KR20220119038A - 종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장을 위한 방법 - Google Patents

종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장을 위한 방법 Download PDF

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니콜라스 존 콜레티
노아 제이콥 투보
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케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

종양 침윤 림프구(TIL)를 1단계 방법으로 활성화 및 확장시키는 방법이 제공된다. 피더 세포를 사용하지 않고 TIL을 활성화 및 확장시키는 방법이 또한 제공된다. 중앙 기억 T 세포 표현형이 풍부한 확장된 TIL의 단리된 집단에 더하여, TIL의 확장된 집단의 조성물이 또한 제공된다.

Description

종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장을 위한 방법
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 제62/940,035호(출원일: 2019년 11월 25일); 및 미국 가출원 제63/081,539호(출원일: 2020년 9월 22일)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 개시내용은 림프구 집단, 특히 종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장 방법에 관한 것이다.
종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)의 입양 전달은 특히 불량한 예후를 갖는 환자에서, 부피가 큰 난치성 암의 치료에 대한 강력한 접근법이다. 많은 수의 TIL은 확장을 위한 강력하고 신뢰할 만한 과정이 필요한 성공적인 면역요법을 필요로 한다. 전형적으로 IL-2-기반 TIL 확장 "사전(pre)-REP", 후속 "신속한 확장 프로토콜"(rapid expansion protocol: REP)을 포함하는 다단계 방법은 치료적으로 유효한 수의 TIL을 생성하는 능력으로 인해서 TIL 확장에 바람직한 방법이 되었지만, 그 방법이 소모하는 시간으로 인해서 여전히 제한적이다. 최대 6주 동안 지속될 수 있는 사전-REP 단계 후, 그 다음 REP는 14일 기간에 걸쳐서 TIL의 1,000배 확장을 초래할 수 있다. REP는 많은 용량의 항-CD3 항체(OKT3) 및 IL-2를 필요로 할 뿐만 아니라, TIL을 활성화시키기 위해서 상당히 과량(예를 들어, 200배)의 피더 세포(feeder cell)를 필요로 하는 어려운 방법이다.
현재 존재하는 REP-기반 TIL 확장 방법의 가장 도전적인 양상 중 하나는 피더 세포를 얻고 사용할 필요성이다. 이러한 REP-기반 방법에서, TIL의 활성화는 피더 세포의 존재에 좌우된다. 피더 세포의 집단은 보통 3 내지 5명의 동종이계 공여자로부터 수집되는데, 이는 피더 세포의 집단을 수집하고, 방사선 조사하고, 유지시키는 방법을 제어하는 것을 고비용이고 어렵게 만든다. 따라서, 피더 세포의 사용이 고비용이고 도전적이긴 하지만, 이것은 TIL 활성화 및 확장 방법에서 필수적이라고 생각된다.
따라서 보다 능률적인 TIL 확장 방법이 필요하다.
보다 능률적인 접근법, 예컨대, 1단계 접근법, 더 짧은 확장 기간이 필요한 접근법, 자극을 위해서 가용성 시약을 사용하는 접근법, 임상 제조에 더 적합한 접근법 및 피더 세포를 사용하지 않는 접근법을 사용하여 TIL을 활성화하는 방법 및 확장하는 방법이 제공된다. 중앙 기억 T 세포 표현형이 풍부한 확장된 TIL의 단리된 집단에 더하여, TIL의 확장된 집단의 조성물이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 피더 세포의 부재 하에서 T 세포 수용체(TCR) 효능제(예를 들어, CD3 효능제)와 CD28 효능제의 조합을 사용하여 TIL이 활성화 및 확장될 수 있다는 것을 예상치 못하게 발견하였다. TCR 효능제 및 CD28 효능제는 서로에 연결되거나, 서로와 복합체를 형성하거나, 나노매트릭스에 연결된 항체일 수 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 기재된 피더 세포-무함유 TIL 활성화 및 확장 방법은 TIL의 150,000배 확장 및 풍부해진 중앙 기억 T 세포 표현형을 초래할 수 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 기재된 피더 세포-무함유 TIL 활성화 및 확장 방법은 또한 1단계 방법의 제14일까지 4,000 내지 100,000배 확장을 초래할 수 있다. 이러한 강력한 확장은 심지어는 사전-REP 조건 하에서 확장에 실패한 다수의 공여자로부터의 샘플에서도 관찰되었다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 현재 실시 표준(current standard of practice)인 2-단계 TIL 확장 방법이 실패하는 상황에서 확장된 TIL을 생성시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 또한 예상치 못하게, 사전-REP 및 REP 단계를 분리할 필요 없이 1단계 방법을 사용하여 TIL이 활성화되고 확장될 수 있다는 것을 발견하였다.
일 양상에서, 본 발명은 응집되지 않은(disaggregated) 종양 샘플에서 TIL의 집단의 집단을 확장시키는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 응집되지 않은 종양 샘플을 배지에서 배양하는 단계를 포함하고, TIL은 TCR 효능제, CD28 효능제 및 T 세포-자극 사이토카인과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 배지는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 T 세포-자극 사이토카인이 보충된다.
일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 10U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인은 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 배지는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 변경된다.
일부 실시형태에서, 배지의 성분은 유지된다. 일부 실시형태에서, 배지 중 30% 내지 99%는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 변경된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 방법은 이전에 실패한 사전-REP 확장으로부터의 TIL 샘플을 구제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 샘플은 TIL 확장을 위해서 종양의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만이었다. 일부 실시형태에서, 종양 샘플은 TIL 확장을 위해서 종양의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만이었다.
일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플은 0.5 내지 4㎣ 크기인 종양 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플은 절단된 종양 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 배지는 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 말초 혈액 단핵 세포 또는 항원 제시 세포이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 TCR 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 효능제를 발현한다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 효능제는 피더 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 TCR 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 리간드를 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제는 CD3 효능제이다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 OKT3이다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 CD86이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 항원 제시 세포이다. 일부 실시형태에서, 항원 제시 세포는 K562 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 TCR 효능제 및/또는 4-1BB 효능제를 발현한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 4-1BB 리간드이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 T 세포-자극 사이토카인을 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인은 IL-2이다.
일부 실시형태에서, 배지는 피더 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 배지 중에 가용성이다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제는 CD3 효능제이다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제 및/또는 CD28 효능제는 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스에 연결되어 있고, 각각의 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD3 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD28 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 CD2 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD2 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD2 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 TIL의 집단을 확장시키는 방법에 관한 것이며, TIL의 집단을 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하고, 매트릭스는 CD3 효능제 및 CD28 효능제에 부착되고, 나노매트릭스는 활성화 신호를 상기 TIL의 집단에 제공하여, TIL의 집단을 활성화시켜 이것이 증식하도록 유도하고, 각각의 매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚의 길이이고, 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스와 접촉된 TIL의 집단은 종양 세포를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 집단을 나노매트릭스와 접촉시키기 전에 TIL의 집단의 추가 확장 공정 없이 대상체로부터 단리되고, 나노매트릭스와 접촉된다.
일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 중합체 쇄의 매트릭스 내에 또는 그 사이에 내장된 자성, 상자성 또는 초상자성 나노결정을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체 쇄의 매트릭스는 덱스트란의 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합체 쇄는 콜로이드성 중합체 쇄이다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:5 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:500 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400 또는 1:500 이상이다.
일부 실시형태에서, CD28 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, 효능제는 재조합 효능제이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 OKT3 또는 UCHT1이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 방법은 이전에 실패한 사전-REP 확장으로부터의 TIL 샘플을 구제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만이다. 일부 실시형태에서, 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 TIL의 집단을 제1, 제2 및 제3 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 TIL의 집단을 확장시키는 방법에 관한 것이며, 각각의 가용성 단일특이적 복합체는 함께 연결된 2개의 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 각각의 가용성 단일특이적 복합체의 각각의 항체 또는 이의 단편은 TIL의 집단 상의 동일한 항원에 특이적으로 결합하고, 제1 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD3 항체를 포함하고, 제2 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD28 항체를 포함하고, 제3 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD2 항체를 포함하고, 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 조성물과 접촉된 TIL의 집단은 종양 세포를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 집단을 조성물과 접촉시키기 전에 TIL의 집단의 추가 확장 공정 없이 대상체로부터 단리되고, 조성물과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 0.2 내지 25㎕/㎖의 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 사량체 항체 복합체(TAC)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 TAC는 제1 동물 종으로부터의 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 제2 종으로부터의 2개의 항체 분자에 의해서 결합된 제1 동물 종으로부터의 2개의 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 OKT3 항체 또는 UCHT1 항체이다. 일부 실시형태에서, 방법은 TIL의 집단을 사이토카인 IL-2와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, TIL은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 상기 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 100U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 방법은 이전에 실패한 사전-REP 확장으로부터의 TIL 샘플을 구제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만이다. 일부 실시형태에서, 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만이다.
일부 실시형태에서, TIL은 최대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 9 내지 25일, 9 내지 21일 또는 9 내지 14일 동안 확장된다.
일부 실시형태에서, TIL은 500 내지 500,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 100 내지 100,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 1,500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 15,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 500,000배 확장된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 유전자 변형된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 유전자-조절 시스템에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 RNA 간섭을 사용하여 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN)를 사용하여 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease)를 사용하여 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 RNA-가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease)를 사용하여 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 Cas 효소 및 적어도 1종의 가이드 RNA를 사용하여 변형된다. 일부 실시형태에서, Cas 효소는 Cas9이다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, 상기 1종 이상의 유전자에서의 변형은 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 유전자에서의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 후성적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 후성적 변형은 히스톤 변형이다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자에서 변형되고, 1종 이상의 유전자에서의 변형은 하나 이상의 핵산의 메틸화이다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 유전자에서의 변형은 하나 이상의 핵산의 메틸화이다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 유전자에서의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 1종 초과의 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 유전자 및 1종 이상의 추가 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 유전자 및 ZC3H12A, PTPN2, CBLB, RC3H1 또는 NFKBIA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가 유전자에서 변형된다. 구체적인 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 ZC3H12A 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 PTPN2 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 및 PTPN2 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 ZC3H12A 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 및 ZC3H12A 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 CBLB 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 및 CBLB 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 RC3H1 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 및 RC3H1 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 NFKBIA 유전자에서 변형된다. 일부 실시형태에서, SOCS1 및 NFKBIA 유전자의 변형은 유전자의 발현 및/또는 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래한다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 10%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 15%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 5 내지 50%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 10 내지 25%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해서 생산된 TIL의 확장된 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 예시적인 실시형태의 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 것이다.
도 1 은 피더 세포를 사용한 TIL 생산 워크플로우를 도시한 개략도.
도 2 는 TIL 제조를 위한 4가지 방법을 도시한 개략도: 방법 1(피더 세포를 사용하지만 사전-REP 단계("REP-유사")가 없는 1-단계 REP); 방법 2(항-CD3 및 항-CD28 항체 접합된 Dynabeads("Dynabeads") 사용); 방법 3(항-CD3, 항-CD2 및 항-CD28 항체-기반 사량체 항체 복합체(TAC)("Stemcell") 사용); 및 방법 4(항-CD3 및 항-CD28 항체-접합된 나노매트릭스("Transact") 사용).
도 3. 도 3A는 제14일에 TIL의 배수 확장을 도시한 플롯. 도 3B는 제21일에 TIL의 배수 확장을 도시한 플롯. 각각의 도면 패널에서 각각의 점은 독립적인 흑색종 공여자를 나타낸다. 방법 1(REP-유사), 방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰의 Dynabeads), 방법 3(Stemcell), 방법 4(Transact) 및 대조군(IL-2 단독)을 사용하여 생성된 데이터를 나타낸다.
도 4 는 세포 계수치에 대한 게이팅 전략을 제공한 일련의 FACS 분석을 도시한 도면.
도 5. 도 5A는 제0일, 제9일 및 제14일에 CD3+ T 세포인 배양물에서의 살아있는 세포의 백분율을 도시한 플롯. 도 5B는 제14일에 중앙 기억 표현형(Tcm, CCR7+ CD45RO+로 정의됨)을 갖는 T 세포의 백분율을 도시한 플롯 방법 1(REP-유사), 방법 3(Stemcell), 방법 4(Transact) 및 대조군(IL-2 단독)을 사용하여 생성된 데이터를 나타낸다.
도 6 은 제14일에 3명의 독립적인 공여자로부터의 중앙 기억 T 세포 표현형을 나타낸 일련의 FACS 분석.
도 7 은 3명의 독립적인 공여자로부터의 TIL pan T 세포 확장의 FACS 계수 비드 분석을 사용하여 제14일에 배수 확장을 도시한 막대 그래프.
도 8 은 조합된 공여자로부터의 TIL pan T 세포 확장의 FACS 계수 비드 분석을 사용하여 제14일에 배수 확장을 도시한 막대 그래프. 방법 1(REP-유사), 방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰의 Dynabeads), 방법 3(Stemcell), 방법 4(Transact) 및 대조군(IL-2 단독)을 사용하여 생성된 데이터를 나타낸다.
도 9 는 3명의 독립적인 공여자로부터의 TIL pan T 세포 확장의 FACS 계수 비드 분석을 사용하여 제21일에 추정 배수 확장을 도시한 막대 그래프. 방법 1(REP-유사), 방법 3(Stemcell) 및 방법 4(Transact)를 사용하여 생성된 데이터를 나타낸다.
도 10 은 시딩 밀도의 함수로서 시간에 따른 제0일 대비 제14일의 배수 확장을 도시한 플롯.
도 11 은 방법 1(REP-유사), 방법 3(Stemcell) 및 방법 4(Transact)를 사용하여 생산된 TIL 공여자 샘플에서 IFNγ(도 11A), IL-2(도 11B), IL-6(도 11C) 및 TNFα(도 11D)의 발현의 배수 유도를 도시한 막대 그래프.
도 12 는 TIL이 방법 1(REP-유사), 방법 3(Stemcell) 또는 방법 4(Transact)를 사용하여 확장된 경우 전기천공 8일 후 TIL의 생존율 및 CD45 편집 백분율을 도시한 도면.
도 13 은 방법 1(REP-유사 또는 "REP"), 방법 3(Stemcell 또는 "Stem"), 방법 4(Transact 또는 "Trans"), 방법 5(aAPC-OKT3 또는 "OKT3") 및 방법 6(aAPC-OKT3-CD86 또는 "OKT3+CD86")을 사용하여 제10일 및 제11일에 가용성 사량체 및 aAPC에 대한 배수 확장을 나타낸 막대 그래프.
도 14 는 제18일(D3399) 또는 제23일(D6752 및 D6755)에 가용성 사량체 및 aAPC 편집된 TIL에 대한 배수 확장을 나타낸 막대 그래프.
도 15 는 제18일(D3399) 또는 제23일(D6752 및 D6755)에 편집된 TIL에 대한 중앙 기억 표현형을 나타낸 막대 그래프.
도 16 은 제18일(D3399) 또는 제23일(D6752 및 D6755)에 편집 빈도의 표.
도 17 은 제14일 또는 제20일에 TIL 종양 단편 추정 세포 계수치를 나타낸 막대 그래프.
도 18 은 제14일 또는 제20일에 중앙 기억 표현형(%)을 나타낸 막대 그래프.
도 19 는 제14일 또는 제20일에 편집 빈도의 표.
도 20 은 제14일 또는 제20일에 편집 빈도의 표.
도 21 은 종양 단편 및 소화물로부터 제조된 상이한 공여자로부터의 TIL의 생존율을 나타낸 막대 그래프.
도 22 는 종양 단편 및 소화물로부터 제조된 상이한 공여자로부터의 TIL에 대한 세포 수를 나타낸 막대 그래프.
TIL의 통상적인 활성화 및 확장 공정은 적어도 별도의 사전-REP 단계 및 REP 단계를 포함하는, 다중 단계에 더하여 피더 세포의 사용을 필요로 한다. 두 요구 사항 모두는 기존 과정을 시간 소모적이고 고비용도록 한다. TIL의 입양 전달을 사용한 면역요법을 필요로 하는 환자는 종종 매우 불량한 예후를 가지며, 더 신속하게 요법에 사용할 수 있는 확장되고 분화된 TIL 집단을 갖는 것이 삶과 죽음의 차이를 구성할 수 있다.
치료 용도에 충분한 TIL의 활성화 및 배수 확장을 달성하기 위해 일반적으로 더 빠른 REP 단계 전에 일반적으로 더 느린 사전-REP 단계를 수행할 필요성은 시간 소모적이고 고비용이다. 특정 응용 분야에서, 종래의 방법의 사전-REP 단계는 2 내지 6주 동안 지속될 수 있으며, 추가로 1 내지 3주의 REP가 지속될 수 있다. 따라서, 피더 세포를 사용하거나 사용하지 않고, 사전-REP 단계를 제거하고, TIL 제조 공정을 1단계로 간소화할 필요가 있다.
피더 세포에 대한 의존성은 적어도 몇 가지 이유로 특히 도전적이다. 첫째, 세포가 3 내지 5개의 동종이계 공여자로부터 수집되기 때문에 생존 가능한 피더 세포 집단을 얻는 것이 매우 어렵다. 피더 세포의 이종성 공급은 공여자 세포의 각각의 집단이 TIL을 확장하는 능력에 대해 개별적으로 자격을 갖추어야 하기 때문에 그들의 사용을 표준화 불가능하게 만든다. 또한, 피더 세포의 고유한 가변성으로 인해, 피더 세포를 사용한 TIL 확장은 재현성 및 예측 가능성이 줄어든다. 둘째, 피더 세포를 사용하는 경우, TIL은 피더 세포의 존재 하에서 조작될 수 없기 때문에 TIL은 REP 단계 전 또는 후에만 조작되거나 유전적으로 변형될 수 있다. 셋째, REP 단계를 포함하는 TIL 제조 방법에서, 확장된 TIL의 집단은 피더 세포가 죽을 때까지 사용될 수 없기 때문에 REP를 단축할 수 없다. 넷째, TIL을 자극하기 위해 피더 세포를 사용하면 자극제를 씻어내거나 제거할 수 없다. 따라서 일부 경우에는 기존 과정의 사전-REP 및 REP 단계가 원하는 수의 TIL을 생성하지 못한다. 상기에 기재된 적어도 4가지 이유 때문에, 본 발명에서 달성되고 본 명세서에 개시된 피더 세포에 대한 의존성을 제거할 필요가 있다. 피더 세포를 제거하면 TIL 확장 공정에 대한 제어가 향상될 수 있다. 예를 들어, 필요한 TIL 수가 달성되는 경우 TIL 확장 공정을 중단할 수 있다.
TIL을 생산하기 위한 개선되고 더 빠르고, 더 간단한 방법을 제공하기 위해, 본 개시내용은 보다 능률적인 접근법, 예컨대, 1단계 접근법, 더 짧은 확장 기간이 필요한 접근법, 자극을 위해서 가용성 시약을 사용하는 접근법 및 피더 세포를 사용하지 않는 접근법을 사용하여 TIL을 활성화하는 방법 및 확장하는 방법을 제공한다. 중앙 기억 T 세포 표현형이 풍부한 확장된 TIL의 단리된 집단에 더하여, TIL의 확장된 집단의 조성물이 또한 제공된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 활성화가 CD3 및 CD28 효능제와의 접촉을 통해 발생하는, 피더 세포를 사용하지 않고 1-단계 과정으로 TIL을 활성화하는 방법 및 확장하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, CD3 및 CD28 효능제는 나노중합체 쇄의 매트릭스에 결합되어 있다. 특정 실시형태에서, CD3 및 CD28 효능제는 서로에 연결되거나 서로와 복합체를 형성한 항체 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 확장된 TIL은 피더 세포-기반 방법을 사용하여 단리된 TIL보다 더 높은 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포의 백분율을 갖는다. 특정 실시형태에서, 방법은 적어도 1종의 4-1BB 효능제를 사용한 TIL의 활성화를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 4-1BB 리간드이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 사전-REP 단계 및 별도의 신속한 확장 프로토콜("REP") 및 사전-REP에 대한 필요성을 제거한 1-단계 과정으로 TIL을 활성화하는 방법 및 확장하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 사용된다. 본 명세서에 제공된 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조사의 사양에 따라 수행된다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 실험실 절차 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제 준비, 제형 및 전달, 환자 치료에 사용된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하는" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 5% 이내인 값을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 림프구 집단을 지칭한다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포, Th1 및 Th17 CD4+ T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본 명세서에 개략된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 얻어진 것이고(때때로 "신선하게 수거된"이라고 지칭), "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL("REP TIL" 또는 "사후-REP TIL")을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. 일부 실시형태에서, 1차 TIL은 환자의 말초 혈액으로부터 얻어진 종양 반응성 T 세포를 포함한다. TIL 세포 집단은 유전적으로 변형된 TIL을 포함할 수 있다. "TIL"은 또한 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 다음 혈류로 다시 들어가기 위해 출발한 림프구의 집단을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 "세포의 집단" 또는 "TIL의 집단"은 공통 형질을 공유하는 다수의 세포 또는 TIL을 지칭한다. 일반적으로 집단은 일반적으로 1×106 내지 1×1010개로 다양하며, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2의 존재 하에서 1차 TIL의 초기 성장은 대략 1×107개 세포의 벌크 TIL의 집단을 초래할 수 있다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위해 1.5×109 내지 1.5×1010개 세포의 집단을 제공하기 위해 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "TIL의 집단을 확장시키는"은 "TIL의 집단을 증식시키는 것"과 동의어이고, TIL 집단에서 세포의 수를 증가시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "확장 공정"은 TIL 집단 내의 세포 수가 증가하는 과정을 지칭한다. TIL의 수를 실질적으로 증가시키지 않으면서 TIL이 단리되거나 풍부해지기만 하는 과정은 확장 공정이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "매트릭스" 또는 "이동성 매트릭스"는 구조의 골격이 유연하거나 이동할 수 있고, 중합체 및 세라믹과 같은 물질로 구성될 수 있는 별개의, 격리 가능한, 3차원 격자형 구조를 지칭한다. 3차원 구조이기 때문에, 매트릭스는 가장 작은 치수 및 가장 큰 치수, 예컨대, 길이를 가질 수 있다. 이동성 매트릭스는 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 다당류, 글리코사미노글리칸 또는 세포외 매트릭스 조성물일 수 있다. 다당류는 예를 들어, 셀룰로오스 에터, 전분, 아라비아검, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 히알루론산, 펙틴, 잔탄, 구아검 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 다른 중합체는 폴리에스터, 폴리에터, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아민, 폴리에틸렌 이민, 폴리쿼터늄 중합체, 폴리포스파젠, 폴리바이닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 블록 공중합체 또는 폴리우레탄을 포함할 수 있다. 이동성 매트릭스는 덱스트란의 중합체를 포함할 수 있다. "매트릭스"는 1종 초과의 매트릭스의 모음을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 매트릭스의 맥락에서 어구 "최대 치수"는 매트릭스의 가장 긴 길이를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "효능제"는 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 표적에 결합하는 화학물질, 분자, 거대분자, 분자 복합체 또는 거대분자 복합체를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 효능제가 세포 표면 상의 표적에 결합할 때, 효능제는 표적을 활성화하여 생물학적 반응을 생성한다. 효능제는 호르몬, 신경전달물질, 항체 및 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "나노매트릭스"는 중합체 쇄의 1개 초과의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 지칭한다. 나노매트릭스는 500㎚ 미만의 치수를 갖는 다상 물질 또는 그 물질을 구성하는 상이한 상 사이에 나노 규모의 반복 거리를 갖는 구조이다. 중합체는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 다당류, 덱스트란 및 기타 거대분자를 포함할 수 있고, 이것은 다수의 반복 소단위로 구성된다. 나노매트릭스는 또한 추가 기능성 화합물, 예컨대, 자기, 상자성 또는 초상자성 나노결정을 그 내부에 가질 수 있다. 또한, 특정 적용을 위해 기능성 모이어티, 예컨대, 리간드 또는 효능제가 중합체 쇄에 공유로 부착되거나 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "덱스트란"은 글루코스의 축합으로부터 유래된 다당류인 복합 분지형 글루칸을 지칭한다. 덱스트란 쇄는 길이가 3에서 2000킬로달톤까지 달라진다. 고분자 주쇄는 α-1,3 링키지의 분지를 갖는 글루코스 단량체 사이의 α-1,6 글리코시드 결합으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "나노매트릭스에 결합된 효능제"는 나노매트릭스 내의 매트릭스를 포함하는 중합체 쇄에 공유 부착된 효능제를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "콜로이드성 현탁액"은 매트릭스와 같은 하나의 물질이 액체와 같은 다른 물질 전체에 걸쳐 현탁된 혼합물을 지칭한다. 따라서 콜로이드성 현탁액은 분산상, 즉, 현탁 물질 및 연속상, 즉, 액체와 같은 현탁액 매질을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "TIL의 집단을 나노매트릭스와 접촉시키는"이라는 어구는 TIL이 이온성, 수소-결합 또는 다른 유형의 물리적 또는 화학적 상호작용을 통해서 나노매트릭스-결합된 작용성 모이어티, 예컨대, 리간드 또는 작용제 또는 나노매트릭스-내장된 기능성 화합물, 예컨대, 나노결정과 회합될 수 있도록 TIL 및 나노매트릭스를 화합하게 하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간의 혈류를 떠난 림프구 집단이 이동하여 TIL로 형질전환된 종양을 갖는 인간을 지칭한다. 이러한 인간은 환자 자신의 TIL의 확장된 집단을 포함하는 면역요법을 필요로 하는 환자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD3"은 세포독성 T 세포(CD8+ 미경험 T 세포) 및 또한 T 헬퍼 세포(CD4+ 미경험 T 세포) 둘 다를 활성화시키는 것을 돕는 CD3(분화 클러스터 3) T 세포 공수용체를 지칭한다. CD3은 6개의 구별되는 폴리펩타이드 쇄(2개의 CD3 제타 쇄, 2개의 CD3 엡실론 쇄, 1개의 CD3e 감마 쇄 및 1개의 CD3 델타 쇄)로 구성된 단백질 복합체이다. 이러한 쇄는 T-세포 수용체(TCR) 알파 쇄 및 베타 쇄(또는 감마 쇄 및 델타 쇄)와 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR 알파 쇄 및 베타 쇄(또는 감마 및 델타 쇄) 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 구성한다. 인간 CD3E 유전자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 유전자 ID 916에 의해 식별된다. 인간 CD3E 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_007383.1이다. 인간 CD3E 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 876으로 제공된다.
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표 1에서, 이들을 갖는 단백질에 대한 추정된 리더 서열을 밑줄로 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD28"은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공자극 신호를 제공하는 T 세포 상에서 발현되는 단백질 중 하나인 분화 클러스터 28을 지칭한다. T-세포 수용체(TCR)에 더하여 CD28을 통한 T 세포 자극은 인터류킨과 같은 다양한 사이토카인의 생산을 위한 강력한 신호를 제공할 수 있다. CD28은 CD80 및 CD86 단백질에 대한 수용체이다. 톨(Toll)-유사 수용체 리간드에 의해 활성화되는 경우, CD80 발현은 항원 제시 세포(APC)에서 상향 조절된다. 인간 CD28 유전자는 NCBI 유전자 ID 940으로 식별된다. 인간 CD28 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_029618.1이다. 인간 CD28 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 877으로 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD2"는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 표면에서 발견되는 세포 부착 분자인 분화 클러스터 2를 지칭한다. CD2는 다른 접착 분자와 상호작용하고, T 세포 및 NK 세포에서 공자극 분자로 작용한다. 인간 CD2 유전자는 NCBI 유전자 ID 914로 식별된다. 인간 CD2 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_050908.1이다. 인간 CD2 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 878로 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "4-1BB"는 T 세포 공자극제인 CD137을 지칭한다. 인간 4-1BB 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NC_000001.11이다. 인간 4-1BB의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001552.2(서열번호 880)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "4-1BB 리간드"는 활성화된 T-림프구 상에서 발현되고, 4-1BB에 결합하는 유형 2 막관통 당단백질을 지칭한다. 인간 4-1BB 리간드 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NC_000019.10이다. 인간 4-1BB 리간드의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: AAA53134.1(서열번호 881)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 효능제 또는 항체와 함께 사용되는 용어 "단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 효능제 또는 항체의 단편을 지칭한다. 항체 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로 공지됨)를 형성하는 단일 단백질로서 만들어 지게 할 수 있는 합성 링커에 의해서 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다이아바디와 같은 다른 형태의 단일 쇄 항체가 또한 포함된다. 또한, 단일 쇄 항체는 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"를 포함한다.
용어 "항체"는 일반적으로 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 Ig 분자의 에피토프 결합 특징을 유지하는 이의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 이러한 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당업계에 공지되어 있다. 전장 항체의 일 실시형태에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 가변 영역(도메인)은 또한 본 개시내용에서 VDH로 지정된다. CH는 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. CL은 단일 CL 도메인으로 구성된다. 경쇄 가변 영역(도메인)은 또한 본 명세서에서 VDL로 지정된다. VH 및 VL은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 일반적으로, 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "선택적 결합" 또는 "선택적으로 결합하다"는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 효능제 결합을 지칭한다. 전형적으로, 효능제는 대략 10-5M 미만, 예컨대, 대략 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 미만 또는 더 낮은 친화도(KD)로 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 명세서에 기재된 효능제는 예를 들어, 리간드로서 효능제 및 분석물로서 표적을 사용하는 Biacore 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 결정된 바와 같이, 대략 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 미만 또는 더 낮은 해리 평형 상수(KD)로 표적에 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대, 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어, 적어도 1000배 더 낮은, 예컨대, 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어, 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 표적 단백질에 결합한다. 친화도가 더 낮은 양은 효능제의 KD에 의존적이어서, 효능제의 KD가 매우 낮은 경우(즉, 효능제가 매우 특이적인 경우), 항원에 대한 친화도가 비-특이적인 항원에 대한 친화도보다 더 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "kd"(sec-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 koff 값으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "ka"(M-1Хsec-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "KD"(M)는 특정 효능제-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "KA"(M-1)는 특정 효능제-항원 상호작용의 회합 평형 상수를 지칭하고, ka를 kd로 나누어서 얻어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "활성화 신호"는 T 세포가 활성화되도록 하는 하나 이상의 비-내인성 자극을 지칭한다. 내인성 과정에서, T 세포는 항원-제시 세포(APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원이 제시될 때 활성화된다. 활성화되면, T 세포는 빠르게 분열하고, 면역 반응을 조절하거나 보조하는 사이토카인을 분비한다. 내인성 T 세포 활성화 과정은 적어도 (a) CD3을 포함하는 TCR 복합체의 활성화, 및 (b) APC 표면 상의 단백질에 의한 CD28 또는 4-1BB의 공자극을 포함한다. T 세포의 내인성 활성화는 CD3, CD28 또는 4-1BB 효능제(예를 들어, 항체)에 의한 T 세포의 자극에 의해 시뮬레이션될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서 CD3, CD28 및/또는 4-1BB는 함께 T 세포에 활성화 신호를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "TIL의 집단을 활성화시켜 이것이 증식하도록 유도하는"은 TIL의 집단을 활성화 신호에 적용하여 TIL의 수가 증가하거나 증식하여 사이토카인(활성화된 TIL)을 생산하여 면역 반응을 증강시키기 시작하는 과정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "나노결정"은 양자점을 기준으로 100㎚보다 더 작은 적어도 하나의 치수를 갖고, 단결정 또는 다결정 배열의 원자로 구성된 물질 입자를 지칭한다. 나노 결정의 크기는 이를 더 큰 결정과 구별한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "자성, 상자성, 또는 초상자성 나노결정"은 자기장을 사용하여 조작될 수 있는 나노결정을 지칭한다. 이러한 나노결정은 일반적으로 자성 물질, 예컨대, 철, 니켈 또는 코발트인 적어도 하나의 성분으로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "종양 세포" 또는 "암 세포"는 제어되지 않는 방식으로 분열하여 고형 종양을 형성하거나 혈액에 비정상적인 세포를 넘치게 하는 세포를 지칭한다. 건강한 세포는 더 이상 더 많은 딸세포가 필요하지 않을 때 분열을 멈추지만, 종양 세포 또는 암세포는 계속해서 복제물을 생산한다. 그들은 또한 전이로 알려진 과정에서 신체의 한 부분에서 또 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 종양 세포는 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 간암, 흑색종, 중피종, 폐암, 비소세포폐암, 두경부암, 신경모세포종, 다형성 교모세포종, 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포 폐암 및 갑상선암을 비롯한 다양한 암 유형에서 단리될 수 있다. 종양 세포는 원발성 종양 및 전이로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "종양 샘플"은 대상체로부터 단리된 종양 세포를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 종양 샘플은 종양을 갖는 대상체 또는 환자로부터 전체적으로 또는 부분적으로 단리된 고형 종양의 적어도 일부이다. 종양 샘플은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 간암, 흑색종, 중피종, 폐암, 비소세포폐암, 두경부암, 신경모세포종, 다형성 교모세포종, 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포 폐암 및 갑상선암을 비롯한 다양한 암 유형에서 단리될 수 있다. 종양 샘플은 원발성 종양 및 전이로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "응집되지 않은 종양 샘플"은 "종양 단편"으로 단편화된 종양 샘플을 지칭한다. 단편화는 물리적 단편화, 기계적 단편화, 초음파 단편화, 효소적 단편화, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 단편화는 기계적으로 수행될 수 있고, 선택적으로 단일 세포 현탁액으로의 종양 단편의 효소 소화가 뒤따를 수 있다. 기계적 비응집 방법은 종양을 더 작은 종양 단편으로 자르거나 슬라이스하는 것을 포함할 수 있는 반면, 효소적 비응집 방법은 종양 단편을 프로테아제와 같은 특정 효소로 처리하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 방법은 이전에 실패한 사전-REP 확장으로부터의 TIL 샘플을 구제할 수 있다. 특정 실시형태에서, 종양 샘플은 이전에 샘플 대상체가 TIL 확장 기술을 받은 적이 있는 대상체로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 이전의 TIL 확장 기술은 사전-REP 확장을 포함하였다. 일부 실시형태에서, 사전-REP 확장은 대상체로부터의 응집되지 않은 종양 샘플에 IL-2를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사전-REP 확장에서 종양 샘플에 투여되는 유일한 면역조절제 또는 종양 샘플로부터 확장된 TIL은 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 이전의 TIL 확장 기술은 실패하였다. 일부 실시형태에서, TIL 확장 기술은 적절한 수의 TIL을 확장하지 않을 때 실패한다. 일부 실시형태에서, 적절한 수의 TIL은 1000, 5000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 또는 100,000개 초과의 TIL이다. 일부 실시형태에서, TIL 확장 기술은 TIL의 적절한 배수 확장을 유도하지 않을 때 실패한다. 일부 실시형태에서, TIL의 적절한 배수 확장은 50, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10,000배 초과의 확장이다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 샘플의 일부가 본 명세서에 개시된 이전의 TIL 확장 기술 및 TIL 확장 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 2개의 별개의 샘플이 동일한 대상체로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 이전의 확장 기술보다 더 많은 수 또는 배수 확장을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 임상적으로 유용한 수의 TIL을 제공할 수 있고, 여기서 이전의 확장 기술은 그 수의 TIL을 제공할 수 없었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "T 세포 수용체 효능제" 또는 "TCR 효능제"는 T 세포 수용체 복합체의 효능제를 지칭한다. 적합한 TCR 효능제는 비제한적으로 CD3 효능제(예를 들어, 항-CD3 항체)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배지"는 인공 환경에서 세포의 생존, 성장 및/또는 증식을 지원하도록 설계된 액체 또는 겔을 지칭한다. 매질은 일반적으로 정의된 성분의 세트를 포함한다. 이러한 성분은 에너지원, 성장 인자, 호르몬, 자극제, 활성화제, 당, 염, 비타민 및/또는 아미노산 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "배지의 성분이 유지된다"는 성분의 아이덴티티는 일정하게 유지되지만, 성분 중 하나 이상의 농도는 달라질 수 있는, 특정 자극제 및 활성화제와 같은 정의된 성분의 세트를 포함하는 배지를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 배지 중의 하나 이상의 성분의 농도는 세포가 배지에서 배양되는 동안 시간이 지남에 따라 달라진다. 그러나 배지가 변경되는 경우 새로운 배지는 각각의 변경에 대해 동일한 성분을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "피더 세포"는 또 다른 세포 유형의 증식을 돕는 세포외 분비물을 제공하는 데 사용되는 세포를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 지칭되는 피더 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 항원-제시 세포(APC)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "재조합 작용제"는 문구는 유전자의 발현 및 mRNA의 번역을 지원하는 시스템에서 클로닝된 재조합 유전자에 의해 암호화되는 효능제 단백질을 지칭한다. 재조합 유전자는 양호하게 특징규명된 프로모터의 제어 하에 있고, 고수준 단백질 발현을 달성하기 위해 선택된 숙주 세포 내에서 표적 효능제 단백질을 발현하도록 설계된다. 재조합 DNA 기술에 의한 유전자의 변형은 돌연변이 단백질 또는 다량의 단백질의 발현으로 이어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "콜로이드성 중합체 쇄"는 공유 결합 또는 다른 물리적 또는 화학적 상호작용을 통해 서로 연결될 때 콜로이드성 현탁액을 형성할 수 있는 중합체 쇄를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "특이적으로 결합한다"는 복합체가 더 낮은 회합 친화도를 갖는 다른 항원과 비교할 때, 특정 항원과 높은 특이성으로 상호작용하는 단백질 복합체, 예컨대, 효능제, 길항제, 항체 또는 가용성 단일특이적 복합체를 지칭한다. 특이적 결합 상호작용은 이온 결합, 수소 결합, 또는 다른 유형의 화학적 또는 물리적 회합을 통해 매개될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 복합체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 인식할 때 특정 항원에 특이적으로 결합한다. 2개 이상의 효능제, 길항제, 항체 또는 가용성 단일특이적 복합체는 효능제가 교차 경쟁하는 경우 "동일한 에피토프에 결합"한다(하나가 다른 하나의 결합 또는 조절 효과를 방지한다).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "중앙 기억 T 세포 표현형"은 인간에서 CD45RO+이고 CCR7(CCR7hi) 및 CD62L(CD62hi)을 발현하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127(IL-7R)을 포함한다. 중앙 기억 T 세포는 TCR 촉발 후 효과기 분자로서 주로 IL-2 및 CD40L을 분비한다. 중앙 기억 T 세포는 혈액의 CD4 구획에서 우세하며, 인간에서 림프절 및 편도선에서 비례적으로 풍부하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "항-CD3 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다. 항-CD3 항체는 무로모납이라고도 알려진 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 또한 T3 및 CD3c로도 알려진 UCHT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는 예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "항-CD28 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD28 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "항-4-1BB 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 4-1BB에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-4-1BB 항체는 4-1BB 리간드로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "항-CD2 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론성 항체를 지칭하고, 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD2 수용체에 대해 지향되는 인간, 인간화된, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "OKT-3"(본 명세서에서 "OKT3"이라고도 지칭됨)은 밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotech, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및/또는 이의 바이오시밀러 또는 변이체(예를 들어, 인간화된, 키메라 또는 친화도 성숙 변이체)에 의해 생산된 항-CD3 항체를 지칭한다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 입수 가능하고, ATCC 수탁 번호 CRL 8001로서 배정된다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 ECACC(European Collection of Authenticated Cell Cultures)에서 입수 가능하고, 카탈로그 번호 86022706으로 배정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "UCHT1"은 문헌[Beverley and Callard (1981) Eur. J. Immunol. 11: 329-334]에 기재된 항-CD3 항체 및 이의 바이오시밀러 또는 변이체(예를 들어, 인간화된, 키메라 또는 친화도 성숙 변이체)를 지칭한다. 예시적인 UCHT1을 생산할 수 있는 하이브리도마는 미국 뉴욕주 셜리에 소재한 크리에이티브 디아그노스틱스사(Creative Diagnostics)로부터 입수 가능하며 카탈로그 번호 CSC-H3068로 배정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "사량체 항체 복합체" 또는 "TAC"는 제1 효능제 및 제2 효능제로서 작용하는 항체에 결합하는 하나 또는 두 개의 링커 항체에 의해 연결된 제1 효능제 및 제2 효능제로 작용하는 2개의 항체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 링커 항체는 효능제 항체의 불변 영역에 결합할 수 있고, 불변 영역이 상이한 아이소타입인 경우, 각각의 아이소타입에 대해 하나의 결합 영역을 갖는 이중-특이적 항체가 또한 사용될 수 있다. 이들 복합체에 대한 지원은 또한 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제4,868,109호에서 찾아볼 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 리간드 및 제2 리간드로서 작용하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 링커 분자에 의해 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 이러한 링커 분자의 비제한적인 예는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하며, 이는 바이오티닐화된 항체, 예컨대, Fc 영역에 바이오틴 모이어티를 갖는 항체를 연결하는 데 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 사량체 항체 복합체는 복합체의 혼합물로서 사용될 수 있다. 이것은 복합체의 혼합물에서 복합체의 하나 초과의 종을 사용하는 것을 포함하고, 여기서 전체 혼합물의 복합체는 2종 초과의 상이한 리간드와 접촉할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "RNA-가이드 뉴클레아제"는 표적화된 게놈 편집을 수행하는 데 사용될 수 있는 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제인, 자연 발생 타입 II CRISPR-Cas 시스템에 기초한 핵산/단백질 복합체를 지칭한다. RNA-가이드 뉴클레아제는 2개의 성분, 즉, 표적 게놈 DNA 서열과 염기쌍을 형성하는 이의 5' 단부에서 20개의 가변 뉴클레오타이드를 사용하는 짧은 약 100개의 뉴클레오타이드 가이드 RNA(gRNA) 및 표적 DNA를 절단하는 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Cas9"는 DNA 바이러스에 대한 특정 박테리아의 면역학적 방어에서 중요한 역할을 하는 단백질인 CRISPR 연관 단백질 9를 지칭하며, 이는 유전 공학 적용에 많이 이용된다. Cas9는 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)에서 CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats) 적응 면역 시스템과 연관된 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. Cas9는 가이드 RNA(gRNA)와 상보적인 부위를 확인함으로써 DNA 섹션을 조사할 수 있다. DNA 기질이 gRNA에 상보적인 경우, Cas9가 DNA를 절단한다. Cas9의 표적 특이성은 gRNA:DNA 상보성으로부터 유래하고, 단백질 자체(예컨대, TALEN 및 아연-핑거)에 대한 변형이 아니기 때문에 새로운 DNA를 표적으로 하도록 Cas9를 조작하는 것은 간단하다. 동족 DNA에 결합하지만 절단하지 않는 Cas9의 버전은 전사 활성화 및 억제를 제어하기 위해 특정 DNA 서열에 대한 전사 활성화인자 또는 억제인자를 위치시키는 데 사용될 수 있다. 천연 Cas9는 회합하는 2개의 이질적인 RNA인 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)로 구성된 가이드 RNA가 필요하다. Cas9 표적화는 키메라 단일 가이드 RNA의 조작을 통해 단순화되었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "죽은 Cas9" 또는 "dCas9"는 죽은 Cas9 엔도뉴클레아제를 나타내며, 이는 엔도뉴클레아제 활성이 이의 엔도뉴클레아제 도메인에서 점 돌연변이를 통해 제거된 Cas9의 돌연변이 형태이다. 돌연변이되지 않은 형태와 유사하게, dCas9는 gRNA와 함께 CRISPR 시스템에서 사용되어 Cas9가 결합할 수 있도록 하는 PAM 서열을 갖는 gRNA와 상보적인 특정 유전자 또는 뉴클레오타이드를 표적화한다. Cas9는 일반적으로 RuvC 및 HNH 도메인이라고 하는 2개의 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다. 점 돌연변이 D10A 및 H840A는 궁극적으로 탈활성화를 초래하는 엔도뉴클레아제 활성에 대한 두 가지 중요한 잔기를 변경한다. dCas9는 엔도뉴클레아제 활성이 부족하지만, 이러한 결합이 다른 도메인에 의해 관리되기 때문에 여전히 가이드 RNA 및 표적이 되는 DNA 가닥에 결합할 수 있다. 이것은 gRNA가 전사 인자 및 RNA 중합효소가 DNA에 접근하는 것을 방지하는 방식으로 dCas9를 배치하는 경우 표적 유전자의 전사를 완전히 차단하지는 않더라도 약화시키기에 충분하다. 그러나, dCas9는 전사 활성화인자를 부착하는 데 사용할 수 있는 변형 가능한 영역, 일반적으로 단백질의 N 말단 및 C 말단을 갖기 때문에 DNA에 결합하는 이러한 능력은 활성화에도 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 세포 신호전달에서 중요한 광범위한 카테고리의 작은 단백질(크기가 약 5 내지 20kDa)을 지칭한다. 사이토카인은 펩타이드이며, 세포의 지질 이중층을 통과하여 세포질로 들어갈 수 없다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 측분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여하는 것으로 나타났다. 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함하지만, 용어가 일부 중복되지만 일반적으로 호르몬 또는 성장 인자는 아니다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포뿐만 아니라 내피 세포, 섬유아세포 및 다양한 기질 세포를 포함한 광범위한 세포에서 생산된다. 사이토카인은 일반적으로 세포-표면 수용체에 대한 결합을 통해 작용하며, 특정 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성 조절에 관여하기 때문에 면역 반응에 특히 중요하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "T 세포-자극 사이토카인"은 T 세포 림프구를 자극 및/또는 활성화시키는 사이토카인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인은 IL-2이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-2"(또한 본 명세서에서 "IL2"로 지칭됨)는 인터류킨-2로 공지된 사이토카인 및 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환을 갖는 형태, 당형태, 바이오시밀러 및 이들의 변이체를 비롯한 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌[Nelson,　J. Immunol.　2004, 172, 3983-88 및 Malek,　Annu. Rev. Immunol.　2008, 26, 453-79]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어 IL-2는 알데스류킨(PROLEUKIN, 일회용 바이알당 2200만 IU로 여러 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능)과 같은 IL-2의 인간 재조합 형태뿐만 아니라 셀제닉스사(CellGenix Inc.)(미국 뉴햄프셔주 포츠마우쓰 소재)(CELLGRO GMP) 또는 프로스펙-타니 테크노진사(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.)(미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크 소재(카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해서 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 공급원으로부터의 다른 상업적 등가물을 포함한다. 알데스류킨(데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 약 15kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 글리코실화되지 않은 인간 재조합 형태이다. 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 넥타 쎄라퓨틱스사(Nektar Therapeutics)로부터 입수 가능한 페길화된 IL-2 전구약물 NKTR-214를 포함하는 IL-2의 페길화된 형태를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 제2014/0328791 A1호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/065086 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 접합된 IL-2의 대안적인 형태는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4,902,502호에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 인간 IL2 유전자는 NCBI 유전자 ID 3558로 식별된다. 인간 IL2 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_016779.1이다. 인간 IL-2 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 879로서 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 어구 "가용성 단일특이적 복합체"는 서로 직접 또는 간접적으로 연결되어, 동일한 항원에 결합하는 2개의 결합 단백질을 포함하는 복합체를 지칭한다. 2개의 결합 단백질은 가용성이며, 표면, 입자 또는 비드에 고정되지 않는다.
또한, 본 개시내용에 따르면, 당업계의 기술 내에서 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (본 명세서에서 "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)] 참조. 이들 참고문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 기본 매개변수를 사용하여 BLAST 2.0 프로그램 제품군을 사용하여 얻어진 값을 지칭한다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402]).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "핵산 표적화 서열" 및 "핵산 결합 서열"은 상호 호환적으로 사용되며 핵산에 결합 및/또는 표적화하는 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 2개의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 서열 내의 잔기에 대한 언급을 포함하며, 이는 명시된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬될 때 동일하다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기 대신 치환되어 분자의 기능적 특성을 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해서 보통 달라진다고 인식된다. 서열이 보존적 치환에서 다른 경우, 백분율 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환이 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조정을 만들기 위한 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이것은 완전한 불일치가 아닌 부분적으로 보존적 치환을 점수화하여 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고, 비보존적 치환에 0의 점수가 주어지는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 예를 들어, 보존적 치환의 점수화는 문헌[Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17]의 알고리즘에 따라서, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE(인텔리지네틱스사(Intelligenetics)(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)에서 구현된 바와 같이 계산된다. 이들 참고문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하며, 여기서 비교 창에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해서 참조 서열(이것은 치환 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 때 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 비교 창에서 위치의 전체 수에 의해 일치되는 위치의 수를 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 표준 매개변수를 사용하여 기술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하는 참조 서열과 비교할 때 폴리뉴클레오타이드가 50 내지 100% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 50% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 당업자는 코돈 축퇴, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 지정 등을 고려하여 2개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정하기 위해 이들 값을 적절하게 조정할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 일반적으로 55 내지 100%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다.
I. 종양 침윤 림프구(TIL)
종양 침윤 림프구 또는 TIL은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 본래 수득된 세포 집단이다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포(림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본 명세서에 개략된 바와 같이 환자 조직 샘플로부터 얻어진 것이고(때때로 "신선하게 수거된"이라고 지칭), "2차 TIL"은 본 명세서에 논의된 바와 같이 확장되거나 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다.
TIL은 일반적으로 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로 정의되거나 종양에 침윤하여 치료에 영향을 미치는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현하는 것으로 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, TCRγδ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD95, PD-1 및 CD25. 추가로, 대안적으로, TIL은 환자에게 재도입될 때 고형 종양을 침윤하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 효력에 의해 추가로 특징규명될 수 있고; 예를 들어, TIL은 TCR 자극 시 예를 들어, 인터페론 감마(IFNγ)방출이 약 50pg/㎖ 초과, 약 100pg/㎖ 초과, 약 150pg/㎖ 초과 또는 약 200pg/㎖ 초과인 경우 강력한 것으로 간주될 수 있다.
통상적인 TIL 제조 공정에 의해 생체외에서 배양된 TIL을 이용하는 입양 세포 요법은 적어도 2개의 단계, 즉 사전-REP 단계에 후속하는 적어도 하나의 급속 확장 프로토콜(REP) 단계를 포함한다. 입양 세포 요법은 흑색종 환자에서 숙주 면역억제 후 성공적인 요법을 초래하였다. 현재 주입 허용 매개변수는 TIL의 구성 판독값(예를 들어, CD28, CD8 또는 CD4 양성) 및 REP 생성물의 확장 및 생존율의 수치적 배수에 의존한다.
실험 결과는 종양 특이적 T 림프구의 입양 전달 이전의 림프고갈이 조절 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소("사이토카인 싱크")를 제거함으로써 치료 효능을 향상시키는 데 핵심적인 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 TIL의 도입 전에 환자에 대한 림프고갈 단계(때로는 "면역억제성 컨디셔닝"으로도 지칭됨)를 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 림프고갈 단계는 사용되지 않는다.
A. TIL의 확장
본 명세서에 일반적으로 약술된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고, 환자에게 이식하기 전에 그 수를 확장하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, TIL은 하기에 논의된 바와 같이 유전자 조작될 수 있다. 일반적으로, TIL은 초기에 환자 종양 샘플("1차 TIL")로부터 얻어진 다음, 본 명세서에 기술된 바와 같은 추가 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 선택적으로 동결보존 및 재자극되고, 선택적으로 TIL의 표시로서 표현형 및 대사 매개변수에 대해 평가된다.
환자 종양 샘플은 일반적으로 외과적 절제술, 바늘 생검, 또는 종양 및 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 얻기 위한 다른 수단을 통해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이를 포함하는 임의의 고형 종양에서 유래할 수 있다. 고형 종양은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 입술 및 구강암, 간암, 흑색종, 중피종, 폐암, 비소세포폐암, 두경부암, 신경모세포종, 다형성 교모세포종, 비흑색종 피부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포 폐암 및 갑상선암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 세포 유형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유용한 TIL은 악성 흑색종 종양으로부터 얻어지는데, 그 이유는 이것이 특히 높은 수준의 TIL을 갖는 것으로 보고되었기 때문이다. 원발성 흑색종 종양 또는 이의 전이를 사용하여 TIL을 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, 고형 종양은 통상적으로 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양 암은 악성, 신생물 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 고형 종양 암은 림프종, 육종, 유방암(삼중 음성 유방암 포함), 췌장암, 전립선암, 결장암, 직장암, 방광암, 폐암(비소세포 폐암(NSCLC) 포함), 뇌암, 신장암, 위암 및 피부암(편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색종을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종(HNSCC) 포함) 신경모세포종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 간암, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 비소세포폐암으로부터 선택된다. 고형 종양의 조직 구조는 실질(암 세포) 및 암세포가 분산되어 있고 지지 미세 환경을 제공할 수 있는 지지 기질 세포를 포함하는 상호 의존적인 조직 구획을 포함한다.
일단 수득되면, 종양 샘플은 일반적으로 약 1 내지 약 8㎣ 또는 약 0.5 내지 약 4㎣의 작은 조각으로 날카로운 절개를 사용하여 단편화되며, 약 2 내지 3㎣가 특히 유용하다. TIL은 효소 종양 소화물을 사용하여 이러한 단편으로부터 배양된다. 이러한 종양 소화물은 효소 배지(예를 들어, 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 1640 완충액, 2mM 글루타메이트, 10mcg/㎖ 젠타마이신, 30단위/㎖의 DNase 및 1.0㎎/㎖의 콜라게나아제)에서의 인큐베이션, 그 다음 기계적 해리(예를 들어, 조직 해리제 사용)에 의해 생산될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소 배지에 넣고, 약 1분 동안 종양을 기계적으로 해리시킨 다음 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 작은 조직 조각만 존재할 때까지 상기 조건 하에서 기계적 해리 및 인큐베이션 주기를 반복하여 생산될 수 있다. 이 과정의 완료 시에, 세포 현탁액이 적혈구 또는 죽은 세포를 상당한 수로 함유하면, FICOLL 분지형 친수성 다당류를 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다. 미국 특허 공개 제2012/0244133 A1호에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 대안적인 방법이 사용될 수 있으며, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 상기 방법 중 임의의 것은 TIL을 확장하는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 수거된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수거된" 세포 집단으로 불린다. 일부 실시형태에서, 단편화는 예를 들어, 분해 및 소화를 포함하는 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 절개에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, 단편화는 소화에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, TIL은 초기에 효소적 종양 소화물 및 환자로부터 얻어진 종양 단편으로부터 배양될 수 있다.
종양이 고형 종양인 일부 실시형태에서, 종양은 종양 샘플이 수득된 후 물리적 단편화를 겪는다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 동결보존 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, 단편화는 종양을 획득한 후 및 임의의 동결보존의 부재 하에 발생한다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고, 10, 20, 30, 40개 또는 그 초과의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고, 30 또는 40개의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 종양은 단편화되고, 40개의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기에 배치된다. 일부 실시형태에서, 다중 단편은 약 4 내지 약 50개의 단편을 포함하고, 여기서 각각의 단편은 약 27㎣의 부피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중 단편은 약 1300㎣ 내지 약 1500㎣의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60개의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중 단편은 약 1350㎣의 총 부피를 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중 단편은 약 1그램 내지 약 1.5그램의 총 질량을 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중 단편은 약 4개의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 날카로운 절개에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1㎣ 내지 10㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1㎣ 내지 8㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 0.5㎣ 내지 4㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 1㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 2㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 3㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 4㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 5㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 6㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 7㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 8㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 9㎣이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 약 10㎣이다.
일부 실시형태에서, TIL은 종양 소화물로부터 수득된다. 일부 실시형태에서, 종양 소화물은 효소 배지, 예를 들어, 비제한적으로 RPMI 1640, 2mM GlutaMAX, 10㎎/㎖ 젠타마이신, 30U/㎖ DNase 및 1.0㎎/㎖ 콜라게나제에서의 인큐베이션, 그 다음 기계적 해리(GentleMACS, 밀테니이 바이오테크사, 미국 캘리포니아주 어번 소재)에 의해서 생성된다. 종양을 효소 배지에 넣은 후, 종양을 약 1분 동안 기계적으로 해리시킬 수 있다. 그런 다음, 용액을 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음 약 1분 동안 다시 기계적으로 파괴할 수 있다. 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 다시 인큐베이션시킨 후, 종양을 약 1분 동안 세 번째로 기계적으로 파괴할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직의 큰 조각이 존재하는 경우 세 번째 기계적 파괴 후, 5% CO2에서 37℃에서 30분의 추가 인큐베이션 유무에 관계없이 하나 또는 두 개의 추가 기계적 해리가 샘플에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최종 인큐베이션의 완료 시에, 세포 현탁액이 적혈구 또는 죽은 세포를 상당한 수로 함유하면, FICOLL을 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플 수거 후 선택적으로 동결되거나 동결보존될 수 있고, 확장 단계로 진입하기 전에 동결 저장될 수 있다.
1. 종래의 TIL 확장 방법의 요약
종래의 TIL 활성화 및 확장 방법에서, 피더 세포의 사용에 더하여 다단계 공정을 사용한다. 이러한 다단계 공정은 개별 사전-REP 단계가 선행되는 적어도 하나의 신속한 확장 프로토콜(REP) 단계를 포함한다.
a. 종래의 다단계 TIL 제조에서의 제1 확장 단계: 사전-REP
종래의 다단계 TIL 제조 공정은 사전-REP 또는 첫 번째 확장으로 시작된다. 일반적으로 사전-REP는 단편화되고/되거나 효소적으로 소화되었고, 종양 샘플 내에서 TIL의 느린 사이토카인-유도 성장을 위해 IL-2가 첨가된 종양 샘플을 사용하여 시작된다. 일반적으로 IL-2는 사전-REP에 첨가된 유일한 사이토카인 또는 면역조절제였다. 사전-REP 또는 첫 번째 확장 단계는 2주에서 몇 개월 정도 걸릴 수 있다. 사전-REP는 대상체/환자에게 투여될 때 복제 주기를 증가시킬 수 있는 젊은 TIL을 얻는 것으로 시작될 수 있으며, 따라서 더 늙은 TIL(즉, 대상체/환자에게 투여하기 전에 더 많은 복제 라운드를 추가로 거친 TIL)에 비해 추가적인 치료 이점을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사전-REP 동안, 종양 조직 또는 종양 조직으로부터의 세포는 표준 실험실 배지(RPMI를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에서 성장되고, 원하는 효과, 예를 들어, TIL 수의 증가 및/또는 원하는 세포 표면 마커 또는 다른 구조적, 생화학적 또는 기능적 특징을 함유하는 세포에 대한 집단의 농축을 달성하기 위해 방사선 조사된 피더 세포 및 항-CD3 항체와 같은 시약으로 처리된다. 사전-REP는 실험실 등급 시약(실험실 등급 시약이 나중 REP 단계에서 희석된다는 가정 하에)을 활용하는데, 이것은 TIL 생산을 개선하기 위한 대체 전략을 더 쉽게 통합하게 할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 개시된 TLR 효능제 및/또는 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 사전-REP 단계 동안 배양 배지에 포함될 수 있다. 사전-REP 배양물은 일부 실시형태에서 IL-2를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 종양 단편의 절개 또는 소화 후, 생성된 세포는 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 선호하는 조건 하에서 IL-2를 함유하는 배지에서 배양된다. 종양 소화물은 6000IU/㎖의 IL-2와 함께 비활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지 중에서 2㎖ 웰에서 인큐베이션된다. 일부 예에서, 300 내지 6000IU/㎖의 IL-2가 첨가된다. 사전-REP 동안, 이러한 1차 세포 집단은 수일에서 수개월 동안 배양되어 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1×108 벌크 TIL 세포가 생성된다.
일부 경우에, 사전-REP 또는 제1 확장 단계 동안, TIL 배양은 작은(약 2㎣) 종양 단편의 이식에 의해서 또는 효소적으로 소화된 종양 조직의 단일 세포 현탁액의 1×106개 생존 세포를 6000IU/㎖의 IL-2를 함유하는 2㎖의 완전 배지(10% 인간 혈청이 보충된 RPMI1640 기반 배지)에 플레이팅함으로써 개시된다. 배양물은 1㎖당 5×105 내지 2×106개 세포의 세포 농도에서 수백만개의 TIL 세포가 사용가능해질 수 있을 때까지(보통 2 내지 4주) 유지된다. 자가유래 종양 세포(가능한 경우) 및 HLA-A2+ 종양 세포주의 인식을 위한 사이토카인 분비 검정에 의해 다중 독립 배양물이 스크리닝된다. 그 다음 가장 높은 사이토카인 분비를 나타내는 2 내지 6개의 독립적인 TIL 배양물은 세포 수가 5×107개 세포(이 세포 수는 일반적으로 종양 절제 후 3 내지 6주에 도달함)를 초과할 때까지 1㎖ IL-2당 6000IU가 있는 완전 배지에서 추가로 확장된다
일부 경우에, 사전-REP 동안의 첫 번째 확장은 G-REX-10 또는 G-REX-100과 같은 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다.
유전자 변형된 TIL이 요법에 사용되는 경우, 첫 번째 TIL 집단(벌크 TIL 집단이라고도 지칭됨)은 REP 단계에서 제2 확장 이전에 유전자 변형을 겪을 수 있다.
사전-REP 단계를 포함하는 종래의 공정에서, 사전-REP와 REP 사이의 경계는 TIL이 IL-2의 존재 하에 확장을 겪고 REP를 시작하는 데 필요한 적절한 세포 수에 도달하거나 미리 결정된 기간 동안 사전-REP를 겪을 때 발생한다. 다양한 실시형태에서, 사전-REP는 사용된 제조 프로토콜에 따라 획득된 TIL의 수가 1×106, 10×106, 4×106 또는 40×106개 세포일 때 완료될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 사전-REP는 도달된 배양 기간이 단편화가 발생한 때로부터 3 내지 14일 또는 최대 9 내지 14일일 때 완료될 수 있다. 그 다음 TIL은 추가 사용을 위해 직접 냉동보존되거나 REP로 전환될 수 있다.
일부 경우에, 사전-REP 또는 첫 번째 확장 단계로부터 얻은 TIL은 선택을 위한 표현형 결정 시까지 저장된다. 일부 경우에, 첫 번째 확장으로부터 얻어진 TIL은 저장되지 않고 제2 확장 또는 REP 단계로 바로 진행된다. 일부 경우에, 사저-REP 단계로부터 얻어진 TIL은 첫 번째 확장 후와 제2 확장 또는 REP 단계 이전에 동결보존되지 않는다.
b. 종래의 다단계 TIL 제조에서의 두 번째 및 후속 확장 단계: REP
종래의 다단계 TIL 제조에서, 일부 경우에, TIL 세포 집단은 수거 및 초기 벌크 처리, 즉 사전-REP 후에 그 수가 확장된다. 이러한 추가 확장은 제2 확장으로 지칭되며, 이는 일반적으로 당업계에서 급속 확장 프로토콜(REP)로 지칭되는 확장 프로세스를 포함할 수 있다. 제2 확장 또는 REP는 일반적으로 기체 투과성 용기에 피더 세포, 사이토카인 공급원 및 항-CD3 항체를 포함하는 다수의 성분을 포함하는 배양 배지를 사용하여 달성된다. 일부 경우에, 제2 확장 또는 REP는 당업자에게 공지된 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있으며 7 내지 14일 이상 동안 진행될 수 있다.
일부 경우에, 제2 확장 또는 REP는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 기체 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 빠르게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 예를 들어, 항-CD3 항체, 예컨대, 약 30ng/㎖의 OKT3, 마우스 단클론성 항-CD3 항체(미국 뉴저지주 라리탄 소재의 오쏘-맥네일사(Ortho-McNeil) 또는 미국 캘리포니아주 어번 소재의 밀테니이 바이오테크사) 또는 UCHT-1(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 바이오레전드사(BioLegend))로부터 상업적으로 입수 가능함)를 포함할 수 있다. TIL은 선택적으로 T 세포 성장 인자, 예컨대, 300IU/㎖ IL-2의 존재 하에서, 벡터로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암의 항원성 부분, 예컨대, 에피토프(들)를 포함하는, 제2 확장 동안 하나 이상의 항원, 예컨대, 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩타이드, 예를 들어, 0.3μM MART-1:26-35(27L) 또는 gpl 00:209-217(210M)을 포함함으로써 시험관내에서 TIL의 추가 자극을 유도하도록 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원은 예를 들어, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2, 및 VEGFR2 또는 이의 항원 부분을 포함할 수 있다. TIL은 또한 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상에서 펄싱된 암의 동일한 항원(들)으로의 재자극에 의해서 빠르게 확장될 수 있다. 대안적으로, TIL은 예를 들어, 방사선 조사된 자가유래 림프구 또는 방사선 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 추가로 재자극될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재자극은 제2 확장의 일부로 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 확장은 방사선 조사된 자가유래 림프구의 존재 하에 또는 방사선 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2와 함께 발생한다.
일부 경우에, 제2 확장 또는 REP는 IL-2, OKT-3, 및 항원-제시 피더 세포를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 항원-제시 피더 세포(APC)는 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)이다. 일부 경우에, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서 TIL 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비율은 1 대 25 및 1 대 500이다. 일부 경우에, REP 및/또는 제2 확장은 150㎖ 배지 중의 100배 또는 200배 과량의 불활성화된 피더 세포, 30㎎/㎖의 OKT3 항-CD3 항체 및 3000IU/㎖의 IL-2와 혼합되는 벌크 TIL이 있는 플라스크에서 수행된다. 세포가 대체 성장 챔버로 옮겨질 때까지 배지 교체가 수행된다(일반적으로 신선한 배지로 호흡을 통한 ½ 또는 ⅔배지 교체). 대체 성장 챔버는 G-REX 플라스크와 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 경우에, 제2 확장 또는 REP가 수행되고, 우수한 종양 반응성을 위해 TIL이 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 공개 제2016/0010058 A1호에 기재된 방법이 우수한 종양 반응성을 위한 TIL의 선택에 사용될 수 있다. 선택적으로, 세포 생존력 검정은 당업계에 공지된 표준 검정을 사용하여 제2 확장(REP 확장으로 지칭되는 확장 포함) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 죽은 세포를 선택적으로 표지하고, 생존력 평가를 허용하는 벌크 TIL의 샘플에서 트리판 블루 배제 검정이 수행될 수 있다. 일부 경우에, TIL 샘플을 계수하고, Cellometer K2 자동 세포 계수기(텍스셀롬 바이오사이언스사(Nexcelom Bioscience), 미국 매사추세츠주 로렌스 소재)를 사용하여 생존력을 결정할 수 있다.
일부 경우에, 제2 확장에 더하여 추가 확장 단계가 수행될 수 있다.
c. 피더 세포
다수의 경우에, 종래의 다단계 피더 세포-기반 TIL 확장 방법에 사용되는 피더 세포는 건강한 헌혈자의 표준 전혈 단위로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. PBMC는 FICOLL-Paque 구배 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 동종이계 PBMC는 방사선 조사 또는 열처리를 통해 불활성화되고, REP 절차에 사용된다. 일부 경우에, PBMC는 복제 불능으로 간주되며, 제14일의 총 생존 세포 수가 REP의 REP 제0일 및/또는 제2 확장 제0일(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양물 내에 투입된 초기 생존 세포 수보다 적은 경우 TIL 확장 절차에 사용되는 것이 허용된다.
일부 경우에, PBMC는 복제 불능으로 간주되며, 제7일 및 제14일에 OKT3 및 IL-2의 존재 하에서 배양된, 총 생존 세포 수가 REP의 REP 제0일 및/또는 제2 확장 제0일(즉, 제2 확장의 시작일)에 배양물 내에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않은 경우 본 명세서에 기재된 TIL 확장 절차에 사용되는 것이 허용된다. 일부 경우에, PBMC는 30ng/㎖의 OKT3 항체 및 3000IU/㎖의 IL-2의 존재 하에서 배양된다.
일부 경우에, 제2 확장 또는 REP 절차는 약 2.5×109개 피더 세포 대 12.5×106개 TIL 내지 100×106개 TIL의 비율을 필요로 한다.
제2 확장 단계 또는 REP 후에, 세포를 수거할 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 1, 2, 3, 4 또는 그 초과의 확장 단계 후에 수거된다. TIL은 예를 들어, 원심분리를 포함하여 임의의 적절하고 멸균된 방식으로 수거될 수 있다. TIL 수거 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 공지된 방법이 본 공정에서 사용될 수 있다.
2. TIL의 확장 및 활성화를 위한 새로운 1-단계 방법
상기에 기재된 종래의 TIL의 다단계 피더 세포 의존적 확장 및 활성화 공정은 다단계 및 피더 세포를 필요로 하고; 두 가지 요구 사항 모두 기존 공정을 시간이 소모적이고 고 비용이게 한다. 종양 침윤 림프구(TIL)의 입양 전달을 사용한 면역요법을 필요로 하는 환자는 종종 매우 불량한 예후를 가지며, 더 신속하게 확장되고 분화된 TIL 집단으로 치료되는 것이 삶과 죽음의 차이를 구성할 수 있다.
일례에서, 이러한 요법을 필요로 하는 환자는 종종 위독하고, 지연은 치료제가 투여되기 전에 사망을 초래할 수 있기 때문에 확장 기간은 도전적이다. 본 명세서에 설명된 방법을 통해 TIL 확장에 필요한 기간을 단축하는 능력은 기존의 긴 공정에 비해 상당한 이점을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 증가된 효과기 기능을 생성하도록 유전자 조작된 TIL은 보다 신속하게 증식하여 확장 시간을 단축하고 종양 세포를 보다 효과적으로 사멸시키는 능력 때문에 유리하다.
또한, 피더 세포에 대한 의존성은 적어도 몇 가지 이유로 문제를 보유한다. 첫째, 세포가 3 내지 5개의 동종이계 공여자로부터 수집되기 때문에 생존 가능한 피더 세포 집단을 얻는 것이 매우 어렵다. 피더 세포의 이종성 공급은 공여자 세포의 각각의 집단이 TIL을 확장하는 능력에 대해 개별적으로 자격을 갖추어야 하기 때문에 그들의 사용을 표준화 불가능하게 만든다. 또한, 피더 세포의 고유한 가변성으로 인해, 피더 세포를 사용한 TIL 확장은 재현성 및 예측 가능성이 줄어든다. 둘째, 피더 세포를 사용하는 경우, TIL은 피더 세포의 존재 하에서 조작될 수 없기 때문에 TIL은 REP 단계 전 또는 후에만 조작되거나 유전적으로 변형될 수 있다. 셋째, 신속 확장 프로토콜(REP)을 포함하는 TIL 제조 방법에서, 확장된 TIL의 집단은 피더 세포가 죽을 때까지 사용될 수 없기 때문에 REP를 단축할 수 없다. 넷째, TIL을 자극하기 위해 피더 세포를 사용하면 자극제를 씻어내거나 제거할 수 없다. 따라서 일부 경우에는 기존 과정의 사전-REP 및 REP 단계가 원하는 수의 TIL을 생성하지 못한다. 상기에 기재된 적어도 3가지 이유 때문에, 일부 실시형태에서 본 명세서에서 달성되고 이에 개시된 피더 세포에 대한 의존성을 제거할 필요가 있다. 피더 세포를 제거하면 TIL 확장 공정에 대한 제어가 향상될 수 있다. 예를 들어, 필요한 TIL 수가 달성되는 경우 TIL 확장 공정을 중단할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 일 양상에서, 종래의 TIL 확장 프로토콜의 사전-REP 단계는 모두 건너뛴다. 놀랍게도, 사전 REP 단계를 사용하지 않고, 즉, 1단계 TIL 활성화 및 확장 공정에서 이러한 단일 확장 단계 동안 21일 이내에 많은 수의 TIL을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 피더 세포에 따라 1단계 REP-유사 공정을 사용하여 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 Dynabeads와 같은 입자를 사용하여 1단계 공정으로 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 예컨대, 스템셀사(Stemcell)로부터의 사량체 항체 복합체(TAC)를 사용하여 1단계 공정으로 확장된다. 일부 실시형태에서, TILS는 예컨대, 밀테니이 바이오테크사(Transact)로부터의 나노매트릭스를 사용하여 1단계 공정으로 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 1단계 TIL 확장 공정 동안 조작되거나 유전자 변형된다.
일부 실시형태에서, TIL은 상기에 기재된 종래의 사전-REP를 사용한 이전의 실패로부터 기원한다. 특정 실시형태에서, 사전-REP 실패는 사전-REP 프로토콜을 사용하여 23일 동안 인간 대상체로부터 단리된 TIL을 4×107개 세포까지 확장시키는 데 있어서의 실패이다. 다른 실시형태에서, 사전-REP 실패는 인간 대상체로부터 단리된 TIL을 본래 수의 100x를 초과하게 확장시키는 데 있어서의 실패이다. 다른 실시형태에서, 사전-REP 실패는 사전-REP 프로토콜을 사용하여 인간 대상체로부터 단리된 TIL을 1×106 또는 1×107개 세포까지 확장시키는 데 있어서의 실패이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 사전-REP 실패를 구제할 수 있고, 즉 사전-REP 실패를 경험한 샘플로부터 세포를 확장시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 일 양상에서, 응집되지 않은 종양 샘플에서 TIL의 집단을 확장시키는 방법은 응집되지 않은 종양 샘플을 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, TIL은 T 세포 수용체(TCR) 효능제, CD28 효능제 및 T 세포-자극 사이토카인과 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 4-1BB 효능제와 접촉된다.
일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플은 0.5 내지 4㎣ 크기인 종양 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 0.5 내지 1㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 1 내지 1.5㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 1.5 내지 2㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 2 내지 2.5㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 2.5 내지 3㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 3 내지 3.5㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 종양 단편은 3.5 내지 4㎣ 크기이다. 일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플은 소화된(digested) 종양 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 배지는 1 내지 2일, 2 내지 3일, 3 내지 4일, 4 내지 5일 또는 5 내지 6일 범위의 시간 간격에 T 세포-자극 사이토카인이 보충된다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 1일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 2일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 3일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 4일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 5일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 6일이다.
일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 10U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 100U/㎖ 내지 200U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 200U/㎖ 내지 300U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 300U/㎖ 내지 400U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 400U/㎖ 내지 500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 500U/㎖ 내지 600U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 600U/㎖ 내지 700U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 700U/㎖ 내지 800U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 800U/㎖ 내지 900U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 900U/㎖ 내지 1000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 1,000U/㎖ 내지 1,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 1,500U/㎖ 내지 2,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 2,000U/㎖ 내지 2,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 2,500U/㎖ 내지 3,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 3,000U/㎖ 내지 3,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 3,500U/㎖ 내지 4,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 4,000U/㎖ 내지 4,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 4,500U/㎖ 내지 5,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 5,000U/㎖ 내지 5,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 5,500U/㎖ 내지 6,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 6,000U/㎖ 내지 6,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 6,500U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다.
T-세포 자극 사이토카인은 자극 T-세포에 효과적인 임의의 사이토카인일 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포-자극 사이토카인은 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 응집되지 않은 종양 샘플 및/또는 TIL의 집단을 사이토카인 IL-2와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, TIL은 격일로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 2, 3, 4, 5 또는 6일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 2일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 3일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 4일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 5일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다. 일부 실시형태에서, TIL은 6일의 시간 간격으로 사이토카인 IL-2와 접촉된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 100U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 100U/㎖ 내지 200U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 200U/㎖ 내지 300U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 300U/㎖ 내지 400U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 400U/㎖ 내지 500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 500U/㎖ 내지 600U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 600U/㎖ 내지 700U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 700U/㎖ 내지 800U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 800U/㎖ 내지 900U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 900U/㎖ 내지 1000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 1,000U/㎖ 내지 1,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 1,500U/㎖ 내지 2,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 2,000U/㎖ 내지 2,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 2,500U/㎖ 내지 3,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 3,000U/㎖ 내지 3,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 3,500U/㎖ 내지 4,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 4,000U/㎖ 내지 4,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 4,500U/㎖ 내지 5,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 5,000U/㎖ 내지 5,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 5,500U/㎖ 내지 6,000U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 6,000U/㎖ 내지 6,500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 6,500U/㎖ 내지 7,000U/㎖이다.
일부 실시형태에서, 배지의 성분은 유지된다. 일부 실시형태에서, 배지 중 30% 내지 99%는 1 내지 2일, 2 내지 3일, 3 내지 4일, 4 내지 5일 또는 5 내지 6일 범위의 시간 간격에 변경된다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 1일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 2일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 3일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 4일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 5일이다. 일부 실시형태에서, 시간 간격은 6일이다.
a. 피더 세포
일부 실시형태에서, 배지는 피더 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 T 세포 수용체(TCR) 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 효능제를 발현한다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Bartkowiak and Curran, Front Oncol, 5:117 (2015)]에 기재된 바와 같은 41BB 효능제를 발현한다. 일부 실시형태에서, 4-1BB 효능제는 4-1BB 리간드이다. 일부 실시형태에서, T 세포 수용체(TCR) 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 효능제는 피더 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제는 CD3 효능제이다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 OKT3 또는 UCHT이다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 CD80 또는 CD86이다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 CD86이다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 배지 중에 가용성이다. 일부 실시형태에서, 피더 세포는 APC이다. 일부 실시형태에서, APC는 K562 세포이다. 일부 실시형태에서, APC는 상기에 기재된 단백질을 발현하도록 변형된다.
일부 실시형태에서, TIL은 1종 이상의 유전자의 발현을 감소시키도록 유전자 변형된다. 이들 유전자 변형에 관련된 추가 개시내용은 하기에 제공된다.
일부 실시형태에서, K562 세포는OKT3 "aAPC-OKT3"을 발현하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 사용 전에 (예를 들어, 15,000rad로) 방사선 조사된다. 일부 실시형태에서, K562 세포는 OKT3 및 CD86 "aAPC-OKT3-CD86"을 발현하도록 조작된다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 사용 전에 (예를 들어, 15,000rad로) 방사선 조사된다. 일부 경우에, 사전-REP 실패 TIL은 가용성 활성화인자 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)로 확장된다.
일부 실시형태에서, 피더 세포는 T 세포-자극 사이토카인을 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 피더 세포가 발현하도록 유전자 변형된 T 세포-자극 사이토카인은 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 배지는 피더 세포를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, TIL은 T 세포-자극 사이토카인 및 피더 세포를 사용하여 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 T 세포-자극 사이토카인을 사용하고, 피더 세포를 사용하지 않고 확장된다.
b. 나노매트릭스
이동성 매트릭스를 갖고, 자극제(들) 또는 효능제가 부착된 1㎛ 또는 500㎚보다 작은 나노매트릭스는 T 세포를 자극할 수 있다. 특정 실시형태에서, 500㎚보다 작은 매트릭스는 동일한 크기의 비드 또는 미소구체와 대조적으로 고체상 표면을 갖지 않는다(가요성 및 이동성 상을 초래함). 나노매트릭스는 이동성 중합체 물질로 이루어진 메쉬 또는 네트와 같다. 특정 실시형태에서, 중합체 물질은 덱스트란이다. 특정 실시형태에서, 나노매트릭스는 표적 세포, 예를 들어, T 세포의 세포 표면 막에 접근하는 능력을 초래하는 플라스틱이다. 따라서, 나노매트릭스는 이동성 매트릭스에 부착된 효능제와 함께 세포 표면 상의 각각의 표적(예를 들어, 수용체)에 결합하여, 매트릭스의 가요성이 결합 파트너와의 최적의 상호작용을 허용한다. 특정 정도까지 나노매트릭스의 형상은 표적 세포 표면에 적응하여 나노매트릭스와 표적 세포 사이의 접촉 표면을 확장한다. 1 내지 500㎚의 매트릭스 크기로 인해서, 이들은 세포에 교란을 일으키기에는 너무 작고, 즉, 나노매트릭스는 세포 기능의 변경과 관련하여 생물학적으로 불활성이다. 직접적인 세포/비드 접촉에 의해 촉발되는 이러한 교란은 1㎛ 이상의 크기의 비드 또는 미소구체가 사용하는 경우 문제가 된다. 또한, 우선적으로, 나노매트릭스는 생분해성 중합체 물질, 예컨대, 덱스트란의 중합체로 이루어진 조성으로 인해서 생분해성이며 세포에 무독성이다. 결과적으로, 나노매트릭스는 세포 기능의 변경과 관련하여 완전히 생물학적으로 불활성인 실체이지만 생분해성이다. 따라서 자극 및 증식을 위해 T 세포와 접촉한 후 나노매트릭스를 제거할 필요가 없다. 이들 세포의 후속 분석, 실험 및/또는 임상 적용을 위해 활성화된 T 세포 조성물에서 나노매트릭스의 존재로 인해서 방해 효과가 발생하지 않는다.
또한, 가용성 또는 콜로이드성으로 인해, 결합되지 않은 나노매트릭스는 반복되는 세척 단계에 의해 T-세포 자극 과정 후 T 세포 활성화 역치 미만의 유효 농도로 쉽게 희석될 수 있다.
나노매트릭스의 이동성 매트릭스는 T 세포에 활성화 신호(들)를 제공함으로써, T 세포를 활성화시켜 이의 증식을 유도하는 1종 이상의 자극성 효능제가 부착되어 있다. 효능제는 세포 표면 구조에 결합할 수 있고 세포의 다클론성 자극을 유도할 수 있는 분자이다. 나노매트릭스의 이동성 매트릭스에 부착된 작용제의 일례는 공자극성 단백질, 예컨대, 항-CD28 mAb와 조합된 항-CD3 단클론성 항체(mAb)이다.
멸균 필터를 통과할 수 있는 나노매트릭스의 특징은 멸균 필터, 예를 들어, 세포 배양 백(밀테니이 바이오테크사, 박스터사(Baxter), 셀제닉스사(CellGenics)), G-Rex 장치(윌슨 올프 매뉴팩처링사(윌슨 울프 매뉴팩처링사)), WAVE 생물반응기(지이 헬쓰케어사(지이 헬쓰케어사)), Quantum Cell Expansion System(테루모 비씨치사(Terumo BCT)), CliniMACS® Prodigy(밀테니이 바이오테크사, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Apel et al. 2013, Chemie Ingenieur Technik 85:103-110] 참조)가 장치되거나 장치될 수 있는 폐쇄된 세포 배양 시스템에 대한 부가를 허용한다. 나노매트릭스는 필터를 통해 나노매트릭스를 밀어 넣는 주사기 또는 백 또는 바이알(통기된 바이알 어댑터에 연결됨)로부터 필터를 통해 나노매트릭스를 끌어당기는 펌프를 사용하여 폐쇄된 세포 배양 시스템에 첨가될 수 있다.
접촉은 예를 들어, 세포를 보유할 수 있는 임의의 용기, 바람직하게는 멸균 환경에서 시험관내에서 일어날 수 있다. 이러한 용기는 예를 들어, 배양 플라스크, 배양 백, 생물반응기 또는 세포를 성장시키는 데 사용할 수 있는 임의의 장치일 수 있다(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 공개 제WO2009072003호의 샘플 처리 시스템, 즉, CliniMACS® Prodigy 시스템).
본 발명에서 사용되는 나노매트릭스는 적어도 하나의 제1 작용제 및 하나의 제2 작용제가 동일한 이동성 매트릭스에 부착된 나노매트릭스일 수 있다. 이러한 부류의 나노매트릭스는 T 세포와 접촉하여, T 세포를 활성화시켜 이의 증식을 유도한다. 동일한 가요성 매트릭스에 부착된 제1 작용제 및 제2 작용제의 비율은 100:1 내지 1:100, 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 가장 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 비율 범위일 수 있다.
또한, 본 발명의 나노매트릭스는 적어도 하나의 제1 효능제 및 하나의 제2 효능제가 별개의 이동성 매트릭스에 부착된 나노매트릭스일 수 있다. 이러한 나노매트릭스의 혼합물은 T 세포와 접촉하여, T 세포를 활성화시켜 이의 증식을 유도한다. 제1 작용제가 부착된 이동성 매트릭스 및 제2 작용제가 부착된 이동성 매트릭스의 비율 및/또는 농도는 사용된 T 세포 및/또는 사용된 작용제의 부류에 따라 최적의 자극 결과를 산출하기 위해 달라질 수 있다. 이것은 제1 작용제가 부착된 이동성 매트릭스 및 제2 작용제가 부착된 이동성 매트릭스의 다양한 농도 및 비율을 적정함으로써 특별한 T 세포 하위세트에 대한 활성화 조건의 최적화를 용이하게 한다.
나노매트릭스는 용매 증발, 상 분리, 분무-건조, 또는 저온에서의 용매 추출을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 선택된 공정은 단순하고, 재현 가능하며, 확장 가능해야 한다. 생성된 나노매트릭스는 균일한 주사 가능한 현탁액을 생성하기 위해 자유롭게 유동하고 응집되지 않아야 한다. 나노매트릭스도 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어, 여과, 최종 멸균 단계 및/또는 무균 처리를 통해 보장될 수 있다. 나노매트릭스의 제조는 실시예 1에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "이동성 중합체 쇄의 매트릭스" 및 "이동성 매트릭스"는 상호 호환 가능한 의미를 갖는다. 용어 "이동성"은 나노입자 상의 덱스트란 또는 다른 것과 같은 유기 생물중합체의 일반적이고 잘 설명된 특징을 지칭한다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Bertholon et al. Langmuir 2006, pp 45485-5490] 참조). 이러한 중합체는 이동성(운동성), 우선적으로 높은 이동성(운동성) 쇄를 포함하므로, 이러한 매트릭스는 자극제, 예컨대, 항체에 대한 부착점으로 고체 표면이 없는 것을 특징으로 하며, 현재 사용되는 비드 또는 규칙적으로 비가요성이고 뻣뻣한 표면을 갖는 미소구체와 상당히 대조적이다. 그 결과, 이동성 중합체 쇄의 매트릭스를 포함하는 나노매트릭스는 가요성이고, 세포 표면의 형태로 조정 가능하다. 또한, 결과적으로, 나노매트릭스는 수용액에서 나노매트릭스의 전체 부피의 대다수(즉, 50% 초과), 우선적으로 80% 초과 및 보다 우선적으로 90% 초과 및 가장 우선적으로 99% 초과가 이동성 중합체 쇄로 이루어진 나노매트릭스이다.
1종 이상의 자극제에 커플링된 나노매트릭스와 자극될 세포 사이의 접촉은 나노매트릭스가 고정되거나, 뻣뻣하거나, 단단한 표면을 갖지 않아서, 나노매트릭스가 세포 표면에 접근할 수 있게 한다는 사실로부터 이익을 얻는다. 특정 실시형태에서, 나노매트릭스는 쇄의 수화로 인해 수용액에서 최대 이동성을 얻는 친수성 중합체 쇄로 구성된다. 이동성 매트릭스는 그것에 부착된 작용제에 관계없이 나노매트릭스의 유일한 또는 적어도 주요 성분이다.
작용제는 당업계에 공지되고 입수 가능한 다양한 방법에 의해 이동성 매트릭스에 부착되거나 커플링될 수 있다. 부착은 공유 또는 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있고, 예를 들어, 화학적, 기계적, 효소적, 또는 작용제가 세포를 자극할 수 있는 다른 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 구조에 대한 항체는 먼저 매트릭스에 부착될 수 있거나, 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘은 바이오티닐화된 작용제에 결합하기 위해 매트릭스에 부착될 수 있다. 세포 표면 구조에 대한 항체는 예를 들어, 항-아이소타입 항체를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 매트릭스에 부착될 수 있다. 또 다른 예는 항체에 결합하기 위해 매트릭스에 부착된 단백질 A 또는 단백질 G 또는 다른 비특이적 항체 결합 분자를 사용하는 것을 포함한다. 대안적으로, 작용제는 매트릭스에 화학적 수단에 의해서 매트릭스에, 예컨대, 가교결합에 의해 매트릭스에 부착될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "생물학적으로 불활성"은 나노매트릭스의 특성을 지칭하며, 이것은 살아있는 세포에 무독성이며, 작은 크기로 인해서, 부착된 리간드 또는 항체의 특이적 리간드/수용체 촉발 기능을 제외하고는 세포 표면과의 물리적 상호작용을 통해 세포 기능의 강한 변경을 유도하지 않는다. 또한, 나노매트릭스는 생분해성일 수 있으며, 예를 들어, 효소 활성에 의해 분해되거나 식세포에 의해 제거될 수 있다. 생분해성 물질은 생물학적 유체, 예를 들어, 세포 배양 배지 및 혈액에서 분해되는 자연 또는 합성 물질로부터 유래될 수 있다. 분해는 효소적 수단을 사용하여 발생할 수 있거나 효소적 수단 없이 발생할 수 있다. 생분해성 물질은 노출된 환경 조건에 따라 수일, 수주 또는 수개월 내에 분해된다. 생분해성 물질은 살아있는 세포 및 인간에 대해 무독성이고, 비-항원성이어야 한다. 분해 산물은 무독성 부산물을 생성해야 한다. 생물학적으로 불활성이라는 맥락에서 중요한 양상은 나노매트릭스가 표지된 세포의 구조, 기능, 활성 상태 또는 생존력에 강한 변경을 유도하지 않는다는 사실이며, 즉, 그것은 세포의 교란을 유발하지 않으며, 자극된 세포의 후속 실험 및 치료 적용을 방해하지 않는다. 매우 작은, 즉 나노 규모 범위인 나노매트릭스의 특성으로 인해서 그리고 세포 표면의 형상을 변경하거나 세포에 강한 전단력을 가하여, 예를 들어, 막 파열을 초래하는 것보다 오히려 세포 표면에 달라붙는 이동성 매트릭스를 가짐으로써 세포의 기계적 또는 화학적 자극이 감소된다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제 및/또는 CD28 효능제는 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스에 연결되어 있고, 각각의 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 50㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 50 내지 100㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 100 내지 150㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 150 내지 200㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 200 내지 250㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 250 내지 300㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 300 내지 350㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 350 내지 400㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 400 내지 450㎚ 길이이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 450 내지 500㎚ 길이이다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 5㎍ 내지 약 10㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 10㎍ 내지 약 15㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 15㎍ 내지 약 20㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 20㎍ 내지 약 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 25㎍ 내지 약 30㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 30㎍ 내지 약 35㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 35㎍ 내지 약 40㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 40㎍ 내지 약 45㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 45㎍ 내지 약 50㎍ 나노매트릭스로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, TCR 효능제는 CD3 효능제이다.
일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 5㎍ 내지 약 10㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 10㎍ 내지 약 15㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 15㎍ 내지 약 20㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 20㎍ 내지 약 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 25㎍ 내지 약 30㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 30㎍ 내지 약 35㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 35㎍ 내지 약 40㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 40㎍ 내지 약 45㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 45㎍ 내지 약 50㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 중합체 쇄의 매트릭스 내에 또는 그 사이에 내장된 자성, 상자성 또는 초상자성 나노결정을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쇄의 매트릭스는 덱스트란의 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쇄는 콜로이드성 중합체 쇄이다.
일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플에서 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:5 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:10 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:25 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:50 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:100 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:200 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:300 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:400 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:500 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:600 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:700 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:800 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:900 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:1,000 이상이다.
일부 실시형태에서, 응집되지 않은 종양 샘플에서 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:500 이상이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:500 내지 1:750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:750 내지 1:1,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,000 내지 1:1,250이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,250 내지 1:1,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,500 내지 1:1,750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,750 내지 1:2,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,000 내지 1:2,250이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,250 내지 1:2,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,500 내지 1:2,750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,750 내지 1:3,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:3,000 내지 1:3,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:3,500 내지 1:4,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:4,000 내지 1:5,000이다.
일부 실시형태에서, 효능제는 재조합 효능제이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 OKT3 항체 또는 UCHT1 항체이다.
본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 양상에서, TIL의 집단을 확장시키는 방법은 TIL의 집단을 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하고, 매트릭스는 CD3 효능제 및 CD28 효능제에 부착되고, 나노매트릭스는 활성화 신호를 상기 TIL의 집단에 제공하여, TIL의 집단을 활성화시켜 이것이 증식하도록 유도하고, 각각의 매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚의 길이이고, 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스와 접촉된 TIL의 집단은 종양 세포를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 집단을 나노매트릭스와 접촉시키기 전에 TIL의 집단의 추가 확장 공정 없이 대상체로부터 단리되고, 나노매트릭스와 접촉된다.
일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 5㎍ 내지 약 10㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 10㎍ 내지 약 15㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 15㎍ 내지 약 20㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 20㎍ 내지 약 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 25㎍ 내지 약 30㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 30㎍ 내지 약 35㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 35㎍ 내지 약 40㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 40㎍ 내지 약 45㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 45㎍ 내지 약 50㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다.
일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 5㎍ 내지 약 10㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 10㎍ 내지 약 15㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 15㎍ 내지 약 20㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 20㎍ 내지 약 25㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 25㎍ 내지 약 30㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 30㎍ 내지 약 35㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 35㎍ 내지 약 40㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 40㎍ 내지 약 45㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제 또는 이의 단편은 나노매트릭스 1㎎당 약 45㎍ 내지 약 50㎍으로 나노매트릭스에 부착되어 있다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스는 중합체 쇄의 매트릭스 내에 또는 그 사이에 내장된 자성, 상자성 또는 초상자성 나노결정을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쇄의 매트릭스는 덱스트란의 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합체 쇄는 콜로이드성 중합체 쇄이다.
일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:5 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:10 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:25 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:50 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:100 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:200 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:300 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:400 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:500 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:600 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:700 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:800 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:900 이상이다. 일부 실시형태에서, 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:1,000 이상이다.
일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:500 이상이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:500 내지 1:750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:750 내지 1:1,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,000 내지 1:1,250이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,250 내지 1:1,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,500 내지 1:1,750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:1,750 내지 1:2,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,000 내지 1:2,250이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,250 내지 1:2,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,500 내지 1:2,750이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:2,750 내지 1:3,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:3,000 내지 1:3,500이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:3,500 내지 1:4,000이다. 일부 실시형태에서, 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:4,000 내지 1:5,000이다.
일부 실시형태에서, 효능제는 재조합 효능제이다. 일부 실시형태에서, 효능제는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제는 OKT3 항체 또는 UCHT1 항체이다.
c. 가용성 단일특이적 복합체
본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 양상에서, TIL의 집단을 확장시키는 방법은 TIL의 집단을 제1, 제2 및 제3 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 각각의 가용성 단일특이적 복합체는 함께 연결된 2개의 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 각각의 가용성 단일특이적 복합체의 각각의 항체 또는 이의 단편은 TIL의 집단 상의 동일한 항원에 특이적으로 결합하고, 제1 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD3 항체를 포함하고, 제2 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD28 항체를 포함하고, 제3 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD2 항체를 포함하고, 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, TCR 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD3 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD28 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD28 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 배지는 CD2 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD2 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD2 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 0.2 내지 25㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 0.2 내지 1㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 1 내지 2㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 2 내지 5㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 5 내지 10㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 10 내지 15㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 15 내지 20㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 20 내지 25㎕/㎖의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 사량체 항체 복합체(TAC)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 TAC는 제1 동물 종으로부터의 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 제2 종으로부터의 2개의 항체 분자에 의해서 결합된 제1 동물 종으로부터의 2개의 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체는 OKT3 항체 또는 UCHT1 항체이다. 일부 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체는 중앙 기억 T 세포 표현형을 증가시키는 데 특히 효과적이다.
d. TIL 확장
일부 실시형태에서, TIL은 초기 종양 단편화 또는 비응집으로부터 최대 총 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 총 9 내지 25일, 9 내지 21일 또는 9 내지 14일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 9일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 10일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 11일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 12일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 13일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 14일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 15일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 16일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 17일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 18일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 19일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 20일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 21일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 22일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 23일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 24일 동안 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL은 최대 총 25일 동안 확장된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 500 내지 500,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 500 내지 1,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 1,000 내지 2,500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 2,500 내지 5,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 5,000 내지 10,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 10,000 내지 20,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 20,000 내지 30,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 30,000 내지 40,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 40,000 내지 50,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 50,000 내지 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 100,000 내지 150,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 150,000 내지 200,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 200,000 내지 250,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 250,000 내지 300,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 300,000 내지 350,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 350,000 내지 400,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 400,000 내지 450,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 450,000 내지 500,000배 확장된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 100 내지 100,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 100 내지 1,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 1,000 내지 2,500개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 2,500 내지 5,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 5,000 내지 7,500 개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 7,500 내지 10,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 10,000 내지 20,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 20,000 내지 30,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 30,000 내지 40,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 40,000 내지 50,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 50,000 내지 60,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 60,000 내지 70,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 70,000 내지 80,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 80,000 내지 90,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 90,000 내지 100,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 150배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 750배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 1000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 1500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 2000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 2500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 3000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 4000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 5000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 6000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 7000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 8000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 9000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제10일에 적어도 10,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, 제10일에 이들 배수 확장은 사전-REP 실패로부터의 TIL에서 일어났다
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 1,500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 5,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 7,500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 10,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 15,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 20,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 25,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 30,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 40,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 50,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 60,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 70,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 80,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 90,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 110,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 120,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 130,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 140,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, 제14일에 이들 배수 확장은 사전-REP 실패로부터의 TIL에서 일어났다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 150,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 5,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 7,500배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 10,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 15,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 20,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 25,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 30,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 40,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 50,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 60,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 70,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 80,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 90,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 110,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 120,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 130,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 140,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, 제14일에 이들 배수 확장은 사전-REP 실패로부터의 TIL에서 일어났다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 15,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 20,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 25,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 30,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 40,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 50,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 60,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 70,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 80,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 90,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 110,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 120,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 130,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 140,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 150,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 200,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 300,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 400,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, 제21일에 이들 배수 확장은 사전-REP 실패로부터의 TIL에서 일어났다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 500,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 20,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 25,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 30,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 40,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 50,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 60,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 70,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 80,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 90,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 100,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 110,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 120,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 130,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 140,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 150,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 200,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 300,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 400,000배 확장된다. 일부 실시형태에서, 제21일에 이들 배수 확장은 사전-REP 실패로부터의 TIL에서 일어났다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 Cas9 및 적어도 1종의 가이드 RNA를 사용하여 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단의 구성원은 후성적으로 변형된다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 2%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 3%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 4%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 5%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 6%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 7%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 8%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 9%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 10%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 11%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 12%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 13%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 14%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 적어도 15%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 5 내지 50%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 10 내지 25%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 5 내지 10%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 10 내지 15%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 15 내지 20%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 20 내지 25%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 25 내지 30%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 30 내지 35%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 35 내지 40%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 40 내지 45%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되고, 확장된 집단 중 45 내지 50%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는다.
일부 실시형태에서, TIL의 집단은 CD8+ 세포의 존재비가 증가된 TIL의 확장된 집단을 생산하도록 확장된다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 10% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 20% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 30% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 40% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 50% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 60% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 70% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 80% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 90% 풍부하다. 일부 실시형태에서, TIL의 집단은 TIL의 출발 집단에 비해서 확장 후 100% 풍부하다
또 다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 발명은 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해서 생산된 TIL의 확장된 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
B. 확장된 TIL의 표현형 특징
일부 경우에, 확장된 TIL을 본 명세서에 기재된 것을 비롯한 다수의 표현형 마커의 발현에 대해서 분석한다. 일부 경우에, 마커는 하기로부터 선택된다: TCRα/β, CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD45RO, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 및 HLA-DR. 일부 경우에, 1종 이상의 조절 마커의 발현은 즉 하기의 군으로부터 측정된다: CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 및 CD154.
일부 경우에, 기억 마커는 CCR7 또는 CD62L이다. 일부 경우에, 재자극된 TIL은 또한 사이토카인 방출 검정을 사용하여, 사이토카인 방출에 대해서 평가될 수 있다. 일부 경우에, TIL은 OKT3으로의 자극 또는 자가유래 종양 소화물과의 공배양에 응답한 인터페론-감마(IFN-감마)에 대해서 평가될 수 있다.
일부 경우에, TIL은 다양한 조절 마커, 예컨대, TCRα/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R, CCR7, CD62L, KLRG1 및 CD122에 대해서 평가된다.
C. TIL의 유전자 변형
일부 경우에, TIL은 고친화도 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어, 종양-연관 항원에 표적화되는 TCR, 예컨대, MAGE-1, HER2 또는 NY-ESO-1, 또는 종양-연관 세포 표면 분자(예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자(예를 들어, EGFR, CD19 또는 HER2)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 추가 기능을 포함하도록 유전자 조작된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하는 하나 이상의 변형을 포함하는 TIL을 포함하는 변형된 TIL뿐만 아니라 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 내인성 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A를 포함한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조) 일부 실시형태에서, 이들 유전자는 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1, NFKBIA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 유전자는 SOCS1 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1개, 2개 또는 그 초과의 유전자를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "변형된 TIL"은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하는, 비-자연 수단을 통해서 달성된 하나 이상의 게놈 변형을 포함하는 TIL뿐만 아니라 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 비-자연 발생 유전자-조절 시스템을 포함하는 TIL을 포함한다. 용어 "변형된 TIL"은 용어 "조작된 TIL" 또는 "eTILTM"과 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서, "비변형된 TIL" 또는 "대조군 TIL"은, 게놈이 외인성 수단을 사용하여 변형되지 않았고, 외인성 유전자-조절 시스템을 포함하지 않거나 대조군 유전자-조절 시스템(예를 들어, 빈 벡터 대조군, 비-표적화 gRNA, 스크램블드(scrambled) siRNA 등)을 포함하는 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다. TIL에 행해질 수 있는 예시적인 변형은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호에 제시되어 있다. 1종 이상의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능이 감소된 자연 발생된 TIL은 용어 비변형된 또는 대조군 TIL 하에 포함된다.
이론에 얽매이고자 함은 아니지만, TIL은 종양 항원에 대한 증가된 특이성을 보유하고(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Radvanyi et al., 2012 Clin Canc Res 18:6758-6770]), 따라서 종양 항원-특이적 면역 반응(예를 들어, 활성화, 증식 및 암 세포에 대한 세포독성 활성)을 매개하여 외인성의 조작된 수용체를 도입하지 않으면서 암 세포 파괴(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Brudno et al., 2018 Nat Rev Clin Onc 15:31-46])로 이어질 수 있다고 생각된다. 따라서, 일부 실시형태에서, TIL은 대상체에서 종양으로부터 단리되고, 생체외에서 확장되고, 대상체에 재주입된다. 일부 실시형태에서, TIL은 자가유래 종양 항원에 대해서 특이적인 1종 이상의 외인성 수용체를 발현하도록 변형되고, 생체외에서 확장되고, 대상체에 재주입된다. 이러한 실시형태는 생체내 마우스 모델을 사용하여 모델링될 수 있는데, 여기서 마우스에 암 항원(예를 들어, CD19)을 발현하는 암 세포주가 이식하고, 암 항원에 특이적인 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포로 치료한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열 내에 하나 이상의 변형(예를 들어, 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 포함하여 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 이러한 변형은 본 명세서에서 "불활성화 돌연변이"로 지칭되고, 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 유전자는 "변형된 내인성 표적 유전자"로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 mRNA 전사를 감소 또는 저해하여, 암호화된 mRNA 전사체 및 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 mRNA 번역을 감소 또는 저해하여, 암호화된 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 내인성 단백질의 비변형된(즉, 야생형) 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세(dominant-negative) 돌연변이체)에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 변형된 내인성 단백질을 암호화한다. TIL에 행해질 수 있는 예시적인 변형은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호에 제시되어 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 변형된 내인성 표적 유전자 SOCS1 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하거나 또는 내인성 단백질의 변형된 버전의 발현을 초래하는 내인성 표적 유전자 이외의 게놈 위치에 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입되어, 유전자-조절 시스템의 발현 시 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 내인성 단백질의 변형된 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈의 하나 이상의 위치에 삽입되며, 여기서 단백질의 변형된 버전의 기능은 단백질의 비변형된 또는 야생형 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세 돌연변이체)에 비해서 감소된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 변형은 비변형된 TIL에 비해서 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물(즉, mRNA 전사체 또는 단백질)의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 단백질의 mRNA 전사체 및/또는 감소된 발현의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 5% 감소된다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 복수(예를 들어, 2개 이상)의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 TIL 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자로부터의 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자, 또는 이의 일부는 변형된 TIL이 mRNA 전사체 또는 단백질을 발현하지 않도록 삭제된다(즉, "넉-아웃된다"). 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 복수의 내인성 표적 유전자 또는 이의 부분의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 표적 DNA 서열 내의 하나 이상의 변형은 비변형된 TIL에서 발현되는 상응하는 단백질(예를 들어, "비변형된 내인성 단백질")의 기능에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 단백질(예를 들어, "변형된 내인성 단백질")의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 단백질을 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질은, 변형된 TIL에 의해서 발현되거나 또는 또 다른 세포에 의해서 발현되는 또 다른 단백질에 대해서 감소된 또는 변경된 결합 친화도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 신호전달 능력을 나타내거나; 감소된 또는 변경된 효소 활성도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 DNA-결합 활성도를 나타내거나; 또는 스캐폴드 단백질로서 기능하는 감소된 또는 변경된 능력을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 내인성 표적 유전자는 하나 이상의 음성 우세 돌연변이(dominant negative mutation)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "음성-우세 돌연변이"는 암호화된 단백질이 비변형된 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질에 길항적으로 작용하도록 하는 표적 유전자의 1종 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는, 음성 표현형이 상응하는 비변형된 유전자의 양성 표현형보다 유전자 우세하기 때문에 음성-우세이다. 하나 이상의 음성-우세 돌연변이를 포함하는 유전자 및 이에 의해서 암호화된 단백질은 "음성-우세 돌연변이체", 예를 들어, 음성-우세 유전자 및 음성-우세 단백질로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 음성 우세 돌연변이체 단백질은 TIL의 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입된 외인성 트랜스젠에 의해서 암호화된다.
음성 우세에 대한 다양한 기전이 공지되어 있다. 전형적으로, 음성 우세 돌연변이체의 유전자 생성물은 비변형된 유전자 생성물의 일부 기능을 보유하지만, 비변형된 유전자 생성물의 하나 이상의 중요한 다른 기능이 결핍되어 있다. 이는 음성-우세 돌연변이체가 비변형된 유전자 생성물을 길항작용하도록 한다. 예를 들어, 예시적인 실시형태로서, 전사 인자의 음성-우세 돌연변이체는 기능성 활성화 도메인이 결핍될 수 있지만 기능성 DNA 결합 도메인을 유지할 수 있다. 이러한 예에서, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자로서 DNA의 전사를 활성화시킬 수 없지만, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자가 전사 인자 결합 부위에 결합하는 것을 예방함으로써 유전자 발현을 간접적으로 저해할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태로서, 이량체로서 기능하는 단백질의 음성-우세 돌연변이가 공지되어 있다. 이러한 이량체 단백질의 음성-우세 돌연변이체는 비변형된 단백질과 이량체화하는 능력을 보유할 수 있지만, 달리 기능할 수 없다. 음성-우세 단량체는, 비변형된 단량체와 이량체화하여 이종이량체를 형성함으로써, 비변형된 단량체의 기능성 동종이량체의 형성을 방지한다. SOCS1 유전자의 우성 음성 돌연변이는 당업계에 공지되어 있고, 뮤린 F59D 돌연변이체(문헌[Hanada et al., J Biol Chem, 276:44:2 (2001), 40746-40754]; 및 Suzuki et al., J Exp Med, 193:4 (2001), 471-482] 참조), 및 인간 및 뮤린 SOCS1 아미노산 서열의 서열 정렬에 의해서 식별된 인간 F58D 돌연변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 표적 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로부터 선택된다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조) 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 표적 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열을 변형시킴으로써(예를 들어, 게놈 DNA 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이에 의해서); 내인성 표적 유전자의 전사를 조절(예를 들어, mRNA 전사의 저해 또는 억제)함으로써; 그리고/또는 내인성 표적 유전자의 번역(예를 들어, mRNA 분해에 의해서)을 조절함으로써 다양한 기전에 의해서 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 유전자-조절 시스템(예를 들어, 핵산-기반 유전자-조절 시스템, 단백질-기반 유전자-조절 시스템 또는 조합 단백질/핵산-기반 유전자-조절 시스템)을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 TIL에 포함된 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자를 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 하기를 포함하는 유전자-조절 시스템을 포함한다:
a. 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
b. 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
c. 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
d. 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
e. 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 RNA(gRNA);
f. 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
g. gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
h. gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
i. 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(gDNA);
j. 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 하나 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
k. gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
l. gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
m. 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
n. 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
o. gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
p. gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
q. 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 하기를 포함하는 유전자-조절 시스템을 포함한다:
a. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
b. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
c. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
d. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
e. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 RNA(gRNA);
f. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
g. gRNA와 상호작용하여 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
h. gRNA와 상호작용하여 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
i. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(DNA);
j. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
k. gDNA와 상호작용하여 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
l. gDNA와 상호작용하여 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
m. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
n. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
o. gRNA와 상호작용하여, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
p. gRNA와 상호작용하여, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
q. 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 하기를 포함하는 유전자-조절 시스템을 포함한다:
a. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 2종 이상의 핵산 분자;
b. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 2종 이상의 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
c. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 2종 이상의 단백질;
d. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키고/시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 2종 이상의 단백질을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
e. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 2종 이상의 가이드 RNA(gRNA);
f. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 2종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
g. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 2종 이상의 가이드 DNA(DNA);
h. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 2종 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
i. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 2종 이상의 gRNA;
j. SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 2종 이상의 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
k. 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종, 2종 또는 그 초과의 폴리뉴클레오타이드가 TIL의 게놈 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜에 의해서(episomally) 발현되고, TIL의 게놈에 삽입되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, 1종 이상의 게놈 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다(예를 들어, 유전자 "넉-인"). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 트랜스진은 검출 가능한 표지, 안정성-스위치 시스템, 키메라 스위치 수용체 및/또는 조작된 항원-특이적 수용체를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 검출 가능한 태그를 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 검출 가능한 태그는 FLAG 태그, 폴리-히스티딘 태그(예를 들어, 6xHis), SNAP 태그, Halo 태그, cMyc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그, 아비딘, 효소, 형광 단백질, 발광 단백질, 화학발광 단백질, 생물발광 단백질 및 인광 단백질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서 형광 단백질은 청색/UV 단백질(예컨대, BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, 사파이어 및 T-사파이어); 시안 단백질(예컨대, CFP, eCFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, 단량체 Midoriishi-Cyan, TagCFP 및 mTFP1); 녹색 단백질(예컨대: GFP, eGFP, meGFP(A208K 돌연변이), Emerald, Superfolder GFP, Monomeric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover 및 mNeonGreen); 황색 단백질(예컨대, YFP, eYFP, Citrine, Venus, SYFP2, 및 TagYFP); 주황색 단백질(예컨대, Monomeric Kusabira-Orange, mKOκ, mKO2, mOrange 및 mOrange2); 적색 단백질(예컨대, RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby 및 mRuby2); 원적(far-red) 단백질(예컨대, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune 및 NirFP); 근적(near-infrared) 단백질(예컨대, TagRFP657, IFP1.4 및 iRFP); 긴 스트로크 이동 단백질(long stokes shift protein)(예컨대, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 및 mBeRFP); 광활성화 가능한(photoactivatible) 단백질(예컨대, PA-GFP, PAmCherry1 및 PATagRFP); 광전환 가능한(photoconvertible) 단백질(예컨대, Kaede(녹색), Kaede(적색), KikGR1(녹색), KikGR1(적색), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2(녹색), mEos2(적색), mEos3.2(녹색), mEos3.2(적색), PSmOrange 및 PSmOrange); 및 광스위치 가능한(photoswitchable) 단백질(예컨대, Dronpa)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 태그는 AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed Monomer 및/또는 AcGFP로부터 선택될 수 있고, 이들 모두는 클론테크사(Clontech)로부터 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 안전성-스위치 시스템을 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 안전성-스위치 시스템(당업계에서 자살 유전자 시스템이라고 지칭됨)은 세포가 대상체에 투여된 후 변형된 TIL의 제거를 가능하게 하는 1종 이상의 단백질을 암호화하는 외인성 트랜스젠을 포함한다. 안전성-스위치 시스템의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 안전성-스위치 시스템은 비독성 전구약물을 독성 화합물로 전환시키는 단백질, 예컨대, 단순 포진 티미딘 키나제(Hsv-tk) 및 간시클로비어(GCV) 시스템을 암호화하는 유전자(Hsv-tk/GCV)를 포함한다. Hsv-tk는 비독성 GCV를 세포독성 화합물로 전환시키는데, 이것은 세포 아포토시스를 일으킨다. 이와 같이, GCV를, Hsv-tk 단백질을 암호화하는 트랜스젠을 포함하는 변형된 TIL로 치료된 대상체에 투여하는 것은 내인성 TIL을 절약하게 하면서 변형된 TIL을 선택적으로 제거할 수 있다. 예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Bonini et al., Science, 1997, 276(5319):1719-1724; Ciceri et al., Blood, 2007, 109(11):1828-1836; Bondanza et al., Blood 2006, 107(5):1828-1836] 참조.
추가의 안전성-스위치 시스템은 ADCC를 통해서 세포-표면 마커에 특이적인 단클론성 항체의 투여에 의해서 변형된 TIL의 제거를 가능하게 하는 세포-표면 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 마커는 CD20이고, 변형된 TIL은 항-CD20 단클론성 항체, 예컨대, 리툭시맙의 투여에 의해서 제거될 수 있다(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Introna et al., Hum Gene Ther, 2000, 11(4):611-620; Serafini et al., Hum Gene Ther, 2004, 14, 63-76; van Meerten et al., Gene Ther, 2006, 13, 789-797] 참조). EGF-R 및 세툭시맙 또는 페니투무맙을 사용한 유사한 시스템은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제 PCT 공개 제WO 2018006880호에 기재되어 있다. 추가적인 안전성-스위치 시스템은 이량체화의 화학 유도기(chemical inducer of dimerization: CID)에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 프로-아포토시스(pro-apoptotic) 분자를 암호화하는 트랜스젠을 포함하는데, 이것은 프로-아포토시스 분자의 올리고머화 및 아포토시스 경로의 활성화를 유도하는 CID의 투여에 의해서 변형된 TIL의 제거를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 Fas(CD95라고도 공지됨)이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Thomis et al., Blood, 2001, 97(5), 1249-1257]). 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 카파제-9이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Straathof et al., Blood, 2005, 105(11), 4247-4254]).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 키메라 스위치 수용체를 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 키메라 스위치 수용체는 내인성 세포-표면 수용체로부터의 세포외 도메인 및 이종 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 세포-표면 수용체여서, 세포외 도메인에 의한 리간드 인식은 세포-표면 수용체의 야생형 형태에 의해서 활성화되는 것보다 상이한 신호전달 캐스케이드 활성화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 키메라 스위치 수용체는 저해성 세포-표면 수용체에 의해서 일반적으로 전달되는 저해성 신호가 아닌 활성화 신호의 전달로 이어지는 세포내 도메인에 융합된 저해성 세포-표면 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, TIL 활성화를 저해한다고 공지된 세포-표면 수용체로부터 유래된 세포외 도메인은 활성화 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 이어서, 상응하는 리간드의 맞물림이 TIL의 활성화를 저해하기 보다는 증가시키는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 PD1-CD28 스위치 수용체를 암호화하는 트랜스진을 포함하며, 여기서 PD1의 세포외 도메인은 CD28의 세포내 신호전달 도메인에 융합된다(예를 들어, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Liu et al., Cancer Res 76:6 (2016), 1578-1590 및 Moon et al., Molecular Therapy 22 (2014), S201] 참조). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 CD200R의 세포외 도메인 및 CD28의 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 트랜스진을 포함한다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Oda et al., Blood 130:22 (2017), 2410-2419] 참조). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 본 명세서에서 "변형된 수용체-조작된 세포" 또는 "변형된 RE-세포"로서 지칭되는, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해서 발현되는 단백질 표적을 인식하는 조작된 항원-특이적 수용체를 추가로 포함한다. 용어 "조작된 항원 수용체"는 비자연 발생 항원-특이적 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 힌지 및 막관통 도메인을 통해서 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포외 도메인은 MHC-독립적인 방식으로 표적 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하고, 이것은 RE 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 융합된 태그를 인식한다. 이러한 실시형태에서, CAR의 항원-특이성은 표지된 항체의 항원-특이성에 좌우되어, 또 다른 항체를 하나의 항체로 대체함으로써 단일 CAR 작제물을 사용하여 다수의 상이한 항원을 표적화할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,233,125호 및 제9,624,279호; 미국 특허 출원 공개 제20150238631호 및 제20180104354호 참조). 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 유용한 항원 결합 도메인은 예를 들어, scFv; 항체; 항체의 항원 결합 영역; 중쇄/경쇄의 가변 영역; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체 제타 쇄(예컨대, CD3ξ 신호전달 도메인), FcγRIII, FcεRI 또는 T-림프구 활성화 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인 중 임의의 2개를 추가로 포함한다. 예시적인 CAR 구조 및 세포내 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; 및 WO 2015/090229 참조).
다양한 종양 항원에 특이적인 CAR은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, CD171-특이적 CAR(문헌[Park et al., Mol Ther (2007) 15(4):825-833]), EGFRvIII-특이적 CAR(문헌[Morgan et al., Hum Gene Ther (2012) 23(10):1043-1053]), EGF-R-특이적 CAR(문헌[Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014) 107(1):364]), 탄산무수화효소 K-특이적 CAR(문헌[Lamers et al., Biochem Soc Trans (2016) 44(3):951-959]), FR-α-특이적 CAR(문헌[Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12(20):6106-6015]), HER2-특이적 CAR(문헌[Ahmed et al., J Clin Oncol (2015) 33(15)1688-1696; Nakazawa et al., Mol Ther (2011) 19(12):2133-2143; Ahmed et al., Mol Ther (2009) 17(10):1779-1787; Luo et al., Cell Res(2016) 26(7):850-853; Morgan et al., Mol Ther (2010) 18(4):843-851; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9(2):32]), CEA-특이적 CAR(문헌[Katz et al., Clin Cancer Res (2015) 21(14):3149-3159]), IL13Rα2-특이적 CAR(문헌[Brown et al., Clin Cacner Res (2015) 21(18):4062-4072]), GD2-특이적 CAR(문헌[Louis et al., Blood (2011) 118(23):6050-6056; Caruana et al., Nat Med (2015) 21(5):524-529]), ErbB2-특이적 CAR(문헌[Wilkie et al., J Clin Immunol (2012) 32(5):1059-1070]), VEGF-R-특이적 CAR(문헌[Chinnasamy et al., Cancer Res (2016) 22(2):436-447]), FAP-특이적 CAR(문헌[Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(2):154-166]), MSLN-특이적 CAR(문헌[Moon et al, Clin Cancer Res (2011) 17(14):4719-30]), NKG2D-특이적 CAR(문헌[VanSeggelen et al., Mol Ther (2015) 23(10):1600-1610]), CD19-특이적 CAR(Axicabtagene ciloleucel(Yescarta®) 및 Tisagenlecleucel(Kymriah®)이다. 종양-특이적 CAR의 임상 시험의 검토에 대해서는 문헌[Li et al., J Hematol and Oncol (2018) 11(22)]을 참고하기 바란다. 본 개시내용에 따라서 사용하기에 적합한 예시적인 CAR을 하기 표 2에 기재한다.
Figure pct00002
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 재조합 TCR이다. 재조합 TCR은 특정 표적 항원을 인식하는 T 세포 집단으로부터 단리 및 클로닝된 TCRα 및/또는 TCRβ 쇄를 포함한다. 예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ 유전자(즉, TRAC 및 TRBC)는 특정 종양 항원 또는 종양 세포로 면역화된 인간화된 마우스로부터 단리된 특정 악성종양 또는 T 세포 집단을 갖는 개체로부터 단리된 T 세포 집단으로부터 클로닝될 수 있다. 재조합 TCR은 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 주 조직적합성 복합체(MHC) 단백질의 맥락에서 제시된 동족 항원의 인식에 의해서) 내인성 반대부분과 동일한 기전을 통해서 항원을 인지한다. 이러한 항원 맞물림은 내인성 신호전달 경로를 자극하여, TCR-조작된 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다.
종양 항원에 특이적인 재조합 TCR, 예를 들어, WT1-특이적 TCR(JTCR016, 주노 쎄라퓨틱스사(Juno Therapeutics); WT1-TCRc4, 미국 특허 출원 제20160083449호에 기재됨), MART-1 특이적 TCR(문헌[Morgan et al., Science 314 (2006) 126-129]에 기재된 DMF4T 클론 포함); 문헌[Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546]에 기재된 DMF5T 클론); 및 문헌[van den Berg et al., Mol. Ther. 23 (2015) 1541-1550]에 기재된 ID3T), gp100-특이적 TCR(Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546), CEA-특이적 TCR(문헌[Parkhurst et al., Mol Ther. 19 (2011) 620-626]), NY-ESO 및 LAGE-1 특이적 TCR(문헌[Robbins et al., J Clin Oncol 26 (2011) 917-924; Robbins et al., Clin Cancer Res 21 (2015) 1019-1027; 및 Rapoport et al., Nature Medicine 21 (2015) 914-921]에 기재된 1G4T 클론), 및 MAGE-A3-특이적 TCR(Morgan et al., J Immunother 36 (2013) 133-151) 및 Linette et al., Blood 122 (2013) 227-242)은 당업계에 공지되어 있다(또한 문헌[Debets et al., Seminars in Immunology 23 (2016) 10-21] 참조).
재조합 TCR을 생성시키기 위해서, 천연 TRAC(서열번호 882) 및 TRBC(서열번호 883) 단백질 서열은 관심대상 단백질 또는 펩타이드에 특이적인 TCR-α 및 TCR-β 쇄 가변 영역의 C-말단 단부에 융합된다. 예를 들어, 조작된 TCR은 NY-ESO 펩타이드(SLLMWITQC, 서열번호 884), 예컨대, 1G4 TCR 또는 95:LY TCR을 인식할 수 있다(문헌[Robbins et al, Journal of Immunology 2008 180:6116-6131]). 이러한 예시적인 실시형태에서, 쌍을 이룬 1G4-TCR α/β 쇄는 각각 서열번호 885 및 886을 포함하고, 쌍을 이룬 95:LY-TCR α/β 쇄는 각각 서열번호 887 및 888을 포함한다. 재조합 TCR은 MART-1 펩타이드(AAGIGILTV, 서열번호 889), 예컨대, DMF4 및 DMF5 TCR을 인식할 수 있다(문헌[Robbins et al, Journal of Immunology 2008 180:6116-6131]). 이러한 예시적인 실시형태에서, 쌍을 이룬 DMF4-TCR α/β 쇄는 각각 서열번호 890 및 891를 포함하고, 쌍을 이룬 DMF5-TCR α/β 쇄는 각각 서열번호 892 및 893을 포함한다. 재조합 TCR은 WT-1 펩타이드(RMFPNAPYL, 서열번호 894), 예컨대, DLT TCR을 인식할 수 있다(문헌[Robbins et al, Journal of Immunology 2008 180:6116-6131]). 이러한 예시적인 실시형태에서, 쌍을 이룬 고친화도 DLT-TCR α/β 쇄는 각각 서열번호 895 및 896를 포함한다.
TCR 쇄 둘 다의 발현이 화학량론적 방식으로 단일 프로모터로부터 제거되도록 재조합 TCRα 및 TCRβ 쇄 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 서열이 생성될 수 있다. 이러한 실시형태에서, P2A 서열(서열번호 897)은 TCRβ 및 TCRα 쇄를 암호화하는 DNA 서열 사이에 삽입될 수 있어서, 재조합 TCR 쇄를 암호화하는 발현 카세트는 다음 포맷을 포함한다: TCRβ - P2A - TCRα. 예시적인 실시형태로서, 이러한 카세트로부터 발현된 1G4 NY-ESO-특이적 TCR의 단백질 서열은 서열번호 898을 포함할 것이고, 이러한 카세트로부터 발현된 95:LY NY-ESO-특이적 TCR의 단백질 서열은 서열번호 899을 포함할 것이고, 이러한 카세트로부터 발현된 DMF4 MART1-특이적 TCR의 단백질 서열은 서열번호 900을 포함할 것이고, 이러한 카세트로부터 발현된 DMF5 MART1-특이적 TCR의 단백질 서열은 서열번호 901을 포함할 것이고, 이러한 카세트로부터 발현된 DLT WT1-특이적 TCR의 단백질 서열은 서열번호 902를 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 분화 분자의 클러스터, 예컨대, CD3, CD4, CD8, CD16, CD24, CD25, CD33, CD34, CD45, CD64, CD71, CD78, CD80(B7-1이라고도 공지됨), CD86(B7-2라고도 공지됨), CD96, CD116, CD117, CD123, CD133 및 CD138, CD371(CLL1이라고도 공지됨); 종양-연관 표면 항원, 예컨대, 5T4, BCMA(CD269 및 TNFRSF17이라고도 공지됨, 유니프로트 번호 Q02223), 암배아 항원(CEA), 탄산무수화효소 9(CAIX 또는 MN/CAIX), CD19, CD20, CD22, CD30, CD40, 다이시알로강글리오사이드, 예컨대, GD2, ELF2M, 관상피 뮤신(ductal-epithelial mucin), 에프린 B2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM), ErbB2(HER2/neu), FCRL5(유니프로트 번호 Q68SN8), FKBP11(유니프로트 번호 Q9NYL4), 글리오마-연관 항원, 글리고스핑고리피드, gp36, GPRC5D(유니프로트 번호 Q9NZD1), mut hsp70-2, 장 카복실 에스터라제(intestinal carboxyl esterase), IGF-I 수용체, ITGA8(유니프로트 번호 P53708), KAMP3, LAGE-1a, MAGE, 메소텔린, 호중구 엘라스타제, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, PAP, 프로스타제(prostase), 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 특이적 항원(PSA), PSMA, 프로스테인, RAGE-1, ROR1, RU1(SFMBT1), RU2(DCDC2), SLAMF7(유니프로트 번호 Q9NQ25), 서바이빈, 태그-72 및 텔로머라제; 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자 제시 종양-특이적 펩타이드 에피토프; 종양 기질 항원, 예컨대, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 A(EDA) 및 엑스트라 도메인 B(EDB); 테나신-C의 A1 도메인(TnC A1) 및 섬유모세포 연관 단백질(FAP); 사이토카인 수용체, 예컨대, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), TFGβ-R 또는 이의 성분, 예컨대, 엔도글린; 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자; 바이러스-특이적 표면 항원, 예컨대, HIV-특이적 항원(예컨대, HIV gp120); EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라사 바이러스-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원뿐만 아니라 이들 표면 항원의 임의의 유도체 또는 변이체로부터 선택된 표적 항원에 지향된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 내인성 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A를 포함한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조).
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 PTPN2의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 SOCS1 및 PTPN2의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1 및 PTPN2의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 PTPN2의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 SOCS1 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 PTPN2 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 PTPN2 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 PTPN2 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 PTPN2 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 ZC3H12A 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 ZC3H12A 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 SOCS1 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 PTPN2 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 PTPN2 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 ZC3H12A 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 ZC3H12A 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 SOCS1 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CBLB 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 CBLB 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 CBLB 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 PTPN2 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 PTPN2 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 ZC3H12A 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 ZC3H12A 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 SOCS1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CBLB 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 CBLB 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 CBLB 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 RC3H1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 TIL 또는 RC3H1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 세포 표면 상에서 발현되는 CAR 또는 재조합 TCR을 추가로 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 RC3H1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 RC3H1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하고, CAR 또는 재조합 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 내인성 유전자는 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A를 포함한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조).
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 PTPN2의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 PTPN2의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CBLB 및 RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 CBLB 및 RC3H1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 PTPN2 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 PTPN2 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 ZC3H12A 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 SOCS1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CBLB 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 CBLB 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 RC3H1 및 NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능 또는 RC3H1 및 NFKBIA의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 TIL을 제공하며, 여기서 면역 효과기 세포는 TIL이다.
D. 효과기 기능
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조)로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능(또는 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템)을 포함하고, 1종 이상의 면역 세포 효과기 기능의 증가를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능(또는 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템)을 포함하고, 하나 이상의 면역 세포 효과기 기능의 증가를 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "효과기 기능"은 표적 세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성, 유지 및/또는 향상과 관련된 면역 세포의 기능을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 하기 특징 중 하나 이상을 나타낸다: 종양 내로의 증가된 침윤 또는 이동, 증가된 증식, 증가된 또는 연장된 세포 생존, 세포의 활성화 상태가 연장되거나 증가되도록 하는 주변 미세환경 내의 저해성 인자에 대한 증가된 저항성, 전염증성 면역 인자(예를 들어, 전염증성 사이토카인, 케모카인, 및/또는 효소)의 증가된 생산, 증가된 세포독성, 소포에 대한 증가된 저항성 및/또는 증가된 Tcm 백분율.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 종양 내로의 증가된 침윤을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 TIL에 의한 증가된 종양 침윤은 동일한 시간 기간 동안 종양 내로 침윤하는 비변형된 TIL의 수에 비해서 주어진 시간 기간 동안 종양 내로 침윤하는 변형된 TIL의 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 면역 세포에 비해서 종양 침윤에서 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다. 종양 침윤은 대상체로부터 하나 이상의 종양을 단리시키고, 유세포 분석법, 면역조직화학 및/또는 면역형광에 의해서 샘플에서 변형된 면역 세포의 수를 평가함으로써 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 세포 증식 증가를 나타낸다. 이들 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 TIL에 비해서 존재하는 변형된 TIL의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 증가된 증식 속도를 나타내고, 여기서 변형된 TIL은 비변형된 TIL보다 더 신속한 속도로 분화된다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 면역 세포에 비해서 증식 속도에서 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 ㅍ는 비변형된 TIL에 비해서 연장된 증식 기간을 나타내는데, 여기서 변형된 TIL 및 비변형된 TIL은 유사한 속도로 분화하지만, 변형된 TIL은 더 긴 시간 기간 동안 증식성 상태를 유지한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 증식성 상태를 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 증가된 또는 연장된 세포 생존을 나타낸다. 이러한 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 TIL에 비해서 존재하는 변형된 TIL의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 생존을 유지하고, 지속된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 저해성 인자에 대해서 증가된 내성을 나타낸다. 예시적인 저해성 인자는 면역 관문 분자(예를 들어, PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, IDO) 및/또는 저해성 사이토카인(예를 들어, IL-10, TGFβ)에 의한 신호전달을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해서 T 세포 소모에 대해서 저항성을 나타낸다. T 세포 소모는 감소된 효과기 기능을 특징으로 하는 항원-특이적 T 세포 이상기능의 상태이고, 이것은 항원-특이적 T 세포의 후속 결실로 이어진다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 항원에 반응하여 증식하는 능력이 결핍되고/되거나 감소된 사이토카인 생산을 나타내고/나타내거나 표적 세포, 예컨대, 종양 세포에 대해서 감소된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 세포 표면 마커 및 전사 인자의 변경된 발현, 예컨대, CD122 및 CD127의 감소된 세포 표면 발현; 저해성 세포 표면 마커, 예컨대, PD1, LAG3, CD244, CD160, TIM3, 및/또는 CTLA4의 증가된 발현; 및/또는 전사 인자, 예컨대, Blimp1, NFAT, 및/또는 BATF의 증가된 발현에 의해서 식별된다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 사이토카인 신호전달의 변경된 민감성, 예컨대, TGFβ 신호전달에 대한 증가된 민감성 및/또는 IL-7 신호전달에 대한 감소된 민감성을 나타낸다. T 세포 소모는 예를 들어, T 세포를 표적 세포의 집단과 공배양하고, T 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포의 용해를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL을 표적 세포(예를 들어, 표적 종양 항원을 발현하도록 조작된 자가유래 종양 세포 또는 세포주)의 집단과 공동 배양하고, 효과기 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포 용해를 측정한다. 이어서, 이러한 결과를 표적 세포와 대조군 면역 세포의 집단(예컨대, 대조군 변형을 갖는 비변형된 TIL 또는 면역 효과기 세포)의 공배양으로부터 얻은 결과와 비교한다.
일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단으로부터 관찰된 사이토카인 생산과 비교하여, 변형된 TIL로부터의 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IFNγ, TNFα 또는 IL-2)의 증가된 생산에 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단으로부터의 사이토카인 생산과 비교하여, 변형된 TIL로부터의 사이토카인 생산에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단으로부터 관찰된 증식과 비교하여, 변형된 TIL의 증가된 증식에 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단의 증식과 비교하여, 변형된 TIL의 증식에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단에 의해서 관찰된 표적 세포 용해와 비교하여, 변형된 TIL에 의한 증가된 표적 세포에 용해 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단에 의한 표적 세포 용해와 비교하여, 변형된 TIL에 의한 표적 세포 용해에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단과 비교된 변형된 TIL의 소모는 시험관내 또는 생체외 제조 과정 동안 측정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 종양 단편으로부터 단리된 TIL은 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 단리되고, 이어서 하나 이상의 라운드의 확장으로 확장되어 변형된 TIL의 집단을 생성한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 TIL의 소모는 수거 직후 및 제1 라운드의 확장 전, 제2 라운드의 확장 전의 제1 라운드의 확장 후, 그리고/또는 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 후에 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단과 비교된 변형된 TIL의 소모를 대상체에게 변형된 TIL을 전달한 후 하나 이상의 시간 지점에서 측정한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 생산되고, 대상체에게 투여된다. 이어서 샘플을 전달 후 다양한 시간 지점에서 대상체로부터 채취하여 시간에 따라서 생체내에서 변형된 TIL의 소모를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 전염증성 면역 인자의 증가된 발현 또는 생산을 나타낸다. 전염증성 면역 인자의 예는 세포용해 인자, 예컨대, 그랜자임 B, 퍼포린 및 그래눌리신; 전염증성 사이토카인, 예컨대, 인터페론(IFNα, IFNβ, IFNγ), TNFα, IL-1β, IL-12, IL-2, IL-17, CXCL8, 및/또는 IL-6을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 비변형된 TIL에 비해서 표적 세포에 대해서 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 비변형된 면역 세포에 비해서 표적 세포에 대한 세포독성에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다.
면역 효과기 기능을 측정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 종양 침윤은 대상체로부터 종양을 단리시키고, 유세포 분석법, 면역조직화학, 및/또는 면역형광에 의해서 종양에 존재하는 림프구의 총 수 및/또는 표현형을 결정함으로써 측정될 수 있다. 세포-표면 수용체 발현은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯 및/또는 qPCR에 의해서 결정될 수 있다. 사이토카인 및 케모카인 발현 및 생산은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯, ELISA, 및/또는 qPCR에 의해서 측정될 수 있다. 세포외자극(예를 들어, 사이토카인, 저해성 리간드 또는 항원)에 대한 반응 또는 민감성은 자극에 반응한 하류 신호전달 경로(예를 들어, 하류 신호전달 중간체의 포스포릴화)의 세포 증식 및/또는 활성화를 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포독성은 변형된 TIL과 표적 세포의 시험관내 또는 생체외 공배양 및 생체내 뮤린 종양 모델, 예컨대 실시예 전체에 기재된 것을 비롯한, 당업계에 공지된 표적-세포 용해 검정에 의해서 측정될 수 있다.
E. 내인성 경로 및 유전자의 조절
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다. 내인성 표적 유전자의 추가 상세 사항은 하기 표 3에 제공된다. 이러한 실시형태에서, 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 또는 기능은 면역 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 사이토카인 신호전달의 억제자(Suppressors of cytokine signaling) SOCS 1(SOCS1) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. SOCS1 단백질은 C-말단 SOCS 박스 모티프, SH2-도메인, ESS 도메인 및 N-말단 KIR 도메인을 포함한다. 키나제 저해성 영역(kinase inhibitory region: KIR)이라고 불리는 12 아미노산 잔기는 JAK1, TYK2 및 JAK2 타이로신 키나제 기능을 부정적으로 조절하는 SOCS1의 능력에 중요하다고 밝혀져 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 PTPN2 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 단백질 타이로신 포스파타제 패밀리(PTP)는 이의 포스파타제 촉매 도메인에 의해서 포스포-타이로신 잔기를 탈포스포릴화시킨다. PTPN2는 JAK/STAT 신호전달 복합체를 통해서 신호를 전달하는 TCR 및 사이토카인 둘 다에 대한 브레이크로서 기능하여, 신호 1 및 3 둘 다에 대한 면역관문으로서 작용한다. 항원과의 T 세포 맞물림 및 TCR의 활성화 이후에, 타이로신 잔기의 포스포릴화에 의한 키나제 Lck 및 Fyn에 의해서 양성 신호가 하류에서 증폭된다. PTPN2는 Lck 및 Fyn 둘 다를 탈포스포릴화시키는 작용을 함으로써 TCR 신호전달을 약화시킨다. 또한, T 세포가 JAK/STAT 신호전달을 통해서 양의 신호를 전달하는 공통 γ 쇄 수용체 복합체를 통해서 사이토카인과 만나서 신호를 전달한 후에, PTPN2는 또한 STAT1 및 STAT3의 탈포스포릴화에 의해서 약화된다. T 세포 기능에 대한 PTPN2 손실의 전체 기능 효과는 TCR 및 성장 및 분화-향상 사이토카인을 통해 급격히 발생하는 T 세포 활성화에 필요한 활성화 역치의 하강이다.
또한, 전체 마우스에서 PTPN2의 결실은 사이토카인 수준, 비림프구 조직에서의 림프구성 침윤 및 류마티스 관절염-유사 증상의 초기 징후를 증가시키고; 이러한 마우스는 5주령을 지나서까지 생존하지 않는다. 따라서, PTPN2는 마우스에서 출생 후 발달에 중요한 것으로 인식되어 있다. 이러한 자가면역 표현형과 일관되게, 출생으로부터의 T 세포 계통에서의 Ptpn2의 결실은 또한 비-림프구 조직에서 림프구성 침윤의 증가를 초래한다. 중요하게는, 성인 마우스 T 세포에서 Ptpn2의 유도성 넉아웃은 임의의 자가면역 징후를 초래하지 않았다. 자가면역에서의 이의 역할 이외에, Ptpn2 결실은 인간에서 소수의 T 세포 급성 림프아구성 백혈병(ALL)과 연관되어 있고; 2-단계의 화학적으로 유도된 발암성에서 피부 종양 발달을 향상시키는 것으로 식별되었다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 ZC3H12A유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. MCPIP1 및 Regnase-1이라고도 지칭되는 Zc3h12는 CCCH-유형 아연-핑거 모티프의 바로 상류에 RNase 도메인을 보유하는 RNase이다. 뉴클레아제 활성을 통해서, Zc3h12a는 이들 유전자의 3' UTR 내의 보존된 줄기 루프 구조에 결합함으로써, 전사체, 예컨대, IL-6의 mRNA를 표적으로 하여, 이를 탈안정화시킨다. T 세포에서, Zc3h12a는 c-Rel, Ox40 및 IL-2를 비롯한, 다수의 전염증성 유전자의 전사체 수준을 제어한다. Regnase-1 활성화는 일시적이고, 프로테아솜-매개된 분해 또는 점막-연관된 림프 조직 1(mucosa-associated lymphoid tissue 1: MALT1) 매개된 절단을 비롯한 음성 피드백 기전에 적용된다. Regnase-1의 주요 기능은 상이한 세포 유형에서 유전자의 하위세트를 특이적으로 표적화함으로써 리보뉴클레아제 활성을 통해서 mRNA 쇠퇴를 촉진시키는 것이다. 단핵구에서, Regnase-1은 IL-6 및 IL-12B mRNA를 하향조절하고, 따라서 염증을 완화시키는 반면, T 세포에서, 그것은 c-Rel, Ox40 및 IL-2 전사체를 표적화함으로써 T-세포 활성화를 제한한다. 암 세포에서, Regnase-1은 Bcl2L1, Bcl2A1, RelB 및 Bcl3을 비롯한 항-아포토시스 유전자를 저해함으로써 아포토시스를 촉진시킨다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 CBLB유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 이 유전자는 RNF56, Nbla00127 및 Cbl 원종양유전자(proto-oncogene) B라고도 지칭되는 CBL-B를 암호화한다. CBL-B는 E3 유비퀴틴-단백질 리가제 및 CBL 유전자 패밀리의 구성원이다. CBL-B는 T-세포 활성화의 음성 조절자로서 기능한다. T 세포에서의 CBL-B 발현은 리간드-유도된 T 세포 수용체 하향조절을 초래하여, 항원 제시 동안 T 세포의 활성화 정도를 제어한다. CBLB 유전자의 돌연변이는 자가면역 병태, 예컨대, 제1형 당뇨병과 연관되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 RC3H1 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 이 유전자는 Roquin-1이라고도 지칭되는 링 핑거(Ring finger) 및 CCCH-유형 도메인 1을 암호화한다. Roquin-1은 mRNA의 3' UTR에서 구성적 감쇠 요소(constitutive decay element: CDE)를 인식하고 이에 결합하여, mRNA 탈아데닐화(deadenylation) 및 분해로 이어진다. 대체 스플라이싱은 다수의 전사체 변이체를 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL은 NFKBIA 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 이 유전자는 NFKB 저해제 알파, MAD-3, NFKBI 및 EDAID2라고도 지칭되는 IκBα를 암호화한다. IκBα는 NF-κB 전사 인자를 저해하는 기능을 하는 세포 단백질의 패밀리의 하나의 구성원이다. IκBα는 NF-κB 단백질의 핵 국지화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 차폐하고, 이를 세포질에서 불활성화 상태로 격리시킴으로써 NF-κB를 저해한다. 또한, IκBα는 DNA에 결합하는 NF-κB 전사 인자의 능력을 차단하는데, 이는 NF-κB의 적절한 기능에 필요하다. NFKBIA 유전자는 일부 호지킨 림프종에서 돌연변이되고; 이러한 돌연변이는 IκBα 단백질을 불활성화시켜, NF-κB가 림프종 종양 세포에서 만성적으로 활성화되게 하고, 이러한 활성은 이들 종양 세포의 악성 상태에 기여한다.
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일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 또는 NFKBIA 중 임의의 1종 또는 2종 또는 그 초과의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, PTPN2, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, SOCS1의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, PTPN2, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, SOCS1의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, PTPN2의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, ZC3H12A, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, PTPN2의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, RC3H1의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A 및 RC3H1로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 CBLB, SOCS1, PTPN2, ZC3H12A 및 RC3H1로부터 선택된 적어도 2종의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, NFKBIA의 감소된 발현 및/또는 기능을 추가로 포함한다.
II. 유전자-조절 시스템
본 명세서에서, 용어 "유전자-조절 시스템"은 세포에 도입될 때 내인성 표적 DNA 서열을 변형시켜서 암호화된 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 조절할 수 있는 단백질, 핵산 또는 이들의 조합물을 지칭한다. shRNA, siRNA, 아연-핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 다수의 유전자-조절 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 유전자-편집 시스템이다. 아연-핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 유전자 편집 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조절한다"는, 내인성 표적 유전자에 대한 유전자-조절 시스템의 효과와 관련하여 사용되는 경우, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 임의의 변화, 내인성 표적 유전자의 후성적 상태에서의 변화 및/또는 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현 또는 기능에서의 임의의 변화를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 예를 들어, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 돌연변이의 도입에 의해서, 예컨대, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입 또는 결실에 의해서, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 변화를 매개할 수 있다. 내인성 표적 서열의 변경을 매개할 수 있는 예시적인 기전은 비-상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ)(예를 들어, 통상적이거나 대안적임), 마이크로상동성-매개된 말단 연결(microhomology-mediated end joining: MMEJ), 상동성-유도된 수선(homology-directed repair)(예를 들어, 내인성 공여자 주형 매개된), SDSA(합성 의존성 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링 또는 단일 가닥 침범을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 서열의 후성적 상태에서의 변화를 매개할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자 DNA의 공유 변형(예를 들어, 사이토신 메틸화 및 하이드록시메틸화) 또는 연관된 히스톤 단백질의 공유 변형(예를 들어, 라이신 아세틸화, 라이신 및 아르기닌 메틸화, 세린 및 트레오닌 포스포릴화 및 라이신 유비퀴틴화 및 수모화(sumoylation))을 매개할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현의 변화를 매개할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 DNA 서열의 변형에 의해서, 또는 DNA 서열에 의해서 암호화된 mRNA 생성물에 작용함으로써 암호화된 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 변형된 내인성 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템에 의해서 매개된 내인성 DNA 서열에 대한 변형은 내인성 단백질의 발현을 초래하는데, 이는 비변형된 TIL에서 상응하는 내인성 단백질과 비교할 때 감소된 기능을 입증한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질의 발현 수준은 증가되거나 감소될 수 있고, 비변형된 면역 세포에서 상응하는 내인성 단백질의 발현 수준과 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있다.
A. 핵산-기반 유전자-조절 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 핵산을 포함하는 핵산 유전자-조절 시스템을 제공한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조) 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 핵산을 포함하는 핵산 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1, 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 핵산을 포함하는 핵산 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 유전자-조절 시스템을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 제조된 변형된 TIL을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 외인성 단백질에 대한 요건 없이 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 표적 핵산 서열에 상보적인 RNA 간섭 분자 또는 안티센스 RNA 분자를 포함한다.
"안티센스 RNA 분자"는 mRNA 전사체와 상보적인, 길이에 무관한 RNA 분자를 지칭한다. 안티센스 RNA 분자는 세포, 조직 또는 대상체에 도입되어 내인성 유전자 침묵 경로에 좌우되지 않지만, 그 보다는 표적 mRNA 전사체의 RNaseH-매개된 분해에 좌우되는 기전을 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 감소시킬 수 있는 단일 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 또는 당업계에 공지된 다른 것을 포함하거나, 또는 비-자연 인터뉴클레오사이드 링키지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.
"RNA 간섭 분자"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 내인성 유전자 침묵 경로(예를 들어, Dicer 및 RNA-유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing 복합체: RISC))를 통한 표적 mRNA의 분해에 의해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현 감소를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭제는 마이크로 RNA(본 명세서에서 "miRNA"라고도 지칭됨), 짧은 헤어-핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), RNA 압타머 및 몰폴리노를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 miRNA를 포함한다. miRNA는 약 21 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 자연 발생, 작은 비-암호 RNA 분자이다. miRNA는 1종 이상의 표적 mRNA 분자에 적어도 부분적으로 상보적이다. miRNA는 번역 억압, mRNA의 절단 및/또는 탈아데닐화를 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 하향조절(예를 들어, 감소)할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 shRNA를 포함한다. shRNA는 줄기-루프 구조를 형성하고, 상보적 mRNA 서열의 분해를 유발하는 약 50 내지 70개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 RNA 분자이다. shRNA는 플라스미드 또는 비-복제 재조합 바이러스 벡터에서 클로닝되어 세포내로 도입되어, 게놈 내의 shRNA-암호화 서열의 통합을 초래할 수 있다. 이와 같이, shRNA는 내인성 표적 유전자 번역 및 발현의 안정적이고 일관된 억제를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 siRNA를 포함한다. siRNA는 전형적으로 약 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)라고 불리는 멀티 단백질 복합체와 회합하고, 그 동안 "패신저" 센스 가닥이 효소에 의해서 절단된다. 이어서 서열 상동성으로 인해서, 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥이 RISC를 상응하는 mRNA로 안내하고, 동일한 뉴클레아제가 표적 mRNA를 절단하여, 특이적 유전자 침묵을 초래한다. 최적으로, siRNA는 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드 길이이고, 3' 단부에 2 염기 오버행을 갖는다. siRNA는 개별 세포 및/또는 배양 시스템에 도입되어, 표적 mRNA 서열의 분해를 초래할 수 있다. siRNA 및 shRNA는 문헌[Fire et al., Nature, 391:19, 1998] 및 미국 특허 제7,732,417호; 제8,202,846호; 및 제8,383,599호에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 몰폴리노를 포함한다. "몰폴리노"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 변형된 핵산 올리고머를 지칭하며, 여기서 표준 핵산 염기가 몰폴리노 고리에 결합되어 있고, 포스포로다이아미데이트 링키지를 통해서 연결된다. siRNA 및 shRNA에 유사하게, 몰폴리노는 상보적 mRNA 서열에 결합한다. 그러나, 몰폴리노는 분해를 위해서 상보성 mRNA 서열을 표적화하기 보다는 mRNA 번역 및 mRNA 스플라이싱의 변경을 통해서 기능한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 표 4, 표 5, 표 9 내지 표 12 및 표 17 내지 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자를 포함한다. 본 출원 전체에서, 언급된 게놈 좌표는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 입수 가능한 게놈 Reference Consortium으로부터의 인간 게놈의 GRCh38(hg38이라고도 지칭됨) 어셈블리의 게놈 주석에 기초한다. 하나의 어셈블리와 또 다른 것 간의 게놈 좌표를 전환시키는 툴(tool) 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 명세서에 제공된 게놈 좌표를 인간 게놈의 또 다른 어셈블리에서 상응하는 좌표로 전환시킬 수 있으며, 이는 동일한 기관에 의해서 또는 동일한 알고리즘을 사용하여 생성된 초기 어셈블리에 대한 전환(예를 들어, GRCh38로부터 GRCh37로), 및 상이한 기관 또는 알고리즘에 의해서 생성된 어셈블리의 전환(예를 들어, GRCh38로부터 NCBI33으로, International 인간 게놈 Sequencing Consortium에 의해서 생성됨)을 포함한다. 당업계에 공지된 사용 가능한 방법 및 툴은 NCBI 게놈 Remapping Service(미국 국립생물공학정보센터로부터 입수 가능), UCSC LiftOver(UCSC 게놈 Brower 웹사이트로부터 입수 가능), 및 Assembly Converter(Ensembl.org 웹사이트에서 입수 가능)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4(인간 게놈) 또는 표 5(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 35 및 56 내지 187 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 35 및 56 내지 187 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 표적 인간 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 23 내지 55 또는 23 내지 200 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 23 내지 35 및 56 내지 187 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 인간 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 23 내지 55 또는 23 내지 200 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 23 내지 35 및 56 내지 187 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 표적 인간 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 분자 또는 shRNA 분자를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 13 내지 22로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 SOCS1-표적화 siRNA이다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 PCT 공개 제WO 2017120996호; 제WO 2018137295호; 제WO 2017120998호; 및 제WO 2018137293호 참조)(표 6). 일부 실시형태에서, SOCS1-표적화 siRNA 분자 또는 shRNA 분자는 서열번호 13 내지 200으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, SOCS1-표적화 siRNA 분자 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 35 및 56 내지 187로부터 선택된 인간 핵산 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 35로부터 선택된 인간 표적 서열에 결합하는 SOCS1-표적화 shRNA 분자 또는 siRNA 분자이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제8,324,369호 참조). (표 7). 일부 실시형태에서, SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 36 내지 55로부터 선택된 마우스 표적 서열에 결합하는 SOCS1-표적화 shRNA 분자 또는 siRNA 분자이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,944,931호 참조)(표 8).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9(인간 게놈) 또는 표 10(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 314 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 314 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 SOCS1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 201 내지 314 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 201 내지 314 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11(인간 게놈) 또는 표 12(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 337 또는 331 내지 797 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 337 또는 331 내지 797 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 328-330또는 329 및 330(인간)으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 ZC3H12A-표적화 siRNA이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Liu et al., Scientific Reports (2016), 6, Article # 24073 및 Mino et al., Cell (2015) 161(5), 1058-1073)] 참조). 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 336 내지 789 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 336-789 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 또는 337로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 ZC3H12A-표적화 shRNA 분자이다(전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Huang et al., J Biol Chem (2015) 290(34), 20782-20792] 참조).\
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17(인간 게놈) 또는 표 18(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 808 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 808 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 798 내지 808 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 798 내지 808 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
Figure pct00030
Figure pct00031
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19(인간 게놈) 또는 표 20(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 836 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 836 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 824 내지 836 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 824 내지 836 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
Figure pct00032
Figure pct00033
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 1종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21(인간 게놈) 또는 표 22(마우스 게놈)에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 856 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 856 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA--표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 845 내지 856 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 shRNA 또는 siRNA는 서열번호 845 내지 856 중 하나에 의해서 암호화된 인간 RNA 서열과 100% 동일한 인간 표적 RNA 서열에 결합한다.
Figure pct00034
Figure pct00035
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-, PTPN2-, ZC3H12A-, CBLB-, RC3H1- 또는 NFKBIA-표적화 siRNA 분자 또는 shRNA 분자는 상업적인 공급원, 예컨대, Sigma Aldrich®, Dharmacon®, ThermoFisher® 등으로부터 입수된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-, PTPN2- 또는 ZC3H12A-표적화 siRNA 분자는 표 23에 제시된 것이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-, PTPN2- 또는 ZC3H12A-표적화 shRNA 분자는 표 24에 제시된 것이다.
Figure pct00036
Figure pct00037
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2--표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB--표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 PTPN2-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 ZC3H12A-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 331 내지 797 또는 331 또는 337 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 SOCS1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 23 내지 200 또는 23 내지 55 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 CBLB-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 핵산 분자는 RC3H1-표적화 핵산 분자이고, 적어도 1종의 핵산 분자는 NFKBIA-표적화 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 핵산 분자는 siRNA 또는 shRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
B. 단백질-기반 유전자-조절 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 단백질을 포함하는 단백질 유전자-조절 시스템을 제공한다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조) 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 단백질을 포함하는 단백질 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 유전자-조절 시스템을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 제조된 변형된 TIL을 제공한다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 핵산 가이드 분자에 대한 요건 없이 서열 특이적 방식으로 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 하나 이상의 단백질을 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "TALEN"로 지칭한다.
1. 아연 핑거 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 아연 핑거 단백질을 포함하는 아연 핑거 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 유전자-조절 시스템을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 제조된 변형된 TIL을 제공한다. 본 명세서에서, 아연 핑거-기반 시스템은 2개의 단백질 도메인: 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. "아연 핑거 DNA 결합 도메인", "아연 핑거 단백질", 또는 "ZFP"는 하나 이상의 아연 핑거를 통해서 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인인데, 이것은 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 표적 DNA 서열에 대한 결합에 의해서, 아연 핑거 도메인은 그 서열 부근에서 효소 도메인의 활성도를 지시하고, 따라서 표적 서열 부근에서 내인성 표적 유전자의 변형을 유도한다. 아연 핑거 도메인은 사실상 임의의 목적하는 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합이 바람직한 표적 DNA 서열을 함유하는 표적 유전자 유전자좌(예를 들어, 표 2 또는 표 3에 언급된 표적 유전자에서의 표적 유전자좌)를 식별한 후, 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인은 표적 유전자 유전자좌에서 하나 이상의 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 세포에서 아연 핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현은, 표적 유전자 유전자좌에서 변형을 달성한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 1종 이상의 아연 핑거를 포함한다(Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Febuary:56-65; 미국 특허 제6,453,242호). 전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이이다. 개별 아연 핑거는 3개-뉴클레오타이드(즉, 삼중) 서열(또는 1개 뉴클레오타이드에 의해서, 인접한 아연 핑거의 4개-뉴클레오타이드 결합 부위와 중첩할 수 있는 4개-뉴클레오타이드 서열)에 결합한다. 따라서 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인이 조작된 서열(예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 핑거 결합 도메인에서 아연 핑거의 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중첩 하위부위에 결합하지 않은 ZFP의 경우, 6개-뉴클레오타이드 표적 서열이 2개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고; 9개-뉴클레오타이드 표적 서열이 3개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고, 그 등등이다. 표적 부위 내의 개별 아연 핑거에 대한 결합 부위(즉, 하위부위)는 인접할 필요는 없지만, 멀티-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거 사이(즉, 인터-핑거 링커)의 아미노산 서열의 길이 및 본성에 따라서, 하나 또는 몇몇 뉴클레오타이드에 의해서 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개별 ZFP의 DNA-결합 도메인은 3 내지 6개의 개별 아연 핑거 반복부를 포함하고, 이것은 각각 9 내지 18개 염기쌍을 인식할 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 선택 서열에 결합하도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참조). 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질에 비해서 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
아연 핑거 도메인에 의한 결합을 위한 표적 DNA 서열의 선택은 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 간단한 육안 검사를 표적 DNA 서열의 선택에 또한 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법에서 표적 DNA 서열 선택을 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다. 표적 부위는 일반적으로 길이가 적어도 9개 뉴클레오타이드이고, 따라서 적어도 3개의 아연 핑거를 포함하는 아연 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들어, 4개-핑거 결합 도메인의 12개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 5개-핑거 결합 도메인의 15개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 또는 6개-핑거 결합 도메인의 18개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다. 보다 큰 결합 도메인(예컨대, 7개-, 8개-, 9개-핑거 및 그 초과)의 보다 긴 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 아연 핑거 융합 단백질(ZFP)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 아연 핑거 융합 단백질(ZFP)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 아연 핑거 융합 단백질(ZFP)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-, PTPN2-, ZC3H12A-, CBLB-, RC3H1- 또는 NFKBIA-표적화 ZFP는 상업적인 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사, 다마콘사, 써모피셔사 등으로부터 입수된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1, PTPN2 또는 ZC3H12A ZFP는 표 25에 제시된 것이다.
Figure pct00038
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 CBLB 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 ZFP를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 ZFP는 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 ZFP는 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
아연 핑거 융합 단백질의 효소 도메인 부분은 엔도- 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 효소 도메인이 도출될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(예를 들어, 51 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNaseI; 마이크로코쿠스 뉴클레아제(micrococcal nuclease); 효모 HO 엔도뉴클레아제(또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 이들 효소(또는 이의 기능성 단편) 중 1종 이상은 절단 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 ZFP의 효소 도메인으로서 사용하기에 적합한 예시적인 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에서 존재하고, DNA에(인식 부위에서) 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 절단 도메인 및 결합 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 FokI는 일 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드에서, 그리고 다른 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터의 13개 뉴클레오타이드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉진한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 뿐만 아니라, 문헌[Li et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al., (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al., (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982] 참조. 따라서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 효소 도메인 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다(문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575] 참조). 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해서, 각각 FokI 효소 도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 효소 도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다. FokI 효소 도메인을 포함하는 예시적인 ZFP가 미국 특허 제9,782,437호에 기재되어 있다.
2. TALEN 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된 적어도 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 1종, 2종 또는 그 초과의 TALEN 융합 단백질을 포함하는 TALEN 유전자-조절 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 유전자-조절 시스템을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 제조된 변형된 TIL을 제공한다. TALEN-기반 시스템은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 이것은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합시킴으로써 제조된다. 위에서 기재된 FokI 제한 효소는 TALEN-기반 유전자-조절 시스템에 사용하기에 적합한 예시적인 효소 도메인이다.
TAL 효과기는 식물을 감염시키는 타입 III 분비 시스템을 통해서 잔토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해서 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 분기하는 제12 및 제13 아미노산을 갖는 반복되고 고도로 보존된 33 내지 34 아미노산 서열을 함유한다. 반복 가변 이잔기(Repeat Variable Diresidue: RVD)라고 지칭되는 이러한 2개의 위치는 고도로 가변성이고, 특이적 뉴클레오타이드 인식과 강하게 상관관계가 있다. 따라서, TAL 효과기 도메인은 적절한 RVD를 함유하는 반복 분절의 조합물을 선택함으로써 특이적 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. RVD 조합물에 대한 핵산 특이성은 하기와 같다: HD는 사이토신을 표적으로 하고, NI 표적은 아데닌을 표적으로 하고, NG는 티민을 표적으로 하고, NN은 구아닌을 표적으로 한다(하지만, 일부 실시형태에서, NN은 더 낮은 특이성으로 아데닌에 결합할 수 있다).
TAL-효과기 반복부를 조립하기 위한 방법 및 조성물은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cermak et al, Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82] 참조). TAL-효과기 반복부의 작제를 위한 플라스미드는 애드젠사(Addgene)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 7 또는 표 8에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하는 적어도 1종의 TALEN 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 표적 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 표적 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 18723 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 18723 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 331 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 NFKBIA 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 23 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 17 또는 표 18 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 Talen 융합 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함하고, 적어도 1종의 Talen 융합 단백질은 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 19 또는 표 20 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 TAL 효과기 도메인은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
C. 조합 핵산/단백질-기반 유전자-조절 시스템
조합 유전자-조절 시스템은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 및 핵산 가이드 분자를 포함한다. 본 명세서에서, "부위-지향된 변형 폴리펩타이드"는 핵산 가이드 분자에 결합하고, 결합되는 핵산 가이드 분자에 의해서 표적 핵산 서열(예를 들어, 내인성 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 표적화되고, (예를 들어, 표적 핵산 서열의 절단, 돌연변이 또는 메틸화) 표적 핵산 서열을 변형시키는 폴리펩타이드를 지칭한다.
부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 2개의 부분, 즉, 핵산 가이드에 결합하는 부분 및 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 부위-지향 효소 활성(예를 들어, DNA 메틸화, DNA 또는 RNA 절단, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화 등)을 나타내는 활성 부분을 포함하며, 여기서 효소 활성 부위는 가이드 핵산에 의해서 결정된다. 일부 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열을 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아민화 활성, 디스무타제(dismutase) 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화(depurination) 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포톨리아제(photolyase) 활성 또는 글리코실라제 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 다른 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열과 회합되는 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤)를 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성도, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 DNA 서열의 전사를 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 RNA 서열의 발현 또는 번역을 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다.
핵산 가이드는 2개의 부분, 즉, 내인성 표적 핵산 서열과 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 제1 부분(본 명세서에서 "핵산-결합 분절"이라고 지칭), 및 부위-지향된 변형 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 제2 부분(본 명세서에서 "단백질-결합 분절"이라고 지칭)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 각각 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함되어, 핵산 가이드는 서로와 회합되어 기능성 가이드를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
핵산 가이드는 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화함으로써 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템의 표적 특이성을 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 서열, 예컨대, 표적 유전자의 mRNA 전사체 내에 포함된 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 표적 유전자의 DNA 서열 내에 포함된 DNA 서열이다. 본 명세서에서 표적 유전자에 대한 언급은 복수의 표적 유전자 유전자좌(즉, 특정 표적 유전자 서열의 부분(예를 들어, 엑손 또는 인트론))를 포함하는 특정 유전자에 대한 전장 DNA 서열을 포함한다. 각각의 표적 유전자 유전자좌 내에는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템에 의해서 변형될 수 있는 본 명세서에서 "표적 DNA 서열"이라고 지칭되는 DNA 서열의 더 짧은 스트레치가 존재한다 추가로, 각각의 표적 유전자 유전자좌는 "표적 변형 부위"를 포함하는데, 이것은 유전자-조절 시스템에 의해서 유도된 변형의 정확한 위치(예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이의 위치, DNA 브레이크의 위치 또는 후성적 변형의 위치)를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 핵산 가이드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 핵산 가이드)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템은 알고너트(Argonaute)(Ago) 단백질(예를 들어, 티. 써모필레스(T. thermophiles) Ago 또는 TtAgo)로부터 유래된 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 티. 써모필레스 Ago DNA 엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드는 가이드 DNA(gDNA)이다(문헌[Swarts et al., Nature 507 (2014), 258-261] 참조). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gDNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gDNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템은 CRISPR(짧은 회문 구조 반복 서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas (CRISPR 연관된) 뉴클레아제 시스템이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 클래스 2 시스템이다. 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템은 3개의 유형으로 나뉜다: 타입 II, 타입 V 및 타입 VI 시스템. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질을 사용하는 클래스 2 타입 II 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 가이드 RNA(gRNA)이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas12 단백질(예를 들어, Cas12a(Cpf1이라고도 공지됨), Cas12b(C2c1이라고도 공지됨), Cas12c(C2c3이라고도 공지됨), Cas12d(CasY라고도 공지됨), 및 Cas12e(CasX라고도 공지됨))를 사용하는 클래스 2 타입 V 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas12 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas13 단백질(예를 들어, Cas13a(C2c2라고도 공지됨), Cas13b 및 Cas13c)을 사용하는 클래스 2 및 타입 VI 시스템이다(문헌[Pyzocha et al., ACS Chemical Biology, 13(2), 347-356] 참조). 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas13 RNA 리보엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다.
Cas 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있거나 gRNA 분자와 협력하여, 표적 DNA 또는 표적 RNA 서열에 귀소 또는 국지화할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 단백질 및 자연 발생 Cas 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 조작된, 변경된 또는 달리 변형된 Cas 단백질을 포함한다.
가이드 RNA(gRNA)는 2개의 분절, DNA-결합 분절 및 단백질-결합 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 단백질-결합 분절은 하나의 RNA 분자에 포함되고, DNA-결합 분절은 또 다른 별개의 RNA 분자에 포함된다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "이중-분자 gRNA" 또는 "2-분자 gRNA" 또는 "이중 gRNA"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자이고, 본 명세서에서 "단일-가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭된다. 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 2-분자 가이드 RNA 및 sgRNA로 지칭되는 것 둘 다를 포함한다.
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로에 혼성화하여 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)를 형성하는 뉴클레오타이드의 2개의 상보적인 스트레치를 부분적으로 포함하며, 이것은 Cas 단백질에 대한 결합을 용이하게 한다. gRNA의 핵산-결합 분절(또는 "핵산-결합 서열")은 특이적 표적 핵산 서열에 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 폴리펩타이드와 상호작용하고, gRNA 분자와 부위-지향된 변형 폴리펩타이드의 상호작용은 내인성 핵산 서열에 대한 Cas 결합을 야기하여, 표적 핵산 서열 내에 또는 그 주변에 하나 이상의 변형을 생성시킨다. 표적 변형 부위의 정확한 위치는 (i) gRNA와 표적 핵산 서열 간의 염기-짝지움 상보성; 및 (ii) 표적 DNA 서열 내의 프로토스페이서 인접한 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)로서 지칭되는, 짧은 모티프의 위치(표적 RNA 서열 내의 프로토스페이서 측접 서열(protospacer flanking sequence: PFS)로서 지칭됨)에 의해서 결정된다. PAM/PFS 서열은 표적 핵산 서열에 대한 Cas 결합에 필요하다. 다양한 PAM/PFS 서열은 당업계에 공지되어 있고, 특정 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)와의 사용에 적합하다(예를 들어, 문헌[Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116-1121 및 Sci Rep. 2014; 4: 5405] 참조). 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 50개 염기쌍 내에 위치된다. 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 10개 염기쌍 내에 위치된다. 이러한 방법에 의해서 표적화될 수 있는 DNA 서열은 표적 변형 부위에 대한 PAM 서열의 상대적인 거리 및 서열-특이적, gRNA-매개된 Cas 결합을 매개하는 고유한 20개 염기쌍 서열의 존재에 의해서만 제한된다. 일부 실시형태에서, PFS 서열은 표적 RNA 서열의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 5' 말단에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 인트론 또는 엑손 내에 위치된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gRNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
1. Cas 단백질
일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas 단백질이다. 다양한 종의 Cas 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있고, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 아우레우스(S. aureus), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 에스. 써모필레스(S. thermophiles), 아시도보락스 아베내(Acidovorax avenae), 악티노바실루스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 시클리필루스데니트리피칸스(Cycliphilusdenitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(아미노monas paucivorans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 스미티이(Bacillus smithii), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실루스 라테로스폭수스(Brevibacillus laterospoxus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(M에틸ocystis sp.) 메틸로시너스 트리코스포리움(M에틸osinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닌기티디스, 네이세리아 종(Neisseria sp.) 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)로부터 유래된 Cas 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 C2C1, C2C3, Cpf1(Cas12a라고도 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csx12라고도 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔도리보뉴클레아제, 예컨대, Cas13 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas13 단백질은 Cas13a(Abudayyeh et al., Nature 550 (2017), 280-284), Cas13b(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027), Cas13c(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027) 또는 Cas13d(Zhang et al., Cell 175 (2018), 212-223) 단백질이다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 야생형 또는 자연 발생 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그이다. 야생형 Cas9는 HNH 뉴클레아제 도메인을 사용하여 DNA의 표적 가닥을 절단하고, RuvC-유사 도메인을 사용하여 비-표적 가닥을 절단하는 멀티-도메인 효소이다. gRNA 특이성에 기초한 DNA에 대한 WT Cas9의 결합은 비-상동 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-유도된 수선(HDR)에 의해서 수선될 수 있는 이중 가닥 DNA 브레이크를 초래한다. 예시적인 자연 발생 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재되어 있고, 추가적인 Cas9 오쏘로그는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아 패밀리, 클러스터 2 박테리아 패밀리, 클러스터 3 박테리아 패밀리, 클러스터 4 박테리아 패밀리, 클러스터 5 박테리아 패밀리, 클러스터 6 박테리아 패밀리, 클러스터 7 박테리아 패밀리, 클러스터 8 박테리아 패밀리, 클러스터 9 박테리아 패밀리, 클러스터 10 박테리아 패밀리, 클러스터 11 박테리아 패밀리, 클러스터 12 박테리아 패밀리, 클러스터 13 박테리아 패밀리, 클러스터 14 박테리아 패밀리, 클러스터 15 박테리아 패밀리, 클러스터 16 박테리아 패밀리, 클러스터 17 박테리아 패밀리, 클러스터 18 박테리아 패밀리, 클러스터 19 박테리아 패밀리, 클러스터 20 박테리아 패밀리, 클러스터 21 박테리아 패밀리, 클러스터 22 박테리아 패밀리, 클러스터 23 박테리아 패밀리, 클러스터 24 박테리아 패밀리, 클러스터 25 박테리아 패밀리, 클러스터 26 박테리아 패밀리, 클러스터 27 박테리아 패밀리, 클러스터 28 박테리아 패밀리, 클러스터 29 박테리아 패밀리, 클러스터 30 박테리아 패밀리, 클러스터 31 박테리아 패밀리, 클러스터 32 박테리아 패밀리, 클러스터 33 박테리아 패밀리, 클러스터 34 박테리아 패밀리, 클러스터 35 박테리아 패밀리, 클러스터 36 박테리아 패밀리, 클러스터 37 박테리아 패밀리, 클러스터 38 박테리아 패밀리, 클러스터 39 박테리아 패밀리, 클러스터 40 박테리아 패밀리, 클러스터 41 박테리아 패밀리, 클러스터 42 박테리아 패밀리, 클러스터 43 박테리아 패밀리, 클러스터 44 박테리아 패밀리, 클러스터 45 박테리아 패밀리, 클러스터 46 박테리아 패밀리, 클러스터 47 박테리아 패밀리, 클러스터 48 박테리아 패밀리, 클러스터 49 박테리아 패밀리, 클러스터 50 박테리아 패밀리, 클러스터 51 박테리아 패밀리, 클러스터 52 박테리아 패밀리, 클러스터 53 박테리아 패밀리, 클러스터 54 박테리아 패밀리, 클러스터 55 박테리아 패밀리, 클러스터 56 박테리아 패밀리, 클러스터 57 박테리아 패밀리, 클러스터 58 박테리아 패밀리, 클러스터 59 박테리아 패밀리, 클러스터 60 박테리아 패밀리, 클러스터 61 박테리아 패밀리, 클러스터 62 박테리아 패밀리, 클러스터 63 박테리아 패밀리, 클러스터 64 박테리아 패밀리, 클러스터 65 박테리아 패밀리, 클러스터 66 박테리아 패밀리, 클러스터 67 박테리아 패밀리, 클러스터 68 박테리아 패밀리, 클러스터 69 박테리아 패밀리, 클러스터 70 박테리아 패밀리, 클러스터 71 박테리아 패밀리, 클러스터 72 박테리아 패밀리, 클러스터 73 박테리아 패밀리, 클러스터 74 박테리아 패밀리, 클러스터 75 박테리아 패밀리, 클러스터 76 박테리아 패밀리, 클러스터 77 박테리아 패밀리, 또는 클러스터 78 박테리아 패밀리의 Cas9 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 자연 발생 Cas9 폴리펩타이드는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9 및 NmeCas9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 Cas9 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 하기 활성 중 하나 이상을 포함한다:
a. 닉카제 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어, 비-상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력;
b. 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 절단하고, 이중 가닥 브레이크를 생성하는 능력(이것은 실시형태에서 2개의 닉카제 활성의 존재임);
c. 엔도뉴클레아제 활성;
d. 엑소뉴클레아제 활성; 및/또는
e. 헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 DNA-손상 신호전달 단백질, 엑소뉴클레아제 또는 포스파타제를 동원하여 하나의 수선 기전 또는 또 다른 것에 의한 표적 서열의 수선 가능성 또는 속도를 추가로 증가시키는 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, WT Cas 폴리펩타이드는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 상이한 Cas 단백질(즉, 다양한 종으로부터의 Cas9 단백질)은 상이한 Cas 단백질의 다양한 효소 특징을 활용하기 위해서(예를 들어, 상이한 PAM 서열 선호도를 위해서; 증가된 또는 감소된 효소 활성도를 위해서; 세포 독성의 증가된 또는 감소된 수준을 위해서; NHEJ, 상동성-유도된 수선, 단일 가닥 브레이크, 이중 가닥 브레이크 등 간의 균형을 변화시키기 위해서) 다양한 제공된 방법에서 사용하는 것이 이로울 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 피오게네스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식한다(Mali et al, Science 2013; 339(6121): 823-826). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 써모필레스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Horvath et al, Science, 2010; 327(5962): 167-170 및 Deveau et al, J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 뮤탄스(S. mutans)로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Deveau et al, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390-1400] 참조). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRT(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRV(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GATT 또는 N GCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Hou et ah, PNAS 2013, 1-6] 참조). 상기에 언급된 실시형태에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어, A, G, C 또는 T 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 렙토트리치아 사히(Leptotrichia shahii)로부터 유래된 Cas13a 단백질이고, 단일 3' A, U 또는 C의 PFS 서열 모티프를 인식한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 90% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 100% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다.
2. Cas 돌연변이체
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 변경시키도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 변경된 효소 특성, 예를 들어, 변경된 뉴클레아제 활성(자연 발생 또는 다른 참조 Cas 분자와 비교할 때) 또는 변경된 헬리카제 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 크기를 변경시키는 변경, 예를 들어, Cas 폴리펩타이드의 또 다른 특성에 상당한 효과를 갖지 않으면서 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함한다 예를 들어, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 Cas 단백질에 의해서 인식된 PAM 서열 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다.
목적하는 특성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 목적하는 특성을 갖는 돌연변이체 또는 변경된 Cas 폴리펩타이드를 제공하기 위해서, 자연 발생 Cas 폴리펩타이드 또는 모 Cas 폴리펩타이드의 변경을 비롯한, 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 모 Cas 폴리펩타이드(예를 들어, 자연 발생 또는 조작된 Cas 폴리펩타이드)의 서열 내에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드에 비해서 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 돌연변이)를 포함한다.
실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 폴리펩타이드와 상이한 절단 특성을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas는 비활성화된 Cas(dCas) 돌연변이체이다. 이러한 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 어떠한 고유한 효소 활성도 포함하지 않고, 표적 핵산 절단을 매개할 수 없다. 이러한 실시형태에서, dCas는 비-절단성 기반 방식으로 표적 핵산을 변형시킬 수 있는 이종 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, dCas 단백질은 전사 활성화인자 또는 전사 억제인자 도메인(예를 들어, 크루펠 연관 박스(KRAB 또는 SKD); Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID 또는 SID4X); ERF 억제인자 도메인(ERD); MAX-상호작용 단백질 1(MXI1); 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2); 등)에 융합된다. 일부 이러한 경우에, dCas 융합 단백질은 sgRNA에 의해서, 표적 핵산 내의 특이적 위치(즉, 서열)에 표적화되고, 유전자좌-특이적 조절을 발휘하고, 예컨대, 프로모터에 대한 RNA 중합효소 결합을 차단(이것은 전사 활성화인자 기능을 선택적으로 저해함)하고/하거나 국지적 크로마틴 상태를 변형시킨다(예를 들어, 융합 서열이 사용되는 경우 표적 DNA를 변형시키거나 또는 표적 DNA와 회합된 폴리펩타이드를 변형시킴). 일부 경우에, 변화는 일시적이다(예를 들어, 전사 억제 또는 활성화). 일부 경우에, 변화는 유전성이다(예를 들어, 후성적 변형이 표적 DNA 또는 표적 DNA와 회합된 단백질, 예를 들어, 뉴클레오솜 히스톤에 일어난 경우).
일부 실시형태에서, dCas는 dCas13 돌연변이체이다(Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676). 이어서, 이들 dCas13 돌연변이체는 아데노신 데아미나제(예를 들어, ADAR1 및 ADAR2)를 비롯한, RNA를 변형시키는 효소에 융합될 수 있다. 아데노신 데아미나제는 아데닌을 이노신으로 전환시키는데, 여기서 번역 머시너리가 유사한 구아닌을 처리함으로써, RNA 서열에서 기능성 A→G를 생성시킨다. 일부 실시형태에서, dCas는 dCas9 돌연변이체이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas9는 Cas9 닉카제 돌연변이체이다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 단지 하나의 촉매 활성 도메인(HNH 도메인 또는 RuvC 도메인)을 포함한다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 gRNA 특이성에 기초한 DNA 결합을 보유하지만, DNA의 단지 하나의 가닥을 절단하여 단일 가닥 브레이크(예를 들어, "닉(nick)")를 생성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 상보성 Cas9 닉카제 돌연변이체(예를 들어, 불활성화된 RuvC 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체, 및 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체)는 2개의 각각의 표적 서열에 상응하는 2개의 gRNA를 갖는 동일한 세포에서 발현되는데; 하나의 표적 서열은 센스 DNA 가닥 상에서, 그리고 하나는 안티센스 DNA 가닥 상에서 발현된다. 이러한 이중-닉카제 시스템은 스태거드(staggered) 이중 가닥 브레이크를 생성시키고, 표적 특이성을 증가시킬 수 있는데, 그 이유는 2개의 표적외 닉이 이중 가닥 브레이크를 생성시키기에 충분히 가깝게 생성될 것 같지 않기 때문이다. 일부 실시형태에서, Cas9 닉카제 돌연변이체는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성을 변경시키도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성과 상이한 PAM/PFS 특이성을 갖는다. 예를 들어, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드가 표적 부위를 감소시키거나 특이성을 개선시키거나 PAM/PFS 인식 요건을 제거하도록 인식하는 PAM/PFS 서열을 변경하도록 자연 발생 Cas 단백질을 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 PAM/PFS 인식 서열의 길이를 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, PAM 인식 서열의 길이는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 아미노산 길이이다. 상이한 PAM/PFS 서열을 인식하고/하거나 감소된 표적외 활성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 유도 분화(directed evolution)를 사용하여 생성될 수 있다. Cas 폴리펩타이드의 유도 분화를 위해서 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은 예를 들어, 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다.
예시적인 Cas 돌연변이체는 국제 PCT 공개 제WO 2015/161276호 및 문헌[Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676]에 기재되어 있고, 이들은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
3. gRNA
본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 특정 표적 핵산 서열에 안내하는 가이드 RNA(gRNA)를 제공한다. gRNA는 핵산-표적화 분절 및 단백질-결합 분절을 포함한다. gRNA의 핵산-표적화 분절은 표적 핵산 서열 내의 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이와 같이, gRNA의 핵산-표적화 분절은 혼성화(즉, 염기 짝지움)를 통해서 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용하고, 핵산-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 gRNA가 결합할 표적 핵산 내의 위치를 결정한다. gRNA의 핵산-표적화 분절은 표적 핵산 서열 내의 임의의 목적하는 서열에 혼성화하도록 (예를 들어, 유전자 조작에 의해서) 변형될 수 있다.
가이드 RNA의 단백질-결합 분절은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드(예를 들어, Cas 단백질)과 상호작용하여 복합체를 형성한다. 가이드 RNA는 결합된 폴리펩타이드를 상기에 기재된 핵산-표적화 분절을 통해서 표적 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드 서열에 안내한다. 가이드 RNA의 단백질-결합 분절은 서로에 상보적이고, 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 2개의 스트레치를 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 2개의 RNA 분자 각각은, 2개의 RNA 분자의 상보적 뉴클레오타이드가 혼성화하여 단백질-결합 분절의 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하도록 서로와 상보적인 뉴클레오타이드의 가닥을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자(sgRNA)를 포함한다.
표적 유전자좌에 대한 gRNA의 특이성은 핵산-결합 분절의 서열에 의해서 매개되는데, 이것은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 상보적인 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상응하는 표적 핵산 서열은 대략 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 적어도 90% 상보적이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보적이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 100% 상보적이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 DNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A를 포함하는 내인성 유전자로부터의 DNA 표적 서열이다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조).
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 SOCS1-표적화 핵산-결합 분절(즉, SOCS1-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 3 또는 표 4에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 SOCS1 표적 DNA 서열은 표 26 및 표 27에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. SOCS1-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 26 및 표 27에 제시되어 있다.
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Figure pct00042
Figure pct00043
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 PTPN2-표적화 핵산-결합 분절(즉, PTPN2-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 PTPN2 표적 DNA 서열은 표 28 및 표 29에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. PTPN2-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 28 및 표 29에 제시되어 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A-표적화 핵산-결합 분절(즉, ZC3H12A-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 ZC3H12A 표적 DNA 서열은 표 30 및 표 31에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. ZC3H12A-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 30 및 표 31에 제시되어 있다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 CBLB-표적화 핵산-결합 분절(즉, CBLB-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 CBLB 표적 DNA 서열은 표 32 및 표 33에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. CBLB-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 32 및 표 33에 제시되어 있다.
Figure pct00060
Figure pct00061
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 RC3H1-표적화 핵산-결합 분절(즉, RC3H1-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 ZRC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 RC3H1 표적 DNA 서열은 표 34 및 표 35에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. RC3H1-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 34 및 표 35에 제시되어 있다.
Figure pct00062
Figure pct00063
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 NFKBIA-표적화 핵산-결합 분절(즉, NFKBIA-표적화 gRNA)을 포함하는 적어도 1종의 gRNA 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12)에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 예시적인 NFKBIA 표적 DNA 서열은 표 36 및 표 37에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자의 핵산-결합 분절은 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 어느 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. NFKBIA-표적화 gRNA의 핵산-결합 분절을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 표 36 및 표 37에 제시되어 있다.
Figure pct00064
Figure pct00065
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 SOCS1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 gRNA 분자는 PTPN2-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 SOCS1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 gRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 PTPN2-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 CBLB-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 CBLB-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 SOCS1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 CBLB-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 RC3H1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 RC3H1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 SOCS1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 CBLB-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 RC3H1-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 NFKBIA-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 PTPN2-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 PTPN2 유전자(서열번호 3) 또는 Ptpn2 유전자(서열번호 4) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 표 9 또는 표 10에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 PTPN2-표적화 gRNA 분자는 서열번호 201 내지 327 또는 201 내지 314 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 NFKBIA-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 ZC3H12A 유전자(서열번호 5) 또는 Zc3h12a 유전자(서열번호 6) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 표 11 또는 표 12에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 ZC3H12A-표적화 gRNA 분자는 서열번호 331 내지 797, 338 내지 797 또는 338 내지 789 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 SOCS1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 SOCS1 유전자(서열번호 1) 또는 Socs1 유전자(서열번호 2) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 표 4 또는 표 5에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 SOCS1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 23 내지 200, 56 내지 200 또는 56 내지 187 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 CBLB-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 CBLB 유전자(서열번호 7) 또는 Cblb 유전자(서열번호 8) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 표 17 또는 표 18에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 CBLB-표적화 gRNA 분자는 서열번호 798 내지 823 또는 798 내지 808 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 적어도 2종의 gRNA 분자를 포함하고, 여기서 적어도 1종의 gRNA 분자는 RC3H1-표적화 gRNA 분자이고, 적어도 1종의 siRNA 또는 shRNA 분자는 NFKBIA-표적화 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 RC3H1 유전자(서열번호 9) 또는 Rc3h1 유전자(서열번호 10) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 NFKBIA 유전자(서열번호 11) 또는 Nfkbia 유전자(서열번호 12) 내의 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 표 19 또는 표 20에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA 서열과 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 표 21 또는 표 22에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 DNA와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 RC3H1-표적화 gRNA 분자는 서열번호 824 내지 844 또는 824 내지 844 또는 824 내지 836 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화되고, 적어도 1종의 NFKBIA-표적화 gRNA 분자는 서열번호 845 내지 875 또는 845 내지 856 중 하나와 100% 동일한 DNA 서열에 의해서 암호화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 당업계에 공지된 알고리즘(예를 들어, Cas-OFF 파인더)을 사용하여 표적외 결합을 최소화하여 특정 표적 유전자좌 또는 표적 유전자에 고유한 표적 서열을 식별하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 뉴클레아제에 대해서 안정성을 도입하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이들 변형된 gRNA는 비-변형된 gRNA와 비교할 때 감소된 선천 면역을 도출할 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 5' 단부에서 또는 그 근처에서(예를 들어, 5' 단부의 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드) 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부는 진핵 생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체(예를 들어, G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체 또는 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체(anti reverse cap analog: ARCA))의 포함에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사된 gRNA는 5' 트라이포스페이트기를 제거하기 위해 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)로 처리함으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 이의 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부는 하나 이상의(예를 들어, 25 내지 200개의) 아데닌(A) 잔기의 첨가에 의해서 변형된다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 gRNA에 존재할 수 있지만, 또한 다른 유전자-조절 시스템, 예를 들어, mRNA, RNAi 또는 siRNA-기반 시스템에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
a. 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스터 골격 링키지 내의 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체;
b. 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체;
c. 포스페이트 모이어티의 "탈포스포(dephospho)" 링커로의 대량 대체;
d. 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체;
e. 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형;
f. 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티의 접합; 및
g. 당의 변형.
일부 실시형태에서, 상기에 열거된 변형을 조합하여 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트기 각각은 포스포로티오에이트기로 대체된다.
일부 실시형태에서, 소프트웨어 툴을 사용하여 사용자의 표적 서열 내의 gRNA의 선택을 최적화하여, 예를 들어, 게놈 전체의 총 표적외 활성을 최소화할 수 있다. 표적외 활성은 절단 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용하여 각각의 가능한 gRNA를 선택하는 경우, 소프트웨어 툴은 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 이하의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐서 모든 잠재적인 표적외 서열(상기 NAG 또는 NGG PAM)을 식별할 수 있다. 각각의 표적외 서열에서의 절단 효율은 예를 들어, 실험 유래된 가중식을 사용하여 예측될 수 있다. 이어서 각각의 가능한 gRNA를 이의 총 예측된 표적외 절단에 따라서 순위매길 수 있고; 상위 순위의 gRNA는 가장 큰 온-타깃 및 가장 적은 표적외 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화 시약 설계, 온-타깃 서베이어(Surveyor) 검정을 위한 프라이머 설계 및 고처리량 검출을 위한 프라이머 설계 및 차세대 서열결정을 통한 표적외 절단의 정량이 또한 툴에 포함될 수 있다.
III. 변형된 TIL의 생산 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 TIL의 개선된 생산 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함하되, 유전자-조절 시스템은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로부터 선택된 1종, 2종 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. (전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 공개 제WO 2019/178422호, 제WO 2019/178420호 및 제WO 2019/178421호 참조) 일부 실시형태에서, 1개, 2개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자는 SOCS1, PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1 및 NFKBIA로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 성분, 예를 들어, 핵산-, 단백질- 또는 핵산/단백질-기반 시스템은 다양한 전달 방법 및 제형을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 플라스미드)에 의해서 전달된다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 벡터는 각각 시스템의 성분을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 복수의 벡터가 사용될 수 있으며, 각각의 벡터는 시스템의 특정 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 또한 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 신호 펩타이드를 암호화하는 서열(예를 들어, 핵 국지화, 핵 국지화, 미토콘드리아 국지화)을 포함할 수 있다 예를 들어, 벡터는 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 핵 국지화 서열(예를 들어, SV40으로부터)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 시험관내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체외에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 백시나 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-연관 바이러스(예를 들어, 미국 특허 제7,078,387호; 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996]; WO 93/09239, 문헌[Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617)]의 스리바스타바(Srivastava); SV40; 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999] 참조)에 기반한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스, 예컨대, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수 증식 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 플라스미드이다. 다수의 적합한 플라스미드 발현 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 상업적으로 이용 가능하다. 하기 벡터가 예로서 제공된다; 진핵 생물 숙주 세포: pXT1, pSG5(스트라타젠사(Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVLSV40 (파마시아사(Pharmacia)). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 벡터가 숙주 세포와 상용성인 한 사용될 수 있다. 이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참조).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 프로모터와 같은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 전사 제어 요소는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고신 세포)에서 기능적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 다중 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참조).
적합한 진핵생물 프로모터(진핵세포에서 기능성인 프로모터)의 비제한적인 예는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV), 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(LTR) 및 마우스 메탈로티오네인-l을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 종결자를 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지향된 변형 폴리펩타이드에 융합되어 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 단백질 태그(예를 들어, 6xHis 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오타이드 및 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 유전자-조절 시스템의 성분을 세포 내로 도입하기 위해 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질주입, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 인산 칼슘 침전, 폴리에틸렌 이민(PEI)매개된 형질주입, DEAE-덱스트란 매개된 형질주입, 리포솜 매개된 형질주입, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 미세 주사, 나노입자-매개된 핵산 전달(예를 들어, 문헌[Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9] 참조), 미세 유체 전달 방법(예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO 2013/059343호) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전기천공을 통한 전달은 세포를 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합하고, 정의된 지속 시간 및 진폭의 하나 이상의 전기 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합되며, 여기서 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기 자극이 적용되고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달된다.
일부 실시형태에서, 전기천공을 사용하여 유전자-조절 시스템의 성분을 세포에 도입한다. 사전-REP 및 REP 프로토콜이 사용되는 일부 실시형태에서, 전기천공을 사용하여 사전-REP 단계 이후에 그러나 REP 단계 이전에 유전자-조절 시스템의 성분을 세포에 도입한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분 또는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 비바이러스 전달 비히클, 예를 들어, 트랜스포손, 나노입자(예를 들어, 지질 나노 입자), 리포솜, 엑소좀, 약독화된 박테리아 또는 바이러스 유사 입자로 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 비히클은 약독화 박테리아(예를 들어, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 특정 살모넬라 균주, 비피도박 테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형 대장균을 포함하는 병원체를 예방하기 위해 침습적이지만 약화되도록 자연적으로 또는 인공적으로 조작됨), 특이적 세포를 표적으로 하기 위한 영양 및 조직-특이적 성향을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경하기 위해 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 유전적으로 변형된 박테리오파지(예를 들어, 큰 패키징 능력, 낮은 면역원성을 갖고 포유동물 플라스미드 유지 서열을 함유하고, 표적화된 리간드를 포함하는 조작된 파지)이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 포유동물 바이러스-유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 생성될 수 있다(예를 들어, "빈" 입자의 정제에 이어 원하는 카고와 바이러스의 생체외 조립에 의해). 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비히클은 생물학적 리포솜이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포(예를 들어, 적혈구 고스트, 이것은 대상체로부터 유래된 구형 구조로 분해되는 적혈구이며, 여기서 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음)로부터 유래된 인지질계 입자, 세포 내 기원의 분비 엑소좀 또는 대상체 유래된 막-결합 나노소포(30 내지 100㎚)(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고 따라서 리간드를 표적화할 필요 없이 세포에 의해 흡수될 수 있음)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 TIL의 방법은 샘플로부터 면역 효과기 세포의 집단을 얻는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 조직 샘플, 유체 샘플, 세포 샘플, 단백질 샘플 또는 DNA 또는 RNA 샘플을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 피부, 모발(뿌리 포함), 골수, 뼈, 근육, 침샘, 식도, 위, 소장(예를 들어, 십이지장, 공장 또는 회장으로부터의 조직), 대장, 간, 쓸개, 췌장, 폐, 신장, 방광, 자궁, 난소, 질, 태반, 고환, 갑상선, 부신, 심장 조직, 흉선, 비장, 림프절, 척수, 뇌, 눈, 귀, 혀, 연골, 백색 지방 조직 또는 갈색 지방 조직을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 조직 유형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 암성, 전암성 또는 비암성 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유체 샘플은 협측 면봉, 혈액, 혈장, 구강 점막, 질 점막, 말초 혈액, 제대혈, 타액, 정액, 소변, 복수액, 흉막액, 척수액, 폐 세척액, 눈물, 땀, 정액, 정액 유체, 정액 혈장, 전립선 유체, 사정전 유체(pre-ejaculatory fluid)(쿠퍼액(Cowper's fluid)), 배설물, 뇌척수액, 림프액, 하나 이상의 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지, 하나 이상의 세포 집단을 포함하는 완충 용액 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 샘플의 잔여부로부터 특정 세포 유형, 예컨대, 면역 효과기 세포를 농축하거나 단리시키기 위해서 가공된다. 특정 실시형태에서, 샘플은 말초 혈액 샘플이며, 이어서 이것은 적혈구 및 혈소판을 분리하고 림프구를 단리시키기 위해 백혈구 형성술을 받는다. 일부 실시형태에서, 샘플은 면역 효과기 세포가 단리 및 농축될 수 있는 류코팩(leukopak)이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 종양에 존재하는 림프구를 단리(즉, 종양 침윤 림프구를 단리)시키기 위해서 추가로 가공되는 종양 샘플이다.
일부 실시형태에서, 단리된 면역 효과기 세포는 배양물에서 확장되어 면역 효과기 세포의 확장된 집단을 생산한다. 1종 이상의 활성화 또는 성장 인자가 확장 공정 동안 배양 시스템에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1종 이상의 사이토카인(예컨대, IL-2, 및/또는 IL-7)이 배양 시스템에 첨가되어 세포 증식 및 확장을 향상시키거나 촉진시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 활성화 항체, 예컨대, 항-CD3 항체가 배양 시스템에 첨가되어 세포 증식 및 확장을 향상시키거나 촉진시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 확장 과정 동안 피더 세포와 공배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 확장 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 샘플로부터 단리된 후 확장될 수 있고, 휴식을 취한 후 다시 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 한 세트의 확장 조건에서 확장된 후, 제2의 상이한 세트의 확장 조건에서 제2 확장 라운드가 이어질 수 있다. 이전의 면역 세포의 생체외 확장 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20180282694호 및 제20170152478호 및 미국 특허 제8,383,099호 및 제8,034,334호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
배양 및 확장 과정 동안 임의의 시점에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 면역 효과기 세포에 도입되어 변형된 TIL의 집단을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 직후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 확장 공정 전에, 확장 공정 중에 또는 확장 공정 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 또는 대상체로부터의 수거 직후에 그리고 임의의 확장 라운드 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드의 확장 후 그리고 제2 라운드의 확장 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 생산된 변형된 TIL은 즉시 사용될 수 있다. 대안적으로 세포는 액체 질소 온도에서 동결되고, 오랜 시간 기간 동안 저장될 수 있고, 해동되어 재사용될 수 있다. 이러한 경우, 세포는 일반적으로 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 50% 혈청, 40% 완충 배지, 또는 이러한 동결 온도에서 세포를 보존하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 방식으로 일부 다른 용액에서 냉동될 것이고, 냉동 배양된 세포를 해동시키기 위해 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이 해동된다.
일부 실시형태에서, 변형된 TIL은 다양한 배양 조건 하에서 시험관내에서 배양될 수 있다. 세포는 배양물에서 확장되고, 즉, 증식을 촉진시키는 조건 하에서 성장될 수 있다. 배양 배지는 예를 들어, 아가, 메틸셀룰로스 등을 함유하는 액체 또는 반고체일 수 있다. 세포 집단은 적절한 영양 배지, 예컨대, 소 태아 혈청(약 5 내지 10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올 및 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙타비딘이 보충된 이스코브 변형(Iscove's modified) DMEM 또는 RPMI 1640에 현탁될 수 있다. 배양물은 조절 T 세포가 응답성인 성장 인자를 함유할 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 성장 인자는 막관통 수용체의 특이적 효과를 통해서, 온전한 조직 내에서 또는 배양물에서 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 인자 및 비폴리펩타이드 인자를 포함한다.
A. CRISPR/Cas 시스템을 사용한 변형된 TIL의 생산
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법은 표적 DNA 서열을 gRNA 및 Cas 폴리펩타이드를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, gRNA 및 Cas 폴리펩타이드는 복합체를 형성하는데, 여기서 gRNA의 DNA-결합 도메인은 복합체를 표적 DNA 서열에 표적화하고, Cas 단백질(또는 효소적으로 불활성인 Cas 단백질에 융합된 이종 단백질)은 표적 DNA 서열을 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 및 Cas 단백질(또는 gRNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)을 세포에 도입한 후 세포 내로 형성된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 핵산이고, 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas 및 gRNA 성분은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질 및 gRNA 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함되고, 바이러스 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas9 및 gRNA 성분은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 바이러스 벡터에 포함되고 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제2 바이러스 벡터에 포함된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제1 바이러스 벡터는 제2 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제2 바이러스 벡터는 제1 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이러한 실시형태에서, 벡터의 통합은 Cas9 및 gRNA 성분의 지속적인 발현을 초래한다. 그러나, Cas9의 지속적인 발현은 표적외 돌연변이 증가 및 일부 세포 유형에서의 절단을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 mRNA 핵산 서열이 형질감염에 의해 세포 집단에 도입될 수 있다. 이러한 실시형태에서, Cas9의 발현은 시간에 따라 감소할 것이고, 표적외 돌연변이 또는 절단 부위의 수를 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 분자 및 Cas 단백질을 함께 혼합하고, 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킴으로써 무세포 시스템에서 형성된다. 이어서 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하고, 본 명세서에서 CRISPR-리보핵단백질(CRISPR-RNP)로 지칭되는 이러한 미리 형성된 복합체는 표적 DNA 서열을 변형시키기 위해 세포에 도입될 수 있다. 복합체 형성은 표적 세포에서 또한 일어날 수 있고, Cas 단백질 및 gRNA는 별개로 도입된다.
B. shRNA 시스템을 사용한 변형된 TIL의 생산
일부 실시형태에서, 표적 유전자의 mRNA 전사체에 상보적인 서열을 갖는 하나 이상의 shRNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입함으로써 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법이 개시된다. 면역 효과기 세포는 작은 유전자 카세트를 통해 세포핵에 특이적 DNA 서열을 도입함으로써 shRNA를 생성하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 둘 다는 shRNA-암호화 DNA를 면역 효과기 세포에 도입하는데 사용될 수 있다. 도입된 DNA는 세포 자신의 DNA의 일부가 되거나 핵에서 지속될 수 있으며, 세포 머시너리에 shRNA를 생산하도록 지시한다. shRNA는 RNAi-매개된 유전자 넉다운을 유도하도록 세포 내부의 다이서 또는 AGO2-매개 슬라이서 활성에 의해 처리될 수 있다.
C. siRNA 시스템을 사용한 변형된 TIL의 생산
일부 실시형태에서, 표적 유전자의 mRNA 전사체에 상보적인 서열을 갖는 하나 이상의 siRNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입함으로써 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법이 개시된다. 면역 효과기 세포는 작은 유전자 카세트를 통해 세포핵에 특이적 DNA 서열을 도입함으로써 siRNA를 생성하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스, 아데나-연관 바이러스, 아데노바이러스 및 렌티바이러스는 siRNA-암호화 DNA를 면역 효과기 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 도입된 DNA는 세포 자신의 DNA의 일부가 되거나 핵에서 지속될 수 있으며, 세포 머시너리에 siRNA를 생산하도록 지시한다. siRNA는 유전자 발현을 방해할 수 있다.
IV. 입양 세포 전달
입양 세포 전달(ACT)은 면역요법의 매우 효과적인 형태이며, 암 환자에게 항종양 활성을 갖는 면역 세포의 전달을 포함한다. ACT는 시험관내에서 항종양 활성이 있는 림프구를 식별하고, 이러한 세포를 시험관내에서 많은 수로 확장시키고, 암-보유 숙주에 주입하는 치료 접근법이다. 입양 전달에 사용되는 림프구는 절제된 종양의 기질(종양 침윤 림프구 또는 TIL)에서 유래할 수 있다. ACT에 대한 TIL은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. TIL은 이들이 혼합 림프구 종양 세포 배양물(MLTC)이 풍부하거나 자가유래 항원 제시 세포 및 종양 유래 펩타이드를 사용하여 클로닝된 항종양 T-세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 조작되는 경우에는 혈액에서 유래하거나 이로부터 기원할 수 있다. 림프구가 주입될 암-보유 숙주로부터 유래하는 ACT를 자가유래 ACT라고 지칭한다. 미국 공개 제2011/0052530호(본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함됨)은 주로 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 암 퇴행을 촉진하기 위해 입양 세포 요법을 수행하는 방법에 관한 것이며, 상기 문헌은 이들 방법에 대해 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, TIL은 본 명세서에 기재된 바와 같이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL 및/또는 세포독성 림프구는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
암 환자에게 항종양 활성을 갖는 면역 세포를 전달하기 전에, 환자에 대한 림프고갈 단계가 이용될 수 있다. 림프고갈은 부분적으로 또는 완전히 조절 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소를 제거한다. 일부 실시형태에서, 림프고갈이 이용된다. 다른 구체예에서, 림프고갈은 이용되지 않는다.
V. 항체 및 항체 복합체
A. 항체 복합체
고정된 항체와 달리, 가용성 항체 복합체는 T 세포에 더 부드러운 활성화 신호를 제공할 수 있다. 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 공개 제US 2007/0036783호는 T 세포 활성화 및 확장을 개시할 수 있는 CD28에 대한 제2 항체와 복합체를 형성하는 하나의 항-CD3 항체로 구성된 가용성 이중특이적 사량체 항체 복합체(TAC)의 용도를 기재한다.
본 개시내용은 TIL을 함유하는 샘플을 적어도 하나의 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는 조성물과 함께 배양하는 것을 포함하는 TIL을 활성화시키는 방법을 제공하며, 여기서 각각의 가용성 단일특이적 복합체는 TIL 상의 동일한 항원에 연결되고 특이적으로 결합하는 2개의 결합 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, TIL은 IL-2의 존재 하에 배양된다. 특정 실시형태에서, 2개의 결합 단백질은 동일한 결합 단백질이고, 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질은 항체 또는 이의 단편이다. 사용될 수 있는 항체 단편은 재조합 공급원으로부터 그리고/또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 Fab, Fab', F(ab)2, scFv 및 dsFv 단편을 포함한다. 항체 또는 단편은 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 및 인간을 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 키메라 항체 유도체, 즉, 비-인간 동물 가변 영역과 인간 불변 영역을 조합하는 항체 분자도 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 키메라 항체 분자는 예를 들어, 인간 불변 영역과 함께 마우스, 래트 또는 다른 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 포함할 수 있다. 통상적인 방법을 사용하여 키메라 항체를 제조할 수 있다. (예를 들어, Morrison 등; Takeda 등, Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호; Boss 등의 미국 특허 제4,816,397호; Tanaguchi 등의 유럽 특허 공개 제EP171496호; 유럽 특허 공개 제0173494호, 영국 특허 제2177096B호 참조). 인간화된 항체의 제조는 EP-B 10 239400에 기재되어 있다. 인간화된 항체는 또한 상업적으로 생산될 수 있다(스코트젠사(Scotgen Limited), 영국 미들섹스 트윅켄함 2 홀리 로드 소재). 키메라 항체는 상응하는 비-키메라 항체보다 인간 대상체에서 덜 면역원성일 것으로 예상된다. 인간화된 항체는 예를 들어, 국제 공개 제WO 00/61635호에 기재된 바와 같이 추가로 안정화될 수 있다. 이들 간행물 모두는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
TIL 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 상업적으로 입수 가능하거나 당업자에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 동일한 항원에 결합하는 2개의 항체 또는 이의 단편은 직접 연결된다. 항체의 직접 연결은 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP)를 사용하여 한 항체를 다른 항체에 화학적으로 커플링시킴으로써 제조될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 2개의 항체는 가용성 단일특이적 복합체에서 간접적으로 연결된다. "간접적으로 연결된"은 2개의 항체가 서로 직접 공유 연결되지 않고 면역학적 복합체와 같은 연결 모이어티를 통해 부착된다는 것을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 2개의 항체는 사량체 항체 복합체를 제조함으로써 간접적으로 연결된다. 사량체 항체 복합체는 동일한 항원에 결합하고 동일한 동물 종인 단클론성 항체를 제1 동물 종의 항체의 Fc-단편에 대해 지향되는 제2 동물 종의 단클론성 항체의 대략 동일 몰량과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 제1 항체 및 제2 항체는 또한 제1 동물 종의 항체의 Fc-단편에 대해 지향되는 제2 동물 종의 단클론성 항체의 F(ab')2 단편의 대략 동일 몰량과 반응할 수 있다. 사량체 항체 복합체 및 이를 제조하는 방법에 대한 설명은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Lansdorp의 미국 특허 제4,868,109호를 참조하기 바란다.
일 실시형태에서, 조성물은 각각 TIL 상의 상이한 항원에 결합하는 적어도 2개의 상이한 단일특이적 복합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 적어도 2개의 상이한 가용성 단일특이적 복합체를 포함하고, 적어도 2개의 상이한 가용성 단일특이적 복합체 각각은 CD3, CD28, CD2, CD7, CD11a, CD26, CD27, CD30L, CD40L, OX-40, ICES, GITR, CD137 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 항원에 결합한다.
특정 실시형태에서, 하나의 단일특이적 복합체는 CD3에 결합하고 두 번째 단일특이적 복합체는 CD28에 결합할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 TIL 상의 3개의 상이한 항원 중 하나에 각각 결합하는 적어도 3개의 상이한 가용성 단일특이적 복합체를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 2개의 단일특이적 복합체는 동일한 항원에 결합하지 않을 것이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 3개의 상이한 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는데, 하나는 CD3에 대해 특이적이고, 두 번째는 CD28에 대해 특이적이고, 세 번째는 CD2에 대해 특이적이다. 특정 실시형태에서, 가용성 단일특이적 복합체의 존재 하에서의 TIL의 활성화는 각각 TIL 상의 상이한 항원에 결합하는 2개의 상이한 결합 단백질 또는 항체를 포함하는 이중특이적 복합체를 사용한 TIL의 활성화보다 더 크다.
B. 항-CD3 및 항-CD28 항체
당업자에 의해 인식될 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 다수의 적합한 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28 항체가 존재한다. 항-인간 CD3 항체는 뮤린, 인간, 영장류, 래트 및 개 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 포유동물로부터의 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, OKT3 항-CD3 항체가 사용된다(미국 뉴저지주 라리탄 소재의 오쏘-맥네일사 또는 미국 캘리포니아주 어번 소재의 밀테니이 바이오테크사). 또한 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 항-인간 CD28 단클론성 항체 및 다클론성 항체를 포함하여 본 발명에서 사용되는 다수의 적합한 항-인간 CD28 항체가 존재한다.
CD3에 대한 항체는 많은 T 세포 증식 프로토콜의 중심 요소이다. 표면에 고정된 항-CD3은 T 세포 표면 상의 T 세포 수용체 복합체의 가교에 의해 활성화 및 증식 유도 신호를 전달한다. 항-CD3 및 항-CD28을 고정화하여 신호 및 공자극 신호를 동시에 전달함으로써 증식이 증가될 수 있다(문헌[Baroja et al (1989), Cellular Immunology, 120: 205-217]). 국제 공개 제WO09429436A1호에서, 고체 상 표면, 예컨대, 배양 접시 및 비드를 사용하여 항-CD3 및 항-CD28 항체를 고정화한다. 정기적으로, 비드에 대한 고정화는 직경 4.5㎛ 크기의 DynaBeads®M-450에서 수행된다. 이들 간행물 모두는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
VI. 사이토카인
본 명세서에 기재된 확장 방법은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 고용량의 사이토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-2"(또한 본 명세서에서 "IL2"로 지칭됨)는 인터류킨-2로 공지된 사이토카인 및 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 보존적 아미노산 치환을 갖는 형태, 당형태, 바이오시밀러 및 이들의 변이체를 비롯한 모든 형태의 IL-2를 포함한다. IL-2는 예를 들어, 문헌[Nelson,　J. Immunol.　2004, 172, 3983-88 및 Malek,　Annu. Rev. Immunol.　2008, 26, 453-79]에 기재되어 있고, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어 IL-2는 알데스류킨(PROLEUKIN, 일회용 바이알당 2200만 IU로 여러 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능)과 같은 IL-2의 인간 재조합 형태뿐만 아니라 셀제닉스사(CellGenix Inc.)(미국 뉴햄프셔주 포츠마우쓰 소재)(CELLGRO GMP) 또는 프로스펙-타니 테크노진사(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.)(미국 뉴저지주 이스트 브룬스위크 소재(카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해서 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 공급원으로부터의 다른 상업적 등가물을 포함한다. 알데스류킨(데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 약 15kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 글리코실화되지 않은 인간 재조합 형태이다. 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 넥타 쎄라퓨틱스사(Nektar Therapeutics)로부터 입수 가능한 페길화된 IL-2 전구약물 NKTR-214를 포함하는 IL-2의 페길화된 형태를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 페길화된 IL-2는 미국 특허 출원 공개 제2014/0328791 A1호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2012/065086 A1호에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 접합된 IL-2의 대안적인 형태는 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4,902,502호에 개시되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 IL-2의 제형은 미국 특허 제6,706,289호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 인간 IL2 유전자는 NCBI 유전자 ID 3558로 식별된다. 인간 IL2 유전자에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 NCBI 참조 서열: NG_016779.1이다. 인간 IL-2 폴리펩타이드의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 879로서 제공된다.
인터류킨-2(IL-2)는 면역계에서 사이토카인 신호전달 분자의 한 유형인 인터류킨이다. 그것은 면역을 담당하는 백혈 세포(백혈구, 종종 림프구)의 활성을 조절하는 15.5 내지 16kDa의 단백질이다. IL-2는 미생물 감염에 대한 신체의 자연적 반응의 일부이다. IL-2는 림프구에서 발현되는 IL-2 수용체에 결합하여 효과를 매개한다. IL-2의 주요 공급원은 활성화된 CD4+ T 세포 및 활성화된 CD8+ T 세포이다.
IL-2는 주로 T 세포에 대한 직접적인 효과를 통해 면역계의 주요 기능, 내성 및 면역에 필수적인 역할을 한다. T 세포가 성숙하는 흉선에서, 그것은 특정 미성숙 T 세포가 조절 T 세포로 분화하는 것을 촉진시킴으로써 자가면역 질환을 예방하는데, 이것은 그렇지 않았으면 신체에서 정상적인 건강한 세포를 공격하기 위해서 프라이밍되었을 다른 T 세포를 억제한다. IL-2는 활성화 유도 세포 사멸(AICD)을 향상시킨다. IL-2는 또한 초기 T 세포가 항원에 의해 자극된 경우 T 세포가 효과기 T 세포 및 기억 T 세포로 분화하는 것을 촉진하여, 신체가 감염과 싸우는 것을 돕는다. 다른 극성화 사이토카인과 함께, IL-2는 미경험 CD4+ T 세포가 Th1 및 Th2 림프구로 분화하는 것을 자극하는 반면, 그것은 Th17 및 여포성 Th 림프구로의 분화를 방해한다. 그것의 발현과 분비는 엄격하게 조절되며, 면역 반응을 높이고 약화시키는 일시적인 양성 및 음성 피드백 루프의 일부로 기능한다. 항원-선택된 T 세포 클론의 수 및 기능의 확장에 의존하는 T 세포 면역학적 기억의 발달에서의 이의 역할을 통해, 그것은 세포-매개된 면역을 지속시키는 역할을 한다.
VII. 약제학적 조성물, 투여량 및 투여 요법
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균 완충액 중의 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 당업계에 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포는 바람직하게는 대략 30 내지 60분 동안 지속되는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척추강내 및 림프내 투여를 포함한다.
임의의 적합한 용량의 TIL이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 1×109 내지 약 2×1011개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 2.3×1010　내지 약 13.7×1010개의 TIL이 투여되고, 특히 암이 흑색종인 경우 평균 대략 7.8×1010개의 TIL이 투여된다. 실시형태에서, 약 1.2×1010　내지 약 4.3×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 3×1010　내지 약 12×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 4×1010　내지 약 10×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 5×1010　내지 약 8×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 6×1010　내지 약 8×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 7×1010　내지 약 8×1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 2.3×1010　내지 약 13.7×1010이다. 일부 실시형태에서, 특히 암이 흑색종인 경우 치료적 유효 투여량은 약 7.8×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 1.2×1010　내지 약 4.3×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 3×1010　내지 약 12×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 4×1010　내지 약 10×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 5×1010　내지 약 8×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 6×1010　내지 약 8×1010개 TIL이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효 투여량은 약 7×1010　내지 약 8×1010개 TIL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013 및 9×1013개이다. 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 수는 1×106　내지 5×106개, 5×106　내지 1×107개, 1×107　내지 5×107개, 5×107　내지 1×108개, 1×108　내지 5×108개, 5×108　내지 1×109개, 1×109　내지 5×109개, 5×109　내지 1×1010개, 1×1010　내지 5×1010개, 5×1010　내지 1×1011개, 5×1011　내지 1×1012개, 1×1012　내지 5×1012개, 및 5×1012 내지 1×1013개 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 예를 들어, 약제학적 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL의 농도는 약제학적 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v 범위이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 제공된 TIL은 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중 및 주치의의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. 적절한 경우 임상적으로 확립된 TIL 투용량을 사용할 수도 있다. TIL의 투여량과 같은 본 명세서의 방법을 사용하여 투여되는 약제학적 조성물의 양은 치료될 인간 또는 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 활성 약제학적 성분의 배치 및 처방의의 재량에 좌우될 것이다.
일부 실시형태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 1달에 1회, 2주에 1회, 주 1회 또는 격주에 1회일 수 있다. TIL의 관리는 필요한 기간 동안 계속될 수 있다.
일부 실시형태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1011, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1011, 8×1012, 9×1011, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013 및 9×1013개 세포이다. 일부 실시형태에서, TIL의 유효 투여량은 1×106 내지 5×106, 5×106 내지 1×107, 1×107 내지 5×107, 5×107 내지 1×108, 1×108 내지 5×108, 5×108 내지 1×109, 1×109 내지 5×109, 5×109 내지 1×1010, 1×1010 내지 5×1010, 5×1010 내지 1×1011, 5×10" 내지 1×1012, 1×1012 내지 5×1012, 및 5×10"내지 1×1013개 세포 범위이다.
TIL의 유효량은 비강내 및 경피 경로, 동맥내 주사, 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 국소, 이식 또는 흡입을 포함하는 유사한 유용성을 갖는 작용제의 허용되는 투여 모드 중 임의의 것에 의해서 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, TIL은 정맥내로 투여된다.
VIII. 세포 계수치, 세포 생존력, 유세포 분석법
일부 실시형태에서, 세포 계수치 및/또는 생존력을 측정한다. 마커, 예컨대, 비제한적으로 CD3, CD4, CD8 및 CD56뿐만 아니라 본 명세서에 개시되거나 기재된 임의의 다른 것의 발현을 항체, 예를 들어, 비제한적으로 비디 바이오사이언시스사(미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 비디 바이오사이언시스사)로부터 상업적으로 입수 가능한 것과 함께 FACSCanto™ 유세포 분석계(BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석법에 의해서 측정할 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계산기(VWR, 미국 일리노이주 바타비아 소재)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있고, 생존력은 트립판 블루 염색을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일 실시형태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 5,000㎖ 내지 약 25,000㎖의 세포 배지, 약 5,000㎖ 내지 약 10,000㎖의 세포 배지, 또는 약 5,800㎖ 내지 약 8,700㎖의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 하나 이하의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어, AIM-V 세포 배지(L-글루타민, 50μM 스트렙토마이신 설페이트, 및 10μM 젠타마이신 설페이트) 세포 배양 배지(인비트로젠사(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)가 사용될 수 있다.
실시형태에서, TIL은 기체-투과성 용기에서 팽창된다. 기체-투과성 용기는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 공개 제2005/0106717 A1호에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장시키는 데 사용되어 왔다. 실시형태에서, TIL은 기체-투과성 백에서 팽창된다. 일 실시예에서, TIL은 Xuri 세포 확장 시스템 W25(지이 헬쓰케어사(GE Healthcare))와 같은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, TIL은 Xuri 세포 확장 시스템 W5(지이 헬쓰케어사)라고도 공지된 WAVE 생물반응기 시스템과 같은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 일 실시형태에서, 세포 확장 시스템은 약 100㎖, 약 200㎖, 약 300㎖, 약 400㎖, 약 500㎖, 약 600㎖, 약 700㎖, 약 800㎖, 약 900㎖, 약 1L, 약 2L, 약 3L, 약 4L, 약 5L, 약 6L, 약 7L, 약 8L, 약 9L 및 약 10L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 실시형태에서, TIL은 G-Rex 플라스크(윌슨 울프 매뉴팩처링사(Wilson Wolf Manufacturing)로부터 상업적으로 입수 가능함)에서 확장될 수 있다. 이러한 실시형태는 세포 집단이 약 5×105개 세포/㎠에서 10×106 내지 30×106개 세포/㎠까지 확장되는 것을 허용한다. 일 실시형태에서, 이러한 확장은 새로운 세포 배양 배지를 세포에 첨가(또한 세포 공급으로 지칭됨)하지 않고 수행된다. 실시형태에서, 이것은 배지가 G-Rex 플라스크에서 약 10cm 높이에 있는 한 공급되지 않는다. 실시형태에서, 이것은 공급 없이 1종 이상의 사이토카인을 첨가한 것이다. 실시형태에서, 사이토카인은 사이토카인과 배지를 혼합할 필요 없이 볼러스(bolus)로서 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, TIL을 확장시키는 데 사용되어 왔고, 미국 특허 출원 공개 제US 2014/0377739A1호, 국제 공개 제WO 2014/210036 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2013/0115617 A1호, 국제 공개 제WO 2013/188427 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2011/0136228 A1호, 미국 특허 제8,809,050 B2호, 국제 공개 제WO 2011/072088 A2호, 미국 특허 출원 공개 제2016/0208216 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2012/0244133 A1호, 국제 공개 제WO 2012/129201 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2013/0102075 A1호, 미국 특허 제8,956,860 B2호, 국제 공개 제WO 2013/173835 A1호, 미국 특허 출원 공개 제2015/0175966 A1호에 기재된 것을 포함한다. 이러한 공정은 또한 문헌[Jin et al.,　J. Immunotherapy,　2012, 35:283-292]에 기재되어 있고. 이들 간행물 모두는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
실시예
실시예 1: 종양 침윤 림프구(TIL)의 확장 방법
종양 침윤 림프구(TIL)를 원발성 인간 흑색종 전이의 단일 세포 현탁액으로부터 직접 확장시켰다. TIL은 기증자 1(D3239), 기증자 2(D3399) 및 기증자 3(D6755)의 3명의 상이한 기증자로부터 얻었다. 배양 제0일에, 단일 세포 현탁액으로부터 200,000 내지 800,000개의 살아있는 세포를 취하고, 6㎖ 부피의 TIL 배지(RPMI 1640 및 AIM V의 1:1 혼합물, 5% 인간 AB 혈청이 보충됨) 중에 24웰 Grex 플레이트(윌슨 울프사, 카탈로그 번호 80192M)의 웰에 시딩하고, 6,000U/㎖의 재조합 인간 IL-2(셀제닉스사(CellGenix), 카탈로그 번호 1020-1000)를 보충하였다. 조건당 시딩된 생존 세포는 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 3.4K 내지 52K개의 CD3+ T 세포를 함유하였다. 세포를 하기에 기재된 바와 같이 4가지 상이한 방법을 사용하여 활성화시키고 확장시켰다(도 2):
Figure pct00066
TIL 확장 방법 1("REP 유사") - 사전-REP가 없는 1단계 신속한 확장 프로토콜. 5명의 건강한 공여자로부터의 피더 세포(PBMC)에 방사선 조사(6,000rad)하고, 1:1:1:1:1 비율로 풀링시켰다. 10M의 방사선 조사된 PBMC를 각각의 웰에 첨가하고, 60ng/㎖의 최종 농도를 위해 360ng의 OKT3(바이오레전드사(Biolegend), 카탈로그 번호 317326)을 첨가하였다.
Figure pct00067
TIL 확장 방법 2("Dynabeads") - Dynabeads를 1.5 또는 0.5×106개 비드/웰로 첨가하였다. 표면에 접합된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 Dynabeads를 TIL에 첨가하였다.
Figure pct00068
TIL 확장 방법 3("Stemcell") - 스템셀로부터의 사량체 항체 복합체(TAC). 스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies)(카탈로그 번호 10970)로부터의 항-CD3/항-CD2/항-CD28 사량체 항체 복합체(TAC) 37.5㎕를 최종 농도 6.25㎕/㎖를 위해 TIL에 첨가하였다.
Figure pct00069
TIL 확장 방법 4("Transact") - 밀테니이 바이오테크사로부터의 나노매트릭스. 밀테니이 바이오테크사로부터의 인간 CD3 및 CD28에 대한 인간화된 재조합 효능제(MACS GMP T Cell Transact, 카탈로그 번호 130-019-011)에 공유 부착된 콜로이드성 중합체 나노매트릭스 324㎕를 최종 농도 54㎕/㎖를 위해 TIL에 첨가하였다.
상기에 요약된 4가지 TIL 확장 방법 모두에 대해, 하기에 제시된 각각의 방법에 대한 변형을 사용하여 이산 시간 간격으로 공통 프로토콜을 따랐다(도 2).
Figure pct00070
제2일: 36,000U의 재조합 인간 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.
Figure pct00071
제4일: 50% 배지를 교체/교환하였다. 방법 1의 경우, 각각의 웰로부터, 웰 바닥의 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 4㎖의 세포 상청액을 제거하고 폐기하였다 그 다음, 4㎖의 새로운 TIL 배지 및 35,000U의 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다. 방법 2의 경우, 세포를 수거하고, 자석을 넣어 Dynabeads를 제거한 다음 300xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 방법 3 및 4의 경우, 배양물을 수거하고, TIL을 300xg에서 5분 동안 원심분리시켰다. 세포 상청액을 흡인시키고, 각각의 세포 배양물을 6㎖의 TIL 배지 + 6,000U/㎖ IL-2에 재현탁시킨 다음, 24웰 G-rex 플레이트의 웰에 다시 시딩하였다.
Figure pct00072
제7일: IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 배지에 첨가하였다. 배양물이 5M개 초과의 세포에 도달하면(Grex 막 ㎠당 2.5M개 초과 반영), 그것을 6-웰 Grex 플레이트(윌슨 울프사)의 웰로 옮기고, 6000U/㎖의 IL-2가 보충된 TIL 배지로 최대 100㎖를 만들었다.
Figure pct00073
제9일: 50% 배지를 제4일에서와 같이 교체/교환하였다.
Figure pct00074
제12일: IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 배지에 첨가하였다. 배양물이 5M개 초과의 세포에 도달하면(Grex 막 ㎠당 2.5M개 초과 반영), 그것을 6-웰 Grex 플레이트(윌슨 울프사)의 웰로 옮기고, 6,000U/㎖의 IL-2가 보충된 TIL 배지로 최대 100㎖를 만들었다.
Figure pct00075
제14일: 배양액에서 10M개 세포를 취하고, 40㎖ TIL 배지 + 6,000U/㎖ IL-2와 함께 Grex-10 용기에 다시 시딩하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 제14일에 평균적으로, IL-2 단독에서 성장된 세포 배양물('대조군'으로 표시됨)은 약 27배 확장되었고, 방법 1에 의해서 성장된 세포(REP-유사)는 5063배 확장되었고, 방법 3에 의해서 성장된 세포('Stemcell')는 3755배 확장되었고, 방법 4에 의해서 성장된 세포('Transact')는 7924배 확장되었다.
Figure pct00076
제16일: 50% 배지를 제4일에서와 같이 교체/교환하였다.
Figure pct00077
제17일: IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 배지에 첨가하였다.
Figure pct00078
제21일: 세포 배양물을 수거하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 제21일까지 평균적으로, 방법 1에 의해서 성장된 세포(REP-유사)는 60166배 확장되었고, 방법 3에 의해서 성장된 세포('Stemcell')는 37596배 확장되었고, 방법 4에 의해서 성장된 세포('Transact')는 80373배 확장되었다.
실시예 2: TIL의 표현형 특징규명
TIL 확장 과정 동안 시간의 함수로서 TIL의 세포 조성을 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 4). 세포를 실시예 1에서와 같이 배양하고, 세포의 분취량을 항체로 염색하여 제0일, 제9일 및 제14일에 CD45 및 CD3e를 발현하는 세포를 검출하였다. 시간 경과에 따른 CD45+ CD3+ T 세포의 점진적 농축이 모든 공여자에 대해 관찰되었는데(도 5A), 이는 실시예 1에 기재된 방법 1, 3 및 4를 사용할 때 T 세포의 특이적 확장을 입증한다.
또한, 생산된 T 세포의 표현형을 평가하였다. 특히, 중앙 기억 T 세포 표현형(Tcm, 마커 표현형 CD45RO+ CCR7+ CD45RA-가짐)으로 정의된 세포의 비율을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 실시예 1에서와 같이 배양된 세포를 취하고, 제14일에 세포의 분취량을 CD45RO, CCR7 및 CD45RA를 검출하는 형광 표지된 항체로 염색하였다. 피더 세포를 사용하는 방법 1(REP-유사)과 비교하여, 방법 3(Stemcell) 및 방법 4(Transact)는 더 많은 비율의 Tcm을 생성하였다(도 5B).
중앙 기억 T 세포 표현형에 대한 마커인 CD45RO 및 CCR7 공발현에 대해 FACS에 의해서 TIL을 분석하였다(도 6). 공여자 3의 경우, 실시예 1(방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰을 사용하는 'Dynabeads'), 방법 3('Stemcell') 및 방법 도 4('Transact'))에 기재된 3개의 피더 세포-무함유 TIL 확장 방법 중 임의의 것을 사용하여 확장된 TIL은, 방법 1('REP')을 사용하여 확장된 TIL과 비교할 때, 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포에서 약 6% 내지 14%의 더 큰 농축을 나타내었으며, 여기서 중앙 기억 T 세포 표현형은 단지 약 1%를 구성하였다. 공여자 2의 경우, 실시예 1(방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰을 사용하는 'Dynabeads'), 방법 3('Stemcell') 및 방법 도 4('Transact'))에 기재된 3개의 피더 세포-무함유 TIL 확장 방법 중 임의의 것을 사용하여 확장된 TIL은, 방법 1('REP-유사')을 사용하여 확장된 TIL과 비교할 때, 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포에서 약 5% 내지 29%의 더 큰 농축을 나타내었으며, 여기서 중앙 기억 T 세포 표현형은 단지 약 3%를 구성하였다. 공여자 1의 경우, 실시예 1(방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰을 사용하는 'Dynabeads'), 방법 3('Stemcell') 및 방법 도 4('Transact'))에 기재된 3개의 피더 세포-무함유 TIL 확장 방법 중 임의의 것을 사용하여 확장된 TIL은, 방법 1('REP-유사' 피더 세포-기반)을 사용하여 확장된 TIL과 비교할 때, 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는 세포에서 약 7% 내지 19%의 더 큰 농축을 나타내었으며, 여기서 중앙 기억 T 세포 표현형은 단지 약 4%를 구성하였다. 3명의 공여자 모두로부터의 TIL을 사용하여 4가지 방법 모두에 의해 확장된 TIL에 대한 % 중앙 기억 T 세포 표현형 데이터를 요약하였는데, 이는 방법 4('Transact')가 3명의 공여자 중 2명에 대해 중앙 기억 T 세포 표현형이 유의하게 풍부한 TIL을 생산했음을 나타낸다(도 6).
(제0일의 세포 수에 비해) 제14일에 TIL의 배수 확장(도 7)을 IL-2 단독('대조군')의 첨가에 의해 확장된 TIL 실시예 1(방법 1('REP-유사'), 방법 2(1.5 또는 0.5×106개 비드/웰을 사용하는 'Dynabeads'), 방법 3('Stemcell') 및 방법 4('Transact'))에 기재된 4가지 방법 모두에 대해 평가하였다. 공여자 3 및 공여자 1의 경우, 방법 4는 방법 1(피더 세포-기반)에 비해 약 4 내지 5배 더 큰 확장을 초래한 반면, 공여자 2의 경우, 방법 1은 방법 4에 비해 약 20배 더 큰 확장을 초래하였다. 방법 3은 공여자 1에 대해 방법 1(피더 세포-기반)과 비교할 때 약 4.5배 더 큰 확장을 초래하였다(도 7). 데이터를 3명의 공여자 모두에 대해 조합하였는데, 이는 평균적으로 적어도 방법 3 및 방법 4에 의해 확장된 TIL이 방법 1(REP-유사)에 의해 확장된 TIL보다 더 높지는 않지만 적어도 이것만큼 높은 배수 확장을 나타내었다는 것을 나타낸다(도 8). 추가 확장이 가능한지 평가하기 위해 일부 세포를 제14일 이후에 배양하였다. 세포는 제14일과 제21일 사이에 계속 확장되었으며, 일부 경우에 이는 150,000보다 큰 총 배수 확장을 나타냈다(도 9).
종양은 이질적이며, 다양한 백분율의 T 세포를 함유하고; 강력한 T 세포 확장 방법은 높은 T 세포 밀도와 낮은 T 세포 밀도 모두에서 세포를 확장할 수 있어야 한다. T 세포의 낮은 시딩 밀도가 피더 세포의 부재 하에서 확장될 수 있는지 여부는 불분명하였다. 따라서, 제14일까지 TIL의 배수 확장에 대한 제0일의 T 세포의 시딩 밀도의 영향을 평가하였다. 배수 확장은 방법 1('REP-유사') 및 방법 3('Stemcell')에 의해 확장된 TIL의 경우 비교적 선형적으로 증가하였지만, 방법 4('Transact')에 의해서 확장된 TIL의 경우에는 약 2,000개 T 세포/㎠ 내지 약 9,000개 T 세포/㎠의 시딩 밀도에서 최대였다(도 10). 따라서, 방법 4는 저밀도에서 T 세포를 확장할 때 방법 1과 거의 동등하였고, 방법 3은 더 낮은 밀도에서 방법 1보다 더 양호하였다. 이것은 피더 세포가 1㎖ 배양 배지(6㎖ 부피)당 85 T 세포만큼 낮은 밀도로 T 세포를 확장하는 데 본질적으로 필요하지 않음을 입증한다.
공여자 3은 사전-REP/REP 방법을 사용한 TIL 확장을 위해서 이전에 샘플을 제공하였다. 공여자 3으로부터의 샘플은 REP 단계로 진행하기 위해 사전-REP 단계로부터 적절한 수의 TIL을 제공하지 못했다. 공여자 3으로부터의 샘플은 사전-REP를 사용하여 달성한 것보다 훨씬 더 높은 TIL의 배수 확장을 제고하였다. 이것은, 본 명세서에 기재된 방법이 사전-REP 동안 적절한 확장이 발생하는 상황을 구제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 피더-무함유 공정 세포의 기능성(TIL에 의한 사이토카인 생산)
피더 무세포 방법(TIL 확장 방법 3 및 4)을 사용하여 생성된 TIL에 의한 사이토카인 IL-2, IFNγ 및 TNFα의 생산을 평가하였다. TIL을 실시예 1에 기재된 바와 같이 해리된 조직 세포로부터 확장시켰다. 공정 제14일에, 200,000개의 확장된 (3명의 독립적인 공여자로부터의) TIL을 취하고, 6.6㎕의 사량체 항-CD3 시약(스템셀 테크놀로지즈사, 상용 시약)이 추가로 보충된 200㎕ 부피의 TIL 배지에서 18시간 동안 자극하였다. 그 다음, 세포 상청액을 수거하고, 상청액 중의 사이토카인 농도를 Quickplex S120(메조스케일 디스커버리사(Mesoscale Discovery))을 사용하여 이중 샘플을 사용하여 결정하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 3명의 상이한 공여자에 대해, 해리된 종양 세포로부터 직접 생성된 TIL은 재자극시 IFNγ, IL-2, TNFα 및 IL-6을 생산할 수 있다. 추가로, 피더 세포-무함유 방법(방법 3: 'Stemcell') 및 방법 4('Transact')를 사용하여 생성된 TIL은 방법 1(피더 세포를 사용한 'REP-유사')을 사용하여 생성된 TIL보다 최대 약 6배 더 많은 IFNγ, 약 4배 더 많은 IL-2, 약 10배 더 많은 TNFα 및 약 25배 더 많은 IL-6을 생성할 수 있다(도 11).
실시예 4: CRISPR-Cas9를 사용하여 TIL을 유전자 조작하는 방법
실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 확장된 TIL을 CRISPR-Cas9를 사용하여 유전자 조작하여 표적 유전자의 기능적 유전자 넉아웃을 생성하였다. 이러한 유전 공학은 실시예 1에 기재된 각각의 방법의 제13일에 수행되었으며, 0 내지 21일 범위의 다른 날에도 수행되었다. 간략하면, 제13일에 1.2x106개의 확장된 TIL을 300xg에서 5분 동안 원심분리시키고, 맥스사이트사 전기천공 완충액(하이클론사(HyClone) 카탈로그 번호 EPB1) 40㎕로 재현탁시켰다. 52p㏖의 Cas9 단백질(알데브론사(Aldevron), 카탈로그 번호 9212) 및 CD45 항원을 암호화하는 PTPRC 유전자(IDT, GAGTTTAAGCCACAAATACA, 서열번호 909)를 표적으로 하는 sgRNA 240p㏖을 함유하는 리보핵단백질(RNP) 마스터 믹스를 만들었다. 100㎕ Nuclease Free Duplex Buffer(IDT 카탈로그 번호 1072570)로 10n㏖ 동결건조된 sgRNA를 재현탁시켜 PTPRC sgRNA의 100μM 용액을 만들었다. 시약을 다음과 같이 첨가하였다:
Figure pct00079
RNP 마스터 믹스 전체 10㎕를 40㎕ 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 50㎕의 세포 현탁액을 OC100 X 2 가공 어셈블리(맥스사이트사, 카탈로그 번호 SOC-1X2)로 옮겼다. 세포를 "Optimization #9" 프로그램을 사용하여 MaxCyte ExPERT 전기천공기에서 전기천공하였다. 그 다음, 50㎕ TIL 배지를 웰에 첨가하고, 세포를 100㎕ TIL 배지를 함유하는 96웰 플레이트로 옮기고, 이어서 이것을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포를 계수하고, 이어서 500K의 살아있는 세포를 6,000U/㎖ IL-2가 보충된 6㎖ TIL 배지를 함유하는 24웰 Grex 플레이트에 시딩하였다.
하루 후(배양 제14일), 소모를 가정하여 IL-2를 6,000U/㎖로 첨가하였다. 배양 제17일에, 각각의 웰로부터의 3㎖의 세포 상청액을 제거하고, 버렸다(웰 바닥에 있는 세포를 방해하지 않도록 주의). 이것을 3㎖의 새로운 TIL 배지로 교체하고, IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다. 제18일에, 소모를 가정하여 IL-2를 6,000U/㎖로 첨가하였다. 제21일에, 세포를 수거하고, 계수하였다. 세포 펠릿을 동결시키고, 앰플리콘 시퀀싱에 의해서 편집을 결정하였다.
CD45의 세포 생존율 및 편집 백분율을 유전자 변형되지 않은 TIL에 대해서 편집된 TIL에 대해 평가하였다(도 12). 방법 1(피더 세포를 사용한 'REP-유사'), 방법 3('Stemcell') 및 방법 4('Transact'')를 사용하여 확장된 TIL에 대한 전기천공 후 8일에 분석을 수행하였다.
실시예 5: 가용성 활성화인자 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 사전-REP 실패 TIL을 확장시키는 방법
종양 침윤 림프구(TIL)를 원발성 인간 흑색종 전이의 단일 세포 현탁액으로부터 직접 확장시켰다. TIL은 기증자 3239, 기증자 6752 및 기증자 6755의 3명의 상이한 기증자로부터 얻었다. 공여자 6752 및 공여자 6755는 사전-REP에서 23일 동안 4×107개 세포까지 확장될 수 없는 사전-REP 실패로서 이전에 식별되었다. 배양 제0일에, 단일 세포 현탁액으로부터 400,000 내지 800,000개의 살아있는 세포를 취하고, 6㎖ 부피의 TIL 배지(RPMI 1640 및 AIM V의 1:1 혼합물, 5% 인간 AB 혈청이 보충됨) 중에 24웰 Grex 플레이트(윌슨 울프사, 카탈로그 번호 80192M)의 웰에 시딩하고, 6,000U/㎖의 재조합 인간 IL-2(페프로테크사(Peprotech), 카탈로그 번호 200-02)를 보충하였다. 조건당 시딩된 생존 세포는 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 22K 내지 52K개의 CD3+ T 세포를 함유하였다. 세포를 하기에 기재된 바와 같이 5가지 상이한 방법을 사용하여 활성화시키고 확장시켰다:
Figure pct00080
TIL 확장 방법 1("REP 유사") - 사전-REP가 없는 1단계 신속한 확장 프로토콜. 5명의 건강한 공여자로부터의 피더 세포(PBMC)에 방사선 조사(6,000rad)하고, 1:1:1:1:1 비율로 풀링시켰다. 1×107개의 방사선 조사된 PBMC를 각각의 웰에 첨가하고, 60ng/㎖의 최종 농도를 위해 360ng의 OKT3(바이오레전드사, 카탈로그 번호 317326)을 첨가하였다.
Figure pct00081
TIL 확장 방법 3("Stemcell") - 스템셀로부터의 사량체 항체 복합체(TAC). 스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies)(카탈로그 번호 10970)로부터의 항-CD3/항-CD2/항-CD28 사량체 항체 복합체(TAC) 37.5㎕를 최종 농도 6.25㎕/㎖를 위해 TIL에 첨가하였다.
Figure pct00082
TIL 확장 방법 4("Transact") - 밀테니이 바이오테크사로부터의 나노매트릭스. 밀테니이 바이오테크사로부터의 인간 CD3 및 CD28에 대한 인간화된 재조합 효능제(MACS GMP T Cell Transact, 카탈로그 번호 170-076-156)에 공유 부착된 콜로이드성 중합체 나노매트릭스 85㎕를 70:1의 최종 희석을 위해 TIL에 첨가하였다.
Figure pct00083
TIL 확장 방법 5("aAPC-OKT3") - OKT3을 발현하도록 조작된 K562 세포를 방사선 조사하였다(15,000rad). 1×106개의 방사선 조사된 aAPC-OKT3 세포를 5×105개 세포/㎠의 최종 세포 대 영역 비율을 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.　
Figure pct00084
TIL 확장 방법 6("aAPC-OKT3-CD86") - OKT3 및 CD86을 발현하도록 조작된 K562 세포를 방사선 조사하였다(15,000rad). 1×106개의 방사선 조사된 aAPC-OKT3 세포를 5×105개 세포/㎠의 최종 세포 대 영역 비율을 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.
상기에 요약된 5가지 TIL 확장 방법 모두에 대해, 하기에 제시된 각각의 방법에 대한 변형을 사용하여 이산 시간 간격으로 공통 프로토콜을 따랐다.
Figure pct00085
제2일: 36,000U의 재조합 인간 IL-2를 상응하는 웰에 대한 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.
Figure pct00086
제4일 제6일: 50% 배지를 교체/교환하였다. 각각의 웰로부터, 웰 바닥의 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 3㎖의 세포 상청액을 제거하고 폐기하였다 그 다음, 3㎖의 새로운 TIL 배지 및 36,000U의 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다. 제7일: 모든 조건에 대해서, 세포를 계수하였다. 전체 부피(6㎖)를 6000U/㎖의 IL-2를 함유한 100㎖ TIL 배지를 함유하는 6웰 Grex(윌슨 울프사)로 옮겼다.
Figure pct00087
제10일 또는 제11일: 제10일 및 제11일에 모든 aAPC 샘플 및 가용성 활성화제 샘플을 각각 실시예 4에 기재된 바와 같이 CRISPR-Cas9를 사용하여 조작하였다. 전기천공 후, 2×105개 세포를 6000U/㎖의 IL-2를 함유하는 6㎖ TIL 배지 중의 24웰 Grex(윌슨 울프사)로 옮겼다.
Figure pct00088
제13일: 36,000U의 재조합 인간 IL-2를 상응하는 웰에 대한 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.
Figure pct00089
제15일: 50% 배지를 교체/교환하였다. 각각의 웰로부터, 웰 바닥의 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 50㎖의 세포 상청액을 제거하고 폐기하였다 그 다음, 50㎖의 새로운 TIL 배지 및 36,000U의 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다.
Figure pct00090
제18일: 공여자 3339 샘플을 수거하였다. 공여자 6755 샘플을 수거하였고, 샘플 후각(O), SOCS1 (S) 및 SOCS1+PTPN2(S+P2)를 제15일에 기재된 바와 같이 50% 배지 교환된 IL-2 중의 aAPC-OKT3 또는 aAPC-OKT3-CD86로 활성화시켰다. 공여자 6752 샘플을 제15일에 기재된 바와 같이 50% 배지 교환시켰다.
Figure pct00091
제21일: 나머지 공여자 6755 샘플 및 공여자 6752 샘플을 제15일에 기재된 바와 같이 50% 배지 교환시켰다.
Figure pct00092
제23일: 나머지 공여자 6755 샘플 및 공여자 6752 샘플을 수거하였다.
실시예 6: CRISPR-Cas9를 사용하여 가용성 활성화인자 또는 aAPC를 사용하여 사전-REP 실패 TIL을 유전자 조작하는 방법
실시예 5에 기재된 프로토콜을 사용하여 확장된 TIL을 CRISPR-Cas9를 사용하여 유전자 조작하여 표적 유전자의 기능적 유전자 넉아웃을 생성하였다. 이러한 유전 공학은 실시예 5에 기재된 각각의 방법의 제10일에 수행되었으며, 0 내지 21일 범위의 다른 날에도 수행되었다. 간략하면, 제10일에 1.2×106개의 확장된 TIL을 300xg에서 5분 동안 원심분리시키고, 맥스사이트사 전기천공 완충액(하이클론사 카탈로그 번호 EPB1) 20㎕로 재현탁시켰다. 52p㏖의 Cas9 단백질(알데브론사, 카탈로그 번호 9212) 및 120p㏖의 각각의 개별 sgRNA를 함유하는 몇몇 리보뉴클레오단백질(RNP) 마스터 믹스를 만들었다 마스터 믹스 1은 OR1A2 유전자(O)에 대한 sgRNA(IDT, AGATGATGTCAACCAAGGAG 서열번호 910)를 함유하였다. 마스터 믹스 2는 SOCS1 유전자(S)에 대한 sgRNA(IDT, GACGCCTGCGGATTCTACTG 서열번호 61)를 함유하였다. 마스터 믹스 3은 SOCS1 유전자 및 PTPN2 유전자(S+P2)에 대한 sgRNA(IDT, GGAAACTTGGCCACTCTATG 서열번호 206)를 함유하였다. 100㎕ Nuclease Free Duplex Buffer(IDT 카탈로그 번호 1072570)로 10n㏖ 동결건조된 sgRNA를 재현탁시켜 OR1A2 sgRNA의 100μM 용액을 만들었다. 시약을 다음과 같이 첨가하였다:
Figure pct00093
RNP 마스터 믹스 전체 5㎕를 20㎕ 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 25㎕의 세포 현탁액을 OC25 X 3 가공 어셈블리(맥스사이트사, 카탈로그 번호 OC-25x3)로 옮겼다. 세포를 "Optimization #9" 프로그램을 사용하여 MaxCyte ExPERT 전기천공기에서 전기천공하였다. 그 다음, 25㎕ TIL을 96웰 플레이트로 옮기고, 각각의 챔버를 25㎕ TIL 배지로 2회 세척하고, 96웰 회수 플레이트로 옮기고, 그 다음 이것을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포를 계수하고, 이어서 2 ×105개의 살아있는 세포를 6,000U/㎖ IL-2가 보충된 6㎖ TIL 배지를 함유하는 24웰 Grex 플레이트에 시딩하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 제13일에 시작하는 추가 세포 조작을 수행하였다. 제18일 및 제23일에, 세포를 수거하고, 계수하였다. 세포 펠릿을 동결시키고, 앰플리콘 시퀀싱에 의해서 편집을 결정하였다(도 16).
실시예 7: 가용성 활성화인자 또는 aAPC를 사용한 사전-REP 실패 TIL의 표현형 특징규명
제18일 또는 제23일에 생산된 T 세포의 표현형을 분석하였다. 특히, 중앙 기억 T 세포 표현형(Tcm, 마커 표현형 CD45RO+ CCR7+ CD45RA-가짐)으로 정의된 세포의 비율을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 실시예 5에서와 같이 배양된 세포를 취하고, 제18일 또는 제23일에 세포의 분취량을 CD45RO, CCR7 및 CD45RA를 검출하는 형광 표지된 항체로 염색하였다. 사전-RNP(전기천공 전 세포)와 비교하여, 방법 3(Stemcell) 및 방법 4(Transact)는 제18일 및 제23일에 유사한 Tcm 세포 백분율을 생성하였다(도 15). CD8+ T 세포의 백분율은 제18일 또는 제23일의 모든 방법에 대해서 사전-RNP 세포와 비교할 때 일반적인 농축을 나타내었다(데이터 나타내지 않음).
전기천공 전(제0일의 세포 수에 비해서) 제10일 또는 제11일에 TIL의 배수 확장(도 13)을 실시예 5에 기재된 5가지 방법의 경우 IL-2의 첨가에 의해서 확장된 TIL에 대해서 평가하였다. 2명의 사전-REP 실패를 포함한 모든 공여자는 방법 1, 3, 4, 5 및 6에서 2600배보다 더 큰 확장을 나타내었다. SOCS1 편집된 TIL은, 제18일 또는 제23일에 모든 방법에 대해서 후각 및 SOCS1+PTPN2 편집된 TIL보다 더 큰 평균 배수 확장을 나타내었다(도 14). 방법 6은 제18일 또는 제23일에 방법 5와 비교할 때 SOCS1 편집된 TIL의 더 큰 평균 배수 확장을 나타내었다.
실시예 8: 가용성 활성화인자를 사용하여 종양 단편으로부터 TIL을 확장시키는 방법
1차 환자로부터의 동결된 흑색종 종양 단편으로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 직접 확장시켰다. 종양 단편을 2명의 공여자: 공여자 D4462 및 공여자 D7283으로부터 얻었다. 제0일에, 종양 단편을 해동시키고, TIL 배지(RPMI 1640와 AIM V의 1:1 혼합물, 5% 인간 AB 혈청이 보충됨)를 함유하는 10㎠ 접시에 놓았다. 단편을 칭량하고, 그 다음 (단편 수에 따라) 2개의 분취물로 균등하게 분할하고, 각각의 분취물을 24웰 Grex 플레이트(윌슨 울프사, 카탈로그 번호 80192M)의 웰에 넣었다. 6㎖의 TIL 배지를 6000U/㎖ IL-2(페프로테크사, 카탈로그 번호 200-02) 중의 GMP TransAct 시약(MACS GMP T Cell Transact, 카탈로그 번호 170-076-156)의 1:70 희석물을 함유하는 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 배양하였다.
확장 제2일에, 36,000U의 재조합 인간 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 각각의 웰에 첨가하였다.
확장 제6일에, D7283의 경우 50% 배지를 교체/교환하였다. 각각의 웰로부터, 웰 바닥의 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 3㎖의 세포 상청액을 제거하고 폐기하였다 그 다음, 3㎖의 새로운 TIL 배지 및 36,000U의 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다. D4462의 경우, 샘플을 실시예 9에 기재된 바와 같이 CRISPR-Cas9를 사용하여 조작하였다. 전기천공 후, 4×105개 세포를 6,000U/㎖의 IL-2를 함유하는 6㎖ TIL 배지 중의 24웰 Grex(윌슨 울프사)로 옮겼다.
확장 제9일에, 50% 배지를 교체/교환하였다. 각각의 웰로부터, 웰 바닥의 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 3㎖의 세포 상청액을 제거하고 폐기하였다 그 다음, 3㎖의 새로운 TIL 배지 및 36,000U의 IL-2를 소모를 가정하여 최종 농도 6,000U/㎖를 위해서 첨가하였다.
확장 제10일에, D4462의 경우, 3㎖의 배지를 24웰 Grex의 각각의 웰로부터 흡인시켰다. 나머지 3㎖를 6,000U/㎖ IL-2를 갖는 100㎖ TIL 배지를 함유하는 6웰 Grex(윌슨 울프사)에 첨가하였다. D7283의 경우, 샘플을 실시예 9에 기재된 바와 같이 CRISPR-Cas9를 사용하여 조작하였다. 전기천공 후, 4×105개 세포를 6,000U/㎖를 함유하는 6㎖ TIL 배지 중의 24웰 Grex(윌슨 울프사)로 옮겼다.
확장 제14일에, D4462 웰을 수거하였다. D7283의 경우, 3㎖의 배지를 24웰 Grex의 각각의 웰로부터 흡인시켰다. 나머지 3㎖를 6,000U/㎖ IL-2를 갖는 100㎖ TIL 배지를 함유하는 6웰 Grex(윌슨 울프사)에 첨가하였다.
확장 제17일에, D7283의 경우, 50㎖ TIL 배지를 제거하고, 50㎖의 새로운 TIL 배지로 교체하였다. 6,000U/㎖의 IL-2를 소모에 대해 첨가하였다.
확장 제20일에, D7283 웰을 수거하였다.
실시예 9: CRISPR-Cas9를 사용하여 가용성 활성화인자를 사용하여 단편 확장된 TIL을 유전자 조작하는 방법
실시예 8에 기재된 프로토콜을 사용하여 확장된 TIL을 CRISPR-Cas9를 사용하여 유전자 조작하여 표적 유전자의 기능적 유전자 넉아웃을 생성하였다. 이러한 유전자 조작을 제6일 또는 제10일에 수행하였다. 간략하면, 제6일 또는 제10일에 1.2×106개의 확장된 TIL을 300xg에서 5분 동안 원심분리시키고, MaxCyte 전기천공 완충액(하이클론사 카탈로그 번호 EPB1) 20㎕로 재현탁시켰다. 52p㏖의 Cas9 단백질(알데브론사, 카탈로그 번호 9212) 및 120p㏖의 각각의 개별 sgRNA를 함유하는 2개의 리보뉴클레오단백질(RNP) 마스터 믹스를 만들었다 마스터 믹스 1은 OR1A2 유전자(O)에 대한 sgRNA(IDT, AGATGATGTCAACCAAGGAG 서열번호 910)를 함유하였다. 마스터 믹스 2는 SOCS1 유전자(S)에 대한 sgRNA(IDT, GACGCCTGCGGATTCTACTG 서열번호 61)를 함유하였다. 100㎕ Nuclease Free Duplex Buffer(IDT 카탈로그 번호 1072570)로 10n㏖ 동결건조된 sgRNA를 재현탁시켜 OR1A2 sgRNA의 100μM 용액을 만들었다. 시약을 다음과 같이 첨가하였다:
Figure pct00094
RNP 마스터 믹스 전체 5㎕를 20㎕ 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 25㎕의 세포 현탁액을 OC25 X 3 가공 어셈블리(맥스사이트사, 카탈로그 번호 OC-25x3)로 옮겼다. 세포를 "Optimization #9" 프로그램을 사용하여 MaxCyte ExPERT 전기천공기에서 전기천공하였다. 그 다음, 25㎕ TIL을 96웰 플레이트로 옮기고, 각각의 챔버를 25㎕ TIL 배지로 2회 세척하고, 96웰 회수 플레이트로 옮기고, 그 다음 이것을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포를 계수하고, 이어서 4×105개의 살아있는 세포를 6,000U/㎖ IL-2가 보충된 6㎖ TIL 배지를 함유하는 24웰 Grex 플레이트에 시딩하였다. 추가 세포 조작을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제14일 및 제20일에, 세포를 수거하고, 계수하였다. 세포 펠릿을 동결시키고, NGS 시퀀싱에 의해서 편집을 결정하였다(도 19).
실시예 10: 가용성 활성화인자 또는 aAPC를 사용한 종양 단편 확장된 TIL의 표현형 특징규명
제14일 또는 제20일에 생산된 T 세포의 표현형을 분석하였다. 특히, 중앙 기억 T 세포 표현형(Tcm, 마커 표현형 CD45RO+ CCR7+ CD45RA-가짐) 또는 효과기 기억 T 세포 표현형(Teff, 마커 표현형 CD45RO+ CCR7- CD45RA- 가짐)으로 정의된 세포의 비율을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 실시예 8에서와 같이 배양된 세포를 취하고, 제14일 또는 제20일에 세포의 분취량을 CD45RO, CCR7 및 CD45RA를 검출하는 형광 표지된 항체로 염색하였다. 시험된 모든 조건은 Teff 기억 표현형을 우세하게 나타내었다. SOCS1 편집은 Tcm 표현형을 약간 증가시켰다(도 18).
제14일 또는 제20일에 가용성 활성화인자 종양 단편 확장 방법에 의해서 생성된 이론적인 TIL 세포 수를 IL-2의 첨가에 의해서 확장된 TIL에 대해서 평가하였다. 1그램 종양 단편 샘플을 가정하여 이론적인 세포 계수치를 계산하였다. 시험된 모든 조건은 20일 후 1×1010개 TIL을 초과하는 평균 확장을 나타내었다(도 17).
실시예 11: 동결된 종양 소화물 TIL 확장 및 동결된 종양 단편 TIL 확장
동결된 종양 소화물 TIL 확장을 TransACT 활성화인자를 사용하여 IL-2의 존재 하에서 동결된 종양 단편 TIL 확장과 비교되었다. 활성화 후, 후각(O) 및 SOCS1(S)에 대한 편집을 수행하고, 전기천공 없음(EP 없음) 대조군과 비교하였다.
본 평가에 사용된 물질은 다음과 같았다:
Figure pct00095
흑색종 소화물은 컨버산트 바이오사(Conversant Bio)로부터 제공받았고, 흑색종 종양 단편은 아이스페시먼(iSpecimen)으로부터 제공받았다. 공여자 정보 및 참조는 다음과 같았다:
Figure pct00096
두 TIL 확장의 경우, 일반적인 프로토콜은 하기에 제시된 바와 같이 별개의 시간 간격이 이어졌다:
확장 0일에, 세포를 공여자당 3개의 바이알을 사용하여 Discovery Life Sciences Protocol(Thawing Viable Cell Products-1.pdf)에 따라서 해동시켰다. 각각의 TIL 공여자 튜브를 1㎖ 완전 배지에 재현탁시키고, 총 3㎖로 합쳤다. 세포를 제조사의 권장 사항에 따라 Nexelcom Cellometer를 사용하여 계수하였다. FACS 염색을 위해 각각의 공여자로부터 200㎕를 제거하였다. WI-002 ACT FACS Differentiation Panel.docx 작업 지침을 따라 염색하였다. 최종 재현탁 단계에서, Accucheck 비드 용액 100㎕를 첨가하여(스톡 농도 200,000개 비드/㎖) 총 20,000개 비드를 얻었다. 획득된 비드에 기초하여 T 세포의 총 수를 계산하였다. 그 후, 2X 작업 용액(1:35)의 TransAct 시약을 1:70의 최종 농도로 준비하였다. 2×106개 세포 및 3㎖의 2X TransAct 시약을 24웰 Grex의 웰에 첨가하고, 나머지 TIL 배지를 세포에 첨가하여 총 부피가 6㎖가 되도록 하였다. IL-2를 6,000U/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이션시켰다.
여전히 확장 0일에, 종양 단편 바이알을 37℃ 수욕에서 해동시켰다. 그런 다음, 단편을 10㎖ TIL 배지를 함유하는 10㎠ 접시에 부었다. 10㎠ 접시를 측정 패드에 놓고, 단편을 촬영하였다. 단편을 2개의 동일한 분취물로 나누고, 각각의 분취물을 1㎖ TIL 배지를 함유하는 1.5㎖ Eppendorf 튜브에 넣었다. 단편을 200g에서 5분 동안 회전시켰다. 배지를 흡인시키고, 풀링된 단편을 칭량하였다. 3㎖의 2X TransACT 시약 및 3㎖의 TIL 배지를 24웰 Grex의 웰에 첨가하였다. 단편을 24웰 Grex의 웰에 첨가하였다. D4462의 경우, 8개의 단편을 IL-2와 조합하였다. D7283의 경우, 6개의 단편을 IL-2와 조합하였다. IL-2를 6,000 U/㎖로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이션시켰다.
확장 제2일에, IL-2를 모든 공여자에게 첨가하였다. IL-2를 6,000 U/㎖로 소모에 대해 첨가하였다.
확장 제4일에, 모든 공여자에 대한 배지를 교환하였다. 각각의 웰로부터의 3㎖의 배지를 폐기하고, 3㎖의 TIL 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, IL-2를 6,000U/㎖의 최종 농도로 첨가하였다.
확장 제6일에, D3239, D6138, D6755, 및 D4462를 FACS 염색하고 전기천공하였다. 후각 sgRNA의 농도를 100uL 이중 완충액으로 10nmol 바이알을 재현탁시킴으로써 100μM으로 조정하였다. SOCS1 가이드는 이미 필요한 농도에 도달하였다. 총 15개의 시험을 위한 RNP 용액을 다음 부피로 준비하였다:
Figure pct00097
MaxCyte 기기를 준비하고, "최적화 #9" OC25X3으로 설정하였다. 3㎖의 배지를 각각의 웰로부터 흡인시키고, 부피를 기록하고, 세포를 계수하였다. 100uL의 사전 전기천공된 세포를 96웰 v-바닥 플레이트로 옮기고, WI-002 ACT FACS Differentiation Panel.docx 프로토콜에 따라 염색하였다. 1.2×106개 세포를 각각의 조건에 대해 1.5㎖ Eppendorf 튜브에 첨가하였다. 튜브를 300g에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 제거하였다. 20uL의 MaxCyte 전기천공 완충액을 1.5㎖ Eppendorf 튜브에 첨가하였다. 5uL의 후각 또는 SOCS1 RNP 용액을 해당 Eppendorf 튜브에 첨가하였다. 최대 25㎕를 OC25X3 어셈블리로 옮기고, 세포를 전기천공하였다. 25㎕의 세포를 OC25X3으로부터의 웰로부터 96웰 회수 플레이트로 옮겼다. OC25X3 웰을 회수 플레이트 웰에서 최종 부피가 75㎕가 되도록 25㎕의 TIL 배지로 2회 헹구었다. 세포를 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 회수 플레이트로부터의 5㎕를 계수 웰 내의 45uL TIL 배지에 첨가하고(10배 희석); 50㎕의 AOPI를 첨가하고, 혼합하고; 계수 챔버로 옮기고; 세포를 계수함으로써 세포를 계수하였다. 그런 다음 4×105개 세포를 24웰 Grex의 웰로 옮겼다. 웰을 37℃에서 인큐베이션시켰다.
확장 제9일에, 모든 공여자에 대한 배지를 교환하였다. 3㎖의 배지를 각각의 웰로부터 폐기하였다. 각각의 웰에 3㎖의 TIL 배지를 첨가하고, IL-2를 최종 농도가 6,000U/㎖가 되도록 첨가하였다.
확장 제10일에, D7283을 FACS 염색하고, 전기천공하였다. 샘플을 제6일의 샘플에 대해 명시된 바와 같이 준비하였다. 5개의 샘플에 대해 충분히 준비하였다.
여전히 확장 제10일에, 샘플 D3239, D6138, D6755, 및 D4462를 6웰 Grex로 옮겼다. 100㎖의 TIL 배지를 6,000U/㎖의 IL-2를 포함하는 6웰 Grex에 첨가하였다. 각각의 공여자 웰로부터 배지 3㎖의 폐기하였다 세포를 계수하고 부피를 기록하였다. 3㎖의 공여자 세포를 사이토카인이 포함된 100㎖ TIL 배지를 포함하는 6웰 Grex의 해당 웰에 첨가하였다.
확장 제14일에, D3239, D6183, D6755, 및 D4462에 대해 테이크다운 검정을 수행하였다. 6웰 Grex의 각각의 웰에서 80㎖를 흡인시키고, 혼합하고 부피를 기록하였다. NGS 처리를 위해 하나의 바이알을 보관하였고; 100만 개의 세포를 1.5㎖ Eppendorf 튜브로 옮기고 튜브를 300g에서 5분 동안 회전시켰다. 상청액을 흡인시키고, 세포를 -80℃에서 저장하였다. FACS 분석을 수행하였다: 조건당 100만 개의 세포를 분화 및 다기능 패널을 위해 각각 v-바닥 또는 u-바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 작업 지침에 따라 세포를 처리하였다. 나머지 세포를 동결시켰다: 5천만 개의 세포 펠릿을 준비하였고; 세포를 5분 동안 300g에서 회전시키고; 상청액을 흡인시키고; cryostore를 첨가하고; 세포를 5천만개 세포/㎖로 재현탁시키고; 1㎖를 cryovial에 첨가하고, LN2로 옮기기 전에 밤새 -80℃의 coozie에 넣었다.
확장 제14일에, D7283을 6웰 Grex로 옮겼다. 100㎖의 TIL 배지를 6,000U/㎖의 IL-2를 포함하는 6웰 Grex에 첨가하였다. 각각의 공여자 웰에서 3㎖의 배지를 폐기하였다. 세포를 계수하고, 부피를 기록하였다. 3㎖의 공여자 세포를 사이토카인이 포함된 100㎖ TIL 배지를 포함하는 6웰 Grex의 해당 웰에 첨가하였다.
확장 제17일에, 샘플 D7283으로부터의 세포를 계수하고 50% 배지 교환을 수행하였다. 50㎖ 배지를 제거하고 세포를 계수하였다. 총 100㎖에 대해 50㎖의 TIL 배지를 첨가하였다. 소모를 가정하여 IL-2를 6,000 U/㎖로 첨가하였다.
확장 제20일에, D7283에 대해 테이크다운 검정을 수행하고 확장을 계속하였다. 6웰 Grex의 각각의 웰에서 70㎖를 흡인시키고, 혼합하고 부피를 기록하였다. 하기의 테이크다운 검정을 지원하기 위해 5백만 개의 세포를 제거하였다. NGS 처리를 위해서 하나의 바이알을 저장하였다: 100만 개의 세포를 1.5㎖ Eppendorf 튜브로 옮기고 300g에서 5분 동안 회전시키고; 상청액을 흡인시키고; -80℃에서 저장하였다. 편집 효율을 도 20에 도시한다. FACS 분석을 다음과 같이 수행하였다: 조건당 100만 개의 세포를 분화를 위해 v-바닥 96웰 플레이트로 옮기고; 작업 지시에 따라 세포를 처리하였다. 나머지 세포를 동결시켰고: 5천만 개의 세포 펠릿을 준비하고; 세포를 5분 동안 300g에서 회전시키고; 상청액을 흡인시키고; cryostore를 첨가하고, 세포를 5천만개 세포/㎖로 재현탁시켰고; 1㎖를 cryovial에 첨가하고 LN2로 옮기기 전에 밤새 -80℃의 coozie에 넣었다. 총 100㎖를 위해 70㎖ TIL 배지를 웰에 첨가하였다. IL-2를 소모를 가정하여 6,000U/㎖로 첨가하였다.
확장 제23일에, D7283에 대해 테이크다운 검정을 수행하고 샘플을 동결시켰다. 6웰 Grex의 각각의 웰에서 70㎖를 흡인시키고, 혼합하고, 부피를 기록하였다. 하기 테이크다운 검정을 지원하기 위해, 1백만 개의 세포를 제거하였다. FACS 분석을 수행하였다: 조건당 100만 개의 세포를 다기능 패널을 위해서 u-바닥 96웰 플레이트로 옮겼다. 작업 지침 "WI-008 ACT FACS Polyfunctional Panel CD25 APC.docx"에 따라 세포를 처리하였다. 나머지 세포를 동결시키고: 5천만 개의 세포 펠릿을 준비하고; 세포를 5분 동안 300g에서 회전시키고; 상청액을 흡인시키고; Cryostore를 첨가하고, 세포를 5천만개 세포/㎖로 재현탁시켰다. 1㎖를 cryovial에 첨가하고, LN2로 옮기기 전에 밤새 -80℃의 coozie에 넣었다. TIL은 상당히 생존 가능한 것으로 결정되었으며(도 21), 외삽된 TIL 수율은 공정 14일까지 단편 및 소화 샘플(도 22) 둘 다에 대해 1×109개 세포를 초과하였다.
SEQUENCE LISTING <110> KSQ Therapeutics, Inc. <120> METHODS FOR ACTIVATION AND EXPANSION OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES <130> 706299: KSQ022-WO01 <150> 62/940,035 <151> 2019-11-25 <150> 63/081,539 <151> 2020-09-22 <160> 910 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1766 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcagctgca cggctcctgg ccccggagca tgcgcgagag ccgccccgga gcgccccgga 60 gccccccgcc gtcccgcccg cggcgtcccg cgccccgccg ccaggtgagc cgggccctgg 120 gcgaggaggc gggagggagg agggagggga gtccagggca gccaggagtc gggcgagcct 180 cgggggctgc agaatggggt cgcggccgcg atgcccctga ccctcgccgg ccccacccag 240 gccgcccccc gcgcgcgggg ctcccgcagc acagcctttc tccggcccta gcccaaatcg 300 cccagaccag gcgcggatcc cagcctggcc agcaggcggc gggcgcgggg cggcgagccg 360 gggccggacg gctggagcca gaaccggctg ctctccacgc ccccctctcg gtgctgcccg 420 gaggccggac tccgcctcca ccgagccccc acccgccggg aagagctccg cggagtacag 480 agcccatttt ctagctgtgt ccactgaggc tgaacggatc cgcgcggact tggtgctccg 540 tgctcgcccc ctagggccgg gtccgccggg agcgccgccc tccggagttg tccggccggc 600 gcacacctgc ccggccccgc agcgccccag ctcacctctt tgtctctccc gcagcgcacc 660 cccggacgct atggcccacc cctccggctg gccccttctg taggatggta gcacacaacc 720 aggtggcagc cgacaatgca gtctccacag cagcagagcc ccgacggcgg ccagaacctt 780 cctcctcttc ctcctcctcg cccgcggccc ccgcgcgccc gcggccgtgc cccgcggtcc 840 cggccccggc ccccggcgac acgcacttcc gcacattccg ttcgcacgcc gattaccggc 900 gcatcacgcg cgccagcgcg ctcctggacg cctgcggatt ctactggggg cccctgagcg 960 tgcacggggc gcacgagcgg ctgcgcgccg agcccgtggg caccttcctg gtgcgcgaca 1020 gccgccagcg gaactgcttt ttcgccctta gcgtgaagat ggcctcggga cccacgagca 1080 tccgcgtgca ctttcaggcc ggccgctttc acctggatgg cagccgcgag agcttcgact 1140 gcctcttcga gctgctggag cactacgtgg cggcgccgcg ccgcatgctg ggggccccgc 1200 tgcgccagcg ccgcgtgcgg ccgctgcagg agctgtgccg ccagcgcatc gtggccaccg 1260 tgggccgcga gaacctggct cgcatccccc tcaaccccgt cctccgcgac tacctgagct 1320 ccttcccctt ccagatttga ccggcagcgc ccgccgtgca cgcagcatta actgggatgc 1380 cgtgttattt tgttattact tgcctggaac catgtgggta ccctccccgg cctgggttgg 1440 agggagcgga tgggtgtagg ggcgaggcgc ctcccgccct cggctggaga cgaggccgca 1500 gaccccttct cacctcttga gggggtcctc cccctcctgg tgctccctct gggtccccct 1560 ggttgttgta gcagcttaac tgtatctgga gccaggacct gaactcgcac ctcctacctc 1620 ttcatgttta catataccca gtatctttgc acaaaccagg ggttggggga gggtctctgg 1680 ctttattttt ctgctgtgca gaatcctatt ttatattttt taaagtcagt ttaggtaata 1740 aactttatta tgaaagtttt tttttt 1766 <210> 2 <211> 1729 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 agcagagaga actgcggccg tggcagcggc acggctccca gccccggagc atgcgcgaca 60 gccgccccgg agcccccagc cgcggctccc cgcgtcctgc cgccaggtga gccaaggcag 120 ctgcgaggga gcaggcggga ggggatggga ggtgatggga gcagagcccg gcaggactaa 180 cctcgcagac tgtatggcag ggtcgaggat gccacgcctc tggcgccccc ccacccccgc 240 cccggctccc ccaggaggcc cctcgctcga gcggggcgcc gtcagcccct cctctccggc 300 cctgagccct gatcctccgc ccgggttcca gtccccggcg tggccagtag gcggcagccg 360 cgaggcgact agccaccagc ggggacggcc gggagtcggg cccctctcca cgcccccttc 420 tccacgcgcg cggggaggca gggctccacc gccagtctgg aagggttccg catacaggaa 480 cggcctactt cgcagatgag cccaccgagg ctcaagctcc gggcggattc tgcgtgccgc 540 tctcgctcct tggggtctgt tggccggcct gtgccacccg gacgcccggc tcactgcctc 600 tgtctccccc atcagcgcag ccccggacgc tatggcccac ccctccagct ggcccctcga 660 gtaggatggt agcacgcaac caggtggcag ccgacaatgc gatctccccg gcagcagagc 720 cccgacggcg gtcagagccc tcctcgtcct cgtcttcgtc ctcgccagcg gcccccgtgc 780 gtccccggcc ctgcccggcg gtcccagccc cagcccctgg cgacactcac ttccgcacct 840 tccgctccca ctccgattac cggcgcatca cgcggaccag cgcgctcctg gacgcctgcg 900 gcttctattg gggacccctg agcgtgcacg gggcgcacga gcggctgcgt gccgagcccg 960 tgggcacctt cttggtgcgc gacagtcgcc aacggaactg cttcttcgcg ctcagcgtga 1020 agatggcttc gggccccacg agcatccgcg tgcacttcca ggccggccgc ttccacttgg 1080 acggcagccg cgagaccttc gactgccttt tcgagctgct ggagcactac gtggcggcgc 1140 cgcgccgcat gttgggggcc ccgctgcgcc agcgccgcgt gcggccgctg caggagctgt 1200 gtcgccagcg catcgtggcc gccgtgggtc gcgagaacct ggcgcgcatc cctcttaacc 1260 cggtactccg tgactacctg agttccttcc ccttccagat ctgaccggct gccgctgtgc 1320 cgcagcatta agtgggggcg ccttattatt tcttattatt aattattatt atttttctgg 1380 aaccacgtgg gagccctccc cgcctgggtc ggagggagtg gttgtggagg gtgagatgcc 1440 tcccacttct ggctggagac ctcatcccac ctctcagggg tgggggtgct cccctcctgg 1500 tgctccctcc gggtcccccc tggttgtagc agcttgtgtc tggggccagg acctgaattc 1560 cactcctacc tctccatgtt tacatattcc cagtatcttt gcacaaacca ggggtcgggg 1620 agggtctctg gcttcatttt tctgctgtgc agaatatcct attttatatt tttacagcca 1680 gtttaggtaa taaactttat tatgaaagtt tttttttaaa agaaacaaa 1729 <210> 3 <211> 98858 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gctcgggcgc cgagtctgcg cgctgacgtc cgacgctcca ggtactttcc ccacggccga 60 cagggcttgg cgtgggggcg gggcgcggcg cgcagcgcgc atgcgccgca gcgccagcgc 120 tctccccgga tcgtgcgggg cctgagcctc tccgccggcg caggctctgc tcgcgccagc 180 tcgctcccgc agccatgccc accaccatcg agcgggagtt cgaagagttg gatactcagc 240 gtcgctggca gccgctgtac ttggtgagtc gcggacccac gcggcagtcg ccgacctcct 300 ccgagacccg gactcgtgcc ctgtccgcag ggtccctccc gcctcccccg cctctcgcct 360 ctagcctctc gctcggggcg gaagtggcgg cgcggtccgc gtcaggggcg cgcctgcgct 420 gaccgctctc ttgctccttt tggtttaaaa aaaaaaaaaa aaaaagcata cttgagctga 480 gcagctcatg gttagcgcaa gcgcagttag ttctggaggg cggtgccaca gcggcttctt 540 ggggagcgcg tggatgcgcc accagcgttg cgcggcccgg gtctgggggt ccttgggaaa 600 gccgtggggg cgctcgggcg cgcgcccccg ggccgcagct tcgccgtagc tcccacgccg 660 ctgtgcttgg ttcttgctcg cggacagctc tttctctggc cgggtgtttt gtggccgggt 720 gggcagctgg cgtccccggg agcggtgagg gcgggggcgg gcgagccggg ccgcggcgtc 780 cgggtccagc tggcgcccgc gcaggacctg tgggagcagg ccgctctggg cgccgggccg 840 gccgccgcag ccctctgcga ggcgaagctc gctctcctgg cggagccgcg gtggttgggg 900 gtggctcgtg gcctctggcg agggcagcgc tctcgggacc ctccgtcttc attttccccc 960 gtggcccagc agcgcccagc gtgggttcgg cccccataga accttcccgg aacgaaagag 1020 gctttgcttg tgttcgtcca gtgatagcgt gtcattctct ttatagtttt ccttactgag 1080 gtatactttc cctacagtga aacgcagctt tcatgtgtgc tcccagacgg gtgtcacaaa 1140 tgaatcccct cttgcaagcc ccctcaaatc aaaatagcct ttccttgccc tgagaaagtg 1200 ccctcatccc ctccccgggg gcacggtgtt ccgatgccta 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acggggttga 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 cgctggcgcg cgtgatgcgc 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 gcgtgcacgg cgggcgctgc 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 tctggaaggg gaaggagctc 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 gtgcgtgtcg ccgggggccg 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 gggcacggcc gcgggcgcgc 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165 gttaatgctg cgtgcacggc 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 gcacggccgc gggcgcgcgg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 ggggcacggc cgcgggcgcg 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 gtgcggaagt gcgtgtcgcc 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 gaggaagagg aggaaggttc 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 ggctggcccc ttctgtagga 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 ggggccgggg 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aaatgtataa 20 <210> 304 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 304 tttgtttggt gaatgatcaa 20 <210> 305 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 305 tctacggaaa cgtattcgag 20 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 306 aaaggccacc acagctcaga 20 <210> 307 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 307 aggtgcagca gatgaaacag 20 <210> 308 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 308 ggctccttga accctgacca 20 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 309 aaggagttac atcttaacac 20 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 310 taaaatgcaa gatacaatgg 20 <210> 311 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 311 acaagtgtct accagagaga 20 <210> 312 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 312 gcgctctggc accttctctc 20 <210> 313 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 313 ctgctgcacc ttctgagctg 20 <210> 314 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 314 tcttccctac ctagaaacga 20 <210> 315 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 315 aatctggcca 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atggtgttta 20 <210> 328 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 328 ccuggacaac uuccuucgua agaaa 25 <210> 329 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 329 gugucccuau ggaaggaaa 19 <210> 330 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 330 caacuuccuu cguaagaaa 19 <210> 331 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 331 agcgaggcca cacagatatt a 21 <210> 332 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 332 gctatgatga ccgcttcatt g 21 <210> 333 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 333 tggtctgagc cgtacccatt a 21 <210> 334 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 334 ctgtgtacag aggcgagatt t 21 <210> 335 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 335 cctggacaac ttccttcgta agaaa 25 <210> 336 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 336 gtgtccctat ggaaggaaa 19 <210> 337 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 337 caacttcctt cgtaagaaa 19 <210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 338 aagctggcct acgagtctga 20 <210> 339 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 339 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ccacaggcag cttactcact 20 <210> 424 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 424 ttcctgtgct ccaaagtgag 20 <210> 425 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 425 accgcagcct tctctgcctt 20 <210> 426 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 426 gggagccaat gcccgagtcc 20 <210> 427 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 427 ttcccagcaa ggcttgccat 20 <210> 428 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 428 agccagatgt cggaactttg 20 <210> 429 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 429 tacacgggct acagtcccta 20 <210> 430 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 430 tctgtgttag accctcttgg 20 <210> 431 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 431 aagctgcccc cagcgctctg 20 <210> 432 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 432 ctttgggggg ttcgaggagg 20 <210> 433 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 433 gggccgatgg caagccttgc 20 <210> 434 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 434 cacaggcagc ttactcactg 20 <210> 435 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 435 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cgcctgcata ccagcaaggt cagaaccaac tctacaatga gcttaacctc 1080 ggtagaagag aggaatatga cgtcttggat aagaggagag gccgagaccc agaaatgggg 1140 ggaaagccgc gccgcaagaa tccacaagaa ggtctttaca atgaactgca gaaggacaaa 1200 atggccgaag cgtatagcga gataggaatg aaaggcgaac ggagacgggg caaggggcat 1260 gacgggcttt accaaggact tagcacagcg acgaaggata catacgacgc actgcatatg 1320 caagcgctgc caccgcgc 1338 <210> 907 <211> 496 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> unknown organism <400> 907 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys 20 25 30 Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly 35 40 45 Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Thr 50 55 60 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 65 70 75 80 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 85 90 95 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 100 105 110 Ala Pro Lys Leu 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Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 325 330 335 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 340 345 350 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 355 360 365 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu 370 375 380 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 385 390 395 400 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 420 425 430 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 435 440 445 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 450 455 460 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 465 470 475 480 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 495 <210> 908 <211> 1488 <212> DNA <213> artificial organism <220> <223> unknown organism <400> 908 atggactttc aggtgcagat cttctcattc ctccttatca gtgcgagtgt aattatgtca 60 agaggtgcta caggcggtgc taccacgacg acatgcgcag ggggtaccgg ttgtgcagga 120 gcgaccacga ctacctgcgc aggttgtacc acctgttgta ctggatgtac tgctgcgaca 180 tgtgcgggga cgggttgttg cacttgtgcg gacatacaaa tgacgcaaag cccgtccagc 240 ctgtctgcat cagttgggga tagagtgacg attacatgta gagcaagcca ggatgttaac 300 accgccgtag cgtggtacca acaaaaacca ggtaaagccc cgaagctgct catatactcc 360 gccagctttc tgtattcagg cgttcccagt cggttcagcg gcagcagatc agggacggat 420 tttacgctca ctatctcttc ccttcagcct gaagattttg ctacctatta ttgtcagcag 480 cattacacga ctcccccaac ttttggtcag gggactaaag ttgaaatcaa acgaacgggc 540 tccacctcag gtagcggtaa gccaggcagc ggagaagggt ctgaagtcca gttggttgag 600 agtggaggcg gtcttgtgca acccggtggc agcttgcgac tgagctgtgc agcgtctggc 660 ttcaacataa aagatactta tattcattgg gtaagacagg ctcctggtaa agggctggaa 720 tgggtggcac gaatatatcc gactaacggt tataccagat acgccgattc tgttaagggc 780 aggttcacaa taagcgccga cacaagtaag aatacggcgt atctgcagat gaattcactt 840 cgagctgaag acacagcggt atactactgc tccaggtggg gtggggatgg tttttatgcg 900 atggacgttt ggggtcaagg aacactggta actgttagtt ctaccacgac acctgctcct 960 aggcccccca caccggcacc tacgatcgct tcccagccgc ttagcctccg cccggaggca 1020 tgccggcccg ctgcgggggg agcggtacat actcgcgggt tggacttcgc ttgcgacatc 1080 tacatttggg caccactggc aggcacatgt ggcgttctgt tgcttagtct ggttattaca 1140 ctgtattgcc tgcgagttaa attctcccgc agcgctgatg cgcccgccta tcagcaaggt 1200 caaaaccagc tgtataatga gcttaatttg ggacgccgag aagagtatga cgtccttgac 1260 aagaggcgcg ggcgcgatcc ggagatgggt ggtaaaccgc gccggaaaaa cccccaggaa 1320 ggcctttaca atgagctcca aaaagataaa atggcagagg catactctga aataggaatg 1380 aagggcgaga gacgccgggg taagggacac gatggccttt atcaagggct tagtacagcc 1440 acgaaggata cgtatgacgc tctgcacatg caggctcttc ccccgaga 1488 <210> 909 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> unknown organism <400> 909 gagtttaagc cacaaataca 20 <210> 910 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 910 agatgatgtc aaccaaggag 20

Claims (105)

  1. 응집되지 않은(disaggregated) 종양 샘플에서 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)의 집단을 확장시키는 방법으로서, 상기 응집되지 않은 종양 샘플을 배지에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 TIL은 T 세포 수용체(TCR) 효능제, CD28 효능제 및 T 세포-자극 사이토카인과 접촉되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 T 세포-자극 사이토카인이 보충된, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 T 세포-자극 사이토카인의 최종 농도는 10U/㎖ 내지 7,000U/㎖인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포-자극 사이토카인은 IL-2인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 변경되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지의 성분은 유지되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지 중 30% 내지 99%는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 변경되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 샘플은 TIL 확장을 위해서 종양 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 기원하고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전(pre)-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 샘플은 TIL 확장을 위해서 종양 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 기원하고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집되지 않은 종양 샘플은 크기가 0.5 내지 4㎣인 종양 단편을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집되지 않은 종양 샘플은 소화된 종양 단편을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 피더 세포(feeder cell)를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 피더 세포는 말초 혈액 단핵 세포 또는 항원 제시 세포인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 피더 세포는 TCR 효능제, CD28 효능제 및/또는 4-1BB 리간드를 발현하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 TCR 효능제, 상기 CD28 효능제 및/또는 상기 4-1BB 리간드는 상기 피더 세포의 표면 상에서 발현되는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 피더 세포는 상기 TCR 효능제, 상기 CD28 효능제 및/또는 상기 4-1BB 리간드를 발현하도록 유전자 변형된, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 TCR 효능제는 CD3 효능제인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CD3 효능제는 OKT3인, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 CD28 효능제는 CD86인, 방법.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피더 세포는 항원 제시 세포인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 K562 세포를 포함하는, 방법.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피더 세포는 T 세포-자극 사이토카인을 발현하도록 유전자 변형된, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 T 세포-자극 사이토카인은 IL-2인, 방법.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 피더 세포를 포함하지 않는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD28 효능제는 상기 배지 중에 가용성인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 효능제는 CD3 효능제인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 효능제 및/또는 상기 CD28 효능제는 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스에 연결되어 있고, 각각의 나노매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚ 길이인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 TCR 효능제 및 상기 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착된, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 TCR 효능제 및 상기 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착된, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 나노매트릭스에 부착된, 방법.
  31. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD3 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제26항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD28 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD28 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제26항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 CD2 효능제를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CD2 효능제는 함께 연결된 2개의 항-CD2 항체를 포함하는 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는, 방법.
  35. 종양 침윤 림프구(TIL)의 집단을 확장시키는 방법으로서, 상기 TIL의 집단을 중합체 쇄의 매트릭스의 콜로이드성 현탁액을 포함하는 나노매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 매트릭스는 CD3 효능제 및 CD28 효능제에 부착되고, 상기 나노매트릭스는 활성화 신호를 상기 TIL의 집단에 제공하여, 상기 TIL의 집단을 활성화시켜 이것이 증식하도록 유도하고, 각각의 매트릭스는 이의 최대 치수가 1 내지 500㎚의 길이이고, 상기 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 나노매트릭스와 접촉된 상기 TIL의 집단은 종양 세포를 더 포함하는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 상기 TIL의 집단을 상기 나노매트릭스와 접촉시키기 전에 상기 TIL의 집단의 추가 확장 공정 없이 대상체로부터 단리되고, 나노매트릭스와 접촉되는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 효능제 및 상기 CD28 효능제는 동일한 중합체 쇄에 부착된, 방법.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 효능제 및 상기 CD28 효능제는 상이한 중합체 쇄에 부착된, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍로 나노매트릭스에 부착된, 방법.
  41. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노매트릭스는 상기 중합체 쇄의 매트릭스 내에 또는 그 사이에 내장된 자성, 상자성 또는 초상자성 나노결정을 더 포함하는, 방법.
  42. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 쇄의 매트릭스는 덱스트란의 중합체를 포함하는, 방법.
  43. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체 쇄는 콜로이드성 중합체 쇄인, 방법.
  44. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노매트릭스의 부피 대 TIL의 부피의 비율은 1:5 이상인, 방법.
  45. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스의 수 대 TIL의 비율은 1:500 이상인, 방법.
  46. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD28 효능제는 나노매트릭스 1㎎당 25㎍으로 상기 나노매트릭스에 부착된, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효능제는 재조합 효능제인, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효능제는 항체인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 방법.
  50. 제27항 내지 제30항 및 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 효능제는 OKT3 또는 UCHT1인, 방법.
  51. 제35항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만인, 방법.
  52. 제35항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만인, 방법.
  53. TIL의 집단을 확장시키는 방법으로서, 상기 TIL의 집단을 제1, 제2 및 제3 가용성 단일특이적 복합체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 각각의 가용성 단일특이적 복합체는 함께 연결된 2개의 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 각각의 가용성 단일특이적 복합체의 각각의 항체 또는 이의 단편은 상기 TIL의 집단 상의 동일한 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 제1 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD3 항체를 포함하고, 상기 제2 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD28 항체를 포함하고, 상기 제3 가용성 단일특이적 복합체는 항-CD2 항체를 포함하고, 상기 방법은 상기 TIL의 집단의 확장 동안 피더 세포의 사용을 포함하지 않는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 조성물과 접촉된 상기 TIL의 집단은 종양 세포를 더 포함하는, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 상기 TIL의 집단을 상기 조성물과 접촉시키기 전에 상기 TIL의 집단의 추가 확장 공정 없이 대상체로부터 단리되고, 조성물과 접촉되는, 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 단일특이적 복합체는 0.2 내지 25㎕/㎖의 농도로 존재하는, 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 단일특이적 복합체는 사량체 항체 복합체(tetrameric antibody complex: TAC)인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 각각의 TAC는 상기 제1 동물 종으로부터의 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 제2 종으로부터의 2개의 항체 분자에 의해서 결합된 제1 동물 종으로부터의 2개의 항체를 포함하는, 방법.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD3 항체는 OKT3 또는 UCHT1인, 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 수는 1000개 TIL 미만인, 방법.
  61. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확장될 TIL은 확장을 위해서 TIL의 샘플을 이전에 제출하였던 대상체로부터 유래되고, 상기 이전의 TIL 확장은 사전-REP 단계를 포함하고, 상기 사전-REP 단계로부터 단리된 TIL의 배수 확장은 5배 미만인, 방법.
  62. 제35항 내지 제40항 및 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단을 상기 사이토카인 IL-2와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 TIL은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일로 이루어진 군으로부터 선택된 시간 간격에 상기 사이토카인 IL-2와 접촉되는, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 사이토카인 IL-2의 최종 농도는 100U/㎖ 내지 7,000U/㎖인, 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL은 최대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25일 동안 확장되는, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL은 9 내지 25일, 9 내지 21일 또는 9 내지 14일 동안 확장되는, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL은 500 내지 500,000배 확장되는, 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 100 내지 100,000개 TIL의 TIL의 초기 집단으로부터 확장되는, 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장 제14일에 적어도 1,500배 확장되는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장 제14일에 최대 100,000배 확장되는, 방법.
  71. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장 제21일에 적어도 15,000배 확장되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장 제21일에 최대 500,000배 확장되는, 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 유전자 변형된, 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 유전자-조절 시스템에 의해서 변형된, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 RNA 간섭을 사용하여 변형된, 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN)를 사용하여 변형된, 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease)를 사용하여 변형된, 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 RNA-가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease)를 사용하여 변형된, 방법.
  79. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 Cas 효소 및 적어도 1종의 가이드 RNA를 사용하여 변형된, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 Cas 효소는 Cas9인, 방법.
  81. 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자에서 변형된, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자에서의 변형은 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이인, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자에서의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  84. 제74항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 후성적으로 변형된, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 후성적 변형은 히스톤 변형인, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 ANKRD11, BCL2L11, BCL3, BCOR, CALM2, CBLB, CHIC2, CTLA4, DHODH, E2F8, EGR2, FLI1, FOXP3, GATA3, GNAS, HAVCR2, IKZF1, IKZF2, IKZF3, LAG3, MAP4K, NFKBIA, NR4A3, NRP1, PBRM1, PCBP1, PDCD1, PELI1, PIK3CD, PPP2R2D, PTPN1, PTPN2, PTPN22, PTPN6, RBM39, RC3H1, SEMA7A, SERPINA3, SETD5, SH2B3, SH2D1A, SMAD2, SOCS1, TANK, TGFBR1, TGFBR2, TIGIT, TNFAIP3, TNIP1, TRAF6, UMPS, WDR6 및 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자에서 변형된, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자에서의 변형은 하나 이상의 핵산의 메틸화인, 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자에서의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 유전자에서 변형된, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 SOCS1 유전자의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  91. 제74항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 1종 초과의 유전자에서 변형된, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 상기 SOCS1 유전자 및 PTPN2, ZC3H12A, CBLB, RC3H1, NFKBIA로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가 유전자에서 변형된, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 ZC3H12A 유전자에서 변형된, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 SOCS1 및 ZC3H12A 유전자의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  95. 제91항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 CBLB 유전자에서 변형된, 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 SOCS1 및 CBLB 유전자의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  97. 제91항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 RC3H1 유전자에서 변형된, 방법.
  98. 제93항에 있어서, 상기 SOCS1 및 RC3H1 유전자의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  99. 제91항에 있어서, 상기 TIL의 집단의 구성원은 SOCS1 및 NFKBIA 유전자에서 변형된, 방법.
  100. 제93항에 있어서, 상기 SOCS1 및 NFKBIA 유전자의 변형은 상기 유전자의 발현 및/또는 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 기능의 감소 또는 저해를 초래하는, 방법.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되되, 상기 확장된 집단 중 적어도 10%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는, 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되되, 상기 확장된 집단 중 적어도 15%는 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는, 방법.
  103. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되되, 상기 확장된 집단 중 5 내지 50%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는, 방법.
  104. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TIL의 집단은 확장된 TIL의 집단을 생산하도록 확장되되, 상기 확장된 집단 중 10 내지 25%는 확장 제14일에 중앙 기억 T 세포 표현형을 갖는, 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 확장된 TIL의 집단을 포함하는, 조성물.
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