KR20210077698A - 저분자 화합물에 의한 내배엽 조직 또는 기관 유래 세포로부터의 줄기/전구 세포의 제작 방법 - Google Patents

저분자 화합물에 의한 내배엽 조직 또는 기관 유래 세포로부터의 줄기/전구 세포의 제작 방법 Download PDF

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Abstract

포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 제작하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 TGFβ 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 방법.

Description

저분자 화합물에 의한 내배엽 조직 또는 기관 유래 세포로부터의 줄기/전구 세포의 제작 방법
본 발명은, 저분자 화합물에 의한 내배엽 조직 또는 기관 유래 세포로부터의 줄기(幹)/전구 세포의 제작 방법에 관한 것으로, 특히, 저분자 화합물에 의한 성숙 췌외분비 세포로부터의 췌장 줄기 (膵幹)/전구 세포의 제작 방법, 및 당해 저분자 화합물을 함유하여 이루어지는 성숙 췌외분비 세포로부터의 췌장 줄기/전구 세포 유도제 등에 관한 것이다.
줄기 세포 생물학의 진보는, 재생 의료에 있어서의 그 응용에 대한 큰 관심을 부르고 있지만, 아직 그 실현에는 이르지 못하였다. 가장 기대되는 세포 소스 중 하나인 인공 다능성 줄기 (幹) 세포 (iPS 세포) 는 종양 형성 리스크가 여전히 존재하여, 실임상에 대한 응용의 목표는 수립되어 있지 않다 (Cell. 2014 Oct 9 ; 159 (2) : 428-39) (Cell Metab. 2016 Apr 12 ; 23 (4) : 622-634.). 한편, 최근의 연구에 의해, 상이한 계보의 세포를 전구 세포형의 세포로 직접 전환 (다이렉트 리프로그래밍) 할 수 있는 것이 나타났지만, 다이렉트 리프로그래밍은, iPS 세포의 경우와 마찬가지로, 유전자 개변을 수반하기 때문에, 예기치 못한 리스크가 여전히 존재하여, 재생 의료에 응용하지 못하고 있다 (Nat Commun. 2016 Jan 6 ; 7 : 10080.) (Cell Stem Cell. 2016 Mar 3 ; 18(3) : 410-21.) (Nat Biotechnol. 2014 Dec ; 32 (12) : 1223-30.).
최근, 췌장이 상해를 입으면, 성체 췌외분비 세포로부터 증식성과 양능성의 췌장 줄기/전구 세포를 단리할 수 있다는 놀랄만한 발견이 보고되었다 (EMBO J. 2013 Oct 16 ; 32 (20) : 2708-21.). 이러한 혁신적인 발견은, 췌장 줄기 세포 이론뿐만 아니라, 췌 재생 연구에도 커다란 통찰을 주는 것이다. 즉, 이와 같은 리프로그래밍을 인비트로에서 재현할 수 있으면, 그렇게 해서 얻어지는 줄기/전구 세포는, 재생 의료에 있어서의 새로운 세포 소스가 될 것으로 기대된다.
그러나, 유전자 개변을 수반하지 않고, 성숙 세포를 줄기/전구 세포로 리프로그램하는 방법은 전혀 알려져 있지 않다.
본 발명자들이나 다른 그룹은 이전에, 어떤 종류의 저분자 저해약의 조합이, 줄기 세포의 다능성의 유도 및 유지에 기여하는 것을 보고하였다 (Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Aug 10 ; 107 (32) : 14223-8.) (Cell Stem Cell. 2017 Jan 5 ; 20 (1) : 41-55) (Cell Stem Cell. 2016 Oct 6 ; 19 (4) : 449-461).
또 본 발명자는, 저분자 화합물에 의한 성숙 간 (肝) 세포로부터 간 줄기 (肝幹)/전구 세포를 제작하는 것에 성공하였다 (WO2017/119512).
그러나, 이들 저분자 저해약의, 간세포 이외에 대한 성숙 세포로부터 줄기/전구 세포로의 리프로그래밍에 대한 기여에 관한 보고는 전무하다.
국제 공개 2017/119512호 팸플릿
Cell. 2014 Oct 9 ; 159 (2) : 428-39 Cell Metab. 2016 Apr 12 ; 23 (4) : 622-634. Nat Commun. 2016 Jan 6 ; 7 : 10080. Cell Stem Cell. 2016 Mar 3 ; 18 (3) : 410-21. Nat Biotechnol. 2014 Dec ; 32 (12) : 1223-30. EMBO J. 2013 Oct 16 ; 32 (20) : 2708-21. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Aug 10 ; 107 (32) : 14223-8. Cell Stem Cell. 2017 Jan 5 ; 20 (1) : 41-55 Cell Stem Cell. 2016 Oct 6 ; 19 (4) : 449-461
본 발명의 목적은, 유전자 개변을 수반하지 않고, 성숙 세포를 줄기/전구 세포로 효율적으로 리프로그램하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기한 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, TGFβ 수용체 저해약, 글리코겐 합성 효소 키나아제 3 (GSK3) 저해약, 및 Rho 키나아제 (ROCK) 저해약의 존재 하에서 포유 동물의 성숙 세포 (예를 들어 성숙 췌외분비 세포) 를 배양하면, 췌외분비 세포를, 증식성으로 또한 췌내분비 세포로 분화할 수 있는 세포로 리프로그램할 수 있는 것을 알아냈다. 이와 같이 하여 얻어진 성숙 췌외분비 세포 유래의 췌장 줄기/전구 세포는, 당뇨병 모델 마우스에 이식하면, 성숙 췌내분비 세포로서 생착할 수 있는 것을 나타냈다.
본 발명자들은, 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 제작하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 TGFβ 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 방법.
(2) 추가로, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 방법.
(3) 추가로, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, (1) 에 기재된 방법.
(4) 내배엽 조직 또는 기관이, 소화관, 폐, 갑상선, 췌장, 분비선, 복막, 흉막, 후두, 이관, 기관, 기관지, 방광, 요도 또는 요관인, (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(5) 내배엽 조직 또는 기관이 췌장인 (1) ∼ (4) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(6) 췌장 유래의 세포가 췌외분비 세포인 (5) 에 기재된 방법.
(7) 상기 췌외분비 세포와 상기 TGFβ 수용체 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재 하에서 그 췌외분비 세포를 배양함으로써 실시되는, (6) 에 기재된 방법.
(8) 상기 췌외분비 세포와 상기 GSK3 저해약 및/또는 상기 ROCK 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재 하에서 그 췌외분비 세포를 배양함으로써 실시되는, (6) 또는 (7) 에 기재된 방법.
(9) 포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스인, (1) ∼ (8) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(10) 이하의 특징을 갖는 포유 동물의 췌외분비 세포 유래의 췌장 줄기/전구 세포.
(a) 자기 재생능을 갖는다
(b) 췌내분비 세포로 분화할 수 있다
(c) Pdx1 및 Nkx6.1 을 발현하지만, 인슐린을 발현하지 않는다
(11) TGFβ 수용체 저해약을 포함하는, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터 당해 세포의 줄기/전구 세포로의 유도제.
(12) GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약의 조합을 추가로 포함하는, (11) 에 기재된 유도제.
(13) GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 조합을 추가로 포함하는, (11) 에 기재된 유도제.
(14) 내배엽 조직 또는 기관이, 소화관, 폐, 갑상선, 췌장, 분비선, 복막, 흉막, 후두, 이관, 기관, 기관지, 방광, 요도 또는 요관인, (11) ∼ (13) 중 어느 한 항에 기재된 유도제.
(15) 내배엽 조직 또는 기관이 췌장인 (11) ∼ (13) 중 어느 한 항에 기재된 유도제.
(16) 췌장 유래의 세포가 췌외분비 세포인 (15) 에 기재된 유도제.
(17) 포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스 유래인, (11) ∼ (16) 중 어느 한 항에 기재된 유도제.
(18) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포의 유지 또는 증폭제로서 사용되는, (11) ∼ (17) 중 어느 한 항에 기재된 유도제.
(19) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포의 유지 또는 증폭 방법으로서, 콜라겐 또는 마트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서, 당해 줄기/전구 세포 또는 췌장 줄기/전구 세포를 계대 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
(20) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포로부터, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포, 또는 췌외분비 세포로 유도하는 방법으로서, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서 상기 줄기/전구 세포, 또는 췌장 줄기/전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
(21) 피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법으로서,
(i) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
(ii) 상기 세포에 있어서의 피검 화합물의 대사를 측정하는 공정
을 포함하는, 방법.
(22) 세포가 분비하는 효소의 분비 유도 물질의 스크리닝 방법으로서,
(i) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 유도된 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
(ii) 상기 세포에 있어서 분비된 물질을 측정하는 공정,
을 포함하는, 상기 방법.
(23) 포유 동물에 대한 피검 화합물의 내배엽 조직 또는 기관 독성을 평가하는 방법으로서,
(i) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
(ii) 피검 화합물과 접촉한 세포에 있어서의 장해의 유무 또는 그 정도를 측정하는 공정
을 포함하는, 상기 방법.
(24) (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포를 포함하는, 내배엽 조직 또는 기관 장해 개선제.
(25) 포유 동물에 있어서의 내배엽 조직 또는 기관 장해의 개선 방법으로서, 당해 조직 또는 기관 장해를 갖는 포유 동물에, (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 유도된 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 방법.
(26) 내배엽 조직 또는 기관 장해 개선제로서 사용하기 위한, (1) ∼ (9) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, (10) 에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 (20) 에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포.
본 발명에 의하면, 유전자 개변을 수반하지 않고, 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 로부터, 자기 복제능과 췌내분비 세포로의 분화능 (양능성) 을 갖는 췌장 줄기/전구 세포를, 안전하고 신속하게 유도할 수 있다.
도 1 은, 췌 전구 세포 유도시에 있어서의 세포 형태의 변화를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 췌 전구 세포 유도시에 있어서의 췌 전구 세포 마커 mRNA 발현의 변화 (마우스) 를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 초회 계대 후에 있어서의 췌 전구 세포 마커 mRNA 발현 (래트) 을 나타내는 도면이다.
도 4 는, 인슐린 분비 세포 클러스터를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 인슐린 분비 세포 클러스터에 있어서의 β 세포 마커 분자 mRNA 와 C 펩티드 분비를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 인슐린 및 GLUT2 의 mRNA 발현을 나타내는 도면이다.
도 7 은, 췌내분비 세포의 글루코오스 농도 응답성을 나타내는 도면이다.
도 8 은, 초회 계대 후에 있어서의 췌 전구 세포 마커 mRNA 발현을 나타내는 도면이다.
도 9 는, In vivo 에서의 당뇨병 환경에 있어서의 이식 세포의 조직 이미지이다.
1. 개요
본 발명은, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 제작하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 TGFβ 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
상기와 같이, 저분자 화합물을 사용하여, 성숙 간세포로부터 간 줄기(肝幹)/전구 세포를 제작하는 방법은, 본 발명자로 인해 성공하였다 (WO2017/119512). 그러나, 간세포 이외의 내배엽 기관 또는 조직에 대해서는, 성숙 세포로부터 줄기 세포 또는 전구 세포 (이하 「줄기/전구 세포」라고 한다) 로 리프로그래밍할 수 있는지의 여부는 불명확하다.
본 발명자는, 간 (肝) 세포 이외의 세포로서 췌장을 사용하여, 저분자 화합물에 의해 췌장 줄기 세포 또는 췌 전구 세포 (이하 「췌장 줄기/전구 세포」라고 한다) 로 리프로그래밍하는 것에 성공하였다.
본 명세서에 있어서, 「줄기 (幹) 세포」란, 자기 복제능과, 여러 가지 세포로 분화하는 다분화능을 갖는 세포를 의미하고, 「전구 세포」란, 줄기 세포로부터 발생하여, 몸을 구성하는 특정한 최종 분화 세포로 분화하는 중간 단계에 있는 세포를 의미한다. 본 명세서에서는, 줄기 세포 또는 전구 세포를 총칭하여, 「줄기 (幹)/전구 세포」라고 부르고, 리프로그래밍의 대상이 된 세포가 췌장 세포이면 「췌장 줄기 (膵幹)/전구 세포」로 표시한다.
본 발명에 있어서, 「내배엽」이란, 후생 동물의 발생 도중에 발생하는 3 배엽의 하나이며, 발생학적으로는, 원장 (原腸) 형성의 시기 (낭배기) 에 원장벽의 전부 또는 일부를 구성한다. 내배엽은, 소화관의 주요 부분과 그 부속선 (간장·췌장), 갑상선, 폐 등의 호흡 기관에 발달한다.
본 발명에 있어서, 「내배엽 조직 또는 기관」으로는, 예를 들어 소화관 (식도, 위, 소장, 대장), 폐, 췌장, 갑상선, 부갑상선, 후두, 기관, 기관지, 방광, 요도, 전립선 등이다 (단, 간장은 제외한다).
그런데, 간장에는 2,000 종류 이상의 효소가 존재하고, 여러 가지 물질을 화학적으로 바꾸어 만드는 대사 반응이 끊임 없이 영위되고 있다. 이것이, 간장이 「생체의 화학 공장」이라고 일컬어지는 까닭이며, 예를 들어 인슐린이라는 단일의 호르몬 물질을 만드는 기능 밖에 갖지 않는 췌장의 베타 세포나, 내배엽에 속하는 일련의 소화기계 세포 등 간장 이외의 내배엽 조직과는 크게 상이하다. 간장은 체내에서 가장 재생 능력이 높은 세포, 장기이며, 간장과 기타 내배엽 조직에서 리프로그래밍의 난도를 비교한 경우, 간장 이외의 내배엽 조직의 리프로그래밍이, 대폭 난도가 높다. 즉, 성숙 세포로 분화를 이룬 내배엽 유래 세포는, 증식능이나 대사능, 액성 인자의 분비능 등에 있어서 각 장기에 따라 고유의 특징을 가지고 있고, 성숙 간세포에 있어서 알아낸 현상이, 성숙 간세포 특이적인 현상인지, 혹은 내배엽 유래 성숙 세포에 있어서 보편적인 현상인지는 지금까지 미지였다.
본 발명은, 간장 이외의 내배엽 조직 또는 기관에 대해서도, 성숙 세포로부터 줄기/전구 세포로 리프로그래밍할 수 있는 것을 알아냈다.
본 발명은, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포에, TGFβ 수용체 저해약을, 인비트로에서 접촉시키는 것을 특징으로 하지만, 글리코겐 합성 효소 키나아제 3 (GSK3) 저해약 및 Rho 키나아제 (ROCK) 저해약 중 어느 일방 또는 양자를, TGFβ 수용체 저해약과 함께 접촉시키는 것도 포함한다. 이로써, 내배엽 조직 또는 기관 유래의 성숙 세포로부터, 당해 내배엽 조직 또는 기관의 줄기/전구 세포를 제작할 수 있다. 본 발명의 방법을, 「본 발명의 리프로그래밍법」이라고도 한다.
2. 성숙 세포로부터의 줄기/전구 세포의 유도
본 발명은, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 제작하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 TGFβ 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 성숙 췌외분비 세포로부터의 췌장 줄기/전구 세포를 제작 또는 유도하려면, 포유 동물의 췌외분비 세포에, TGFβ 수용체 저해약, 글리코겐 합성 효소 키나아제 3 (GSK3) 저해약, 및 Rho 키나아제 (ROCK) 저해약을 함유하는 저분자 시그널 전달 경로 저해약을, 인비트로에서 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 리프로그래밍법의 출발 재료로서 사용되는 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포 (「성숙 세포」라고도 한다) 로는, 예를 들어, 소화관 상피 세포, 폐포 상피 세포, 췌실질 세포, 갑상선 여포 상피 세포, 요로 상피 세포, 전립선 상피 세포를 들 수 있다. 출발 재료로서 췌실질 세포를 사용하는 경우에는, 췌외분비 세포, 췌내분비 세포 등을 사용할 수 있다. 「췌외분비 세포」는, 선방 세포와 췌관 세포로 분류되고, 어느 일방 또는 양자가 췌장 줄기/전구 세포의 시원 (始源) 이 되는 것으로 생각된다. 또, 「췌내분비 세포」는 α 세포, β 세포, δ 세포, ε 세포, PP 세포로 분류되고, 언젠가는 모두가 췌장 줄기/전구 세포의 시원이 되는 것으로 생각된다.
본 발명의 리프로그래밍법에 사용하는 세포는, 어떠한 소스로부터 제공되어도 되고, 예를 들어, 포유 동물 (예를 들어, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 말, 돼지, 소, 원숭이 등, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스) 의 배성 줄기 세포 (ES 세포) 혹은 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있다.
그러나, 유전자 개변을 수반하지 않는 줄기/전구 세포를 안전하고 신속하게 제공한다는 본 발명의 주된 과제를 고려하면, 예를 들어 췌외분비 세포를 사용하는 경우에는, 포유 동물로부터 적출한 췌장으로부터 단리 정제된 췌외분비 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
예를 들어 래트의 경우, 10 - 20 주령의 성체 래트로부터 적출한 췌장을 사용하는 것이 바람직하지만, 2 개월령 이하의 유약 (幼若) 래트 유래의 췌장을 사용해도 된다. 인간의 경우, 생검 또는 외과 수술에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 췌실질, 소화관 상피, 폐포 상피, 전립선 상피 등 모두 생검에 의해 채취할 수 있다. 외과 수술의 경우에는, 절제한 성인의 췌장 조직편을 사용할 수도 있고, 사망 태아로부터 절제한 췌장을 사용할 수도 있다. 혹은, 이들 적출한 췌장으로부터 단리 정제된 췌외분비 세포를 동결시킨 세포 (동결 췌외분비 세포) 를 사용할 수도 있다.
포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포를 정제하려면, 조직을 단리한 후, 효소 처리한 후, 여과, 원심 분리 등에 의해 정제한다.
포유 동물의 췌장 또는 그 조직편으로부터 췌외분비 세포를 정제하는 방법으로는, 췌조직을 단리한 후, 콜라게나아제로 췌장을 소화하고, 여과, 원심 등에 의해 랑게르한스섬이나 비실질 세포, 세포편을 제거하여 췌외분비 세포를 정제한다.
상기와 같이 하여 조제된 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 에, TGFβ 수용체 저해약을 함유하는 1 이상의 저분자 시그널 전달 경로 저해약을, 인비트로에서 접촉시킨다.
본 발명에 사용되는 TGFβ 수용체 저해약으로는, 트랜스포밍 증식 인자 (TGF) β 수용체의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘, 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카르바모일-1H-피라졸 (A-83-01), 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)프테리딘-4-일)피리딘-4-일아민 (SD-208), 3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)]-1H-피라졸, 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프틸리딘 (이상, 머크사), SB431542 (Sigma Aldrich 사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 A-83-01 을 들 수 있다. TGFβ 수용체 저해약에는, TGFβ 수용체 안타고니스트도 포함된다.
이들 TGFβ 수용체 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.
TGFβ 수용체 저해약 이외의 저분자 시그널 전달 경로 저해약으로는, 바람직하게는 GSK3 저해약과 ROCK 저해약을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 GSK3 저해약으로는, 글리코겐 합성 효소 키나아제 (GSK) 3 의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, SB216763 (Selleck 사), CHIR98014, CHIR99021 (이상, Axon medchem 사), SB415286 (Tocris Bioscience 사), 켄파울론 (Kenpaullone, 코스모·바이오사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 CHIR99021 을 들 수 있다.
이들 GSK3 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.
본 발명에 사용되는 ROCK 저해약으로는, Rho 결합 키나아제의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. ROCK 저해약으로는, 예를 들어, GSK269962A (Axon medchem 사), 파스딜 하이드로클로라이드 (Fasudil hydrochloride, Tocris Bioscience 사), Y-27632, H-1152 (이상, 와코 순약 공업사) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Y-27632 를 들 수 있다.
이들 ROCK 저해약은, 1 종의 화합물을 사용해도 되고, 2 종 이상의 화합물을 조합하여 사용해도 된다.
GSK3 저해약과 ROCK 저해약은, 각각 단독으로 또는 양자를 조합하여 TGFβ 수용체 저해약과 함께 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 에 접촉시키면, TGFβ 수용체 저해약만을 접촉시킨 경우와 비교하여, 줄기/전구 세포의 유도 효율 (「리프로그래밍 효율」이라고도 한다) 이 현저하게 상승한다. 따라서, 본 발명의 리프로그래밍법에 있어서는, TGFβ 수용체 저해약에 더하여, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을 추가로 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 에 접촉시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, TGFβ 수용체 저해약과 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약의 조합을 이하에 나타낸다.
(a) TGFβ 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 와, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 의 조합 (AC).
(b) TGFβ 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 와, ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 의 조합 (YA).
(c) TGFβ 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 와, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 및 ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 의 조합 (YAC).
TGFβ 수용체 저해약에 GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을 조합하여 사용한 경우, TGFβ 수용체 저해약과 GSK3 저해약을 조합하여 사용한 경우와 비교하여, 리프로그래밍 효과에는 큰 차이는 확인되지 않지만, 전자가, 후자에 비해, 얻어지는 줄기/전구 세포의 증식능이 우수하다. 따라서, 본 발명의 실시양태에 있어서는, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 조합을, 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 에 접촉시키는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 리프로그래밍법에 있어서는, GSK3 저해약, ROCK 저해약 이외의 저분자 시그널 전달 경로 저해약을 TGFβ 수용체 저해약과 조합할 수도 있다. 그러한 저해약으로는, 예를 들어 MEK 저해약 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. MEK 저해약으로는, MEK (MAP kinase-ERK kinase) 의 기능을 저해하는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, AZD6244, CI-1040 (PD184352), PD0325901, RDEA119 (BAY86-9766), SL327, U0126-EtOH (이상, Selleck 사), PD98059, U0124, U0125 (이상, 코스모·바이오사) 등을 들 수 있다.
본 발명의 리프로그래밍법에 있어서, 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 와 TGFβ 수용체 저해약을 포함하는 저분자 시그널 전달 경로 저해약의 접촉은, 이들 저해약의 존재 하에서 성숙 세포를 배양함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는, 배지 중에 유효한 농도로 이들 저해약을 첨가하여 배양을 실시한다. 여기서 배지로는, 넓게 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 이용할 수 있다. 시판되고 있는 기초 배지를 이용해도 되고, 그것들로는, 예를 들어, 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코 개변 최소 필수 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, Ham's F12 배지, William's E 배지 등을 들 수 있고, 이것들을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있지만, 이것들에 특별히 한정되지 않는다.
배지로의 첨가제로는, 예를 들어, 각종 아미노산 (예를 들어, L-글루타민, L-프롤린 등), 각종 무기염 (아셀렌산염, NaHCO3 등), 각종 비타민 (니코틴아미드, 아스코르브산 유도체 등), 각종 항생 물질 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등), 항진균제 (예를 들어, 암포테리신 등), 완충제 (HEPES 등) 등을 들 수 있다.
또, 배지에는, 5 - 20 ％ 의 혈청 (FBS 등) 을 첨가할 수도 있지만, 무혈청 배지여도 된다. 무혈청 배지의 경우, 혈청 대체물 (BSA, HAS, KSR 등) 을 첨가해도 된다. 또한, 통상적으로, 증식 인자, 사이토카인, 호르몬 등의 인자가 첨가된다. 이들 인자로는, 예를 들어 상피 증식 인자 (EGF), 인슐린, 트랜스페린, 하이드로코르티손 21-헤미숙신산 또는 그 염, 덱사메타손 (Dex) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.
TGFβ 수용체 저해약의 배지로의 첨가 농도는, 예를 들어, 0.01 - 10 μM, 바람직하게는 0.1 - 1 μM 의 범위에서 적절히 선택될 수 있다.
GSK3 저해약의 배지로의 첨가 농도는, 예를 들어, 0.01 - 100 μM, 바람직하게는 1 - 10 μM 의 범위에서 적절히 선택될 수 있다.
ROCK 저해약의 배지로의 첨가 농도는, 예를 들어, 0.0001 - 500 μM, 바람직하게는 1 - 50 μM 의 범위에서 적절히 선택될 수 있다.
이들 저해약이 수불용성 또는 수난용성의 화합물인 경우, 소량의 저독성의 유기 용매 (예를 들어, DMSO 등) 에 용해시킨 후, 상기한 최종 농도가 되도록 배지에 첨가할 수 있다.
배양에 사용되는 배양 용기는, 접착 배양에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디시, 페트리 디시, 조직 배양용 디시, 멀티 디시, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 등을 들 수 있다. 배양 용기는, 세포의 부유 배양을 실시하기 위해서 세포를 접착할 수 없도록 표면이 가공된 배양 용기를 사용할 수 있다. 혹은, 접착 배양의 경우에는, 내표면이, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적에서 세포 지지용 기질에 의해 코팅된 것을 사용할 수 있다. 그러한 세포 지지용 기질로는, 예를 들어, 콜라겐, 젤라틴, 마트리겔, 폴리-L-리신, 라미닌, 피브로넥틴 등을 들 수 있다. 바람직하게는 콜라겐 또는 마트리겔을 들 수 있다.
성숙 세포는, 102 ∼ 106 세포/㎠, 바람직하게는 103 ∼ 105 세포/㎠ 의 세포 밀도로 배양 용기 상에 파종할 수 있다.
췌외분비 세포의 경우에도, 102 ∼ 106 세포/㎠, 바람직하게는 103 ∼ 105 세포/㎠ 의 세포 밀도로 배양 용기 상에 파종할 수 있다. 배양은, CO2 인큐베이터 중, 1 - 10 ％, 바람직하게는 2 - 5 ％, 보다 바람직하게는 약 5 ％ 의 CO2 농도의 분위기 하에서, 30 - 40 ℃, 바람직하게는 35 - 37.5 ℃, 보다 바람직하게는 약 37 ℃ 에서 실시할 수 있다. 배양 기간으로는, 예를 들어 1 - 4 주일, 바람직하게는 1 - 3 주일을 들 수 있다. 1 - 3 일마다 신선한 배지로 교환한다.
상기와 같이 하여, 성숙 세포 (췌외분비 세포) 를 TGFβ 수용체 저해약, 그리고 임의로 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약에 접촉시킴으로써, 성숙 세포 줄기/전구 세포로 리프로그램할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 수용체 저해약으로서 A-83-01 (A) 를 사용하고, GSK3 저해약으로서 CHIR99021 (C) 및 ROCK 저해약으로서 Y-27632 (Y) 를 조합하여 (YAC), 마우스 초대 성숙 췌외분비 세포를 배양한 경우, 30 일의 배양에 의해 약 3000 배로 증식하여, YAC 비존재 하에서 배양한 경우에 비해 현저하게 증가한다.
본 명세서에 있어서 「췌장 줄기/전구 세포」(「PSC」라고도 한다) 란, (a) 자기 재생능을 갖고, 또한 (b) 췌내분비 세포 (예를 들어 랑게르한스섬을 구성하는 세포) 또는 췌외분비 세포로 분화할 수 있는 성질을 갖는 세포로서, 줄기 세포 또는 전구 세포를 의미한다.
태아 췌장의 췌 아세포도 췌장 줄기/전구 세포 (PSC) 에 포함된다.
바람직한 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 리프로그래밍 방법에 의해 얻어지는 PSC 는, 상기 (a) 및 (b) 의 성질에 더하여, (c) 마스터 인자인 Pdx1 및 Nkx6.1 을 발현하는 것 외에 Gata4, Hes1, Sox9, Foxa2, CK19, CD133 등을 발현한다. 단, 본 발명의 리프로그래밍 방법에 의해 얻어지는 PSC 는, 다른 이미 알려진 PSC 로 발현하고 있는 Lgr5 를 발현하고 있지 않다. 따라서, 본 발명의 PSC 는 신규한 PSC 라고 할 수 있다.
본 발명의 PSC 는, 추가로 이하의 특징 중 1 이상을 갖는다.
(d) 적어도 10 계대, 바람직하게는 20 계대 이상, 외관상의 증식 속도가 저하되지 않는다.
(e) 적어도 10 계대, 바람직하게는 20 계대 이상, 췌내분비 세포로의 분화능을 유지한다.
(f) 췌외분비 세포와 비교하여 핵/세포질 (N/C) 비가 높다.
(g) Pdx1, Nkx6.1 에서 선택되는 1 이상의 PSC 마커 유전자의 발현이, 췌외분비 세포와 비교하여 상승하고 있다
(h) Pdx1, Nkx6.1 에서 선택되는 1 이상의 단백질의 발현이, 췌외분비 세포와 비교하여 상승하고 있다
바람직한 실시양태에 있어서는, 본 발명의 PSC 는, 상기 (d) ∼ (h) 의 특징을 모두 갖는 것이다.
이상과 같이, 성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 를 TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약에 접촉시킴으로써, 줄기/전구 세포로 유도 (예를 들어 췌외분비 세포로부터 PSC 를 유도) 할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 유도하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에, TGFβ 수용체 저해약, 또는 TGFβ 수용체 저해약과 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약의 조합을 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
특히 췌외분비 세포로부터 PSC 를 유도하는 경우에는, 췌외분비 세포를 TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약에 접촉시킴으로써, 췌외분비 세포로부터 PSC 를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, TGFβ 수용체 저해약을 포함하는, 췌외분비 세포로부터의 PSC 유도제를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 PSC 유도제는, TGFβ 수용체 저해약과 GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약의 조합을 포함하고, 보다 바람직하게는, TGFβ 수용체 저해약과 GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 조합을 포함한다.
TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약은 그대로 PSC 유도제로서 사용할 수 있지만, 적당한 용매에 용해시켜 액제로 할 수도 있다. 혹은, 이들 저해약은, 상기한 췌외분비 세포로부터 PSC 를 유도용 배지와 조합하여 키트화할 수도 있다.
3. 줄기/전구 세포 유지·증폭
상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 줄기/전구 세포는, 콜라겐 또는 마트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서, 각각 TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서 계대 배양함으로써, 효율적으로 유지·증폭시킬 수 있다.
배양 용기로는, 성숙 세포로부터 줄기/전구 세포를 유도하기 위해서 사용한 배양 용기와 동일한 배양 용기를 사용할 수 있다.
췌외분비 세포를 사용한 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 PSC 는, 콜라겐 또는 마트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서, 각각 TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서 계대 배양함으로써, 효율적으로 유지·증폭시킬 수 있다.
배양 용기로는, 췌외분비 세포로부터의 PSC 의 유도에 사용한 것과 동일한 배양 용기를 사용할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 초대 PSC 를, 70 - 100 ％ 컨플루언트에 도달한 단계에서, 상기 콜라겐 또는 마트리겔 코트한 배양 용기 상에, 103 ∼ 105 세포/㎠ 의 밀도로 파종한다. 배지로는, PSC 의 유도 배양에 대해 상기한 배지를 동일하게 사용할 수 있다. TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약의 첨가 농도도, PSC 의 유도 배양에 대해 상기한 농도 범위에서 적절히 선택할 수 있다. 배양 온도, CO2 농도도 PSC 유도 배양의 조건에 준한다. 70 - 100 ％ 컨플루언트에 도달한 단계에서, 세포를 트립신 처리하여 해리시키고, 계대를 실시한다. 5 - 8 계대 정도에서 안정적인 PSC 를 얻을 수 있다. 10 계대 이상 계대한 후에, 통상적인 방법에 의해 클론화를 실시할 수 있다.
상기와 같이, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약은, 줄기/전구 세포 (예를 들어 PSC) 의 유도 배양뿐만 아니라, 유지·증폭 배양에 있어서도 배지에 첨가된다. 따라서, 본 발명은 또한, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약, ROCK 저해약을 함유하여 이루어지는 줄기/전구 세포 (예를 들어 PSC) 의 유지·증폭제를 제공한다.
4. 줄기/전구 세포로부터 성숙 세포로의 분화
줄기/전구 세포로부터 성숙 세포로의 분화 유도는, 예를 들어 YAC 첨가 SHM (Small hepatocyte medium) 배지를 사용하여 초저 흡착 배양 접시 위에서 7 일간 부유 배양시킴으로써 실시할 수 있다. 혹은, 포르볼 12,13-디부티레이트 (Phorbol 12,13-dibutyrate), LDN193189, 케라티노사이트 증식 인자 (Keratinocyte Growth Factor), SANT1, 레티노산 (Retinoic Acid), XXI, 베타세룰린 (Betacellulin) 등을 첨가한 배양액으로 배양하는 방법 (Cell. 2014 Oct 9 ; 159 (2) : 428-39.) 등을 이용해도 된다.
PSC 로부터 췌내분비 세포로의 분화 유도에 대해서도, 상기와 동일한 방법을 적용할 수 있다. 혹은, 포르볼 12,13-디부티레이트 (Phorbol 12,13-dibutyrate), LDN193189, 케라티노사이트 증식 인자, SANT1, 레티노산, XXI, 베타세룰린 (Betacellulin) 등을 첨가한 배양액으로 배양하는 방법 (Cell. 2014 Oct 9 ; 159 (2) : 428-39.) 등을 이용해도 된다.
본 발명의 PSC 를 분화 유도함으로써 얻어진 췌외분비 세포는, 성숙 췌내분비 세포에 전형적인 인슐린 산생 기능을 가지고, 인슐린 분비를 반영하는 C 펩티드 분비도 검출된다. 또, 췌내분비 세포의 마스터 전사 인자인 Ngn3 이나 글루코오스 트랜스포터 (GLUT2) 의 mRNA 상승이 확인된다. 즉, 본 발명의 PSC 는, 기능적 췌내분비 세포로 분화할 수 있다.
5. 본 발명의 줄기/전구 세포의 용도
상기 4. 에 기재되는 바와 같이 하여 본 발명의 줄기/전구 세포로부터 재분화한 성숙 세포는, 예를 들어, 피검 화합물의 대사나 세포 또는 조직 독성의 평가 등에 이용할 수 있다.
피검 화합물의 대사나 독성의 평가에는, 종래, 동물 모델 등이 이용되고 있었지만, 한번에 평가할 수 있는 피검 화합물의 수에 제한이 있고, 또 동물 모델 등에서 얻어진 평가를, 그대로 인간에게 적용할 수 없다는 문제가 있었다. 그 때문에, 인간 암 세포주나 초대 정상 인간 배양 세포를 사용하는 평가 방법이 채용되고 있다. 그러나, 인간 암 세포주는, 인간 암 세포주에서 얻어진 평가를, 인간 정상 세포에 적용할 수 없다는 가능성이 남는다. 또, 초대 정상 인간 배양 세포는 안정 공급이나 비용 면에서의 문제가 있다. 또한, 초대 정상 인간 배양 세포를 불사화한 세포주는, 불사화하지 않은 경우와 비교하여, 그 활성이 저하되어 있는 것이 나타나 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포를 이용함으로써, 이와 같은 문제를 해결할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 췌장 줄기/전구 세포, 또는 본 발명의 유도 방법에 의해 얻어진 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및 상기 세포에 있어서의 피검 화합물의 대사를 측정하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 췌외분비 세포를 사용하는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 췌외분비 세포에 피검 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 췌외분비 세포에 접촉시킨 피검 화합물의 대사를 측정한다.
본 발명에서 사용하는 피검 화합물로는, 특별히 제한은 없다. 예를 들어, 생체 이물질, 천연 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드 등의 단일 화합물, 그리고, 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현 산물, 세포 추출물, 세포 배양 상청, 발효 미생물 산생물, 해양 생물 추출물, 식물 추출물 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
생체 이물질로는, 예를 들어 약제나 식품의 후보 화합물, 기존의 약제나 식품을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것이 아니고, 생체에 있어서 이물질인 한, 본 발명의 생체 이물질에 포함된다. 보다 구체적으로는, 리팜피신 (Rifampin), 덱사메타손 (Dexamethasone), 페노바비탈 (Phenobarbital), 시글리타존 (Ciglirazone), 페니토인 (Phenytoin), 에파비렌즈 (Efavirenz), 심바스타틴 (Simvastatin), β-나프토플라본 (β-Naphthoflavone), 오메프라졸 (Omeprazole), 클로트리마졸 (Clotrimazole), 3-메틸콜란트렌 (3-Methylcholanthrene) 등을 예시할 수 있다.
성숙 세포 (예를 들어 췌외분비 세포) 와 피검 화합물의 접촉은, 통상적으로, 배지나 배양액에 피검 화합물을 첨가함으로써 실시하지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 피검 화합물이 단백질 등인 경우에는, 그 단백질을 발현하는 DNA 벡터를, 그 세포에 도입함으로써, 접촉을 실시할 수도 있다.
피검 화합물의 대사는, 당업자에게 주지된 방법으로 측정하는 것이 가능하다. 예를 들어 피검 화합물의 대사 산물이 검출된 경우에, 피검 화합물이 대사된 것으로 판정된다.
예를 들어, 피검 화합물의 접촉에 의해, 인슐린 등의 효소 유전자의 발현이 유도된 경우나, 이들 효소의 활성이 상승한 경우에, 피검 화합물이 대사된 것으로 판정된다.
췌장 이외의 조직 또는 기관에 대해서도, 당해 조직 또는 기관에 존재하는 유전자의 발현을 지표로 하여 피검 화합물이 대사된 것으로 판정할 수 있다.
또 본 발명은, 세포가 분비하는 효소의 분비 유도 물질의 스크리닝 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 본 발명의 췌장 줄기/전구 세포, 또는 본 발명의 유도 방법에 의해 유도된 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및 상기 세포에 있어서 분비된 물질을 측정하는 공정을 포함하는, 상기 방법이 제공된다.
예를 들어, 피검 물질을, 췌장 줄기/전구 세포 또는 유도된 췌세포에 접촉시킨 후, 세포로부터 분비되는 각 효소가 분비 유도되는지의 여부를 지표로 하여, 분비 조정 물질을 스크리닝할 수 있다.
또 본 발명은, 포유 동물에 대한 피검 화합물의 내배엽 조직 또는 기관 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 췌장 줄기/전구 세포, 또는 본 발명의 유도 방법에 의해 유도된 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및 피검 화합물과 접촉한 세포에 있어서의 장해의 유무 또는 그 정도를 측정하는 공정을 포함한다.
본 발명에 있어서, 피검 화합물의 췌 독성을 평가하는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 췌외분비 세포에 피검 화합물을 접촉시킨다. 이어서, 피검 화합물을 접촉시킨 췌외분비 세포의 장해의 정도를 측정한다. 장해의 정도는, 예를 들어 췌외분비 세포의 생존률이나 췌 장해 마커를 지표로 측정할 수 있다.
예를 들어, 췌외분비 세포의 배양액에 피검 화합물을 첨가함으로써, 췌외분비 세포의 생존률이 저하되는 경우, 그 피검 화합물은 췌 독성을 갖는 것으로 판정되고, 생존률에 유의한 변화가 없는 경우, 그 피검 화합물은 췌 독성을 갖지 않은 것으로 판정된다.
또한, 이미 췌 독성의 유무가 판명되어 있는 화합물을 대조로서 사용함으로써, 보다 정확하게, 피검 화합물이 췌 독성을 갖는지의 여부를 평가할 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 췌장 줄기/전구 세포, 또는 본 발명의 유도의 방법에 의해 유도된 세포를 포함하는, 내배엽 조직 또는 기관 장해 개선제를 제공한다. 또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 췌장 줄기/전구 세포, 또는 본 발명의 유도의 방법에 의해 유도된 세포의 유효량을, 내배엽 조직 또는 기관 장해를 갖는 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
예를 들어 췌 장해를 개선하려면, 본 발명의 PSC 를 만성적인 췌 장해를 갖는 면역 부전 마우스에 이식함으로써, 초대 성숙 췌외분비 세포를 이식한 경우와 동등한 췌 재생능을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 PSC 를 함유하여 이루어지는, 췌 장해 개선제를 제공한다.
본 발명의 PSC 는, 필요에 따라 표면 항원 마커에 대한 항체를 사용하여 플로 사이토메트리에 의해 정제하여 사용할 수 있다. PSC 는 적당한 등장 완충액 (예를 들어, PBS) 에 현탁하여 제제화할 수 있다. 필요에 따라, 의약상 허용되는 첨가물을 추가로 함유시킬 수 있다. PSC 현탁액은, 췌 질환의 종류, 췌 장해의 중독도 등에 따라서도 상이한데, 예를 들어 성인의 경우, 108 - 1011 세포를 이식할 수 있다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 순서
췌 전구 세포의 수립
마우스 또는 래트의 췌외분비 세포를 이미 알려진 수법에 따라서 콜라게나아제 처리 및 단리하였다 (Reichert et al. Cold Spring Harb Protoc. 2015 Jun 1 ; 2015 (6) : 558-61). 단리한 세포 내에 인슐린 분비 세포가 포함되지 않은 것을, 디티존 (DTZ) 염색에 의해 확인하였다. 단리한 췌외분비 세포를, 3 종류의 저분자 화합물 (Y-27632 [10 μM], A-83-01 [0.5 μM], CHIR99021 [3 μM] ; 이하 YAC) 을 첨가한 Small hepatocyte medium (SHM) 배지를 사용하여 I 형 콜라겐 코트 배양 접시 위에서 평면 배양하였다.
SHM 배지 : DMEM/F12 472.7 ㎖ 에 이하의 첨가물을 첨가한 배지 (Katsuda et al. Bio Protoc. 2018 Jan 20 ; 8 (2))
2M HEPES, 1.25 ㎖
30 g/ℓ L-프롤린 (L-proline), 500 ㎕
100x 항생 물질/항진균제 (antibiotic/antimycotic), 5 ㎖
5 N NaOH, 250 ㎕ (pH 7.5 로 조정하기 위해)
5 ％ BSA, 5 ㎖
10 ㎍/㎖ EGF, 500 ㎕
100x ITS-X, 5 ㎖
10-4 M 덱사메타손, 500 ㎕
1 M 니코틴아미드, 5 ㎖
100 mM Asc2P, 5 ㎖
PSC 의 계대 배양
초대 배양의 14 일째에, YAC 존재 하에서 배양한 세포를 트립신 처리하여 회수하고, YAC 를 첨가한 SHM 중에 9 × 103 세포/㎠ 로 파종하였다. 마우스의 경우, I 형 콜라겐 코트 배양 접시 위에서, 래트의 경우, 마트리겔 코팅한 배양 접시 위에서 세포를 배양하였다. CELLBANKER (등록 상표) 1 (타카라주조, 오쓰) 을 사용하여 동결 스톡을 조제하였다. 적어도 10 계대 후, BD FACSAria II 셀 소터를 사용하여 PSC 의 클로닝을 실시하였다.
저세포 밀도에서의 저속도 촬영
초대 췌외분비 세포를 콜라겐으로 코팅한 35 ㎜ 플레이트 (IWAKI) 상에, YAC 의 존재 하 또는 비존재 하에서 1 × 102 세포/㎠ 로 파종하였다. 1 일째에 배지를 교환하였다. 2 번째의 배지 교환 후, BZ9000 올인원 형광 현미경 (키엔스, 오사카) 을 사용하여 저속도 촬영을 실시하였다. 위상차 이미지는 2 일째부터 6 일째까지 30 분 간격으로 300 회 촬영하고, 동영상은 해석마다 작성하였다. 다음으로, 개개의 세포를 촬영 기간을 통해 추적하여, 목적하는 세포에서 유래하는 최종의 세포수를 계측하였다. 또, 개개의 세포에서 유래하는 아포토시스 세포의 총계도 계수하여, 아포토시스 빈도를, 총아포토시스 세포/최초의 총세포수 (저속도 촬영의 개시시에 계수) 로서 정량하였다.
정량적 RT-PCR
췌외분비 세포 및 PSC 세포로부터, miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) 를 사용하여 전체 RNA 를 단리하였다. 역전사 반응은, High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Lifetechnologies) 를 사용하여, 제조자의 가이드 라인에 따라서 실시하였다. 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여, Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 표적 유전자의 발현 레벨은 내재성 컨트롤인 β-액틴으로 표준화하였다.
면역 세포화학, 면역 조직화학
세포를 4 ％ 파라포름알데히드에 의해 15 분간 고정시켰다. 블로킹액 (Blocking One) (나카라이테스크, 교토) 으로, 4 ℃, 30 분 인큐베이트한 후, 세포를 1 차 항체와 실온에서 1 시간 또는 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 다음으로, Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 594-결합 2 차 항체 (Lifetechnologies) 를 사용하여, 1 차 항체를 검출하였다. 핵을 Hoechst 33342 (Dojindo) 로 공염색하였다.
조직 샘플은 포르말린 고정시켜, 파라핀 포매 (包埋) 하였다. 탈랍 및 재수화 (再水和) 후, 표본을 1/200 희석한 ImmunoSaver (닛신 EM, 도쿄) 중, 98 ℃ 에서 45 분 자비함으로써, 열유도성 에피토프 회복을 실시하였다. 다음으로, 표본을 0.1 ％ Triton-X 100 으로 처리하여 막 투과화하였다. 블로킹 시약 (나카라이테스크) 으로 4 ℃, 30 분 처리한 후, 표본을 실온에서 1 시간 1 차 항체와 인큐베이트하였다. 이들 절편을, ImmPRESS IgG-peroxidase kit (Vector Labs) 및 metal-enhanced DAB substrate kit (Life Technologies) 를 제조자의 지시에 따라 사용함으로써 염색하였다. 헤마톡실린으로 대비 염색한 후, 표본을 탈수하여 마운트하였다.
PSC 의 췌내분비 세포 유도
세포를, 5 ％ FBS 를 첨가한 SHM＋YAC 중에 현탁하고 (세포 농도 : 1 × 104 ∼ 1 × 106 세포/㎠), 초저 흡착 배양 접시 위에서 7 일간 배양하였다. 배지 교환은 4 일째에 실시하였다.
2. 결과
1) 췌 전구 세포의 수립
췌외분비 세포 함유 배지에 YAC 를 첨가함으로써, 도 1 에 나타내는 바와 같이 높은 증식능을 갖는 소형 상피 세포를 수립하였다. 이 세포는 20 회 이상의 계대가 가능하고, 1 세포 배양도 가능했다. 또 인슐린 합성능을 갖는 내분비계 세포로 분화할 수 있는 점에서, 췌 전구 세포로서의 특징을 가지고 있다고 할 수 있다.
2) 유도된 췌 전구 세포의 성상
수립한 세포는, 도 2, 3 에 나타내는 바와 같이 췌 전구 세포에 있어서의 마스터 전사 인자인 Pdx1 과 Nkx6.1 을 포함하는 줄기 세포 마커를 발현하고 있었다.
3) 췌 전구 세포로부터 인슐린 산생 세포로의 분화 유도
수립한 췌 전구 세포는, YAC 첨가 SHM 배지를 사용하여 초저 흡착 배양 접시 위에서 7 일간 부유 배양시킴으로써, 도 4 에 나타내는 바와 같이 세포가 클러스터상으로 집적하면서 증식하고, 이 클러스터는 DTZ 염색 양성, 또 면역 염색에 의해 인슐린의 염색성이 검출되었다. 이 점에서, 췌 전구 세포는 인슐린 산생 세포로 분화되었던 것을 알 수 있다. 실제, 인슐린에 더하여 췌내분비 세포의 마스터 전사 인자인 Ngn3 이나 글루코오스 트랜스포터 (GLUT2) 의 mRNA 상승이 보였다 (도 5). 또 인슐린 분비를 반영하는 C 펩티드 분비도 검출되었다 (도 5).
또, YAC 에 ALK5 저해약 II (Enzo, ALX-270-445-M001) 를 첨가하여 7 일간의 부유 배양을 실시하는 것에 의해, 인슐린이나 GLUT2 의 mRNA 발현을 더욱 향상시킬 수 있었다 (도 6).
또한, 췌내분비 세포로의 분화 유도 후, 배지의 글루코오스 농도를 저농도 (3 mM) 와 고농도 (20 mM) 의 조건에서 비교하면, 고농도 글루코오스에 의한 인슐린 mRNA 나 배지 중 C 펩티드의 상승이 보여, 글루코오스 농도 응답성을 획득하고 있는 것이 나타났다 (도 7).
4) 동물에서의 실시예
스트렙토조토신 투여 당뇨병 모델 마우스를 사용하고, 인슐린 산생 세포로의 분화 유도 처리를 실시한 췌 전구 세포를 매트리젤 (Matrigel) 에 봉입하고 췌피막 하에 이식하였다. 도 8 에 나타내는 바와 같이, 이식 3 일 후에 있어서 혈당치의 개선이 얻어졌다. 또한 이식 부위에 있어서 이식 세포의 클러스터의 상당수는 선관형의 세포로 분화되어 있는 한편, 일부의 세포는 인슐린, Pdx1, Nkx6.1 이 양성이고, β 세포로 분화되어 있는 모습이 관찰되었다 (도 9).
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, 유전자 개변을 수반하지 않고, 췌외분비 세포로부터, 자기 재생능과 췌외분비 세포로의 분화능 (양능성) 을 갖는 췌장 줄기/전구 세포를, 안전하고 신속하게 유도할 수 있으므로, 약물 평가 시스템이나 췌 재생 의료에 대한 응용이 가능해지는 점에서 본 발명의 방법은 매우 유용하다.

Claims (26)

  1. 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터, 당해 세포의 줄기/전구 세포를 제작하는 방법으로서, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 TGFβ 수용체 저해약을 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    추가로, GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약을, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    추가로, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약을, 인비트로에서 상기 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내배엽 조직 또는 기관이, 소화관, 폐, 갑상선, 췌장, 분비선, 복막, 흉막, 후두, 이관, 기관, 기관지, 방광, 요도 또는 요관인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내배엽 조직 또는 기관이 췌장인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    췌장 유래의 세포가 췌외분비 세포인, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 췌외분비 세포와 상기 TGFβ 수용체 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재 하에서 그 췌외분비 세포를 배양함으로써 실시되는, 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 췌외분비 세포와 상기 GSK3 저해약 및/또는 상기 ROCK 저해약의 접촉이, 그 저해약의 존재 하에서 그 췌외분비 세포를 배양함으로써 실시되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스인, 방법.
  10. 이하의 특징을 갖는 포유 동물의 췌외분비 세포 유래의 췌장 줄기/전구 세포.
    (a) 자기 재생능을 갖는다
    (b) 췌내분비 세포로 분화할 수 있다
    (c) Pdx1 및 Nkx6.1 을 발현하지만, 인슐린을 발현하지 않는다
  11. TGFβ 수용체 저해약을 포함하는, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 (간장을 제외한다) 유래의 세포로부터 당해 세포의 줄기/전구 세포로의 유도제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    GSK3 저해약 및/또는 ROCK 저해약의 조합을 추가로 포함하는, 유도제.
  13. 제 11 항에 있어서,
    GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 조합을 추가로 포함하는, 유도제.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내배엽 조직 또는 기관이, 소화관, 폐, 갑상선, 췌장, 분비선, 복막, 흉막, 후두, 이관, 기관, 기관지, 방광, 요도 또는 요관인, 유도제.
  15. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내배엽 조직 또는 기관이 췌장인, 유도제.
  16. 제 15 항에 있어서,
    췌장 유래의 세포가 췌외분비 세포인, 유도제.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유 동물이 인간, 래트 또는 마우스 유래인, 유도제.
  18. 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포의 유지 또는 증폭제로서 사용되는, 유도제.
  19. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포의 유지 또는 증폭 방법으로서, 콜라겐 또는 마트리겔로 코팅한 배양 용기 상에서, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서, 당해 줄기/전구 세포 또는 췌장 줄기/전구 세포를 계대 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 또는 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포로부터, 포유 동물의 내배엽 조직 또는 기관 유래의 세포, 또는 췌외분비 세포로 유도하는 방법으로서, TGFβ 수용체 저해약, GSK3 저해약 및 ROCK 저해약의 존재 하에서 상기 줄기/전구 세포, 또는 췌장 줄기/전구 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
  21. 피검 화합물의 포유 동물 체내에서의 대사를 평가하는 방법으로서,
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
    (ii) 상기 세포에 있어서의 피검 화합물의 대사를 측정하는 공정
    을 포함하는, 방법.
  22. 세포가 분비하는 효소의 분비 유도 물질의 스크리닝 방법으로서,
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 유도된 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
    (ii) 상기 세포에 있어서 분비된 물질을 측정하는 공정
    을 포함하는, 상기 방법.
  23. 포유 동물에 대한 피검 화합물의 내배엽 조직 또는 기관 독성을 평가하는 방법으로서,
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포에 피검 화합물을 접촉시키는 공정, 및
    (ii) 피검 화합물과 접촉한 세포에 있어서의 장해의 유무 또는 그 정도를 측정하는 공정
    을 포함하는, 상기 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포를 포함하는, 내배엽 조직 또는 기관 장해 개선제.
  25. 포유 동물에 있어서의 내배엽 조직 또는 기관 장해의 개선 방법으로서, 당해 조직 또는 기관 장해를 갖는 포유 동물에, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 유도된 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 방법.
  26. 내배엽 조직 또는 기관 장해 개선제로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 줄기/전구 세포, 제 10 항에 기재된 췌장 줄기/전구 세포, 또는 제 20 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 세포.
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