KR20200095902A - 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도 - Google Patents

항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20200095902A
KR20200095902A KR1020190013863A KR20190013863A KR20200095902A KR 20200095902 A KR20200095902 A KR 20200095902A KR 1020190013863 A KR1020190013863 A KR 1020190013863A KR 20190013863 A KR20190013863 A KR 20190013863A KR 20200095902 A KR20200095902 A KR 20200095902A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
her2
cdk12
ser
pro
therapy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020190013863A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102338510B1 (ko
Inventor
공구
이정연
최희주
조하니
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 산학협력단 filed Critical 한양대학교 산학협력단
Priority to KR1020190013863A priority Critical patent/KR102338510B1/ko
Priority to US16/778,237 priority patent/US12037646B2/en
Publication of KR20200095902A publication Critical patent/KR20200095902A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102338510B1 publication Critical patent/KR102338510B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G01N33/574—
    • G01N33/57415—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 HER2(Human epidermal growth factor receptor2) 양성 암 및 항-HER2 치료에서 바이오마커로서 사이클린 디펜던트 키나아제 12(CDK12)의 기능 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, CDK12는 HER2+ 암에서 항 HER2 표적치료제에 대한 개체의 반응에 대한 예후인자이자 예측인자로서 HER2+ 암을 갖는 개체를 위한 HER2 표적치료제에 대한 동반진단 또는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 발현 가능성 확인을 위해 사용할 수 있다. CDK12가 기준값 이상으로 증폭 또는 발현된 경우, 이의 억제를 통해 HER2 치료제에 대한 저항성을 극복하고 치료 효능을 향상시킬 수 있어, HER2 양성 암의 치료 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

항-HER2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도{COMPANION DIAGNOSTIC BIOMARKER FOR ANTI-HER2 THERAPY AND USE THEREOF}
본 발명은 HER2(Human epidermal growth factor receptor2) 양성 암 및 항-HER2 치료에 대한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
HER2 증폭 또는 과발현에 의해 정의되는 인간 상피세포 성장인자 수용체 2 양성(HER2+) 유방암은 모든 유방암의 15%~20%를 차지한다1 ,2. 가장 공격적인 유방암 아형으로 여겨지지만, HER2 표적 약물의 개발은 HER2+ 유방암으로 고통받는 환자에게 상당한 임상적 이점을 부여했다. 최초로 승인된 항-HER2 단일 클론 항체인 트라스투주맙은 HER2+ 유방암 환자를 위한 표준 요법으로 세계에서 가장 흔하게 사용되는 약물이다3 ,4. 그러나 축적된 임상적 증거에 따르면 트라스투주맙 치료에 대한 HER2+ 유방암의 반응은 다양하며, 50% 이상의 환자가 트라스투주맙에 반응하지 않거나 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다5 -7. 따라서, HER2+ 유방암과 관련된 생물학적 메커니즘을 정의하고, HER2+ 유방암의 모든 하위 그룹에 더 광범위하게 적용 할 수 있는 더 나은 치료 전략을 개발하는 것이 필요하다.
HER2+ 유방암은 임상적으로 항-HER2 치료법으로부터 효과를 얻는 유방암의 분명한 하위 집단으로 정의되지만, HER2+ 종양의 게놈 분석에 따른 상기 하위 유형의 생물학적 및 분자적 이질성은 HER2+ 유방암의 추가 설명 및 분류의 필요성을 시사한다. 최근 HER2+ 유방암에 대한 대규모의 전체-게놈 서열 분석과 전사체 분석은 그것이 염색체(chr) 17 및 기타 염색체 부위의 유전자 증폭 및 다중 유전자의 체세포 돌연변이를 포함하는 상이한 유전자 발현 및 구별되는 게놈 특성을 나타내는 여러 하위 그룹을 포함한다는 것을 보여주었다8. 또한, 이러한 게놈 이질성(genomic heterogeneity)은 HER2-표적 치료법에 다양한 반응을 일으킨다4 ,9,10. HER2 증폭을 일으키는 chr17의 이상이 HER2+ 유방암의 가장 대표적인 특징 중 하나이지만1 ,2,11, HER2 증폭물 내의 분자적 변이와 임상적 영향에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
사이클린-의존성 키나아제 12(CDK12, Cyclin-dependent kinase 12)는 chr17q12에 위치하고, HER2+ 유방암의 약 90%를 차지하는 HER2와 함께 높은 동시 증폭을 나타낸다12 -14. CDK12 키나아제 활성은 PolII-매개 전사 개시를 조절하기 위해 세린 2(PolII CTD-ser2)에서 RNA 중합 효소 II의 C-말단 도메인(CTD)을 인산화시킨다. 또한, CDK12는 세포주기의 진행 및 DNA 손상 수리 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 수행한다15 -18. 게놈 분석은 인간 암에서 돌연변이, 재배치 또는 증폭을 통한 CDK12의 빈번한 변경(alteration)를 확인하였는데, 이는 CDK12를 잠재적인 암 표적 유전자로 제안한다12 ,19-22. 게다가, 기능적으로 비활성인 CDK12 돌연변이가 있는 난소암에서, CDK12 결핍은 PARP(poly(ADP-ribose) polymerase) 1/2 억제제인 올라파립(olaparib)에 대한 민감성을 향상시켰다. 유사하게, 3중 음성 유방암(TNBC)에서 CDK12 억제제인 디나시클립의 투여로 PARP1/2 억제제에 대한 내성이 역전되었다24. 그러나, 인간 암에서 CDK12 증폭의 빈도가 높더라도, CDK12의 증폭을 포함하는 암 유형에서 CDK12의 기능적 역할은 대체로 알려지지 않았다.
따라서, HER2양성 유방암에서 항-HER2 치료에 대한 효과를 향상시키고, HER2 내성을 극복하기 위한 새로운 치료 전략이 여전히 필요하다.
상기 종래 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명자들은 지속적인 연구를 통해서 HER2+ 암에서 HER2 표적치료제에 대한 반응성이 CDK12와 관련이 있음을 새롭게 밝혔고, HER2+ 암 치료에 대한 새로운 전략을 제시한다.
구체적으로, 본 발명의 발명자는 HER2+ 유방암에서 CDK12 증폭이 암 줄기 세포의 조절, 종양 성장 및 트라스투주맙에 대한 반응을 포함한 많은 HER2 특이적 기능을 포함하고 있어, CDK12가 HER2+ 유방암에서 HER2를 대체할 수 있는 바이오 마커가 될 수 있음을 새롭게 밝혔다. 특히, 또한, CDK12 키나아제 저해가 다양한 유형의 HER2+ 유방암에 대해 광범위하게 효과적인 치료 방법이 될 수 있고, 항-HER2 치료에서 트라스투주맙 내성을 극복 및 항-HER2 치료제의 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 HER2 양성 암에 대한 새로운 치료 전략의 제시를 위해, CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물을 제공한다.
상기 동반진단용 조성물은 구체적으로, HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 암은 HER2 양성 유방암 일 수 있다.
상기 조성물에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 CDK12의 복제(copy) 수는 CDK12 유전자 복제(copy) 수 일 수 있고, 상기 CDK12의 발현 수준은 CDK12 mRNA 발현 수준; 또는 CDK12 단백질의 발현 수준 일 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준;을 측정하는 것을 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 동반진단 방법은 상기 측정결과 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 경우, 상기 시료를 제공한 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함할 수 있다:
CDK12 저해제의 투여가 필요함;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용투여가 필요함.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 방법에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준은 형광 핵산 혼성화(FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR)으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의하여 확인하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트를 제공한다.
상기 키트는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2)의 복제(copy)수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
상기 키트에서 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 상보적이거나 특이적인 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 키트는 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; 또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 치료 보조용 조성물을 제공한다.
상기 CDK12 저해제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물에서 CDK12 저해제는 디나시클립 및 THZ-531로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
상기 조성물은 HER2 표적치료제와 함께 투여되는 것일 수 있고, 또는 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물 또는 치료 보조용 조성물은 HER2 표적 치료제를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 치료 보조용 조성물은 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체의 치료를 위한 것일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK12를 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질과 CDK12를 접촉시키는 것, 및 상기 CDK12의 유전자 복제(copy) 수; mRNA 발현 수준; 또는 단백질 발현 수준;을 감소시키거나, CDK12 단백질 발현을 억제하는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법은 상기 CDK12를 감소시키거나 발현을 억제하는 후보물질을 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약물로 판단하는 것;을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12 유전자의 복제(copy) 수, CDK12 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 CDK12 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; 및/또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체에 CDK12 유전자 저해제 및 CDK12 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물이 투여되는 개체에 HER2 표적치료제를 병용 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 투여 전에, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로부터 수득한 시료로부터 CDK12 유전자의 복제(copy) 수, CDK12 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 CDK12 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 방법에서 CDK12 및/또는 CDK12의 유전자 또는 mRNA 발현 저해제는 CDK12 및/또는 CDK12 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법에서 CDK12 및/또는 CDK12 단백질 활성 저해제는 CDK12 및/또는 CDK12 단백질에 특이적으로 작용하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법에서 CDK12 및/또는 CDK12 단백질 활성 저해제는 디나시클립 일 수 있다.
또한, 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준;을 측정하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트의 제조를 위한 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제 또는 상기 제제를 포함하는 키트의 제조를 위한 용도(application)를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 가질 것으로 예상되는 개체의 치료용 약물의 제조를 위한 CDK12 저해제의 용도(application)를 제공한다.
본 발명의 CDK12는 HER2+ 암에서 항 HER2 표적치료제에 대한 개체의 반응에 대한 예후/예측 인자로서, HER2+ 암을 갖는 개체에 대해 HER2 표적치료제에 대한 동반진단에 적합하며, HER2 표적치료제에 대한 내성을 극복하고, CDK12 저해제의 병용 투여를 통해 이의 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있어, HER2 치료법에 의한 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 17q12에서 HER2와 유전자들의 증폭 여부, CDK12와의 관계 및 증폭과 치료의 예후의 관계를 확인한 결과이다. 17q12에서 HER2와 CDK12 동시 증폭은 유방암의 나쁜 예후와 관련이 있음을 확인할 수 있다;
도 1a: 포레스트 플롯(Forest plot)은 METABRIC 데이터 세트에서 유방암 환자의 무병 생존률(DFS, 오른쪽 상단)과 전체 생존률(OS, 오른쪽 하단)에 따른 17q12 증폭 산물(amplicon)에서 유전자의 위험 비(hazard ratio)를 나타낸다. HER2 증폭에 위치한 유전자는 위험-비(hazard-ratio) 수준에 다라 기재되었다(모든 P 값 < 0.01). 왼쪽의 막대 그래프는 표시된 유전자의 HER2 동시-증폭 백분율을 나타낸다.
도 1b: 산점도는 CDK12 발현과 METABRIC에서 CNA(copy number alteration) 사이의 상관관계를 보여준다(왼쪽). r값은 피어슨 상관 계수로 계산되었다(Pearson's correlation coefficient). 박스 그래프(Box plot)는 METABRIC의 표시된 하위 유형에서 CDK12 mRNA 수준을 보여준다(오른쪽). P-값은 post hoc LSD 검정을 이용한 one-way ANOVA로 계산되었다.
도 1c: 로그 순위 테스트와 함께 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 METABRIC(상단) 및 KM 플로터(하단)에서 CDK12 발현에 따른 유방암 환자의 생존 분석 결과를 보여준다.
도 1d: 1 μg/mL 또는 100 μg/mL 트라스투주맙(Trz); 및/또는 5 nM 또는 10 nM 디나시클린(Dina)으로 각각 처리된 트라스투주맙-민감성 BT474 세포와 트라스투주맙-저항성 HCC-1954 세포에서 SRB 분석에 의한 세포 생존력을 측정한 결과이다. 데이터는 평균±s.d.를 나타낸다(n=3). P-값은 post hoc LSD 검정을 사용한 RM ANOVA로 계산되었다.
도 1e: HER2+ 유방암의 in vivo 상에서 트라스투주맙 반응성에 대한 CDK12 결핍의 영향 분석 결과를 보여준다. 마우스는 표시된 HER2+ 유방암 세포로 동소 이식되었고, 20 mg/kg 트라스투주맙 및/또는 20 mg/kg 디나시클립으로 처리되었다. 각 그룹의 성장 곡선은 5주에서 6주간 2회 분석되었다(n=8/그룹; 평균±SEM; post hoc LSD 검정을 이용한 RM ANOVA(왼쪽)). 오른쪽은 동소 이식 후 트라스투주맙 및/또는 디나시클립으로 처리된 BT474 또는 HCC-1954 세포로부터 얻은 종양 사진이다.
도 2a 내지 2f는 다양한 종양 신호 케스케이드의 활성인자를 전사적으로 상향조절하는 CDK12의 역학을 확인한 결과이다;
도 2a: RNA-seq 분석에서 얻은 대조군(CON)과 CDK12 과발현 ZR-75-30 세포(CDK12) 사이의 유전자 발현의 변화(≥1.5-폴드)를 보여주는 열지도(Heatmap).
도 2b: RNA-seq 결과를 바탕으로 대조군과 CDK12 과발현 세포 사이의 유전자 발현 프로파일의 상관 관계를 보여주는 GSEA 분석 결과이다.
도 2c: CDK12 과발현 ZR-75-30 세포에서 qRT-PCR 분석을 사용하여 검증된 RNA-seq에 의해 동정된 CDK12-표적 유전자를 보여준다. 데이터는 3회 측정한 값의 평균±s.d.를 나타낸다. P-값은 양측 Student's t 검정을 사용하여 계산되었다.
도 2d: 디나시클립-표적 유전자(GSE8882224) 및 PolII ChIP-seq 결과(GSE7202330)와 RNA-seq 결과로부터의 일반적인 유전자의 수를 비교한 벤다이어그램이다.
도 2e: WNT1, WNT3 및 IRS1의 발현에 CDK12 키나제 억제가 미치는 영향을 확인한 결과. 세포는 다양한 투여량의 디나시클립으로 12시간 동안 처리되었고, CDK12의 후보 표적의 발현은 면역블롯 및 qRT-PCR으로 분석되었다(n=3, 평균± s.d., post hoc LSD 검정을 이용한 ANOVA).
도 2f: IRS1, WNT1 및 WNT3의 TSS에서 표기된 단백질 및 히스톤 H3 아세틸화의 폴드-농축(enrichment)을 보여주는 ChIP-qPCR 분석결과. 데이터는 3회 측정값의 평균±s.d. 이며, P-값은 양측 Student's t 검정을 사용하였다.
도 3은 CDK12가 HER2+ 유방암에서 WNT 리간드의 상향 조절을 통해 암 줄기세포능(stemness)과 WNT/β-catenin 신호전달 경로를 조절함을 보여준다;
도 3a: CDK12-과발현 ZR-75-30 세포 및 CDK12-siRNA-주입된 BT474 세포에서 CD44+/CD24-/ESA+ 유방 CSC-유사 집단 백분율의 FACS 분석 결과. 3회 독립적인 시료의 평균±s.d. P-값은 양측 Student's t 테스트(ZR-75-30 세포; 왼쪽) 및 post hoc LSD 검정을 이용한 일원 ANOVA(BT474 세포; 오른쪽)에 기초한다.
도 3b: 각각 표시된 안정한 세포주에서 CSC의 자가 재생을 종양구-형성 분석(tumorsphere-formation assay)을 사용해 분석한 그래프. 1차(P1) 및 2차(P2) 종양구 세포(≥ 직경 100㎛)의 수를 3일, 5일 및 7일 후에 계수하였다. 결과는 평균±s.d.를 보여준다(n=3). P-값은 양측 Student's t 검정(왼쪽 패널) 또는 포스트 hoc LSD 검정을 이용한 ANOVA(오른쪽 패널)를 기반으로 계산되었다.
도 3c: 표시된 세포주 각각에서, GSK-3β의 인산화 수준 및 WNT1 및 WNT3 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR 결과(n=3, 평균±s.d.; 양측 Student's t 검정).
도 3d 및 도 3e: 표시된 안정한 세포주에서 β-카테닌의 세포 내 위치를 세포 분획(d) 및 면역 형광 염색(e)으로 분석한 결과. 대조군, CDK12 과발현 세포 및 CDK12-넉다운 안정 세포주에서 β-카테닌의 핵 전좌(translocation)는 면역 형광 이미지로부터 β-카테닌 핵을 보유하는 세포를 계수함으로써 정량화되었다. 데이터는 3회 측정의 평균±s.d.를 나타낸다. P-값은 양측 Student's t 검정법으로 계산되었다. M+C - 막(membrane) 및 세포질 β-카테닌; N - 핵 β-catenin.
도 3f: 표시된 세포주에서 TCF/림프성 인핸서-결합인자-프로모터 활성을 측정하는 루시퍼라제-리포터 분석 결과. TOP - pTOP-flash(야생형 TCF-결합 사이트), FOP - pFOP-flash(변이 TCF-결합 사이트). 데이터는 3회 측정한 값의 평균±s.d. 이다. P-값은 양측 Student's t 검정법으로 계산되었다.
도 3g: CDK12-과발현 ZR-75-30 세포에서 WNT/β-카테닌/TCF-표적 유전자의 mRNA 수준에 대한 qRT-PCR로 분석 결과. 평균±s.d.(n=3). P-값은 양측 Student’s t 검정법으로 계산되었다.
도 4는 CDK12가 IRS1 발현을 상향 조절하여 EGFR-HER2-PI3K-AKT 신호를 활성화시킴을 보여준다;
도 4a: CDK12-넉다운 BT474 세포에서 포스포키나제(phosphokinase)-관련 단백질의 활성화를 보여주는 인간 phospho-RTK 어레이 결과. 막대 그래프는 스팟 강도의 폴드 변화를 나타낸다.
도 4b: CDK12를 안정적으로 발현 또는 CDK12 넉다운 HER2+ 유방암에서 표시된 단백질의 수준을 보여주는 면역블롯 결과.
도 4c: 표시된 세포주 각각에서, IRS1의 인산화 수준 및 발현의 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR 분석 결과. 평균±s.d.(n=3). P-값은 양측 Student’s t 검정법을 사용하였다.
도 4d 및 도 4e: CDK12 과발현 ZR-75-30 세포로부터의 세포 용해물에 대한 항체를 이요한 면역 침전 및 면역 블로팅 결과.
도 4f: HER2+ 유방암에서 암 줄기세포능, 세포 성장 및 트라스투주맙 반응성의 CDK12 조절 기작에 대한 제안 모델.
도 5는 HER2+ 유방암에서 CDK12 증폭과 나쁜 예후 사이의 연관성을 보여준다;
도 5a: METABRIC 및 TCGA에서 HER2 및 CDK12의 유전적 변화와 관련된 경우의 비율을 보여주는 Oncoprint.
도 5b: 왼쪽 - TCGA로부터 유방암의 각 아형에서 CDK12 mRNA 수준을 보여주는 박스 그래프(Box plot). P-값은 post-hoc LSD 검정을 이용한 일원 ANOVA 로 계산되었다. 오른쪽 - TCGA에서 CDK12 mRNA 수준과 복제 수 사이의 상관 관계를 보여주는 산포도. r 값은 피어슨 상관 계수로 계산되었다.
도 5c: METABRIC 및 TCGA에서 CDK12와 HER2 발현 사이의 상관 관계. r 값은 피어슨 상관 계수로 계산되었다.
도 5d: bc-GenExMiner 4.0을(http://bcgenex.centregauducheau.fr)를 이용하여 생성된 다양한 유형의 유방암 데이터 세트에서 CDK12 발현과 전이성 재발(MR) 위험 사이의 연관성을 보여주는 포레스트 플롯(Forest plot; 위 패널) 및 NPI 및 AOL 조정 분석(아래쪽 패널)의 결과.
도 5e: CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)로부터 얻은 HER2+ 및 HER2- 유방암 세포에서 CDK12의 증폭 상태 및 mRNA 수준을 보여주는 oncoprint(위). 각 세포주에서, CDK12 단백질의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(아래).
도 6은 CDK12가 HER2+ 유방암에서 종양 성장을 촉진하는 것을 보여준다;
도 6a: SRB 분석법에 따라 측정된 각 세포주의 성장 곡선. 평균±s.d.(n=3). P-값은 post-hoc LSD 검정을 이용한 RM ANOVA로 계산하였다.
도 6b: 동소 종양 이종 이식 모델에서 in vivo 종양 성장에 대한 CDK12의 영향을 분석한 결과. NOD/SCID 마우스에 17-β 에스트라디올 펠렛으로 이식 한 후 각 포주가 주입되었다. 종양 크기를 주 2회 측정하여 종양 성장 곡선으로 분석하였다(n=7/군; 평균±s.e.m). P-값은 post hoc LSD 검정을 이용한 RM ANOVA로 계산되었다.
도 7은 HER2+ 유방암에서 트라스투주맙 반응성에 대한 CDK12의 영향을 보여주는 결과이다;
도 7a: 각 용량의 트라스투주맙(Trz)(μg/mL) 또는 비히클로 5일 동안 처리된 후 SRB 분석법으로 측정된 세포 생존률. 데이터는 평균±s.d.(n=3). P-값은 post hoc LSD 검정을 이용해서RM ANOVA로 계산되었다.
도 7b: 트라스투주맙(Trz) 또는 비히클로 5일 동안 처리된 후 SRB 분석법으로 측정된 각 안정한 세포주의 세포 성장을 확인한 결과. 트라스투주맙-민감성 HER2+ 유방암 세포주, ZR-75-30 세포 및 BT474 세포;와 트라스투주맙-내성 HER2+ 유방암 세포주, HCC-1419 세포 및 HCC-1954 세포는 1μg/mL 또는 100μg/mL 트라스투주맙으로 각각 처리되었다. 데이터는 평균±s.d.(n=3). P-값은 post hoc LSD 테스트를 이용한 RM ANOVA로 계산되었다.
도 7c: 1μg/mL 트라스투주맙(Trz) 및/또는 5nM 디나시클립(Dina)으로 처리 후 SKBR3 세포에서 SRB 분석법으로 측정된 세포 생존률 결과. 데이터는 평균±s.d.(n=3). post-hoc LSD test를 이용한 RM ANOVA를 이용하여 P 값을 계산 하였다.
도 8은 HER2+ 유방암에서 유방 CSC에 대한 CDK12의 효과를 보여준다;
도 8a: 유동 세포 계측법으로 측정된 각각 표기된 안정한 세포주에서 유방 CSC(CD44+/CD24-/ESA+)의 비율. 데이터는 평균±s.d.(n=3). P-값은 양측 Student’s t 검정법(왼쪽 패널) 또는 post hoc LSD 검정을 이용한 ANOVA(오른쪽 패널)를 사용하여 계산되었다.
도 8b: 각 세포주의 종양구-형성(Tumoursphere-형성) 분석 결과. 1차(P1) 및 2차(P2) 종양구 세포(≥ 직경 100㎛)의 수는 3, 5, 및 7일 후에 계수되었다. 데이터는 평균±s.d.(n=3). P-값은 양측 Student's t 검정법(왼쪽 패널) 또는 post hoc LSD 검정을 이용한 ANOVA(오른쪽 패널)를 사용하여 계산되었다.
이하에서, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 조성물에 관한 것으로, CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물을 제공한다.
상기 CDK12는 NCBI 등에 유전자, mRNA 및 단백질 정보를 참고할 수 있다. 예를 들어, NCBI Reference Sequence로서 NM_016507.3, NM_015083.2, NP_057591.2 또는 NP_055898.1 등으로 등록되어 있으며, 상기 유전자 정보 외에, CDK12로 알려진 서열 정보를 모두 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 CDK12가 WNT-리간드-매개 WNT/β-catenin/TCF-신호전달 경로를 활성화하고 PolII CTD를 표적으로하는 CDK12 키나아제 활성에 의존하는 방식으로 ErbB-신호전달 네트워크를 촉진시킴으로써 CSC-유사 특성을 유지하는 것을 확인하였다(도 4f).
또 다른 일 실시예에서, HER2+ 유방암을 일으키는 chr17q12에서 HER2와 CDK12의 동시-증폭의 필수적인 역할을 확인하였다. HER2가 HER2+ 유방암의 잘 알려진 발암인자 이지만, HER2와 동시-증폭된 여러 유전자가 HER2+ 유방암에서 성장-저해 효과 또는 세포사멸 유도를 증가시키는 이들 유전자의 공동-억제로 인해 항-HER2 치료에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있다. 이와 일관되게 HER2 앰플리콘(amplicon)이 HER2 치료의 예후 결과와 유의하게 관련된 다양한 유전자를 포함하여, 이는 HER2+ 유방암의 공격성을 더욱 강화시키는데, CDK12가 HER2와 동시-증폭을 통한 발암인자 임을 확인하였다. 나아가, CDK12가 HER2+ 유방암의 유망한 표적이 될 수 있음을 확인하여, CDK12 증폭 또는 그 발현 상태를 바탕으로 HER2 표적치료에 대한 환자를 선택할 수 있음을 밝혔다.
본 발명의 일 실시예에서, HER2 양성 유방암을 갖는 개체에서 CDK12의 유전자 증폭이 나타나거나, CDK12 mRNA 과발현, CDK12 단백질 과발현의 경우, HER2 표적치료제인 트라스트주맙에 대한 저항성을 갖는 것을 확인하였고, CDK12의 증폭 또는 과발현을 저해하거나 CDK12 키나아제 저해제를 처리하는 경우 트라스트주맙에 대한 저항성이 개선되고, 트라스투주맙의 치료효과를 향상시키는 것을 확인하였다.
또 다른 일 실시예에서, 유방암 환자의 생존 분석에서 CDK12 발현의 임상적 중요성은 HER2와 유사함을 확인하였다. 이러한 디나시클립에 의한 CDK12의 억제는 트라스투주맙-민감성 및 저항성 HER2+ 유방암에서 두드러진 항종양 효과를 나타나게 함을 확인하여, CDK12가 HER2 양성 유방암에서 하나의 아형으로서 유망한 치료표적이 될 수 있음을 밝혔다.
따라서, 본 발명의 동반진단용 조성물은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 마커로서 용도를 갖는다.
본 발명에서 용어 "CDK12"로 지칭하는 경우, CDK12 유전자, CDK12 유전자의 mRNA 또는 CDK12 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석된다. 또한, CDK12 유전자, CDK12 mRNA 또는 CDK12 단백질은 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 단편 또는 재조합 단백질, 코돈 최적화된 cDNA 등을 포함하는 것으로 해석된다. 따라서, 본 발명에서 CDK12의 발현 수준은 CDK12 유전자, 이의 mRNA 발현 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 포함하는 의미이다. 또한, 본 발명에서 언급되는 각각의 유전자명 역시 그 유전자, mRNA 또는 단백질을 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 용어 "동반진단(Companion Diagnostic)"이란, 특정 치료 약물을 특정 환자에 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위한 진단 테스트 중 하나를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암을 갖는 개체에 HER2 표적치료제; 및/또는 CDK12 저해제를 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위해 상기 HER2 양성 암을 갖는 개체에서 CDK12의 유전자의 복제수, mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단배질 발현 수준을 동반진단 마커로서 측정할 수 있다.
따라서, 이러한 측면에서 본 발명에서 동반진단은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "판별"은 특정 기준에 따라 대상을 구별하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 것으로 진단되거나 가질 가능성이 있는 개체가 HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성을 갖거나 갖지 않는 것을 구별하는 것, 또는 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 갖거나 갖지 않는 것을 구별하는 의미로 사용 될 수 있다.
또한, 본 발명에서 표현 "투여의 필요성"이란 치료제(약물)에 대한 치료효과를 얻을 수 있거나 얻을 수 있다고 예상되는 개체에 대하여 상기 치료제의 투여 여부를 결정하기 위한 것으로, 상기 결정은 본 발명의 동반진단 마커의 복제수 또는 발현 순준을 측정하여 기준값과 비교하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에서는 HER2 표적치료제; CDK12 저해제; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제 병용 투여 여부를 결정하기 위해서, 동반진단 마커로서 CDK12 유전자의 복제수, 이의 mRNA 발현 주순 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 것 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암"은 HER2 유전자의 증폭 또는 과발현을 나타내는 암을 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 양성을 나타내는 유방암, 위암, 폐암, 식도암(esophageal carcinoma), 방광암 및 결장암으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 HER2 양성 유방암 일 수 있다. 상기 HER2 양성(유전자 증폭 또는 과발현) 여부는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 기준에 의해서 결정될 수 있고, 이는 각 나라에서 HER2 양성 여부를 진단하는 임상적 기준 등에 따라 달라질 수 있다. HER2 양성암의 가장 대표적인 치료법으로 HER2 표적치료법이 사용되고 있고, 이 중에서도 항-HER2 단일 클론 항체인 트라스트주맙이 HER2+ 유방암 환자를 위한 표준 요법으로 세계에서 가장 흔하게 사용되는 약물이다. 그러나 축적된 임상적 증거에 따르면 트라스투주맙 치료에 대한 HER2+ 유방암의 반응은 다양하며, 50% 이상의 환자가 트라스투주맙에 반응하지 않거나 내성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, HER2 표적치료제를 사용하기 위한 환자군을 보다 정밀하게 구분할 수 있는 동반진단 마커의 개발이 필요하며, 항-HER2 치료법에서 나타나는 내성을 극복하고 치료효과를 향상시킬 수 있는 치료법의 개발이 필요하다.
본 발명에서 HER2 표적치료제는 HER2를 치료 표적으로 하는 임의의 치료제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 동반진단용 조성물은 CDK12의 복제(copy) 수 또는 CDK12의 발현수준을 포함하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 상기 CDK12의 복제(copy) 수는 CDK12 유전자 복제(copy) 수를 의미하며, 상기 CDK12의 발현 수준은 CDK12 mRNA 발현 수준; 또는 CDK12 단백질의 발현 수준을 의미한다.
본 발명에서 용어 "유전자의 복제(copy) 수"는 각 개체의 특정 유전자형(genotype)에서 특정 유전자의 수를 의미하는 것으로, 여러 복제가 형성되는 특정 유전자 또는 유전자 단편의 수를 의미한다. 본 발명에서 유전자의 복제수를 측정하는 것은 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 복제수변이(Copy number variation 또는 Copy number variant, CNV) 및 유전자 복제수(Gene Copy Number, GCN)를 측정하는 것과 동일한 것으로 해석될 수 있다. 또한, 상기 유전자의 복제 수는 특정한 기준값에 대하여 복제수가 그 이상 또는 초과인 경우 "유전자의 증폭"이 있는 것으로 나타낼 수 있고, 기준값 미만 또는 이하인 경우 "유전자의 증폭"이 없는 것으로 나타낼 수 있다. 본 발명에서 상기 "유전자의 증폭"은 "유전자의 중복"과 혼용해서 사용될 수 있는 것으로, 유전자 복제(copy)의 수가 기준값의 이상 또는 초과인 경우를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 HER2 양성 유방암 개체에서, CDK12의 유전자의 복제수가 FISH 분석을 통해 CEP17(chromosome 17) 대비 레티오(ratio)가 2.2인 경우를 기준값으로 하여, 이를 초과하는 경우 유전자의 증폭이 있는 것으로 설정하고, 분석을 수행하였다. 다만, 이는 본 발명에서 CDDK12 의 증폭 또는 과발현과 ER 양성 유방암에서 HER2 표적치료제에 대한 내성과의 관계를 확인하기 위해 설정된 값이므로, CDK12을 바이오마커로 이용하는 키트, 조성성 또는 검출방법 등의 밸리데이션과 같은 개발과정에 따라 증폭 기준값이 다르게 설정될 수 있다.
본 발명에서 용어 "mRNA 발현 수준" 또는 "단백질 발현 수준"은 특정 유전자의 유전정보를 리보솜에 전달하는 메신저 RNA가 발현되는 정도 또는 이로부터 단백질이 발현되는 정도를 의미한다. 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준은 특정 기준값에 대하여 발현 수준이 그 이상 또는 초과인 경우 “과발현”이라고 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 마이크로어레이를 통해 얻은 측정값 기준(quantile normalization) log2 강도가 8이상인 경우를 과발현 기준값으로 설정하고 분석을 수행하였다. 다만, 이는 본 발명에서 CDDK12 의 증폭 또는 과발현과 ER 양성 유방암에서 HER2 표적치료제에 대한 내성과의 관계를 확인하기 위해 설정된 값이므로, CDK12을 바이오마커로 이용하는 키트, 조성성 또는 검출방법 등의 밸리데이션과 같은 개발과정에 따라 과발현 기준값이 다르게 설정될 수 있다.
본 발명에서 용어 "유전자의 복제(copy) 수를 측정하는 제제" 또는 "mRNA 발현 수준을 측정하는 제제"는 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynuleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서 프라이머는 CDK12 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은, 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 프라이머는 CDK12 유전자 또는 이의 mRNA에 상보적인 센스 및/또는 안티센스 프라이머일 수 있다. 센스 또는 안티센스 프라이머를 단독으로 포함할 수도 있고, 센스 및 안티센스 프라이머를 함께 포함할 수도 있다. 또한, CDK12에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 일 수 있다.
본 발명에서 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 라벨링되어 있어서 특정 유전자 또는 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 "유전자 복제수를 측정하는 방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 유전체 전장 분석방법과 표적 특이적 방법을 모두 사용할 수 있다. 구체적으로 형광 핵산 혼성화(fluorescent in situ hybridization, FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR) 으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준을 측정하는 방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), RNA-염기순서결정법(RNA-seq; RNA-sequencing), 나노스트링 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 동반진단이 필요한 개체로부터 수득한 생물학적 시료의 mRNA 발현량과 대조시료에서의 mRNA 발현량을 비교해서 mRNA의 과발현/저발현 여부를 확인하거나, 상기 시료의 mRNA 발현값을 측정해서 기준값과 비교해서 과발현/저발현 여부를 확인, 또는, HER2 표적치료제 처리 후 mRNA 발현 수준이 HER2 치료제 처리 전 CDK12 mRNA 발현 수준 보다 낮은지 비교해서 발현 증가/발현 저하 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서 "단백질 수준을 측정하는 제제"는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 CDK12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정방법"은 본 발명의 기술분야에서 사용되는 통상적인 방법을 모두 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학 염색(IHC), 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "저항성"은 "내성"이라고도 하며, 특정 약제에 대하여 유의적으로 세포성 또는 생물학적 반응을 나타내지 않는 것을 의미한다. 구체적으로 약제를 이용한 치료에 대해 암세포의 사멸 속도 또는 세포 사멸이 나타나지 않거나, 감소하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "HER2 표적치료제"는 "HER2 유전자, mRNA 또는 단백질 저해제"를 의미하는 것으로, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자 또는 단백질에 특이적으로 작용하여 HER2 유전자 또는 단백질 저해제의 발현 또는 활성을 억제 또는 저해시키는 효과를 갖는 제제로서의 항 HER2 치료제를 모두 포함하는 의미이다. 구체적으로 HER2의 이량체화 또는 HER2가 다른 수용체와 상호작용하는 신호를 억제하는 것 일 수 있다.
상기 HER2 발현 저해제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
상기 HER2 단백질 활성 저해제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 천연 또는 합성화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 HER2 표적치료제는 HER-2 수용체를 표적으로 하는 치료제를 의미하는 것으로, 예를 들어 항체성 치료제 일 수 있다. HER-2 표적치료제는 현재 상업적으로 판매하고 있는 의약품 외에도, 이미 논문, 특허 등을 통해서 알려진 표적인 HER-2 수용체를 치료 표적으로 하는 치료제라면 모두 본 발명에서 의도하는 HER2 표적치료제 범위에 속할 수 있다.
구체적으로 HER-2 수용체를 표적으로 하는 치료제는 트라스투주맙, 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군으로부터 선택 된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트라스트주맙(Trastuzumab)은 허셉틴(Herceptin)이라고도 한다. 사람 상피증식인자 수용체 HER-2유전자 또는 그의 유전자산물 과잉발현으로 나타나는 전이성암에 대한 치료제로, HER2의 세포외 부분을 항원 결정부(epitope)로 하여 인식하는 항체성 치료제이다.
상기 퍼투주맙은 전이성 질환에 대한 항-HER2 치료제로서, 퍼제타 등의 상품명으로 상업적으로 판매되고 있다. HER-2의 신호전달을 차단하여 HER2 이합체화를 억제하는 작용을 한다. 상기 퍼투주맙은 트라스트주맙 또는 도세탁셀과 병용투여될 수 있다.
상기 T-DM1(트라스투주맙엠탄신, trastuzumab emtansine)은 ado-trastuzumab emtansine이라고도 하며, 캐싸일라(Kadcyla)의 상품명으로 상업적으로 판매되고 있는 항체-약물 컨쥬게이트 형태의 치료지에다. 트라스트주맙이 세포독성제(cytotoxic agent)인 엠탄신(emtansine, DM1)에 결합된 구조를 갖는다.
본 발명에서 용어 "개체" 또는 "환자"는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유동물일 수 있으며, 상기 포유동물은 개, 말, 고양이, 소, 영장류, 마우스 및 랫트를 모두 포함하는 것으로, 바람직한 구현예에 따라 인간일 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준;을 측정하는 것을 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 동반진단용 조성물에 대한 기재내용은 본 발명의 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
상기 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 동반진단 방법은 측정결과 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 경우, 상기 시료를 제공한 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함할 수 있다:
CDK12 저해제의 투여가 필요함;
HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용투여가 필요함.
상기 측정에 의하여 CDK12 증폭이 나타난 개체, 즉 기준값보다 높은 CDK12 유전자 복제(copy) 수; CDK12 유전자의 mRNA 발현 수준; 또는 CDK12 단백질의 발현 수준을 나타내는 개체는 HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮거나, 상기 치료제에 대한 저항성을 갖는 것으로 구분 할 수 있다. 또한, 상기 개체가 HER2 표적치료제의 투여를 받은 개체인 경우, HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량할 것으로 예측할 수 있고, 투여된 HER2 표적치료제에 이하여 약제 저항성을 갖는다고 판단할 수 있다. 따라서, 상기 개체에서 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 높이거나 저항성을 낮추기 위해서 CDK12 저해제의 투여(또는 처방)가 필요하다고 판단하거나 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용투여가 항암 치료 효과를 가질 수 있다고 판단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "기준값(reference value)"은 유전자의 증폭/비증폭; 또는 mRNA 또는 단백질의 과발현/저발현을 나누는 기준이 되는 값을 의미한다. 상기 기준값은 일 예로 특정 약물의 처리 전 개체의 평균 유전자 복제 수 또는 평균 mRNA/단백질 발현 수준 이거나, 정상 개체의 평균 유전자 복제 수 또는 평균 mRNA/단백질 발현 수준 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 기준값은 특정 환자군의 평균 유전자 복제수의 분포 또는 mRNA/단백질 발현 수준의 분포에 따라 정해질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 유전자 복제수, mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용하는 유전자, mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 방법을 이용하여 각 개체의 시료로부터 평균 유전자 복제수, mRNA 발현 수준 이나 단백질 발현 수준을 측정하고, 측정값의 분포에서 상위 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에 해당하는 경우의 측정값을 기준값으로 설정할 수 있다.
일 예로, CDK12 유전자 복제 수의 경우, 기준값은 유전자 복제수 1 카피 이상, 2 카피 이상, 3카피 이상, 4 카피 이상, 5카피 이상, 6카피 이상, 7카피 이상, 8카피 이상, 9 카피 이상, 또는 10 카피 이상 일 수 있다.
앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 기준값은 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 설정될 수 있고, 각종 통계법 및 통계를 구하기 위한 소프트웨어 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 기준값은 시료(또는 개체)의 총 수(n)에 따라서 달라지거나 설정하고자 하는 목적에 따라서 값이 상이해질 수 있고, 본 발명의 CDK12 마커를 이용해서 키트 등을 제조하는 경우, 제품의 최적화 수준 등에 따라 달라질 수 있으나, 그 기준값은 본 발명을 참고하여 설정할 수 있는 것이므로, 모두 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 기준값은 통상적인 방법에 따라서 설정된 소정(pre-determined)의 값 일 수 있다.
또한, 상기 방법은 CDK12 유전자 증폭으로 구분된 개체에게 CDK12 저해제 및HER2 표적치료제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 처방하거나 이를 위해 정보를 제공)하는 것;을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"는 소변, 체액(혈액, 림프액 또는 조직액 등 포함), 또는 생검 조직일 수 있고, 바람직하게는 암을 갖는 개체로부터 얻은 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 HER2 양성 암으로 의심되거나, 판별 또는 진단받은 개체로부터 얻은 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트 또는 동반진단 시스템을 제공한다.
상기 동반진단용 조성물 또는 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대한 설명은 본 발명의 동반진단용 키트 또는 동반진단 시스템에 준용 될 수 있다.
상기 키트는 또는 시스템은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 유전자의 복제(copy) 수; HER2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 HER2 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 동반진단용 키트는 시료의 개체가 HER2 양성인지 여부와 HER2 표적치료제에 대한 저항성(또는 감수성)을 갖는지를 동시에 판단할 수 있다. HER2 양성에 해당하는지 여부는 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법에 따라 판단할 수 있고, 예를 들어 HER2 양성 유방암의 경우 [J Clin Oncol. 2007 Jan 1;25(1):118-45. Epub 2006 Dec 11; PMID: 17159189]에 개시된 기준에 따라 판단, HER2 유전자 복제수가 6을 초과하는 경우 양성으로 판단할 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니고, HER2 양성 암종에 따라 달라질 수 있고, 임상 기준에 따라 각 국가에서 개별적으로 정하는 방법 및/또는 기준이 있는 경우, 이에 따라 결정될 수 있다.
상기 유전자의 복제 수; mRNA 발현 수준; 또는 단백질 수준을 측정하는 제제는 중복된 기재를 피하기 위해, 상기 CDK12에서 설명한 바를 준용할 수 있다.
상기 키트 또는 시스템은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
상기 키트는 통상적인 유전자 복제수, mRNA 발현 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 또는 어레이 키트일 수 있다. RT-PCR 키트의 경우, CDK12 유전자 및/또는 HER2 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 통상적으로 키트의 구성에 포함될 수 있는 것을 포함할 수 있다. 또한, 동반진단 키트 또는 시스템을 위한 통상적인 기술이 본 발명에 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 암 개체로부터 얻은 시료로부터 HER2 양성여부를 확인하고, CDK12 유전자의 복제수, CDK12 mRNA 발현수준 또는 CDK12 단백질의 발현/활성 수준을 측정해서, 항 HER2 치료제에 대한 처방 여부를 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 개체가 기준값 이상의 CDK12 유전자 복제수 및/또는 발현 수준을 갖는 경우, 상기 개체는 HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮거나, HER2 표적치료제에 대한 저항성을 갖는 것으로 구분 할 수 있다. 또한, 상기 개체가 HER2 표적치료제의 투여를 받은 개체인 경우, HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량할 것으로 예측할 수 있고, 투여된 HER2 표적치료제에 대하여 약제 저항성을 갖는다고 판단할 수 있다. 따라서, 상기 개체에서 HER2 표적치료제에 대한 민감성을 높이거나 저항성을 낮추기 위해서 CDK12 저해제의 투여가 필요하다고 판단하거나, HER2 표적치료제와 CDK12A 저해제의 병용투여가 치료효과를 갖는다고 판단하거나, 상기 투여가 필요하다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; 또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 치료 보조용 조성물을 제공한다.
상기에서 기재한 동반진단용 조성물, 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 동반진단용 키트에 대한 설명은 본 발명의 약학 조성물; 또는 치료 보조용 조성물에 준용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 치료 보조용 조성물은 CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하여, HER2 양성 암을 가지면서 CDK12 증폭 또는 과발현을 나타내는 개체, 즉 CDK12의 유전자 복제 수 또는 발현 수준이 기준값 이상인 개체; 및/또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성이 발현되거나 발현 가능성이 예상되는 개체에 CDK12 저해제를 투여하거나 CDK12 저해제와 HER2 표적체료제를 병용투여하여, 상기 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성을 억제하고, 약제 민감성 및 치료제의 효과를 향상시키고, 예후를 좋게 할 수 있다
항-HER2 치료법이 HER2+ 유방암 환자에게 가장 일반적으로 적용되는 치료법이긴 하나, HER2+ 유방암 환자의 절반 이상이 대표적인 약물인 트라스투주맙에 반응하지 않거나 이에 대한 저항성을 갖는다는 문제점이 지속적으로 존재한다. 또한, 상기 트라스투주맙은 항체 기반 치료제로서, 다른 항암제에 비해 매우 비싸고, 환자에게 자이간 투여되어야 하는 문제도 존재한다. 따라서 이를 대체하거나, 이의 치료 효과를 개선할 수 있는 치료법의 개발에 대한 요구는 여전히 존재한다.
트라스투주맙의 작용 메커니즘과 그 내성 메커니즘은 여전히 논쟁의 여지가 있지만, ErbB- 수용체 혼선을 통한 HER2의 우회와 하류 신호 전달 케스케이드의 구성적 활성화가 트라스투주맙 내성과 관련된 주요 메커니즘을 이를 극복하기 위해 ErbB-패밀리 수용체에 대한 다른 키나제 억제제 또는 PI3K-AKT 신호전달 억제제와 함께 사용 가능한 항-HER2 제제의 조합과 같은 다양한 조합-치료 전략이 임상에서 수행되었다. CDK12는 현재 항-HER2 치료를 포함하는 병용 치료 전략의 표적이 되는 다중 종양 신호전달 케스케이드를 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시예의 in vitro 및 in vivo 데이터는 CDK12의 강력한 저분자 억제제 디나시클립이 트러스투주맙 민감성 및 내성 HER2+ 유방암에 대한 새로운 치료제로 효과를 가짐을 보여준다. 특히, HER2와 CDK12의 동시-증폭을 포함하는 HER2+ 유방암은 항-HER2 치료보다 CDK12 키나아제 활성의 억제에서 더 두드러지게 효과가 나타남을 확인하였다.
이러한 측면에서, HER2 양성암 개체는 HER2와 CDK12의 동시-증폭이 나타나는 개체일 수 있다.
본 발명에서 용어 저해 또는 억제는 특정 물질이 표적 유전자의 전사(transcript) 조절하여 전사가 되지 못하도록 하거나, 유전자의 mRNA에서 단백질로 해독(translation)되는 과정을 방해하여 단백질의 발현이 되지 못하도록 하거나, 단백질 및/또는 mRNA 자체를 분해시켜 유전자의 역할을 하지 못하도록 작용하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 따라서, 본 발명에서 유전자 저해제 또는 억제제는 유전자의 mRNA 발현 저해제 및 유전자에 의해 코딩되는 단백질 발현 저해제를 모두 포함하는 의미이다.
상기 저해제는 CDK12 유전자에 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 화합물 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 단백질 저해제는 CDK12 단백질에 특이적으로 작용하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, HER2와 CDK12의 동시 증폭이 나타나는 경우 HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성을 가짐을 구체적으로 밝혔고, CDK12 증폭 또는 과발현을 억제함으로써 HER2 치료제에 대한 약제 저항성을 억제 또는 개선할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 CDK12의 억제를 통해서 HER2 표적치료제에 대한 내성을 개선 또는 억제할 수 있음을 새롭게 밝히고, HER2 표적치료제와 병용 투여할 수 있는 새로운 치료적 접근을 제시한다는 점에서 상기 CDK12 저해제 또는 활성화제가 구체적인 종류의 화합물, 항체 등의 제제에 한정되지 않고, 본 발명에 폭 넓게 포함될 수 있다.
구체적으로, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 CDK12 저해제는 디나시클립 및 THZ-531로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 조성물은 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “병용투여”는 두 가지 이상의 약물을 함께 투여하는 것을 의미하며, 함께 투여된다고도 표현할 수 있다. 상기 병용 투여는 두 가지 이상을 약물을 동시에 투여하거나 두 가지 이상의 약물을 순차적으로 투여하는 것을 모두 포함한다. 상기 HER2 표적치료제와 병용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 경우, 상기 저해제에 의하여 유도된 저항성을 개선할 수 있고, 저해제에 의한 저항성의 생성을 억제할 수 있으며, 종래 치료제의 효과 또한 개선할 수 있는 장점이 있다.
상기 HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 CDK12를 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질과 CDK12를 접촉시키는 것, 및 상기 CDK12의 유전자 복제(copy) 수; mRNA 발현 수준; 또는 단백질 발현 수준;을 감소시키거나, CDK12 단백질 발현을 억제하는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법은 상기 CDK12를 감소시키거나 발현을 억제하는 후보물질을 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약물로 판단하는 것;을 더 포함할 수 있다.
단백질 또는 mRNA와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) CDK12 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, CDK12 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), CDK12 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.
상기 스크리닝용 조성물은 유효성분 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 CDK12를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 CDK12를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12 유전자의 복제(copy) 수, CDK12 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 CDK12 단백질의 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; 및/또는 HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체에 CDK12 유전자 저해제 및 CDK12 단백질 활성 저해제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
앞서 본 발명에 대하여 기술한 모든 내용이 본 치료방법에도 준용될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 투여되는 개체에 HER2 표적치료제를 병용 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물 투여 전에, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로부터 수득한 시료로부터 CDK12 유전자의 복제(copy) 수, CDK12 유전자의 mRNA 발현 수준, 또는 CDK12 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 단계는 HER2 표적치료제에 대한 동반진단 마커로서 CDK12의 수준을 측정하여 HER2 표적치료제의 효과 또는 예후를 예측하는 것, 즉 동반진단을 하는 것을 의미한다.
상기 투여는 경구투여 또는 비경구투여의 모든 방법을 포함할 수 있고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 통해서 투여가 이루어질 수 있다. 또한, 병용 투여서 제1의 약물은 비경구투여를 통해서 투여되고, 제2의 약물은 경구투여를 통해서 투여되는 것과 같이, 서로 다른 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에서는 HER2 표적치료제에 저항성을 갖는 HER2 양성 유방암 개체에 CDK12 저해제를 트라스투주맙과 함께 투여하는 경우, 상기 트라스투주맙에 대한 저항성이 개선되고, 트라스투주맙의 치료효과가 더욱 향상되는 것을 구체적인 실시예를 통해서 확인하였다.
또한, 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준;을 측정하기 위한 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트의 제조를 위한 인간상피성장인자수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제 또는 상기 제제를 포함하는 키트의 제조를 위한 용도(application)를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 개체; HER2 표적치료제에 대해 저항성을 갖는 개체; 또는 가질 것으로 예상되는 개체의 치료용 약물의 제조를 위한 CDK12 저해제의 용도(application)를 제공한다.
앞서 본 발명에 대하여 기술한 모든 내용이 본 발명의 용도에도 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실험준비 및 실험 방법]
1. 세포 배양 및 시약
BT474, ZR-75-30, HCC-1419, HCC-1954 및 SKBR3을 포함하는 HER2+ 인간 유방암 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 얻어, 10% 소 태아 혈청(FBS, Welgene, 한국)을 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. 모든 세포는 가습된 5% CO2 배양기에서 37℃로 배양되었다. 트라스투주맙과 디나시클립은 로슈(Roche, Basel, Switzerland)와 셀렉캠(SCH727965, Selleckchem, Houston, TX, USA)에서 각각 얻었다.
2. 렌티 바이러스 감염 및 안정한 세포 생산
인간 CDK12 cDNA(서열번호 3)를 렌티 바이러스 pLVX-puro 벡터(Clontech, Mountain View, CA, USA)에 클로닝시키고, CDK12에 대한 shRNA(cat#: RHS4531-EG51755; CloneID: V3LHS_349483(서열번호 7) 및 V3LHS_645396(서열번호 8))를 각각 pGIPZ 벡터(GE Dharmacon, Lafayette, CO, USA)에 삽입하였다. CDK12 cDNA 또는 shRNA를 코딩하는 렌티 바이러스는 전술한 바와 같이 제조하였다43. 안정한 CDK12-과발현 및 -넉다운 세포주를 각각 확립하기 위해, CDK12 cDNA 또는 shRNA를 함유하는 렌티 바이러스를 6㎍/mL 폴리브렌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 사용하여 각 세포주를 감염시켰다. 감염된 세포는 2μg/mL 퓨로마이신(puromycin, Sigma-Aldrich)으로 선발되었다.
3. 면역 블롯 및 면역 침전
세포는 프로테아제-저해제와 포스파타제-저해제 칵테일을 함유한 방사면역 침전 완충액으로 용해되었고, 면역블롯은 앞서 공지된 바에 따라 수행하였다44. 면역 침전을 위해서, 세포 용해물은 4℃에서 하룻밤 동안 적절한 항체와 함께 인큐베이트되었고, 4℃에서 2시간 단백질 A- 또는 G- 아가로오스 비드를 이용해서 침전시켰다. 아가로오스 비드를 포함한 면역 복합체는 냉장된 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 세척되었고, β-머캅토에탄올을 함유한 3x시료-로딩 완충액에서 95 ℃로 5 분 동안 가열되었다. 시료를 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하고, 면역 블롯을 앞서 알려진 바에따라 수행하였다.
하기 항체를 면역 블롯 및 공동-면역침전 분석에 사용 하였다: CDK12(ab57311)는 Abcam(Cambridge, MA, USA)으로부터 수득하였다; 인산화된 (p)-EGFR(2236S), p-HER3(4791S), p-IRS1(3203S), IRS1(3407S), p-CTD(13499S), CTD(2629S), p-AKT(4060S), AKT(9272S), p-ERK(9101S), ERK(9102), p-GSK-3(9336), 및 GSK-3(9315S)는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)로부터 입수하였다; p-HER2(06-229), β-actin(MAB1501R), p85(06-195), 및 histone H3 acetylation(06-599)는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 입수하였다; HER3은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)로부터 입수하였다; β-catenin은 BD Biosciences(Franklin Lakes, NJ, USA)에서 입수하였다.
4. qRT-PCR
총 RNA 추출과 RT-PCR은 앞서 알려진 방법에 따라 수행하였다45. 7300 실시간 PCR 시스템과 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green master mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 표적-유전자 mRNA 수준을 정량화하고, 글리세롤알데히드 3- 포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase, GAPDH) mRNA 수준으로 정규화하였다. 다음의 특정 프라이머를 qRT-PCR 분석에 사용하였다: CDK12, 5′-CCTGGAGATGATGACATGGATAG-3′; WNT1, 5′-CCGATGGTGGGGTATTGTGA-3′ 및 5′-CCCGGATTTTGGCGTATCAG-3′; WNT3, 5′-CGTGTTAGTGTCCAGGGAGT-3′ 및 5′-GCATTTGAGGTGCATGTGGT-3′; IRS1, 5′-GGTGGATGACTCTGTGGTGG-3′ 및 5′-GGACGCTGATGGGGTTAGAG-3′; AQP3, 5′-TGCTACCTACCCCTCTGGAC-3′ 및 5′-GTCAACAATGGCCAGCACAC-3′; CD74, 5′-ACGGCAACTATCTGCCACTC-3′ 및 5′-CTCTCACATGGGGACTGGGC-3′; TSPAN8, 5′-CCCAGGAGCTATGACAAGCA-3′ 및 5′-GCACTCACACCTGCCATTTC-3′; FGF8, 5′-GGGTGTCTCCCAACAGGTAAC-3′ 및 5′-TCTGCTTCCAAAGGTGTCCG-3′; FGF19, 5′-GCTTTCGAGGAGGAGATCCG-3′ 및 5′-GGGGCGAAGAGAACATGTCA-3′; WNT5B, 5′-CAGGAGCACATGGCCTACAT-3′ 및 5′-GGCTGCCTATCTGCATGACT-3′; TCF7, 5′-ACATGCAGCTATACCCAGGC-3′ 및 5′-ACTGTCATCGGAAGGAACGG-3′; DKK1, 5′-GTGCAAATCTGTCTCGCCTG-3′ 및 5′-GCACAACACAATCCTGAGGC-3′; TLE1, 5′-CCGCTGTGACTACTCTGGAC-3′ 및 5′-AGGGACGACATCCACGAGAT-3′; MMP9, 5′-CAGTCCACCCTTGTGCTCTT-3′ 및 5′-CGACTCTCCACGCATCTCTG-3′; MYCBP, 5′-AGAGCTGCTTCGCCTAGAAC-3′ 및 5′-TTCTCCTCCTGAGGTGGTTCA-3′; TWIST, 5′-CGGACAAGCTGAGCAAGATT-3′ 및 5′-CCTTCTCTGGAAACAATGAC-3′; SNAI1, 5′-AGCCTGGGTGCCCTCAAGATG-3′ 및 5′-CTTGGTGCTTGTGGAGCAGGGAC-3′; 및 GAPDH, 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′ 및 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′.
5. 유세포 분석(Flow cytometry)
유방 CSC-유사 세포 집단 분석을 위해 이전에 설명한 바에 따라, 알로피코시아닌 컨쥬게이트된 CD44, 피코에리트린 컨쥬게이트된 CD24(BD Biosciences) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트 컨쥬게이트된 ESA(Dako, Carpenteria, CA, USA)로 세포를 염색 하였다. 유방 CSC의 비율은 FACSCanto II 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 표면 마커(CD44+/CD24-/ESA+)의 발현을 기초로 측정되었다.
6. 종양구 분석(Tumorsphere analysis)
CDK12-과발현 또는 -넉다운 HER2+ 유방암에서 종양구 형성은 종래 개시된 바에 따라 분석되었다44. 요약하면, BT-474(5x103세포/웰), ZR-75-30(5x103세포/웰), HCC-1419(5x103세포/웰), HCC-1954(5x103세포/웰)을 6-well 초저 부착 표면 플레이트(Corning, Corning, NY, USA)에서 다음을 함유하는 DMEM-GlutaMAX 배지(Invitrogen)에서 SK-BR- USA)에서 배양하였다: 2% B27(Invitrogen), 20ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 20ng/mL 상피 성장 인자(Sigma-Aldrich) 및 4ng/mL 헤파린(Sigma-Aldrich). 3 일, 5 일 및 7 일 후에 종양구 형성을 분석하고 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 정량화했다. 2 차 종양구-형성 분석을 위해, 1차 종양구(> 직경 100㎛)는 7 일 후 수확하였고, 0.05% 트립신 EDTA로 현탁하여 단일세포로 분리시키고, 그 후에 기재된 바와 같이 배양되었다.
7. In vivo 종양 이종 이식
모든 마우스 실험은 한양대학교 동물실험 윤리위원회(서울, 대한민국)의 승인을 받았다. 5주령 암컷 NOD/SCID 마우스는 KoATECH(평택, 대한민국)에서 구입하였다. In vivo 한계 희석 분석(limiting-dilution assay)을 위해, 단계적으로 희석된 CDK12-과발현 ZR-75-30 세포 및 CDK12-넉다운 BT474 세포를 마우스에 동소 주입하였다(표 1 및 표 2 참고). 여기서, 상기 세포 주입 2일 전에 상기 마우스에 E2 펠렛(0.72 mg/펠렛; 60일 방출; Innovative Research of America, Sarasota, FL, 미국)을 이식하였다. 종양 형성 빈도는 이전에 기술된 바에 따라 분석되었다44. In vivo 트라스투주맙 효과를 평가하기 위해, PBS 및 마트리겔(matrigel, BD Biosciences)과 혼합한 BT474 및 HCC-1954 세포(각각 2x106 및 1x106 세포)를 마우스에 동소 주입하였다. 종양 크기가 ~100mm3에 다다르면, 마우스에 트라스투주맙(20mg/kg) 및/또는 디나시클립(20mg/kg)을 복강 내 주사하였다. 종양의 크기는 5주에서 6주 동안 매주 2번 측정하였고, 다음 식으로 계산하였다.
[식]
부피(mm3) = (a x b2)/2
(상기 식에서, a는 가장 큰 직경이고, b는 수직 직경이다.)
8. SRB(Sulforhodamine B colorimetric) 분석
In vitro 독성 시험 분석 키트(SRB-계, TOX6)는 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 세포 성장 분석을 위해, ZR-75-30(1x103 세포/웰), HCC-1419(3x103 세포/웰), BT474(2x103 세포/웰) 및 HCC-1954(1x103 세포/웰)을 96- 웰 플레이트에 시딩하고, 제조자의 지침에 따라 SRB 검정 키트를 사용하여 7 일 동안 세포-증식률을 분석하였다. 약물 반응 분석을 위해, 세포(5x103 세포/웰)는 96 웰-플레이트에서 10% FBS를 함유한 RPMI-1640로 배양되었는데, 여기서 상기 배지에는 0.1μg/mL 내지 10μg/mL의 트라스투주맙 및/또는 5nM 내지 10nM 디나시클립이 첨가되거나 첨가되지 않았다. 배지는 3일 마다 약물을 함유하는 새로운 배지로 교환하였다. 약물 처리 후 세포 생존력은 SRB 분석 키트를 사용하여 측정되었다.
9. RNA-seq 분석
총 RNA는 TRIzol RNA 분리 시약(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 대조군 또는 CDK12-과발현 ZR-75-30 세포로부터 추출하였다. RNA 무결성(integrity)은 Agilent RNA 6000 피코 키트(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 바이오 분석기를 사용하여 분석했다. 추출된 총 RNA는 제조사 지침에 따라 TruSeq 가닥 mRNA LT 샘플 준비 키트(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 준비된 mRNA-시퀀싱 라이브러리로 처리되었다. 모든 시료는 양방향(paired-end) 100-bp 리드(read)를 사용해서 Illumina HiSeq2500 시퀀서(Illumina)로 시퀀싱되었다. 원 이미지 데이터(raw image data)는 염기-호출(base-calling)에 의하여 서열데이터로 전환되었고 FASTQ 형식으로 저장되었다. 여섯 개의 독립적인 시료의 양방향 리드는 Cutadapt(http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, 버전 1.16)를 사용하여 PCR 및 시퀀싱 어댑터 모두에 맞게 조절되었다.
조절된 리드를 STAR(버전 2.6.0c)을 사용하여 hg19 인간 참조 게놈(hg19 human reference genome)에 맞춰 정렬하였고46, 유전자-수준 리드 카운트는 Subread package(버전 1.6.2)의 featureCounts 기능을 사용하여 준비하였다47. 유의적인 발현 차이의 존재는 유전자 수준에서 edgeR(버전 3.22.3)로 결정하였다48. 모든 유전자는 CDK12-과발현 군과 대조군 사이에 최소 1.5 배(fold)의 변화를 나타냈다. 이 데이터는 GEO(Gene Expression Omnibus)에 수탁 번호 GSE117523로 기탁되었다. 대조군과 CDK12-과발현 군 사이의 차별적으로 발현된 유전자를 기능적으로 분류하기 위해, Molecular Signatures Database(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) 버전 6.2의 모든 유전자 세트를 GSEA(버전 3.0)으로 분석하였고, 여러 가설 시험을 위해 수정하였다. FDR(false-discovery rate threshold) 임계값은 0.2549로 설정되었다. 유전자 발현 차이의 열지도(heatmap)는 R 언어(https://www.r-project.org/; 버전 3.5.1)를 사용하여 제작하였다.
10. 공개 데이터(Public data)
METABRIC과 TCGA(Cancer Genome Atlas)의 공개적으로 이용 가능한 인간 유방암 환자의 데이터 세트를 cBioportal(http://www.cbioportal.org/)에서 다운로드 받아 재분석하였다. 유방암 코호트, METABRIC 및 TCGA와 Cancer Cell Line Encyclopedia 데이터 세트의 CDK12의 유전자 변형에 대한 온코프린트(Oncoprint)는 cBiodortal로 제조하였다. METABRIC의 유방암 환자에서 HER2와 공동-증폭 빈도와 17q12-앰플리콘 유전자의 예후 영향은 R 프로그래밍 패키지를 사용하여 분석하였다. METABRIC 및 GEO 데이터 세트에서 유방암 환자의 무병생존 기간(DFS)과 전체 생존 기간(OS)는 최근 개발된 웹 애플리케이션인 CTGS(Cancer Target Gene Screening; http://ctgs.biohackers.net)과 KM 플로터(http://www.kmplot.com) 각각을 사용하여 분석하였다. METABRIC의 유전자 발현 수준에 따라 환자군을 계층화하기 위해, 각 유전자의 최대 유효 컷-오프 포인트를 CTGS를 사용하여 최상의 P-값을 기준으로 계산하였다. KM 플로터에서, CDK12(225697_s_at)의 자동 선택 최적 컷-오프가 사용되었다. NPI와 AOL에 상대적으로 CDK12의 독립적인 예후 영향(prognostic impact)은 유방암 유전자 발현 마이너 버전 4.1(bc-GeneExMiner 4.1, http://bcgenex.centregauducheau.fr)을 사용하여 조절된 Cox 비례 위험 모델에 의해 표시되었다. 공개 데이터세트, 디나시클립 처리된 MDA-MB-231 세포(GSE8882224)의 발현 -프로파일링 어레이 및 Jurkat 세포의 PolII ChIP-seq(GSE7202330)은 GEO로부터 얻어 재분석했다.
11. ChIP 분석 (ChIP assay)
ChIP 분석 키트(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 ChIP 분석을 수행하였다. ChIP 신호(배경신호에 상대적인 신호)의 폴드 농축(fold enrichment)는 실시간 qPCR을 사용하여 결정되었다. 다음의 프라이머를 ChIP-qPCR에 사용하였다: IRS1 TSS, 5′-CGTGGATTTCAGAGTCGGGG- 3′ 및 5′-GAGGCTCCGAAAAACAACCG-3′; WNT1 TSS, 5′-CCATTGTCTGCGCCCCTAA-3′ 및 5′-CGGCACCGCCTCTTATAGT-3′; 및 WNT3 TSS, 5′- TCGCTGACATCCTCAAACCC-3′ 및 5′- GACGCCCCCAATAGTTGGAA-3′.
12. 핵 및 세포질 세포 분획
β-catenin의 세포 내 위치를 분석하기 위해, 제조사 지침에 따라 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 세포로부터 핵 및 세포질 분획을 얻었다. 분획된 추출물은 앞서 기재된 바와 같이, 면역 블롯 처리 되었다.
13. 면역 형광 염색
세포(8x104 세포/웰)를 4-챔버 유리 슬라이드 상에 시딩되어 하룻방 동안 놓아두었고, 세척하고, 5분 동안 냉각된 메탄올로 고정시켰다. 3% 소 혈청 알부민으로 1시간 블로킹한 후, 세포를 항-β-catenin(1:200)으로 염색하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이트된 후. 항-래빗 면역글로불린/R-PE(1:400; P9795; Sigma-Aldrich)로 1 시간 동안 처리하였다. 염색된 세포를 추가로 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(4′,6-diamidino-2-phenylindole)로 10분 동안 염색하여 핵을 시각화 하였다. 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 형광을 검출하였다.
14. 루시퍼 라제 - 리포터 분석법
β-catenin/TCF-프로모터 활성의 분석을 위해, 세포는 야생형 또는 돌연변이 TCF-결합 부위를 각각 함유하는 pTOP-플래시 또는 pFOP-플래시 루시페라아제-리포터 구조체; 및 β-갈락토시다아제 발현 벡터로 공동 형질 감염시켰다. 루시페라아제 활성은 제조사 지침에 따라 루시페라아제 분석 키트(Promega, Madison, MI, USA)를 사용하여 분석하였다. 루시페라아제 활성은 상대 광선 단위로 나타내었고, β-갈락토시다아제 활성에 따라 표준화되었다.
15. 인간 RTK 분석
CDK12-넉다운 BT474 세포에서 다중 RTK의 인산화 수준은 제조사의 지침에 따라 인간 phospho-RTK 어레이 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포 용해물을 희석하고 인간 포스포키나아제 멤브레인과 함께 인큐베이트하였는데, 여기서 인산화된 RTK에 대한 항체를 4℃에서 밤새 2회에 걸쳐 스포팅(spot)한 멤브레인을 사용하였다. 상기 멤브레인을 2차 항체와 반응시킨 다음 엑스레이 필름에 노출시켰다. 표시된 상대적 스팟의 강도는 AlphaEaseFC 소프트웨어(AlphaInnotech, Inc., San Leandro, CA, USA)로 측정하였다.
16. 통계 분석
두 그룹 사이의 차이의 통계적 유의성은 비대응표본 Student's t 검정(unpaired Student's t test)으로 분석하였다. 다중 그룹 비교 및 반복 측정은 분산 분석(ANOVA)과 반복-측정 ANOVA(RM ANOVA)를 사용하여 분석되었고, 이어서 LSD(post hoc least-significant difference) 검정을 수행하였다. 생존 분석을 위한 Kaplan-Meier 플롯은 log-rank 검정을 사용하여 평가되었다. 종양-유발능의 빈도를 평가하기 위해, L-Calc 소프트웨어(Stemcell Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 한계-희석 분석 결과를 계산하였다. 모든 P-값은 양측 검정이었고, P < 0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
[시험예 1] Chr17q12에서 임상적 의미를 지닌 유전자의 확인
종래에 유방암에서 17q12-앰플리콘(17q12-amplicon) 유전자의 잠재적인 중요성이 암시되고 있었지만11 ,25, 이러한 유전자들의 임상적 관련성은 아직 불분명하다. HER2 앰플리콘의 임상적 의미를 규명하기 위해, 분자 분류 유방암 국제 컨소시엄(METABRIC) 데이터 세트(n=1980)을 이용하여 유방암 환자의 생존에 chr17q12에 위치한 유전자의 개별적인 발현 수준의 효과를 조사하였다. HER2 외에도, MIEN1, PGAP3, TCAP, GRB7, STARD3 및 CDK12를 포함한 17q12 앰플리콘 내의 많은 유전자는 유방암 환자에서 높은 재발 및 사망 위험성과 관련이 있었다(도 1a). 또한 RPL19, PIP4K2B 및 CACNB1을 비롯한 여러 유전자가 코호트에서 유리한 생존 결과와 관련이 있었다. 이는, chr17q12가 암 유전자 및 종양 억제 유전자를 모두 포함한다는 것을 의미한다.
예후가 불량했지만 HER2+ 유방암에서의 기능이 불분명한 유전자들 중에서, 종종 암 표적으로 확인되는 RNA PolII CTD의 인산화와 관련된 키나아제인 CDK12의 잠재적 역할12 ,19,20이 HER2+ 유방암에서 더 확인되었다. 이전 보고8 , 13와 일치하게, HER2+ 유방암의 약 90%가 CDK12 증폭을 가지고 있음을 발견했다(도 5a). 또한 CDK12 발현은 유방암 아형 중에서 HER2+ 유방암에서 가장 높았으며, 상승된 CDK12의 수준은 이의 유전자 증폭 및 HER2 발현과 관련이 있었다(도 1b, 도 5b 및 도 5c). METABRIC 데이터 세트 및 Kaplan-Meier plotter(KM plotter, http://kmplot.com)에 따르면, 유방암 환자에서의 CDK12 발현은 불량한 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(DFS; OS, P=0.015; DFS, METABRIC 데이터 세트에서 P < 0.001; 도 1c)과 관련이 있었다. 또한, CDK12은 잘-확립된 유방암 예후 지수인 NPI(Nottingham Prognostic Index)26, 27 및 AOL(adjuvant Online)28에 대해 전이 재발(metastatic relapse, MR)의 위험성이 높은 독립적인 예후 인자였다(http://bcgenex.centregauducheau.fr)29(도 5d). 이러한 결과는 chr17q12 앰플리콘에서 유전자의 임상적 중요하고, CDK12가 유방암에서 잠재적 예후 마커로 제시됨을 의미한다.
[시험예 2] HER2+ 유방암에서 CDK12 증폭 표적화 가능성
그 다음, HER2+과 CDK12 사이의 높은 수준의 동시-증폭이 HER2+ 유방암의 다양한 하위 그룹에서 기능을 발휘하는지 여부를 조사했다. 비-증폭으로 인해 CDK12 발현이 상대적으로 낮은 에스트로겐 수용체(ER)+/HER2+ 또는 ER-/HER2+ 유방암 세포주에서 CDK12의 렌티 바이러스 과발현은 세포 성장 촉진과 함께 트라스투주맙에 대한 무감각(insensitivity)을 유발했다(도 5e, 6a, 7a 및 7b). CDK12 증폭이 있는 트라스투주맙-민감성 ER+/HER2+ 또는 ER-/HER2+ 유방암 세포에서 shRNA(short-hairpin RNA)-매개 CDK12 넉다운은 세포 성장을 감소시켰고, 나아가 트라스투주맙에 대해 세포가 반응하게 하였다(도 5e, 6a, 7a, 및 7b). CDK12 증폭이 있는 트라스투주맙-내성 HER2+ 유방암 세포에서, CDK12 넉다운은 트라스투주맙 감수성을 부여하지 않았지만, 성장 지연을 유도했다(도 7b). 이러한 데이터는 동소 종양 이종이식 모델에서 확인되었다(도 1e 및 도 6b). 또한, 트라스투주맙과 디나시클립(CDK12 키나아제 활성 억제제24)를 병용 투여한 결과, in vitro 및 in vivo에서 트라스투주맙-민감성 HER2+ 유방암 세포에서 현저한 항종양 효과를 보였다(도 1d, 도 1e, 및 도 7c). 특히, 디나시클립 단독 요법은 in vitro와 in vivo에서 트라스투주맙 내성을 나타내는 HER2+ 유방암 세포에서 탁월한 항종양 효과를 나타내었는데(도 1d 및 도 1e), 이는 HER2+ 유방암에서 CDK12을 표적하여 트라스투주맙 치료에 대한 내성을 극복 할 수 있음을 보여준다. 따라서, 상기한 결과는 CDK12가 상이한 호르몬-수용체 상태 및 트라 스투주맙 반응성을 나타내는 HER2+ 유방암에서 효과적인 치료 표적이 될 수 있음을 의미한다.
[ 시험예 3] 종양 신호 전달 경로를 촉진시키는 유전자의 전사 상향 조절에 대한 CDK12 키나아제 활성의 역할 규명
HER2+ 유방암에서 CDK12가 어떻게 종양 성장과 트라스투주맙 반응을 조절 하는지 밝히기 위해, CDK12 과발현 ZR-75-30 세포에서 RNA-seq 분석을 통해 게놈 차원의 CDK12-표적 유전자를 조사했다.
또한, 제한-희석 분석을 이용해서, 500 내지 10,000 개의 ZR-75-30 대조군(CON) 또는 CDK12 과발현 세포(CDK12)를 NOD/SCID 마우스의 지방 패드에 주입하여 in vivo 종양 유발 능력을 확인하였다. TIC(tumour-initiating cell) 빈도는 L-Calc 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
세포 종류 주입
세포수		 일 수(Day)
7 14 21 28
ZR-75-30
- CON		 500 0/7 0/7 0/7 0/7
1,000 0/7 0/7 0/7 0/7
5,000 0/7 0/7 3/7 3/7
10,000 0/7 3/7 7/7 7/7
TIC 빈도 1/33,250
(1/10,907-
1/101,364)		 1/6,315
(1/3,368-1/11,839)		 1/6,315
(1/3,368- 1/11,839)
ZR-75-30 - CDK12 500 0/7 0/7 0/7 3/7
1,000 0/7 0/7 4/7 7/7
5,000 0/7 4/7 7/7 7/7
10,000 2/7 7/7 7/7 7/7
TIC 빈도 1/52,592
(1/13,338 - 1/207,374)		 1/5,327
(1/2,887-
1/9,829)		 1/1,619
(1/834-
1/3,145)		 1/504
(1/257-1/987)
P 0.0048 0.0036 0.0001
상기와 동일한 방법으로 세포만 달리하여, CDK12 넉다운 세포를 이용해서 CDK12 증폭이 있는 HER2+ 유방암에서 CDK12 넉다운이 in vivo 종양 유발 능력 억제효과에 영향이 있는지 확인하였다. 대조군 shRNA(shCON) 또는 CDK12를 억제하는 shRNA(shCDK12)로 형질주입된 5,000 내지 100,000개의 BT474 세포를 NOD/SCID 마우스의 지방패드에 주입하고, TIC 빈도를 L-Calc 소프트웨어로 계산하였다.
세포
종류		 주입
세포수		 일 수(Day)
6 13 21 28 36
BT474
shCON		 5000 0/7 0/7 1/7 3/7 5/7
10,000 1/7 3/7 3/7 4/7 5/7
50,000 1/7 6/7 7/7 7/7 7/7
100,000 5/7 7/7 7/7 7/7 7/7
TIC 빈도 1/119,832
(1/56,942-
1/252,180)		 1/25,420
(1/13,702-
1/47,158)		 1/16,559
(1/8,544- 1/32,091)		 1/10,151
(1/5,075- 1/20,304)		 1/5,893
(1/2,996-
1/11,589)
BT474
shCDK12 		5,000 0/7 0/7 0/7 1/7 2/7
10,000 0/7 0/7 0/7 0/7 3/7
50,000 0/7 0/7 2/7 6/7 6/7
100,000 1/7 5/7 7/7 7/7 7/7
TIC 빈도 1/1,104,245
(1/157,095- 1/7,761,907)		 1/176,298
(1/74,940-
1/414,747)		 1/74,865
(1/39,049-
1/143,530)		 1/32,937
(1/18,032-1/60,161)		 1/5,893
(1/2,996-
1/11,589
P 0.0048 0.0036 0.0001 0.0001
CDK12 과발현의 존재 하에서 차별적으로 발현된 유전자는 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 신호전달, PI3K(phosphoinositide 3-kinase) 케스케이드 및 WNT 신호전달 경로와 같은 몇몇 종양 신호전달 케스케이드에서 더 강화되었다(도 2a 및 2b, 표 1). 이들 유전자의 발현의 변화는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 검증되었다(도 2c). 또한, ErbB-PI3K-AKT 조절 인자 인슐린 수용체 기질 1(IRS1, insulin receptor substrate 1)과 몇 개의 WNT 리간드를 포함한 PolII CTD 인산화에 대한 효소 활성과 관련된 CDK12-표적 유전자를 디나시클립24으로 처리된 유방암세포로부터 얻은 유전자-발현 마이크로어레이 데이터 및 최근 개발된 CDK12억제제인 THZ-53130로 처리된 세포로부터 얻은 ChIP(PolII chromatin immunoprecipitation) 데이터와 RNA-seq 데이터의 비교 분석을 통해 확인했다(도 2d). 일관되게, 디나시클립 처리는 트라스투주맙-민감성 및 -내성 HER2+ 유방암 세포에서 투여량-의존적으로 전사수준에서 IRS1, WNT1 및 WNT3의 발현을 감소시켰다(도 2e). 또한, ChIP 분석 결과 CDK12와 PolII는 IRS1, WNT1 및 WNT3의 전사 시작 부위(TSS) 부위에 함께 모이는 것이 확인되었다(도 2f). 표적 유전자좌들(loci)에서, 히스톤 H3의 아세틸화도 또한 강화되었는데, 이는 CDK12와 PolII에 의한 이들 유전자의 전사 활성화를 의미한다(도 2f). 따라서 상기한 결과들은 CDK12 키나아제 활성이 HER2+ 유방암에서 EGFR-, PI3K- 및 WNT-신호전달 케스케이드에 관여하는 유전자의 전사 조절에 중요하다는 것을 보여준다.
[ 시험예 4] HER2 + 유방암에서 WNT /β- catenin 신호전달 및 암 줄기세포능 강화에 대한 CDK12의 영향
WNT 리간드 WNT1과 WNT3은 유방암 발생(mammary tumorigenesis), 줄기세포-유사 성질 또는 유방암에서 트라스투주맙 저항성에 관여하기 때문에, HER2+ 유방암의 암 줄기세포(CDC, cancer stem cell) 활성에 CDK12가 미치는 영향을 평가했다. CD44+/CD24-/ESA+(epithelial-specific antigen) 부분 모집단(subpopulation) 분화 클러스터의 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석 및 종양구(tumorsphere) 은 CDK12 과발현은 CSC-유사 집단의 자가-재생(self-renewing)을 확장시켰으나, CDK12 넉다운은 트라스투주맙-민감성 및 -내성 세포주를 모두 포함하는 다양한 유형의 HER2+ 유방암 세포에서 CSC 부분 및 구 형성을 감소시켰다(도 3a, 3b, 8a 및 8b). in vitro 결과와 일치하게, CDK12-과발현 ZR-75-30 세포를 보유하는 동소 이종이식된 마우스에서 종양-형성이 촉진되는 것을 나타냈는데, CDK12-넉다운 BT474 세포를 갖는 마우스는 종양-개시능(tumour-initiating ability)이 손상된 것을 나타냈다(표 1 및 2). 이러한 결과는 CDK12가 HER2+ 유방암에서 CSC의 자가-재생 및 종양형성을 강화시킴을 의미한다.
WNT1 및 WNT3 발현의 CDK12-매개 증가가 HER2+ 유방암에서 표준(canonical) WNT 신호전달 경로의 활성에 영향을 미쳤는지를 더 조사하였다. CDK12 과발현은 ZR-75-30 세포에서 GSK-3β 인산화(glycogen synthase kinase-3β phosphorylation) 및 β-카테닌(β-catenin) 발현을 증가시키는 반면, CDK12-넉다운은 BT474 세포에서 각각의 활성을 감소시켰다(도 3c). 더욱이, CDK12 발현의 변화는 WNT1 및 WNT3 발현의 변화를 동반하였다(도 3c). 또한, β-카테닌은 면역블롯 및 면역형광 염색 분석에 따르면 CDK12 과발현에 반응하여 핵에 축적되었다(도 3d 및 3e). 결과적으로, TCF/LEF-프로모터 활성 및 β-카테닌/TCF-표적 유전자의 발현은 CDK12에 의해 양성적으로 조절되었다(도 3f 및 3g). 종합하면, 상기한 결과들은 CDK12가 WNT 리간드의 발현을 통해서 WNT/β-카테닌 신호전달 케스케이드를 활성화하여 HER2+ 유방암의 줄기세포능을 향상시킨다는 것을 시사한다.
[ 실험예 5] CDK12의 IRS1 , ErbBs 및 p85 사이의 상호작용 촉진을 통한 ErbB -PI3K-AKT 신호전달 케스케이드 활성화
RNA-seq 결과의 GSEA(gene-set enrichment analysis)에 기반한, EGFR- 및 PI3K- 신호전달 캐스케이트의 조절에 CDK12가 관여하는 것을 더울 명확히 증명하기 위해, RTK(receptor tyrosine kinase) 어레이를 CDK12-넉다운 BT474 세포를 이용하여 수행하였다.
그 결과 ErbB 패밀리 구성원(EGFR, HER2 및 HER3, 그러나 HER4는 아님)의 인산화 수준은 이 세포들에서 CDK12 넉다운에 의해 감소됨을 보였다(도 4a). 이러한 결과와 일치하게, 면역블롯(immunoblot) 분석 결과는 ErbB 패밀리 구성원의 인산화된 형태와 하류의 AKT 및 세포 외 신호-조절된 키나아제(ERK, extracellular signal-regulated kinase) 신호전달이 트라스투주맙에 대한 상이한 반응 속도를 나타내는 여러 HER2+ 유방암 세포주에서 CDK12 발현에 반응하여 바뀐다는 것을 보여주었다(도 4b).
RNA-seq 분석에 따라 CDK12-표적 유전자로 확인된 IRS1은 여러 ErbB 수용체 및 PI3K의 조절 서브유닛 인 p85와 직접 상호 작용하여 AKT 인산화를 조절한다36 -38. RNA-seq 결과와 일치하게, 면역블롯 및 qRT-PCR 분석에 따라 IRS1과 그 인산화된 형태 [IRS1(Y612)]의 수준은 트라스투주맙-민감성 및 -내성 HER2+ 유방암 세포에서 CDK12에 의해 양성적으로 조절되었다(도 4c). 동시-면역침전 분석은 증가된 IRS1 발현 및 활성은 IRS1 및 ErbB 수용체뿐만 아니라, IRS1 및 p85 사이의 결합 친화도를 향상 시킨다는 것을 보였다(도 4d). 또한, 이러한 관련성은 EGFR, HER2 및 HER3 사이의 이종이량체화(heterodimerization)를 유도했다(도 4e). 따라서, 이러한 결과는 CDK12가 IRS1-p85-ErbB-수용체 결합을 촉진하고 트라스투주맙-민감성 및 -내성 HER2+ 유방암에서 IRS1의 발현 및 활성을 증가시킴으로써 ErbB-PI3K- 및 ERK-신호전달 케스케이드를 활성화 시킨다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> COMPANION DIAGNOSTIC BIOMARKER FOR ANTI-HER2 THERAPY AND USE THEREOF <130> P18U10C1090/P20180645OP <160> 43 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 8283 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtgtgactgg gtctgtgtga gggagagagt gtgtgtggtg tggaggtgaa acggaggcaa 60 gaaagggggc tacctcagga gcgagggaca aagggggcgt gaggcaccta ggccgcggca 120 ccccggcgac aggaagccgt cctgaaccgg gctaccgggt aggggaaggg cccgcgtagt 180 cctcgcaggg ccccagagct ggagtcggct ccacagcccc gggccgtcgg cttctcactt 240 cctggacctc cccggcgccc gggcctgagg actggctcgg cggagggaga agaggaaaca 300 gacttgagca gctccccgtt gtctcgcaac tccactgccg aggaactctc atttcttccc 360 tcgctccttc accccccacc tcatgtagaa gggtgctgag gcgtcgggag ggaggaggag 420 cctgggctac cgtccctgcc ctccccaccc ccttcccggg gcgctttggt gggcgtggag 480 ttggggttgg gggggtgggt gggggttgct ttttggagtg ctggggaact tttttccctt 540 cttcaggtca ggggaaaggg aatgcccaat tcagagagac atgggggcaa gaaggacggg 600 agtggaggag cttctggaac tttgcagccg tcatcgggag gcggcagctc taacagcaga 660 gagcgtcacc gcttggtatc gaagcacaag cggcataagt ccaaacactc caaagacatg 720 gggttggtga cccccgaagc agcatccctg ggcacagtta tcaaaccttt ggtggagtat 780 gatgatatca gctctgattc cgacaccttc tccgatgaca tggccttcaa actagaccga 840 agggagaacg acgaacgtcg tggatcagat cggagcgacc gcctgcacaa acatcgtcac 900 caccagcaca ggcgttcccg ggacttacta aaagctaaac agaccgaaaa agaaaaaagc 960 caagaagtct ccagcaagtc gggatcgatg aaggaccgga tatcgggaag ttcaaagcgt 1020 tcgaatgagg agactgatga ctatgggaag gcgcaggtag ccaaaagcag cagcaaggaa 1080 tccaggtcat ccaagctcca caaggagaag accaggaaag aacgggagct gaagtctggg 1140 cacaaagacc ggagtaaaag tcatcgaaaa agggaaacac ccaaaagtta caaaacagtg 1200 gacagcccaa aacggagatc caggagcccc cacaggaagt ggtctgacag ctccaaacaa 1260 gatgatagcc cctcgggagc ttcttatggc caagattatg accttagtcc ctcacgatct 1320 catacctcga gcaattatga ctcctacaag aaaagtcctg gaagtacctc gagaaggcag 1380 tcggtcagtc ccccttacaa ggagccttcg gcctaccagt ccagcacccg gtcaccgagc 1440 ccctacagta ggcgacagag atctgtcagt ccctatagca ggagacggtc gtccagctac 1500 gaaagaagtg gctcttacag cgggcgatcg cccagtccct atggtcgaag gcggtccagc 1560 agccctttcc tgagcaagcg gtctctgagt cggagtccac tccccagtag gaaatccatg 1620 aagtccagaa gtagaagtcc tgcatattca agacattcat cttctcatag taaaaagaag 1680 agatccagtt cacgcagtcg tcattccagt atctcacctg tcaggcttcc acttaattcc 1740 agtctgggag ctgaactcag taggaaaaag aaggaaagag cagctgctgc tgctgcagca 1800 aagatggatg gaaaggagtc caagggttca cctgtatttt tgcctagaaa agagaacagt 1860 tcagtagagg ctaaggattc aggtttggag tctaaaaagt tacccagaag tgtaaaattg 1920 gaaaaatctg ccccagatac tgaactggtg aatgtaacac atctaaacac agaggtaaaa 1980 aattcttcag atacagggaa agtaaagttg gatgagaact ccgagaagca tcttgttaaa 2040 gatttgaaag cacagggaac aagagactct aaacccatag cactgaaaga ggagattgtt 2100 actccaaagg agacagaaac atcagaaaag gagacccctc cacctcttcc cacaattgct 2160 tctcccccac cccctctacc aactactacc cctccacctc agacaccccc tttgccacct 2220 ttgcctccaa taccagctct tccacagcaa ccacctctgc ctccttctca gccagcattt 2280 agtcaggttc ctgcttccag tacttcaact ttgccccctt ctactcactc aaagacatct 2340 gctgtgtcct ctcaggcaaa ttctcagccc cctgtacagg tttctgtgaa gactcaagta 2400 tctgtaacag ctgctattcc acacctgaaa acttcaacgt tgcctccttt gcccctccca 2460 cccttattac ctggagatga tgacatggat agtccaaaag aaactcttcc ttcaaaacct 2520 gtgaagaaag agaaggaaca gaggacacgt cacttactca cagaccttcc tctccctcca 2580 gagctccctg gtggagatct gtctccccca gactctccag aaccaaaggc aatcacacca 2640 cctcagcaac catataaaaa gagaccaaaa atttgttgtc ctcgttatgg agaaagaaga 2700 caaacagaaa gcgactgggg gaaacgctgt gtggacaagt ttgacattat tgggattatt 2760 ggagaaggaa cctatggcca agtatataaa gccaaggaca aagacacagg agaactagtg 2820 gctctgaaga aggtgagact agacaatgag aaagagggct tcccaatcac agccattcgt 2880 gaaatcaaaa tccttcgtca gttaatccac cgaagtgttg ttaacatgaa ggaaattgtc 2940 acagataaac aagatgcact ggatttcaag aaggacaaag gtgcctttta ccttgtattt 3000 gagtatatgg accatgactt aatgggactg ctagaatctg gtttggtgca cttttctgag 3060 gaccatatca agtcgttcat gaaacagcta atggaaggat tggaatactg tcacaaaaag 3120 aatttcctgc atcgggatat taagtgttct aacattttgc tgaataacag tgggcaaatc 3180 aaactagcag attttggact tgctcggctc tataactctg aagagagtcg cccttacaca 3240 aacaaagtca ttactttgtg gtaccgacct ccagaactac tgctaggaga ggaacgttac 3300 acaccagcca tagatgtttg gagctgtgga tgtattcttg gggaactatt cacaaagaag 3360 cctatttttc aagccaatct ggaactggct cagctagaac tgatcagccg actttgtggt 3420 agcccttgtc cagctgtgtg gcctgatgtt atcaaactgc cctacttcaa caccatgaaa 3480 ccgaagaagc aatatcgaag gcgtctacga gaagaattct ctttcattcc ttctgcagca 3540 cttgatttat tggaccacat gctgacacta gatcctagta agcggtgcac agctgaacag 3600 accctacaga gcgacttcct taaagatgtc gaactcagca aaatggctcc tccagacctc 3660 ccccactggc aggattgcca tgagttgtgg agtaagaaac ggcgacgtca gcgacaaagt 3720 ggtgttgtag tcgaagagcc acctccatcc aaaacttctc gaaaagaaac tacctcaggg 3780 acaagtactg agcctgtgaa gaacagcagc ccagcaccac ctcagcctgc tcctggcaag 3840 gtggagtctg gggctgggga tgcaataggc cttgctgaca tcacacaaca gctgaatcaa 3900 agtgaattgg cagtgttatt aaacctgctg cagagccaaa ccgacctgag catccctcaa 3960 atggcacagc tgcttaacat ccactccaac ccagagatgc agcagcagct ggaagccctg 4020 aaccaatcca tcagtgccct gacggaagct acttcccagc agcaggactc agagaccatg 4080 gccccagagg agtctttgaa ggaagcaccc tctgccccag tgatcctgcc ttcagcagaa 4140 cagacgaccc ttgaagcttc aagcacacca gctgacatgc agaatatatt ggcagttctc 4200 ttgagtcagc tgatgaaaac ccaagagcca gcaggcagtc tggaggaaaa caacagtgac 4260 aagaacagtg ggccacaggg gccccgaaga actcccacaa tgccacagga ggaggcagca 4320 gcatgtcctc ctcacattct tccaccagag aagaggcccc ctgagccccc cggacctcca 4380 ccgccgccac ctccaccccc tctggttgaa ggcgatcttt ccagcgcccc ccaggagttg 4440 aacccagccg tgacagccgc cttgctgcaa cttttatccc agcctgaagc agagcctcct 4500 ggccacctgc cacatgagca ccaggccttg agaccaatgg agtactccac ccgaccccgt 4560 ccaaacagga cttatggaaa cactgatggg cctgaaacag ggttcagtgc cattgacact 4620 gatgaacgaa actctggtcc agccttgaca gaatccttgg tccagaccct ggtgaagaac 4680 aggaccttct caggctctct gagccacctt ggggagtcca gcagttacca gggcacaggg 4740 tcagtgcagt ttccagggga ccaggacctc cgttttgcca gggtcccctt agcgttacac 4800 ccggtggtcg ggcaaccatt cctgaaggct gagggaagca gcaattctgt ggtacatgca 4860 gagaccaaat tgcaaaacta tggggagctg gggccaggaa ccactggggc cagcagctca 4920 ggagcaggcc ttcactgggg gggcccaact cagtcttctg cttatggaaa actctatcgg 4980 gggcctacaa gagtcccacc aagaggggga agagggagag gagttcctta ctaacccaga 5040 gacttcagtg tcctgaaaga ttcctttcct atccatcctt ccatccagtt ctctgaatct 5100 ttaatgaaat catttgccag agcgaggtaa tcatctgcat ttggctactg caaagctgtc 5160 cgttgtattc cttgctcact tgctactagc aggcgactta cgaaataatg atgttggcac 5220 cagttccccc tggatgggct atagccagaa catttacttc aactctacct tagtagatac 5280 aagtagagaa tatggagagg atcattacat tgaaaagtaa atgttttatt agttcattgc 5340 ctgcacttac tgatcggaag agagaaagaa cagtttcagt attgagatgg ctcaggagag 5400 gctctttgat ttttaaagtt ttggggtggg ggattgtgtg tggtttcttt cttttgaatt 5460 ttaatttagg tgttttgggt ttttttcctt taaagagaat agtgttcaca aaatttgagc 5520 tgctctttgg cttttgctat aagggaaaca gagtggcctg gctgatttga ataaatgttt 5580 ctttcctctc caccatctca cattttgctt ttaagtgaac actttttccc cattgagcat 5640 cttgaacata ctttttttcc aaataaatta ctcatcctta aagtttactc cactttgaca 5700 aaagatacgc ccttctccct gcacataaag caggttgtag aacgtggcat tcttgggcaa 5760 gtaggtagac tttacccagt ctctttcctt ttttgctgat gtgtgctctc tctctctctt 5820 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tgtctcgctt gctcgctctc 5880 gctgtttctc tctctttgag gcatttgttt ggaaaaaatc gttgagatgc ccaagaacct 5940 gggataattc tttacttttt ttgaaataaa ggaaaggaaa ttcagactct tacattgttc 6000 tctgtaactc ttcaattcta aaatgttttg ttttttaaac catgttctga tggggaagtt 6060 gatttgtaag tgtggacagc ttggacattg ctgctgagct gtggttagag atgatgcctc 6120 cattcctaga gggctaataa cagcatttag catattgttt acacatatat ttttatgtca 6180 aaaaaaaaac aaaaaccttt caaacagagc attgtgatat tgtcaaagag aaaaacaaat 6240 cctgaagata catggaaatg taacctagtt tagggtgggt atttttctga agatacatca 6300 atacctgacc ttttttaaaa aaataatttt aaaacagcat actgtgagga agaacagtat 6360 tgacataccc acatcccagc atgtgtaccc tgccagttct tttagggatt tttcctccaa 6420 agagatttgg atttggtttt ggtaaaaggg gttaaattgt gcttccaggc aagaactttg 6480 ccttatcata aacaggaaat gaaaaaggga agggctgtca ggatgggata atttgggagg 6540 cttctcattc tggcttctat ttctatgtga gtaccagcat atagagtgtt ttaaaaacag 6600 atacatgtca tataatttat ctgcacagac ttagaccttc aggaaacata ggttaagccc 6660 ccttttacaa agaaaaagta aacatacttc agcatcttgg agggtagttt tcaaaactca 6720 agtttcatgt ttcaatgcca agttcttatt ttaaaaaata aaatctactt ataagagaaa 6780 ggtgcattac ttaaaaaaaa aaaactttaa agaaatgaaa gaagaaccct cttcagatac 6840 ttacttgaag actgttttcc cctgttaatg agatatagct agatatcggt gtgtgtattt 6900 ctttattatt ctctggtttt tgatctggcc ttgcctccag ggccaaacac tgatttagaa 6960 agagagcctt ctagctattt tggcattgat ggctttttat accagtgtgt ccagttagat 7020 ttactaggct tactgacatg ctattggtaa atcgcattaa agttcatctg aaccttctgt 7080 ctgttgactt cttagtcctc agacatgggc ctttgtgttt tagaatattt gaatttgagt 7140 tattgggccc cactccctgt tttttattaa agaacgtgag cctgggatac tttcagaagt 7200 atctgttcaa tgaaaaaaag ttggtttccc atcaaatatg aataaaattc tctatatatt 7260 tcattgtatt ttggttatca gcagtcatca ataatgtttt tccctcccct ctcccacctc 7320 ttatttttaa ttatgccaaa tatcctaaat aatatactta agcctccatt ccctcatccc 7380 tactagggaa gggggtgagt gtatgtgtga gtgtatgtgt atgtatgatc ccatctcacc 7440 cccaccccca ttttgggagt cttttaaaat gaaaacaaag tttggtagtt ttgactattt 7500 ctaaaagcag aggagaaaaa aaaacttatt taaatatcct ggaatctgta tggaggaaga 7560 aaaggtattt gttaattttt cagttacgtt atctataaac atgatggaag taaaggtttg 7620 gcagaatttc accttgacta tttgaaaatt acagacccaa ttaattccat tcaaaagtgg 7680 ttttcgtttt gttttaatta ttgtacaatg agagatattg tctattaaat acattatttt 7740 gaacagatga gaaatctgat tctgttcatg agtgggaggc aaaactggtt tgaccgtgat 7800 catttttgtg gttttgaaaa caaatatact tgacccagtt tccttagttt tttcttcaac 7860 tgtccatagg aacgataagt atttgaaagc aacatcaaat ctatacgttt aaagcagggc 7920 agttagcaca aatttgcaag tagaacttct attagcttat gccatagaca tcacccaacc 7980 acttgtatgt gtgtgtgtat atataatatg catatatagt taccgtgcta aaatggttac 8040 cagcaggttt tgagagagaa tgctgcatca gaaaagtgtc agttgccacc tcattctccc 8100 tgatttaggt tcctgacact gattcctttc tctctcgttt ttgaccccca ttgggtgtat 8160 cttgtctatg tacagatatt ttgtaatata ttaaattttt ttctttcagt ttataaaaat 8220 ggaaagtgga gattggaaaa ttaaatattt cctgttacta taccactttt gctccattgc 8280 att 8283 <210> 2 <211> 8256 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtgtgactgg gtctgtgtga gggagagagt gtgtgtggtg tggaggtgaa acggaggcaa 60 gaaagggggc tacctcagga gcgagggaca aagggggcgt gaggcaccta ggccgcggca 120 ccccggcgac aggaagccgt cctgaaccgg gctaccgggt aggggaaggg cccgcgtagt 180 cctcgcaggg ccccagagct ggagtcggct ccacagcccc gggccgtcgg cttctcactt 240 cctggacctc cccggcgccc gggcctgagg actggctcgg cggagggaga agaggaaaca 300 gacttgagca gctccccgtt gtctcgcaac tccactgccg aggaactctc atttcttccc 360 tcgctccttc accccccacc tcatgtagaa gggtgctgag gcgtcgggag ggaggaggag 420 cctgggctac cgtccctgcc ctccccaccc ccttcccggg gcgctttggt gggcgtggag 480 ttggggttgg gggggtgggt gggggttgct ttttggagtg ctggggaact tttttccctt 540 cttcaggtca ggggaaaggg aatgcccaat tcagagagac atgggggcaa gaaggacggg 600 agtggaggag cttctggaac tttgcagccg tcatcgggag gcggcagctc taacagcaga 660 gagcgtcacc gcttggtatc gaagcacaag cggcataagt ccaaacactc caaagacatg 720 gggttggtga cccccgaagc agcatccctg ggcacagtta tcaaaccttt ggtggagtat 780 gatgatatca gctctgattc cgacaccttc tccgatgaca tggccttcaa actagaccga 840 agggagaacg acgaacgtcg tggatcagat cggagcgacc gcctgcacaa acatcgtcac 900 caccagcaca ggcgttcccg ggacttacta aaagctaaac agaccgaaaa agaaaaaagc 960 caagaagtct ccagcaagtc gggatcgatg aaggaccgga tatcgggaag ttcaaagcgt 1020 tcgaatgagg agactgatga ctatgggaag gcgcaggtag ccaaaagcag cagcaaggaa 1080 tccaggtcat ccaagctcca caaggagaag accaggaaag aacgggagct gaagtctggg 1140 cacaaagacc ggagtaaaag tcatcgaaaa agggaaacac ccaaaagtta caaaacagtg 1200 gacagcccaa aacggagatc caggagcccc cacaggaagt ggtctgacag ctccaaacaa 1260 gatgatagcc cctcgggagc ttcttatggc caagattatg accttagtcc ctcacgatct 1320 catacctcga gcaattatga ctcctacaag aaaagtcctg gaagtacctc gagaaggcag 1380 tcggtcagtc ccccttacaa ggagccttcg gcctaccagt ccagcacccg gtcaccgagc 1440 ccctacagta ggcgacagag atctgtcagt ccctatagca ggagacggtc gtccagctac 1500 gaaagaagtg gctcttacag cgggcgatcg cccagtccct atggtcgaag gcggtccagc 1560 agccctttcc tgagcaagcg gtctctgagt cggagtccac tccccagtag gaaatccatg 1620 aagtccagaa gtagaagtcc tgcatattca agacattcat cttctcatag taaaaagaag 1680 agatccagtt cacgcagtcg tcattccagt atctcacctg tcaggcttcc acttaattcc 1740 agtctgggag ctgaactcag taggaaaaag aaggaaagag cagctgctgc tgctgcagca 1800 aagatggatg gaaaggagtc caagggttca cctgtatttt tgcctagaaa agagaacagt 1860 tcagtagagg ctaaggattc aggtttggag tctaaaaagt tacccagaag tgtaaaattg 1920 gaaaaatctg ccccagatac tgaactggtg aatgtaacac atctaaacac agaggtaaaa 1980 aattcttcag atacagggaa agtaaagttg gatgagaact ccgagaagca tcttgttaaa 2040 gatttgaaag cacagggaac aagagactct aaacccatag cactgaaaga ggagattgtt 2100 actccaaagg agacagaaac atcagaaaag gagacccctc cacctcttcc cacaattgct 2160 tctcccccac cccctctacc aactactacc cctccacctc agacaccccc tttgccacct 2220 ttgcctccaa taccagctct tccacagcaa ccacctctgc ctccttctca gccagcattt 2280 agtcaggttc ctgcttccag tacttcaact ttgccccctt ctactcactc aaagacatct 2340 gctgtgtcct ctcaggcaaa ttctcagccc cctgtacagg tttctgtgaa gactcaagta 2400 tctgtaacag ctgctattcc acacctgaaa acttcaacgt tgcctccttt gcccctccca 2460 cccttattac ctggagatga tgacatggat agtccaaaag aaactcttcc ttcaaaacct 2520 gtgaagaaag agaaggaaca gaggacacgt cacttactca cagaccttcc tctccctcca 2580 gagctccctg gtggagatct gtctccccca gactctccag aaccaaaggc aatcacacca 2640 cctcagcaac catataaaaa gagaccaaaa atttgttgtc ctcgttatgg agaaagaaga 2700 caaacagaaa gcgactgggg gaaacgctgt gtggacaagt ttgacattat tgggattatt 2760 ggagaaggaa cctatggcca agtatataaa gccaaggaca aagacacagg agaactagtg 2820 gctctgaaga aggtgagact agacaatgag aaagagggct tcccaatcac agccattcgt 2880 gaaatcaaaa tccttcgtca gttaatccac cgaagtgttg ttaacatgaa ggaaattgtc 2940 acagataaac aagatgcact ggatttcaag aaggacaaag gtgcctttta ccttgtattt 3000 gagtatatgg accatgactt aatgggactg ctagaatctg gtttggtgca cttttctgag 3060 gaccatatca agtcgttcat gaaacagcta atggaaggat tggaatactg tcacaaaaag 3120 aatttcctgc atcgggatat taagtgttct aacattttgc tgaataacag tgggcaaatc 3180 aaactagcag attttggact tgctcggctc tataactctg aagagagtcg cccttacaca 3240 aacaaagtca ttactttgtg gtaccgacct ccagaactac tgctaggaga ggaacgttac 3300 acaccagcca tagatgtttg gagctgtgga tgtattcttg gggaactatt cacaaagaag 3360 cctatttttc aagccaatct ggaactggct cagctagaac tgatcagccg actttgtggt 3420 agcccttgtc cagctgtgtg gcctgatgtt atcaaactgc cctacttcaa caccatgaaa 3480 ccgaagaagc aatatcgaag gcgtctacga gaagaattct ctttcattcc ttctgcagca 3540 cttgatttat tggaccacat gctgacacta gatcctagta agcggtgcac agctgaacag 3600 accctacaga gcgacttcct taaagatgtc gaactcagca aaatggctcc tccagacctc 3660 ccccactggc aggattgcca tgagttgtgg agtaagaaac ggcgacgtca gcgacaaagt 3720 ggtgttgtag tcgaagagcc acctccatcc aaaacttctc gaaaagaaac tacctcaggg 3780 acaagtactg agcctgtgaa gaacagcagc ccagcaccac ctcagcctgc tcctggcaag 3840 gtggagtctg gggctgggga tgcaataggc cttgctgaca tcacacaaca gctgaatcaa 3900 agtgaattgg cagtgttatt aaacctgctg cagagccaaa ccgacctgag catccctcaa 3960 atggcacagc tgcttaacat ccactccaac ccagagatgc agcagcagct ggaagccctg 4020 aaccaatcca tcagtgccct gacggaagct acttcccagc agcaggactc agagaccatg 4080 gccccagagg agtctttgaa ggaagcaccc tctgccccag tgatcctgcc ttcagcagaa 4140 cagacgaccc ttgaagcttc aagcacacca gctgacatgc agaatatatt ggcagttctc 4200 ttgagtcagc tgatgaaaac ccaagagcca gcaggcagtc tggaggaaaa caacagtgac 4260 aagaacagtg ggccacaggg gccccgaaga actcccacaa tgccacagga ggaggcagca 4320 gagaagaggc cccctgagcc ccccggacct ccaccgccgc cacctccacc ccctctggtt 4380 gaaggcgatc tttccagcgc cccccaggag ttgaacccag ccgtgacagc cgccttgctg 4440 caacttttat cccagcctga agcagagcct cctggccacc tgccacatga gcaccaggcc 4500 ttgagaccaa tggagtactc cacccgaccc cgtccaaaca ggacttatgg aaacactgat 4560 gggcctgaaa cagggttcag tgccattgac actgatgaac gaaactctgg tccagccttg 4620 acagaatcct tggtccagac cctggtgaag aacaggacct tctcaggctc tctgagccac 4680 cttggggagt ccagcagtta ccagggcaca gggtcagtgc agtttccagg ggaccaggac 4740 ctccgttttg ccagggtccc cttagcgtta cacccggtgg tcgggcaacc attcctgaag 4800 gctgagggaa gcagcaattc tgtggtacat gcagagacca aattgcaaaa ctatggggag 4860 ctggggccag gaaccactgg ggccagcagc tcaggagcag gccttcactg ggggggccca 4920 actcagtctt ctgcttatgg aaaactctat cgggggccta caagagtccc accaagaggg 4980 ggaagaggga gaggagttcc ttactaaccc agagacttca gtgtcctgaa agattccttt 5040 cctatccatc cttccatcca gttctctgaa tctttaatga aatcatttgc cagagcgagg 5100 taatcatctg catttggcta ctgcaaagct gtccgttgta ttccttgctc acttgctact 5160 agcaggcgac ttacgaaata atgatgttgg caccagttcc ccctggatgg gctatagcca 5220 gaacatttac ttcaactcta ccttagtaga tacaagtaga gaatatggag aggatcatta 5280 cattgaaaag taaatgtttt attagttcat tgcctgcact tactgatcgg aagagagaaa 5340 gaacagtttc agtattgaga tggctcagga gaggctcttt gatttttaaa gttttggggt 5400 gggggattgt gtgtggtttc tttcttttga attttaattt aggtgttttg ggtttttttc 5460 ctttaaagag aatagtgttc acaaaatttg agctgctctt tggcttttgc tataagggaa 5520 acagagtggc ctggctgatt tgaataaatg tttctttcct ctccaccatc tcacattttg 5580 cttttaagtg aacacttttt ccccattgag catcttgaac atactttttt tccaaataaa 5640 ttactcatcc ttaaagttta ctccactttg acaaaagata cgcccttctc cctgcacata 5700 aagcaggttg tagaacgtgg cattcttggg caagtaggta gactttaccc agtctctttc 5760 cttttttgct gatgtgtgct ctctctctct ctttctctct ctctctctct ctctctctct 5820 ctctctctct ctctgtctcg cttgctcgct ctcgctgttt ctctctcttt gaggcatttg 5880 tttggaaaaa atcgttgaga tgcccaagaa cctgggataa ttctttactt tttttgaaat 5940 aaaggaaagg aaattcagac tcttacattg ttctctgtaa ctcttcaatt ctaaaatgtt 6000 ttgtttttta aaccatgttc tgatggggaa gttgatttgt aagtgtggac agcttggaca 6060 ttgctgctga gctgtggtta gagatgatgc ctccattcct agagggctaa taacagcatt 6120 tagcatattg tttacacata tatttttatg tcaaaaaaaa aacaaaaacc tttcaaacag 6180 agcattgtga tattgtcaaa gagaaaaaca aatcctgaag atacatggaa atgtaaccta 6240 gtttagggtg ggtatttttc tgaagataca tcaatacctg acctttttta aaaaaataat 6300 tttaaaacag catactgtga ggaagaacag tattgacata cccacatccc agcatgtgta 6360 ccctgccagt tcttttaggg atttttcctc caaagagatt tggatttggt tttggtaaaa 6420 ggggttaaat tgtgcttcca ggcaagaact ttgccttatc ataaacagga aatgaaaaag 6480 ggaagggctg tcaggatggg ataatttggg aggcttctca ttctggcttc tatttctatg 6540 tgagtaccag catatagagt gttttaaaaa cagatacatg tcatataatt tatctgcaca 6600 gacttagacc ttcaggaaac ataggttaag ccccctttta caaagaaaaa gtaaacatac 6660 ttcagcatct tggagggtag ttttcaaaac tcaagtttca tgtttcaatg ccaagttctt 6720 attttaaaaa ataaaatcta cttataagag aaaggtgcat tacttaaaaa aaaaaaactt 6780 taaagaaatg aaagaagaac cctcttcaga tacttacttg aagactgttt tcccctgtta 6840 atgagatata gctagatatc ggtgtgtgta tttctttatt attctctggt ttttgatctg 6900 gccttgcctc cagggccaaa cactgattta gaaagagagc cttctagcta ttttggcatt 6960 gatggctttt tataccagtg tgtccagtta gatttactag gcttactgac atgctattgg 7020 taaatcgcat taaagttcat ctgaaccttc tgtctgttga cttcttagtc ctcagacatg 7080 ggcctttgtg ttttagaata tttgaatttg agttattggg ccccactccc tgttttttat 7140 taaagaacgt gagcctggga tactttcaga agtatctgtt caatgaaaaa aagttggttt 7200 cccatcaaat atgaataaaa ttctctatat atttcattgt attttggtta tcagcagtca 7260 tcaataatgt ttttccctcc cctctcccac ctcttatttt taattatgcc aaatatccta 7320 aataatatac ttaagcctcc attccctcat ccctactagg gaagggggtg agtgtatgtg 7380 tgagtgtatg tgtatgtatg atcccatctc acccccaccc ccattttggg agtcttttaa 7440 aatgaaaaca aagtttggta gttttgacta tttctaaaag cagaggagaa aaaaaaactt 7500 atttaaatat cctggaatct gtatggagga agaaaaggta tttgttaatt tttcagttac 7560 gttatctata aacatgatgg aagtaaaggt ttggcagaat ttcaccttga ctatttgaaa 7620 attacagacc caattaattc cattcaaaag tggttttcgt tttgttttaa ttattgtaca 7680 atgagagata ttgtctatta aatacattat tttgaacaga tgagaaatct gattctgttc 7740 atgagtggga ggcaaaactg gtttgaccgt gatcattttt gtggttttga aaacaaatat 7800 acttgaccca gtttccttag ttttttcttc aactgtccat aggaacgata agtatttgaa 7860 agcaacatca aatctatacg tttaaagcag ggcagttagc acaaatttgc aagtagaact 7920 tctattagct tatgccatag acatcaccca accacttgta tgtgtgtgtg tatatataat 7980 atgcatatat agttaccgtg ctaaaatggt taccagcagg ttttgagaga gaatgctgca 8040 tcagaaaagt gtcagttgcc acctcattct ccctgattta ggttcctgac actgattcct 8100 ttctctctcg tttttgaccc ccattgggtg tatcttgtct atgtacagat attttgtaat 8160 atattaaatt tttttctttc agtttataaa aatggaaagt ggagattgga aaattaaata 8220 tttcctgtta ctataccact tttgctccat tgcatt 8256 <210> 3 <211> 4473 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcccaatt cagagagaca tgggggcaag aaggacggga gtggaggagc ttctggaact 60 ttgcagccgt catcgggagg cggcagctct aacagcagag agcgtcaccg cttggtatcg 120 aagcacaagc ggcataagtc caaacactcc aaagacatgg ggttggtgac ccccgaagca 180 gcatccctgg gcacagttat caaacctttg gtggagtatg atgatatcag ctctgattcc 240 gacaccttct ccgatgacat ggccttcaaa ctagaccgaa gggagaacga cgaacgtcgt 300 ggatcagatc ggagcgaccg cctgcacaaa catcgtcacc accagcacag gcgttcccgg 360 gacttactaa aagctaaaca gaccgaaaaa gaaaaaagcc aagaagtctc cagcaagtcg 420 ggatcgatga aggaccggat atcgggaagt tcaaagcgtt cgaatgagga gactgatgac 480 tatgggaagg cgcaggtagc caaaagcagc agcaaggaat ccaggtcatc caagctccac 540 aaggagaaga ccaggaaaga acgggagctg aagtctgggc acaaagaccg gagtaaaagt 600 catcgaaaaa gggaaacacc caaaagttac aaaacagtgg acagcccaaa acggagatcc 660 aggagccccc acaggaagtg gtctgacagc tccaaacaag atgatagccc ctcgggagct 720 tcttatggcc aagattatga ccttagtccc tcacgatctc atacctcgag caattatgac 780 tcctacaaga aaagtcctgg aagtacctcg agaaggcagt cggtcagtcc cccttacaag 840 gagccttcgg cctaccagtc cagcacccgg tcaccgagcc cctacagtag gcgacagaga 900 tctgtcagtc cctatagcag gagacggtcg tccagctacg aaagaagtgg ctcttacagc 960 gggcgatcgc ccagtcccta tggtcgaagg cggtccagca gccctttcct gagcaagcgg 1020 tctctgagtc ggagtccact ccccagtagg aaatccatga agtccagaag tagaagtcct 1080 gcatattcaa gacattcatc ttctcatagt aaaaagaaga gatccagttc acgcagtcgt 1140 cattccagta tctcacctgt caggcttcca cttaattcca gtctgggagc tgaactcagt 1200 aggaaaaaga aggaaagagc agctgctgct gctgcagcaa agatggatgg aaaggagtcc 1260 aagggttcac ctgtattttt gcctagaaaa gagaacagtt cagtagaggc taaggattca 1320 ggtttggagt ctaaaaagtt acccagaagt gtaaaattgg aaaaatctgc cccagatact 1380 gaactggtga atgtaacaca tctaaacaca gaggtaaaaa attcttcaga tacagggaaa 1440 gtaaagttgg atgagaactc cgagaagcat cttgttaaag atttgaaagc acagggaaca 1500 agagactcta aacccatagc actgaaagag gagattgtta ctccaaagga gacagaaaca 1560 tcagaaaagg agacccctcc acctcttccc acaattgctt ctcccccacc ccctctacca 1620 actactaccc ctccacctca gacaccccct ttgccacctt tgcctccaat accagctctt 1680 ccacagcaac cacctctgcc tccttctcag ccagcattta gtcaggttcc tgcttccagt 1740 acttcaactt tgcccccttc tactcactca aagacatctg ctgtgtcctc tcaggcaaat 1800 tctcagcccc ctgtacaggt ttctgtgaag actcaagtat ctgtaacagc tgctattcca 1860 cacctgaaaa cttcaacgtt gcctcctttg cccctcccac ccttattacc tggagatgat 1920 gacatggata gtccaaaaga aactcttcct tcaaaacctg tgaagaaaga gaaggaacag 1980 aggacacgtc acttactcac agaccttcct ctccctccag agctccctgg tggagatctg 2040 tctcccccag actctccaga accaaaggca atcacaccac ctcagcaacc atataaaaag 2100 agaccaaaaa tttgttgtcc tcgttatgga gaaagaagac aaacagaaag cgactggggg 2160 aaacgctgtg tggacaagtt tgacattatt gggattattg gagaaggaac ctatggccaa 2220 gtatataaag ccaaggacaa agacacagga gaactagtgg ctctgaagaa ggtgagacta 2280 gacaatgaga aagagggctt cccaatcaca gccattcgtg aaatcaaaat ccttcgtcag 2340 ttaatccacc gaagtgttgt taacatgaag gaaattgtca cagataaaca agatgcactg 2400 gatttcaaga aggacaaagg tgccttttac cttgtatttg agtatatgga ccatgactta 2460 atgggactgc tagaatctgg tttggtgcac ttttctgagg accatatcaa gtcgttcatg 2520 aaacagctaa tggaaggatt ggaatactgt cacaaaaaga atttcctgca tcgggatatt 2580 aagtgttcta acattttgct gaataacagt gggcaaatca aactagcaga ttttggactt 2640 gctcggctct ataactctga agagagtcgc ccttacacaa acaaagtcat tactttgtgg 2700 taccgacctc cagaactact gctaggagag gaacgttaca caccagccat agatgtttgg 2760 agctgtggat gtattcttgg ggaactattc acaaagaagc ctatttttca agccaatctg 2820 gaactggctc agctagaact gatcagccga ctttgtggta gcccttgtcc agctgtgtgg 2880 cctgatgtta tcaaactgcc ctacttcaac accatgaaac cgaagaagca atatcgaagg 2940 cgtctacgag aagaattctc tttcattcct tctgcagcac ttgatttatt ggaccacatg 3000 ctgacactag atcctagtaa gcggtgcaca gctgaacaga ccctacagag cgacttcctt 3060 aaagatgtcg aactcagcaa aatggctcct ccagacctcc cccactggca ggattgccat 3120 gagttgtgga gtaagaaacg gcgacgtcag cgacaaagtg gtgttgtagt cgaagagcca 3180 cctccatcca aaacttctcg aaaagaaact acctcaggga caagtactga gcctgtgaag 3240 aacagcagcc cagcaccacc tcagcctgct cctggcaagg tggagtctgg ggctggggat 3300 gcaataggcc ttgctgacat cacacaacag ctgaatcaaa gtgaattggc agtgttatta 3360 aacctgctgc agagccaaac cgacctgagc atccctcaaa tggcacagct gcttaacatc 3420 cactccaacc cagagatgca gcagcagctg gaagccctga accaatccat cagtgccctg 3480 acggaagcta cttcccagca gcaggactca gagaccatgg ccccagagga gtctttgaag 3540 gaagcaccct ctgccccagt gatcctgcct tcagcagaac agacgaccct tgaagcttca 3600 agcacaccag ctgacatgca gaatatattg gcagttctct tgagtcagct gatgaaaacc 3660 caagagccag caggcagtct ggaggaaaac aacagtgaca agaacagtgg gccacagggg 3720 ccccgaagaa ctcccacaat gccacaggag gaggcagcag catgtcctcc tcacattctt 3780 ccaccagaga agaggccccc tgagcccccc ggacctccac cgccgccacc tccaccccct 3840 ctggttgaag gcgatctttc cagcgccccc caggagttga acccagccgt gacagccgcc 3900 ttgctgcaac ttttatccca gcctgaagca gagcctcctg gccacctgcc acatgagcac 3960 caggccttga gaccaatgga gtactccacc cgaccccgtc caaacaggac ttatggaaac 4020 actgatgggc ctgaaacagg gttcagtgcc attgacactg atgaacgaaa ctctggtcca 4080 gccttgacag aatccttggt ccagaccctg gtgaagaaca ggaccttctc aggctctctg 4140 agccaccttg gggagtccag cagttaccag ggcacagggt cagtgcagtt tccaggggac 4200 caggacctcc gttttgccag ggtcccctta gcgttacacc cggtggtcgg gcaaccattc 4260 ctgaaggctg agggaagcag caattctgtg gtacatgcag agaccaaatt gcaaaactat 4320 ggggagctgg ggccaggaac cactggggcc agcagctcag gagcaggcct tcactggggg 4380 ggcccaactc agtcttctgc ttatggaaaa ctctatcggg ggcctacaag agtcccacca 4440 agagggggaa gagggagagg agttccttac taa 4473 <210> 4 <211> 4446 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcccaatt cagagagaca tgggggcaag aaggacggga gtggaggagc ttctggaact 60 ttgcagccgt catcgggagg cggcagctct aacagcagag agcgtcaccg cttggtatcg 120 aagcacaagc ggcataagtc caaacactcc aaagacatgg ggttggtgac ccccgaagca 180 gcatccctgg gcacagttat caaacctttg gtggagtatg atgatatcag ctctgattcc 240 gacaccttct ccgatgacat ggccttcaaa ctagaccgaa gggagaacga cgaacgtcgt 300 ggatcagatc ggagcgaccg cctgcacaaa catcgtcacc accagcacag gcgttcccgg 360 gacttactaa aagctaaaca gaccgaaaaa gaaaaaagcc aagaagtctc cagcaagtcg 420 ggatcgatga aggaccggat atcgggaagt tcaaagcgtt cgaatgagga gactgatgac 480 tatgggaagg cgcaggtagc caaaagcagc agcaaggaat ccaggtcatc caagctccac 540 aaggagaaga ccaggaaaga acgggagctg aagtctgggc acaaagaccg gagtaaaagt 600 catcgaaaaa gggaaacacc caaaagttac aaaacagtgg acagcccaaa acggagatcc 660 aggagccccc acaggaagtg gtctgacagc tccaaacaag atgatagccc ctcgggagct 720 tcttatggcc aagattatga ccttagtccc tcacgatctc atacctcgag caattatgac 780 tcctacaaga aaagtcctgg aagtacctcg agaaggcagt cggtcagtcc cccttacaag 840 gagccttcgg cctaccagtc cagcacccgg tcaccgagcc cctacagtag gcgacagaga 900 tctgtcagtc cctatagcag gagacggtcg tccagctacg aaagaagtgg ctcttacagc 960 gggcgatcgc ccagtcccta tggtcgaagg cggtccagca gccctttcct gagcaagcgg 1020 tctctgagtc ggagtccact ccccagtagg aaatccatga agtccagaag tagaagtcct 1080 gcatattcaa gacattcatc ttctcatagt aaaaagaaga gatccagttc acgcagtcgt 1140 cattccagta tctcacctgt caggcttcca cttaattcca gtctgggagc tgaactcagt 1200 aggaaaaaga aggaaagagc agctgctgct gctgcagcaa agatggatgg aaaggagtcc 1260 aagggttcac ctgtattttt gcctagaaaa gagaacagtt cagtagaggc taaggattca 1320 ggtttggagt ctaaaaagtt acccagaagt gtaaaattgg aaaaatctgc cccagatact 1380 gaactggtga atgtaacaca tctaaacaca gaggtaaaaa attcttcaga tacagggaaa 1440 gtaaagttgg atgagaactc cgagaagcat cttgttaaag atttgaaagc acagggaaca 1500 agagactcta aacccatagc actgaaagag gagattgtta ctccaaagga gacagaaaca 1560 tcagaaaagg agacccctcc acctcttccc acaattgctt ctcccccacc ccctctacca 1620 actactaccc ctccacctca gacaccccct ttgccacctt tgcctccaat accagctctt 1680 ccacagcaac cacctctgcc tccttctcag ccagcattta gtcaggttcc tgcttccagt 1740 acttcaactt tgcccccttc tactcactca aagacatctg ctgtgtcctc tcaggcaaat 1800 tctcagcccc ctgtacaggt ttctgtgaag actcaagtat ctgtaacagc tgctattcca 1860 cacctgaaaa cttcaacgtt gcctcctttg cccctcccac ccttattacc tggagatgat 1920 gacatggata gtccaaaaga aactcttcct tcaaaacctg tgaagaaaga gaaggaacag 1980 aggacacgtc acttactcac agaccttcct ctccctccag agctccctgg tggagatctg 2040 tctcccccag actctccaga accaaaggca atcacaccac ctcagcaacc atataaaaag 2100 agaccaaaaa tttgttgtcc tcgttatgga gaaagaagac aaacagaaag cgactggggg 2160 aaacgctgtg tggacaagtt tgacattatt gggattattg gagaaggaac ctatggccaa 2220 gtatataaag ccaaggacaa agacacagga gaactagtgg ctctgaagaa ggtgagacta 2280 gacaatgaga aagagggctt cccaatcaca gccattcgtg aaatcaaaat ccttcgtcag 2340 ttaatccacc gaagtgttgt taacatgaag gaaattgtca cagataaaca agatgcactg 2400 gatttcaaga aggacaaagg tgccttttac cttgtatttg agtatatgga ccatgactta 2460 atgggactgc tagaatctgg tttggtgcac ttttctgagg accatatcaa gtcgttcatg 2520 aaacagctaa tggaaggatt ggaatactgt cacaaaaaga atttcctgca tcgggatatt 2580 aagtgttcta acattttgct gaataacagt gggcaaatca aactagcaga ttttggactt 2640 gctcggctct ataactctga agagagtcgc ccttacacaa acaaagtcat tactttgtgg 2700 taccgacctc cagaactact gctaggagag gaacgttaca caccagccat agatgtttgg 2760 agctgtggat gtattcttgg ggaactattc acaaagaagc ctatttttca agccaatctg 2820 gaactggctc agctagaact gatcagccga ctttgtggta gcccttgtcc agctgtgtgg 2880 cctgatgtta tcaaactgcc ctacttcaac accatgaaac cgaagaagca atatcgaagg 2940 cgtctacgag aagaattctc tttcattcct tctgcagcac ttgatttatt ggaccacatg 3000 ctgacactag atcctagtaa gcggtgcaca gctgaacaga ccctacagag cgacttcctt 3060 aaagatgtcg aactcagcaa aatggctcct ccagacctcc cccactggca ggattgccat 3120 gagttgtgga gtaagaaacg gcgacgtcag cgacaaagtg gtgttgtagt cgaagagcca 3180 cctccatcca aaacttctcg aaaagaaact acctcaggga caagtactga gcctgtgaag 3240 aacagcagcc cagcaccacc tcagcctgct cctggcaagg tggagtctgg ggctggggat 3300 gcaataggcc ttgctgacat cacacaacag ctgaatcaaa gtgaattggc agtgttatta 3360 aacctgctgc agagccaaac cgacctgagc atccctcaaa tggcacagct gcttaacatc 3420 cactccaacc cagagatgca gcagcagctg gaagccctga accaatccat cagtgccctg 3480 acggaagcta cttcccagca gcaggactca gagaccatgg ccccagagga gtctttgaag 3540 gaagcaccct ctgccccagt gatcctgcct tcagcagaac agacgaccct tgaagcttca 3600 agcacaccag ctgacatgca gaatatattg gcagttctct tgagtcagct gatgaaaacc 3660 caagagccag caggcagtct ggaggaaaac aacagtgaca agaacagtgg gccacagggg 3720 ccccgaagaa ctcccacaat gccacaggag gaggcagcag agaagaggcc ccctgagccc 3780 cccggacctc caccgccgcc acctccaccc cctctggttg aaggcgatct ttccagcgcc 3840 ccccaggagt tgaacccagc cgtgacagcc gccttgctgc aacttttatc ccagcctgaa 3900 gcagagcctc ctggccacct gccacatgag caccaggcct tgagaccaat ggagtactcc 3960 acccgacccc gtccaaacag gacttatgga aacactgatg ggcctgaaac agggttcagt 4020 gccattgaca ctgatgaacg aaactctggt ccagccttga cagaatcctt ggtccagacc 4080 ctggtgaaga acaggacctt ctcaggctct ctgagccacc ttggggagtc cagcagttac 4140 cagggcacag ggtcagtgca gtttccaggg gaccaggacc tccgttttgc cagggtcccc 4200 ttagcgttac acccggtggt cgggcaacca ttcctgaagg ctgagggaag cagcaattct 4260 gtggtacatg cagagaccaa attgcaaaac tatggggagc tggggccagg aaccactggg 4320 gccagcagct caggagcagg ccttcactgg gggggcccaa ctcagtcttc tgcttatgga 4380 aaactctatc gggggcctac aagagtccca ccaagagggg gaagagggag aggagttcct 4440 tactaa 4446 <210> 5 <211> 1490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Asn Ser Glu Arg His Gly Gly Lys Lys Asp Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser Gly Thr Leu Gln Pro Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Asn Ser 20 25 30 Arg Glu Arg His Arg Leu Val Ser Lys His Lys Arg His Lys Ser Lys 35 40 45 His Ser Lys Asp Met Gly Leu Val Thr Pro Glu Ala Ala Ser Leu Gly 50 55 60 Thr Val Ile Lys Pro Leu Val Glu Tyr Asp Asp Ile Ser Ser Asp Ser 65 70 75 80 Asp Thr Phe Ser Asp Asp Met Ala Phe Lys Leu Asp Arg Arg Glu Asn 85 90 95 Asp Glu Arg Arg Gly Ser Asp Arg Ser Asp Arg Leu His Lys His Arg 100 105 110 His His Gln His Arg Arg Ser Arg Asp Leu Leu Lys Ala Lys Gln Thr 115 120 125 Glu Lys Glu Lys Ser Gln Glu Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Met Lys 130 135 140 Asp Arg Ile Ser Gly Ser Ser Lys Arg Ser Asn Glu Glu Thr Asp Asp 145 150 155 160 Tyr Gly Lys Ala Gln Val Ala Lys Ser Ser Ser Lys Glu Ser Arg Ser 165 170 175 Ser Lys Leu His Lys Glu Lys Thr Arg Lys Glu Arg Glu Leu Lys Ser 180 185 190 Gly His Lys Asp Arg Ser Lys Ser His Arg Lys Arg Glu Thr Pro Lys 195 200 205 Ser Tyr Lys Thr Val Asp Ser Pro Lys Arg Arg Ser Arg Ser Pro His 210 215 220 Arg Lys Trp Ser Asp Ser Ser Lys Gln Asp Asp Ser Pro Ser Gly Ala 225 230 235 240 Ser Tyr Gly Gln Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Ser Arg Ser His Thr Ser 245 250 255 Ser Asn Tyr Asp Ser Tyr Lys Lys Ser Pro Gly Ser Thr Ser Arg Arg 260 265 270 Gln Ser Val Ser Pro Pro Tyr Lys Glu Pro Ser Ala Tyr Gln Ser Ser 275 280 285 Thr Arg Ser Pro Ser Pro Tyr Ser Arg Arg Gln Arg Ser Val Ser Pro 290 295 300 Tyr Ser Arg Arg Arg Ser Ser Ser Tyr Glu Arg Ser Gly Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Gly Arg Ser Pro Ser Pro Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Ser Ser Pro Phe 325 330 335 Leu Ser Lys Arg Ser Leu Ser Arg Ser Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ser 340 345 350 Met Lys Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ala Tyr Ser Arg His Ser Ser Ser 355 360 365 His Ser Lys Lys Lys Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg His Ser Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Val Arg Leu Pro Leu Asn Ser Ser Leu Gly Ala Glu Leu Ser 385 390 395 400 Arg Lys Lys Lys Glu Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Met Asp 405 410 415 Gly Lys Glu Ser Lys Gly Ser Pro Val Phe Leu Pro Arg Lys Glu Asn 420 425 430 Ser Ser Val Glu Ala Lys Asp Ser Gly Leu Glu Ser Lys Lys Leu Pro 435 440 445 Arg Ser Val Lys Leu Glu Lys Ser Ala Pro Asp Thr Glu Leu Val Asn 450 455 460 Val Thr His Leu Asn Thr Glu Val Lys Asn Ser Ser Asp Thr Gly Lys 465 470 475 480 Val Lys Leu Asp Glu Asn Ser Glu Lys His Leu Val Lys Asp Leu Lys 485 490 495 Ala Gln Gly Thr Arg Asp Ser Lys Pro Ile Ala Leu Lys Glu Glu Ile 500 505 510 Val Thr Pro Lys Glu Thr Glu Thr Ser Glu Lys Glu Thr Pro Pro Pro 515 520 525 Leu Pro Thr Ile Ala Ser Pro Pro Pro Pro Leu Pro Thr Thr Thr Pro 530 535 540 Pro Pro Gln Thr Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Ile Pro Ala Leu 545 550 555 560 Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro Pro Ser Gln Pro Ala Phe Ser Gln Val 565 570 575 Pro Ala Ser Ser Thr Ser Thr Leu Pro Pro Ser Thr His Ser Lys Thr 580 585 590 Ser Ala Val Ser Ser Gln Ala Asn Ser Gln Pro Pro Val Gln Val Ser 595 600 605 Val Lys Thr Gln Val Ser Val Thr Ala Ala Ile Pro His Leu Lys Thr 610 615 620 Ser Thr Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Leu Pro Gly Asp Asp 625 630 635 640 Asp Met Asp Ser Pro Lys Glu Thr Leu Pro Ser Lys Pro Val Lys Lys 645 650 655 Glu Lys Glu Gln Arg Thr Arg His Leu Leu Thr Asp Leu Pro Leu Pro 660 665 670 Pro Glu Leu Pro Gly Gly Asp Leu Ser Pro Pro Asp Ser Pro Glu Pro 675 680 685 Lys Ala Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Lys Lys Arg Pro Lys Ile 690 695 700 Cys Cys Pro Arg Tyr Gly Glu Arg Arg Gln Thr Glu Ser Asp Trp Gly 705 710 715 720 Lys Arg Cys Val Asp Lys Phe Asp Ile Ile Gly Ile Ile Gly Glu Gly 725 730 735 Thr Tyr Gly Gln Val Tyr Lys Ala Lys Asp Lys Asp Thr Gly Glu Leu 740 745 750 Val Ala Leu Lys Lys Val Arg Leu Asp Asn Glu Lys Glu Gly Phe Pro 755 760 765 Ile Thr Ala Ile Arg Glu Ile Lys Ile Leu Arg Gln Leu Ile His Arg 770 775 780 Ser Val Val Asn Met Lys Glu Ile Val Thr Asp Lys Gln Asp Ala Leu 785 790 795 800 Asp Phe Lys Lys Asp Lys Gly Ala Phe Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Met 805 810 815 Asp His Asp Leu Met Gly Leu Leu Glu Ser Gly Leu Val His Phe Ser 820 825 830 Glu Asp His Ile Lys Ser Phe Met Lys Gln Leu Met Glu Gly Leu Glu 835 840 845 Tyr Cys His Lys Lys Asn Phe Leu His Arg Asp Ile Lys Cys Ser Asn 850 855 860 Ile Leu Leu Asn Asn Ser Gly Gln Ile Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 865 870 875 880 Ala Arg Leu Tyr Asn Ser Glu Glu Ser Arg Pro Tyr Thr Asn Lys Val 885 890 895 Ile Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Arg 900 905 910 Tyr Thr Pro Ala Ile Asp Val Trp Ser Cys Gly Cys Ile Leu Gly Glu 915 920 925 Leu Phe Thr Lys Lys Pro Ile Phe Gln Ala Asn Leu Glu Leu Ala Gln 930 935 940 Leu Glu Leu Ile Ser Arg Leu Cys Gly Ser Pro Cys Pro Ala Val Trp 945 950 955 960 Pro Asp Val Ile Lys Leu Pro Tyr Phe Asn Thr Met Lys Pro Lys Lys 965 970 975 Gln Tyr Arg Arg Arg Leu Arg Glu Glu Phe Ser Phe Ile Pro Ser Ala 980 985 990 Ala Leu Asp Leu Leu Asp His Met Leu Thr Leu Asp Pro Ser Lys Arg 995 1000 1005 Cys Thr Ala Glu Gln Thr Leu Gln Ser Asp Phe Leu Lys Asp Val 1010 1015 1020 Glu Leu Ser Lys Met Ala Pro Pro Asp Leu Pro His Trp Gln Asp 1025 1030 1035 Cys His Glu Leu Trp Ser Lys Lys Arg Arg Arg Gln Arg Gln Ser 1040 1045 1050 Gly Val Val Val Glu Glu Pro Pro Pro Ser Lys Thr Ser Arg Lys 1055 1060 1065 Glu Thr Thr Ser Gly Thr Ser Thr Glu Pro Val Lys Asn Ser Ser 1070 1075 1080 Pro Ala Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gly Lys Val Glu Ser Gly Ala 1085 1090 1095 Gly Asp Ala Ile Gly Leu Ala Asp Ile Thr Gln Gln Leu Asn Gln 1100 1105 1110 Ser Glu Leu Ala Val Leu Leu Asn Leu Leu Gln Ser Gln Thr Asp 1115 1120 1125 Leu Ser Ile Pro Gln Met Ala Gln Leu Leu Asn Ile His Ser Asn 1130 1135 1140 Pro Glu Met Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ser 1145 1150 1155 Ala Leu Thr Glu Ala Thr Ser Gln Gln Gln Asp Ser Glu Thr Met 1160 1165 1170 Ala Pro Glu Glu Ser Leu Lys Glu Ala Pro Ser Ala Pro Val Ile 1175 1180 1185 Leu Pro Ser Ala Glu Gln Thr Thr Leu Glu Ala Ser Ser Thr Pro 1190 1195 1200 Ala Asp Met Gln Asn Ile Leu Ala Val Leu Leu Ser Gln Leu Met 1205 1210 1215 Lys Thr Gln Glu Pro Ala Gly Ser Leu Glu Glu Asn Asn Ser Asp 1220 1225 1230 Lys Asn Ser Gly Pro Gln Gly Pro Arg Arg Thr Pro Thr Met Pro 1235 1240 1245 Gln Glu Glu Ala Ala Ala Cys Pro Pro His Ile Leu Pro Pro Glu 1250 1255 1260 Lys Arg Pro Pro Glu Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 1265 1270 1275 Pro Pro Leu Val Glu Gly Asp Leu Ser Ser Ala Pro Gln Glu Leu 1280 1285 1290 Asn Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Leu Gln Leu Leu Ser Gln Pro 1295 1300 1305 Glu Ala Glu Pro Pro Gly His Leu Pro His Glu His Gln Ala Leu 1310 1315 1320 Arg Pro Met Glu Tyr Ser Thr Arg Pro Arg Pro Asn Arg Thr Tyr 1325 1330 1335 Gly Asn Thr Asp Gly Pro Glu Thr Gly Phe Ser Ala Ile Asp Thr 1340 1345 1350 Asp Glu Arg Asn Ser Gly Pro Ala Leu Thr Glu Ser Leu Val Gln 1355 1360 1365 Thr Leu Val Lys Asn Arg Thr Phe Ser Gly Ser Leu Ser His Leu 1370 1375 1380 Gly Glu Ser Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Val Gln Phe Pro 1385 1390 1395 Gly Asp Gln Asp Leu Arg Phe Ala Arg Val Pro Leu Ala Leu His 1400 1405 1410 Pro Val Val Gly Gln Pro Phe Leu Lys Ala Glu Gly Ser Ser Asn 1415 1420 1425 Ser Val Val His Ala Glu Thr Lys Leu Gln Asn Tyr Gly Glu Leu 1430 1435 1440 Gly Pro Gly Thr Thr Gly Ala Ser Ser Ser Gly Ala Gly Leu His 1445 1450 1455 Trp Gly Gly Pro Thr Gln Ser Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Tyr Arg 1460 1465 1470 Gly Pro Thr Arg Val Pro Pro Arg Gly Gly Arg Gly Arg Gly Val 1475 1480 1485 Pro Tyr 1490 <210> 6 <211> 1481 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Asn Ser Glu Arg His Gly Gly Lys Lys Asp Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser Gly Thr Leu Gln Pro Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Asn Ser 20 25 30 Arg Glu Arg His Arg Leu Val Ser Lys His Lys Arg His Lys Ser Lys 35 40 45 His Ser Lys Asp Met Gly Leu Val Thr Pro Glu Ala Ala Ser Leu Gly 50 55 60 Thr Val Ile Lys Pro Leu Val Glu Tyr Asp Asp Ile Ser Ser Asp Ser 65 70 75 80 Asp Thr Phe Ser Asp Asp Met Ala Phe Lys Leu Asp Arg Arg Glu Asn 85 90 95 Asp Glu Arg Arg Gly Ser Asp Arg Ser Asp Arg Leu His Lys His Arg 100 105 110 His His Gln His Arg Arg Ser Arg Asp Leu Leu Lys Ala Lys Gln Thr 115 120 125 Glu Lys Glu Lys Ser Gln Glu Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Met Lys 130 135 140 Asp Arg Ile Ser Gly Ser Ser Lys Arg Ser Asn Glu Glu Thr Asp Asp 145 150 155 160 Tyr Gly Lys Ala Gln Val Ala Lys Ser Ser Ser Lys Glu Ser Arg Ser 165 170 175 Ser Lys Leu His Lys Glu Lys Thr Arg Lys Glu Arg Glu Leu Lys Ser 180 185 190 Gly His Lys Asp Arg Ser Lys Ser His Arg Lys Arg Glu Thr Pro Lys 195 200 205 Ser Tyr Lys Thr Val Asp Ser Pro Lys Arg Arg Ser Arg Ser Pro His 210 215 220 Arg Lys Trp Ser Asp Ser Ser Lys Gln Asp Asp Ser Pro Ser Gly Ala 225 230 235 240 Ser Tyr Gly Gln Asp Tyr Asp Leu Ser Pro Ser Arg Ser His Thr Ser 245 250 255 Ser Asn Tyr Asp Ser Tyr Lys Lys Ser Pro Gly Ser Thr Ser Arg Arg 260 265 270 Gln Ser Val Ser Pro Pro Tyr Lys Glu Pro Ser Ala Tyr Gln Ser Ser 275 280 285 Thr Arg Ser Pro Ser Pro Tyr Ser Arg Arg Gln Arg Ser Val Ser Pro 290 295 300 Tyr Ser Arg Arg Arg Ser Ser Ser Tyr Glu Arg Ser Gly Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Gly Arg Ser Pro Ser Pro Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Ser Ser Pro Phe 325 330 335 Leu Ser Lys Arg Ser Leu Ser Arg Ser Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ser 340 345 350 Met Lys Ser Arg Ser Arg Ser Pro Ala Tyr Ser Arg His Ser Ser Ser 355 360 365 His Ser Lys Lys Lys Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg His Ser Ser Ile 370 375 380 Ser Pro Val Arg Leu Pro Leu Asn Ser Ser Leu Gly Ala Glu Leu Ser 385 390 395 400 Arg Lys Lys Lys Glu Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Met Asp 405 410 415 Gly Lys Glu Ser Lys Gly Ser Pro Val Phe Leu Pro Arg Lys Glu Asn 420 425 430 Ser Ser Val Glu Ala Lys Asp Ser Gly Leu Glu Ser Lys Lys Leu Pro 435 440 445 Arg Ser Val Lys Leu Glu Lys Ser Ala Pro Asp Thr Glu Leu Val Asn 450 455 460 Val Thr His Leu Asn Thr Glu Val Lys Asn Ser Ser Asp Thr Gly Lys 465 470 475 480 Val Lys Leu Asp Glu Asn Ser Glu Lys His Leu Val Lys Asp Leu Lys 485 490 495 Ala Gln Gly Thr Arg Asp Ser Lys Pro Ile Ala Leu Lys Glu Glu Ile 500 505 510 Val Thr Pro Lys Glu Thr Glu Thr Ser Glu Lys Glu Thr Pro Pro Pro 515 520 525 Leu Pro Thr Ile Ala Ser Pro Pro Pro Pro Leu Pro Thr Thr Thr Pro 530 535 540 Pro Pro Gln Thr Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Ile Pro Ala Leu 545 550 555 560 Pro Gln Gln Pro Pro Leu Pro Pro Ser Gln Pro Ala Phe Ser Gln Val 565 570 575 Pro Ala Ser Ser Thr Ser Thr Leu Pro Pro Ser Thr His Ser Lys Thr 580 585 590 Ser Ala Val Ser Ser Gln Ala Asn Ser Gln Pro Pro Val Gln Val Ser 595 600 605 Val Lys Thr Gln Val Ser Val Thr Ala Ala Ile Pro His Leu Lys Thr 610 615 620 Ser Thr Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Leu Pro Gly Asp Asp 625 630 635 640 Asp Met Asp Ser Pro Lys Glu Thr Leu Pro Ser Lys Pro Val Lys Lys 645 650 655 Glu Lys Glu Gln Arg Thr Arg His Leu Leu Thr Asp Leu Pro Leu Pro 660 665 670 Pro Glu Leu Pro Gly Gly Asp Leu Ser Pro Pro Asp Ser Pro Glu Pro 675 680 685 Lys Ala Ile Thr Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Lys Lys Arg Pro Lys Ile 690 695 700 Cys Cys Pro Arg Tyr Gly Glu Arg Arg Gln Thr Glu Ser Asp Trp Gly 705 710 715 720 Lys Arg Cys Val Asp Lys Phe Asp Ile Ile Gly Ile Ile Gly Glu Gly 725 730 735 Thr Tyr Gly Gln Val Tyr Lys Ala Lys Asp Lys Asp Thr Gly Glu Leu 740 745 750 Val Ala Leu Lys Lys Val Arg Leu Asp Asn Glu Lys Glu Gly Phe Pro 755 760 765 Ile Thr Ala Ile Arg Glu Ile Lys Ile Leu Arg Gln Leu Ile His Arg 770 775 780 Ser Val Val Asn Met Lys Glu Ile Val Thr Asp Lys Gln Asp Ala Leu 785 790 795 800 Asp Phe Lys Lys Asp Lys Gly Ala Phe Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Met 805 810 815 Asp His Asp Leu Met Gly Leu Leu Glu Ser Gly Leu Val His Phe Ser 820 825 830 Glu Asp His Ile Lys Ser Phe Met Lys Gln Leu Met Glu Gly Leu Glu 835 840 845 Tyr Cys His Lys Lys Asn Phe Leu His Arg Asp Ile Lys Cys Ser Asn 850 855 860 Ile Leu Leu Asn Asn Ser Gly Gln Ile Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 865 870 875 880 Ala Arg Leu Tyr Asn Ser Glu Glu Ser Arg Pro Tyr Thr Asn Lys Val 885 890 895 Ile Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu Leu Leu Gly Glu Glu Arg 900 905 910 Tyr Thr Pro Ala Ile Asp Val Trp Ser Cys Gly Cys Ile Leu Gly Glu 915 920 925 Leu Phe Thr Lys Lys Pro Ile Phe Gln Ala Asn Leu Glu Leu Ala Gln 930 935 940 Leu Glu Leu Ile Ser Arg Leu Cys Gly Ser Pro Cys Pro Ala Val Trp 945 950 955 960 Pro Asp Val Ile Lys Leu Pro Tyr Phe Asn Thr Met Lys Pro Lys Lys 965 970 975 Gln Tyr Arg Arg Arg Leu Arg Glu Glu Phe Ser Phe Ile Pro Ser Ala 980 985 990 Ala Leu Asp Leu Leu Asp His Met Leu Thr Leu Asp Pro Ser Lys Arg 995 1000 1005 Cys Thr Ala Glu Gln Thr Leu Gln Ser Asp Phe Leu Lys Asp Val 1010 1015 1020 Glu Leu Ser Lys Met Ala Pro Pro Asp Leu Pro His Trp Gln Asp 1025 1030 1035 Cys His Glu Leu Trp Ser Lys Lys Arg Arg Arg Gln Arg Gln Ser 1040 1045 1050 Gly Val Val Val Glu Glu Pro Pro Pro Ser Lys Thr Ser Arg Lys 1055 1060 1065 Glu Thr Thr Ser Gly Thr Ser Thr Glu Pro Val Lys Asn Ser Ser 1070 1075 1080 Pro Ala Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gly Lys Val Glu Ser Gly Ala 1085 1090 1095 Gly Asp Ala Ile Gly Leu Ala Asp Ile Thr Gln Gln Leu Asn Gln 1100 1105 1110 Ser Glu Leu Ala Val Leu Leu Asn Leu Leu Gln Ser Gln Thr Asp 1115 1120 1125 Leu Ser Ile Pro Gln Met Ala Gln Leu Leu Asn Ile His Ser Asn 1130 1135 1140 Pro Glu Met Gln Gln Gln Leu Glu Ala Leu Asn Gln Ser Ile Ser 1145 1150 1155 Ala Leu Thr Glu Ala Thr Ser Gln Gln Gln Asp Ser Glu Thr Met 1160 1165 1170 Ala Pro Glu Glu Ser Leu Lys Glu Ala Pro Ser Ala Pro Val Ile 1175 1180 1185 Leu Pro Ser Ala Glu Gln Thr Thr Leu Glu Ala Ser Ser Thr Pro 1190 1195 1200 Ala Asp Met Gln Asn Ile Leu Ala Val Leu Leu Ser Gln Leu Met 1205 1210 1215 Lys Thr Gln Glu Pro Ala Gly Ser Leu Glu Glu Asn Asn Ser Asp 1220 1225 1230 Lys Asn Ser Gly Pro Gln Gly Pro Arg Arg Thr Pro Thr Met Pro 1235 1240 1245 Gln Glu Glu Ala Ala Glu Lys Arg Pro Pro Glu Pro Pro Gly Pro 1250 1255 1260 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Val Glu Gly Asp Leu Ser 1265 1270 1275 Ser Ala Pro Gln Glu Leu Asn Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Leu 1280 1285 1290 Gln Leu Leu Ser Gln Pro Glu Ala Glu Pro Pro Gly His Leu Pro 1295 1300 1305 His Glu His Gln Ala Leu Arg Pro Met Glu Tyr Ser Thr Arg Pro 1310 1315 1320 Arg Pro Asn Arg Thr Tyr Gly Asn Thr Asp Gly Pro Glu Thr Gly 1325 1330 1335 Phe Ser Ala Ile Asp Thr Asp Glu Arg Asn Ser Gly Pro Ala Leu 1340 1345 1350 Thr Glu Ser Leu Val Gln Thr Leu Val Lys Asn Arg Thr Phe Ser 1355 1360 1365 Gly Ser Leu Ser His Leu Gly Glu Ser Ser Ser Tyr Gln Gly Thr 1370 1375 1380 Gly Ser Val Gln Phe Pro Gly Asp Gln Asp Leu Arg Phe Ala Arg 1385 1390 1395 Val Pro Leu Ala Leu His Pro Val Val Gly Gln Pro Phe Leu Lys 1400 1405 1410 Ala Glu Gly Ser Ser Asn Ser Val Val His Ala Glu Thr Lys Leu 1415 1420 1425 Gln Asn Tyr Gly Glu Leu Gly Pro Gly Thr Thr Gly Ala Ser Ser 1430 1435 1440 Ser Gly Ala Gly Leu His Trp Gly Gly Pro Thr Gln Ser Ser Ala 1445 1450 1455 Tyr Gly Lys Leu Tyr Arg Gly Pro Thr Arg Val Pro Pro Arg Gly 1460 1465 1470 Gly Arg Gly Arg Gly Val Pro Tyr 1475 1480 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> shRNA for CDK12 <400> 7 tctcctgtgt ctttgtcct 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> shRNA for CDK12 <400> 8 tcaggacact gaagtctct 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CDK12 primer <400> 9 cctggagatg atgacatgga tag 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT1 primer <400> 10 ccgatggtgg ggtattgtga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT1 primer <400> 11 cccggatttt ggcgtatcag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT3 primer <400> 12 cgtgttagtg tccagggagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT3 primer <400> 13 gcatttgagg tgcatgtggt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IRS1 primer <400> 14 ggtggatgac tctgtggtgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IRS1 primer <400> 15 ggacgctgat ggggttagag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AQP3 primer <400> 16 tgctacctac ccctctggac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AQP3 primer <400> 17 gtcaacaatg gccagcacac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CD74 primer <400> 18 acggcaacta tctgccactc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CD74 primer <400> 19 ctctcacatg gggactgggc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TSPAN8 Primer <400> 20 cccaggagct atgacaagca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TSPAN8 Primer <400> 21 gcactcacac ctgccatttc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGF8 Primer <400> 22 gggtgtctcc caacaggtaa c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGF8 Primer <400> 23 tctgcttcca aaggtgtccg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGF19 Primer <400> 24 gctttcgagg aggagatccg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FGF19 Primer <400> 25 ggggcgaaga gaacatgtca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT5B primer <400> 26 caggagcaca tggcctacat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WNT5B primer <400> 27 ggctgcctat ctgcatgact 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TCF7 Primer <400> 28 acatgcagct atacccaggc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TCF7 Primer <400> 29 actgtcatcg gaaggaacgg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DKK1 Primer <400> 30 gtgcaaatct gtctcgcctg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DKK1 Primer <400> 31 gcacaacaca atcctgaggc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TLE1 primer <400> 32 ccgctgtgac tactctggac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TLE1 primer <400> 33 agggacgaca tccacgagat 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MMP9 Primer <400> 34 cagtccaccc ttgtgctctt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MMP9 Primer <400> 35 cgactctcca cgcatctctg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MYCBP Primer <400> 36 agagctgctt cgcctagaac 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MYCBP Primer <400> 37 ttctcctcct gaggtggttc a 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TWIST Primer <400> 38 cggacaagct gagcaagatt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TWIST Primer <400> 39 ccttctctgg aaacaatgac 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SNAI1 Primer <400> 40 agcctgggtg ccctcaagat g 21 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SNAI1 primer <400> 41 cttggtgctt gtggagcagg gac 23 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH Primer <400> 42 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH Primer <400> 43 gaagatggtg atgggatttc 20

Claims (26)

  1. CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 동반진단용 조성물은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암은 HER2 양성 유방암인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 조성물.
  6. 인간상피성장인자수용체2(HER2) 양성 암 개체로부터 얻은 시료에서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준;을 측정하는 것을 포함하는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암에서의 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 방법은 시료의 CDK12 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높은 경우, 시료를 제공한 개체가 다음 중 하나 이상의 경우에 해당할 가능성에 대한 정보를 제공하는 것을 더 포함하는, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
    CDK12 저해제의 투여가 필요함;
    HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현가능성이 높음;
    HER2 표적치료제에 대한 민감성이 낮음;
    HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후가 불량함; 또는
    HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용투여가 필요함.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준은 형광 핵산 혼성화(FISH), 비교유전체 혼성화법(comparative genomic hybridization, CGH-based array), 단일염기변이 배열(SNP array), 서열조립비교(sequence assembly comparison), 페어-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing), MLPA(multiplex ligation dependent probe amplification) 법, MAPH(multiplex amplifiable probe hybridization) 법, QMPSF(quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments), 미세위성 유전자형 분석(Microsatellite genotyping) 방법, 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학(IHC), 중합효소반응(PCR), 정량적 중합효소반응(qPCR), 정량적 실시간 중합효소반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소반응(Real-time PCR), 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화 및 라이게이스 연쇄 반응(LCR)으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의하여 확인하는 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단(companion diagnostics)용 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 키트는 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2)의 복제(copy)수 또는 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 제제는 CDK12에 상보적이거나 특이적인 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 항체, 압타머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 키트는 HER2 표적치료제의 투여의 필요성; CDK12 저해제의 투여의 필요성; HER2 표적치료제에 대한 약제 저항성의 발현 가능성; HER2 표적치료제에 대한 민감성; HER2 표적치료제에 의한 치료의 예후 예측; 또는 HER2 표적치료제와 CDK12 저해제의 병용 투여의 필요성에 대한 정보를 제공하기 위한 것인, HER2 양성 암에서 HER2 표적치료제에 대한 동반진단용 키트.
  15. CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 CDK12 저해제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 CDK12 저해제는 디나시클립 및 THZ-531로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 HER2 표적치료제와 함께 투여, 또는 HER2 표적치료제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것인, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  19. 제15항에 있어서,
    HER2 표적 치료제는 트라스트주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 트라스트주맙 엠타신(T-DM1, trastuzumab emtansine)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  20. 제15항에 있어서,
    HER2 표적 치료제를 더 포함하는, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체를 치료하기 위한 항암용 약학 조성물.
  21. CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물로,
    상기 CDK12 저해제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이거나, 디나시클립 및 THZ-531로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    HER2 표적 치료제를 더 포함하는, CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, HER2 양성 암을 갖는 개체로서 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물.
  23. CDK12 저해제를 유효성분으로 포함하는, 인간상피성장인자수용체2(Human epidermal growth factor receptor2, HER2) 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 치료 보조용 조성물로,
    상기 CDK12 저해제는 CDK12에 상보적이거나 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이거나, 디나시클립 및 THZ-531로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, HER2 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 치료 보조용 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 조성물은 CDK12의 복제(copy) 수 또는 발현 수준이 기준값(reference value)보다 높으며, HER2 표적치료제에 대해 약물 저항성을 갖거나 가질 것으로 예상되는 개체의 치료를 위한 것인, HER2 양성 암을 갖는 개체의 HER2 표적치료제에 대한 치료 보조용 조성물.
  25. CDK12를 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선용 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 제제 스크리닝용 조성물
  26. 후보물질과 CDK12를 접촉시키는 것, 및
    상기 CDK12의 유전자 복제(copy) 수; mRNA 발현 수준; 또는 단백질 발현 수준;을 감소시키거나, CDK12 단백질 발현을 억제하는 후보물질을 선별하는 것을 포함하는 HER2 표적치료제에 대한 저항성 개선 또는 HER2 표적치료제와 병용투여용 물질을 스크리닝하는 방법.
KR1020190013863A 2019-02-01 2019-02-01 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도 Active KR102338510B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190013863A KR102338510B1 (ko) 2019-02-01 2019-02-01 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도
US16/778,237 US12037646B2 (en) 2019-02-01 2020-01-31 Companion diagnostic biomarker for anti-HER2 therapy and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190013863A KR102338510B1 (ko) 2019-02-01 2019-02-01 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200095902A true KR20200095902A (ko) 2020-08-11
KR102338510B1 KR102338510B1 (ko) 2021-12-13

Family

ID=71837320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190013863A Active KR102338510B1 (ko) 2019-02-01 2019-02-01 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
US (1) US12037646B2 (ko)
KR (1) KR102338510B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022177341A1 (ko) * 2021-02-18 2022-08-25 ㈜베르티스 항암제에 대한 내성 진단용 조성물

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202100017414A1 (it) * 2021-07-01 2023-01-01 Fondazione St Italiano Tecnologia Marcatore di danno del dna in prossimita' di loci genomici trascritti e metodi per identificare e/o quantificare tali danni del dna
WO2023107705A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Incyte Corporation Bicyclic amines as cdk12 inhibitors
KR102615451B1 (ko) 2022-07-14 2023-12-20 사회복지법인 삼성생명공익재단 Her2 양성 유방암 치료 예후 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016201370A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy of transcription inhibitors and kinase inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201605126D0 (en) * 2016-03-24 2016-05-11 Univ Nottingham Inhibitors and their uses

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016201370A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy of transcription inhibitors and kinase inhibitors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mol Cancer Ther, 17(1): 306-315 (2017.11.13.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022177341A1 (ko) * 2021-02-18 2022-08-25 ㈜베르티스 항암제에 대한 내성 진단용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US12037646B2 (en) 2024-07-16
KR102338510B1 (ko) 2021-12-13
US20200248271A1 (en) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1751309B1 (en) Methods for prediction of clinical outcome to epidermal growth factor receptor inhibitors by cancer patients
JP2022125079A (ja) がん転移の予後診断および処置のための方法
US20230366035A1 (en) Biomarker for her2-positive cancer and anti-her2 therapy and applications thereof
Liu et al. EREG-driven oncogenesis of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma exhibits higher sensitivity to Erlotinib therapy
CN105980576B (zh) 用于源自乳腺癌的骨转移癌的预后和治疗的方法
EP3430163A1 (en) Gene signatures for cancer detection and treatment
KR20150122731A (ko) 암 전이의 예후 및 치료 방법
KR102338510B1 (ko) 항-her2 치료제에 대한 동반진단 마커 및 이의 용도
WO2009015233A2 (en) Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
JP2020517273A (ja) 膜貫通ドメインまたは膜近傍ドメインにおけるＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２突然変異
EP3030577B1 (en) Novel nrg1 fusion genes in cancer
TW201726140A (zh) 治療癌症之新型生物標記及方法
WO2010040083A2 (en) Gene expression predictors of chemoresistance
US8216783B2 (en) Over-expression and mutation of a tyrosine kinase receptor FGFR4 in tumors
CN105659085A (zh) 预测受试者对多激酶抑制剂的反应的基因表达标志及其使用方法
CN101688243A (zh) 抗her2-靶向治疗中脂质激酶和与所述脂质激酶相关的信号转导途径的参与
KR20140098834A (ko) 암에서의 erbb3 돌연변이
Shaban et al. Human blood serum counteracts EGFR/HER2-Targeted drug lapatinib impact on squamous carcinoma SK-BR-3 cell growth and gene expression
US10167516B2 (en) Six-gene biomarker of survival and response to platinum based chemotherapy in serious ovarian cancer patients
CN106573967A (zh) 表皮生长因子受体基因的胞外域iii中的突变
CN111910005B (zh) Cdk4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用
KR20190051744A (ko) Egfr 저해제 저항성 암 치료제
Quinlan et al. High Expression of NTRK1 in ETV6:: RUNX1 Positive Acute Lymphoblastic Leukaemia Drives Factor Independence and Sensitivity to Larotrectinib
KR101797354B1 (ko) Ｅｉ２４의 신규 용도
KR20230064502A (ko) 상피 나트륨 채널 관련 유전자들의 자궁경부암 진단 또는 예후 예측 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

R15-X000 Change to inventor requested

St.27 status event code: A-3-3-R10-R15-oth-X000

R16-X000 Change to inventor recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R16-oth-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

U11 Full renewal or maintenance fee paid

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-4-4-U10-U11-OTH-PR1001 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Year of fee payment: 5

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000