KR20210052425A - 뇌전증과 관련된 ｍｉＲＮＡ 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

뇌전증과 관련된 miRNA 및 그의 치료제, 진단용 조성물, 및 질환 동물 모델에의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 miRNA를 억제할 수 있는 물질에 의하면, KCNQ2의 발현을 증가시켜 뇌전증과 관련된 뉴런 흥분성을 감소시키므로 뇌전증의 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 그를 바이오 마커로 하는 뇌전증 진단 방법에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 질환 동물 모델에도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

뇌전증과 관련된 ｍｉＲＮＡ 및 그의 용도{miRNA associated with epilepsy and uses thereof}
뇌전증과 관련된 miRNA 및 그의 치료제, 진단용 조성물, 및 질환 동물 모델에의 용도에 관한 것이다.
뇌전증 (epilepsy)은 만성적인 신경 장애의 하나로, 뇌신경 세포의 불규칙한 흥분으로 뇌에 전기가 발생해 발작과 경련을 일으키는 질환이다. 뇌전증은 여러 가지 원인에 의해 발생하며, 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고되어 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등을 들 수 있다.
KCNQ2 유전자는 뉴런의 흥분성을 조절하는 칼슘채널의 한 서브유닛을 코딩하며, 이 유전자에 돌연변이가 생기면 신생아 뇌전증 (epilepsy) 을 유도한다는 보고가 잘 알려져 있다. 비교적 생후 1주 내에 발작을 보이고 정상적인 생활패턴을 보이는 양성 신생아 뇌전증 환자군이 대부분이지만, 일부 환자군에서는 신생아 간질성 뇌증(neonatal epileptic encephalopathy)를 보이고 EEG(　electroencephalography, 뇌전도) 가 비정상적이며, 심한 발작(seizure) 과 함께 심각한 지적 장애를 가져올 수 있다.
한편, MicroRNAs(miRNA)는 21- 내지 23-뉴클레오타이드의 작은 RNA 분자이며, 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 유전자 발현을 조절한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여를 한다.
뇌전증은 전 세계적으로 약 6500만명이 앓고 있는 흔한 질환이며 (WHO, 2004), 뇌전증 환자들은 병으로 인해 많은 의료비용을 지출하고 있으며, 정상적인 직장생활을 하지 못하여 많은 경제적 손실을 입고 있다. 특히, 전체 뇌전증 환자들의 약 30%에 해당되는 환자들은 약물로 뇌전증 발작이 잘 조절되지 않는 약물 내성 뇌전증으로 인해 더 큰 어려움을 겪고 있다. 이에 새로운 기전의 뇌전증 약물의 개발이 시급한 실정이다.
일 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA를 검출할 수 있는 제제, 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 발현을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 발현량을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 후보 물질을 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA와 접촉시키는 단계; 및 무처리 대조군에 비하여 상기 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 발현 수준을 감소시킨 후보 물질을 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA를 포함하는 벡터가 도입된, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 동물 모델을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 활성을 억제할 수 있는 물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA"는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본 명세서에서 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성된다.
용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본 명세서에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “miR-17-5p, miR-93-5p, 또는 miR-106b-5p miR-203의 활성을 억제할 수 물질”은 이의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 예를 들면, 상기 miR 의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 결합할 수 있는 핵산 분자일 수 있다. 또한, 예를 들면 앤타고미어, 안티센스 분자, 소헤어핀 RNA 분자 (shRNA), 소방해 RNA 분자 (siRNA), 시드 표적 LNA (Locked Nucleic Acid) 올리고뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, 터프 디코이(tough decoy) 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 리보자임, 또는 DNA:RNA 하이브리드를 인지하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA, 앤타고미어(antagomir), 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, 터프 디코이(tough decoy) 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 표적으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 씨드 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄하는 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 "상보적 핵산-기반 억제제"로 나타낼 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에는 다양한 분자가 포함되며, 예를 들면 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 앤타고미어, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, 터프 디코이(tough decoy) 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 리보핵산은 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.
LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2' 내지 4' 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다.
PNA(peptide nucleic acids)는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-알킬 올리고뉴클레오타이드, 2'-O-C1-3 알킬 올리고뉴클레오타이드, 또는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드일 수 잇다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앤타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "앤타고미어"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 microRNA의 차단 (silence)에 사용된다. 앤타고미어는 Arganoute 2 (Ago 2) 절단 부위에서 상보적이지 않는 서열을 포함하거나, 또는 Ago2 절단이 억제되도록 염기가 예를 들면 2' 메톡시기, 3‘ 콜레스테롤기, 포스포로씨오에이트로 변형되어 있으며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본 명세서에 따른 앤타고미어는 miR-106b-5p에 적어도 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 일 구현예에서 앤타고미어는 하나 이상의 변형 (예컨대, 2'-O-메틸-당 변형, 또는 3' 콜레스테롤 변형)을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 앤타고미어는 하나이상의 포스포로씨오에이트 결합을 포함하며, 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 본 명세서에 따른 miR-106b-5p 등을 억제하기 위하여 적합한 앤타고미어의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-25 뉴클레오타이드, 또는 16-19 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-106b-5p 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미일 수 있다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본 명세서에 따른 효과 즉, miR-106b-5p의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.
일 구체예에 있어서, miR-106b-5p의 활성을 억제할 수 있는 물질은 miR-106b-5p의 전구 및/또는 성숙 서열의 전부 또는 일부, 특히 씨드 서열에 상보적으로 결합하여, 이의 활성을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 활성의 억제는 miR-106b-5p의 전사 및/또는 miR-106b-5p의 표적 mRNA와의 결합을 억제하는 것이다. 본 명세서에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드를 연결하는 백본(골격)이 하기 하나 이상의 변형을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 LNA, 또는 이를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 당이 2‘-O- 메틸화, 또는 이의 백본에 하나이상의 포스포티오에이트를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산분자는 miR-106b-5p의 씨드서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 씨드 서열은 miRNA의 표적분자의 인지에 매우 중요한 다양한 종에서 보존된 서열이다. miRNA는 씨드서열을 통해 표적과 결합하기 때문에, 씨드서열의 표적과의 상호작용을 억제하는 경우, 표적 mRNA의 번역 등을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 하나 이상의 각 뉴클레오타이드는 2'-O- 메틸화되거나, 또는 상기 각 하나 이상의 뉴클레오타이드는 LNA이거나, 또는 상기 백본을 구성하는 화학결합 중 하나 이상은 포스포티오에이트일 수 있으나, 상기 변형을 포함하지 않을 수도 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 miR-106b-5p의 활성을 억제할 수 있는 물질은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 유전자 치료제일 수 있다. 구체적으로, 상기 miR 의 활성을 억제할 수 있는 물질은 상기 miR 의 활성을 억제할 수 있는 물질을 포함하는 벡터 또는 그에 의해 형질전환되거나, 그를 포함하는 세포일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 핵산 분자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, RNA 발현 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 명세서의 miR-106b-5p의 서열은 포유류 유래 예를 들면, 인간, 마우스, 또는 래트 유래이다. 예를 들면, miR-106b-5p의 성숙된 서열은 서열번호 1을 포함하고, miR-106b-5p의 전구 서열은 서열번호 2를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 miR-106b-5p의 활성 억제는 miR-106b-5p의 세포내 작용 또는 기능을 억제 또는 방해하는 것을 의미하는 것으로 전형적으로 miR-106b-5p가 이의 표적 KNCQ2를 코딩하는 mRNA 분자와의 결합을 직접적으로 억제하거나, 또는 저분자 억제제, 항체 또는 항체의 단편을 이용하여 miR-106b-5p의 기능을 직접적으로 억제하거나, 또는 억제제 또는 small interfereing RNA분자를 이용하여 간접적으로 조절되는 것을 포함한다. 나아가 miR-106b-5p의 활성의 방해 또는 억제는 직접 또는 간접적으로 전구서열(예를 들면, 서열번호 3) 및 성숙서열 (예를 들면, 서열번호 1)의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 또한 miR-106b-5p의 활성 억제는 miR-106b-5p의 전사를 억제하여 이의 세포내 농도를 낮추는 것을 포함한다.
특정 이론에 제한됨이 없이, 본 명세서에서 miR-106b-5p은 KCNQ2 유전자를 코딩하는 mRNA의 3‘ 비번역 부위에 결합하여, 이의 발현을 억제하여, 뇌전증과 관련된 KCNQ2 유전자 또는 단백질의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 따라서, 상기 miR-106b-5p의 활성을 억제할 수 있는 물질은 KCNQ2의 발현을 증가시키는 것이거나, 상기 miR-106b-5p의 표적 mRNA는 KCNQ2의 3'-비번역 부위(UTR)인 것일 수 있다.
이에, 본 명세서의 miR-106b-5p의 활성의 억제를 KCNQ2의 발현을 증가시켜, 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서의 조성물은 뇌전증 (epilepsy)의 치료에 사용된다. 뇌전증은 뇌조직의 병변 또는 기능적인 장애로 인하여 발작적으로 신경기능장애를 일으켜 여러 가지 신경증상, 즉 돌발적인 의식상실, 경련, 정신 또는 감각장애를 일으키는 병으로, 지속적인 재발성의 자극되지 않은 발작을 나타낼 수 있다.
뇌전증은 만성 뇌전증 및 한 번 발생시 30분이상 지속되는 간질지속증 (status epilepticus, SE)을 포함하는 것이다. 뇌전증은 발작을 기준으로 분류할 때 부분성뇌전증 발작을 나타내는 부분성뇌전증과 전반성뇌전증 발작을 나타내는 전반성뇌전증을 포함한다. 그리고 원인을 기준으로 분류할 때, 각기 유전적인 요인 외에는 특별한 원인이 없는 특발성, MRI나 CT와 같은 뇌영상에서 뇌전증의 원인이 되는 병소가 발견되는 증후성, 뇌전증의 원인이 되는 병소가 있을 것으로 추정되나 현재의 뇌영상에서 이상 소견이 발견되지 않는 은닉성뇌전증을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발작 관련 질환"은 발작이 수반되는 뇌 관련 질환을 포함하며, 발작 (seizure) 일으키는, 예를 들면 뇌졸중; 뇌염; 해마경화; 뇌성마비 및 선천성 기형; CNS 감염관련 발작; 저산소증; 뇌종양; 외상성 뇌손상; 혈관기형; 신경퇴행성질환; 저혈당증, 당원축적병 및 파이루베이트탈수소효소 결핍증과 같은 대사성 질환; 다발성경화증; 전신홍반루프스와 같은 자가면역질환을 들 수 있고, 원인 미상으로 인한 발작 질환을 포함한다. 본 명세서의 조성물은 발작 관련 질환으로부터 유래된 발작의 치료에 사용된다.
본 명세서의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 아주번트를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 예를 들면 용액, 에멀젼 및 리포좀 제형 등과 같은 다양한 제형 및 투약형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 활성성분을 약학적으로 허용가능한 액체 및/또는 미세분말의 고형 담체 또는 부형제와 혼합하여, 정제, 캡슐, 젤, 시럽 또는 좌제로 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에 따른 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질을 이용한 현탁액으로 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 높이는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 따른 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 비강내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있다. 본 명세서의 조성물은 또한 다양한 경로로 전달될 수 있으며, 예를 들면 인퓨전 또는 볼러스 주사, 표피 또는 점막 (경구점막, 항문 점막, 장 점막 등)을 통해 투여될 수 있다. 본 명세서의 조성물은 또한 전신 또는 국소투여될 수 있다.
나아가 본 명세서의 조성물은 뇌로 전달되는 것일 수 있다. 구체적으로, 조성물은 적절한 경로를 통해 중추신경 또는 말초신경으로 도입될 수 있다. 경로는 뇌실내 (intraventricular) 또는 수막내 (intrathecal) 투여를 포함한다. 이러한 투여는 저장고에 연결된 카테터를 이용하여 달성될 수 있다. 본 명세서에 따른 효과가 발생되는 한, 정맥내 투여, 피하 주사, 뇌척수강내 주사, 흡입투여, 또는 경구 투여용 제형을 제외하는 것은 아니다. 본 명세서에 따른 일 구현예에서는 비강 투여될 수 있다.
본 명세서에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 명세서에 따른 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 조성물에 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염이란, 본 명세서에 따른 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 활성은 유지하면서, 바람직하지 않는 독성은 최소화된 것이다. 이러한 염은 예를 들면 아연, 칼슘, 비스부스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 코퍼, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소디움, 포타슘 등과 같은 금속 양이온과 형성된 염기 부가염 및 유기 아미노산과 형성된 염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌디아민 (dibenzylethylene-diamine), D-클루코사민 (glucosamine), 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine) 유래의 양이온과 형성된 염을 포함 할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 명세서에 따른 일 구현예에서, 본 명세서의 유효성분 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이를 이루는 뉴클레오타이드의 특성상 음으로 하전되어 있을 수 있다. 세포막은 친지질성 성질로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 세포막으로의 흡수가 감소될 수 있다. 이러한 극성으로 인한 흡수 방해는 하기에 기재된 전구약물 접근방식을 통해 해결될 수 있다 (Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).
또 다른 양상은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA를 검출할 수 있는 제제, 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열, 그의 상보적 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 발현을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 마커의 발현량을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법, 또는 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 명세서는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miR-106b-5p 및 KCNQ2의 발현을 검출하여 이들의 상호작용을 분석하는 단계; 및 상기 miR-106b-5p 및 KCNQ2의 발현 수준에 따른 miRN-106b-5p 및 KCNQ2의 상호작용을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 질환의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법, 또는 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 명세서의 목적상, 진단은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 발병 여부, 또는 질환 예후를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, miRNA를 검출할 수 있는 제제는 miRNA를 특이적으로 인식하는 것으로 상기 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 완전 상보적인 것 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하고, 상세하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 명세서의 키트 또는 진단 방법은 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 키트 또는 진단 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 명세서의 키트 또는 진단 방법은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTP를 포함할 수 있다. 본 명세서의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 또한, 상기 키트는 마이크로어레이일 수 있다. 본 명세서의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있을 수 있다. 프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명의 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 miRBase에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 명세서의 방법에서 상기 비교하는 단계는 상기 결정된 마커의 발현 수준을 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커에 대한 검출 결과와 비교하는 것일 수 있다. 예를 들면, 정상 대조군과 대비하여 상기 분석된 miR-106b-5p의 발현 수준이 감소되거나, KCNQ2의 발현 수준이 증가되거나, 또는 상기 miR-106b-5p에 의해 KCNQ2의 발현이 조절되거나, 상기 miR-106b-5p 및 KCNQ2의 상호작용이 증가한 경우 뇌전증 또는 발직 관련 질환으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 또는 miRNA의 발현 수준 측정"이란 뇌전증 또는 발직 관련 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하거나, miRNA의 발현량을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있을 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 뇌전증 또는 발직 관련 질환 진단을 위하여 생물학적 시료에서 뇌전증 또는 발직 관련 질환 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 또한, 예를 들면, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수 있다. 상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 뇌전증 또는 발직 관련 질환 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 시료, 비점막 시료, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다.
나아가 본원에 따른 방법은 마커의 발현량을 검사 대상자의 뇌전증 또는 발작관련 질환의 진단 또는 예후 판별시에 발작 질환 검사 대상자의 비마커 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 검사 대상자의 비마커 임상정보는 상기 대상자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환 및 뇌파검사, 발작 종류, 뇌 MRI, 뇌 CT, 또는 뇌 척수액 검사을 포함할 수 있다.
본 명세서의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현 정도, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rded. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현 정도가 정상 대조군과 비교하여 1.2배 이상, 1.5배 이상, 또는 2배 이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 뇌전증 또는 발작 질환 특히 뇌전증 질환을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정하는 것일 수 있다. 또한, miRNA와 표적 유전자의 mRNA의 상호작용이 정상 대조군과 비교하여 1.2배 이상, 1.5배 이상, 또는 2배 이상의 발현도를 나타내는 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 뇌전증 또는 발작 질환 특히 뇌전증 질환을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정하는 것일 수 있다. 상기 상호작용은 miRNA의 증가 또는 감소에 따라, 표적 유전자 또는 단백질의 발현이 감소 또는 증가하는 역 상관관계를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 상기 방법에 사용되는 RNA-RNA 상호작용을 검출하는 방법은 당업계의 공지된 것으로 예를 들면 RNA Walk (Lusting et al., Nucleic Acids Res. 2010; 38(1):e5 에 기재된 것 참조) 또는 Yeat two hybrid system (Piganeau et al., RNA 2006; 12: 177-184) 등을 이용하여 검출할 수 있으며, RNA: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 2011)를 참조할 수 있다.
또 다른 양상은 후보 물질을 miR-106b-5p와 접촉시키는 단계; 및 무처리 대조군에 비하여 상기 miR-106b-5p의 발현 수준을 감소시킨 후보 물질을 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 상기 miR-106b-5p RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공될 수 있다. 상기 활성은 상기 miR-106b-5p RNA의 발현으로 분석되는 것이다. 예를 들어 본원에 따른 miR-106b-5p을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, miR-106b-5p의 발현량의 변화를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 발현량에 변동, 특히 감소가 있는 것을 후보물질로 선별할 수 있다. 본 명세서에서 miRNA의 발현량은 상기 진단 방법에서 언급된 것과 동일한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또다른 구현예에서 상기 miR-106b-5p RNA는 이를 발현하는 세포의 형태로 제공되며, 상기 활성은 상기 miR-106b-5p RNA와 이의 표적인 KCNQ2의 3'-UTR 과의 상호작용 분석으로 결정된다. 예를 들어 본 명세서에 따른 miR-106b-5p을 발현하는 세포를 시험물질과 접촉시킨 후, KCNQ2의 3'-UTR과 miR-106b-5p의 상호작용 정도를 접촉전 또는 접촉되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 상호작용에 변동, 감소가 있는 것을 후보물질로 선별한다. 본 명세서에서 상기 방법에 사용되는 RNA-RNA 상호작용을 검출하는 방법은 상기 진단 방법에서 언급된 것과 동일한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 후보물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 세포의 종류, 양 및/또는 조건을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 후보 물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 miR-106b-5p RNA의 활성의 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벋어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본 명세서의 "후보물질"은 상술한 바와 같은 miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA의 활성 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함할 수 있다. 상기 후보 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 후보 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 예를 들면 생물학적 제제(바이오로직스)가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
또 다른 양상은 miR-106b-5p의 발현 또는 활성이 증가하도록 유전적으로 조작된 뇌전증 또는 발작 관련 질환 동물 모델을 제공한다.
또 다른 양상은 miR-106b-5p 또는 그의 발현을 증가시키는 물질을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물 모델은 miR-106b-5p를 포함하는 벡터가 도입된 것일 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 세포는 miR-106b-5p의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 활성에 비해, 동일한 타입의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 외인성 핵산 분자는, 상기 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 miRNA의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 핵산 분자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 핵산 분자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 핵산 분자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 핵산 분자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 miRNA, 상기 miRNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.
상기 벡터 및 세포에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 양상에 따른 miRNA를 억제할 수 있는 물질에 의하면, KCNQ2의 발현을 증가시켜 뇌전증과 관련된 뉴런 흥분성을 감소시키므로 뇌전증의 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 그를 바이오 마커로 하는 뇌전증 진단 방법에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 질환 동물 모델에도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 마우스 뇌의 해마조직에서 발생단계 별로 miR-105b-5p의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 일 구체예에 따른 miR-106b-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 일 구체예에 따른 miR-17-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 일 구체예에 따른 miR-93-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 일 구체예에 따른 miR-106b-5p의 mRNA를 나타낸 도면으로서, miR-106b-5p가 마우스 KCNQ2(wt)의 3' UTR에 결합하면서, 씨드 서열에 돌연변를 갖는 마우스 KCNQ2(mut)의 3'UTR에는 결합하지 않는 것을 나타낸다.
도 3a는 마우스 주령에 따라 해마조직에서의 KCNQ2 단백질의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 마우스 주령에 따라 해마조직에서의 miR-106b-5p 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 miR-106b-5p의 모사체와 억제제 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 4b는 miR-106b-5p의 모사체와 억제제 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 전구체(Pre) miR-106b-5p 및 TuD-miR-106b-5p의 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 5b는 전구체(Pre) miR-106b-5p 및 TuD-miR-106b-5p의 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 뉴런의 전압 변화를 나타낸 도면이다.
도 6b는 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 활동 전위, 유지 전위, 및 AP 프리퀀시 변화를 나타낸 도면이다; 적색: miR106b, 검정색: Control)
도 6c는 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 전도도의 변화를 나타낸 도면이다.
도 6d는 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 Action potential firing의 변화를 나타낸 도면이다.
도 6e는 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 oncet time(current 가 induce 된 시점으로부터 action potential 이 firing 되기까지의 소요시간)의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7a는 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 뉴런의 전압 변화를 나타낸 도면이다.
도 7b는 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 활동 전위, 유지 전위, 및 AP 프리퀀시 변화를 나타낸 도면이다; 적색: miR106b, 검정색: Control)
도 7c는 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 전도도의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7d는 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 Action potential firing의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7e는 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성과 관련된 oncet time(current 가 induce 된 시점으로부터 action potential 이 firing 되기까지의 소요시간)의 변화를 나타낸 도면이다.
이하 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뇌전증과 관련된 miRNA의 규명
KCNQ2 유전자는 뉴런의 흥분성을 조절하는 칼슘채널의 한 서브유닛을 암호화하며, 이 유전자에 돌연변이가 생기면 신생아 뇌전증 (epilepsy) 을 유도한다고 알려져 있다. 이에, 본 실시예에서는 마우스 KCNQ2 유전자의 3'UTR (590bp)에 잘 보존된(highly conserved) 마이크로 RNA 결합 부위가 존재하는지 여부를 TargetScan(www.targetscan.org), Miranda(www.microRNA.org) 및 miRDB(www.mirDB.org)를 이용하여 확인하였다. 이후에, 상기 3개의 프로그램을 통해 공통으로 존재하는 5개의 miR, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-93-5p, miR-106a-5p, 및 miR-106b-5p를 도출하였다. 이후에, KCNQ2가 발현되고 뇌전증과 기능적으로 관련된 마우스 뇌의 해마 조직을 분리하였다. 구체적으로, 출생 후 여러단계의 마우스 뇌를 우선 분리하고 이들로부터 실체현미경하에서 선명한 바나나 형태의 해마조직을 포셉을 사용하여 분리하엿다. RNA-seq은 싱기의 해마조직에서 RNA 를 분리하고 50nt 미만의 작은 RNA 만을 gel 에서 분리하여 어댑터(adapter)를 붙여서 가닥 특이적 cDNA 라이브러리(strand specific cDNA library)를 제조하였다. 이후에, Illumina Hiseq 2000 system 을 사용하여 단일 말단 51 nt 시퀀싱을 수행하였고, 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
해마 조직 miRNA에 대한 RPM(read per million) 값
P1 P14 P30 P60
mmu-miR-17-5p 442.60 68.29 38.82 16.01
mmu-miR-20a-5p 189.69 38.04 24.64 8.96
mmu-miR-93-5p 752.89 155.60 109.75 93.49
mmu-miR-106b-5p 441.43 110.65 75.40 56.35
다음으로, qPCR을 위해 해마 조직에서 RNeasy mini kit (QIAGEN, 독일)을 사용하여 RNA를 추출하였다. miRNA의 qpcr을 위한 cDNA 합성은 Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(clontech, USA)를 사용하여 역전사 하였고, mRNA의 위한 cDNA 합성은 ImProm-II™Reverse Transcriptase kit(Promega, USA)를 사용하여 역전사 하였다. 합성된 시료들은 iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA)로 증폭 사이클을 실시하였다. 증폭과 탐지를 CFX96TM real-time PCR system (Bio-Rad, USA)에서 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 마우스 뇌의 해마조직에서 발생단계 별로 miR-105b-5p의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스 뇌의 해마조직에서 miR-20a-5p, miR-106a-5p는 존재하지 않는 것으로 확인되었고, 따라서, miR-17-5p, miR-93-5p, 및 miR-106b-5p의 3 종류의 miR 가 KCNQ2 유전자의 3' UTR 에 결합하여 그 발현을 조절하는 것을 알 수 있었다.
이후에, 상기 3 종류의 miRNA에와 KCNQ2 유전자의 발현 조절과의 관련성을 확인하기 위해 루시퍼라아제 어세이를 수행하였다. 구체적으로, 마우스 KCNQ2의 총 3'-UTR 서열(WT), 및 돌연변이 서열(Mut)을 루시퍼라아제 리포터 컨스트럭트 (SwitchDB, USA)에 클로닝하였다. HEK293T 세포를 48 웰 플레이트에 2.5x104 cells/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건하에 밤새도록 배양하였다. 다음날 25ng PRL-TK와 250ng의 KCNQ2-3'UTR 재조합 플라스미드 야생형(Wild type) 또는 돌연변이(Mutant), 20nM의 SCR mimic 또는 mmu-miRNA-106b-5p를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)에 혼합하여 형질전환하였다. 형질도입 24시간 후 세포를 PBS로 세척하고 lysis buffer(Promega, USA)를 이용하여 세포를 용해시키고 Dual-Glo® assay kit(Promega, USA)을 이용하여 루시퍼라아제 활성 어세이를 수행하였다. 세포 활성 측정은 Multi-Mode Readers (Bio-Tek, USA)를 이용하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2a는 일 구체예에 따른 miR-106b-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 일 구체예에 따른 miR-17-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 일 구체예에 따른 miR-93-5p가 KCNQ2 유전자의 발현을 조절하는지 여부를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 일 구체예에 따른 miR-106b-5p의 mRNA를 나타낸 도면으로서, miR-106b-5p가 마우스 KCNQ2(wt)의 3' UTR에 결합하면서, 시드 서열에 돌연변를 갖는 마우스 KCNQ2(mut)의 3'UTR에는 결합하지 않는 것을 나타낸다.
도 2a 내지 2c에 나타낸 바와 같이, miR-106b-5p, miR-17-5p 및 miR-93-5p 모두 루시퍼라아제 활성을 감소시켰음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 miR-106b-5p, miR-17-5p 및 miR-93-5p가 Luc-KCNQ2 WT 3' UTR에 결합하여 KCNQ2 단백질을 조절함을 의미한다.
또한, 도 2a에 나타낸 바와 같이, miR-106b-5p의 경우에는 KCNQ2 유전자가 결합하는 시드 서열(seed sequence)에 돌연변이를 만든 Luc-KCNQ2 Mut3' UTR 에는 결합하지 못하여 루시퍼아라제 활성에 변화를 주지 않았음을 알 수 있었다.
상기의 결과로, miR-106b-5p, miR-17-5p 및 miR-93-5p 모두 KCNQ2를 발현 조절하면, 특히 miR-106b-5p는 더욱 특이적으로 KCNQ2를 발현 조절함을 알 수 있고, 이하의 실험에서는 miR-106b-5p를 사용하여 수행하였다.
실시예 2. 뇌전증 관련 유전자인 KCNQ2 단백질 변화와 miRNA의 관련성 규명
본 실시예에서는 상기 실시예1의 miR-106b-5p와 KCNQ2의 단백질의 발현 변화를 규명하였다.
먼저, 1주령~6주령의 마우스 발생 단계에서 miR-106b-5p와 KCNQ2 단백질의 발현 변화를 해마조직에서 분석하였다. 구체적으로, 해마 조직을 RIPA buffer(Thermo, USA)로 용해시킨 후 4 ℃, 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 하여 단백질을 얻었다. 이후에 BCA 단백질 어세이 시약(Thermo, USA)를 사용하여 단백질 정량 후 단백질 30㎍ 을 10% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 겔 중의 단백질은 PVDF membrane(Millipore, USA)으로 전이 시킨 후, 5% 탈지 분유가 든 TBST 용액으로 1시간 동안 블로킹을 진행하였다. 1차 항체(5% milk in TBST, 1:1000)를 처리하여 4 ℃에서 하룻밤 반응시키고, 세척 후 2차 항체(5% milk in TBST, 1:10,000)는 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 결합된 항체를 ECL 화학발광 시스템을 이용하여 x-ray film상에 가시화 하였고, 그 결과를 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.
도 3a는 마우스 주령에 따라 해마조직에서의 KCNQ2 단백질의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 마우스 주령에 따라 해마조직에서의 miR-106b-5p 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, KCNQ2 는 첫 1,2주에는 발현이 낮다가 3주에서 5주까지 점진적으로 증가하였고, 반면 miR-106b-5p는 첫 1,2주에는 높게 발현되다가 그 이후에는 지속적으로 낮게 발현되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는, KCNQ2와 miR-106b-5p가 역 상관관계(inverse correlation)를 나타내며, KCNQ2가 miR-106b-5p 에 의해 조절 받음을 의미한다.
또한, miR-106b-5p와 KCNQ2의 발현의 상관관계를 더욱 구체적으로 확인하기 위해, miR-106b-5p 모사체(mimic)(서열번호 1), 및 miR-106b-5p 억제제(서열번호 2)를 포함하는 플리스미드 컨스트럭트를 바이오니어(대한민국)에 의뢰하여 제공받았다. 또한, 추가적으로, miR-106b-5p를 증가시키는 전구체 miR-106b-5p(서열번호 3), 및 miR-106b-5p를 감소시키는 TD(Tough Decoy) miR-106b-5p(서열번호 4)를 포함하는 플리스미드 컨스트럭트는 DNA 시퀀스를 합성하여 BamHI 과 HindIII 사이트를 이용하여 small RNA 발현 벡터인 pmiENSR 에 클로닝하여 제조하였다.
이후에 마우스 해마에서 primary 뉴런을 분리하여 in vitro 배양한지 3일 되는 뉴런에 duplex RNA 인 상기 모사체와 억제제를 Ca phosphate 방법으로 형질전환하였다. 대조군은 마우스나 인간에 존재하지 않는 sequence(SCR mimic과 SCR inhibitor)를 사용하여 해마 뉴런에서 영향을 주지 않도록 하였다. 이후에, 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏팅을 수행하였고, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.
또한, 상기 전구체 miR-106b-5p(서열번호 3), 및 TD(Tough Decoy) miR-106b-5p(서열번호 4)를 세포에 상기와 동일한 방법으로 형질전환한 후, 상기와 동일한 방법으로, KCNQ2의 발현량을 확인하였고, 그 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 4a는 miR-106b-5p의 모사체와 억제제 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 4b는 miR-106b-5p의 모사체와 억제제 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 전구체(Pre) miR-106b-5p 및 TuD-miR-106b-5p의 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 5b는 전구체(Pre) miR-106b-5p 및 TuD-miR-106b-5p의 처리에 따른 KCNQ2의 상대적 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 해마 뉴런에 miR-106b-5p 모사체를 처리하면, 세포의 KCNQ2의 발현이 15% 감소하였고, 반대로 miR-106b-5p 억제제를 처리하면, KCNQ2 발현이 20% 증가 하였음을 알 수 있었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, TuD-miR-106-5p는 TuD 대조군에 비해 KCNQ2의 발현을 85% 이상 증가시켰고, 또한 pre-miR-106b-5p는 Pre 대조군에 비해 KCNQ2 단백질 발현을 50% 감소시켰음을 알 수 있었다.
실시예 3. 뇌전증 표현형과 miRNA 발현의 상관 관계 규명
miRNA 발현 조절에 따라 신경세포의 활성화 조절에 미치는 영향을 miR-106b-5p의 플라스미드 컨스트럭트를 사용하여 분석하였다.
구체적으로, 해마조직에서 분리한 뉴런을 커버슬립에 플레이팅(plating) 한 후 3일 후에 Ca Phosphate 를 이용하여 miR-106b-5p의 플라스미드 컨스트럭트를 형질전환 하였다. 형질전환 2일 후 전체 세포 패치 클램프 챔버(whole cell patch clamp chamber)에 이동시켰다. GFP 양성 뉴런을 현미경으로 확인하여 바로 측정을 하였다. 유리 모세관(Glass capillaries) 에서 뽑은 리코딩 피펫(recording pipette) 끝을 뉴런의 soma 에 주입하여 뉴런을 -60mv 로 유지한 상태에서 action potential firing rate를 측정하였다. recording 분석은 Clampfit software를 이용하여 수행하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
상기 pre-miR-106b-5p의 결과는 도 6에 나타내었고, 상기 TuD-miR-106b-5p의 결과는 도 7에 나타내었다.
도 6은 miR-106b-5p의 발현 증가에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성의 변화를 나타낸 도면이다.
도 7은 miR-106b-5p의 발현 감소에 따른 신경 세포에서의 뉴런 흥분성의 변화를 나타낸 도면이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, pre-miR-106b-5p가 뉴런에 발현되면 대조군에 비해 활동 전위 숫자, 유지 전위(holding potential), 및 AP frequency 가 증가한 것을 알 수 있었다. 이는 pre-miR-106b-5p의 증가로 인해 뉴런에서 KCNQ2의 발현이 감소되어 뉴런자체가 가지고 있는 기본적 흥분성을 크게 증가시킨 것을 의미한다.
반면에, 도 7에 나타낸 바와 같이, TuD-miR-106-5p가 뉴런에 발현되면 대조군에 비해 활동전위 숫자, 유지 전위 및 AP frequency가 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이 결과는 뇌전증환자에 miR-106-5p을 억제하면, 뉴런의 KCNQ2 발현 증가를 유도하여 발작과 같은 과도한 신경 흥분성을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
상기의 결과로, miR-106b-5p는 뇌전증과 관련된 KCNQ2를 조절하며, 상기 miR-106b-5p는 뇌전증의 바이오마커로서 활용될 수 있을 뿐만 아니라, miR-106b-5p를 억제하는 물질은 뇌전증의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예4. 뇌전증 동물 모델 마우스의 제작
상기의 실시예 3.의 miR-106b-5p의 발현 변화에 따라, 뇌전증의 표현형이 나타난다는 결과에 기초하여 miR-106b-5p의 발현을 증가시키는 벡터를 주입하여 뇌전증 동물 모델을 제조하고자 하였다.
구체적으로, AAV pre-miR-106b-5p를 제작하고 이를 해마에 주입함으로써 뉴런에 형질유도 되어 pre-miR-106b-5p가 장기적으로 안정되게 발현할 수 있게 하였다. 따라서, 이로 인해 KCNQ2 의 발현 감소가 일어나 쉽게 뉴런 흥분성을 유도되는 뇌전증모델을 제작하였다.
<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> miRNA associated with epilepsy and uses thereof <130> PN210454 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-106b-5p mimic <400> 1 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-106b-5p inhibitor <400> 2 aucugcacug ucagcacuuu a 21 <210> 3 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-106b precursor <400> 3 aaggatcccc tgctgggact aaagtgctga cagtgcagat agtggtcctc tctgtgctac 60 cgcactgtgg gtacttgctg ctccagcagg aagcttaa 98 <210> 4 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mmu-miR-106b-5p TuD <400> 4 aaggatccga cggcgctagg atcatcaaca tctgcactgt cagcacttta caagtattct 60 ggtcacagaa tacaacatct gcactgtcag cactttacaa gatgatccta gcgccgtctt 120 ttttggaaaa gcttaa 136

Claims (6)

  1. miR-106b-5p의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 상보적으로 결합하여 miR-106b-5p의 활성을 억제하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA, 앤타고미어(antagomir), 안티센스 분자, siRNA, shRNA, 2'-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 리보뉴클레오타이드, 디코이 올리고뉴클레오타이드, 터프 디코이(tough decoy) 올리고뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA(locked nucleic acid) 올리고뉴클레오타이드인 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 KCNQ2의 발현을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 miR-106b-5p의 표적 mRNA는 KCNQ2의 3'-비번역 부위(UTR)인 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 발작 관련 질환은, 뇌졸중, 해마경화, 뇌선마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가면역질환, 또는 원인 미상으로 인한 발작인 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 뇌로 전달되는 것인 약학적 조성물.
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