KR20200094183A - 표적 간섭이 억제된 항-약물 항체 분석 - Google Patents

Abstract

혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화하는 면역 분석이 본원에 보고되되, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 면역 분석은, a) 혈청 또는 혈장 샘플을 대략 표적의 pI 값인 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계, b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계, c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 포획 항체 및 검출가능한 표지에 접합된 추적 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계, 및 d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체를 정량화하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화는 단계를 포함한다.

Description

표적 간섭이 억제된 항-약물 항체 분석

본 발명은 항-약물 항체 분석의 분야에 속한다. 치료 약물의 표적으로부터의 간섭이 감소된 항-약물 항체 분석이 본원에 보고된다.

문헌[Moxness, M., et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 1005 (2003) 265-268]은 인슐린 항체(IAB)의 전체 및 Ig 클래스의 방사리간드 결합 분석을 보고하였다. 시험 및 대조군 혈청을 먼저 산성화시켜 결합된 인슐린을 해리시키고, 숯을 첨가하여 혈청 인슐린을 흡착시켰다. 중화 후에, 숯 및 결합된 인슐린을 혈청으로부터 원심분리에 의해 제거하였다. 각각의 분석에서, 인슐린-추출된 혈청 샘플을 방사선 표지된 인슐린과 함께 고수준의 표지되지 않은 인슐린의 존재 및 부재 하에 항온처리하여 비-특이적 결합 및 전체 결합을 각각 측정하였다. 따라서, Moxness 등은 밤새 항온처리 및 산 해리를 비교한, 2개의 ADA 분석 프로토콜의 비교를 보고하였다.

문헌[Patton, A., et al., J. Immunol. Meth. 304 (2005) 189-195]은, 산 해리 단계와 조합으로, 공유결합으로 커플링된 고밀도 항원 표면을 사용하여 인간 혈청에서 항원의 존재 하에, 즉, 과량의 항원의 제거 없이 항체 검출을 가능하게 하는 가교(bridging) ELISA를 보고한다. 따라서, Patton 등은 과량의 항원이 치료 항체의 분석 전에 제거되지 않는 분석 프로토콜을 보고하였다. 상기 저자는 동일한 분석 절차로 산 전처리된 샘플을 전처리되지 않은 샘플과 비교한다.

문헌[Lee, J.W., et al., AAPS J. 13 (2011) 99-110]은 약물 개발을 뒷받침함에 있어서 생분석의 두르러진 추진 요인이 데이터의 의도된 용도임을 보고한다. 현재 사용되는 mAb 및 이의 항원 리간드(L)의 측량의 신뢰할만한 방법론은 효능 및 안전성 평가 및 투여량 선택의 지지에 있어서 노출-반응 관계의 평가에서 중요하다. 리간드-결합 분석(LBA)은 약동력학/약력학(PK/PD) 및 안전성 평가를 지지하는 단백질 생물치료제 및 항원 리간드(L)의 분석을 위해 널리 사용된다. 단클론 항체 약물(mAb), 특히 L에 비-공유결합으로 결합되는 단클론 항체 약물의 경우, 유리 mAb, 유리 L, 및 mAb 및 L의 일가 및/또는 이가 복합체를 포함하는 mAb 및 L의 다수의 형태가 생체내 존재할 수 있다. 투여 후 체내에서 발생하는 동적 결합 평형의 복잡성 및 생분석 동안 평형의 동요의 다수의 근원을 고려하면, 관심 형태(유리 mAb 및 L, 결합된 mAb 및 L, 및 전체 mAb 및 L)의 생체외 정량화는 생체내 실제의 것과 상이할 수 있음이 분명하다. LBA 시약 및 분석 포맷은 이론상으로 mAb 및 L의 전체 또는 유리 형태를 측량하도록 설계될 수 있다. 그러나, 명시된 조건 하에 측량되는 형태의 확인은 기술적으로 도전적일 수 있다.

문헌[Kelly, M., et al., AAPS J., 15 (2013) 646-658]은 최근 증가하는 주목을 받는 한 분야가 "유리" 및 "전체" 분석물의 평가 및 상기 평가에 대한 분석 포맷의 영향이라는 것을 보고한다. 상기 저자는 입수가능한 문헌의 중요한 리뷰를 제공하고, PK 분석 측량에 대한 항-약물 항체의 잠재적 영향을 경감시키는 방법을 향후 탐구한다. 또한, ADA(항-약물 항체) 분석에서 약물 내성을 증가시키는 방법이, 일반적으로 면역 복합체를 분해하고 약물을 추출하는 준비 단계를 수반하여, PK 분석에서 ADA 내성을 평가하거나 증가시키기 위해 다른 용도에 맞게 고쳐질 수 있다. 이러한 도전적인 조작의 이행이 후기 임상 생분석에서 통상적인 것으로 간주되지 않으나, 방법 개발의 조사 단계에서 초기에 가치있는 정보를 약동력학에 해석을 위해 제공할 수 있는 곳에 주목해야 한다. 궁극적으로, 약물의 정량화를 보조하는 데 사용되는 임의의 추출 공정이 "전체" 평가를 초래할 수 있다.

문헌[Davis, R.A., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48 (2008) 897-901]은 포획/산 용리 포맷으로 단일 비-경쟁 MoAb를 사용하여 고수준의 치료적 MoAb의 존재 하에 전체(유리 + 결합된) 바이오마커 농도의 정량화 방법을 보고하였다. 이러한 분석은 200 μ/ml 이상의 치료적 MoAb의 존재 하에 순환하는 바이오마커 수준(ng/ml)를 정확히 검출하고 정량화하는 능력을 갖는다.

문헌[Salimi-Moosavi, H., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 51 (2010) 1128-1133]은 단백질 결합을 해리시키고 우선적으로 ThA를 변성시키는 알칼리 및 산/구아니딘 처리 접근법을 보고하였다. 중화된 항원 단백질은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 이들 방법은 ThA 간섭 없이 전체 항원 단백질의 재현가능한 측량을 제공한다. 항원 단백질 및 ThA를 함유하는 혈청 샘플, 기준물 및 QC를 카제인 또는 산/구아니딘 완충제(pH < 1)를 함유하는 알칼리성 완충제(pH > 13)로 처리하였다. 2개의 상이한 ThA 시스템의 전체 항원 단백질을 성공적으로 측량하였고, 간섭을 처리에 의해 완전히 제거하였다. 이들 방법은 전임상 혈청 샘플의 분석에 성공적으로 적용되었다.

문헌[Smith, H.W., et al., Regul. Toxicol. Pharmacol. 49 (2007) 230-237]은 ELISA 전에 산 해리에 의한 고상 추출(SPEAD) 샘플 처리를 사용하여 잔여 치료 단백질의 존재 하에 치료 단백질에 붙은 항체의 검출을 개시하였다.

고수준의 약물의 존재 하에 단클론 항체 치료제에 대한 항-약물 항체의 검출을 위한 친화도 포획 용리(ACE) 분석이 문헌[Bourdage, J.S., et al., J. Immunol. Meth. 327 (2007) 10-17]에 개시되어 있다.

문헌[Zoghbi, J., et al., J. Immunol. Meth. 426 (2015) 62-69]은 환자 샘플에서 약물의 존재 하에 전체 ADA(유리 ADA 및 약물 결합된 ADA)의 검출을 위한 4가지 요소를 포함하는, 면역원 분석에서 약물 및 표적 간섭 문제를 해결하는 약진적이고 새로운 방법을 개시하였다: (1) 과량의 약물을 사용하여 유리 ADA를 포화시켜 약물 결합된 ADA를 약물:ADA 복합체로서 형성한다, (2) 제제, 예컨대 PEG를 사용하여 복합체를 침전시킨다, (3) 산성 조건 하에 (중화 없이) ADA를 약물로부터 산 해리시키고 대용량 표면 상에 유리 ADA(및 유리 약물)를 고정(포획)시킨다, (4) 특이적 항-인간 Ig 검출 시약을 사용하여 유리 ADA(포획된 약물이 아님)를 검출한다.

고수준의 약물의 존재 하에 단클론 항체 치료제에 대한 항-약물 항체의 검출을 위한 친화도 포획 용리(ACE) 분석이 문헌[Bourdage, J.S., et al., J. Immunol. Meth. 327 (2007) 10-17]에 개시되어 있다.

현재 항-약물 항체(ADA) 분석 최전 기준은 형성된 복합체의 양면 상의 약물(이것이 검출됨)을 사용하는 가교 분석이다. 이는 ADA 동형 및 ADA 특이성을 검출하는 적절한 분석 포맷으로 보인다.

문헌[Collet-Brose, J., et al., J. Immunol. Res., Article ID 5069678 (2016)]은 가장 적절한 약물 및 표적 내성을 나타내는 항-약물 항체 분석을 선택하는 다수의 면역 분석 기술 플랫폼의 평가를 개시하였다. 이러한 연구의 목적은 분석 개발 단계에서 적절한 정도의 정확도에 의해 ADA 분석을 위해 가장 적절한 기술 플랫폼 및 샘플 전처리 절차를 선택하는 것이었다.

WO 2008/031532는 인간 IgG에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 시노몰구스 IgG에 특이적으로 결합하는 항체, 및 이중 항원 가교 면역 분석을 사용한 원숭이 종의 샘플에서 약물 항체(DA) 및 상기 약물 항체에 붙은 항체(항-약물 항체, ADA)의 면역 복합체(DA/ADA 복합체)의 면연학적 측정 방법을 개시하였다. 여기서, 인간 IgG에 교차 결합하지 않는 특이적 항-시노몰구스 원숭이 IgG가 사용되어, 이러한 분석은 인간 샘플을 분석하는 데 사용될 수 없다. 또한, 가용성 치료 표적의 존재는 WO 2008/031532에 보고된 바와 같이 분석에서 위양성 신호를 야기하지 않을 것이다.

WO 2015/123315는 면역 복합체(약물 및 ADA)의 침전을 야기하는 침전 단계 후에, 복합체로부터 ADA의 방출을 야기하는 침전물의 산성화 및 측량가능한 복합체의 최종 설정을 위한 표면에 대한 ADA의 산성 흡착을 포함하는 항-약물 항체의 존재 또는 양의 검출을 위한 분석을 개시하였다.

문헌[Llinares-Tello, F., et al., BMJ 73 (2014) THU0166]은 표준 ADA 분석에서 항-TNF 약물에 의한 처리에서 환자의 면역원 검출에 있어서 산 해리의 유용성을 개시하였다.

약물의 (치료) 표적에 의해 항-약물 항체의 차폐가 감소되거나 심지어 제거되는 항-약물 항체 분석이 본원에 보고된다.

약물의 (치료) 표적의 간섭이 감소되거나 심지어 제거되는, 약물, 이의 표적 및 항-약물 항체를 포함하는 샘플에 특히 유용한 항-약물 항체 분석이 본원에 보고된다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 항-약물 항체의 검출 전에 표적의 pI 값 또는 산성 pH 값에서 수행되는 항온처리 단계가 항-약물 항체 (검출) 분석에서 혈청 또는 혈장 샘플에 존재하는 치료 항체(약물)의 표적으로부터 간섭을 감소시키는 데 사용될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 본 발명에 따른 분석은, 치료 약물의 표적이 응집하는 경향이 있어 비-특이적 결합을 초래하는 경우, 및/또는 표적이 이가/다가여서 분석에서 위양성 신호를 일반적으로 야기하는 경우 특히 유용하다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 면역 분석에서 분석할 샘플에 존재하는 약물(치료 항체)의 가용성 (치료) 표적의 간섭이 분석 절차에서 2개 이상의 산 해리 단계를 사용함으로써 감소되거나 심지어 제거될 수 있다는 발견을 기반으로 한다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 가용성 (치료) 표적의 침전/응집 특성이 ADA 및 약물의 존재 하에 사용되어 면역 분석에서 가용성 (치료) 표적의 간섭을 감소시킬 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 일반적으로 사용되는 낮은 pH 값으로의 산성화는 높은 (백그라운드) 신호를 초래하여 감도 손실을 야기한다(예를 들어 도 18 참조). 가용성 표적 불활성화 단계를 개선하고/표적 간섭을 감소시키기 위해, 분석 절차에 면역 복합체의 침전을 포함시키는 것이 필요하지 않다는 것이 밝혀졌다. 면역 분석의 분석 감도의 개선/가용성 (치료) 표적 간섭의 감소가 침전물의 임의의 분리 및/또는 재현탁 없이 산성화 및 중화에 의해 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 산 처리 단계가 가용성 표적을 (예를 들어 이의 등전점에서/근처에서) 제거, 즉, 침전시키는 데 사용될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 상기 산 처리 단계를 사용하여 샘플의 가용성 (치료) 표적을 제거하고 면역 분석에서 표적 간섭을 감소시키는 것은 본 발명에 따른 방법을 일반적으로 적용가능하게 만든다. 이러한 이론에 구속되지 않고, 가용성 (치료) 표적이 상이한 개체에서 비슷한 양으로 존재하는 것으로 추정될 수 있기 때문에 본 발명에 따른 방법이 미공지된 면역 반응을 사용하는 임상 샘플의 분석에 보다 적합한 것으로 추정된다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 가용성 표적의 pI에서의 항온처리가 면역 분석의 수행의 개선을 위해, 예를 들어 표적 간섭의 감소 또는 분석 감도의 개선에 있어서 유리하다는 발견을 기반으로 한다.

본 발명에 따른 한 양태는, 하기 단계를 (하기 순서로) 포함하는, 표적 간섭이 감소된, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석이다(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있다):

a) 고정된 포획 항체를 약물, 표적 및 항-약물 항체를 포함하는 혈청 또는 혈장 샘플과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체 복합체를 형성하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 형성된 복합체를, 대략 상기 표적의 pI 값인 pH 값을 갖는 당 및 세제를 포함하는 완충제로 세척하는 단계,

c) 상기 단계 b)의 세척된 복합체를 (검출가능한) 표지에 접합된 추적 항체와 함께 12 내지 24시간 동안 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를 형성하는 단계, (및)

d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체에서 (검출가능한) 표지를 측정함으로써 항-약물 항체를 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 약물은 항체(약물 항체)이다.

한 실시양태에서, 추적 항체 및 포획 항체는 약물 항체이다.

한 실시양태에서, 면역 분석은 포획 항체, 추적 항체 및 검출 항체를 포함하되, 상기 포획 항체는 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 약물이고, 상기 추적 항체는 검출가능한 표지에 접합된 약물 항체이고, 효소에 추가로 접합되는 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항체이다.

한 실시양태에서, 포획 항체 및/또는 추적 항체는 서로 독립적으로 전장 약물 항체, 및 약물 항체의 F(ab')2, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 포획 항체 및 추적 항체는 각각 전장 약물 항체, 약물 항체의 F(ab')2 또는 약물 항체의 Fab이다.

한 실시양태에서, 당은 모노사카라이드, 다이사카라이드 또는 트라이사카라이드이다. 한 실시양태에서, 당은 다이사카라이드이다. 한 실시양태에서, 당은 사카로스, 락토스, 말토스, 이소-말토스 및 트레할로스로 이루어진 다이사카라이드의 군으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 당은 사카로스이다.

한 실시양태에서, 당은 약 6.5 중량%의 농도를 갖는다.

한 실시양태에서, 당은 약 6.5 중량% 농도의 사카로스이다.

한 실시양태에서, 세제는 비-이온성 세제이다. 한 실시양태에서, 세제는 폴리알킬렌 글리콜 에터(상표 Brij), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에스터(상표 Tween), 옥틸페놀 에톡시레이트(상표 Trion 또는 Nonident), 옥틸-베타-글리코시드, n-지방산-N-메틸-D-글루카미드(상표 MEGA) 및 N,N'-비스-(3-D-글루콘아미도프로필) 콜아미드(상표 CHAP)로 이루어진 세제의 군으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이다.

한 실시양태에서, 당은 사카로스이고, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이다.

한 실시양태에서, 항온처리는 14 내지 20시간 동안 수행된다. 한 실시양태에서, 항온처리는 15 내지 17시간 동안 수행된다. 한 실시양태에서, 항온처리는 약 16시간 동안 수행된다.

한 실시양태에서, 당은 사카로스이고, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이고, 항온처리는 15 내지 17시간 동안 수행된다.

한 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 결합쌍은 항원/항체 쌍 또는 합텐/항-합텐 항체 쌍이다.

한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴/(스트렙트)아비딘, 테오필린/항-테오필린 항체, 5-브로모-데옥시-우리딘/항-5-브로모-데옥시-우리딘 항체, 디곡시제닌/항-디곡시제닌 항체 및 헬리카/항-헬리카 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴 및 (스트렙트)아비딘이다.

한 실시양태에서, 약물은 항-C5 항체이고, 표적은 인간 C5이다.

한 실시양태에서, 당은 사카로스이고, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이고, 약물은 항-C5 항체이고, 표적은 인간 C5이다.

한 실시양태에서, 당은 사카로스이고, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이고, 약물은 항-C5 항체이고, 표적은 인간 C5이고, 완충제는 약 5.5 또는 약 5.0의 pH 값을 갖는다.

한 실시양태에서, 샘플은 인간 샘플(인간 혈청 또는 혈장 샘플)이다.

본원에 보고된 한 양태는, 하기 단계를 포함하는, 표적 간섭이 감소된, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석이다(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있다):

a) 혈청 또는 혈장 샘플을 대략 표적의 pI 값인 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,

c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 포획 항체 및 검출가능한 표지에 접합된 추적 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계, (및)

d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체를 측량하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 측량하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계(단계 d))는 하기 단계를 포함한다:

d1) 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 결합쌍의 제2 구성원과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계,

d2) 상기 단계 d1)에서 형성된 복합체의 검출가능한 표지를 측정하여 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 결정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 대략 표적의 pI 값에서의 항온처리가 상기 표적의 pI 값보다 0.5 pH 단위 낮은 값 내지 상기 표적의 pI 값보다 0.5 pH 단위 높은 값의 범위의 pH 값에서 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 a)의 항온처리는 교반과 함께 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 a)의 항온처리는 1.5 내지 2.5시간 동안 수행된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 항온처리는 약 2시간 동안 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 b)의 항온처리는 약 5분 동안 수행된다.

한 실시양태에서, 단계 d)의 항온처리는 약 60분 동안 수행된다.

한 실시양태에서, 추적 항체 및 포획 항체는 약물 항체이다.

한 실시양태에서, 면역 분석은 포획 항체, 추적 항체 및 검출 항체를 포함하되, 상기 포획 항체는 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 약물이고, 상기 추적 항체는 검출가능한 표지에 접합된 약물 항체이고, 효소에 접합된 상기 검출 항체는 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항체이다.

한 실시양태에서, 포획 항체 및/또는 추적 항체는 서로 독립적으로 전장 약물 항체, 및 약물 항체의 F(ab')2, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 포획 항체 및 추적 항체는 각각 전장 약물 항체, 약물 항체의 F(ab')2 또는 약물 항체의 Fab이다.

한 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 결합쌍은 항원/항체 쌍 또는 합텐/항-합텐 항체 쌍이다.

한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴/(스트렙트)아비딘, 테오필린/항-테오필린 항체, 5-브로모-데옥시-우리딘/항-5-브로모-데옥시-우리딘 항체, 디곡시제닌/항-디곡시제닌 항체 및 헬리카/항-헬리카 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴 및 (스트렙트)아비딘이다.

한 실시양태에서, 약물은 항-C5 항체이고, 표적은 인간 C5이다. 한 실시양태에서, 단계 a)의 pH 값은 pH 4.7 내지 pH 5.5 범위이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 단계 a)의 pH 값은 약 pH 5.0 또는 약 pH 5.5이다.

한 실시양태에서, 표적 간섭이 감소된, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석은 하기 단계를 포함한다(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 인간 C5에 특이적으로 결합할 수 있는 항-C5 항체이다):

a) 혈청 또는 혈장 샘플을 4.7 내지 5.5 범위의 pH 값에서 1.5 내지 2.5시간 동안 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 약 5분 동안 항온처리한 후에, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,

c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 비오틴에 접합된 포획 약물 항체 및 디곡시제닌에 접합된 추적 약물 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계,

d) 상기 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 (스트렙트)아비딘과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계, (및)

e) 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체와 함께 항온처리한 후에, HPPA 또는 TMB와 함께 항온처리하여 상기 단계 d)에서 형성된 디곡시제닌을 측정하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화함으로써 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계(형성된 복합체를 샘플의 ADA의 양과 상관관계를 보여주는 단계).

모든 양태의 한 실시양태에서, 샘플은 동물로부터 기원한다. 한 실시양태에서, 동물은 인간 및 실험 동물로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 샘플은, 샘플을 수득하기 전에 약물을 투여받은 동물로부터 기원한다. 한 실시양태에서, 샘플은, 샘플을 수득하기 전에 약물을 투여 받은, 약물에 의한 치료가 필요한 환자로부터 기원한다. 어떤 경우에도, 본원에 보고된 방법이 샘플에 의해 수행된 후에 샘플은 생물에 재적용되지 않는다.

모든 양태의 한 실시양태에서, 샘플은 인간 샘플(인간 혈청 또는 혈장 샘플)이다.

모든 양태의 한 실시양태에서, 복합체는 비-공유결합 복합체이다.

일반적으로, 면역 분석은 하기 단계를 포함한다:

a) 포획 항체를 고체 표면 상에 고정시키고, 임의적으로 상기 고정 단계 후에 상기 표면을 세척하여 미결합된 포획 항체 및 비-특이적으로 결합된 포획 항체를 제거하는 단계,

b) 상기 단계 a)의 고정된 포획 항체를, 면역 분석의 검출 범위 내의 항-약물 항체 농도를 갖도록 임의적으로 희석된 혈청 또는 혈장 함유 샘플과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 샘플 및 비-특이적으로 결합된 샘플을 제거하는 단계,

c) 상기 단계 b)의 포획 항체-항-약물 항체-복합체를, 표지된 추적 항체와 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 추적 항체 및 비-특이적으로 결합된 추적 항체를 제거하는 단계,

d) 상기 단계 c)의 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를, 효소에 접합된 추적 항체의 표지에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-검출 항체 복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 검출 항체 및 비-특이적으로 결합된 검출 항체를 제거하는 단계,

e) 상기 단계 d)의 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-검출 항체 복합체를, 기질 상에서 효소의 작용시 효소의 무색 기질이 유색 반응 생성물로 전환되는 효소의 무색 기질과 함께 항온처리하고, 사전 정의된 시간 후에 광학 밀도를 측정하는 단계, (및)

f) 상기 단계 e)에서 측정한 광학 밀도를 검량선과 상호연관시켜 샘플의 항-약물 항체의 양을 측정하는 단계.

시험관내 또는 생체내 기관의 샘플의 치료 항체(약물 또는 간략히 D) 및 상기 치료 항체에 붙은 각각의 항체(항-약물 항체 또는 또는 간략히 ADA)의 분석을 위해, 각각의 분석이 필요하다.

ADA는 이의 항원(시험관내 및 생체내), 즉, 치료 항체/약물에 결합하고, 유리 ADA와 유리 약물 사이의 평형, 뿐만 아니라 모노- 및 다이-복합체화된 약물(이가 단일특이적 약물을 나타냄)이 형성된다. 이러한 평형은 동적 평형이다, 즉, 이러한 평형에 가담하는 하나의 요소의 농도 변화가 이러한 평형에 가담하는 모든 다른 요소의 농도를 변화시킨다.

유리 ADA, 즉, 결합하지 않은 ADA의 분율이 생체내 결합에 대한 약물의 유용성 및 ADA의 항원, 즉, 약물에 대한 ADA의 결합 능력과 연관성을 나타내는 반면에, 전체 ADA의 측정은 ADA와 약물 사이의 상호 작용을 특성규명하는 데 사용될 수 있다.

약물의 전체 약동학 평가를 위해, 예를 들어 전신 순환에 있어서 유리, 즉, 약물-결합 역량이 있거나 약물과의 복합체로 존재하는 ADA 농도의 이해가 중요하다. 유리 ADA는 잠재적 바이오마커로서 평가될 수 있다.

샘플의 ADA 측정을 위한 분석은 약물의 항원이 샘플에 존재하는 경우 간섭 당할 수 있다. 약동학 평가를 위해, 약물에 결합할 수 있거나 결합한 ADA 분율이 중요하다.

용어 "치료 항체" 및 "약물"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체) 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우)을 포함하는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.

특정 실시양태에서, 약물은 단일특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 약물은 단일특이적 이가 항체이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 약물은 단클론 단일특이적 이가 항체이다.

특정 실시양태에서, 약물은 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 제1 항원에 대한 것이고, 나머지 하나는 상이한 제2 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 제1 및 제2 항원에 결합하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 i) 제1 항원, 또는 항원 상의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성, 및 ii) 제2 항원, 또는 (동일한) 항원 상의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, 동일한 항원 상의 제2 에피토프는 중첩하지 않는 에피토프이다. 한 실시양태에서, 항체는 이중특이적 이가 항체이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 항체는 단클론 이중특이적 이가 항체이다.

다중특이적 항체는 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 또는 WO 2010/145793에 기재되어 있다.

용어 "항-C5 항체" 및 " C5에 (특이적으로) 결합하는 항체"는 충분한 친화도에 의해 C5에 결합하는 항체를 지칭하며, 상기 항체는 C5를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용하다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-C5 단백질에 대한 항-C5 항체의 결합의 정도는 C5에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 이하이다. 특정 실시양태에서, 항-C5 항체는 상이한 종의 C5 중에서 보존된 C5의 에피토프에 결합한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, C5는 인간 C5이다.

본원에 사용된 용어 "C5"는 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어 인간 및 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C5를 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "C5"는 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 갖고 서열번호 31에 나타낸 베타쇄 서열을 함유하는 인간 C5 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 C5, 및 세포에서의 처리로부터 야기된 임의의 형태의 C5를 포괄한다. 또한, 상기 용어는 C5의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적 인간 C5의 아미노산 서열은 서열번호 30("야생형" 또는 "wt" C5)에 나타나 있다. 인간 C5의 예시적 베타쇄의 아미노산 서열은 서열번호 31에 나타나 있다. 인간 C5의 베타쇄의 예시적 MG1, MG2 및 MG1-MG2 도메인의 아미노산 서열은 각각 서열번호 32, 33 및 34에 나타나 있다. 예시적 시노몰구스 원숭이 및 뮤린 C5의 아미노산 서열은 각각 서열번호 35 및 96에 나타나 있다. 서열번호 30, 31, 34, 35 및 96의 아미노산 잔기 1 내지 19는 세포에서의 처리 동안 제거되어 해당하는 예시적 아미노산 서열로부터 누락되는 신호 서열에 해당한다.

본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단(즉, 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고(이러한 변이체는 일반적으로부수적인 양으로 존재한다) 상기 집단을 구성하는 개별적 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다)으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)를 지향하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정 인자를 지향한다. 따라서, 수식어 "단클론"은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역 글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환된 동물을 사용하는 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 상기 방법 및 기타 예시적인 단클론 항체의 제조 방법이 본원에 기재된다.

상이한 면역 분석의 원리가 예를 들어 문헌[Hage, D.S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R]에 기재되어 있다. 문헌[Lu, B., et al., Analyst 121 (1996) 29R-32R]은 면역 분석에서 사용하기 위한 항체의 배향된 고정을 보고한다. 아비딘-비오틴-매개된 면역 분석은 예를 들어 문헌[Wilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469]에 보고되어 있다.

단클론 항체 및 이의 불변 도메인은 결합쌍의 구성원, 예컨대 폴리펩티드/단백질, 중합체(예를 들어 PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티올) 또는 효소를 접합시키기 위한 많은 반응성 아미노산 측쇄를 함유한다. 아미노산의 화학적 반응성 기는 예를 들어 아미노 기(리신, 알파-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카복시산 기(아스파르트산, 글루탐산) 및 당-알코올성 기이다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Aslam M., and Dent, A., "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pages 50-100]에 기재되어 있다.

항체의 가장 통상적인 반응성 기 중 하나는 지방족 ε-아민인 아미노산 리신이다. 일반적으로, 거의 모든 항체는 풍부한 리신을 함유한다. 리신 아민은 pH 8.0 초과(pKa = 9.18)에서 타당하게 양호한 친핵체이고, 따라서 다양한 시약과 용이하고 깔끔하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 아민-반응성 시약은 주로 리신 및 단백질의 α-아미노 기와 반응한다. 반응성 에스터, 특히 N-하이드록시-석신이미드(NHS) 에스터는 아민 기의 변형을 위해 가장 통상적으로 사용되는 시약이다. 수성 환경에서의 반응에 최적인 pH는 pH 8.0 내지 9.0이다. 이소티오시아네이트는 아민-변형 시약이고 단백질과의 티오우레아 결합을 형성한다. 이는 수용액(pH 9.0 내지 9.5에서 최적)에서 단백질 아민과 반응한다. 알데하이드는 온화한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 하이드라진 및 하이드라지드와 반응하여 이민 중간체(시프(Schiff) 염기)를 형성한다. 시프 염기는 약한 또는 강한 환원제(예컨대 나트륨 보로하이드라이드 또는 나트륨 시아노보로하이드라이드)에 의해 선택적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 변형하는 데 사용되는 다른 시약은 산 무수물이다 예를 들어, 다이에틸렌트라이아민펜타아미노산 무수물(DTPA)은 2개의 아민-반응성 무수물 기를 함유하는 이작용성 킬레이트화제이다. 이는 아미노산의 N-말단의 ε-아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개환되어 배위 착체에서 금속과 단단히 결합할 수 있는 다가의 금속-킬레이팅 아암(arm)을 형성한다.

항체의 또 다른 통상적 반응성 기는 황 함유 아미노산 시스틴 및 이의 환원 생성물 시스테인(또는 하프 시스틴)의 티올 잔기이다. 시스테인은, 아민보다 친핵성이고 일반적으로 단백질에서 가장 반응성 작용기인 유리 티올 기를 함유한다. 티올은 일반적으로 중성 pH에서 반응성이고, 따라서 아민의 존재 하에 선택적으로 다른 분자에 커플링할 수 있다. 유리 설피하이드릴 기는 비교적 반응성이기 때문에, 이들 기를 갖는 단백질은 흔히 이들 기를 다이설파이드 기 또는 다이설파이드 결합으로서 이들 기의 산화된 형태로 갖는다. 이러한 단백질에서, 시약, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT)에 의한 다이설파이드 결합의 환원이 반응성 유리 티올을 생성하는 데 필요하다. 티올-반응성 시약은 폴리펩티드 상의 티올 기에 커플링하여 티오에터-커플링된 생성물을 형성하는 것이다. 이들 시약은 약간 산성 내지 중성 pH에서 신속히 반응하고, 따라서 아민 기의 존재 하에 선택적으로 반응할 수 있다. 문헌은, 다수의 설피하이드릴 기를 반응성 아미노 기를 통해 도입하는 효율적인 방법을 제공하는, 여러 티올화 가교결합 시약, 예컨대 트라우트(Traut) 시약(2-이미노티올란), 석신이미딜 (아세틸티오) 아세테이트(SATA) 및 설포석신이미딜 6-[3-(2-피리딜다이티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트(Sulfo-LC-SPDP)의 사용을 보고한다. 할로아세틸 유도체, 예를 들어 요오도아세트아미드는 티오에터 결합을 형성하고, 또한 티올 변형을 위한 시약이다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약의 반응은 요오도아세트아미드와의 반응과 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약간 산성 내지 중성 pH에서 신속히 반응한다.

항체의 또 다른 통상적인 반응성 기는 카복시산이다. 항체는 C-말단 위치에 및 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에 카복시산 기를 함유한다. 수중 카복시산의 비교적 낮은 반응성은, 선택적으로 폴리펩티드 및 항체를 변형시키는 데 이들 기를 사용하는 것을 어렵게 만든다. 이것이 완료될 때, 카복시산 기는 일반적으로 수용성 카보다이이미드의 사용에 의해 반응성 에스터로 전환되고 친핵성 시약, 예컨대 아민, 하이드라지드 도는 하이드라진과 반응한다. 아민 함유 시약은 보다 고도로 염기성인 ε-아민인 리신의 존재 하에 활성화된 카복시산과 선택적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하기 위해 약하게 염기성이어야 한다. 단백질 가교결합은 pH가 8.0 초과로 상승할 때 발생할 수 있다.

과옥소산 나트륨은 항체에 부착된 탄수화물 잔기 내의 당의 알코올 부분을 알데하이드로 산화시키는 데 사용될 수 있다. 각각의 알데하이드 기는 카복시산에 대해 기재된 바와 같이 아민, 하이드라지드 또는 하이드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 잔기가 항체의 결정화가능한 단편 영역(Fc-영역) 상에 대게 발견되기 때문에, 접합은 항원-결합 부위를 떠나 탄수화물의 위치-지향성 변형을 통해 달성될 수 있다. 시프 염기 중간체가 형성되고, 이는 나트륨 시아노보로하이드라이드(약한 또는 선택적) 또는 나트륨 보로하이드라이드(강한) 수용성 환원제에 의한 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.

접합 파트너에 대한 추적 및/또는 포획 및/또는 검출 항체의 접합은 상이한 방법, 예컨대 화학 결합 또는 결합쌍을 통한 결합에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "접합 파트너"는 예를 들어 고체 지지체, 폴리펩티드, 검출가능한 표지, 결합쌍의 구성원을 나타낸다. 한 실시양태에서, 접합 파트너에 대한 포획 및/또는 추적 및/또는 검출 항체의 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 항체의 아미노산 주쇄의 카복시-, 설피하이드릴-, 하이드록시 및/또는 페놀성 작용기, 및/또는 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학 결합에 의해 수행된다. 한 실시양태에서, 포획 항체는 이의 접합 파트너에 결합쌍을 통해 접합된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 포획 항체는 비오틴에 접합되고, 고체 지지체에 대한 고정은 고체 지지체 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다. 한 실시양태에서, 포획 항체는 이의 접합 파트너에 결합쌍을 통해 접합된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 추적 항체는 디곡시제닌에 공유결합에 의해 검출가능한 표지로서 접합된다.

용어 "샘플"은 비제한적으로 살아있는 것 또는 과거에 살아있던 것으로부터의 임의의 수량의 물질을 포함한다. 이러한 생물은 비제한적으로 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼 및 기타 동물을 포함한다. 한 실시양태에서, 샘플은 원숭이, 특히 시노몰구스 원숭이, 토끼, 마우스, 래트 또는 인간로부터 수득된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 인간 샘플이다. 이러한 물질은 비제한적으로 한 실시양태에서 개체로부터의 전혈, 혈장 또는 혈청을 포함하고, 이는 임상 루틴에서 가장 널리 사용되는 샘플의 공급원이다.

용어 "고상"은 비-유체 물질을 나타내고, 물질, 예컨대 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹으로부터 제조된 입자(마이크로 입자 및 비드 포함); 겔 물질, 예컨대 실리카, 알루미나 및 중합체 겔; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 고상 성분은, "고상"이 이의 표면 상에 샘플에서 물질과 상호작용하도록 의도된 하나 이상의 모이어티를 함유한다는 점에서 불활성 고체 표면과 구별된다. 고상은 정지 성분, 예컨대 튜브, 스트립, 큐벳 또는 마이크로타이터 플레이트일 수 있거나, 비-정지 성분, 예컨대 비드 및 마이크로 입자일 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비-공유결합 또는 공유결합 부착을 허용하는 다양한 마이크로 입자가 사용될 수 있다. 이러한 입자는 중합체 입자, 예컨대 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트); 금 입자, 예컨대 금 나노 입자 및 금 콜로이드; 및 세라믹 입자, 예컨대 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A] 또는 [Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23]을 참조한다.

크로모겐(형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성기 또는 금속 입자, 합텐, 예를 들어 디곡시제닌이 "검출가능한 표지"의 예이다. 또한, 검출가능한 표지는 광 활성화 가교결합 기, 예를 들어 아지도 또는 아지린 기일 수 있다. 또한, 전자화학 발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트가 바람직한 신호-방출 기이며, 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄 (비스피리딜)₃ ²⁺ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지 기는 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138에 기재되어 있다. 직접 검출을 위해, 표지 기는 임의의 공지된 검출가능한 마커 기, 예컨대 염료, 발광 표지 기, 예컨대 화학 발광 기, 예를 들어 아크리디늄 에스터 또는 다이옥세탄, 또는 형광 염료, 예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레조루핀, 시아닌 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지 기의 다른 예는 발광 금속 착체, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착체, 효소, 예를 들어 ELISA 또는 CEDIA(클로닝된 효소 공여자 면역 분석, 예를 들어 EP-A-0 061 888)에 사용되는 효소, 및 방사성 동위원소이다.

간접 검출 시스템은 예를 들어 검출 시약, 예를 들어 검출 항체가 결합쌍의 제1 파트너에 의해 표지되는 것을 포함한다. 적합한 결합쌍의 예는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 제1 결합쌍 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 합텐은 디곡신, 디곡시제닌, 비오틴 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 결합쌍의 제2 파트너, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은 일반적으로 직접 검출을 위해 예를 들어 상기에 언급된 표지에 의해 표지된다.

용어 "면역 분석"은 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 항체를 사용하여 정성 또는 정량 분석을 위한 특이적 표적을 포획하고/하거나 검출하는 임의의 기술을 나타낸다. 일반적으로, 면역 분석은 하기 단계를 특징으로 한다: 1) 분석물의 고정 또는 포획, 및 2) 분석물의 검출 및 측량. 분석물을, 임의의 고체 표면, 예컨대 막, 플라스틱 플레이트 또는 몇몇 다른 고체 표면 상에 포획, 즉, 결합시킬 수 있다.

면역 분석은 일반적으로 3개의 상이한 포맷으로 수행될 수 있다. 하나는 직접 검출에 의한 것이고, 하나는 간접 검출에 의한 것이고, 하나는 샌드위치 분석에 의한 것이다. 직접 검출 면역 분석은 직접 측량될 수 있는 검출 (또는 추적) 항체를 사용한다. 효소 또는 기타 분자가, 신호를 시각화하거나 측량할 수 있도록 하는 색, 형광 또는 발광을 생성하는 신호의 생성을 가능하게 한다(방사성 동위원소가 오늘날 통상적으로 사용되지는 않으나 사용될 수 있다). 간접 분석에서는, 분석물에 결합하는 일차 항체가 일차 항체에 의해 제공되는 표적에 특이적으로 결합하는 이차 항체(추적 항체)(탐지 또는 추적 항체로도 지칭됨)에 대해 정의된 표적을 제공하는 데 사용된다. 이차 항체는 측량가능한 신호를 생성한다. 샌드위치 분석은 2개의 항체, 포획 및 추적 (탐지) 항체를 사용한다. 포획 항체는 용액으로부터 분석물을 결합(고정)시키거나 용액 중의 분석물에 결합하는 데 사용된다. 이는 분석물이 샘플로부터 특이적으로 제거되는 것을 가능하게 한다. 추적 (탐지) 항체는 (상기에 기재된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 생성하는 제2 단계에 사용된다. 샌드위치 포맷은 각각 표적 분자 상의 별개의 에피토프를 갖는 2개의 항체를 필요로 한다. 또한, 이는 둘 모두의 항체가 동시에 표적에 결합되어야 하기 때문에 서로 간섭하지 않아야 한다.

본 발명에 따른 방법의 실시양태

ADA 분석의 약물 간섭은 일반적으로 공지된 현상이나, ADA 분석의 약물의 표적의 간섭은 아니다.

일반적으로, 산 해리 후에, 중화 단계는 산 또는 염기 해리에 뒤따라 결합 파트너가 가교하는 것을 허용하여 문제를 유지하면서 용액에서 재결합될 경우에도 새로 간섭 인자를 야기한다.

많은 접근법, 예컨대 산 또는 염기 해리, 특이적 항체를 사용하는 간섭의 경쟁적 억제, 간섭 인자의 제거, 산 해리에 의한 고상 추출(SPEAD), 친화성 포획 용리(ACE) 및 그외 다수가 이러한 문제를 경감시키는 데 사용되었다. 가교 분석에서 산 해리의 사용은 ADA의 검출에서 약물 내성의 몇몇 개선을 나타냈다(예를 들어 문헌[Moxness, M., et al., Clin. Chem. 51 (10), 1983]; [Patton, A., et al., J. Immunol. Methods 304 (2005) 189] 참조).

표적 분자 또는 면역 복합체의 PEG 침전은 크기(또는 분자량, MW)을 기초로 하고 PEG 농도에 의존적이다. PEG 농도가 높을수록, 침전할 MW 목표가 낮아진다. 비-특이적 혈청 단백질, 예컨대 알부민 및 면역 글로불린의 침전을 감소시키기 위해, 저농도의 PEG가 사용되어 큰 MW 약물:ADA 면역 복합체를 침전시키는 데 사용된다. 산성 조건 하에(결합 파트너가 재결합하는 것을 방지함) 산 해리 및 고용량 표면 상의 포획과 결합된 침전 원리를 사용하는 것은 특이적 검출 시약을 사용하여 ADA 또는 약물 또는 약물 표적의 특이적 검출을 가능하게 한다.

산 해리가, 약물-ADA-복합체를 분열시켜 ADA를 상기 면역 복합체로부터 방출시키는 데 통상적으로 사용된다. 방출된 (유리) ADA는 후속 단계에서 검출 항체와의 복합체를 형성할 수 있다. 산 해리 단계는 종래의 ADA 분석(산 해리 단계 없음)과 비교하여 전체 분석 시간을 단축시킬 수 있다. 일반적으로, 주안점은 비슷한 감도이다.

일반적으로, 표준 ADA 분석은, 잔여 약물의 존재 하에 ADA와 시약 사이의 새로운 평형을 형성하기 위한 긴 항온처리 시간의 단점을 갖는다. 짧은 항온처리 시간이 적용되는 경우, 단지 낮은 약물 내성이 수득될 수 있다(=잔여 약물의 존재 하에 낮은 감도).

측량가능한 복합체의 형성은 시간이 걸리며 시약에 대한 ADA의 결합 속도 상수에 좌우된다. 표준 ADA 분석을 위해, 면역 복합체의 해리 속도 상수는 시간 제한 단계이다. 이러한 이유로, 보다 긴 항온처리 시간(통상적으로 밤새)이 샘플 및 시약의 항온처리에 적용된다.

따라서, 산 해리는 대게 복합체 해리 절차이다.

본 발명에 따른 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석이다(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있다):

a) 고정된 포획 항체를 약물, 표적 및 항-약물 항체를 포함하는 혈청 또는 혈장 샘플과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체 복합체를 형성하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 형성된 복합체를, 대략 상기 표적의 pI 값인 pH 값을 갖는 당 및 세제를 포함하는 완충제로 세척하는 단계,

c) 상기 단계 b)의 세척된 복합체를 표지된 추적 항체와 함께 12 내지 24시간 동안 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를 형성하는 단계, (및)

d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체의 검출가능한 표지를 측정함으로써 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 당은 사카로스이고, 세제는 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이고, 약물은 항-C5 항체이고, 표적은 인간 C5이고, 완충제는 약 5.5의 pH 값을 갖는다.

본 발명에 따른 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석이다(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체는 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있다):

a) 혈청 또는 혈장 샘플을 대략 표적의 pI 값인 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,

c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 포획 항체 및 검출가능한 표지에 접합된 추적 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계, (및)

d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체를 측량하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 측량하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계(단계 d)는 하기 단계를 포함한다:

d1) 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 결합쌍의 제2 구성원과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계, (및)

d2) 상기 단계 d1)에서 형성된 복합체의 검출가능한 표지를 측정하여 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

한 실시양태에서, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 면역 분석(여기서, 상기 항-약물 항체는 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 약물 항체는 인간 C5에 특이적으로 결합할 수 있는 항-C5 항체이다)은 하기 단계를 포함한다:

a) 혈청 또는 혈장 샘플을 4.7 내지 5.5 범위의 pH 값에서 1.5 내지 2.5시간 동안 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,

b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 약 5분 동안 항온처리한 후에, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,

c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 비오틴에 접합된 포획 약물 항체 및 디곡시제닌에 접합된 추적 약물 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계,

d) 상기 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 (스트렙트)아비딘과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계, (및)

e) 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체와 함께 항온처리한 후에, HPPA 또는 TMB와 함께 항온처리하여 상기 단계 d)에서 형성된 복합체의 디곡시제닌을 측정하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화함으로써 항-약물 항체의 양을 검출하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하는 단계.

본원에 보고된 분석은 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 측량 및/또는 측정 및/또는 정량화에 있어서 치료 약물의 표적의 간섭을 해결한다.

일반적으로, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체(ADA)의 측정 및/또는 측량 및/또는 정량화에 있어서 약물로부터의 간섭이 해결되어야 한다. 따라서, 방안은 항-약물 항체에 대한 높은 특이적 감도일 수 있고, 이는 유리 항-약물 항체를 향하는 샘플의 평형에 영향을 미치거나 샘플 전처리에 의해 ADA-약물 복합체를 해리시키거나 ADA-약물 복합체를 검출하거나 ADA를 풍부하게 한다.

그러나, 샘플에서 약물의 표적의 간섭은 해결되지 않는다.

본원에 보고된 면역 분석은 치료 항-C5 항체를 사용하여 하기에 예시된다. 이는 단지 본원에 보고된 면역 분석의 예시로서 제시되며 본 발명의 제한으로서 해석되어서는 안된다.

인간 C5는 약 70 μg/ml(약 368 nM)의 혈청 농도를 갖는다.

상이한 샘플 희석(1:100, 1:1000), 상이한 포획 항체 및 추적 항체 농도(각각 500 ng/ml, 각각 1000 ng/ml, 각각 1500 ng/ml, 각각 2000 ng/ml), 상이한 퍼옥시다제 농도(1000 ng/ml 포획 및 추적 항체 농도에서 5 mU, 10 mU, 25 mU, 50 mU)를 평가하였다(도 1 및 2 참조). 모든 실험에서, 시약에 의한 샘플 항온처리를 밤새 수행하였다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 포획 항체 및 추적 항체 농도가 500 ng/ml 이상이어야 하고, 1500 ng/ml 이상인 경우 추가적 신호 이득이 달성될 수 없다는 발견을 기반으로 한다.

그러나, 꽤 높은 백그라운드가 존재한다.

1%(v/v) 인간 혈청의 존재 하에 비-특이적 결합을 관찰할 수 있었다. BSA에 의한 플레이트의 차단은 비-특이적 결합의 문제를 해결하지 않았다.

Bi/Dig 시약의 부재 하에도 높은 신호가 수득되었음을 알 수 있다(열 "-/-"). 다른 것들에 비해, 더 많이 검출 시약의 비-특이적 결합이 관찰되었다(열 "-/Dig").

세제(Brij 35)의 첨가에 의해, 비-특이적 결합의 감소가 관찰되었다("-/-", "Bi/-" 및"-/Dig" 열 참조). 세제의 부재 하에, 컷-포인트(cut-point, CP)는 10240(약 2562 ng/ml)("Bi/Dig" 열 참조)인 반면에, 세제의 존재 하에 CP는 4708(약 817 ng/ml)("Bi/Dig" 열 참조)이었다. 그러나, 개체의 변동 계수(CV)는 높다.

검출 효소에 대한 기질의 교환은 신호 대 잡음(S/N) 비를 감소시킬 수 있다.

HPPA의 사용시 컷-포인트(CP)는 4708(약 817 ng/ml)인 반면에, TMB의 사용시 CP는 0.162(약 845 ng/ml)였다.

장기간 항온처리(밤새 항온처리)를 피하기 위해, 산 해리 단계를 도입하였다. 방법은 pH 2에서 30-분 항온처리 후에, pH 7.4로의 pH 조절, 비오틴일화된 포획 항체 및 디곡시제닐화된 추적 항체의 첨가 및 1-시간 항온처리를 포함한다.

8개의 개별 샘플을 기반으로, 9%의 변동 계수와 함께 4410 형광 단위의 평균 값을 측정하였다. 컷-포인트는 5059 형광 단위(1915 ng/ml)였다. 따라서, 산 해리 단계의 도입은 감도의 개선을 야기하지 않았다.

혈장 또는 혈청의 존재는 분석 특성을 유의미하게 변화시키지 않았다. 인간 및 NHP 혈청은 유사한 분석 결과를 제공한다(도 3 참조).

말 및 토끼 혈청은 완충제와 유사한 결과를 제공한다. 말 및 토끼 C5는 교차 반응성이 아니다. C5 결핍된 인간 혈청의 블랭크 신호는 완충제와 비슷하고, 희석물 4에 의한 신호는 인간 풀 혈청보다 낮다(도 4 참조).

분석 성능은 샘플에서 말 혈청 및 말 C5 함량의 증가에 의해 손상되었다(도 5 참조).

마찬가지로, 인간 C5의 첨가는 신호의 증가를 유발하고, 이는 분석 간섭이 샘플의 치료 항체의 표적에서 기인한다는 것을 확인시켜준다(도 6 참조).

가교 분석의 보정이 C5 및 대조군 pAb 모두의 경우 가능하다, 즉, C5가 분석에서 신호를 야기함이 밝혀졌다(도 7 참조). 이러한 이론에 구속되지 않고, 점착성의 C5 응집체가 문제점을 야기한다는 것이 추정된다(도 8(세척 완충제 pH 7.4) 및 도 9(세척 완충제 pH 5.5) 참조).

C5 및 pAb 모두가 치료 약물에 결합하는 것이 밝혀졌다. 보다 높은 약물 대 C5 비는 보다 낮은 반응을 야기하고, 이는 비-특이적 결합 없음을 시사한다(도 10의 BIAcore 데이터 참조).

C5 및 pAb 모두가 치료 약물 사전 코팅된 표면을 사용하여 치료 약물에 결합한다는 것이 밝혀졌다. C5의 포획 후에, 표면은 치료 약물에 결합할 수 있고, 이는 유리 에피토프가 여전히 존재하며, 이는 응집된 C5의 경우임을 시사한다(도 11 참조).

이러한 발견을 기반으로, 방법은 5.5의 pH 값의 완충제에 의한 6회의 세척 단계를 사용함으로써 추가로 개조되었다. 이러한 이론에 구속되지 않고, 이는 포획된 응집체의 양/수량을 감소시킨다.

S/N 비는 희석에 의해 낮아진다. 컷-포인트 값 및 최저 교정기는 1% 및 0.1% 혈청 함유 샘플에서 유사하다. 컷-포인트는 혈청의 양성 대조군에서 약 100 ng/ml이다.

분석을 본원에 보고된 발견에 조정하여 4℃에서 약 16시간 동안(밤새) 항온처리의 수행, 분석 완충제 중의 6.5 중량% 사카로스의 첨가 및 비-이온성 세제 Brij 35의 첨가에 의해 응집체의 형성을 감소시켰다.

분석을 5.5의 pH 값을 갖는 세척 완충제를 사용하여 추가로 조정하여 치료 약물과 표적, 즉, C5의 상호작용을 감소시켰다.

상기에 개괄된 발견을 기반으로, ta 샘플의 항-약물 항체의 측정 및/또는 측량 및/또는 정량화 전에 샘플에 존재하는 C5 응칩체를 제거하는 새로운 분석 포맷을 확립하였다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은, 치료 항체의 표적이 대략 이의 pI 값인 pH 값에서 침전하는 특이적 침전 단계를 포함한다. 치료 약물로서 항-C5 항체의 경우, 표적은 인간 C5이고, 침전은 4.7 내지 5.5 범위의 pH 값에서 항온처리에 의해 달성된다. 한 실시양태에서, 항온처리는 약 5의 pH 값에서 수행된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 항온처리는 약 5의 pH 값에서 약 2시간 동안 임의적으로 교반과 함께 수행된다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은 특이적 침전 단계 후에 산 해리 단계를 포함한다. 이 단계에서, 이러한 이론에 구속되지 않고, ADA(항-항-C5 항체-항체; 항-약물 항체)는 침전물로부터 해리된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 산 해리는 약 2의 pH 값에서 약 5분 동안 항온처리에 의해 수행된다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은 산 해리 단계 후에 원심분리 단계를 임의적으로 포함한다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은 산 해리 단계 후에, 샘플의 pH 값을 약 7.4로 조정하는 단계 후에, 포획 항체 및 추적 항체의 첨가 및 후속 항온처리의 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 항체 및 추적 항체는 약물 항체이다. 한 실시양태에서, 포획 항체는 결합쌍의 제1 구성원에 접합된다. 한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴/(스트렙트)아비딘, 합텐/항-합텐 항체, 핵산/상보적 핵산 및 리간드/리간드 수용체로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 결합쌍은 비오틴/(스트렙트)아비딘이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 포획 항체는 비오틴에 접합된다. 한 실시양태에서, 추적 항체는 검출가능한 표지에 접합된다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은 포획 및 추적 항체와의 항온처리 단계 후에, 결합쌍의 제2 구성원으로부터 유도된 고상 상에 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체의 고정을 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 결합쌍의 제2 구성원은 (스트렙트)아비딘이다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은, 고정 단계 후에, 고정된 복합체를, 무색 기질을 유색 생성물로 전환시키는 것에 촉매 작용하는 효소에 접합된 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 항온처리한 후에, 효소의 무색 기질과 함께 항온처리하고, 형성된 유색 생성물 양을 측정하고 형성된 유색 생성물의 양을 검량선과 상호연관시켜 고정된 복합체의 양을 측량하고/하거나 측정하고/하거나 정량화하여, 샘플의 항-약물 항체의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 합텐이다. 한 실시양태에서, 합텐은 비오틴, 디곡시제닌, 테오필린 및 브로모 데옥시 우리딘으로부터 선택된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 디곡시제닌이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제이다. 한 실시양태에서, 무색 기질은 ABTS, HPPA 또는 TMB이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 무색 기질은 TMB이다.

30개의 개별값을 기반으로 한 본원에 보고된 방법(C5 침전 접근법)에 의해 수득한 결과를 하기 표에 나타냈다.

본원에 보고된 새로운 분석 포맷은 높은 동적 범위에 적합하며, 민감하고 분석할 샘플에 존재하는 개별 표적 수준으로부터의 간섭을 해결한다.

샘플 처리에서, 분석 전에 대략 표적의 pI 값에서의 항온처리 단계에서 형성된 침전물을 제거하는 것이 필요하지 않다. 산 항온처리 단계 없이, 간섭이 존재한다(도 12 참조):

양성 대조군, 긴 항온처리 시간 및 pH 5.5 세척에 의한 보정을 도 13에 나타냈다. 15개의 개별값의 평균은 119이고, 블랭크 풀 값은 123이고, 컷-포인트는 135이다.

다클론 항체, 긴 항온처리 시간 및 pH 7.4 세척에 의한 보정을 도 14에 나타냈다. 15개의 개별값의 평균은 145이고, 블랭크 풀 값은 157이고, 컷-포인트는 193이다.

다클론 항체, 짧은 항온처리 시간 및 pH 5.5 세척에 의한 보정을 도 15에 나타냈다. 15개의 개별값의 평균은 124이고, 블랭크 풀 값은 115이고, 컷-포인트는 247이다.

C5의 존재 하에 다클론 항체, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 5.5 세척에 의한 보정을 도 16에 나타냈다.

C5의 존재 하에 다클론 항체, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 7.5 세척에 의한 보정을 도 17에 나타냈다.

C5의 존재 하에 다클론 항체, pH 2에서 30-분 항온처리 및 pH 5.5 세척에 의한 보정을 도 18에 나타냈다(본 기술에 따른 산 해리를 사용한 ADA 분석).

본 발명의 특정 실시양태의 예시적 약물 항체

US 2016/0167054는 항-C5 항체 및 이의 사용 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 개시된 단리된 항-C5 항체는 산성 pH보다는 중성 pH에서 높은 친화도에 의해 C5의 베타쇄 내에서 에피토프에 결합한다.

C5는 정상 혈청에서 약 71 μg/ml(0.4 μM)로 발견되는 181 kDa 단백질이다. C5는 탄수화물에 기인한 이의 질량의 약 1.5 내지 3%에 의해 글리코실화된다. 성숙 C5는 66 kDa 베타쇄에 다이설파이드 결합된 106 kDa 알파쇄의 이종 이량체이다. C5는 1577개의 아미노산의 단일쇄 전구체 단백질(프로-C5 전구체)로서 합성된다(예를 들어, US 6,355,245 및 US 7,432,356 참조). 프로-C5 전구체는 절단되어 아미노 말단 단편으로서 베타쇄 및 알파 카복시 말단 단편으로서 쇄가 수득된다. 알파쇄 및 베타쇄 폴리펩티드 단편은 서로 다이설파이드 결합를 통해 연결되고 성숙 C5 단백질을 구성한다.

성숙 C5는 보체 경로의 활성화 동안 C5a 및 C5b 단편으로 절단된다. C5a는 알파쇄의 처음 65개의 아미노산을 포함하는 아미노 말단 단편으로서 C5 전환효소에 의해 C5의 알파쇄로부터 절단된다. 성숙 C5의 나머지 부분은 단편 C5b이고, 이는 베타쇄에 다이설파이드 결합된 알파쇄의 나머지를 함유한다. 11 kDa 질량의 C5a의 약 20%는 탄수화물에 기인한다.

C5a는 아나필라톡신이다. C5b는 C6, C7, C8 및 C9와 조합되어 표적 세포의 표면에서 막 공격 복합체(MAC, C5b-9, 말단 보체 복합체(TCC))를 형성한다. 충분한 수의 MAC가 표적 세포막 내로 삽입되는 경우, MAC 공극이 형성되어 표적 세포의 신속한 삼투성 용해를 매개한다.

아나필라톡신은 비만 세포 탈과립을 촉발할 수 있고, 이는 히스타민 및 염증의 기타 매개자를 방출하여 평활근 수축, 증가된 혈관 투과성, 백혈구 활성화 및 기타 염증 현상(세포 과다를 야기하는 세포 증식을 포함)을 야기한다. 또한, C5a는, 과립구, 예컨대 중성구, 호산구, 호염기구 및 단핵구를 보체 활성화 부위에 끌어들이는데 기여하는 화학주성(chemotactic) 펩티드로서 작용한다.

C5a의 활성은, 카복시-말단 아르기닌을 C5a로부터 제거하여 C5a-des-Arg 유도체를 형성하는 혈장 효소 카복시펩티다제 N에 의해 조절된다. C5a-des-Arg는 변형되지 않은 C5a의 아낙필라시스 활성 및 다형핵 화학주성 활성의 1%만을 나타낸다.

적절하게 작용하는 보체 시스템은 미생물 감염에 대한 강한 방어를 제공하나, 보체의 부적절한 조절 또는 활성화는, 예를 들어 류머티스 관절염(RA); 루푸스 신염; 허혈 재관류 손상; 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH); 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS); 고밀도 침착병(DDD); 황반 변성(예를 들어 연령-관련된 황반 변성(AMD)); 용혈, 증가된 간 효소 및 저혈소판(HELLP) 증후군; 혈전성 혈소판 감소 자반병(TTP); 자연 유산; Pauci-면역 맥관염; 수포성 표피박리증; 재발성 유산; 다발성 경화증(MS); 외상성 뇌 손상; 심근 경색, 심폐 우회 및 혈액 투석을 야기하는 부상을 포함하는 다양한 장애의 발병의 원인이 된다(예를 들어, 문헌[Holers et al., Immunol. Rev. 223 (2008) 300-316] 참조). 따라서, 보체 캐스케이드의 과도하거나 제어되지 않는 활성의 억제는 상기 장애를 앓는 환자, 특히 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH) 환자에게 임상적 이점을 제공할 수 있다.

에쿨리주맙(Eculizumab)은 보체 단백질 C5를 지향하는 인간화된 단클론 항체이고, 제1 요법은 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH) 및 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS)의 치료에 대해 승인되었다(예를 들어, 문헌[Dmytrijuk et al., The Oncologist 13 (2008) 894-910] 참조). 에쿨리주맙은 C5 전환효소에 의해 C5가 C5a 및 C5b로 절단되는 것을 억제하며, 이는 말단 보체 복합체 C5b-9의 생성을 방지한다. C5a 및 C5b-9 모두는 PNH 및 aHUS의 특징인 말단 보체-매개된 사건을 초래한다(또한, WO 2005/065607, WO 2007/96586, WO 2008/060790 및 WO 2010/054403 참조). 여러 보고서는 다른 항-C5 항체를 기재하였다. 예를 들어, WO 86/28707은 C5의 알파쇄에 결합하나 C5a에는 결합하지 않고 C5의 활성화를 차단하는 항-C5 항체를 기재하는 반면에, WO 2002/30886은 C5a 형성을 억제하는 항-C5 단클론 항체를 기재한다. 다른 한편으로는, WO 2004/006653은, C5의 알파쇄 상에 C5 전환효소에 대한 단백질 분해 부위를 인식하고 C5를 C5a 및 C5b로 전환시키는 것을 억제하는 항-C5 항체를 기재한다. WO 2010/015608은 1x10E7 M-1 이상의 친화도 상수를 갖는 항-C5 항체를 기재한다. 한 실시양태에서, 약물은 에쿨리주맙이다.

일부 실시양태에서, 방법은, C5의 베타쇄 내에서 에피토프에 결합한 항-C5 항체에 붙은 ADA의 검출을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5의 베타쇄의 MG1-MG2 도메인 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는, C5의 베타쇄(서열번호 31)의 아미노산 27-115로 이루어진 단편 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 아미노산 38-48, 61-67 및 98-101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단편을 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 31) 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-C5 항체는 서열번호 31의 Glu48, Asp51, His61, His63, Lys100 및 His101로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 C5의 베타쇄(서열번호 31)의 단편 내에서 에피토프에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 산성 pH보다는 중성 pH에서 보다 높은 친화도에 의해 C5에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 pH 5.8보다는 pH 7.4에서 보다 높은 친화도에 의해 C5에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-C5 항체는 표 1에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 pH 5.8보다는 pH 7.4에서 보다 높은 친화도에 의해 표 1에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 항-C5 항체는 표 2 또는 3에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 추가적 실시양태에서, 항체는 pH 5.8보다는 pH 7.4에서 높은 친화도에 의해 표 2 또는 3에 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

특정 실시양태에서, 항-C5 항체는 C5에 대한 결합에 대해, (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (c) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (d) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (e) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (f) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (g) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (h) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (i) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; 및 (j) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁한다.

특정 실시양태에서, 항-C5 항체는 약제로서 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 항-C5 항체는 과도하거나 제어되지 않은 C5의 활성화를 수반하는 보체-매개된 질병 또는 질환을 치료하는 데 사용된다. 추가적 실시양태에서, 항-C5 항체는 비제한적으로 발작성 야간 헤모글로빈뇨(PNH), 연령-관련된 황반 변성, 심근 경색, 류머티스 관절염, 골다공증, 골관절염 및 염증을 포함하는 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용된다. 항-C5 항체는 혈장으로부터 C5의 클리어런스를 증진시키는 데 사용된다.

특정 실시양태에서, 방법은 상기에 제공된 임의의 실시양태의 VH, 및 서열번호 27, 28, 29, 105, 106 및 107 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-C5 항체에 붙은 ADA의 검출을 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 방법은 상기에 제공된 임의의 실시양태의 VH, 및 서열번호 36, 37, 및 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-C5 항체의 검출을 위한 것이다.

특정 실시양태에서, 방법은, C5에 대한 결합에 대해 (a) 서열번호 1의 VH 및 서열번호 11의 VL; (b) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 25의 VL; (c) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 24의 VL; (d) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (e) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (f) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (g) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (h) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (i) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (j) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (k) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (l) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 26의 VL; 및 (m) 서열번호 10의 VH 및 서열번호 20의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-C5 항체에 붙은 ADA의 검출을 위한 것이다.

특정 실시양태에서, 방법은, C5 결합에 대해 (a) 서열번호 22의 VH 및 서열번호 25의 VL; (b) 서열번호 21의 VH 및 서열번호 24의 VL; (c) 서열번호 5의 VH 및 서열번호 15의 VL; (d) 서열번호 4의 VH 및 서열번호 14의 VL; (e) 서열번호 6의 VH 및 서열번호 16의 VL; (f) 서열번호 2의 VH 및 서열번호 12의 VL; (g) 서열번호 3의 VH 및 서열번호 13의 VL; (h) 서열번호 9의 VH 및 서열번호 19의 VL; (i) 서열번호 7의 VH 및 서열번호 17의 VL; (j) 서열번호 8의 VH 및 서열번호 18의 VL; (k) 서열번호 23의 VH 및 서열번호 26의 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-C5 항체에 붙은 ADA의 검출을 위한 것이다.

하기 실시예, 서열 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 해당하는 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 제시된 절차에서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

도 1: 상이한 포획 항체 및 추적 항체 농도의 효과((1): 각각 500 ng/ml, (2): 각각 1000 ng/ml, (3): 각각 1500 ng/ml, (4): 각각 2000 ng/ml).
도 2: 상이한 퍼옥시다제 농도의 효과(1000 ng/ml 포획 및 추적 항체 농도에서, (1): 5 mU, (2): 10 mU, (3): 25 mU, (4): 50 mU).
도 3: 인간 및 NHP 혈청의 효과((1): 인간 혈청, (2): 인간 혈장, (3): 시노몰구스 혈청).
도 4: 말(1), 토끼(2), C5 결핍된 인간 혈장(3) 및 완충제(4)의 효과.
도 5: 분석 성능이 샘플에서 말 혈청 및 말 C5 함량의 증가에 의해 손상되었다(도 5 참조)(0%(1), 1%(2), 5%(3) 또는 10%(4) 말 혈청 중 1% 인간 혈청).
도 6: 분석에 대한 인간 C5의 효과(pAb + (1): 인간 혈청, (2): 완충제+brij, (3): 인간 혈청에서 500 ng/ml C5, (4): 완충제+brij에서 500 ng/ml C5).
도 7: C5((1): pH 7.4, (2): pH 5.5, (3): pH 8.0) 및 대조군 pAb(항-이디오타입 항체)((4): pH 7.4, (5): pH 5.5, (6): pH 8.0)를 사용한 가교 분석의 보정.
도 8: 가교 분석에서 세척 완충제 pH 7.4의 사용((1) pAb 항-이디오타입 항체, 및 포획 및 추적 항체, (2) 포획 항체 및 추적 항체가 부재하는 C5, (3) 포획 항체는 존재하나 추적 항체는 부재하는 C5, (4) C5 포획 항체는 부재하나 추적 항체는 존재하는 C5, (5) 포획 및 추적 항체가 존재하는 C5를 사용한 보정).
도 9: 가교 분석에서 세척 완충제 pH 5.5의 사용((1) pAb 항-이디오타입 항체, 및 포획 및 추적 항체, (2) 포획 항체 및 추적 항체가 부재하는 C5, (3) 포획 항체는 존재하나 추적 항체는 부재하는 C5, (4) C5 포획 항체는 부재하나 추적 항체는 존재하는 C5, (5) 포획 및 추적 항체가 존재하는 C5를 사용한 보정).
도 10: 약물 대 C5 비의 효과; 조정된 SPR 센서그램; (1): C5, (2): C5+pAb 100/100 nM, (3): C5+pAb 100/10 nM, (4): C5+pAb 100/250 nM, (5): C5+pAb 100/500 nM, (6): C5+pAb 100/50 nM, (7): mAb-C5, (8): pAb-항-이디오타입-mAb C5, (9) 완충제.
도 11: 비오틴일화된 약물 코팅된 표면에 대한 pAb(녹색) 및 C5(적색)의 결합 후에, 화살표로 표시된 시간에서 완충제 또는 추적(1, 2)/디곡시제닐화된 약물(3, 4)의 첨가.
도 12: 산 항온처리 단계 적용이 부재하는 보정(3)과 비교한 (1) 원심분리가 부재하거나 (2) 원심분리가 존재하는 가교 분석에서 pAb의 보정.
도 13: 양성 대조군, 긴 항온처리 시간 및 pH 5.5 세척을 사용한 보정.
도 14: 다클론 항체, 긴 항온처리 시간 및 pH 7.4 세척을 사용한 보정.
도 15: 다클론 항체, 짧은 항온처리 시간 및 pH 5.5 기밀 세척을 사용한 보정.
도 16: 혈청(1) 또는 완충제(2)의 존재 하에 다클론 항체, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 5.5 세척을 사용한 보정, 및 혈청(3) 또는 완충제(4)의 존재 하에 C5, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 5.5 세척을 사용한 보정.
도 17: 혈청(1) 또는 완충제(2)의 존재 하에 다클론 항체, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 7.4 세척을 사용한 보정, 및 혈청(3) 또는 완충제(4)의 존재 하에 C5, pH 5에서 2-시간 항온처리 및 pH 7.4 세척을 사용한 보정.
도 18: 혈청(1) 또는 완충제(2)의 존재 하에 다클론 항체, pH 2에서 0.5-시간 항온처리 및 pH 5.5 세척을 사용한 보정, 및 혈청(3) 또는 완충제(4)의 존재 하에 C5, pH 2에서 0.5-시간 항온처리 및 pH 5.5 세척을 사용한 보정.

실시예

실시예 1: 사카로스 및 Brij를 사용한 분석

비오틴일화된 약물 및 디곡시제닐화된 약물을 30개의 개별적 혈청 샘플과 함께 항온처리하였다. 사용된 시약을 기능적으로 시험하기 위해 (대조군) 혈청 샘플(풀링된 혈청)을 상이한 농도의 인공 양성 대조군 기준물을 사용하여 준비하고 항온처리하고 개별적 혈청 샘플로서 처리하였다. 표지된 약물 농도를 각각 1000 ng/mL에서 일정하게 유지하였다. 분석에서 최종 혈청 농도는 1%였다. 생산된 면역 복합체를 백색의 스트렙타비딘(SA)-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 옮기고 1시간 동안 항온처리하여 비오틴-표지된 포획 시약을 통해 복합체를 고정시켰다. 상청액의 흡인 후에, 미결합 기질을 반복된 세척에 의해 제거하였다. 고정된 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체(항-디곡시제닌-POD (폴리))와 함께 항온처리하였다. 각각의 단계를 6.5% 사카로스를 함유하는 PBS 완충제 또는 ELISA를 위해 0.5% 농도에서 Brij 35를 함유하는 로슈 유니버셜(Roche universal) 완충제를 사용하여 동일한 완충제에 의해 수행하였다. 마지막으로, 생산된 고정된 면역 복합체를 산화된 HPPA 용액, 형광 POD 기질의 첨가에 의해 시각화하였다. 방출을 광도계로 측정하고(320 nm 파장에서 여기, 405 nm 파장에서 방출) 샘플의 양성 대조군 농도와 관련하여 설정하였다. 개별적 혈청 샘플의 CV는 29%(사카로스 완충제 분석) 및 181%(로슈 유니버셜 완충제 및 Brij)였다.

실시예 2: 산 항온처리 단계를 사용한 분석

개별적 혈청 샘플(N=30) 및 인공 양성 대조군 샘플을 2시간 동안 10 mM 아세테이트 완충제(pH 5.0)와 함께 항온처리하였다. 이후, 샘플을 5분 동안 0.1 M 글리신 하이드로클로라이드(pH 2.0)와 함께 항온처리하였다. 산성화된 샘플을 비오틴일화된 포획 항체 및 디곡시제닐화된 검출 항체와 혼합하고 0.5 M TRIS 완충제(pH 8.5)에 의해 중화시키고 30분 동안 RT에서 및 450 rpm에서 마이크로타이터 플레이트 진탕기 상에서 항온처리하였다. 최종 혈청 분석 농도는 1%였다. 생산된 면역 복합체를 스트렙타비딘(SA)-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 옮기고 1시간 동안 항온처리하여 비오틴-표지된 포획 항체를 통해 면역 복합체를 고정시켰다. 상청액의 흡인 후에, 미결합 기질을 반복된 세척에 의해 제거하였다. 고정된 면역 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 Fab 단편(항-Dig-POD)과 함께 항온처리하였다. 생산된 고정된 면역 복합체를 산화된 HPPA 용액, 형광 POD 기질의 첨가에 의해 시각화하였다. 방출을 광도계로 측정하고(320 nm 파장에서 여기, 405 nm 파장에서 방출) 혈청 샘플의 인공 양성 대조군 농도와 관련하여 설정하였다. 인공 양성 대조군은 100% 혈청에서 100 ng/mL에서 3 초과의 블랭크 대 노이즈 비를 제공하였다. 개별적 혈청 샘플(N=30)의 CV는 7%였다.

실시예 3: 낮은 혈청 함량을 사용하고 산 해리를 사용하지 않은 분석

비오틴일화된 약물 및 디곡시제닐화된 약물을 1% 및 0.1%.의 최종 혈청 농도에서 32개의 개별적 혈청과 함께 항온처리하였다. 사용된 시약을 기능적으로 시험하기 위해 (대조군) 혈청 샘플(풀링된 혈청)을 상이한 농도의 인공 양성 대조군 기준물을 사용하여 준비하고 항온처리하고 개별적 혈청 샘플로서 처리하였다. 표지된 약물 농도를 각각 1000 ng/mL에서 일정하게 유지하였다. 생산된 면역 복합체를 백색의 스트렙타비딘(SA)-코팅된 마이크로타이터 플레이트에 옮기고 1시간 동안 항온처리하여 비오틴-표지된 포획 시약을 통해 복합체를 고정시켰다. 상청액의 흡인 후에, 미결합 기질을 반복된 세척에 의해 제거하였다. 고정된 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체(항-디곡시제닌-POD (폴리))와 함께 항온처리하였다. 마지막으로, 생산된 고정된 면역 복합체를 산화된 HPPA 용액, 형광 POD 기질의 첨가에 의해 시각화하였다. 방출을 광도계로 측정하였고(320 nm 파장에서 여기, 405 nm 파장에서 방출), 이는 샘플의 양성 대조군 농도에 비례하였다. 인공 양성 대조군은 1 및 0.1% 분석에 대해 100% 혈청에서 약 100 ng/mL의 분석 감도를 나타낸다. 개별적 혈청 샘플의 CV는 74%(0.1% 혈청 분석) 및 65%(1% 혈청 분석)였다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Target interference suppressed anti-drug antibody assay <130> P34384-WO <140> PCT/EP2018/082664 <141> 2018-11-27 <150> EP17204316.8 <151> 2017-11-29 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFA0305 VH <400> 1 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser Asp Gly Gly Tyr Val Thr Pro Thr His Ala Met Tyr Leu Trp Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFA0307 VH <400> 2 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 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Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gln 85 90 95 Ile Tyr Ser Gly Asp Asn Asn Asp Asn Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFA0599 VH <400> 6 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser Asp Asn Thr 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Phe Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Pro Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly 85 90 95 Ala Gly Asn Ile Phe Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val 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Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ala Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Ser Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CFA0675 VH <400> 9 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala 20 25 30 Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Thr Ile Asp Thr Gly Asp Asn Ser Phe Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn Asp 85 90 95 Gly Ser Val Tyr Asn Leu Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO5 VH <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 98 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO16 VH <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO18 VH <400> 99 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO19, 20, 22 VH <400> 100 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO23 VH <400> 101 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser 20 25 30 Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19 VL <400> 102 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 103 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO20 VL <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 104 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO22, 23 VL <400> 104 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser 85 90 95 Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 105 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG115 <400> 105 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 106 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG422 <400> 106 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 107 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG429 <400> 107 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Arg Arg Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Arg Lys Glu 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19, 20, 22, 23 HVR-H1 <400> 108 Ser Ser Tyr Tyr Met Ala 1 5 <210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 18, 19, 20, 22 HVR-H2 <400> 109 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO16 HVR-H2 <400> 110 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO23 HVR-H2 <400> 111 Gly Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19, 20, 22, 23 HVR-H3 <400> 112 Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19, 20, 22, 23 HVR-L1 <400> 113 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19, 20 HVR-L2 <400> 114 Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO22, 23 HVR-L2 <400> 115 Gly Ala Ser Thr Thr Gln Ser 1 5 <210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 305LO15, 16, 18, 19, 20, 22, 23 HVR-L3 <400> 116 Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr 1 5 10

Claims (31)

1. 표적 간섭이 감소된, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화하는 면역 분석으로서,
   상기 항-약물 항체가 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체가 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 면역 분석이
   a) 고정된 포획 항체를 약물, 표적 및 항-약물 항체를 포함하는 혈청 또는 혈장 샘플과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체 복합체를 형성하는 단계,
   b) 상기 단계 a)에서 형성된 복합체를, 대략 상기 표적의 pI 값인 pH 값을 갖는 당 및 세제를 포함하는 완충제로 세척하는 단계,
   c) 12 내지 24시간 동안 상기 단계 b)의 세척된 복합체를 표지에 접합된 추적 항체와 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를 형성하는 단계, 및
   d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체의 표지를 측정함으로써 항-약물 항체의 양을 정량화하는 단계
   를 포함하는, 면역 분석.
2. 제1항에 있어서,
   추적 항체 및 포획 항체가 약물 항체인, 면역 분석.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   면역 분석이 포획 항체, 추적 항체 및 검출 항체를 포함하되, 상기 포획 항체가 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 약물이고, 상기 추적 항체가 검출가능한 표지에 접합된 약물 항체이고, 상기 검출 항체가 효소에 접합된 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역 분석.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   포획 항체 및/또는 추적 항체가 서로 독립적으로 전장 약물 항체, F(ab')2, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   당이 모노사카라이드, 다이사카라이드 또는 트라이사카라이드인, 면역 분석.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   당이 사카로스, 락토스, 말토스, 이소-말토스 및 트레할로스로 이루어진 다이사카라이드의 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   당이 약 6.5 중량%의 농도를 갖는, 면역 분석.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   세제가 비-이온성 세제인, 면역 분석.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   세제가 폴리알킬렌 글리콜 에터(상표 Brij), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에스터(상표 Tween), 옥틸페놀 에톡시레이트(상표 Trion 또는 Nonident), 옥틸-베타-글리코시드, n-지방산-N-메틸-D-글루카미드(상표 MEGA) 및 N,N'-비스-(3-D-글루콘아미도프로필) 콜아미드(상표 CHAP)로 이루어진 세제의 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항온처리가 14 내지 24시간 동안 수행되고, 한 실시양태에서 항온처리가 15 내지 17시간 동안 수행되는, 면역 분석.
11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합쌍의 제1 구성원이 합텐, 항원 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합쌍이 비오틴/(스트렙트)아비딘, 테오필린/항-테오필린 항체, 5-브로모-데옥시-우리딘/항-5-브로모-데옥시-우리딘 항체, 디곡시제닌/항-디곡시제닌 항체 및 헬리카/항-헬리카 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물이 항-C5 항체이고, 표적이 인간 C5인, 면역 분석.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    당이 사카로스이고, 세제가 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터이고, 약물이 항-C5 항체이고, 표적이 인간 C5이고, 완충제가 약 5.5의 pH 값을 갖는, 면역 분석.
15. 표적 간섭이 감소된, 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화하는 면역 분석으로서,
    상기 항-약물 항체가 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체가 치료 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 면역 분석이
    a) 혈청 또는 혈장 샘플을 대략 표적의 pI 값인 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,
    b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,
    c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 포획 항체 및 검출가능한 표지에 접합된 추적 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계, 및
    d) 상기 단계 c)에서 형성된 복합체를 정량화하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화는 단계
    를 포함하는, 면역 분석.
16. 제15항에 있어서,
    포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 정량화하는 단계(단계 d)가
    d1) 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 결합쌍의 제2 구성원과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계, 및
    d2) 상기 단계 d1)에서 형성된 복합체의 검출가능한 표지를 측정하여 항-약물 항체의 양을 정량화하는 단계
    를 포함하는, 면역 분석.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    대략 표적의 pI 값에서의 항온처리가 상기 표적의 pI 값보다 0.5 pH 단위 낮은 값 내지 상기 표적의 pI 값보다 0.5 pH 단위 높은 값의 범위의 pH 값에서 수행되는, 면역 분석.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)의 항온처리가 교반과 함께 수행되는, 면역 분석.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)의 항온처리가 1.5 내지 2.5시간 동안 수행되는, 면역 분석.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)의 항온처리가 약 5분 동안 수행되는, 면역 분석.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 d)의 항온처리가 약 60분 동안 수행되는, 면역 분석.
22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    추적 항체 및 포획 항체가 약물 항체인, 면역 분석.
23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 분석이 포획 항체, 추적 항체 및 검출 항체를 포함하되, 상기 포획 항체가 결합쌍의 제1 구성원에 접합된 약물이고, 상기 추적 항체가 검출가능한 표지에 접합된 약물 항체이고, 상기 검출 항체가 효소에 접합된 검출가능한 표지에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역 분석.
24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    포획 항체 및/또는 추적 항체가 서로 독립적으로 전장 약물 항체, F(ab')2, Fab 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합쌍의 제1 구성원이 합텐, 항원 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합쌍이 비오틴/(스트렙트)아비딘, 테오필린/항-테오필린 항체, 5-브로모-데옥시-우리딘/항-5-브로모-데옥시-우리딘 항체, 디곡시제닌/항-디곡시제닌 항체 및 헬리카/항-헬리카 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 분석.
27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물이 항-C5 항체이고, 표적이 인간 C5이고, 한 실시양태에서 단계 a)의 pH 값이 pH 4.7 내지 pH 5.5 범위인, 면역 분석.
28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체의 양을 정량화하는 면역 분석으로서,
    상기 항-약물 항체가 약물 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 약물 항체가 인간 C5에 특이적으로 결합할 수 있는 항-C5 항체이고, 상기 면역 분석이
    a) 혈청 또는 혈장 샘플을 4.7 내지 5.5 범위의 pH 값에서 1.5 내지 2.5시간 동안 항온처리하고, 임의적으로 상기 항온처리 후에 형성된 침전물을 제거하는 단계,
    b) 상기 단계 a)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 약 2의 pH 값에서 약 5분 동안 항온처리한 후에, 임의적으로 상기 항온처리한 샘플을 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하는 단계,
    c) pH 값을 약 7.4로 조정하고, 비오틴에 접합된 포획 약물 항체 및 디곡시제닌에 접합된 추적 약물 항체를 상기 단계 b)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플에 첨가하고, 상기 혼합물을 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 형성하는 단계,
    d) 상기 단계 c)에서 수득한 혈청 또는 혈장 샘플을 고체 표면에 접합된 (스트렙트)아비딘과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-복합체를 포획하고, 임의적으로 상기 표면을 세척하는 단계, 및
    e) 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-디곡시제닌 항체와 함께 항온처리한 후에, HPPA 또는 TMB와 함께 항온처리하여 상기 단계 d)에서 형성된 복합체의 디곡시제닌을 측정하여 혈청 또는 혈장 샘플의 항-약물 항체를 검출함으로써 항-약물 항체를 검출하는 단계(형성된 복합체와 샘플의 ADA의 양의 상관관계를 보여주는 단계)
    를 포함하는, 면역 분석.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이, 샘플을 수득하기 전에 약물을 투여한, 약물에 의한 치료가 필요한 환자로부터 유래되는, 면역 분석.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    복합체가 비-공유결합 복합체인, 면역 분석.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 포획 항체를 고체 표면 상에 고정시키고, 임의적으로 상기 고정 단계 후에 상기 표면을 세척하여 미결합된 포획 항체 및 비-특이적으로 결합된 포획 항체를 제거하는 단계,
    b) 상기 단계 a)의 고정된 포획 항체를, 면역 분석의 검출 범위 내의 항-약물 항체 농도를 갖도록 임의적으로 희석된 혈청 또는 혈장 함유 샘플과 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 샘플 및 비-특이적으로 결합된 샘플을 제거하는 단계,
    c) 상기 단계 b)의 포획 항체-항-약물 항체-복합체를, 표지된 추적 항체와 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 추적 항체 및 비-특이적으로 결합된 추적 항체를 제거하는 단계,
    d) 상기 단계 c)의 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체 복합체를, 효소에 접합된 추적 항체의 표지에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 항온처리하여 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-검출 항체 복합체를 형성하고, 임의적으로 상기 항온처리 단계 후에 표면을 세척하여 미결합된 검출 항체 및 비-특이적으로 결합된 검출 항체를 제거하는 단계,
    e) 상기 단계 d)의 포획 항체-항-약물 항체-추적 항체-검출 항체 복합체를, 기질 상에서 효소의 작용시 효소의 무색 기질이 유색 반응 생성물로 전환되는 효소의 무색 기질과 함께 항온처리하고, 사전 정의된 시간 후에 광학 밀도를 측정하는 단계, 및
    f) 상기 단계 e)에서 측정한 광학 밀도를 검량선과 상호연관시켜 샘플의 항-약물 항체의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는 면역 분석.

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