KR20220080720A - ROR-beta의 발현을 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 - Google Patents

ROR-beta의 발현을 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 Download PDF

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Abstract

본 출원은 ROR-beta(RAR related orphan receptor B)의 발현을 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ROR-beta를 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 및 상기 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

ROR-beta의 발현을 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 {Asymmetric nucleic acid molecules inducing RNA interference that Inhibits Expression of ROR-beta}
본 발명은 ROR-beta(Retinoid-related orphan nuclear receptor)의 발현을 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ROR-beta를 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자 및 상기 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
망막색소변성증(retinitis pigmentosa)은 간상세포의 특징을 갖게 하는 유전자에 돌연변이가 생겨, 간상세포가 파괴되고 이차적으로 원추세포가 파괴되어 결국 실명에 이를 수 있는 질병이다. ROR-beta(Retinoid-related orphan nuclear receptor)는 간상세포 및 원추세포의 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자로, 간상세포로의 분화를 조절하는 Neural retina leucine zipper(NRL)의 발현을 조절하며 그 외에 다양한 망막 기능에 관여한다. ROR-beta는 RORβ1 및 RORβ2의 두 가지 isoform이 존재하는데, RORβ1은 NRL의 upstream 단계에서 NRL의 발현을 유도하며 RORβ2는 NRL에 의해 조절되는 인자로서 NRL의 발현이 강화되도록 한다. 즉, ROR-beta와 NRL의 두 유전자 간에 positive feedback 작용이 일어나면서 간상세포 분화를 안정화 시키게 된다. (Fu et al., "Feedback Induction of a Photoreceptor-specific Isoform of Retinoid-related Orphan Nuclear Receptorβ by the Rod Transcription Factor NRL" Journal of Biological Chemistry 2014 Nov 21;289(47):32469-80.). 특히 ROR-beta와 밀접하게 연관되어 있는 NRL의 경우 adenovirus-associated virus(AAV) delivered CRISPR/Cas9으로 knockout하면, 간상세포가 부분적인 원추세포의 성질을 획득하여, 간상세포의 특징을 갖게 하는 유전자에 돌연변이가 있을 때 간상세포가 파괴되지 않고 유지되어 이차적인 원추세포의 손실을 막는다는 것이 retinal degeneration의 mouse model을 통해 관찰되었다(Yu, Wenhan, et al., "Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice." Nature communications 8 (2017): 14716). 이러한 현상은 Ror-beta가 결손된 마우스에서 간상세포가 원추세포의 성질을 득하게 되는 연구와 유사하며 (jia et al, "Retinoid-related orphan nuclear receptor RORβ is an early-acting factor in rod photoreceptor development" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2009) 13;106(41):17534-9.), 따라서 NRL 및 ROR-beta는 망막 내 간상세포 및 원추세포의 분화 과정에서 매우 중요한 기능을 하고 있음을 알 수 있다.
한편, RNA 간섭(RNA interference) 현상을 이용한 질병의 치료는 mRNA를 타겟으로 하여, 유전자의 발현을 translational level에서 조절하는 siRNA를 이용하기 때문에 보다 안전하게 질병을 치료할 수 있다. 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 표적 mRNA와 같은 시퀀스를 가진 sense strand와 그와 상보적인 시퀀스를 가진 antisense strand로 구성된다. conventional siRNA는 19-21bp의 짧은 duplex를 가지며 양쪽 strand 3'에 2개의 뉴클레오타이드가 돌출되어있다. siRNA는 세포 내로 들어가 표적 mRNA에 붙어 표적 mRNA를 분해시키며 표적 유전자의 발현을 억제한다. oligo의 시퀀스를 바꿈으로써 모든 mRNA를 표적으로 하는 것이 가능하기 때문에 구조가 복잡한 단백질의 발현도 억제할 수 있으며, 따라서 현재 치료가 어려운 암, 바이러스 감염, 유전병과 같은 질병의 치료를 가능하게 할 수 있다. 그러나 세포 내로 유입된 siRNA는 면역반응 유발, 비표적 유전자의 억제와 같은 부작용을 일으킬 수 있는데, 그 중에서도 siRNA를 세포 내로 도입하는 delivery system이 siRNA를 이용한 치료제 개발에서 가장 큰 문제가 되고 있다.
siRNA는 phosphate backbone 때문에 음전하를 띄게 되는데, 음전하를 갖는 세포막과 반발력을 갖게 되어 세포 내로 siRNA를 도입하려면 delivery system을 필요로 한다. delivery system의 한 예로는 양전하를 갖는 리포좀이나 폴리머로 siRNA를 감싸서 음전하를 상쇄시켜 세포 내로 도입하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나 양전하를 갖는 전달체는 음전하를 갖는 세포막에 붙어 원하지 않는 독성을 나타내거나 세포 내의 여러 종류의 단백질과 상호작용을 통해 원하지 않는 복합체를 형성하는 등 다양한 부작용을 일으킬 수 있다. 또한 siRNA는 혈액 내의 핵산가수분해효소(nuclease)에 의해 빠르게 분해되기 때문에 표적으로 하는 세포에 도달되는 siRNA의 양이 표적 유전자의 발현을 상당히 감소시킬 만큼 충분하지 않을 수 있다. 따라서 siRNA가 안전하고 효과적으로 타겟 세포 내로 전달될 수 있는 방법이 필요하다.
이에 본 발명자들은 ROR-beta의 발현을 억제시킬 수 있는 ROR-beta 표적 siRNA를 선별하고, 전달체의 도움 없이 세포 내로 전달되며 핵산가수분해효소에 대한 저항성이 높은 siRNA를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, ROR-beta를 타겟으로 하는 siRNA들을 디자인하였으며, 스크리닝을 통해 가장 효율적으로 ROR-beta를 억제시키는 siRNA를 선별하고, 변형(modification)을 통해 세포 내 전달 문제를 극복할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 ROR-beta의 발현을 특이적으로 억제하는 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비대칭 RNAi 유도용 핵산 분자를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 약학 조성물, 또는 망막질환 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ROR-beta(Retinoid-related orphan nuclear receptor)를 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 RNAi 유도용 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 간상세포 및 원추세포의 분화 과정에서 매우 중요한 기능을 하는 ROR-beta의 발현을 효율적으로 억제시킬 수 있는 비대칭 siRNA를 선별하고, 상기 siRNA가 전달체 도움 없이 세포 내로 도입되고 핵산가수분해효소에 대한 저항성을 갖도록 화학적으로 변형시켜 전달체로 인한 세포독성을 제거하고, in vivo에서 보다 효율적인 유전자 발현의 억제를 가능하게 함으로써, 망막색소변성증을 포함한 망막질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 16 mer의 센스 가닥, 및 19 mer의 안티센스 가닥으로 이루어지는 ROR-beta asiRNA의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 ROR-beta asiRNA 62종을 Y-79 세포에 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 ROR-beta asiRNA 13종을 Y-79 세포에 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 ROR-beta asiRNA 13종을 Y-79 세포에 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 ROR-beta cp-asiRNA 67종을 Y-79 세포에 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 ROR-beta cp-asiRNA 10종을 Y-79 세포에 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 ROR-beta plasmid를 이용하여 ROR-beta를 transient하게 발현하는 A549 세포에 cp-asiRNA 10종을 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 ROR-beta plasmid를 이용하여 ROR-beta를 transient하게 발현하는 A549 세포에 cp-asiRNA 5종을 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 ROR-beta plasmid를 이용하여 ROR-beta를 transient하게 발현하는 A549 세포에 cp-asiRNA 5종을 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 ROR-beta cp-asiRNA 4 (OLX304C-026-4) 및 ROR-beta cp-asiRNA 5 (OLX304C-026-5)의 sequence와 modification 정보를 나타낸다 (sense strand: 16mer, antisense strand: 19mer).
도 11은 정상 마우스 안구에 ROR-beta cp-asiRNA 2종(OLX304C-026-4, OLX304C-026-5)을 처리한 후, 이에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과로. 각각 (A) 정상 마우스의 망막 조직을 분리하여 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과, (B) 정상 마우스의 망막색소상피세포/맥락막층을 분리하여 ROR-beta 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 정상 마우스 안구에 ROR-beta cp-asiRNA 2종(OLX304C-026-4, OLX304C-026-26)을 투여 용량별로 처리한 후, 망막 조직에서 투여 용량에 따른 ROR-beta mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 13은 정상 마우스 안구에 ROR-beta cp-asiRNA 1종(OLX304C-026-4)을 투여 용량별로 처리한 후, 망막 조직에서 투여 용량에 따른 ROR-beta mRNA의 발현 억제 효과의 지속 기간을 확인한 결과이다.
도 14는 망막색소변성증 질환 연관 인간 유전자 도입 마우스 모델에 ROR-beta cp-asiRNA 2종(OLX304C-026-4, OLX304C-026-26)을 최적 투여 용량으로 처리한 후, 안구 조직의 H&E 염색을 통한 각 층의 두께를 비교한 결과이다.
도 15는 망막색소변성증 질환 연관 인간 유전자 도입 마우스 모델에 ROR-beta cp-asiRNA 2종(OLX304C-026-4, OLX304C-026-26)을 최적 투여 용량으로 처리한 후, 망막전위도(Electroretinogram; ERG) 검사를 수행한 결과로, 각각 (A) a-파의 진폭 변화를 확인한 결과, (B) b-파의 진폭 변화를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"RNAi(RNA interference; RNA 간섭)"란, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 등에 도입하여 목적 유전자 mRNA의 분해를 유도함으로써 목적 유전자의 발현을 억제하는 메카니즘을 의미한다.
“RNAi 유도용 핵산 분자 (nucleic acid molecules inducing RNAi)”란 서열-특이적 방식으로 상기 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 개별 핵산 분자, 복수의 상기 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 풀 (pool) 모두를 지칭할 수 있다. 일 구체예에 있어서 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 siRNA일 수 있다.
"siRNA(small interfering RNA; 짧은 간섭 RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)를 의미한다.
"안티센스 가닥(antisense strand)"이란 관심 있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g.,microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다.
"센스 가닥(sense strand)"이란 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
"유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적 유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물 유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 HIV 게놈상의 유전자일 수 있다. 이 경우, siRNA 분자는 포유동물 세포 내 HIV 유전자의 번역을 불활성화시키는데 유용하다.
"Retinoid-related orphan nuclear receptor (ROR-beta)"는 망막 내 간상세포 및 원추세포의 분화를 조절하는 중요한 전사인자로서, 광수용체 전구체가 간상세포로 분화되도록 하는 NRL(Neural retina leucine zipper)과 그 하위인자인 NR2E3(nuclear receptor subfamily 2, group E, member 3)의 upstream regulator 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편 ROR-beta 유전자가 결여된 Rorb-/- 마우스는 Nrl 및 Nr2e3의 발현이 현저히 감소되며, 간상세포 관련 유전자는 감소하는 반면 원추세포 관련 유전자의 발현은 증가함으로써 ROR-beta 및 NRL에 의한 간상세포 분화 신호조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.
망막색소변성증(retinitis pigmentosa)은 간상세포의 특징을 나타내도록 하는 유전자에 돌연변이가 생겨 간상세포가 먼저 파괴되고 이차적으로 원추세포가 파괴되는 질병이다. 광수용체 기능에 중요한 유전자에 돌연변이가 있을 때 해로운 효과는 완전히 분화된 광수용체 환경에서 최대가 된다는 연구결과가 있다. 따라서 간상세포로의 분화를 유도하는 NRL의 상위인자인 ROR-beta를 knockout시키면 간상세포가 형태적으로 원추세포와 비슷한 세포로 바뀌며 간상세포의 기능은 잃게 되지만, 형태와 기능이 변한 간상세포라 할지라도 그 존재가 이차적인 원추세포의 손실을 막아줌으로써 망막색소변성증의 치료법으로서의 가능성이 있다.
본 발명의 목적은 크게 두 가지로 나타낼 수 있는데, 첫째는 ROR-beta를 타겟으로 하는 siRNA들을 디자인하고, 스크리닝을 통해 가장 효율적으로 ROR-beta를 억제시키는 siRNA를 선별하는 것이며, 둘째는 siRNA를 별다른 전달체 없이 세포 내로 전달시키고 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높이기 위해 화학적인 변형을 도입하는 것이다. 인지질로 구성된 세포막을 통과하려면 크기가 작거나 혹은 소수성이어야 한다. 그러나 siRNA는 phosphate backbone에 의해 음전하를 띄며 그로 인해 세포막을 투과하는데 어려움이 있다. 또한 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 높여 serum에서의 긴 lifetime을 가지게 하여 표적으로 도달되는 양이 효과적인 RNAi를 일으키기에 충분하도록 만들어야 한다. 따라서 변형(modification)을 도입하여, siRNA의 delivery 문제를 극복하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 먼저 ROR-beta를 타겟으로 하는 asiRNA를 디자인하고 ROR-beta를 발현하는 세포에서 asiRNA를 transfection하여 가장 knockdown efficiency가 좋은 ROR-beta asiRNA를 선별하였다. 이 선별된 siRNA에 다음 4가지의 modification을 도입하여 asiRNA가 세포 관통능을 가지고 핵산가수분해효소에 저항성을 가지도록 변형시킨다. 첫째는 sense strand의 3' 말단에 콜레스테롤을 첨가하여 siRNA가 세포막을 투과할 수 있게 해준다. 두 번째는 sense strand와 antisense strand의 5' 말단 또는 3' 말단 가까이의 phosphate backbone을 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 치환하여 핵산외부가수분해 효소에 대한 저항성을 가지며, 세포로의 흡수와 in vivo에서 siRNA의 생물학적 이용을 가능하게 해준다. 세 번째는 당의 2'을 OMethyl로 modification하여 핵산가수분해 효소에 대한 저항성을 부여하며 siRNA immunogenicity를 낮추어 주며 off-target 효과를 감소시켜준다. 네 번째는 당의 2'을 fluoro로 modification하여 double strand duplex에 안정성을 부여하며, serum에서의 안정성을 높이고 in vitro와 in vivo에서 효율적인 silencing이 가능하게 한다. siRNA에 위와 같은 modification을 가함으로써 siRNA는 세포 관통능을 갖게 되고, serum에 더욱 오래 머물러 표적 세포로 충분한 양의 siRNA가 전달됨에 따라 보다 효율적인 유전자 억제를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, ROR-beta(Retinoid-related orphan nuclear receptor)을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것을 특징으로 하는 RNAi 유도용 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념이다. RNAi는 1998년 Caenorthabditis elegans에서 최초로 발견된 세포 내 유전자 조절 기작으로 작용기전은 세포 내로 투입된 RNA 이중 가닥 중 안티센스 가닥이 표적 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자 분해를 유도한다고 알려져 있다. 그 중 siRNA는 "in vitro"에서 유전자의 발현을 억제하는 방법 중에 하나다. 19-21bp의 siRNA는 이론적으로 거의 모든 유전자에 대한 선택적 억제가 가능하여 암, 바이러스성 감염 등의 다양한 유전자 관련 질환 치료제로 개발이 가능하며, 최근 가장 각광받는 신약 개발 후보 기술이다. 포유동물에서 siRNA를 사용한 생체 내 치료를 첫 시도한 경우는 2003년 중반이었으며, 그 이후로 응용 연구에 대한 많은 시도로 생체 내 치료에 관하여 다수 보고되었다.
다만, 가능성과 반대로 siRNA의 부작용 및 단점이 계속적으로 보고되어 있다. RNAi 기반 치료제의 개발이 이루어지기 위해서는 1) 효과적인 전달시스템의 부재 2) 오프타겟 효과 3) 면역반응 유도 4) 세포 내 RNAi 기구 포화와 같은 장벽을 극복해야 할 필요성이 있다. siRNA가 표적 유전자의 발현을 직접적으로 조절할 수 있는 효과적인 방법임에도 불구하고 이와 같은 문제들로 인해 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 이와 관련하여, 비대칭 siRNA(asymmetric shorter duplex siRNA, asiRNA)는 종래의 siRNA가 가지는 19+2 구조에 비해 짧은 이중나선 길이를 갖는 비대칭 RNAi 유도 구조이다. 기존 siRNA 구조 기술에서 확인되는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화, TLR3에 의한 면역반응 등의 문제점들을 극복한 기술이며, 이에 따라 부작용이 낮은 RNAi 신약 개발이 가능하다.
이를 바탕으로, 일 실시예에서는 센스 가닥 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 비대칭 siRNA를 제시하며, 일 실시예에 따른 siRNA는 오프-타겟 효과, RNAi 기작의 포화 등의 문제를 일으키지 않아 안정적으로 높은 전달 효율을 유지하면서, 목적하는 정도로 유효하게 ROR-beta 표적 유전자에 대한 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥은 18nt 이상의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 안티센스 가닥은 18 내지 31nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 18 내지 23nt의 길이를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 센스 가닥의 길이는 16nt, 이와 상보적인 안티센스 가닥의 길이는 19nt, 20nt, 21nt 또는 22nt인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성한다. 안티센스 가닥의 3' 말단은 예를 들어 1 내지 16nt의 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, ROR-beta의 발현을 억제시키기 위하여 62개의 ROR-beta asiRNA를 디자인하였고, ROR-beta를 발현하는 세포 또는 일시적으로 발현하는 transient cell에서 mRNA level과 protein level의 억제를 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 및 123으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 센스 가닥은 예를 들어, 서열번호 27, 29, 51, 83, 85, 91, 95, 97, 103, 105, 107, 109 및 115로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 또는 서열번호 27, 29, 51 및 109로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 51 또는 109일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122 및 124로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로는, 상기 안티센스 가닥은 예를 들어, 서열번호 28, 30, 52, 84, 86, 92, 96, 98, 104, 106, 108, 110 및 116으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있고, 또는 서열번호 28, 30, 52 및 110으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 52 또는 110일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일반적인 siRNA는 포스페이트 백본 구조에 의한 높은 음전하 및 높은 분자량 등의 이유로 세포막을 통과할 수 없고 혈액에서의 빠른 분해 및 제거되어 실제 표적 부위에 RNAi 유도를 위한 충분한 양을 전달하는데 어려움이 있다. 현재 in vitro 전달의 경우 cationic lipids와 cationic polymers들을 이용한 높은 효율의 delivery 방법이 많이 개발되어 있지만, in vivo의 경우에는 in vitro만큼의 높은 효율로 siRNA를 전달하기 어렵고, 생체 내에 존재하는 다양한 단백질들과 상호작용에 의하여 siRNA 전달 효율이 감소하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 비대칭 siRNA 구조에 화학적 변형을 도입하여 별도의 전달체 없이 효과적이고 세포 내 전달을 할 수 있는 자가 전달능을 가진 asiRNA 구조체(cp-asiRNA)를 개발하였다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 화학적 변형은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group), 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 침투 펩타이드 결합.
본 발명에 있어서, 상기 친유성 화합물(lipophilic compound)은 콜레스테롤, 토코페롤, 스테아르산(stearic acid), 레티노산(retinoic acid), DHA(docosahexaenoica cid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 및 탄소수 10개 이상의 장쇄지방산으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 콜레스테롤인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다: 3'말단으로부터 인접한 2 내지 4개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 3' 말단에 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
일 구체예에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 하기로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다: 3' 말단으로부터 인접한 3 내지 5개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 및 5' 말단에 인산기(phosphate group) 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
다른 구체예에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -OCH3(methoxy) 또는 -F(불소)로 치환되는 변형; 센스 또는 안티센스 가닥에서 10% 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 변형; 센스 가닥의 3' 말단에 콜레스테롤 또는 팔미트산 결합; 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기(phosphate group) 결합;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 센스 가닥은 하기 표1의 (a) 내지 (l)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나이고, 안티센스 가닥은 하기 표1의 (m) 내지 (x)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
[표 1]
Figure pat00001
상기 서열에서 *는 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated bond), m은 2'-O-메틸(Methyl), 2'-F-는 2'-플루오르(Fluoro), chol은 콜레스테롤, PA는 팔미트산, P는 5'-인산기(Phosphate group)를 의미한다.구체적으로, 상기 센스 가닥은 상기 표 1의 (a) 내지 (e), 및 (l) 중 어느 하나이고, 및 상기 안티센스 가닥은 상기 표 1의 (m) 내지 (q) 중 어느 하나일 수 있으며; 상기 센스 가닥은 상기 표 1의 (f) 내지 (k) 중 어느 하나일 수 있고, 및 상기 안티센스 가닥은 상기 표 1의 (r) 내지 (x) 중 어느 하나일 수 있으며; 상기 센스 가닥은 상기 표 1의 (a) 또는 (l)이고, 및 상기 안티센스 가닥은 상기 표의 (p) 또는 (q)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, sense strand는 공통적으로 3' 말단에 3개의 phosphate linkage를 phosphorothioate linkage로 치환하고 콜레스테롤 또는 팔미트산을 첨가하였다. antisense strand는 공통적으로 3' 말단에 4개의 phosphate linkage를 phosphorothioate linkage로 치환하였다. 그리고 당의 2'에 OMethyl과 fluoro의 치환 개수와 치환 위치를 다르게 하여 sense strand 12개, antisense strand 12개를 합성하였다. 총 68가지 경우로 annealing하여 전달체 없이 ROR-beta를 가장 잘 knockdown시키는 modification을 선별하였으며 ROR-beta를 가장 효율적으로 knockdown시키는 ROR-beta cp-asiRNA를 선택하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 망막질환은 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바뎃-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congenital Amaurosis; Leber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventinese), 오구치병(Oguchi disease) 또는 레프섬병(Refsum disease)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 유효성분인 RNAi 유도용 핵산 분자 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.
상기 약학 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 유리체강 내(intravitreal injection; IVT), 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막질환 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 개선 또는 치료방법에 포함되는 구성은 앞서 설명한 발명에 포함되는 구성과 동일하므로, 위 설명은 개선 또는 치료방법에도 동일하게 적용될 수 있다.
용어 "투여하는"은 일 구체예에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자의 배치를 의미할 수 있다.
상기 “개체”는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 원숭이, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 망막색소변성증 등의 망막질환 개선, 예를 들어, ROR-beta 유전자의 발현 억제 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 망막질환 개선 또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한 상기 RNAi 유도용 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 상기 용도에 있어서, 망막질환, 개선, 치료, RNAi 유도용 핵산 분자에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: ROR-beta를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥 핵산 분자 62종
본 실시예에서는 스크리닝을 위한 ROR-beta asymmetric siRNA(asiRNA)를 디자인하였다. conventional siRNA는 양쪽 strand 3'에 2개 뉴클레오타이드 overhang을 가지는 19 base pair의 duplex이다. asiRNA는 antisense의 5'이 blunt end이고 15-16 base pair의 짧은 duplex를 가져 siRNA와 동등한 억제효율을 나타내면서 짧아진 sense 길이로 인하여 감소된 off-target 효과를 가진다. 따라서 16mer(sense strand)-19mer(antisense strand)의 asiRNA로 디자인하였다(도 1).
ROR-beta asiRNA는 동물실험을 위하여 Homo sapiens(Human), Mus musculus(Mouse), Oryctolagus cuniculus(Rabbit), Macaca mulatta (Monkey)의 homology를 고려하여 디자인되었으며, 해당 종들에 대하여 100% 일치하는 시퀀스들이다. 하기 표 2는 62개의 ROR-beta asiRNA의 sequence를 나타낸다.
[표 2]
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
실시예 2: ROR-beta를 표적으로 하는 RNAi 유도 이중가닥의 핵산 분자 스크리닝
본 실시예에서는 상기 실시예 1의 ROR-beta asiRNA의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 10 nM의 비대칭 siRNA를 Y-79 세포(ATCC)에 형질감염시킨 뒤, 웨스턴 블랏을 통해 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, Y-79 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 cells/well로 씨딩하였고, 이후, Lipofectamine RNAiMax Transfection Reagent(Invitrogen, 13778030)를 이용하여 Invitrogen에서 제공한 프로토콜에 따라 48시간 동안 10 nM의 asiRNA를 형질감염시켰다. 이후, 상기 형질감염된 세포를 파쇄하여 cell lysate를 수득한 후 웨스턴 블랏을 진행하였다. 상기 수득한 cell lysate를 대상으로, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ROR-beta 항체(Proteintech, Cat. #17635-1), 및 Vinculin 항체(Santa Cruz Biotechonology, Cat. #sc-73614)를 사용하여 각 제조사의 프로토콜에 따라 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 음성 대조군은 비처리군을 이용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, ROR-beta asiRNA의 처리에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, 62개의 ROR-beta asiRNA 중에서 우수한 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과를 나타내는 13종 (#14, #15, #26, #42, #43, #46, #48, #49, #52, #53, #54, #55, #58)의 비대칭 siRNA를 확인하였다.
실시예 3: 도출된 asiRNA에 대한 ROR-beta 발현 억제 효율 확인
3.1. ROR-beta 단백질 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 도출된 ROR-beta asiRNA(#14, #15, #26, #42, #43, #46, #48, #49, #52, #53, #54, #55, #58)에 의한 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위하여 1 nM 또는 5 nM의 비대칭 siRNA를 Y-79 세포(ATCC)에 형질감염시킨 뒤, 웨스턴 블랏을 통해 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, Y-79 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 cells/well로 씨딩하였고, 이후, Lipofectamine RNAiMax Transfection Reagent(Invitrogen, 13778030)를 이용하여 Invitrogen에서 제공한 프로토콜에 따라 48시간 동안 1 nM 또는 5 nM의 asiRNA를 형질감염시켰다. 이후, 상기 형질감염된 세포를 파쇄하여 cell lysate를 수득한 후 웨스턴 블랏을 진행하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방식으로, 상기 수득한 cell lysate를 대상으로, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ROR-beta 항체(Proteintech, Cat. #17635-1), 및 Vinculin 항체(Santa Cruz Biotechonology, Cat. #sc-73614)를 사용하여 각 제조사의 프로토콜에 따라 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 음성 대조군은 비처리군을 이용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ROR-beta asiRNA의 처리에 따른 농도 의존적인 ROR-beta 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히 1 nM 처리 결과를 기준으로 #14, #26, #55에서 약 50% 이상의 단백질 발현 억제가 관찰되었다.
3.2. ROR-beta mRNA 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 도출된 ROR-beta asiRNA(#14, #15, #26, #42, #43, #46, #48, #49, #52, #53, #54, #55, #58)에 의한 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위하여 1 nM 또는 10 nM의 비대칭 siRNA를 Y-79 세포(ATCC)에 형질감염시킨 뒤, Real-Time PCR로 ROR-beta mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, Y-79 세포를 24-웰 플레이트에 6x104 cells/well로 씨딩하였고, 이후, Lipofectamine RNAiMax Transfection Reagent(Invitrogen, 13778030)를 이용하여 Invitrogen에서 제공한 프로토콜에 따라 24시간 동안 1 nM 또는 10 nM의 asiRNA를 형질감염시켰다. 이후, Tri-RNA reagent (FAVORGEN, FATRR001)을 이용하여 total RNA를 추출한 후, High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, 4368813)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후, TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems)의 ROR-beta (Hs00199445_m1) 및 RN18S1 (Hs03928985_g1)과 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (TOYOBO, QPS-101)를 이용하여 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad)으로 ROR-beta mRNA의 발현 수준을 확인하였다. ROR-beta mRNA의 발현 수준은 RN18S1을 이용하여 normalization 하였으며 음성 대조군은 비처리군을 이용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, ROR-beta asiRNA에 따른 ROR-beta mRNA의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히 1 nM 처리 결과를 기준으로 #15, #26, #55에서 60% 이상의 mRNA 발현 억제가 관찰되었다.
본 실시예 3의 결과를 종합하여, ROR-beta mRNA 및 단백질 발현 억제 효능이 우수한 상위 3종 서열에 모두 포함되는 서열 2종 (#26, #55)을 도출하였다.
실시예 4: 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA의 디자인 및 제작
본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 발현 억제 효과를 확인한 ROR-beta asiRNA들 중 2종 (#26 및 #55)을 대상으로, 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA (cell penetrating-asymmetric siRNA: cp-asiRNA)를 디자인하였다. 본 실시예에서 디자인된 cp-asiRNA는 상기 asiRNA에 비해, 다양한 화학적 변형(2'OMe, PS, Fluoro)이 된 것으로서, 세포 내부로의 전달이 향상된 비대칭 siRNA이다.
본 실시예에서 제작한 총 67종의 cp-asiRNA의 서열정보는 하기 표 3과 같다.
[표 3]
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
한편, 상기 표 2에 "*", "m", "f", 및 "chol"로 표기된 화학적 변형은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4]
Figure pat00011
구체적으로, 상기 표 3에서, "*"은 기존의 포스포다이에스터 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 형태를 의미하는 것이며, "m"은 기존의 2'-OH가 2'-O-메틸로 치환된 형태를 의미하는 것이다. 또한, "f"는 예를 들어, fG의 경우, 기존의 G(구아닌)의 2'-OH가 플루오르로 치환된 형태를 의미하는 것이며, "Chol"은 3'-말단에 콜레스테롤이 첨가된 형태를 의미하는 것이다.
실시예 5: 화학적 변형이 도입된 비대칭 siRNA 스크리닝
5.1 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 4의 ROR-beta cp-asiRNA의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 각각의 cp-asiRNA를 Y-79 세포에 처리하고, 이를 인큐베이션 (free uptake)한 후, 웨스턴 블랏으로 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, Y-79 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 cells/well로 씨딩하였고 이로부터 24시간 후, 여기에 1 μM의 cp-asiRNA를 첨가한 후, 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco, 16000-044)가 포함된 RPMI(Gibco, 11875-093) media 조건에서 세포를 인큐베이션하였다(free uptake). 48시간 후, 세포를 파쇄하여 cell lysate를 수득한 후 웨스턴 블랏을 진행하였다. 상기 수득한 cell lysate를 대상으로, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ROR-beta 항체(Proteintech, Cat. #17635-1), 및 Vinculin 항체(Santa Cruz Biotechonology, Cat. #sc-73614)를 사용하여 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 음성 대조군은 비처리군을 이용하였으며, 양성 대조군은 화학적 변형이 도입되지 않은 ROR-beta asiRNA를 lipofectamine RNAiMAX를 이용해 10 nM의 농도로 transfection 처리한 군을 이용하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, ROR-beta cp-asiRNA의 처리에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히, 이들 중에서도 우수한 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과를 나타내는 10종(4, 5, 6, 10, 24, 25, 32, 43, 52, 53)의 ROR-beta cp-asiRNA를 확인하였다.
상기 10종의 cp-asiRNA에 의한 ROR-beta 단백질 억제 효과를 재확인하기 위하여, 동일한 과정으로 2 μM의 농도로 처리한 후 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이 ROR-beta cp-asiRNA의 처리에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히, 이들 중에서도 cp-asiRNA 4, 5, 10, 24, 25, 32, 52에서 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과의 재현성을 확인하였다.
5.2. ROR-beta 과발현 조건에서의 ROR-beta 단백질 억제 효과 확인
본 실시예에서는 ROR-beta plasmid(Origene, RC208666)을 이용하여 일시적으로 ROR-beta를 발현하는 cell (transient cell line)에서의 cp-asiRNA의 단백질 억제 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로는 A549 세포를 10% FBS를 첨가한 Ham's F-12K (Kaighn's) Medium (Gibco, 21127022)을 이용하여 12-well 플레이트에 웰 당 5×10⁴개씩 분주하고 24시간 뒤 200 ng의 ROR-beta plasmid를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, 11668-019)과 Opti-MEM reduced serum media(gibco, 31985-070)에 incubation한 후 세포에 처리하였다. 6 시간 후 PBS를 이용하여 plate wash를 수행한 후 Opti-MEM reduced serum media 조건에서 1 μM의 cp-asiRNA와 함께 24 시간 incubation하였다(free uptake). 다음 날 Ham's F-12K (Kaighn's) Medium (10% FBS)으로 바꾸어 주고 하루 뒤에 세포를 파쇄하여 cell lysate를 수득한 후, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔, ROR-beta 항체(Proteintech, Cat. #17635-1), Vinculin 항체(Santa Cruz Biotechonology, Cat. #sc-73614) 및 Neomycin Phosphotransferase II 항체 (Invitrogen, Cat. MA5-15275)를 사용하여 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 Neomycin Phosphotransferase II 항체는 plasmid transfection에 대한 control로서 사용되었으며, 음성 대조군은 ROR-beta plasmid가 처리된 cp-asiRNA 비처리군을 이용하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 비처리군 대비 높은 단백질 발현 저해 효과를 확인하였다. 특히, 본 실시예의 결과는 실시예 5.1의 Y-79 세포주에서의 ROR-beta 단백질 억제 효과와 유사한 경향성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 5.1 및 5.2의 결과를 종합하여 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과가 우수한 5종의 cp-asiRNA(4, 5, 10, 24, 25)를 확인하였다.
실시예 6: 도출된 cp-asiRNA에 대한 ROR-beta 발현 억제 효율 확인
6.1. ROR-beta mRNA 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 5에서 도출한 ROR-beta cp-asiRNA 5종(4, 5, 10, 24, 25)의 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위하여 일시적으로 ROR-beta를 발현하는 A549 세포주에 200 nM 또는 500 nM의 cp-asiRNA를 처리한 후, Real-Time PCR로 ROR-beta mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, A549세포를 96-웰 플레이트에 8x103 cells/well로 씨딩하였고, 다음 날 10 ng의 ROR-beta plasmid를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, 11668-019)과 Opti-MEM reduced serum media(gibco, 31985-070)에 incubation한 후 세포에 처리하였다. 6 시간 후 PBS를 이용하여 plate wash를 수행한 후 Opti-MEM reduced serum media 조건에서 200 nM 또는 500 nM의 cp-asiRNA와 함께 24 시간 incubation하였다(free uptake). 이후 SuperPrep II Cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cell lysate으로부터 cDNA를 합성한 뒤, TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, ROR-beta: Hs00199445_m1, RN18S1: Hs03928985_g1), THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (TOYOBO, QPS-101) 및 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)을 이용하여 qRT-PCR(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)에 의한 표적 mRNA인 ROR-beta의 발현 수준을 분석하였다. 본 실시예에서 음성 대조군은 ROR-beta plasmid가 처리된 cp-asiRNA 비처리군을 이용하였으며, 양성 대조군은 화학적 변형이 도입되지 않은 ROR-beta asiRNA를 lipofectamine RNAiMAX를 이용해 10 nM의 농도로 transfection 처리한 군을 이용하였다.
그 결과 도 8과 같이, 5종의 cp-asiRNA 모두 500 nM의 농도 처리 시 80% 이상, 200 nM의 농도 처리 시 70% 이상의 mRNA 발현 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
6.2. ROR-beta 단백질 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 5에서 도출한 ROR-beta cp-asiRNA 5종(4, 5, 10, 24, 25)의 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위하여, 일시적으로 ROR-beta를 발현하는 A549 세포주에 200 nM 또는 500 nM의 cp-asiRNA를 처리한 후, 웨스턴 블랏으로 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, A549 세포를 10% FBS를 첨가한 Ham's F-12K (Kaighn's) Medium (Gibco, 21127022)을 이용하여 12-well 플레이트에 웰 당 5×10⁴개씩 분주하고 24시간 뒤 200 ng의 ROR-beta plasmid를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, 11668-019)과 Opti-MEM reduced serum media(gibco, 31985-070)에 incubation한 후 세포에 처리하였다. 6 시간 후 PBS를 이용하여 plate wash를 수행한 후 Opti-MEM reduced serum media 조건에서 200 nM 또는 500 nM의 cp-asiRNA와 함께 24 시간 incubation하였다(free uptake). 다음 날 Ham's F-12K (Kaighn's) Medium (10% FBS)으로 바꾸어 주고 하루 뒤에 상기 실시예 5.2와 동일한 방식으로 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 본 실시예에서 음성 대조군은 ROR-beta plasmid가 처리된 cp-asiRNA 비처리군을 이용하였으며, 양성 대조군은 화학적 변형이 도입되지 않은 ROR-beta asiRNA를 lipofectamine RNAiMAX를 이용해 10 nM의 농도로 transfection 처리한 군을 이용하였다.
그 결과 도 9에 나타난 바와 같이 ROR-beta cp-asiRNA의 처리에 따른 ROR-beta 단백질의 발현 억제 효과를 확인하였다. 특히, 이들 중에서도 ROR-beta 단백질 억제 효과가 우수한 cp-asiRNA 4, 5를 최종 도출하였다. 도 10은 cp-asiRNA 4, 5번인 OLX304C-026-4 및 OLX304C-026-5를 나타낸다.
실시예 7: 정상 마우스 안구에서 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 도출한 ROR-beta cp-asiRNA 2종(OLX304C-026-4, OLX304C-026-5)이 in vivo에서도 높은 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과를 갖는지 확인하기 위하여, 정상 마우스 안구에 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-5을 투여한 후 웨스턴 블랏으로 ROR-beta 단백질의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, 8 주령의 수컷 C57Bl6 마우스 양안에 유리체강내 주사 (intravitreal injection; IVT)를 통해 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-5을 0.6 μg/μl 용량으로 1 μl 투여하였다. 투여 과정은 구체적으로 미드린피 점안액 (Santen, E00170121)을 점안 후 0.3 ml 31G 인슐린 주사기 (BD, 328822)를 사용하여 마취제를 복강 주사하여 마취를 진행한 후 알카인 점안액 (알콘, E07370271)을 점안하여 안구마취를 진행하였다. 산동과 마취가 진행된 마우스 안구를 수술 현미경 (Leica, M844 F40)으로 확인하면서 0.3 ml 31G 인슐린 주사기로 안구 공막에 작은 구멍을 만들었다. Microthin Dual Gauge Needle with taper 90° (35G) (Ito co., DWG.No.5-0608)를 부착한 10 μl Exmire microsyringe (Ito co, MS*NE10U)를 사용하여 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-5을 1 μl씩 투여하였다. 맥시트롤 안연고 (알콘, E07370151)를 도포하여 염증을 막아주고 체온유지를 위해 온열매트 위에서 마취가 깨도록 기다렸다. 투여 7일째에 안구를 적출하여 망막과 망막색소상피세포(retinal pigmented epithelium, RPE)/맥락막층 (Choroid)을 각각 분리하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 8% SDS-polyacrylamide gel에 각 well당 20 μg을 전기 영동 후, ROR-beta (17635-1-AP, 1:500), Vinculin (sc-73614, 1:2000)으로 확인하였다.
그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, OLX304C-026-4와 OLX304C-026-5 모두 0.6 μg 용량 처리 시 정상 마우스의 망막 조직에서 60~78%의 ROR-beta 단백질 발현 억제 효과를 보였고, 마찬가지로 RPE/choroid 층에서도 약 40%의 단백질 억제 효과를 보였다.
실시예 8: 정상 마우스 안구에서 투여 용량에 따른 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 도출한 ROR-beta cp-asiRNA 2종 중 하나인 OLX304C-026-4와 상기 OLX304C-026-4의 센스 가닥 3' 말단에 콜레스테롤 대신 팔미트산을 첨가하여 추가로 합성한 OLX304C-026-26이 in vivo에서 높은 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 갖는지 확인하기 위하여, 정상 마우스 안구에 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-26을 투여한 후 Real-Time PCR로 ROR-beta mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, 7 주령의 수컷 C57Bl6 마우스 양안에 유리체강내 주사 (intravitreal injection; IVT)를 통해 OLX304C-026-4는 0.1, 0.4, 1.0 μg/μl으로, OLX304C-026-26은 0.4, 1.0, 4.0 μg/μl의 용량으로 1 μl 투여한 점을 제외하고는 상기 실시예 7과 동일한 투여 과정으로 진행하였으며, 투여 7일째에 안구를 적출하여 망막 조직에서 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 RNeasy Plue Mini Kit (QIAGEN, 74136)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 진행하였다. 추출된 RNA는 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™, 4368814)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cNDA 합성후 TB Green® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa, RR820B) 제품 및 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)을 이용하여 qRT-PCR(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)에 의한 표적 mRNA인 ROR-beta의 발현 수준을 분석하였다. ROR-beta (F: 5`- TGCCCAAGTCCGAAGGTTATT-3`(서열번호 125), R: 5`- CCATGCCAGCTGATGGAGTT-3`(서열번호 126), GAPDH (F: 5`-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3`(서열번호 127), R: 5`- GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3`(서열번호 128)) primer를 사용하여 qRT-PCR을 진행하였다.
그 결과 도 12에 나타난 바와 같이, 2종의 cp-asiRNA 모두 용량 의존적으로 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 보였으며, OLX304C-026-4는 1.0 μg에서 약 97%, OLX304C-026-26은 4.0 μg에서 약 87% 발현 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
[표 5]
Figure pat00012
상기 표 5에 "*", "m", "f", 및 "PA"로 표기된 화학적 변형은 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
[표 6]
Figure pat00013
실시예 9: 정상 마우스 안구에서 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과의 지속 기간 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 7에서 도출한 ROR-beta cp-asiRNA 2종 중 하나인 OLX304C-026-4의 ROR-beta mRNA 억제 효과 지속 기간을 확인하기 위하여. 정상 마우스 안구에 OLX304C-026-4를 투여한 후 Real-Time PCR로 ROR-beta mRNA의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로, 7 주령의 수컷 C57Bl6 마우스 안구에 유리체강내 주사 (intravitreal injection; IVT)를 통해 OLX304C-026-4를 1.0 또는 2.0 μg/μl 용량으로 1 μl 투여하고, 투여 14일, 21일, 또는 28일째에 안구를 적출하여 망막 조직에서 RNA를 추출한 점을 제외하고는 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과 도 13에 나타난 바와 같이, OLX304C-026-4는 2 μg 투여 후 28일까지도 약 44%의 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 유지하였다. 장기간 유지되는 경향은 1 μg 투여보다 2 μg에서 더 효력을 보였으며 투여 후 28일에서는 두 용량에서 비슷한 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 1 μg으로 투여시 3주까지 약 50% 이상의 ROR-beta mRNA 발현 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 10: 망막색소변성증 (retinitis pigmentosa; RP) 질환 모델 마우스에서의 치료 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 8에서 검증된 최적의 ROR-beta mRNA 발현 억제 용량을 투여하여 망막색소변성증 질환 모델 마우스에서 효력 실험을 진행하였다. 구체적으로, 대표적인 망막색소변성증 질환 모델 마우스로 알려진 Rho P23H knock-in 마우스의 이형접합체 (heterozygote)를 실험에 사용하였다. 상기 실시예 8의 결과에 따라, OLX304C-026-4는 1.0 μg, OLX304C-026-26은 4.0 μg을 투여한 후 21일째에 안구 조직 분석 및 망막전위도(Electroretinogram; ERG) 검사를 수행하여 치료 효과를 확인하였다. OLX304C-026-4와 OLX304C-026-26의 안구체강내 주사는 실시예 8과 동일하게 진행하였으며 H&E 염색은 파라핀 섹션을 통해 얻은 조직 절편을 사용해 자동 슬라이드 염색기로 염색하였다. ERG 촬영은 마우스를 촬영 하루 전 암실에서 암순응을 진행하고 빛이 없는 상태를 유지한 상태로 촬영을 진행하였다. 실시예 8과 동일하게 산동과 마취를 진행하고 ground 전극을 꼬리 바로 위 가죽에, reference 전극을 미간에 고정하였다. 안구에 하이셀 멸균액 2% (삼일제약, A05050401)를 도포해 Ganzfeld ERG (Phoenix, MICRON Ganzfeld ERG)기기에 안구가 잘 접촉하도록 위치를 잡아 준 후 낮은 세기의 빛 자극부터 높은 세기의 빛 자극까지 차례로 촬영을 진행하였다.
그 결과 도14에 나타난 바와 같이, OLX304C-026-4와 OLX304C-026-26에서 안구조직의 H&E 염색을 통한 각 층의 두께를 비교한 결과, OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-26을 투여한 안구 조직의 두께가 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히 대조군에 비해 광수용세포가 주로 위치한 ONL(outer nuclear layer)의 두께의 증가가 시각 기능의 복구와 연관되어 있을 것으로 보이며. 이를 통해 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-26의 투여가 ONL 층이 무너지는 것을 보호한다는 것을 알 수 있었다.
마찬가지로, ERG 측정 결과를 나타낸 도 15에서도, OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-26 투여군에서 손상된 a-파가 각각 약 25%, 25%, b-파가 각각 약 42%, 65% 대조군 대비 유의미하게 복구되는 것을 확인하였다. 이는 망막색소변성증 환자에서의 다양한 유전적 결함을 가진 간상세포를 원추세포로 변환시키는 전략으로서 ROR-beta를 타겟팅하는 OLX304C-026-4 또는 OLX304C-026-26의 유리체강내 투여를 통해 시각 손상을 지연시키거나 치료될 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> OliX Pharmaceuticals, Inc. Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Asymmetric nucleic acid molecules inducing RNA interference that Inhibits Expression of ROR-beta <130> PN142692 <150> KR 10-2020-0169855 <151> 2020-12-07 <160> 128 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-001 sense <400> 1 aaauuugugg cgauaa 16 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-001 antisense <400> 2 uuaucgccac aaauuuugc 19 <210> 3 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-002 sense <400> 3 aaaauuugug gcgaua 16 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-002 antisense <400> 4 uaucgccaca aauuuugca 19 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-003 sense <400> 5 accaugcaaa auuugu 16 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-003 antisense <400> 6 acaaauuuug caugguauc 19 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> 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<223> asiRORB-059 sense <400> 117 guuaauagcc aagaua 16 <210> 118 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-059 antisense <400> 118 uaucuuggcu auuaacuuu 19 <210> 119 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-060 sense <400> 119 aguuaauagc caagau 16 <210> 120 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-060 antisense <400> 120 aucuuggcua uuaacuuug 19 <210> 121 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-061 sense <400> 121 aaguuaauag ccaaga 16 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-061 antisense <400> 122 ucuuggcuau uaacuuugc 19 <210> 123 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-062 sense <400> 123 gaauacacug uuuccu 16 <210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asiRORB-062 antisense <400> 124 aggaaacagu guauucacu 19 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROR-beta Forward primer <400> 125 tgcccaagtc cgaaggttat t 21 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROR-beta Reverse primer <400> 126 ccatgccagc tgatggagtt 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 127 gggtgtgaac cacgagaaat 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 128 gtcatgagcc cttccacaat 20

Claims (16)

  1. ROR-beta(Retinoid-related orphan nuclear receptor)를 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적 결합을 형성하는 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 센스 가닥은 15 내지 17nt의 길이를 가지고, 상기 안티센스 가닥은 18nt 내지 23nt의 길이를 가지는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 27, 29, 51, 83, 85, 91, 95, 97, 103, 105, 107, 109, 및 115로 구성된 군에서 선택되는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 27, 29, 51, 및 109로 구성된 군에서 선택되는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 28, 30, 52, 84, 86, 92, 96, 98, 104, 106, 108, 110, 및 116으로 구성된 군에서 선택되는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 28, 30, 52, 및 110으로 구성된 군에서 선택되는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자:
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, 또는 -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 산소가 황으로 치환;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및
    인산기(phosphate group), 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 침투 펩타이드 결합.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 친유성 화합물(lipophilic compound)은 콜레스테롤, 토코페롤, 스테아르산(stearic acid), 레티노산(retinoic acid), DHA(docosahexaenoica cid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid) 및 탄소수 10개 이상의 장쇄 지방산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 센스 가닥은 하기로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자:
    3'말단으로부터 인접한 2 내지 4개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    3' 말단에 친유성 화합물(lipophilic compound) 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 하기로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자:
    3'말단으로부터 인접한 3 내지 5개의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형;
    2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 및
    5' 말단에 인산기(phosphate group) 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는
    센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 2개 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -OCH3(methoxy) 또는 -F(불소)로 치환되는 변형;
    센스 또는 안티센스 가닥에서 10% 이상의 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 변형;
    센스 가닥의 3' 말단에 콜레스테롤 또는 팔미트산 결합; 및
    안티센스 가닥의 5' 말단에 인산기(phosphate group) 결합;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 하기로부터 선택된 어느 하나의 안티센스 가닥을 포함하며,
    (a) P-mUAGGfUAAAfCAAGfUfUG*G*G*fU*A; 및
    (b) P-mUfAmGfGmUfAmAfAmCfAmAfGmUfUmG*fG*mG*fU*mA,
    상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-OCH3로의 치환, f는 2'-F의 치환, P는 5'-인산기의 결합을 의미하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 하기로부터 선택된 어느 하나의 센스 가닥을 포함하며,
    (A) mCmCAACUUGUUUACC*mU*mA*chol;
    (B) mCCmAAmCUmUGmUUmUAmCC*mU*A*chol;
    (C) mCfCmAfAmCfUmUfGmUfUmUfAmCfC*mU*fA*chol; 및
    (D) mCmCAACUUGUUUACC*mU*mA*PA,
    상기에서, *는 포스포로티오에이트 결합으로의 변형, m은 2'-OCH3로의 치환, chol은 3'-콜레스테롤의 결합, PA는 3'-팔미트산의 결합을 의미하는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  14. 청구항 7에 있어서, 상기 RNAi 유도용 핵산 분자는 세포 관통능(cell-penetrating ability)을 가지는 것인 RNAi 유도용 핵산 분자.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따른 RNAi 유도용 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 망막질환의 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 망막질환은 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바뎃-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congenital Amaurosis; Leber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventinese), 오구치병(Oguchi disease) 및 레프섬병(Refsum disease)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
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