KR20200092302A - 다중-특이적 항체 및 이들의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

다중-특이적 항체 및 이들의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 N-말단 및 C-말단을 가지는 사중-특이적(tetra-specific) 항체 단량체로서, N-말단에서 C-말단으로 나란히 N-말단에 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, Fc 도메인, 및 C-말단에 제3 scFv 도메인을 포함하며, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각이 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가지는 사중-특이적 항체 단량체를 제공한다. 하나의 구현예에서 항원은 종양 항원, 면역 신호전달 항원 또는 이들의 조합이다. 하나의 구현예에서, 항원은 CD19, CD3, CD137, 4-1BB, 및 PD-L1을 포함한다. 개시된 사중-특이적 항체를 포함하는 다중-특이적 항체가 또한 제공된다.

Description

다중-특이적 항체 및 이들의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 6월 25일자로 출원된 미국 가출원 62524558호의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 명확하게 포함된다.
기술 분야
본 개시는 일반적으로 생물학적 치료(biologic therapeutics)의 기술 분야에 관한 것이고, 보다 특히 다중-특이적 항체(multi-specific antibody)의 제조 및 사용에 관한 것이다.
암 세포는 면역계를 피하기 위한 다양한 전략을 개발한다. 면역 회피( immune escape)의 기본 메커니즘 중 하나는 면역계에 의한 암 세포의 인식 감소이다. 암 특이적 항원의 결함있는 제시(presentation) 또는 이의 결핍은 면역 관용(immune tolerance) 및 암 진행을 초래한다. 효과적인 면역 인식의 존재 하에서, 종양은 면역계에 의한 제거를 피하기 위해 다른 메커니즘을 사용한다. 면역적격(immunocompetent) 종양은 면역 반응을 하향 조절하기 위해 억제성 미세환경을 생성한다. 종양 세포, 조절 T 세포, 골수-유래 억제 세포, 간질 세포 및 다른 세포 유형을 포함하는 다수의 참가자가 억제성 종양 미세환경 형성에 관여한다. 면역 반응의 억제는 면역억제성 사이토카인의 분비 또는 국소 환경으로부터의 필수 생존 인자의 제거를 통해, 접촉-비의존적 형식뿐만 아니라 세포 접촉-의존적 방식으로 실행될 수 있다. 세포 접촉-의존적 억제는 세포 표면상에 발현된 분자, 예를 들어 프로그램화된 사멸 리간드 1(PD-L1), T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4) 및 기타에 의존한다[Dunn, et al., 2004, Immunity, 21 (2):137-48; Adachi & Tamada, 2015, Cancer Sci., 106 (8):945-50].
종양이 면역계에 의한 인식을 회피하는 메커니즘이 계속해서 더 잘 이해되고 있으며, 이러한 메커니즘을 표적으로 하는 새로운 치료 방식이 최근에 등장했다. 2011년 3월 25일에, 미국 식품의약국(FDA)은 절제불가능하거나 전이성 흑색종(melanoma)의 치료를 위한 이필리무맙(ipilimumab) 주사(예르보이(Yervoy), Bristol-Myers Squibb)를 승인했다. 예르보이(Yervoy)는 활성화된 T 세포에서 발현된 세포 독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)에 결합하고, 항원-제시 세포에서 CDLA-4와 CD80/86의 상호작용을 차단함으로써 CTLA-4를 통한 T 세포로 전달되는 음성 또는 저해 신호를 차단하여 많은 환자에서 종양의 박멸로 이어지는 항원-특이적 T 세포의 재-활성화를 초래한다. 몇 년 후인 2014년, FDA는 진행성 흑색종 치료를 위해 케이트루다(Keytruda)(펨브로리주맙(Pembrolizumab), Merck) 및 옵디보(Opdivo)(니볼루맙(Nivolumab), Bristol-Myers Squibb)을 승인했다. 이들 단일클론 항체는 활성화되고/되거나 소진된 T 세포에서 발현되는 PD-1에 결합하고, 종양에서 발현된 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단함으로써 PD-1을 통한 T 세포 내로의 저해 신호(inhibitory signal)를 제거하여 많은 환자에서 다시 종양의 박멸로 이어지는 항원-특이적 T 세포의 재-활성화를 초래한다. 이후, 항체의 조합으로 치료한 환자들에서 전반적인 생존율 및 무진행 생존율(progression-free survival)의 개선을 보여준 진행성 흑생종 치료에서의 예르보이 및 옵디보 단일클론 항체의 조합과 단독의 단일클론 항체 예르보이를 비교하는 추가 임상 시험이 수행되었다(Hodi et al., 2016, Lancet Oncol. 17 (11):1558-1568, Hellman et al., 2018, Cancer Cell 33 (5):853-861). 그러나, 많은 임상 시험에서 하나 이상의 면역 체크포인트 분자에 특이적인 단일클론 항체로 암 환자를 치료하는 것의 큰 장점을 보였으나, 데이터는 항원-특이적 T 세포에 의해 인식되는 새로운 T 세포 에피토프(들)를 생성하는 높은 돌연변이 부담을 가진 환자만이 임상 반응을 보이는 것으로 나타났다(Snyder et al., 2014, NEJM 371:2189-2199). 종양 돌연변이 부하가 낮은 환자는 대부분 객관적인 임상 반응을 보이지 않는다(Snyder et al., 2014, NEJM 371:2189-2199, Hellman et al., 2018, Cancer Cell 33 (5):853-861).
최근 다른 그룹은 T-세포를 활성화시키기 위해 항원-제시 세포에 의한 네오에피토프 제시의 존재를 필요로 하지 않는 대안적인 접근법을 개발하였다. 하나의 예시는 종양 관련 항원, 예를 들어 CD19에 특이적인 항체의 결합 도메인이 T 세포상의 CD3에 특이적인 항체 결합 도메인에 연결되어 이중-특이적 T 세포 인게이저(bi-specific T cell engager) 또는 BiTe 분자를 생성하는 이중-특이적 항체의 개발이다. 2014년에 FDA는 전구체 B-세포 급성 림프모구 백혈병의 치료를 위한 블리나투무맙(Blinatumumab)이라는 이중-특이적 항체를 승인했다. 블리나투무맙은 백혈병 세포에서 발현된 CD19에 특이적인 scFv를 T 세포에서 발현된 CD3에 특이적인 scFv와 연결시킨다(Bejnjamin and Stein 2016, Ther Adv Hematol 7 (3):142-146). 그러나 재발 또는 불응성 환자에서 초기 반응률이 > 50% 임에도 불구하고 많은 환자는 블리나투무맙 치료에 내성이 있거나 성공적인 블리나투무밥으로의 치료 후 재발한다. 블리나투무맙에 대한 내성 또는 블리나투무밥 치료 후 재발자는 활성화된 T 세포에서 발현된 PD-1을 통해 저해 신호를 작동시키는 PD-L1과 같은, 종양 세포에서 발현된 면역 체크포인트 저해 분자의 발현에 기인한다는 증거가 나타나고 있다(Feuch et al. al., 2016, Oncotarget 7 (47):76902-76919). 블리나투무맙을 사용한 치료에 내성이 있는 환자의 사례 연구에서, 2차 블리나투무맙 치료가 수행되었지만, PD-1에 특이적이고 T 세포-발현된 PD-1과 종양 세포 발현된 PD-L1의 상호작용을 차단하는 단일클론 항체, 펨브로리주맙(케이트루다, Merck)을 첨가하자 한 환자에서 극적인 반응 및 골수 내 종양 세포의 45%에서 5% 미만으로의 감소가 초래되었다(Feuch et al., 2016, Oncotarget 7 (47):76902-76919). 이들 결과는 이중-특이적 BiTe 분자를 하나 이상의 단일클론 항체와 조합하면 제제 단독과 비교하여 임상 활성을 상당히 증가시킬 수 있음을 보여준다.
본 개시는, 무엇보다도, 사중-특이적 항체 단량체, 사중-특이적 단량체를 함유하는 항체, 이들의 항원-결합 단편, 다중-특이적 항체, 개시된 항체 또는 단량체를 포함하는 면역-컨쥬게이트(immuno-conjugate), 개시된 단량체, 항원-결합 단편, 및 항체를 제조하는 방법, 및 암을 치료하기 위해 개시된 분자를 사용하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 출원은 사중-특이적 항체 단량체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 사중-특이적 항체 단량체는 N-말단 및 C-말단을 가지며 N-말단에서 C-말단으로 나란히 N-말단에 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, Fc 도메인, 및 C-말단에 제3 scFv 도메인을 포함한다. 제1 scFv 도메인, Fab 도메인, 제2 scFv 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각은 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가진다.
하나의 구현예에서, 항원은 종양 항원, 면역 신호전달 항원, 또는 이들의 조합을 포함한다. 하나의 구현예에서 제1 scFv 도메인, Fab 도메인, 제2 scFv 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각은 종양 항원 또는 면역 신호전달 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인은 종양 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인은 면역 신호전달 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제2 scFv 도메인은 종양 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제2 scFv 도메인은 면역 신호전달 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, Fab 도메인은 종양 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, Fab 도메인은 면역 신호전달 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제3 scFv 도메인은 종양 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제3 scFv 도메인은 종양 항원에 대한 결합 특이성을 가진다.
하나의 구현예에서, 사중-특이적 항체 단량체는 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인을 포함하며 이들 각각은 독립적으로 CD19, CD3, CD137, 4-1BB, PD-L1, ROR1, CD28, 41BB, CEA, HER2, EGFRvIII, EGFR, LMP1, LMP2A, 메소텔린(Mesothelin), PSMA, EpCAM, 글리피메이-3(glypimay-3), gpA33, GD2, TROP2, NKG2D, BCMA, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30, PD1, OX40, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, LIGHT, HVEM, CSF1R, CD73, 및 CD39로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각은 독립적으로 CD19, CD3, CD137, ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFRvIII, LMP1, LMP2A, 메소텔린, PSMA, EpCAM, 글리피메이-3, gpA33, GD2, TROP2, BCMA, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 특이적 항원, 또는 PD-L1, PD1, OX40, 4-1BB, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, Light, HVEM, CD73, CD39 등을 제한 없이 포함하는 면역 체크포인트 조절자에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서 하나의 세트의 scFv 도메인은 면역 체크포인트 조절자 또는 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. CD3 요소에 대해 특이적인 scFv는 중쇄 또는 경쇄의 C 또는 N 말단 어느 하나에 있을 수 있다.
하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각은 독립적으로 CD19, CD3, CD137M , PD-L1, 및 4-1BB로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인은 CD19에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제2 scFv 도메인은 CD3에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, Fab 도메인은 4-1BB 또는 CD137에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제3 scFv 도메인은 PD-L1에 대한 결합 특이성을 가진다.
하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인은 CD19에 대한 결합 특이성을 가지며, 제2 scFv 도메인은 CD3에 대한 결합 특이성을 가지고, Fab 도메인은 4-1BB에 대한 결합 특이성을 가지며, 제3 scFv 도메인은 PD-L1에 대한 결합 특이성을 가진다. 하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인은 CD19에 대한 결합 특이성을 가지며, 제2 scFv 도메인은 CD3에 대한 결합 특이성을 가지고, Fab 도메인은 CD137에 대한 결합 특이성을 가지며, 제3 scFv 도메인은 PD-L1에 대한 결합 특이성을 가진다.
scFv 도메인은 scFv 도메인을 항체의 중쇄 또는 경쇄에 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 10개 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 15개 초과 아미노산 길이를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 20개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 링커는 gly-gly-gly-gly-ser (G4S)n 링커를 포함할 수 있으며, n은 1 내지 20 사이의 정수일 수 있다. 예를 들어, n은 2, 4, 또는 6일 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, 또는 제3 scFv 도메인은 gly-gly-gly-gly-ser (G4S)n 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 n은 2 또는 4이다.
Fc 도메인은 인간화될 수 있다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc이다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 서열 번호 38 및 39에 대해 퍼센트 상동성(precentage homology)을 가지는 아미노산 서열을 가지는 사중-특이적 항체 단량체를 제공한다. 퍼센트 상동성은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다.
본 출원은 항원-결합 단편을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 scFv 도메인을 제공한다. 하나의 구현예에서, scFv 도메인은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30, 32에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 퍼센트 상동성은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 Fab 도메인을 제공한다. 하나의 구현예에서, Fab 도메인은 서열 번호 1 내지 12, 26 내지 32에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 퍼센트 상동성은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다. 본원에 개시된 항원-결합 단편은 사중-특이적 항체 단량체 또는 다중-특이적 항체를 구성하는데 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 출원은 다중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 사중-특이적 항체 단량체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 본원에 개시된 사중-특이적 항체 두개를 포함한다. 각각의 사중-특이적 항체 단량체가 네 개의 항원-결합 도메인을 가지므로, 개시된 다중-특이적 항체는 8개의 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이와 같은 다중-특이적 항체 내의 항원 결합 도메인 각각은 독립적으로 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가지므로 팔중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 오중-특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 오중-특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 오중-특이적 항체육중-특이적 항체이다. 하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 오중-특이적 항체칠중-특이적 항체이다.
하나의 구현예에서, 다중-특이적 항체는 사중-특이적 항체 단량체의 이량체를 포함하므로 사중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 단리된, 정제된, 또는 비-자연적으로 존재하는 다중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 서열 번호 37 내지 40에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 사중-특이적 항체를 제공한다. 퍼센트 상동성은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다.
본 출원은 사중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 서열을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 핵산은 서열 번호 37, 38을 가지는 사중-특이적 항체 단량체에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화한다. 퍼센트 상동성은 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상이다.
본 출원은 본원에 개시된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 출원은 면역-컨쥬게이트를 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 면역-컨쥬게이트는 링커를 통해 본원에 개시된 사중-특이적 항체와 연결된 세포독성제 또는 영상화제를 포함한다.
링커는 절단가능하거나 또는 절단불가능할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 에스테르 결합, 에테르 결합, 아미드 결합, 디설피드 결합, 이미드 결합, 설폰 결합, 포스페이트 결합, 인 에스테르 결합, 펩타이드 결합 또는 이들의 조합과 같은 공유결합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 소수성 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 포함한다.
세포독성제는 화학요법제, 성장 저해제, 칼리케아미신(calicheamicin)계의 세포독성제, 항유사분열(antimitotic)제, 독소(toxin), 방사성 동위원소, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포독성제는 칼리케아미신, 오조가미신(ozogamicin), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 엠탄신(emtansine), 이들의 유도체 또는 조합을 포함한다.
영상화제는 영상화 목적에 유용한 임의의 화합물일 수 있다. 하나의 구현예에서, 영상화제는 방사성핵종(radionuclide), 형광제, 퀀텀 닷(quantum dot), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 출원은 약제학적 조성물을 추가로 제공할 수 있다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 담체 및 사중-특이적 항체 단량체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 담체 및 다중-특이적 항체 단량체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 담체 및 항원-결합 단편을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 담체 및 면역-컨쥬게이트를 포함한다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료제를 추가로 포함한다. 치료제의 예는 방사성 동위원소, 방사성핵종, 독소, 화학요법제, 항체, 효소, 또는 이들의 조합을 제한없이 포함한다. 하나의 구현예에서, 치료제는 항-에스트로겐제, 티로신 키나아제 수용체 저해제, 키나아제 저해제, 세포 주기 저해제, DNA, RNA, 또는 단백질 합성 저해제, RAS 저해제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 치료제는 체크포인트 저해제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 치료제는 PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73의 저해제, 이들의 유도체 또는 조합을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 출원은 사중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 이들의 항원-결합 단편, 및 이들의 면역-컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 방법은 항체를 암호화하는 DNA 서열이 발현되도록 본원에 개시된 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 정제하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 사중-특이적 항체이다.
추가의 측면에서, 본 출원은 암 치료를 위해 사중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 이들의 항원-결합 단편, 및 이들의 면역-컨쥬게이트를 사용하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 사중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 이들의 항원-결합 단편, 및 이들의 면역-컨쥬게이트, 또는 이들의 약제학적 조성물을 이와 같은 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 방법은 사중-특이적 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 다중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 면역-컨쥬게이트, 이들의 항원-결합 단편의 유효량을 종양 부위에 직접적으로 주입하는 단계를 포함한다.
다양한 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 하나의 구현예에서, 암은 ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFR VIII, LMP1, LMP2A, 메소텔린, PSMA, EpCAM, 글리피메이-3, gpA33, GD2, TROP2, NKG2D, BCMA, PD-L1, 4-1BB, CD3, CD19, CD20, CD33, CD137, CD123, CD22, 또는 CD30를 발현하는 세포를 가질 수 있다. 암의 예시는 유방암, 결장직장암, 항문암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 두부 및 경부암, 비인두암, 피부암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 요도암, 폐암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 뇌종양, 신경아교종, 신경모세포종, 식도암, 위암, 간암, 신장암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 갑상선암, 눈암, 육종, 골암, 백혈병, 골수종 또는 림프종을 제한 없이 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 유효량의 치료제를 동시-투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 항체, 화학요법제, 효소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 항-에스트로겐제, 티로신 키나아제 수용체 저해제, 키나아제 저해제, 세포 주기 저해제, DNA, RNA, 또는 단백질 합성 저해제, RAS 저해제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 체크포인트 저해제를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 PD1, PD-L1, cd19, cd3, cd137, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73의 저해제, 이들의 유도체 또는 조합을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 치료제는 카페시타빈(capecitabine), 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 시클로포스파미드, 머스틴(Mustine), 빈크리스틴(vincristine), 프로카르바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카바진(dacarbazine), 에토포시드(etoposide), 에피루비신(Epirubicin), 페메트렉세드(pemetrexed), 폴린산(folinic acid), 제미시타빈(gemicitabine), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 캄프토테신(camptothecin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 풀베스트란트(fulvestrant), 타목시펜(tamoxifen), 레트로졸(letrozole), 엑스메스탄(exemestane), 아나스트로졸(anastrozole), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 테스토락톤(testolactone), 보로졸(vorozole), 포르메스탄(formestane), 파드로졸(fadrozole), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(lafatinib), 다사티닙(dasatinib), 제피티닙(gefitinib), 오시머티닙(osimertinib), 반더타닙(vandertanib), 아파티닙(afatinib), 이마티닙(imatinib), 파조피닙(pazopinib), 라파티닙(lapatinib), 수니티닙(sunitinib), 닐로티닙(nilotinib), 소라페닙(sorafenib), 납-팔리탁셀(nab-palitaxel), 에베로리무스(Everolimus), 템시로리무스(elmsirolimus), 다브라페닙(dabrafenib), 베무라페닙(vemurafenib), 트라메티닙(trametinib), 빈타폴리드(vintafolide), 아파티닙(apatinib), 크리조티닙(crizotinib), 페리포르신(periforsine), 올라파립(olaparib), 보르테조밉(bortezomib), 토파시티닙(tofacitinib), 트라트스주맙(trastuzumab), 이들의 유도체 또는 조합을 포함할 수 있다.
대상체는 인간일 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체는 암으로 고통받을 수 있다. 본 출원은 유효 농도의 본원에 개시된 다중-특이적 항체, 단량체, 또는 면역-컨쥬게이트를 포함하는 용액을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 용액은 대상체의 혈장이다.
본 개시의 목적 및 이점은 첨부 도면과 관련하여 이하의 예시적인 구현예의 상세한 설명으로부터 명백해질 수 있다. 또 다른 구현예는 이하의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 수 있으며, 여기서 고려되는 최상의 모드를 설명하는 구현예가 설명된다. 알 수 있는 바와 같이, 다른 및 상이한 구현예들이 가능하고, 구현예들의 몇몇 세부 사항들은 모두 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하고 명백한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 사실상 예시적인 것이며 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
이하의 상세한 설명에서, 본원의 일부를 형성하는 첨부된 도면을 참조한다. 도면에서, 내용이 달리 명시하지 않는 한, 유사한 기호는 전형적으로 유사한 구성 요소를 나타낸다. 상세한 설명, 도면, 및 청구범위에 기술된 예시적인 구현예는 제한적인 것임을 의미하지 않는다. 본원에 제시된 대상의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 다른 구현예들이 이용될 수 있고, 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본원에 일반적으로 기술되고 도면에 도시된 바와 같이, 본 개시의 측면이 다양하고 상이한 구성으로 배열, 대체, 조합, 분리, 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 본원에 명시적으로 고려된다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
본 개시는, 무엇보다도, 단리된 항체, 이러한 항체의 제조 방법, 사중-특이적 또는 다중-특이적 분자, 항체-약물 컨쥬게이트 및/또는 이러한 항체 또는 항원-결합 단편으로 구성된 면역-컨쥬게이트, 항체를 함유하는 약제학적 조성물, 사중-특이적 또는 다중-특이적 분자, 항체-약물 컨쥬게이트 및/또는 면역-컨쥬게이트, 이들의 제조 방법, 및 암을 치료하기 위해 개시된 분자 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, 및 Fv) 뿐만 아니라, 단일의 단일클론 항체 (작용제 및 길항체 항체를 포함), 폴리에피토프 특이성을 가지는 항체 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론, 다클론, 키메라, 단일 사슬, 이중-특이적 또는 이중-효과적, 유인원의, 인간 및 인간화 항체뿐만 아니라, 이들의 활성 단편일 수 있다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예는 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리의 생성물 및 상기 언급된 임의의 항체 및 단편의 에피토프-결합 단편을 포함하여, Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 부위를 함유하는 분자를 포함할 수 있다. 면역글로불린은 임의의 유형 (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 면역글로불린 분자의 클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브 클래스일 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 전체 항체 및 전체 항체로부터 유래된 임의의 항원-결합 단편일 수 있다. 전형적인 항체는 전형적으로 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 이종사량체 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH로 약칭) 및 중쇄 불변 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL로 약칭) 및 경쇄 불변 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 초가변(hypervariable) 상보성 결정 영역(CDR)의 도메인, 및 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 가변 도메인(VH 또는 VL)은 전형적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내에는 항원과 상호작용하는 결합 영역이 존재한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생이 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정 인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 종래의 (다클론) 항체 제조물(preparation)과 대조적으로, 단일클론 항체는 각각 항원상의 단일 결정 인자에 대한 것이다. 이들의 특이성에 더하여, 단일클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리할 수 있다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 개시에 따라 사용되는 단일클론 항체는 Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567호 참조).
단일클론 항체는 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함할 수 있으며, 이는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬의 나머지는 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(US 특허 제 4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).
단일클론 항체는 마우스 하이브리도마 또는 파지 디스플레이(리뷰를 위해 Siegel. Transfus. Clin. Biol. 9:15-22 (2002) 참조)를 포함하는 다양한 방법을 사용하여 또는 1차 B 세포로부터의 항체의 분자 클로닝(Tiller. New Biotechnol. 28:453-7 (2011))으로부터 직접적으로 생산될 수 있다. 본 개시에서 항체는 인간 PD-L1 단백질 및 세포 표면상에서 일시적으로 인간 PD-L1을 발현하는 세포 둘 다에 의한 토끼의 면역화에 의해 생성되었다. 토끼는 높은 친화성, 다양성 및 특이성의 항체를 생산하는 것으로 알려져 있다(Weber et al. Exp. Mol. Med. 49:e305). 면역화된 동물로부터의 B 세포를 시험관 내에서 배양하고 항 PD-L1 항체의 생산을 위해 스크리닝 하였다. 항체 가변 유전자를 재조합 DNA 기술을 사용하여 단리하고, 생성된 항체를 재조합적으로 발현시키고, PD-L1이 PD-1에 결합하는 것을 저해하는 능력, 비인간 영장류 PD-L1에 결합하는 능력 및 인간 T 세포 활성을 강화시키는 능력과 같은 원하는 특징을 위해 추가로 스크리닝 하였다. 이 일반적인 항체 발견 방법은 Seeber et al. PLOS One. 9 : e86184 (2014)에 기술된 것과 유사하다.
용어 "항원- 또는 에피토프-결합 부분 또는 단편"은 항원 (이 경우 PD-L1)에 결합할 수 있는 항체의 단편을 지칭한다. 이들 단편은 온전한 항체의 항원 결합 기능 및 추가 기능을 수행할 수 있다. 결합 단편의 예는 합성 링커에 의해 단일 폴리펩타이드 쇄로 연결된 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 단일-쇄 Fv 단편(scFv) 또는 VL, 불변 경쇄(CL), VH 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 훨씬 더 작은 서브-단편일 수 있고, 단일 CDR 도메인만큼 작은 도메인, 특히 VL 및/또는 VH 도메인으로부터의 CDR3 영역으로 구성될 수 있다(Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-49 (2000)). 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 방법을 사용하여 생산된다. 온전한 항체를 쓰는 동일한 기술을 사용하는 유용성을 위해 항체 단편은 스크리닝될 수 있다.
"항원- 또는 에피토프-결합 단편"은 당업계에 공지된 다수의 기술에 의해 본 개시의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 단일클론 항체는 펩신과 같은 효소로 절단되어 HPLC 겔 여과될 수 있다. 이어서, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획을 수집하고 막 여과 등에 의해 농축시킬 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술에 대한 추가 설명은 예를 들어, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986를 참조한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원 결합 부위를 가지는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 그 명칭이 그것의 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 잔여의 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교 결합(cross-linking)시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유할 수 있다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서의 몇몇 잔기 첨가로 인해 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올기를 가지는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 결합을 가지는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 구성에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 VH-VL 이량체의 표면상에 항원 결합 부위를 정의하기 위해 상호작용한다. 총괄적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성에도 불구하고, 단일 가변 도메인 (또는 하나의 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 가진다.
임의의 척추 동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다(λ)라 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 주요 클래스(class)가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 일부는 서브클래스(아이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 추가로 나눠질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, 델타, 엡실론, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구성이 공지되어 있다.
"인간화 항체"는 비-인간 공여자 면역글로불린으로부터 유래된 이의 CDR를 가지며, 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분은 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된, 조작된 항체의 유형을 지칭한다. 또한, 프레임워크 서포트 잔기는 결합 친화성을 유지하기 위해 변경될 수 있다. "인간화 항체"를 수득하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다(Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조). 하나의 구현예에서, "인간화 항체"는 예를 들어, 토끼와 같은 큰 동물에서 친화도-성숙한 인간형 다클론 항체의 생산을 가능하게 하는 유전적 조작 접근법에 의해 수득 될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 7,129,084 참조).
본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환 가능하며 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 생체 분자를 의미하는 것으로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "하나의(a, an)” 및 그(“the”)는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되며 문맥이 부적절하지 않은 한 복수를 포함한다.
"단리된"은 자연적으로 발생하는 요소 중 적어도 일부가 없는 생물학적 분자를 의미한다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩타이드를 기술하기 위해 사용될 때 "단리된"은 그것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다.
"재조합체"는 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기술을 사용하여 항체가 생성됨을 의미한다.
용어 "항원"은 유기체, 특히 동물, 보다 특히 인간을 포함하는 포유 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 독립체(identity) 또는 이의 단편을 지칭한다. 상기 용어는 항원성 또는 항원 결정 인자를 담당하는 면역원 및 이의 영역을 포함한다.
또한 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 면역원성 제제(immunogenic agent)에 대해 유도된 항체, T 세포 또는 다른 반응성 면역 세포의 생성을 유도하거나 강화시키고, 인간 또는 동물에서 면역 반응에 기여하는 물질을 지칭한다. 면역 반응은 개체가 치료될 장애를 완화 또는 경감시키기 위해 투여된 본 개시의 면역원성 조성물에 대한 충분한 항체, T 세포 및 다른 반응성 면역 세포를 생산할 때 발생한다.
특정 항원 또는 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "~에 특이적"은 비-특이적 상호작용과는 상당히 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자(control molecule)의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어, 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 적어도 약 10-12 M, 또는 그 초과의 항원 또는 에피토프에 대한 KD를 가지는 항체에 의해 나타날 수 있고, 여기서 KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 일부 구현예에서, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 대해, 대조 분자에 비해 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 초과의 KD를 가질 수 있다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어, 대조군에 관한 에피토프에 비해 항원 또는 에피토프에 대한 적어도 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 또는 그 초과의 KA 또는 Ka를 가지는 항체에 의해 나타날 수 있고, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 결합률(association rate)을 지칭한다.
두 서열 사이의 "상동성"은 서열 동일성에 의해 결정된다. 서로 비교될 2개의 서열이 길이가 상이한 경우, 서열 동일성은 바람직하게는 더 긴 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 잔기의 퍼센트에 관한 것이다. 서열 동일성은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 주어진 서열과 본 개시의 전술한 서열 사이의 비교에서 나타나는 편차는 예를 들어 첨가, 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 야기될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 출원은 사중-특이적 항체 단량체, 항원-결합 단편, 및 다중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 사중-특이적 항체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 4개의 상이한 항원 표적에 대한 결합 특이성을 가지는 사중-특이적 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 항원 표적은 종양 특이적 항원, T 세포 수용체 CD3 요소, 또는 면역 체크포인트 분자이다. 사중-특이적 항체는 신체의 내인성 T 세포에 직접 관여하여 항원 특이적 T 세포 수용체에 대한 MHC에 의한 종양 항원 제시와 무관하게 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 또한, 사중-특이적 항체의 면역 체크포인트 조절 요소는 면역 억제성 종양 미세환경을 극복하여 종양 미세환경 내에서 소진된 T 세포를 완전히 활성화시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 사중-특이적 항체는 면역 체크포인트를 조절하거나 Treg 또는 다른 저해성 면역 세포를 저해하거나 또는 종양 항원에 대한 요소로 종양을 표적화하는 동시에, T 세포를 직접 관여시키는 독특한 특성을 가진다. 이는 BiTE 또는 CAR-T 치료가 적합하지 않은 환자에게 이점을 나타낼 수 있다. 특히, 사중-특이적 항체는 저해성 종양 미세환경에 의해 부과된 한계로 인해 BiTE-유사 기술 또는 CAR-T 처리가 아직 임상적 이점을 나타내지 않는 고형 종양에서 임상적 이점을 입증할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 4개의 상이한 결합 도메인 또는 "사중-특이적 항체"를 가지는 조작된 항체를 제공한다. 하나의 결합 도메인은 T 세포상의 CD3에 특이적이고, 제2 결합 도메인은 ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFRvIII, LMP1, LMP2A, 메소텔린, PSMA, EpCAM, 글리피칸-3, gpA33, GD2, TROP2, BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30을 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양 관련 항원에 특이적이고, 제3 및 제 4 결합 도메인은 PD-L1, PD-1, OX40, 4-1BB, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, Light, HVEM, CD73, CD39 등과 같은 2개의 구별되는 면역 체크포인트 조절자에 특이적이다.
하나의 구현예에서, 사중-특이적 분자(도 1)는 종양 관련 항원인 인간 CD19 서열 번호 25 내지 32를 표적화한다. 일부 구현예에서, 이들 표적화된 사중-특이적 단백질은 항-인간 PD-L1 (서열 번호 9 내지 12), 항-인간 4-1BB (서열 번호 13 내지 24), 항-인간 CD3 결합 도메인 (서열 번호 1 내지 8)을 운반한다. 사중-특이적 분자 결합 도메인은 결합 도메인 배치가 N-말단에서부터 D1, scFv VLVH, 이어서 D2, scFv VLVH, 이 클래스의 사중-특이적 단백질에서 Fab 위치에 있는 D3, 이어서 D4에 인간 IgG1 Fc 및 scFv, VHVL로 진행되는 것과 같이 배열된다.
하나의 구현예에서, 사중-특이적 단백질 SI-38E34 (서열 37 내지 40)는 위치 D1, D2, D3 및 D4를 각각 차지하는, 항-인간 CD19 21D4 scFv, 항-인간 CD3 284A10 scFv, 항-인간 CD137 (Fab) 및 항-인간 PD-L1 클론 PL221G5 scFv으로 구성된다. D1, D2 및 D3은 인간 IgG1 Fc 및 D4의 C-말단과 마찬가지로 10개 아미노산 (G4S)x2 링커를 통해 유전적으로 연결되어 있고, 이는 결합 특이성을 함유하는 연속된 ~ 150kDa 중쇄 단량체 펩타이드를 생성한다. 본원에 기술된 모든 scFv 분자는 V-영역 배향 (LH 또는 HL)에 관계없이 VH 및 VL을 작동가능하게 연결시키는 20개 아미노산의 유연한 gly-gly-gly-gly-ser(G4S)x4 링커를 함유한다. 사중-특이적 단백질에서의 나머지 위치는, 도메인 3 (D3)은 IgG1 중쇄, VH-CH1-힌지-CH2-CH3 및 상응하는 경쇄 VL-CL로 구성되며, 이는 카파 또는 람다 쇄일 수 있다. D1 및 D2는 10개 아미노산의 (G4S)x2 링커를 통해 유전적으로 연결되며, D2, D3 및 D4는 연속된 ~ 150kDa 중쇄 단량체 펩타이드를 생성한다. 적절한 경쇄로 공동-형질감염된 경우, 최종 대칭적 사중-특이적 펩타이드는 IgG1 Fc (단백질 A/단백질 G)를 통해 정제되고 기능적 활성을 평가하기 위해 분석될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 "카세트"는 V-영역이 제한 효소 부위 (중쇄의 경우 HindIII/NheI 및 경쇄의 경우 HindIII/BsiWI) 또는 깁슨 조립(Gibson Assembly) (SGI-DNA, La Jolla, CA), 혼입(Infusion) (Takara Bio USA) 또는 NEBuilder (NEB, MA, Ipswich, MA)와 같은 "무-제한효소 클로닝"을 사용하여 쉽게 클로닝 될 수 있도록 이전에 구축되었다. 후자가 본원에서 사용되었다.
하나의 구현예에서, 사중-특이적 단백질은 온전한 분자의 디자인, 각 도메인에 대한 뉴클레오티드 서열의 합성 및 클로닝, 포유 동물 세포에서의 발현 및 최종 생성물의 정제를 포함하는 공정을 통해 생산된다. 뉴클레오티드 서열을 Geneious 10.2.3 소프트웨어 패키지 (Biomatters, Auckland, NZ)를 사용하여 조립하고 유전자 합성(Genewiz, South Plainsfield, NJ)을 위한 이들의 요소 도메인으로 분리하였다.
하나의 구현예에서, SI-35E18 (서열 65 및 67)은 D1을 차지하는 항-4-1BB scFv, VLVH, D2를 차지하는 항-인간 PD-L1 클론 PL230C6 (Fab 위치), D3를 차지하는 항-인간 ROR1 Ig 도메인-특이적 클론 323H7 VHVL scFv, C-말단 D4를 차지하는 항-인간 CD3 scFv, VHVL 요소 도메인으로 나눠진다. NEBuilder 웹 기반 도구를 사용하여 더 큰 단백질에서의 위치에 따라 5 '및 3' 뉴클레오티드를 각각의 도메인에 추가하여 각각의 도메인이 부위 특이적 재조합과 관련된 20 내지 30 뉴클레오티드만큼 측면 도메인과 겹치도록하여 유전적으로 단일 유전자 조립 단계에서 각각의 도메인을 융합하였다. 사중-특이적 뉴클레오티드 서열에서 다수의 상동성 영역으로 인해, N-말단 도메인 1 및 2는 C-말단 D3 및 D4와 별도로 조립된다. 이어서 N- 및 C-말단 단편을 제2 NEBuilder 반응에서 함께 조립하였다. 소량의 분취 액을 E.coli DH10b (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 형질전환시키고 TB + 카베니실린 100ug/ml 플레이트 (Teknova, Hollister, CA) 상에 플레이팅하고 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 결과로 생긴 콜로니를 선택하고 TB + 카베니실린에 2ml의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 하룻밤 배양물로부터 DNA를 제조하고 (Thermo-Fisher, Carlsbad, CA) 각각의 도메인을 인접시키는 서열 분석 프라이머 (Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 서열 분석 (Genewiz, South Plainsfield, MO) 하였다. 모든 DNA 서열을 Geneious로 조립하고 분석하였다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 다중-특이적 항체 단량체, 다중-특이적 항체, 항원-결합 단편, 및 이의 면역-컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 암의 치료를 위해 개시된 항체 또는 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
현존하는 치료법에 비해, 암을 치료하는데 개시된 사중-특이적 항체 단량체, 사중-특이적 단량체를 함유하는 항체, 이들의 항원-결합 단편, 다중-특이적 항체, 개시된 항체 또는 단량체를 포함하는 면역-컨쥬게이트 또는 조성물을 사용하는 것의 이점은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 1) IgG Fc 도메인의 포함은 이중 특이성 BiTe 분자에 비해 혈청에서 더 긴 반감기의 특성을 부여할 수 있다; 2) 면역 체크포인트 조절자에 특이적인 2개의 결합 도메인의 포함은 억제 경로를 저해하고, 동시에 공동-자극 경로에 관여할 수 있다; 및 3) 종양 관련 항원과 T 세포상의 CD3을 가교결합하여, 환자로부터 T 세포를 제거하고, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)에 대해 수행된 바와 같이 이들을 환자에게 다시 재도입하기 전에 종양 세포에 특이적이 되도록 이들을 유전적으로 변형할 필요 없이, T 세포를 재배향하여 종양을 사멸시킨다.
약제학적 조성물의 제형은 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시에 따른 항체 및 단량체는 생리학적으로 허용가능한 제형으로 제조될 수 있고, 공지된 기술을 사용하여 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시에 따른 그리고 본원에 기술된 바와 같은, 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 항체, 특히, 임의의 기능적으로 동등한 항체 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 단일클론 항체는 치료적 조성물을 형성하기 위해 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합된다. 본 개시에 따른 약제학적 조성물의 제형은 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 달성될 수 있다.
치료가 필요한 인간 환자와 같은 대상체에게 투여하기에 적합한 조성물의 제형과 관련하여, 본원에 개시된 항체는 선택된 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합되거나 조합될 수 있다. 본원에 개시된 항체의 적용 방식에는 특별한 제한이 없으며, 적절한 투여 경로 및 적합한 조성물의 선택은 과도한 실험 없이 당업계에 공지되어 있다.
적합한 약학적 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 오일/물 유화제와 같은 유화제를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 화합물, 물질, 조성물, 및 투여 형태를 지칭한다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 혈청 알부민 또는 면역글로불린, 특히 인간 기원의 것과 같은 단백질성 담체를 포함할 수 있다. 또한 생물학적 활성제는 의도된 용도에 따라 본 개시의 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 하나의 구현예에서, 단백질성 약제학적 활성 물질은 용량 당 1ng 내지 10mg의 양으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 투여 요법은 본 개시에 따른 항체의 0.1㎍ 내지 10㎎ 범위, 특히 1.0㎍ 내지 1.0㎎ 범위, 보다 특히 1.0㎍ 내지 100㎍ 범위이어야 하고, 이들 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자도 본 개시의 일부이다. 투여가 연속 주입을 통해 발생하는 경우, 보다 적절한 투여량은 시간당 체중 킬로그램당 0.01 ㎍ 내지 10 mg 단위의 범위일 수 있으며, 이 범위 내에 속하는 모든 개별 숫자 또한 본 개시의 일부이다.
본 개시의 조성물은 대상체에게 적합하고, 약학적으로 유효한 용량에서 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예는 알약, 크림, 및 이식 가능한 투여 단위를 포함한다. 알약은 경구 투여될 수 있다. 치료적 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 가능한 투여 단위는 국소적으로, 예를 들어, 종양 부위에 투여될 수 있거나, 또는 치료적 조성물의 전신성 방출을 위해, 예를 들어 피하로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예시는 근육 내, 피하, 정맥 내, 동맥 내 주사에 적합한 제형, 및 국소 및 안구 내 투여를 위한 제형을 포함한다. 에어로졸 제형의 예는 폐로 투여하기 위한 흡입기 제형을 포함한다.
조성물의 투여량은 치료되는 상태, 사용된 특정 조성물, 및 체중, 크기, 성별 및 환자의 일반적인 건강 상태, 체면적, 투여될 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여되는 다른 약물, 및 투여 경로와 같은 기타 임상적 요인과 같은 다양한 요소에 따라 달라지는 것으로 잘 알려져 있다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 인간 또는 동물에게 투여될 때, 상기 인간 또는 동물에서 치료 효과를 생성하기에 충분한 반응을 이끌어내는 (예를 들어, 대상체에서 질병을 완화시키기에 충분한 반응) 항체의 양을 지칭한다. 유효량은 이하의 일상적인 절차에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 질환이 암인 경우, 약물의 유효량은 암 세포 성장, 암 세포 증식, 암 세포 이동성, 주변 기관으로 암 세포의 침윤, 종양 전이, 및 종양 성장을 포함하지만 이에 제한되지 않는 예시적인 특징 중 하나 이상을 저해(예를 들어, 어느 정도 늦추거나, 저해 또는 중단)시킬 수 있다. 질환이 메이어(mayer)인 경우, 유효량의 약물은 대안적으로 대상체에게 투여될 때 다음 중 하나 이상을 수행할 수 있다: 종양 성장 둔화 또는 중지, 종양 크기 감소 (예를 들어, 부피 또는 질량), 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화, 무진행 생존 연장, 객관적인 반응 초래 (예를 들어, 부분 반응 또는 완전한 반응 포함), 및 전반적인 생존 시간 증가. 약물이 성장을 예방하고/하거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 한, 그것은 세포증식억제성 및/또는 세포독성이다.
당업자는 암과 같은 상태를 효과적으로 치료하기 위해 본원에 개시된 항체의 유효량 또는 농도를 결정할 수 있다. 약제학적 조성물에서 다양한 요소의 비율, 투여량 및 빈도와 같은 다른 파라미터는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 적합한 주사 용액은 ml 당 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10 mg의 항체를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 용량은 약 0.1 내지 약 20, 약 1 내지 약 5mg/Kg 체중일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 투여 빈도는 하루에 한 번 또는 일주일에 세 번일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
조성물은 표준 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국소, 경구, 직장, 코, 피내(intradermal), 복강내, 또는 비경구 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 또는 근육 내) 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 생분해성 중합체와 같은 지효성 매트릭스에 통합될 수 있으며, 중합체는 전달이 필요한 부근, 예를 들어 종양 부위에 이식된다. 방법은 단일 용량의 투여, 미리 설정된 시간 간격으로 반복된 용량의 투여, 및 미리 설정된 기간 동안 지속적인 투여를 포함한다.
많은 투여 형태가 가능하지만, 예시적 투여 형태는 주사용 용액, 특히 정맥 내 또는 동맥 내 주사용 용액일 것이다. 일반적으로, 주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 약학적으로 적합한 담체 또는 부형제, 예를 들어 완충제, 계면 활성제, 또는 안정화제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 완충제는 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 계면활성제는 폴리소르베이트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적 안정화제는 인간 알부민을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
하나의 구현예에서, 투여는 비경구, 예를 들어 정맥 내 투여일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화제를 포함한다. 비수성 용매는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 수성 용매는 물, 알코올/수성 용액, 식염수 및 완충 배지를 포함하는 유화제 또는 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산을 가한 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유를 포함한다. 정맥 내 비히클은 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등과 같은 보존제가 존재할 수 있다.
항체 단량체, 항체, 항원-결합 단편 및 이들의 면역-컨쥬게이트는 치료제 또는 치료 목적을 위한 치료제를 포함하는 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항체 분자는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 유효량으로 사용된다. 추가적인 치료제는 항체, 화학요법제, 효소, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 항에스트로겐제, 수용체 티로신 키나아제 저해제, 키나아제 저해제, 세포 주기 저해제, DNA, RNA 또는 단백질 합성 저해제, RAS 저해제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 체크포인트 저해제일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73의 저해제, 이들의 유도체 또는 조합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 치료제는 카페시타빈, 시스플라틴, 트라스투주맙, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 엑스메스탄, 아나스트로졸, 아미노글루테티미드, 테스토락톤, 보로졸, 포르메스탄, 파드로졸, 레트로졸, 엘로티닙, 라파티닙, 다사티닙, 제페티닙, 이마티닙, 파조피닙, 라파티닙, 수니티닙, 닐로티닙, 소라페닙, 납-팔리탁셀, 이들의 유도체 또는 조합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 카페시타빈, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 시클로포스파미드, 머스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 블레오마이신, 빈블라스틴, 다카바진, 에토포시드, 에피루비신, 페메트렉세드, 폴린산, 제미시타빈, 옥살리플라틴, 이리노테칸(메이), 토포테칸(메이), 캄프토테신, 도세탁셀, 파클리탁셀, 풀베스트란트, 타목시펜, 레트로졸, 엑스메스탄, 아나스트로졸, 아미노글루테티미드, 테스토락톤, 보로졸, 포르메스탄, 파드로졸, 레트로졸, 엘로티닙, 라파티닙, 다사티닙, 제피티닙, 오시머티닙, 반더타닙, 아파티닙, 이마티닙, 파조피닙, 라파티닙, 수니티닙, 닐로티닙, 소라페닙, 납-팔리탁셀, 에베로리 무스, 템시로리무스, 다브라페닙, 베무라페닙, 트라메티닙, 빈타폴리드, 아파티 닙, 크리조티닙, 페리포르신, 올라파립, 보르테조밉, 토파시티닙, 이들의 유도체 또는 조합을 포함할 수 있다.
유방암, 결장직장암, 췌장암, 두부 및 경부암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 비-소세포 폐암, 신경아교종, 식도암, 비인두암, 항문암, 직장암, 위암, 방광암, 자궁경부암 또는 뇌암을 포함하는 암은 암 관련 유전자를 발현할 수 있다. 특이적 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편에 의한 암 관련 활성의 저해는 암의 치료 효과를 가질 수 있다. 또한, 암 관련 단백질에 특이적인 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 것은 세포독성제의 효과를 통해 암을 치료, 예방, 완화할 수 있고, 암의 발달 또는 전이를 지연시킬 수 있다.
본 개시는 본원에 포함된 하기한 구체적인 구현예 및 실시예의 상세한 설명을 참조함으로써 더 쉽게 이해될 수 있다. 본 개시는 특정 구현예의 특정 상세한 설명을 참조하여 설명되지만, 이러한 상세한 설명은 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 개시의 전술되거나 다른 특징들은 첨부된 표 및 도면과 관련하여 이하의 설명 및 첨부된 청구 범위로부터 보다 완전히 명백해질 수 있다. 이들 표 및 도면은 본 개시에 따라 배열된 몇몇의 구현예만을 도시하고, 따라서 그 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다는 것을 이해하고, 본 개시는 첨부된 도면을 사용하여 추가의 특이성 및 세부 사항으로 설명될 수 있다:
도 1은 가이드 내비게이션 제어(GNC) 사중-특이적 항체의 일반적 형식의 도해이다.
도 2는 효과기(effector)로서 PBMC(말초 혈액 단핵 세포) 및 표적으로서 B-급성 림프모구 백혈병(B-ALL) 세포주 카스미-2를 사용한, 재배향된(re-directed) T 세포 세포독성(RTCC) 분석을 보여주는 실험 결과를 도시한다.
도 3은 사중-특이적 GNC 항체에 의해 유도된 CD8+ T 세포의 증식을 보여주는 실험 결과를 도시한다
도 4는 사중-특이적 GNC 항체에 의해 유도된 CD4+ T 세포의 증식을 보여주는 실험 결과를 도시한다
도 5는 사중-특이적 GNC 항체에 의해 유도된 PBMC로부터 감마 인터페론의 분비를 보여주는 실험 결과를 도시한다
도 6은 사중-특이적 GNC 항체에 의해 유도된 PBMC로부터 그랜자임 B의 분비를 보여주는 실험 결과를 도시한다
도 7은 CD19 종양 항원 인식 도메인을 가지는 사중-특이적 항체의 예시를 보여준다.
도 8은 본원에 개시된 예시적인 사중-특이적 항체의 목록을 제공한다.
실시예
실시예 1 : 효과기(effector)로서 PBMC(말초 혈액 단핵 세포) 및 표적으로서 B-급성 림프모구 백혈병 (B-ALL) 세포주 카스미-2 및 날름(NALM)-6을 사용한, 재배향된(re-directed) T 세포 세포독성(RTCC) 분석
표 1 및 2에 열거된 사중-특이적 항체를 인간 PBMC를 효과기로서 사용하여 B-ALL 세포주 카스미-2 및 날름(Nalm)-6에 대한 RTCC 활성에 대해 시험하였다. 카스미-2 및 날름-6 표적 세포 둘 다 이전에 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질 감염되고 FACS 분류되어 99% 초과가 GFP를 발현하는 세포 집단을 생성하였다. GFP+ 카스미-2 및 GFP+ 날름-6 세포를 계수하고 분석 배지에서 100,000 세포/ml의 밀도로 설정하였다. 인간 PBMC를 계수하고 100,000 세포/ml의 밀도로 설정하였다. 항체를 2X 최종 농도로 제조하고 분석 배지에서 96 웰 플레이트의 6 웰에 걸쳐 1:10으로 적정하였다. 지정 96 웰 플레이트에서, 표적 세포, PBMC 및 연속 적정된 항체를 50ul의 표적 세포(5,000), 50ul의 PBMC 세포(5,000) 및 100ul의 각 항체 희석액을 분석의 각 웰에 첨가함으로써 조합하였다. 분석 플레이트를 37 ℃에서 8 일 동안 배양한 다음, 100ul의 상청액을 새로운 96 웰로 옮기고 이후 분석을 위해 -80 ℃에서 동결시켰다. 세포를 피펫팅에 의해 재현탁시키고 384 웰 플레이트로 옮겼다. 항-CD4 및 항-CD8 직접 컨쥬게이트된 상업적인 항체를 포함하는 항체 칵테일로 세포를 염색하였다. 웰에 남아있는 세포를 세척하고, 항-CD4 (biolegend Cat # 317436) 및 항-CD8 (biolegend Cat # 557746)과 직접 컨쥬게이션된 상업적인 항체와 7AAD 생/사 염색 및 계수 비드를 함유하는 분석 완충액에 재현탁시키고 BD LSRII Fortessa에서 분석하였다. 웰당 CD4+, CD8+ 및 GFP+ 표적 세포의 수를 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 사중-특이적 항체 SI-38X34, 35 및 36은 0.05 pM의 농도에서 대부분의 표적 NALM-6 세포의 T 세포 사멸을 유도하는데, 이는 이중-특이적 항체 SI-38X19 및 HD37 x I2C 보다 약 10 배 더 강력하다. 이중 특이적 SI-38X19는 사중-특이적 항체 SI-38E34, 35 및 36에서와 같이 21D4 (CD19) 및 284A10 (CD3) 결합 도메인을 가지지만 사중-특이적 항체는 420H5, 466F6, 460C3 (41BB) 및 PL221 (PDL1)의 도메인을 추가로 가지며, 사중-특이적 항체에서 추가의 41BB 및/또는 PDL1 결합 도메인이 표적 세포의 T 세포 사멸에 증강 효과를 가진다는 것을 시사한다. 또한, 도 3에 도시 된 바와 같이, 이중-특이적 항체 21D4 x 284A10은 21-D4 x 284A10 이중-특이적보다 10배 높은 농도에서의 이중-특이적 HD37 xI2C와 같이 CD8+ T 세포의 증식을 강하게 유도한다. 그러나, 사중-특이적 항체 SI-38E34, 35 및 36은 유사한 농도에서 훨씬 더 낮은 수준의 CD8+ T 세포 증식을 유도한다. 도 2의 RTCC 데이터와 결합된 이들 데이터는 사중-특이적 항체가 이중-특이적 항체보다 말단 세포 독성 T 세포로 CD8+ T 세포의 분화를 더 잘 유도함을 시사한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 시험된 이중 특이적 항체는 또한 CD8+ T 세포의 증식에 대한 효과와 유사하게 CD4+ T 세포의 더 큰 증식을 유도하고, 사중-특이적 항체는 훨씬 더 낮은 수준의 CD4+ T 세포 증식을 유도한다.
실시예 2 : 8일차 RTCC로부터 배양 상청액에서 CD19-특이적 GNC 항체와의 감마 인터페론 및 그랜자임 B의 ELISA 분석.
-80에 저장된 웰 상청액을 해동하고 제조업체 권장 프로토콜에 따라 R & D 시스템 (No.DY285B 및 DY2906-05)의 g-IFN 및 GrB 키트를 사용하여 인터페론 감마 및 그랜자임 B 수준을 분석하였다. 퀀타레드 ™ 향상된 화학형광 HRP 기질(QuantaRed ™ Enhanced Chemifluorescent HRP Substrate)(ThermoFisher Scientific no.15159)을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고 제조 지침에 따라 사용하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이중-특이적 21D4 x 284A10은 50 pM의 항체에서 PBMC로부터 사중-특이적 항체 SI-34E34와 거의 동일한 높은 수준의 감마 인터페론 분비를 유도하는 반면, 이중-특이적 HD37 x I2C뿐만 아니라 다른 사중-특이적 항체 SI-34E35 및 36은 PBMC로부터 감마 인터페론 분비를 유도하였으나, 훨씬 더 낮은 수준이었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이중-특이적 21D4 x 284A10은 50 pM의 항체에서 PBMC로부터 사중-특이적 항체 SI-34E34와 거의 동일한 반면, 이중 특이적 HD37 x I2C뿐만 아니라 다른 사중-특이적 항체 SI-34E35 및 36은 PBMC로부터 그랜자임 B 분비를 유도하였으나, 약간 더 낮은 수준이었다. 사중-특이적 항체 SI-38E34, 35 및 36에 의해 매개되는 종양 세포 사멸이 도 3에 도시된 바와 매우 유사하였지만, PBMC로부터 분비 된 그랜자임 B의 양은 사중-특이적 항체 SI-38E34에서 다른 2 개의 사중-특이적 항체 SI-38E35 및 36에 비해 약 2 배 높은 수준으로 가장 높았다 .
본 개시는 특정 구현예 또는 실시예들을 참조하여 기술되었지만, 구현예는 예시적이고 본 개시 범위가 그에 따라 제한되지 않는 것으로 이해될 수 있다. 본 개시의 대안적인 구현예는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에게 명백할 수 있다. 이러한 대안적인 구현예는 본 개시의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 따라서, 본 개시의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해 정의되고 전술한 설명에 의해 뒷받침된다. 본 명세서에서 인용되거나 언급된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
다중-특이적 항체 및 이들의 제조 및 사용 방법
서열 목록
사중-특이적 서열 목록
아미노산 서열에서 CDR은 밑줄 그어져 있다.
>서열 번호 1 항-CD3 284A10 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA
>서열 번호 2 항-CD3 284A10 VHv1 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS
>서열 번호 3 항-CD3 284A10 VLv1 nt
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>서열 번호 4 항-CD3 284A10 VLv1 aa
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK
>서열 번호 5 항-CD3 I2C VH nt
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGAGGGGGACTGGTGCAGCCCGGGGGAAGTCTGAAGCTGTCCTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTCAACAAGTACGCCATGAATTGGGTCCGACAGGCCCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCACGGATTCGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCCGGGACGACTCTAAGAACACCGCCTATCTGCAGATGAACAACCTGAAAACCGAGGATACAGCTGTGTACTATTGTGTGCGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACATCTCCTACTGGGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCTAGC
>서열 번호 6 항-CD3 I2C VH aa
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>서열 번호 7 항-CD3 I2C VL nt
CAGACCGTGGTCACCCAGGAACCTTCCCTGACCGTCTCCCCAGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGTGGCTCCTCTACCGGCGCTGTGACCTCCGGCAACTACCCTAACTGGGTGCAGCAGAAACCCGGACAGGCTCCTAGAGGCCTGATCGGCGGCACCAAGTTTCTGGCCCCTGGCACCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCCTGCTGGGAGGCAAGGCCGCTCTGACCCTGTCTGGCGTGCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTACTGTGTGCTGTGGTACTCCAACAGATGGGTGTTCGGAGGCGGCACAAAGCTGACCGTGCTGTCCTCG
>서열 번호 8 항-CD3 I2C VL aa
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSS
>서열 번호 9 항-PD-L1 PL221G5 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>서열 번호 10 항-PD-L1 PL221G5 VHv1 aa
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>서열 번호 11 항-PD-L1 PL221G5 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>서열 번호 12 항-PD-L1 PL221G5 VLv1 aa
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>서열 번호 13 항-4-1BB 420H5 VHv3 nt
CAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>서열 번호 14 항-4-1BB 420H5 VHv3 aa
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>서열 번호 15 항-4-1BB 420H5 VLv3 nt
GCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>서열 번호 16 항-4-1BB 420H5 VLv3 aa
ALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIK
>서열 번호 17 항-4-1BB 466F6 VHv2 nt
CGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCGAGCTCCGCGAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>서열 번호 18 항-4-1BB 466F6 VHv2 aa
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>서열 번호 19 항-4-1BB 466F6 VLv5 nt
GACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGCCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>서열 번호 20 항-4-1BB 466F6 VLv5 aa
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKVEIK
>서열 번호 21 항-4-1BB 460C3 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTAGGAGATACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATATATACTGGTAGCCGCGATACTCCTCACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGAAGGTAGCCTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>서열 번호 22 항-4-1BB 460C3 VHv1 aa
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>서열 번호 23 항-4-1BB 460C3 VLv1 nt
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>서열 번호 24 항-4-1BB 460C3 VLv1 aa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYSNWFSWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGYNTVIDTFAFGGGTKVEIK
>서열 번호 25 항-CD19 21D4 VH nt
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>서열 번호 26 항-CD19 21D4 VH aa
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>서열 번호 27 항-CD19 21D4 VL nt
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
>서열 번호 28 항-CD19 21D4 VL aa
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>서열 번호 29 항-CD19 HD37 VH nt
CAGGTCCAACTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCCTTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGGAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC
>서열 번호 30 항-CD19 HD37 VH aa
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>서열 번호 31 항-CD19 HD37 VL nt
GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGTGAGTTACTTGAACTGGTATCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCTTCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATTAAA
>서열 번호 32 항-CD19 HD37 VL nt
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGVSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
>서열 번호 33 인간 IgG1 무표지(null) (G1m-fa 와 ADCC/CDC 무표지 돌연변이) nt
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>서열 번호 34 인간 IgG1 무표지 (G1m-fa 와 ADCC/CDC 무표지 돌연변이) aa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>서열 번호 35 인간 Ig 카파 nt
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>서열 번호 36 인간 Ig 카파 aa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>서열 번호 37 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) 중쇄 nt
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAACCAGGAGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTAGCAGTTCATGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGGAAAGGCCTGGAATGGATGGGGATCATCTATCCTGATGACTCTGATACCAGATACAGTCCATCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGGACTGCCTACCTGCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCTATGTATTACTGTGCGAGACATGTTACTATGATTTGGGGAGTTATTATTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGAGGTGGTGGCTCCCAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCTTAAGCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>서열 번호 38 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) 중쇄 aa
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQAPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQSLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIACIYVGSSGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSSSYYMFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIK
>서열 번호 39 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) 경쇄 nt
GCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>서열 번호 40 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) 경쇄 aa
ALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (26)

  1. N-말단 및 C-말단을 가지는 사중-특이적(tetra-specific) 항체 단량체로서, N-말단에서 C-말단으로 나란히
    N-말단에 제1 scFv 도메인,
    제2 scFv 도메인,
    Fab 도메인,
    Fc 도메인, 및
    C-말단에 제3 scFv 도메인을 포함하며,
    제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각이 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 가지고, 항원이 종양 항원, 면역 신호전달 항원 또는 이들의 조합인, 사중-특이적 항체 단량체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각이 독립적으로 ROR1, PD-L1, CD3, CD28, 41BB, CEA, HER2, EGFRvIII, EGFR, LMP1, LMP2A, 메소텔린(Mesothelin), PSMA, EpCAM, 글리피메이-3(glypimay-3), gpA33, GD2, TROP2, NKG2D, BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30, PD1, OX40, 4-1BB, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, LIGHT, HVEM, CSF1R, CD73, 및 CD39로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 가지며, Fc 도메인이 인간 IgG Fc 도메인을 포함하는, 사중-특이적 항체 단량체.
  3. 제1항에 있어서, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인, Fab 도메인, 및 제3 scFv 도메인 각각이 독립적으로 CD19, CD3, CD137, 4-1BB, 및 PD-L1로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  4. 제1항에 있어서, 제1 scFv 도메인이 CD19에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  5. 제1항에 있어서, 제2 scFv 도메인이 CD3에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  6. 제1항에 있어서, Fab 도메인이 4-1BB 또는 CD137에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  7. 제1항에 있어서, 제3 scFv 도메인이 PD-L1에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  8. 제1항에 있어서, 제1 scFv 도메인이 CD19에 대한 결합 특이성을 가지며, 제2 scFv 도메인이 CD3에 대한 결합 특이성을 가지고, Fab 도메인이 4-1BB 또는 CD137에 대한 결합 특이성을 가지며, 제3 scFv 도메인이 PD-L1에 대한 결합 특이성을 가지는, 사중-특이적 항체 단량체.
  9. 제1항에 있어서, 제1 scFv 도메인, 제2 scFv 도메인 또는 제3 scFv 도메인이 gly-gly-gly-gly-ser (G4S)n 링커를 포함하며, 여기서 n이 2, 3 또는 4인, 사중-특이적 항체 단량체.
  10. 제1항에 있어서, 서열 번호 37 내지 40에 대해 퍼센트 상동성(percentage homology)을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 퍼센트 상동성이 98% 이상인, 사중-특이적 항체 단량체.
  11. 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30, 32에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 퍼센트 상동성이 98% 이상인, scFv 도메인.
  12. 제1항의 사중-특이적 항체 단량체의 Fab 도메인으로서, 서열 번호 1 내지 12, 26 내지 32에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 퍼센트 상동성이 90% 이상인, Fab 도메인.
  13. 제1항의 사중-특이적 항체 단량체를 포함하는, 사중-특이적 항체.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 38 및 40에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 퍼센트 상동성이 98% 이상인, 사중-특이적 항체.
  15. 서열 번호 37 및 39에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하며, 여기서 퍼센트 상동성이 98% 이상인, 단리된 핵산 서열.
  16. 제15항의 단리된 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  17. 제15항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포로서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인, 숙주 세포.
  18. 사중-특이적 항체 또는 단량체를 생산하는 방법으로서,
    사중-특이적 항체 또는 단량체를 암호화하는 DNA 서열이 발현되도록 단리된 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    상기 사중-특이적 항체를 정제하는 단계를 포함하며,
    여기서 단리된 핵산 서열이 서열 번호 37 내지 40에 대해 퍼센트 상동성을 가지는 아미노산을 암호화하고, 여기서 퍼센트 상동성이 98% 이상인, 방법.
  19. 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 제13항의 정제된 사중-특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 링커를 통해 제13항의 사중-특이적 항체와 연결된 세포독성제 또는 영상화제를 포함하는 면역-컨쥬게이트(immuno-conjugate)로서, 링커가 에스테르 결합, 에테르 결합, 아미드 결합, 디설피드 결합, 이미드 결합, 설폰 결합, 포스페이트 결합, 인 에스테르 결합, 펩타이드 결합, 소수성 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 또는 이들의 조합을 포함하는, 면역-컨쥬게이트.
  21. 제20항에 있어서, 세포독성제가 화학요법제, 성장 저해제, 칼리케아미신(calicheamicin)계의 세포독성제, 항유사분열(antimitotic)제, 독소(toxin), 방사성 동위원소, 독소, 치료제, 또는 이들의 조합인, 면역-컨쥬게이트.
  22. 약학적으로 허용가능한 담체 및 제13항의 사중-특이적 항체, 제20항의 면역-컨쥬게이트 중 하나, 또는 이들 둘 다를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 방사성 동위원소, 방사성핵종(radionuclide), 독소, 항체, 효소, 화학요법제 또는 이들의 조합으로부터 선택된 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제13항에 따른 사중-특이적 항체의 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 인간 대상체를 치료하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 유효량의 치료제를 동시-투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 치료제가 항체, 화학요법제, 효소, 항-에스트로겐제, 티로신 키나아제 수용체 저해제, 키나아제 저해제, 세포 주기 저해제, 체크포인트(check point) 저해제, DNA, RNA, 또는 단백질 합성 저해제, RAS 저해제, PD1, PD-L1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73, CD3, CD19의 저해제 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  26. 유효 농도의 제13항의 사중-특이적 항체를 포함하는 용액으로서, 인간 대상체의 혈장인, 용액.
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