KR20200090734A

KR20200090734A - 세포 외 매트릭스 제조를 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20200090734A
Application number: KR1020207005888A
Authority: KR
Inventors: 프란시스 크리스토퍼 제이글러
Original assignee: 브레이크쓰로우 테크, 엘엘씨
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2020-07-29
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: US11718829B2; AU2018306930A1; JP2023129673A; EP3658667A4; US20240150717A1; US20190032017A1; JP2020529220A; JP7701152B2; CN111417722A; EP3658667A1; WO2019022894A1; KR102759124B1

Abstract

본원의 실시예들은 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하기 위한 방법들, 키트들, 및 조성물들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법들은 섬유아세포들을 유도 다능성 줄기 세포들로 분화시키는 단계, 유도 다능성 줄기 세포들을 증식시키는 단계, 및 유도 다능성 줄기 세포들을 섬유아세포들로 분화시키는 단계를 포함한다. 섬유아세포들은 성숙한 ECM을 생산할 수 있으며, 이는 의료 및/또는 미용 제품들 및 절차들을 위해 단리되고 사용될 수 있다.

Description

세포 외 매트릭스 제조를 위한 방법 및 조성물

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 PCT 규칙 4.10 하에 2017년 7월 28일자로 출원된 발명의 명칭이 "Methods and Compositions for Manufacturing Extracellular Matrix"인 미국 특허 번호 제15/662901호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다.

서열 목록, 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 참조

본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출 중이다. 서열 목록은 크기가 247,550 바이트인, 2018년 6월 22일에 생성되고 마지막으로 수정된, 명칭이 SEQUENCEBREK001WO.TXT인 파일로서 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 본원에 전체적으로 참조로 통합된다.

세포외 기질(extracellular matrix; ECM)은 많은 미용 및 치료 용도들을 갖는 다목적 생체물질(biomaterial)이다. 대부분의 결합 조직은 콜라겐들, 및 훨씬 더 적은 정도의(중량 당 상대적 풍부(abundance) 기준) 다른 당단백질들, 예컨대 라미닌들, 파이브로넥틴, 및 히알루론산을 포함하는 글리코사미노글리칸들(glycosaminoglycans; GAGs), 및 다른 황산화 GAG들, 예컨대 아그레칸 및 퍼레칸을 포함한다. 그러나, 콜라겐들은 가교되고 미용 또는 치료 용도들을 위해 단리되고 인간 용도를 위해 유용한 제품들로 제조되기 위해 효소적 또는 화학적 분해를 필요로 한다. 펩신 소화 또는 화학적 변형 후 소 및 돼지 진피(corium), 돼지 장 점막하조직, 그리고 피부 및 뼈와 같은 인간 사체-유래 조직들의 사용을 포함하는 예들은 모두 기술 분야에 널리 공지되어 있다.

돼지 및 소 조직들과 같은 ECM을 위한 동물 공급원들은 주로 단백질들인 소 및 돼지 항원들 또는 알레르겐들에 대한 공지된 알레르기들을 포함하는 원치 않는 면역 반응의 위험을 가지고 있는 반면, 동물-유래 성분들(가장 흔히 소 혈청, 소 알부민, 또는 돼지 트립신을 포함함), 또는 비-인간 식물-유래 단백질들(잔류 식물 단백질들 또는 폴리펩티드들을 함유할 수 있는 식물들에서 생산되는 대두 트립신 억제제(inhibitor) 또는 재조합 인간 알부민을 포함함)을 사용하는 인간 세포들은 동일한 위험들을 겪는다. 따라서, 동물 공급원들로부터의 ECM의 상업적 유용성은 상업적 사용 승인을 위해 요구되는 더 안전한 잔류 레벨들로의 동물 성분들의 제거를 검증하기 위한 안전 문제들 및/또는 규제 장애물들에 의해 제한될 수 있다. 인간 면역계는 매우 낮은 풍부 항원들에 반응하기에 충분히 민감하고, 동물 및 식물 단백질들은 과민성 쇼크(anaphylactic shock) 및 일부 경우들에서 심지어 사망을 야기할 수 있는 잠재적 생명-위협 알레르기 반응들을 포함하는, 원치 않는 면역 반응을 야기하는 것으로 입증되었다. 동물-유래 및 식물-유래 단백질 성분들, 및 동물-유래 또는 식물-유래 단백질 성분들에서 성장되는 인간 세포들은 집합적으로 "이종(xenogeneic)"으로 칭하여진다. 반면에, 이들 동물-유래 및 식물-유래 단백질 성분들에 대한 접촉 없이 제조되는 제품들은 "제노-프리(xeno-free)"로 공지되어 있다. 이종 배지에서 ECM을 제조하기 위한 종래의 접근법들은 이들 방법들의 상업적 유용성을 제한하는, 동물-유래 및/또는 식물-유래 단백질 성분들의 제거를 요구할 수 있다.

인간 ECM은 사체들로부터의 동종(allogeneic) 조직들로부터 유래될 수 있다. 그러나, 그러한 사체-유래 ECM는 각각의 공여자가 수득가능한 인간 ECM(예를 들어, 70 kg의 인간은 중량 당 20% 미만의 인간 콜라겐들 또는 수 kg보다 크지 않은 원시 ECM 재료들을 함유함)을 제한된 양으로 제공하므로, 제한된 상업적 확장성 뿐만 아니라, 질병 전염의 위험을 제공한다. 추가적으로, 사체-유래 조직들은 질병 전염의 일부 위험을 완화시키기 위해 고가의 안전성 시험을 수반하고, 각각의 단일 사체 공여자에 대한 바이러스들 및 박테리아들을 포함하는 다수의 질병-유발 병원체들에 대한 광범위한 시험이 시행되어야 한다.

추가적으로, ECM은 동물 사료에 대해 사용될 수 있다. 그러나, 현실적인 문제로서, 사체들로부터의 세포 배양 또는 채취물(harvest)을 사용하여 ECM을 제조하기 위한 종래의 접근법들은 상업적 규모 상에서 엄청난 비용이 발생할 수 있다. 질병-전염 및 면역원성(immunogenicity)의 위험들을 최소화하는 동시에, 상업적 규모에서 ECM을 효율적으로 제조하기 위한 방법들, 조성물들, 및 키트들이 본원의 일부 실시예들에 따라 설명된다.

미국 등록 특허 9,683,232; 6,378,527; 5,830,708; 7,118,746; 6,372,494; 8,257,947; 8,530,415; 8,535,913; 9,034,312; 8,852,637; 8,128,924; 8,138,147; 8,361,485; 8,476,231; 9,458,486;

기술분야

본원의 일부 실시예들은 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하기 위한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 일부 실시예들에서, 세포 배양을 위한 방법들 및 조성물들이 설명된다.

요약

일부 실시예들은 세포외 기질(extracellular matrix)을 제조하는 방법을 포함한다. 방법은 유도 다능성 줄기 세포들(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)를 생산 섬유아세포(production fibroblast)로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생산 섬유아세포들을 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 배양 단계에 의해, 생산 섬유아세포들은 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 생산할 수 있다. 방법은 ECM을 생산 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 방법은 iPSC들을 생산 섬유아세포로 분화시키기 전에 iPSC들을 형성하기 위해 전구체 섬유아세포를 역분화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 분화 단계 전에 iPSC들을, 예를 들어 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 또는 30 배(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위를 포함함) 증식시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 분화 단계 전에 iPSC들의 뱅크(bank)를 구축하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 분화되는 iPSC들만이 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들의 배양은 정상산소(normoxia)에서 시행된다. 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들을 배양하는 단계는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 배양하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, 전구체 섬유아세포는 성체 피부(생검) 섬유아세포를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 정제함으로써, 적어도 약 80%(w/w) ECM인 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 정제하는 단계는 산성 완충액에서 ECM을 세정하는 단계, 및 생산 섬유아세포 및 ECM을 포함하는 용액을 덱스트라나아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재(substrate) 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다. 일부 실시예들에서, ECM은 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM의 약 90%(w/w)는 COL1이고, 약 10%는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 방법은 전구체 섬유아세포를 역분화 인자들과 접촉시킴으로써, 전구체 섬유아세포를 iPSC로 역분화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 Oct 패밀리 멤버, Sox 패밀리 멤버, Klf 패밀리 멤버를 인코딩하는 바이러스 삽입들이 없다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 풋프린트(footprint)가 없다. 일부 실시예들에서, 방법은 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포(bone marrow multipotent stem cell), ES-유래 MSC, 또는 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주 중 임의의 것을 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 생산 섬유아세포들이 성숙한 콜라겐들을 생산할 때까지 생산 섬유아세포들을 혈청과 접촉시키고, 그 다음, 혈청의 농도에서 적어도 95% 감소가 있을 때까지 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 점진적인 감소 단계는 적어도 약 5일의 기간에 걸쳐 있다.

일부 실시예들은 ECM을 제조하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 인간 섬유아세포들을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 역분화 인자들을 포함할 수 있다. 키트는 섬유아세포 분화 인자들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 조성물의 모든 섬유아세포들은 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 키트는 기재(substrate), 예컨대 덱스트란 미세담체들(microcarriers)을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 키트는 덱스트라나아제를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 키트는 덱스트라나아제 및 DNAase를 더 포함한다.

일부 실시예들은 적어도 80%(w/w) 세포외 기질을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 세포외 기질은 위의 방법들 중 임의의 방법에 따라 제조된다.

일부 실시예들은 iPSC-유래 섬유아세포들을 포함하는 세포 배양물을 포함하며, 여기서 iPSC-유래 섬유아세포들은 성숙한 세포외 기질을 생산하고 있다. 세포 배양물은 역분화 인자들을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 조성물의 적어도 50%(w/w)는 ECM을 포함한다.

일부 실시예들은 세포외 기질(ECM)을 제조하는 방법을 포함한다. 방법은 섬유아세포들 및/또는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 기재 상에 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 기재는 적어도 2개의 표면들을 포함할 수 있다. 배양 단계는 혈청-프리 및 제노-프리일 수 있다. 배양 단계는 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 및/또는 MSC들의 적어도 80%가 그들의 세포 주기를 정지시킬 때까지 수행될 수 있다. 그 다음, 방법은 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 적어도 약 2주 동안 혈청과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이를 통해 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 가용성의 성숙한 ECM을 생산한다. 따라서, 가용성의 성숙한 ECM 및 섬유아세포들 또는 MSC들을 포함하는 용액이 생산될 수 있으며, 여기서 용액은 제노-프리이다. 방법은 가용성의 성숙한 ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서, ECM은 성숙한 제노-프리 ECM이다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다. 일부 실시예들에서, 방법은 인간 다능성 세포 배양을 증식시킴으로써 - 증식은 혈청-프리 및 제노-프리임 -, 인간 다능성 세포들을 생산하는 단계; 및 인간 다능성 세포들을 분화 인자들과 접촉시켜, 이를 통해 인간 다능성 세포들이 섬유아세포들 또는 MSC들로 분화하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 약 2주 내지 약 8주 동안이다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 적어도 약 8주 동안이다. 일부 실시예들에서, 인간 다능성 세포들은 유도 다능성 줄기 세포들(induced pluripotent stem cells; iPSCSs)을 포함한다. 일부 실시예들에서, iPSCS들은 풋프린트가 없다. 일부 실시예들에서, iPSCS들은 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 방법은 성숙한 제노-프리 ECM을 포함하는 미용 조성물을 제조하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 혈청과 접촉하는 적어도 2주 동안 섬유아세포들 또는 MSC들을 아스코르브산과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 상기 섬유아세포들 또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 또는 MSC들의 적어도 70%가 그들의 세포 주기를 정지시키기 전에 혈청과 접촉되지 않는다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양은 약 0.1% 내지 10%(v/v)이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양은 약 1 내지 2%(v/v)이다. 일부 실시예들에서, 혈청은 임상-등급의 우아 혈청, 풀링된(pooled) 인간 혈청, 또는 그 조합을 포함한다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포들은 동물 성분들을 사용하여 이전에 성장된 세포주이다. 일부 실시예들에서, 성숙한 제노-프리 ECM은 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 제노-프리 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마 형(gamma-form) 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용액은 기재의 cm²당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제조된 성숙한 제노-프리 ECM은 기재의 cm²당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포들은 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 방법은 용액에서 성숙한 ECM의 양을 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 다량의 폐(spent) 배양 배지를 용액으로부터 수집하고 가용성의 성숙한 ECM을 폐 배양 배지로부터 단리시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들은 위의 단락의 방법들 중 임의의 방법에 따라 생산되는 섬유아세포들 또는 MSC들 및 가용성의 성숙한 ECM을 포함하는 용액을 포함한다. 용액은 제노-프리일 수 있고, 가용성의 성숙한 ECM은 가교된 콜라겐을 포함할 수 있다.

일부 실시예들은 세포외 기질(ECM)을 제조하는 방법을 포함한다. 방법은 섬유아세포들을 일정 농도의 혈청을 포함하는 배지에 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때까지 섬유아세포들을 포함하는 배지에서 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은, 혈청의 점진적인 감소 다음에, 섬유아세포들을 적어도 약 2주 동안 배양하며, 이를 통해 섬유아세포들이 가용성 ECM을 생산함으로써, 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.7 배이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.9 배이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계는 세포 증식 또는 세포 계대배양(subculture) 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 혈청은 적어도 약 5일 동안 점진적으로 감소된다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계에 있다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸(apoptosis)을 겪고 있다. 일부 실시예들에서, 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함하며, 상기 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 갖는다. 일부 실시예들에서, ECM을 제조하는 단계는 (나노구조체들을 배제하지 않도록) 살균-여과 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시키는 단계는 살균-여과 없이 수행된다.

일부 실시예들은 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 포함한다. 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계에 있을 수 있다. 용액 내의 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있을 수 있다. 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함할 수 있으며, 상기 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 갖는다. 일부 실시예들에서, 가용성 ECM은 청구항 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된다.

도 1은 본원의 일부 실시예들에 따라 iPSC들로부터 분화되는 섬유아세포들을 사용하여 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다.
도 2는 본원의 일부 실시예들에 따라 적어도 2주 동안 섬유아세포들 또는 MSC들을 배양하는 단계를 포함하는 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다.
도 3은 본원의 일부 실시예들에 따라 혈청 이유(serum weaning)를 포함하는 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다. ECM은 제노-프리일 수 있다.

ECM은 다수의 미용 및 치료 응용들에 대해 유용할 수 있지만, ECM을 생산하는 종래의 방법들은 확장성, 사용의 용이성, 오염(인간 숙주들 내의 면역원성을 포함함), 질병 전염, 및 비용 효율성과 관련된 문제들을 겪을 수 있다. 상업적 규모들을 포함하는, ECM을 효율적으로 제조하기에 유용한 방법들, 조성물들, 및 키트들이 본원에 설명된다. 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따른 ECM은 비교적 높은 수준의 상업적으로 유용한 성숙한 콜라겐들(예컨대 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다)을 포함할 수 있고, 잠재적으로 유해한 제노 물질들(xeno substances)과 같은 오염물질들이 상대적으로 없을 수 있다.

일부 실시예들은 인간 세포외 기질(ECM)을 제조하기 위한 바이오리액터(bioreactor)로서 사용하기 위한 비-배아 인간 섬유아세포를 만들기 위한 방법들, 조성물들, 및 키트들을 포함한다. 이들 실시예들에 따르면, 성숙한 섬유아세포들은 유도 다능성 줄기 세포들(iPSCs)로 역분화되고, 증식되고, 성숙한 비-배아 생산 섬유아세포들로 재분화될 수 있다. 이들 생산 섬유아세포들은 콜라겐-풍부 ECM을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시예들은 성숙한 제노-프리 ECM을 제조하기 위한 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들을 포함한다. 이들 실시예들에 따르면, 세포들은 연장된 기간(예를 들어, 최대 8주, 예컨대 2 내지 3주 이상에 걸침) 동안 배양될 수 있으며, 이는 바람직한 특성들, 예컨대 콜라겐의 증가된 가교(cross-linking) 및 우수한 ECM 용해도(solubility)를 갖는 ECM을 산출할 수 있다. 대조적으로, ECM을 제조하기 위한 많은 종래의 접근법들은 훨씬 더 짧은 시간, 예를 들어 12 내지 17일 동안 세포 배양을 수행할 수 있다. 놀랍게도, 본원의 일부 실시예들에 따른 2 내지 3주 이상의 세포 배양물들은 더 짧은 기간의 배양물들과 비교하여 증가된 가교 및 용해도를 갖는 ECM을 생산한다.

일부 실시예들은 섬유아세포들이 혈청으로부터 점진적으로 이유되는(weaned) ECM을 생산하기 위해 섬유아세포들을 배양하는 방법들을 포함한다. 이들 실시예들에 따르면, 섬유아세포들은 먼저 혈청-함유 제형(formulation)으로 배양될 수 있고, 그 다음, 혈청의 양은 (예를 들어, 혈청 함량을 낮추기 위해 배양 배지를 제거 및 대체하고/하거나 세포들을 더 낮은 혈청 함량을 갖는 상이한 배양 배지로 이동시킴으로써) 점진적으로 감소될 수 있다. 세포들은 혈청의 감소 다음에 적어도 2주 동안 성숙한 가용성 ECM을 생산할 수 있고, 가용성 ECM은 세포들로부터 단리될 수 있다. "가용성"(예를 들어 가용성 ECM의 맥락에서)은 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 수상(aqueous phase)에서 용해되거나 용해될 수 있는 ECM의 유형 또는 분획(fraction)을 포함한다. 이와 같이, 가용성 ECM은 수상에서 회수되고 수상에서 유지될 수 있다. 일부 실시예들에서, 가용성 ECM은 수상에서 침전되지 않는다. 일부 실시예들에서, 가용성 ECM은, 예를 들어 가용성 ECM의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 또는 약 그 미만이 침전하도록, 최소 침전으로, 적어도 24시간 동안 동일한 조건들 하에서 수상에서 안정적으로 유지될 수 있다. 이 방법은 유리하게는 고-가용성 ECM을 산출할 수 있으며, 이는 미용 및 의료 제품들에 대해 유용할 수 있다. 일부 실시예들에서, ECM은 임의의 세포 증식 또는 계대배양 없이 효율적으로 생산된다. 일부 실시예들에서, 가용성 및 비-가용성 ECM 둘 다는 동일한 배양물로부터 회수될 수 있으며, 유리하게는 두 상태들(phases)에서 ECM을 회수하고 단지 상태들 중 하나로부터 ECM을 획득하는 방법보다 더 높은 수율을 획득한다는 점이 주목된다.

세포외 기질(ECM)

"세포외 기질(Extracellular Matrix)"(ECM)은 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 단백질들 및 탄수화물들과 같은 세포들에 의해 분비되는 분자들을 포함하며, 이는 세포들을 지지하기 위한 구조를 제공한다. ECM은 콜라겐과 같은 원섬유성 단백질들을 포함할 수 있다. 인간 ECM은 예를 들어 COL1, COL3, COL4, COL5, 및 COL6을 포함하는 다수의 콜라겐 단백질들 뿐만 아니라, 이들 단백질들의 조합들을 포함할 수 있다. 호모 사피엔스의 예시적 폴리펩티드 서열들 COL1, COL3, COL4, COL5, 및 COL6이 아래 표 1에 표시된다. 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들에서, 세포 배양물들은 ECM을 생산하며, 이는 세포 배양물들로부터 단리될 수 있다. 일부 실시예들에서, ECM은 인간 ECM을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 실시예들에서, ECM을 세포 배양물들로부터 단리시키는 단계는 ECM을 정제시키는 단계를 포함한다. 따라서, 단리된 ECM을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성되는 인간 ECM 제품들이 생산될 수 있다.

표 1: 예시적 호모 사피엔스 콜라겐 폴리펩티드 서열들

유전자 명 (단백질 명)	유니프로트 (Uniprot) ID	폴리펩티드 서열 (Polypeptide Sequence)	서열 식별 번호 SEQ ID NO:
COL1A1 (Collagen alpha-1(I) chain)	P02452	MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQGFQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQGARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPTGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAPGKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEGSRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCVYPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAIQLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLQGSNEIEIRAEGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDVAPLDVGAPDQEFGFDVGPVCFL	1
COL1A2 Collagen alpha-2(I) chain	P08123	MLSFVDTRTLLLLAVTLCLATCQSLQEETVRKGPAGDRGPRGERGPPGPPGRDGEDGPTGPPGPPGPPGPPGLGGNFAAQYDGKGVGLGPGPMGLMGPRGPPGAAGAPGPQGFQGPAGEPGEPGQTGPAGARGPAGPPGKAGEDGHPGKPGRPGERGVVGPQGARGFPGTPGLPGFKGIRGHNGLDGLKGQPGAPGVKGEPGAPGENGTPGQTGARGLPGERGRVGAPGPAGARGSDGSVGPVGPAGPIGSAGPPGFPGAPGPKGEIGAVGNAGPAGPAGPRGEVGLPGLSGPVGPPGNPGANGLTGAKGAAGLPGVAGAPGLPGPRGIPGPVGAAGATGARGLVGEPGPAGSKGESGNKGEPGSAGPQGPPGPSGEEGKRGPNGEAGSAGPPGPPGLRGSPGSRGLPGADGRAGVMGPPGSRGASGPAGVRGPNGDAGRPGEPGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPPGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFGLPGPAGPRGERGPPGESGAAGPTGPIGSRGPSGPPGPDGNKGEPGVVGAVGTAGPSGPSGLPGERGAAGIPGGKGEKGEPGLRGEIGNPGRDGARGAPGAVGAPGPAGATGDRGEAGAAGPAGPAGPRGSPGERGEVGPAGPNGFAGPAGAAGQPGAKGERGAKGPKGENGVVGPTGPVGAAGPAGPNGPPGPAGSRGDGGPPGMTGFPGAAGRTGPPGPSGISGPPGPPGPAGKEGLRGPRGDQGPVGRTGEVGAVGPPGFAGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGLLGAPGILGLPGSRGERGLPGVAGAVGEPGPLGIAGPPGARGPPGAVGSPGVNGAPGEAGRDGNPGNDGPPGRDGQPGHKGERGYPGNIGPVGAAGAPGPHGPVGPAGKHGNRGETGPSGPVGPAGAVGPRGPSGPQGIRGDKGEPGEKGPRGLPGLKGHNGLQGLPGIAGHHGDQGAPGSVGPAGPRGPAGPSGPAGKDGRTGHPGTVGPAGIRGPQGHQGPAGPPGPPGPPGPPGVSGGGYDFGYDGDFYRADQPRSAPSLRPKDYEVDATLKSLNNQIETLLTPEGSRKNPARTCRDLRLSHPEWSSGYYWIDPNQGCTMDAIKVYCDFSTGETCIRAQPENIPAKNWYRSSKDKKHVWLGETINAGSQFEYNVEGVTSKEMATQLAFMRLLANYASQNITYHCKNSIAYMDEETGNLKKAVILQGSNDVELVAEGNSRFTYTVLVDGCSKKTNEWGKTIIEYKTNKPSRLPFLDIAPLDIGGADQEFFVDIGPVCFK	2
COL2A1 Collagen alpha-1(II) chain	P02458	MIRLGAPQTLVLLTLLVAAVLRCQGQDVQEAGSCVQDGQRYNDKDVWKPEPCRICVCDTGTVLCDDIICEDVKDCLSPEIPFGECCPICPTDLATASGQPGPKGQKGEPGDIKDIVGPKGPPGPQGPAGEQGPRGDRGDKGEKGAPGPRGRDGEPGTPGNPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAAQMAGGFDEKAGGAQLGVMQGPMGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPGKPGDDGEAGKPGKAGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPGVKGESGSPGENGSPGPMGPRGLPGERGRTGPAGAAGARGNDGQPGPAGPPGPVGPAGGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEGAQGPRGEPGTPGSPGPAGASGNPGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGPQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGVGPIGPPGERGAPGNRGFPGQDGLAGPKGAPGERGPSGLAGPKGANGDPGRPGEPGLPGARGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRGLPGKDGETGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPSGFQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPRGERGFPGERGSPGAQGLQGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPPGLQGMPGERGAAGIAGPKGDRGDVGEKGPEGAPGKDGGRGLTGPIGPPGPAGANGEKGEVGPPGPAGSAGARGAPGERGETGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEQGEAGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVTGPKGARGAQGPPGATGFPGAAGRVGPPGSNGNPGPPGPPGPSGKDGPKGARGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGAPGASGDRGPPGPVGPPGLTGPAGEPGREGSPGADGPPGRDGAAGVKGDRGETGAVGAPGAPGPPGSPGPAGPTGKQGDRGEAGAQGPMGPSGPAGARGIQGPQGPRGDKGEAGEPGERGLKGHRGFTGLQGLPGPPGPSGDQGASGPAGPSGPRGPPGPVGPSGKDGANGIPGPIGPPGPRGRSGETGPAGPPGNPGPPGPPGPPGPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMRADQAAGGLRQHDAEVDATLKSLNNQIESIRSPEGSRKNPARTCRDLKLCHPEWKSGDYWIDPNQGCTLDAMKVFCNMETGETCVYPNPANVPKKNWWSSKSKEKKHIWFGETINGGFHFSYGDDNLAPNTANVQMTFLRLLSTEGSQNITYHCKNSIAYLDEAAGNLKKALLIQGSNDVEIRAEGNSRFTYTALKDGCTKHTGKWGKTVIEYRSQKTSRLPIIDIAPMDIGGPEQEFGVDIGPVCFL	3
COL3A1 Collagen alpha-1(III) chain	P02461	MMSFVQKGSWLLLALLHPTIILAQQEAVEGGCSHLGQSYADRDVWKPEPCQICVCDSGSVLCDDIICDDQELDCPNPEIPFGECCAVCPQPPTAPTRPPNGQGPQGPKGDPGPPGIPGRNGDPGIPGQPGSPGSPGPPGICESCPTGPQNYSPQYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGRPGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGAPGPMGPRGAPGERGRPGLPGAAGARGNDGARGSDGQPGPPGPPGTAGFPGSPGAKGEVGPAGSPGSNGAPGQRGEPGPQGHAGAQGPPGPPGINGSPGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGAPGLRGGAGEPGKNGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGSPGEPGANGLPGAAGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGVPGGPGMRGMPGSPGGPGSDGKPGPPGSQGESGRPGPPGPSGPRGQPGVMGFPGPKGNDGAPGKNGERGGPGGPGPQGPPGKNGETGPQGPPGPTGPGGDKGDTGPPGPQGLQGLPGTGGPPGENGKPGEPGPKGDAGAPGAPGGKGDAGAPGERGPPGLAGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGAAGTPGLQGMPGERGGLGSPGPKGDKGEPGGPGADGVPGKDGPRGPTGPIGPPGPAGQPGDKGEGGAPGLPGIAGPRGSPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGERGSPGGPGAAGFPGARGLPGPPGSNGNPGPPGPSGSPGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYGDEPMDFKINTDEIMTSLKSVNGQIESLISPDGSRKNPARNCRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCNMETGETCISANPLNVPRKHWWTDSSAEKKHVWFGESMDGGFQFSYGNPELPEDVLDVHLAFLRLLSSRASQNITYHCKNSIAYMDQASGNVKKALKLMGSNEGEFKAEGNSKFTYTVLEDGCTKHTGEWSKTVFEYRTRKAVRLPIVDIAPYDIGGPDQEFGVDVGPVCFL	4
COL4A1 Collagen alpha-1(IV) chain	P02462	MGPRLSVWLLLLPAALLLHEEHSRAAAKGGCAGSGCGKCDCHGVKGQKGERGLPGLQGVIGFPGMQGPEGPQGPPGQKGDTGEPGLPGTKGTRGPPGASGYPGNPGLPGIPGQDGPPGPPGIPGCNGTKGERGPLGPPGLPGFAGNPGPPGLPGMKGDPGEILGHVPGMLLKGERGFPGIPGTPGPPGLPGLQGPVGPPGFTGPPGPPGPPGPPGEKGQMGLSFQGPKGDKGDQGVSGPPGVPGQAQVQEKGDFATKGEKGQKGEPGFQGMPGVGEKGEPGKPGPRGKPGKDGDKGEKGSPGFPGEPGYPGLIGRQGPQGEKGEAGPPGPPGIVIGTGPLGEKGERGYPGTPGPRGEPGPKGFPGLPGQPGPPGLPVPGQAGAPGFPGERGEKGDRGFPGTSLPGPSGRDGLPGPPGSPGPPGQPGYTNGIVECQPGPPGDQGPPGIPGQPGFIGEIGEKGQKGESCLICDIDGYRGPPGPQGPPGEIGFPGQPGAKGDRGLPGRDGVAGVPGPQGTPGLIGQPGAKGEPGEFYFDLRLKGDKGDPGFPGQPGMTGRAGSPGRDGHPGLPGPKGSPGSVGLKGERGPPGGVGFPGSRGDTGPPGPPGYGPAGPIGDKGQAGFPGGPGSPGLPGPKGEPGKIVPLPGPPGAEGLPGSPGFPGPQGDRGFPGTPGRPGLPGEKGAVGQPGIGFPGPPGPKGVDGLPGDMGPPGTPGRPGFNGLPGNPGVQGQKGEPGVGLPGLKGLPGLPGIPGTPGEKGSIGVPGVPGEHGAIGPPGLQGIRGEPGPPGLPGSVGSPGVPGIGPPGARGPPGGQGPPGLSGPPGIKGEKGFPGFPGLDMPGPKGDKGAQGLPGITGQSGLPGLPGQQGAPGIPGFPGSKGEMGVMGTPGQPGSPGPVGAPGLPGEKGDHGFPGSSGPRGDPGLKGDKGDVGLPGKPGSMDKVDMGSMKGQKGDQGEKGQIGPIGEKGSRGDPGTPGVPGKDGQAGQPGQPGPKGDPGISGTPGAPGLPGPKGSVGGMGLPGTPGEKGVPGIPGPQGSPGLPGDKGAKGEKGQAGPPGIGIPGLRGEKGDQGIAGFPGSPGEKGEKGSIGIPGMPGSPGLKGSPGSVGYPGSPGLPGEKGDKGLPGLDGIPGVKGEAGLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHATEGPKGDRGPQGQPGLPGLPGPMGPPGLPGIDGVKGDKGNPGWPGAPGVPGPKGDPGFQGMPGIGGSPGITGSKGDMGPPGVPGFQGPKGLPGLQGIKGDQGDQGVPGAKGLPGPPGPPGPYDIIKGEPGLPGPEGPPGLKGLQGLPGPKGQQGVTGLVGIPGPPGIPGFDGAPGQKGEMGPAGPTGPRGFPGPPGPDGLPGSMGPPGTPSVDHGFLVTRHSQTIDDPQCPSGTKILYHGYSLLYVQGNERAHGQDLGTAGSCLRKFSTMPFLFCNINNVCNFASRNDYSYWLSTPEPMPMSMAPITGENIRPFISRCAVCEAPAMVMAVHSQTIQIPPCPSGWSSLWIGYSFVMHTSAGAEGSGQALASPGSCLEEFRSAPFIECHGRGTCNYYANAYSFWLATIERSEMFKKPTPSTLKAGELRTHVSRCQVCMRRT	5
COL4A2 Collagen alpha-2(IV) chain	P08572	MGRDQRAVAGPALRRWLLLGTVTVGFLAQSVLAGVKKFDVPCGGRDCSGGCQCYPEKGGRGQPGPVGPQGYNGPPGLQGFPGLQGRKGDKGERGAPGVTGPKGDVGARGVSGFPGADGIPGHPGQGGPRGRPGYDGCNGTQGDSGPQGPPGSEGFTGPPGPQGPKGQKGEPYALPKEERDRYRGEPGEPGLVGFQGPPGRPGHVGQMGPVGAPGRPGPPGPPGPKGQQGNRGLGFYGVKGEKGDVGQPGPNGIPSDTLHPIIAPTGVTFHPDQYKGEKGSEGEPGIRGISLKGEEGIMGFPGLRGYPGLSGEKGSPGQKGSRGLDGYQGPDGPRGPKGEAGDPGPPGLPAYSPHPSLAKGARGDPGFPGAQGEPGSQGEPGDPGLPGPPGLSIGDGDQRRGLPGEMGPKGFIGDPGIPALYGGPPGPDGKRGPPGPPGLPGPPGPDGFLFGLKGAKGRAGFPGLPGSPGARGPKGWKGDAGECRCTEGDEAIKGLPGLPGPKGFAGINGEPGRKGDRGDPGQHGLPGFPGLKGVPGNIGAPGPKGAKGDSRTITTKGERGQPGVPGVPGMKGDDGSPGRDGLDGFPGLPGPPGDGIKGPPGDPGYPGIPGTKGTPGEMGPPGLGLPGLKGQRGFPGDAGLPGPPGFLGPPGPAGTPGQIDCDTDVKRAVGGDRQEAIQPGCIGGPKGLPGLPGPPGPTGAKGLRGIPGFAGADGGPGPRGLPGDAGREGFPGPPGFIGPRGSKGAVGLPGPDGSPGPIGLPGPDGPPGERGLPGEVLGAQPGPRGDAGVPGQPGLKGLPGDRGPPGFRGSQGMPGMPGLKGQPGLPGPSGQPGLYGPPGLHGFPGAPGQEGPLGLPGIPGREGLPGDRGDPGDTGAPGPVGMKGLSGDRGDAGFTGEQGHPGSPGFKGIDGMPGTPGLKGDRGSPGMDGFQGMPGLKGRPGFPGSKGEAGFFGIPGLKGLAGEPGFKGSRGDPGPPGPPPVILPGMKDIKGEKGDEGPMGLKGYLGAKGIQGMPGIPGLSGIPGLPGRPGHIKGVKGDIGVPGIPGLPGFPGVAGPPGITGFPGFIGSRGDKGAPGRAGLYGEIGATGDFGDIGDTINLPGRPGLKGERGTTGIPGLKGFFGEKGTEGDIGFPGITGVTGVQGPPGLKGQTGFPGLTGPPGSQGELGRIGLPGGKGDDGWPGAPGLPGFPGLRGIRGLHGLPGTKGFPGSPGSDIHGDPGFPGPPGERGDPGEANTLPGPVGVPGQKGDQGAPGERGPPGSPGLQGFPGITPPSNISGAPGDKGAPGIFGLKGYRGPPGPPGSAALPGSKGDTGNPGAPGTPGTKGWAGDSGPQGRPGVFGLPGEKGPRGEQGFMGNTGPTGAVGDRGPKGPKGDPGFPGAPGTVGAPGIAGIPQKIAVQPGTVGPQGRRGPPGAPGEMGPQGPPGEPGFRGAPGKAGPQGRGGVSAVPGFRGDEGPIGHQGPIGQEGAPGRPGSPGLPGMPGRSVSIGYLLVKHSQTDQEPMCPVGMNKLWSGYSLLYFEGQEKAHNQDLGLAGSCLARFSTMPFLYCNPGDVCYYASRNDKSYWLSTTAPLPMMPVAEDEIKPYISRCSVCEAPAIAIAVHSQDVSIPHCPAGWRSLWIGYSFLMHTAAGDEGGGQSLVSPGSCLEDFRATPFIECNGGRGTCHYYANKYSFWLTTIPEQSFQGSPSADTLKAGLIRTHISRCQVCMKNL	6
COL4A3 Collagen alpha-3(IV) chain	Q01955	MSARTAPRPQVLLLPLLLVLLAAAPAASKGCVCKDKGQCFCDGAKGEKGEKGFPGPPGSPGQKGFTGPEGLPGPQGPKGFPGLPGLTGSKGVRGISGLPGFSGSPGLPGTPGNTGPYGLVGVPGCSGSKGEQGFPGLPGTLGYPGIPGAAGLKGQKGAPAKEEDIELDAKGDPGLPGAPGPQGLPGPPGFPGPVGPPGPPGFFGFPGAMGPRGPKGHMGERVIGHKGERGVKGLTGPPGPPGTVIVTLTGPDNRTDLKGEKGDKGAMGEPGPPGPSGLPGESYGSEKGAPGDPGLQGKPGKDGVPGFPGSEGVKGNRGFPGLMGEDGIKGQKGDIGPPGFRGPTEYYDTYQEKGDEGTPGPPGPRGARGPQGPSGPPGVPGSPGSSRPGLRGAPGWPGLKGSKGERGRPGKDAMGTPGSPGCAGSPGLPGSPGPPGPPGDIVFRKGPPGDHGLPGYLGSPGIPGVDGPKGEPGLLCTQCPYIPGPPGLPGLPGLHGVKGIPGRQGAAGLKGSPGSPGNTGLPGFPGFPGAQGDPGLKGEKGETLQPEGQVGVPGDPGLRGQPGRKGLDGIPGTPGVKGLPGPKGELALSGEKGDQGPPGDPGSPGSPGPAGPAGPPGYGPQGEPGLQGTQGVPGAPGPPGEAGPRGELSVSTPVPGPPGPPGPPGHPGPQGPPGIPGSLGKCGDPGLPGPDGEPGIPGIGFPGPPGPKGDQGFPGTKGSLGCPGKMGEPGLPGKPGLPGAKGEPAVAMPGGPGTPGFPGERGNSGEHGEIGLPGLPGLPGTPGNEGLDGPRGDPGQPGPPGEQGPPGRCIEGPRGAQGLPGLNGLKGQQGRRGKTGPKGDPGIPGLDRSGFPGETGSPGIPGHQGEMGPLGQRGYPGNPGILGPPGEDGVIGMMGFPGAIGPPGPPGNPGTPGQRGSPGIPGVKGQRGTPGAKGEQGDKGNPGPSEISHVIGDKGEPGLKGFAGNPGEKGNRGVPGMPGLKGLKGLPGPAGPPGPRGDLGSTGNPGEPGLRGIPGSMGNMGMPGSKGKRGTLGFPGRAGRPGLPGIHGLQGDKGEPGYSEGTRPGPPGPTGDPGLPGDMGKKGEMGQPGPPGHLGPAGPEGAPGSPGSPGLPGKPGPHGDLGFKGIKGLLGPPGIRGPPGLPGFPGSPGPMGIRGDQGRDGIPGPAGEKGETGLLRAPPGPRGNPGAQGAKGDRGAPGFPGLPGRKGAMGDAGPRGPTGIEGFPGPPGLPGAIIPGQTGNRGPPGSRGSPGAPGPPGPPGSHVIGIKGDKGSMGHPGPKGPPGTAGDMGPPGRLGAPGTPGLPGPRGDPGFQGFPGVKGEKGNPGFLGSIGPPGPIGPKGPPGVRGDPGTLKIISLPGSPGPPGTPGEPGMQGEPGPPGPPGNLGPCGPRGKPGKDGKPGTPGPAGEKGNKGSKGEPGPAGSDGLPGLKGKRGDSGSPATWTTRGFVFTRHSQTTAIPSCPEGTVPLYSGFSFLFVQGNQRAHGQDLGTLGSCLQRFTTMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWLSTPALMPMNMAPITGRALEPYISRCTVCEGPAIAIAVHSQTTDIPPCPHGWISLWKGFSFIMFTSAGSEGTGQALASPGSCLEEFRASPFLECHGRGTCNYYSNSYSFWLASLNPERMFRKPIPSTVKAGELEKIISRCQVCMKKRH	7
COL4A4 Collagen alpha-4(IV) chain	P53420	MWSLHIVLMRCSFRLTKSLATGPWSLILILFSVQYVYGSGKKYIGPCGGRDCSVCHCVPEKGSRGPPGPPGPQGPIGPLGAPGPIGLSGEKGMRGDRGPPGAAGDKGDKGPTGVPGFPGLDGIPGHPGPPGPRGKPGMSGHNGSRGDPGFPGGRGALGPGGPLGHPGEKGEKGNSVFILGAVKGIQGDRGDPGLPGLPGSWGAGGPAGPTGYPGEPGLVGPPGQPGRPGLKGNPGVGVKGQMGDPGEVGQQGSPGPTLLVEPPDFCLYKGEKGIKGIPGMVGLPGPPGRKGESGIGAKGEKGIPGFPGPRGDPGSYGSPGFPGLKGELGLVGDPGLFGLIGPKGDPGNRGHPGPPGVLVTPPLPLKGPPGDPGFPGRYGETGDVGPPGPPGLLGRPGEACAGMIGPPGPQGFPGLPGLPGEAGIPGRPDSAPGKPGKPGSPGLPGAPGLQGLPGSSVIYCSVGNPGPQGIKGKVGPPGGRGPKGEKGNEGLCACEPGPMGPPGPPGLPGRQGSKGDLGLPGWLGTKGDPGPPGAEGPPGLPGKHGASGPPGNKGAKGDMVVSRVKGHKGERGPDGPPGFPGQPGSHGRDGHAGEKGDPGPPGDHEDATPGGKGFPGPLGPPGKAGPVGPPGLGFPGPPGERGHPGVPGHPGVRGPDGLKGQKGDTISCNVTYPGRHGPPGFDGPPGPKGFPGPQGAPGLSGSDGHKGRPGTPGTAEIPGPPGFRGDMGDPGFGGEKGSSPVGPPGPPGSPGVNGQKGIPGDPAFGHLGPPGKRGLSGVPGIKGPRGDPGCPGAEGPAGIPGFLGLKGPKGREGHAGFPGVPGPPGHSCERGAPGIPGQPGLPGYPGSPGAPGGKGQPGDVGPPGPAGMKGLPGLPGRPGAHGPPGLPGIPGPFGDDGLPGPPGPKGPRGLPGFPGFPGERGKPGAEGCPGAKGEPGEKGMSGLPGDRGLRGAKGAIGPPGDEGEMAIISQKGTPGEPGPPGDDGFPGERGDKGTPGMQGRRGEPGRYGPPGFHRGEPGEKGQPGPPGPPGPPGSTGLRGFIGFPGLPGDQGEPGSPGPPGFSGIDGARGPKGNKGDPASHFGPPGPKGEPGSPGCPGHFGASGEQGLPGIQGPRGSPGRPGPPGSSGPPGCPGDHGMPGLRGQPGEMGDPGPRGLQGDPGIPGPPGIKGPSGSPGLNGLHGLKGQKGTKGASGLHDVGPPGPVGIPGLKGERGDPGSPGISPPGPRGKKGPPGPPGSSGPPGPAGATGRAPKDIPDPGPPGDQGPPGPDGPRGAPGPPGLPGSVDLLRGEPGDCGLPGPPGPPGPPGPPGYKGFPGCDGKDGQKGPVGFPGPQGPHGFPGPPGEKGLPGPPGRKGPTGLPGPRGEPGPPADVDDCPRIPGLPGAPGMRGPEGAMGLPGMRGPSGPGCKGEPGLDGRRGVDGVPGSPGPPGRKGDTGEDGYPGGPGPPGPIGDPGPKGFGPGYLGGFLLVLHSQTDQEPTCPLGMPRLWTGYSLLYLEGQEKAHNQDLGLAGSCLPVFSTLPFAYCNIHQVCHYAQRNDRSYWLASAAPLPMMPLSEEAIRPYVSRCAVCEAPAQAVAVHSQDQSIPPCPQTWRSLWIGYSFLMHTGAGDQGGGQALMSPGSCLEDFRAAPFLECQGRQGTCHFFANKYSFWLTTVKADLQFSSAPAPDTLKESQAQRQKISRCQVCVKYS	8
COL4A5 Collagen alpha-5(IV) chain	P29400	MKLRGVSLAAGLFLLALSLWGQPAEAAACYGCSPGSKCDCSGIKGEKGERGFPGLEGHPGLPGFPGPEGPPGPRGQKGDDGIPGPPGPKGIRGPPGLPGFPGTPGLPGMPGHDGAPGPQGIPGCNGTKGERGFPGSPGFPGLQGPPGPPGIPGMKGEPGSIIMSSLPGPKGNPGYPGPPGIQGLPGPTGIPGPIGPPGPPGLMGPPGPPGLPGPKGNMGLNFQGPKGEKGEQGLQGPPGPPGQISEQKRPIDVEFQKGDQGLPGDRGPPGPPGIRGPPGPPGGEKGEKGEQGEPGKRGKPGKDGENGQPGIPGLPGDPGYPGEPGRDGEKGQKGDTGPPGPPGLVIPRPGTGITIGEKGNIGLPGLPGEKGERGFPGIQGPPGLPGPPGAAVMGPPGPPGFPGERGQKGDEGPPGISIPGPPGLDGQPGAPGLPGPPGPAGPHIPPSDEICEPGPPGPPGSPGDKGLQGEQGVKGDKGDTCFNCIGTGISGPPGQPGLPGLPGPPGSLGFPGQKGEKGQAGATGPKGLPGIPGAPGAPGFPGSKGEPGDILTFPGMKGDKGELGSPGAPGLPGLPGTPGQDGLPGLPGPKGEPGGITFKGERGPPGNPGLPGLPGNIGPMGPPGFGPPGPVGEKGIQGVAGNPGQPGIPGPKGDPGQTITQPGKPGLPGNPGRDGDVGLPGDPGLPGQPGLPGIPGSKGEPGIPGIGLPGPPGPKGFPGIPGPPGAPGTPGRIGLEGPPGPPGFPGPKGEPGFALPGPPGPPGLPGFKGALGPKGDRGFPGPPGPPGRTGLDGLPGPKGDVGPNGQPGPMGPPGLPGIGVQGPPGPPGIPGPIGQPGLHGIPGEKGDPGPPGLDVPGPPGERGSPGIPGAPGPIGPPGSPGLPGKAGASGFPGTKGEMGMMGPPGPPGPLGIPGRSGVPGLKGDDGLQGQPGLPGPTGEKGSKGEPGLPGPPGPMDPNLLGSKGEKGEPGLPGIPGVSGPKGYQGLPGDPGQPGLSGQPGLPGPPGPKGNPGLPGQPGLIGPPGLKGTIGDMGFPGPQGVEGPPGPSGVPGQPGSPGLPGQKGDKGDPGISSIGLPGLPGPKGEPGLPGYPGNPGIKGSVGDPGLPGLPGTPGAKGQPGLPGFPGTPGPPGPKGISGPPGNPGLPGEPGPVGGGGHPGQPGPPGEKGKPGQDGIPGPAGQKGEPGQPGFGNPGPPGLPGLSGQKGDGGLPGIPGNPGLPGPKGEPGFHGFPGVQGPPGPPGSPGPALEGPKGNPGPQGPPGRPGLPGPEGPPGLPGNGGIKGEKGNPGQPGLPGLPGLKGDQGPPGLQGNPGRPGLNGMKGDPGLPGVPGFPGMKGPSGVPGSAGPEGEPGLIGPPGPPGLPGPSGQSIIIKGDAGPPGIPGQPGLKGLPGPQGPQGLPGPTGPPGDPGRNGLPGFDGAGGRKGDPGLPGQPGTRGLDGPPGPDGLQGPPGPPGTSSVAHGFLITRHSQTTDAPQCPQGTLQVYEGFSLLYVQGNKRAHGQDLGTAGSCLRRFSTMPFMFCNINNVCNFASRNDYSYWLSTPEPMPMSMQPLKGQSIQPFISRCAVCEAPAVVIAVHSQTIQIPHCPQGWDSLWIGYSFMMHTSAGAEGSGQALASPGSCLEEFRSAPFIECHGRGTCNYYANSYSFWLATVDVSDMFSKPQSETLKAGDLRTRISRCQVCMKRT	9
COL4A6 Collagen alpha-6(IV) chain	Q14031	MLINKLWLLLVTLCLTEELAAAGEKSYGKPCGGQDCSGSCQCFPEKGARGRPGPIGIQGPTGPQGFTGSTGLSGLKGERGFPGLLGPYGPKGDKGPMGVPGFLGINGIPGHPGQPGPRGPPGLDGCNGTQGAVGFPGPDGYPGLLGPPGLPGQKGSKGDPVLAPGSFKGMKGDPGLPGLDGITGPQGAPGFPGAVGPAGPPGLQGPPGPPGPLGPDGNMGLGFQGEKGVKGDVGLPGPAGPPPSTGELEFMGFPKGKKGSKGEPGPKGFPGISGPPGFPGLGTTGEKGEKGEKGIPGLPGPRGPMGSEGVQGPPGQQGKKGTLGFPGLNGFQGIEGQKGDIGLPGPDVFIDIDGAVISGNPGDPGVPGLPGLKGDEGIQGLRGPSGVPGLPALSGVPGALGPQGFPGLKGDQGNPGRTTIGAAGLPGRDGLPGPPGPPGPPSPEFETETLHNKESGFPGLRGEQGPKGNLGLKGIKGDSGFCACDGGVPNTGPPGEPGPPGPWGLIGLPGLKGARGDRGSGGAQGPAGAPGLVGPLGPSGPKGKKGEPILSTIQGMPGDRGDSGSQGFRGVIGEPGKDGVPGLPGLPGLPGDGGQGFPGEKGLPGLPGEKGHPGPPGLPGNGLPGLPGPRGLPGDKGKDGLPGQQGLPGSKGITLPCIIPGSYGPSGFPGTPGFPGPKGSRGLPGTPGQPGSSGSKGEPGSPGLVHLPELPGFPGPRGEKGLPGFPGLPGKDGLPGMIGSPGLPGSKGATGDIFGAENGAPGEQGLQGLTGHKGFLGDSGLPGLKGVHGKPGLLGPKGERGSPGTPGQVGQPGTPGSSGPYGIKGKSGLPGAPGFPGISGHPGKKGTRGKKGPPGSIVKKGLPGLKGLPGNPGLVGLKGSPGSPGVAGLPALSGPKGEKGSVGFVGFPGIPGLPGIPGTRGLKGIPGSTGKMGPSGRAGTPGEKGDRGNPGPVGIPSPRRPMSNLWLKGDKGSQGSAGSNGFPGPRGDKGEAGRPGPPGLPGAPGLPGIIKGVSGKPGPPGFMGIRGLPGLKGSSGITGFPGMPGESGSQGIRGSPGLPGASGLPGLKGDNGQTVEISGSPGPKGQPGESGFKGTKGRDGLIGNIGFPGNKGEDGKVGVSGDVGLPGAPGFPGVAGMRGEPGLPGSSGHQGAIGPLGSPGLIGPKGFPGFPGLHGLNGLPGTKGTHGTPGPSITGVPGPAGLPGPKGEKGYPGIGIGAPGKPGLRGQKGDRGFPGLQGPAGLPGAPGISLPSLIAGQPGDPGRPGLDGERGRPGPAGPPGPPGPSSNQGDTGDPGFPGIPGPKGPKGDQGIPGFSGLPGELGLKGMRGEPGFMGTPGKVGPPGDPGFPGMKGKAGPRGSSGLQGDPGQTPTAEAVQVPPGPLGLPGIDGIPGLTGDPGAQGPVGLQGSKGLPGIPGKDGPSGLPGPPGALGDPGLPGLQGPPGFEGAPGQQGPFGMPGMPGQSMRVGYTLVKHSQSEQVPPCPIGMSQLWVGYSLLFVEGQEKAHNQDLGFAGSCLPRFSTMPFIYCNINEVCHYARRNDKSYWLSTTAPIPMMPVSQTQIPQYISRCSVCEAPSQAIAVHSQDITIPQCPLGWRSLWIGYSFLMHTAAGAEGGGQSLVSPGSCLEDFRATPFIECSGARGTCHYFANKYSFWLTTVEERQQFGELPVSETLKAGQLHTRVSRCQVCMKSL	10
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COL5A3 Collagen alpha-3(V) chain	P25940	MGNRRDLGQPRAGLCLLLAALQLLPGTQADPVDVLKALGVQGGQAGVPEGPGFCPQRTPEGDRAFRIGQASTLGIPTWELFPEGHFPENFSLLITLRGQPANQSVLLSIYDERGARQLGLALGPALGLLGDPFRPLPQQVNLTDGRWHRVAVSIDGEMVTLVADCEAQPPVLGHGPRFISIAGLTVLGTQDLGEKTFEGDIQELLISPDPQAAFQACERYLPDCDNLAPAATVAPQGEPETPRPRRKGKGKGRKKGRGRKGKGRKKNKEIWTSSPPPDSAENQTSTDIPKTETPAPNLPPTPTPLVVTSTVTTGLNATILERSLDPDSGTELGTLETKAAREDEEGDDSTMGPDFRAAEYPSRTQFQIFPGAGEKGAKGEPAVIEKGQQFEGPPGAPGPQGVVGPSGPPGPPGFPGDPGPPGPAGLPGIPGIDGIRGPPGTVIMMPFQFAGGSFKGPPVSFQQAQAQAVLQQTQLSMKGPPGPVGLTGRPGPVGLPGHPGLKGEEGAEGPQGPRGLQGPHGPPGRVGKMGRPGADGARGLPGDTGPKGDRGFDGLPGLPGEKGQRGDFGHVGQPGPPGEDGERGAEGPPGPTGQAGEPGPRGLLGPRGSPGPTGRPGVTGIDGAPGAKGNVGPPGEPGPPGQQGNHGSQGLPGPQGLIGTPGEKGPPGNPGIPGLPGSDGPLGHPGHEGPTGEKGAQGPPGSAGPPGYPGPRGVKGTSGNRGLQGEKGEKGEDGFPGFKGDVGLKGDQGKPGAPGPRGEDGPEGPKGQAGQAGEEGPPGSAGEKGKLGVPGLPGYPGRPGPKGSIGFPGPLGPIGEKGKSGKTGQPGLEGERGPPGSRGERGQPGATGQPGPKGDVGQDGAPGIPGEKGLPGLQGPPGFPGPKGPPGHQGKDGRPGHPGQRGELGFQGQTGPPGPAGVLGPQGKTGEVGPLGERGPPGPPGPPGEQGLPGLEGREGAKGELGPPGPLGKEGPAGLRGFPGPKGGPGDPGPTGLKGDKGPPGPVGANGSPGERGPLGPAGGIGLPGQSGSEGPVGPAGKKGSRGERGPPGPTGKDGIPGPLGPLGPPGAAGPSGEEGDKGDVGAPGHKGSKGDKGDAGPPGQPGIRGPAGHPGPPGADGAQGRRGPPGLFGQKGDDGVRGFVGVIGPPGLQGLPGPPGEKGEVGDVGSMGPHGAPGPRGPQGPTGSEGTPGLPGGVGQPGAVGEKGERGDAGDPGPPGAPGIPGPKGDIGEKGDSGPSGAAGPPGKKGPPGEDGAKGSVGPTGLPGDLGPPGDPGVSGIDGSPGEKGDPGDVGGPGPPGASGEPGAPGPPGKRGPSGHMGREGREGEKGAKGEPGPDGPPGRTGPMGARGPPGRVGPEGLRGIPGPVGEPGLLGAPGQMGPPGPLGPSGLPGLKGDTGPKGEKGHIGLIGLIGPPGEAGEKGDQGLPGVQGPPGPKGDPGPPGPIGSLGHPGPPGVAGPLGQKGSKGSPGSMGPRGDTGPAGPPGPPGAPAELHGLRRRRRFVPVPLPVVEGGLEEVLASLTSLSLELEQLRRPPGTAERPGLVCHELHRNHPHLPDGEYWIDPNQGCARDSFRVFCNFTAGGETCLYPDKKFEIVKLASWSKEKPGGWYSTFRRGKKFSYVDADGSPVNVVQLNFLKLLSATARQNFTYSCQNAAAWLDEATGDYSHSARFLGTNGEELSFNQTTAATVSVPQDGCRLRKGQTKTLFEFSSSRAGFLPLWDVAATDFGQTNQKFGFELGPVCFSS	13
COL6A2 Collagen alpha-2(VI) chain	P12110	MLQGTCSVLLLWGILGAIQAQQQEVISPDTTERNNNCPEKTDCPIHVYFVLDTSESVTMQSPTDILLFHMKQFVPQFISQLQNEFYLDQVALSWRYGGLHFSDQVEVFSPPGSDRASFIKNLQGISSFRRGTFTDCALANMTEQIRQDRSKGTVHFAVVITDGHVTGSPCGGIKLQAERAREEGIRLFAVAPNQNLKEQGLRDIASTPHELYRNDYATMLPDSTEIDQDTINRIIKVMKHEAYGECYKVSCLEIPGPSGPKGYRGQKGAKGNMGEPGEPGQKGRQGDPGIEGPIGFPGPKGVPGFKGEKGEFGADGRKGAPGLAGKNGTDGQKGKLGRIGPPGCKGDPGNRGPDGYPGEAGSPGERGDQGGKGDPGRPGRRGPPGEIGAKGSKGYQGNSGAPGSPGVKGAKGGPGPRGPKGEPGRRGDPGTKGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPADPGPPGEPGPRGPRGVPGPEGEPGPPGDPGLTECDVMTYVRETCGCCDCEKRCGALDVVFVIDSSESIGYTNFTLEKNFVINVVNRLGAIAKDPKSETGTRVGVVQYSHEGTFEAIQLDDERIDSLSSFKEAVKNLEWIAGGTWTPSALKFAYDRLIKESRRQKTRVFAVVITDGRHDPRDDDLNLRALCDRDVTVTAIGIGDMFHEKHESENLYSIACDKPQQVRNMTLFSDLVAEKFIDDMEDVLCPDPQIVCPDLPCQTELSVAQCTQRPVDIVFLLDGSERLGEQNFHKARRFVEQVARRLTLARRDDDPLNARVALLQFGGPGEQQVAFPLSHNLTAIHEALETTQYLNSFSHVGAGVVHAINAIVRSPRGGARRHAELSFVFLTDGVTGNDSLHESAHSMRKQNVVPTVLALGSDVDMDVLTTLSLGDRAAVFHEKDYDSLAQPGFFDRFIRWIC	14
COL6A3 Collagen alpha-3(VI) chain	P12111	MRKHRHLPLVAVFCLFLSGFPTTHAQQQQADVKNGAAADIIFLVDSSWTIGEEHFQLVREFLYDVVKSLAVGENDFHFALVQFNGNPHTEFLLNTYRTKQEVLSHISNMSYIGGTNQTGKGLEYIMQSHLTKAAGSRAGDGVPQVIVVLTDGHSKDGLALPSAELKSADVNVFAIGVEDADEGALKEIASEPLNMHMFNLENFTSLHDIVGNLVSCVHSSVSPERAGDTETLKDITAQDSADIIFLIDGSNNTGSVNFAVILDFLVNLLEKLPIGTQQIRVGVVQFSDEPRTMFSLDTYSTKAQVLGAVKALGFAGGELANIGLALDFVVENHFTRAGGSRVEEGVPQVLVLISAGPSSDEIRYGVVALKQASVFSFGLGAQAASRAELQHIATDDNLVFTVPEFRSFGDLQEKLLPYIVGVAQRHIVLKPPTIVTQVIEVNKRDIVFLVDGSSALGLANFNAIRDFIAKVIQRLEIGQDLIQVAVAQYADTVRPEFYFNTHPTKREVITAVRKMKPLDGSALYTGSALDFVRNNLFTSSAGYRAAEGIPKLLVLITGGKSLDEISQPAQELKRSSIMAFAIGNKGADQAELEEIAFDSSLVFIPAEFRAAPLQGMLPGLLAPLRTLSGTPEVHSNKRDIIFLLDGSANVGKTNFPYVRDFVMNLVNSLDIGNDNIRVGLVQFSDTPVTEFSLNTYQTKSDILGHLRQLQLQGGSGLNTGSALSYVYANHFTEAGGSRIREHVPQLLLLLTAGQSEDSYLQAANALTRAGILTFCVGASQANKAELEQIAFNPSLVYLMDDFSSLPALPQQLIQPLTTYVSGGVEEVPLAQPESKRDILFLFDGSANLVGQFPVVRDFLYKIIDELNVKPEGTRIAVAQYSDDVKVESRFDEHQSKPEILNLVKRMKIKTGKALNLGYALDYAQRYIFVKSAGSRIEDGVLQFLVLLVAGRSSDRVDGPASNLKQSGVVPFIFQAKNADPAELEQIVLSPAFILAAESLPKIGDLHPQIVNLLKSVHNGAPAPVSGEKDVVFLLDGSEGVRSGFPLLKEFVQRVVESLDVGQDRVRVAVVQYSDRTRPEFYLNSYMNKQDVVNAVRQLTLLGGPTPNTGAALEFVLRNILVSSAGSRITEGVPQLLIVLTADRSGDDVRNPSVVVKRGGAVPIGIGIGNADITEMQTISFIPDFAVAIPTFRQLGTVQQVISERVTQLTREELSRLQPVLQPLPSPGVGGKRDVVFLIDGSQSAGPEFQYVRTLIERLVDYLDVGFDTTRVAVIQFSDDPKVEFLLNAHSSKDEVQNAVQRLRPKGGRQINVGNALEYVSRNIFKRPLGSRIEEGVPQFLVLISSGKSDDEVDDPAVELKQFGVAPFTIARNADQEELVKISLSPEYVFSVSTFRELPSLEQKLLTPITTLTSEQIQKLLASTRYPPPAVESDAADIVFLIDSSEGVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKVRVGVVQFSNDVFPEFYLKTYRSQAPVLDAIRRLRLRGGSPLNTGKALEFVARNLFVKSAGSRIEDGVPQHLVLVLGGKSQDDVSRFAQVIRSSGIVSLGVGDRNIDRTELQTITNDPRLVFTVREFRELPNIEERIMNSFGPSAATPAPPGVDTPPPSRPEKKKADIVFLLDGSINFRRDSFQEVLRFVSEIVDTVYEDGDSIQVGLVQYNSDPTDEFFLKDFSTKRQIIDAINKVVYKGGRHANTKVGLEHLRVNHFVPEAGSRLDQRVPQIAFVITGGKSVEDAQDVSLALTQRGVKVFAVGVRNIDSEEVGKIASNSATAFRVGNVQELSELSEQVLETLHDAMHETLCPGVTDAAKACNLDVILGFDGSRDQNVFVAQKGFESKVDAILNRISQMHRVSCSGGRSPTVRVSVVANTPSGPVEAFDFDEYQPEMLEKFRNMRSQHPYVLTEDTLKVYLNKFRQSSPDSVKVVIHFTDGADGDLADLHRASENLRQEGVRALILVGLERVVNLERLMHLEFGRGFMYDRPLRLNLLDLDYELAEQLDNIAEKACCGVPCKCSGQRGDRGPIGSIGPKGIPGEDGYRGYPGDEGGPGERGPPGVNGTQGFQGCPGQRGVKGSRGFPGEKGEVGEIGLDGLDGEDGDKGLPGSSGEKGNPGRRGDKGPRGEKGERGDVGIRGDPGNPGQDSQERGPKGETGDLGPMGVPGRDGVPGGPGETGKNGGFGRRGPPGAKGNKGGPGQPGFEGEQGTRGAQGPAGPAGPPGLIGEQGISGPRGSGGAAGAPGERGRTGPLGRKGEPGEPGPKGGIGNRGPRGETGDDGRDGVGSEGRRGKKGERGFPGYPGPKGNPGEPGLNGTTGPKGIRGRRGNSGPPGIVGQKGDPGYPGPAGPKGNRGDSIDQCALIQSIKDKCPCCYGPLECPVFPTELAFALDTSEGVNQDTFGRMRDVVLSIVNDLTIAESNCPRGARVAVVTYNNEVTTEIRFADSKRKSVLLDKIKNLQVALTSKQQSLETAMSFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASPQLREAVLKLSDAGITPLFLTRQEDRQLINALQINNTAVGHALVLPAGRDLTDFLENVLTCHVCLDICNIDPSCGFGSWRPSFRDRRAAGSDVDIDMAFILDSAETTTLFQFNEMKKYIAYLVRQLDMSPDPKASQHFARVAVVQHAPSESVDNASMPPVKVEFSLTDYGSKEKLVDFLSRGMTQLQGTRALGSAIEYTIENVFESAPNPRDLKIVVLMLTGEVPEQQLEEAQRVILQAKCKGYFFVVLGIGRKVNIKEVYTFASEPNDVFFKLVDKSTELNEEPLMRFGRLLPSFVSSENAFYLSPDIRKQCDWFQGDQPTKNLVKFGHKQVNVPNNVTSSPTSNPVTTTKPVTTTKPVTTTTKPVTTTTKPVTIINQPSVKPAAAKPAPAKPVAAKPVATKMATVRPPVAVKPATAAKPVAAKPAAVRPPAAAAAKPVATKPEVPRPQAAKPAATKPATTKPMVKMSREVQVFEITENSAKLHWERAEPPGPYFYDLTVTSAHDQSLVLKQNLTVTDRVIGGLLAGQTYHVAVVCYLRSQVRATYHGSFSTKKSQPPPPQPARSASSSTINLMVSTEPLALTETDICKLPKDEGTCRDFILKWYYDPNTKSCARFWYGGCGGNENKFGSQKECEKVCAPVLAKPGVISVMGT	15
COL6A5 Collagen alpha-5(VI) chain	A8TX70	MKILLIIFVLIIWTETLADQSPGPGPVYADVVFLVDSSDHLGPKSFPFVKTFINKMINSLPIEANKYRVALAQYSDEFHSEFHLSTFKGRSPMLNHLKKNFQFIGGSLQIGKALQEAHRTYFSAPINGRDRKQFPPILVVLASAESEDEVEEASKALQKDGVKIISVGVQKASEENLKAMATSHFHFNLRTIRDLSTFSQNMTQIIKDVTKYKEGAVDADMQVHFPISCQKDSLADLVFLVDESLGTGGNLRHLQTFLENITSSMDVKENCMRLGLMSYSNSAKTISFLKSSTTQSEFQQQIKNLSIQVGKSNTGAAIDQMRRDGFSESYGSRRAQGVPQIAVLVTHRPSDDEVHDAALNLRLEDVNVFALSIQGANNTQLEEIVSYPPEQTISTLKSYADLETYSTKFLKKLQNEIWSQISTYAEQRNLDKTGCVDTKEADIHFLIDGSSSIQEKQFEQIKRFMLEVTEMFSIGPDKVRVGVVQYSDDTEVEFYITDYSNDIDLRKAIFNIKQLTGGTYTGKALDYILQIIKNGMKDRMSKVPCYLIVLTDGMSTDRVVEPAKRLRAEQITVHAVGIGAANKIELQEIAGKEERVSFGQNFDALKSIKNEVVREICAEKGCEDMKADIMFLVDSSWSIGNENFRKMKIFMKNLLTKIQIGADKTQIGVVQFSDKTKEEFQLNRYFTQQEISDAIDRMSLINEGTLTGKALNFVGQYFTHSKGARLGAKKFLILITDGVAQDDVRDPARILRGKDVTIFSVGVYNANRSQLEEISGDSSLVFHVENFDHLKALERKLIFRVCALHDCKRITLLDVVFVLDHSGSIKKQYQDHMINLTIHLVKKADVGRDRVQFGALKYSDQPNILFYLNTYSNRSAIIENLRKRRDTGGNTYTAKALKHANALFTEEHGSRIKQNVKQMLIVITDGESHDHDQLNDTALELRNKGITIFAVGVGKANQKELEGMAGNKNNTIYVDNFDKLKDVFTLVQERMCTEAPEVCHLQEADVIFLCDGSDRVSNSDFVTMTTFLSDLIDNFDIQSQRMKIGMAQFGSNYQSIIELKNSLTKTQWKTQIQNVSKSGGFPRIDFALKKVSNMFNLHAGGRRNAGVPQTLVVITSGDPRYDVADAVKTLKDLGICVLVLGIGDVYKEHLLPITGNSEKIITFQDFDKLKNVDVKKRIIREICQSCGKTNCFMDIVVGFDISTHVQGQPLFQGHPQLESYLPGILEDISSIKGVSCGAGTEAQVSLAFKVNSDQGFPAKFQIYQKAVFDSLLQVNVSGPTHLNAQFLRSLWDTFKDKSASRGQVLLIFSDGLQSESNIMLENQSDRLREAGLDALLVVSLNTTAHHEFSSFEFGKRFDYRTHLTIGMRELGKKLSQYLGNIAERTCCCTFCKCPGIPGPHGTRGLQAMKGSQGLKGSRGHRGEDGNPGVRGDTGPQGDKGIAGCPGAWGQKGLKGFSGPKGGHGDDGIDGLDGEEGCHGFPGIKGEKGDPGSQGSPGSRGAPGQYGEKGFPGDPGNPGQNNNIKGQKGSKGEQGRQGRSGQKGVQGSPSSRGSRGREGQRGLRGVSGEPGNPGPTGTLGAEGLQGPQGSQGNPGRKGEKGSQGQKGPQGSPGLMGAKGSTGRPGLLGKKGEPGLPGDLGPVGQTGQRGRQGDSGIPGYGQMGRKGVKGPRGFPGDAGQKGDIGNPGIPGGPGPKGFRGLALTVGLKGEEGSRGLPGPPGQRGIKGMAGQPVYSQCDLIRFLREHSPCWKEKCPAYPTELVFALDNSYDVTEESFNKTRDIITSIVNDLNIRENNCPVGARVAMVSYNSGTSYLIRWSDYNRKKQLLQQLSQIKYQDTTEPRDVGNAMRFVTRNVFKRTYAGANVRRVAVFFSNGQTASRSSIITATMEFSALDISPTVFAFDERVFLEAFGFDNTGTFQVIPVPPNGENQTLERLRRCALCYDKCFPNACIREAFLPEDSYMDVVFLIDNSRNIAKDEFKAVKALVSSVIDNFNIASDPLISDSGDRIALLSYSPWESSRRKMGTVKTEFDFITYDNQLLMKNHIQTSFQQLNGEATIGRALLWTTENLFPETPYLRKHKVIFVVSAGENYERKEFVKMMALRAKCQGYVIFVISLGSTRKDDMEELASYPLDQHLIQLGRIHKPDLNYIAKFLKPFLYSVRRGFNQYPPPMLEDACRLINLGGENIQNDGFQFVTELQEDFLGGNGFIGQELNSGRESPFVKTEDNGSDYLVYLPSQMFEPQKLMINYEKDQKSAEIASLTSGHENYGRKEEPDHTYEPGDVSLQEYYMDVAFLIDASQRVGSDEFKEVKAFITSVLDYFHIAPTPLTSTLGDRVAVLSYSPPGYMPNTEECPVYLEFDLVTYNSIHQMKHHLQDSQQLNGDVFIGHALQWTIDNVFVGTPNLRKNKVIFVISAGETNSLDKDVLRNVSLRAKCQGYSIFVFSFGPKHNDKELEELASHPLDHHLVQLGRTHKPDWNYIIKFVKPFVHLIRRAINKYPTEDMKATCVNMTSPNPENGGTENTVLLLPGIYEIKTENGDLFDEFDSQAQHLLVLGNNHSSGSETATDLMQKLYLLFSTEKLAMKDKEKAHLEEISALVVDKQQEKEDKEMEATDI	16
COL6A6 Collagen alpha-6(VI) chain	A6NMZ7	MMLLILFLVIICSHISVNQDSGPEYADVVFLVDSSDRLGSKSFPFVKMFITKMISSLPIEADKYRVALAQYSDKLHSEFHLSTFKGRSPMLNHLRKNFGFIGGSLQIGKALQEAHRTYFSAPANGRDKKQFPPILVVLASSESEDNVEEASKALRKDGVKIISVGVQKASEENLKAMATSQFHFNLRTVRDLSMFSQNMTHIIKDVIKYKEGAVDDIFVEACQGPSMADVVFLLDMSINGSEENFDYLKGFLEESVSALDIKENCMRVGLVAYSNETKVINSLSMGINKSEVLQHIQNLSPRTGKAYTGAAIKKLRKEVFSARNGSRKNQGVPQIAVLVTHRDSEDNVTKAAVNLRREGVTIFTLGIEGASDTQLEKIASHPAEQYVSKLKTFADLAAHNQTFLKKLRNQITHTVSVFSERTETLKSGCVDTEEADIYLLIDGSGSTQATDFHEMKTFLSEVVGMFNIAPHKVRVGAVQYADSWDLEFEINKYSNKQDLGKAIENIRQMGGNTNTGAALNFTLSLLQKAKKQRGNKVPCHLVVLTNGMSKDSILEPANRLREEHIRVYAIGIKEANQTQLREIAGEEKRVYYVHDFDALKDIRNQVVQEICTEEACKEMKADIMFLVDSSGSIGPENFSKMKTFMKNLVSKSQIGPDRVQIGVVQFSDINKEEFQLNRFMSQSDISNAIDQMAHIGQTTLTGSALSFVSQYFSPTKGARPNIRKFLILITDGEAQDIVKEPAVVLRQEGVIIYSVGVFGSNVTQLEEISGRPEMVFYVENFDILQRIEDDLVFGICSPREECKRIEVLDVVFVIDSSGSIDYDEYNIMKDFMIGLVKKADVGKNQVRFGALKYADDPEVLFYLDDFGTKLEVISVLQNDQAMGGSTYTAEALGFSDHMFTEARGSRLNKGVPQVLIVITDGESHDADKLNATAKALRDKGILVLAVGIDGANPVELLAMAGSSDKYFFVETFGGLKGIFSDVTASVCNSSKVDCEIDKVDLVFLMDGSTSIQPNDFKKMKEFLASVVQDFDVSLNRVRIGAAQFSDTYHPEFPLGTFIGEKEISFQIENIKQIFGNTHIGAALREVEHYFRPDMGSRINTGTPQVLLVLTDGQSQDEVAQAAEALRHRGIDIYSVGIGDVDDQQLIQITGTAEKKLTVHNFDELKKVNKRIVRNICTTAGESNCFVDVVVGFDVSTQEKGQTLLEGQPWMETYLQDILRAISSLNGVSCEVGTETQVSVAFQVTNAMEKYSPKFEIYSENILNSLKDITVKGPSLLNANLLDSLWDTFQNKSAARGKVVLLFSDGLDDDVEKLEQKSDELRKEGLNALITVALDGPADSSDLADLPYIEFGKGFEYRTQLSIGMRELGSRLSKQLVNVAERTCCCLFCKCIGGDGTMGDPGPPGKRGPPGFKGSEGYLGEEGIAGERGAPGPVGEQGTKGCYGTKGPKGNRGLNGQEGEVGENGIDGLNGEQGDNGLPGRKGEKGDEGSQGSPGKRGTPGDRGAKGLRGDPGAPGVDSSIEGPTGLKGERGRQGRRGWPGPPGTPGSRRKTAAHGRRGHTGPQGTAGIPGPDGLEGSLGLKGPQGPRGEAGVKGEKGGVGSKGPQGPPGPGGEAGNQGRLGSQGNKGEPGDLGEKGAVGFPGPRGLQGNDGSPGYGSVGRKGAKGQEGFPGESGPKGEIGDPGGPGETGLKGARGKMISAGLPGEMGSPGEPGPPGRKGVKGAKGLASFSTCELIQYVRDRSPGRHGKPECPVHPTELVFALDHSRDVTEQEFERMKEMMAFLVRDIKVRENSCPVGAHIAILSYNSHARHLVRFSDAYKKSQLLREIETIPYERSSASREIGRAMRFISRNVFKRTLPGAHTRKIATFFSSGQSADAHSITTAAMEFGALEIIPVVITFSNVPSVRRAFAIDDTGTFQVIVVPSGADYIPALERLQRCTFCYDVCKPDASCDQARPPPVQSYMDAAFLLDASRNMGSAEFEDIRAFLGALLDHFEITPEPETSVTGDRVALLSHAPPDFLPNTQKSPVRAEFNLTTYRSKRLMKRHVHESVKQLNGDAFIGHALQWTLDNVFLSTPNLRRNKVIFVISAGETSHLDGEILKKESLRAKCQGYALFVFSLGPIWDDKELEDLASHPLDHHLVQLGRIHKPDHSYGVKFVKSFINSIRRAINKYPPINLKIKCNRLNSIDPKQPPRPFRSFVPGPLKATLKEDVLQKAKFFQDKKYLSRVARSGRDDAIQNFMRSTSHTFKNGRMIESAPKQHD	17

본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따른 성숙한 ECM의 한 종류인 원섬유성의 콜라겐성 ECM 콜라겐은 COL1을 주요 성분으로 포함할 수 있고, 또한 COL3, COL4, COL5, 및/또는 COL6, 예를 들어 약 90%의 COL1 및 약 10%의 COL3, COL4, COL5, 및/또는 COL6을 포함할 수 있지만, (i) COL1 및 (ii) COL3, COL4, COL5 및/또는 COL6의 다른 백분율, 예를 들어 각각 약 97% 및 3%, 각각 약 95% 및 5%, 각각 약 93% 및 7%, 각각 약 85% 및 15%, 각각 약 80% 및 20%, 각각 약 75% 및 25%, 또는 각각 약 70% 및 30%가 적합하다.

본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 생산되는 바와 같은 ECM, 및 특히, 인간 ECM 제품들은 근골격계 장애들, 정형외과의 기능장애 및 연관된 고통, 심장혈관 장애들, 피부 질환들, 외모의 개선을 요구하는 연령-관련된 미용 피부 및 모발 상태들, 수술 상처들, 외과 절제, 화학요법 및 면역요법을 포함하는 치료를 요구하는 고형-종양들로 고통을 받는 환자들의 조직들을 치료하는 데 유용하다. 본원의 일부 실시예들에 따른 방법들, 키트들, 및 조성물들에 의해 생산되는 인간 ECM 제품들에 대한 용도들은 예로서, 골연골 결손 수복, 골관절염, 퇴행성 디스크-질환, 정형외과 용 수술 상처들을 포함하는 근골격계 응용들; 종양 절제 공동들과 연관되는 수술 상처들, 심혈관 재생 디바이스들 및 생물제제(biologics), 피부 상처 디바이스들 및 생물제제, 주름들, 국소 미용, 치료상의 모발 성장을 치료하기 위한 피부 필러들, 및 환자에게 전달될 때 증가된 지속성 및 원치 않는 면역 반응의 감소를 위한 세포-전달 및 약물-전달 매개체들(vehicles)을 위한 의료 디바이스들 및 생물제제를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 생산되는 ECM(예를 들어, 인간 ECM 제품)은 의료 제품, 미용 제품, 약물, 의료 디바이스, 치료, 또는 생물제제 중 적어도 하나를 위해 사용된다. 일부 실시예들에서 ECM은 의료 제품, 생물제제, 의료 디바이스, 약물, 또는FDA에 의해 규제되는 임의의 다른 제품 또는 조성물 중 적어도 하나에 대해 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, ECM은 의료 또는 미용 절차(procedure) 중 적어도 하나를 위해 사용될 수 있다.

본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따른 인간 ECM의 생산을 위한 인간 세포 배양물들의 사용은 동물 및 사체-유래 ECM들에 비해 이점들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, 배양 내의 세포들은 단일 공여자로부터 유래할 수 있고/있거나, 쉽게 증식될 수 있고/있거나, 제노-프리일 수 있다. 반면에, 세포 배양에서 ECM을 생산하기 위한 종래의 접근법들은 도전들, 예를 들어 상업적 규모, 비용-효율성, 및 비-인간 성분들의 존재와 관련되는 도전들을 제시하였다. 예를 들어, 세포 배양 및 제조 방법들로부터의 섬유아세포-유래 인간 ECM들이 설명되었다. 예를 들어, Naughton 등의 특허 그룹("Naughton 특허들"로서 언급되고, 이에 의해 전체적으로 참조로 통합되는, 미국 특허들 6,378,527; 5,830,708; 7,118,746; 6,372,494; 8,257,947; 8,530,415; 8,535,913; 9,034,312; 8,852,637; 8,128,924; 8,138,147; 8,361,485; 8,476,231; 및 9,458,486)은 가용성 및 불용성 인간 ECM에 대한 다양한 조성물들 및 생산 방법들을 개시한다. 예를 들어, Naughton 특허들은 인간 ECM의 세포 증식 및 생산을 지원하기 위해 우태아 혈청, 송아지 혈청, 및 돼지 트립신과 같은 동물성 단백질들의 사용을 개시한다. 동물 성분들을 사용하는 이들 프로세스들은 또한 예를 들어 CosmoDerm™ 및 CosmoPlast™ 피부 필러 제품들의 제조에서, ECM이 생산된 후 돼지 펩신을 콜라겐들에 사용하였다. 예를 들어, 돼지 헤파린과 같은 돼지 탄수화물들은 인간들에게 유해한 면역 반응을 야기할 수 있다.

Naughton 특허들은 또한 대두 트립신 억제제를 개시한다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 대두 트립신 억제제는 혈청이 세포 배양물들에서 유해한 단백질 분해를 감소시키기 위해 포함되지 않을 때 사용될 수 있다. 그러나, 일부 식물성 단백질들, 및 특히 대두 트립신 억제제는 인간들에게 원치 않는 면역 반응, 심지어 잠재적 알레르기들 또는 과민성 쇼크 또는 드문 경우 사망을 야기할 수 있다. 이와 같이, 동물 혈청들에서 발견되는 효소 억제제들을 식물 성분들, 예컨대 대두 트립신 억제제로 대체하는 것은 여전히 원치 않는 면역 반응을 야기할 수 있다는 것이 고려된다. 더욱이, 대두 트립신 억제제는 효소 활성을 가질 수 있으며, 이는 예를 들어 국소 또는 경피 적용 시, 대두 트립신 억제제를 함유하는 조성물들, 또는 대두 트립신 억제가가 노출되는 피부 조직에 영향을 미칠 수 있다는 것이 고려된다. 대두 트립신 억제제는 또한 모발 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 가용성 대두 트립신 억제제를 제거하는 것이 공식적으로 가능하지만, 그렇게 하는 것은 그것이 폐 배양 배지에서 세포-분비 산물들의 미정의된 혼합물들에서 광범위하고 값비싼 정제 방법들을 수반하여, 정확한 활성 성분들이 알려지지 않을 수 있는 제품들을 산출함에 따라 상업적 실용성이 제한적이다. 이와 같이, 일부 실시예들은 동물-유래 제품들, 또는 대두 트립신 억제제를 포함하지 않는다. 일부 실시예들은 동물-유래 제품들 또는 식물-유래 제품들을 포함하지 않는다.

유리하게는, 본원의 일부 실시예들에 따라 ECM을 제조하는 제노-프리 방법들은 제노-프리 시스템들 및 방법들이 애당초에 동물- 및/또는 식물-유래 성분들의 사용을 회피할 수 있으므로, 동물- (및/또는 식물-) 유래 성분들의 제거에 관한 임상 연구들에 대한 필요성을 제거할 수 있다. 예를 들어, 본원의 일부 실시예들에 따른 방법들 및 조성물들은 미용 용도들을 위한 가용성 ECM 조성물들을 생산할 수 있고, 이는 대두 단백질들과 같은 공지된 식물 알레르겐들을 반드시 함유할 필요는 없다. 추가적으로, 동물- 또는 식물- 유래 성분들을 함유하지 않는 본원의 일부 실시예들에 따라 제조되는 ECM 조성물들은 동물성 제품들 또는 대두 단백질들과 같은 식물성 제품들에 대한 잠재적인 알레르기들에 대한 안전 경고들을 요구하지 않을 것이다.

일부 실시예들에서, 세포-기반 시험관내(in vitro) 배양 방법들은 배치 당 단일 인간보다 더 큰 규모에서 제노-프리 인간 ECM을 생산할 수 있다. 더욱이, 제노-프리 ECM은 세포주들이 광범위하게 시험될 수 있으므로 질병 전염의 감소된 위험을 가질 수 있고, 시험들의 각각의 세트는 시험된 세포주들이 증식될 수 있기 때문에, 인간 ECM을 사용하여 제조된 제품들의 많은 상업적 규모의 배치들을 지원할 수 있다.

섬유아세포 폐 배지는 가용성 ECM을 포함할 수 있고, 따라서 일부 실시예들에서 미용 목적들을 위해 또한 사용될 수 있다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 태아 및 배아 ECM은 상대적으로 더 낮은 정도의 풍부한 성숙한 및 비-환원성(non-reducible) 가교들을 함유한다는 것이 본원에서 관측된다. 그러나, 본원의 일부 실시예들에 따라 생산되는 가용성 인간 ECM은 상당량의 성숙한 콜라겐 유형 1, 예를 들어 상당량의 성숙한 삼중 나선 콜라겐 유형 1, 뿐만 아니라 일부 덜 풍부한 원섬유성 콜라겐들, 예를 들어 콜라겐 유형들 3, 5, 및 6을 포함할 수 있다.

다수의 접근법들은 본원의 실시예들에 따른 ECM에서 성숙한 콜라겐들의 존재 및/또는 레벨들을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 가교된 성숙 콜라겐들의 양들은 비교를 위한 성체-조직 유래 유형 I 콜라겐을 사용하는, 감소된 SDS-PAGE 겔들 상에서 측정될 수 있다.

다능성 세포들

"다능성 세포(Pluripotent cell)"는 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 다수의 상이한 운명들에 따라 분화할 수 있는 세포들의 부류를 포함한다. 다능성 세포들의 예들은 유도 다능성 줄기 세포들(iPSCs) 및 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 본원의 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들에 적합한 다능성 세포들은 iPSC들을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 실시예들에서, 본원의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 적합한 다능성 세포들은 iPSC들 또는 ES 세포들을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 실시예들에서, 본원의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 적합한 다능성 세포들은 ES 세포들이 아닌, iPSC들을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 실시예들에서, 본원의 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들에 적합한 다능성 세포는 인간 세포들이다. 일부 실시예들에서, 본원의 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들에 적합한 다능성 세포는 단일 공여자로부터 유래된다.

이론에 의해 제한되는 것 없이, 다능성 세포들(기점에서 유도 또는 배아됨)은 전통적으로 세포 배양물들에서 충분한 원섬유성의 콜라겐성 ECM을 생산하지 않았다. 그러나, 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에서, 다능성 세포들은 단일 공여자로부터 세포들의 (거의 무제한으로 생각될 수 있는) 풍부한 공급을 제공할 수 있고, 그들이 ECM을 분비하고 침착시키는 섬유아세포의 세포들로 분화될 때 사용될 수 있다. 따라서, 본원의 일부 실시예들의 조성물들, 방법들, 및 키트들에 따라 섬유아세포들을 iPSC들로 역분화시키고, iPSC들을 증식시키고, 그 다음, iPSC들을 섬유아세포들로 재분화시키는 것은 ECM의 생산을 위한 단일-공여자 섬유아세포들을 상업적 규모의 양으로 생산할 수 있다. 세포들이 단일 공여자이므로, 생산되는 ECM 제품의 균일성이 더 크고, 질병의 오염 및/또는 질병의 전염에 대한 위험이 더 낮을 수 있다. 숙련된 기술자는 일반적으로 iPSC들을 섬유아세포들로부터 생산하고, 그 다음, iPSC들을 다시 섬유아세포들로 분화시키는 것이 상당한 양의 노력을 수반하지만, 본원에서 논의되는 실질적인 용도들을 위해 본원에서 논의되는 실질적인 이점들이 노력을 가치 있게 만들 것이라는 점을 이해할 것이다.

"유도 다능성 줄기 세포"(iPSC)는 본 분야의 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, ES 세포들과 유사한 특성들을 갖는 세포들로 체세포들의 역분화에 의해 생산되는 세포들의 부류를 포함한다. iPSC들을 만들기 위한 다수의 당업계에 인식된 접근법들은 본원의 실시예들의 방법들, 키트들, 및 조성물에 대해 적합하다. 일부 실시예들에서, iPSC는 체세포를 역분화 인자들과 접촉시킴으로써 이루어진다. 본원에서 상세히 언급되는 바와 같이, 역분화 인자들은 체세포가 iPSC로 역분화하도록 유도하는 핵산들, 폴리펩티드들, 및/또는 소분자들을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "역분화 인자들(이 루트 용어의 변이체들을 포함함)"은 한 세트의 유전자 산물들, 및/또는 유전자 산물들을 인코딩하는 핵산들, 및/또는 소분자들을 지칭하며, 이는 체세포(예를 들어, 섬유아세포)를 iPSC로 역분화시키기에 충분하다. 역분화 인자들은 본원의 일부 실시예들의 방법들에 따라 체세포(예를 들어, 섬유아세포)를 iPSC로 역분화시키기 위해 사용될 수 있다. 역분화 인자들은 또한 그들이 체세포(예를 들어, 섬유아세포)를 iPSC로 역분화시키는 데 유용할 수 있음에 따라, 본원의 일부 실시예들에 따른 조성물들 및 키트들과 함께 포함될 수 있다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 2개 이상의 전사 인자들(transcription factors)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct 패밀리 멤버(예를 들어, Oct3/4 또는 POU5F1), Sox 패밀리 멤버(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox11, 또는 Sox15), Klf 패밀리 멤버(예를 들어, Klf1, Klf2, Klf4, 또는 Klf5), 및 (i) a Myc 패밀리 멤버(예를 들어, c-Myc, L-Myc, 또는 N-Myc), (ii) Nanog, (iii) Lin28 또는 Lin28B, 또는 (iv) Glis1 중 적어도 하나, 및/또는 (역분화된 섬유아세포들의 경우, Oct 패밀리 멤버(예를 들어, Oct 4) 및 Bmi1을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 화학적 역분화 인자들(예를 들어, 소분자들)을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다.

일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 체세포(예를 들어, 섬유아세포)를 iPSC로 역분화시키기에 충분한 유전자 산물들을 인코딩하는 하나 이상의 핵산들로서 제공된다. 그러한 역분화 인자들은 단일 벡터 상에, 또는 한 세트의 하나보다 많은 벡터들 상에 제공될 수 있다. 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따른 적합한 벡터들의 예들은 레트로바이러스성 벡터들, 아데노바이러스성 벡터들, 아데노-연관 벡터들, 렌티바이러스성 벡터들 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들을 인코딩하는 핵산들 각각은 프로모터(promoter)에 동작가능하게 링크된다(또한, 2개 이상의 핵산들이 예를 들어, IRES 또는 2A 요소에 의해 분리되는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다는 것이 고려됨). 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 체세포를 (예를 들어, 섬유아세포를 iPSC로) 역분화시키기에 충분한 하나 이상의 유전자 산물들(예를 들어, 단백질들)로서 제공된다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 단백질들의 수집물(collection)로서 제공된다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 단일 폴리펩티드로 제공되며, 이는 개별 역분화 인자들을 산출하기 위해 절단될 수 있다. 폴리펩티드(들)은 타겟 세포의 적합한 부분 상으로, 진입 및 국소화를 촉진시키기 위해, 태그, 예를 들어, 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence)을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 본원에서 설명되는 바와 같이, 화학적 역분화 인자들을 포함한다. "풋프린트가 없는(footprint free)" 역분화 인자들(예를 들어, 비-통합 벡터들, 벡터들의 제거, mRNA 또는 폴리펩티드들의 직접 투여, 또는 다능성의 화학적 유도에 의해 전달됨)과 연관되는 추가적인 이점들이 존재할 수 있으며, 이는 그들이 다능성을 유도하는 인자들을 전달하기 위해 잠재적으로 유해한 바이러스들을 사용하지 않고, 삽입 돌연변이유발의 위험을 상승시킬 수 있는, 이물질을 숙주 게놈으로 삽입하지 않기 때문이다. 따라서, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 풋프린트가 없다. Klf4, c-Myc, Oct4, 및 Sox2를 인코딩하는 mRNA들을 체세포들로 전달하는 것에 의해 체세포들로부터 iPSC들의 풋프린트가 없는 생성의 예들은 예를 들어, 문헌[Warren et al. (2010), Cell Stem Cell 7: 618-30]에서 발견될 수 있으며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합되며 그러한, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들을 인코딩하는 mRNA들이 iPSC들을 만들기 위해 사용된다. 일부 실시예들에서, 다능성의 화학적 유도는 본원에서 설명된 바와 같다.

Oct 패밀리 멤버(예를 들어, Oct3, Oct4, /또는 POU5F1) 및 Sox 패밀리 멤버(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox11, 또는 Sox15)의 조합은 체세포를 iPSC로 역분화시키기에 충분하다고 보고되었다. 미국 특허 번호 제9,683,232호를 참고하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct 패밀리 멤버, 및 Sox 패밀리 멤버를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다. 미국 특허 번호 제9,683,232호를 참고한다. 더욱이, 이론에 의해 제한되는 것 없이, 추가 인자들의 포함은 역분화의 효율성을 증가시킬 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct 패밀리 멤버, Klf 패밀리 멤버(예를 들어, Klf1, Klf2, Klf4, 또는 Klf5) 및 Sox 패밀리 멤버를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다. 예를 들어, Oct 3/4, Klf4, c-Myc, 및 Sox2의 조합은 체세포들(및 특히 섬유아세포들)을 iPSC들로 역분화시키기에 충분하다. 미국 특허 번호 제8,058,065호를 참고하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 따라서, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct 3/4, Klf4, c-Myc, 및 Sox2를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다.

일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct 패밀리 멤버(예를 들어, Oct3, Oct4, 또는 POU5F1), Klf 패밀리 멤버(예를 들어, Klf1, Klf2, Klf4, 또는 Klf5), Myc 패밀리 멤버(예를 들어, c-Myc, L-Myc, 또는 N-Myc), 및 Sox 패밀리 멤버(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox4, Sox11, 또는 Sox15)를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다. 더욱이, Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 (i) Myc 패밀리 멤버, (ii) Nanog, (iii) Lin28 또는 Lin28B, 또는 (iv) Glis1 중 적어도 하나의 조합은 또한 체세포들, 및 특히 섬유아세포들을, iPSC들로 역분화시키기에 충분하다고 보고되었다. 미국 제9,447,408호를 참고하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 따라서, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 (i) Myc 패밀리 멤버, (ii) Nanog, (iii) Lin28 또는 Lin28B, 또는 (iv) Glis1 중 적어도 하나를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다.

섬유아세포들은 특히 (예를 들어, Bmi1이 Sox2, Klf4, 및/또는 c-Myc의 조합으로 대체될 수 있도록) 인자들 Oct4 및 Bmi1의 조합을 사용하여 iPSC들로 재프로그래밍될 수 있다는 것이 또한 보고되었다. 문헌[Moon et al. (2011), Cell. Res. 21: 1305-15]을 참조하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 따라서, 일부 실시예들에서, 예를 들어 전구체 섬유아세포가 iPSC로 역분화되는 경우, 역분화 인자들은 Oct4 및 Bmi1을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다.

소분자들의 칵테일인,"VC6TF"(V, VPA; C, CHIR99021 또는 CHIR; 6, 616452; T, 트라닐시프로민 ; F, 포스콜린)는 체세포들로부터 다능성 줄기 세포들을 유도할 수 있다는 것이 나타났다. 문헌[Hou et al. (2013), Science 341: 651-654]을 참조하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 예를 들어, H3K79 히스톤 메틸전이효소 DOT1L의 억제제인 EPZ 004777(EPZ, E), 및 레티노이드 산 수용체(retinoid acid receptor; RAR) 작용제인 Ch 55를 VC6TF에 첨가하는 것은 체세포들의 역분화를 촉진시키는 것으로 나타났다. 문헌[e et al. (2016), Cell Research 26: 34-35]을 참조하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 따라서, 일부 실시예들에서, 역분화 인자들은 EPZ 004777, DOT1L, 및 Ch 55와 함께 화학적 역분화 인자들, 예를 들어, VC6TF, 또는 VC6TF를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성된다.

일부 실시예들에서, iPSC들은 단일 공여자의 체세포들로부터 유래된다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 단일 공여자로부터의 iPSC들(또는 다른 다능성 세포들)은 예를 들어 세포들의 노출을 바이러스들, 미생물 유기체들, 또는 다른 잠재적인 병원체들의 단일 공여자의 보체(complement)에만 제한하고, 따라서 다수의 공여자들로부터의 세포들의 수집물들과 비교하여 질병의 전염에 대한 위험을 최소화하는, 안전성 이점들을 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, iPSC들이 2개 이상의 공여자들의 체세포들로부터 유래되는 것이 또한 공식적으로 가능하다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 성체 피부 섬유아세포 생검들(biopsies)로부터 유래된다.

배아 줄기 세포들은 다능성 줄기 세포의 다른 유형이다. 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에서 다능성 세포들로서 배아 줄기 세포들을 사용하는 것이 가능하다. 인간 배아 줄기 세포들을 포함하는 배아 줄기 세포들을 단리 및 제조하는 방법들은 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,200,806호에 설명되며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 그러나, 일부 실시예들의 iPSC들은 배아 줄기 세포들에 비해 다수의 이점들을 제공할 수 있다는 것이 또한 인식된다. 예를 들어, ES 세포들은 다능성 세포를 생성하는 하나의 방법인, 인간 배아의 파괴를 중심으로 윤리적 및 법적 고려들을 수반하는 한계들을 가질 수 있다. 화학적-유도 다능성 세포들이 바람직한 공급원이다.

섬유아세포들

"섬유아세포"는 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 다양한 동물 조직들에 대해 구조적 골격(스트로마)을 제공하는 세포들의 부류를 포함한다. 섬유아세포들은 또한 상처 치유를 매개하기 위해 상처의 부위로 이동할 수 있고, 다양한 결합 조직들의 성분일 수 있다. 섬유아세포들은 예를 들어,문헌[Goodpaster et al. (2008), J. Histochem Cyotchem. 56: 347-58]에 설명되는, 섬유아세포-특이 항체들, 예를 들어 항체 TE-7을 사용하여 식별될 수 있으며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다.

이론에 의해 제한되는 것 없이, 기재(예를 들어, 플라스틱)에 부착되고, 혈청의 존재에서 성장하고, 세포 배양에서 원섬유성의 콜라겐성 ECM 콜라겐을 합성 및 침착시킬 수 있는 임의의 중간엽 세포가 배양에서 인간 ECM을 만들기 위해 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 실시예들에서, 중간엽 세포의 한 유형인 섬유아세포들은 ECM을 생산하기 위해 사용된다. ECM을 생산할 수 있는 세포들("ECM-생산 세포들"로서 지칭될 수 있음)의 예시적 유형들은, 예를 들어 신생아 포피 섬유아세포 세포주(다능성 또는 비-다능성일 수 있음)로부터, 또는 피부 또는 혈액 생검으로부터의 골수 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC), iPSC-유래 MSC, ES-유래 MSC, 및 섬유아세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 중간엽 세포 유형들 사이의 차이들은 (공통 세포 공급원으로부터의) 단일 공여자 균주 또는 세포주의 임의의 세포들 사이의 차이들보다 더 크기 않을 수 있다는 것이 더 고려된다. 세포들이 결합 조직들을 함유하는 인간 공여자 샘플들로부터 비롯되는 경우, 이들 세포들은 본원의 일부 실시예들에 따라 세포 배양에서 ECM을 만드는 데 적합할 수 있다.

전통적으로, 섬유아세포들은 이들이 폐기된 조직들에서 쉽게 획득되므로, 신생아 포피들로부터 획득되었다. 그러나, 이 접근법은 일반적으로 생산-규모의 세포 뱅크들을 생성하고 선별(screen)하기 위해 다수의 공여자들로부터 세포들을 요구한다. 하나보다 많은 공여자의 사용은 또한 우발적인 제제들(adventitious agents)의 전염에 대한 위험의 증가를 초래할 수 있다. 공여자 세포 뱅크들을 개발하고 선별하는 비용들은 또한 크고 불리할 수 있다. 우발적인 제제 시험 요건들은 다수의 공여자들로부터의 세포들을 뱅킹하고 사용하기 위한 다른 장애물을 나타낼 수 있다. 더욱이, 1차 세포주들이 비-형질전환 체세포들에 대한 헤이플릭 한계(Hayflick limit)에 의해 이론적으로 제한될 수 있지만, 실질적으로 말하면, 1차 세포주들은 조직 공급원으로부터의 단리 후 약 8 내지 20회 이하의 통과들을 처리할 수 있을 것이다. 통과들에 대한 이들 제한들은 세포 뱅킹 프로세스, 예를 들어 상업적인 양들을 제조하기 위한 마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank), 워킹 세포 뱅크(Working Cell Bank), 또는 생산 세포 뱅크(Production Cell Bank) 스키마의 그것에 따라 증식들 위한 종래의 섬유아세포들의 적합성을 제한할 수 있다. 그러나, 본원의 일부 실시예들에 따른 방법들, 키트들, 및 조성물들은 섬유아세포의 종래의 공급원들에 비해 이점들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원의 일부 실시예들에 따라 iPSC들로부터 분화되는 섬유아세포들은 (예를 들어, iPSC들이 섬유아세포들로 분화되기 전에 증식되는 경우) 단일 공여자로부터 유래될 수 있어서, 질병의 전염에 대한 위험을 감소시키고, 시험 요건들 감소시킨다. 더욱이, 일부 실시예들에서, iPSC들은 1차 세포주들보다 더 많은 증식 사이클들을 많이 겪을 수 있어서, iPSC들로부터 유래되는 섬유아세포들 또는 다른 ECM-생산 세포들의 상업적 확장성을 촉진시킨다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 혈청의 부재에서 증식된다.

일부 실시예들에서, 섬유아세포들은 iPSC들을 섬유아세포들로 분화시킴으로써 획득될 수 있다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, iPSC들은 iPSC들을, 예를 들어, 하나 이상의 성장 인자들을 포함할 수 있는, 하나 이상의 섬유아세포 분화 인자와 접촉시킴으로써 섬유아세포들로 분화될 수 있다는 것이 고려된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "섬유아세포 분화 인자들"(이 루트 용어의 변이체들을 포함함)은 한 세트의 유전자 산물들 및/또는 유전자 산물들을 인코딩하는 핵산들을 의미하며, 여기서 유전자 산물들은 다능성 세포(예를 들어, iPSC)를 섬유아세포로 분화시키기에 충분하다. 예를 들어, iPSC들은 iPSC들을 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor; CTGF)와 접촉시킴으로써 섬유아세포들로 분화될 수 있다는 것이 보고되었다. iPSC들은 3-D 스캐폴드 상에서 성장될 수 있다. 문헌[Xu et al., Scientific Reports 5: 8480 DOI: 10.1038/srep08480]을 참조하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, 섬유아세포 분화 인자들은 CTGF를 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포 분화 인자들은 CTGF 및 피브리노겐을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 3-차원 기재(예를 들어, 덱스트린 미세담체들; 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,378,527호를 참조하며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합됨) 상에서 배양되고, 그 다음, 섬유아세포 분화 인자들과 접촉된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "생산 섬유아세포들"은 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 ECM의 생산을 위해 사용되고 있거나, 사용될 수 있는 섬유아세포들을 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "전구체 섬유아세포들"은 다능성 세포들(Pluripotent cells)에 대한 전구체들로서, 사용되고 있거나, 사용될 수 있는 섬유아세포들을 언급한다. 예를 들어, 일부 실시예들의 방법들 및 키트들에 따르면, 전구체 섬유아세포는 전구체 섬유아세포를 iPSC로 역분화시키기 위해, 역분화 인자들과 접촉될 수 있다.

세포 배양 및 기재들

세포 배양을 위한 다양한 접근법들이 본원의 일부 실시예들의 방법들, 키트들, 및 조성물들에 따라 사용될 수 있다. 세포 배양을 위한 프로토콜들 및 시약들에 대한 상세 지침은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000]에서 발견될 수 있으며, 이는 이로써 전체적으로 참조로 통합된다. 일반적으로, 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 ECM들의 제조를 위한 섬유아세포들을 배양하는 것은 배양 배지에서 수행될 수 있다.

일부 실시예들에서, 세포 배양 배지는 혈청을 포함한다. 혈청은 처음에 세포 배양 배지의 일부일 수 있거나, 배양 과정에서 나중에 첨가될 수 있다. 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들과 함께 사용하기 위한 혈청의 적합한 유형들은 시험된 임상-등급의 우아 혈청, 만료된 혈액 유닛들로부터의 풀링된 인간 혈청, 또는 이들 2개의 물질들의 조합들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 배양 배지 내의 혈청의 양(v/v)은 약 0.1% 내지 약 20%, 예를 들어 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 35%, 약 3% 내지 약 30%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 15% 내지 약 20%, 예를 들어 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함)이다. 일부 실시예들에서, 배양 배지 내의 혈청의 양(v/v)은 약 0.1% 내지 약 10%이다. 일부 실시예들에서, 배양 배지 내의 혈청의 양은 배양에서 세포들에 의한 ECM의 생물생성(bioproduction)을 증가시키기에 충분한 양이다. 일부 실시예들에서, 배양 배지 내의 혈청의 양은 배양에서 세포들에 의해 생산되는 ECM의 성숙 및 가교를 유도하기에 충분한 양이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "가교된" ECM은 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에 사용되고, 폴리펩티드들(예를 들어 콜라겐)이 펩티드 연결 이외의 이온 결합 및/또는 공유 결합에 의해 ECM의 하나 이상의 다른 폴리펩티드들에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 ECM을 포함한다. 일부 실시예들에서, 가교된 ECM의 각각의 폴리펩티드는 펩티드 결합이 아닌 결합에 의해 가교된 ECM의 적어도 하나의 다른 폴리펩티드에 공유적으로 및/또는 이온적으로 결합된다. 일부 실시예들에서, ECM의 가교된 펩티드는 ECM의 다른 펩티드에 직접적으로 결합된다. 일부 실시예들에서, ECM의 가교된 폴리펩티드는 예를 들어 개재(intervening) 소분자, 이온, 아미노산, 및/또는 상이한 폴리펩티드를 통해, ECM의 다른 폴리펩티드에 간접적으로 결합된다. 일부 실시예들에서, 가교된 ECM은 폴리펩티드들의 대다수, 실질적으로 전부, 또는 전부가 ECM의 적어도 하나의 다른 폴리펩티드, 예를 들어 열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위를 포함하는, 약 또는 적어도 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 폴리펩티드들에 비-펩티드 결합에 의해 결합되는 ECM을 포함한다.

일부 실시예들에서, 다능성 세포들(예를 들어, iPSC들) 또는 섬유아세포들은 기재 상에서 또는 기재 근처에서 배양된다. 일부 실시예들에서, 기재는 덱스트란, 예를 들어 덱스트란 미세담체들을 포함하거나. 이들로 구성되거나, 본질적으로 이들로 구성된다. 유리하게는, 덱스트란 기재들은 이후에 본원에서 설명되는 바와 같은 덱스트라나아제를 사용하여 소화될 수 있으며, 이는 본원의 일부 실시예들에 따른 세포 배양에 의해 생산되는 ECM의 단리 및 정제를 촉진시킬 수 있다. 일부 실시예들에서, 기재는 탄수화물을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성된다. 일부 실시예들에서, 기재는 중합체를 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성된다. 일부 실시예들에서, 기재는 플라스틱을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성된다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 임의의 기재 또는 고상으로부터 ECM을 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 이론에 의해 제한되는 것 없이, 덱스트라나아제는 ECM 상에서 프로테아제의 역할을 하지 않고, 그래서, 본원의 일부 실시예들에 따른 덱스트라나아제를 사용하여 ECM을 단리시키는 단계가 온전한 것(비-프로테아제-소화 ECM)을 산출한다는 것이 고려된다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다.

덱스트란은 많은 포도당 분자들로부터 이루어진 큰, 분지형 탄수화물이다. 덱스트란 사슬들은 예를 들어 겨우 3 kDa에서 2,000 kDa 초과까지의 분자량들을 갖는, 다양한 길이들일 수 있다. 덱스트란 미세담체들과 같은 덱스트란 구조들은 본원의 일부 실시예들의 방법들, 키트들, 및 조성물들에서 다능성 세포들, 또는 섬유아세포들과 같은, 세포들의 배양을 위한 기재로서 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 유리하게는, 덱스트란은 무독성일 수 있고, 본원에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 덱스트라나아제에 의해 쉽게 가수분해될 수 있다.

덱스트라나아제는 산업 응용들(EC 3.2.1.11, 덱스트란 하이드롤레이즈, 엔도덱스트라나아제, 덱스트라나아제 DL 2, DL 2, 엔도-덱스트라나아제, 알파-D-1,6-글루칸-6-글루카노하이드롤레이즈, 1,6-알파-D-글루칸 6-글루카노하이드롤레이즈)에서 널리 사용되는 박테리아 효소이고, 계통명(systematic name) 6-알파-D-글루칸 6-글루카노하이드롤레이즈를 갖는다. 이 효소는 덱스트란에서 (1->6)-알파-D-글루코시드 결합들의 엔도하이드로시스의 화학적 반응에서 촉매작용을 한다. 세포 배양에서의 덱스트라나아제는 다양한 응용들, 예를 들어 증식된 포유류 세포들, 예컨대 인간 연골세포들, 및 덱스트란 미세담체들 상에 세포들 및 세포-유래 바이러스 또는 다른 생물학적 산물들을 제조하기 위한 포유류 세포주들의 단리를 위해(예를 들어, 미국 특허 번호 제6,378,527호 참조), 또는 생물제제(biologics) 생산을 위한 상업적 규모의 세포 배양들에서 사용되는 대량의 비드들의 폐기물-처리를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예들의 방법들, 키트들, 및 조성물들에서, 덱스트란은 다능성 세포들(예를 들어 iPSC들)을 위한, 또는 다능성 세포들로부터 유래되는 섬유아세포들(예를 들어, 섬유아세포를 iPSC로 역분화시키고, 그 다음, iPSC를 섬유아세포로 재분화시킴으로써 생산되는 섬유아세포들)을 위한 기재 또는 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 덱스트란은 연골세포들의 배양 및/또는 증식을 위해 사용되지 않는다. 일부 실시예들에서, 덱스트란은 비-인간 세포들, 예를 들어 VERO(유인원) 및/또는 CHO(설치류) 세포들의 배양을 위해 사용되지 않는다.

일반적으로 상업적 용도의 인간 ECM에 대해 적용할 수 없는, 다양한 연구-등급의, 소규모 배양들에 대한 덱스트라나아제 효소의 사용은 Pinney 등에 의해 개시된다(문헌[Pinney E, (2011) International Journal of Stem Cells 4: 70-75] 및 문헌[Menen et al., (2012) Anticancer Research 32: 1573-1578]을 참조하며, 그 각각은 이로써 전체적으로 참조로 통합됨).종래의 접근법들은 주로 덱스트란 미세담체들의 폐기물 처리의 맥락에서, 증식 후 세포 단리를 위한 덱스트란의 사용을 수반하였다는 점이 주목된다.일부 실시예들에서, 덱스트란은 ECM을 생산하는 다능성 세포들 또는 섬유아세포들의 배양을 위해 사용된다. 일부 실시예들에서, 덱스트란은 다능성 세포들 또는 섬유아세포들의 배양에서 사용되지만, 폐기물 처리를 위해 사용되지 않는다. 일부 실시예들에서, 배양물은 다능성 세포들 또는 섬유아세포들에 의해 생산되는 인간 ECM을 포함한다.

일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및/또는 키트들에서, ECM은 배양물 내의 세포들(예를 들어, 섬유아세포들, 및/또는 iPSC들)에 의해 제조되고, 그 다음, ECM은 배양물 내의 세포들로부터 단리된다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM의 가용성 분획(soluble fraction)을 단리시키는 단계를 포함한다. 가용성 ECM을 포함하는 폐배지는 세포 배양물들로부터 단리될 수 있고, 선택적으로, 세포 배양물들이 계속 생산될 수 있도록 신선한 배지로 대체될 수 있다. 일부 실시예들에서 ECM은 덱스트라나아제의 효소활성을 촉진시키는 pH(예를 들어, pH 6.0 내지 6.5)에서의 덱스트라나아제 소화 전에, 산성 세정에 의해 단리된다. 덱스트라나아제는 비교적 저 농도일 수 있다(1,000 U/ml 미만, 예를 들어 1,000 U/ml, 900 U/ml, 800 U/ml, 700 U/ml, 600 U/ml, 500 U/ml, 400 U/ml, 300 U/ml, 200 U/ml, 100 U/ml, 50 U/ml, 10 U/ml, 5 U/ml, 2 U/ml, 또는 1 U/ml 미만이며, 이들 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 1 내지 1,000 U/ml; 500 내지 1,000 U/ml, 1 내지 500 U/ml, 100 내지 300 U/ml, 또는 600 내지 800 U/ml을 포함함). 더 낮은 농도들의 덱스트라나아제는 다른 비-덱스트란 탄수화물들을 비-특이적으로 분해할 가능성이 적으며, 이 중 다수는 ECM의 성분들일 수 있다는 것이 고려된다. ECM은 세포 핵산들을 제거하기 위해 DNase에 의해 더 접촉될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서의 ECM의 제조는 제노-프리 배양 배지를 사용하여 동물 또는 식물성 단백질들이 없고, 체외에서 세포 증식을 조절하기 위한 Pinney의 사용 없이 있을 수 있다.

다능성 세포들로부터 생성되는 섬유아세포들을 사용한 ECM 제조

일부 실시예들에서, 세포외 기질을 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 다능성 세포(예컨대 유도 다능성 줄기 세포(iPSC))를 생산 섬유아세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 생산 섬유아세포가 ECM을 생산하도록, 생산 섬유아세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 방법은 다능성 세포를 생산 섬유아세포로 분화시키기 전에 다능성 세포를 형성하기 위해 전구체 섬유아세포를 역분화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포는 그것이 섬유아세포들로 분화되기 전에 증식된다. 먼저 다능성 세포를 증식시킴으로써, 큰 개체군(population)의 다능성 세포들이 다능성 세포들을 섬유아세포들로 재분화시키기 전에 소수의 초기 다능성 세포들로부터 생성될 수 있다는 점이 주목된다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포는 적어도 약 10배, 예를 들어 약 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 또는 30배, 및 열거된 값들 중 적어도 2개의 값들 사이의 포함된 범위들, 예를 들어 약 10 내지 30배, 약 10 내지 25배, 약 10 내지 20배, 약 15 내지 30배, 약 15 내지 25배, 약 15 내지 20배, 또는 약 20 내지 30배 동안 증식된다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포는 적어도 약 15배 동안 증식된다. 다수의 배가들(doublings)을 겪는 다능성 세포들의 능력은 전형적으로 그들이 고갈 및 노화되기 전에 단지 약 10-12배를 겪는, 신생아 포피 세포들과 같은 섬유아세포들의 종래의 공급원들에 비해 이점을 제공할 수 있다는 점이 주목된다.

도 1은 본원의 일부 실시예들에 따라 iPSC들로부터 분화되는 섬유아세포들을 사용하여 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다. 방법에서, 선택적으로, 전구체 섬유아세포는 iPSC들을 형성하기 위해 역분화될 수 있다(100). 방법에서, 유도 다능성 줄기 세포들(iPSCs)은 생산 섬유아세포들로 분화될 수 있다(110). 방법에서, 생산 섬유아세포들은 배양될 수 있으며, 그것에 의해 생산 섬유아세포들은 세포외 기질(ECM)을 생산한다(120). 방법에서, 생산 섬유아세포들은 배양될 수 있으며, 그것에 의해 생산 섬유아세포들은 세포외 기질(ECM)을 생산한다(130).

일부 실시예들의 방법들, 키트들, 및 조성물들에서, 단일 공여자로부터의 전구체 섬유아세포들(또는 iPSCs)은 ECM을 만들기 위해 사용된다. 유리하게는, 단일 공여자로부터 ECM을 제조하는 단계는 잠재적인 오염물질들(예컨대 바이러스 오염물질들)의 수를 최소화할 수 있다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들로 분화되는 iPSC들만이 단일 공여자로부터 유래된다. 바이러스가 없는(예를 들어 레트로바이러스가 없는) 다능성 세포들은 오염 또는 면역원성의 위험을 더 최소화할 수 있다는 점이 또한 주목된다. 따라서, 일부 실시예들에서, iPSC들은 본원에서 설명된 바와 같은 Oct 패밀리 멤버, Sox 패밀리 멤버, 및 Klf 패밀리 멤버와 같은 역분화 인자들을 인코딩하는 바이러스 삽입들이 없다. 일부 실시예들에서, 방법은 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포(Pluripotent stem cell; MSC), ES-유래 MSC, 또는 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주 중 임의의 것을 사용하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, 방법은 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포(Pluripotent stem cell; MSC), ES-유래 MSC, 또는 임의의 신생아 포피 섬유아세포 세포주 중 임의의 것을 사용하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 풋프린트가 없는, 예를 들어 화학적 역분화 인자들 또는 mRNA 역분화 인자들을 사용하여 역분화된 iPSC들이다.

다능성 세포는 본원에 설명되는 바와 같이 분화 인자들(differentiation factors)을 사용하여 생산 섬유아세포로 분화될 수 있다는 점이 주목된다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포들은 그들을 생산 섬유아세포들로 분화시키기 전에 증식된다. 일부 실시예들에서, 분화 전에 다능성 세포들을 증식시키는 단계는 단일 공여자로부터 다량의 생산 섬유아세포들을 산출하기 위해 분화될 수 있는, 단일 공여자로부터 다량의 세포들을 제공할 수 있다. 일부 실시예들에서, 증식 다음에, 그러나 생산 섬유아세포들로의 분화 전에, 다능성 세포들은 뱅킹된다. 예를 들어, 다능성 세포들은 액체 질소에서의 동결에 의해 뱅킹될 수 있다.

일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들은 말단-분화된 세포들(예를 들어, 생산 섬유아세포들 자체)을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성되는 배지에서 배양된다. 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들은 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)이 실질적으로 없거나 없는 배지에서 배양된다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 본원의 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 섬유아세포-유래 iPSC들로부터 분화되는 섬유아세포들은 성숙한 ECM의 효율적인, 대규모 생산에 효과적일 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 일부 실시예들에 따라 단일 공여자 iPSC들을 섬유아세포들로 역분화시키고, 증식시키고, 재분화시키는 단계는 오염 또는 질병 전염의 최소 위험을 갖는 ECM-생산 섬유아세포를의 상업적 규모들을 산출할 수 있다.

일부 실시예들에서, 방법은 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포(multipotent stem cell; MSC), ES-유래 MSC, 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주, 또는 임의의 신생아 포피 섬유아세포주, 또는 이들 중 2개 이상 중 임의의 것 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 방법은 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포(multipotent stem cell; MSC), ES-유래 MSC, 또는 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주, 또는 이들 중 2개 이상 중 임의의 것 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 방법은 이들 중 임의의 것 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 방법은 상업적 규모로 수행되며, 따라서 ECM의 상업적 규모의 생산을 달성한다. 일부 실시예들에서, 방법은 생산 섬유아세포 배양물의 적어도 10리터, 예를 들어 생산 섬유아세포 배양물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 10, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 리터의 배양물을 포함하는 상업적 규모의 생산을 포함하며, 열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 10 내지 1,000 리터, 10 내지 500 리터, 10 내지 200 리터, 50 내지 1,000 리터, 50 내지 500 리터, 50 내지 200 리터, 100 내지 1,000 리터, 100 내지 500 리터, 또는 100 내지 200 리터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법은 ECM의 적어도 50 g, 예를 들어 ECM의 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000, 4,000, 또는 5,000 g(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들을 포함)의 생산을 포함하는 상업적 규모의 생산을 포함한다. 위에 언급된 바와 같이, 1차 세포들, 예를 들어 1차 골수 MSC들, 또는 신생아 포피-유래 세포들의 상업적 규모화는 다수의 공여자들로부터의 세포들을 요구할 수 있어서, 오염 또는 질병 전염의 위험을 상승시킨다. 또한, 위에 언급된 바와 같이, ES 세포들은 예를 들어 윤리적인 고려들로 인해, 제한된 가용성 및 사용을 받을 수 있을 뿐만 아니라, 질병 전염의 위험들을 상승시킬 수 있다. 더욱이, 골수 MSC들과 같은 MSC들은 다능성을 유지할 수 있고, 따라서 추가 분화를 받을 수 있다. 반면에, 일부 실시예들에서의 방법들, 조성물들, 및 키트들은 분화된 섬유아세포들(그러나 MSC들은 아님)로 수행될 수 있어서, 유리하게는, 섬유아세포들은 추가 분화를 받지 않는다.

일부 실시예들에서, 방법은 iPSC를 형성하기 위해 전구체 섬유아세포를 역분화시키는 단계를 포함한다. 전구체 섬유아세포는 역분화 인자들과 접촉될 수 있으며, 그것에 의해 전구체 섬유아세포를 iPSC로 역분화시킨다. 일부 실시예들에서, 전구체 섬유아세포는 성체 피부(생검) 섬유아세포를 포함한다. 일부 실시예들에서, 전구체 섬유아세포는 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 Oct 패밀리 멤버, Sox 패밀리 멤버, 또는 Klf 패밀리 멤버를 인코딩하는 바이러스 삽입물들이 없다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 풋프린트가 없다. 그 다음, iPSC들은 생산 섬유아세포들로 증식 및 분화될 수 있다.

생산 섬유아세포들의 배양은 산소의 존재에서 수행될 수 있다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 정상산소에서의 배양은 산소가 모든 또는 본질적으로 모든 대사 과정에 수반되는, 탄소 공급원들의 효율적인 및 최대의 전환을 촉진하기 때문에 유리하다는 것이 고려된다. 상업적 규모들에서, 산소는 포도당 및 글루타민을 ATP로 전환시키는 반응에서의 반응물이며, 이는 다른 단백질들 중에서, 콜라겐들의 합성을 지원한다. 저산소에서, 세포들은 호기성 호흡보다는 해당(glycolysis)에 훨씬 더 의존하도록 강제되어 콜라겐들과 같은 단백질들의 덜 효율적인 합성을 초래된다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들의 배양은 정상산소에서 수행된다. 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들의 배양은 저산소증에서 수행되지 않는다. 저산소증은 일반적으로 주변 공기의 산소 농도(정상산소; 대략 15%-20%의 산소)와 비교하여 더 낮은 산소 농도를 언급한다. 일부 실시예들에서, 저산소 조건들은 약 10% 미만의 산소 농도를 포함한다. 일부 실시예들에서, 저산소 조건들은 약 1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 1% 내지 8%, 1% 내지 7%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3%, 또는 1% 내지 2%의 산소 농도를 특징으로 한다. 저산소 조건들은 주변 가스 농도들을 제어하는 것을 허용하는 배양 장치, 예를 들어, 혐기성 챔버를 사용함으로써 생성 및 유지될 수 있다.

일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들은 기재의 존재에서 배양된다. 일부 실시예들에서, 기재는 중합체, 예를 들어 플라스틱 표면 또는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시예들에서, 기재는 덱스트란 미세담체를 포함한다.

예를 들어 생산 섬유아세포들이 덱스트란 미세담체들의 존재에서 배양되는 일부 실시예들에서, ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시키는 단계는 산성 완충액에서 ECM을 세정하는 단계, 및 생산 섬유아세포 및 ECM을 포함하는 용액을 덱스트라나아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 생산 섬유아세포 및 ECM을 포함하는 용액은 또한 DNase에 의해 접촉될 수 있다. 예로서, 덱스트라나아제는 박테리아 덱스트라나아제를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 덱스트라나아제는 1 내지 1,000 U/ml 사이의 농도로 제공된다. 따라서, 덱스트라나아제 및 DNase는 다른 물질들을 제거함으로써 ECM의 정제를 촉진할 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다. 일부 실시예들에서, 인간 ECM을 정제하는 단계는 잔류 배양 배지 성분들을 제거하기 위해 6.0 내지 6.5의 pH에서 산성 완충액으로 세정하는 단계를 포함한다. 산-세정된 ECM은 2.0 내지 7.0 사이의 pH, 또는 바람직하게는 pH 6.0 내지 6.5 사이의 산성 용액에서 1 내지 1,000 U/ml 사이의 박테리아 덱스트라나아제 및 1 내지 1,000 U/ml 사이의 재조합 인간 DNase를 포함하는 용액과 접촉될 수 있으며, 여기서, 효소 활성은 덱스트란 비드들 및 세포 핵산들을 제거하기에 충분한다. 선택적으로, 정제는 ECM의 인-프로세스(in-process) 시험 후에 수행될 수 있다.

일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들로부터의 단리 시, ECM은 더 이상 생산 섬유아세포와 유체 연통하지 않는다. 예를 들어, ECM은 생산 섬유아세포로부터 별개의 용기에 있을 수 있다. 일부 실시예들에서, ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시키는 단계는 적어도 20%(w/w) ECM, 예를 들어, 열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함하여, 약 또는 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% ECM인 조성물을 제조하기 위해, ECM을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 조성물은 적어도 약 80% ECM을 포함한다. 일부 실시예들에서, 조성물은 적어도 약 80% 내지 95% ECM을 포함한다. 일부 실시예들에서, 생산 섬유아세포들로부터의 단리 시, ECM은 더 이상 기재에 결합되지 않는다(예를 들어, 더 이상 기재에 직접적으로 결합되지 않고/않거나, 더 이상 기재에 직접적으로 또는 하나 이상의 개재 결합 분자들을 통해 기재에 결합되는 분자에 결합되지 않음).

ECM은 본원에 설명되는 바와 같이 성숙한 ECM 성분들을 포함할 수 있다. "성숙한 ECM"은 본 분야의 그 통상적인 의미에 따라 본원에서 사용되고, 가교된 ECM, COL1의 c-말단 프로펩티드, 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함하는 ECM, 또는 이들 특징들 중 2개 이상의 조합을 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM은 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM의 약 90%(w/w)는 COL1을 포함하고, 약 10%는 COL3, COL4, COL5, COL6, 또는 이들 중 임의의 것 또는 이들 중 전부의 조합으로 구성되는 군(group)으로부터 선택된다. 호모 사피엔스의 예시적 서열들 COL1, COL3, COL4, COL5, 및 COL6은 본원의 표 1에 도시된 서열들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM의 적어도 약 80%는 COL1을 포함하고, 적어도 약 10%는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM의 적어도 약 85%는 COL1(예를 들어, 적어도 약 85%, 87%, 90%, 또는 95%)을 포함하고, 적어도 약 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 13%, 또는 15%)는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 성숙한 ECM의 상이한 분자들, 예를 들어 본원에 설명된 바와 같은 콜라겐 분자들은 다른 분석들 중에서, ELISA를 사용하여 쉽게 검출될 수 있다는 점을 주목한다. 일부 실시예들에서, 콜라겐 단백질(또는 COL1의 c-말단 프로펩티드)에 특이적인 항체는 성숙한 ECM의 성분들의 양들을 확인하기 위해 양적 ELISA에서 사용된다.

일부 실시예들에서, 방법은 생산 섬유아세포들이 성숙한 콜라겐들을 생산할 때까지 생산 섬유아세포들을 혈청과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 생산 섬유아세포들을 혈청과 접촉시키는 단계는 ECM 침착을 지원하고, 생물생성(bioproduction)을 증가시키고, 성숙한 ECM, 예를 들어 가교된 ECM의 생산을 유도할 수 있다는 것이 고려된다. 그 다음, 혈청의 양은 혈청의 농도에서 적어도 95% 감소가 있을 때까지 점진적으로 감소될 수 있다. 일부 실시예들에서, 점진적인 감소는 적어도 약 5일, 예를 들어 약 또는 적어도 약 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50일의 기간에 걸쳐 있으며, 열거된 값들 중 적어도 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함한다.

일부 실시예들에서, 섬유아세포들의 생산 로트(lot)를 개시하기 위해, 다능성 세포들(예를 들어, 섬유아세포들을 역분화 인자들과 접촉시킴으로써 생성되는 iPSC들)의 바이알(vial)은 적합한 수들로 증식되고, 그 다음, 다능성 세포들은 MSC들 또는 섬유아세포들과 같은 원섬유성의 콜라겐성 ECM-생산 세포들로 역분화하도록 유도되고, 이들 세포들은 성숙한 ECM을 생산하기 위해 이용된다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, ECM을 제조하기 위한 방법은 (a) 섬유아세포 피부 생검 또는 혈액 샘플들을 분화시키는 단계, (b) 이 후에, 화학물질, 폴리펩티드, 또는 핵산-기반 벡터가 없는/풋프린트가 없는 유도 다능성을 통해 다능성을 유도하는 단계, (c) 클론들을 단리시키고 다능성 상태에서 세포들을 증식시키는 단계, (d) 세포 뱅크들(선택적으로 세포들의 특성화 및 우발적인 제제 시험을 포함함)을 생성하는 단계, (e) ECM을 위한 생산 로트를 개시하기 위해 다능성 세포들을 증식시키는 단계, 및/또는 (f) 다능성 세포들을 배양에서 불용성인 충분히 성숙한 원섬유성의 콜라겐성 ECM을 생산하는 분화된 상태로 다시 역분화시키는 단계를 포함한다.

일부 실시예들에서, ECM을 제조하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 인간 섬유아세포들, 역분화 인자들; 및 섬유아세포 분화 인자들을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 인간 섬유아세포들을 포함하는 조성물은 냉동 인간 섬유아세포들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 조성물의 모든 섬유아세포들은 단일 공여자로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 키트는 기재, 예를 들어 덱스트란 미세담체들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 키트는 덱스트라나아제 및 DNAase를 더 포함하며, 이는 예를 들어, ECM을 세포들 및 세포 배양물로부터 단리시키는 데 유용할 수 있다. 일부 실시예들에서, 키트는 인간 섬유아세포들 및 역분화 인자들 대신에 iPSC들과 같은 다능성 세포들을 포함한다(그러나, 다능성 세포들을 섬유아세포들로 분화시키기 위해 분화 인자들을 여전히 포함함). 일부 실시예들에서, 키트는 프로테아제를 포함하지 않는다.

일부 실시예들은 적어도 약 80%(w/w) 세포외 기질을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서 세포외 기질은 위에 설명된 방법들 중 어느 하나에 따라 제조된다. 일부 실시예들에서, 조성물은 약 또는 적어도 약 60%(w/w) ECM, 예를 들어 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들을 포함) ECM들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 조성물의 ECM은 본원에서 설명된 바와 같이 성숙한 ECM을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 이로 구성된다.

일부 실시예들에서, 세포 배양물은 iPSC-유래 섬유아세포들이 세포외 기질을 생산하고 있는 복수의 iPSC-유래 섬유아세포들을 포함한다. 세포 배양물은 본원에서 설명된 바와 같이 역분화 인자들을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 조성물의 적어도 약 5%(w/w), 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%(열거된 값들 중 적어도 2개의 값들 사이의 범위들을 포함)는 ECM이다. 일부 실시예들에서, ECM의 약 90%(w/w)는 COL1을 포함하고, 적어도 약 10% 는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, ECM의 적어도 약 80%는 COL1을 포함하고, 적어도 약 10%는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, ECM의 적어도 약 85%는 COL1(예를 들어, 적어도 약 85%, 87%, 90%, 또는 95%)을 포함하고, 적어도 약 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 13%, 또는 15%)는 COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다.

성숙한, 제노-프리 ECM의 생산

일부 실시예들은 세포외 기질(ECM)을 제조하는 방법을 포함한다. 방법은 섬유아세포들 및/또는 중간엽 줄기 세포들(MSCs)을 기재 상에 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 기재는 적어도 2개의 표면들을 포함할 수 있다. 배양은 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 및/또는 MSC들의 적어도 80%가 그들의 세포 주기를 정지시킬 때까지(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99%), 혈청-프리 및 제노-프리로 수행될 수 있다. 그 다음, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 약 또는 적어도 약 2주(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주) 동안 혈청과 접촉될 수 있다. 혈청과의 접촉의 결과로서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 가용성의 성숙한 ECM을 생산할 수 있으며, 따라서 가용성의 성숙한 ECM 및 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 포함하는 용액을 생산한다. 용액은 제노-프리일 수 있다. 방법은 가용성의 성숙한 ECM을 섬유아세포들 및/또는 MSC들로부터 단리시키는 단계, 따라서 ECM을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 ECM은 성숙한 제노-프리 ECM이다. 예를 들어, 가용성의 성숙한 ECM을 단리시키는 단계는 폐배지를 포함하는, 용액의 가용성 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 방법은 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 (나중에 혈청을 첨가하기 보다는) 배양의 시작에서 혈청을 함유하는 배지들에 있도록 수행될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 섬유아세포들 및 ECM들이 위에 언급되어 있지만, 방법은 또한 본원에 설명되는 ECM-생산 세포들로 수행될 수 있다는 것이 명백하게 고려된다는 점이 주목된다. 일부 실시예들에서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다.

도 2는 본원의 일부 실시예들에 따라 적어도 2주 동안 섬유아세포들 또는 MSC들을 배양하는 단계를 포함하는 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다. 방법에서, 선택적으로, 인간 다능성 세포 배양물이 증식될 수 있다. 상기 증식은 혈청-프리 및 제노-프리일 수 있으며, 그것에 의해 인간 다능성 세포들을 생산한다. 인간 다능성 세포들은 분화 인자들과 접촉될 수 있으며, 이에 의해 인간 다능성 세포들은 섬유아세포들 또는 MSC들로 분화한다(200). 방법에서, 섬유아세포들 및/또는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)은 기재 상에서 배양될 수 있다. 기재는 적어도 2개의 표면들을 포함할 수 있다. 배양은 혈청-프리 및 제노-프리일 수 있고, 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 및/또는 MSC들의 적어도 80%가 그들의 세포 주기를 정지시킬 때까지 수행될 수 있다(210). 방법에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 적어도 약 2주 동안 혈청과 접촉될 수 있으며, 이에 의해 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 가용성의 성숙한 ECM을 생산함으로써, 가용성의 성숙한 ECM 및 섬유아세포들 또는 MSC들을 포함하는 용액을 생산하며, 여기서, 상기 용액은 제노-프리이다(220). 방법에서, 가용성의 성숙한 ECM은 생산 섬유아세포로부터 단리될 수 있음으로써, ECM을 제조하며, 여기서, ECM은 성숙한 제노-프리 ECM이다(230).

일부 실시예들에서, 방법은 인간 다능성 세포 배양물(예를 들어, iPSC들, 예컨대 본원에서 설명된 같은 풋프린트가 없는 iPSC들)을 증식시키는 단계를 더 포함한다. 증식 단계는 혈청-프리 및 제노-프리 조건들에서 수행될 수 있고, 증식된 양의 인간 다능성 세포들을 생산할 수 있다. 방법은 본원에서 설명된 바와 같이 증식된 인간 다능성 세포들을 분화 인자들과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 분화 인자들은 인간 다능성 세포들을 섬유아세포들 또는 MSC들로 분화시키기에 적합할 수 있다.

섬유아세포들 및/또는 MSC들을 적어도 2주 이상 동안 혈청과 함께 배양하는 단계는 콜라겐 가교를 포함하고, 우수한 용해도를 갖는 성숙한 ECM의 생산을 예상외로 산출했다는 것이 본원에서 관측되었다. 따라서, 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 적어도 약 2주, 예를 들어, 적어도 약 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 또는 12주(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들을 포함) 동안 수행된다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 적어도 약 8주 동안 수행된다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 약 2주 내지 약 12주, 예를 들어 약 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 또는 12주 동안 수행되며, 열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 약 2주 내지 약 11주, 약 2주 내지 약 10주, 약 2주 내지 약 8주, 약 2주 내지 약 6주, 약 2주 내지 약 4주, 약 3주 내지 약 12주, 약 3주 내지 약 10주, 약 3주 내지 약 8주, 약 3주 내지 약 6주, 약 4주 내지 약 12주, 약 4주 내지 약 10주, 약 4주 내지 약 8주, 약 4주 내지 약 6주, 약 6주 내지 약 12주, 약 6주 내지 약 10주, 또는 약 6주 내지 약 8주를 포함한다. 일부 실시예들에서, 접촉 단계는 약 2주 내지 약 8주 동안 수행된다. 일부 실시예들에서, 접촉 단계는 2주보다 더 길게 수행된다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 정상산소 조건들 하에서 혈청과 함께 배양된다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 저산소 조건들 하에서 혈청과 함께 배양되지 않는다.

일부 실시예들에서, 인간 다능성 세포들은 유도 다능성 줄기 세포들(induced pluripotent stem cells; iPSCs)을 포함한다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 풋프린트가 없다. 일부 실시예들에서, iPSC들은 단일 공여자로부터 유래된다. 본원에 논의되는 바와 같이, iPSC들의 사용은 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 섬유아세포들과 같은 ECM-생산 세포들로 분화되기 전에, 다능성 세포들이 증식되고, 선택적으로 뱅킹되는 것을 허용할 수 있다. 따라서, iPSC들이 단일 공여자로부터 비롯되고 그 다음 증식될 수 있음에 따라, iPSC들의 그러한 사용들은 단일 공여자로부터 ECM-생산 세포들의 상업적 규모의 양들을 허용할 수 있다.

일부 실시예들에서, 방법은 성숙한 제노-프리 ECM을 포함하는 미용 조성물을 제조하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 폐배지는 또한 일부 미용 조성물들의 제조에 대해 유용할 수 있다.

혈청이 본원에서 설명되는 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 섬유아세포들과 같은, ECM-생산 세포들의 배양물에서 사용되거나 이에 첨가될 때, 아스코르브산은 또한 예를 들어 배양물에서 세포들의 건강의 유지하는 데 유용할 수 있다. 이론에 의해 제한되는 것 없이, 아스코르브산은 성숙한 삼중 나선 콜라겐들을 안정화시키는 콜라겐의 특정 번역 후 변형들(post-translational modifications)에 대해 요구될 수 있다는 점이 주목된다. 예로서, 아스코르브산은 프롤릴 하이드록실라제와 같은 일부 효소들에 대한 보조인자(cofactor)일 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 방법은 세포들이 혈청과 접촉되는 시간(예를 들어, 적어도 2주) 동안 섬유아세포들 또는 MSC들을 아스코르브산과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

이론에 의해 제한되는 것 없이, 섬유아세포들 및/또는 MSC들과 같은 세포들은 그들이 기재(예컨대 스캐폴드 또는 지지체, 예를 들어 본원에 설명된 바와 같은 덱스트란 미세담체들) 상에서 충분한 밀도에 도달하면 ECM 침착 및 성숙을 지원할 수 있다는 것이 고려된다. 더욱이, 세포들이 충분한 밀도에 도달하기 시작함에 따라, 그들의 세포 주기들은 정지될 수 있다(즉, 세포들은 세포 주기의 G0기에 진입할 수 있음). 따라서, 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 그들이 ECM 침착 및 성숙을 지지하기 위해 적합한 밀도에 도달할 때까지 혈청과 접촉되지 않는다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 이들 섬유아세포들 또는 MSC들이 3 차원 형상을 정의하는 기재의 적어도 2개의 표면들 상에 배치되고, 섬유아세포들 또는 MSC들의 적어도 약 70%가 그들의 세포 주기들을 정지시킬 때까지 혈청과 접촉되지 않는다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 이들 섬유아세포들 또는 MSC들이 3 차원 형상을 정의하는 기재의 적어도 2 개의 표면들 상에 배치되고 섬유아세포들 또는 MSC들의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함)가 그들의 세포 주기들을 정지시킬 때까지 혈청과 접촉되지 않는다.

다수의 적합한 형태들의 혈청, 예를 들어 시험된 임상-등급의 우아 혈청 또는 만료된 혈액 유닛들로부터의 풀링된 인간 혈청, 또는 이들의 조합은 섬유아세포들 및/또는 MSC들과 접촉될 수 있다. 일부 실시예들에서, 혈청을 섬유아세포들과 접촉시키는 단계는 혈청을 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 포함하는 용액에 첨가시키는 단계를 포함한다. "첨가"는 본원에서 광범위하게 사용되고, 혈청을 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 함유하는 용액에 첨가하는 것 뿐만 아니라, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 함유하는 용액을 혈청에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시예들에서, 혈청은 혈청의 양(v/v)이 약 0.1% 내지 10%, 예를 들어 약 1 내지 2%, 1 내지 5%, 2 내지 10%, 2 내지 5%, 3 내지 10%, 3 내지 5%, 또는 5 내지 10%일 때까지 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 함유하는 용액에 첨가된다.

유리하게는, 본원의 일부 실시예들에 따라 제노-프리 ECM을 생산하는 것은 ECM을 함유하는 제품들의 사용자들에서 유해(adverse) 면역 반응들의 위험을 감소시킬 수 있다. 그러한 제품들은 간결한 규제 검토와 같은 이점들을 더 누릴 수 있다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 및/또는 MSC들은 동물 성분들을 사용하여 이전에 성장된 세포주(cell line)의 인간 다능성 세포들(예를 들어 iPSC들)로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 다능성 세포들은 단일 공여자로부터 유래된다. 다능성 세포들은 이종 성분들의 사용 없이 증식될 수 있다. 따라서, 다량의 제노-프리 세포들이 획득될 수 있다. 제노-프리 다능성 세포들은, 일부 실시예들에 따라, 그 다음, ECM-생산 세포들, 예를 들어 섬유아세포들 및/또는 MSC들로 분화될 수 있다. 분화는 본원에 설명된 바와 같이 제노-프리 다능성 세포들을 분화 인자들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

더욱이, 일부 실시예들의 방법들, 조성물들, 및 키트들에 따라 제조되는 제노-프리 ECM은 본원에 설명된 바와 같이, 성숙한 ECM을 포함할 수 있다. 이와 같이, 성숙한 제노-프리 ECM은 다수의 미용 및 의료 제품들에 대해 매우 적합할 수 있다. 일부 실시예들에서, 성숙한 제노-프리 ECM은 원섬유성 콜라겐을 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 제노-프리 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마 형 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예들에서, 성숙한 제노-프리 ECM은 삼중 나선 및/또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐을 포함한다.

일부 실시예들에서, 용액은 기재의 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, 예를 들어 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, cm² 당 150 μg의 콜라겐, cm² 당 200 μg의 콜라겐, cm² 당 250 μg의 콜라겐, cm² 당 300 μg의 콜라겐, cm² 당 350 μg의 콜라겐, cm² 당 400 μg의 콜라겐, cm² 당 450 μg의 콜라겐, cm² 당 500 μg의 콜라겐, cm² 당 600 μg의 콜라겐, cm² 당 700 μg의 콜라겐, cm² 당 800 μg의 콜라겐, cm² 당 900 μg의 콜라겐, 또는 cm² 당 1,000 μg의 콜라겐(열거된 값들 중 적어도 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용액은 기재의 cm² 당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함한다.

일부 실시예들에서, 제조된 성숙한 제노-프리 ECM은 기재의 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, 예를 들어 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, cm² 당150 μg의 콜라겐, cm² 당 200 μg의 콜라겐, cm² 당 250 μg의 콜라겐, cm² 당 300 μg의 콜라겐, cm² 당 350 μg의 콜라겐, cm² 당 400 μg의 콜라겐, cm² 당 450 μg의 콜라겐, cm² 당 500 μg의 콜라겐, cm² 당 600 μg의 콜라겐, cm² 당 700 μg의 콜라겐, cm² 당 800 μg의 콜라겐, cm² 당 900 μg의 콜라겐, 또는 cm² 당 1,000 μg의 콜라겐(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위를 포함)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제조된 성숙한 제노-프리 ECM은 기재의 cm² 당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함한다.

일부 실시예들에서, 방법은 용액에서 성숙한 ECM의 양을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 검출 단계는 본원에서 설명된 바와 같은 성숙한 ECM의 하나 이상의 성분들의 존재, 부재, 및/또는 레벨들을 검출하기 위해 ELISA를 사용하여 수행된다.

일부 실시예들은 위의 방법들 중 어느 하나에 따라 생산되는 섬유아세포들 또는 MSC들 및 가용성의 성숙한 ECM을 포함하는 용액을 포함한다. 용액은 제노-프리일 수 있고, 가용성의 성숙한 ECM은 가교된 콜라겐을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 용액은 섬유아세포들을 포함하지만, MSC들은 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 용액에서 기재에 걸쳐 있고, 용액은 기재의 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, 예를 들어 cm² 당 적어도 약 100 μg의 콜라겐, cm² 당 150 μg의 콜라겐, cm² 당 200 μg의 콜라겐, cm² 당 250 μg의 콜라겐, cm² 당 300 μg의 콜라겐, cm² 당 350 μg의 콜라겐, cm² 당 400 μg의 콜라겐, cm² 당 450 μg의 콜라겐, cm² 당 500 μg의 콜라겐, cm² 당 600 μg의 콜라겐, cm² 당 700 μg의 콜라겐, cm² 당 800 μg의 콜라겐, cm² 당 900 μg의 콜라겐, 또는 cm² 당 1,000 μg의 콜라겐(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용액은 기재의 cm2 당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함한다.

본원의 일부 실시예들에 따라 설명되는 바와 같은 기간 동안 ECM을 생산하는 것은 종래의 방법들보다 더 높은 풍부한 성숙한 ECM을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본원의 일부 실시예들에 따라, 가용성 ECM을 갖는 폐배지를 수집하기 전에 약 8 내지 12주 동안 세포들을 배양하는 것은 종래의 방법들보다 더 많은 ECM을 생산할 수 있다. 반면에, 일부 종래의 방법들에 따라 저산소 조건들 하에서 배아형 ECM의 생산은 전체적으로 더 적은 ECM을 산출할 수 있고, 임의의 성숙한 ECM을 반드시 생산하지 않아도 된다. 특정 방법에 의해 생산되는 ECM의 양들은 예를 들어, 성체-조직 유래 유형 I 콜라겐을 대상(subject) 세포 배양(들)에 의해 생산되는 ECM과 비교하는 SDS-PAGE 겔의 의해 측정될 수 있다.

혈청의 점진적 제거를 포함하는 ECM의 제조

일부 실시예들은 세포외 기질(ECM)을 제조하는 방법을 포함한다. 방법은 0이 아닌 농도의 혈청을 포함하는 배지에 섬유아세포들을 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 배지가 혈청의 농도의 5% 이하, 예를 들어, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하를 함유할 때까지 섬유아세포들을 포함하는 배지에서 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 혈청의 이러한 점진적인 감소는 또한 "혈청 이유(serum weaning)"로서 본원에 언급될 수 있다. 혈청의 점진적인 감소 후, 방법은 적어도 약 1주(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들을 포함하는, 예를 들어 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12주) 동안 섬유아세포들을 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 의해 섬유아세포들은 가용성 ECM을 생산한다. 따라서, 방법은 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 생산할 수 있다. 방법은 가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시키는 단계, 따라서 ECM을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 방법은 혈청 이유가 시작되었으면 거의 또는 전혀 세포 증식을 포함하지 않는다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 약 0.7 배이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 약 0.6 배, 0.7 배, 0.8 배, 0.9 배, 1 배, 1.1 배, 또는 1.2 배(열거된 값들의 적어도 2개의 값들 사이의 범위들을 포함함)이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.9 배이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 약 0.8 배 내지 1.2 배이다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 것(즉, 혈청 이유)은 세포 증식 또는 세포 계대배양 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 것(즉, 혈청 이유)은 세포 계대배양 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, 혈청은 (배양물 또는 ECM에 주목할 만한 영향을 미치지 않는 미량들을 제외하고) 혈청의 점진적인 감소에 의해 완전히 제거된다. 섬유아세포들이 위에 언급되지만, 방법은 또한 본원에 설명되는 ECM-생산 세포들로 수행될 수 있다는 것이 명백히 고려된다는 것이 주목된다. 일부 실시예들에서, ECM을 섬유아세포들로부터 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함한다(예를 들어, 기재 또는 고상은 섬유아세포들에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있고/있거나, ECM은 섬유아세포들에 의해 생산되고 있는 과정에서 기재 또는 고상과 연관되었을 수 있음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리된다(예를 들어, 이에 결합되지 않음). 일부 실시예들에서, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전하다.

도 3은 본원의 일부 실시예들에 따라 혈청 이유를 포함하는 ECM을 제조하는 방법들을 예시하는 흐름도이다. ECM은 제노-프리일 수 있다. 방법에서, 섬유아세포들이 일정 농도의 혈청을 포함하는 배지에 제공될 수 있다(300). 방법에서, 섬유아세포들을 포함할 수 있는 배지 내의 혈청의 양은 배지가 혈청의 농도의 5% 이하를 함유할 때까지 점진적으로 감소될 수 있다(310). 방법에서, 섬유아세포들은 적어도 약 2주(예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주) 동안 배양될 수 있으며, 그것에 의해 섬유아세포들은 가용성 ECM을 생산함으로써, 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 생산한다(320). 방법에서, 가용성 ECM은 섬유아세포들로부터 단리될 수 있음으로써, ECM을 제조한다(330).

본원에서 사용되는 바와 같이, 배지에서 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계는 수 일, 예를 들어 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일에 걸쳐 발생할 수 있으며, 열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 약 1 내지 30일, 1 내지 20일, 1 내지 14일, 1 내지 10일, 1 내지 7일, 1 내지 5일, 1 내지 30일, 2 내지 20일, 2 내지 14일, 2 내지 10일, 2 내지 7일, 2 내지 5일, 3 내지 20일, 3 내지 14일, 3 내지 10일, 3 내지 7일, 3 내지 5일, 5 내지 20일, 5 내지 14일, 5 내지 10일, 5 내지 7일, 7 내지 20일, 7 내지 14일, 7 내지 10일, 10 내지 20일, 또는 10 내지 14일을 포함한다. 일부 실시예들에서, 혈청은 적어도 약 5일 동안 점진적으로 감소된다. 혈청의 점진적인 감소는 혈청-함유 배지의 제거, 및 혈청이 없는 배지로의 대체를 수반할 수 있다. 혈청-함유 배지의 일부를 혈청이 없는 배지로 여러 번 대체하는 것을 수행함으로써, 혈청은 그것이 효과적으로 제거될 때까지(즉, 세포 배양 또는 ECM에 주목할 만한 영향을 미치지 않는, 미량들 이하의 혈청이 남아 있도록), 점진적으로 감소될 수 있다.

놀랍게도, 혈청이 본원의 일부 실시예들에 따라 설명된 바와 같이 완전히(또는 거의 완전히) 제거될 때까지, 혈청을 점진적으로 감소시키는 것은 다수의 ECM-생산 세포들이 세포 주기를 정지시키도록(즉, G0기에 진입하도록) 유도하고, 실질적으로 ECM을 분해하거나 세포사멸을 유도하는 것 없이 가용성의 성숙한 ECM을 생산할 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서, 혈청의 점진적인 감소(reducing) 다음에, 가용성의, 온전하고, 성숙한 ECM이 생산된다.

일부 실시예들에서, 혈청의 점진적인 감소 다음에, 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 70%, 예를 들어 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 70 내지 99%, 70 내지 95%, 70 내지 90%, 80 내지 99%, 80 내지 95%, 80 내지 90%, 85 내지 99%, 85 내지 95%, 또는 85 내지 90%를 포함)는 G₀ 세포 주기 단계에 있다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계에 있다.

일부 실시예들에서, 혈청의 점진적인 감소 다음에, 용액 내의 섬유아세포들의 약 5% 미만은 세포사멸을 겪고 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포사멸을 "겪는(undergoing)" 세포들의 백분율은 세포사멸을 표시하는 검출가능 마커들을 나타내는 세포들을 의미하고, 따라서 세포사멸의 과정에 있는 세포들 뿐만 아니라, 세포사멸의 프로그램을 최근에 완료한 세포들을 포함할 수 있다. 세포사멸을 겪는 세포들의 백분율은 예를 들어 카스파제 절단, 또는 TUNEL 염색의 검출에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 섬유아세포들의 5% 미만, 예를 들어 약 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만(열거된 값들 중 임의의 2 개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 3%, 0.1% 내지 1%, 0.5% 내지 5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 5%, 1% 내지 3%, 또는 3% 내지 5%를 포함)은 세포사멸을 겪고 있다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 섬유아세포들의 약 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있다.

본원의 일부 실시예들에 따른 방법들, 조성물들, 및 키트들은 다량의 성숙한 ECM을 생산할 수 있다는 점이 주목된다. 일부 실시예들에서, ECM을 포함하는 큰 구조체들은, 구조체들 중 일부가 현미경 하에서 보일 수 있는 정도로 제조된다. 일부 실시예들에서, 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함하며, 여기서 나노구조체들은 적어도 200 nm, 및 10,000 nm까지, 예를 들어 적어도 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 1,000 nm, 2,000 nm, 5,000 nm, 또는 그 이상의 최대 직경을 갖는다. 일부 실시예들에서, 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 갖는다. 이들 큰 직경들을 고려하면, 특정 필터들을 통한 여과는 ECM을 포함하는 구조체들이 필터를 쉽게 막을 수 있어서, 회수된 ECM의 실질적인 손실을 야기함에 따라, 실현 가능하지 않을 수 있다는 점이 주목된다. 이와 같이, 일부 실시예들에서, ECM을 제조하고/하거나, 정제하고/하거나 단리시키는 단계는 여과를 포함하지 않는 정제를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 제조하는 단계는 멸균 여과를 포함하지 않는 정제를 포함한다. 일부 실시예들에서, ECM을 제조하는 단계는 0.1 μM 여과를 포함하지 않는 정제를 포함한다. 일부 실시예들에서, 0.1 μM 여과와 같은 여과(또는 멸균 여과)를 회피하는 것은 회수되는 성숙한 ECM의 수율을 상당히 증가시킬 수 있다. 일부 실시예들에서, ECM을 섬유아세포들로부터 단리시키는 단계는 ECM을 포함하는 멸균 여과 용액 없이 수행된다. 일부 실시예들에서, ECM을 제조하는 단계는 멸균 여과 용액 없이 수행된다.

일부 실시예들은 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 포함하며, 여기서 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계에 있고, 용액 내의 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있다. 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함할 수 있다. 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 용액 내의 혈청의 함량(v/v)은 0.1% 미만, 예를 들어, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 또는 0.001% 미만(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어, 0.1% 내지 0.001%의 혈청 함량을 포함)이다. 일부 실시예들에서, 용액은 혈청이 없다(본원에서 사용된 바와 같이, 혈청이 "없는(free)" 용액은 선택적으로 ECM의 생산의 세포 배양에 주목할 만한 영향들을 미치지 않는 미미한 양들의 혈청을 함유할 수 있음). 일부 실시예들에서, 용액은 위의 방법들 중 임의의 방법에 따라 제조된다.

추가 실시예들

일부 실시예들은 또한 인간 ECM 그리고 미용 및 치료 용도들을 위해 ECM을 함유하는 제품들의 제조 및 분배를 위한 시스템들 및 방법들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 방법들 및 시스템들은 하기의 제조 및 분배에 효율성들을 제공한다: 1) 미세담체들로부터의 간섭 없이 인간 ECM의 수집 및 추가 처리에 충분한, 다수의 덱스트란 미세담체들의 저비용 및 효율적인 제거, 2) 제노-프리 제품들의 마케팅 및 상업적 구현을 위한 바람직한 특징들(그러한 바람직한 특징들을 제조업자들 및 사용자들에 전달하기 위한 방법들 및 시스템들을 포함), 및 3) 단일 제조 로트로부터의 가용성 및 비-가용성 분획들 둘 다로부터 제품들을 만들 시의 효율성들, 이는 제품을 제조하기 위해 이들 분획들 중 하나만을 사용하는 것보다 더 자원-효율적일 수 있음. 이와 같이, 본원의 일부 실시예들에 따른 방법들 및 시스템들은 ECM 및 ECM-함유 제품들의 제조에서 효율성들을 제공할 수 있다.

추가 옵션들이 아래에 진술된다:

1. 세포외 기질(extracellular matrix)을 제조하는 방법으로서,

유도 다능성 줄기 세포들(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)을 생산 섬유아세포로 분화시키는 단계;

생산 섬유아세포들을 배양하여, 생산 섬유아세포들이 세포외 기질(ECM)을 생산하는 단계; 및

ECM을 생산 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.

2. 옵션 1에 있어서, iPSC들을 생산 섬유아세포로 분화시키기 전에 iPSC들을 형성하기 위해 전구체 섬유아세포를 역분화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

3. 옵션들 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 분화 단계 전에 iPSC들을 증식시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

4. 옵션들 2 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 분화 단계 전에 iPSC들의 뱅크를 구성하는 단계를 더 포함하는, 방법.

5. 옵션 1에 있어서, 분화된 iPSC들만이 단일 공여자로부터 유래되는, 방법.

6. 옵션들 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 생산 섬유아세포들의 상기 배양 단계는 정상산소에서 수행되는, 방법.

7. 옵션들 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 생산 섬유아세포들을 배양하는 단계는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 배양하는 단계를 포함하지 않는, 방법.

8. 옵션들 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 전구체 섬유아세포는 성체 피부(생검) 섬유아세포를 포함하는, 방법.

9. 옵션들 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, ECM을 단리시키는 단계는 ECM을 정제시킴으로써, 적어도 약 80%(w/w) ECM인 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.

10. 옵션 9에 있어서, ECM을 정제하는 단계는:

ECM을 산성 완충액에서 세정하는 단계; 및

생산 섬유아세포 및 ECM을 포함하는 용액을 덱스트라나아제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.

11. 옵션들 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, ECM은 콜라겐을 포함하는, 방법.

12. 옵션 11에 있어서, ECM의 약 90%(w/w/)는 COL1이고, 약 10%는: COL3, COL4, COL5, COL6, 및 이들 중 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.

13. 옵션들 2 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 전구체 섬유아세포를 역분화 인자들과 접촉시킴으로써, 전구체 섬유아세포를 iPSC로 역분화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

14. 옵션들 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, iPSC들은 Oct 패밀리 멤버, Sox 패밀리 멤버, Klf 패밀리 멤버를 인코딩하는 바이러스 삽입들이 없는, 방법.

15. 옵션들 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, iPSC들은 풋프린트가 없는, 방법.

16. 옵션들 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 방법은: 배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포, ES-유래 MSC, 또는 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주 중 임의의 것을 포함하지 않는, 방법.

17. 옵션들 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.

18. 옵션들 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 생산 섬유아세포들이 성숙한 콜라겐들을 생산할 때까지 생산 섬유아세포들을 혈청과 접촉시키는 단계, 그 다음, 혈청의 농도에서 적어도 95% 감소가 있을 때까지 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

19. 옵션 18에 있어서, 점진적인 감소 단계는 적어도 약 5일의 기간에 걸치는, 방법.

20. ECM을 제조하기 위한 키트로서,

인간 섬유아세포들을 포함하는 조성물;

역분화 인자들; 및

섬유아세포 분화 인자들을 포함하는, 키트.

21. 옵션 20에 있어서, 조성물의 섬유아세포들 전부는 단일 공여자로부터 유래되는, 키트.

22. 옵션들 20 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 기재, 예컨대 덱스트란 미세담체들을 더 포함하는, 키트.

23. 옵션 22에 있어서, 덱스트라나아제 및 DNAase를 더 포함하는, 키트.

24. 적어도 80%(w/w) 세포외 기질을 포함하는 조성물에 있어서, 세포외 기질은 옵션들 1-14 중 어느 하나의 방법에 따라 제조되는, 조성물.

25. 세포 배양물로서,

iPSC-유래 섬유아세포들 - iPSC-유래 섬유아세포들은 성숙한 세포외 기질을 생산하고 있음 -; 및

역분화 인자들을 포함하고,

조성물의 적어도 50%(w/w)는 ECM을 포함하는, 세포 배양물.

26. 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하는 방법으로서,

섬유아세포들 및/또는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 기재 - 상기 기재는 적어도 2개의 표면들을 포함함 - 상에 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계는 상기 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3 차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 및/또는 MSC들의 적어도 80%가 그들의 세포 주기를 정지시킬 때까지 혈청-프리 및 제노-프리인, 상기 배양 단계;

그후에, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 적어도 약 2주 동안 혈청과 접촉시켜, 이에 의해 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 가용성의 성숙한 ECM을 생산함으로써, 가용성의 성숙한 ECM 및 섬유아세포들 또는 MSC들을 포함하는 용액 - 상기 용액은 제노-프리임 -을 생산하는 단계; 및

가용성의 성숙한 ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시킴으로써, ECM - ECM은 성숙한 제노-프리 ECM임 -을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.

27. 옵션 26에 있어서,

인간 다능성 세포 배양물을 증식시킴으로써 - 상기 증식은 혈청-프리 및 제노-프리임 -, 인간 다능성 세포들을 생산하는 단계; 및

인간 다능성 세포들을 분화 인자들과 접촉시켜, 이에 의해 인간 다능성 세포들이 상기 섬유아세포들 또는 MSC들로 분화하는 단계를 더 포함하는, 방법.

28. 옵션들 26 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 약 2주 내지 약 8주 동안인, 방법.

29. 옵션들 26 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 적어도 약 8주 동안인, 방법.

30. 옵션들 27 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 다능성 세포들은 유도 다능성 줄기 세포들(induced pluripotent stem cells; iPSCSs)을 포함하는, 방법.

31. 옵션 30에 있어서, 상기 iPSCS들은 풋프린트가 없는, 방법.

32. 옵션들 30 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 iPSCS들은 단일 공여자로부터 유래되는, 방법.

33. 옵션들 26 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 성숙한 제노-프리 ECM을 포함하는 미용 조성물을 제조하는 단계를 더 포함하는, 방법.

34. 옵션들 26 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 적어도 2주의 혈청과의 접촉 동안 섬유아세포들 또는 MSC들을 아스코르브산과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

35. 옵션들 26 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 섬유아세포들 또는 MSC들은 상기 섬유아세포들 또는 MSC들이 적어도 2개의 표면들에 걸쳐 3 차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 또는 MSC들의 적어도 70%가 그들의 세포 주기를 정지시키기 전에 혈청과 접촉되지 않는, 방법.

36. 옵션들 26 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 혈청의 양은 약 0.1% 내지 10%(v/v)인, 방법.

37. 옵션들 26 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 혈청의 양은 약 1-2%(v/v)인, 방법.

38. 옵션들 26 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 혈청은 임상-등급의 우아 혈청, 풀링된 인간 혈청, 또는 그 조합을 포함하는, 방법.

39. 옵션들 26 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 인간 다능성 세포들은 동물 성분들을 사용하여 이전에 성장된 세포주인, 방법.

40. 옵션들 26 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 성숙한 제노-프리 ECM은 원섬유성 콜라겐을 포함하는, 방법.

41. 옵션 40에 있어서, 성숙한 제노-프리 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.

42. 옵션들 26 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 용액은 기재의 cm²당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함하는, 방법.

43. 옵션들 26 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 제조된 성숙한 제노-프리 ECM은 기재의 cm²당 적어도 250 μg의 콜라겐을 포함하는, 방법.

44. 옵션들 27 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 다능성 세포들은 단일 공여자로부터 유래되는, 방법.

45. 옵션들 26 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 용액에서 성숙한 ECM의 양을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.

46. 옵션들 26 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 용액으로부터 다량의 폐 배양 배지를 수집하는 단계 및 폐 배양 배지로부터 가용성의 성숙한 ECM을 단리시키는 단계를 더 포함하는, 방법.

47. 섬유아세포들 또는 MSC들 및 옵션들 26-45 중 어느 하나에 따라 생산되는 가용성의 성숙한 ECM을 포함하는 용액에 있어서, 상기 용액은 제노-프리이고, 가용성의 성숙한 ECM은 가교된 콜라겐을 포함하는, 용액.

48. 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하는 방법으로서,

섬유아세포들을 일정 농도의 혈청을 포함하는 배지에 제공하는 단계;

배지가 혈청의 농도의 5% 이하를 함유할 때까지 섬유아세포들을 포함하는 배지에서 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계;

상기 점진적으로 감소시키는 단계 다음에, 섬유아세포들을 적어도 약 2주 동안 배양하여 섬유아세포들이 가용성 ECM을 생산함으로써, 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 생산하는 단계; 및

가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.

49. 옵션 48에 있어서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.7 배인, 방법.

50. 옵션 49에 있어서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 배지가 5% 이하의 농도의 혈청을 함유할 때 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.9 배인, 방법.

51. 옵션들 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계는 세포 증식 또는 세포 계대배양 없이 수행되는, 방법.

52. 옵션들 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 혈청은 적어도 약 5일 동안 점진적으로 감소되는, 방법.

53. 옵션들 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계인, 방법.

54. 옵션들 48 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 용액 내의 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있는, 방법.

55. 옵션들 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함하며, 상기 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 갖는, 방법.

56. 옵션들 48 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 ECM을 제조하는 단계는 (나노구조체들을 배제하지 않기 위해) 살균-여과 없이 수행되는, 방법.

57. 옵션들 48 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시키는 단계는 살균-여과 없이 수행되는, 방법.

58. 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액에 있어서, 용액 내의 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계에 있고, 용액 내의 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있고, 용액은 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들 - 상기 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 가짐 -을 포함하는, 용액.

59. 옵션 58에 있어서, 상기 가용성 ECM은 옵션들 48-57 중 어느 하나의 방법에 따라 제조되는 용액.

60. 옵션들 1 내지 19, 26 내지 47, 또는 48 내지 57 중 어느 하나에 있어서, ECM을 섬유아세포들(예컨대 생산 섬유아세포들)로부터 단리시키는 단계는 ECM을 기재 또는 고상으로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.

61. 옵션들 1 내지 19, 26 내지 47, 48 내지 57, 또는 60 중 어느 하나에 있어서, 섬유아세포들(예컨대 생산 섬유아세포들)로부터의 단리 시, ECM은 임의의 기재 또는 고상으로부터 분리되는(예를 들어, 이에 결합되지 않는), 방법.

62. 옵션들 1 내지 19, 26 내지 47, 48 내지 57, 또는 60 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 섬유아세포들(예컨대 생산 섬유아세포들)로부터의 단리 시, 단리된 ECM은 임의의 프로테아제에 의해 소화되지 않았고, 따라서 온전한, 방법.

63. 옵션들 1 내지 19, 26 내지 47, 또는 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 생산 섬유아세포들의 적어도 10 리터, 예를 들어 생산 섬유아세포 배양물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 10, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 리터(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들, 예를 들어 10 내지 1,000 리터, 10 내지 500 리터, 10 내지 200 리터, 50 내지 1,000 리터, 50 내지 500 리터, 50 내지 200 리터, 100 내지 1,000 리터, 100 내지 500 리터, 또는 100 내지 200 리터를 포함)가 배양되는, 방법.

64. 옵션들 48 내지 57, 또는 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, ECM을 생산하는 적어도 10 리터의 섬유아세포들이 배양되는, 방법.

65. 옵션들 1 내지 19, 26 내지 47, 또는 60 내지 64 중 어느 하나에 있어서, ECM의 적어도 50 g, 예를 들어 ECM의 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000, 4,000, 또는 5,000 g(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들을 포함)이 생산되는, 방법.

66. 옵션들 48 내지 57, 또는 60 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 가용성 ECM의 적어도 50 g, 예를 들어 가용성 ECM의 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 3,000, 4,000, 또는 5,000 g(열거된 값들 중 임의의 2개의 값들 사이의 범위들을 포함)이 생산되는, 방법.

실시예들

실시예 1

인간 섬유아세포들은 단일 공여자의 피부 생검으로부터 유래된다. 섬유아세포들은 그들을 풋프린트가 없는 iPSC들로 유도하기 위해, Oct4, Sox2, 및 c-Myc mRNA와 접촉된다. 풋프린트가 없는 iPSC들은 30배로부터 증식되고, iPSC들은 뱅킹된다. 상업적-규모의 양의 iPSC들은 그들이 섬유아세포들로 분화하도록 유도하기 위해 결합 조직 성장 인자(connective tissue growth factor; CTGF)와 접촉된다. 섬유아세포들은 덱스트란 미세담체 기재들 포함하는 배지에서 배양되고, 성숙한 ECM을 생산하도록 진행된다. ECM은 배양물에서 불용성이다. 덱스트란 미세담체들은 덱스트라나아제를 사용하여 소화된다. 성숙한 ECM을 포함하는 잔류 불용성 분획은 회수된다. 이와 같이, 성숙한 ECM을 포함하는 배양물의 불용성 분획은 섬유아세포들 및 가용성 성분들로부터 단리된다. 따라서, 성숙한 ECM이 제조되고, 의료 및 미용 제품들에서 사용하기에 적합하다.

실시예 2

인간 섬유아세포들은 소분자 칵테일 "VC6TF"(V, VPA; C, CHIR99021 또는 CHIR; 6, 616452; T, 트라닐시프로민; F, 포스콜린)를 사용하여 풋프린트가 없는 iPSC들로 화학적으로 역분화된다. iPSC들은 상업적 생산 규모로 증식되고, 액화-질소 급속 냉동 보존으로 뱅킹된다. 상업적 양의 iPSC들이 회수되고, CTGF를 사용하여 섬유아세포들로 분화된다. 섬유아세포들은 덱스트란 미세담체 기재들을 포함하는 혈청-프리, 제노-프리 배지들에서 배양된다. 섬유아세포들이 기재들의 2개 이상의 표면들에 걸쳐 충분한 밀도에 도달할 때, 섬유아세포들의 약 90%는 세포 주기의 G₀기에 진입한다. 이 지점에서, 만료된 혈액으로부터의 풀링된 인간 혈청은 2% 혈청의 농도(v/v)까지 섬유아세포 배양물에 첨가된다. 아스코르브산은 혈청과 함께 배양물에 첨가된다. 세포들은 혈청에서 추가 8주 동안 배양되고, 성숙한 ECM을 생산한다. 성숙한 ECM은 세포 배양물로부터 단리되고, 그 후에 미용 제품들을 제조하기 위해 사용된다.

실시예 3

인간 섬유아세포들은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 단일 공여자 인간 iPSC들로부터 유래된다. 섬유아세포들은 2% 우태아 혈청에서 배양되고, 성숙한 ECM을 생산한다. 10일 동안 매일, 혈청-함유 배지의 절반은 혈청이 없는 배지로 대체된다. 이와 같이, 대체 10일 후, 2% 혈청이 2¹⁰배로 감소됨으로써, 배양물은 0.002% 미만의 혈청을 함유하는 것으로 추정된다. 점진적인 혈청 대체가 완료된 후, 섬유아세포들은 6주 동안 (0.002% 미만의 혈청의 추정치를 함유하는) 배지에서 배양된다. 가용성 ECM은 폐배지들로부터 회수된다. 추가적으로, ECM을 포함하는 큰 구조체들(직경 200 nm 내지 10,000 nm)이 배지들에 존재하며, 따라서 ECM의 단리는 멸균 여과 없이 수행된다.

일부 실시예들에서, 방법, 용도, 또는 조성물은 (다수의 단계들 또는 특징들과 대조적으로) 단일 단계들 또는 특징들로 존재하는 다양한 단계들 또는 특징들을 포함한다. 예를 들어, 일 실시예에서, 방법은 흐름 조절제(flow modulator)의 단일 투여를 포함하거나, 조성물은 단일 사용을 위한 흐름 조절제를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된다. 흐름 조절제는 흐름을 증가(또는 면역 세포 이동을 감소)시키는 데 효과적인 단일 투여 유닛으로 존재할 수 있다. 조성물 또는 용도는 본원에서 설명된 바와 같이 흐름을 증가(또는 면역 세포의 이동을 억제)시키는 데 효과적인 흐름 조절제의 단일 투여 유닛을 포함할 수 있다. 다수의 특징들 또는 구성요소들이 대안적인 실시예들에서 제공된다. 일부 실시예들에서, 방법, 조성물, 또는 용도는 흐름 조절을 위한 하나 이상의 수단을 포함한다. 일부 실시예들에서, 수단은 흐름 조절제를 포함한다.

다양한 양태들 및 실시예들이 본원에 개시되었지만, 다른 양태들 및 실시예들은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 개시되는 다양한 양태들 및 실시예들은 예시의 목적들을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범위 및 사상은 다음의 청구항들에 의해 지시된다. 본원에 설명되는 각각의 방법에 대해, 방법에 사용하기 위한 관련 조성물들이 명백히 고려되고, 방법에서 조성물들의 사용, 및, 해당될 경우, 방법에서 사용하기 위한 약제를 제조하는 방법들이 또한 명백히 고려된다. 예를 들어, 흐름 조절제를 포함하는 흐름을 증가시키는 방법들의 경우, 대응 방법에서 사용하기 위한 흐름 조절제들은, 방법에 따라 흐름을 증가시킬 시 흐름 조절제의 용도들과 마찬가지로, 흐름을 증가시킬 시 사용하기 위한 흐름 조절제를 포함하는 약제를 제조하는 방법들로서 또한 고려된다.

당업자는 본원에 개시되는 이러한 및 다른 프로세스들 그리고 방법들에 대해, 프로세스들 및 방법들에서 수행되는 기능들이 상이한 순서로 구현될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 개략적인 단계들 및 동작들은 단지 예들로서 제공되고, 단계들 및 동작들 중 일부는 선택적이거나, 더 적은 단계들 및 동작들로 결합되거나, 개시된 실시예들의 본질을 손상시키는 것 없이 추가적인 단계들 및 동작들로 확장될 수 있다.

본원에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어들의 사용과 관련하여, 당업자들은 맥락 및/또는 적용에 적절한 바와 같이 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열들(permutations)이 명료성을 위해 본원에 명백히 진술될 수 있다.

일반적으로, 본원, 및 특히 첨부된 청구항들(예를 들어, 첨부된 청구항들의 본문들)에 사용되는 용어들은 일반적으로 "개방형" 용어들(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는" 것으로서 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로서 해석되어야 하는 등)로서 의도된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 특정 수의 도입 청구항 인용이 의도된 경우, 그러한 의도는 청구항에서 명시적으로 인용될 것이고, 그러한 인용의 부재 시 그러한 의도가 존재하지 않는다는 것이 당업자에 의해 더 이해될 것이다. 예를 들어, 이해에 대한 도움으로써, 다음의 첨부된 청구항들은 청구항 인용들을 도입하기 위해 도입 구들(introductory phrases)인 "적어도 하나" 및 "하나 이상의" 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 구들의 사용은 부정 관사들 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 인용의 도입이 심지어 동일한 청구항이 도입 구들인 "하나 이상의" 또는 "적어도 하나" 및 "a" 또는 "an"(예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상의"를 의미하도록 해석되어야 함)과 같은 부정관사들을 포함하는 경우에도, 그러한 도입 청구항 인용을 포함하는 임의의 특정 청구항을 하나의 그러한 인용만을 포함하는 실시예들로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며; 청구항 인용들을 도입하기 위해 사용되는 정관사들의 사용에 대해서도 마찬가지다. 게다가, 도입 청구항 인용의 특정 수가 명시적으로 인용되는 경우에도, 당업자들은 그러한 인용이 적어도 인용된 수를 의미하도록 해석되어야 한다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 다른 수식어들이 없는, "2 개의 인용들"의 베어 인용들(bare recitation)은 적어도 2 개의 인용들, 또는 2 개 이상의 인용들을 의미함). 더욱이, "A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙(convention)이 사용되는 그 경우들에서, 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A만, B만, C만, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템들을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것임). "A, B, 또는 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용되는 그 경우들에서, 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 규칙을 이해할 것이라는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A만, B만, C만, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템들을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것임). 2개 이상의 대체 용어들을 나타내는 사실상 임의의 분리형 단어 및 어구는, 명세서, 청구항, 또는 도면에 있어서든, 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나, 또는 용어 둘 다를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 당업자에 의해 더 이해될 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

게다가, 본 개시의 특징들 또는 양태들이 마쿠시 그룹들(Markush groups)에 관하여 설명되는 경우, 당업자들은 본 개시가 또한 이에 의해 마쿠시 그룹의 개별 멤버 또는 멤버들의 서브그룹에 관하여 설명된다는 것을 인식할 것이다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적들을 위해, 예컨대 서면 설명을 제공하는 것에 관하여, 본원에 개시되는 모든 범위들은 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위들 및 그 하위범위들의 조합을 망라한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위를 충분히 설명하고 이들이 적어도 동일한 2분의 1, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 분해될 수 있게 함으로써 쉽게 이해될 수 있다. 비제한 예로서, 본원에 논의되는 각각의 범위는 하부 3분점, 중앙 3분점 및 상부 3분점 등으로 쉽게 분해될 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도" 등과 같은 모든 언어는 언급된 번호를 포함하고 위에 논의된 바와 같은 하위범위들로 이후에 분해될 수 있는 범위들을 언급한다. 예를 들어, "약 5"는 숫자 5를 포함할 것이다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 번호를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3개의 세포들을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3 개의 세포들을 갖는 그룹들을 언급한다. 유사하게, 1 내지 5개의 세포들을 갖는 그룹들은 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 세포들 등등을 갖는 그룹들을 언급한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "대략", "약", 및 "실질적으로"와 같은 용어를 앞세우는 번호들은 인용된 번호들을 포함하고(예를 들어, 약 10% = 10%), 또한 여전히 원하는 기능을 수행하고 원하는 결과를 달성하는 언급된 양에 가까운 양을 나타낸다. 예를 들어, 용어들 "대략", "약", 및 "실질적으로"는 진술된 양의 10% 미만 내, 5% 미만 내, 1% 미만 내, 0.1% 미만 내, 및 0.01% 미만 내에 있는 양을 언급할 수 있다.

이상으로부터, 본 개시의 다양한 실시예들이 예시의 목적을 위해 본원에서 설명되었고, 다양한 변형들이 본 개시의 범위 및 사상으로부터 벗어나는 것 없이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본원에 개시되는 다양한 실시예들은 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범위 및 사상은 다음의 청구항들에 의해 지시된다.

<110> BREAKTHROUGH TECH, LLC <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR <130> IP200011 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1464 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp 20 25 30 Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His 35 40 45 Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp 50 55 60 Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn 65 70 75 80 Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro 85 90 95 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly 100 105 110 Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala 145 150 155 160 Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser 165 170 175 Val Pro 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2110 Val Ile Ser Leu Gly Ser Thr Arg Lys Asp Asp Met Glu Glu Leu Ala 2115 2120 2125 Ser Tyr Pro Leu Asp Gln His Leu Ile Gln Leu Gly Arg Ile His Lys 2130 2135 2140 Pro Asp Leu Asn Tyr Ile Ala Lys Phe Leu Lys Pro Phe Leu Tyr Ser 2145 2150 2155 2160 Val Arg Arg Gly Phe Asn Gln Tyr Pro Pro Pro Met Leu Glu Asp Ala 2165 2170 2175 Cys Arg Leu Ile Asn Leu Gly Gly Glu Asn Ile Gln Asn Asp Gly Phe 2180 2185 2190 Gln Phe Val Thr Glu Leu Gln Glu Asp Phe Leu Gly Gly Asn Gly Phe 2195 2200 2205 Ile Gly Gln Glu Leu Asn Ser Gly Arg Glu Ser Pro Phe Val Lys Thr 2210 2215 2220 Glu Asp Asn Gly Ser Asp Tyr Leu Val Tyr Leu Pro Ser Gln Met Phe 2225 2230 2235 2240 Glu Pro Gln Lys Leu Met Ile Asn Tyr Glu Lys Asp Gln Lys Ser Ala 2245 2250 2255 Glu Ile Ala Ser Leu Thr Ser Gly His Glu Asn Tyr Gly Arg Lys Glu 2260 2265 2270 Glu Pro Asp His Thr Tyr Glu Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Glu Tyr 2275 2280 2285 Tyr Met Asp Val Ala Phe Leu Ile Asp Ala Ser Gln Arg Val Gly Ser 2290 2295 2300 Asp Glu Phe Lys Glu Val Lys Ala Phe Ile Thr Ser Val Leu Asp Tyr 2305 2310 2315 2320 Phe His Ile Ala Pro Thr Pro Leu Thr Ser Thr Leu Gly Asp Arg Val 2325 2330 2335 Ala Val Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Tyr Met Pro Asn Thr Glu Glu 2340 2345 2350 Cys Pro Val Tyr Leu Glu Phe Asp Leu Val Thr Tyr Asn Ser Ile His 2355 2360 2365 Gln Met Lys His His Leu Gln Asp Ser Gln Gln Leu Asn Gly Asp Val 2370 2375 2380 Phe Ile Gly His Ala Leu Gln Trp Thr Ile Asp Asn Val Phe Val Gly 2385 2390 2395 2400 Thr Pro Asn Leu Arg Lys Asn Lys Val Ile Phe Val Ile Ser Ala Gly 2405 2410 2415 Glu Thr Asn Ser Leu Asp Lys Asp Val Leu Arg Asn Val Ser Leu Arg 2420 2425 2430 Ala Lys Cys Gln Gly Tyr Ser Ile Phe Val Phe Ser Phe Gly Pro Lys 2435 2440 2445 His Asn Asp Lys Glu Leu Glu Glu Leu Ala Ser His Pro Leu Asp His 2450 2455 2460 His Leu Val Gln Leu Gly Arg Thr His Lys Pro Asp Trp Asn Tyr Ile 2465 2470 2475 2480 Ile Lys Phe Val Lys Pro Phe Val His Leu Ile Arg Arg Ala Ile Asn 2485 2490 2495 Lys Tyr Pro Thr Glu Asp Met Lys Ala Thr Cys Val Asn Met Thr Ser 2500 2505 2510 Pro Asn Pro Glu Asn Gly Gly Thr Glu Asn Thr Val Leu Leu Leu Pro 2515 2520 2525 Gly Ile Tyr Glu Ile Lys Thr Glu Asn Gly Asp Leu Phe Asp Glu Phe 2530 2535 2540 Asp Ser Gln Ala Gln His Leu Leu Val Leu Gly Asn Asn His Ser Ser 2545 2550 2555 2560 Gly Ser Glu Thr Ala Thr Asp Leu Met Gln Lys Leu Tyr Leu Leu Phe 2565 2570 2575 Ser Thr Glu Lys Leu Ala Met Lys Asp Lys Glu Lys Ala His Leu Glu 2580 2585 2590 Glu Ile Ser Ala Leu Val Val Asp Lys Gln Gln Glu Lys Glu Asp Lys 2595 2600 2605 Glu Met Glu Ala Thr Asp Ile 2610 2615 <210> 17 <211> 2263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Met Leu Leu Ile Leu Phe Leu Val Ile Ile Cys Ser His Ile Ser 1 5 10 15 Val Asn Gln Asp Ser Gly Pro Glu Tyr Ala Asp Val Val Phe Leu Val 20 25 30 Asp Ser Ser Asp Arg Leu Gly Ser Lys Ser Phe Pro Phe Val Lys Met 35 40 45 Phe Ile Thr Lys Met Ile Ser Ser Leu Pro Ile Glu Ala Asp Lys Tyr 50 55 60 Arg Val Ala Leu Ala Gln Tyr Ser Asp Lys Leu His Ser Glu Phe His 65 70 75 80 Leu Ser Thr Phe Lys Gly Arg Ser Pro Met Leu Asn His Leu Arg Lys 85 90 95 Asn Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ser Leu Gln Ile Gly Lys Ala Leu Gln 100 105 110 Glu Ala His Arg Thr Tyr Phe Ser Ala Pro Ala Asn Gly Arg Asp Lys 115 120 125 Lys Gln Phe Pro Pro Ile Leu Val Val Leu Ala Ser Ser Glu Ser Glu 130 135 140 Asp Asn Val Glu Glu Ala Ser Lys Ala Leu Arg Lys Asp Gly Val Lys 145 150 155 160 Ile Ile Ser Val Gly Val Gln Lys Ala Ser Glu Glu Asn Leu Lys Ala 165 170 175 Met Ala Thr Ser Gln Phe His Phe Asn Leu Arg Thr Val Arg Asp Leu 180 185 190 Ser Met Phe Ser Gln Asn Met Thr His Ile Ile Lys Asp Val Ile Lys 195 200 205 Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Asp Ile Phe Val Glu Ala Cys Gln Gly 210 215 220 Pro Ser Met Ala Asp Val Val Phe Leu Leu Asp Met Ser Ile Asn Gly 225 230 235 240 Ser Glu Glu Asn Phe Asp Tyr Leu Lys Gly Phe Leu Glu Glu Ser Val 245 250 255 Ser Ala Leu Asp Ile Lys Glu Asn Cys Met Arg Val Gly Leu Val Ala 260 265 270 Tyr Ser Asn Glu Thr Lys Val Ile Asn Ser Leu Ser Met Gly Ile Asn 275 280 285 Lys Ser Glu Val Leu Gln His Ile Gln Asn Leu Ser Pro Arg Thr Gly 290 295 300 Lys Ala Tyr Thr Gly Ala Ala Ile Lys Lys Leu Arg Lys Glu Val Phe 305 310 315 320 Ser Ala Arg Asn Gly Ser Arg Lys Asn Gln Gly Val Pro Gln Ile Ala 325 330 335 Val Leu Val Thr His Arg Asp Ser Glu Asp Asn Val Thr Lys Ala Ala 340 345 350 Val Asn Leu Arg Arg Glu Gly Val Thr Ile Phe Thr Leu Gly Ile Glu 355 360 365 Gly Ala Ser Asp Thr Gln Leu Glu Lys Ile Ala Ser His Pro Ala Glu 370 375 380 Gln Tyr Val Ser Lys Leu Lys Thr Phe Ala Asp Leu Ala Ala His Asn 385 390 395 400 Gln Thr Phe Leu Lys Lys Leu Arg Asn Gln Ile Thr His Thr Val Ser 405 410 415 Val Phe Ser Glu Arg Thr Glu Thr Leu Lys Ser Gly Cys Val Asp Thr 420 425 430 Glu Glu Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Thr Gln 435 440 445 Ala Thr Asp Phe His Glu Met Lys Thr Phe Leu Ser Glu Val Val Gly 450 455 460 Met Phe Asn Ile Ala Pro His Lys Val Arg Val Gly Ala Val Gln Tyr 465 470 475 480 Ala Asp Ser Trp Asp Leu Glu Phe Glu Ile Asn Lys Tyr Ser Asn Lys 485 490 495 Gln Asp Leu Gly Lys Ala Ile Glu Asn Ile Arg Gln Met Gly Gly Asn 500 505 510 Thr Asn Thr Gly Ala Ala Leu Asn Phe Thr Leu Ser Leu Leu Gln Lys 515 520 525 Ala Lys Lys Gln Arg Gly Asn Lys Val Pro Cys His Leu Val Val Leu 530 535 540 Thr Asn Gly Met Ser Lys Asp Ser Ile Leu Glu Pro Ala Asn Arg Leu 545 550 555 560 Arg Glu Glu His Ile Arg Val Tyr Ala Ile Gly Ile Lys Glu Ala Asn 565 570 575 Gln Thr Gln Leu Arg Glu Ile Ala Gly Glu Glu Lys Arg Val Tyr Tyr 580 585 590 Val His Asp Phe Asp Ala Leu Lys Asp Ile Arg Asn Gln Val Val Gln 595 600 605 Glu Ile Cys Thr Glu Glu Ala Cys Lys Glu Met Lys Ala Asp Ile Met 610 615 620 Phe Leu Val Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Pro Glu Asn Phe Ser Lys 625 630 635 640 Met Lys Thr Phe Met Lys Asn Leu Val Ser Lys Ser Gln Ile Gly Pro 645 650 655 Asp Arg Val Gln Ile Gly Val Val Gln Phe Ser Asp Ile Asn Lys Glu 660 665 670 Glu Phe Gln Leu Asn Arg Phe Met Ser Gln Ser Asp Ile Ser Asn Ala 675 680 685 Ile Asp Gln Met Ala His Ile Gly Gln Thr Thr Leu Thr Gly Ser Ala 690 695 700 Leu Ser Phe Val Ser Gln Tyr Phe Ser Pro Thr Lys Gly Ala Arg Pro 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915 920 925 Leu Asn Ala Thr Ala Lys Ala Leu Arg Asp Lys Gly Ile Leu Val Leu 930 935 940 Ala Val Gly Ile Asp Gly Ala Asn Pro Val Glu Leu Leu Ala Met Ala 945 950 955 960 Gly Ser Ser Asp Lys Tyr Phe Phe Val Glu Thr Phe Gly Gly Leu Lys 965 970 975 Gly Ile Phe Ser Asp Val Thr Ala Ser Val Cys Asn Ser Ser Lys Val 980 985 990 Asp Cys Glu Ile Asp Lys Val Asp Leu Val Phe Leu Met Asp Gly Ser 995 1000 1005 Thr Ser Ile Gln Pro Asn Asp Phe Lys Lys Met Lys Glu Phe Leu Ala 1010 1015 1020 Ser Val Val Gln Asp Phe Asp Val Ser Leu Asn Arg Val Arg Ile Gly 1025 1030 1035 1040 Ala Ala Gln Phe Ser Asp Thr Tyr His Pro Glu Phe Pro Leu Gly Thr 1045 1050 1055 Phe Ile Gly Glu Lys Glu Ile Ser Phe Gln Ile Glu Asn Ile Lys Gln 1060 1065 1070 Ile Phe Gly Asn Thr His Ile Gly Ala Ala Leu Arg Glu Val Glu His 1075 1080 1085 Tyr Phe Arg Pro Asp Met Gly Ser Arg Ile Asn Thr Gly Thr Pro Gln 1090 1095 1100 Val Leu Leu Val Leu Thr Asp Gly Gln Ser Gln Asp Glu Val Ala Gln 1105 1110 1115 1120 Ala Ala Glu Ala Leu Arg His Arg Gly Ile Asp Ile Tyr Ser Val Gly 1125 1130 1135 Ile Gly Asp Val Asp Asp Gln Gln Leu Ile Gln Ile Thr Gly Thr Ala 1140 1145 1150 Glu Lys Lys Leu Thr Val His Asn Phe Asp Glu Leu Lys Lys Val Asn 1155 1160 1165 Lys Arg Ile Val Arg Asn Ile Cys Thr Thr Ala Gly Glu Ser Asn Cys 1170 1175 1180 Phe Val Asp Val Val Val Gly Phe Asp Val Ser Thr Gln Glu Lys Gly 1185 1190 1195 1200 Gln Thr Leu Leu Glu Gly Gln Pro Trp Met Glu Thr Tyr Leu Gln Asp 1205 1210 1215 Ile Leu Arg Ala Ile Ser Ser Leu Asn Gly Val Ser Cys Glu Val Gly 1220 1225 1230 Thr Glu Thr Gln Val Ser Val Ala Phe Gln Val Thr Asn Ala Met Glu 1235 1240 1245 Lys Tyr Ser Pro Lys Phe Glu Ile Tyr Ser Glu Asn Ile Leu Asn Ser 1250 1255 1260 Leu Lys Asp Ile Thr Val Lys Gly Pro Ser Leu Leu Asn Ala Asn Leu 1265 1270 1275 1280 Leu Asp Ser Leu Trp Asp Thr Phe Gln Asn Lys Ser Ala Ala Arg Gly 1285 1290 1295 Lys Val Val Leu Leu Phe Ser Asp Gly Leu Asp Asp Asp Val Glu Lys 1300 1305 1310 Leu Glu Gln Lys Ser Asp Glu Leu Arg Lys Glu Gly Leu Asn Ala Leu 1315 1320 1325 Ile Thr Val Ala Leu Asp Gly Pro Ala Asp Ser Ser Asp Leu Ala Asp 1330 1335 1340 Leu Pro Tyr Ile Glu Phe Gly Lys Gly Phe Glu Tyr Arg Thr Gln Leu 1345 1350 1355 1360 Ser Ile Gly Met Arg Glu Leu Gly Ser Arg Leu Ser Lys Gln Leu Val 1365 1370 1375 Asn Val Ala Glu Arg Thr Cys Cys Cys Leu Phe Cys Lys Cys Ile Gly 1380 1385 1390 Gly Asp Gly Thr Met Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Lys Arg Gly Pro 1395 1400 1405 Pro Gly Phe Lys Gly Ser Glu Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ile Ala 1410 1415 1420 Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Glu Gln Gly Thr Lys Gly 1425 1430 1435 1440 Cys Tyr Gly Thr Lys Gly Pro Lys Gly Asn Arg Gly Leu Asn Gly Gln 1445 1450 1455 Glu Gly Glu Val Gly Glu Asn Gly Ile Asp Gly Leu Asn Gly Glu Gln 1460 1465 1470 Gly Asp Asn Gly Leu Pro Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Asp Glu Gly 1475 1480 1485 Ser Gln Gly Ser Pro Gly Lys Arg Gly Thr Pro Gly Asp Arg Gly Ala 1490 1495 1500 Lys Gly Leu Arg Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Val Asp Ser Ser Ile 1505 1510 1515 1520 Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Gly Glu Arg Gly Arg Gln Gly Arg Arg 1525 1530 1535 Gly Trp Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Arg Lys Thr Ala 1540 1545 1550 Ala His Gly Arg Arg Gly His Thr Gly Pro Gln Gly Thr Ala Gly Ile 1555 1560 1565 Pro Gly Pro Asp Gly Leu Glu Gly Ser Leu Gly Leu Lys Gly Pro Gln 1570 1575 1580 Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Val Lys Gly Glu Lys Gly Gly Val Gly 1585 1590 1595 1600 Ser Lys Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gly Gly Glu Ala Gly Asn 1605 1610 1615 Gln Gly Arg Leu Gly Ser Gln Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Asp Leu 1620 1625 1630 Gly Glu Lys Gly Ala Val Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Leu Gln Gly 1635 1640 1645 Asn Asp Gly Ser Pro Gly Tyr Gly Ser Val Gly Arg Lys Gly Ala Lys 1650 1655 1660 Gly Gln Glu Gly Phe Pro Gly Glu Ser Gly Pro Lys Gly Glu Ile Gly 1665 1670 1675 1680 Asp Pro Gly Gly Pro Gly Glu Thr Gly Leu Lys Gly Ala Arg Gly Lys 1685 1690 1695 Met Ile Ser Ala Gly Leu Pro Gly Glu Met Gly Ser Pro Gly Glu Pro 1700 1705 1710 Gly Pro Pro Gly Arg Lys Gly Val Lys Gly Ala Lys Gly Leu Ala Ser 1715 1720 1725 Phe Ser Thr Cys Glu Leu Ile Gln Tyr Val Arg Asp Arg Ser Pro Gly 1730 1735 1740 Arg His Gly Lys Pro Glu Cys Pro Val His Pro Thr Glu Leu Val Phe 1745 1750 1755 1760 Ala Leu Asp His Ser Arg Asp Val Thr Glu Gln Glu Phe Glu Arg Met 1765 1770 1775 Lys Glu Met Met Ala Phe Leu Val Arg Asp Ile Lys Val Arg Glu Asn 1780 1785 1790 Ser Cys Pro Val Gly Ala His Ile Ala Ile Leu Ser Tyr Asn Ser His 1795 1800 1805 Ala Arg His Leu Val Arg Phe Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ser Gln Leu 1810 1815 1820 Leu Arg Glu Ile Glu Thr Ile Pro Tyr Glu Arg Ser Ser Ala Ser Arg 1825 1830 1835 1840 Glu Ile Gly Arg Ala Met Arg Phe Ile Ser Arg Asn Val Phe Lys Arg 1845 1850 1855 Thr Leu Pro Gly Ala His Thr Arg Lys Ile Ala Thr Phe Phe Ser Ser 1860 1865 1870 Gly Gln Ser Ala Asp Ala His Ser Ile Thr Thr Ala Ala Met Glu Phe 1875 1880 1885 Gly Ala Leu Glu Ile Ile Pro Val Val Ile Thr Phe Ser Asn Val Pro 1890 1895 1900 Ser Val Arg Arg Ala Phe Ala Ile Asp Asp Thr Gly Thr Phe Gln Val 1905 1910 1915 1920 Ile Val Val Pro Ser Gly Ala Asp Tyr Ile Pro Ala Leu Glu Arg Leu 1925 1930 1935 Gln Arg Cys Thr Phe Cys Tyr Asp Val Cys Lys Pro Asp Ala Ser Cys 1940 1945 1950 Asp Gln Ala Arg Pro Pro Pro Val Gln Ser Tyr Met Asp Ala Ala Phe 1955 1960 1965 Leu Leu Asp Ala Ser Arg Asn Met Gly Ser Ala Glu Phe Glu Asp Ile 1970 1975 1980 Arg Ala Phe Leu Gly Ala Leu Leu Asp His Phe Glu Ile Thr Pro Glu 1985 1990 1995 2000 Pro Glu Thr Ser Val Thr Gly Asp Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ala 2005 2010 2015 Pro Pro Asp Phe Leu Pro Asn Thr Gln Lys Ser Pro Val Arg Ala Glu 2020 2025 2030 Phe Asn Leu Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Arg Leu Met Lys Arg His Val 2035 2040 2045 His Glu Ser Val Lys Gln Leu Asn Gly Asp Ala Phe Ile Gly His Ala 2050 2055 2060 Leu Gln Trp Thr Leu Asp Asn Val Phe Leu Ser Thr Pro Asn Leu Arg 2065 2070 2075 2080 Arg Asn Lys Val Ile Phe Val Ile Ser Ala Gly Glu Thr Ser His Leu 2085 2090 2095 Asp Gly Glu Ile Leu Lys Lys Glu Ser Leu Arg Ala Lys Cys Gln Gly 2100 2105 2110 Tyr Ala Leu Phe Val Phe Ser Leu Gly Pro Ile Trp Asp Asp Lys Glu 2115 2120 2125 Leu Glu Asp Leu Ala Ser His Pro Leu Asp His His Leu Val Gln Leu 2130 2135 2140 Gly Arg Ile His Lys Pro Asp His Ser Tyr Gly Val Lys Phe Val Lys 2145 2150 2155 2160 Ser Phe Ile Asn Ser Ile Arg Arg Ala Ile Asn Lys Tyr Pro Pro Ile 2165 2170 2175 Asn Leu Lys Ile Lys Cys Asn Arg Leu Asn Ser Ile Asp Pro Lys Gln 2180 2185 2190 Pro Pro Arg Pro Phe Arg Ser Phe Val Pro Gly Pro Leu Lys Ala Thr 2195 2200 2205 Leu Lys Glu Asp Val Leu Gln Lys Ala Lys Phe Phe Gln Asp Lys Lys 2210 2215 2220 Tyr Leu Ser Arg Val Ala Arg Ser Gly Arg Asp Asp Ala Ile Gln Asn 2225 2230 2235 2240 Phe Met Arg Ser Thr Ser His Thr Phe Lys Asn Gly Arg Met Ile Glu 2245 2250 2255 Ser Ala Pro Lys Gln His Asp 2260

Claims

세포외 기질(extracellular matrix)을 제조하는 방법으로서,
유도 다능성 줄기 세포들(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)을 생산 섬유아세포로 분화시키는 단계;
생산 섬유아세포들을 배양하여, 생산 섬유아세포들이 세포외 기질(ECM)을 생산하는 단계; 및
ECM을 생산 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 iPSC들을 상기 생산 섬유아세포로 분화시키기 전에 상기 iPSC들을 형성하기 위해 전구체 섬유아세포를 역분화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 분화 단계 전에 상기 iPSC들을 증식시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 분화 단계 전에 상기 iPSC들의 뱅크를 구성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 분화된 iPSC들만이 단일 공여자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 생산 섬유아세포들의 상기 배양 단계는 정상산소에서 있는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 생산 섬유아세포들을 배양하는 단계는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 배양하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 iPSC들은 풋프린트가 없는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
배아 줄기(embryonic stem; ES) 세포, 골수 다능성 줄기 세포, ES-유래 MSC, 또는 비-다능성 신생아 포피 섬유아세포 세포주 중 임의의 것을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하는 방법으로서,
섬유아세포들 및/또는 중간엽 줄기 세포들(mesenchymal stem cells; MSCs)을 기재(substrate) - 상기 기재는 적어도 2 개의 표면들을 포함함 - 상에 배양하는 단계로서, 상기 배양 단계는 상기 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 적어도 2 개의 표면들에 걸쳐 3 차원 형상을 정의하고 섬유아세포들 및/또는 MSC들의 적어도 80%가 그들의 세포 주기를 정지시킬 때까지, 혈청-프리 및 제노-프리인 배양 단계;
그후에, 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 적어도 약 2주 동안 혈청과 접촉시켜, 이에 의해 섬유아세포들 및/또는 MSC들이 가용성의 성숙한 ECM을 생산함으로써, 가용성의 성숙한 ECM 및 섬유아세포들 또는 MSC들을 포함하는 용액 - 상기 용액은 제노-프리임 -을 생산하는 단계; 및
가용성의 성숙한 ECM을 생산 섬유아세포로부터 단리시킴으로써, ECM - ECM은 성숙한 제노-프리 ECM임 -을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
인간 다능성 세포 배양물을 증식시킴으로써 - 상기 증식은 혈청-프리 및 제노-프리임 -, 인간 다능성 세포들을 생산하는 단계; 및
인간 다능성 세포들을 분화 인자들과 접촉시켜, 이에 의해 인간 다능성 세포들이 상기 섬유아세포들 또는 MSC들로 분화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 섬유아세포들 및/또는 MSC들을 혈청과 접촉시키는 단계는 적어도 약 8주 동안인 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 인간 다능성 세포들은 유도 다능성 줄기 세포들(induced pluripotent stem cells; iPSCSs)을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 성숙한 제노-프리 ECM을 포함하는 미용 조성물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 성숙한 제노-프리 ECM은 COL1의 c-말단 프로펩티드, 또는 삼중 나선 또는 비-환원성 감마형의 원섬유성 콜라겐, 또는 둘 다를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 다능성 세포들은 단일 공여자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 제조하는 방법으로서,
섬유아세포들을 일정 농도의 혈청을 포함하는 배지에 제공하는 단계;
배지가 혈청의 농도의 5% 이하를 함유할 때까지 섬유아세포들을 포함하는 배지에서 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계;
상기 점진적으로 감소시키는 단계 다음에, 섬유아세포들을 적어도 약 2주 동안 배양하여 섬유아세포들이 가용성 ECM을 생산함으로써, 섬유아세포들 및 가용성 ECM을 포함하는 용액을 생산하는 단계; 및
가용성 ECM을 섬유아세포들로부터 단리시킴으로써, ECM을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 혈청의 양을 점진적으로 감소시키기 시작할 때 상기 배지 내의 섬유아세포들의 양은, 상기 배지가 5% 이하의 농도의 상기 혈청을 함유할 때 상기 배지 내의 섬유아세포들의 양의 적어도 0.7 배인 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 혈청의 양을 점진적으로 감소시키는 단계는 세포 증식 또는 세포 계대배양 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 용액 내의 상기 섬유아세포들의 적어도 약 90%는 G₀ 세포 주기 단계인 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 용액 내의 상기 섬유아세포들의 1% 미만은 세포사멸을 겪고 있는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.
제18항에 있어서,
상기 용액은 상기 가용성 ECM을 포함하는 나노구조체들을 포함하며, 상기 나노구조체들은 200 nm 내지 10,000 nm의 최대 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 세포외 기질을 제조하는 방법.