근위축증은 운동, 심장 근육, 및 평활근을 제어하는 골격근 또는 수의근과 같은 근육 질량의 손실 또는 근육의 점진적인 약화 및 퇴행이다. 불용, 기아, 암, 당뇨병, 및 신부전 또는 글루코코르티코이드 치료를 포함한 다양한 병리 생리학적 상태는 근위축증 및 근력 감소를 초래한다. 근위축증의 표현형 효과는 근육 단백질 합성의 억제, 근육 단백질의 회전율 상승, 위성 세포 분화의 비정상적인 조절, 및 근섬유 형태의 비정상적인 전환을 포함하여 다양한 분자 사건에 의해 유발된다.
광범위한 연구는 근위축증이 특정 신호 전달 경로 및 전사 프로그램에 의해 제어되는 활성 과정임을 확인하였다. 이 과정에 수반되는 예시적인 경로는 IGF1-Akt-FoxO, 글루코코르티코이드-GR, PGC1α-FoxO, TNFα-NFκB, 및 미오스타틴-ActRIIb-Smad2/3을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 근위축증을 조절하는 메카니즘의 치료적 조작은 IGF1-Akt, TNFα-NFκB, 및 미오스타틴에 집중되어있다. IGF1 유사체가 근위축증을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났지만, 종양 형성 및 비대를 촉진하는 데 있어 IGF1-Akt 경로의 관여는 이들 요법을 방해한다. Akt-mTOR 경로의 조절을 위한 β-아드레날린 아고니스트의 사용에 있어 유사한 위험이 수반된다. 가용성 ActRIIB 또는 리간드 차단 ActRIIb 항체를 사용한 미오스타틴의 억제는 골격근 손실을 예방하고 역전시키고, 종양 보유 동물의 생존을 연장시켰다. 그러나 미오스타틴 차단의 위축 방지 효과의 메커니즘은 우성 음성 ActRIIb의 발현 또는 Smad2/3의 녹다운이 탈신경 후 근육 손실을 막지 않았기 때문에 확실하지 않다(Satori et al., "Smad2 and 3 transcription factors control muscle mass in adulthood" Am J Physiol Cell Physiol 296: C1248-C1257, 2009).
근위축증의 다른 모델(당뇨병, 암 악액질, 만성 신부전, 단식 및 탈신경 포함)에서 유전자 발현을 비교하여 위축성 근육에서 일반적으로 상향 또는 하향 조절되는 아트로젠으로 명명된 위축 관련 유전자를 확인하였다(Sacheck et al., "Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases", The FASEB Journal, 21(1): 140-155, 2007). 위축 상태에서 강하게 상향 조절되는 유전자 중에는 근육 특이적 유비퀴틴 단백질(E3) 리가아제(예를 들어, 아트로진-1, MuRF1), 포크헤드 박스 전사 인자, 및 스트레스 반응을 매개하는 단백질이 있다. 일부 경우에, 이들 이펙터 단백질 중 다수가 전통적인 약물을 사용하여 조절하기 어렵다.
핵산(예를 들어, RNAi) 요법은 선택성 및 특이성이 높은 표적화 요법이다. 그러나 일부 경우에, 핵산 요법은 또한 세포 내 흡수 불량, 제한된 혈액 안정성 및 비특이적 면역 자극에 의해 방해받는다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 예를 들어 더 우수한 안정화 및/또는 더 낮은 독성을 위한 신규 링커, 증가된 표적 특이성 및/또는 표적 전달을 위한 결합 모이어티의 최적화, 및 안정성 향상 및/또는 목표 외 효과 감소를 위한 핵산 중합체 변형과 같은 핵산 조성물의 다양한 변형이 탐구된다.
일부 실시 양태에서, 핵산 조성물을 구성하는 상이한 성분의 배열 또는 순서는 세포 내 흡수, 안정성, 독성, 효능, 및/또는 비특이적 면역 자극에 추가로 영향을 미친다. 예를 들어, 핵산 성분이 결합 모이어티, 중합체, 및 폴리핵산 분자(또는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 결합 모이어티, 중합체, 및/또는 폴리핵산 분자(또는 폴리뉴클레오티드)의 순서 또는 배열(예를 들어, 결합 모이어티-폴리핵산 분자-중합체, 결합 모이어티-중합체-폴리핵산 분자, 또는 중합체-결합 모이어티-폴리핵산 분자)는 세포 내 흡수, 안정성, 독성, 효능 및/또는 비특이적 면역 자극에 추가로 영향을 미친다.
일부 실시 양태에서, 근위축증 또는 근긴장성 이영양증의 치료를 위한 폴리핵산 분자 및 폴리핵산 분자 접합체가 본원에 기재된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체는 세포 내 흡수, 안정성 및/또는 효능을 향상시킨다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 접합체는 화학식 (I) A-X1-B-X2-C의 분자를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 하나 이상의 아트로젠의 표적 서열에 혼성화한다.
본원에 기재된 추가의 실시 양태는 근위축증 또는 근긴장성 이영양증의 치료 방법으로서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 폴리핵산 분자 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
아트로젠
아트로젠, 또는 위축 관련 유전자는 위축 근육에서 상향 조절되거나 하향 조절되는 유전자이다. 일부 경우에, 상향 조절되는 아트로젠은 유비퀴틴 리가아제를 코딩하는 유전자, 포크헤드 박스 전사 인자, 성장 인자, 탈유비퀴틴화 효소, 또는 글루코코르티코이드 유발 위축에 관여하는 단백질을 포함한다.
유비키틴
리가아제
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 E3 유비퀴틴 리가아제를 코딩한다. 예시적인 E3 유비퀴틴 리가아제는 아트로진-1/MAFbx, 근육 RING 핑거 1(MuRF1), TNF 수용체 어댑터 단백질 6(TRAF6), F-Box 단백질 30(Fbxo30), F-Box 단백질 40(Fbxo40), 신경 전구체 세포 발현되는 발생적으로 하향 조절되는 단백질 4(Nedd4-1), 및 트리파타이트(tripartite) 모티프-함유 단백질 32(Trim32)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 미토콘드리아 유비퀴틴 리가아제에는 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 단백질 리가아제 1(Mul1) 및 Hsc70 상호 작용 단백질의 카르복시 말단(CHIP: carboxy terminus of Hsc70 interacting protein)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 F-Box 단백질 패밀리의 구성원인 근위축증 F-Box(MAFbx)로도 명명된 아트로진-1을 코딩한다. 아트로진-1/MAFbx는 근육 전사 인자 MyoD, 및 진핵 생물 번역 개시 인자 3 서브 유닛 F(eIF3-f)의 분해를 촉진하는 유비퀴틴 리가아제 복합체 SKP1-쿨린-F-box(SCF)의 4개의 서브 유닛 중 하나이다. 아트로진-1/MAFbx는 FBXO32에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 근육 RING 핑거 1(MuRF1)을 코딩한다. MuRF1은 근육 특이적 RING 핑거 단백질의 구성원이며, 패밀리 구성원 MuRF2 및 MuRF3과 함께 근원섬유의 M선 및 Z선 격자에서 발견된다. 또한, 몇몇 연구는 MuRF1이 트로포닌 I, 미오신 중쇄, 액틴, 미오신 결합 단백질 C, 및 미오신 경쇄 1 및 2와 같은 근육 구조 단백질과 상호작용하고/거나 이들의 반감기를 조절하는 것으로 밝혀졌다. MuRF1은 TRIM63에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 TNF 수용체 어댑터 단백질 6(TRAF6)(인터루킨-1 신호 전달 인자, RING 핑거 단백질 85, 또는 RNF85로도 알려짐)을 코딩한다. TRAF6은 표적 단백질에 Lys63 연결된 폴리유비퀴틴 쇄의 접합을 매개하는 E3 리가아제의 구성원이다. Lys63 연결된 폴리유비퀴틴 쇄는 스캐폴드 단백질 p62(SQSTM1)에 의한 자가포식 의존적 카르고(cargo) 인식을 신호 전달한다. TRAF6은 TRAF6 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 F-Box 단백질 30(Fbxo30)(F-Box 단독 단백질, 헬리카제, 18; 아트로피-1에서 SCF 복합체의 근육 유비퀴틴 리가아제; 또는 MUSA1로도 알려짐)을 코딩한다. Fbxo30은 E3 유비퀴틴 리가아제의 SCF 복합체 패밀리의 구성원이다. 한 연구에서, Fbox30은 골 형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 경로에 의해 억제되고 위축 유발 조건에서 상향 조절되고, 이후 자가 유비퀴틴화를 거치는 것으로 제안된다. Fbxo30은 FBXO30 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 F-Box 단백질 40(Fbxo40)(F-Box 단독 단백질 40 또는 근육 질환 관련 단백질로도 알려짐)을 코딩한다. E3 유비퀴틴 리가아제의 SCF 복합체 패밀리의 제2 구성원인 Fbxo40은 동화(anabolic) 신호를 조절한다. 일부 경우에, Fbxo40은 인슐린 수용체 매개 신호 전달의 하류 이펙터인 인슐린 수용체 기질 1을 유비퀴틴화하고 이의 분해에 영향을 미친다. Fbxo40은 FBXO40 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 불용 중에 근육 세포에서 상향 조절되는 것으로 나타난 HECT 도메인 E3 유비퀴틴 리가아제인 신경 전구 세포 발현되는 발생적으로 하향 조절되는 단백질 4(Nedd4-1)을 코딩한다. Nedd4-1은 NEDD4 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 트리파타이트 모티프 함유 단백질 32(Trim32)를 코딩한다. Trim32는 액틴, 트로포미오신, 및 트로포닌; α-액티닌; 및 데스민과 같은 얇은 필라멘트의 분해에 관여하는 E3 유비퀴틴 리가아제의 구성원이다. Trim32는 TRIM32 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 단백질 리가아제 1(Mul1)(미토콘드리아 고정 단백질 리가아제, RING 핑거 단백질 218, RNF218, MAPL, MULAN, 및 GIDE로도 알려짐)을 코딩한다. Mul1은 미토콘드리아 네트워크 리모델링에 관여하며, 예를 들어, 탈신경 또는 단식과 같은 이화 조건하에서 FoxO 패밀리의 전사 인자에 의해 상향 조절되며, 이어서 자가포식(미토파지(mitophagy))을 통한 미토콘드리아 단편화 및 제거를 야기한다. 또한, Mul1은 미토콘드리아 융합에 관여하는 GTPase인 미토콘드리아 프로-융합(pro-fusion) 단백질 미토푸신(mitofusin) 2를 유비퀴틴화하여, 미토푸신 2의 분해를 초래한다. Mul1은 MUL1 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 Hsc70 상호 작용 단백질의 카르복시 말단(CHIP)(STIP1 상동성 및 U-Box 함유 단백질 1, STUB1, CLL 관련 항원 KW-8, 항원 NY-CO-7, SCAR16, SDCCAG7, 또는 UBOX1로도 알려짐)을 코딩한다, CHIP는 Z선에서 발견되는 근육 단백질인 필라민 C의 유비퀴틴화 및 리소좀 의존성 분해를 조절하는 미토콘드리아 유비퀴틴 리가아제이다. Z선 또는 Z-디스크는 인접한 근섬유 분절 사이에 형성된 구조이며 근섬유 분절은 근육의 기본 단위이다. 필라민 구조의 변경은 CHIP와 샤페론 Hsc70 및 HspB8을 포함하는 복합체인 코-샤페론 BAG3의 결합을 유발한다. CHIP에 의한 BAG3 및 필라민의 후속 유비퀴틴화는 자가포식 시스템을 활성화시켜 필라민 C의 분해를 초래한다. CHIP는 STUB1 유전자에 의해 코딩된다.
포크헤드
박스 전사 인자
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 포크헤드 박스 전사 인자를 코딩한다. 예시적인 포크헤드 박스 전사 인자는 아이소형 포크헤드 박스 단백질 O1(FoxO1) 및 포크헤드 박스 단백질 O3(FoxO3)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 포크헤드 박스 단백질 O1(FoxO1)(횡문근육종에서 포크헤드 상동체, FKHR, 또는 FKH1)로도 알려짐)을 코딩한다. FoxO1은 인슐린 신호 전달에 의한 포도당 신생 합성 및 글리코겐 분해의 조절, 및 전지방세포(preadipocyte)에 의한 지방 생성의 개시에 관여한다. FoxO1은 FOXO1 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 포크헤드 박스 단백질 O3(FoxO3)(횡문근육종에서의 포크헤드 유사 1, FKHRL1 또는 FOXO3A로도 알려짐)을 코딩한다. FoxO3은 AMP 활성화된 단백질 키나아제 AMPK에 의해 활성화되는데, 이는 차례로 아트로진-1 및 MuRF1의 발현을 유도한다. FoxO3은 FOXO3 유전자에 의해 코딩된다.
성장 인자
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 성장 인자를 코딩한다. 예시적인 성장 인자는 미오스타틴을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 아트로젠은 성장/분화 인자 8(GDF-8)로도 알려진 미오스타틴(Mstn)을 코딩한다. 미오스타틴은 세포 내에서 활성화 인자로 전환되고, Smad(small mothers against decapentaplegic)의 인산화/활성화를 통해 Akt를 억제함으로써 근육 분해를 자극하고 근육 합성을 억제한다. 일부 경우에, 미오스타틴은 Akt-FoxO 신호 전달 경로에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. 추가의 경우에, 미오스타틴은 위성 세포의 분화를 억제하고, Akt 경로의 억제를 통해 근육 분해를 자극하고, mTOR 경로를 통한 근육 합성을 억제하는 것으로 나타났다.
탈유비퀴틴화
효소
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 탈유비퀴틴화 효소를 코딩한다. 예시적인 탈유비퀴틴화 효소는 유비퀴틴 특이적 펩티다제 14(USP14) 및 유비퀴틴 특이적 펩티다제 19(USP19)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 아트로젠은 USP14(탈유비퀴틴화 효소 14 또는 TGT로도 알려짐)를 코딩한다. 다른 경우에, 본원에 기재된 아트로젠은 USP19(아연 핑거 MYND 도메인 함유 단백질 9, 탈유비퀴틴화 효소 19, 또는 ZMYND9로도 알려짐)를 코딩한다. USP14는 USP14 유전자에 의해 코딩된다. USP19는 USP19 유전자에 의해 코딩된다.
추가의 아트로젠
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 DNA 손상 유발성 전사체 4(DDIT4) 및 HIF-1 반응성 단백질 RTP801로도 알려진 Redd1(regulated in development and DNA damage response 1)을 코딩한다. Redd1은 14-3-3을 격리시켜 mTOR 기능을 억제하고 TSC1/2 활성을 증가시킨다. 또한, Redd1은 근육 단백질 합성에 관여하는 4E-BP1 및 S6K1의 인산화를 감소시킨다. Redd1은 DDIT4 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 카텝신 V로도 알려진 카텝신 L2를 코딩한다. 카텝신 L2는 리소좀 시스테인 프로테이나제이다. 이는 CTSL2 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 TG 상호 작용 인자, 또는 호 메오 박스 단백질 TGIF1을 코딩한다. TG 상호 작용 인자는 배아 발생에 관여하는 신호 전달 경로를 조절하는 전사 인자이다. 이 단백질은 TGIF 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 근원성 인자 4로도 알려진 미오게닌을 코딩한다. 골격근 발생 및 복구의 조정에 관여하는 근육 특이적 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH: basic-helix-loop-helix) 전사 인자의 MyoD 패밀리의 구성원이다. 미오게닌은 MYOG 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 MDPK(myotonic dystrophy-protein kinase: 근긴장성 이영양증 단백질 키나아제) 또는 DMK(dystrophia myotonica protein kinase: 근긴장성 이영양증 단백질 키나아제)로도 알려진 미오토닌 단백질 키나아제(MT-PK: myotonin-protein kinase)를 코딩한다. MT-PK는 세린/트레오닌 키나아제이며, GTPase의 Rho 패밀리의 구성원과 추가로 상호 작용한다. 인간에서, MT-PK는 DMPK 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 히스톤 데아세틸라제 패밀리의 구성원인 히스톤 데아세틸라제 2를 코딩한다. 히스톤 데아세틸라제 2는 HDAC2 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 히스톤 데아세틸라제 패밀리의 다른 구성원인 히스톤 데아세틸라제 3을 코딩한다. 히스톤 데아세틸라제 3은 HDAC3 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 메탈로티오네인 패밀리의 구성원인 메탈로티오네인 1L을 코딩한다. 메탈로티오네인(MT)은 중금속에 결합하여 금속 독성 및/또는 산화 스트레스로부터 보호할 수 있는 시스테인 풍부한 저 분자량 단백질이다. 메탈로티오네인 1L은 MT1L 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 메탈로티오네인 패밀리의 제2 구성원인 메탈로티오네인 1B를 코딩한다. 메탈로티오네인 1B는 MT1B 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 아트로젠은 표 14에 열거된 아트로젠이다.
폴리핵산 분자
특정 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 위축증 관련 유전자(아트로젠이라고도 지칭함)의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 유비퀴틴 리가아제(예를 들어, E3 유비퀴틴 리가아제 또는 미토콘드리아 유비퀴틴 리가아제)의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 포크헤드 박스 전사 인자의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 성장 인자의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 탈유비퀴틴화 효소의 표적 서열에 혼성화한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FBXO32, TRIM63, TRAF6, FBXO30, FBXO40, NEDD4, TRIM32, MUL1, STUB1, FOXO1, FOXO3, MSTN, USP14, USP19, DDIT4, CTSL2, TGIF, MYOG, HDAC2, HDAC3, MT1L, MT1B , 또는 DMPK의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FBXO32, TRIM63, FOXO1, FOXO3, 또는 MSTN의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FBXO32의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 TRIM63의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 TRAF6의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FBXO30의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FBXO40의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 NEDD4의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 TRIM32의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 MUL1의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 STUB1의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FOXO1의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 FOXO3의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 MSTN의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 USP14의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 USP19의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 DDIT4의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 CTSL2의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 TGIF의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 MYOG의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 HDAC2의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 HDAC3의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 MT1L의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 MT1B의 표적 서열에 혼성화한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 DMPK의 표적 서열에 혼성화한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 28-141 및 370-480에 제시된 바와 같은 표적 서열로 이루어진다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 서열 번호 703-3406에 제시된 바와 같은 표적 서열로 이루어진다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 142-255, 256-369, 481-591, 592-702, 및 3407-14222에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 142-255, 256-369, 481-591, 592-702, 및 3407-14222에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 번호 142-255, 481-591, 3407-6110, 및 8815-11518에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 256-369, 592-702, 6111-8814, 및 11519-14222에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥(예를 들어, 패신저 가닥) 및 안티센스 가닥(예를 들어, 가이드 가닥)을 포함한다. 일부 경우에서, 센스 가닥(예를 들어, 패신저 가닥)은 서열 번호 142-255, 481-591, 3407-6110, 및 8815-11518에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 안티센스 가닥(예를 들어, 가이드 가닥)은 서열 번호 256-369, 592-702, 6111-8814, 및 11519-14222에 제시된 바와 같은 표적 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 RNA 또는 DNA를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 운반 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 또는 이형 핵 RNA(hnRNA)를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 shRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 miRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 dsRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 tRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 rRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 hnRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 siRNA를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 siRNA를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 19 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 18 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 17 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 16 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 15 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 14 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 13 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 12 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 11 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10 내지 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 15 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 12 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 패신저 가닥이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시 양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22 뉴클레오티드 길이이다.
일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 19 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 18 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 17 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 16 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 15 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 14 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 13 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 12 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 11 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 15 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제1 폴리뉴클레오티드는 약 12 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 제2 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 25, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 23, 또는 약 20 내지 약 22 뉴클레오티드 길이이다.
일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 19 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 18 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 17 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 16 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 15 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 14 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 13 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 12 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 11 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 45 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 35 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 15 내지 약 25 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 제2 폴리뉴클레오티드는 약 12 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 평활 말단, 오버행, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 평활 말단은 5' 평활 말단, 3' 평활 말단 또는 둘 다이다. 일부 경우에, 오버행은 5' 오버행, 3' 오버행, 또는 둘 다이다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-염기쌍(non-base pairing) 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1, 2, 3 또는 4개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 1개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 2개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 3개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 오버행은 4개의 비-염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.5% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 50% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 60% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 70% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 80% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 90% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 95% 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 적어도 99% 상보적이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열 대해 100% 상보적이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열과 5개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열과 4개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열과 3개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열과 2개 이하의 불일치를 갖는다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자의 서열은 본원에 기재된 표적 서열과 1개 이하의 불일치를 갖는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 표적 서열에 혼성화하는 폴리핵산 분자의 특이성은 표적 서열에 대해 폴리핵산 분자의 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 서열 상보성이다. 일부 경우에, 혼성화는 엄격한 혼성화 조건이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 표적 외 효과가 감소된다. 일부 경우에, "표적 외" 또는 "표적 외 효과"는 주어진 표적에 대한 폴리핵산 중합체가 다른 mRNA 서열, DNA 서열 또는 세포 단백질 또는 다른 모이어티와 직접 또는 간접적으로 상호 작용함으로써 의도하지 않은 효과를 야기하는 모든 경우를 지칭한다. 일부 경우에, "표적 외 효과"는 다른 전사체와 폴리핵산 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥 사이의 부분적 상동성 또는 상보성으로 인해 다른 전사체가 동시에 분해될 때 발생한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 천연 또는 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 DNA, RNA 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 합성 또는 인공 뉴클레오티드 유사체 또는 염기는 리보오스 모이어티, 포스페이트 모이어티, 뉴클레오시드 모이어티 또는 이들의 조합의 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 인공 뉴클레오티드 염기는 리보오스 모이어티의 2' 히드록실 기에서 변형을 갖는 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 변형은 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN을 포함하며, 여기서 R은 알킬 모이어티이다. 예시적인 알킬 모이어티는 할로겐, 황, 티올, 티오에테르, 티오에스테르, 아민(1차, 2차, 또는 3차), 아미드, 에테르, 에스테르, 알코올 및 산소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 알킬 모이어티는 변형을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 변형은 아조 기, 케토 기, 알데히드 기, 카르복실 기, 니트로 기, 니트로소, 기, 니트릴 기, 헤테로사이클(예를 들어, 이미다졸, 히드라지노 또는 히드록실아미노) 기, 이소시아네이트 또는 시아네이트 기, 또는 황 함유 기(예를 들어, 술폭시드, 술폰, 술피드 및 디술피드)를 포함한다. 일부 경우에, 알킬 모이어티는 헤테로 치환을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 헤테로시클릭 기의 탄소는 질소, 산소 또는 황으로 치환된다. 일부 경우에, 헤테로시클릭 치환은 모르폴리노, 이미다졸, 및 피롤리디노를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 2'히드록실 기에서의 변형은 2'-O-메틸 변형 또는 2'-O-메톡시 에틸(2'-O-MOE) 변형이다. 일부 경우에, 2'-O-메틸 변형은 리보오스 모이어티의 2'히드록실 기에 메틸기를 추가하는 반면, 2'O-메톡시에틸 변형은 리보오스 모이어티의 2' 히드록실 기에 메톡시에틸 기를 추가한다. 아데노신 분자의 2'-O-메틸 변형 및 우리딘의 2'O-메톡시에틸 변형의 예시적인 화학 구조는 하기에 도시한다.
일부 경우에, 2' 히드록실 기에서의 변형은 프로필 링커를 포함하는 연장된 아민 기가 아민 기를 2' 산소에 결합시키는 2'-O-아미노프로필 변형이다. 일부 경우에, 이 변형은 당마다 아민 기로부터 하나의 양전하를 도입함으로써 올리고뉴클레오티드 분자의 포스페이트 유래의 전체 음전하를 중화시켜 그의 양쪽이온성 특성으로 인해 세포 흡수 특성을 개선시킨다. 2'-O-아미노프로필 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 예시적인 화학 구조는 하기에 도시한다.
일부 경우에, 2' 히드록실 기에서의 변형은 2' 탄소에 결합된 산소 분자가 메틸렌 기에 의해 4' 탄소에 연결된 잠금 또는 가교된 리보오스 변형(예를 들어, 잠금 핵산 또는 LNA)이며, 이에 따라 2'-C, 4'C-옥시-메틸렌-연결된 비시클릭 리보뉴클레오티드 단량체를 형성한다. LNA의 화학 구조의 예시적인 표현은 아래에 도시한다. 왼쪽에 나타낸 표현은 LNA 단량체의 화학적 연결성을 강조한다. 우측에 나타낸 표현은 LNA 단량체의 푸라노오스 고리의 잠금된 3'-엔도(3E) 입체 구조를 강조한다.
일부 경우에, 2' 히드록실 기에서의 변형은, 예를 들어 2'-4'-에틸렌-가교된 핵산과 같은 에틸렌 핵산(ENA)을 포함하며, 이는 당 입체 구조를 C3'-엔도 당 주름 입체 구조로 잠근다. ENA는 LNA를 또한 포함하는 변형된 핵산의 가교된 핵산 부류의 일부이다. ENA 및 가교된 핵산의 예시적인 화학 구조는 하기에 도시한다.
일부 실시 양태에서, 2' 히드록실 기에서의 추가 변형은 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 뉴클레오티드 유사체는 변형된 염기, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 5-프로피닐우리딘, 5-프로피닐시티딘, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, N,N,-디메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-프로필구아닌, 2-아미노아데닌, 1-메틸이노신, 3-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘 및 5번 위치에 변형을 갖는 다른 뉴클레오티드, 5-(2-아미노) 프로필 우리딘, 5-할로시티딘, 5-할로우리딘, 4-아세틸시티딘, 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, 3-메틸시티딘, 6-메틸우리딘, 2-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2,2-디메틸구아노신, 5-메틸아미노에틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 데아자뉴클레오티드 예컨대 7-데아자-아데노신, 6-아조우리딘, 6-아조시티딘, 6-아조티미딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 다른 티오 염기 예컨대 2-티오우리딘 및 4-티오우리딘 및 2-티오시티딘, 디히드로우리딘, 슈도우리딘, 큐오신, 아케오신, 나프틸 및 치환된 나프틸 기, 임의의 O- 및 N-알킬화 퓨린 및 피리미딘 예컨대 N6-메틸아데노신, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐 및 변형된 페닐 기 예컨대 아미노페놀 또는 2,4,6-트리메톡시 벤젠, G-클램프 뉴클레오티드로서 작용하는 변형된 시토신, 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-치환된 우라실 및 티민, 아자피리미딘, 카르복시히드록시알킬 뉴클레오티드, 카르복시알킬아미노알킬 뉴클레오티드, 및 알킬카르보닐알킬화 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 당 모이어티와 관련하여 변형된 뉴클레오티드뿐만 아니라 리보실이 아닌 당 또는 이의 유사체를 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 당 모이어티는 일부 경우에, 만노오스, 아라비노오스, 글루코피라노오스, 갈락토피라노오스, 4'-티오리보오스, 및 다른 당, 헤테로사이클 또는 카르보사이클이거나 이들을 기반으로 한다. 용어 뉴클레오티드는 또한 당 업계에 보편적 염기로 알려진 것을 포함한다. 예로서, 보편적 염기는 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, 또는 네불라린을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 뉴클레오티드 유사체는 모르폴리노, 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA), 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 모르폴리노 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고(PMO)는 그의 구조가 일반 당 및 포스페이트 구조에서 벗어나 천연 핵산 구조를 모방하는 합성 분자를 포함한다. 일부 경우에, 5원 리보오스 고리는 4개의 탄소, 1개의 질소 및 1개의 산소를 함유하는 6원 모르폴리노 고리로 치환된다. 일부 경우에, 리보오스 단량체는 포스페이트 기 대신에 포르포르디아미데이트 기에 의해 연결된다. 이러한 경우에, 골격 변경은 모든 양전하 및 음전하를 제거하여, 모르폴리노를 하전된 올리고뉴클레오티드에 의해 사용되는 것과 같이 세포 전달제의 도움없이 세포막을 통과할 수 있는 중성 분자로 만든다.
일부 실시 양태에서, 펩티드 핵산(PNA)은 당 고리 또는 포스페이트 연결을 함유하지 않으며, 염기는 올리고글리신 유사 분자에 의해 부착되고 적절히 이격되어, 골격 전하를 제거한다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 변형은 경우에 따라 뉴클레오티드간 연결에서 발생한다. 일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 5'-알킬렌포스포네이트, 5'-메틸포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 보론트리플루오리데이트, 3'-5'연결 또는 2'-5'연결의 보라노 포스페이트 에스테르 및 셀레노포스페이트, 포스포트리에스테르, 티오노알킬포스포트리에스테르, 하이드로젠 포스페이트 연결, 알킬 포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 아릴포스포노티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 3'-알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 포스포로피페라지데이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 케톤, 술폰, 술폰아미드, 카르보네이트, 카르바메이트, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 티오아미데이트, 리보아세틸 기에 의한 연결, 아미노에틸 글리신, 실릴 또는 실록산 연결; 예를 들어, 포화되거나 불포화되고/되거나 치환되고/되거나 헤테로원자를 함유하는 1 내지 10개의 탄소의 헤테로원자를 갖거나 갖지 않는 알킬 또는 시클로알킬 연결; 염기가 백본의 아자 질소에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 모르폴리노 구조, 아미드, 또는 폴리아미드를 갖는 연결; 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드(PS ASO)는 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 예시적인 PS ASO는 하기에 도시한다.
일부 경우에, 변형은 메틸포스포네이트 또는 티올포스포네이트 변형과 같은 메틸 또는 티올 변형이다. 예시적인 티올포스포네이트 뉴클레오티드(왼쪽) 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드(오른쪽)는 아래에 도시한다.
일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드는 다음과 같이 도시되는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
일부 경우에, 변형된 뉴클레오티드는 하기와 같이 도시된 헥시톨 핵산(또는 1',5'-언히드로헥시톨 핵산(HNA))을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 변형은 경우에 따라 리보오스 모이어티, 포스페이트 골격 및 뉴클레오시드의 변형, 또는 3 '또는 5' 말단에서의 뉴클레오티드 유사체의 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 3' 말단은 경우에 따라 3' 양이온성 기를 포함하거나, 역위에 의해 3' 말단에서 3'-3' 연결을 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 다른 대안에서, 3' 말단은 경우에 따라 아미노알킬 기, 예를 들어 3' C5-아미노알킬 dT와 접합된다. 추가의 대안에서, 3' 말단은 경우에 따라 무염기 부위, 예를 들어 아퓨린성 또는 아피리미딘성 부위와 접합된다. 일부 경우에, 5' 말단은 아미노알킬 기, 예를 들어 5'-O-알킬아미노 치환기와 접합된다. 일부 경우에, 5' 말단은 무염기 부위, 예를 들어 아퓨린성 또는 아피리미딘성 부위와 접합된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 하나 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 이상의 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인공 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 이상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 이상의 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25개 이상의 티올포스포네이트 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 5% 내지 약 100% 변형, 약 10% 내지 약 100% 변형, 약 20% 내지 약 100% 변형, 약 30% 내지 약 100% 변형, 약 40% 내지 약 100% 변형, 약 50% 내지 약 100% 변형, 약 60% 내지 약 100% 변형, 약 70% 내지 약 100% 변형, 약 80% 내지 약 100% 변형, 및 약 90% 내지 약 100% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 90% 변형, 약 20% 내지 약 90% 변형, 약 30% 내지 약 90% 변형, 약 40% 내지 약 90% 변형, 약 50% 내지 약 90% 변형, 약 60% 내지 약 90% 변형, 약 70% 내지 약 90% 변형, 및 약 80% 내지 약 100% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 80% 변형, 약 20% 내지 약 80% 변형, 약 30% 내지 약 80% 변형, 약 40% 내지 약 80% 변형, 약 50% 내지 약 80% 변형, 약 60% 내지 약 80% 변형, 및 약 70% 내지 약 80% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 70% 변형, 약 20% 내지 약 70% 변형, 약 30% 내지 약 70% 변형, 약 40% 내지 약 70% 변형, 약 50% 내지 약 70% 변형, 및 약 60% 내지 약 70% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 60% 변형, 약 20% 내지 약 60% 변형, 약 30% 내지 약 60% 변형, 약 40% 내지 약 60% 변형, 및 약 50% 내지 약 60% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 50% 변형, 약 20% 내지 약 50% 변형, 약 30% 내지 약 50% 변형, 및 약 40% 내지 약 50% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 40% 변형, 약 20% 내지 약 40% 변형, 및 약 30% 내지 약 40% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 30% 변형, 및 약 20% 내지 약 30% 변형 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 10% 내지 약 20% 변형을 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 약 15% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 40% 내지 약 60% 변형을 포함한다.
추가 경우에, 폴리핵산 분자는 적어도 약 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 변형을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22개 이상의 변형을 포함한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우에, 약 5 내지 약 100%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 5%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 10%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 15%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 20%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 25%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 30%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 35%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 40%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 45%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 50%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 55%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 60%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 65%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 70%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 75%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 80%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 85%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 90%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 95%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 96%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 97%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 98%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 99%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 약 100%의 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 인공 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 1 내지 약 25개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 1개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 2개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 3개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 4개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 5개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 6개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 7개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 8개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 9개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 10개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 11개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 12개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 13개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 14개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 15개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 16개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 17개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 18개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 19개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 20개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 21개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 22개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 23개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 24개의 변형을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 본원에 기재된 인공 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 약 25개의 변형을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드로부터 조립되며, 여기서 하나의 폴리뉴클레오티드는 폴리핵산 분자의 센스 가닥을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 센스 가닥은 링커 분자를 통해 안티센스 가닥에 연결되며, 링커 분자는 일부 경우에 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'O-메틸피리미딘 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시 양태, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥에 존재하는 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고 여기서 센스 가닥에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.
일부 실시 양태, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 상기 안티센스 가닥에 존재할 때 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고 상기 안티센스 가닥에 존재할 때 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다.
일부 실시 양태, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 상기 안티센스 가닥에 존재할 때 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고 여기서 상기 안티센스 가닥에 존재할 때 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 다에 말단 캡 모이어티를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 말단 캡 모이어티는 역위된 데옥시 무염기 모이어티이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 3' 말단에 포스페이트 골격 변형을 포함한다. 일부 경우에, 포스페이트 골격 변형은 포스포로티오에이트이다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 3' 말단에 글리세릴 변형을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥은 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 약 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 10개 이상, 구체적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 안티센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드는 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 동일하거나 상이한 가닥에 존재하는 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자가 있거나 없이 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 및/또는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로 화학적으로 변형된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 약 1 내지 약 25, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 약 1 내지 25개 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 안티센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드는 약 1 내지 약 25개 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 동일하거나 상이한 가닥에 존재하는 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자가 있거나 없이 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 및/또는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로 화학적으로 변형된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 약 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 약 1 내지 10개 이상, 구체적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 안티센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드는 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 동일하거나 상이한 가닥에 존재하는 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자가 있거나 없이 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 및/또는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로 화학적으로 변형된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 약 1 내지 약 25개 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 및 경우에 따라 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 약 1 내지 25개 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로, 및/또는 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 보편적 염기 변형된 뉴클레오티드, 경우에 따라 안티센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 하나 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드는 약 1 내지 약 5개 이상, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및/또는 동일하거나 상이한 가닥에 존재하는 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 말단 캡 분자가 있거나 없이 2'-데옥시, 2'-O-메틸, 및/또는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드로 화학적으로 변형된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 폴리핵산 분자의 각 가닥에 약 1 내지 약 25, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산 분자이다.
또 다른 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 2'-5' 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 경우에, 2'-5' 뉴클레오티드간 연결(들)은 하나 또는 양쪽 서열 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 존재한다. 또 다른 경우에, 2'-5' 뉴클레오티드간 연결(들)은 하나 또는 양쪽 가닥 내의 여러 다른 위치에 존재하며, 예를 들어, 폴리핵산 분자의 하나 또는 양쪽 가닥에서 피리미딘 뉴클레오티드의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포함하는 모든 뉴클레오티드간 연결은 2'-5' 뉴클레오티드간 연결을 포함하거나, 폴리핵산 분자의 하나 또는 양쪽 가닥에서 퓨린 뉴클레오티드의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포함하는 모든 뉴클레오티드간 연결은 2'-5' 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 세포에서 또는 시험관 내 시스템에서 재구성된, RNAi 활성을 매개하는 단일 가닥 폴리핵산 분자이며, 여기서 폴리핵산 분자는 표적 핵산 서열에 상보성을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 폴리핵산에 존재하는 하나 이상의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 여기서 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이거나 대안적으로 다수의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드임)이고, 여기서 폴리핵산에 존재하는 임의의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드(예를 들어, 여기서 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이거나 대안적으로 다수의 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드임)이고, 말단 캡 변형이 경우에 따라 안티센스 서열의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3'과 5' 말단 둘 다에 존재하고, 폴리핵산 분자는 경우에 따라 폴리핵산 분자의 3' 말단에서 약 1 내지 약 4(예를 들어, 약 1, 2, 3, 또는 4)개의 말단 2'-데옥시뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 말단 뉴클레오티드는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개)의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함하고, 여기서 폴리핵산 분자는 경우에 따라 말단 포스페이트 기, 예컨대 5' 말단 포스페이트 기를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체는 천연 핵산 분자와 비교할 때 예를 들어 리보뉴클레아제, 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제, 예컨대 DNase, 또는 엑소뉴클레아제, 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 대해 내성을 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트, 또는 이들의 조합을 포함하는 인공 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 리보뉴클레아제 예컨대 RNase H, 데옥시리보뉴클레아제 예컨대 DNase, 또는 엑소뉴클레아제 예컨대 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 3'-5' 엑소뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 대해 내성을 갖는다. 일부 경우에, 2'-O-메틸 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-데옥시 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, T-데옥시-2'-플루오로 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, LNA 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, ENA 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, HNA 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 모르폴리노는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, PNA 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제에 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 변형된 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 폴리핵산 분자는 뉴클레아제 내성(예를 들어, RNase H, DNase, 5'-3' 엑소뉴클레아제 또는 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성)이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 5' 접합체는 5'-3'엑소뉴클레오티드 분해성 절단을 억제한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 3' 접합체는 3'-5'엑소뉴클레오티드 분해성 절단을 억제한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-0-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된, LNA, ENA, PNA, HNA, 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 하나 이상의 인공 뉴클레오티드 유사체는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-메틸 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-데옥시 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, T-데옥시-2'-플루오로 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, LNA 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, ENA 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, PNA 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, HNA 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 모르폴리노 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 티올포스포네이트 뉴클레오티드 변형된 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함하는 폴리핵산 분자는 그의 mRNA 표적에 대한 결합 친화도가 동등한 천연 폴리핵산 분자에 비해 증가한다. 일부 경우에, 증가된 친화도는 더 낮은 Kd, 더 높은 용융 온도(Tm), 또는 이들의 조합으로 예시된다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 키랄 순수(또는 입체 순수) 폴리핵산 분자, 또는 단일 거울상 이성질체를 포함하는 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 L-뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 D-뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 조성은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하보다 적은 거울상 이성질체를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 조성은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하보다 적은 라세미 혼합물을 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미국 특허 공개 2014/194610호 및 2015/211006호; 및 PCT 공개 WO2015107425호에 기재된 폴리핵산 분자이다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 앱타머 접합 모이어티를 포함하도록 추가로 변형된다. 일부 경우에, 앱타머 접합 모이어티는 DNA 앱타머 접합 모이어티이다. 일부 경우에, 앱타머 접합 모이어티는 Alphamer(Centauri Therapeutics)이며, 이는 특정 세포 표면 표적을 인식하는 앱타머 부분 및 순환 항체에 부착하기 위한 특정 에피토프를 나타내는 부분을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 미국 특허 제8,604,184호, 제8,591,910호, 및 제7,850,975호에 기재된 바와 같이 앱타머 접합 모이어티를 포함하도록 추가로 변형된다.
추가의 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가 시키도록 변형된다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 RNA(예를 들어, siRNA)이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키기 위해 상기 기재된 하나 이상의 변형에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 2' 히드록실 위치에서, 예컨대 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-0-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형에 의해 또는 잠금 또는 가교된 리보오스 입체 구조(예를 들어, LNA 또는 ENA)에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 2'-O-메틸 및/또는 2'-O-메톡시에틸 리보오스에 의해 변형된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 또한 그의 안정성을 증가시키기 위해 모르폴리노, PNA, HNA, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및/또는 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 키랄 순수(또는 입체 순수) 폴리핵산 분자이다. 일부 경우에, 키랄 순수(또는 입체 순수) 폴리핵산 분자는 그의 안정성을 증가시키기 위해 변형된다. 전달 안정성을 증가시키기 위해 RNA에 대한 적합한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 자기 상보적(self-complementary) 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자이며, 여기서 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 일부분 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 하나는 안티센스 가닥인 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드로부터 조립되며, 여기서 안티센스 및 센스 가닥은 자기 상보적이고(예를 들어, 각각의 가닥은 다른 가닥 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함함; 예컨대 안티센스 가닥과 센스 가닥은 이중체 또는 이중 가닥 구조를 형성하고, 예를 들어 여기서 이중 가닥 영역은 약 19, 20, 21, 22, 23개 이상의 염기쌍임); 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 이의 일부분 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대안적으로, 폴리핵산 분자는 폴리핵산 분자의 자기 상보적 센스 및 안티센스 영역이 핵산계 또는 비핵산계 링커(들)에 의해 연결된 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립된다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 자기 상보적 센스 및 안티센스 영역을 갖는 이중체, 비대칭 이중체, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 이차 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 안티센스 영역은 별개의 표적 핵산 분자 또는 이의 일부분 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 경우에, 폴리핵산 분자는 2개 이상의 루프 구조 및 자기 상보성 및 안티센스 영역을 포함하는 줄기를 갖는 원형 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 일부분 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 여기서 원형 폴리뉴클레오티드는 생체 내 또는 시험관 내에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 폴리핵산 분자를 생성한다. 추가의 경우에, 폴리핵산 분자는 또한 표적 핵산 분자 또는 이의 일부분 내 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하고(예를 들어, 이러한 폴리핵산 분자가 표적 핵산 서열 또는 이의 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 폴리핵산 분자 내에 존재하지 않아도 됨), 여기서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 말단 포스페이트 기, 예컨대 5'-포스페이트(예를 들어, 문헌[Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574 및 Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568] 참조), 또는 5'-3' 디포스페이트를 포함한다.
일부 경우에, 비대칭 헤어핀은 안티센스 영역, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드를 포함하는 루프 부분, 및 센스 영역이 안티센스 영역과 염기쌍을 이루고 루프와 이중체를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드를 갖는 정도로 안티센스 영역보다 적은 뉴클레오티드를 포함하는 센스 영역을 포함하는 선형 폴리핵산 분자이다. 예를 들어, 비대칭 헤어핀 폴리핵산 분자는 세포 또는 시험관 내 시스템에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이(예를 들어, 약 19 내지 약 22 뉴클레오티드)를 갖는 안티센스 영역 및 약 4 내지 약 8 뉴클레오티드를 포함하는 루프 영역, 및 안티센스 영역에 상보적인 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드를 갖는 센스 영역을 포함한다. 일부 경우에, 비대칭 헤어핀 폴리핵산 분자는 또한 화학적으로 변형된 5' 말단 포스페이트 기를 포함한다. 추가 경우에, 비대칭 헤어핀 폴리핵산 분자의 루프 부분은 뉴클레오티드, 비뉴클레오티드, 링커 분자, 또는 접합체 분자를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 비대칭 이중체는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함하는 2개의 별개의 가닥을 갖는 폴리핵산 분자이며, 여기서 센스 영역은 센스 영역이 안티센스 영역과 염기쌍을 이루고 이중체를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드를 갖는 정도로 안티센스 영역보다 적은 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 비대칭 이중체 폴리핵산 분자는 세포 또는 시험관 내 시스템에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이(예를 들어, 약 19 내지 약 22 뉴클레오티드)를 갖는 안티센스 영역 및 안티센스 영역에 상보적인 약 3 내지 약 18 뉴클레오티드를 갖는 센스 영역을 포함한다.
일부 경우에, 보편적 염기는 각각의 천연 DNA/RNA 염기와 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체를 지칭하는데, 이들 사이의 구별은 거의 없다. 보편적 염기의 비제한적 예는 당 업계에 공지된 바와 같이(예를 들어 문헌[Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447] 참조) C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복사미드, 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌. 및 6-니트로인돌을 포함한다.
폴리핵산 분자 합성
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리핵산 분자는 당 업계에 공지된 절차를 사용하여 화학 합성 및/또는 효소 라이게이션 반응을 사용하여 구축된다. 예를 들어, 폴리핵산 분자는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 폴리핵산 분자와 표적 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 천연 발생 뉴클레오티드 또는 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성된다. 예시적인 방법은 미국 특허 제5,142,047호; 제5,185,444호; 제5,889,136호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호; PCT 공개 WO2009099942호; 또는 유럽 공개 1579015호에 기재된 것들을 포함한다. 추가의 예시적인 방법은 문헌[Griffey et al., "2'-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides," J. Med . Chem. 39(26):5100-5109 (1997)); Obika, et al. "Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and cytidine. Novel bicyclic nucleosides having fixed C3-endo sugar puckering". Tetrahedron Letters 38 (50): 8735 (1997); Koizumi, M. "ENA oligonucleotides as therapeutics". Current opinion in molecular therapeutics 8 (2): 144-149 (2006); 및 Abramova et al., "Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities." Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726 (2009)]에 기재된 것들을 포함한다. 대안적으로, 폴리핵산 분자는 안티센스 방향으로 폴리핵산 분자가 서브 클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산된다(즉, 삽입된 폴리핵산 분자로부터 전사된 RNA는 관심의 표적 폴리핵산 분자에 대해 안티센스 방향일 것임).
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 직렬(tandem) 합성 방법론을 통해 합성되며, 여기서 두 가닥은 절단성 링커에 의해 분리된 단일 연속 올리고뉴클레오티드 단편 또는 가닥으로 합성되며, 상기 링커는 후속적으로 절단되어, 혼성화하고 이중체의 정제를 허용하는 별도의 단편 또는 가닥을 제공한다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 또한 2개의 별개의 핵산 가닥 또는 단편으로부터 조립되며, 여기서 하나의 단편은 센스 영역을 포함하고 제2 단편은 분자의 안티센스 영역을 포함한다.
예를 들어, 당, 염기 및 포스페이트 변형을 혼입시키기 위한 추가의 변형 방법은 문헌[Eckstein et al., 국제 공개 PCT WO 92/07065호; Perrault et al. Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken et al. Science, 1991, 253, 314-317; Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci ., 1992, 17, 334-339; Usman et al. 국제 공개 PCT WO 93/15187호; Sproat, 미국 특허 제5,334,711호 및 Beigelman et al., 1995, J. Biol . Chem ., 270, 25702; Beigelman et al., 국제 PCT 공개 WO 97/26270호; Beigelman et al., 미국 특허 제5,716,824호; Usman et al., 미국 특허 제5,627,053호; Woolf et al., 국제 PCT 공개 WO 98/13526호; Thompson et al., 미국 특허 출원 제60/082,404호(1998년 4월 20일 출원), 1998; Karpeisky et al., 1998, Tetrahedron Lett ., 39, 1131; Earnshaw and Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma and Eckstein, 1998, Annu . Rev. Biochem ., 67, 99-134; 및 Burlina et al., 1997, Bioorg . Med . Chem ., 5, 1999-2010]을 포함한다. 이러한 공개물에는 촉매 작용을 조정하지 않고 당, 염기 및/또는 포스페이트 변형 등을 핵산 분자에 혼입시키는 위치를 결정하기 위한 일반적인 방법 및 전략이 기술되어있다.
일부 경우에, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 및/또는 5'-메틸포스포네이트 연결과의 폴리핵산 분자 간 뉴클레오티드 연결의 화학적 변형은 안정성을 향상시키지만, 과도한 변형은 때때로 독성 및 감소된 활성을 일으킨다. 따라서, 핵산 분자를 설계할 때, 일부 경우에, 이들 뉴클레오티드간 연결의 양은 최소화된다. 이러한 경우, 이들 연결의 농도의 감소는 독성을 낮추고, 이들 분자의 효능을 증가시키고 특이성을 더 높인다.
폴리핵산 분자 접합체
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 관심 부위로 전달하기 위해 폴리펩티드 A에 추가로 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 폴리펩티드 A 및 경우에 따라 중합체 모이어티에 접합된다.
일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 B에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 B에 접합되어 A-B 접합체를 형성한다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 A는 B의 5' 말단, B의 3' 말단, B의 내부 부위, 또는 이들의 임의의 조합에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 2개의 B에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 B에 접합된다.
일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 B의 적어도 하나의 말단에 접합되는 한편, 적어도 하나의 C는 적어도 하나의 B의 반대 말단에 접합되어 A-B-C 접합체를 형성한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 B의 하나의 말단에 접합되는 한편, 적어도 하나의 C는 적어도 하나의 B의 내부 부위에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 C에 직접 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 B는 적어도 하나의 C를 통해 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 간접적으로 접합되어 A-C-B 접합체를 형성한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 B 및/또는 적어도 하나의 C, 및 경우에 따라 적어도 하나의 D는 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 B는 말단(예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단)에서 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 접합되거나 내부 부위를 통해 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 C는 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 직접 또는 적어도 하나의 B를 통해 간접적으로 접합된다. 적어도 하나의 B를 통해 간접적일 경우, 적어도 하나의 C는 B 상의 적어도 하나의 폴리펩티드 A와 동일한 말단에서, 적어도 하나의 폴리펩티드 A로부터 반대 말단에서, 또는 독립적으로 내부 부위에서 접합된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 폴리펩티드 A는 적어도 하나의 폴리펩티드 A에, B에, 또는 C에 추가로 접합된다. 추가 경우에, 적어도 하나의 D는 경우에 따라 적어도 하나의 폴리펩티드 A에, 적어도 하나의 B에, 또는 적어도 하나의 C에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 직접적일 경우, 적어도 하나의 D는 또한 경우에 따라 적어도 하나의 B에 접합되어 A-D-B 접합체를 형성하거나, 경우에 따라 적어도 하나의 B 및 적어도 하나의 C에 접합되어 A-D-B-C 접합체를 형성한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 D는 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 직접적으로, 적어도 하나의 B 및 적어도 하나의 C에 간접적으로 접합되어 D-A-B-C 접합체를 형성한다. 적어도 하나의 폴리펩티드 A에 간접적일 경우, 적어도 하나의 D는 또한 경우에 따라 적어도 하나의 B에 접합되어 A-B-D 접합체를 형성하거나, 경우에 따라 적어도 하나의 B 및 적어도 하나의 C에 접합되어 A-B-D-C 접합체를 형성한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 추가의 D는 적어도 하나의 폴리펩티드 A에, B에, 또는 C에 추가로 접합된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19A]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19B]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19C]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19D]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19e]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19F]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19G]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19H]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19I]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19J]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19K]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 접합체는 [도 19L]에 도시된 바와 같은 구축물을 포함한다.
[도 19M]에 도시된 바와 같은 항체 그림은 단지 표현 목적을 위한 것이며 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, 단쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 또는 낙타과 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
결합
모이어티
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 경우에, 단편은 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 설치류 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), bis-scFv,(scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화 안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일 도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타과 항체 또는 이의 결합 단편, 이중 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
일부 경우에, A는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 설치류 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), bis-scFv,(scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 이황화물 안정화 Fv 단백질("dsFv"), 단일 도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타과 항체 또는 이의 결합 단편, 이중 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체이다. 일부 경우에, A는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 설치류 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 키메라 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 단클론 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, A는 1가 Fab'이다. 일부 경우에, A는 2가 Fab2이다. 일부 경우에, A는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 이중 특이적 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, 이중 특이적 항체는 삼작용성 항체 또는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, 이중 특이적 항체는 삼작용성 항체이다. 일부 경우에, 삼작용성 항체는 2개의 상이한 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 전장의 단클론 항체이다.
일부 경우에, 이중 특이적 항체는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, 이중 특이적 미니 항체는 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, bis-scFv. (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 이중 특이적 T 세포 관여 항체(BiTE: bi-specific T-cell engager)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 이중 특이적 T 세포 관여 항체는 2개의 단쇄 가변 단편(scFv)을 함유하고 2개의 scFv가 2개의 상이한 항원의 에피토프를 표적화하는 융합 단백질이다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 이중 특이적 미니 항체이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 Fab2이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 F(ab)'3 단편이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적 bis-scFv이다. 일부 경우에, A는 이중 특이적c(scFv)2이다. 일부 실시 양태에서, A는 이중 특이적 디아바디이다. 일부 실시 양태에서, A는 이중 특이적 미니바디이다. 일부 실시 양태에서, A는 이중 특이적 트리아바디이다. 다른 실시 양태에서, A는 이중 특이적 테트라바디이다. 다른 실시 양태에서, A는 이중 특이적 T 세포 관여 항체(BiTE)이다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 삼중 특이적 항체이다. 일부 경우에, 삼중 특이적 항체는 F(ab)'3 단편 또는 트리아바디를 포함한다. 일부 경우에, A는 삼중 특이적 F(ab)'3 단편이다. 일부 경우에, A는 트리아바디이다. 일부 실시 양태에서, A는 문헌[Dimas, et al., "Development of a trispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target three different antigens on tumor cells," Mol . Pharmaceutics, 12(9): 3490-3501(2015)]에 기술된 바와 같은 삼중 특이적 항체이다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 세포 표면 단백질을 인식하는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 근육 세포 상의 세포 표면 단백질을 인식하는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 골격근 세포 상의 세포 표면 단백질을 인식하는 항체 또는 이의 결합 단편이다.
일부 실시 양태에서, 예시적인 항체는 항-미오신 항체, 항-트랜스페린 항체, 및 근육 특이적 키나아제(MuSK)를 인식하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 항체는 항-트랜스페린(항-CD71) 항체이다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 비특이적으로 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비-부위 특이적 방식으로 리신 잔기 또는 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비-부위 특이적 방식으로 리신 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 비-부위 특이적 방식으로 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식으로 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적인 방식으로 리신 잔기, 시스테인 잔기, 5' 말단, 3' 말단, 비천연 아미노산, 또는 효소 변형된 또는 효소 촉매된 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 리신 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 시스테인 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 5' 말단에서 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 3' 말단에서 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 비천연 아미노산을 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 부위 특이적 방식에 의해 효소 변형된 또는 효소 촉매된 잔기를 통해 폴리핵산 분자 (B)에 접합된다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 폴리핵산 분자 (B)가 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 이상의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 1개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 2개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 3개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 4개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 5개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 6개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 7개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 8개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 9개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 10개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 11개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 12개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 13개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 14개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 15개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 약 16개의 폴리핵산 분자가 하나의 결합 모이어티 A에 접합된다. 일부 경우에, 하나 이상의 폴리핵산 분자는 동일하다. 다른 경우에, 하나 이상의 폴리핵산 분자는 상이하다.
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티 A에 접합된 폴리핵산 분자 (B)의 개수는 비를 형성한다. 일부 경우에, 비는 DAR(약물 대 항체) 비로 지칭되며, 여기서 본원에 언급된 바와 같은 약물은 폴리핵산 분자 (B)이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 1 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 2 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 3 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 4 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 5 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 6 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 7 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 8 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 9 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 10 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 11 이상이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 12 이상이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 1이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 2이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 3이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 4이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 5이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 6이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 7이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 8이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 9이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 10이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 11이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 12이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 13이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 14이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 15이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 약 16이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 1이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 2이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 4이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 6이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 8이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 대 결합 모이어티 A의 DAR 비는 12이다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 및 결합 모이어티 A를 포함하는 접합체는 결합 모이어티 A가 없는 폴리핵산 분자 (B)를 포함하는 접합체와 비교하여 활성이 개선된다. 일부 경우에, 개선된 활성은 향상된 생물학적 관련 기능, 예를 들어, 질환 상태의 치료 또는 예방에서 개선된 안정성, 친화도, 결합, 기능적 활성, 및 효능을 초래한다. 일부 경우에, 질환 상태는 유전자의 하나 이상의 돌연변이된 엑손의 결과이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자 (B) 및 결합 모이어티 A를 포함하는 접합체는 결합 모이어티 A가 없는 폴리핵산 분자 (B)를 포함하는 접합체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이된 엑손의 엑손 스키핑이 증가된다. 일부 경우에, 엑손 스키핑은 결합 모이어티 A가 없는 폴리핵산 분자 (B)를 포함하는 접합체와 비교하여 폴리핵산 분자 (B) 및 결합 모이어티 A를 포함하는 접합체에서 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 95% 초과로 증가한다.
일부 실시 양태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 당 업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어 아미노산 결실, 삽입, 치환, 첨가 및/또는 재조합 및/또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 변형(예를 들어 번역 후 및 화학적 변형, 예컨대 클리코실화 및 인산화)을 단독으로 또는 조합하여 사용하여 추가로 변형된다. 일부 경우에, 변형은 Fc 수용체와의 상호 작용을 조절하기 위한 변형을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 변형은 예를 들어 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호 작용에 관여하는 아미노산 잔기를 개시하는 국제 공개 WO97/34631호에 기재된 것을 포함한다. 항체 또는 이의 결합 단편의 아미노산 서열에 기초한 핵산 서열에 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져있다.
일부 경우에, 항체 결합 단편은 이의 유도체를 추가로 포함하고 적어도 하나의 CDR을 함유하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "단쇄"는 이중 특이적 단쇄 구축물의 제1 및 제2 도메인이 바람직하게는 단일 핵산 분자에 의해 코딩 가능한 공동의 선형 아미노산 서열의 형태로, 공유적으로 연결된다.
일부 경우에, 이중 특이적 단쇄 항체 구축물은 2개의 항체 유래 결합 도메인을 포함하는 구축물에 관한 것이다. 이러한 실시 양태에서, 이중 특이적 단쇄 항체 구축물은 직렬의 이중 scFv 또는 디아바디이다. 일부 경우에, scFv는 링커 펩티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 링커는 제1 및 제2 도메인 각각이 서로 독립적으로 차등적 결합 특이성을 유지할 수 있도록 보장하기에 충분한 길이 및 서열을 갖는다.
일부 실시 양태에서, 본원에 사용된 바의 결합 또는 상호 작용은 적어도 2개의 항원-상호 작용 부위의 서로의 결합/상호 작용을 정의한다. 일부 경우에, 항원-상호 작용-부위는 특정 항원 또는 특정 그룹의 항원과의 특이적 상호 작용 능력을 나타내는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 일부 경우에, 결합/상호 작용은 또한 특이적 인식을 정의하는 것으로 이해된다. 이러한 경우에, 특이적 인식은 항체 또는 이의 결합 단편이 각각의 표적 분자의 적어도 2개의 아미노산과 특이적으로 상호 작용하고/거나 이에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 특이적 인식은 항체 분자의 특이성 또는 표적 분자의 특정 영역을 구별하는 능력에 관한 것이다. 추가의 경우에, 항원-상호 작용 부위와 그의 특이적 항원의 특이적 상호 작용은 예를 들어 항원의 입체 구조의 변화, 항원의 올리고머화 등의 유도로 인한, 신호의 개시를 초래한다. 다른 실시 양태에서, 결합은 "열쇠 자물쇠 원리"의 특이성로 예시된다. 따라서, 일부 경우에, 항원-상호 작용 부위의 아미노산 서열의 특정 모티프와 항원은 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과뿐만 아니라 상기 구조의 2차 변형의 결과로 서로 결합한다. 이러한 경우에, 항원-상호 작용 부위와 그의 특이적 항원의 특이적 상호 작용은 역시 항원에 부위의 간단한 결합을 초래한다.
일부 경우에, 특이적 상호 작용은 추가로 항체 또는 이의 결합 단편의 교차 반응성 감소 또는 표적 외 효과 감소를 의미한다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드/단백질에 결합하지만 다른 폴리펩티드에는 본질적으로 전혀 결합하지 않는 항체 또는 이의 결합 단편은 관심 폴리펩티드 /단백질에 특이적인 것으로 간주한다. 항원-상호 작용 부위와 특이적 항원의 특이적 상호 작용의 예는 리간드의 그의 수용체에 대한 특이성, 예를 들어 항체의 항원 결합 부위와 항원 결정기(에피토프)와의 상호 작용을 포함한다.
추가적인 결합
모이어티
일부 실시 양태에서, 결합 모이어티는 혈장 단백질이다. 일부 경우에, 혈장 단백질은 알부민을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티 A는 알부민이다. 일부 경우에, 알부민은 본원에 기재된 하나 이상의 접합 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 알부민은 천연 라이게이션(native ligation) 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 알부민은 리신 접합에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 스테로이드이다. 예시적인 스테로이드에는 콜레스테롤, 인지질, 디- 및 트리아실글리세롤, 지방산, 포화, 불포화된, 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 탄화수소가 포함된다. 일부 경우에, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 콜레스테롤이다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 본원에 기재된 하나 이상의 접합 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 천연 라이게이션 화학에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다. 일부 경우에, 콜레스테롤은 리신 접합에 의해 폴리핵산 분자에 접합된다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 세포 상 특정 표면 마커에 결합하는 폴리핵산 분자 앱타머를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 중합체이다. 이 경우, 결합 모이어티는 표적 유전자 또는 mRNA에 혼성화하지 않고, 대신에 세포 표면 마커의 특이적 에피토프에 항체 결합과 유사하게 세포 표면 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 폴리핵산이다.
일부 경우에, 결합 모이어티는 펩티드이다. 일부 경우에, 펩티드는 약 1 내지 약 3 kDa를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드는 약 1.2 내지 약 2.8 kDa, 약 1.5 내지 약 2.5 kDa, 또는 약 1.5 내지 약 2 kDa을 포함한다. 일부 경우에, 펩티드는 비시클릭 펩티드이다. 일부 경우에, 비시클릭 펩티드는 제한적 비시클릭 펩티드이다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 비시클릭 펩티드(예를 들어, Bicycle Therapeutics의 비사이클)이다.
추가 경우에, 결합 모이어티는 소분자이다. 일부 경우에, 소분자는 항체 동원 소분자이다. 일부 경우에, 항체 동원 소분자는 표적 결합 말단 및 항체 결합 말단을 포함하고, 여기서 표적 결합 말단은 세포 표면 수용체를 인식하고 이와 상호 작용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 글루타메이트 우레아 화합물을 포함하는 표적 결합 말단은 PSMA와의 상호 작용을 가능하게 하여, PSMA를 발현하는 세포와의 항체 상호 작용을 향상시킨다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 문헌[Zhang et al., "A remote arene-binding site on prostate specific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules," J Am Chem Soc. 132(36): 12711-12716(2010); 또는 McEnaney, et al., "Antibody-recruiting molecules: an emerging paradigm for engaging immune function in treating human disease," ACS Chem Biol. 7(7): 1139-1151(2012)]에 기술된 소분자이다.
항체 또는 이의 결합 단편의 생산
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편)는, 특히 화학적 합성 또는 재조합 합성에 의한, 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 합성에 유용하다고 당 업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 생산되며, 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 생산된다.
일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 재조합적으로 발현되고, 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립되며(예를 들어, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기술된 바와 같이), 이는 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드 함유 부분의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션, 이어서 PCR에 의해 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 경우에 따라 서열의 3' 말단과 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들어, 면역글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리, 또는 cDNA 라이브러리)으로부터 생성된다.
일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 경우에 따라 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein 1975, Nature 256:495-497)에 기재된 바와 같이, 또는 문헌[Kozbor et al. 1983, Immunology Today 4:72] 또는 문헌[Cole et al. 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]에 기술된 바와 같이, 토끼와 같은 동물을 면역화하여 다클론 항체를 생성하거나, 더 바람직하게는 단클론 항체를 생성함으로써 생성된다. 대안적으로, 항체의 적어도 Fab 부분을 코딩하는 클론은 경우에 따라 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론을 위한 Fab 발현 라이브러리(예를 들어, 문헌[Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281]에 기술된 바와 같이)를 스크리닝함으로써, 또는 항체 라이브러리(예를 들어, 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc . Natl . Acad. Sci. USA 94:4937] 참조)를 스크리닝함으로써 수득한다.
일부 실시 양태에서, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc . Natl. Acad . Sci . 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)이 이용된다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자, 예컨대 설치류 단클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들, 예를 들어 인간화 항체이다.
일부 실시 양태에서, 단쇄 항체의 생산에 대해 기재된 기술(미국 특허 제4,694,778호; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85:5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334:544-54)는 단쇄 항체를 생성하는데 적용된다. 단쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 단쇄 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 작용성 Fv 단편의 조립을 위한 기술도 경우에 따라 사용된다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
일부 실시 양태에서, 항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 기술(예를 들어, 전기 천공, 리포솜 형질 감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 전달되고, 이어서 형질 감염된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 항체를 생산한다. 특정 실시 양태에서, 항체의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직, 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
일부 실시 양태에서, 다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 항체 또는 이의 결합 단편을 발현시키기 위해 이용된다. 이러한 숙주-발현 시스템은 항체의 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제되는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질 전환 또는 형질 감염될 때 항체 또는 이의 결합 단편을 제자리에서 발현하는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 및 비. 섭틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물; 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아(Saccharomyces Pichia )); 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질 전환되거나 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV: tobacco mosaic virus))로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus) 후기 프로모터; 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 7.5K 프로모터)로부터 유래한 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3 세포)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 일부 경우에, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 경우에 따라 조작된다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결 인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질 전환된다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1-2 일 동안 성장하도록 한 후, 선택적 배지로 바꿔준다. 재조합 플라스미드에서 선별 가능한 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 포커스를 형성하도록 하고, 이를 차례로 클로닝하고 세포주로 확장시킨다. 이 방법은 유리하게는 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하는 세포주를 조작하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 각각 tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포에서 사용되는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 티미딘 키나아제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 48:202) 유전자를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 많은 선별 시스템이 사용된다. 또한, 대사 길항 물질이 다음 유전자에 대한 선별을 기초로 하여 사용된다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem . 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215) 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al.(eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al.(eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)에 기술되어 있다.
일부 경우에, 항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가된다(검토를 위해,문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3.(Academic Press, New York, 1987)] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭될 수 있는 경우, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 관련되기 때문에, 항체의 생산 또한 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol . Cell Biol . 3:257).
일부 경우에, 항체 또는 항체 접합체의 정제 또는 분석을 위해 당 업계에 공지된 임의의 방법이 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심 분리, 시차 용해성, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 수행된다. 예시적인 크로마토그래피 방법은 강한 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
접합 화학
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자 B는 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 항원, 독소, 호르몬, 지질, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 탄수화물, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 중합체뿐만 아니라 이러한 모든 종류의 물질의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 결합 모이어티의 추가 예는 또한 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 인지질, 디- 및 트리아실글리세롤, 지방산, 탄화수소(예를 들어, 포화, 불포화되거나 치환을 함유함), 효소 기질, 비오틴, 디곡시제닌, 및 다당류를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 중합체, 및 경우에 따라 엔도솜 분해성 모이어티에 추가로 접합된다.
일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 화학적 라이게이션 공정에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 천연 라이게이션에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 접합은 문헌[Dawson, et al. "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779; Dawson, et al. "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J. Am. Chem . Soc. 1997, 119, 4325-4329; Hackeng, et al. "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc . Natl . Acad . Sci . USA 1999, 96, 10068-10073; 또는 Wu, et al. "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew . Chem . Int . Ed. 2006, 45, 4116-4125]에 기술된 바와 같다. 일부 경우에, 접합은 미국 특허 제8,936,910호에 기재된 바와 같다. 일부 실시 양태에서, 폴리핵산 분자는 천연 라이게이션 화학을 통해 부위 특이적으로 또는 비특이적으로 결합 모이어티에 접합된다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 "흔적없는(traceless)" 커플링 기술(Philochem)"을 사용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, "흔적없는" 커플링 기술은 결합 모이어티 상에 N-말단 1,2-아미노 티올기를 이용하고, 이어서 이는 알데히드기를 함유하는 폴리핵산 분자와 접합된다(문헌[Casi et al., "Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery,"JACS 134(13): 5887-5892(2012)] 참조)
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 결합 모이어티에 포함된 비천연 아미노산을 이용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 p-아세틸페닐알라닌(pAcPhe)을 포함한다. 일부 경우에, pAcPhe의 케토 기는 알콕시-아민 유도체화된 접합 모이어티에 선택적으로 커플링되어 옥심 결합을 형성한다(문헌[ Axup et al., "Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids," PNAS 109(40): 16101-16106(2012)] 참조).
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 효소 촉매된 공정을 이용하는 부위 지정 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, 부위 지정 방법은 SMARTag™ 기술(Catalent, Inc.)을 이용한다. 일부 경우에, SMARTag™ 기술은 알데히드 태그의 존재하에 산화 공정을 통해 포르밀글리신 생성 효소(FGE: formylglycine-generating enzyme)에 의해 시스테인으로부터 포르밀글리신(FGly) 잔기의 생성 및 히드라지노-픽텟-스펭글러(HIPS: hydrazino-Pictet-Spengler) 라이게이션을 통한 알킬히드레인 작용화된 폴리핵산 분자에 FGly의 후속적인 접합을 포함한다(문헌[ Wu et al., "Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag," PNAS 106(9): 3000-3005 (2009); Agarwal, et al., "A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification," PNAS 110(1): 46-51 (2013)] 참조)
일부 경우에, 효소 촉매된 공정은 미생물 트랜스글루타미나제(mTG)를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미생물 트랜스글루타미나제 촉매된 공정을 이용하여 결합 모이어티에 접합된다. 일부 경우에, mTG는 인식 서열 내의 글루타민의 아미드 측쇄와 작용화된 폴리핵산 분자의 1차 아민 사이의 공유 결합의 형성을 촉매한다. 일부 경우에, mTG는 스트렙토마이세스 모바렌시스(Streptomyces mobarensis)로부터 생산된다(문헌[Strop et al., "Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates," Chemistry and Biology 20(2) 161-167(2013)] 참조)
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 서열 특이적 트랜스펩티다제를 이용하는 PCT 공개 WO2014 /140317호에 기재된 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다.
일부 경우에, 폴리핵산 분자는 미국 특허 공개 제2015/0105539호 및 제2015/0105540호에 기재된 방법에 의해 결합 모이어티에 접합된다.
중합체 접합
모이어티
일부 실시 양태에서, 중합체 모이어티 C는 본원에 기재된 폴리핵산 분자, 본원에 기재된 결합 모이어티, 또는 이들의 조합에 추가로 접합된다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리핵산 분자와 접합된다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 결합 모이어티에 접합된다. 다른 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리핵산 분자-결합 모이어티 분자에 접합된다. 추가적인 경우에, 중합체 모이어티 C는 상기 예시된 바와 같이 접합된다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 분지형 또는 비분지형 단량체의 장쇄, 및/또는 2차원 또는 3차원의 단량체의 가교 결합된 네트워크로 이루어진 천연 또는 합성 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 다당류, 리그닌, 고무, 또는 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 중합체 모이어티 C는 알파-, 오메가-디히드록실폴리에틸렌글리콜, 생분해 성 락톤계 중합체, 예컨대 폴리아크릴산, 폴리락티드산(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리 프로필렌, 폴리스티렌, 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리이미드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(또한, 폴리(에틸렌테레 프탈레이트), PET, PETG 또는 PET로도 알려짐), 폴리테트라메틸렌 글리콜(PTG), 또는 폴리우레탄 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 혼합물은 블록 공중합체와 관련하여서뿐만 아니라 동일한 화합물 내에서 상이한 중합체의 사용을 지칭한다. 일부 경우에, 블록 공중합체는 중합체의 하나 이상의 섹션이 다른 중합체의 단량체로부터 축적되는 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리알킬렌 옥시드를 포함한다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 PEG를 포함한다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 폴리에틸렌 이미드(PEI) 또는 히드록시 에틸 전분(HES)을 포함한다.
일부 경우에, C는 PEG 모이어티이다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 5' 말단에 접합되는 한편 결합 모이어티는 폴리핵산 분자의 3' 말단에 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 3' 말단에 접합되는 한편 결합 모이어티는 폴리핵산 분자의 5' 말단에 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 폴리핵산 분자의 내부 부위에 접합된다. 일부 경우에, PEG 모이어티, 결합 모이어티, 또는 이들의 조합은 폴리핵산 분자의 내부 부위에 접합된다. 일부 경우에, 접합은 직접 접합이다. 일부 경우에, 접합은 천연 라이게이션에 의한다.
일부 실시 양태에서, 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)는 다분산 또는 단분산 화합물이다. 일부 경우에, 다분산 물질은 평균 중량(중량 평균) 크기 및 분산도를 특징으로 하는 상이한 분자량 물질의 분산 분포를 포함한다. 일부 경우에, 단분산 PEG는 하나의 크기의 분자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, C는 다분산 또는 단분산 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)이고, 표시된 분자량은 폴리알킬렌 옥시드, 예를 들어 PEG 분자의 분자량의 평균을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)의 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다.
일부 실시 양태에서, C는 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)이고 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다. 일부 실시 양태에서, C는 PEG이고 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 또는 100,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1100 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1450 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2100 Da이다.일부 경우에, C의 분자량은 약 200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1100 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1450 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 1900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2100 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2200 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2300 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2400 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2700 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2800 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 2900 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3250 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3350 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 3750 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4250 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4600 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 4750 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 5000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 5500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 6000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 6500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 7000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 7500 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 8000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 10,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 12,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 20,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 35,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 40,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 50,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 60,000 Da이다. 일부 경우에, C의 분자량은 약 100,000 Da이다.
일부 실시 형태에서, 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)는 이산(discrete) 에틸렌 옥시드 단위(예를 들어, 4 내지 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위)를 포함한다. 일부 경우에, 이산 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 폴리알킬렌 옥시드는 선형 사슬이다. 다른 경우에, 이산 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 폴리알킬렌 옥시드는 분지 쇄이다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 이산 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 약 4 내지 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함한다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 또는 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함한다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 4 내지 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 또는 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 4개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 5개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 6개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 7개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 8개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 9개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 10개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 11개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 12개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 13개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 14개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 15개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 16개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 17개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 18개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 19개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 20개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 21개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 22개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 23개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 24개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 25개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 26개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 27개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 28개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 29개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 30개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 31개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 32개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 33개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 34개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 35개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 36개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 37개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 38개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 39개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 40개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 41개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 42개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 43개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 44개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 45개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 46개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 47개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 예를 들어, 약 48개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하는 이산 PEG이다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 dPEG®(Quanta Biodesign Ltd)이다.
일부 실시 양태에서, 중합체 모이어티 C는 양이온성 뮤신산계 중합체(cMAP)를 포함한다. 일부 경우에, cMAP는 적어도 하나의 반복 서브 유닛의 하나 이상의 서브 유닛을 포함하고, 서브 유닛 구조는 화학식 (V)로 나타낸다:
여기서, m은 각각의 경우 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 바람직하게는 4-6 또는 5이며; n은 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 일부 실시 양태에서, m 및 n은 예를 들어 약 10이다.
일부 경우에, cMAP는 PEG 모이어티에 추가로 접합되어 cMAP-PEG 공중합체, mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체, 또는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체를 생성한다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 약 500 Da 내지 약 50,000 Da의 범위이다. 일부 경우에, PEG 모이어티는 약 500 Da 내지 약 1000 Da, 1000 Da 초과 내지 약 5000 Da, 5000 Da 초과 내지 약 10,000 Da, 10,000 초과 내지 약 25,000 Da, 25,000 Da 초과 내지 약 50,000 Da, 또는 이들 범위 중 둘 이상의 임의의 조합의 범위에 있다.
일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG 공중합체, mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체, 또는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체이다. 일부 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG 공중합체이다. 다른 경우에, 중합체 모이어티 C는 mPEG-cMAP-PEGm 삼블록 중합체이다. 추가의 경우에, 중합체 모이어티 C는 cMAP-PEG-cMAP 삼블록 중합체이다.
일부 실시 양태에서, 중합체 모이어티 C는 상기 예시된 바와 같이 폴리핵산 분자, 결합 모이어티, 및 경우에 따라 엔도솜 분해성 모이어티에 접합된다.
엔도솜
분해성
모이어티
일부 실시 양태에서, 화학식 (I): A-X1-B-X2-C의 분자는 추가의 접합 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 추가의 접합 모이어티는 엔도솜 분해성 모이어티이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 세포 내 구획 방출 성분, 예컨대, 엔도솜, 리소좀, 소포체(ER), 골지 장치, 미세 소관, 퍼옥시좀, 또는 세포를 이용한 다른 소포성 소체(vesicular body)와 같이 당 업계에 공지된 임의의 세포 구획으로부터 방출될 수 있는 화합물이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 부분은 엔도솜 분해성 폴리펩티드, 엔도솜 분해성 중합체, 엔도솜 분해성 지질, 또는 엔도솜 분해성 소분자를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 엔도솜 분해성 중합체를 포함한다.
엔도솜
분해성
폴리펩티드
일부 실시 양태에서, 화학식 (I): A-X1-B-X2-C의 분자는 추가로 엔도솜 분해성 폴리펩티드와 접합된다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 pH 의존성 막 활성 펩티드이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 양친매성 폴리펩티드이다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 펩티드 모방체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 INF, 멜리틴, 뮤신, 또는 이들의 각각의 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 INF 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 멜리틴 또는 이의 유도체를 포함한다. 추가의 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 뮤신 또는 이의 유도체를 포함한다.
일부 경우에, INF7는 24개 잔기의 폴리펩티드로 이들 서열은 CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA (서열 번호 1), 또는 GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (서열 번호 2)를 포함한다. 일부 경우에, INF7 또는 이의 유도체는 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG (서열 번호 3), GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2 (서열 번호 4), 또는 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2 (서열 번호 5)의 서열을 포함한다.
일부 경우에, 멜리틴은 26개 잔기의 폴리펩티드로 이들의 서열은 CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ (서열 번호 6), 또는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (서열 번호 7)를 포함한다. 일부 경우에, 멜리틴은 미국 특허 제8,501,930호에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 경우에, 뮤신은 전갈 메소부투스 에우페우스(Mesobuthus eupeus)의 독선에서 유래한 항균성 펩티드(AMP)이다. 일부 경우에, 뮤신은 서열이 IFGAIAGLLKNIF-NH2 (서열 번호 8)을 포함하는 뮤신-13, 및 서열이 FFGHLFKLATKIIPSLFQ (서열 번호 9)를 포함하는 뮤신-18을 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 폴리펩티드는 이의 서열이 INF7 또는 이의 유도체, 멜리틴 또는 이의 유도체, 또는 뮤신 또는 이의 유도체와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 이의 유도체, 멜리틴 또는 이의 유도체, 또는 뮤신 또는 이의 유도체를 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 INF7 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1-5와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 2-5와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 2-5를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 1로 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 2-5로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 멜리틴 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 6 또는 7과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 6과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 7과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 6을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 7을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 6과 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 7로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 뮤신 또는 이의 유도체이다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 8 또는 9와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 8과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 9와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 8을 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 9를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 8로 이루어진다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 서열 번호 9로 이루어진다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 표 1에 예시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 Bcl-2 및/또는 Bcl-xL과 같은 억제제 표적의 길항 작용을 통해 아폽토시스를 유도하는 Bak BH3 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 문헌[Albarran, et al., "Efficient intracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsive carrier, "Reactive & Functional Polymers 71: 261-265(2011)]에 기재된 Bak BH3 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 PCT 공개 WO2013/166155호 또는 WO2015/069587호에 기재된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, 세포-침투 폴리펩티드)를 포함한다.
엔도솜
분해성 지질
일부 실시 양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티는 지질(예를 들어, 푸소제닉 지질)이다. 일부 실시 양태에서, 화학식 (I): A-X1-B-X2-C의 분자는 추가로 엔도솜 분해성 지질(예를 들어, 푸소제닉 지질)에 접합된다. 예시적인 푸소제닉 지질은 1,2-디레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(Di-Lin), N-메틸(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)메탄아민(DLin-k-DMA) 및 N-메틸-2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄아민(XTC)을 포함한다.
일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 PCT 공개 WO09/126,933호에 기재된 지질(예를 들어, 푸소제닉 지질)이다.
엔도솜
분해성
소분자
일부 실시 양태에서, 엔도솜 분해성 모이어티는 소분자이다. 일부 실시 양태에서, 화학식 (I): A-X1-B-X2-C의 분자는 엔도솜 분해성 소분자에 추가로 접합된다. 엔도솜 분해성 모이어티로서 적합한 예시적인 소분자는 퀴닌, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 아모디아퀸(카르노퀸), 아모피로퀸, 프리마퀸, 메플로퀸, 니바퀸, 할로판트린, 퀴논 이민, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 퀴놀린 엔도솜 분해성 모이어티는 7-클로로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린(클로로퀸); 7-클로로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린(히드록시클로로퀸); 7-플루오로-4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸-아미노)퀴놀린; 4-(4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노) 퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-디에틸-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린(데스메틸클로로퀸); 7-플루오로-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린); 4-(4-디에틸-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-디에틸-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노) 퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-디에틸-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-디에틸아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(4-에틸-(2-히드록시-에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노-)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 히드록시클로로퀸 포스페이트; 7-클로로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸-1)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린(데스메틸히드록시클로로퀸); 7-플루오로-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노) 퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-부틸아미노)퀴놀린; 7-클로로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-플루오로-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 7-히드록시-4-(1-카르복시-4-에틸-(2-히드록시에틸)-아미노-1-메틸부틸아미노)퀴놀린; 8-[(4-아미노펜틸)아미노-6-메톡시디히드로클로라이드 퀴놀린; 1-아세틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린; 8-[(4-아미노펜틸)아미노]-6-메톡시퀴놀린 디히드로클로라이드; 1-부티릴-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린; 3-클로로-4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린, 4-[(4-디에틸-아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 3-플루오로-4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린, 4-[(4-디에틸아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 4-(4-히드록시-알파,알파'-비스(2-메틸-1-피롤리디닐)-2,5-자일리디노퀴놀린; 4-[(4-디에틸아미노)-1-메틸부틸-아미노]-6-메톡시퀴놀린; 3,4-디히드로-1-(2H)-퀴놀린카르복시알데히드; 1,1'-펜타메틸렌 디퀴놀레이늄 디아이오다이드; 8-퀴놀리놀 술페이트 및 아미노, 알데히드, 카르복실, 히드록실, 할로겐, 케토, 술프히드릴 및 비닐 유도체 또는 이들의 유사체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 엔도솜 분해성 모이어티는 문헌[Naisbitt et al (1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893] 및 미국 특허 제5,736,557호에 기재된 소분자이다.
링커
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 링커는 절단성 링커 또는 비-절단성 링커이다. 일부 경우에, 링커는 절단성 링커이다. 다른 경우에, 링커는 비-절단성 링커이다.
일부 경우에, 링커는 비중합체성 링커이다. 비중합체성 링커는 중합 공정에 의해 생성된 반복 단위의 단량체를 함유하지 않는 링커이다. 예시적인 비중합체성 링커는 C1-C6 알킬기(예를 들어, C5, C4, C3, C2, 또는 C1 알킬기), 동종 이작용성 교차 링커, 이종 이작용성 교차 링커, 펩티드 링커, 흔적없는 링커, 자가 희생(self-immolative) 링커, 말레이미드계 링커, 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 비중합체성 링커는 C1-C6 알킬기(예를 들어, C5, C4, C3, C2, 또는 C1 알킬기), 동종 이작용성 교차 링커, 이종 이작용성 교차 링커, 펩티드 링커, 흔적없는 링커, 자가 희생 링커, 말레이미드계 링커, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가의 경우에, 비중합체성 링커는 2개 초과의 동일한 유형의 링커, 예를 들어 2개 초과의 동종 이작용성 교차 링커, 또는 2개 초과의 펩티드 링커를 포함하지 않는다. 추가의 경우에, 비중합체성 링커는 경우에 따라 하나 이상의 반응성 작용기를 포함한다.
일부 경우에, 비중합체성 링커는 상기 기재된 중합체를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 비중합체성 링커는 중합체 모이어티 C에 의해 포괄되는 중합체를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 비중합체성 링커는 폴리알킬렌 옥시드(예를 들어, PEG)를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 비중합체성 링커는 PEG를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 링커는 동종 이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 동종 이작용성 링커는 로만트(Lomant) 시약 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 디술포숙신이미딜 타르트레이트(술포 ST), 에틸렌 글리코비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할로겐화물 함유 화합물(DFDNB), 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드(BASED), 포름알데히드, 글루타르알데히드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디히드라지드, 카르보히드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-크실렌 술폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 링커는 이종 이작용성 링커이다. 예시적인 이종 이작용성 링커는 아민 반응성 및 술프히드릴 교차 링커, 예컨대 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(술포-LC-sPDP), 숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 술포숙신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(술포-LC-sMPT), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBs), m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르(술포-MBs), N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 술포숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(술포-sIAB), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(술포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMBs), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르(술포-GMBs), 숙신이미딜 6-((아이오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 숙신이미딜 6-[6-(((아이오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 숙신이미딜 4-(((아이오도아세틸)아미노)메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sIAC), 숙신이미딜 6-((((4-아이오도아세틸)아미노)메틸)시클로헥산-1-카르보닐)아미노) 헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 아이오도아세테이트(NPIA), 카르보닐 반응성 및 술프히드릴 반응성 교차 링커, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실-히드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(PDPH), 아민 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도살리실산(술포-NHs-AsA), 술포숙신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(술포-NHs-LC-AsA), 술포숙신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-히드록시숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트(술포-HsAB), N-숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(술포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드(ANB-NOs), 술포숙신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-숙신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-술포숙신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(술포-sADP), 술포숙신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(술포-sAPB), 술포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(술포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 술프히드릴 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카르보닐 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 ρ-아지도벤조일 히드라지드(ABH), 카르복실레이트 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광반응성 교차 링커, 예컨대 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 링커는 반응성 작용기를 포함한다. 일부 경우에, 반응성 작용기는 결합 모이어티 상에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 포함한다. 예시적인 친전자성 기는 카르보닐 기, 예컨대 알데히드, 케톤, 카복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할로겐화물 또는 산 무수물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 반응성 작용기는 알데히드이다. 예시적인 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴 히드라지드를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 링커는 말레이미드 기를 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미드 스페이서로도 지칭된다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)을 형성하는 카프로 산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도메틸 기, 예컨대 상기에 기재된 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 또는 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-sMCC)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 말레이미드 기는 자가 안정화 말레이미드이다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 디아미노프로피온산(DPR)을 이용하여 말레이미드에 인접한 염기성 아미노기를 혼입하여 티오숙신이미드 고리 가수 분해의 분자 내 촉매를 제공함으로써 말레이미드가 레트로-마이클 반응을 통한 제거 반응을 겪지 않도록한다. 일부 경우에, 자가 안정화 말레이미드는 문헌[Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기재된 말레이미드 기이다. 일부 경우, 링커는 자가 안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우, 링커는 자가 안정화 말레이미드이다.
일부 실시 양태에서, 링커는 펩티드 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 절단성 펩티드 모이어티(예를 들어, 효소적으로 또는 화학적으로)이다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 비-절단성 펩티드 모이어티이다. 일부 경우에, 펩티드 모이어티는 Val-Cit(발린-시트룰린), Gly-Gly-Phe-Gly (서열 번호 14223), Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호 14224), 또는 Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호 14225)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 펩티드 모이어티, 예컨대 Val-Cit(발린-시트룰린), Gly-Gly-Phe-Gly (서열 번호 14223), Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호 14224), 또는 Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호 14225)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 Val-Cit을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 Val-Cit이다.
일부 실시 양태에서, 링커는 벤조산 기, 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 벤조산 기 또는 이의 유도체는 파라아미노벤조산(PABA)을 포함한다. 일부 경우에, 벤조산 기 또는 이의 유도체는 감마-아미노부티르산(GABA)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 링커는 말레이미드 기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산 기 중 하나 이상을 임의의 조합으로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 링커는 말레이미드 기, 펩티드 모이어티, 및/또는 벤조산 기의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드 기는 말레이미도카프로일(mc)이다. 일부 경우에, 펩티드 기는 val-cit이다. 일부 경우에, 벤조산 기는 PABA이다. 일부 경우에, 링커는 mc-val-cit 기를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 val-cit-PABA 기이다. 추가의 경우에, 링커는 mc-val-cit-PABA 기를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 링커는 자가 희생 링커 또는 자가 제거 링커이다. 일부 경우에, 링커는 자가 희생 링커이다. 다른 경우에, 링커는 자가 제거 링커(예를 들어, 고리화 자가 제거 링커)이다. 일부 경우에, 링커는 미국 특허 제9,089,614호 또는 PCT 공개 WO2015038426호에 기재된 링커를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 링커는 수지형(dendritic type) 링커이다. 일부 경우에, 수지형 링커는 분지형 다작용성 링커 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 수지형 링커는 폴리뉴클레오티드 B 대 결합 모이어티 A의 몰비를 증가시키기 위해 사용된다. 일부 경우에, 수지형 링커는 PAMAM 덴드리머를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 링커는 흔적없는 링커, 또는 절단 후 결합 모이어티 A, 폴리뉴클레오티드 B, 중합체 C, 또는 엔도솜 분해성 모이어티 D에 링커 모이어티(예컨대, 원자 또는 링커 기)를 남기지 않는 링커이다. 예시적인 흔적없는 링커는 게르마늄 링커, 규소 링커, 황 링커, 셀레늄 링커, 질소 링커, 인 링커, 붕소 링커, 크롬 링커, 또는 페닐히드라지드 링커를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 링커는 문헌[Hejesen, et al., "A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry," Org Biomol Chem 11(15): 2493-2497 (2013)]에 기술된 바와 같은 흔적없는 아릴-트리아진 링커이다. 일부 경우에, 링커는 문헌[Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)]에 기재된 흔적없는 링커이다. 일부 경우, 링커는 미국 특허 제6,821,783호에 기재된 바와 같은 흔적없는 링커이다.
일부 경우, 링커는 미국 특허 제6,884,869호; 제7,498,298호; 제8,288,352호; 제8,609,105호; 또는 제8,697,688호; 미국 특허 공개 제2014/0127239호; 제2013/028919호; 제2014/286970호; 제2013/0309256호; 제2015/037360호; 또는 제2014/0294851호; 또는 PCT 공개 WO2015057699호; WO2014080251호; WO2014197854호; WO2014145090호; 또는 WO2014177042호에 기재된 링커이다.
일부 실시 양태에서, X1 및 X2는 각각 독립적으로 결합 또는 비중합체성 링커이다. 일부 경우에, X1 및 X2는 각각 독립적으로 결합이다. 일부 경우에, X1 및 X2는 각각 독립적으로 비중합체성 링커이다.
일부 경우에, X1은 결합 또는 비중합체성 링커이다. 일부 경우에, X1은 결합이다. 일부 경우에, X1은 비중합체성 링커이다. 일부 경우에, 링커는 C1-C6 알킬기이다. 일부 경우에, X1은 C1-C6 알킬기, 예를 들어, C5, C4, C3, C2, 또는 C1 알킬기이다. 일부 경우에, C1-C6 알킬기는 비치환된 C1-C6 알킬기이다. 링커와 관련하여, 특히 X1과 관련하여 사용되는 바와 같이, 알킬은 최대 6개의 탄소 원자를 함유하는 포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 경우에, X1은 상기 기재된 동종 이작용성 링커 또는 이종 이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에, X1은 이종 이작용성 링커를 포함한다. 일부 경우에, X1에 sMCC를 포함한다. 다른 경우에, X1은 경우에 따라 C1-C6 알킬기에 접합된 이종 이작용성 링커를 포함한다. 다른 경우에, X1은 경우에 따라 C1-C6 알킬기에 접합된 sMCC를 포함한다. 추가의 경우에, X1은 상기 기재된 동종 이작용성 링커 또는 이종 이작용성 링커를 포함하지 않는다.
일부 경우에, X2는 결합 또는 링커이다. 일부 경우에, X2는 결합이다. 다른 경우에, X2는 링커이다. 추가의 경우에, X2는 비중합체성 링커이다. 일부 실시 양태에서, X2는 C1-C6 알킬기이다. 일부 경우에, X2는 상기 기재된 동종 이작용성 링커 또는 이종 이작용성 링커이다. 일부 경우에, X2는 상기 기재된 동종 이작용성 링커이다. 일부 경우에, X2는 상기 기재된 이종 이작용성 링커이다. 일부 경우에, X2는 말레이미도카프로일(mc)과 같은 말레이미드 기 또는 상기 기재된 자가 안정화 말레이미드기를 포함한다. 일부 경우에, X2는 Val-Cit와 같은 펩티드 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, X2는 PABA와 같은 벤조산 기를 포함한다. 추가의 경우에, X2는 말레이미드 기, 펩티드 모이어티 및/또는 벤조산 기의 조합을 포함한다. 추가의 경우에서, X2는 mc 기를 포함한다. 추가의 경우에, X2는 mc-val-cit 기를 포함한다. 추가의 경우에, X2는 val-cit-PABA 기를 포함한다. 추가의 경우에, X2는 mc-val-cit-PABA 기를 포함한다.
사용 방법
근위축증은 근육 질량의 손실 및/또는 점진적인 근육 약화 및 퇴화를 의미한다. 일부 경우에, 근육 질량의 손실 및/또는 점진적인 근육 약화 및 퇴화는 높은 단백질 분해 속도, 낮은 단백질 합성 속도, 또는 이 둘의 조합으로 인해 발생한다. 일부 경우에, 높은 근육 단백질 분해 속도는 근육 단백질 이화 작용(즉, 아미노산을 포도당 신생 합성의 기질로서 사용하기 위한 근육 단백질의 분해)에 기인한다.
일 실시 양태에서, 근위축증은 근력의 현저한 손실을 의미한다. 근력의 현저한 손실은 대조군 대상체에서 동일한 근육 조직에 비해 대상체에서 질환, 부상 또는 미사용 근육 조직에서의 힘의 감소를 의미한다. 일 실시 양태에서, 근력의 현저한 손실은 대조군 대상체에서 동일한 근육 조직에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 이상의 힘의 감소이다. 다른 실시 형태에서, 근력의 현저한 손실은 미사용 기간 이전에 동일한 대상체에서 동일한 근육 조직의 근력에 비해 미사용 근육 조직에서의 힘의 감소를 의미한다. 일 실시 양태에서, 근력의 현저한 손실은 미사용 기간 전에 동일한 대상체에서 동일한 근육 조직의 근력에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 이상의 감소이다.
다른 실시 양태에서, 근위축증은 근육 질량의 현저한 손실을 의미한다. 근육 질량의 현저한 손실은 대조군 대상체에서 동일한 근육 조직에 비해 대상체에서 질환, 부상 또는 미사용 근육 조직에서의 근육 부피의 감소를 의미한다. 일 실시 양태에서, 근육 부피의 현저한 손실은 대조군 대상체에서 동일한 근육 조직에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 이상이다. 다른 실시 형태에서, 근육 질량의 현저한 손실은 미사용 기간 이전에 동일한 대상체에서 동일한 근육 조직의 근육 부피에 비해 미사용 근육 조직에서의 근육 부피의 감소를 의미한다. 일 실시 양태에서, 근육 조직의 현저한 손실은 미사용 기간 이전에 동일한 대상체에서 동일한 근육 조직의 근육 부피에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 이상이다. 근육 부피는 경우에 따라, 자기 공명 영상화(예를 들어, 근육 부피/단면적(CSA: cross-section area) MRI 방법)에 의해서와 같이 근육의 단면적을 평가함으로써 측정된다.
근긴장성 이영양증은 근긴장성 이영양증 1형(DM1) 및 근긴장성 이영양증 2형(DM2)의 2 가지 주요 유형을 포함하는 다중 전신 신경근 질환이다. DM1은 유전자 DM 단백질 키나아제(DMPK)에서 우세하게 유전된 "CTG" 반복 팽창에 의해 유발되는데, 이 단백질은 mRNA로 전사될 때 MBNL(Muscleblind-like) 패밀리의 단백질에 높은 친화도로 결합하는 헤어핀을 형성한다. MBNL 단백질은 전사 후 스플라이싱 및 폴리아데닐화 부위 조절에 관여하고, MBNL 단백질 기능의 상실은 핵 병소의 하류 축적 및 스플라이싱 오류 사건의 증가로 이어지고,이어서 근긴장증 및 다른 임상 증상으로 이어진다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 근위축증 또는 근긴장성 이영양증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 경우에, 근위축증은 악액질(예를 들어, 암 악액질), 탈신경, 근육 병증, 운동 뉴런 질환, 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환, 간 질환, 울혈성 심부전, 만성 신부전, 만성 감염, 패혈증, 단식, 사르코페니아, 글루코코르티코이드 유발 위축증, 불용, 또는 우주 비행과 연관되고/되거나 이에 의해 유도된다. 일부 경우에, 근긴장성 이영양증은 DM1이다.
악액질
악액질은 기저 질환으로 인한 후천성으로 가속화되는 근육 손실이다. 일부 경우에, 악액질은 영양적으로 되돌릴 수 없고 일반적으로 암, COPD, AIDS, 심부전 등과 같은 기저 질환과 연관된 체질량 손실을 지칭한다. 말기 암 환자에서 악액질이 발견될 경우, 이를 "암 악액질"이라고 한다. 암 악액질은 진행된 암 환자의 대부분에 영향을 미치며 치료 허용, 치료에 대한 반응, 삶의 질 및 생존 기간의 감소와 관련이 있다. 일부 경우에, 암 악액질은 체지방량 손실의 유무에 관계없이 골격근 질량의 지속적인 손실을 특징으로 하는 다인자 증후군으로 정의되며, 이는 종래의 영양학적 지원에 의해 완전히 역전될 수 없고 점진적인 기능 장애를 초래한다. 일부 경우에, 골격근 손실은 암 악액질에서 가장 중요한 사건으로 보인다. 또한, 암 악액질의 분류는 진단 기준이 체중 감소가 악액질 과정의 신호 사건이라는 것을 고려해야 할 뿐만 아니라 낮은 BMI 또는 낮은 수준의 근육질과 같이 환자의 초기 비축량도 고려해야 한다는 것을 시사한다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 악액질 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 추가의 실시 양태에서, 대상체에서 암 악액질 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
탈신경
탈신경은 기관과 중추 신경계 사이에 신경 섬유가 부분적으로 또는 완전히 중단되어 말초 운동뉴런에 손상을 입히고, 신경전도 및 운동 뉴런 발화가 중단되어 차례로 골격근의 수축성을 방해한다. 이러한 신경 기능 상실은 국소화되거나 전체 운동 뉴런 단위의 상실로 인해 전신화된다. 그 결과 골격근이 수축할 수 없게 되면 근위축증이 생긴다. 일부 경우에, 탈신경은 퇴행성, 대사성, 또는 염증성 신경 병증(예를 들어, 길랭-바레 증후군, 말초 신경 병증, 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)과 관련되거나 그로 인한 결과이다. 추가의 경우에, 탈신경은 신체적 상해, 예를 들어 수술 절차와 관련된다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 탈신경과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 탈신경과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
근육 병증
근육 병증은 근육 질환을 나타내는 포괄적인 용어이다. 일부 경우에, 근육 병증은 근긴장증; 선천성 근육 병증, 예컨대 네말린 근육 병증, 다핵/미세핵 근육 병증 및 근관(중심핵) 근육 병증; 미토콘드리아 근육 병증; 가족성 주기적 근육마비; 염증성 근육 병증; 예를 들어, 글리코겐 또는 지질 저장 질환으로 인한 대사 근육 병증; 피부 근육염; 다발성 근육염; 포함체 근육염; 골화 근육염; 횡문근 융해증; 및 미오글로빈 뇨를 포함한다. 일부 경우에, 근육 병증은 근위축증 증후군, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면-견갑-상완형, 에머리-드레이푸스, 안구인두근, 견갑상완골, 하지대, 후쿠야마, 선천성 근위축증, 또는 유전성 원위 근육 병증에 의해 야기된다. 일부 경우에, 근육 병증은 근긴장성 이영양증(예를 들어, 근긴장성 이영양증 1형 또는 DM1)에 의해 야기된다. 일부 경우에, 근육 병증은 DM1에 의해 야기된다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 근육 병증와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 근육 병증과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
운동 뉴런 질환
운동 뉴런 질환(MND)은 신체의 수의근을 제어하는 세포인 운동 뉴런에 영향을 미치는 신경계 장애를 포함한다. 예시적인 운동 뉴런 질환은 성인 운동 뉴런 질환, 유아 척수 근위축증, 근위축성 측삭 경화증, 청소년 척수 근위축증, 다초점 전도 차단을 동반한 자가 면역 운동 신경 병증, 뇌졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비, 또는 외상으로 인한 골격 고정을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 운동 뉴런 질환과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 운동 뉴런 질환과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
당뇨병
당뇨병(진성 당뇨, DM(diabetes mellitus))은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 3형 당뇨병, 4형 당뇨병, 이중 당뇨병, 잠복 자가 면역 당뇨병(LAD: latent autoimmune diabetes), 임신성 당뇨병, 신생아 당뇨병(NDM: neonatal diabetes mellitus), 저연령대 성인발병 당뇨병(MODY: maturity onset diabetes of the young), 볼프람 증후군, 알스트룀 증후군, 당뇨병 전증, 또는 요붕증을 포함한다. 비-인슐린 의존성 당뇨병이라고도 하는 2형 당뇨병은 모든 당뇨병 사례의 95%를 차지하는 가장 일반적인 유형의 당뇨병이다. 일부 경우에, 2형 당뇨병은 췌장 베타 세포 기능 장애로 인한 인슐린 저항성을 비롯한 여러 요인의 조합에 의해 야기되며, 이는 차례로 고혈당 수준으로 이어진다. 일부 경우, 증가한 글루카곤 수준은 간을 자극하여 불필요한 양의 불필요한 포도당을 생성하여 고혈당 수준에 기여한다.
인슐린 의존성 당뇨병으로도 불리는 1형 당뇨병은 모든 당뇨병 사례의 약 5% 내지 10%를 구성한다. 1형 당뇨병은 T 세포가 췌장에서 인슐린 생성 베타 세포를 공격하고 파괴하는 자가 면역 질환이다. 일부 실시 양태에서, 1형 당뇨병은 유전적 및 환경적 요인에 의해 야기된다.
4형 당뇨병은 65세 이상의 당뇨병 환자의 약 20%에 영향을 미치는 최근에 발견된 당뇨병 유형이다. 일부 실시 양태에서, 4형 당뇨병은 노화 관련 인슐린 저항성을 특징으로 한다.
일부 실시 양태에서, 3형 당뇨병은 뇌에서 인슐린 저항성을 유발하는 알츠하이머병에 대한 용어로 사용된다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 당뇨병 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 추가의 실시 양태에서, 대상체에서 암 당뇨병 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
만성 폐쇄성 폐질환
만성 폐쇄성 폐질환(COPD: Chronic obstructive pulmonary disease)은 장기간 호흡 문제 및 불량한 공기 흐름을 특징으로 하는 폐쇄성 폐질환의 한 유형이다. 만성 기관지염과 폐기종은 두 가지 다른 유형의 COPD이다. 일부 경우에, 대상체에서 COPD(예를 들어, 만성 기관지염 또는 폐기종)과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 COPD(예를 들어, 만성 기관지염 또는 폐기종)와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
간 질환
간 질환(liver disease 또는 hepatic disease)은 섬유증, 간경변, 간염, 알코올성 간 질환, 지방간, 유전성 질환, 또는 원발성 간암을 포함한다. 일부 경우에, 대상체에서 간질환과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 간질환과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
울혈성 심부전
울혈성 심부전은 심장이 신체 조직에 충분한 혈액과 산소를 펌핑할 수 없는 병태이다. 일부 경우에, 대상체에서 울혈성 심부전과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 울혈성 심부전과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
만성 신부전
만성 신부전 또는 만성 신장 질환은 시간이 지남에 따라 점차 신장 기능이 상실되는 병태이다. 일부 경우에, 대상체에서 만성 신부전과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 만성 신부전과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
만성 감염
일부 실시 양태에서, AIDS와 같은 만성 감염이 또한 근위축증을 초래한다. 일부 경우에, 대상체에서 만성 감염(예를 들어, AIDS)과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 만성 감염(예를 들어, AIDS)과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
패혈증
패혈증은 조직 손상, 기관 부전, 및/또는 사망을 초래하는 감염에 대한 면역 반응이다. 일부 실시 양태에서, 대상체에서 패혈증과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 패혈증과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
단식
단식은 일정 기간 동안 일부 또는 모든 음식, 음료 또는 둘 다의 자발적 금욕 또는 감소이다. 일부 실시 양태에서, 대상체에서 단식과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 단식과 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
사르코페니아
사르코페니아는 보통의 노화 과정에서 근위축의 지속적인 과정으로 수개월 및 수년에 걸친 근육 질량과 근력의 점진적 손실을 특징으로 한다. 보통의 노화 과정은 본원에서 골격근 신경변성을 촉진하는 장애 및 질병의 존재에 의해 영향을 받거나 가속되지 않는 노화 과정을 의미한다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 사르코페니아와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 사르코페니아와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
글루코코르티코이드
관련 근위축증
일부 실시 양태에서, 글루코코르티코이드에 의한 치료로 근위축증이 또한 발생한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 및 프레드니솔론을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 글루코코르티코이드와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 글루코코르티코이드와 관련된 또는 이에 의해 유발된 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
불용 관련 근위축증
사지가 고정될 때(예를 들어, 사지 또는 관절 골절 또는 정형외과 수술, 예컨대 고관절 또는 무릎 대체 수술로 인해), 불용 관련 근위축증이 발생한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "고정" 또는 "고정된다"는 사지, 근육, 뼈, 힘줄, 관절, 또는 임의의 다른 신체 부위의 움직임을 연장된 기간 동안(예를 들어, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 일주일, 2주, 또는 그 이상 동안) 부분적으로 또는 완전히 제한하는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 고정 기간은 짧은 기간, 또는 목욕, 외부 장치 교체, 또는 외부 장치 조정과 같은 제한되지 않은 움직임의 경우를 포함한다. 사지 고정은 경우에 따라 버팀대, 슬링, 캐스트, 붕대, 및 부목(이들 중 임의의 것은 경우에 따라 천, 거즈, 섬유 유리, 플라스틱, 플라스터, 또는 금속을 포함하지만 이에 제한되지 않는 경질 또는 연질 재료로 구성됨)을 포함하는 임의의 다양한 외부 장치뿐 아니라, 섬유 유리, 플라스틱, 플라스터 또는 금속)뿐만 아니라 외과적으로 이식된 부목, 플레이트, 버팀대 등을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 내부 장치에 의해 수행된다. 사지 고정과 관련하여, 움직임의 제한은 단일 관절 또는 다중 관절(예를 들어, 어깨 관절 또는 고관절과 같은 단순 관절, 요수근 관절과 같은 복잡 관절, 및 무릎 관절과 같은 복합 관절, 이들은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않음: 손 관절, 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 손목 관절, 보조 관절, 흉쇄 관절, 척추 관절, 악관절, 천장 관절, 고관절, 무릎 관절, 및 발 관절), 단일 힘줄 또는 인대 또는 다중 힘줄 또는 인대(예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않음: 전방 십자 인대, 후방 십자 인대, 회전근개건, 팔꿈치 및 무릎의 내측 측부 인대, 손의 굴곡건, 발목의 측부 인대, 턱관절 또는 악관절의 힘줄 및 인대), 단일 뼈 또는 복합 뼈(예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않음: 두개골, 하악골, 쇄골, 갈비뼈, 요골, 척골, 상완골, 골반, 천골, 대퇴골, 슬개골, 지골, 손목뼈, 중수골, 발목뼈, 중족골, 비골, 경골, 견갑골, 및 척추), 단일 근육 또는 다중 근육(예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함 하나 이에 제한되지는 않음: 광배근, 승모근, 삼각근, 흉근, 이두근, 삼두근, 외복사근, 복근, 대둔근, 햄스트링, 사두근, 비복근, 및 가로막); 하나의 팔다리 또는 여러 팔다리(하나 이상의 팔 다리); 또는 전체 골격근계 또는 그 일부(예를 들어, 전신 캐스트 또는 스파이커 캐스트의 경우)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 대상체에서 불용 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 다른 실시 양태에서, 대상체에서 불용 관련 근위축증을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 폴리핵산 분자 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
약학 제제
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 제제는 비경구(예컨대, 정맥 내, 피하, 근육 내), 경구, 비강내, 협측, 직장, 또는 경피 투여 경로를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 다수의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물은 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 척수강 내, 뇌 내, 뇌실 내, 또는 두개 내) 투여용으로 제제화된다. 다른 경우, 본원에 기재된 약학 조성물은 경구 투여용으로 제제화된다. 다른 경우, 본원에 기재된 약학 조성물은 비강내 투여용으로 제제화된다.
일부 실시 양태에서, 약학 제제는 수성 액체 분산액, 자기 유화 분산액, 고체 용액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 고체 체형, 분말, 즉시 방출 제제, 제어 방출 제제, 고속 용융 제제, 정제, 캡슐, 환제, 지연 방출 제제, 서방형 제제, 맥동 방출 제제, 다중 미립자 제제(예를 들어, 나노입자 제제), 및 혼합 즉시 및 제어 방출 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 약학 제제는 다중 미립자 제제를 포함한다. 일부 경우에, 약학 제제는 나노입자 제제를 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 cMAP, 시클로덱스트린, 또는 지질을 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 고체 지질 나노입자, 중합체성 나노입자, 자가 유화 나노입자, 리포솜, 마이크로에멀젼, 또는 미셀 용액을 포함한다. 추가의 예시적인 나노입자는 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀러렌 유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머(예컨대, 공유 결합된 금속 킬레이트를 가짐), 나노섬유, 나노혼(nanohorn), 나노-오니온(nano-onion), 나노로드(nanorod), 나노로프(nanrope), 및 양자점을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 나노입자는 금속 나노입자, 예를 들어 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 니오븀, 몰리브덴, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 하프늄, 탄탈륨, 텅스텐, 레늄, 오스뮴, 이리듐, 백금, 금, 가돌리늄, 알루미늄, 갈륨, 인듐, 주석, 탈륨, 납, 비스무트, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨, 리튬, 나트륨, 칼륨, 붕소, 실리콘, 인, 게르마늄, 비소, 안티몬, 및 이들의 조합, 합금 또는 산화물의 나노입자이다.
일부 경우에, 나노입자는 코어-쉘 나노입자에서와 같이 코어 또는 코어 및 쉘을 포함한다.
일부 경우에, 나노입자는 작용성 요소의 부착을 위한 분자(예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티)로 추가로 코팅된다. 일부 경우에, 코팅은 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란 술페이트, 카르복시메틸 덱스트란, 알긴산, 펙틴, 카라기난, 후코이단, 아가로펙틴, 포르피란, 카라야 검, 젤란 검, 잔탄 검, 히알루론산, 글루코사민, 갈락토사민, 키틴(또는 키토산), 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 리소자임, 시토크롬 C, 리보뉴클레아제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, α-키모트립신, 폴리리신, 폴리아르기닌, 히스톤, 프로타민, 오브알부민 또는 덱스트린 또는 시클로덱스트린을 포함한다. 일부 경우에, 나노입자는 그래핀 코팅된 나노입자를 포함한다.
일부 경우에, 나노입자는 약 500nm, 400nm, 300nm, 200nm 또는 100nm 미만의 적어도 하나의 치수를 갖는다.
일부 경우에, 나노입자 제제는 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀러렌 유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머(예컨대, 공유 결합된 금속 킬레이트를 가짐), 나노섬유, 나노혼, 나노-오니온, 나노로드, 나노로프 또는 양자점을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티는 나노입자에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 폴리핵산 분자 또는 결합 모이어티는 나노입자에 직접 또는 간접적으로 접합된다.
일부 실시 양태에서, 약학 제제는 폴리핵산 분자의 세포로의 전달을 위한 전달 벡터, 예를 들어 재조합 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 재조합 벡터는 DNA 플라스미드이다. 다른 경우에, 재조합 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적인 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 알파 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 표적 세포에서 안정한 발현을 제공한다. 추가의 경우에, 폴리핵산 분자의 일시적 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용된다.
일부 실시 양태에서, 약학 제제는 본원에 개시된 조성물과의 적합성 및 목적하는 제형의 방출 프로파일 특성에 기초하여 선택된 담체 또는 담체 물질을 포함한다. 예시적인 담체 물질은 예를 들어 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면 활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. 약학적으로 적합한 담체 물질은 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 말토덱스트린, 글리세린, 마그네슘 실리케이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 카세인산나트륨, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 접합체, 당 소듐 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세리드, 디글리세리드, 전호화 전분 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed.(Lippincott Williams & Wilkins1999)]을 참조한다.
일부 경우에, 약학 제제는 pH 조정제 또는 완충제를 추가로 포함하며, 이는 산, 예컨대 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기, 예컨대 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 젖산나트륨 및 트리스-히드록시메틸아미노메탄; 및 완충제, 예컨대 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함한다. 이러한 산, 염기 및 완충제는 조성물의 pH를 허용 가능한 범위로 유지하는데 필요한 양으로 포함된다.
일부 경우에, 약학 제제는 조성물의 삼투압 농도를 허용 가능한 범위가 되도록 하기 위해 필요한 양의 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 비카르보네이트, 술페이트, 티오술페이트 또는 비술파이트 음이온을 갖는 염을 포함하고, 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 및 황산 암모늄을 포함한다.
일부 경우에, 약학 제제는 화합물을 안정화시키는데 사용되는 희석제를 추가로 포함하는데 그 이유는 이들이 더 안정한 환경을 제공하기 때문이다. 완충 용액에 용해된 염(또한 pH 제어 또는 유지를 제공함)은 포스페이트 완충 식염수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당 업계의 희석제로 사용된다. 특정 경우에, 희석제는 조성물의 부피를 증가시켜 압축을 용이하게 하거나 캡슐 충전을 위한 균일한 블렌드를 위해 충분한 부피를 생성한다. 이러한 화합물은 예를 들어 락토스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로스, 아비셀(Avicel)®과 같은 미세결정 셀룰로오스; 제이인산칼슘, 인산이칼슘 이수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토오스, 분무 건조된 락토오스; 전호화 전분, 압축성 당, 예컨대 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 히드록시 프로필메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 수크로오스계 희석제, 정제당(confectioner's sugar); 일염기성 황산칼슘 일수화물, 황산칼슘 이수화물; 젖산칼슘 삼수화물, 덱스트레이트; 가수분해된 곡물 고형물(cereal solid), 아밀로스; 분말 셀룰로오스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
일부 경우에, 약학 제제는 물질의 분해 또는 붕해를 촉진하기 위한 붕해제(disintegration agent 또는 disintegrant)를 포함한다. 용어 "붕해"는 위장액과 접촉할 때 제형의 용해 및 분산 둘 다를 포함한다. 붕해제의 예는 전분, 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 천연 전분, National 1551 또는 아미젤(Amijel)®과 같은 전호화 전분, 또는 프로모겔(Promogel)® 또는 엑스플로탭(Explotab)®과 같은 전분 글리콜산 나트륨, 목재 산물과 같은 셀룰로오스, 메틸 결정형 셀룰로오스, 예를 들어, 아비셀(Avicel)®, 아비셀® PH101, 아비셀® PH102, 아비셀® PH105, 엘세마(Elcema)® P100, 엠코셀(Emcocel)®, 비바셀(Vivacel)®, 밍 티아(Ming Tia)®, 및 솔카-플록(Solka-Floc)®, 메틸셀룰로오스, 크로스카르멜로스, 또는 가교된 셀룰로오스, 예컨대 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(Ac-Di-Sol®), 가교된 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 가교된 크로스카르멜로스, 전분 글리콜산 나트륨과 같은 가교된 전분, 가교된 중합체, 예컨대 크로스포비돈, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 알긴산과 같은 알지네이트 또는 알긴산나트륨과 같은 알긴산의 염, 비검(Veegum)® HV(마그네슘 알루미늄 실리케이트)와 같은 점토, 검, 예컨대 아가, 구아, 로커스트 빈, 카라야, 펙틴, 또는 트라가간트, 전분 글리콜산 나트륨, 벤토나이트, 천연 스펀지, 계면활성제, 수지, 예컨대 양이온 교환수지, 시트러스 펄프, 소듐 라우릴 술페이트, 전분과 조합된 소듐 라우릴 술페이트 등을 포함한다.
일부 경우에, 약학 제제는 충전제, 예컨대 락토오스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 제이인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 전호화 전분, 수크로오스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함한다.
윤활제 및 활택제는 또한 물질의 접착 또는 마찰을 방지, 감소 또는 억제하기 위해 본원에 기재된 약학 제제에 경우에 따라 포함된다. 예시적인 윤활제는, 예를 들어, 스테아르산, 수산화칼슘, 탈크, 소듐 스테아릴 푸마레이트, 탄화수소, 예컨대 광유, 또는 수소첨가 식물성 오일, 예컨대 수소첨가 대두유(스테로텍스(Sterotex)®), 고급 지방산 및 이들의 알칼리-금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 스테아르산나트륨, 글리세롤, 탈크, 왁스, 스테아로웨트(Stearowet)®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 카르보왁스(Carbowax)™, 올레산나트륨, 벤조산나트륨, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 소듐 라우릴 술페이트, 콜로이드성 실리카, 예컨대 실로이드(Syloid)™, Cab-O-Sil®, 전분, 예컨대 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 등을 포함한다.
가소제는 미세캡슐화 물질 또는 필름 코팅을 연화시켜 취성을 감소시키는 데 사용되는 화합물을 포함한다. 적합한 가소제는, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로오스 및 트리아세틴을 포함한다. 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.
가용화제는 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도큐세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, N-히드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 시클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알코올, 콜레스테롤, 담즙산염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코푸롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소소르비드 등과 같은 화합물을 포함한다.
안정화제는 임의의 항산화제, 완충제, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다.
현탁화제는 폴리비닐피롤리돈, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 분자량이 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400인 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 히드록시에틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 검, 예컨대 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아검, 잔탄검을 포함하는 잔탄, 당, 셀룰로오스 화합물, 예컨대, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡시화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡시화 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈 등과 같은 화합물을 포함한다.
계면활성제는 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도큐세이트, 트윈 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴록사머, 담즙산염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 공중합체, 예컨대, 플루로닉(Pluronic)®(BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 추가의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌(60) 수소첨가 피마자유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어, 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 때때로, 계면활성제는 물리적 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 포함된다.
점도 향상제는, 예를 들어, 메틸 셀룰로오스, 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 아세테이트 스테아레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 카르보머, 폴리비닐 알코올, 알지네이트, 아카시아, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다.
습윤제는 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 소듐 도큐세이트, 소듐 올레에이트, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 도큐세이트, 트리아세틴, 트윈 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등과 같은 화합물을 포함한다.
치료 요법
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 치료 적용을 위해 투여된다. 일부 실시 양태에서, 약학 조성물은 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 또는 그 이상 투여된다. 약학 조성물은 일일, 매일, 격일, 주 5일, 주 1회, 격주, 1개월에 2주, 1개월에 3주, 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 또는 그 이상 투여된다. 약학 조성물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 2년, 3년, 또는 그 이상 동안 투여된다.
일부 실시 양태에서, 하나 이상의 약학 조성물은 동시에, 순차적으로, 또는 일정 시간 간격으로 투여된다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 약학 조성물은 동시에 투여된다. 일부 경우, 하나 이상의 약학 조성물은 순차적으로 투여된다. 추가의 경우, 하나 이상의 약학 조성물은 일정 시간 간격으로 투여된다(예를 들어, 제1 약학 조성물의 첫 번째 투여는 제1일, 그 다음 적어도 제2 약학 조성물의 투여 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5일, 또는 그 이상의 간격)
일부 실시 양태에서, 2개 이상의 상이한 약학 조성물은 공동 투여된다. 일부 경우, 2개 이상의 상이한 약학 조성물은 동시에 공동 투여된다. 일부 경우에, 2개 이상의 상이한 약학 조성물은 투여 사이에 시간 간격 없이 순차적으로 공동 투여된다. 다른 경우에, 2개 이상의 상이한 약학 조성물은 투여 사이에 약 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 12시간, 1일, 2일, 또는 그 이상의 간격으로 순차적으로 공동 투여된다.
환자의 상태가 개선된 경우, 의사의 재량으로 조성물의 투여는 지속적으로 제공되며; 대안적으로, 투여되는 조성물의 용량은 일시적으로 감소되거나 특정 기간 일시적으로 중단된다(즉, "휴약기(drug holiday)"). 일부 경우, 휴약 기간은 2일 내지 1년으로 다양하며, 단지 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 또는 365일을 포함한다. 휴약기 동안의 용량 감소는 10% 내지 100%이며, 단지 예로써, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함한다.
환자의 병태가 개선되면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 이후, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는, 증상의 함수로서, 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 이러한 양에 상응하는 주어진 약제의 양은 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체 또는 숙주의 정체성(예를 들어, 체중)과 같은 인자에 따라 달라지지만, 그럼에도, 예를 들어, 투여되는 특정 제제, 투여 경로, 및 치료되는 대상체 또는 숙주를 포함하는, 사례를 둘러싼 구체적인 환경에 따라 당 업계에 알려진 방식으로 통상적으로 결정된다. 일부 경우에, 원하는 용량은 단일 용량으로서 간편하게 제공되거나 분할된 용량으로서 동시에(또는 짧은 기간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 매일 2, 3, 4가지 이상의 분할 용량(subdose)으로 투여된다.
개별 치료 요법에 관한 변수의 수가 많고, 이러한 권장 값으로부터 상당히 벗어나는 일이 드물지 않기 때문에 전술한 범위는 단지 제안적이다. 이러한 투여량은 사용되는 화합물의 활성, 치료될 질환 또는 병태, 투여 방식, 개별 대상체의 요건, 치료되는 질환 또는 병태의 중증도, 및 의사의 판단에 제한되지 않는 다수의 변수에 따라 변경된다.
일부 실시 양태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에 대한 치료 유효량)의 결정을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 세포 배양물 또는 실험동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수(therapeutic index)이며, 이는 LD50과 ED50 간의 비로서 표현된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 정하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 최소 독성을 갖는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라진다.
키트
/제조품
특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조품이 본원에 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함하며, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에서 사용되는 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 일 실시 양태에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조품은 포장재를 함유한다. 약학 포장재의 예는 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 임의의 포장재를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 용기(들)는 본원에 기재된 표적 핵산 분자를 포함한다. 이러한 키트는 경우에 따라 본원에 기재된 방법에서의 그의 용도와 관련된 확인 설명서 또는 라벨 또는 지침서를 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물을 열거하는 라벨 및/또는 사용을 위한 지침서 및 사용을 위한 지침서가 있는 포장 삽입물을 포함한다. 지침서 세트가 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일 실시 양태에서, 라벨은 용기 상에 있거나 또는 용기와 결합된다. 일 실시 양태에서, 라벨을 형성하는 글자, 숫자, 또는 다른 문자가 용기 자체에 부착되거나, 성형되거나, 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있으며; 라벨이, 예를 들어 포장 삽입물로서, 용기를 또한 담는 통 또는 캐리어 내에 존재할 때, 라벨은 용기와 결합된다. 일 실시 양태에서, 라벨은 내용물이 특정 치료 용도로 사용되어야 한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 라벨은 또한 본원에 기재된 방법에서와 같이 내용물의 사용을 위한 지시를 나타낸다.
특정 실시 양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 화합물을 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 함유하는 팩 또는 디스펜서 장치에 제공된다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 함유한다. 일 실시 양태에서, 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지침서가 동반된다. 일 실시 양태에서, 팩 또는 디스펜서는 또한 의약품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 결합된 안내문과 동반되며, 이 안내문은 인간 또는 동물 투여를 위한 약물 형태의 기관에 의한 승인을 반영한다. 이러한 안내문은, 예를 들어, 처방 약물, 또는 승인된 제품 삽입물에 대해 미국 식품의약국에 의해 승인된 라벨이다. 일 실시 양태에서, 적합성 약학 담체에 제제화된 본원에 제공된 화합물을 함유하는 조성물은 또한 제조되고, 적절한 용기에 담기고, 표시된 병태의 치료를 위해 라벨된다.
특정
용어학
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 청구된 주제가 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 전술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 어떠한 주제도 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한하는 것이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있는 것으로 예측되는 양을 포함한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "개체(들)", "대상체(들)" 및 "환자(들)"는 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시 양태에서, 포유동물은 비인간이다. 상기 용어들은 보건 전문가(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 임상 간호사, 의료 보조자, 잡역부 또는 호스피스 직원)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)에 의해 특성화되는 상황을 요구하거나 이에 제한되지 않는다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물 대상체에서 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 폴리핵산 분자 접합체의 양과 관련된다. 일부 경우에, 양은 장애 또는 재발하는 장애의 적어도 하나의 증상의 치료, 예방, 발병의 예방, 치유, 지연, 중증도 감소, 경감을 위해 또는 이러한 치료가 없을 경우 예상되는 것보다 환자의 생존의 연장을 위해 환자(예컨대 인간)에게 투여되는 단일 또는 다중 용량이다. 당연히, 치료적 유효량을 제공하기 위해 사용되는 특정 폴리핵산 분자 접합체의 투여량 수준은 손상의 유형, 연령, 체중, 성별, 대상체의 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정 억제제에 따라 달라진다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료 유효량의 폴리핵산 분자 접합체는 초기에 세포 배양 및 동물 모델로부터 추정된다. 예를 들어, 세포 배양 방법에서 결정된 IC50 값은 경우에 따라 동물 모델의 출발점으로 사용되지만, 동물 모델에서 결정된 IC50 값은 경우에 따라 인간에서 치료 유효량을 확인하는데 사용된다.
골격근, 또는 수의근은 일반적으로 힘줄에 의해 뼈에 고정되며 운동과 같은 골격 움직임 수행 또는 자세 유지에 일반적으로 사용된다. 골격근의 일부 통제는 일반적으로 무의식 반사(예를 들어, 자세 근육 또는 가로막)로서 유지되지만 골격근은 의식적 통제에 반응한다. 평활근 또는 불수의근은 식도, 위, 내장, 자궁, 요도, 및 혈관과 같은 기관 및 구조물의 벽에서 발견된다.
골격근은 2가지 넓은 유형으로 더 나뉜다: I형(또는 "지근(slow twitch)") 및 II형(또는 "속근(fast twitch)"). I형 근섬유는 모세 혈관이 치밀하고, 미토콘드리아 및 미오글로빈이 풍부하여, I형 근육 조직에 특징적인 붉은색을 제공한다. 일부 경우에, I형 근섬유는 연료로 지방 또는 탄수화물을 사용하여 더 많은 산소를 운반하고 호기성 활동을 유지한다. I형 근섬유는 장기간 수축하지만 힘이 거의 없다. II형 근섬유는 수축 속도와 생성된 힘의 변화에서 달라지는 세 가지 주요 하위 유형(IIa, IIx 및 IIb)으로 세분화된다. II형 근섬유는 신속하고 강력하게 수축하지만 매우 빠르게 피로하므로 짧은 혐기성 활동만 발생한 후 근육 수축은 통증이 생긴다,
골격근과 달리 평활근은 의식적인 통제를 받지 않는다.
심장 근육은 또한 불수의근이지만 구조상 골격근과 더욱 유사하며 심장에서만 발견된다. 심장 근육과 골격근은 매우 규칙적인 배열의 다발로 밀집된 근섬유 분절을 포함한다는 점에서 줄무늬가 있다. 대조적으로, 평활근 세포의 근원섬유는 근섬유 분절로 배열되지 않으므로 줄무늬가 없다.
근육 세포는 근육 조직에 기여하는 임의의 세포를 포함한다. 예시적인 근육 세포는 근원세포, 위성 세포, 근관, 및 근원섬유 조직을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 근력은 단면적(CSA)에 비례하고, 근육 속도는 근섬유 길이에 비례한다. 따라서, 다양한 종류의 근육 사이의 단면적과 근섬유를 비교하여 근위축증의 징후를 제공할 수 있다. 근력 및 근육 중량을 측정하기 위한 다양한 방법이 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌["Musculoskeletal assessment: Joint range of motion and manual muscle strength"by Hazel M. Clarkson, published by Lippincott Williams & Wilkins, 2000]을 참조한다. 계산된 CAT(computed axial tomography) 및 초음파 평가에 의해 선택된 근육 조직으로부터의 단층 이미지 생성은 근육 질량을 측정하는 추가적인 방법이다.
실시예
이들 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며 본원에 제공된 청구 범위의 범주를 제한하지는 않는다.
실시예
1.
siRNA
서열 및 합성
모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 수득하였다. 모든 siRNA 패신저 가닥은 가닥의 각 말단에 하나, 상이한 형식의 C6-NH2 및/또는 C6-SH의 접합 핸들을 함유한다. 접합 핸들 또는 접합 핸들들을 역위된 무염기 포스포디에스테르 또는 포스포로 티오에이트를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 아래는 생체 내 실험에 사용되는 형식의 대표적인 구조이다.
5' 말단에 C6-NH2 접합 핸들 및 3' 말단에 C6-SH를 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
5' 말단에 C6-NH2 접합 핸들 및 3' 말단에 C6-S-PEG를 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
5' 말단에 C6-NH2 접합 핸들 및 3' 말단에 C6-S-NEM을 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
5' 말단에 C6-N-SMCC 접합 핸들 및 3' 말단에 C6-S-NEM을 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
5' 말단에서 PEG 및 3' 말단에 C6-SH를 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
5' 말단에 C6-S-NEM 및 3' 말단에 C6-NH2 접합 핸들을 갖는 siRNA 패신저 가닥의 대표적인 구조.
콜레스테롤-
미오스타틴
siRNA
접합체
가이드/안티센스 가닥의 서열은 MSTN에 대한 마우스 mRNA 전사체의 염기 위치 1169를 시작하는 유전자 서열에 상보적이었다(UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU; 서열 번호 14226). 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 [도 1]에 도시된 바와 같이 접합되는 5' 콜레스테롤을 함유하였다.
실시예
2. 일반적인 실험 프로토콜 및 재료
동물
모든 동물 연구는 Explora BioLabs의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC: Institutional Animal Care and Use Committee)에 따른 프로토콜에 따라 수행하였으며, 이는 USDA 동물 복지법에 개설된 규정 및 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(National Research Council publication, 8th Ed., 2011년 개정)를 준수한다. 모든 마우스는 Charles River Laboratories 또는 Harlan Laboratories에서 구입하였다.
야생형 CD-1 마우스(4-6 주령)를 지시된 ASC(또는 항체-핵산 접합체) 및 용량으로 정맥 내(iv) 주사를 통해 투여하였다.
항-
트랜스페린
수용체 항체
항-마우스 트랜스페린 수용체 항체 또는 CD71 mAb는 마우스 CD71 또는 마우스 트랜스페린 수용체 1(mTfR1)에 결합하는 랫트 IgG2a 서브 클래스 단클론 항체이다. 항체는 BioXcell에서 생산하였으며 이는 시판되고있다(카탈로그 번호 BE0175).
IgG2a
아이소형
대조군 항체
랫트 IgG2a 아이소형 대조군 항체는 BioXcell(클론 2A3, 카탈로그 번호 BE0089)로부터 구입하였고 이 항체는 트리니트로페놀에 특이적이고, 마우스에서 공지된 항원을 전혀 갖지 않는다.
항-
EGFR
항체
항-EGFR 항체는 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 완전 인간 IgG1κ 단클론 항체이다. 이는 인간 항-EGFR 항체 생산 하이브리도마 세포주(2F8)로부터 유래한 항체 유전자를 보유하는 GS 벡터로 형질 감염시켜 중국 햄스터 난소 세포주 CHO-K1SV로부터 유래한 CHO 세포주 DJT33에서 생산하였다. 항-EGFR 항체의 제조에는 표준 포유동물 세포 배양 및 정제 기술을 사용한다.
글리칸이 없는 항-EGFR 항체의 이론적 분자량(MW)은 146.6 kDa이다. 항체의 주요 글리코실화된 아이소형의 실험적 MW는 질량 분석법에 의해 측정시 149 kDa이다. 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 사용하여 경쇄의 MW는 대략 25 kDa, 중쇄의 MW는 대략 50 kDa인 것으로 확인되었다. 중쇄는 2개의 쇄간 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 하나의 경쇄는 단일 쇄간 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 부착된다. 경쇄는 2개의 쇄내 이황화 결합을 갖고 중쇄는 4개의 쇄 내 이황화 결합을 갖는다. 항체는 중쇄의 Asn305에서 N-아세틸-글루코사민, 만노스, 푸코스 및 갈락토스로 구성된 글리칸으로 N-연결된 글리코실화된다. 존재하는 우세한 글리칸은 0 또는 하나의 말단 갈락토오스 잔기를 함유하는 푸코실화된 이중 안테나 구조이다.
IgG1κ 항체의 하전된 아이소형 패턴은 영상화 모세관 IEF, 아가로스 IEF 및 분석 양이온 교환 HPLC를 사용하여 조사하였다. 다수의 하전된 아이소형이 발견되며, 주 아이소형은 대략 8.7의 등전점을 갖는다.
항-EGFR 항체의 주요 작용 메커니즘은 A431 암세포에서 EGF 유도된 EGFR 인산화의 농도 의존적 억제이다. 또한, 전임상 세포 시험관 내 연구에서 낮은 항체 농도에서 항체-의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)의 유도를 관찰하였다.
siRNA
효능 및 효율의 시험관 내 평가
C2C12 근원세포(ATCC)를 10% v/v FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형질 감염을 위해, 세포를 24 웰 플레이트에서 10.000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 24시간 내에 형질 감염시켰다. 2% v/v 말 혈청이 보충된 DMEM에서 합류 C2C12 근원세포 배양물을 3 내지 4일 동안 인큐베이션하여 C2C12 근관을 생성하였다. 분화 중 및 후에 배지를 매일 교체하였다. 사전-분화된(pre-differentiated) 1차 인간 골격근 세포를 ThermoFisher로부터 구입하고, 제조사의 권고에 따라 2% v/v 말 혈청 포함 DMEM에 플레이팅하였다. 인간 SJCRH30 횡문근육종 근원세포(ATCC)를 10% v/v 열 불활성화 태아 송아지 혈청, 4.5 mg/mL 글루코오스, 4 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 및 1 mM 피루브산나트륨이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형질 감염을 위해, 세포를 24 웰 플레이트에서 10.000 내지 20.000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 24시간 내에 형질 감염시켰다. 모든 세포를 제조자의 권고에 따라 RNAiMax(ThermoFisher)를 사용하여 다양한 농도의 siRNA(0.0001 내지 100 nM; 10배 희석)로 형질 감염시켰다. 형질 감염된 세포를 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 세척하고, 300 ul TRIzol(ThermoFisher)에 수거하고 -80℃에 저장하였다. ZYMO 96 웰 RNA 키트(ThermoFisher)를 사용하여 RNA를 제조하고 시판되는 TaqMan 프로브(LifeTechnology)를 사용하는 RT-qPCR에 의해 상대적인 RNA 발현 수준을 정량화하였다. 발현 데이터는 Ppib에 정규화된 □□CT에 방법을 이용하여 분석하고, 모의 형질 감염된 세포에 대한 % KD로 나타낸다. 3 파라미터 용량 반응 억제 함수(GraphPadPrism 7.02)를 이용한 비선형 회귀에 의해 데이터를 분석하였다. 모든 녹다운 결과는 이 실험 조건하에서 관찰된 최대 KD를 나타낸다.
미오스타틴
ELISA
혈장 내 미오스타틴 단백질은 제조사의 지시에 따라 R&D Systems의 GDF-8(Myostatin) Quantikine ELISA Immunoassay(part# DGDF80)를 사용하여 정량화하였다.
RISC 로딩 분석
조직 용해물로부터 RISC의 특이적인 면역 침전 및 면역 침전물 중 작은 RNA의 정량은 문헌[Pei et al. Quantitative evaluation of siRNA delivery in vivo. RNA (2010), 16:2553-2563]에 기술된 분석을 적용하여 줄기-루프 PCR에 의해 결정하였다.
실시예
3. 접합체 합성
하기 구조는 본원에 기재된 예시적인 A-X1-B-X2-Y (화학식 I) 아키텍처를 도시한다.
아키텍처-1: 항체-Cys-SMCC-5'-패신저 가닥. 이 접합체는 패신저 가닥의 5' 말단에서 말레이미드(SMCC)에 항체 쇄간 시스테인 접합에 의해 생성되었다.
아키텍처-2 : 항체-Cys-SMCC-3'-패신저 가닥. 이 접합체는 패신저 가닥의 3' 말단에서 말레이미드(SMCC)에 항체 쇄간 시스테인 접합에 의해 생성되었다.
ASC 아키텍처-3: 항체-Cys-bisMal-3'-패신저 가닥. 이 접합체는 패신저 가닥의 3' 말단에서 비스말레이미드(bisMal) 링커에 항체 쇄간 시스테인 접합에 의해 생성되었다.
ASC 아키텍처-4: Fab-Cys-bisMal-3'-패신저 가닥의 모델 구조. 이 접합체는 패신저 가닥의 3' 말단에서 비스말레이미드(bisMal) 링커에 Fab 쇄간 시스테인 접합에 의해 생성되었다.
ASC 아키텍처-5: 하나의 항체 분자에 부착된 2개의 상이한 siRNA를 갖는 항체 siRNA 접합체의 모델 구조. 이 접합체는 SSB 및 HPRT siRNA의 혼합물을 각 siRNA의 패신저 가닥의 3' 말단에서 비스말레이미드(bisMal) 링커에 환원된 mAb 쇄간 시스테인에 의해 접합시킴으로써 생성되었다.
ASC 아키텍처- 6: 2개의 상이한 siRNA가 부착된 항체 siRNA 접합체의 모델 구조. 이 접합체는 SSB 및 HPRT siRNA의 혼합물을 각 siRNA의 패신저 가닥의 3' 말단에서말레이미드(SMCC) 링커에 환원된 mAb 쇄간 시스테인에 의해 접합시킴으로써 생성되었다.
실시예
3.1:
SMCC
링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
합성 반응식-1 : 항체 시스테인 접합을 통한 항체-
Cys
-
SMCC
-
siRNA
-PEG 접합체
단계 1:
TCEP에
의한 항체 쇄간
이황화
환원
항체를 붕사 완충액(pH 8)으로 완충액 교환하고 최대 10 mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 물 중 2 당량의 TCEP를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 생성된 반응 혼합물을 5 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4 PBS와 완충액 교환하고 실온에서 5 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4 PBS 중 SMCC-C6-siRNA 또는 SMCC-C6-siRNA-C6-NHCO-PEG-XkDa(2 당량)(X = 0.5 kDa 내지 10 kDa)의 용액에 첨가하고, 밤새 회전시켰다. 분석 SAX 칼럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 실시예 3.4에 기재된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용하여 AKTA explorer FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR>2 항체-siRNA-PEG 접합체를 함유하는 분획을 분리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS와 완충액 교환하였다.
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체는 SEC, SAX 크로마토그래피 및 SDS-PAGE로 특성화하였다. 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2 또는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-3을 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다. 두 방법 모두 실시예 3.4에 설명되어 있다. 단리된 DAR1 접합체는 전형적으로 분석 SAX 방법에서 9.0±0.3분에 용리되고 순도는 90% 초과이다. 전형적인 DAR>2 시스테인 접합체는 85% 초과의 DAR2 및 15% 미만의 DAR3을 함유한다.
[도 2]는 TfR mAb-(Cys)-HPRT-PEG5k, DAR1의 SAX HPLC 크로마토그램을 도시한다.
[도 3]은 TfR mAb-(Cys)-HPRT-PEG5k, DAR1의 SEC HPLC 크로마토그램을 도시한다.
실시예
3.2.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
합성 반응식-2: 항체-
Cys
-
BisMal
-
siRNA
-PEG 접합체
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 붕사 완충액(pH 8)으로 완충제 교환하고 최대 5mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 물 중 2 당량의 TCEP를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 생성된 반응 혼합물을 5mM EDTA를 함유하는 pH 7.4 PBS와 교환하고 실온에서 5mM EDTA를 함유하는 pH 7.4 PBS 중 BisMal-C6-siRNA-C6-S-NEM(2 당량)의 용액에 첨가하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 칼럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용하여 AKTA explorer FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 분리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS와 완충액 교환하였다.
단계 3 : 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체는 질량 분석 또는 SDS-PAGE로 특성화하였다. 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2 또는 3뿐만 아니라 크기 배제 크로마토그래피 방법-1을 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
[도 4]는 TfR1mAb-Cys-BisMal-siRNA 접합체의 DAR1 및 DAR2 SAX HPLC 크로마토그램의 오버레이를 도시한다.
[도 5]는 TfR1mAb-Cys-BisMal-siRNA 접합체의 DAR1 및 DAR2 SEC HPLC 크로마토그램의 오버레이를 도시한다.
실시예
3.3.
mAb로부터
Fab
' 생성 및
siRNA와의
접합
반응식-3 :
Fab
-
siRNA
접합체 생성
단계 1: 펩신에 의한 항체 분해
항체를 pH 4.0, 20 mM 아세트산나트륨/아세트산 완충액으로 완충액 교환하고 최대 5mg/ml 농도로 만들었다. 고정화된 펩신(Thermo Scientific, Prod# 20343)을 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 30 kDa MWCO Amicon 스핀 필터 및 pH 7.4 PBS를 사용하여 여과하였다. 잔류물을 수집하고 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 F(ab')2를 단리하였다. 수집한 F(ab')2를 10 당량의 TCEP에 의해 환원시키고 pH 7.4 PBS에서 실온에서 SMCC-C6-siRNA-PEG5와 접합시켰다. SAX 크로마토그래피에서 반응 혼합물의 분석은 미반응 Fab 및 siRNA-PEG와 함께 Fab-siRNA 접합체를 보였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 방법-1을 사용하여 AKTA explorer FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 Fab-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 분리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS와 완충액 교환하였다.
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 특성화 및 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2 또는 3뿐만 아니라 및 SEC 방법-1을 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다.
[도 6]은 CD71 Fab-Cys-HPRT-PEG5의 SEC 크로마토그램을 도시한다.
[도 7]은 CD71 Fab-Cys-HPRT-PEG5의 SAX 크로마토그램을 도시한다.
실시예
3.4. 정제 및 분석 방법
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
1. 칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
2. 용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
3. 구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1.00
c.
60
40
18.00
d.
40
60
2.00
e.
40
60
5.00
f.
0
100
2.00
g.
100
0
2.00
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2.
1.
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
3. 구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
13.00
40
60
f.
15.00
90
10
g.
20.00
90
10
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-3.
1. 칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
2. 용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl
3. 유속: 0.75 ml/분
4. 구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
23.00
40
60
f.
25.00
90
10
g.
30.00
90
10
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법-1
1. 칼럼: TOSOH Biosciences, TSKgelG3000SW XL, 7.8 X 300 mm, 5μM
2. 이동상: 150 mM 포스페이트 완충액
3. 유속: 15분 동안 1.0 ml/분
실시예
4. 시험관 내 스크리닝:
아트로진
-1
마우스 및 인간/
NHP
아트로진
-1의 조절을 위한
siRNA의
확인
생물 정보학 스크리닝을 수행하여 마우스 아트로진-1(Fbxo32; NM_026346.3)에 특이적으로 결합하는 56개의 siRNA(19mer)를 확인하였다. 또한, 마우스 아트로진-1 및 인간 아트로진-1(FBXO32; NM_058229.3)을 표적화하는 6개의 siRNA를 확인하였다. 인간/NHP 아트로진-1(FBXO32; NM_058229.3)을 특이적으로 표적화하는 siRNA(19mer)에 대한 스크리닝으로 52개의 후보를 얻었다(표 2A 내지 표 2B). 선택된 모든 siRNA 표적 부위는 SNP(위치 2-18)를 보유하지 않는다.
표 2A 및 2B는 마우스 및 인간/NHP 아트로진-1의 조절을 위한 확인된 siRNA 후보를 나타낸다.
[표 2A]
[표 2B]
형질 감염된 마우스
C2C12
근원세포, 마우스
C2C12
근관
, 1차 인간 골격근 세포의
사전
-분화된
근관
, 및 인간
SJCRH30
횡문근육종
근원세포에서의 선택된
아트로진
-1
siRNA의
평가.
마우스 아트로진-1를 표적화하는 62개 및 인간 아트로진-1을 표적화하는 52개의 확인된 siRNA로부터 합성 및 기능 분석을 위해 각각 30 및 20개의 siRNA를 선택하였다. 이들 siRNA의 활성을 형질 감염된 마우스 C2C12 근원세포, 마우스 C2C12 근관, 1차 인간 골격근 세포의 사전-분화된 근관, 및 인간 SJCRH30 횡문근육종 근원세포에서 분석하였다.
마우스 아트로진-1을 표적화하는 시험된 siRNA 중 어느 것도 마우스 C2C12 근관(10 nM에서)에서 유의한 활성을 나타내지 않았지만, 3개의 siRNA는 C2C12 근원세포에서 마우스 아트로진-1 mRNA를 >75% 하향 조절하였다(표 3). 대조적으로, C2C12 근관에서 독점적으로 발현되는 Murf1을 표적화하는 siRNA(도 8)는 C2C12 근관에서 활성적이며, 이는 siRNA가 C2C12 근관 내로 형질 감염될 수 있음을 입증한다. C2C12 근원세포 및 근관에서 아트로진-1이 선택적으로 스플라이싱될 수 있는지를 결정하기 위해, RT-qPCR에 의해 아트로진-1 mRNA의 다양한 위치를 탐침하였지만 유사한 결과를 얻었다. 인간 아트로진-1을 표적화하는 20개의 시험된 siRNA 중 단지 4개만이 >75% KD를 얻었다. 마우스 및 인간 아트로진-1 둘 다에 대해, 활성 siRNA는 코딩 영역 내에 또는 코딩 영역에 근접하여 위치하였다. 마우스 아트로진-1을 표적화하는 siRNA 중 하나(1179)는 인간 아트로진-1과 강력한 교차 반응성을 보였다. 이 siRNA는 마우스 C2C12 근관에서 유의한 활성을 나타내지 못했지만, 1차 인간 골격근 세포의 근관에서 인간 아트로진-1을 효과적으로 하향 조절하였다. 모든 효과적인 siRNA는 나노 몰 이하의 역가로 각각의 표적을 하향 조절하였다.
표 3은 형질 감염된 마우스 C2C12 근원세포, 마우스 C2C12 근관, 1차 인간 골격근 세포의 사전-분화된 근관, 및 인간 SJCRH30 횡문근육종 근원세포에서의 선택된 아트로진-1 siRNA의 활성을 나타낸다. 실험 절차는 실시예 2를 참조한다.
[표 3]
실시예
5. 시험관 내 스크리닝:
MuRF
-1
마우스
Murf1
(
Trim63
) 및/또는 인간/
NHP
MuRF1(TRIM63)을
표적화하는
siRNA의 확인
생물정보학 스크리닝을 수행하여 마우스 Murf2(Trim55; NM_001039048.2) 또는 Murf3(Trim54)으로부터 >3 서열 유도체화를 나타내는 마우스 Murf1 서열에 특이적으로 결합하는 51개의 siRNA(19mer)를 확인하였다. 또한, 마우스 Murf1 및 인간 MuRF1(TRIM63; NM_032588.3)을 표적화하는 9개의 siRNA를 확인하였다. 인간 및 NHP MuRF1(NM_032588.3)을 특이적으로 표적화하는 siRNA(19mer)에 대한 스크리닝으로 52개의 후보를 얻었다(표 4A 내지 표 4B). 선택된 모든 siRNA 표적 부위는 SNP(위치 2-18)를 보유하지 않는다.
표 4A 및 4B는 마우스 및 인간/NHP MuRF1의 조절을 위한 확인된 siRNA 후보를 나타낸다.
[표 4A]
[표 4B]
형질 감염된 마우스
C2C12
근관
및 1차 인간 골격근 세포의 사전-분화된 근관에서의 선택된 MuRF1 siRNA의 활성
확인된 마우스 Murf1을 표적화하는 확인된 60개 및 인간 MuRF1을 표적화하는 25개의 siRNA로부터 합성을 위해 각각 35 및 25개의 siRNA를 선택하였다. 이들 siRNA의 활성을 형질 감염된 마우스 C2C12 근관 및 사전-분화된 1차 인간 골격근 세포에서 분석하였다(표 5). 마우스 MurF1을 표적화하는 siRNA 중 14개는 Murf1의 >70% 녹다운을 나타냈지만, C2C12 근관에서 Murf2 및 Murf3의 <20% 녹다운을 나타냈다. 이들 14개의 siRNA 중 적어도 6개는 인간 MuRF1과 교차 반응성을 보였다. 인간 MuRF1을 표적화하는 시험된 siRNA 중 8개는 MuRF1의 >70% 녹다운을 나타냈지만, 1차 인간 골격근 세포의 사전-분화된 근관에서 MuRF2 및 MuRF3의 <20% 녹다운을 나타냈다. 이들 8개의 siRNA 중 하나만이 마우스 Muf1과의 유의한 교차 반응성을 보였다. 모든 효과적인 siRNA는 나노 몰 이하의 역가로 각각의 표적을 하향 조절하였다.
표 5는 형질 감염된 마우스 C2C12 근관 및 1차 인간 골격근 세포의 사전-분화된 근관에서의 선택된 MuRF1 siRNA의 활성을 나타낸다. 세포를 배양하고 형질 감염시키고 RNA를 단리하고 실시예 5에 기재된 바와 같이 분석하였다.
[표 5]
실시예
6. 2017-PK-279-WT-CD71 vs
IgG2A
아이소형
,
HPRT
vs
MSTN
siRNA
설계 및 합성
MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
HPRT: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU (서열 번호 14227)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 3' 말단에 C6-NH2 및 5'말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
음성 대조군 siRNA 서열(스크램블): 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 공개된(Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60) 21mer 이중체를 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)였다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA DAR1 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조, 정제 및 특성화하였다. 모든 접합체는 시스테인 접합, SMCC 링커를 통해 제조하였고, MSTN 및 스크램블 siRNA에 대해 아키텍처 1을 사용하고 HPRT siRNA에 대해 아키텍처 2를 사용하여 PEG를 티올에 부착하였다. 실시예 3을 참조한다. 접합체는 표 6에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 6]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다. [도 9a]를 참조한다. 96시간 후, 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자(housekeeping gene))를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
결과
투여 후 96시간에 수거된 비복근 근육의 경우, 3 mg/kg의 siRNA의 단일 정맥 투여 후 90% 초과의 최대 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다, [도 9b]를 참조한다. 추가로, 용량 반응이 또한 관찰되었고(용량 범위: 0.3 내지 3.0 mg/kg siRNA) 대조군 그룹에 대해 유의한 mRNA 하향 조절이 관찰되지 않았다.
결론
비복근 근육에서, ASC가 근육 특이적 유전자를 하향 조절할 수 있다는 것이 입증되었다. ASC는 MSTN mRNA를 하향 조절하도록 설계된 siRNA에 접합된 항-트랜스페린 항체로 만들어졌다. 마우스 비복근 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 비복근 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 MSTN mRNA의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
7. 표현형
siRNA
설계 및 합성을 위한 2017-PK-289-WT-CD71
mAb
MSTN
시간 경과
MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUGUUUUGCCUU (서열 번호 : 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
음성 대조군 siRNA 서열(스크램블): 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 공개된(Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60) 21mer 이중체를 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)였다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA DAR1 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조, 정제 및 특성화하였다. 모든 접합체는 시스테인 접합, SMCC 링커를 통해 제조하였고, 아키텍처 1을 사용하여 티올을 NEM으로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 7에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 7]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 10a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 혈장 및 조직 샘플을 또한 [도 10a]에 나타낸 바와 같이 취하였다. 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
ELISA를 사용하여 혈장 미오스타틴 수준을 결정하였다. 전체 실험 세부 사항은 실시예 2를 참조한다. 다리 근육 면적에서의 변화를 결정하였다: 측정할 다리를 면도하고 측정 영역을 표시하기 위해 지워지지 않는 잉크를 사용하여 선을 그렸다. 마우스를 원추형 구속 장치로 구속하고 오른쪽 다리를 손으로 잡았다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 시상 면에서 한 번 측정하고 관상 면에서 한번 측정하였다. 이 절차를 주 2회 반복하였다.
결과
항체 siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후 근육 조직에서 siRNA의 정량화 가능한 수준이 축적되었다. [도 10b]를 참조한다. 강력한 MSTN mRNA 하향 조절이 비복근 근육에서 관찰되었으며, 이는 3 ㎎/㎏의 siRNA의 단일 정맥 투여 후 혈장에서 MSTN 단백질의 수준을 감소시켰다, [도 10c] 및 [도 10d]를 참조한다. 투여 후 7 내지 14일 사이에 ~90%의 최대 mRNA 하향 조절이 관찰되었다. 투여 후 6주에 비복근 근육은 대략 75% mRNA 하향 조절을 보였으며, 이는 PBS 또는 항-트랜스페린 항체 접합된 스크램블 대조군에 비해 혈장 단백질 수준의 약 50% 감소에 해당한다. MSTN의 하향 조절은 근육 크기의 통계적으로 유의미한 증가를 초래하였다. [도 10c] 및 [도 10f]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 항-트랜스페린 항체 표적화된 siRNA 접합체의 단일 투여 후 다양한 근육 조직에서 siRNA의 축적이 입증되었다. 비복근 근육에서, 유의하고 오래 지속되는 siRNA 매개 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다. 마우스 비복근 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고, 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 비복근 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 MSTN 유전자의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
8: 2017
-PK-299-WT-
MSTN
Zalu
vs
TfR
,
mAb
vs
Fab
,
DAR1
vs
DAR2
siRNA 설계 및 합성
MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
MSTN*: MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 하나의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였고, 이를 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA DAR1 및 DAR2 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조, 정제 및 특성화하였다. 그룹 1-8 및 17-20은 아키텍처 3을 사용하여 시스테인 접합 및 BisMal 링커를 통해 만들었다. 그룹 9-16은 시스테인 접합, SMCC 링커를 사용하여 만들었고 유리 티올은 아키텍처 1을 사용하여 NEM PEG로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 8에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 8]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 11a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 혈장 및 조직 샘플을 또한 [도 11a]에 나타낸 바와 같이 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
결과
항체 및 Fab siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후 근육 조직에서 정량화 가능한 수준의 siRNA가 축적되었다. [도 11b]를 참조한다. 항-트랜스페린 항체 접합체가 DAR1 또는 DAR2로서, 또는 Fab DAR1 접합체로서 투여될 때 비복근 근육에서 강력한 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다. [도 11c]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 항-트랜스페린 항체 및 Fab 표적화된 siRNA 접합체의 단일 투여 후 비복근 근육 조직에서 siRNA의 축적이 입증되었다. 비복근 근육에서, DAR1 Fab 접합체 이외에, DAR1 및 DAR2 항체 접합체에 의한 siRNA 매개 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다. 마우스 비복근 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고, 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체 또는 Fab를 가지므로, 비복근 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 MSTN 유전자의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
9: 2017
-PK-303-WT-용량 반응
MSTN
mAb
vs
Fab
vs
Chol
siRNA
설계 및 합성
MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
MSTN*: MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 하나의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였고, 이를 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
음성 대조군 siRNA 서열(스크램블): 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 공개된(Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60) 21mer 이중체를 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA DAR1 및 DAR2 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 특성화하였다. 그룹 5-12는 아키텍처 3을 사용하여 시스테인 접합 및 BisMal 링커를 통해 만들었다. 그룹 13-16은 시스테인 접합, SMCC 링커를 사용하여 만들었고 유리 티올은 아키텍처 1을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 그룹 17-20은 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었고, 유리 티올은 아키텍처 3을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 9에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 9]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 12a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 조직 샘플은 또한 [도 12a]에 나타낸 바와 같이 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
세포 내 RISC 로딩은 실시예 2에 기재된 바와 같이 결정하였다.
결과
항체 및 Fab siRNA 접합체의 단일 정맥 투여 후 비복근 및 심장 조직에서 정량 가능한 수준의 siRNA가 축적되었다. [도 12b]를 참조한다. ASC가 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 Fab로 표적화될 때 비복근 근육에서 강력한 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다, [도 12b] 및 [도 12c]를 참조한다. 훨씬 더 높은 농도의 siRNA가 심장 조직으로 전달되었지만, 이는 강력한 미오스타틴 mRNA 하향 조절을 초래하지 않았다. [도 12b]를 참조한다. 콜레스테롤 siRNA 접합체와 비교하여, 동등한 mRNA 하향 조절을 달성하기 위해 훨씬 더 낮은 용량의 ASC가 요구되었다. MSTN siRNA 가이드 가닥의 RISC 로딩량은 mRNA의 하향 조절과 상관 관계가 있었다. [도 12d]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 항-트랜스페린 항체 및 Fab 표적화된 siRNA 접합체의 단일 투여 후 비복근 근육 조직에서 siRNA의 축적이 입증되었다. 비복근 근육에서, DAR1 항-트랜스페린 항체 또는 Fab 접합체에 의한 siRNA 매개 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다. 마우스 비복근 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고, 접합체는 페이로드를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체 또는 Fab를 가지므로, 비복근 근육에 접합체의 축적 및 RISC 복합체로의 로딩을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 siRNA 매개 MSTN mRNA 하향 조절을 초래하였다.
실시예
10:
MSTN
표현형
mAb
vs
Chol
siRNA을
갖는 2017-PK-304-WT-PK 설계 및 합성
MSTN: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAUUAUUUGUUCUUUGCCUU (서열 번호 14226)이었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
음성 대조군 siRNA 서열(스크램블): 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 공개된(Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60) 21mer 이중체를 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA DAR1 및 DAR2 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조, 정제 및 특성화하였다. 그룹 5-12는 시스테인 접합, SMCC 링커를 사용하여 만들었고, 유리 티올은 아키텍처 1을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 그룹 13-16 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었고, 유리 티올은 아키텍처 3을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 10에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 10]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 미오스타틴(MSTN)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 13a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 조직 샘플은 또한 [도 13a]에 나타낸 바와 같이 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
세포 내 RISC 로딩을 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 혈장 MSTN 단백질 수준을 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다.
다리 근육 면적에서의 변화를 결정하였다: 측정할 다리를 면도하고 측정 영역을 표시하기 위해 지워지지 않는 잉크를 사용하여 선을 그렸다. 마우스를 작은 데카피콘 백(decapicone bag)으로 구속하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 시상 면에서 한 번 측정하고 관상 면에서 한 번 측정하였다. 이 절차를 주 2회 반복하였다.
결과
3 mg/kg의 항체 siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후 비복근, 삼두근, 사두근(Quad), 및 심장 조직에서 정량 가능한 수준의 siRNA가 축적되었다. [도 13d]를 참조한다. DAR1 및 DAR2 접합체에 의해 MSTN mRNA 하향 조절이 비복근, 사두근, 및 삼두근에서 관찰되었으나 심장 조직에서는 관찰되지 않았다. [도 13b]를 참조한다. ELISA에 의해 측정된 바와 같이, MSTN mRNA 하향 조절은 MSTN 단백질의 혈장 농도를 감소시켰다. [도 13c]를 참조한다. MSTN siRNA 가이드 가닥의 RISC 로딩량은 mRNA의 하향 조절과 상관관계가 있었다. [도 13e]를 참조한다. MSTN의 하향 조절은 근육 크기의 통계적으로 유의한 증가를 초래하였다. [도 13f] 및 [도 13g]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 항-트랜스페린 항체 siRNA 접합체, DAR1 및 DAR2의 단일 투여 후 비복근, 사두근, 및 삼두근 근육 조직에서 siRNA의 축적이 입증되었다.세 조직 모두에서, DAR1 및 DAR2 항-트랜스페린 항체 접합체로 측정 가능한 siRNA 매개 MSTN mRNA 하향 조절이 관찰되었다. mRNA 하향 조절은 감소된 수준의 혈장 MSTN 단백질 및 siRNA 가이드 가닥의 RISC 로딩과 상관관계가 있었다. 3개의 근육 조직 모두가 트랜스페린 수용체를 발현하였고, 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 접합체가 근육에 축적된다. 수용체 매개 흡수는 MSTN 유전자의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다
실시예
11: 2017
-PK-355-WT 다중
siRNA
투여
siRNA
설계 및 합성
HPRT: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUAAAAUCUACAGUCAUAGUU (서열 번호 14227)이었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 하나의 접합 핸들, 5'에서 C6-NH2을 함유하였으며, 이를 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커에 의해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
SSB: 마우스 MSTN에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체를 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU (서열 번호 14229)이었다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 하나의 접합 핸들, 5'에서 C6-NH2을 함유하였으며, 이를 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커에 의해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 특성화하였다.
그룹 1-4 및 5-8은 아키텍처 3을 사용하여 패신저 가닥 상의 3' 접합 핸들 없이 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었다. 그룹 13-16은 패신저 가닥 상의 3' 접합 핸들 없이 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었지만, 아키텍처 4를 사용하여 HPRT 및 SSB siRNA의 혼합물로 제조된 DAR2 접합체였다. 접합체는 표 11에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 11]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 2개의 세포 유지 유전자(HPRT 및 SSB)의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 14a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 조직 샘플은 또한 [도 14a]에 나타낸 바와 같이 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
RISC 로딩 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
지시된 용량의 항체 siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후, 비복근 및 심장 조직에서 mRNA 하향 조절이 관찰되었다. [도 14b] 내지 [도 14d]를 참조한다. 2개의 상이한 유전자(HPRT 및 SSB)를 표적화하는 2개의 ASC의 혼합물의 공동-투여는 비복근 및 심장 조직에서 두 표적의 효율적인 mRNA 하향 조절을 초래하였다. 추가로, 2개의 상이한 siRNA(HPRT 및 SSB)의 1:1 혼합물을 사용하여 합성된 DAR2 접합체의 투여는 또한 비복근 및 심장 조직에서 두 표적의 효율적인 mRNA 하향 조절을 초래하였다. 전달에 대한 모든 접근법은 비복근 조직에 축적되는 측정 가능한 양의 siRNA를 초래하였다. [도 14f]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 항-트랜스페린 항체 siRNA 접합체의 단일 투여 후 비복근 및 심장 조직에서 siRNA의 축적이 입증되었다. 동일한 항-트랜스페린 항체로 생성되었지만 2개의 상이한 siRNA(HPRT 및 SSB)에 접합된 2개의 ASC의 공동 투여에 의해 2개의 유전자는 하향 조절되었다. 또한, 2개의 상이한 siRNA(HPRT 및 SSB)의 1:1 혼합물을 사용하여 합성된 항-트랜스페린 mAb DAR2 접합체에 의해 2개의 유전자가 하향 조절되었다. 일부 경우에, 하나 초과의 유전자의 동시 하향 조절은 근위축증에 유용하다.
실시예
12: 생체 내(용량 반응)
siRNA
설계 및 합성에서
아트로진
-1 siRNA의 2017-PK-380-WT 활성
아트로진-1 siRNA: 아트로진-1에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 4개의 상이한 21mer 이중체를 설계하였다. 서열의 세부 사항은 실시예 4를 참조한다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 4개의 siRNA 모두에 동일한 설계를 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
ASC
합성 및 특성화
실시예 3에 기재된 바와 같이 CD71 mAb-siRNA 접합체를 제조하고 특성화하였다.
그룹 1-16은 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었고, 유리 티올은 아키텍처 3을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 12에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 12]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격근에서 아트로진-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 15a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. [도 15a]에 지시된 바와 같이 조직 샘플을 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
결과
지시된 용량의 항체 siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후, 비복근 근육에서 최대 80%의 아트로진-1 mRNA 하향 조절이 관찰되었고 심장 조직에서 최대 50%가 관찰되었다. [도 15b] 및 [도 15c]를 참조한다.
결론
이 실시예에 예시된 바와 같이, 항체 siRNA 접합체는 근육 및 심장에서 아트로진-1을 차등적으로 하향 조절한다.
실시예
13: 2017
-PK-383-WT 생체 내
MuRF1
siRNA의
활성(용량 반응)
siRNA
설계 및 합성
MuRF1 siRNA: 아트로진-1에 대해 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 4개의 상이한 21mer 이중체를 설계하였다. 서열의 세부 사항은 실시예 5를 참조한다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 4개 siRNA 모두에 동일한 설계를 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포로티오에이트-역위된 무염기-포스포로티오에이트 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
ASC
합성 및 특성화
CD71 mAb-siRNA 접합체는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조 및 특성화하였다.
그룹 1-16은 시스테인 접합, BisMal 링커를 통해 만들었다. 유리 티올은 아키텍처 3을 사용하여 NEM으로 말단 캡핑하였다. 접합체는 표 13에 기재된 바와 같이 크로마토그래피로 특성화하였다.
[표 13]
생체 내 연구 설계
접합체를 야생형 CD-1 마우스에서 생체 내 골격 및 심장 근육에서 MuRF-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 [도 16a]에 지시된 용량의 지시된 ASC를 정맥 내(iv) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. [도 16a]에 지시된 바와 같이 조직 샘플을 취하였다. 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
결과
지시된 용량의 항체 siRNA 접합체의 단일 정맥 내 투여 후, 비복근 근육에서 MuRF1 mRNA는 최대 70%로 하향 조절되고 심장 조직에서 최대 50%로 하향 조절되었다. [도 16b] 및 [도 16c]를 참조한다.
결론
이 실시예에 예시된 바와 같이, 항체 siRNA 접합체는 근육 및 심장에서 MuRF1을 차등적으로 하향 조절한다.
실시예
14.
표 14는 근위축증을 조절하기 위한 예시적인 siRNA(또는 아트로젠) 표적을 예시한다. 일부 경우에, 폴리핵산 분자는 표 14에 기재된 아트로젠의 표적 영역에 혼성화한다.
[표 14]
실시예
15: 서열
하나의 DMPK 전사체 변이체(NM_001288766) 내의 23-mer 표적 서열은 서열 번호 703-3406으로 할당된다. 한 번에 하나의 염기의 전사체의 길이를 아래로 워킹함으로써 이 전사체 변이체에 대한 23-mer 표적 서열 세트를 생성하였으며, 동일한 절차를 이용하여 다른 DMPK 전사체 변이체에 대해 유사한 표적 서열 세트를 생성할 수 있었다. DMPK 전사체에서 이들 부위를 표적화하는데 사용될 수 있는 하나의 일반적인 siRNA 구조는 각 가닥의 3' 말단에 2개의 오버행(염기쌍을 이루지 않는) 뉴클레오티드를 갖는 19-mer 완전 상보적 이중체이다. 따라서, 2개의 뉴클레오티드 오버행 둘 모두를 갖는 19-mer을 첨가하면 표적 부위에 대해 총 23개의 염기가 생성된다. 오버행은 표적 전사체 또는 다른 뉴클레오티드의 서열을 반영하는 서열(예를 들어 "UU"와 같이 관련 없는 디뉴클레오티드 서열)로 구성될 수 있기 때문에, 19-mer 완전 상보적 서열은 각 23-mer 표적 부위에 대한 siRNA를 기술하는데 사용될 수 있다.
DMPK 전사체 내의 각각의 부위를 표적화하는 siRNA 이중체에 대한 19-mer 센스 및 안티센스 서열은 서열 번호 3407-8814로 할당된다(서열 번호 3407 및 서열 번호 6111로서 첫 번째 센스와 안티센스 쌍을 가짐). 서열 번호 3407-6110은 센스 가닥을 예시한다. 서열 번호 6111-8814는 안티센스 가닥을 예시한다. DMPK 전사체 변이체 NM_001288766를 예시를 위해 사용하였지만, 다른 DMPK 전사 변이체를 통해 워킹함로써 유사한 siRNA 이중체 세트를 생성할 수 있다. siRNA의 안티센스 가닥이 Ago2에 로딩될 때, 첫 번째 염기는 Ago2 결합 포켓 내에서 결합하지만 다른 염기(안티센스 가닥의 위치 2에서 시작)는 상보적인 mRNA 결합을 위해 디스플레이된다. "U"는 Ago2에 결합하기에 열역학적으로 바람직한 첫 번째 염기이고 표적 mRNA에 결합하지 않기 때문에, 모든 안티센스 서열은 표적 상보성 및 특이성에 영향을 미치지 않으면서 첫 번째 염기에 "U"가 치환될 수 있다. 상응하게, 센스 가닥 19-mer의 마지막 염기 (위치 19)는 안티센스 가닥의 첫 번째 위치에서 "U"와 염기 쌍을 이루도록 "A"로 전환된다.
서열 번호 8815-11518은 염기 "A"로 치환된 19-mer 센스 가닥의 마지막 위치를 제외하고는 서열 번호 3407-6110과 유사하다.
서열 번호 11519-14222는 염기 "U"로 치환된 19-mer 안티센스 가닥의 첫 번째 위치를 제외하고는 서열 번호 6111-8814와 유사하다.
첫 번째 각각의 센스 및 안티센스 페어링을 위한 서열 번호 8815 및 서열 번호 11519.
실시예
16 : 시험관 내 활성에 대한 선택된
DMPK
siRNA
세트의 초기 스크리닝
서열 번호 8815-14222로부터의 초기 DMPK siRNA 세트를 표적 내 활성의 가능성이 가장 높고 표적 외 활성의 가능성이 가장 낮은 서열을 선택하는 것을 목표로 하는 생체 정보 분석을 사용하여 81개의 siRNA 서열 목록으로 좁혔다. 활성적이고 특이적인 siRNA를 선택하기 위한 생물 정보학적 방법은 RNAi의 분야에 잘 설명되어 있으며, 당업자는 임의의 다른 DMPK 전사체 변이체에 대해 DMPK siRNA 서열의 유사한 목록을 생성할 수 있을 것이다. 81개 서열 세트의 DMPK siRNA를 올리고뉴클레오티드 합성 문헌에 기재된 표준 고체상 합성 방법을 사용하여 소규모로 합성하였다. 비변형 및 화학적으로 변형된 siRNA는 시험관 내 형질 감염 후 효과적인 녹다운을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시키기 위해 RNAi의 분야에 기재된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 DMPK siRNA 서열을 합성하였다. DMPK siRNA의 시험관 내 활성을 평가하기 위해 2개의 인간 세포주를 사용하였다: 첫째, SJCRH30 인간 횡문근육종 세포주(ATCC® CRL-2061™); 및 둘째, 근긴장성 이영양증 1형(DM1) 환자 유래 불멸화 인간 골격 근원세포. DMPK siRNA 라이브러리의 초기 스크리닝을 위해, 각각의 DMPK siRNA를 1 nM 및 0.01 nM 최종 농도의 SJCRH30 세포 및 10 nM 및 1 nM 최종 농도의 DM1 근원세포에 형질 감염시켰다. siRNA를 형질 감염 시약 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)으로 제조사의 "포워드 형질 감염(forward transfection)" 지침에 따라 제제화하였다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트 상에 형질 감염 24시간 전에 SJCRH30의 경우 웰당 8500개 및 DM1 근원세포의 경우 웰당 4000개로 3중으로 플레이팅하였다. 형질 감염 후 48시간(SJCRH30) 또는 72시간(DM1 근원세포) 세포를 PBS로 세척하고 TRIzol 시약(Life Technologies)으로 수거하였다. Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Resea)를 사용하여 RNA를 제조사의 지침에 따라 단리하였다. 10㎕의 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사 지침에 따라 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플을 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 DMPK 특이적 및 PPIB 특이적 TaqMan 인간 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 이용한 qPCR에 의해 평가하였다. DMPK 값을 각 샘플 내에서 PPIB 유전자 발현에 정규화하였다. 표준 2-△△Ct 방법을 사용하여 DMPK 하향 조절의 정량화를 수행하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였으며, 표 15A 및 표 15B에 3회의 평균값을 제시하였다.
[표 15A]
[표 15B]
실시예
17 : 선택된
DMPK
siRNA
세트에 대한 시험관 내 용량 반응 곡선
DMPK siRNA의 활성을 추가로 검증하기 위해, 용량 반응 형식의 후속 평가를 위해 초기 스크리닝에서 최상의 활성을 나타낸 다수의 서열을 선택하였다. 다시 한번, 2개의 인간 세포주를 사용하여 DMPK siRNA의 시험관 내 활성을 평가하였다: 첫째, SJCRH30 인간 횡문근육종 세포주; 둘째, 근긴장성 이영양증 1형(DM1) 환자 유래 불멸화 인간 골격 근원세포. 선택된 siRNA를 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0,001 및 0.0001 nM의 최종 농도에서의 10배 용량 반응 또는 50, 5.55556, 0.617284, 0.068587, 0.007621, 0.000847, 및 0.000094 nM의 최종 농도에서의 9배 용량 반응으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 시약 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)로 제조사의 "포워드 형질 감염" 지침에 따라 siRNA를 제제화하였다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트 상에 형질 감염 24시간 전에 SJCRH30의 경우 웰당 8500개 및 DM1 근원세포의 경우 웰당 4000개로 3중으로 플레이팅하였다. 형질 감염 후 48시간(SJCRH30) 또는 72시간(DM1 근원세포) 세포를 PBS로 세척하고 TRIzol 시약(Life Technologies)으로 수거하였다. Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Resea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리하였다. 10㎕의 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사 지침에 따라 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플을 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 DMPK 특이적 및 PPIB 특이적 TaqMan 인간 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 이용한 qPCR에 의해 평가하였다. DMPK 값을 각 샘플 내에서 PPIB 유전자 발현에 정규화하였다. 표준 2-△△Ct 방법을 사용하여 DMPK 하향 조절의 정량화를 수행하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였으며, 표 16A-B, 17A-B 및 표 18A-B에 3회의 평균값 및 비선형 회귀 분석에 의해 용량-반응 데이터에 대한 맞춤 곡선으로부터 결정된 계산된 IC50 값을 제시하였다.
[표 16A]
[표 16B]
[표 17A]
[표 17B]
[표 18A]
[표 18B]
실시예
18: 마우스에서 종 교차 반응성을 결정하기 위한 시험관 내 실험
선택된 siRNA를 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0,001, 및 0.0001 nM의 최종 농도에서 C2C12 마우스 근육 근원세포(ATCC® CRL-1772™)로 형질 감염시켰다. 형질 감염 시약 리포펙타민 RNAiMAX(Life Technologies)로 제조사의 "포워드 형질 감염" 지침에 따라 siRNA를 제제화하였다. 세포를 96 웰 조직 배양 플레이트 상에 형질 감염 24시간 전에 C2C12 접종을 위해 웰당 4000개로 3중으로 플레이팅하였다. 형질 감염 후 48시간에 세포를 PBS로 세척하고 TRIzol 시약(Life Technologies)으로 수거하였다. Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Resea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리하였다. 10㎕의 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사 지침에 따라 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플을 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 DMPK 특이적 및 PPIB 특이적 TaqMan 마우스 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 이용한 qPCR에 의해 평가하였다. DMPK 값을 각 샘플 내에서 PPIB 유전자 발현에 정규화하였다. 표준 2-△△Ct 방법을 사용하여 DMPK 하향 조절의 정량화를 수행하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였으며, 결과는 [도 17]에 나타낸다. 4개의 DMPK siRNA([도 17] 범례에 표시된 숫자는 표 19(표 19A-19B)에 열거된 ID#에 상응함)는 마우스 DMPK mRNA와 효과적으로 교차 반응하여 마우스 C2C12 근원세포 세포주에서 강력한 mRNA 녹다운을 생성하는 것으로 나타났다. siRNA 중 2개(ID# 535 및 1028)는 약간 덜 효과적이었으며 대략 70%의 최대 mRNA 녹다운만을 생성하였다. siRNA 중 2개(ID# 2628 및 2636)가 더 효과적이었고 대략 90%의 최대 mRNA 녹다운을 생성하였다.
실시예
19: 마우스에서 종 교차 반응성을 결정하기 위한 생체 내 실험
동물
모든 동물 연구는 Explora BioLabs의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따른 프로토콜에 따라 수행하였으며, 이는 USDA 동물 복지법에 개설된 규정 및 "실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드"(National Research Council publication, 8th Ed., 2011년 개정)를 준수한다. 모든 마우스는 Charles River Laboratories 또는 Harlan Laboratories에서 구입하였다.
접합체 제조
생체 내 연구에서 총 5개의 siRNA를 사용하였다. 시험관 내에서 마우스와 교차 반응성을 나타낸 4개의 DMPK siRNA(도 17) 및 DMPK 녹다운을 생성하지 않는 스크램블 서열을 가지며 음성 대조군으로 사용될 수 있는 1개의 siRNA. 모든 siRNA는 올리고뉴클레오티드 합성 문헌에 기재된 표준 고체상 합성 방법을 사용하여 합성하였다. 단일 가닥을 표준 방법을 사용하여 HPLC로 정제한 다음 순수한 단일 가닥을 등 몰비로 혼합하여 순수한 이중 가닥을 생성하였다. 모든 siRNA는 항체에 연결하기 위한 접합 핸들로서 작용할 수 있는 패신저(센스) 가닥의 5' 말단의 헥실아민 링커를 갖도록 합성하였다. siRNA는 효능을 최대화하고, 대사 안정성을 최대화하고, 이중체의 면역원성을 최소화하기 위해 RNAi의 분야에서 잘 설명된 최적의 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 합성하였다.
항-마우스 트랜스페린 수용체(TfR1, 또한 CD71로 알려짐) 단클론 항체(mAb)는 마우스 CD71 단백질에 높은 친화도로 결합하는 랫트 IgG2a 서브 클래스 단클론 항체이다. 이 CD71 항체는 BioXcell에서 생산되었으며 시판되고 있다(카탈로그 번호 BE0175). BioXcell의 CD71 mAb 및 각각의 DMPK 또는 스크램블 siRNA를 사용하여 항체-siRNA 접합체를 합성하였다. 모든 접합체는 전술한 바와 같이 비스말레이미드-TFP 에스테르 링커를 사용하여 항체에 시스테인 접합 및 siRNA에 아민 접합(헥실 아민을 통해)을 통해 합성하였다. 전술한 바와 같이, 모든 접합체는 강력한 양이온 교환(SAX)에 의해 정제하여 약물-항체 비(DAR)가 1인 접합체만 단리한다(즉, mAb당 1 siRNA의 몰비). 모든 항체-siRNA 접합체는 생체 내 투여를 위해 PBS에서 희석하여 제제화하였다.
생체 내 투여 및 분석
정제된 DAR1 항체-siRNA 접합체는 0.1, 0.3, 1 및 3 mg/kg(siRNA의 중량을 기준으로)로 암컷 야생형 CD-1 마우스(4-6 주령)의 그룹(n=4)에 5 mL /kg의 투여 부피로 꼬리 정맥에 단일 iv 볼러스 주사로 투여하였다. 단일 가짜 용량의 PBS 비히클을 일치하는 투여 부피로 암컷 야생형 CD-1 마우스(4-6 주령)의 대조군 그룹(n=5)에 주사하였다. 투여 후 7일에, CO2 질식에 의해 마우스를 희생시켰고, 각 마우스로부터 여러 조직(비복근, 전경골, 사두근, 가로막, 심장, 및 간)의 20-30 mg 조각을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. TRIzol® 시약(Life Technologies)을 첨가한 다음, TissueLyser II(Qiagen)를 사용하여 각 조직 조각을 균질화하였다. Direct-zol-96 RNA 키트(Zymo Resea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 RNA를 단리하였다. 10㎕의 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사 지침에 따라 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 샘플을 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 DMPK 특이적 및 PPIB 특이적 TaqMan 마우스 유전자 발현 프로브(Thermo Fisher)를 이용한 qPCR에 의해 평가하였다. DMPK 값을 각 샘플 내에서 PPIB 유전자 발현에 정규화하였다. 처리된 동물을 PBS 대조군 그룹과 비교하여 표준 2-△△Ct 방법을 사용하여 DMPK 하향 조절의 정량화를 수행하였다. 생체 내 DMPK mRNA 녹다운 결과는 [도 18A] 내지 [도 18F]에 제시한다. 4개의 모든 DMPK siRNA([도 18A] 내지 [도 18F] 범례에 나타낸 번호는 표 19(표 19A-19B)에 열거된 ID#에 상응함)는 용량 의존적 방식으로 분석된 모든 골격근(비복근, 전경골, 사두근, 및 가로막)에서 DMPK mRNA의 수준을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 활성이 가장 큰 siRNA는 모든 골격근에서 최고 용량(3mg/kg)에서 75% 초과의 DMPK mRNA 녹다운을 달성했다. siRNA ID# 2628 및 2636이 siRNA ID# 535 및 1028보다 더 높은 mRNA 녹다운을 나타냄으로써, 마우스의 골격근에서 관찰된 생체 내 DMPK 녹다운([도 18A] 내지 [도 18F])은 마우스 C2C12 근원세포 세포주에서 관찰된 시험관 내 DMPK 녹다운(도 17)과 우수한 상관관계가 있었다. 골격근에서의 DMPK mRNA 녹다운에 이외에, 마우스 심장 근육(심장)에서도 강한 활성(50% 초과의 mRNA 녹다운)이 관찰되었다. 최종적으로, 마우스 간에서 저조한 활성(50% 미만의 mRNA 녹다운)이 관찰되었다. 이러한 결과는 간과 같은 표적 외 조직에서의 녹다운을 최소화하면서, 다수의 마우스 근육 그룹(골격 및 심장 포함)에서 강력한 DMPK mRNA 녹다운을 달성할 수 있음을 입증한다.
실시예
20:
siRNA
합성
모든 siRNA 단일 가닥은 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC를 사용하여 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 모든 siRNA 패신저 가닥은 5' 말단에 C6-NH2 접합 핸들을 함유하였다 [도 20a] 내지 [도 21b]를 참조한다. 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 이중체의 경우, 접합 핸들을 역위된 무염기 염기성 포스포디에스테르를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 구조에 대해 [도 20a] 내지 [도 20b]를 참조한다. 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 평활 말단 이중체의 경우, 접합 핸들을 말단 염기상의 포스포디에스테르를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 구조에 대해 [도 21a] 내지 [도 21b]를 참조한다.
정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다.
실시예
21: 2017
-PK-401-
C57BL6
: 다양한
아트로진
-1
siRNA의
생체 내
트
랜스페린 mAb 접합체 전달
그룹 1-4의 경우, [도 22]의 연구 설계를 참조한다. 21mer 아트로진-1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCUACGUAGUUGAAUCUUCUU (서열 번호 14230)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg /mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR 2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS와 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충제, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다. 접합체 mTfR1-mAb-아트로진-1(DAR1)의 경우, SAX 체류 시간은 9.1분이고 % 순도(크로마토그래피 피크 면적에 의함)는 99였다.
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 골격근에서 아트로진-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다, [도 22]를 참조한다. 지시된 시점 이후, 비복근(gastroc) 및 심장 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
결과
아트로진-1 siRNA 가이드 가닥은 트랜스페린 수용체를 표적화하는 항-TfR mAb에 접합될 때 비복근 및 심장 근육에서 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있었다. [도 23] 및 [도 24]를 참조한다.
결론
이 실시예에서, 생체 내 전달 후 TfR1-si아트로진-1 접합체는 비복근 및 심장 근육에서 표적 유전자의 특이적 하향 조절을 매개한다는 것이 입증되었다. ASC는 항-트랜스페린 항체로 제조하였고, 마우스 비복근 및 심장 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고, 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 비복근 및 심장 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 표적 mRNA의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
22: 2017
-PK-413-
C57BL6
: 다양한
MuRF1
서열의 생체 내
트랜스페린
mAb 접합체 전달
그룹 1-2의 경우, [도 25]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2089) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUUCGCACCAACGUAGAAAUU (서열 번호 14231)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
그룹 3-6의 경우, [도 g]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2265) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCGUGAGACAGUAGAUGUUUU (서열 번호 14232)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥을 단일 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결시켰다.
그룹 7-10의 경우, [도 g]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2266) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCACACGUGAGACAGUAGAUU (서열 번호 14233)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결된 단일 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였다.
그룹 11-14의 경우 [도 g]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2267) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUCACACGUGAGACAGUAGUU(서열 번호 14234)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결된 단일 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였다.
그룹 15-18의 경우, [도 g]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2268) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAAUAUUUCAUUUCGCACCUU (서열 번호 14235)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결된 단일 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였다.
그룹 19-22의 경우, [도 g]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1(2269) 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAAGCACCAAAUUGGCAUAUU (서열 번호 14236)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결된 단일 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2를 함유하였다.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg /mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS로 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다(표 19).
[표 19]
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 근육(비복근 및 심장)에서 MuRF-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다, [도 25]를 참조한다. 96시간 후에, 비복근(gastroc) 및 심장 근육 조직을 수거하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
결과
MuRF1 siRNA 가이드 가닥은 트랜스페린 수용체 1을 표적화하는 항-TfR1 mAb에 접합될 때 비복근 및 심장 근육에서 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있었다. [도 26] 및 [도 27]을 참조한다.
결론
이 실시예에서, 생체 내 전달 후, TfR1-MuRF1-1 접합체는 비복근 및 심장 근육에서 표적 유전자의 특이적 하향 조절을 매개한다는 것이 입증되었다. ASC는 항-트랜스페린 항체로 제조하였고, 마우스 비복근 및 심장 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고, 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 비복근 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 표적 mRNA의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
23: 2017
-PK-412-
C57BL6
:
아트로진
-1 및
MuRF1
TfR1
-
mAb
접합체에 의한 덱사메타손 유발 근위축증의 예방
이 실험을 위해, 3가지 상이한 siRNA을 사용하였다:
(1): 21mer 아트로진-1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCUACGUAGUUGAAUCUUCUU (서열 번호 14230)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
(2): 21mer MuRF1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUUCGCACCAACGUAGAAAUU (서열 번호 14231)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
(3): 음성 대조군 siRNA 서열(스크램블): 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 공개된(Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60) 21mer 이중체를 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
비스
-
말레이미도
(
BisMal
) 링커를 사용한
항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg /mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS로 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다(표 20).
[표 20]
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 근위축증의 존재 및 부재하에서 비복근(gastroc)에서 MuRF1 및 아트로진-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다(표 21 참조). 접합체 전달 후 7일, 그룹 2-4, 9-11 및 16-18에 대해, 21일 동안 덱사메타손의 복강 내 주사(10 mg/kg)를 통한 매일 투여에 의해 근위축증을 유발하였다. 대조군 그룹 5-7, 12-14 및 19-21(근위축 유발 없음)에 대해 매일 복강 내 주사로 PBS를 투여하였다. 제7일에 그룹 1, 8, 15 및 22를 수거하여 근위축층을 유발하기 전에 mRNA 발현 및 칭량된 근육의 기준선 측정값을 확립하였다. 지시된 시점에, 비복근(gastroc) 및 심장 근육 조직을 수거하고, 칭량하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
[표 21]
결과
데이터는 [도 28] 내지 [도 31]에 요약한다. TfR1 mAb 접합체를 사용하여 전달될 때, 정상 및 위축성 근육에서 아트로진-1 및 MuRF1 siRNA의 공동-전달은 아트로진-1 및 MuRF1 mRNA 발현을 효율적으로 하향 조절하였다. 위축증의 유발은 일시적으로 약 4배의 아트로진-1 및 MuRF1 발현을 유도한다. mTfR1-아트로진-1 + TfR1.mAb-siMuRF1(각각 3mg/kg 및 혼합물로서 투여)의 단일 투여는 정상 및 위축성 비복근 근육에서 아트로진-1 및 MuRF1 mRNA 수준을 >70% 감소시켰다. MuRF1 및 아트로진-1 mRNA의 하향 조절은 비복근 중량을 5-10% 증가시키고 DEX 유발된 비복근 중량 감소를 50% 감소시킨다. 아트로진-1 단독의 하향 조절은 비복근 중량 변화에 유의한 영향을 미치지 않는다. 근위축증이 없으면 아트로진-1/MuRF1 siRNA의 처리는 근육 비대를 유발한다.
결론
이 실시예에서, TfR1 mAb 접합체를 사용하여 전달될 때, 아트로진-1 및 MuRF1 siRNA의 공동-전달은 정상 및 위축성 비복근 근육에서 아트로진-1 및 MuRF1 mRNA 발현을 효율적으로 하향 조절한다는 것이 입증되었다. 접합체는 심장 근육에 거의 영향을 미치지 않았으며, 여기서 아트로진-1의 하향 조절은 유해했을 수 있었다. MuRF1 및 아트로진-1 mRNA의 하향 조절은 비복근 근육 중량을 5-10% 증가시켰고 DEX 유발된 비복근 근육 질량 손실을 50% 감소시켰다. 아트로진-1 단독의 하향 조절은 비복근 중량 변화에 유의한 영향을 미치지 않는다. ASC는 항-트랜스페린 항체로 제조하였고, 마우스 비복근 근육은 트랜스페린 수용체를 발현하고 접합체는 siRNA를 표적화하는 마우스 특이적 항-트랜스페린 항체를 가지므로, 비복근 근육에서 접합체의 축적을 초래한다. 수용체 매개 흡수는 표적 mRNA의 siRNA 매개 녹다운을 초래하였다.
실시예
24: 2017
-PK-435-
C57BL6
:
아트로진
-1의
트랜스페린
mAb
접합체 전달을 위한 생체 내 용량 반응 실험
그룹 1-12의 경우, [도 32]의 연구 설계를 참조한다. 21mer 아트로진-1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCGUAGUUAAAUCUUCUGGUU (서열 번호 14237)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 a]에 도시된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
그룹 13-18의 경우, [도 32]의 연구 설계를 참조한다. 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 음성 대조군 siRNA 서열(스크램블)(문헌[Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60]에 공개됨)을 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg/mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS로 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다(표 22).
[표 22]
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 근위축증의 존재 및 부재하에서 근육(비복근)에서 아트로진-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다, [도 32]를 참조한다. 접합체 전달 후 7일, 그룹 3, 6, 9, 12, 및 15의 경우, 3일 동안 덱사메타손의 복강 내 주사(10 mg/kg)를 통한 매일 투여에 의해 근위축증을 유발하였다. 대조군 그룹 2, 5, 8, 11, 및 14(근위축 유발 없음)에 대해 매일 복강 내 주사로 PBS를 투여하였다. 그룹 1, 4, 7, 10, 및 13을 제7일에 수거하여 근위축의 유발 전에 mRNA 발현 및 칭량된 근육의 기준선 측정값을 확립하였다. 위축증 유발 후 3일(또는 접합체 전달 후 10일)에, 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고, 칭량하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
결과
데이터는 [도 33] 내지 [도 35]에 요약한다. 아트로진-1 siRNA 가이드 가닥은 트랜스페린 수용체를 표적화하는 항-TfR mAb에 접합될 때 비복근 근육에서 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있었다. [도 33]을 참조한다. 3에서 9 mg/kg로 용량을 증가시켜 위축성 유발된 아트로진-1 mRNA 수준이 2-3배 감소하였다. 이 siRNA로 달성할 수 있는 최대 KD는 80%였고 위축성 근육에서 최대 KD를 달성하기 위해 40 nM의 조직 농도가 필요하였다. 이는 접합체 전달 접근법이 용량을 증가시킴으로써 아트로진-1의 질병 유발된 mRNA 발현 수준을 변화시킬 수 있음을 강조한다. [도 34]를 참조한다. [도 35]는 mRNA 하향 조절이 아트로진-1 가이드 가닥의 RISC 로딩에 의해 매개되고 농도 의존적임을 강조한다.
결론
이 실시예에서, TfR1-아트로진-1 접합체는 생체 내 전달 후 용량 의존적 방식으로 비복근 근육에서 표적 유전자의 특이적 하향 조절을 매개한다는 것이 입증되었다. 위축증의 유발 후, 접합체는 고용량에서 아트로진-1의 질병 유발된 mRNA 발현 수준을 매개할 수 있었다. 아트로진-1 가이드 가닥의 높은 RISC 로딩은 mRNA 하향 조절 증가와 상관관계가 있었다.
실시예
25: 2017
-PK-381-
C57BL6
:
미오스타틴
(
MSTN
) 하향 조절은 덱사메타손 처리된 마우스에서 근육 손실을 감소시킨다
그룹 1-12의 경우, 표 24의 연구 설계를 참조한다. 21mer 아트로진-1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UCGUAGUUAAAUCUUCUGGUU (서열 번호 14237)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
그룹 13-18의 경우 표 24를 참조한다. 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 음성 대조군 siRNA 서열(스크램블)(문헌[Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60]에 공개됨)을 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg /mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS로 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다(표 23).
[표 23]
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 근위축증의 존재 및 부재하에서 근육(비복근)에서 MSTN의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다, 표 24를 참조한다. 접합체 전달 후 7일, 그룹 2, 3, 4, 9, 10 및 11의 경우, 13일 동안 덱사메타손의 복강 내 주사(10 mg/kg)를 통한 매일 투여에 의해 근위축증을 유발하였다. 대조군 그룹 5, 6, 7, 12, 13 및 14(근위축증의 유발 없음)의 경우, 매일 복강 내 주사로 PBS를 투여하였다. 그룹 1 및 8을 제7일에 수거하여 근위축의 유발 전에 mRNA 발현 및 칭량된 근육의 기준선 측정을 확립하였다. 위축 유발 3, 7, 및 14일 후(또는 접합체 전달 10, 14, 및 21일 후), 비복근(gastroc) 근육 조직을 수거하고, 칭량하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
[표 24]
결과
데이터는 [도 36] 및 [도 37]에 요약한다. MSTN siRNA 가이드 가닥은 덱사메타손 유발 위축증의 존재 및 부재하에서 트랜스페린 수용체를 표적화하는 항-TfR mAb에 접합될 때 비복근 근육에서 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있었다, [도 36]을 참조한다. 3mg/kg siRNA의 단일 투여는 MSTN mRNA 수준을 >75% 하향 조절하였다. 덱사메타손 유발 위축증이 존재하는 경우, MSTN 하향 조절은 근육 질량을 증가시켰고 Dex 유발된 근육 손실을 약화시킨다. [도 37]을 참조한다.
결론
이 실시예에서, 생체 내 전달 후 TfR1-MSTN 접합체는 비복근 근육에서 표적 유전자의 특이적 하향 조절을 매개한다는 것이 입증되었다. 위축증의 유발 후, 접합체는 근육 질량을 증가시키고 Dex-유발된 근육 손실을 약화시킬 수 있었다.
실시예
26: 2017
-PK-496-
C57BL6
:
아트로진
-1 및
MuRF1
하향 조절은 마우스에서 좌골 탈신경 시 다리 근육 손실을 감소시킨다
그룹 1-4의 경우, [도 38]의 연구 설계를 참조한다. 21mer 아트로진-1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUGGGUAACAUCGUACAAGUU (서열 번호 14238)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
그룹 5-6의 경우, [도 V]의 연구 설계를 참조한다. 21mer MuRF1 가이드 가닥을 설계하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UUUCGCACCAACGUAGAAAUU (서열 번호 14231)이었다. 가이드 및 완전 상보적 RNA 패신저 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 조립하고 HPLC로 정제하였다. RNAi의 분야에서 잘 설명된 염기, 당 및 포스페이트 변형을 사용하여 이중체의 효능을 최적화하고 면역원성을 감소시켰다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 [도 20b]에 기재된 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
그룹 7-12의 경우, 아트로진-1 및 MuRF1을 상기와 같이 설계하였다. TfR1 mAb에 접합 후와 개별 DAR1 종의 정제 및 단리 후에, 혼합하고 공동-투여하였다.
그룹 13의 경우, [도 38]의 연구 설계를 참조한다. 19개 염기의 상보성 및 3' 디뉴클레오티드 오버행을 갖는 21mer 음성 대조군 siRNA 서열(스크램블)(문헌[Burke et al. (2014) Pharm. Res., 31(12):3445-60)에 의해 공개됨)을 사용하였다. 가이드/안티센스 가닥의 서열(5'에서 3'로)은 UAUCGACGUGUCCAGCUAGUU (서열 번호 14228)이었다. 활성의 MSTN siRNA 이중체에 사용된 동일한 염기, 당 및 포스페이트 변형을 음성 대조군 siRNA에 사용하였다. 모든 siRNA 단일 가닥을 표준 포스파라미다이트 화학을 사용하여 고체상에서 완전히 조립하고 HPLC로 정제하였다. 정제된 단일 가닥을 이중체화하여 이중 가닥 siRNA를 얻었다. 패신저 가닥은 2개의 접합 핸들, 5' 말단에 C6-NH2 및 3' 말단에 C6-SH를 함유하였다. 두 접합 핸들을 포스포디에스테르-역위된 무염기-포스포디에스테르 링커를 통해 siRNA 패신저 가닥에 연결하였다. 유리 티올을 접합에 사용하고 있지 않았기 때문에, N-에틸말레이미드로 말단 캡핑하였다.
비스
-
말레이미드
(
BisMal
) 링커를 이용한 항체
siRNA
접합체 합성
단계 1:
TCEP에
의한 항체 환원
항체를 1mM DTPA를 포함한 25mM 붕산염 완충액(pH 8)과 완충액 교환하고 최대 10mg/ml 농도로 만들었다. 이 용액에, 동일한 붕산염 완충액 중 4 당량의 TCEP를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 pH 6.0 10 mM 아세테이트 완충액 중 BisMal-siRNA 용액(1.25 당량)과 합하고 밤새 4℃에서 유지시켰다. 분석 SAX 컬럼 크로마토그래피에 의한 반응 혼합물의 분석은 미반응 항체 및 siRNA와 함께 항체 siRNA 접합체를 보였다. 반응 혼합물을 10 당량의 N-에틸말레이미드(DMSO 중 10 mg /mL로)로 처리하여 남아있는 유리 시스테인 잔기를 캡핑하였다.
단계 2: 정제
조 반응 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1을 사용하여 AKTA Pure FPLC로 정제하였다. DAR1 및 DAR2 항체-siRNA 접합체를 함유하는 분획을 단리하고, 농축시키고 pH 7.4 PBS로 완충액 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-1.
칼럼: Tosoh Bioscience, TSKGel SuperQ-5PW, 21.5 mm ID X 15 cm, 13 um
용매 A: 20 mM 트리스 완충액, pH 8.0; 용매 B: 20 mM 트리스, 1.5 M NaCl, pH 8.0; 유속: 6.0 ml/분
구배:
a.
%A
%B
칼럼 부피
b.
100
0
1
c.
81
19
0.5
d.
50
50
13
e.
40
60
0.5
f.
0
100
0.5
g.
100
0
2
음이온 교환 크로마토그래피(SAX) 방법-2
칼럼: Thermo Scientific, ProPac™ SAX-10, Bio LC™, 4 X 250 mm
용매 A: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올; 용매 B: 80% 10 mM 트리스 pH 8, 20% 에탄올, 1.5 M NaCl; 유속: 0.75 ml/분
구배:
a.
시간
%A
%B
b.
0.0
90
10
c.
3.00
90
10
d.
11.00
40
60
e.
14.00
40
60
f.
15.00
20
80
g.
16.00
90
10
h.
20.00
90
10
단계 3: 정제된 접합체의 분석
단리된 접합체의 순도는 음이온 교환 크로마토그래피 방법-2를 사용하여 분석 HPLC에 의해 평가하였다(표 25).
[표 25]
생체 내 연구 설계
접합체를 생체 내 실험(C57BL6 마우스)에서 좌골 신경 탈신경의 존재 및 부재하에서 근육(비복근)에서 MuRF1 및 아트로진-1의 mRNA 하향 조절을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. PBS 비히클 대조군 및 지시된 ASC 및 용량을 정맥 내(iv) 주사를 통해 마우스에 투여하였다, [도 38]을 참조한다. 접합체 전달 후 7일, 그룹 2-4, 6-8, 10-12 및 14-16 경우, 좌골 신경 탈신경에 의해 다리 근위축증을 유발하였다. 대조군 그룹 1, 5, 9, 13, 및 17에 대해 탈신경을 유발하지 않았다.
제7일에 탈신경 절차를 위해, 마우스를 마취시키고(5% 이소플루란) 0.1 mg/kg 부프레노르핀의 피하 용량을 투여하였다. 우측 등쪽 골반 부위는 좌골 절흔에서 무릎까지 면도하였다. 이 영역을 알코올과 포비돈 요오드로 교대로 소독하였다. 좌골 절흔은 촉지 및 좌골 절흔에서 무릎쪽으로 만들어진 약 1cm의 절개로 확인하였다. 대퇴골 이두근을 찢어 좌골 신경을 노출시켰으며, 양쪽 끝을 소작하여 약 1cm 단편을 제거하였다. 그런 다음 근육과 피부를 봉합하여 절개를 닫았다. 그런 다음 수술 팔다리는 매일 검사하여 수술 상처 상태를 관찰하고 동물의 전반적인 건강 상태를 관찰하였다.
그룹 4, 8, 12, 및 16에 대해 다리 근육 면적에서의 변화를 결정하였다: 측정할 다리를 면도하고 측정 영역을 표시하기 위해 지워지지 않는 잉크를 사용하여 선을 그렸다 마우스를 원추형 구속 장치로 구속하고 오른쪽 다리를 손으로 잡았다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 시상 면에서 한 번 측정하고 관상 면에서 한번 측정하였다. 이 절차를 주 2회 반복하였다. 지시된 시점에 모든 그룹에 대해, 비복근(gastroc) 및 심장 근육 조직을 수거하고, 칭량하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 방법 부분에 기재된 바와 같이 비교 qPCR 분석을 사용하여 표적 조직에서의 mRNA 녹다운을 결정하였다. 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, 역전사시키고, 적절하게 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하는 TaqMan qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화하였다. 내부 RNA 로딩 대조군으로 PPIB(세포 유지 유전자)를 사용하였고, 비교 Ct 방법에 의해 결과를 계산하였으며, 여기서 표적 유전자 Ct 값과 PPIB Ct 값 사이의 차이(△Ct)를 계산한 후 두 번째 차이(△△Ct)를 취하여 PBS 대조군 그룹에 대해 추가로 정규화하였다.
방법 부분에 기재된 바와 같이 줄기-루프 qPCR 분석을 사용하여 조직 siRNA 농도를 정량화하였다. siRNA의 안티센스 가닥을 서열 특이적 줄기-루프 RT 프라이머를 사용하는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. 이어서, RT 단계로부터의 cDNA를 실시간 PCR에 사용하고 Ct 값을 표준 곡선으로부터 유도된 선형 방정식을 사용하여 혈장 또는 조직 농도로 변환시켰다.
[도 39a]는 4.5 mg/kg(siRNA)의 아트로진-1 siRNA 또는 MuRF1 siRNA의 단일 처리 또는 조합된 두 siRNA의 단일 투여가 비복근에서 각 표적의 최대 75% 하향 조절을 초래하였음을 보여준다.
[도 39b]는 비복근에서 두 표적의 mRNA 녹다운이 ASC 투여 후 37일까지 온전한 다리에서 75%로 유지됨을 보여준다.
탈신경된 다리에서, 아트로진 1 mRNA 녹다운은 탈신경 후 3일에 유지되지만, 탈신경 후 10일까지 20%로, 탈신경 후 30일까지 0%로 감소된다. 탈신경된 다리에서 MuRF1 mRNA 녹다운은 탈신경 후 3일에 80-85%로 향상되지만, 탈신경 후 10일까지 50%로, 탈신경 후 30일까지 40%로 감소된다(도 39c).
각각의 표적의 mRNA 녹다운은 두 siRNA의 조합으로 처리될 때 다른 표적의 녹다운에 의해 영향을 받지 않았다(도 39d).
다리 근육 면적 측정값을 기준으로, MuRF1, 및 MuRF1과 아트로진-1의 조합의 siRNA 매개 하향 조절은 최대 30%까지 탈신경 유도된 근육 소모를 감소시켰다. MuRF1 siRNA 단독 처리는 MuRF1과 아트로진-1의 조합 처리와 유사한 반응을 보였다. 아트로진-1 단독의 하향 조절은 다리 근육 영역에 유의한 영향을 미치지 않았다. 통계 분석은 웰치 T 검정을 사용하여 처리 군을 스크램블 siRNA 대조군 그룹과 비교하였다. [도 39e]를 참조한다.
비복근 중량을 기준으로, MuRF1만이 스크램블 siRNA 대조군 그룹과 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 다리 근육 면적을 측정하여 얻은 결과와 유사하게, MuRF1의 하향 조절은 탈신경 유발된 근육 소모를 최대 35% 감소를 보였다. 이러한 결과는 마우스에서 MuRF1 녹아웃의 효과에 일치한(Bodine et al., Science 291, 2001).[도 39f]를 참조한다.
본 발명의 바람직한 실시 양태를 본원에서 보여주고 설명하였지만, 이러한 실시 양태는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 당 업자는 본 발명을 벗어나지 않고서 많은 변형, 변화, 및 대체를 생각해 낼 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시 양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구 범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구 범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그 등가물이 이로써 포함되도록 의도된다.