KR20200098521A - 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생성물, 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 표적 유전자 발현을 방해하거나 표적 유전자 발현을 저해하는 핵산 생성물 및 이러한 생성물의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산
본 발명은 생성물, 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 표적 유전자 발현을 방해하거나 또는 표적 유전자 발현을 저해하는 핵산 생성물 및 이러한 생성물의 치료 용도에 관한 것이다.
발현된 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA: dsRNA)는 RNA 간섭(RNA interference: RNAi)라 불리는 기전에 의해서 유전자 발현을 차단할 수 있다고 밝혀져 있다(Fire et al, 1998 및 Elbashir et al, 2001). 짧은 dsRNA는 척추동물을 비롯한 다수의 유기체에서 유전자-특이적 전사후 침묵(gene-specific, post-transcriptional silencing)을 유도하고, 유전자 기능을 연구하는데 유용한 도구가 되었다. RNAi는 RNA-유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)에 로딩된 침묵 촉발인자에 상동성인 메신저 RNA를 파괴하는 서열-특이적 다중-성분 뉴클레아제인 RISC 복합체에 의해서 매개된다. 간섭 RNA(iRNA), 예컨대, siRNA, 안티센스 RNA 및 마이크로-RNA는 유전자-침묵에 의해서, 즉, mRNA 분자의 분해를 통해서 단백질의 유전자 번역을 저해함으로써 단백질의 형성을 예방하는 올리고뉴클레오타이드이다. 유전자-침묵제(gene-silencing agent)는 의약에서 치료 응용에 상당히 중요해지고 있다.
문헌[Watts and Corey in the Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379)]에 따르면, 핵산을 설계하는데 사용될 수 있는 알고리즘이 존재하지만, 완전한 것은 없다. 효력있는 siRNA를 식별하기 위해서 다양한 실험 방법이 필요할 수 있는데, 그 이유는 알고리즘은 3차 구조 또는 RNA 결합 단백질의 관여와 같은 인자를 고려하지 않기 때문이다. 따라서, 최소한의 오프-타깃 효과를 갖는 효력있는 핵산의 발견은 복잡한 과정이다. 이러한 고도로 충전된 분자의 약제 개발을 위해서, 이들은 경제적으로 합성되고, 표적 조직에 분포되고, 세포에 도입되고, 허용 가능한 독성 한계치 내에서 기능할 수 있는 것이 필요하다.
그러나, 효능 및 표적 특이성을 유지하면서, 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 회피하는 세포에 RNA와 같은 핵산을 전달하는 것은 치료 용도를 위한 핵산 분자를 개발하는 분야의 사람들에게 도전적인 것으로 입증되었다.
따라서, 생체내에서 올리고뉴클레오타이드, 특히 이중 가닥 siRNA를 세포에 효율적으로 전달하기 위한 수단은 점점 중요해지고 있고, 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 특이적 표적화 및 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 하나의 방법은 iRNA 듀플렉스 작용제(duplex agent)에 표적화 모이어티를 접합시키는 것이다. 표적화 모이어티는 iRNA 듀플렉스 작용제를 필요한 표적 부위에 표적화하는 것을 돕고, 예컨대, 새포내이입(endocytosis)에 의해서 세포에 의해서 취해질 접합된 분자를 위한 목적하는 수용체 부위에 대한 적절한 표적화 모이어티를 설계할 필요가 있다.
그러나, 지금까지 개발된 표적화 리간드는 항상 생체내 설정으로 번역되는 것은 아니며, 보다 효능있는 수용체 특이적 리간드 접합된 iRNA 듀플렉스 작용제 및 올리고뉴클레오타이드 치료제, 핵산 및 이중 가닥 siRNA의 생체내 전달을 위한 이의 제조 방법에 대한 명백한 요구가 존재한다.
지질 전달 시스템 단독이라기 보다는, 본 발명은 핵산의 구조 자체를 다룬다. 본 발명에 따른 핵산은 증가된 안정성을 갖는데, 이것이 세포 내로의 유입 이전에 핵산의 분해를 예방한다는 것을 예상치 못하게 발견하였다.
본 발명은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산을 제공하며, 이 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함한다. 제1 가닥은 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 중 임의의 것 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하지 않을 수 있다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있고/있거나 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
핵산은 제1 가닥의 3' 단부에 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5' 단부에 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 단부에 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재하지 않는 경우 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 제1 가닥 상의 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 제2 가닥의 3개의 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥은 별개의 가닥일 수 있다. 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥은 각각 17 내지 35게 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 17 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍으로 이루어질 수 있다.
핵산은 a) 양 단부 다에서 평활 단부(blunt ended)일 수 있거나; b) 하나의 단부에서 오버행을 갖고, 나머지에서 평활 단부를 가질 수 있거나; 또는 c) 양 단부 다에서 오버행을 가질 수 있다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어, 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접할 수 있다.
복수의 홀수 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산 내에서 변형될 수 있다. 복수의 짝수 뉴클레오타이드가 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형(common modification)에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과는 상이한 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 상의 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드 상에 존재하는 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다.
제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는데, 이것은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있다.
본 발명의 핵산에서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
제1 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있고/있거나 제2 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오타이드는 잠금(locked) 뉴클레오타이드, 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드 또는 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 임의의 하나일 수 있다. 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/있거나 적어도 하나의 변형은 2'-F일 수 있다.
본 발명의 핵산은 리간드와 접합될 수 있다.
본 발명의 핵산은 동일일 단부에 또는 상이한 단부 또는 가닥에서의 포스포로다이티오에이트에 더하여, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드 및/또는 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
본 발명은 제2 양상으로서, 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산을 추가로 제공하며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고, 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 리간드에 접합되어 있다.
따라서 본 발명에 사용하기 위한 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있고, 여기서 링커는 임의의 상기 양상에 정의된 바와 같은 서열에 GalNAc 모이어티를 접합한다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 명세서에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
리간드는 하기 화학식 I을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
따라서 본 발명은 하기 구조식 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 추가로 제공한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
여기서 Z는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산을 나타낸다.
리간드는 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00006
.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 부형제(들)는
i) 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) 페길화된 지질일 수 있다.
조성물 중의 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 제형의 전체 지질 함량의 약 55㏖% 내지 약 65㏖%, 바람직하게는 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 59㏖%일 수 있다.
조성물은 하기를 포함할 수 있다:
하기 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00007
하기 구조를 갖는 스테로이드:
Figure pct00008
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질:
Figure pct00009
및
하기 구조를 갖는 페길화된 지질:
Figure pct00010
.
또한 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 및/또는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산 또는 접합된 핵산이 제공된다.
본 발명은 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 핵산 또는 접합된 핵산은 대상체에게 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 또는 접합된 핵산의 제조 방법이 또한 포함된다.
본 발명은 이중 가닥이고, 표적 유전자의 발현된 RNA 전사물에 지향되는 핵산 및 이의 조성물에 관한 것이다. 이러한 핵산은, 표적 유전자 생성물의 감소된 발현이 바람직한 다양한 질환 및 장애의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 양상은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산에 관한 것이며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 저해될 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥 및 제2 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함한다.
선택적으로, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있고/있거나 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
선택적으로, 제1 가닥은 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 중 임의의 것 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하지 않으며, 다시 말해서, 그것은 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 중 임의의 것 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지 이외의 링키지를 포함한다.
관련된 양상은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산이며, 이 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 핵산은 제1 가닥의 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고, 여기서 핵산은 각각 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이 및 제2 가닥의 5' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고, 여기서 제1 가닥은 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트가 아닌 링키지를 포함한다. 바람직하게는 포스포로다이티오에이트가 아닌 이러한 링키지는 포스페이트 또는 포스포로티오에이트, 바람직하게는 (비치환된) 포스페이트이다. 바람직하게는, 제1 가닥의 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이의 링키지 및 제2 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이의 링키지 이외의 두 가닥의 뉴클레오타이드 사이의 링키지 모두는 비치환된 포스페이트 링키지이다.
핵산이라는 것은 유전자 발현을 방해할 수 있는, 뉴클레오타이드를 포함하는 2개의 가닥을 포함하는 핵산을 의미한다. 저해는 완전하거나 또는 부분적일 수 있고, 표적화된 방식으로 유전자 발현을 하향 조절할 수 있다. 핵산은 2개의 별개의 폴리뉴클레오타이드 가닥, 즉, 가이드 가닥일 수도 있는 제1 가닥, 및 패신저(passenger) 가닥일 수도 있는 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 '접혀서' 이중 가닥 분자를 형성하는 자가 상보성인 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자의 부분일 수 있다. 핵산은 siRNA 분자일 수 있다.
핵산은 리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥(당업계에서 가이드 가닥으로도 공지됨)의 전부 또는 일부 및 제2 가닥(당업계에서 패신저 가닥으로도 공지됨)의 전부 또는 일부에 의해서 형성된 이중-가닥 핵산 부분 또는 듀플렉스 영역을 추가로 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하고, 제1 가닥과 제2 가닥(이들 포함) 사이에 형성된 마지막 염기쌍에서 끝난다고 정의된다.
듀플렉스 영역은, 왓슨-크릭 염기 짝지움 또는 상보성 또는 실질적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드 가닥 사이에 듀플렉스 영역의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식에 의해서 서로와 염기 쌍을 형성하는 2개의 상보성이거나 실질적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드 내의 영역을 의미한다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오타이드 단위를 갖는 올리고뉴클레오타이드 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 단위의 또 다른 올리고뉴클레오타이드와 염기 쌍을 이룰 수 있지만, 각각의 가닥 상의 19개의 뉴클레오타이드만 상보성 또는 실질적으로 상보성이어서, "듀플렉스 영역"은 19개의 염기 쌍으로 이루어진다. 남아있는 염기 쌍은 5' 오버행 및 3' 오버행으로서, 또는 단일 가닥 영역으로서 존재할 수 있다. 추가로, 듀플렉스 영역 내에서, 100% 상보성은 필요하지 않고, 실질적인 상보성이 듀플렉스 영역 내에서 허용 가능하다. 실질적인 상보성은, 생물학적 조건 하에서 어닐링될 수 있도록 하는 가닥 간의 상보성을 지칭한다. 두 가닥이 생물학적 조건 하에서 어닐링될 수 있는지를 경험적으로 결정하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 두 가닥을 합성하고, 생물학적 조건 하에서 함께 첨가하여 그들이 서로 어닐링될 수 있는지를 결정할 수 있다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역을 형성하는 제1 가닥 및 제2 가닥의 부분은 완전히 상보성일 수 있고, 서로와 적어도 부분적으로 상보성이다.
핵산의 길이에 따라서, 제1 가닥과 제2 가닥 간의 염기 상보성과 관련하여 완벽한 매치가 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나, 제1 가닥 및 제2 가닥은 생리학적 조건 하에서 혼성화할 수 있어야 한다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역에서 제1 가닥과 제2 가닥 간의 상보성은, 어느 가닥에서 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다는 점에서 완벽할 수 있다. 대안적으로, 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%일 수 있다.
제1 가닥 및 제2 가닥은 적어도 15개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성의 영역을 포함할 수 있다.
핵산은 제1 가닥의 모두 또는 일부와 표적 핵산의 일부 간의 듀플렉스 영역의 형성에 관여한다. 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하고, 제1 가닥과 표적 서열(이들 포함) 사이에 형성된 마지막 염기 쌍에서 끝난다고 정의된, 제1 가닥과 듀플렉스 영역을 형성하는 표적 핵산의 일부는 표적 핵산 서열 또는 단순히 표적 서열이다. 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스 영역과 동일할 필요는 없다. 즉, 제2 가닥은 표적 서열과 상이한 서열을 가질 수 있지만, 제1 가닥은 제2 가닥 및 표적 서열 둘 다와 듀플렉스 구조를 형성할 수 있어야 한다.
제1 가닥과 표적 서열 간의 상보성은 완벽할 수 있다(두 핵산 내에 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오타이드가 존재하지 않음).
제1 가닥과 표적 서열 간의 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열의 상보성 서열 간의 동일성은 약 75% 내지 약 100% 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 중간 값일 수 있되, 단 핵산은 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 저해할 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열 간에 100% 미만의 상보성을 갖는 핵산은 제1 가닥과 표적 서열 간에 완벽한 상보성을 갖는 핵산과 동일한 수준까지 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 그것은 완벽한 상보성을 갖는 핵산에 의해서 달성되는 발현 수준의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%인 수준까지 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
추가 양상에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 핵산일 수 있는 저해제의 부재 하에서 관찰된 수준과 비교할 때 세포에서 표적 유전자의 발현을 적어도 10% 감소시킬 수 있다. 상기 양상 중 임의의 것의 모든 바람직한 특징이 또한 본 양상에 적용된다. 특히, 세포에서 표적 유전자의 발현은 저해제(핵산일 수 있음)의 부재 하에서 관찰된 것보다, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 또는 그 미만 및 중간값으로 감소될 수 있다.
핵산은 각각 19 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함할 수 있다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 상이한 길이를 가질 수 있다.
핵산은 15 내지 25개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 17 내지 23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 17 내지 25개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 23 내지 24개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 19 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 21 내지 23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다.
핵산은 19 내지 25개 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 이루어진 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 인접할 수 있는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 염기 쌍으로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 RNA 간섭을 매개한다.
추가 양상에서, 기재된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산은 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 관찰되는 발현에 비해서 이의 표적 전사체의 발현을 적어도 15% 감소시킬 수 있다. 상기 양상 중 임의의 것의 바람직한 특징이 이러한 양상에 또한 적용된다. 특히, 이의 표적 전사체의 발현은 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 또는 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰되는 것보다 적어도 하기에 주어진 %로, 또는 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 미만 또는 더 낮게 그리고 중간 값으로 감소될 수 있다.
본 발명의 핵산 중의 포스포로다이티오에이트 링키지의 사용은 카이럴 중심을 갖는 포스포로티오에이트 링키지에 의해서 유발될 수 있고, 비-연결 산소가 황 대신 치환되는 것을 제어할 수 없는 핵산 분자의 집단의 입체화학의 변화를 감소시킨다. 포스포로다이티오에이트의 사용은 링키지 내에 카이럴 중심이 존재하지 않는 것을 보장하기 때문에, 핵산 분자에 사용되는 포스포로다이티오에이트 및 포스포로티오에이트 링키지의 수에 따라서, 핵산 분자의 집단에서의 임의의 변화를 감소 또는 제거한다.
추가로, 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 단일 포스포로다이티오에이트 링키지가 2개의 포스포로티오에이트 링키지 대신에 사용될 수 있고, 따라서 본 발명의 핵산 내에서 "비-자연" 링키지의 수를 감소시킬 수 있다.
핵산은 제1 가닥의 3' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 3' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5' 말단에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 또한 단부에 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재하지 않을 경우 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 제2 가닥의 3개의 3' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 3개의 5' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 포스포로티오에이트와 포스포로다이티오에이트 링키지의 혼합물을 포함할 수 있고, 이의 예는 본 명세서에 제시되어 있다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥 각각의 3' 단부에서 포스포로다이티오에이트를 포함할 수 있다.
핵산은 양 단부 다에서 평활 단부일 수 있거나; 하나의 단부에서 오버행을 갖고, 나머지 단부에서 평활 단부를 가질 수 있거나; 또는 양 단부 다에서 오버행을 가질 수 있다.
"오버행"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 당업계에서의 이의 일반적인 통상적인 의미를 갖고, 즉, 이중 가닥 핵산에서 상보성 가닥의 말단 뉴클레오타이드를 지나서 연장된 핵산의 단일 가닥 부분이다. 용어 "평활 단부"는 말단 뉴클레오타이드(들)가 염기 쌍을 형성하는지의 여부와 관계 없이, 두 가닥 모두가 동일한 위치에서 종결되는 이중 가닥 핵산을 포함한다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오타이드는 쌍을 형성하지 않을 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오타이드는 쌍을 형성하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "비치환된 포스페이트"는 자연, 예를 들어, 자연 DNA 또는 자연 RNA 분자에서 2개의 뉴클레오타이드 사이에서 통상적으로 발견되는 바와 같은 일반적인 포스페이티를 지정한다. 이러한 포스페이트는 본 명세서에서 "포스페이트", "비치환된 포스페이트" 또는 "포스포다이에스터"로서 단순히 지정될 수 있다.
핵산은 한쪽 단부에 오버행 및 다른 쪽에는 평활 단부를 가질 수 있다. 핵산은 양 단부에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 양 단부 다에서 평활 단부일 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부 또는 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 5'-단부에서 평활 단부일 수 있다.
핵산은 3'- 또는 5'-단부에 오버행을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 둘 다에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 둘 다에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다.
제2 가닥 또는 제1 가닥의 3'-단부 또는 5' 단부의 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5개 길이의 뉴클레오타이드로부터 선택될 수 있다. 선택적으로, 오버행은 뉴클레오타이드 1 또는 2개로 이루어질 수 있고, 이는 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다.
비변형된 폴리뉴클레오타이드, 특히 리보뉴클레오타이드는 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있고, 따라서, 변형/변형된 뉴클레오타이드가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있다. 이러한 변형은 핵산을 뉴클레아제에 대해서 더 저항성이게 함으로써 핵산을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 개선된 저항성은 핵산이 RNA 간섭을 매개하는 데 있어서 더 긴 시간 경과 동안 활성이게 하고, 핵산을 치료를 위해서 사용하려는 경우에 특히 바람직하다.
본 발명의 핵산의 제2 및/또는 제1 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 핵산의 변형은 네이티브 RNA 분자에 대해 고유한 시험관내 및 생체내 안정성 및 생체이용률을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 잠재적인 한계를 극복하는데 있어서 강력한 도구를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산은 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 인간에서 인터페론 활성을 유도할 가능성을 또한 최소화할 수 있다. 변형은 표적 세포로의 핵산의 기능적 전달을 추가로 향상시킬 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산은 제1 가닥 또는 제2 가닥 중 어느 하나 또는 둘 다의 하나 이상의 화학적으로 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오타이드는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 리보핵산은 핵산 또는 염기의 유사체로의 치환 또는 삽입에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역 외부, 즉 단일 가닥 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 제1 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제2 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제1 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제2 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 핵산은 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있거나 본 발명의 핵산은 약 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있거나, 핵산은 약 4 내지 6개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 6 내지 8개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 8 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 10 내지 12개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 12 내지 14개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 14 내지 16개의 변형된 뉴클레오타이드 약 16 내지 18개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 18 내지 20개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 20 내지 22개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 22 내지 24개의 변형된 뉴클레오타이드, 24 내지 26개의 변형된 뉴클레오타이드 또는 약 26 내지 28개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 각각의 경우에 상기 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산은 상기 변형된 뉴클레오타이드를 갖지 않는 것을 제외하고는 동일한 핵산과 비교할 때 활성도의 적어도 50%를 유지한다. 핵산은 상기 변형된 뉴클레오타이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 핵산과 비교할 때 활성도의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 또는 중간 값을 유지할 수 있거나, 또는 상기 변형된 뉴클레오타이드가 없는 동일한 뉴클레오타이드의 활성도의 100%를 초과할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 퓨린의 적어도 절반은 변형될 수 있다. 피리미딘의 적어도 절반은 변형될 수 있다. 퓨린의 전부가 변형될 수 있다. 피리미딘의 전부가 변형될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 몰폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아마이드기에 연결된 말단 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 염기는 2-아미노아데노신, 2,6-다이아미노퓨린,이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트라이메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 다이하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬사이티딘(예를 들어, 5-메틸사이티딘), 5-알킬우리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(예를 들어 6-메틸우리딘), 프로핀, 쿠에소신(quesosine), 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신(wybutosine), 와이부톡소신(wybutoxosine), 4-아세틸사이티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 5'-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아노신, 3-메틸사이티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐일아데노신, 베타-D-만노실쿠에오신, 우리딘-5-옥시아세트산 및 2-티오사이티딘으로부터 선택된다. 염기는 2,6-다이아미노퓨린 리보사이드, 피리딘-4-온 리보사이드, 피리딘-2-온 리보사이드, 페닐 리보사이드, 2,4,6-트라이메톡시 벤젠 리보사이드, 아미노페닐 리보사이드, 6-아자피리미딘 리보사이드, 프로핀 리보사이드일 수 있다.
본 명세서에 논의된 핵산은 비변형된 RNA뿐만 아니라 예를 들어, 효능을 개선시키도록 변형된 RNA 및 뉴클레오사이드 대용물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉, 당, 염기 및 포스페이트 모이어티가 자연에서 발생하는 것, 예를 들어, 인체에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 모이어티 중 하나 이상이 자연에서 발생하는 것과 상이한 뉴클레오타이드를 지칭한다. 그것이 변형된 뉴클레오타이드로 지칭되는 경우, 이는, 변형으로 인해, 뉴클레오타이드가 아닌 분자, 예를 들어, 리보포스페이트 골격이 가닥 사이의 혼성화를 허용하는 비-리보포스페이트 작제물로 교체된 폴리뉴클레오타이드 분자를 물론 포함할 것이고, 즉, 변형된 뉴클 레오타이드는 리보포스페이트 골격을 모방한다.
핵산 내에서 일어나는 하기에 기재된 변형 중 다수, 예컨대 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이 폴리뉴클레오타이드 분자 내에서 반복될 것이다. 일부 경우에, 변형은 폴리뉴클 레오타이드 내의 모든 가능한 위치/뉴클레오타이드에서 일어날 것이지만, 다수의 경우에 그렇지 않을 것이다. 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어날 수 있고, 말단 영역에서만, 예컨대, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 둘 다에서 일어날 수 있다. 변형은 본 발명의 핵산의 이중 가닥 영역에서만 일어날 수 있거나, 또는 본 발명의 핵산의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 비-연결 O 위치의 포스포로티오에이트 변형은 하나의 또는 양 말단에서만 일어날 수 있거나, 말단 영역에서만, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드에서 일어날 수 있거나, 또는 듀플렉스 및/또는 단일 가닥 영역에서, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5' 단부 또는 3' 단부는 포스포릴화될 수 있다.
오버행 내에 특정 염기를 포함함으로써, 또는 단일 가닥 오버행 내에, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 내에, 또는 둘 다 내에 변형된 뉴클레오타이드를 포함함으로써 본 발명의 핵산의 안정성이 증가될 수 있다. 퓨린 뉴클레오타이드가 오버행 내에 포함될 수 있다. 3' 또는 5' 오버행 내의 염기 중 전부 또는 일부가 변형될 수 있다. 변형은 리보스 당의 2' OH 기에서의 변형을 사용하는 것, 리보뉴클레오타이드 대신 데옥시리보뉴클레오타이드를 사용하는 것, 및 포스페이트기에서의 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
본 발명의 dsRNA 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 두 가닥 모두에서의 5'- 또는 3'-오버행은 포스포릴화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 두 가닥 모두의 3'-단부에 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
뉴클레아제는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 핵산에 대한 화학적 변형은 개선된 특성을 부여할 수 있고, 올리고리보뉴클레오타이드를 뉴클레아제에 대해 더욱 안정적이게 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 변형된 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상(본 발명의 핵산의 5' 및 3' 말단에 있는 경우에도 연결로 지칭됨)의 변경, 예를 들어, 대체;
(ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체;
(iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체;
(iv) 자연 발생 염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형;
(vi) RNA의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 예를 들어, 형광 표지 모이어티의 RNA의 3' 또는 5' 단부에 대한 접합.
대체, 변형, 변경이라는 용어는 자연 발생 분자와의 차이를 나타낸다.
구체적인 변형이 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황에 의해서 대체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 연결 산소의 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해서 또한 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 대체되는 것이 가능하다.
변형된 뉴클레오타이드는 당기의 변형을 포함할 수 있다. 2' 하이드록실기(OH)는 변형되거나 또는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체될 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들어, R〓H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; "잠금" 핵산(LNA)(여기서 2' 하이드록실은 예를 들어, 메틸렌 브리지에 의해서 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결됨); O-아민(아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민, 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n아민(예를 들어, 아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민, 폴리아미노)을 포함한다.
"데옥시" 변형은 산소, 할로, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 다이헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민(아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노), ―NHC(O)R(R=알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당), 사이아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알켄일 및 알킨일(이것은 예를 들어, 아미노 작용기로 선택적으로 치환될 수 있음)을 포함한다. 특정 실시형태의 다른 치환체는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴 및 2'-플루오로를 포함한다.
당기는 리보스 내의 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학 구성을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 뉴클레오타이드는 아라비노스와 같은 당을 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 "무염기성" 당을 또한 포함할 수 있고, 이것은 C-1'의 핵염기가 결핍되어 있다. 이러한 무염기성 당은 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서의 변형을 추가로 함유할 수 있다.
2'-변형이 하나 이상의 포스페이트 링커 변형과 조합되어 사용될 수 있다(예를 들어, 포스포로티오에이트).
포스페이트기는 인 비함유 연결기에 의해서 개별적으로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 특정 실시형태에서, 대체는 메틸렌카보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노기를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 저항성 뉴클레오타이드에 의해서 대체될 수 있다.
예는 몰폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함한다. 특정 실시형태에서, PNA 대용물이 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 5' 단부가 변형될 수 있다. 이러한 변형은 분자의 3' 단부 또는 5' 단부 또는 양 단부에 존재할 수 있다. 이는 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트기의 원자 중 하나 이상의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 5' 단부가 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단(예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스터를 기초로 함)와 같은 다른 기능성 분자 엔티티에 접합될 수 있다. 기능성 분자 엔티티는 포스페이트기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트기의 연결 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C기에 연결되거나 또는 이를 대체할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오타이드 대용물(예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결되거나 이를 대체할 수 있다. 이러한 스페이서 또는 링커는 예를 들어, -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, -O(CH2CH2O)nCH2CH2O-(예를 들어, n=3 또는 6임), 무염기성 당, 아마이드, 카복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에터, 다이설파이드, 티오유레아, 설폰아마이드 또는 몰폴리노, 또는 바이오틴 및 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다. 3' 단부는 -OH기일 수 있다.
말단 변형의 다른 예는 염료, 인터칼레이팅제(intercalating agent)(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌(psoralene), 미토마이신 C), 포피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 다이하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제, EDTA, 친유성 담체(예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 다이하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판다이올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 다이메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 바이오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 착물)를 포함한다.
활성을 조정하는 것 또는 분해에 대한 저항성을 조절하는 것을 포함하는 다수의 이유로 인해서 말단 변형이 부가될 수 있다. 활성을 조절하는데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로의 5' 단부의 변형을 포함한다. 제1 가닥 또는 제2 가닥 상의 본 발명의 핵산은 5' 인산화될 수 있거나 또는 5' 말단에 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵과 상용성인 것을 포함한다. 적합한 변형은 하기를 포함한다: 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-다이포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트라이포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화된 또는 비-메틸화된)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노다이티오포스페이트(포스포로다이티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 다이포스페이트 및 트라이포스페이트의 임의의 추가적인 조합물(예를 들어, 5'-알파-티오트라이포스페이트, 5'-감마-티오트라이포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 아이소프로필, 프로필 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-바이닐포스포네이트, 5'-알킬에터포스포네이트(R=알킬에터=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-).
본 발명의 핵산은 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 단부 중 하나 이상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 선택적으로, 제1 가닥의 각각의 단부 또는 어느 하나의 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제2 가닥의 각각의 단부 또는 어느 하나의 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제1 가닥의 양 단부 및 제2 가닥의 5' 단부는 2개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드라는 것은 뉴클레오타이드와 인접한 뉴클레오타이드 사이의 링키지가 표준 포스페이트기 대신에 포스포로티오에이트기를 포함하는 것을 의미한다.
말단 변형은 분포를 모니터링하는데 또한 유용할 수 있고, 이러한 경우에, 부가될 기는 형광단, 예를 들어, 플루오레세인 또는 알렉사(Alexa) 염료를 포함할 수 있다. 말단 변형은 흡수를 향상시키는데 또한 유용할 수 있고, 이에 유용한 변형은 콜레스테롤을 포함한다. 말단 변형은 RNA 작용제를 또 다른 모이어티에 가교시키는데 또한 유용할 수 있다.
아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실은 RNA에서 발견되는 가장 통상적인 염기이다. 이들 염기는 특성이 개선된 RNA를 제공하도록 변형 또는 대체될 수 있다. 예를 들어, 이들 염기 또는 합성 및 자연 핵염기(예를 들어, 이노신, 티민, 잔틴, 하이포크잔틴, 뉴불라린, 아이소구아니신 또는 투베르시딘) 및 상기 변형 중 어느 하나를 사용하여 뉴클레아제 저항성 올리고리보뉴클레오타이드가 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 염기 및 "만능 염기" 중 임의의 것의 치환된 또는 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 예는 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로핀일 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일우라실 및 5-프로핀일사이토신, 다이하이드로우라실, 3-데아자-5-아자사이토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 사이토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-다이메틸아데닌, 2,6-다이아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트라이아졸, 2-피리디논, 5-나이트로인돌, 3-나이트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우라실, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N<4>-아세틸 사이토신, 2-티오사이토신, N6-메틸아데닌, N6-아이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐일아데닌, N-메틸구아닌 또는 O-알킬화된 염기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 유사체"는 6 데스 아미노 아데노신(네불라린(Nebularine)), 4-Me-인돌, 3-나이트로피롤, 5-나이트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, N3-Me dC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 염기 쌍을 이루지 않은 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 염기 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 유사체는 리보뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 그것은 데옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말단 작용기"는 비제한적으로 할로겐, 알코올, 아민, 카복실, 에스터, 아마이드, 알데하이드, 케톤, 에터기를 포함한다.
특정 모이어티가 제1 가닥 또는 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있고, 무염기성 리보스 모이어티, 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 변형 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 예컨대, 2' O 알킬 변형; 역전된 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 및 이의 변형, C6-이미노-Pi; 거울 뉴클레오타이드, 예컨대, L-DNA 및 L-RNA; 5'OMe 뉴클레오타이드; 및 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대, 4',5'-메틸렌 뉴클레오타이드; 1-(β-D-에리트로퓨라노실)뉴클레오타이드; 4'-티오 뉴클레오타이드, 탄소환식 뉴클레오타이드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-다이아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-언하이드로헥시톨 뉴클레오타이드; 알파-뉴클레오타이드; 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오타이드; 비환식 3',4'-세코 뉴클레오타이드; 3,4-다이하이드록시부틸 뉴클레오타이드; 3,5-다이하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄다이올 포스페이트; 5'-아미노; 및 브리징 또는 비브리징 메틸포스포네이트 및 5'-머캅토 모이어티를 포함한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 역전된 뉴클레오타이드, 예를 들어 역전된 티미딘 또는 역전된 아데닌으로서 포함될 수 있다(예를 들어, 문헌[Takei, et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06] 참고).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어 "저해하다", "하향 조절하다" 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 소단위 또는 펩타이드를 암호화하는 등가의 RNA 분자(예를 들어, mRNA)의 수준, 또는 1종 이상의 단백질, 단백질 소단위의 활성도가 본 발명의 핵산 부재 하에서 또는 인간 전사물에 대한 상동성이 공지되어 있지 않은 siRNA 분자(본 명세서에서 비-침묵 대조군으로 지칭)를 참고로 관찰되는 것보다 낮게 감소된다는 것을 의미한다. 이러한 대조군은 본 발명의 분자와 유사한 방식으로 접합 및 변형될 수 있고, 동일한 경로에 의해 표적 세포 내로 전달될 수 있고; 예를 들어, 발현은 (핵산일 수 있는) 저해제의 부재 또는 (표적 서열과 비-상보성인 핵산일 수 있는) 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰되는 것의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 또는 더 낮게 감소될 수 있다.
본 발명의 핵산은 무염기성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 용어 "무염기성"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 염기가 결핍되거나 또는 1' 위치의 염기 대신 다른 염기, 예를 들어, 3',3'-연결된 또는 5',5'-연결된 데옥시무염기성 리보스 유도체를 갖는 모이어티를 지칭한다.
핵산은 변형된 제2 가닥 및/또는 제1 가닥 상에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 교번하는 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 교번하는은 규칙적인 방식으로 하나 뒤에 또 다른 하나가 존재하는 것을 의미한다. 다시 말해서, 교번하는은 차례대로 반복적으로 존재하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오타이드가 변형되면, 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 변형되지 않고, 그 다음의 인접한 뉴클레오타이드가 변형되고 그 등등이다. 하나의 뉴클레오타이드는 제1 변형으로 변형될 수 있고, 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 변형될 수 있으며, 그 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 제1 변형으로 변형되고 그 등등이고, 여기서 제1 변형 및 제2 변형은 상이하다.
본 발명의 핵산의 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'로 번호 매겨지고, 가장 5'인 뉴클레오타이드가 제1 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이다. 용어 "홀수"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 2로 나눌 수 없는 수를 의미한다. 홀수의 예는 1, 3, 5, 7, 9, 11 등이다. 본 발명의 핵산의 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'로 번호 매겨진다. 용어 "짝수"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 2로 균일하게 나눌 수 있는 수를 의미한다. 짝수의 예는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 등이다. 본 발명의 핵산의 제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2 가닥은 3'에서 5'로 번호 매겨지고, 가장 3'인 뉴클레오타이드가 제2 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이다. 본 발명의 핵산의 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2가닥은 3'에서 5'로 번호 매겨진다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어, 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접할 수 있다.
제1 가닥 내의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산 내에서 변형될 수 있다. 제1 가닥 내의 복수의 짝수 뉴클레오타이드가 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥 상의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과는 상이한 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드 상에 존재하는 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드의 변형과는 상이하다.
제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는데, 이것은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있다.
본 발명의 핵산에서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 공통 변형에 의해서 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 공통 변형에 의해서 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 교번하는 변형의 적어도 2개의 영역을 포함하는 단일 또는 이중 가닥 작제물을 포함할 수 있다. 이들 교번하는 영역은 최대 약 12개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 교번하는 뉴클레오타이드의 영역은 본 발명의 핵산의 하나 또는 두 가닥의 말단에 위치될 수 있다. 핵산은 4개 내지 약 10개의 교번하는 뉴클레오타이드를 각각의 말단(3' 및 5')에 포함할 수 있고, 이러한 영역은 약 5개 내지 약 12개의 인접한 비변형된 뉴클레오타이드 또는 상이하게 또는 공통적으로 변형된 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드는 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 서로, 그리고 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 동일한 변형을 갖는 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
본 발명의 핵산은 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 가닥을 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제2 변형으로 변형될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 근접할 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변형 중 하나와 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 근접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 3' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
(제1 가닥에서는 5'에서 3'로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'로) 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산을 위해 제1 가닥에서는 5'에서 3'로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'로 번호 매겨진다.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다.
명백하게, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥이 25개 뉴클레오타이드 길이보다 짧으면, 예컨대 19개 뉴클레오타이드 길이이면, 20, 21, 22, 23, 24 및 25로 번호 매겨진 변형될 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다. 따라서 당업자는 상기 설명이 더 짧은 가닥에 적용된다는 것을 이해한다.
제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 공통 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 상이한 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상의 비변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제2 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상의 비변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 다시 말해서, 예를 들어, 제2 가닥의 교번하는 영역 내의 모든 변형이 제1 가닥 내의 동일한 변형과 쌍을 이루도록, 또는 대안적으로 하나의 가닥의 교번하는 영역 내의 공통 변형이 다른 가닥 내의 유사하지 않은 변형(즉, 제2 변형 또는 추가 변형)과 쌍을 형성하면서 변형이 1개의 뉴클레오타이드만큼 오프셋될 수 있도록 교번하는 뉴클레오타이드는 2개의 가닥 상에서 정렬될 수 있다. 또 다른 선택은 각각의 가닥에 유사하지 않은 변형을 갖는 것이다.
공통 변형된 뉴클레오타이드가 서로 쌍을 이루지 않도록, 제1 가닥 상의 변형이 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 1개의 뉴클레오타이드만큼 이동될 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드 또는 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 임의의 하나일 수 있다.
적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/있거나 적어도 하나의 변형은 2'-F일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 변형이 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 단부 중 하나 또는 몇몇에 역전된 RNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 역전된 뉴클레오타이드는 핵산에 안정성을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 가닥 중 적어도 하나의 3' 단부 및/또는 제2 가닥의 5' 단부 중 하나 및 몇몇에서 적어도 역전된 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 뉴클레오타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 이러한 뉴클레오타이드는 바람직하게는 역전된 A이다. 역전된 뉴클레오타이드는 바람직하게는 나머지 가닥 내의 상응하는 뉴클레오타이드 반대에 오버행으로서가 아니라 가닥의 단부에 존재한다. 이러한 변형을 갖는 핵산은 안정적이고, 합성이 용이하다.
본 발명의 설명 전체에 걸쳐, "동일한 또는 공통 변형"은 임의의 뉴클레오타이드, 즉, 메틸기 또는 플루오로기와 같은 기로 변형된 A, G, C 또는 U에 대한 동일한 변형을 의미한다. 이는 동일한 뉴클레오타이드 상의 동일한 부가를 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG가 모두 동일한 또는 공통 변형인 것으로 간주되고, 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG도 그러하다. 2'F 변형은 2'OMe 변형과는 상이한 변형이다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에 제시된다. 이러한 예는 대표적이고 비제한적인 것으로 의도된다.
바람직하게는, 핵산은, 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형으로 이루어진 군으로부터 각각 개별적으로 선택되는, 변형 및 제2 변형 또는 추가 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-O-메틸(2'OMe)인 변형, 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 각각의 가닥 또는 두 가닥의 각각의 단부 또는 임의의 단부의 말단의 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드 내에 또는 그 사이에 존재할 수 있는 포스포로티오에이트 변형 및/또는 데옥시 변형을 또한 포함할 수 있다.
핵산은 리간드에 접합되어, 접합체를 형성할 수 있다.
일부 리간드는 엔도소몰리틱(endosomolytic) 특성을 가질 수 있다. 엔도소몰리틱 리간드는 엔도솜의 용해 및/또는 본 발명의 조성물 또는 이의 성분의 엔도솜으로부터 세포의 세포질로의 수송을 촉진시킨다. 엔도소몰리틱 리간드는 pH-의존적 막 활성도 및 융합생성(fusogenicity)을 나타내는 다음이온성 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 엔도소몰리틱 성분은 pH 변화에 반응하여 전하 또는 양성자화의 변화를 겪는 화학기를 함유할 수 있다. 엔도소몰리틱 성분은 선형 또는 분지형일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 흡수를 향상시키기 위한 치료 변형제; 예를 들어, 분포를 모니터링하기 위한 진단 화합물 또는 수용체 기; 가교제; 및 뉴클레아제-내성 부여 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적인 예는 지질, 스테로이드, 비타민, 당, 단백질, 펩타이드, 폴리아민 및 펩타이드 모방체를 포함한다. 리간드는 자연 발생 물질, 예컨대, 단백질, 탄수화물 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 재조합 또는 합성 분자일 수 있다.
리간드는 또한 표적화기, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화제를 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 인터칼레이팅제, 가교제, 포피린, 다환식 방향족 탄화수소, 인공 엔도뉴클레아제 또는 킬레이터, 친유성 분자, 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG, MPEG, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지 마커, 효소, 햅텐, 수송체/흡수 촉진제, 합성 리보뉴클레아제 또는 이미다졸 클러스터를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 또는 호르몬 수용체일 수 있다. 이것은 또한 비-펩타이드 종, 예컨대, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민 또는 보조인자일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 핵산의 세포 내로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예컨대, 약물일 수 있다.
리간드는 염증 반응을 활성화시킴으로써 핵산의 세포 내로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 리간드는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨-1 베타 또는 감마 인터페론을 포함한다.
리간드는 지질 또는 지질계 분자일 수 있다. 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질에 결합한다. 바람직하게는, 지질계 리간드는 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합한다. 지질 또는 지질계 분자는 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시키고/거나, 표적 세포에 대한 표적화 또는 수송을 증가시키고/거나 혈청 단백질에 대한 접합을 조정할 수 있다. 지질계 리간드는 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 조절하는데 사용될 수 있다.
리간드는 스테로이드일 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체이다.
리간드는 표적 세포에 의해서 취해지는 모이어티, 예를 들어, 비타민일 수 있다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, K 및 B 비타민을 포함한다. 비타민은 증식 중인 세포에 의해서 취해질 수 있고, 이것은 세포, 예컨대, 악성 또는 비악성 종양 세포에 핵산을 전달하는데 유용할 수 있다.
리간드는 세포-투과제, 예컨대, 나선 세포-투과제일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 작용제는 양친매성이다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 펩티도미메틱은 자연 펩타이드와 유사한 정의된 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱 리간드는 자연 발생 또는 변형된 펩타이드 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 구속(constrained) 펩타이드 또는 가교 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(hydrophobic membrane translocation sequence.)을 포함할 수 있다. 펩타이드 모이어티는 큰 극성 분자, 예컨대, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 세포막을 통해서 이동시킬 수 있는 펩타이드, 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ) 및 드로소필리아 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK)일 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 세포 표적화 펩타이드, 예를 들어, 아르기닌-글리신-아스파트산(RGD)-펩타이드이다.
리간드는 예를 들어, 미생물 세포 또는 포유동물 세포를 투과할 수 있는 세포 투과 펩타이드일 수 있다.
리간드는 약동학적 조절제일 수 있다. 약동학적 조절제는 친유체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, PEG 비타민 등일 수 있다.
2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 동일한 특성을 가질 수 있거나 모두 상이한 특성을 가질 수 있거나 일부 리간드는 동일한 특성을 가질 수 있는 반면, 나머지 것은 상이한 특성을 갖는다. 예를 들어, 리간드는 표적화 특성을 가질 수 있거나, 엔도소몰리틱 활성을 가질 수 있거나 PK 조절 특성을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 모든 리간드가 상이한 특성을 갖는다.
리간드는 3'-단부, 5'-단부 및/또는 내부 위치에서 핵산에 커플링될 수 있다. 바람직하게는 리간드는 테더(tether) 또는 링커를 통해서 핵산에 커플링된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 이중 가닥 핵산이다. 이중 가닥 핵산에서, 리간드는 하나의 가닥 또는 두 가닥에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 가닥 핵산은 센스 가닥에 접합된 리간드를 함유한다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 핵산은 안티센스 가닥에 접합된 리간드를 함유한다.
리간드는 핵 염기, 당 모이어티 또는 핵산 분자의 뉴클레오사이드간 링키지에 접합될 수 있다. 퓨린 핵염기 또는 이의 유도체에 대한 접합은 엔도사이클릭 및 엑소사이클릭 원자를 포함하는 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 피리미딘 뉴클레오타이드 또는 이의 유도체에 대한 접합이 또한 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 뉴클레오사이드의 당 잔기에 대한 접합은 임의의 탄소 원자에서 일어날 수 있다. 뉴클레오사이드간 링키지에 대한 접합은 인-함유 링키지의 인 원자에서 또는 인 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자에서 일어날 수 있다. 아민- 또는 아마이드-함유 뉴클레오사이드간 링키지의 경우, 접합은 아민 또는 아마이드의 질소 원자에서 또는 인접한 탄소 원자에 대해서 일어날 수 있다.
리간드는 전형적으로 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 또는 다당류이다. 리간드는 링커에 의해서 핵산에 접합될 수 있다. 링커는 1가, 2가 또는 3가 분지형 링커일 수 있다.
생체 내에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 특히 이중 가닥 핵산을 세포로 효율적으로 전달하기 위한 수단이 중요하고, 이는 특이적 표적화 및 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 한 방법은 표적화 모이어티 또는 리간드를 핵산에 접합시키는 것이다. 표적화 모이어티는 핵산을 필요한 표적 부위에 표적화하는 것을 돕고, 세포에 의해서, 예컨대, 세포내이입에 의해서 취해질 접합된 분자를 위해서 목적하는 수용체 부위에 대해서 적절한 표적화 모이어티를 접합시키는 것이 요구된다. 표적화 모이어티 또는 리간드는 특이적 수용체를 표적화할 수 있는 임의의 모이어티 또는 리간드일 수 있다.
예를 들어, 아시알로당단백질 수용체 복합체(asialoglycoprotein receptor: ASGP-R)는 고능력 수용체이고, 이것은 간세포에서 가장 풍부하다. 삼안테나형(triantennary) 클러스터 글리코사이드의 최초의 개시 중 하나는 미국 특허 제5,885,968호에서였다. 3개의 GalNAc 리간드를 갖고, 포스페이트기를 포함하는 접합체가 공지되어 있고, 문헌[Dubber et al. (2003)]에 기재되어 있다. ASGP-R은 D-Gal보다 N-아세틸-D-갈락토실아민(GalNAc)에 대해서 50배 더 높은 친화도를 나타낸다.
글리코실화 단백질 또는 다른 올리고당의 말단 β-갈락토실 소단위를 특이적으로 인식하는 렉틴을 발현하는 간세포(아시알로당단백질 수용체(ASGPR))(P. H. Weigel et. al., 2002)는 약물 물질에 갈락토스 또는 갈락토사민을 공유 커플링시킴으로써 간에 대해서 약물을 표적화시키기 위해서 사용될 수 있다(Ishibashi, S.; et. al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6). 또한, 표적화 단위의 반복에 의해 달성되는 다가 효과에 의해 결합 친화도가 유의하게 증가될 수 있다(Biessen EA, et al., J Med Chem. 1995 Apr 28;38(9):1538-46).
ASGPR은 말단 β-갈락토실 함유 당단백질의 활성 엔도솜 수송체에 대한 매개인자이기 때문에, ASGPR은 세포에 전달될 핵산과 같은 약물 후보물질의 표적화 전달에 상당히 적합하다(Akinc et al.).
리간드라고도 지칭될 수 있는 당류는 표적 세포 상의 수용체 중 적어도 하나의 유형에 대해서 친화도를 갖도록 선택된 당류를 포함할 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R) 상에 존재한다.
당류는 N-아세틸 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로부터 선택될 수 있다. 당류는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)일 수 있다.
리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있고, 여기서 링커는 임의의 상기 양상에 정의된 바와 같은 핵산에 GalNAc 모이어티를 접합한다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 명세서에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
"GalNAc"는 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 일반적으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. β-형태 둘 다: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β-형태, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
리간드는 GalNAc를 포함할 수 있다.
리간드는 하기 화학식 I의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
화학식 I에서, 분지 단위 "A"는 3개의 당류 리간드를 수용하기 위해서 3개로 분지된다. 분지 단위는 리간드 및 핵산에 공유 부착된다. 분지 단위는 알킬, 아마이드, 다이설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에터, 티오에터 및 하이드록시아미노기로부터 선택된 기를 포함하는 분지형 지방족기를 포함할 수 있다. 분지 단위는 알킬기 및 에터기로부터 선택된 기를 포함할 수 있다.
분지 단위 A는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00011
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00012
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00013
여기서 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00014
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00015
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00016
.
선택적으로, 분지 단위는 탄소 원자만으로 이루어진다.
"X3" 부분은 브리징 단위이다. 브리징 단위는 선형이고, 분지 단위 및 핵산에 공유 결합된다.
X3은 -C1-C20 알킬렌-, -C2-C20 알켄일렌-, 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터, -C(O)-C1-C20 알킬렌-, -C0-C4 알킬렌(Cy)C0-C4 알킬렌-(여기서 Cy는 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원의 사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리를 나타냄), -C1-C4 알킬렌-NHC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)NH-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-SC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)S-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-OC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)O-C1-C4 알킬렌-, 및 -C1-C6 알킬렌-S-S-C1-C6 알킬렌-으로부터 선택될 수 있다.
X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터일 수 있다. X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C4-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터일 수 있고, 여기서 상기 (C4-C20 알킬렌)은 Z에 연결된다. X3은 -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-, 특히, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 경우에 -CH2-기는 A에 연결된다.
리간드는 하기 화학식 (II)의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
식 중,
S는 당류를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 에틸렌 글리콜 줄기 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 C1-C8 알킬렌이고;
A는 하기로부터 선택된 분지 단위이고:
Figure pct00017
X3은 브리징 단위이며;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00018
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00019
여기서 X3은 질소 원자에 부착된다.
X3은 C1-C20 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, X3은 -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-, 특히 -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리간드는 하기 화학식 (III)의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
식 중,
S는 당류를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 에틸렌 글리콜 줄기 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에터이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식의 알킬렌 에터이고, 여기서 각각의 경우에 -CH2-기는 A에 연결되고,
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
분지 단위는 탄소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분지 단위는 탄소이다.
X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 양상 중 임의의 것의 경우, P는 변형된 포스페이트기를 나타내고, P는 하기로 표현될 수 있다:
Figure pct00020
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx 및 -ORx를 나타내고, 여기서 Rx는 C1-C6 알킬을 나타내고, 여기서
Figure pct00021
는 화합물의 나머지에 대한 부착을 나타낸다.
변형된 포스페이트는, 산소 중 하나 이상이 대체된 포스페이트기를 의미한다. 변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황에 의해서 대체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 연결 산소의 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해서 또한 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 대체되는 것이 가능하다.
예를 들어, Y1은 -OH를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나; 또는
Y1은 -O-를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있고;
Y1은 =O를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, -SH, -ORx 또는 -BH3를 나타낼 수 있고;
Y1은 =S를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, ORx 또는 -SH를 나타낼 수 있다.
당업자는 특정 예에서 Y1과 Y2 사이에 비편재화가 존재할 것임을 이해할 것이다.
바람직하게는, 변형된 포스페이트기는 티오포스페이트기이다. 티오포스페이트기는 바이티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 =S를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄) 및 모노티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 -O-를 나타내고, Y2는 =S를 나타내거나, 또는 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄)를 포함한다. 바람직하게는, P는 모노티오포스페이트이다. 본 발명자들은 포스페이트기 대신에 티오포스페이트기를 갖는 접합체가 생체내에서 개선된 효력 및 작용 기간을 갖는다는 것을 발견하였다.
P는 또한 에틸포스페이트일 수 있다(즉, 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 OCH2CH3를 나타낸다).
리간드로서도 지칭될 수 있는 당류는 표적 세포 상의 수용체 중 적어도 하나의 유형에 대해서 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면 상에 있고, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R)이다.
상기 양상 중 임의의 것의 경우, 당류는 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸룩토스 중 하나를 갖는 N-아세틸로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 당류는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)의 2개의 분자이다. 본 발명의 화합물은 3개의 리간드를 가질 수 있는데, 이것은 각각 바람직하게는 N-아세틸 갈락토사민이다.
"GalNAc"는 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 일반적으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. 특정 실시형태에서, β-형태 둘 다: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β-형태, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
상기 화학식 (III)의 화합물 중 임의의 것에 대해서, X1은 에틸렌 글리콜 줄기 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-일 수 있고, 여기서 m은 1, 2 또는 3이다. X1은 (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-일 수 있다. 바람직하게는, X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-이다. 대안적으로, X1은 C3-C6 알킬렌을 나타낸다. X1은 프로필렌일 수 있다. X1은 부틸렌일 수 있다. X1은 펜틸렌일 수 있다. X1은 헥실렌일 수 있다. 바람직하게는 알킬은 선형 알킬렌이다. 특히, X1은 부틸렌일 수 있다.
화학식 (III)의 화합물의 경우, X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-, 즉, C3 알콕시 메틸렌, 또는 -CH2CH2CH2OCH2-의 알킬렌 에터를 나타낸다.
따라서 본 발명은 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 추가로 제공한다:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
여기서 Z는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산을 나타낸다.
화학식 (I), (II) 또는 (III)의 리간드는 제1 (안티센스) 가닥의 3'-단부에서 그리고/또는 제2 (센스) 가닥의 3'- 단부 및/또는 5'-단부에서 부착될 수 있다. 핵산은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 하나를 초과하는 리간드를 포함할 수 있다. 그러나, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 단일 리간드가 바람직한데, 그 이유는 단일의 그러한 리간드가 표적 세포에 대한 핵산의 효율적인 표적화에 충분하기 때문이다.
바람직하게는, 제1 (안티센스) 가닥의 5'-단부는 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 리간드에 부착되지 않는데, 그 이유는 이 위치에서의 리간드는 핵산의 생물학적 활성도를 잠재적으로 방해할 수 있기 때문이다.
따라서, 가닥의 5'-단부에 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 단일 리간드를 갖는 핵산이 3'-단부에 동일한 리간드를 갖는 동일한 핵산보다 합성이 더 용이하고, 더 저비용이다. 따라서, 바람직하게는 화학식 (I), (II) 또는 (III) 중 임의의 것의 단일 리간드는 핵산의 제2 가닥의 5'-단부에 공유 부착된다(이것과 접합된다).
일 실시형태에서, 핵산은 지질을 포함하는 리간드, 보다 바람직하게는 콜레스테롤을 포함하는 리간드에 접합된다.
본 발명의 접합체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 리간드 또는 리간드들에 접합된 본 명세서 개시된 바와 같은 임의의 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체에 관한 것이며, 상기 접합체는 본 발명의 임의의 양상의 핵산을 포함하는 핵산 부분, 및 적어도 하나의 리간드 부분을 포함하며, 상기 적어도 하나의 리간드 부분은 링커 모이어티, 바람직하게는 세린올-유래된 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 여기서 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고, 여기서,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않는다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥)은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)의 3' 단부는 접합되지 않아서, 도 16A에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥)의 3' 단부는 접합되지 않아서, 도 16B에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥) 및 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥) 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)의 5' 단부는 접합되지 않아서, 도 16C에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥) 및 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥) 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되어, 도 16D에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
상기 실시형태 중 임의의 하나에서,
Figure pct00030
는 핵산 부분의 단부에 리간드를 접합한 링커를 나타내고; 리간드는 GalNAc 모이어티, 예컨대, GalNAc일 수 있고; 도 16E에 나타낸 바와 같은 개략적인 구조는 핵산 부분을 나타낸다.
이러한 개략적인 다이어그램은 제1 가닥 또는 제2 가닥 내의 뉴클레오타이드의 수에 제한되도록 의도되지도 않고, 다이어그램은 염기의 상보성에 대한 제한 또는 임의의 다른 제한 중 임의의 유형을 나타내지도 않는다.
리간드는 단량체 또는 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체 등)일 수 있다.
적합하게는, 따라서 리간드는 단일 표적화 리간드 모이어티, 예를 들어, 단일 GalNAc 모이어티를 함유하는 단량체이다.
대안적으로, 리간드는 이량체 리간드일 수 있고, 여기서 리간드 부분은 2개의 링커 모이어티, 예컨대, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 비-세린올 링커 모이어티를 포함하고, 각각은 단일 표적화 리간드 모이어티에 연결된다.
리간드는 삼량체 리간드일 수 있고, 여기서 리간드 부분은 3개의 링커 모이어티, 예컨대, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 비-세린올 링커 모이어티를 포함하고, 각각은 단일 표적화 리간드 모이어티에 연결된다.
2개 또는 3개의 세린올-유래된 링커 모이어티는 예를 들어, 하기에 나타낸 바와 같이 일렬로 연결될 수 있다:
Figure pct00031
여기서 n은 1 또는 2이고, Y는 S 또는 O이다.
바람직하게는, 리간드는 단량체이다.
적합하게는, 접합된 RNA 가닥은 추가 링커를 포함하는 링커 모이어티를 통해서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 추가 링커는 포화, 비분지형 또는 분지형 C1-15 알킬쇄이거나, 이를 포함하고, 여기서 선택적으로 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 O, N, S(O)p로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 대체되고, 여기서 p는 0, 1 또는 2이고(예를 들어, CH2기는 O, 또는 NH, 또는 S, 또는 SO2로 대체되거나 쇄의 말단 또는 분지 상의 -CH3기는 OH 또는 NH2로 대체됨), 여기서 상기 쇄는 하나 이상의 옥소기(예를 들어 1 내지 3개, 예컨대, 1개의 기)에 의해서 선택적으로 치환된다.
적합하게는, 링커 모이어티는 세린올-유래된 링커 모이어티이다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함하고, 여기서 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 산소 원자에 의해서 대체된다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 PEG-쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-6 알킬쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C4 또는 C6 알킬쇄, 예를 들어, C4 알킬쇄를 포함한다.
실시형태에서,
Figure pct00032
는 하기 화학식 (V)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00033
여기서 n, Y 및 L1은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
따라서 실시형태에서, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (VI)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00034
여기서 n, Y 및 L1은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure pct00035
는 하기 화학식 (XIV)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00036
여기서 n, Y, R1 및 L은 하기에 정의되어 있고, L은 표적화 리간드, 예를 들어, GalNAc에 연결되고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (IV)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00037
여기서 n, Y, R1 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure pct00038
는 하기 화학식 (VII)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00039
여기서 n, Y 및 L2는 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (VIII)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00040
여기서 n, Y 및 L2는 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure pct00041
는 하기 화학식 (IX)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00042
여기서 F, Y 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (IXa)의 연결 모이어티이다:
Figure pct00043
여기서 F, Y 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, L은
Figure pct00044
이다.
상기 구조 중 임의의 것에서, 적합하게는 리간드는 GalNAc 및 갈락토스 모이어티, 특히 GalNAc 모이어티로부터 선택된다. 대안적으로, GalNac는 또 다른 표적화 리간드, 예를 들어, 당류에 의해서 대체될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 제1 RNA 가닥은 화학식 (X)의 화합물이고:
Figure pct00045
여기서 b는 0 또는 1이고;
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XI)의 화합물이다:
Figure pct00046
식 중,
c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L1은 리간드가 부착된 링커이고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3이다.
적합하게는, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
Figure pct00047
(여기서 b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물이다:
Figure pct00048
(식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이며;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L은 화학식 (XV) 및 (XVI)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고: 그리고
여기서 말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3임).
적합하게는, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XII)의 화합물이고:
Figure pct00049
(여기서 b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XIII)의 화합물이다:
Figure pct00050
(식 중,
c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L2는 화학식 (XII) 및 (XIII)에서 동일하거나 또는 상이하고, b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 동일하거나 또는 상이하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되거나:
Figure pct00051
; 또는
n은 0이고, L2는
Figure pct00052
이고, 말단 OH기는 존재하지 않아서 하기 모이어티를 형성하고:
Figure pct00053
;
여기서
F는 포화된 분지형 또는 비분지형 (예컨대, 비분지형) C1-8알킬(예를 들어, C1-6알킬) 쇄이고, 여기서 탄소 원자 중 하나는 산소 원자로 선택적으로 대체되되, 단 상기 산소 원자는 적어도 2개의 탄소 원자에 의해서 또 다른 헤테로원자(예를 들어, O 또는 N 원자)로부터 분리되고;
L은 화학식 (XII) 및 (XIII)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고
여기서 말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3임).
GalNAc가 존재하는 상기 화학식 중 임의의 하나에서, GalNAc는 임의의 다른 표적화 리간드, 예컨대, 본 명세서에 언급된 것에 대해서 치환될 수 있다.
적합하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 1이고, d는 0이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다.
보다 적합하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다.
가장 적합하게는, b는 0이고, c는 1이며, d는 1이다.
일 실시형태에서, Y는 O이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 S이다.
일 실시형태에서, R1은 H 또는 메틸이다. 일 실시형태에서, R1은 H이다. 또 다른 실시형태에서, R1은 메틸이다.
일 실시형태에서, n은 0, 1, 2 또는 3이다. 적합하게는, n은 0이다.
일 실시형태에서, L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임);
여기서 말단 C(O)는 NH기에 부착된다.
적합하게는, L은 -(CH2)r-C(O)-이고, 여기서 r은 2 내지 12이다. 적합하게는, r은 2 내지 6이다. 보다 적합하게는, r은 4 또는 6, 예를 들어, 4이다.
적합하게는, L은
Figure pct00054
이다.
예시적인 F 모이어티는 (CH2)1-6, 예를 들어, (CH2)1-4 예를 들어, CH2, (CH2)4, (CH2)5 또는 (CH2)6, 또는 CH2O(CH2)2-3, 예를 들어, CH2O(CH2)CH3를 포함한다.
적합하게는, L2는
Figure pct00055
이다.
적합하게는, L2는
Figure pct00056
이다.
적합하게는, L2는
Figure pct00057
이다.
적합하게는, L2는
Figure pct00058
이다.
적합하게는, n은 0이고, L2는
Figure pct00059
이고,
말단 OH기는 존재하지 않아서 하기 모이어티가 형성된다:
Figure pct00060
;
여기서 Y는 본 명세서 다른 곳에 정의된 바와 같다.
b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티 내에서, L2는 전형적으로 동일하다. b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티 사이에서, L2는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 실시형태에서, c에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서의 L2와 동일하다. 실시형태에서, c에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서의 L2와 동일하지 않다. 실시형태에서, b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는, 예를 들어, 링커 모이어티가 세린올-유래된 링커 모이어티인 경우 동일하다.
세린올 유래된 링커 모이어티는 임의의 입체화학에서 세린올에 기초할 수 있고, 즉, L-세린 이성질체, D-세린 이성질체, 라세미체 세린 또는 입체이성질체의 다른 조합물로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 양상에서, 세린올-GalNAc 모이어티(SerGN)는 하기 입체화학을 갖고:
Figure pct00061
즉, L-세린 이성질체로부터 유래된 (S)-세린올-아미다이트 또는 (S)-세린올 석신에이트 고체 지지된 빌딩 블록을 기재로 한다.
일 실시형태에서, 표적화된 세포는 간세포이다.
본 발명은 추가 양상으로서 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산을 제공하며, 이 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 저해될 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고/하거나 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 직접적으로 또는 링커를 통해서 간접적으로 리간드에 접합된다.
핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 리간드에 접합될 수 있다. 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
리간드는 GalNAc일 수 있다.
절단 가능한 연결기는 세포 외부에서 안정적이지만, 표적 세포로 도입된 후 절단되는 링커이다. 절단은 2개의 부분을 방출하고, 링커는 함께 유지된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에서보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건 하에서 적어도 10배 이상, 바람직하게는 적어도 100배이상 더 신속하게 절단되는 절단 가능한 연결기를 포함한다.
절단 가능한 연결기는 절단제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 분해 분자는 산화 또는 환원 효소, 환원제(예컨대, 머캅탄), 에스터라제, 엔도솜 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 작용제, 일반적인 산으로서 작용함으로써 산 절단 가능한 연결기를 가수분해하거나 절단할 수 있는 효소, 펩티다제 및 포스파타제를 포함한다.
절단 가능한 연결기는 pH에 민감한 다이설파이드 결합일 수 있다.
링커는 특정 효소에 의해서 절단 가능한 절단 가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커에 혼입되는 절단 가능한 연결기의 유형은 표적 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 간 세포가 표적인 경우 에스터기를 포함하는 링커가 바람직하다. 펩티다제가 풍부한 세포, 예컨대, 간 세포 및 활막세포를 표적으로 하는 경우 펩타이드 결합을 함유하는 링커가 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보물질 절단 가능한 연결기의 적합성은 후보물질 연결기를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 혈액에서 또는 다른 비-표적 조직과 접촉하는 경우 절단에 저항하는 능력에 대해서 후보물질 절단 가능한 연결기를 시험하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 유용한 후보물질 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)과 비교할 때 세포에서(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 신속하게 절단된다.
일 양상에서, 절단 가능한 연결기는 산화환원 절단 가능한 연결기일 수 있다. 산화환원 절단 가능한 연결기는 다이설파이드 연결기일 수 있다.
일 양상에서, 연결기는 포스페이트계 절단 가능한 연결기일 수 있다. 바람직한 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-이다.
일 양상에서, 절단 가능한 연결기는 산 절단 가능한 연결기일 수 있다. 바람직하게는 산 절단 가능한 연결기는 pH가 6.5 이하인 환경에서 절단되거나 또는 작용제, 예컨대, 일반적인 산으로서 작용할 수 있는 효소에 의해서 절단된다. 산 절단 가능한 연결기의 예는 하이드라존, 에스터 및 아미노산의 에스터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 산 절단 가능한 기는 일반 화학식 -C=NN-; C(O)O 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 바람직한 실시형태는 에스터(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기, 3차 알킬기, 예컨대, 다이메틸 펜틸 또는 t-부틸인 연결기이다.
일 실시형태에서, 절단 가능한 연결기는 에스터계 절단 가능한 연결기일 수 있다. 에스터계 절단 가능한 연결기의 예는 알킬렌, 알켄일렌 및 알킨일렌기의 에스터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 절단 가능한 연결기는 펩타이드계 절단 가능한 연결기일 수 있다. 펩타이드계 절단 가능한 연결기는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이어서 올리고펩타이드(예를 들어, 다이펩타이드, 트라이펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 수득한다. 펩타이드계 절단기는 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합(즉, 아마이드 결합)으로 제한되고, 전체 아마이드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드계 절단 가능한 연결기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R기이다.
단일 가닥의 합성
예시적인 화합물은 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립은 예를 들어, 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행될 수 있다. 고체상 합성은 염기 또는 변형된 빌딩 블록 로딩된 lcaa CPG로부터 출발할 수 있다. 포스포르아미다이트 합성 커플링 사이클은 1) DMT-제거, 2) 벤질티오테트라졸(BTT)일 수 있는 활성화제 및 요구되는 DMT-차폐된 포스포르아미다이트를 사용하는 쇄 연장, 3) 비-연장된 올리고뉴클레오타이드 쇄의 캡핑, 그 다음 아이오딘(포스포다이에스터 링키지가 바람직한 경우) 또는 EDITH(포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 링키지가 바람직한 경우)에 의한 P(III)에서 P(V)로의 산화, 그리고 다시 캡핑(Cap/Ox/Cap 또는 Cap/Thio/Cap)으로 이루어진다. 포스포로다이티오에이트 링키지가 바람직한 경우, 포스포르아미다이트 합성 커플링 사이클은 1) DMT-제거, 2) 요구된 DMT-차폐된 티오포스포르아미다이트를 사용한 쇄 연장, 3) 비-연장된 올리고뉴클레오타이드 쇄의 캡핑, 그 다음 EDITH에 의한 P(III)에서 P(V)로의 산화 및 다시 캡핑(Cap/Thio/Cap)으로 이루어진다. 3가 나무-유사 GalNAc 클러스터의 칼럼 상 접합의 경우, 필요한 3가 분지형 아미다이트 ST41-phos를 사용한 동일한 포스포르아미다이트 합성 사이클이 적용되고, 그 다음 GalNAc 아미다이트 ST23-phos를 사용한 또 다른 라운드의 합성 사이클이 적용되었다. 필요한 빌딩 블록은 입수 가능하거나 하기에 기재된 바와 같이 합성된다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명한다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
ST41의 포스포르아미다이트 유도체(ST41-phos)뿐만 아니라 ST23(ST23-phos)의 합성은 국제 특허 제WO2017/174657호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다:
Figure pct00062
Figure pct00063
이중 가닥의 합성
이중 가닥 접합체를 수득하기 위해서, 필요한 개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시킨다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가할 수 있다. 더 용이한 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행할 수 있다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가한다. 반응 혼합물을 예를 들어, 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시킨다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링할 수 있다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 반응을 예를 들어, 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시킨다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 리포좀의 형태로 지질과 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 리포플렉스로서 당업계에 기재될 수 있다. 지질/리포좀을 갖는 조성물을 사용하여 본 발명의 핵산을 표적 세포로 전달하는 것을 도울 수 있다. 본 명세서에 기재된 지질 전달 시스템은 접합된 리간드에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형은 지질 전달 시스템 또는 리간드 접합체 전달 시스템과 함께 본 발명의 핵산을 사용하는 경우 존재할 수 있다.
이러한 리포플렉스는,
i) 양이온성 지질, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) 페길화된 지질
을 포함하는 지질 조성물을 포함할 수 있다.
양이온성 지질은 아미노 양이온성 지질일 수 있다.
양이온성 지질은 하기 화학식 (XIX) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 가질 수 있다:
Figure pct00064
(XIX)
식 중,
X는 O, S 또는 NH를 나타내고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C4-C22 선형 또는 분지형 알킬 쇄 또는 하나 이상의 이중 결합을 갖는 C4-C22 선형 또는 분지형 알켄일 쇄를 나타내고, 여기서 알킬 또는 알켄일쇄는 선택적으로 개재된 에스터, 아마이드 또는 다이설파이드를 함유하고;
X가 S 또는 NH를 나타내는 경우, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나, 또는 R3과 R4는 함께 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
X가 O를 나타내는 경우, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나 또는 R3과 R4는 함께 헤테로사이클릴 고리를 형성하거나, 또는 R3은 수소를 나타내고, R4는 C(NH)(NH2)를 나타낸다.
양이온성 지질은 하기 화학식 (XIXA)을 갖거나 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
Figure pct00065
.
양이온성 지질은 하기 화학식 (XIXB)을 갖거나 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
Figure pct00066
.
양이온성 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 55㏖% 내지 약 65㏖%일 수 있다. 특히, 양이온성 지질 성분은 조성물의 전체 지질 함량의 약 59㏖%이다.
조성물은 스테로이드를 추가로 포함할 수 있다. 스테로이드는 콜레스테롤일 수 있다. 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 26㏖% 내지 약 35㏖%일 수 있다. 보다 특별하게는, 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 30㏖%일 수 있다.
포스파티딜에탄올아민 인지질은 1,2-다이파이탄오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLoPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1,2-다이에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE), 1,2-다이스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSQPE) 및 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(SLPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 인지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 10㏖%일 수 있다.
페길화된 지질은 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG) 및 C16-세라마이드-PEG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 페길화된 지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 1 내지 5㏖%일 수 있다.
조성물 중의 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 55㏖% 내지 약 65㏖%, 바람직하게는 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 59㏖%일 수 있다.
조성물은 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; 및 65:24:10:1로부터 선택된 i):ii):iii):iv)의 성분의 몰비를 가질 수 있다.
조성물은 하기 구조를 갖는 양이온성 지질
Figure pct00067
하기 구조를 갖는 스테로이드
Figure pct00068
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질
Figure pct00069
및 하기 구조를 갖는 페길화된 지질
Figure pct00070
을 포함할 수 있다.
중성 리포좀 조성물은 예를 들어, 다이미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 다이팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 다이미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성될 수 있는 반면, 음이온성 융합성 리포좀은 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 주로 형성될 수 있다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린(PC), 예를 들어, 대두 PC, 난 PC로부터 형성될 수 있다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질, N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 사용하여 핵산과 자발적으로 상호작용하는 작은 리포좀을 형성하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성할 수 있다. DOTMA 유사체를 또한 사용하여 리포좀을 형성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 지질의 유도체 및 유사체를 또한 사용하여 리포좀을 형성할 수 있다.
핵산을 함유하는 리포좀은 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 일례에서, 리포좀의 지질 성분을 세제 중에 용해시켜 마이셀(micelle)이 지질 성분과 함께 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 높은 임계 마이셀 농도를 가질 수 있고, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사코신을 포함한다. 이어서 헥산 제제를 지질 성분을 포함하는 마이셀에 첨가한다. 지질 상의 양이온성 기가 핵산과 상호작용하고, 핵산 주변에서 축합하여 리포좀을 형성한다. 축합 후, 예를 들어, 투석에 의해서 세제를 제거하여 핵산의 리포좀 제제를 수득한다.
필요한 경우 축합을 돕는 담체 화합물이 예를 들어, 제어된 첨가에 의해서 축합 반응 동안 첨가될 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체(예를 들어, 스퍼민 또는 스퍼미딘)일 수 있다. pH를 또한 축합이 선호되도록 조정할 수 있다.
핵산 제형은 계면활성제를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 핵산은 계면활성제를 포함하는 에멀션으로서 제형화된다.
이온화되지 않는 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 예는 비이온성 에스터, 예컨대, 에틸렌 글리콜 에스터, 프로필렌 글리콜 에스터, 글리세릴 에스터 등, 비이온성 알칸올아마이드 및 에터, 예컨대, 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올 및 에톡실화된/프로폭실화된 블록 중합체를 포함한다.
물 중에 용해되거나 분산될 때 음전하를 보유하는 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 예는 카복실레이트, 예컨대, 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아마이드, 황산의 에스터, 예컨대, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트, 예컨대, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 아이소티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트를 포함한다.
물 중에 용해되거나 분산될 때 양전하를 보유하는 계면활성제는 양이온성 계면활성제이다. 예는 4차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다.
양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 갖는 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 예는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아마이드, N-알킬베타인 및 포스파타이드를 포함한다.
"마이셀"은 양친매성 분자가 구형 분자로 배열되어 분자의 모든 소수성 부분이 내부로 향하고, 친수성 부분이 주변 수성 상과 접촉하는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 본 명세서에 정의되어 있다. 환경이 소수성인 경우 컨버스 배열이 존재한다. 마이셀은 핵산의 수성 용액, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 적어도 1종의 마이셀 형성 화합물을 혼합함으로써 형성될 수 있다.
예시적인 마이셀 형성 화합물은 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약제학적으로 허용 가능한 염, 글리콜산, 락트산, 캐모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트라이하이드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 라이신, 폴리라이신, 트라이올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이의 유사체, 폴리도칸올 알킬 에터 및 이의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트 및 이들의 혼합물을 포함한다.
페놀 및/또는 m-크레졸을 혼합된 마이셀 조성물에 혼합하여 안정화제 또는 보존제로서 제공할 수 있다. 등장제, 예컨대, 글리세린이 첨가될 수 있다.
핵산 제제를 입자, 예컨대, 미세입자에 혼입할 수 있다. 미세입자는 분무 건조, 동결건조, 증발, 유체층 건조, 진공 건조 또는 이들 방법의 조합에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 의약으로서 또는 진단제로서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 전달 비히클(예를 들어, 리포좀) 및/또는 부형제, 예컨대, 담체, 희석제와 조합될 수 있다. 다른 작용제, 예컨대, 보존제 및 안정화제가 또한 첨가될 수 있다. 핵산 또는 접합된 핵산의 전달 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자의 지식 범위 내이다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 별개로 또는 동시에, 예를 들어, 조합 단위 용량으로서 투여되는, 다른 치료 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 생리학적으로/약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등 중에 본 발명에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태로의 투여를 위해서 특별하게 제형화될 수 있다. 조성물은 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사 포함), 국소 도포, 질내 또는 직장내 투여, 설하 투여, 안내 투여, 경피 투여 또는 비강 투여를 위해서 제형화될 수 있다. 피하 또는 정맥내 방법을 사용한 전달이 바람직하다.
본 발명의 의약 및 약제학적 조성물에 대한 투여량 수준은 일상적인 실험에 의해서 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 단위 용량은 약 0.01㎎/㎏ 및 약 100㎎/㎏ 체중의 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 용량은 10㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏ 체중, 또는 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏ 체중, 또는 0.05㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 1㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 0.5㎎/㎏ 체중, 또는 0.5㎎/㎏ 내지 1㎎/㎏ 체중일 수 있다. 투여량 범위는 또한 다른 파라미터, 예를 들어, 체표면적 등을 통해서 계산될 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 현탁액 또는 용액 또는 동결건조 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 리포플렉스(lipoplexe) 또는 리포플렉스의 수성 현탁액을 포함할 수 있다. 리포플렉스는 바람직하게는 본 발명의 핵산을 포함한다. 이러한 리포플렉스는 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 핵산을 표적 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 의약은 포유동물 대상체에게 약제학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트, 햄스터, 고슴도치 및 기니피그로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 생리학적으로/약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등 중에 본 발명에 따른 하나 이상의 RNAi 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 현탁액 또는 용액, 또는 동결건조된 형태일 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 조성물은 본 발명에 따른 임의의 실시형태에서, 단독으로 취해지거나 또는 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 제형화되는 치료적 유효량의 1종 이상의 핵산(들)을 포함할 수 있다.
약제학적으로-허용 가능한 담체로서 제공될 수 있는 물질의 예는 (1) 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탤크; (8) 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대, 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원 수; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대, 폴리펩타이드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대, 혈청 알부민, HDL 및 LDL; 및 (22) 약제학적 제형에서 사용되는 다른 비독성의 상용성 물질을 포함한다.
안정화제는 핵산 작용제를 안정화시키는 작용제, 예를 들어, 핵산, 킬레이터(예를 들어, EDTA), 염, RNAse 저해제 및 DNAse 저해제와 복합체를 이룰 수 있는 단백질일 수 있다.
일부 경우에 약물의 효과를 연장시키기 위해서 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 둔화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 불량한 수 용해도를 갖는 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해서 달성될 수 있다. 이어서 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 좌우되며, 이것은 결국 결정 크기 및 결정질 형태에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비히클 중에 약물을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.
본 명세서에 기재된 핵산은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산은 세포에서 표적 유전자의 발현을 부분적으로 저해할 수 있다. 저해는 완전할 수 있고, 즉, 본 발명의 핵산의 부재 하에서의 표적 유전자 발현의 발현 수준의 0%일 수 있다. 표적 유전자 발현의 저해는 부분적일 수 있고, 즉, 그것은 본 발명의 핵산의 부재 하에서의 표적 핵산 발현의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%일 수 있다. 저해는 대상체, 예컨대, 인간 대상체에서 사용되는 경우 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 최대 3개월 지속될 수 있다. 핵산 또는 핵산 조성물을 포함하는 조성물은 매주마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다 또는 8주마다 1회 사용을 위한 것일 수 있다. 핵산은 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로의 사용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 핵산으로 치료되거나 이를 제공받는 세포 및/또는 대상체에서, 표적 유전자 발현은 미치료 세포 및/또는 대상체와 비교할 때 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%만큼 저해될 수 있다. 저해 수준은 표적 유전자 발현 또는 과발현과 연관된 질환의 치료를 허용할 수 있거나, 또는 표적 유전자 생성물의 기능의 추가 조사를 허용할 수 있다.
표적 유전자는 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erkl/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JU 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 헵시딘, 활성화 단백질 C, 사이클린 D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포아이소머라제 I 유전자, 토포아이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자에서의 돌연변이, p21(WAF1/CIPl) 유전자에서의 돌연변이, p27(KIPl) 유전자에서의 돌연변이, PPM ID 유전자에서의 돌연변이, RAS 유전자에서의 돌연변이, 카베올린 I 유전자에서의 돌연변이, MIB I 유전자에서의 돌연변이, MTAI 유전자에서의 돌연변이, M68 유전자에서의 돌연변이, 종양 억제인자 유전자에서의 돌연변이 및 p53 종양 억제인자 유전자에서의 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산에 관한 것이다.
또한 본 발명에는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법이 포함되며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 조성물은 매주 2회 또는 매주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8주마다 투여될 수 있다. 핵산은 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 핵산 작용제의 초기 용량 및 1회 이상의 유지 용량이 투여된다. 유지 용량 또는 용량들은 초기 용량과 동일하거나 초기 용량보다 낮을 수 있고, 예를 들어, 초기 용량의 절반보다 적을 수 있다. 유지 용량은 예를 들어, 2, 5, 10 또는 30일마다 1회 이하로 투여된다. 치료 요법은 특정 질환의 본성, 이의 중증도 및 환자의 전체 상태에 따라서 달라지는 시간 간격 동안 지속될 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 복수의 핵산 작용제 종을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 작용제 종은 자연 발생 표적 서열과 관련하여 또 다른 종과 중첩되지 않고, 인접하지 않은 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 복수의 핵산 작용제 종은 상이한 자연 발생 표적 유전자에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 작용제는 대립유전자 특이적이다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 별개로 또는 동시에, 예를 들어, 조합 단위 용량으로서 투여되는, 다른 치료 화합물과 조합하여 사용하기 위해서 투여될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 화학적 합성 또는 시험관내에서(예를 들어, 전사의 런 오프(run off)) 또는 생체내에서 핵산을 발현시키는 것을 비롯하여, 당업계에서의 일상적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 고체상 화학적 합성을 사용하거나 발현 벡터를 사용한다. 일 실시형태에서, 발현 벡터는 표적 세포에서 본 발명의 핵산을 생성시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다.
예시적인 화합물을 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성하였다. 포스포르아미다이트 기술을 적용한 고체상 합성에 의해서 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 결합 블록의 조립을 수행할 수 있다. 반응식 1은 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 3가 GalNAc 나무-유사 클러스터를 조립하는데 필요한 트레블러(trebler) 아미다이트 C4xlt-phos 및 GalNAc 아미다이트(ST23-phos)를 나타낸다. C4XLT-phos뿐만 아니라 ST23-phos의 합성은 국제 특허 공개 제WO2017/174657호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
Figure pct00071
반응식 1: 3가 나무-유사 GalNAc 클러스터의 칼럼 상 접합을 위해서 사용되는 트레블러 아미다이트 및 GalNAc 아미다이트의 구조
나무-유사 GalNAc-클러스터 접합된 siRNA의 올리고뉴클레오타이드 합성을 도 11에 도시된 반응식 2에 요약한다.
올리고뉴클레오타이드 쇄 조립을 예를 들어, 화합물 A0149(STS12009V15L4B)에서와 같이 염기 로딩된 지지체, 예를 들어, 5'DMT-2'FdU-석시네이트-lcaa-CPG를 사용하여 시작할 수 있다. 제1 포스포다이티오에이트 링키지의 도입의 경우, 포스포르아미다이트 합성 커플링 사이클은 1) DMT-제거, 2) 필요한 DMT-차폐된 티오포스포아미다이트를 사용한 쇄 연장, 3) 비-연장된 올리고뉴클레오타이드 쇄의 캡핑, 그 다음 P(III)에서 P(V) EDITH로의 산화 및 다시 캡핑(Cap/Thio/Cap)으로 이루어진다. 그 후, 생성물의 전장에 도달될 때까지 포스포다이에스터 또는 포스포로티오에이트 링키지가 바람직한지의 여부에 따라서 표준 DMT-포스포아미다이트 및 Cap/Ox/Cap 또는 Cap/Thio/Cap을 사용하여 합성 사이클을 반복할 수 있다. 3가 나무-유사 GalNAc 클러스터의 칼럼 상 접합의 경우, 필요한 3가 분지화 아미다이트 C4XLT를 사용하여 동일한 합성 사이클을 적용하고, 그 다음 GalNAc 아미다이트 ST23을 사용하여 또 다른 라운드의 합성 사이클을 적용할 수 있다. 이러한 마지막 합성기 단계의 완결 시에, 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체로부터 절단하고, (포스포로다이티오에이트 링키지가 존재하는 경우 20mM DTT의 존재 하에서) 메틸아민 처리에 의해서 추가 보호기로부터 자유롭게 할 수 있다. 이어서, NaCl 구배를 적용하는 AEX-HPLC에 의해서 조 생성물을 정제시킬 수 있다. SEC에 의해서 IEX 정제로부터 과량의 염을 제거하여 최종 생성물을 수득하였다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 이의 순도를 증명할 수 있다. 순도는 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하에 UV-면적의 백분율인 FLP%(전장 생성물%)로 제공될 수 있다. 각각의 단일 가닥 생성물(비-변형된 또는 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드)의 아이덴티티를 LC-MS 분석에 의해서 증명할 수 있다.
동일몰량의 각각의 단일 가닥의 첨가 및 80℃까지의 가열에 의해서 이중 가닥 siRNA의 듀플렉스 형성을 달성할 수 있다. RT까지 서서히 냉각시켜 완전 이중 가닥을 형성할 수 있다. 듀플렉스 형성 다음 IP-RP-HPLC(이온 짝지움 역상(ion-pairing reverse-phase) HPLC)를 수행할 수 있다. 이중 가닥 순도를 이중 가닥 %로 제공할 수 있는데, 이것은 IP-RP-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산을 제공하며, 여기서 제1 RNA 가닥은 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드를 갖고, 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 바람직하게는 포스포다이에스터 링키지에 의해서 제1 가닥 내의 제2 뉴클레오타이드에 연결된다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 1개 초과의 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 말단 3개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 말단 4개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 하기 화학식 (XVII)를 포함할 수 있다:
Figure pct00072
식 중, '(vp)-'는 5' (E)-바이닐포스포네이트이고, 'N'은 뉴클레오타이드이고, 'po'는 포스포다이에스터 링키지이고, n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 - 2)이고, 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 -3)이고, 보다 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 -4)이다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트(ps) 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥 내의 다른 뉴클레오타이드 사이의 링키지는 포스포다이에스터 링키지이다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 1개 초과의 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 제2 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
또 다른 추가 실시형태에서, 제2 가닥은 말단 2개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 RNA 뉴클레오타이드이다.
말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드이고, 여기서 5'-단부에서의 자연 포스페이트기는 E-바이닐포스포네이트로 대체되었고, 여기서 5' 포스포릴화된 가닥의 말단 뉴클레오타이드의 브리징 5'-산소 원자는 메틴일(-CH=)기로 대체된다:
Figure pct00073
5'-단부에서 자연 포스페이트를 갖는 뉴클레오타이드
Figure pct00074
5'-단부에서 E-바이닐포스포네이트를 갖는 뉴클레오타이드.
5' (E) 바이닐포스포네이트는 5' 포스페이트 모방체이다. 생물학적 모방체는 모방되는 본래 분자와 동일한 기능을 수행할 수 있거나 구조적으로 매우 유사한 분자이다. 본 발명의 내용에서, 5' (E) 바이닐포스포네이트는 정상 5' 포스페이트의 기능, 예를 들어, 효율적인 RISC 로딩 가능성을 모방한다. 또한, 이의 약간의 변경된 구조로 인해서, 5' (E) 바이닐포스포네이트는 5'-단부 뉴클레오타이드를 효소, 예컨대, 포스파타제에 의한 탈포스포릴화로부터 보호함으로써 그것을 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 일 양상은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산으로서, 이 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 RISC에 의한 핵산의 가공을 용이하게 하기 위해서 복수의 위치에서 변형된 뉴클레오타이드 또는 비변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양상에서 "RISC에 의한 가공을 용이하게 한다"는 핵산이 RISC에 의해서 가공될 수 있고, 예를 들어, 존재하는 임의의 변형이 핵산이 RISC에 의해서 가공되는 것을 허용할 것이어서, 적합하게는 siRNA 활성이 일어날 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산, 여기서 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않는다.
제1 가닥 상의 위치에 "상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 적합하게는 제1 가닥 상의 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 이루는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 13번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 11번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 11번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 12번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 12번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥이고, 평활 단부인 19량체 핵산에서, 제1 가닥의 13번 위치는 제2 가닥의 7번 위치와 쌍을 이룰 것이다. 제1 가닥의 11번 위치는 제2 가닥의 9번 위치와 쌍을 이룰 것이다. 이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 뉴클레오타이드는 적합하게는 제2 가닥의 13번 위치이고, 이것은 제2 가닥의 3'로부터 계수하고, 이중 가닥 영역의 제1 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 마찬가지로 제2 가닥의 11번 위치는 적합하게는 이중 가닥 영역의 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하여, 제2 가닥의 3'로부터 11번째 뉴클레오타이드이다. 이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
일 양상에서, 부분적으로 상보성인 제1 가닥 및 제2 가닥의 경우에, 제1 가닥 상의 위치"에 상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는, 위치가 미스매치가 존재하는 위치인 염기 쌍을 본질적으로 형성할 수 있는 것은 아니지만, 명명법의 원칙은 여전히 적용된다.
듀플렉스 영역(임의의 오버행 영역을 무시함)에 대해서 완전히 상보성이고, 핵산의 이중 가닥 영역 내에 미스매치가 존재하지 않는 제1 가닥 및 제2 가닥이 바람직하다.
또한 하기가 바람직하다:
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 및 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
일 양상에서 제1 가닥의 12번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않는다. 핵산에 대한 제한은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 제한으로 인지될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 및 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이다.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 자연 발생 RNA 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 이러한 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 적합한 자연 발생 변형은 2 O' 메틸뿐만 아니라, 다른 2' 당 변형, 특히 2' H 변형을 포함하여, DNA 뉴클레오타이드를 생성한다.
바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하, 예컨대, 15% 이하, 예컨대, 10% 이하로 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
바람직하게는 두 가닥의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-플루오로 변형을 20% 이하(예컨대, 15% 이하 또는 10% 이하)로 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드를 제외한, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
핵산의 뉴클레오타이드 모두가 당의 2' 위치에서 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이 바람직하다. 바람직하게는 이들 뉴클레오타이드는 변형이 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-플루오로 변형으로 변형된다.
본 발명의 핵산은 2' 위치에서 2' H로 변형된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 따라서, 핵산 내에 DNA 뉴클레오타이드를 갖는다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 계수하여 제1 가닥의 2번 위치 및/또는 14번 위치에서 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일 양상에서 본 발명의 핵산당 하나 이하의 DNA가 존재한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 계수하여 제1 가닥의 2번 위치 및/또는 14번 위치에서 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 LNA를 포함할 수 있다.
일 양상에서 핵산은 교번하는 2-O 메틸 변형 및 2 플루오로 변형으로 제1 가닥 상에서 변형되고, 2번 및 14번 위치(5' 단부로부터 시작)는 2'-플루오로로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드에서 2'-플루오로 변형으로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 상보성(이중 가닥) 영역의 제1 위치에서 시작하여 3' 단부로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치에서 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 나머지 변형은 자연 발생 변형, 바람직하게는 2'-O-메틸이다.
일 양상에서 본 발명의 핵산은 5'-5' 링키지 또는 3'-3' 링키지, 바람직하게는 제2 가닥의 3' 단부에서 3'-3' 링키지를 사용하여, 하나 이상의 역전된 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 역전된 아데닌을 포함한다.
일 양상에서 핵산은 하나 이상의 포스포로다이티오에이트 링키지, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함한다. 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서 각각 하나씩 최대 4개의 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재한다.
핵산의 특징 모두는 본 명세서에 개시된 본 발명의 다른 양상 모두와 조합될 수 있다.
특히, 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 핵산은 하기 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 siRNA 분자인 핵산이 바람직하다:
(i) 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 뉴클레오타이드, 바람직하게는 3'-3' 링키지;
(ii) 하나 이상의 포스포로다이티오에이트 링키지;
(iii) 제1 가닥 중 11번 또는 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않음(바람직하게는 여기서 이들 위치 중 하나 또는 둘 다는 2'-플루오로 변형을 포함함);
(iv) 핵산은 2'-O-메틸 변형을 갖는 모든 뉴클레오타이드 중 적어도 80%를 포함함;
(v) 핵산은 2'-플루오로 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하 포함함.
또한 본 발명에는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이 제공되며, 여기서 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번, 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 나머지 뉴클레오타이드 중 적어도 90%는 2'-O 메틸 변형되고, 또 다른 자연 발생 2'-변형을 포함한다.
오버행을 갖지 않는, 평활 이중 가닥의 19 염기 핵산에 대한 구체적인 바람직한 예는 다음과 같다:
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번, 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 자연 발생 RNA 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 이러한 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 적합한 자연 발생 변형은 2 O' 메틸뿐만 아니라, 다른 2' 당 변형, 특히 2' H 변형을 포함하여, DNA 뉴클레오타이드를 생성한다.
바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하, 예컨대, 15% 이하, 예컨대, 10% 이하로 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
바람직하게는 두 가닥의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-플루오로 변형을 20% 이하(예컨대, 15% 이하 또는 10% 이하)로 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 위치를 제외하고, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않는 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 내지 9번 위치를 제외하고, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않는 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
20개의 염기 쌍 듀플렉스 영역을 포함하는 핵산의 경우, 제2 가닥은 바람직하게는 각각 제1 가닥의 13번, 12번 및 11번 위치에 상응하는 듀플렉스의 5' 단부로부터 계수하여 뉴클레오타이드 8 또는 9 또는 10에서 2'-O-메틸기를 갖지 않는다.
21개의 염기 쌍 듀플렉스 영역을 포함하는 핵산의 경우, 제2 가닥은 바람직하게는 각각 제1 가닥의 13번, 12번 및 11번 위치에 상응하는 듀플렉스의 5' 단부로부터 계수하여 뉴클레오타이드 9 또는 10 또는 11에서 2'-O-메틸기를 갖지 않는다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 모든 변형된 서열의 비변형된 서열에 관한 것이다.
본 발명을 이제 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참고로 기재할 것이다.
도 1은 말단 위치에 2개의 포스포로티오에이트(PS), 하나의 PS, 2개의 포스포로다이티오에이트(PS2) 및 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성의 결과를 도시한 도면;
도 2는 GalNAc 모이어티 내에 PS를 갖지 않으면서 말단 위치에 2개의 PS, 하나의 PS, 2개의 PS2 및 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성의 결과를 도시한 도면;
도 3은 개별 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정의 결과를 도시한 도면;
도 4는 개별 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 활성도를 도시한 도면;
도 5는 링커 모이어티 내에 PS를 갖지 않으면서 제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각의 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정의 결과를 도시한 도면;
도 6은 GalNAc 모이어티 내에 PS를 갖지 않으면서 제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 활성도를 도시한 도면;
도 7은 내부 PS 없이 GalNAc 모이어티와 함께, 상이한 siRNA 말단에 PS2를 함유하는 siRNA 접합체 서열을 도시한 도면;
도 8은 내부 PS 없이 GalNAc 모이어티와 함께, 상이한 siRNA 말단에 PS2를 갖는 GalNAc siRNA 접합체의 혈청 안정성을 도시한 도면;
도 9는 내부 PS 없이 GalNAc 모이어티와 함께, 상이한 siRNA 말단에 PS2를 갖는 GalNAc siRNA 접합체의 시험관내 활성도를 도시한 도면;
도 10은 포스포로다이티오에이트 링키지를 함유하는 나무-유사 3가 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드의 합성 흐름도를 도시한 도면;
도 11은 포스포로다이티오에이트 링키지를 함유하는 다른 나무-유사 3가 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드의 합성 흐름도를 도시한 도면;
도 12는 상이한 siRNA 말단에 PS2를 갖는 GalNAc siRNA 접합체의 생체내 mRNA 감소 활성도를 도시한 도면;
도 13은 상이한 siRNA 말단에 PS2를 갖는 GalNAc siRNA 접합체의 생체내 혈청 철분 감소 활성도를 도시한 도면;
도 14는 내부 PS가 있거나 없이 GalNAc 모이어티와 함께, 상이한 siRNA 말단에 PS2 및 PS를 갖는 GalNAc siRNA 접합체의 시험관내 활성도를 도시한 도면;
도 15는 제2 가닥의 5' 및 3' 단부에 적어도 하나의 세린올-연결된 GalNAc 및 말단 포스포로다이티오에이트를 갖는 siRNA 접합체의 활성도를 도시한 도면;
도 16은 링커를 통해서 리간드와 접합된 핵산의 다양한 실시형태의 개략적인 표현을 나타낸 도면.
실시예
실시예 1
일반적인 절차
siRNA 변형: 포스포로티오에이트(PS) 또는 포스포로다이티오에이트 링키지(PS2)를 사용한 siRNA의 합성.
실시예 화합물을 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립을 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행하였다.
올리고뉴클레오타이드 합성, 탈보호 및 정제는 당업계에 공지된 표준 절차에 따랐다.
모든 올리고뉴클레오타이드를 AKTA 올리고파일로트 합성기 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체 및 2'O-메틸 RNA 포스포르아미다이트, 2'플루오로, 2'데옥시 RNA 포스포르아미다이트(모두 표준 보호, 켐젠스사(ChemGenes), 링크테크사(LinkTech))를 제조사 제안 절차에 따라서 사용하였다.
ST41의 포스포르아미다이트 유도체(ST41-phos)뿐만 아니라 ST23 (ST23-phos)의 합성을 국제 특허 공개 제WO2017/174657호에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다:
Figure pct00075
.
보조 시약을 이엠피 바이오테크사로부터 구매하였다. 무수 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토나이트릴 중의 0.3M)로서 사용하였다. 커플링 시간은 15분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/Thio/Cap 사이클을 적용하였다(Cap: Ac2O/NMI/루티딘/아세토나이트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중의 0.1M I2). 아세토나이트릴 중의 50　mM EDITH를 사용하여 포스포로티오에이트 및 포스포로다이티오에이트를 도입하였다. 모든 다른 시약 및 용매는 상업적으로 입수 가능하였고, 표준 시약 품질로 사용하였다.
톨루엔 중의 3% 다이클로로아세트산으로의 처리에 의해서 DMT 절단을 달성하였다. 프로그래밍된 합성 사이클의 완결 시에, 다이에틸아민(DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드를 DMT-오프 모드로 합성하였다.
단일 가닥을 40% 수성 메틸아민 처리에 의해서 CPG를 절단하였다. 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사)에 의해서 정제시켰다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사(EMP Biotech)) 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
올리고뉴클레오타이드의 합성
모든 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 상기 및 도 10에 기재된 반응 조건에 따라서 합성하였다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명하였다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물(비-변형된, 아미노-변형된 전구체 또는 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드)의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
Figure pct00076
이중 가닥 형성
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시켰다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가하였다. 더 용이한 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행하였다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시켰다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링하였다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시켰다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복하였다.
Figure pct00077
실시예 2
말단 위치에 2개의 PS(STS12009L4), 하나의 PS(STS12009V21L4), 2개의 PS2(STS12009V16L4) 및 하나의 PS2(STS12009V15L4)를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시키고, 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화시킨다. 각각 포스포로티오에이트 및 포스포로다이티오에이트를 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에 위치시켰다. 5μM의 GalNAc-siRNA 접합체를 37℃에서 3일 동안 50% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분석하고, 결과를 도 1에 도시한다. "UT"는 미처리 샘플을 나타내고, "FBS"는 FBS 처리를 나타낸다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 나타낸다.
서열을 표 3에 제시한다.
Figure pct00078
실시예 3
말단 위치에 2개의 PS(STS12009L4, STS12009V20L50), 하나의 PS(STS12009V19L50), 2개의 PS2(STS12009V18L50) 및 하나의 PS2(STS12009V17L50)를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정. 변이체 -V20, -V19, -V18 및 -V17에서, GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 임의의 PS를 함유하지 않는다. 포스포로티오에이트 및 포스포로다이티오에이트 각각을 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부, 제2 가닥의 5'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에 위치시켰다. STS12009L4는 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유하는 반면, GalNAc는 제2 가닥 5'-단부에 부착시키고, 4개의 내부 PS에 의해서 안정화된다. 5μM의 GalNAc-siRNA 접합체를 37℃에서 3일 동안 50% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분석하였다. 결과를 도 2에 도시한다. "UT"는 미처리 샘플을 나타내고, "FBS"는 FBS 처리를 나타낸다.
서열을 표 4에 제시한다.
Figure pct00079
실시예 4
개별 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시키고, 이것은 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화된다. 포스포로다이티오에이트 변형을 제1 가닥의 5'-단부(STS12009V37L4), 제1 가닥의 3'-단부(STS12009V36L4) 및 제2 가닥의 3'-단부(STS12009V34L4)에 위치시켰다. 다른 모든 비접합된 단부를 각각 2개의 말단 PS에 의해서 안정화시켰다. STS12009L4는 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에서 2개의 말단 PS를 함유한다. 5μM의 GalNAc-siRNA 접합체를 37℃에서 3일 동안 50% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분석하였다. 결과를 도 3에 도시한다. "UT"는 미처리 샘플을 나타내고, "FBS"는 FBS 처리를 나타낸다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 나타낸다.
서열을 표 5에 제시한다.
Figure pct00080
실시예 5
개별 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 활성도. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화된다. 포스포로다이티오에이트 변형을 제1 가닥의 5'-단부(STS12009V37L4), 제1 가닥의 3'-단부(STS12009V36L4) 및 제2 가닥의 3'-단부(STS12009V34L4)에 위치시켰다. 다른 모든 비접합된 단부를 각각의 2개의 말단 PS에 의해서 안정화시켰다. STS12009L4는 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유한다. 실험을 마우스 1차 간세포에서 수행하였다. 세포를 6-웰당 250,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 100nM, 10nM 및 1nM GalNAc-siRNA로 처리하였다. 10nM GalNAc-siRNA 및 1㎍/㎖ Atufect로의 형질주입을 대조군으로서 제공하였다. 세포를 24시간 후에 용해시켰고, 전체 RNA를 추출하고, Tmprss6 및 Pten mRNA 수준을 Taqman qRT-PCR에 의해서 결정하였다. 결과를 도 4에 도시한다. 각각의 막대는 3개의 기술적인 반복물의 평균 ± SD를 나타낸다. 서열을 표 5에 제시한다.
실시예 6
제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체(STS12009V40L50)의 혈청 안정성 검정. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 임의의 내부 PS에 의해서 안정화되지 않는다. STS12009L4는 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥 단부의 3'-단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유하고, GalNAc는 제2 가닥 5'-단부에 부착되고, 4개의 내부 PS에 의해서 안정화된다. 5μM의 GalNAc-siRNA 접합체를 37℃에서 3일 동안 50% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분석하였다. 결과를 도 5에 도시한다. "UT"는 미처리 샘플을 나타내고, "FBS"는 FBS 처리를 나타낸다.
서열을 표 6에 나타낸다.
Figure pct00081
실시예 7
제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체(STS12009V40L50)의 활성도. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 임의의 내부 PS에 의해서 안정화되지 않는다. STS12009L4는 제1 가닥의 5'-단부, 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유한다. 여기서, GalNAc는 제2 가닥의 5'-단부에 부착되고, 이것은 4개의 내부 PS에 의해서 안정화된다. 마우스 1차 간세포에서 실험을 수행하였다. 세포를 6-웰당 250,000개 세포의 밀도로 시딩하였고, 100nM, 10nM 및 1nM GalNAc-siRNA로 처리하였다. 루스퍼라제에 대한 siRNA의 GalNAc 접합체("GalNAc-Luc")를 대조군으로서 제공하였다. 세포를 24시간 후에 용해시켰고, 전체 RNA를 추출하고, Tmprss6 및 Pten mRNA 수준을 Taqman qRT-PCR에 의해서 결정하였다. 결과를 도 6에 도시한다. 각각의 막대는 3개의 기술적인 반복물의 평균 ± SD를 나타낸다. 서열을 표 6에 제시한다.
실시예 8
말단 위치 및 GalNAc 모이어티에서 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 및 포스포다이에스터를 갖는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정. GalNAc를 센스 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화되거나(STS12009L4), 안정화되지 않고, 대신에 포스포다이에스터 링키지가 사용되었다(STS12009V54L50 - V57L50). 제1 가닥 5'-단부를 제외한 듀플렉스의 모든 말단 위치에(-V54L50), 3'-단부 단독에(-V55L50, -V57L50) 또는 제2 가닥의 3'-단부 단독에(-V56L50) 포스포로다이티오에이트 변형을 위치시켰다. 특정 설계에서, 포스포다이에스터를 siRNA 듀플렉스의 말단 위치에 사용하였다(-V56L50, -V57L50).
5μM의 GalNAc-siRNA 접합체를 37℃에서 3일 동안 50% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분석하였다. "UT"는 미처리 샘플을 나타내고, "FBS"는 FBS 처리를 나타낸다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 나타낸다.
서열을 도 7 및 도 8의 결과에 나타낸다.
실시예 9
상이한 단부 안정화 화학(포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포다이에스터)을 함유하는 Tmprss6을 표적화하는 siRNA의 GalNAc 접합체를 1차 마우스 간세포에서 수용체-매개된 흡수에 의해서 시험하였다. GalNAc를 제2 가닥의 5'-단부에 접합시켰고, 이것은 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화되거나(STS12009L4), 안정화되지 않으며, 포스포다이에스터 링키지가 대신에 사용된다(STS12009V54L50 - V57L50). 제1 가닥 5'-단부를 제외하고 듀플렉스의 모든 말단 위치에(-V54L50), 3'-단부 단독에(-V55L50, -V57L50) 또는 제2 가닥의 3'-단부 단부에(-V56L50) 포스포로다이티오에이트 변형을 위치시켰다. 특정 설계에서, 포스포다이에스터를 siRNA 듀플렉스의 말단 위치에서 사용하였다(-V56L50, -V57L50).
마우스 1차 간세포에서 실험을 수행하였다. 세포를 96-웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였고, 125nM 내지 0.2nM의 GalNAc-siRNA로 처리하였다. 세포를 24시간 후에 용해시켰고, 전체 RNA를 추출하고, Tmprss6 및 Pten mRNA 수준을 Taqman qRT-PCR에 의해서 결정하였다. 각각의 막대는 3개의 기술적인 반복물의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열을 도 7 및 도 9에 결과를 제시한다.
실시예 10
TMPRSS6을 표적화하고, 하나 이상의 말단에 포스포로다이티오에이트 링키지를 함유하는 GalNAc 접합체는 생체내에서 혈청 철분 및 TMPRSS6 mRNA 수준을 효과적으로 감소시킨다.
STS12009L4 및 STS12009V34L4는 4개의 포스포로티오에이트 링키지에 의해서 내부적으로 안정화된 GalNAc 모이어티를 함유한다. STS12009V54L50은 내부 포스포로티오에이트 없이 GalNAc 모이어티를 함유한다. STS12009L4에서 모든 비-접합된 말단은 각각 2개의 포스포로티오에이트에 의해서 안정화된다. STS12009V34L4에서, 하나의 포스포로다이티오에이트 링키지가 제2 가닥의 3' 단부에 존재하는 반면, 모든 다른 비-접합된 단부는 각각 2개의 포스포로티오에이트에 의해서 안정화된다. STS12009V54L50에서, 각각 하나의 포스포로다이티오에이트가 제1 가닥의 3' 단부, 제2 가닥의 5' 단부 및 제2 가닥의 3' 단부에 존재한다. 제1 가닥의 5' 단부는 2개의 포스포로티오에이트에 의해서 안정화된다. 이러한 siRNA 접합체는 TMPRSS6 mRNA 수준 및 혈청 철분 수준의 용량 의존적 감소를 나타낸다. 포스포로다이티오에이트-함유 접합체 STS12009V34L4 및 STS12009V54L50은 포스포로다이티오에이트를 함유하지 않는 참조군만큼 활성이다. 따라서, 활성도를 손상시키지 않으면서 포스포로티오에이트의 수는 10개(STS12009L4)에서 8개(STS12009V34L4)로, 추가로 2개(STS12009V54L50)로 감소될 수 있다. STS12009V57L50은 제1 가닥의 3' 단부에 그리고 제2 가닥의 3' 단부에 각각 하나의 포스포로다이티오에이트 링키지를 함유한다. 두 가닥의 5' 단부는 포스포다이에스터를 함유하고, 링커 모이어티는 내부 포스포다이에스터를 함유하지 않는다. 이러한 siRNA 접합체의 생체내 활성도는 상당히 감소된다.
C57BL/6 수컷 마우스(n = 6)를 3㎎/㎏, 1㎎/㎏ 및 0.3㎎/㎏의 GalNAc 접합체로 피하로 처리하였다. 처리 7일 후에 간 절편을 준비하였고, 전체 RNA를 조직으로부터 추출하고, TaqMan qRT-PCR에 의해서 TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 결정하였다. 또한, 혈청 철분 수준을 분석하였다.
서열을 하기 표 7 및 도 12 및 도 13에 결과를 나타낸다.
실시예 11
말단 포스포로다이티오에이트를 갖는 GalNAc 접합체는 시험관내에서 활성이다.
TMPRSS6을 표적화하고, 상이한 단부 안정화 화학(포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포다이에스터)을 함유하는 siRNA의 GalNAc 접합체를 1차 마우스 간세포에서 수용체-매개된 흡수에 의해서 시험하였다. 삼안테나형 GalNAc 모이어티를 제2 가닥의 5' 단부에 접합시켰고, 이것은 X0027, X0346, X0347에서 4개의 PS에 의해서 내부적으로 안정화된다. 이 경우에, 제2 가닥의 5' 단부에 포스포로티오에이트가 존재하지 않는다. X0214 및 X0345에서, GalNAc 모이어티는 포스포로티오에이트를 함유하지 않고, 제2 가닥의 5' 단부에 포스포로다이티오에이트가 존재한다. X0214, X0345, X0346 및 X0347에서, 포스포로다이티오에이트 변형이 제1 가닥 및 제2 가닥의 3' 단부에 존재한다. 제1 가닥 5' 단부는 2개의 포스포로티오에이트(X0214, X0346)에 의해서 안정화되거나 또는 포스포다이에스터 링키지(X0345, X0347)를 함유한다. 모든 기재된 접합체는 시험관내에서 표적 mRNA 수준을 감소시킨다. X0214 및 X0346은 X0345 및 X0347에 비해서 감소된 활성도를 나타낸다. 이는, 제1 가닥의 5' 단부에서의 포스포로티오에이트가 시험관내에서 siRNA 활성도에 부정적으로 영향을 미친다는 것을 시사한다.
마우스 1차 간세포에서 실험을 수행하였다. 세포를 96-웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였고, 0.1nM, 1nM, 10nM 및 100nM의 GalNAc-siRNA로 처리하였다. 세포를 24시간 후에 용해시켰고, 전체 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 Taqman qRT-PCR에 의해서 결정하였다. 각각의 막대는 3개의 기술적인 반복물의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열을 하기 표 7 및 도 14의 데이터에 제시한다.
실시예 12
제2 가닥의 5' 및 3' 단부에 각각 하나의 세린올-연결된 GalNAc를 갖고, 말단 포스포로다이티오에이트를 갖는 siRNA 접합체는 시험관내에서 활성이다.
TMPRSS6을 표적으로 하는 GalNAc-접합된 siRNA를 1차 마우스 간세포에서 수용체-매개된 흡수에 의해서 시험하였다. X0454 및 X0456 둘 다에서, 각각 하나의 세린올-연결된 GalNAc 모이어티를 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에 접합시켰다. 두 접합체 모두는 제1 가닥의 5' 단부에 (E)-바이닐포스포네이트를 함유한다. 제1 가닥의 5' 단부에는 포스포로티오에이트가 존재하지 않는다. X0454에서, 제1 가닥의 3' 단부 및 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에 각각 2개의 포스포로티오에이트가 존재한다. 각각의 GalNAc 모이어티는 하나의 포스포로티오에이트를 함유한다. X0456에서, 제1 가닥의 3' 단부에 그리고 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에 마지막 2개의 뉴클레오타이드 사이에 각각 하나의 포스포로다이티오에이트가 존재한다. X0456에 규정되지 않은 입체 중심이 존재하지 않는다. 루시퍼라제를 표적화하는 GalNAc-접합된 siRNA를 125nM에서 비-표적화 대조군으로서 사용하였고, 이것은 표적 mRNA 수준을 감소시키지 않는다. TMPRSS6을 표적화하는 접합체 모두는 시험관내에서 표적 mRNA 수준을 감소시킨다. 포스포로다이티오에이트는 제2 가닥의 양 단부에 단일 GalNac 모이어티를 갖는 siRNA의 단부 안정화를 위해서 적용될 수 있다.
마우스 1차 간세포에서 실험을 수행하였다. 세포를 96-웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였고, 0.2nM, 1nM, 5nM, 25nM 및 125nM의 GalNAc-siRNA로 처리하였다. 세포를 24시간 후에 용해시켰고, 전체 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 Taqman qRT-PCR에 의해서 결정하였다. 각각의 막대는 3개의 기술적인 반복물의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열을 하기 표 7 및 도 15의 데이터에 제시한다.
본 발명의 진술
1. 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
2. 진술 1에 있어서, 제1 가닥은 5' 단부에 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 중 임의의 것 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하지 않는, 핵산.
3. 진술 1 또는 2에 있어서, 제1 가닥의 3' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
4. 진술 1 내지 3에 따라서, 제2 가닥의 3' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하거나 또는 제2 가닥의 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 또한 단부에 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재하지 않을 경우 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 제2 가닥의 3개의 3' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 3개의 5' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥은 별개의 가닥인, 핵산.
8. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함하는, 핵산.
9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥은 각각 17 내지 35개 뉴클레오타이드 길이인, 핵산.
10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 17 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍으로 이루어지는, 핵산.
11. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서,
a) 양 단부 다에서 평활 단부이거나; 또는
b) 하나의 단부에서는 오버행을 갖고, 나머지에서는 평활 단부를 갖거나; 또는
c) 양 단부 다에서 오버행을 갖는, 핵산.
12. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성하는, 핵산.
13. 진술 12에 있어서, 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된, 핵산.
14. 진술 13에 있어서, 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형되고, 적어도 제2 변형은 진술 13의 변형과 상이한, 핵산.
15. 진술 14에 있어서, 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접하는, 핵산.
16. 진술 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 변형된, 핵산.
17. 진술 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형된, 핵산.
18. 진술 12 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
19. 진술 13 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 진술 13의 변형과 상이한 제2 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
20. 진술 13 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 진술 13의 변형과는 상이한 변형에 의해서 변형된, 핵산.
21. 진술 13 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 진술 13의 변형에 의해서 변형된, 핵산.
22. 진술 20 또는 21에 있어서, 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접하는, 핵산.
23. 진술 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형된, 핵산.
24. 진술 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 진술 13에 따른 변형에 의해서 변형된, 핵산.
25. 진술 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형되고, 제2 변형은 진술 13의 변형과 상이한, 핵산.
26. 진술 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
27. 진술 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥은 진술 13의 변형과 상이한 제2 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
28. 진술 12 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형에 의해서 변형된, 핵산.
29. 진술 13 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥에서 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제2 가닥에서 변형된, 핵산.
30. 진술 20 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된, 핵산.
31. 진술 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 서열번호 1의 서열을 포함하는, 핵산.
32. 진술 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥은 서열번호 2의 서열을 포함하는, 핵산.
33. 진술 8 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산.
34. 진술 8 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 변형은 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드 또는 비-자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 어느 하나인, 핵산.
35. 진술 8 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸인, 핵산.
36. 진술 8 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 변형은 2'-F인, 핵산.
38. 진술 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 리간드와 접합된, 핵산.
39. 진술 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 포스포로다이티오에이트가 단부에 존재하지 않는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드 및/또는 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
40. 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 저해될 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고/하거나 제2 가닥은 적어도 2개의 말단 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하며, 그리고 핵산 분자는 리간드에 접합된, 핵산.
41. 진술 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 하나 이상의 GalNac 리간드 및 이의 유도체를 포함하는, 핵산.
42. 진술 38 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNac) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하되, 링커는 GalNac 모이어티를 임의의 상기 진술에 정의된 바와 같은 서열에 접합시키는, 핵산.
43. 진술 40에 있어서, 뉴클레오타이드는 임의의 상기 진술에 정의된 바와 같이 변형된, 핵산.
44. 임의의 상기 진술에 있어서, 리간드는 하기 화학식 I을 포함하는, 핵산:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
45. 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산:
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Z는 진술 1 내지 39 중 임의의 것에 따른다.
46. 임의의 상기 진술에 있어서, 리간드는 하기를 포함하는, 핵산:
Figure pct00087
.
47. 진술 1 내지 27, 31 내지 32 또는 39 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서 뉴클레오타이드는 2' 플루오로 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 11번 또는 13번 또는 11번과 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 2' 플루오로 변형으로 변형된, 핵산.
48. 진술 1 내지 43 또는 47에 있어서, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
Figure pct00088
(식 중, b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물인 핵산:
Figure pct00089
(식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이며;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L은 화학식 (XV) 및 (XVI)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)q(여기서 q는 2 내지 12임);
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고
말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
b + c + d는 2 또는 3임).
49. 진술 48에 있어서, b는 0이고, c는 1이며, d는 1인, 핵산.
50. 진술 48에 있어서, b는 1이고, c는 0이며, d는 1인, 핵산.
51. 진술 48에 있어서, b는 1이고, c는 1이며, d는 0인, 핵산.
52. 진술 48에 있어서, b는 1이고, c는 1이며, d는 1인, 핵산.
53. 진술 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, Y는 O인, 핵산.
54. 진술 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, Y는 S인, 핵산.
55. 진술 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, R1은 H인, 핵산.
56. 진술 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, R1은 메틸인, 핵산.
57. 진술 48 내지 56 중 어느 하나에 있어서, n은 0인, 핵산.
58. 진술 48 내지 57 중 어느 하나에 있어서, L은 -(CH2)r-C(O)-이되, r은 2 내지 12인, 핵산.
59. 진술 58에 있어서, r은 2 내지 6인, 핵산.
60. 진술 59에 있어서, r은 4 내지 6, 예를 들어, 4인, 핵산.
61. 임의의 상기 진술에 정의된 바와 같은 핵산 및 하기를 포함하는 제형을 포함하는 조성물:
i) 양이온성 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) 페길화된 지질.
62. 진술 61에 있어서, 조성물에서 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 55㏖% 내지 약 65㏖%, 바람직하게는 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 59㏖%인, 조성물.
63. 진술 62에 있어서, 제형은 하기를 포함하는, 조성물:
하기 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00090
.
하기 구조를 갖는 스테로이드:
Figure pct00091
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질:
Figure pct00092
및 하기 구조를 갖는 페길화된 지질:
Figure pct00093
.
64. 임의의 상기 진술의 핵산 또는 접합된 핵산 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
65. 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 임의의 상기 진술에 따른 핵산 또는 접합된 핵산.
66. 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 진술에 따른 핵산 또는 접합된 핵산의 용도.
67. 치료를 필요로 하는 개체에게 임의의 하나의 상기 진술에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법.
68. 진술 67에 있어서, 핵산 또는 접합된 핵산 분자는 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여되는, 방법.
69. 진술 1 내지 65 중 어느 하나의 핵산 또는 접합된 핵산의 제조 방법.
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
예를 들어, 상기에 열거된 서열은 링커 또는 리간드, 예컨대 GalNAc 또는 (ps) 또는 (ps2) 링키지와 함께 개시될 수 있다. 이들은 서열 목록의 서열의 선택적이지만, 바람직한 부분을 형성한다.
하기 약어가 본 명세서에서 사용될 수 있다:
Figure pct00097

Claims (22)

  1. 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오이트 링키지를 포함하는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 가닥은 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 중 임의의 것 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하지 않는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 가닥의 3' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고/포함하거나 상기 제2 가닥의 상기 3' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지 및/또는 상기 제2 가닥의 상기 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단부에 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재하지 않을 경우 상기 핵산은 상기 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 상기 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 상기 제2 가닥의 상기 3개의 3' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고/또는 상기 3개의 5' 말단 뉴클레오타이드 각각 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥 및 상기 제2 가닥은 별개의 가닥인, 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 17 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍으로 이루어지는, 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성하는, 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합된, 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 또는 이의 유도체 및 (ii) 링커를 포함하되, 상기 링커는 적어도 하나의 GalNAc 모이어티 또는 이의 유도체를 상기 핵산에 접합시키는, 핵산.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 핵산은 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 리간드에 접합되되:
    [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
    (식 중,
    S는 당류를 나타내되, 바람직하게는 상기 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
    X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이되, m은 1, 2 또는 3이며;
    P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 비치환된 포스페이트이고;
    X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에터이되, n은 1 내지 6이며;
    A는 분지 단위이고;
    X3은 브리징 단위를 나타냄);
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 비치환된 포스페이트를 통해서 X3에 접합된, 핵산.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (X)의 화합물이고:
    Figure pct00098

    (식 중, b는 0 또는 1임);
    상기 제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XI)의 화합물인, 핵산:
    Figure pct00099

    (식 중,
    c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
    Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
    Y는 O 또는 S, 바람직하게는 O이고;
    n은 0, 1, 2 또는 3이며;
    L1은 리간드가 부착된 링커이되;
    b + c + d는 2 또는 3임).
  12. 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고,
    상기 핵산은 상기 제1 가닥의 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하고,
    상기 핵산은 상기 제2 가닥의 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 그리고 5' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함하며, 그리고
    상기 제1 가닥은 상기 5' 단부에서 2개, 3개 또는 4개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 포스포로다이티오에이트가 아닌 링키지를 포함하는, 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산은 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 리간드에 접합되되;
    [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
    (식 중,
    S는 당류를 나타내되, 바람직하게는 상기 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
    X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이되, m은 1, 2 또는 3이고;
    P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 비치환된 포스페이트이며;
    X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에터이되, n은 1 내지 6이고;
    A는 분지 단위이며;
    X3은 브리징 단위를 나타냄)
    제12항에 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트를 통해서 X3에 접합되는, 핵산.
  14. 제12항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합되되, 상기 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
    Figure pct00100

    (식 중, b는 0 또는 1임);
    상기 제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물인, 핵산:
    Figure pct00101

    (식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
    Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
    Y는 O 또는 S, 바람직하게는 O이고;
    R1은 H 또는 메틸이며;
    n은 0, 1, 2 또는 3이며;
    L은 화학식 (XV) 및 (XVI)에서 동일하거나 또는 상이하고,
    -(CH2)q(여기서 q는 2 내지 12임);
    -(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
    -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
    -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
    -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
    -(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)
    로 이루어진 군으로부터 선택되되;
    존재하는 경우 말단 C(O)는 NH기에 부착되고;
    b + c + d는 2 또는 3임).
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNA 가닥은 이의 5' 단부에 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드를 갖고, 그리고 상기 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 바람직하게는 포스포다이에스터 링키지에 의해서 상기 제1 가닥 내의 상기 제2 뉴클레오타이드에 연결되는, 핵산.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥의 상기 뉴클레오타이드는 홀수 뉴클레오타이드 상에서 제1 변형에 의해서 변형되고, 짝수 뉴클레오타이드 상에서 제2 변형에 의해서 변형되되, 상기 제2 가닥의 상기 뉴클레오타이드는 상기 홀수 뉴클레오타이드 상에서 상기 제2 변형으로 변형되고, 상기 짝수 뉴클레오타이드 상에서 제1 변형으로 변형되며, 상기 제1 가닥은 5'에서 3'로 번호 매겨지고, 가장 5'인 뉴클레오타이드가 상기 제1 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이고, 그리고 상기 제2 가닥은 3'에서 5'로 번호 매겨지고, 가장 3'인 뉴클레오타이드가 상기 제2 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이며, 상기 제1 변형은 바람직하게는 2'OMe이고, 상기 제2 변형은 바람직하게는 2' 플루오로이고, 그리고 상기 핵산은 바람직하게는 양 단부에서 평활 단부(blunt ended)인, 핵산.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥의 상기 5' 단부로부터의 2번 위치 및 14번 위치에서의 상기 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 그리고 상기 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 상기 제2 가닥 상의 상기 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형으로 변형되며, 바람직하게는 남아있는 뉴클레오타이드는 2'OMe 변형으로 변형되는, 핵산.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가닥의 상기 3' 단부에서 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이의 링키지 및 상기 제2 가닥의 상기 3' 단부 및 상기 5' 단부에서 상기 2개의 말단 뉴클레오타드 사이의 링키지가 아닌 두 가닥의 뉴클레오타이드 사이의 모든 링키지는 비치환된 포스페이트 링키지인, 핵산.
  19. 조성물로서, 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 어느 한 항의 핵산 및 선택적으로 전달 비히클 및/또는 생리학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 희석제 및/또는 완충제 및/또는 보존제를 포함하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하고, 그리고 전달 비히클, 바람직하게는 리포좀 및/또는 생리학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체 및/또는 희석제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 질환, 장애 또는 증후군의 예방 또는 치료에서의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제20항의 약제학적 조성물의 용도.
  22. 질환, 장애 또는 증후군의 예방 또는 치료 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물 또는 제19항 또는 제20항에 따른 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 바람직하게는 상기 핵산 또는 조성물은 상기 대상체에게 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로 투여되는, 예방 또는 치료 방법.
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