animal Care)에 따라 수행되었으며 댈하우지대학교 실험동물 위원회(Dalhousie University Laboratory Animals Committee)의 승인을 받았다. 동물들은 캐나다 노바스코샤주 핼리팩스 소재의 댈하우지대학교 의학부의 칼턴(Carlton) 동물 보호 시설에서 사육하였다. 본 연구에서 사용된 마우스에는 표준 12시간 명/암 주기 조건 하에 물과 설치류 사료를 제공하고 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 2종의 동물 IC 모델을 사용하였다: 전신(내독소혈증-유도된) 방광 염증 모델 및 국소(내독소-유도된) 방광 염증 모델.
전신 방광 염증 모델: 동물을 펜토바비탈 투여(i.p.)를 통해 마취시켰다. 마취 유도 후, 10 mg/kg 지질다당류(LPS; 동의어: 내독소)를 복강내 투여하여 전신 염증(내독소혈증)을 유도하였다. LPS 주사(t = 0분) 후, 동물들은 실험군에 따라 요법을 받았다(t= 15분). 처리 후, 동물들을 가열 패드 위에 놓고, 마취 깊이, 호흡 및 전체적인 편안함을 면밀히 모니터링하였다. 처리 2시간 후, 동물을 하기 설명하는 바와 같이 IVM용으로 준비시켰다. 마우스 군은 다음과 같았다: (1) 식염수-주사 대조군, (2) LPS-주사 실험군 및 (3) LPS 및 100 mg/kg 베타-C 주사 처리군.
국소 방광 염증 모델: 동물을 펜토바비탈 투여(i.p.)를 통해 마취시켰다. 그 후, P10 카테터를 요도에 조심스럽게 삽입하였다. 가요성 카테터가 요도 외상을 일으킬 가능성이 적기 때문에 가요성 카테터를 사용하였다. 이어서, 방광에 약한 압력을 가하여 방광 내용물을 제거하는 것을 수반하는 크레데 메뉴버(Crede's maneuver)를 사용하여 방광을 수동으로 배액하였다. 이후, LPS 용액(100 ㎍/ml)을 30분 동안 천천히 점적주입하였다25. 역류 또는 누출을 피하기 위해, 방광내 점적주입 후에 카테터를 클램핑하였다. LPS 점적주입 기간이 만료되면, LPS 용액을 방광으로부터 제거하고 실험군에 따라 식염수 또는 약물 점적주입으로 대체하였다. 마우스 군은 다음과 같았다: (1) 식염수를 점적주입하는 대조군, (2) 식염수를 점적주입하는 LPS 군, (3) 베타-C와 DMSO(40%)를 점적주입하는 LPS 군 및 (4) DMSO(40%)를 점적주입하는 LPS 군. 군 (3)에서는, 투여 전에 베타-C를 DMSO에 용해시키고, DMSO와 베타-C를 단 1회의 점적주입으로서 동시에 투여하였다.
(b) 방광의 생체 현미경검사
마취 깊이를 임상 검사(페달 회피 반사의 복귀)에 의해 지속적으로 모니터링하면서 5 mg/kg 페토바르비탈의 IP 주사를 반복하여 마취를 유지하였다. 방광을 생체 현미경검사(IVM)용으로 준비하기 위해 개복술을 실시하였다. 이어서, 방광을 사전 습윤된(가온된 식염수) 면봉 도포구로 조심스럽게 노출시키고 약간의 각도에 위치시켰다. 현미경검사 관찰이 가능하도록 작은 커버 슬립을 방광의 상단에 위치시켰다. 생체 현미경검사 동안 호흡 아티팩트(artifact)를 피하기 위해, 복부 지방과 근육을 복부 상부의 가열 및 보습된 면 스폰지에 약한 압력을 가하는 금속 아암(arm)을 통해 방광에서 멀리 떨어뜨려 놓아서 호흡과 같은 횡격막 활동으로 인한 상당한 움직임을 방지한다. 복부 절개를 가능한 한 작게 유지하면서, 검사하지 않을 복부의 모든 부위를 거즈로 덮고, 탈수 및 주변 공기에 노출되는 것을 피하기 위해 생리학적 온도에서 유지되는 생리식염수에 부분적으로 침지시키고 지속적으로 초수화(super-hydrate)시켰다. 백혈구-내피 상호작용을 가시화하기 위해, 0.05% 로다민-6G 용액을 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하고 5% FITC- 알부민 용액(정맥내)을 사용하여 모세혈관상의 명확한 평가를 용이하게 하였다. 초점 설정 후, 컴퓨터화 영상 시스템을 사용하여 방광 벽 내의 모세혈관의 무작위 영역의 5개의 비디오 시퀀스(30초)를 기록하였다. 이어서, 비디오 시퀀스를 확립된 프로토콜에 따라 분석하였다.
(c) 통계 분석
결과를 소프트웨어 Prism 6(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 분석하였다. 모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로서 표현하였다. 콜모고로프-스미르노프(Kolmogorov-Smirnov) 검정에 의해 정규 분포를 확인한 후, 군들을 일원분산분석(ANOVA)과 던네트(Dunnett) 사후검정을 사용하여 유의성에 대해 검사하였다. 유의성은 p <0.05에서 고려되었다.
II. 결과
(a) 전신 방광 염증 모델
백혈구 부착: 도 1은 건강한 대조군(CON; n=9), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=9) 및 CB2 아고니스트인 베타-C로 처리된 LPS-유도된 방광염(베타-C, n=9)에 대한 암컷 CD-1 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. # p <0.05 대 LPS. 도 1에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서는 낮은 기준선 수준의 백혈구 부착이 관찰되었다. 내독소 시험투여된 동물에서는 대조군 동물과 비교하여 부착성 백혈구 수의 유의적 증가가 관찰되었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 베타-C 처리는 부착성 백혈구의 수를 유의적으로 감소시켰다.
백혈구 롤링: 도 2는 건강한 대조군(CON; n=9), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=9) 및 CB2 아고니스트인 베타-C로 처리된 LPS-유도된 방광염(베타-C, n=7)에 대한 암컷 CD-1 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. 도 2에 도시된 바와 같이, 건강한 대조군은 백혈구 롤링의 기본 수준과 관련되었다. LPS 투여는 롤링 백혈구의 수를 대조군 동물과 비교하여 유의적으로 감소시켰다. 베타-C 처리군은 양성 경향을 나타냈지만, 내독소혈증 군에 비해 롤링 백혈구의 수를 유의적으로 변화시키지 않았다.
기능적 모세혈관 밀도: 도 3은 건강한 대조군(CON; n=9), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=9) 및 CB2 아고니스트인 베타-C로 처리된 LPS-유도된 방광염(베타-C, n=7)에 대한 암컷 CD-1 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. # p <0.05 대 LPS. 도 4 내지 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 내독소 시험투여 후에 방광 미세순환에서의 기능적 모세혈관의 수는 건강한 대조군(도 5)과 비교하여 유의적으로 감소되었다(도 4). 베타-C의 투여는 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다.
(b) 국소 방광 염증 모델
백혈구 부착: 도 6은 건강한 대조군(CON; n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), BCP/DMSO40% 점적주입으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP; n=3) 및 DMSO40% 점적주입으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+DMSO, n=2)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. # p <0.05 대 LPS. 도 6에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서는 낮은 기준선 수준의 백혈구 부착이 관찰되었다. 내독소 시험투여된 동물에서는 대조군 동물과 비교하여 부착성 백혈구 수의 유의적 증가가 관찰되었다. 베타-C + DMSO 처리는 부착성 백혈구의 수를 유의적으로 감소시켰다. 대조적으로, DMSO 처리 단독만으로는 백혈구 부착을 유의적으로 감소시키지 않았다.
백혈구 롤링: 도 7은 건강한 대조군(CON; n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), BCP/DMSO40% 점적주입으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP; n=3) 및 DMSO40% 점적주입으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+DMSO, n=2)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. 도 7에 도시된 바와 같이, 건강한 대조군은 백혈구 롤링의 기본 수준과 관련되었다. LPS 투여는 롤링 백혈구의 수를 대조군 동물과 비교하여 유의적으로 감소시켰다. 베타-C 처리와 DMSO 또는 DMSO 단독은 본 모델에서 내독소혈증 군과 비교하여 어떠한 유의차도 나타내지 않았다.
기능적 모세혈관 밀도: 도 8은 건강한 대조군(CON; n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), BCP/DMSO 40% 점적주입으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + DMSO, n=3) 및 DMSO 40%로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + DMSO, n=2)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. # p <0.05 대 LPS. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 내독소 시험투여 후에 방광 미세순환에서의 기능적 모세혈관의 수는 대조군과 비교하여 유의적으로 감소되었다. 베타-C와 DMSO의 투여는 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 대조적으로, DMSO 단독 처리는 관류를 향상시켰지만, 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시키지는 않았다.
III. 논의
결과적인 방광 염증을 갖는 국소 및 전신 염증 모델은 염증과 방광 기능장애 및 통증의 실험 모델을 제공한다. 도 1 내지 3 및 도 6 내지 8의 데이터는 다음을 보여주었다: 1) 베타-C 처리군에서 LPS 시험투여 후 백혈구-내피 세포 부착의 감소; 2) 베타-C 처리군에서 LPS 시험투여 후 방광의 모세혈관 관류의 유의적 향상; 그러나 3) 잠재적으로 이하 보다 상세히 논의되는 이유로 인해 베타-C 처리군에서 백혈구 롤링의 유의적 변화 없음.
현재의 연구의 조사결과는 CB2 수용체의 조절을 통한 방광염의 염증 반응의 약화를 보여줄뿐만 아니라, 다수의 표적; 칸나비노이드 수용체와 비-칸나비노이드 수용체 둘 다를 통해 작용하여 염증뿐만 아니라 통증을 감소시키고 국소 마취를 통해 완화를 일으키는 테르페노이드 베타-C와 같은 특정의 CB2 리간드에 대한 역할을 확인시켜 주는 새로운 데이터를 제공한다. 또한, 본 연구의 결과는 DMSO와 CB2 오르토스테릭 아고니스트(예: 베타-C)와 같은 병용 요법이 DMSO 단독과 같은 기존의 요법보다 유리할 수 있음을 보여준다.
요로상피 기능장애는 사이토카인 생산 및 비만세포 활성화의 상향조절을 초래한다. 실험적 연구에서 얻은 현재의 증거는 방광의 비만세포 활성화가 IC의 병태 생리학에서 중심적 역할을 한다고 시사하였다26. 게다가, 비만세포는 인터류킨(IL) -6, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)와 같은 다양한 사이토킨을 분비하기 때문에 염증에 관여한다고 언급된다27. 또한, 비만세포 자체는 염증의 개시에 필수적인 백혈구-내피 상호작용을 매개하는 분자인 세포 부착 분자(CAM)28, 특히 내피 세포 ICAM-1(세포내 CAM-1) 및 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM-1)를 생성하고 이들의 발현을 조절한다. IC 환자 유래의 방광 생검에서 백혈구-내피 부착에 관여하는 ICAM-1 및 기타 분자의 존재를 조사한 연구는 IC 환자의 방광 조직이 다양한 CAM의 발현을 가졌음을 보여주었다29. 또한, 비만세포는 LPS-유도된 염증 모델에서 LPS 시험투여에 반응하여 활성화를 위해 toll-유사 수용체 4(TLR-4)를 필요로 하는 것으로 나타났다.30 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이것은 백혈구 부착의 증가 및 염증 반응의 증대를 초래하는 활성화된 비만세포에 의한 ICAM-1의 발현 및 조절 과정이 본 연구에서 사용된 LPS-유도된 IC 모델 내에서 발생하고 있음을 시사한다. 염증 동안, 부착성 백혈구의 수가 증가하면, 백혈구 롤링의 감소를 볼 수 있을거라 예상되며, 이는 본 연구의 여러 군들에 걸쳐 관찰된다. 그러나, 베타-C의 투여는 관련된 백혈구 부착의 감소와 함께, 백혈구 롤링을 대조군에서 나타난 수준과 유사한 수준으로 회복시키지 않았다. 이것의 한 가지 이유는 관찰 시기가 너무 빨라서 롤링 횟수의 유의적 변동을 인식하지 못했기 때문일 수 있다. 그러나, 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 다른 가능한 설명은 베타-C가 백혈구의 동원을 지속적으로 억제한다는 것이고, 이것은 베타-C 처리 후에 관찰되는 롤링 백혈구의 적은 수를 설명할 수 있다.
미세혈관 관류는 혈관계의 전반적인 생리학적 상태의 유용한 지표이다. 모세혈관 관류의 조절은 신경내분비, 주변분비 및 기계적감각 경로의 상호작용을 통해 달성된다.31 그러나, 전신 염증 동안, 부착 분자의 상향 조절 때문에 적혈구의 변형성의 감소, 혈액 점도의 증가 및 활성화된 백혈구의 응집성의 증가와 같은 다양한 요인으로 인해 이러한 과정의 방해가 인식된다.32 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 기전들이 군들에서 관찰된 FCD 변화를 설명한다고 믿어진다. 또한, 조사결과는 래트 내독소혈증 모델에서 TLR-4의 차단이 장내 미세순환 관류를 증가시킨다는 것을 보여주었다33. 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이는 TLR-4 경로의 LPS-매개 활성화가 모세혈관 관류에서 역할을 한다는 것을 시사한다. 예를 들어, 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 염증촉진성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 접착 분자의 방출 증가에 관여하는 NF-κB의, 베타-C에 의한 직접적 또는 간접적 억제는34 본 연구에서 관찰된 FCD의 향상을 유도할 수 있었으며 따라서 유사한 활성을 나타내는 화합물도 이러한 병태의 치료에 유용할 수 있다. 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, LPS 시험투여로 인한 과도한 면역활성화에도 불구하고 베타-C 처리군의 혈관 관류 데이터 내의 유의적 향상의 존재는 실험적 IC에서의 CB2 관련 면역조절의 강력한 역할을 시사한다.
임상 연구에서, 비만세포에 의해 방출되는 염증촉진성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α는 IC 환자의 혈청에서 고농도로 발견되는 주요 사이토카인들 중 2인 것으로 관찰되었으며, IC에 대한 바이오마커로서 개발될 수 있다35. 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 IL-6 및 TNF-α의 현저한 증가는 부분적으로 IC에서의 비만세포의 역할에 기인할 수 있다. 이러한 조사결과와 일치하여, 수많은 연구들도 LPS 처리된 설치류 신경교 또는 LPS 유도된 내독소혈증에서 CB2 수용체 활성화를 통한 염증촉진성 사이토킨, 특히 TNF-α의 억제를 보고하였다.36 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이는 본 연구에서 관찰된 베타-C의 치료 효과를 유도할 수 있으며, 따라서 유사한 활성을 나타내는 화합물도 IC의 치료에 유용할 수 있다.
요약하면, 본 데이터는 베타-C와 같은 추가적인 국소 마취 작용을 갖는 CB2 수용체 아고니스트가 IC에서 염증과 통증 둘 다를 감소시키는 데 유용할 수 있고, 게다가 CB2 수용체 아고니스트가 DMSO 요법과 같은 IC에 대한 기존의 요법과 함께 공동-투여될 경우, 이러한 IC에 대한 병용 요법의 효능이 유리할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 2: 결과적인 방광 염증을 갖는 국소 및 전신 염증 동물 모델을 사용한 추가 연구
I. 재료 및 방법
동물: 찰스 리버 래버러토리즈사(미국 매사추세츠주 윌밍턴)로부터 암컷 BALB/c 마우스(도착시 6주령, 체중 20 내지 30g)를 입수하고 1주간의 순응 기간 후에 실험에 사용하였다. 모든 실험 절차는 동물 보호에 대한 캐나다 협회의 지침에 따라 수행되었으며 댈하우지대학교의 실험동물 위원회의 승인을 받았다. 동물들은 캐나다 노바스코샤주 핼리팩스 소재의 댈하우지대학교 의학부의 칼턴 동물 보호 시설에서 사육하였다. 본 연구에서 사용된 마우스에는 표준 12시간 명/암 주기 조건 하에 물과 설치류 사료를 제공하고 자유롭게 접근할 수 있게 하였다.
국소 방광 염증 모델: 동물을 펜토바비탈 투여(i.p.)를 통해 마취시켰다. 이어서, 개복술을 실시하여 방광에 접근하고 방광 접적주입 성공을 가시적으로 확인하였다. 방광이 주변 조직과 기관에 노출되면, 방광을 (방광에 약한 압력을 가하여 방광 내용물을 제거하는 것을 수반하는 크레데 메뉴버와 유사하게) 약한 압력을 가하여 수동으로 배액하였다. 이어서 P10 카테터를 요도에 삽입하였다. 가요성 카테터가 요도 외상을 일으킬 가능성이 적기 때문에 가요성 카테터를 사용하였다. LPS 용액(150 ㎍/ml)을 천천히 점적주입하고 30분 동안 방광에서 유지시켰다. 이어서, 방광의 모든 면이 LPS에 동일하게 노출되는 것을 보장하기 위해 동물을 중간 지점에서 가열 패드상에서 회전시켰다. 역류 또는 누출을 피하기 위해, 방광내 점적주입 후에 카테터를 클램핑하였다. LPS 점적주입 기간이 만료되면, LPS 용액을 방광으로부터 제거하고 실험군에 따라 식염수 또는 약물 점적주입으로 대체하였다(상기 실시예 1에서 설명한 바와 같음).
방광의 생체 현미경검사: 마취 깊이를 임상 검사(페달 회피 반사의 복귀)에 의해 지속적으로 모니터링하면서 상기와 동일한 마취된 동물을 5 mg/kg 페토바비탈의 IP 주사를 반복하여 유지시켰다. 방광을 사전 습윤된(가온된 식염수) 면봉 도포구로 조심스럽게 노출시키고 약간의 각도에 위치시켰다. 현미경검사 관찰이 가능하도록 작은 커버 슬립을 방광의 상단에 위치시켰다. 생체 현미경검사 동안 호흡 아티팩트를 피하기 위해, 복부 지방과 근육을 복부 상부의 가열 및 보습된 면 스폰지에 약한 압력을 가하는 금속 아암을 통해 방광에서 멀리 떨어뜨려 놓아서 호흡과 같은 횡격막 활동으로 인한 상당한 움직임을 방지한다. 복부 절개를 가능한 한 작게 유지하면서, 검사하지 않을 복부의 모든 부위를 거즈로 덮고, 탈수 및 주변 공기에 노출되는 것을 피하기 위해 생리학적 온도에서 유지되는 생리식염수에 부분적으로 침지시키고 지속적으로 초수화시켰다. 백혈구-내피 상호작용을 가시화하기 위해, 0.05% 로다민-6G 용액을 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하고 5% FITC- 알부민 용액(정맥내)을 사용하여 모세혈관상의 명확한 평가를 용이하게 하였다. 초점 설정 후, 컴퓨터화 영상 시스템을 사용하여 방광 벽 내의 모세혈관의 무작위 영역의 5개의 비디오 시퀀스(30초)를 기록하였다. 이어서, 비디오 시퀀스를 확립된 프로토콜에 따라 분석하였다.
통계 분석: 결과를 소프트웨어 Prism 6(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 분석하였다. 모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로서 표현하였다. 콜모고로프-스미르노프 검정에 의해 정규 분포를 확인한 후, 군들을 일원분산분석(ANOVA)과 던네트 사후검정을 사용하여 유의성에 대해 검사하였다. 유의성은 p <0.05에서 고려되었다.
II. 결과 및 논의
BCP 점적주입은 실험적 방광염에서 백혈구 부착을 감소시킨다. 도 9는 건강한 대조군(CON; n=6), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=8), 비히클 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 비히클 중의 BCP; n=6), 40% DMSO 점적주입액으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + DMSO, n=5) 및 40% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP + 40% DMSO, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. # p <0.05 대 LPS. 도 9에 도시된 바와 같이, 대조군 동물에서는 낮은 기준선 수준의 백혈구 부착이 관찰되었다. 내독소 시험투여된 동물에서는 대조군과 비교하여 부착성 백혈구 수의 유의적 증가가 관찰되었다. 베타-C(100 mg/kg) 처리는 부착성 백혈구의 수를 건강한 대조군 동물의 수준으로 감소시켰다. 대조적으로, 40% DMSO 처리는 본 모델에서 높은 수준의 활성화된 백혈구를 유지하였다.
BCP 점적주입은 실험적 방광염에서 백혈구 롤링을 회복시킨다. 도 10은 건강한 대조군(CON; n=6), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=8), 비히클 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 비히클 중의 BCP; n=6), 40% DMSO 점적주입액으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 40% DMSO, n=5) 및 40% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+40% DMSO, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. 도 10에 도시된 바와 같이, 건강한 대조군은 백혈구 롤링의 기본 수준과 관련되었다. LPS 투여는 대조군 동물과 비교하여 롤링 백혈구의 수를 유의적으로 감소시켰다. 비히클 중의 BCP 처리는 백혈구의 수준을 대조군 동물의 수준으로 회복시켰다. DMSO 투여는 백혈구 롤링을 향상시키지 않았고, 본 모델에서 내독소혈증 군(LPS)과 비교하여 어떠한 유의차도 나타내지 않았다. BCP와 DMSO의 병용 투여도 미처리 군과 비교하여 롤링 유량 수를 향상시켰다.
BCP 점적주입은 실험적 방광염에서 기능적 모세혈관 밀도를 회복시킨다. 도 11은 건강한 대조군(CON; n=6), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=8), 비히클 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 비히클 중의 BCP; n=6), 40% DMSO 점적주입액으로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS +40% DMSO, n=5) 및 40% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+40% DMSO, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 CON. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 내독소(LPS) 시험투여 후에 방광 미세순환에서의 기능적 모세혈관의 수는 대조군과 비교하여 유의적으로 감소되었다. 비히클 중의 BCP뿐만 아니라 40% DMSO 중의 BCP의 투여는 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시켰다. 대조적으로, DMSO 단독으로의 처리는 관류를 향상시켰지만, 관류를 건강한 대조군 동물에서 관찰된 수준으로 회복시키지는 않았다.
DMSO 점적주입액 중의 BCP는 실험적 방광염에서 백혈구 부착을 감소시킨다. 도 12는 건강한 대조군(CON; n=6), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=8), 비히클 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 비히클 중의 BCP; n=6), 5% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+5% DMSO; n=4), 40% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+40% DMSO, n=5) 및 50% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+50% DMSO, n=3)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 LPS+BCP+50% DMSO. 도 12에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서는 증가된 백혈구 부착이 관찰되었다. 부착성 백혈구 수의 유의적 감소는, 다양한 수준의 DMSO가 점적주입된 군들(현재의 표준 임상 치료)에 필적하는 백혈구 부착성 감소를 야기한 비히클 중의 BCP 처리를 포함하는 BCP로 처리된 모든 동물 군에서 관찰되었다. 5% DMSO 점적주입액 중의 BCP는 백혈구 부착에 대한 가장 낮은 전체 값을 산출하였다.
DMSO 점적주입액 중의 BCP는 실험적 방광염에서 기능적 모세혈관 밀도를 향상시킨다. 도 13은 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=8), 비히클 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + 비히클 중의 BCP; n=6), 5% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+5% DMSO; n=4), 40% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+40% DMSO, n=5) 및 50% DMSO 점적주입액 중의 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP+50% DMSO, n=3)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 LPS. 도 13에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 높은 수준의 모세혈관 기능장애가 관찰되었다. BCP로 처리된 실험적 방광염을 갖는 모든 동물 군에서 방광의 모세혈관 관류의 유의적 향상이 관찰되었다. 비히클 중 BCP로의 처리는 다양한 수준의 DMSO 점적주입으로만 처리된 실험적 방광염을 갖는 군들에 필적하는 FCD의 유의적 향상을 초래하였다. 비히클 중의 베타-C와 40% DMSO 점적주입액 중의 베타-C는 FCD에 대해 가장 높은 전체 값을 산출하였다.
실시예 3: 국소 방광 염증 모델을 이용한 추가 연구
(a) 메틸설포닐메탄(MSM)을 이용한 베타-C의 방광내 투여
베타-C와 MSM의 병용물의 방광내 투여를 조사하기 위해 연구를 수행한다.
군들은 다음과 같다:
1. 대조군
2. LPS(국소)
3. LPS(국소) + 베타-C(방광내)
4. LPS(국소) + MSM(방광내)
5. LPS(국소) + MSM(방광내) + 베타-C(방광내)
LPS(국소) 및 베타-C(방광내)는 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 같이 제공된다. MSM은 DMSO에 대해 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 유사하게 제공된다. 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 기능적 모세혈관 밀도는 실시예 1에 설명된 기술을 사용하여 측정한다. MSM과 베타-C의 병용 처리는 베타-C 또는 MSM 단독보다 백혈구 부착 및 기능적 모세혈관 밀도에서 더 큰 효능을 갖는다.
(b) 방광내 DMSO 또는 MSM과 병용된 경구 베타-C
경구 베타-C를 대체 투여 경로로서 조사한다. 상기 투여 경로는 방광내 DMSO 또는 MSM 요법과 함께 간격 치료의 가능성을 제공한다. 임상적 맥락에서, 간격 치료는 CB2 표적제 국소 마취제를 이용한 경구 치료(즉, 진료소 또는 병원의 외부에서 제공될 수 있는 바와 같이 덜 침습적임), 예를 들어 진료소 또는 병원에서 전형적으로 실시될 수 있는 방광내 치료들 사이의 베타-C를 가능하게 할 수 있다.
군들은 다음과 같다:
1. 대조군
2. LPS(국소)
3. LPS(국소) + 베타-C(경구; 위관영양법)
4. LPS(국소) + DMSO(방광내)
5. LPS(국소) + MSM(방광내)
6. LPS(국소) + DMSO(방광내) + 베타-C(경구; 위관영양법)
7. LPS(국소) + MSM(방광내) + 베타-C(경구; 위관영양법)
경구 위관영양법 군에서는, 마우스를 LPS 노출 60분 전에 위관영양법에 의해 10 mg/kg 베타-C로 처리한다. LPS(국소) 및 DMSO(방광내)는 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 유사하게 제공한다. MSM은 DMSO에 대해 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 유사하게 제공한다. 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 기능적 모세혈관 밀도는 실시예 1에 설명된 기술을 사용하여 측정한다. DMSO 또는 MSM과 베타-C의 병용 치료는 베타-C 또는 DMSO 또는 MSM 단독보다 백혈구 부착 및 기능적 모세혈관 밀도에서 더 큰 효능을 갖는다.
(c) 경구 MSM과 병용된 경구 베타-C
경구 베타-C와 경구 MSM의 병용을 대안적인 투여 경로로서 조사한다. 상기 투여 경로는 진료소 또는 병원의 외부에서 제공될 수 있는 덜 침습적 치료의 가능성을 제공한다.
군들은 다음과 같다:
1. 대조군
2. LPS(국소)
3. LPS(국소) + 베타-C(경구; 위관영양법)
4. LPS(국소) + MSM(경구; 위관영양법)
5. LPS(국소) + MSM(경구, 위관영양법) + 베타-C(경구, 위관영양법)
베타-C 경구 위관영양법 군에서는, 마우스를 LPS 노출 60분 전에 위관영양법에 의해 10 mg/kg 베타-C로 처리한다. MSM 경구 위관영양법 그룹에서는, 마우스를 LPS 노출 60분 전에 위관영양법에 의해 100 mg/kg MSM으로 처리한다. 베타-C + MSM 경구 위관영양법 그룹에서는, 마우스를 LPS 노출 60분 전에 위관영양법에 의해 10 mg/kg 베타-C 및 100 mg/kg MSM으로 처리한다. LPS(국소)는 상기 실시예 1에서 설명한 바와 같이 제공한다. 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 기능적 모세혈관 밀도는 실시예 1에 설명된 기술을 사용하여 측정한다. MSM과 베타-C의 병용 처리는 베타-C 또는 MSM 단독보다 백혈구 부착 및 기능적 모세혈관 밀도에서 더 큰 효능을 갖는다.
(d) 베타-C의 국소 마취 효과
베타-C 단독 또는 DMSO 또는 MSM과 병용된 베타-C의 국소 마취 효과를 추가 조사하기 위해 연구를 수행한다. 군들은 다음과 같다:
1. 대조군
2. LPS
3. LPS + 베타-C(경구; 위관영양법)
4. LPS + DMSO(방광내)
5. LPS + MSM(방광내)
6. LPS + DMSO(방광내) + 베타-C(경구; 위관영양법)
7. LPS + MSM(방광내) + 베타-C(경구; 위관영양법)
경구 위관영양법 군에서는, 마우스를 LPS 노출 60분 전에 위관영양법에 의해 10 mg/kg 베타-C로 처리한다. LPS(국소) 및 DMSO(방광내)는 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 같이 제공한다. MSM은 DMSO에 대해 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 유사하게 제공한다.
IC를 유도하는 국소 LPS 시험투여 후에 베타-C의 국소 진통 효과를 평가하기 위해 행동 통증 평가를 수행한다. 경구 및 방광내 처리를 병용한다.
행동 통증 평가: 관찰된 각각의 2가지 파라미터, 즉 눈 감기 및 비정상적 자세(등근 등 및 뻗은 자세)에 대해 10의 최대 값을 사용하고 동물이 복부를 핥는 것과 같은 다른 파라미터를 또한 나타낼 때는 추가의 10을 사용한다(짧은 통증 위기). 따라서 최대 점수는 30이다. 파라미터가 영향을 받지 않는다면(통증 없음), 최소 점수는 0이다. 짧은 통증 위기란 용어는 꼬리 과신장, 복부 수축 및 후퇴 움직임을 나타낸다. 비정상적 자세는 0- 정상 자세, 5- 때때로 둥근 등 또는 스트레칭, 7- 거의 둥근 뒤 또는 뻗은 자세 및 10- 둥근 등 및 스트레칭으로서 점수를 매긴다. 눈 감기는 0- 완전히 뜬 눈, 5- 반쯤 감긴 눈 및 10- 완전히 감긴 눈으로서 점수를 매긴다. 최종 통증 점수는 방광염이 유도된지 30분후부터 시작하여 15분 간격에서 14회 측정으로부터 얻은 점수를 종합한 것이다.
실시예 4: 경구 베타-C 단독 및 방광내 MSM과 병용된 경구 베타-C
I. 재료 및 방법
경구 베타-C를 대체 투여 경로로서 조사하였다. 상기 투여 경로는, 임의로 방광내 DMSO 또는 MSM 요법과 함께 간격 치료의 가능성을 제공한다. 임상적 맥락에서, 간격 치료는 CB2 표적제 국소 마취제를 이용한 경구 치료(즉, 진료소 또는 병원의 외부에서 제공될 수 있는 바와 같이 덜 침습적임), 예를 들어 진료소 또는 병원에서 전형적으로 실시될 수 있는 방광내 치료들 사이의 베타-C를 가능하게 할 수 있다.
동물 및 국소 방광 염증 모델은 상기 실시예 2에 설명한 바와 같았다. 군들은 다음과 같았다:
1. 건강한 동물 대조군
2. LPS(국소)
3. LPS(국소) + 베타-C (경구; 위관영양법)
4. 건강한 동물 대조군 + 베타-C(경구; 위관영양법)
5. LPS(국소) + MSM + 베타-C(경구; 위관영양법)
6. LPS(국소) + MSM(방광내) + 베타-C(경구; 위관영양법)
경구 위관영양법 군에서는, 마우스를 위관영양법에 의해 100 mg/kg 베타-C 또는 100 mg/kg 메틸설포닐메탄(MSM) 중의 100 mg/kg 베타-C로 처리하였다. 경구 베타-C를 투여한 건강한 동물 대조군 이외의 군에서는, LPS 노출 60분 전에 투여 하였다. LPS(국소)는 상기 실시예 2에서 상세히 설명한 바와 같이 제공하였다. 방광내 MSM은 DMSO에 대해 상기 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 같이 제공하였다. 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 기능적 모세혈관 밀도는 상기 실시예 2에서 설명한 바와 같은 기술을 사용하여 측정하였다. 결과는 상기 실시예 2에서 설명한 통계 방법을 사용하여 평가하였다.
II. 결과 및 논의
경구 BCP 투여는 실험적 방광염에서 백혈구 부착을 감소시킨다. 도 14는 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5) 및 경구 베타-C(100 mg/kg)가 투여된 건강한 동물(BCP, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 14에 도시된 바와 같이, 높은 수준의 백혈구 부착은 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 관찰되었다. 경구 BCP로 처리된 군에서는 부착성 백혈구 수의 유의적 감소가 관찰되었다. 건강한 동물에서 비히클 중의 베타-C는 백혈구 부착의 어떠한 변화도 일으키지 않았다.
경구 BCP 투여는 대조군 동물에서 기능적 모세혈관 밀도를 증가시킨다. 도 15는 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5) 및 경구 베타-C(100 mg/kg)가 투여된 건강한 동물(BCP, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. * p <0.05 대 LPS. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 처리군에서 유의차는 관찰되지 않았다. 내독소혈증 군과 비교했을 때, BCP로만 처리된 군에서 FCD의 유의적 향상이 있었다. 본 결과는 경구 BCP 처리가 내독소혈증(LPS) 군과 비교했을 때 FCD를 향상시킬 가능성이 있을 수 있지만, 검출 불가능하였음을 시사한다.
경구 BCP 및 MSM 투여는 실험적 방광염에서 백혈구 부착을 감소시킨다. 도 16은 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)가 투여된 건강한 동물(BCP, n=5) 및 경구 베타-C(100 mg/kg)와 MSM(실험 당일 제조된 100 mg/kg의 수용액; 20 g 동물에서 약 0.04 mg/㎕, 본 연구에서 사용된 동물의 대략적 평균 체중)로 처리된 LPS-유도된 방광염에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 16에 도시된 바와 같이, 높은 수준의 백혈구 부착은 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 관찰되었다. 경구 BCP로 처리된 군에서는 부착성 백혈구 수의 유의적 감소가 관찰되었다. 건강한 동물에서 비히클 중의 베타-C는 백혈구 부착의 어떠한 유의적 변화도 일으키지 않았다. 베타-C와 MSM으로 경구 처리된 동물은 미처리된 동물과 비교했을 때 백혈구의 부착 수준의 유의적 감소를 나타냈다.
경구 BCP 및 MSM 투여는 실험적 방광염에서 기능적 모세혈관 밀도를 향상시킨다. 도 17은 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)가 투여된 건강한 동물(BCP, n=5) 및 경구 베타-C(100 mg/kg)와 MSM(100 mg/kg)으로 처리된 LPS-유도된 방광염에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, MSM 중의 BCP로의 경구 투여는 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 기능적 모세혈관 밀도를 다시 대조군의 수준으로 회복시켰다. BCP 단독은 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 FCD를 유의적으로 향상시키지 않았다. 그러나, 기능적 모세혈관 밀도의 유의적 향상은 대조군과 비교하여 베타-C만으로 처리된 건강한 군에서 발견되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 결과들은 경구 BCP 치료 단독만으로도 내독소혈증(LPS) 군과 비교했을 때 FCD를 향상시킬 가능성이 있을 수 있지만, 검출 불가능하였음을 시사한다.
BCP 및 MSM 점적주입은 실험적 방광염에서 백혈구 부착을 감소시킨다. 도 18은 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5) 및 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM(100 mg/kg)의 점적주입로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP/MSM; n=3)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 부착 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 18에 도시된 바와 같이, 높은 수준의 백혈구 부착은 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 관찰되었다. 경구 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM 점적주입의 병용물로 처리된 군에서 부착성 백혈구 수의 유의적 감소가 관찰되었다.
BCP와 MSM 점적주입은 실험적 방광염에서 백혈구 롤링을 회복시킨다. 도 19는 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5) 및 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM(100 mg/kg)의 점적주입로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP/MSM; n=3)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 방광 세정맥에서의 백혈구 롤링 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 19에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서는 백혈구 롤링의 유의적 감소가 관찰되었다. 경구 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM 점적주입의 병용물로 처리된 군에서는 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 군과 비교하여 롤링 백혈구 수의 유의적 회복이 관찰되었다.
BCP 및 MSM 점적주입은 실험적 방광염에서 기능적 모세혈관 밀도를 회복시킨다. 도 20은 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS, n=5) 및 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM(100 mg/kg)의 점적주입로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS+BCP/MSM; n=3)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 모세혈관 내의 기능적 모세혈관 밀도(FCD)를 통해 정량된 모세혈관 관류의 결과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시하였다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 20에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서는 기능적 관류의 유의적 감소가 관찰되었다. 경구 베타-C(100 mg/kg)와 5% MSM 점적주입이 병용 처리된 군에서는 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 군과 비교하여 기능적 관류의 유의적 증가가 관찰되었으며, 대조군 동물의 수준으로 회복하였다.
실시예 5: 베타-C의 마취 효과
베타-C의 경구 투여의 마취 효과를 조사하기 위해 연구를 수행하였다. 동물 및 국소 방광 염증 모델은 상기 실시예 2에서 상세히 설명한 바와 같았다. 군들은 다음과 같았다:
1. 건강한 동물 대조군
2. LPS(국소)
3. LPS + 베타-C(경구; 위관영양법)
4. 건강한 동물 대조군 + 베타-C(경구; 위관영양법)
경구 위관영양법 군에서, 마우스를 위관영양법에 의해 100 mg/kg 베타-C로 처리하였다. 경구 베타-C가 투여된 LPS 군에서는, LPS 노출 60분 전에 투여하였다. LPS(국소)는 상기 실시예 2에서 설명한 바와 같이 제공하였다.
통증 평가 점수화: 각 표본에 대한 개별 기준선을 설정하기 위해 건강한 동물을 행동적으로 점수를 매겼다. 이어서, 동물들은 이소플루란으로 마취시키고 LPS 점적주입하여 방광에서 방광염과 유사한 상태를 유도하였다. 유도 후, 동물들은 깨어났고 관찰 중인 그들의 케이지 내에서 스스로 정상적으로 탐험/먹이 섭취를 할 수 있도록 하였다. 이어서, 행동 및 외모의 변화(즉, 호흡률, 자세, 운동 활동, 눈 뜨기)에 대해 다시 점수를 매겼다. 각 행동 파라미터는 가능한 최대 점수인 10점을 받았으며 총점의 가능한 최대 값은 40점이었다. 가능한 최소 점수는 0점이며, 이는 파라미터가 기존의 상태로서 영향을 받지 않음을 의미한다. 호흡률 - 사이클의 각 감소는 점수의 증가를 보장한다. 눈 뜨기 - 0 완전히 뜨기, 5 절반 뜨기, 10 완전히 감김 및 2와 7은 중간 위치이다. 자세 - 변화 없음은 0이고, 완전히 둥근 등 또는 절뚝거림은 10이다. 중간 자세는 중간 점수를 얻는다. 운동 활동 - 20초 이내에 활동(탐색, 이동, 털 손질(grooming)). 예를 들어, 10초 동안 움직임 없음(= 50%) = 5점; 2초 동안 움직임 없음(= 10%) = 1점. 점수화 시스템은 에슈할리어(Eschalier) 등37에 의해 보고된 것에 기반하지만, 운동 활동의 추가 파라미터를 갖는다. 이것은 내장통이 있는 연구 동물에서 현저하게 뚜렷한 어떤 것으로서 추가되었다.
전자 폰 프레이 촉공간역치측정: 이것은 동물이 유해 자극에 반응(예를 들어, 회피)하기 전에 가해진 힘의 양(그램)을 측정하는 정량된 통증 평가이다. 이러한 정량은 치료의 통증 완화 효과를 정확하게 검출할 수 있게 한다. 각 표본에 대한 개별 기준선을 설정하기 위해, 임의의 치료 또는 방광염 유도 전에 건강한 동물을 점수를 매겼다. 방광염이 유도되고 처리 효과가 측정될 수 있게 된 후에도 동물에 대해 점수를 매겼다. 각각의 개별 동물을 유도 전에 자체와 비교하였을 뿐만 아니라, 요약된 군 비교를 수행하였다.
통계 분석: 결과를 소프트웨어 Prism 6(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 분석하였다. 모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로서 표현하였다. 콜모고로프-스미르노프 검정에 의해 정규 분포를 확인한 후, 군들을 일원분산분석(ANOVA)과 던네트 사후검정을 사용하여 유의성에 대해 검사하였다. 유의성은 p <0.05에서 고려되었다.
II. 결과 및 논의
경구 BCP 투여는 실험적 방광염에서 호흡률, 눈 뜨기, 운동 활동 및 자세 점수를 향상시킨다. 도 21 내지 24는 건강한 동물(대조군, n= 5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS; n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5) 및 건강한 동물에서의 베타-C 단독(BCP, n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 행동 결과의 개별 범주를 도시한다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 후(T1)의 개별 데이터 포인트로서 제시되었으며, 또한 각 파라미터에 대해 평균 ± SD가 제시된다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 21에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 호흡률의 유의적 증가가 관찰되었다. 동물을 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리하는 것은 호흡률을 유의적으로 감소시켰다. 마찬가지로, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물은 또한 열악한 눈 뜨기 점수를 나타냈으며, 경구 BCP로 처리된 동물에서는 유의적 향상이 있었다(도 22). 경구 BCP로 처리된 동물에서는 운동 활동(도 23)과 자세(도 24)의 유의적 향상이 또한 존재하며, 이는 미처리된 동물과 비교하여 전반적인 향상을 시사한다.
경구 BCP 투여는 실험적 방광염에서 행동 통증 점수를 감소시킨다. 도 25는 건강한 동물(대조군, n=5), 미처리된 LPS-유도된 방광염 (LPS, n=5), 경구 베타-C(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP, n=5) 및 건강한 동물에서의 BCP 단독(BCP; n=5)에 대한 암컷 BALB/c 마우스의 행동 결과의 총 종합 점수를 나타낸다. 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 처리 기간 후(T1)의 개별 데이터 포인트와 총 점수로서 제시되었으며, 또한 각 군에 대해 평균 ± SD가 제시된다. * p <0.05 대 대조군, # p <0.05 대 LPS. 도 25에 도시된 바와 같이, 미처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 행동 통증 점수의 유의적인 증가가 관찰되었다. 동물을 경구 BCP(100 mg/kg)로 처리하는 것은 행동 통증 점수를 유의적으로 감소시켰으며, 이는 불편감 수준의 감소 및 통증 완화를 시사한다.
경구 BCP 투여는 실험적 방광염에서 통증 회피 역치를 증가시킨다. 도 26은 다음의 군들에 대한 암컷 BALB/c 마우스에 관찰된, 반응(예를 들어, 회피) 전에 전자 폰 프레이 촉공간역치측정을 통해 가해진 힘의 양(그램)을 도시한다: 건강한 동물(대조군, n= 5), 미처리된 LPS-유도된 방광염(LPS; n=5), 경구 BCP(100 mg/kg)로 처리된 LPS-유도된 방광염(LPS + BCP; n=5) 및 건강한 동물에서의 BCP 단독(BCP, n=5). 데이터는 방광염 유도 전(T0)과 처리 기간 후(T1)의 개별 데이터 포인트와 가해진 총 힘으로서 제시되었으며, 또한 각 군에 대해 평균 ± SD가 제시된다. * p <0.05 대 대조군. 도 26에 도시된 바와 같이, 경구 BCP로 처리된 LPS-유도된 방광염을 갖는 동물에서 가해진 힘의 유의적 증가가 기록되었다. 동물을 경구 BCP(100 mg/kg)로 처리하는 것은 회피 역치를 유의적으로 향상시켰으며, 이는 불편감 수준의 감소 및 통증 완화를 시사한다.
본 출원은 현재 바람직한 예라고 고려되는 것들을 참고로 하여 설명되었지만, 본 출원은 개시된 예들로 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 이와 반대로, 본 출원은 첨부된 청구범위의 취지와 범위 내에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 구성을 포함하고자 한다.
모든 간행물, 특허 및 특허출원은 마치 각각 개개의 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 도입되어 있다는 것을 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 그 전체가 참고로 본 명세서에 도입된다. 본 출원의 용어가 본원에 참고로 도입된 문헌에서와 상이하게 정의된 것으로 확인될 경우, 본원에 제공된 정의가 그 용어의 정의일 것이다.
명세서에서 인용된 문헌에 대한 전체 기재
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Claims (21)

  1. 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 CB2 표적제(target agent) 국소 마취제의 용도.
  2. 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 CB2 표적제 국소 마취제의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 CB2 오르토스테릭(orthosteric) 아고니스트 국소 마취제인, 용도.
  4. 제3항에 있어서, 상기 CB2 오르토스테릭 아고니스트 국소 마취제가 베타-카리오필렌인, 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 간질성 방광염을 치료하기 위한 추가 제제의 사용을 추가로 포함하는, 용도.
  6. 제5항에 있어서, 상기 추가 제제가 디메틸 설폭사이드인, 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 디메틸 설폭사이드가 약 5% 내지 약 50% 디메틸 설폭사이드를 포함하는 수용액으로서 방광내 사용하기 위한 것인, 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 수용액이 약 5% 디메틸 설폭사이드를 포함하는, 용도.
  9. 제5항에 있어서, 상기 추가 제제가 메틸설포닐메탄인, 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 메틸설포닐메탄이 약 5% 메틸설포닐메탄을 포함하는 수용액으로서 방광내 사용하기 위한 것인, 용도.
  11. 제9항에 있어서, 상기 메틸설포닐메탄이 경구 사용하기 위한 것인, 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 경구 사용하기 위한 것인, 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 경구 사용이 CB2 표적제 국소 마취제를 포함하는 캡슐제의 형태인, 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 메틸설포닐메탄과 함께 사용하기 위한 것이고, 상기 캡슐제가 메틸설포닐메탄을 추가로 포함하는, 용도.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 국소 사용하기 위한 것인, 용도.
  16. 제15항에 있어서, 상기 국소 사용이 CB2 표적제 국소 마취제를 포함하는 국소 크림의 형태인, 용도.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 방광내 사용하기 위한 것인, 용도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 디메틸 설폭사이드와 함께 사용하기 위한 것이고, 상기 방광내 사용이 CB2 표적제 국소 마취제와 디메틸 설폭사이드를 포함하는 수용액의 형태인, 용도.
  19. 제17항에 있어서, 상기 CB2 표적제 국소 마취제가 메틸설포닐메탄과 함께 사용하기 위한 것이고, 상기 방광내 사용이 CB2 표적제 국소 마취제와 메틸설포닐메탄을 포함하는 수용액의 형태인, 용도.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 여성인, 용도.
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