KR20210056475A

KR20210056475A - 7-아자인돌 유도체를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20210056475A
Application number: KR1020190142588A
Authority: KR
Inventors: 오구택; 창동신; 공윤정
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-05-20
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: KR102709050B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

Description

7-아자인돌 유도체를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING THROMBOTIC DISEASE COMPRISING 7-AZAINDOLE DERIVATIVES}

본 발명은 7-아자인돌 유도체의 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

혈소판(Platelet)은 핵이 없는 가장 작은 혈액 세포로서 골수 내 전구체인 거핵구(megakaryocyte)로부터 파쇄되어 생성되며, 지름은 2~5 μm, 두께는 약 0.5 μm인 원반 모형의 세포이다. 생존 주기는 7~10일이고, 건강한 사람의 혈액 내 혈소판 수는 1.5 ~ 4×10⁹ platelets/mL이다. 혈소판은 비활성화 상태로 혈관 내에서 순환하다가, 혈관의 내벽 손상 시 노출되는 콜라겐 및 von Willebrand factor가 세포막에 존재하는 각각의 수용체를 통해 결합하면, 활성화가 시작되어 혈전(thrombus) 형성을 통해 지혈 과정에서 중심적인 역할을 담당한다. 혈소판의 수가 적거나 활성 작용이 저하되면 지혈이 원활히 이뤄지지 않으며, 수가 많거나 과도한 활성화는 손상되지 않은 정상적인 혈관 내에서도 혈전 형성을 유도하여 혈액순환을 억제하는 혈전증 (thrombosis) 및 죽상동맥경화를 비롯한 다양한 심혈관계 질환을 유발한다. 심혈관계 질환의 치료제로 항혈소판제가 처방되고 있다. 그러므로, 혈소판에 대한 활성 억제 물질 탐색 및 기전 연구는 심혈관계 질환에 대한 예방 및 치료를 위해 중요한 의미를 갖는다.

혈소판의 활성화는 다양한 작용 물질 및 신호전달 물질의 관여로 매우 복잡한 기전으로 이뤄진다. 수용체 신호 전달에 의해 활성화된 혈소판으로부터 thromboxane A2가 생성되고, 세포 내 과립으로부터 ADP, thrombin, fibrinogen 등이 분비된다. 이 물질들은 다시 혈소판의 활성화를 증폭시킨다. 혈소판의 활성화가 이뤄지면 fibrinogen receptor인 integrin α_IIbβ₃는 conformational change를 통해 fibrinogen에 대한 affinity가 증가되어 활성화된 다른 혈소판들과 fibrinogen을 통해 bridge를 형성한다. Bridge를 형성하면, 다른 혈소판과 응집이 일어나 혈구들이 얽히고 혈전을 형성하여 지혈작용을 이룬다. 정상적인 지혈작용의 경우 혈전이 섬유소 분해로 용해되지만 과도한 응집의 경우 혈전증을 유발한다.

혈소판의 다양한 agonist들 중 하나인, 콜라겐은 혈관의 extracellular matrix에 존재하며 강력한 혈소판 활성 물질로 잘 알려져 있다. 혈소판 막에 콜라겐 receptor인 glycoprotein VI (GPVI)가 주요 수용체로 존재한다. GPVI는 Fc receptorγ-chain (FcRγ-chain)과 교차 결합으로 복합체를 형성하고 있다. 콜라겐이 GPVI binding site에 결합하게 되면 혈소판의 활성화 신호전달이 시작된다. 세포 내 Src family kinase들은 FcRγ-chain의 immunoreceptor tyrosine kinase (ITAM)부분의 tyrosine을 인산화 시키고 spleen tyrosine kinase (Syk)이 인산화된 ITAM 부분에 recruit되어 autophosphorylation을 일으킨다. 활성화된 Syk이 adaptor protein의 다양한 tyrosine 잔기들을 인산화시키며 domain인 SH2 domain을 포함하고 있는 다양한 kinase, adaptor protein들이 결합하여 신호전달이 이뤄진다.

중심적인 신호전달 매개체로 phospholipase Cγ2 (PLCγ2)의 활성이 증가된다. PLCγ2는 세포막의 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate를 inositol-triphosphate (IP₃)와 diacylglycerol (DAG)로 가수분해한다. 가수분해로 증가된 IP₃는 endoplasmic reticulum (ER)내의 IP₃receptor와 binding하며 Ca²⁺ channel을 개방한다. 개방된 channel을 통해 Ca²⁺이 세포 내로 방출되어 세포내 Ca²⁺ level을 증가시킨다. 혈소판에서 Ca²⁺은 형태 변화에 필수적인 actin cytoskeleton의 재조직화, degranulation 및 혈소판 응집에 관여하는 다양한 단계의 세포 활성에 관여한다. PLCγ2의 하위 신호전달계가 활성화되면 혈소판 과립함유 물질의 분비와 integrin α_IIbβ₃ 활성화 및 이에 따른 혈소판 응집 반응도 증폭된다.

콜라겐 자극을 받은 혈소판에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)의 생성이 증가되며, 생성된 ROS는 다양한 혈소판 활성화 신호를 증폭시키는 이차 신호전달자로 작용함으로써 혈소판의 응집 반응을 증폭시키는 인자로 작용한다. 콜라겐 자극을 받은 혈소판에서 ROS의 생성을 증가시키는 주된 효소는 NADPH oxidase (NOX)로 알려져 있다. NOX는 superoxide anion (O₂·^-)을 생성하기 위해 전자공여체인 NADPH로부터 산소 분자까지 전자를 전달함으로써 산소의 환원을 촉매하는 multisubunit 단백질 복합체이다. 생성된 ROS인 superoxide anion은 superoxide dismutase (SOD) 효소가 작용하거나 또는 효소가 작용하지 않는 두가지 반응에 의해 생체 반감기가 더 긴 또다른 ROS인 hydrogen peroxide (H₂O₂)로 빠르게 변환될 수 있다. 따라서 콜라겐 자극으로 인한 NOX 활성 증가로 발생한 superoxide anion은 결국 H₂O₂로 전환되고, 전환된 H₂O₂가 세포 내 이차 신호전달자로 작용할 수 있다. 혈소판에서 ROS를 매개로 한 분자 수준의 조절 메커니즘은 많이 알려져 있지 않지만, 콜라겐 자극에 의해 생성된 ROS가 SH2 domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP-2)의 oxidative inactivation을 유도함으로써, 혈소판 활성화를 주도하는 주요 단백질의 tyrosine 인산화를 향상시켜, 결과적으로 혈소판 활성화 신호를 증폭시킨다는 메커니즘이 보고된 바 있다 (Jang, J.Y., et al., Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal, 2014. 20(16): p. 2528-40.).

하기 화학식 1의 화합물은 7-아자인돌 유도체로서 N-(1-이소프로필-3-(1-메틸인돌린-6-일)-1H-피롤[2,3-b]피리딘-4-일)-1-메틸-1H-피라졸-3-설폰아마이드의 화학명을 갖는 NOX의 억제제로, NOX-2를 타켓으로 개발된 small molecule이다. 현재까지 하기 화학식 1의 화합물이 실제로 항혈소판제로 사용될 수 있는지는 명확히 알려진 바 없다.

[화학식 1]

본 발명에서는 화학식 1의 화합물의 항혈소판 활성을 발견하여 혈전 생성 억제제로 이용가능한 치료제를 제공하고자 한다.

Jang, J.Y., et al., Reactive oxygen species play a critical role in collagen induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal, 2014. 20(16): p. 2528-40.

본 발명은 혈전성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 본 발명은 혈전 생성을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는 화학식 1의 화합물의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

일 실시태양에서, 상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 및 심부전증일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 ROS의 생성을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 SHP-2의 산화를 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화를 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 세포질 내(cytosolic) Ca²⁺의 농도를 감소시킴으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화를 유도함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃ 활성화를 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 혈소판의 응집을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항혈전제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한

a) 혈소판을 콜라겐 또는 콘불신(convulxin)으로 활성화시키는 단계;

b) 상기 활성화된 혈소판을 후보 화합물로 처리하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계에서 처리된 혈소판을 분석하여 하기를 확인하는 단계;

(i) ROS의 생성 억제;

(ii) SHP-2의 산화 억제;

(iii) PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소;

(v) NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화 유도; 및

(vi) P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃활성화의 억제

를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 혈소판 활성화의 억제를 통해 혈소판의 응집 및 부착을 방지함으로써 혈전 생성을 억제하여 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는다.

따라서 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 혈전 생성 억제제로 이용될 수 있다.

도 1은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 생성된 ROS의 농도에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 2 및 3은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 SHP-2의 oxidative inactivation에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 2는 산화된 SHP-2 및 SHP-2를 Immunoblot으로 확인한 결과이다.
도 3은 산화된 SHP-2를 측정한 결과를 대조군에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 4 및 5는 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 주요 신호전달 단백질인 PLCγ2, ERK5, p38MAPK의 특이적 티로신 인산화에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 4는 PLCγ2, ERK5, p38MAPK 및 이들의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과이다.
도 5는 PLCγ2, ERK5, 및 p38MAPK의 인산화 정도를 측정한 결과를 대조군에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 세포 내 Ca²⁺ 농도(cytosolic calcium level)의 중가에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 6은 화학식 1의 화합물의 농도별로 세포 내 Ca²⁺ 농도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다
도 7은 세포 내 Ca²⁺ 농도를 측정한 결과를 대조군에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 10은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 NO/cGMP/PKG 신호전달 경로에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 8은 VASP 및 이의 인산화된 형태를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 9는 DEA-NONOate를 함께 처리했을 경우 VASP 및 이의 인산화된 형태를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 10은 8pCPT-Cgmp를 함께 처리했을 경우 VASP 및 이의 인산화된 형태를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 11 내지 14는 convulxin으로 활성화된 혈소판에서 degranulation에 의존한 P-selectin의 표면 노출 및 integrin α_IIbβ₃의 활성화에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 11은 P-selectin의 노출 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 P-selectin의 노출 정도를 측정한 flow cytometry 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 integrin α_IIbβ₃의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 integrin α_IIbβ₃의 활성화 정도를 측정한 flow cytometry 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15 및 16은 콜라겐으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 15는 화학식 1의 화합물의 농도별로 탁도에 의한 빛 투과 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 화학식 1의 화합물의 농도에 따른 탁도에 의한 빛 투과 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17 및 18은 콜라겐으로 활성화된 혈소판의 부착능에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 17은 콜라겐에 부착된 혈소판을 나타낸 사진이다.
도 18은 혈소판이 콜라겐에 부착되어 덮인 표면적을 측정한 결과를 대조군에 대한 비율로 나타낸 그래프이다.
도 19는 NOX 억제를 통한 화학식 1의 화합물의 항혈소판 활성에 대한 작용 기전을 나타낸 모식도이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

본원에 사용된 용어 "혈전"은 혈관 속이나 심장 속에서 혈액 성분이 국소적(局所的)으로 응고해서 생기는 응어리로서, 혈소판(血小板), 피브린, 적혈구 및 백혈구를 포함하는 것을 의미한다.

상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 및 심부전증일 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 ROS의 생성을 억제하거나, SHP-2의 산화를 억제하거나, PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화를 억제하거나, 세포질 내(cytosolic) Ca²⁺의 농도를 감소시키거나, NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화를 유도하거나, P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃ 활성화를 억제하거나, 혈소판의 응집을 억제하거나, 또는 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 조성물은 또한 항혈전제를 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 (a) 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) 항혈전제를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 항혈전제는 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 (a) 화학식 1의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염; 및 (b) 항혈전제는 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명에서는, 콜라겐에 의해 증가된 ROS의 생성이 화학식 1의 화합물에 의해 억제되며, 그 결과, 콜라겐 수용체 신호 전달 경로에 대한 주요 구성 요소 (PLCγ2, ERK5 및 p38MAPK)의 활성화와 연관된 특이적 티로신 인산화가 억제됨을 최초로 밝혔다. 또한 본 발명의 화학식 1의 화합물은 세포질 칼슘 상승, P-selectin 표면 노출 및 Integrin α_IIbβ₃활성화를 포함하는 하위 단계의 세포 반응을 감소시켰다. 또한 본 발명의 화학식 1의 화합물은 NO/cGMP/PKG/VASP 인산화를 포함하는 일련의 항혈소판신호 전달계가 ROS에 의해 감소되는 것도 억제하였다.

보다 구체적으로, 본 발명에서는 실시예를 통해 화학식 1의 화합물이 하기와 같은 작용을 나타냄을 밝혔다.

(i) ROS의 생성 억제;

(ii) SHP-2의 산화 억제;

(iii) PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소;

(v) NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화 유도; 또는

(vi) P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃활성화의 억제.

이에 따라, 본 발명에서는 특정 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은

(i) ROS의 생성 억제;

(ii) SHP-2의 산화 억제;

(iii) PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소;

(vi) P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃활성화의 억제

를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 후보 화합물은 화학식 1의 화합물이다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액, 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 크림제, 겔제, 경고제, 드레싱제, 패취제, 스프레이 또는 주사제의 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물에 약제학적으로 허용 가능한 통상의 첨가제, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등이 더 포함될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

혈소판 분리

채혈 이전 10일 이내에 비타민, 영양제, 비스테로이드성 항염증제 또는 해열제 등의 약물을 복용하지 않은 건강한 사람으로부터 채혈한 전혈을 Acid Citrate Dextrose Solution (ACD: 22.0 g sodium citrate, 24.5 g dextrose, 7.3 g citric acid per 1 L)로 응고를 방지하였다. 채혈 후, 상온에서 150×g로 15 분 동안 원심분리하여 상층인 platelet rich plasma (PRP)를 얻었다. PRP를 300×g에서 10 분 동안 원심분리하여 얻은 침전을 Tyrode's buffer (10 mM HEPES [pH 7.4], 129 mM NaCl, 0.8 mM KH₂PO₄, 8.9 mM NaHCO₃, 2.8 mM KCl, 0.8 mM MgCl₂ and 5.6 mM glucose)에 추가로 2 mM EDTA, 10% ACD, 1 μM prostaglandin E1를 넣은 washing buffer로 세척 후, 300×g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 혈소판은 Tyrode's buffer에서 3x10⁸ platelets/mL 농도로 최종 재현탁시켜 사용하였다.

[실시예 2]

ROS 농도 분석

콜라겐 자극으로 활성화된 혈소판은 NOX를 활성화시켜 ROS를 생성하고, ROS는 혈소판의 활성화 신호전달에 중요 역할을 한다. ROS인 superoxide anion은 결국 H₂O₂로 전환되고, 전환된 H₂O₂가 세포 내 이차 신호전달자로 작용한다. 따라서 세포 외액의 H₂O₂농도를 측정함으로써 혈소판에서 발생하는 ROS 농도를 분석하여, 화학식 1의 화합물의 NOX 활성 억제 효과를 확인하고자 하였다.

Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 H₂O₂농도를 측정하였다. Amplex® Red는 H₂O₂ 또는 peroxidase 활성을 검출하기 위해 사용되는 one-step assay 시약으로, horseradish peroxidase (HRP)와 함께 세포 등의 생물학적 시료에서 방출되거나 효소 결합 반응에서 생성된 H₂O₂를 검출하는데 사용된다. 과량의 H₂O₂발생 시, Amplex® Red 시약과 1:1 stoichometry에 의하여 반응하며 적색 형광 산화 생성물인 resorufin을 생성한다.

washed platelet(WP)을 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물로 5 분간 전처리한 후, 1 mM의 CaCl₂와 2 분 동안 반응시켰다. 10 μg/mL의 콜라겐 (Chrono-Log)으로 자극하여 혈소판의 활성화를 유발시킨 후, 1:1의 비율의 Amplex® Red 및 HRP 혼합물과 상온에서 차광 상태로 10 분간 반응시켰다. 그 후, excitation 540 nm / emission 585 nm의 파장에서 형광 정도를 측정하였다.

측정된 결과로 ROS 농도를 분석한 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 혈소판에서 ROS 발생이 농도 의존적으로 억제되었다(도 1). 이를 통해 화학식 1의 화합물이 활성화된 혈소판에서 NOX의 활성을 억제함을 확인하였다.

[실시예 3]

SHP-2의 산화 분석

콜라겐 자극에 의해 생성된 ROS가 단백질 티로신 탈인산화효소(protein tyrosine phosphatase, PTP)인 SHP-2(SH2 domain-containing tyrosine phosphatase-2)의 oxidative inactivation을 유도함으로써, 혈소판 활성화를 주도하는 주요 단백질의 티로신 인산화를 향상시켜, 결과적으로 혈소판 활성화 신호를 증폭시킨다. 따라서 본 실시예에서는 SHP-2의 catalytic cysteine의 산화를 통한 oxidative inactivation이 화학식 1의 화합물에 의해 억제되는지 확인하고자 하였다.

washed platelet(WP)을 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물로 5 분간 전처리한 후 10 μg/mL의 콜라겐으로 처리하여 자극시켰다. 혈소판을 anoxic chamber (산소 1% 미만 조건; Thermo Forma) 내에서 100 mM iodoacetamide를 포함한 oxygen-free buffer (50 mM HEPES, pH 6.5, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM AEBSF, 1 μg/mL leupeptin and 1 μg/mL aprotinin)로 용해시켰다. 그 후, 세포의 debris를 제거하기 위해 4 ℃에서 10 분 동안 12,500×g로 원심분리하여 상층액에 있는 cell lysate를 얻었다. Cell lysate에서 산화된 SHP-2를 immunoprecipitation하기 위해 4 ℃에서 SHP-2 항체와 protein G-sepharose bead를 사용하였다. Cell lysis buffer로 bead를 3회 세척하여 과량의 iodoacetamide를 제거하였다. 산화된 SHP-2의 cysteine을 thiol (-SH)로 환원시키기 위하여 30 분 동안 상온에서 10 mM DTT와 반응시킨 후 20 mM HEPES (pH 7.4) buffer로 bead를 3회 세척하였다. 다시 sulfonic acid (-SO₃H)로 산화시키기 위하여 100 μM pervanadate와 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 과산화된 SHP-2 (SHP-2-SO₃H)는 anti-oxPTP 항체를 사용해 immunoblotting하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 혈소판에서 콜라겐 자극으로 유도된 SHP-2의 산화가 억제되었다(도 2 및 도 3). 이를 통해 화학식 1의 화합물이 콜라겐 자극으로 활성화된 혈소판에서 ROS 생성을 저해함으로써 SHP-2의 oxidative inactivation을 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 4]

신호전달 단백질들의 티로신 인산화 측정

콜라겐을 처리하면 혈소판에서 발생한 ROS가 SHP-2와 같은 PTP(protein tyrosine phosphatase)를 산화시켜 비활성화시키고, 혈소판 내 신호전달계는 세포 내의 다양한 단백질의 티로신 인산화가 오래 유지되면서 세포의 활성화를 촉진한다. 반대로 ROS 생성이 억제되면 PTP의 효소 활성이 유지되어 세포 내 단백질의 티로신 탈인산화가 유도된다. 따라서 위 신호전달경로의 하위단계인 PLCγ2의 753번 티로신 잔기, ERK5의 218번 트레오닌/220번 티로신 잔기, 및 p38MAPK의 180번 트레오닌/ 182번 티로신 잔기의 인산화 정도를 분석하여 화학식 1의 화합물의 혈소판의 활성화 억제 효과를 확인하고자 하였다.

ERK5는 ROS를 매개로 수용체-독립적, 수용체-의존적 메커니즘을 통해 혈소판의 활성화를 매개한다. p38MAPK는 과립방출의 유도 작용을 매개하는 mitogen-activated protein kinase(MAPK)들 중 하나이다.

washed platelet(WP)을 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물로 5 분간 전처리한 후, 1 mM의 CaCl₂와 2 분 동안 반응시킨 후 10 μg/mL의 콜라겐으로 자극하여 혈소판의 활성화를 유발시키고 immunoblotting 분석을 수행하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 혈소판에서 모든 단백질의 티로신 인산화가 감소하였다(도 4 및 도 5). 이를 통해 화학식 1의 화합물에 의하여 혈소판에서 ROS의 생성이 감소하여 SHP-2와 같은 PTP의 oxidative inactivation이 억제되고, PTP로 인해 신호전달 단백질의 티로신 탈인산화가 일어나는 것을 확인하였다.

[실시예 5]

세포질 내의 Ca ²⁺ 농도 측정

콜라겐이 혈소판 세포막 수용체인 GPVI에 결합하면 신호전달에 의해 PLCγ2의 활성이 증가하여 IP₃의 생성이 유도되고, 생성된 IP₃가 소포체 내의 IP₃수용체에 결합함으로써 Ca²⁺채널이 개방되어 세포 내 Ca²⁺(cytosolic calcium)의 농도가 증가하게 된다. 혈소판에서 Ca²⁺의 증가는 다양한 단계의 세포에 활성화에 관여한다. 즉, 혈소판의 형태 변화에 필수적인 actin cytoskeleton의 재배열화, degranulation 및 혈소판 응집에 관여하는 integrin α_IIbβ₃의 활성화 등을 증가시키는 이차 신호전달자 역할을 한다. 따라서 본 실시예에서는 세포 내 Ca²⁺의 농도를 측정하여 화학식 1의 화합물의 혈소판 활성화의 억제 효과를 확인하고자 하였다.

cytosolic Ca²⁺의 농도를 측정하기 위하여 Fluo-3 AM 염료를 사용하였다. Fluo-3 AM은 세포막 투과 후, 세포 내의 esterase에 의하여 Fluo-3으로 분해되며, Ca²⁺와 결합하는 성질을 가진다. washed platelet(WP) 1 mL의 phosphate buffered saline(PBS)에 현탁 후 10 μM 의 Fluo-3 AM 염료를 넣어주고 차광하여 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켰다. 이를 washing buffer로 세척한 후 Tyrode's buffer에 재현탁시켜 Fluo-3가 로딩된 혈소판을 37 ℃에서 5 분 동안 1,000 rpm으로 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물(DMSO 최종 농도 0.5 %)과 반응시켰다. 그 후, 1 mM CaCl₂와 2 분간 반응시키고 10 μg/mL의 콜라겐을 처리하여 혈소판을 활성화시켰다. 세포 내 Ca²⁺ 농도는 spectrofluorophotometer(Shimadzu)를 사용하여 fluorescence 488 nm excitation, 525 nm emission 파장으로 측정하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 혈소판의 cytosolic Ca²⁺ 농도가 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7).

[실시예 6]

NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화 측정

혈소판에서 nitric oxide/cyclic GMP/protein kinase G (NO/cGMP/PKG) 신호전달계는 혈소판의 활성화를 억제시키는 중요한 역할을 담당한다. 혈소판에서 nitric oxide (NO·) 및 PKG에 의해 vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)의 239번 serine 잔기의 인산화가 증가되면 integrin α_IIbβ₃의 활성화 억제, ligand인 피브리노겐 및 혈소판의 결합 억제, 이에 따른 혈소판의 응집능 억제와 같은 일련의 혈소판 활성화 억제 작용이 나타난다. 한편, 혈소판에서 증가된 ROS는 NO/cGMP/PKG 신호전달계를 억제하는 것으로 알려져있다. 콜라겐 자극으로 발생한 ROS인 superoxide anion (O2·-)과 nitric oxide (NO·)가 반응하여 peroxynitrite (ONOO-)를 생성하기 때문에 NO 농도가 급격히 감소되고 결과적으로 VASP의 인산화가 저하된다. 또한, ROS는 PKG의 활성을 직접적으로 억제시킨다는 보고도 있다. 따라서 화학식 1의 화합물이 콜라겐 자극을 받은 혈소판에서 생성된 ROS에 의해 NO/cGMP/PKG 신호전달계가 억제되는 것을 차단시켜 혈소판의 integrin α_IIbβ₃의 활성화 억제 및 혈소판의 응집능 억제에 기여할 것으로 기대된다. 본 실시예에서는 콜라겐 자극을 받은 혈소판을 화학식 1의 화합물로 처리시 VASP의 239번 serine 잔기의 인산화 정도를 분석하였다.

washed platelet(WP)을 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물로 5 분간 전처리한 후, 1 μM의 CaCl₂을 2 분 동안 처리한 후 10 μg/mL의 콜라겐으로 자극하여 혈소판의 활성화를 유발시켰다. 그 후, 항체로 anti-VASP-pS²³⁹(Cell Signaling Technology)를 사용하여 cell lysate를 immunoblotting하였다.

그 결과, 혈소판에서 높게 유지되던 VASP의 239번 serine 잔기의 인산화가 콜라겐 처리 후 매우 감소된 반면, 화학식 1의 화합물을 처리한 경우 VASP의 인산화는 농도 의존적으로 억제되었다(도 8).

한편, VASP의 인산화가 저하가 ROS에 의한 NO 농도의 감소 및 ROS에 의한 PKG 활성의 직접적 억제의 두가지 가능성에 의해 발생할 수 있으므로 상기 두가지 가능성을 검증하기 위한 추가적인 실험을 진행하였다.

화학식 1의 화합물 처리 후, NO donor인 DEA-NONOate (100 μM, Enzo)를 가해주거나, PKG를 직접 활성화시키는 cGMP 유사물질인 8pCPT-cGMP (5 μM, Enzo)를 첨가한 상태에서 10 분 동안 혈소판을 배양하고, 콜라겐을 처리한 후 VASP 인산화를 분석하였다.

그 결과, NO donor를 추가적으로 넣은 경우와 cGMP를 추가적으로 넣은 각각의 경우에 모두 화학식 1의 화합물만 처리한 군에 비하여 VASP의 인산화가 더 높게 유지되었다(도 9 및 도 10). 따라서 콜라겐 자극을 받은 혈소판에서 NOX 활성 증가로 인해 생성이 증가된 ROS는 NO의 농도를 감소시킬 뿐만 아니라 PKG의 활성을 억제시킴으로써 NO/cGMP/PKG 신호전달계를 억제하고, 화학식 1의 화합물은 NO/cGMP/PKG 신호전달계 억제를 차단하는 것을 확인하였다.

[실시예 7]

P-selectin의 노출 및 integrin α _IIb β ₃ 활성화 정도 측정

혈소판의 응집과 부착에 필수적인 P-selectin과 integrin α_IIbβ₃은 외부의 다양한 자극에 의해 활성화된다. 혈소판의 세포막 표면에 존재하는 integrin α_IIbβ₃는 혈소판이 자극을 받으면 conformational change를 거쳐 ligand인 피브리노겐에 대한 affinity가 증가되는 형태로 활성화된다. 이렇게 활성화된 integrin α_IIbβ₃가 피브리노겐과 결합되면서 혈소판들 간의 bridge 형성이 증가되어 혈소판의 응집 반응을 촉진하게 된다. 또한 P-selectin은 혈소판의 alpha granule에 다량 함유되어 있다가 활성화된 혈소판의 degranulation으로 세포막에 노출되어 혈관 내피세포 또는 백혈구들에 존재하는 P-selectin glycoprotein ligand-1에 결합함으로써 혈소판과 면역 세포들 간의 결합을 매개하는 작용을 한다. 따라서 혈소판에서의 integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 P-selectin의 노출은 혈소판 활성화의 중요한 지표가 되므로, 본 실시예에서는 활성화된 integrin α_IIbβ₃및 세포막에 노출된 P-selectin를 측정하고자 하였다.

노출된 P-selectin 및 활성화된 integrin α_IIbβ를 확인하기 위하여 항체와 결합시켜 flow cytometry로 분석하였다. 콜라겐은 cross-linking 결합으로 인해 혈소판의 응집을 과도하게 유발하기 때문에, single cell level로 검출하여 분석하는 flow cytometry에 적합하지 않으므로, 콜라겐 대신 콜라겐 수용체 GPVI에 특이적으로 작용하는 convulxin (CVX, Alexis)을 사용하였다. 항체로는 활성화된 integrin α_IIbβ₃를 확인할 수 있는 PAC-1-FITC (BD Biosciences) 또는 P-selectin 지표로 사용되는 anti-PE-CD62P (BD Biosciences)를 이용하였다. washed platelet(WP)에 화학식 1의 화합물을 전처리한 후, Convulxin (100 ng/mL)으로 자극하고, P-selectin에 특이적인 PAC-1-FITC (0.5 μg/mL) 또는 integrin α_IIbβ₃에 특이적인 PE-CD62P (0.5 μg/mL)와 함께 5분 간 어두운 곳에서 반응시켰다. PBS를 사용하여 반응을 정지시켰다. FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson)를 시료 당 최소 5 × 10⁴ 세포로 모든 분석에 사용하였다. 혈소판의 integrin α_IIbβ₃의 활성 및 P-selectin 표면 발현은 각각 530 nm (FL1) 및 585 nm (FL2)에서 측정되었다. 형광의 상대적인 변화는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물이 처리된 혈소판에서는 혈소판 표면의 P-selectin과 활성형의 integrin α_IIbβ₃의 발현이 감소되었다(도 11 내지 도 14).

[실시예 8]

혈소판의 응집능 측정

콜라겐 자극으로 활성화된 혈소판에서 신호전달에 의해 α-granule에 존재하던 P-selectin이 세포막으로 노출되고 면역 세포에 존재하는 P-selectin ligand와 결합을 이뤄 혈소판의 응집이 일어난다. 또한 integrin α_IIbβ₃의 구조가 변화되어 피브리노겐과 결합하여 다른 혈소판 사이의 bridge를 형성하게 되면서 혈소판의 응집 반응을 유발한다. 따라서 본 실시예에서는 화학식 1의 화합물의 활성화된 혈소판의 응집능 억제 효과를 확인하기 위하여 혈소판의 응집 정도를 측정하였다.

turbidomertric method (Born, G.V., Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature, 1962. 194: p. 927-9.)에 의하여 탁도에 의한 빛 투과 정도의 변화를 측정하였고, CHRONO-LOG 4-channel aggregometer (Chrono-log Corp, USA)를 이용하였다. washed platelet(WP)를 실리콘이 코팅된 cuvette에 담아 aggregometer에서 37 ℃, 1,000 rpm으로 교반시키면서 실험하였다. 0.35 % BSA가 들어있는 Tyrode's buffer를 대조하여 혈소판에 DMSO에 녹인 화학식 1의 화합물(DMSO 최종 농도 0.5%)을 농도 별로(1~30 μM) 5 분간 전처리 후 1 mM CaCl₂와 2 분 동안 반응시켰다. 10 μg/mL 콜라겐으로 자극하여 혈소판의 응집을 유발시킨 후 탁도에 의한 빛 투과 정도를 측정하였다. 데이터는 Chrono-log "Aggrolink" software를 사용해 수집하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물에 의해 농도 의존적으로 응집이 감소되었고, IC₅₀ 값은 약 6.75 ± 0.9 μM 으로 산출되었다(도 15 및 도 16). 이로부터, 화학식 1의 화합물이 콜라겐으로 유발된 응집을 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 9]

혈소판의 부착능 측정

혈관 손상 부위의 혈전 형성에 앞서 일반적으로 세포 외 기질에 대한 유동 저항성으로 인해 콜라겐에의 혈소판 부착이 선행된다. 따라서, 본 실시예에서는 화학식 1의 화합물이 활성화된 혈소판의 부착능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 혈소판이 덮인 표면적을 측정하였다.

콜라겐이 코팅된 coverslip (Neuvitro)을 flow chamber (Chamlide CF; Live Cell Instruments)에 부착하였다. washed platelet(WP)를 10 또는 30 μM의 화학식 1의 화합물로 37 ℃에서 5분간 처리한 후 CaCl₂와 2분 동안 반응시켰다. 혈소판(1 x 10⁹ platelets/mL)을 1 μM 형광 염료 DiOC₆ (Sigma-Aldrich)와 함께 37 ℃에서 10분 간 반응시킨 후 syringe pump (Harvard Apparatus)를 사용하여 1,000 s^-1 의 전단속도로 형광 표지된 혈소판을 관류시켰다. Chamber 내의 부착되지 않은 혈소판은 Tyrode's buffer로 세척하였다. 부착된 혈소판을 차가운 4% paraformaldehyde로 15 분간 고정시킨 후 Tyrode's buffer로 세척하였다. 콜라겐에 부착된 혈소판을 Nikon A1R laser scanning confocal microscope을 사용하여 40× 배율로 시각화하여 확인하였다. Thrombin에 의한 flow chamber 표면 범위는 ImageJ software를 사용하여 계산하였다.

화학식 1의 화합물을 처리한 경우 혈소판이 덮인 표면적이 감소하였다(도 17 및 도 18). 이로써 화학식 1의 화합물이 콜라겐에 대한 혈소판의 부착을 억제할 수 있음을 확인하였다.

위 실시예들로부터 본 발명의 화학식 1의 화합물은 NOX2 억제제로서 혈소판이 활성화될 때 ROS 생성 억제를 통해 항혈소판 활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로 화학식 1의 화합물은 (ⅰ) ROS가 매개하는 산화환원 신호전달계, 특히 콜라겐 수용체 신호 전달 경로에 대한 주요 구성 요소 (PLCγ2, ERK5 및 p38MAPK)의 활성화와 연관된 특이적 tyrosine 인산화를 억제, (ⅱ) ROS에 의한 NO/cGMP/PKG/VASP 인산화를 포함하는 일련의 항혈소판 신호전달계의 저해를 차단하는 작용 기전에 따라 항혈소판 활성을 나타낸다(도 19). 또한, 세포질 칼슘 상승, P-selectin surface exposure 및 integrin α_IIbβ₃ 활성화를 포함하는 하위 단계의 활성화 과정들을 억제함으로써 콜라겐에 의한 혈소판의 응집 및 부착 반응을 차단한다. 결국, 본 발명의 NOX2 억제제로서의 화학식 1의 화합물은 우수한 항혈소판제로 개발될 수 있다.

[참고예]

Immunoblotting의 실험방법

시료를 cell extraction buffer (20 mM HEPES [pH 7.0] 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 20 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM AEBSF, 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL aprotinin)로 용해시키고, 4 ℃에서 12,500×g으로 10 분간 원심 분리하여 상층액에 있는 cell lysate를 얻었다. 각각의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 상기 cell lystes에 대해 immunoblotting 분석을 수행하였다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 및 심부전증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 ROS의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 SHP-2의 산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포질 내(cytosolic) Ca²⁺의 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항혈전제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
a) 혈소판을 콜라겐 또는 콘불신(convulxin)으로 활성화시키는 단계;
b) 상기 활성화된 혈소판을 후보 화합물로 처리하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 처리된 혈소판을 분석하여 하기를 확인하는 단계;
(i) ROS의 생성 억제;
(ii) SHP-2의 산화 억제;
(iii) PLCγ2, ERK5, 또는 p38MAPK의 인산화 억제;
(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소;
(v) NO/cGMP/PKG 신호전달계의 활성화를 통해 VASP의 인산화 유도; 및
(vi) P-selectin의 노출 또는 integrin α_IIbβ₃활성화의 억제
를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.