KR20200095455A - 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 결합되는 항체 - Google Patents

폴리펩티드 및 폴리펩티드에 결합되는 항체 Download PDF

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시우메이 카이
루핑 다이
후아마오 왕
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상하이 일레 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디.
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Abstract

본 발명은 뇌유래 신경영양 인자전구체 단백질 pro-BDNF에 특이적으로 결합되는 항체 및 이의 결합 에티토프에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체 및 단백질을 사용하여 자가 면역 질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것으로, 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스(SLE), 홍반성 신장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 천식 또는 낭포성 섬유증, 다발성 경화증和다른 가자 면역성 및 염증성 질환과 같은 상기 질환은 pro-BDNF 매개 활성을 억제하여 치료될 수 있다.

Description

폴리펩티드 및 폴리펩티드에 결합되는 항체
본 발명의 의약 분야에 속하는 것으로, 구체적으로 pro-BDNF의 폴리펩티드 단편 및 폴리펩티드 단편에 결합되는 단백질에 관한 것으로, 또한 pro-BDNF의 폴리펩티드 단편의 용도에 관한 것이다.
자가 면역 질환(AID)은 자가 면역 내성이 파괴되고 면역 체계가 활성화되어 자가 항원을 공역함으로써 조직 및 기관의 손상의 일으키는 일종의 질환이다. 이의 병인 및 발병 메커니즘은 밝혀지지 않았으나, 현재는 자가 항체, 자가 반응성 T 임파구 또는 이 둘다에 의한 자가 항원에 대한 과민성 반응성 질환으로 간주되고 있다. 임상적인 근치적 약물이 없으며, 기존의 글루코코티코이드(glucocorticoid)와 면역 억제제를 적시에 적용하면 증상을 제어할 수 있고 환자의 생존율을 향상시킬 수 있으나, 장기적으로 사용하면 일련의 부작용이 생길 수 있으며, 심각한 경우 삶의 질에 영향을 미치거나 생명을 위협할 수도 있지만, 일부 환자는 글루코코티코이드와 면역 억제제 치료에 민감하지 않다.
최근에 AID 분자 메커니즘에 대한 깊은 이해와 함께, 유전자 요법, 후생적 개입, 소분자 톨-유사 수용체 억제제, 항 염증 인자 항체, 줄기 세포 및 조절 T 세포 자가 주입, 수지상 세포 백신 등을 포함한 새로운 치료 전략이 제안되었다. 이러한 약물 치료 또는 방법 중 일부는 임상에 이미 사용되었고, 일부는 임상 연구 단계(예를 들어, 줄기 세포 자가 주입 치료 등) 및 심지어 동물 실험 단계(예를 들어, 후생적 조절 등)에 있다.
그러나, 이러한 약물은 글루코코티코이드 대신 일차 약물로 될 수 없으므로, 임상 적용을 위해 새롭고 안전하며 효과적인 치료 약물과 방법이 시급히 필요하다.
본 발명의 목적은 폴리펩티드를 제공하는 것이고, 상기 폴리펩티드를 이용하여 이에 특이적으로 결합되는 항체를 얻을 수 있으며; 상기 항체는 자가 면역 질환의 치료에 유용하게 사용된다.
제1 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 41로 표시된다.
제2 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 44로 표시된다.
제3 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 47로 표시된다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드의 코딩 폴리 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 담체를 제공한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드의 스크리닝 또는 이의 특이적 항체 제조에서의 용도를 제공한다.
제4 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 단백질을 제공한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 단백질과 인간 pro-BDNF의 결합 친화력은 < 10 nM이다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 단백질은 항체이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체, 다클론항체 또는 항체 단편이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체로부터 선택될 수 있다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 14로 표시되는 CDR1;
SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 CDR2; 및
SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 CDR3을 구비한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체의 경쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR3; 또는
SEQ ID NO: 14로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 15로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 CDR3을 구비한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 11로 표시되는 CDR1;
SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 CDR2; 및
SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 CDR3을 구비한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR3; 또는
SEQ ID NO: 11로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 12로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 CDR3을 구비한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체는,
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열을 포함하는 항체(a);
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 서열을 포함하는 항체(b); 및
항체(a) 또는 항체(b)의 변이체이고, 항체(a) 또는 항체(b)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는 항체(c)로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체(c)는 항체(a)의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열 중 하나 또는 복수 개, 예를 들어 1개 내지 3개, 바람직하게는 1개의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환(바람직하게는 치환)에 의해 얻고, 항체(a)의 활성을 갖거나 기본적으로 가지거나; 또는
상기 항체(c)는 항체(b)의 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16으로 표시되는 서열 중 하나 또는 복수 개, 예를 들어 1개 내지 3개, 바람직하게는 1개의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환(바람직하게는 치환)에 의해 얻고, 항체(b)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 항체는,
SEQ ID NO: 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체(d);
SEQ ID NO: 17로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체(e); 및
항체(d) 또는 항체(e)의 변이체이고, 항체(d) 또는 항체(e)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는 항체(f)로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체(f)는 항체(d)의 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8로 표시되는 서열 중 하나 또는 복수 개, 예를 들어 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 6개, 더 바람직하게는 1개 내지 3개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환(바람직하게는 치환)에 의해 얻고, 항체(f)의 활성을 갖거나 기본적으로 가지거나; 또는
상기 항체(f)는 항체(e)의 SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 서열 중 하나 또는 복수 개, 예를 들어 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 6개, 더 바람직하게는 1개 내지 3개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환(바람직하게는 치환)에 의해 얻고, 항체(f)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체는,
i) 10 nM 또는 더욱 낮은 KD로 pro-BDNF 폴리펩티드에 결합되는 특징;
ii) pro-BDNF와 p75의 결합을 경쟁적으로 억제하는 특징; 및
iii) pro-BDNF 의존적 활성 특징 중 하나 또는 여러 가지를 갖는다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 단백질은 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역시켜 얻거나 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드로 파지 라이브러리를 스크리닝하여 얻는다.
제5 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질 및 임의의 하나 또는 여러 가지의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
제6 양태에 있어서, 본 발명은 자가 면역 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질의 용도를 제공한다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 pro-BDNF 매개 자가 면역 질환이다.
제7 양태에 있어서, 본 발명은 pro-BDNF 매개 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질의 용도를 제공한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 상기 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 재생 불량성 빈혈, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 한랭글로불린혈증, 만성 폐쇄성 폐질환, 전신홍반루푸스(SLE), 홍반성 신장염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭포성 섬유증이다.
제8 양태에 있어서, 본 발명은 TNF-α, IL-2, IL-6 또는 IL-4의 분비를 억제하여 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질의 용도를 제공한다.
제9 양태에 있어서, 본 발명은 통증 완화용 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질의 용도를 제공한다.
제10 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 단백질을 코딩하기 위한 핵산을 제공한다.
제11 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역시키거나 본 발명의 제1 양태 내지 제3 양태에 따른 폴리펩티드로 파지 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하는 항체 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각각의 기술적 특징 및 이하(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각각의 기술적 특징을 서로 조합함으로써 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 형성할 수 있음을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 여기서 일일이 설명하지 않을 것이다.
도 1은 인간 proBDNF 전구체 단백질에 대한 1D3과 2H8의 결합 능력의 ELISA 결합도를 나타낸다.
도 2는 정제된 재조합 단일 클론 항체1D3과 2H8(인간 IgG1 형태)을 나타낸다.
도 3은 Biacore 친화력 측정 실험에서의 1D3의 동역학 곡선을 나타낸다.
도 4는 Biacore 친화력 측정 실험에서의 2H8의 동역학 곡선을 나타낸다.
도 5a는 실험적 자가 면역성 뇌척수염(EAE)에 대한 2H8 치료 실험을 나타내고, 도 5b는 EAE의 2H8 치료에 대한 누적 치료 점수를 나타낸다.
도 6a는 실험적 자가 면역성 뇌척수염에 대한 1D3 치료 실험을 나타내고, 도 6b는 EAE의 1D3 치료에 대한 누적 치료 점수를 나타낸다.
도 7a는 염증 인자 TNF-α 유전자 발현 정황을 나타내고, 도 7b는 EAE 마우스 비장 인터루킨(IL)-6에 대한 Ab-proB의 작용을 나타내며, 도 7c는 EAE 마우스 비장 IL-2에 대한 Ab-proB의 작용을 나타내고, 도 7d는 EAE 마우스 비장 IL-4에 대한 Ab-proB의 작용을 나타낸다.
도 8은 1D3 및 2H8과 폴리펩티드E2및 폴리펩티드E5의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 9는 1D3 및 2H8과 폴리펩티드DH의 ELISA 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 광범위하고 심층적인 연구를 걸쳐, 예상 밖으로 pro-BDNF에 특이적으로 결합되는 항체를 발견하였고, 이러한 항체는 체내 실험적 자가 면역성 뇌척수염 모델에서 TNF-α, IL-2, IL-6, 또는 IL-4 분비를 감소시킬 수 있었고, 동시에 이러한 항체의 결합 에티토프를 분석하며, 이를 기초로 본 발명을 완성하였다.
용어
본 명세서에 사용된 과학 기술 용어는 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일하거나 유사한 의미를 갖는다. 본 발명의 이해를 돕기 위해, 일부 용어는 다음과 같이 정의 된다.
용어 “proBDNF”(precursor for brain-derived neurotrophic factor)는 “뇌유래 신경 영양 인자 전구체”이고, BDNF 유전자의 전구체 산물이다. 다른 설명이 없으면, 용어 “pro-BDNF”는 서열 SEQ ID NO: 27로 표시되는 인간 pro-BDNF를 지칭한다. proBDNF의 분자 아미노산 서열 제1 내지 18번 부위는 신호 펩티드 서열로, 분비 과정 동안 이 부위에서 2개의 단편이 생성되는데, 그 중 하나의 단편은 서열 제19 내지 129번 아미노산, 즉 전구체 도메인을 포함하는 폴리펩티드 단편이고, 전구체 도메인(proBDNF pro-domain)이라 불리며, 다른 하나의 단편은 아미노산 서열 제130 내지 247번, 즉 성숙 도메인에 의해 코딩된 단편으로, 가공 후 생물 활성이 형성된 성숙 BDNF이다.
용어 “p75”는 신경 영양 인자 수용체(P75neurotrophin receptor, p75NTR)이고, CD271이라도 불리며, proBDNF의 리간드이다.
본 명세서에 사용된 용어 “본 발명의 단백질” 또는 “본 발명 단백질”은 본 발명의 폴리펩티드에 결합된 단백질을 나타낸다. 본 발명의 폴리펩티드는 구체적으로 SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열 또는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 41로 표시되는 것을 포함하는 폴리펩티드; SEQ ID NO: 44로 표시되는 아미노산 서열 또는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 44로 표시되는 것을 포함하는 폴리펩티드; 또는 SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열 또는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 47로 표시되는 것을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 구체적인 실시양태에 있어서, 본 발명의 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있고; 본 발명의 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질일 수도 있다.
용어 “항체”는 본 명세서에서 완전한 항체와 임의의 항원 결합 단편을 포함한다. 천연적으로 존재하는 “항체”는 이황화 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄을 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 이루어졌다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2및 CH3 3개의 도메인으로 이루어졌다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH와 VL 영역은 프레임 워크 영역(ER)이라 불리는보다 보존적인 영역에 의해 이격 된 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 가변성이 높은 영역으로 더 세분 될 수있다. 각각의 VH와 VL는 아미노기 말단으로부터 카르복실기 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자(면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어 효과 세포)와 고전적 보체 시스템의 첫 번째 성분(C1q)을 포함함)에 대한 면역 글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 “상보성 결정 영역”과 “CDR”은 항체 가변 영역 내에서 항원 특이성 및 결합력을 부여하는 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 존재하고 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다.
주어진 CDR의 아미노산 서열 경계는 Kabat등 (1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”제5 버전을 포함한 다수의 알려진 수단의 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”번 수단 ), Al-Lazikani 등,(1997) JMB 273,927-948(“Chothia ”번 수단)에 설명된 그런한 수단들이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 “항체”는 항원(예를 들어, pro-BDNF의 부분)에 특이적으로 결합되는 능력을 유지하는 항체의 전장 또는 하나 또는 복수 개의 단편, 또는 유사한 항체 결합 활성을 갖는 다른 폴리펩티드를 지칭한다. 항체의 항원 결합 능력은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체에 포함된 “항원 결합 단편”의 구현예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역의 이황화 브릿지(disulfide bridge)에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루러진 Fd 단편; 항체의 단일 암(one arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward 등, 1989, Nature341:544-546); 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이러한 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “유사한 항체 결합 활성을 갖는 폴리펩티드”는 단일 도메인 항체, 마이크로 항체, 이량체, 삼량체와 같은 항체-항원 결합 부위를 갖는 단백질일 수 있으며, 비 항체 구조를 갖는 친화성 단백질 일 수도 있다.
Fv 단편의 VL 및 VH 2개의 도메인은 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법으로 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 형성된 단일 쇄 단백질(scFv)로서 생성되도록 하는 링커(linker)를 합성함으로써 결합될 수 있다(예를 들어, Bird 등, 1988,Science 242:423-426; 및 Huston 등, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. 85:5879-5883 참조). 이러한 단일 쇄 항체 또한 용어 항체의 “항원 결합 단편” 내에 포함되도록 의도된다. 이러한 항체 단편은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 완전한 항체에 사용된 것과 동일한 방식으로 상기 단편의 기능을 스크리닝할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “분리된 항체”는 상이한 항원 특이성을 갖는 항체를 대체적으로 포함하지 않는 항체를 지칭한다(예를 들어, 인간 pro-BDNF와 같이 pro-BDNF에 특이적으로 결합되는 분리된 항체는 pro-BDNF 외의 다른 항원에 특이적으로 결합되는 항체를 대체적으로 포함하지 않음). 그러나, pro-BDN에 특이적으로 결합되는 분리된 항체는 다른 항원(예를 들어 다른 종류의 pro-BDNF 분자로부터 유래됨)과 교차 반응성을 가질 수 있다. 이 외에, 분리된 항체는 다른 세포 재료 및/또는 화학 의약품을 대체적으로 포함하지 않을 수 있다.
용어 “에티토프”는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정 인자를 의미한다. 에티토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성 표면 성분으로 이루어지고, 통상적으로 특정 구조 특징 및 전하 특징을 갖는다.
용어 “동종형”은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체의 유형을 지칭한다(예를 들어, IgM, IgE, 및 IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG). 동종형으로 이러한 유형 중 하나의 변형된 형식을 더 포함하는데, 여기서 효과기 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증가시키거나 감소시키는 것과 같이 변형됨으로써 Fc 기능을 변경시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “완전한 인간 항체”는 프레임 워크 영역과 CDR 영역이 모두 인간 유래의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 이 외에, 항체가 불변 영역을 포함할 경우, 상기 불변 영역도 이러한 인간 서열로부터 유래되며, 예를 들어, 인간계 서열, 또는 인간계 서열 또는 인간 프레임 워크 서열 분석(예를 들어, Knappik 등, 2000, J Mol Biol 296: 57-86에 서술됨)으로부터 유래된 공유 프레임 워크 서열을 포함하는 항체의 돌연변이 형식이 있다. 본 개시 내용의 완전한 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 체외 무작위 또는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 또는 체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “완전한 인간 항체”는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임 워크 서열에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “재조합 인간 항체”는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함한다. 예를 들면, 인간 면역 글로불린 유전자의 유전자 변형 또는 염색체 변형 동물(예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 잡종 종양으로 분리된 항체, 예를 들어, 형질 감염된 종양으로부터 분리된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 인간 면역 글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA서열과 스플라이싱(splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같은 형질 전환되어 인간 항체를 발현하는 숙주 세포를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임 워크 영역과 CDR 영역이 모두 인간계 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 체외 돌연변이 유발 될 수 있어(또는, 인간 Ig 서열을 갖는 유전자 변형 동물을 사용할 경우, 체내 체세포 돌연변이 유발), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되거 이와 관련되어 있지만, 체내에서 인간 항체 생식 계열 라이브러리 내의 서열에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “동종형”은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체의 유형(예를 들어, IgM, IgE, 및 IgG1 또는 IgG4와 같은IgG)을 지칭한다.
문구 “항원을 식별하는 항체”와 “항원에 특이적인 항체”는 본 명세서에서 용어 “항원에 특이적으로 결합되는 항체”와 상호 교환하여 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “pro-BDNF 폴리펩티드에 특이적으로 결합”하는 항체 또는 단백질은 100 nM 또는 그 이하, 10 nM 또는 그 이하, 5 nM 또는 그 이하의 KD로 인간 pro-BDNF 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 단백질을 의미한다. “pro-BDNF 외의 항원과 교찬 반응”하는 항체는 10 nM 또는 그 이하, 5 nM 또는 그 이하의 KD로 항원에 결합하는 항체를 의미한다. “특정 항원과 교차 반응하지 않는” 항체는 200 nM 또는 그 이상 KD 또는 1 μM 이상의 KD 또는 10 μM 이상의 KD로 항원에 결합하는 항체를 의미한다. 일부 해결수단에 있어서, 항원과 교차 반응하지 않는 이러한 항체 표준 결합 측정에서 기본적으로 검출할 수 없는 이러한 단백질에 대한 결합을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “KD”는 Kd 대 Ka의 비례(즉 Kd/Ka)로부터 얻으며 몰 농도(M)의 해리 상수로 나타내는 것을 의미한다. 항체의 KD 값은 해당 기술분야에서 양호하게 확립된 방법으로 측정할 수 있다. 항체의 KD를 측정하기 위한 방법은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 실시예의 조작에따른 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 BiacoreTM 시스템과 같은 바이오 센세 시스템을 사용하였다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “친화력” 또는 “친화성 활성”은 단일 항원 부위(antigenic site)에서 항체와 항원 사이의 상호 작용의 강도를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 IgG항체 또는 이의 단편(예를 들어, Fab 단편)에 대한“고친화력”은 표적 항원에 대해 KD가 10 내지 8 M 이하, 10 내지 9 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, 고친화력은 다른 항체 동종형에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 본 개시 내용의 항체 또는 단백질의 “선택적”은 일부 표적폴리펩티드에 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 결합하지 않는 항체 또는 단백질을 지칭한다. 문구 “항원을 칙별하는 항체”와 “항원에 특이적인 항체”는 본 명세서에서 용어 “항원에 특이적으로 결합되는 항체”와 상호 교환하여 사용된다.
용어 “핵산” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 단일 쇄 또는 이중 쇄 형식의 중합체를 지칭한다. 달리 명확하게 한정되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합성을 갖고 천연적으로 존재하는 핵하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 이미 알려진 천연 뉴클레오티드의 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 변성 코돈 치환), 대립 유전자, 동원체, SNP와 상보 서열 및 명시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은 하나 또는 복수 개의 선택된 (또는 전부) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신(deoxyinosine) 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로 구현할 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “질환”(예를 들어, 류마티스 관절염)의 “치료”란, 하나의 해결수단에서 질환 또는 질병을 개선하는 것을 지칭한다(즉 질환의 진행 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나를 완화, 억제 또는 감소시킴). 다른 하나의 해결수단에서, “치료”는 환자가 실별할 수 없는 물리적 파라미터를 비롯한 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선시키는 것을 지칭한다. 또 다른 하나의 해결수단에 있어서, “치료”는 신체적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 신체 파라미터의 안정화) 또는 둘 모두를 조절하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 명시되지 않는 한, 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하기 위한 방법은 해당 기술분야에 공지되어 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 예를 들어 핵산 서열용 BLASTN 프로그램과 같은 아로리즘을 사용할 수도 있으며, 11의 단어 길이(W), 10의 예상 값(E), M＝5, N＝4 및 두 가닥을 위한 비교를 용어 “교차 차단”, “교차 차단된”, “교차 억제”로 본 명세서에서 상호 교환하여 사용되고, 표준 경쟁적 결합 측정에서 다른 항체 또는 결합제가 pro-BDNF에 대한 결합을 간섭하는 항체 다른 결합제의 능력을 지칭하는데 사용된다.
항체의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질과 같은 항체 또는 다른 결합제는 다른 항체 또는 결합 분자가 pro-BDNF에 결합하는 능력 또는 정도를 간섭할 수 있고, 따라서 본 개시 내용에 따른 교차 차단으로 간주될 수 있는지 여부는 표준 경쟁적 결합 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 하나의 적합한 측정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 상호 작용의 정도를 측정할 수 있는 BiacoreTM 기술(예를 들어, BiacoreTM 3000 의기(BiacoreTM, Uppsala, Sweden) 사)을 사용하는 것을 포함한다.
용어 “변이체”는 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었으나 본 명세서에 개시된 CDR, VL, VH, 또는 경쇄, 또는 중쇄, 또는 scFv 등과 대응되는 코딩 핵산 서열과 적어도 60 ％, 70 ％, 80 ％, 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％, 94 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 99 ％ 또는 100 ％의 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 본 개시 내용의 항체를 코딩하는 다른 핵산을 지칭한다.
일부 해결수단에 있어서, 이는 돌연변이 핵산을 포함하고, 상기 돌연 변이 핵산에서, 본 명세서에 기술된 CDR 코딩 영역 대비, CDR 코딩 영역에서 뉴클레오티드 결실, 삽입 또는 치환에 의해 변경된 뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개를 초과하지 않는다.
동일한 에티토프에 결합하는 항체의 경우, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열(뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 “혼합 및 매칭”되어 본 개시 내용의 다른 항 pro-BDNF 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 “혼합 및 매칭”된 항체의 pro-BDNF 결합은 상기 결합 측정 및 다른 통상적인 결합 측정(예를 들어, ELISA)에 의해 측정할 수 있다. 이러한 쇄가 혼합 및 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH서열은 구조적으로 유사한 VH서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
이러한 항체 각각이 pro-BDNF에 결합할 수 있고 항원 특이성이 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 주로 제공되는 것을 고려하면, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 서열은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3서열과 “혼합 및 매칭”될 수 있다(즉, 상이한 항체로부터의 CDR을 혼합 및 매칭할 수 있고, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 함유하는 각각의 항체는 본 개시 내용의 다른 항pro-BDNF 결합 분자를 생성함). 상술된 실시예에서의 결합 측정 또는 다른 통상적인 측정(예를 들어, ELISA)을 사용하여 이러한 “혼합 및 매칭” 항체의 pro-BDNF 결합을 테스트하였다. VH CDR 서열을 혼합하고 매칭시킬 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열을 혼합하고 매칭시킬 때, 특정 VL서열로부터의 CDR1, CDR2및/또는 CDR3서열은 구조저그로 유사한 CDR 서열로 대체되어야 한다. 하나 또는 복수 개의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 명세서에 개시된 내용의 단일 클론 항체의 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써, 신규한 VH 및 VH를 생성될 수 있는 것이 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 가변 영역 쇄 또는 전장 쇄가 인간 생식 계열 면역 글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우, 인간 항체는 특정 생식 계열 서열“의 산물” 또는 “이로부터 유도”된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 표적 항원으로 인간 면역 글로불린 유저자를 지닌 유전자 변형 마우스를 면역화시키거나, 또는 표적 항원으로 파지 디스플레이된 인간 면역 글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식 계열 면역 글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 서열에서 인간 항체의 서열과 가장 근접(즉, 최대 백분율 동일성)한 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열을 선택함으로써, 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열“의 산물” 또는 “이로부터 유도”된 인간 항체로 검정될 수 있다. 특정 인간 생식 계열 면역 글로불린 서열“의 산물” 또는 “이로부터 유도”된 인간 항체는 천연적으로 존재하는 체세포 돌연변이 또는 부위 지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해 생식 계열 서열과 상이한 아미노산을 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 통상적으로 아미노산 서열에서 적어도 90 ％의 동일성을 갖고, 다른 종의 생식 계열 면역 글로불린과 아미노산 서열(예컨대, 뮤린계 서열)과 비교시 인간 항체가 인간으로 검정되는 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우, 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 적어도 60 ％, 70 ％, 80 ％, 90 ％ 또는 적어도 95 ％ 또는 심지어 적어도 96 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％의 동일성을 가질 수 있다. 통상적으로, 특정 생식 계열 서열로부 유도된 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개의 아미노산의 차이를 나타낸다. 일부 경우, 인간 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산의 차이를 나타낼 수 있다.
보존적으로 변형된 항체
일부 해결수단에 있어서, 본 개시 내용의 항체(또는 이의 항원 결합 단편을 포함함)는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열(또는 HCDR1’, HCDR2’ 및 HCDR3’)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열(또는 LCDR1’, LCDR2’ 및 LCDR3’)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이러한 CDR 서열의 하나 또는 복수 개는 본 명세서에 기재된 항체1D3 또는 2H8에 기초하여 지정된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변형을 가지며, 여기서 상기 항체 또는 단백질은 본 개시 내용의 항 pro-BDNF 항체의 원하는 기능을 유지한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “보존적 서열 변형”은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 아미노산에 의해 치환되는 것을 의미한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 해당 기술분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트 산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린 산, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 개시 내용의 항체의 CDR 영역 내의 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 본 명세서에 기술된 기능 측정을 이용하여 변경된 항체가 보유한 기능을 테스트할 수 있다.
부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 해당 기술분야에 공지된 표준 기술에 의해 본 명에서에 개시된 항체에 변형을 도입할 수 있다.
이 외에, 본 발명의 재조합 항체1D3과 2H8 외에, 본 발명은 1D3과 2H8 항체의 이상적인 기능 성질을 보유하고 있는 항체 또는 단백질을 더 포함한다.
특히, 상기 본 발명의 상동성 항체 또는 단백질은 pro-BDNF 폴리펩티드에 대한 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 또는 단백질이며, 상기 항체 또는 단백질은,
i) 예를 들어 실시예에 따른 BiacoreTM 측정에서 측정된 바와 같이 10 nM 이하의 KD로 pro-BDNF 폴리펩티드의 결합하고;
(ii) p75의 결합에 대한 pro-BDNF의 경쟁적 억제하며, 및
(iii) pro-BDNF의 활성에 의존하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 따른 “pro-BDNF의 활성 의존”은 본 발명의 항체 또는 단백질이 pro-BDNF 관련 활성을 갖는 것을 지칭한다. 예를 들어, proBDNF가 이의 리간드에 결합하여 생물학적 과정을 촉진하는 경우, 본 발명의 항체 또는 단백질은 상기 생물학적 과정의 억제제 또는 길항제이고; proBDNF가 이의 리간드에 결합하여 특정 생물학적 과정을 억제하는 경우, 본 발명의 항체 또는 단백질은 상기 생물학적 과정의 촉진제 또는 작용제이다.
본 발명 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 항체 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CHO 세포주와 같은 포유 동물 세포에서의 단백질 발현에 최적화된 후자 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 완전한 세포, 세포 분해물에 존재할 수 있거나 부분적으로 정제되거나 대체적으로 수순한 형태의 핵산일 수 있다. 표준 기술(염기성/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가 로즈 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 공지된 다른 기술)에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염 물질(예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질)로부터 정제될 때, 핵산은 “분리된” 또는 “대체적으로 순수한” 것이다. F.Ausubel 등 편집, 1987, Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience, New York을 참조하기 바란다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 얻으면, 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키는 것과 같이 표준 재조합 DNA 기술에 의해 이러한 DNA 단편을 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH- 코딩 DNA 단편은 다른 DNA 분자 또는 다른 단백질(예를 들어, 항체 불변 영역 또는 가요성 링커)을 코딩하는 단편에 효과적으로 연결된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “효과적으로 연결된”이란 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되거나 원하는 프로모터의 제저 하에서 단백질을 발현되도록 2개의 DNA 단편의 기능적 결합을 의미한다.
VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 하나의 DNA 분자에 효과적으로 연결함으로써 VH 영역을 코딩하는 분리된 DNA를 전장 중쇄 유전자를 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 해당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat,E.A. 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5 버전, 미국 보건 복지부, NIH Publication No.91-3242). 이러한 영역을 코딩하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD불변 영역일 수 있다. 일부 해결수단에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 동종형에서 선택된다. Fab 단편의 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄CH1 불변 영역만을 코딩하는 다른 하나의 DNA 분자에 효과적으로 연결될 수 있다.
VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 하나의 DNA 분자에 효과적으로 연결시킴으로써 VL 영역을 코딩하는 분리된 DNA를 전장 경쇄 유전자(및 Fab경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 해당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat,E.A. 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5 버전, 미국 보건 복지부, NIH Publication No.91-3242). 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 중폭에 의해 얻을 수 있다. 상기 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 VH 및 VL 서열이 연속 단일 쇄 단백질로 발현도리 수 있도록 아미노산 서열(Gly4-Ser)3과 같은 가요성 링커를 코딩하는 다른 하나의 단편에 효과적으로 연결되며, VL과 VH 영역은 상기 가요성 링커에 의해 연결된다(예를 들어, Bird 등, 1988, Science 242: 423-426; Huston 등, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty 등, 1990, Nature 348: 552-554 참조).
본 발명의 재조합 항체의 분리
항체와 이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질을 스크리닝하는 다양한 방법이 해당 기술분야에 기술되어 있다. 이러한 방법은 상기 체내 시스템은 항원 면역 후 전장 인간 항체를 생성할 수 있는 유전자 변형 마우스와 같은 체내 시스템, 항체 DNA 코팅 라이브러리를 생성하는 체외 시스템으로 나뉠 수 있다. 이러한 체외 기술은 디스플레이 기술이라 불리우고, 파지 디스플레이, RNA 또는 DNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 효모 또는 포유 동물 세포 디스플레이를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이들은 해당 기술분야에서 상세세하게 설명되었다(총론은 예를 들어, Nelson 등, 2010, Nature Reviews Drug discovery,“Developmenttrends for human monoclonal antibody therapeutics”를 참조). 하나의 구체적인 해결수단에서, 인간 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하기 위한 라이브러리를 사용하여, 예를 들어 라이브러리의 파지 디스플레이 방법을 사용하여 본 개시 내용의 인간 재조합 항체를 분리한다.
VH 및 VL 유전자 또는 관련 CDR 영역의 라이브러리는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되거나 DNA 합성기에 의해 합성될 수 있고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합한 후, 이의 항원 결합 클론을 스크리닝할 수 있다.
인간 항체를 분리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 해당 기술분야에 확립되어 있거나 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, US5,223,409; US5,403,484; US5,427,908; US5,580,717; US6,521,404 등을 참조하기 바란다.
단일 클론 항체를 생성하는 형질 감염된 종양
예를 들어, 해당 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기술과 유전자 형질 감염 방법의 조합을 사용하여(예를 들어, Morrison,S. 1985, Science 229:1202) 숙조 세포에 형질 감염된 종양에서 본 개시 내용의 항체를 생성할 수 있다.
예를 들어, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 코부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 또는 생물학 화학 기술(예를 들어, DNA 화학 합성, PCR증폭 또는 표적 항체를 발현하는 잡종 종양을 사용한 cDNA 클론)에 의해 얻을 수 있으며, 상기 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 효과적으로 연결되도록 상기 DNA를 발현 담체에 삽입할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “효과적으로 연결된”이란 담체 내에서 전사 및 번역 제저 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 예정된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 담체 내로 연결되는 것을 의미한다. 사용된 발현 숙주 세포와 상용될 수 있는 발현 담체 및 발현 제어 서열을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 상이한 담체에 삽입하거나, 통상적으로, 2개의 유전자를 동일한 발현 담체에 삽입할 수 있다. 표준 방법에 의해 항체 유전자를 발현 담체에 삽입한다(예를 들어, 항체 유전자 단편과 담체의 상보적인 제한 부위를 연결하거나, 제한 부위가 존재하지 않으면, 평활 말단 연결함). 본 명에서에 따른 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 의해 임의의 항체 동형형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있으며, 이를 원하는 동종형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩한 발현 담체에 삽입함으로써, VH세그먼트가 담체 중의 CH세그먼트에 효과적으로 연결되고, VL세그먼트가 담체 중의 CL세그먼트에 효과적으로 연결된다.
경쇄 및 중쇄를 발현시키기 위해, 표준 기술을 응용하여 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 발현 담체를 숙주 세포로 형질 감염시킨다. 다양한 형식의 용어 “형질 감염”은 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하기 위한 전기 천공, 인산 칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질 감염 등 과 같은 기술을 포함하는 것을 의미한다. 이론적으로 원핵 또는 진핵 숙주 세포 모두에서 본 개시 내용의 항체를 발현하는 것이 가능하다. 포유 동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균과 같은 진핵 세포에서 항체의 발현에 대하여 논술하면, 이러한 진핵 세포 (특히 포유 동물 세포)는 원핵 세포보다 올바르게 접히고 면역 학적으로 활성이 있는 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
이중 특이적 분자
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 개시 내용의 항 proBDNF를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질의 이중 특이적 또는 다중 특이적 분자를 특성화 하였다. 본 발명의 항체 또는 단백질은 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체의 다른 항체 또는 리간드)로 유도되거나 연결되어, 적어도 2가지 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중 특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 단백질은 실제로 하나 이상의 다른 기능성 분자로 유도되거나 열결되어 2개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중 특이적 분자를 생성할 수 있으며; 이러한 다중 특이적 분자는 본 명세서에 사용된 용어 “이중 특이적 분자”에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중 특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체 또는 단백질은 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 유사물과 같은 하나 또는 여러 가지 다른 결합 분자에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링(coupling, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 기타 방식)되어 이중 특이적 분자를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 pro-BDNF 또는 이의 단편(예를 들어, SEQ ID NO: 41, 44, 또는 47)에 대한 적어도 하나의 이중 특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에티토프는 제1 표적 에티토프와 다른 pro-BDNF의 또 다른 에티토프이다. 또 다른 구현예는 pro-BDNF에 대한 제1 결합 특이적 부분(에를 들어, 1D3 또는 2H8의 하나의 항원 결합 부분)과 pro-BDNF 내의 다른 곳 또는 다른 표적 항원 내의 에티토프에 대한 제2 결합 특이적 부분을 포함하는 이중 특이적 분자이다.
다가 항체
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 pro-BDNF에 결합하는 적어도 2개의 동일하거나 상이한 본 발명의 항체의 항원 결합 부분(예를 들어, 1D3 또는 2H8의 항원 결합 부분으로부터 선택됨)을 포함하는 다가 항체를 제공한다. 하나의 해결수단에 있어서, 다가 항체는 적어도 2개, 3개 또는 4개의 항체의 항원 결합 부분을 제공한다. 단백질 융합 또는 공유 또는 비공유 연결에 의해 항원 결합 부분히 서로 연결될 수 있다. 또는, 이중 특이적 분자에 대한 연결 방법을 설명하였다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 Fc 또는 힌지 영역과 같은 본 발명의 항체의 불변 영역에 결합하는 항체를 가교시켜 4가 화합물을 얻을 수 있다.
약물 조성물
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 약물 조성물을 제공하고, 예를 들어, 약물 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화된 하나 또는 일련의 본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질(1D3 또는 2H8로부터 선택되는 항체)을 포함한다. 이러한 조성물은 하나 또는 일련(예를 들어, 두 가지 또는 여러 가지)의 본 발명 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약물 조성물은 일련의 표적 항원에 결합하는 상이한 에티토프 또는 상보적인 활성을 갖는 항체 또는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 병용 요법(즉, 다른 약물과 조합) 투여될 수도 있다. 예를 들어, 병용 요법은 적어도 하나으 다른 항염제 또는 다른 화학 요법제(예를 들어, 면역 억제제)와 조합된 본 발명의 항 pro-BDNF 항체 또는 단백질(예를 들어 1D3 또는 2H8로부터 선택되는 항체)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “약학적으로 허용 가능한 담체”는 생리학적으로 상용되는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제와 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어 주사 또는 주입에 의함)에 적합하여야 한다. 하나의 해결수단에 있어서, 담체는 피하 경로에 적합하여야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역 접합체 또는 이중 특이적 분자는 산 및 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건 작용으로부터 상기 화합물을 보호하기 위해 한 가지 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 하나 또는 여러 가지 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. “약학적으로 허용 가능한 염”은 임의의 유해한 독성 효과를 생성하지 않으면서 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하는 염을 지칭한다(예를 들어, Berge,S.M. 등, 1977, J.Pharm.Sci. 66: 1-19 참조). 이러한 염의 예로 산부가염 및 염기부가염을 포함한다.
산부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화 수소, 요오드화수소, 인산 등과 같은 무독성 무기산으로부터 유도된 염, 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등과 같은 무독성 유기사으로부터 유도된 염을 포함한다. 염기부가염은 알칼리토금속(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등)으로부터 유도된 염, 및 N, N'-디벤질에틸렌디아민(N, N'-dibenzylethylenediamine), N-메틸글루카민(N-methylglucamine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 콜린(choline), 디에탄올아민(diethanolamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), 프로카인(procaine) 등과 같은 무독성 유기아민으로 부터 유도된 염을 포함한다.
본 발명의 약물 조성물은 약학적으로 허용 가능한 항산화제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예로 아스코르브산(ascorbic acid), 시스테인히드로클로하이드(Cysteine Hydrochloride), 황산수소나트륨(sodium hydrogen sulfate), 피로아황산나트륨(sodium pyrosulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite) 등과 같은 수용성 항산화제; 아스코르빌팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸화히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 레시틴(lecithin), 프로필갈레이트(propyl gallate), α-토코페롤(α-tocopherol) 등과 같은 지용성 항산화제; 및 시트르산(Citric acid), 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 소르비톨(sorbitol), 타르타르산(tartaric acid), 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.
본 발명의 약물 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로 물, 에탄올, 폴리(예를 들어, 글리세롤(glycerol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸올레에이트(Ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 재료를 사용하면, 분산시 원하는 입자 크기를 유지하고 계면 활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 좌제를 더 포함할 수 있다. 멸균 방법 및 파라벤계(Parabens), 클로로부탄올(Chlorobutanol), 페놀(phenol), 소르브산(Sorbic acid) 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함함으로써 미생물의 존재를 예방할 수 있다. 조성물에 당류, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이 외에, 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약물의 첨가에 의해, 주사 가능한 약물 형식의 흡수를 지연시킬 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 무균 주사 용액 또는 분산체 및 무균 주사 용액 또는 분산체의 즉각적인 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 약물 활성 물질에 사용하기 위한 이러한 매질과 시약의 용도는 해당 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약물이 활성 화합물과 불상용되는 경우 외에, 본 발명의 약물 조성물에서의 이의 용도를 상상하였다. 조성물에 보충적인 활성 화합물을 더 혼입할 수 있다.
치료적 조성물은 생산 및 보관 조건하에서 일반적으로 무균되고 안정하여야 한다. 조성물을 용액, 마이크로 에멀젼, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬 구조로 제조할 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질 일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산체의 경우 원하는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면 활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 많은 경우에, 당류, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨과 같은 폴리올과 같은 등장제가 조성물에 포함될 수 있다. 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시킴으로써, 주사 가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
안정적인 단백질(예를 들어, 항체) 제제의 개발에 관한 총론은 Cleland 등, 1993, Crit.Reviews.Ther.Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 및 Wei Wang 1999, Int. J.Pharmaceutcs 185:129-88를 참조할 수 있다. 항체의 다른 배합에 관한 논의는 예를 들어 Daugherty 및 Mrsny 2006, Advanced Drug Delivery Reviews 58:686-706; US 6,171,586 및 다른 공지된 문헌을 참조할 수 있다.
피내 또는 피하 투여용 용액 또는 현탁액은 통상적으로 주사용수, 염 수용액, 비 휘발성 오일, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 글리세롤(glycerol), 프로필렌글리콜(propylene glycol) 또는 기타 합성 용매와 같은 무균 희석제, 벤질알코올(benzyl alcohol) 또는 메틸파라벤(methyl paraben)과 같은 항균제, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제, 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제, 아세테이트, 구연산염 또는 인산염과 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 포도당과 같은 장력 조절 시약 중 하나 또는 여러 가지를 포함한다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절할 수 있다. 이러한 제제를 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알에 밀봉 포장할 수 있다.
필요한 양의 상기 활성 화합물을 필요되는 하나 또는 일련의 상기에 열거된 성분과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후, 미량으로 여과 무균하여 무균 주사액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 본 개시 내용의 항체 또는 단백질을 기본적인 분산 매질과 상기에 열거된 그러한 성분들에 필요한 다른 성분을 함유한 무균 매질에 혼입시켜 분산제를 제조한다. 무균 주사액을 제조하기 위한 무균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고, 상기 방법은 이전에 여과된 멸균 용액의 활성 성분에 임의의 별도의 필요한 성분을 추가한 분말제에 의한 것이다.
담체 재료와 조합하여 단일 조제량 형식을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 피험자 및 구체적인 투여 방식에 따라 다를 수 있다. 담체 재료와 조합하여 단일 조제량 형식을 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양이다.
“치료 유효량”의 본 개시 내용의 항 pro-BDNF 항체 또는 단백질은 질환 증상의 중증도를 감소, 무 질환 증상 기간의 빈도 및 지속 시간의 증가 또는 질환에 의해 야기되는 손상 또는 장애의 예방할 수 있다.
해당 기술분야에 공지된 다양한 방법 중의 하나 또는 여러 가지를 이용하여 하나 또는 여러 가지 투여 경로에 의해 본 개시 내용의 조성물을 투여할 수 있다. 해당 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 다르다. 본 개시 내용의 항체의 투여 경로는 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내, 척축 또는 주사 또는 주입과 같은 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 문구“비 경구 투여”는 장 및 국소 투여 외의 투여 방식을 의미하고, 통상적으로 주사를 의미하며,정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 기관, 피하, 표피 하, 관절 내, 피막 하, 지주막 하, 척추 내, 경막 외 및 흉골 내(intrastemal) 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
또는, 본 개시 내용의 항체 또는 단백질은, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로와 같은 비경구 경로에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 비강 내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여 된다.
담체를 사용하여 본 개시 내용의 항체 또는 단백질을 제조할 수 있고, 상기 담체는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로 캡슐화 된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은 빠른 방출로부터 항체를 보호한다. 에틸렌비닐아세테이트(Ethylene vinyl acetate), 폴리무수물계(polyanhydrides), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리-n-에스테르(poly-n-esters) 및 폴리락트산(polylactic acid)과 같은 생분새성, 생체 적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허를 받았거나 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson 편집, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조하기 바란다.
해당 기술분야에 공지된 의학적 수단을 사용하여 치료적 조성물을 투여할 수 있다. 예를 들어, 하나의 해결수단에 있어서, 본 개시 내용의 치료적 조성물은 US5,399,163; US5,383,851; US5,312,335 등에 개시된 수단과 같은 발늘 없는 피하 주사 수단에 의해 투여될 수 있다.
본 개시 내용에 사용될 수 있는 공지된 임플란트 및 모듈의 구현예로, 조절 된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식 가능한 미세 주입 펌프를 개시한 US4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료용 장치를 개시한 US4,486,194; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시한 US4,447,233; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름 이식형 주입 장치를 개시한 US4,447,224; 다중 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 US4,439,196;삼투 약물 전달 시스템을 개시한 US4,475,196을 포함한다. 수많은 다른 이러한 임플란트, 전단 시스템, 및 모듈은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
일부 해결수단에 있어서, 본 개시 내용의 항체 또는 단백질은 체내에서 적절하게 분포되도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 혈액 뇌 장벽(BBB)은 많은 고친수성 화합물을 배제하였다. 본 개시 내용의 치료 화합물이 BBB(필요하면)를 통과하도록 이들은 리포좀에 제제화될 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 관하여, 예를 들어 US4,522,811, US5,374,548 및 5,399,331을 참조하기 바란다. 상기 리포좀은 특정 세포 또는 장기에 선택적으로 수송되어 표적화 약물 전달을 향상시키는 하나 또는 복수 개의 부분을 포함 할 수 있다(예를 들어, V.V.Ranade 1989, J.Cline Pharmacol. 29: 685를 참조). 예시적인 표적화 부분은 엽산 또는 비오틴(예를 들어, Low 등의 미국 특허 5,416,016을 참조), 만노시드(mannoside)(Umezawa 등, 1988, Biochem.Biophys.Res.Commun. 153: 1038); 항체(P.G.Bloeman 등, 1995, FEBS Lett. 357: 140; M.Owais 등, 1995, Antimicrob.Agents Chernother. 39: 180); 계면활성제A 단백질 수용체(Briscoe 등, 1995, Am.J.Physiol. 1233: 134); p120(Schreier 등, 1994, J.Biol.Chem. 269: 9090)를 포함하고; 또한 Keinanen 및 Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346: 123; Killion 및 Fidler, 1994, Immuno methods 4:273을 참조하기 바란다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체 또는 단백질은 체외 및 체내 진단 및 치료 기능이 있다. 예를 들어, 이러한 분자는 배양 중(예를 들어 체외 또는 체내) 또는 피험자 중(예를 들어 체내에서)의 세포에 투여하여 다양한 질병을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다.
상기 방법은 pro-BDNF 관련 질병 및/또는 자가 면역성 및 염증성 질병, 예를 들어 다발성 경화증, 류마티스관절염 또는 건선; 또는 진통의 치료, 예방 또는 진단에 특히 적합하다.
구체적으로, 본 발명은 pro-BDNF 관련 질병 및/또는 자가 면역성 및 염증성 질병, 또는 진통을 치료하는 방법을 제공하였다. 일부 해결수단에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 세포를 치료 유효량의 본 개시 내용의 항체를 포함하는 조성물과 접촉시켜 표적 세포 또는 조직에서 pro-BDNF 또는 pro-BDNF에 의해 유도된 신호 전달 응답을 감소시키거나 억제하는 단계를 포함하는 방법을 더 제공하였다.
본 명세서에서, 문구 “pro-BDNF 매개 질환” 또는 “pro-BDNF 관련 질병”은 pro-BDNF 또는 pro-BDNF가 질환 또는 의학적 상태에서(직접적 또는 간접적으로) 작용을 일으키는 모든 질환과 의학적 상태를 포함한다. 따라서, 이러한 용어 비정상적인 pro-BDNF 수준 관련되거나 및/또는 표적 세포 또는 조직에서 pro-BDNF가 유도하는 활성(예를 들어, TNF-α, IL-2, IL-6 또는 IL-4의 생성)을 감소 또는 억제함으로써 질환 또는 증상를 치료할 수 있다. 이러한 질환 또는 증상는 염증성 증상 및 자가 면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 천식, 관절염, 류마티스 관절염 또는 건선을 포함한다. 이러한 질환은 알레르기 및 알레르기성 증상, 과민증, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증 및 장기 또는 조직 이식 거부를 더 포함한다.
본 발명의 항체 또는 단백질은 자가 면역 질환 또는 염증 증상을 치료, 예방 또는 개선할 수 있고(그러나 이에 제한되지 않음), 특히 병인학은 자가 면역 성분의 염증성 증상을 포함하며, 예를 들어, 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente) 및 기형 관절염) 및 류마티스 질환을 포함하고, 뼈 손실, 염증성 통증 및 류마티스 질환, 척추 관절 질환 (강직성 척추염 포함), 라이트 증후군, 반응성 관절염, 건선 관절염, 소아 특발성 관절염 및 장성 관절염, 시작점 및 끝점 염증, 과민증(기도 과민증 및 피부 과민증 포함) 및 알레르기에 관한 것을 포함한다. 본 개시 내용의 항체가 사용될 수 있는 특정 자가 면역 질환으로 자가 면역 혈액학적 장애(에를 들어, 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈, 순수한 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판 감소증 포함), 전신홍반루푸스(SLE), 홍반성 신장염, 염증성 근육 질환(피부 근육염), 치주염, 다발성 연골염, 경피증, 베게너 육아 종증, 피부 근육염, 만성 활동성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐 존슨 증후군, 자발적인 구강 염증성 설사, 자가 면역 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양 성 대장염, 크론 병 및 과민성 대장 증후군 포함), 내분비 안과 질환, 그레이브스 질환, 유육종증, 다발성 경화증, 전신 경화증, 섬유성 질환, 원발성 담즙성 경변증, 소아 당뇨병 (I형 당뇨병), 포도막염, 건성 각막 결막염 및 봄 각막 결막염, 간질성 폐 섬유증, 인공 삽입 골다공증, 사구체신염(특발성 신증후군 또는 미세 병증성 신장병을 포함한 신증후군이 있거나 없는), 다발성 골수종, 다른 유형의 종양, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 뼈 이식의 느슨함, 대사 장애(예를 들어, 비만, 죽상 동맥 경화증 및 확장성 심근증, II 형 당뇨병 및 이상 지질 혈증을 포함한 다른 심혈관 질환) 및 자가 면역 갑상선 질환 (하시모토 갑상선염 포함), 중소 혈관 1 차 혈관염, 거대 세포 동맥염을 포함한 큰 혈관 혈관염, 화농성 땀샘 염, 시신경 골수염, 쇼그렌 증후군, 베체트 병, 아토피성 및 접촉성 피부염, 세기관지염, 염증성 근육 질환,자가 면역 말초 신경증, 면역 신장, 간 및 갑상선 질환, 염증 및 죽상 동맥 경화증, 자가 염증 열병 증후군, 피부 및 점막의 면역 혈액 장애 및 수 포성 질환을 포함한다. 해부학적으로 포도막염은 전포도막염, 중간포도막염, 후포도막염 또는 범포도막염 일 수 있다. 이는 만성 또는 급성 일 수 있다. 포도막염의 병인은자가 면역 또는 비 감염성, 전염성일 수 있으며, 전신성과 관련되거나 또는 백점 증후군이다.
본 개시 내용의 항체 또는 단백질은 천식, 기관지염, 세기관지염, 특발성 간질성 폐렴, 폐렴, 폐기종 및 기도의 다른 폐쇄성 또는 염증성 질환을 치료, 예방 또는 개선할 수도 있다.
본 개시 내용의 항체 또는 단백질은 골관절염, 골다공증 및 기타 염증성 관절염을 비롯한 골대사 질환 및 연령 관련 골 손실, 특히 치주 질환을 포함한 일반적인 골 손실에 사용될 수도 있다.
다발성 경화증, 건선, 천식, 전신홍반루푸스(SLE) 및 홍반성 신장염은 본 발명의 항체 또는 包含이의 항원 결합 부분을 포함하는 단백질을 이용하여 치료되는 특히 바람직한 표적을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 단백질을 유일한 활성 성분으로 투여하거나 면역 억제제 또는 면역 조절제 또는 다른 항염제 또는 다른 세포 독성제 또는 항암제와 같은 다른 약물과 함께(예를 들어, 이의 좌제 또는 이의 조합) 투여하여 상기 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 금염, 술파살라진(sulfasalazine), 항말라리아제, 메토트렉세이트(methotrexate), D-페니실라민( D-penicillamine), 아자티오프린(azathioprine), 미코페놀릭산(mycophenolic acid), 타크로리무스(tacrolimus), 시롤리무스(sirolimus), 미노사이클린(minocycline), 레플루노마이드(leflunomide), 글루코코티코이와 같은 DMARD; 시클로스폴린 A(Ciclosporin A) 또는 FK 506과 같은 칼시뉴린(calcineurin) 억제제; FTY720 및 FTY720 유사체와 같은 림프구 재순환 조절제; 라파마이신(rapamycin), 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신(40-O- (2-hydroxyethyl) -rapamycin), CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93과 같은 mTOR 억제제; ABT-281, ASM981 등과 같은 면역 억제 성질을 가진 아스코마이신(ascomycin); 코르티코스테로이드(corticosteroids); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 아자티오프린; 레플루노마이드; 미조리빈(mizoribine); 미코페놀레이트모페틸(Mycophenolate Mofetil); 15-데옥시스퍼구아린(15-deoxyspergualin) 또는 이의 면역 억제 동족체, 유사체 또는 유도체; MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이의 리간드와 같은 백혈구 수용체에 관한 단일 클론 항체와 같은 면역 억제 단일 클론 항체; 다른 면역 조절 화합물, 예를 들어, CTLA4 또는 이의 돌연변이체를 갖는 세포 외 도메인의 적어도 일부분, 예를 들어 CTLA4 단백질 서열의 CTLA4 또는 이의 돌연변이체의 세포외 도메인 의 적어도 일부분에 연결된 재조합 결합 분자, 예를 들어, CTLA4Ig(예를 들어, ATCC 6862로 지정됨) 또는 이의 돌연변이체, 예를 들어 LEA29Y; LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제와 같은 접착 분자 억제제; 또는 택솔(taxol), 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(cisplatin), 아드리아마이신(Adriamycin) 또는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 같은 화학 요법제; 인플리시맙(Infliximab), 아달리무맙(adalimumab), CDP870과 같은 TNF에 대한 단일 클론 항체 또는 에타너셉트(etanercept), PEG-TNF-RI와 같은 TNF-RI 또는 TNF-RII 수용체 구조물과 같은 항 TNF 약물; 전 염증성 사이토카인 차단제, IL1 차단제, 예를 들어 아나킨라(Anakinra) 또는 IL1 트랩(trap), 카나누주맙(Kananuzumab), IL13차단제, IL4차단제, IL6차단제, IL17차단제(예를 들어, 세쿠키누맙(secukinumab), 브로아다루맙(broadalumab), 이제키누맙(ixekizumab)) ; 메탈로프로테아제(metalloprotease)와 같은 프로테아제 억제제 또는 활성화제, 항-IL15항체, 항-IL6항체, 항-IL4항체, 항-IL13항체, 항-CD20항체, 아스피린(aspirin) 또는 항감염제와 같은 NSAID와 같은 케모카인 차단제와 조합하여 사용할 수 있다(언급된 시약에 제하되지 않음).
아래, 본 발명은 구체적인 실시예에 결부하여 더 설명할 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는 것을 이해하여야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 J. Sambrook 등이 편집한 분자 클론 실험 지침, 제3 버전, 화학 출판사, 2002와 같은 통상적인 조건, 또는 제조 업체가 건의하는 조건에 따른다.
실시예 1. 인간 proBDNF전구체 도메인 단백질의 발현 및 정제
(1) pET22b-proBDNF 담체 구축 및 검증
인간 종양 세포 U87MG의 cDNA를 주형으로 하고(RAYGENE 회사로부터 구매함), 프라이머 PROBDNF-F(SEQ ID No:25)와 PROBDNF-R(SEQ ID No: 26)로 PCR 증폭하여, 양단에 제한 효소 부위 ECORI/XhoI가 있는 proBDNF 유전자 단편(703bp)을 얻으며, ECORI/XhoI 이중 절단로(NEB 회사로부터 구매함), 목적 유전자 단편 proBDNF를 얻었다. 담체 플라스미드는 pET22b(Novogen 회사로부터 구매함) ECORI/XhoI 이중 절단를 사용하고, 아가 로즈 겔 전기 영동 후 담체 단편을 회수하여, T4 리가제(NEB회사로부터 구매함) 작용하에서 전술한 목적 유전자 단편 proBDNF와 연결한 후, 대장균 TOP10(LIFE회사로부터 구매함)으로 형질전환하며, 암피실린(ampicillin) 내성에 의해 스크리닝하고, ECORI/XhoI 절단 효소로 삽입된 단편을 함유한 양성 클론을 검증하며, 시퀀싱 확인을 통해 정확한 인간 proBDNF 유전자 서열의 원핵 발현 플라스미드 pET22b-proBDNF를 얻었다.
(2) 인간 proBDNF 단백질의 발현 및 정제
pET22b-proBDNF 플라스미드를 발현 숙주균 BL21(DE3)(Novagen회사로부터 구매함)에 형질전환시키고, 암피실린 내성의 플레이트에 평평하게 펴고 37 ℃의 온도하에서 뒤집어 하룻밤 배양하며, 단일 클로을 골라 발현시키고, 단일 클론을 고른 후 OD600이 0.6 내지 0.8이 될때 까지 진탕배양하며, 최종 농도가 1 mM인 IPTG를 넣어, 30 ℃의 온도 하에서 4시간 동안 유도하여 균액을 수집하였다. 원심 분리하여 침전을 얻고, 1/10 부피의 완충액A(50 mM의 NaH2PO4, 300 mM의 NaCl, 10 mM의 이미다졸, pH 8.0)를 넣어 재부유하며, PMSF(최종 농도는 1 mM임)를 넣어 얼음에서 초음파 처리하고, 15분 동안 원심 분리(4 ℃, 12000 g)하며, 원심 분리하여 상청액을 수집하고, Ni-NTA Agarose(QIAGEN회사로부터 구매함) 친화 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 발현 단백질을 얻은 후, PBS 용액을 투석하며, 12 %의 SDS-PAGE로 투석 후 정제된 단백질의 순도를 분석하고, A280로 이의 함량을 측정하며, SDS PAGE 전기 영동으로 이의 분자량을 측정한 결과 목적 밴드 분자량이 30 kD 부근에 있는 것으로 나타났고, 상기 분자량은 proBDNF 분자의 이론 분자량 27.8 kD와 기본적으로 일치하였다.
(3) 인간 proBDNF전구체 도메인 발현 담체V5F-pro-domain의 구축
상기에서 얻은 플라스미드 pET22b-proBDNF를 주형으로, 프라이머 BDNFproVF1(SEQ ID NO:28)과 BDNFproVR1(SEQ ID NO: 29)로 PCR 증폭하여, 양단에 제한 효소 부위 NheI/XhoI가 있는 인간 proBDNF 전구체 도메인 유전자 단편(350bp)을 얻었다. 상기 PCR 단편을 제한 효소 NheI/XhoI(NEB회사로부터 구매함)로 이중 절단하하고, 얻은 전구체 도메인 유전자 단편과 동일한NheI/XhoI(NEB회사로부터 구매함) 이중 절단하여 얻은 담체 V5F(RAYGENE회사로부터 구매함)를 T4 DNA 리가제에 의해 연결한 후, 숙주균 TOP10(LIFE회사로부터 구매함)에 형질 전환시키며, 양성 클론을 골라 PCR 검증하고, 시퀀싱을 통해 정확성을 확인하여, V5F-pro-domain 플라스미드 를 성공적으로 구축하였다.
(4) 인간 proBDNF전구체 도메인 단백질의 발현 및 정제
잘 성장한 HEK293F 세포(HEK293F, LIFE회사로부터 구매함)를 1×106 세포/ml의 밀도로 세포 삼각형 배양 플라스크에 접종하고, 37 ℃, 5 %의 CO2 및 120 rpm의 조건 하에서 하룻밤 배양하며; 상기 단계에서 얻은 V5F-pro-domain 플라스미드와 리포좀(293Fectin, LIFE회사로부터 구매함)을 각각 DMEM로 희석하여 부드럽게 혼합하고, 실온 하에서 20분 동안 인큐베이션(incubation)하며, 인큐베이션된 DNA-리포좀 복합체를 HEK293F 세포에 넣어, 37 ℃ 5 %의 CO2 및 120 rpm의 조건 하에서 72시간 동안 배야하였다. 세포 배양액을 수집하고, 4500 g으로 15분 동안 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 1 ml의 FLAG 항체 친화성 충진재(ANTI-FLAG Agarose Affinity Gel, Sigma-Aldrich회사로부터 구매함)를 취하여 컬럼에 넣고, FLAG 친화성 컬럼을 용해 완충액(50 mM의 PB, 0.3 M의 NaCl, 5 %의 글리세롤)으로 5개 내지 10개의 컬럼 부피에로 평형화시켰다. 원심 분리된 세포 배양액 상청액을 FLAG 친화성 컬럼을 통해 1 ml/min으로 흘러지나는 용액을 수집하여 4 ℃의 온도 하에 보관하였다. 세척 완충액1(50 mM의 PB, pH 7.8, 0.3 M의 NaCl, 5 %의 글리세롤)로 5개 내지 10개의 컬럼 부피를 세척하고, 세척액1을 수집하여 4 ℃의 온도에 보관하였다. 세척 완충액2(50 mM의 PB, pH 7.8, 0.3 M의 NaCl, 5 %의 글리세롤)로 4 내지 5개의 컬럼 부피를 세척하고, 세척액2를 수집하여 4 ℃의 온도에 보관하였다. 세척 완충액(50 mM의 Glycine.HCl, pH 3.0, 0.3 M의 NaCl, 5 %의 글리세롤)으로 4 내지 5개의 컬럼 부피를 세척하고, 세척액을 수집하여 중화 완충액(1M Tris.HCl pH8.0)을 넣으며, 투석액(50 mM의PB, pH 7.8, 0.3 M의 NaCl, 5 %의 글리세롤)에서 4 ℃의 온도로 하룻밤 투석하고, SDS PAGE 전기 영동에 의해 목적 밴드 분자량이 인간 proBDNF 전구체 도메인 단백질의 이론 분자량 13 kD에 해당되는 것으로 나타났다.
실시예 2. 인간 proBDNF전구체의 단일쇄 항체 스크리닝
2.1 파지 디스플레이에 의한 인간 proBDNF 전구체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 스크리닝
파지 디스플레이 기술을 이용하여, 완전 인간 처연 항체 라이브러리로부터 인간 proBDNF 전구체 단백질 특이적 항체를 스크리닝하였다. 이를 위해, 해당 기술분야의 통상적인 파지 디스플레이 방법을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하고, 비오틴 표지된 인간 proBDNF 전구체 재조합 단백질에 대하여 4라운드 정향 스크리닝을 수행하여, 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법과 디스플레이 방법은 PCT/CN2016/096292, Antibody Phage Display(edited by Robert Aitken)에 개시된 방법과 같은 해당 기술분야의 조작에 의해 수행된다.
2.2 인간 proBDNF전구체 특이적 결합 항체의 검증
제4 라운드 스크리닝에서 얻은 클론으로부터 무작위로 96개를 선택하고, 단일 파지 ELISA(효소결합면역흡착분석)에 의해 인간 proBDNF 전구체와의 결합 능력을 분석하였다. 이를 위해, 96웰 딥웹 배양 플레이트에서 각각의 단일콜로니에 300 μl의 2×YT/암피실린 배지를(2 %의 글루코오스 함유함)를 접종하여, 37 ℃ 및 250 rpm의 조건 하에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 20 μl의 배양물을 500 μl 2×YT/암피실린 배지(0.1 %의 글루코오스 함유함)에 접종하고, 37 ℃ 및 250 rpm의 조건 하에서 1.5시간 동안 진탕 배양하였다. 헬퍼 파지(helper phage) 용액을 준비하고, 75 μl의M13KO7(적정도는 3×1012 pfu/ml임)을 취하여 15 ml의 2×YT 배지에 혼합하여 50 μl/웰로 배양 플레이트에 첨가하였다. 37 ℃ 및 150 rpm의 조건 하에서 30분 동안 배양한 후, 준비된 카나마이신(Kanamycin) 용액을 50 μl/웰(180 μl의 50 mg/ml카나마이신을 취하여, 15 ml의 2×YT 배지에 넣음) 취하여, 37 ℃ 및 250 rpm의 조건 하에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 마지막으로, 세포를 원심 분리하여(30분, 5000×g, 4 ℃), 상청액을 새로운 96웰 딥웰 배양 플레이트로 옮겼다.
단일 파지 ELISA 수행을 위해, 100 ng/웰 항원 인간 proBDNF전구체 및 음성 대조 단백질 BSA(100 μl/웰)을 사용하여 4 ℃의 온도 하에서 96웰의 MediSorp ELISA 플레이트(Nunc로부터 구매함)에 하룻밤 코딩하였다. 각각의 웰을 2 %의 BSA(w/v)를 함유한 PBST로 차단하였다. 이 후, PBST로 웰을 3번 세척하여 깨끗하게 제거하였다. 다음, 100 μl/웰의 상기에서 제조된 각각의 파이 용액을 플레이트의 각 웰에 넣었다. 37 ℃의 온도 하에서 2시간 동안 보온한 후, PBST로 3번 세척하였다. 결합된 파지를 검출하기 위해, 항 M13항체 슈퍼옥시드디스무타아제(superoxide dismutase) 결합체(GE Healthcare로부터 구매함)를 PBST에 1:5000으로 희석하고, 100 μl를 취하여 각각의 웰에 넣었다. 37 ℃의 온도 하에서 1시간 동안 보온한 후, PBST로 웰을 3번 세척하고, 다음 PBS로 3번 세척하였다. 마지막으로, 50 μl의 TMB 기질을 취하여 각 웰에 넣고, 실온 하에서 10분 동안 발색한 후, 각 웰에 50 μl의2 M의 H2SO4를 넣어 발색 반응을 정지시켰다. 효소결합면역분석기(Bio-Rad)를 사용하여 450 nM에서 소광 값을 측정하였다.
시퀀싱 분석에 결합하여, 단일 쇄 항체 1D3(뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 22 참조, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21 참조) 및 2H8(뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 24 참조, 아미노산 서열은 23 참조)을 관찰하였고, ELISA 실험에서 인간 proBDNF 전구체 단백질에 대한 결합 신호 는 강하지만, BSA는 결합이 없다(도 1). 이 2개의 항체에 대응되는 플라스미드는 pCantab-1D3과 pCantab-2H8이다.
실시예 3. 인간 proBDNF 전구체 단백질 단일 클론 항체의 제조
본 실시예에서, 단일 클론 항체의 발현은 이중 플라스미드 시스템을 사용하였고, 각각 항체 중쇄 가변 영역 유전자를 인간 IgG1 CH 유전자를 포함하는 pIH 플라스미드에 구축하여야하고, 항체 경쇄 가변 영역 유전자를 인간 IgG CL 유전자를 포함하는 pIK 플라스미드에 구축하여야 한다(플라스미드는 상하이 루이진바이오텍 유한회사 로부터 구매함).
프라이머쌍 1D3-HF(SEQ ID NO: 30)와 1D3-HR(SEQ ID NO: 31)을 사용하여 주형 플라스미드 pCantab-1D3으로부터 VH-1D3 단편을 증폭시켰다. 프라이머쌍 HF1F(SEQ ID NO: 32)와 HF1R(SEQ ID NO: 33)을 사용하여 주형 플라스미드 pIH로부터 HF1 단편을 증폭시켰고; 프라이머쌍 HF3F(SEQ ID NO: 34)와 HF3R(SEQ ID NO: 35)을 사용하여 주형 플라스미드 pIH로부터 HF3 단편을 증폭시켰다. 3개의 단편을 등몰비로 혼합한 후 스플라이싱(splicing) PCR을 수행하고, 단편을 회수한 후 제한 효소 NheI/NotI로 이중 절단하며, 마찬가지로 NheI/NotI로 이중 절단된 담체 플라스미드 pIH를 T4 DNA리가제로 숙주균 TOP10에 형질 전환시키고, 클론을 골라 PCR을 통해 양성 클론을 검증하며 시퀀싱으로 확인하여, pIH-1D3 진핵 발현 플라스미드를 얻었다. 동일한 방식으로 pIH-2H8 진핵 발현 플라스미드를 얻었다.
pIK-1D3 진핵 발현 플라스미드를 얻기 위해, 프라이머쌍 1D3-LF(SEQ ID NO: 36)와 1D3-LR(SEQ ID NO: 37)을 사용하여 주형 플라스미드 pCantab-2H8로부터 VL-2H8 단편을 증폭시키고; 프라이머쌍 LF1F(SEQ ID NO: 38)와 LF1R(SEQ ID NO: 39)을 사용하여 주형 플라스미드 pIK로부터 LF1 단편을 증폭시켰다. 2개의 단편을 등몰비로 혼합한 후 스플라이싱 PCR을 수행하고, 단편을 회수한 후 제한 효소 EcoRV/BsiWI 이중 절단로 이중 절단하며, 마찬가지로 EcoRV/BsiWI로 이중 절단된 담체 플라스미드 pIK를 T4 DNA리가제로 숙주균 TOP10에 형질 전환시키고, 클론을 골라 PCR을 통해 양성 클론을 검증하며 시퀀싱으로 확인하였다. 동일한 방식으로 pIK-2H8진핵 발현 플라스미드를 얻었다.
발현 플라스미드 pIH-1D3과 pIK-1D3을 등몰비로 혼합하고, pIH-2H8과 pIK-2H8을 등몰비로 혼합하여, 각각 잘 성장한 HEK-293F 세포에 형질 감염시키며, 37 ℃, 5 %의 CO2, 125 rpm의 조건 하에 7일 동안 연속 쉐이킹 배양하고, 4000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 침전을 제거하며, 상청액을 수집하여, 0.45 μm의 여과막으로 여과하고, 처리된 샘플을 protein A(GE로부터 구매함) 친화성 컬럼으로 친화 정제하여, 최종적으로 정제된 재조합 단일 클론 항체1D3과 2H8을 얻었으며, 검증 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 4. 인간 proBDNF 전구체 단백질 단일 클론 항체의 친화력
Biacore T200 시스템(GE로부터 구매함)을 사용하여 포획법에 의해 각각 1D3과 2H8 단일 클론 항체의 친화력과 동역학 파라미터를 측정하였다. 조작은 명세서를 참조하고 사용된 인간 proBDNF 전구체 단백질의 농도는 각각 0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM 및 8 nM이다. Biacore T200 evaluation software에 의해 얻은 작용 곡선을 평가하고, 친화력 값 KD 값을 측정하였다. 도 3 및 도 4는 각각 Biacore 친화력 측정 실험에서의 단일 클론 항체1D3 및 2H8의 동역학 곡선을 나타낸다.
각각 인간 proBDNF 전구체 단백질에 대한 1D3 및 2H8의 단일 클론 항체의 결합 데이터는 표 1에 요약되어 있다.
인간 proBDNF 전구체 단백질에 대한 1D3 및 2H8의 단일 클론 항체의 친화력 파라미터
항체 샘플 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1D3단일 항체 5.256E+06 7.994E-04 1.521E-10
2H8단일 항체 3.103E+06 5.940E-03 1.914E-09
실시예 5. 2H8 및 1D3 치료 실험적 자가 면역성 뇌척수염(EAE)의 실험
본 실험은 SPF급 6 내지 8 주 웅성 C57BL/6 마우스를 사용하였고, 체중은 18 내지 20 g이다.
EAE 모델 제조: MOG35-55(3 mg/ml)/IFA(H37RA 4 mg/ml)가 완전히 유화된 후, 50 μl/마우스의 조제량으로 마우스 등 윗 부분 좌우 양측 및 좌측 꼬리 부분에 피하 주사하였다. 동시에, 백일해균 독소(pertussis toxin)PTX(0.5μg/100μl)를 50 μl/마우스의 조제량으로 복강 주사하고, 48시간 후 다시 같은 조제량의 PTX를 주사하였다. 7일째에, MOG35-55(3 mg/ml)/IFA(H37RA 2 mg/ml) 면역화된 마우스 등 아래 부분 좌우 양측 및 우측 꼬리 부분에 50 μl/마우스의 조제량으로 피하주사 하였다.
20마리의 마우스를 무작위로 완전 인간 유래 IgG 대조 항체군 2H8 단일 클론 항체 관여군으로 나누었다. 상동 IgG 대조 항체군은 EAE 모델링 후 17일째, 19일째 및 23일째에 전 인간 유래 IgG 대조 항체군을 0.2 ml/회로 복강 주사하였다. 2H8단일 클론 항체 관여군은 모델링 후 17일째, 19일째 및 23일째에 2H8단일 클론 항체를 5 mg/k씩 200 μL을 복강 주사하였다.
블랭크(Blank) 대조군과 실험군의 마우스를 매일 EAE 모델로 임상 적으로 평점하고, 평점 표준은 하기와 같다. 0점은 임상 증상이 없고; 0.5점은 꼬리에 힘이 없으며; 1점은 꼬리가 마비되고; 2점은 조화로운 움직임이 사라지며; 2.5점은 일측 뒷다리가 마비되고; 3점은 양측 뒷다리가 마비되며; 3.5점은 양측 뒷다리가 마비되고 앞다리 절반이 힘이 없으며; 4점은 앞다리가 마비되고; 5점은 죽어가거나 죽은 것이다. 죽은 쥐는 죽은 날에 5점을 얻고, 다음 날부터 점수를 기록하지 않는다.
결과는 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같고, 상동 대조 항체가 제공된 EAE 마우스는 모델링 후 17일에 임상 평점에서 현저하게 증가하였고, 임상 점수는 2 점을 초과하였으며, 모델링 후 49 일까지 계속 유지되었고; 2H8단일 클론 항체가 제공된 EAE 마우스는 모델링 후 17일 내지 49일에 임상 평점에서 모두 1.5점 보다 낮았으며; 임상 누적 점수는 상동 대조군 항체가 관여된 EAE 마우스 이미상 치료 누적 평점(43.45±5.009점)은 2H8 클론으로 치료된 EAE 마우스 임상 평점(24.65±1.282점)보다 현저하게 높은 것으노 나타났고, 결과적으로 2H8 클론이 EAE 마우스에서 임상 증상이 갯선되었음을 시사한다.
본 실시예의 상기 조작을 참조하면, 항체1D3에 대하여 EAE 모델 임상 평점을 지행한 결과 도 6a 및 6b에 도시된 바와 같고, 1D3 클론 관여군 EAE 마우스 임상 평점은 상동 IgG 대조 항체 관여군보다 현저하게 감소되었으며; 임상 누적 치료 평점군 1D3 치료군은 21.65±1.734점이고, 상동 대조군 IgG 항체군은 43.45±5.009점으로, 1D3이 EAE 마우스 진행을 현저하게 감소시키는 것을 시사한다.
실시예 6. EAE 마우스 발병 초기 염증 인자의 발현에 대한 proBDNF항체의 영향
실시예 5의 조작을 참조하여 EAE 모델링을 수행하고, 실험 군을, (1) 정상 대조(con)군; (2) 단일 Ab-proBDNF단일 항체 투여(Ab-proB) 군: 모델링 1일 전 5 mg/kg의 Ab-proBDNF(1D3) 단일 클론 항체 투여 군; (3) EAE 모델링 + 상동 IgG 항체 투여 대조(EAE)군; (4) EAE 모델링 + Ab-proBDNF 단일 클론 항체 투여(EAE+Ab-proB)군으로 나눈다. QPCR의 방법으로 각 군에서 척수 및 비장과 질환 관련 유전자 발현을 검출하였고, 그 결과 도 7에 도시된 바와 같다.
도 7a는 염증 인자 TNF-α 유전자 발현 정황을 나타낸다. Ab-proB군은 정상 대조군 대비, TNF-α의 발현이 기본적으로 유사하나, EAE군의 TNF-α 발현이 정상 대조군보다 현저하게 증가되었으며, 이는 proBDNF 항체가 조기 염증에 대하여 간섭 및 예방 작용이 있는 것을 보여준다. EAE+Ab-proB군은 EAE군 대비, TNF-α mRNA 수준이 현저하게 감소하였고, 정상 대조군 대비 현저한 차이가 없으며, 1D3 단일 클론 항체 투여는 TNF-α의 수준을 현저하게 감소시킬 수 있는 것을 보여주고, 즉 proBDNF 항체가 항영 작용이 있는 것을 보여준다.
도 7b, 도 7c, 도 7d는 각각 EAE 마우스 비장 IL-6, IL-2, IL-4에 대한 Ab-proB의 작용을 나타낸다. 결과, 정상 대조군 대비, Ab-proB군의 IL-6, IL-2, IL-4 유전자 발현은 현저한 차이가 없으나, EAE군의 TNF-α 발현은 정상 대조군보다 현저하게 증가하였으며, proBDNF항체가 조기 염증에 대하여 간섭 및 예방 작용이 있는 것을 보여주고; EAE군 비장 IL-6, IL-2, IL-4 유전자는 대조군 대비, 발현이 현저하에 상향 조절되었으며; 1D3 관여 후(EAE+Ab-proB군), IL-6, IL-2 및 IL-4 유전자 수준이 EAE군보다 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 proBDNF항체 투여가 EAE 조기 비장에서 상향 조절된 IL-6, IL-2, IL-4 mRNA 수준을 억제할 수 있는 것을 보여주고, 즉 proBDNF 항체가 항염 작용이 있는 것을 보여준다.
실시예 7. 항체의 에티토프 결합 실험
Western blot 결과는 항체1D3, 2H8이 변성된 huBDNFpro,에 결합할 수 있는 것을 나타내고, 2개의 항체의 결합 에티토프가 선형일 가능성이 있는 것을 시사한다. huBDNFpro를 2개의 펩티드 세그먼트(E1, E2) 또는 3개의 펩티드 세그먼트(E3, E4, E5)로 평균적으로나누면, 아미노산 서열은 하기와 같다.
E1: pmkeanirgqgglaypgvrthgtlesvngpkagsrgltsladtfehmieelldedq(SEQ ID NO: 40)
E2: kvrpneennkdadlytsrvmlssqvpleppllflleeyknyldaa nMsmrvrrh(SEQ ID NO: 41)
E3: pmkeanirgqgglaypgvrthgtlesvngpkagsrgl(SEQ ID NO: 42)
E4: tsladtfehmieelldedqkvrpneennkdadlytsr(SEQ ID NO: 43)
E5: vmlssqvpleppllflleeyknyldaa nMsmrvrrh(SEQ ID NO: 44)
5개의 펩티드 세그먼트 및 GST 융합 발현시킨 후 정제하였다. ELISA에 의해 항체1D3 및 2H8의 결합을 검출하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 항체1D3 및 2H8 및 GST-huBDNFpro전장, GST-huBDNFpro-E2 펩티드 세그먼트, GST-huBDNFpro-E5 펩티드 세그먼트가 모두 결합되고, 이 2개의 항체의 결합 에티토프가 E5 펩티드 세그먼트의 이들 36개의 아미노산 내에 위치하는 것을 시사한다.
실시예 8. 항체의 에티토프 결합 실험
E5 펩티드 세그먼트를 12개의 아미노산을 함유하는 3개의 삼등분 펩티드 세그먼트로 분할하고, 각각 VP 펩티드 세그먼트(VMLSSQVPLEPP, SEQ ID NO: 45), LL 펩티드 세그먼트(LLFLLEEYKNYL, SEQ ID NO: 46), DH 펩티드 세그먼트(DAA nMSMRVRRH, SEQ ID NO: 47)이다. GL Biochem(상하이) 유한회사에 의해 비오틴의 VP 펩티드 세그먼트, LL 펩티드 세그먼트 및 DH 펩티드 세그먼트를 합성하여 ELISA에 의해 항체의 결합을 검출하였다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같고, 항체 1D3 및 DH 펩티드 세그먼트 결합이 비교적 강하고, 2H8 및 DH 펩티드 세그먼트 결합이 비교적 약하며, 다른 2개의 펩티드 세그먼트은 결합하지 않으며, 항체1D3의 에티토프가 DH 펩티드 세그먼트 부근에 있고, 2H8의 에티토프가 DH 펩티드 세그먼트 부군에 있는 것을 시사한다.
본 발명에서 언급하는 서열은 하기의 표 2와 같이 총결된다.
명칭 서열 번호 서열
1D3의 HCDR1 1 GYDMH
1D3의 HCDR2 2 GLGMEGDSYYSASVKG
1D3의 HCDR3 3 DVHGFDV
1D3의 LCDR1 4 RSSQSLLYSNGYTYLD
1D3의 LCDR2 5 MGSNRAS
1D3의 LCDR3 6 MQALQTPLT
1D3의 VH 7 QVQLVESGGGLIQPGGSMRLSCAASGFSLSGYDMHWVRQIAGKGL
EWVAGLGMEGDSYYSASVKGRFTISRQDAKNSLYLEMKDLGGGD
TAVYYCLRDVHGFDVWGQGTTVTVSS
1D3의 VL 8 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYTYLDWYLQRPG
QSPQLLIYMGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY
CMQALQTPLTFGGGTKLEIKR
1D3의 중쇄 9 QVQLVESGGGLIQPGGSMRLSCAASGFSLSGYDMHWVRQIAGKG
LEWVAGLGMEGDSYYSASVKGRFTISRQDAKNSLYLEMKDLGGG
DTAVYYCLRDVHGFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST
SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSC
PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1D3의 경쇄 10 DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYTYLDWYLQR
PGQSPQLLIYMGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV
GVYYCMQALQTPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
EC
2H8의 HCDR1 11 SYGMH
2H8의 HCDR2 12 VISGSGDSTYYAESVKG
2H8의 HCDR3 13 GILTGYVFDY
2H8의 LCDR1 14 RSSQSLVSNDGNTYLN
2H8의 LCDR2 15 MVSKWDS
2H8의 LCDR3 16 MQSTHWPPT
2H8의 VH 17 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGK
GLEWVSVISGSGDSTYYAESVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLR
AEDTAVYYCASGILTGYVFDYWGKGTMVTVSS
2H8의 VL 18 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSNDGNTYLNWFQQRPGQPPRRLIYMVSKWDSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDV
GVYYCMQSTHWPPTFGGGTKLEIKR
2H8의 중쇄 19 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGL
EWVSVISGSGDSTYYAESVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLRAEDT
AVYYCASGILTGYVFDYWGKGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST
SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCP
APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL
TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2H8의 경쇄 20 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSNDGNTYLNWFQQR
PGQPPRRLIYMVSKWDSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDV
GVYYCMQSTHWPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
1D3의 scFv 21 QVQLVESGGGLIQPGGSMRLSCAASGFSLSGYDMHWVRQIAGK
GLEWVAGLGMEGDSYYSASVKGRFTISRQDAKNSLYLEMKDL
GGGDTAVYYCLRDVHGFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSG
GGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYTYLDW
YLQRPGQSPQLLIYMGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKLEIKR
1D3의 scFv의 뉴클레오티드 서열 22 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGATAC
AGCCGGGGGGGTCGATGAGACTCTCCTGTGCAGCCTC
TGGATTCAGCCTCAGTGGATATGACATGCACTGGGTC
CGCCAAATTGCGGGAAAAGGTCTGGAGTGGGTCGCCG
GTCTTGGGATGGAAGGTGACTCATATTATTCAGCCTCC
GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGACAAGATGCCA
AGAATTCCCTGTATCTTGAAATGAAGGACCTGGGAGG
CGGGGACACGGCTGTCTATTACTGTCTAAGAGATGTC
CACGGATTCGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC
ACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTG
GTTCTGGCGGTGGCGGATCGGATGTTGTGATGACTCAG
TCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGC
CTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATA
GTAATGGATACACCTATTTGGATTGGTACCTGCAGAG
GCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATATGGG
TTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGT
GGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCA
GCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTG
CATGCAAGCTCTACAAACTCCCCTCACTTTCGGCGGA
GGGACCAAGCTGGAGATCAAACGT
2H8의 scFv 23 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR
QAPGKGLEWVSVISGSGDSTYYAESVKGRFTISRDNARN
TVYLQMNSLRAEDTAVYYCASGILTGYVFDYWGKGTM
VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTLGQP
ASISCRSSQSLVSNDGNTYLNWFQQRPGQPPRRLIYMVS
KWDSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQ
STHWPPTFGGGTKLEIKR
2H8의 scFv의 뉴클레오티드 서열 24 GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGGGGCGGCTTGGTCC
AGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCT
GGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTT
ATTAGTGGTAGTGGTGATAGTACATACTACGCAGAGTC
CGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCA
GGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCC
GAGGACACGGCTGTATATTATTGTGCAAGTGGCATTTTG
ACTGGTTATGTATTTGACTATTGGGGCAAAGGGACAATG
GTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGG
TGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGATGTTGTGATGACTCAG
TCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCT
CCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATCCAATG
ATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAG
GCCAACCTCCAAGGCGCCTAATTTATATGGTTTCTAAGT
GGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGG
TCAGGCACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGGGTGGA
GGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTAC
ACACTGGCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGG
AGATCAAACGT
프라이머 PROBDNF-F 25 GCGAATTCCCCATGAAAGAAGCAAACATCC
PROBDNF-R 26 CCGCTCGAGTTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAATG
인간 proBDNF 유전자서열 27 Gcccccatgaaagaagcaaacatccgaggacaaggtggcttggcctacccaggtgtgc
ggacccatgggaCtctggagagcgtgaatgggcccaaggcaggttcaagaggcttgac
atcattggctgacactttcgaacacatGatagaagagctgttggatgaggaccagaaagtt
cggcccaatgaagaaaacaataaggacgcagacttgtaCacgtccagggtgatgctcag
tagtcaagtgcctttggagcctcctcttctctttctgctggaggaatacaaaaattacctagat
gctgcaaacatgtccatgagggtccggcgc
프라이머 BDNFproVF1 28 GCTGGCTAGCACCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAG
프라이머 BDNFproVR1 29 CCGCTCGAGGTGGCGCCGGACCCTCATG
프라이머쌍 1D3-HF 30 gcctttcctggtttcctgtctcaggtgcagctggtggag
프라이머쌍 1D3-HR 31 ATGGGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTG
프라이머쌍 HF1F 32 ggctaactagagaacccactgc
프라이머쌍 HF1R 33 AGACAGGAAACCAGGAAAGGC
프라이머쌍 HF3F 34 gcctccaccaagggcccatc
프라이머쌍 HF3R 35 gacaatcttagcgcagaagtc
프라이머쌍 1D3-LF 36 ctttggtttccaggtgcaagatgtgatgttgtgatgactcagtctcc
프라이머쌍 1D3-LR 37 CACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGG
프라이머쌍 LF1F 38 ggctaactagagaacccactgc
LF1R 39 ACATCTTGCACCTGGAAACCAAAG
E1 40 pmkeanirgqgglaypgvrthgtlesvngpkagsrgltsladtfehmieelldedq
E2 41 kvrpneennkdadlytsrvmlssqvpleppllflleeyknyldaa nMsmrvrrh
E3 42 pmkeanirgqgglaypgvrthgtlesvngpkagsrgl
E4 43 tsladtfehmieelldedqkvrpneennkdadlytsr
E5 44 vmlssqvpleppllflleeyknyldaa nMsmrvrrh
VP 45 VMLSSQVPLEPP
LL 46 LLFLLEEYKNYL
DH 47 DAA nMSMRVRRH
본 발명에서 언급되는 모든 문헌은 본원 발명에서 각각의 문헌이 단독으로 참조로 인용되는 것처럼 참조로 인용된다. 이 외에 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 해당 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 할 수 있으며, 이런한 등가 형식도 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속하는 것을 이해하여야 한다.
<110> SHANGHAI YILE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. <120> POLYPEPTIDE AND ANTIBODY BOUND TO POLYPEPTIDE <130> P2018-1403 <150> CN 201710752743.8 <151> 2017-08-28 <160> 47 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, HCDR1 <400> 1 Gly Tyr Asp Met His 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, HCDR2 <400> 2 Gly Leu Gly Met Glu Gly Asp Ser Tyr Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, HCDR3 <400> 3 Asp Val His Gly Phe Asp Val 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, LCDR1 <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, LCDR2 <400> 5 Met Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1D3, LCDR3 <400> 6 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> 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gaggccaggc 540 caacctccaa ggcgcctaat ttatatggtt tctaagtggg actctggggt cccagacaga 600 ttcagcggca gtgggtcagg cactgatttc acactgagaa tcagcagggt ggaggctgag 660 gatgttgggg tttattactg catgcaaagt acacactggc ctcccacttt cggcggaggg 720 accaagctgg agatcaaacg t 741 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcgaattccc catgaaagaa gcaaacatcc 30 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ccgctcgagt tatcttcccc ttttaatggt caatg 35 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human proBDNF gene sequence <400> 27 gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc aggtgtgcgg 60 acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg cttgacatca 120 ttggctgaca ctttcgaaca catgatagaa gagctgttgg atgaggacca gaaagttcgg 180 cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat gctcagtagt 240 caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa ttacctagat 300 gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc 330 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctggctagc acccatgaaa gaagcaaaca tccgag 36 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ccgctcgagg tggcgccgga ccctcatg 28 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcctttcctg gtttcctgtc tcaggtgcag ctggtggag 39 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atgggccctt ggtggaggca ctcgagacgg tgaccgtg 38 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ggctaactag agaacccact gc 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 agacaggaaa ccaggaaagg c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcctccacca agggcccatc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gacaatctta gcgcagaagt c 21 <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ctttggtttc caggtgcaag atgtgatgtt gtgatgactc agtctcc 47 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 caccgtacgt ttgatctcca gcttgg 26 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ggctaactag agaacccact gc 22 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 acatcttgca cctggaaacc aaag 24 <210> 40 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 peptide fragment <400> 40 Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr Pro 1 5 10 15 Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys Ala 20 25 30 Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Met Ile 35 40 45 Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln 50 55 <210> 41 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2 peptide fragment <400> 41 Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Val Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu 20 25 30 Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser 35 40 45 Met Arg Val Arg Arg His 50 <210> 42 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E3 peptide fragment <400> 42 Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Met Ile Glu Glu Leu Leu Asp 1 5 10 15 Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp 20 25 30 Leu Tyr Thr Ser Arg 35 <210> 43 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 peptide fragment <400> 43 Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Met Ile Glu Glu Leu Leu Asp 1 5 10 15 Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp 20 25 30 Leu Tyr Thr Ser Arg 35 <210> 44 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E5 peptide fragment <400> 44 Val Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg 20 25 30 Val Arg Arg His 35 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP peptide fragment <400> 45 Val Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LL peptide fragment <400> 46 Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DH peptide fragment <400> 47 Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His 1 5 10

Claims (21)

  1. SEQ ID NO: 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. SEQ ID NO: 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. SEQ ID NO: 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질과 인간 pro-BDNF의 결합 친화력이 < 10 nM인 것을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 14로 표시되는 CDR1;
    SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 CDR2; 및
    SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 CDR3을 구비하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO: 4로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 5로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 CDR3; 또는
    SEQ ID NO: 14로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 15로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 CDR3을 구비하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 11로 표시되는 CDR1;
    SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 CDR2; 및
    SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 CDR3을 구비하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO: 1로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 2로 표시되는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 CDR3; 또는
    SEQ ID NO: 11로 표시되는 CDR1, SEQ ID NO: 12로 표시되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 CDR3을 구비하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는,
    중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열을 포함하는 항체(a);
    중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 서열을 포함하는 항체(b); 및
    항체(a) 또는 항체(b)의 변이체이고, 항체(a) 또는 항체(b)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는 항체(c)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 항체는,
    SEQ ID NO: 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 8로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체(d);
    SEQ ID NO: 17로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체(e); 및
    항체(d) 또는 항체(e)의 변이체이고, 항체(d) 또는 항체(e)의 활성을 갖거나 기본적으로 갖는 항체(f)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질.
  13. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 단백질은 제1항 내재 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역시켜 얻거나, 제1항 내재 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드로 파지 라이브러리를 스크리닝하여 얻는 것을 특징으로 하는 단백질.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질 및 임의의 하나 또는 여러 가지의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  15. 자가 면역 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
  16. pro-BDNF 매개 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 질환은 관절염, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 재생 불량성 빈혈, 건선, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 한랭글로불린혈증, 만성 폐쇄성 폐질환, 전신홍반루푸스(SLE), 홍반성 신장염, 천식, 다발성 경화증 또는 낭포성 섬유증인 것을 특징으로 하는 용도.
  18. TNF-α, IL-2, IL-6 또는 IL-4의 분비를 억제하여 질환의 예방, 치료 또는 진단용 약물을 제조하기 위한 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
  19. 통증 완화용 약물을 제조하기 위한 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
  20. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 핵산.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드로 동물을 면역시키거나 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드로 파지 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체의 스크리닝 방법.
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