KR20220121815A - 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20220121815A
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hemoglobin
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발레리아 크라비츠
마나스 레이
마리아 시조바
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에벨로 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

헴-함유 폴리펩타이드(예컨대, 동물로부터 공급되지 않고/않거나 재조합적으로 생성될 수 있는 헴-함유 폴리펩타이드)와 함께 박테리아(예컨대, 헤모글로빈-의존성 박테리아)를 배양시키는 것과 관련된 조성물 및 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2019년 11월 27일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/941,076호; 및 2020년 4월 10일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/008,233호의 이익을 주장하며; 이들 기초출원 각각의 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
사람의 마이크로바이옴 조성은 이들의 건강 및 웰빙에 중요한 역할을 할 수 있다. 확실히, 개체의 마이크로바이옴의 붕괴는 염증성 장질환, 면역 장애, 2형 당뇨병, 신경퇴행성 장애, 심혈관 질환 및 암을 포함하는 수많은 질환과 관련되어 왔다. 따라서, 마이크로바이옴 조절은 이러한 질환에 대한 매력적인 치료 전략이다.
사람의 마이크로바이옴을 조절하는 한 가지 방법은, 예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물에서), 예를 들어, 치료용으로 제형화된 유익한 박테리아 중 1가지 이상의 균주를 이들에게 경구 투여하는 것에 의한다. 그러나, 이러한 요법의 개발은 많은 박테리아 균주, 특히, 성장을 위해 헤모글로빈(또는 이의 유도체, 예컨대, 헤민(hemin))을 필요로 하는 박테리아 균주의 대규모 생산이 어려운 것으로 입증되었다는 사실에 의해 방해되었다.
헤모글로빈은 폐에서 대기 중의 산소를 포획하고 이를 신체의 나머지로 운반하는 적혈구의 철-함유 금속 단백질이다. 철은 박테리아를 포함하는 거의 모든 형태의 생명체에 대해 필수 영양소이다. 헤모글로빈은 인간에서의 가장 흔한 철 저장소이며, 인간 마이크로바이옴을 구성하는 다수의 박테리아는 이들의 주요 철 공급원으로서 헤모글로빈 또는 이의 유도체를 사용한다. 종종, 이러한 헤모글로빈-의존성 박테리아는 최적의 시험관내 성장을 위해 헤모글로빈 또는 헤민의 존재를 필요로 한다. 그러나, 상업적 헤모글로빈 및 이의 유도체는 전형적으로 동물 공급원으로부터, 예컨대, 돼지 혈액으로부터 정제되며, 이는 특히 정제된 헤모글로빈을 비싸게 만든다. 게다가, GMP(우수 의약품 제조 관리 기준(good manufacturing practice))-등급 헤모글로빈은 쉽게 조달되지 않아서, 약제학적 목적을 위한 헤모글로빈-의존성 박테리아의 대규모 제조 및/또는 GMP 등급 제조를 특히 어렵게 만든다.
따라서, 예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈에 대한 필요 없이(예를 들어, 돼지 또는 소 헤모글로빈에 대한 필요 없이) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 성장시키기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 큰 요구가 있다.
특정 양상에서, 프레보텔라(Prevotella) 속, 예컨대, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola)의 박테리아를 포함하는 헤모글로빈-의존성 박테리아의 시험관내 배양을 용이하게 하기 위해 성장 배지에서 사용될 수 있는 헴(heme)-함유 폴리펩타이드(동물로부터 공급되지 않음)가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않음)는, 예를 들어, 치료용의 및/또는 박테리아 조성물(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물))에서의 헤모글로빈-의존성 박테리아의 대규모 제조 및/또는 GMP 등급 제조를 가능하게 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기(즉, 어류) 폴리펩타이드 또는 조류(avian)(즉, 새) 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물-유래 폴리펩타이드, 예컨대, 식물 폴리펩타이드(예를 들어, 곡물 또는 협과(legume) 폴리펩타이드), 박테리아 폴리펩타이드, 사이노박테리아 폴리펩타이드, 진균 폴리펩타이드, 조류(algae) 폴리펩타이드 또는 원생동물 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 협과 폴리펩타이드(예를 들어, 레그헤모글로빈(leghemoglobin), 예를 들어, 콩 레그헤모글로빈)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드는 이들의 천연 공급원으로부터 얻을 수 있다(예를 들어, 어류, 새, 식물, 박테리아, 사이노박테리아, 진균, 조류 또는 원생동물로부터 단리시킴). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 특히, 개시된 헴-함유 폴리펩타이드의 재조합 발현은, 특히, 헴-함유 폴리펩타이드의 비용 효과적인 채식주의자, 코셔(kosher) 및 GMP-등급 생산을 용이하게 하며; 이는 박테리아 세포 배양 적용분야에서 사용하기 위한 헴-함유 폴리펩타이드를 생산하는 매력적인 방법이다.
특정 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아의 배양을 용이하게 하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장은 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드의 세포 배양 배지에 포함을 통해 달성된다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈 또는 이의 변이체, 예컨대, 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 절단된 헤모글로빈이다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈(예를 들어, 콩 레그헤모글로빈(재조합적으로 발현된(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 천연 공급된)) 또는 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 미오글로빈이다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 그 외의 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 지원하기 위해 헤모글로빈을 대체할 수 있는 사이토크롬 또는 과산화효소이다. 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드 부류의 비제한적 예는 안드로글로빈, 사이토글로빈, 글로빈 E, 글로빈 X, 글로빈 Y, 헤모글로빈, 미오글로빈, 에리트로크루오린, 베타 헤모글로빈, 알파 헤모글로빈, 프로토글로빈, 사이아노글로빈, 사이토글로빈, 히스토글로빈, 뉴로글로빈, 클로로크루오린, 절단된 2/2 글로빈, 헤모글로빈 3(예를 들어, Glb3), 사이토크롬 및/또는 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 지원할 수 있는 과산화효소(예를 들어, 사이토크롬 c 과산화효소)를 포함한다.
따라서, 특정 양상에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 양상에서, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈)이 없는 조건(예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈을 포함하지 않는 조건)에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하는 데 유용한 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물(예를 들어, 성장 배지)뿐만 아니라 이러한 조성물의 제조 및/또는 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 물고기 헴-함유 폴리펩타이드는 어류, 어분 및/또는 어류 단백질 가수분해물로부터 정제된다. 일부 실시형태에서, 물고기 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 물고기 헴-함유 폴리펩타이드는 초어(Ctenopharyngodon), 멸치(Engraulis), 큰머리잉어(Hypophthalmichthys), 잉어(Cyprinus), 명태(Theragra), 오레오크로미스(Oreochromis), 대두어(Hypophthalmichthys nobilis), 가다랑어(Katsuwonus), 카틀라(Catla), 붕어(Carassius), 살모(Salmo), 청어(Clupea), 고등어(Scomber), 라베오(Labeo), 트리키우루스(Trichiurus), 가두스(Gadus), 사르디나(Sardina), 말로투스(Mallotus), 카노스(Chanos), 고등어, 연어(Oncorhynchus), 청어, 프로캄바루스(Procambarus), 브레보오르티아(Brevoortia), 밴댕이(Sardinella), 강청어(Mylopharyngodon), 가물치(Channa), 대구(Gadus), 꽁치(Cololabis), 전갱이(Trachurus), 농어(Larimichthys), 멜라노그람무스(Melanogrammus), 메기(Silurus), 스프라투스(Sprattus), 시리누스(Cirrhinus), 이크타룰루스(Ictalurus), 마이크로메시스티우스(Micromesistius), 테누알로사(Tenualosa), 갯장어(Muraenesox), 정어리(Sardinops), 세텐그라울리스(Cetengraulis), 폴라키우스, 점다랑어(Euthynnus), 줄무늬고등어(Rastrelliger), 드렁허리(Monopterus), 민대구(Merluccius), 줄무늬고등어, 미꾸리(Misgurnus), 쏘가리(Siniperca), 선농어(Lates), 정어리, 물천구(Harpadon), 삼치(Scomberomorus), 에트말로사(Ethmalosa), 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마(Opisthonema), 새가라지(Selar), 셀라로이데스(Selaroides) 또는 까나리(Ammodytes) 속 어류의 헴-함유 폴리펩타이드이다. 따라서, 재조합 또는 천연 물고기 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 양상에서, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈)이 없는 조건(예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈을 포함하지 않는 조건)에서 헤모글로빈-의존성 박테리아(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 및/또는 치료적 용도를 위한)을 배양시키는 데 유용한 재조합 또는 천연 물고기 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 성장 배지)뿐만 아니라 이러한 조성물의 제조 및/또는 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 조류 헴-함유 폴리펩타이드는 새, 새 모이(예를 들어, 닭 모이) 및/또는 새 단백질 가수분해물로부터 정제된다. 일부 실시형태에서, 조류 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 특정 실시형태에서, 조류 헴-함유 폴리펩타이드는 갈루스(Gallus), 멜레아그리스(Meleagris), 오리(Anas), 기러기(Anser), 흑기러기(Branta), 흰기러기(Chen), 아겔라스테스(Agelastes), 누미다(Numida), 구테라(Guttera), 아크릴리움(Acryllium) 또는 콜럼바(Columba) 속 새의 헴-함유 폴리펩타이드이다. 따라서, 재조합 또는 천연 조류 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 양상에서, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈)이 없는 조건(예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈을 포함하지 않는 조건)에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 데 유용한 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 및/또는 치료적 용도를 위한) 재조합 또는 천연 조류 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 성장 배지)뿐만 아니라 이러한 조성물의 제조 및/또는 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 유래가 아니다. 특정 실시형태에서, 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드는 식물(예를 들어, 곡물, 협과) 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류 및/또는 원생동물과 같은 공급원으로부터 정제된다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드는 아라비돕시스(Arabidopsis), 니코티아나(Nicotiana), 아시도보락스(Acidovorax), 아퀴펙스(Aquifex), 써모필러스(Thermophilus), 바실러스, 에스케리키아(Escherichia), 브레비바실러스(Brevibacillus), 코리네박테륨(Corynebacterium), 프리고리박테륨(Frigoribacterium), 메틸아시디필룸(Methylacidiphilum), 리조븀(Rhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 노스톡(Nostoc), 푸사리움(Fusarium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 트리코더마(Trichoderma), 마이셀리오프테라(Myceliopthera), 클루이베라(Kluyvera), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 오리자(Oryza), 마그나포르테(Magnaporthe), 제아(Zea), 호르데움(,Hordeum), 글리신(Glycine), 시세르(Cicer), 파세올루스(Phaseolus), 루피누스(Lupinus), 메디카고(Medicago), 브라시카(Brassica), 트리티쿰(Triticum), 고시피움(Gossypium), 지자니아(Zizania), 헬리안투스(Helianthus), 베타(Beta), 페니세툼(Pennisetum), 케노포디움(Chenopodium), 세사뭄(Sesamum), 리눔(Linum), 비냐(Vigna), 리시너스(Ricinus), 피섬(Pisum), 테트라하이메나(Tetrahymena) 또는 파라메시움(Paramecium) 속 유기체의 헴-함유 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 이들 유기체의 가공 형태(예를 들어, 대두분말, 완두콩가루, 녹두가루 등)로부터 정제될 수 있다. 따라서, 재조합 또는 천연 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 양상에서, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈)이 없는 조건(예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈을 포함하지 않는 조건)에서 헤모글로빈-의존성 박테리아(예를 들어, 박테리아 조성물을 배양시키는 데 유용한 (예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 및/또는 치료적 용도를 위한) 재조합 또는 천연 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 성장 배지)뿐만 아니라 이러한 조성물의 제조 및/또는 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에서 유용한 예시적인 헴-함유 폴리펩타이드 및 핵산 서열은, 예를 들어, 표 3에 열거된다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 114 중 임의의 아미노산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 또는 114 중 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 헴-함유 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드, 예컨대, 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 이종성 폴리펩타이드는 헴-함유 폴리펩타이드의 정제 및/또는 검출을 향상시키거나 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서(예를 들어, 숙주 세포에 존재하는 발현 벡터와 같은 외인성 핵산으로부터) 발현된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포(예를 들어, 포유류 세포주)이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스이다. 피키아 파스토리스가 코마가타엘라(Komagataella) 종, 예컨대, 코마가타엘라 파피(Komagataella phaffii), 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris) 또는 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris)로서 재분류되었지만, "피키아 파스토리스"라는 용어가 여전히 사용되고, 임의의 적절한 코마가타엘라 종을 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 피키아 파스토리스 숙주 세포를 이용하는 대표적인 재조합 헴-함유 폴리펩타이드는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제9,938,327호; 제10,273,492호; 제10,798,958호에, 특히 이들에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드 작제물에 대해 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다.
특정 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 데 사용하기 위한 성장 배지, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함한다. 특정 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아에 대한 성장 배지에서 통상적인 헤모글로빈 또는 이의 유도체의 대체물로서 사용하기 위한 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)가 본 명세서에 제공된다.
특정 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드) 및 헤모글로빈-의존성 박테리아를 성장 배지에 첨가하는 단계; 및 (b) 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
특정 양상에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드 및 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 성장 배지를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
특정 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지에서(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ, 적어도 0.005 g/ℓ, 적어도 0.01 g/ℓ, 적어도 0.02 g/ℓ, 적어도 0.03 g/ℓ, 적어도 0.04 g/ℓ, 적어도 0.05 g/ℓ, 적어도 0.06 g/ℓ, 적어도 0.07 g/ℓ, 적어도 0.08 g/ℓ, 적어도 0.09 g/ℓ, 적어도 0.1 g/ℓ, 적어도 0.2 g/ℓ, 적어도 0.3 g/ℓ, 적어도 0.4 g/ℓ, 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.75 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.25 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 1.75 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ, 적어도 2.25 g/ℓ, 적어도 2.5 g/ℓ, 적어도 2.75 g/ℓ, 적어도 3 g/ℓ, 적어도 3.25 g/ℓ, 적어도 3.5 g/ℓ, 적어도 3.75 g/ℓ, 적어도 4 g/ℓ 또는 적어도 4.25 g/ℓ의 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ 및 1 g/ℓ 이하의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.05 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤(Soy peptone) A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및/또는 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 5 g/ℓ 글루코스, 약 10 g/ℓ 효모 추출물 19512, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2 SC 19649, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885, 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨 K2HPO4, 및 약 0.5 g/ℓ L-시스테인-HCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5이다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 약 6.5이다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, 성장 배지는 헤모글로빈 또는 이의 유도체를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 동물 생성물을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 동물로부터 공급된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 최적의 성장을 위해(즉, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드의 부재 하에 최적의 성장을 위해) 헤모글로빈 또는 헤모글로빈 유도체의 존재를 필요로 하는 임의의 박테리아일 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스(Actinomyces), 알리스티페스(Alistipes), 아나에로부티리쿰(Anaerobutyricum), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 클로아시바실러스(Cloacibacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 콜린셀라(Collinsella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에이센베르기엘라(Eisenbergiella), 에리시펠로트리카세애(Erysipelotrichaceae), 유박테리움(Eubacterium)/모기박테리움(Mogibacterium), 파칼리박테리움(Faecalibacterium), 푸르니에렐라(Fournierella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 메가스파에라(Megasphaera), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 펩토니필러스(Peptoniphilus), 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 라리마이크로비움(Rarimicrobium), 셔틀워티아(Shuttleworthia), 투리시박터(Turicibacter) 또는 베일로넬라(Veillonella) 속의 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 프레보텔라 암니(Prevotella amnii), 프레보텔라 베르겐시스(Prevotella bergensis), 프레보텔라 비비아(Prevotella bivia), 프레보텔라 브레비스(Prevotella brevis), 프레보텔라 브리안티(Prevotella bryantii), 프레보텔라 부카에(Prevotella buccae), 프레보텔라 부칼리스(Prevotella buccalis), 프레보텔라 콥리(Prevotella copri), 프레보텔라 덴탈리스(Prevotella dentalis), 프레보텔라 덴티콜라(Prevotella denticola), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 마쿨로사(Prevotella maculosa), 프레보텔라 마르쉬(Prevotella marshii), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 미칸스(Prevotella micans), 프레보텔라 멀티포르미스(Prevotella multiformis), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 프레보텔라 오랄리스(Prevotella oralis), 프레보텔라 오리스(Prevotella oris), 프레보텔라 오울로럼(Prevotella oulorum), 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens), 프레보텔라 살리바에(Prevotella salivae), 프레보텔라 스테르코레아(Prevotella stercorea), 프레보텔라 탄네라에(Prevotella tannerae), 프레보텔라 티모넨시스(Prevotella timonensis), 프레보텔라 제주니(Prevotella jejuni), 프레보텔라 아우란티아카(Prevotella aurantiaca), 프레보텔라 바로니아에(Prevotella baroniae), 프레보텔라 콜로란스(Prevotella colorans), 프레보텔라 코르포리스(Prevotella corporis), 프레보텔라 덴타시니(Prevotella dentasini), 프레보텔라 에노에카(Prevotella enoeca), 프레보텔라 팔세니(Prevotella falsenii), 프레보텔라 푸스카(Prevotella fusca), 프레보텔라 헤파리놀리티카(Prevotella heparinolytica), 프레보텔라 로에스케이(Prevotella loescheii), 프레보텔라 멀티사카리보락스(Prevotella multisaccharivorax), 프레보텔라 난세이엔시스(Prevotella nanceiensis), 프레보텔라 오리자에(Prevotella oryzae), 프레보텔라 팔루디비벤스(Prevotella paludivivens), 프레보텔라 플레우리티디스(Prevotella pleuritidis), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 프레보텔라 사카로리티카(Prevotella saccharolytica), 프레보텔라 스코포스(Prevotella scopos), 프레보텔라 샤히(Prevotella shahii), 프레보텔라 주글레오포르만스(Prevotella zoogleoformans) 또는 프레보텔라 베로랄리스(Prevotella veroralis)이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 알리스티페스 인디스틴쿠스(Alistipes indistinctus), 알리스티페스 샤히(Alistipes shahii), 알리스티페스 티모넨시스(Alistipes timonensis), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 박테로이데스 아시디파시엔스(Bacteroides acidifaciens), 박테로이데스 셀룰로실리티쿠스(Bacteroides cellulosilyticus), 박테로이데스 에게르티(Bacteroides eggerthii), 박테로이데스 인테스티날리스(Bacteroides intestinalis), 박테로이데스 유니포르미스(Bacteroides uniformis), 콜린셀라 아에로파시엔스(Collinsella aerofaciens), 클로아시바실러스 에브리엔시스(Cloacibacillus evryensis), 클로스트리디움 카다베리스(Clostridium cadaveris), 클로스트리디움 코클레아툼(Clostridium cocleatum), 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes), 에이센베르기엘라 종(Eisenbergiella sp.), 에리시펠로트리카세애 종(Erysipelotrichaceae sp.), 유박테리움 할리(Eubacterium hallii)/아나에로부티리쿰 할리(Anaerobutyricum halii), 유박테리움 인퍼뭄(Eubacterium infirmum), 메가스파에라 마이크로누시포르미스(Megasphaera micronuciformis), 파라박테로이데스 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 펩토니필러스 라크리말리스(Peptoniphilus lacrimalis), 라리마이크로비움 호미니스(Rarimicrobium hominis), 셔틀워티아 사텔레스(Shuttleworthia satelles) 또는 투리시박터 산쿠이니스(Turicibacter sanguinis)이다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종의 균주이다. 일부 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 게놈 서열, 16S 서열, CRISPR 서열)에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)의 게놈 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)의 16S 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)이다.
일부 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(2019년 9월 10일자로 기탁된 ATCC 수탁번호 PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 게놈 서열, 16S 서열, CRISPR 서열)에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 게놈 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 16S 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)이다.
일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주이다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질 중 하나 이상이 실질적으로 없는 프레보텔라 균주로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ, 적어도 0.005 g/ℓ, 적어도 0.01 g/ℓ, 적어도 0.02 g/ℓ, 적어도 0.03 g/ℓ, 적어도 0.04 g/ℓ, 적어도 0.05 g/ℓ, 적어도 0.06 g/ℓ, 적어도 0.07 g/ℓ, 적어도 0.08 g/ℓ, 적어도 0.09 g/ℓ, 적어도 0.1 g/ℓ, 적어도 0.2 g/ℓ, 적어도 0.3 g/ℓ, 적어도 0.4 g/ℓ, 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.75 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.25 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 1.75 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ, 적어도 2.25 g/ℓ, 적어도 2.5 g/ℓ, 적어도 2.75 g/ℓ, 적어도 3 g/ℓ, 적어도 3.25 g/ℓ, 적어도 3.5 g/ℓ, 적어도 3.75 g/ℓ, 적어도 4 g/ℓ 또는 적어도 4.25 g/ℓ의 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ 및 1 g/ℓ 이하의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.05 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 1 g/ℓ의 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및/또는 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 5 g/ℓ 글루코스, 약 10 g/ℓ 효모 추출물 19512, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2 SC 19649, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885, 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨 K2HPO4 및 약 0.5 g/ℓ L-시스테인-HCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5이다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 약 6.5이다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, 성장 배지는 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈)(예를 들어, 동물로부터 공급된 헤모글로빈을 포함하지 않음) 또는 이의 유도체를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 동물 생성물을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 동물로부터 공급된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도는, 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390% 또는 적어도 400% 더 높다. 일부 실시형태에서, 성장 속도는 200% 내지 400%만큼 증가된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 특정 실시형태에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 헴-함유 폴리펩타이드 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 보다 높은 세포 밀도로 성장한다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390% 또는 적어도 400% 더 높은 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서의 세포 밀도로 성장한다. 일부 실시형태에서, 박테리아 세포 밀도는 200% 내지 400% 이상이다.
특정 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 본 명세서에 개시된 헤모글로빈-의존성 박테리아 및 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
도 1은 다양한 공급원의 헤모글로빈에 따른 균주 A(프레보텔라 히스티콜라 균주 B 50329(NRRL 수탁번호 B 50329))에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
도 2는 다양한 공급원 및 농도의 헤모글로빈에 따른 균주 A(프레보텔라 히스티콜라 균주 B 50329(NRRL 수탁번호 B 50329))에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
도 3은 다양한 공급원 및 농도의 헤모글로빈에 따른 파라박테로이데스 균주 A에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
도 4는 다양한 공급원 및 농도의 헤모글로빈에 따른 박테로이데스 균주 B에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
도 5는 다양한 공급원 및 농도의 헤모글로빈에 따른 알리스티페스 균주 C에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
특정 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아의 배양을 가능하게 하는 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 구체적으로는, 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 하기 위해 배양 배지에 첨가될 수 있는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드, 조류 폴리펩타이드, 또는 비-동물-유래 폴리펩타이드일 수 있다. 이들 헴-함유 폴리펩타이드는 다양한 유기체 또는 이의 가공 형태(예를 들어, 가루, 단백질 가수분해물, 으깬 가루 등)으로부터 직접 정제될 수 있다. 대안적으로, 이들 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 생성되고, 예를 들어, 숙주 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
따라서, 특정 양상에서, 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하는 데 유용한 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 성장 배지)뿐만 아니라 이러한 조성물의 제조 및/또는 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "혐기성 조건"은 정상 대기 조건에 비해서, 감소된 산소 수준을 갖는 조건이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 혐기성 조건은 산소 수준이 8% 이하의 산소 부분압(pO2)인 조건이다. 일부 예에서, 혐기성 조건은 pO2가 2% 이하인 조건이다. 일부 예에서, 혐기성 조건은 pO2가 0.5% 이하인 조건이다. 특정 실시형태에서, 혐기성 조건은 산소 이외의 기체, 예컨대, 질소 및/또는 이산화탄소(CO2)가 있는 바이오리액터 및/또는 배양 플라스크를 퍼징함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "박테리아 조성물"은 약제학적 조성물 및/또는 치료용 조성물을 포함한다. 박테리아 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 박테리아 조성물은 의약품, 의료 식품, 식료품 또는 식이보충제일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 헤모글로빈의 "유도체"는 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 할 수 있는 헤모글로빈으로부터 유래된 화합물을 포함한다. 헤모글로빈의 유도체의 예는 헤민 및 프로토포르피린을 포함한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 용어 "유전자"는 특정 게놈 서열뿐만 아니라 해당 게놈 서열에 의해 암호화된 cDNA 또는 mRNA에도 적용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "헴-함유 폴리펩타이드"는 헴 모이어티에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
2개의 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 "동일성"은, 예를 들어, 문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]에서와 같은 디폴트 파라미터를 사용하여, "FASTA" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 동일성 백분율로서 결정될 수 있다(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(문헌[Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)]; 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994], 및 문헌[Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073]을 포함한다). 예를 들어, 국립 생명공학 정보 센터 데이터베이스의 BLAST 기능을 사용하여 정체를 확인할 수 있다. 다른 상업적으로 또는 공개적으로 이용가능한 프로그램에는, DNAStar "MegAlign" 프로그램(위스콘신주 메디슨에 소재) 및 위스콘신 대학교 Genetics Computer Group(UWG)의 "Gap" 프로그램(위스콘신주 메디슨에 소재)이 포함된다.
"마이크로바이옴"은 광범위하게 대상체 또는 환자의 신체 부위 상에 또는 그 안에 존재하는 미생물을 지칭한다. 마이크로바이옴의 미생물에는 박테리아, 바이러스, 진핵 미생물 및/또는 바이러스가 포함될 수 있다. 마이크로바이옴의 개별 미생물은 대사 활성, 휴면성, 잠복성일 수 있거나, 포자로서 존재할 수 있거나, 플랑크톤으로 또는 바이오 필름에 존재할 수 있거나, 지속 가능하거나 일시적인 방식으로 마이크로바이옴에 존재할 수 있다. 마이크로바이옴은 공생 또는 건강 상태 마이크로바이옴 또는 질환 상태 마이크로바이옴일 수 있다. 마이크로바이옴은 대상체 또는 환자에 고유할 수 있거나, 또는 건강 상태(예를 들어, 전암성 또는 암성 상태) 또는 치료 조건(예를 들어, 항생제 치료, 상이한 미생물에 대한 노출)의 변화로 인해 마이크로바이옴의 성분이 조절, 도입, 또는 고갈될 수 있다. 일부 양상에서, 마이크로바이옴은 점막 표면에서 발생한다. 일부 양상에서, 마이크로바이옴은 장내 마이크로바이옴이다. 일부 양상에서, 마이크로바이옴은 종양 마이크로바이옴이다.
"비-인간-유래 폴리펩타이드"는 동물 공급원으로부터 정제되지 않은 폴리펩타이드를 지칭한다. 비-동물-유래 폴리펩타이드는 비-동물 공급원으로부터 정제된 폴리펩타이드와 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드를 둘 다 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "비-동물-유래 폴리펩타이드"는 동물 폴리펩타이드를 암호화하는, 예를 들어, 동물 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대응하는 서열로부터 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드를 포함한다.
"균주"는 동일한 박테리아 종의 밀접하게 관련된 구성원과 구별될 수 있도록 유전적 특징을 갖는 박테리아 종의 구성원을 지칭한다. 유전자 서명은 적어도 하나의 유전자의 전부 또는 일부의 부재, 적어도 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 종결자, 리보스위치, 리보솜 결합 부위)의 전부 또는 일부의 부재, 적어도 하나의 천연 플라스미드의 부재("경화(curing)"), 적어도 하나의 재조합 유전자의 존재, 적어도 하나의 돌연변이 유전자의 존재, 적어도 하나의 외래 유전자(다른 종으로부터 유래된 유전자)의 존재, 적어도 하나의 돌연변이 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 종결자, 리보스위치, 리보솜 결합 부위), 적어도 하나의 비-천연 플라스미드의 존재, 적어도 하나의 항생제 내성 카세트의 존재 또는 이들의 조합일 수 있다. 상이한 균주 사이의 유전자 서명은 임의로 PCR 증폭에 이어서 관심있는 게놈 영역(들) 또는 전체 게놈의 DNA 서열분석에 의해 확인될 수 있다. (동일 종의 또 다른 균주와 비교하여)한 균주가 항생제 내성을 얻거나 잃었거나 생합성 능력을 얻거나 잃은 경우(예컨대, 영양요구성 균주), 균주는 항생제 또는 영양소/대사산물을 각각 사용한 선택 또는 역선택에 의해 구별될 수 있다.
헤모글로빈-의존성 박테리아
일부 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 헤모글로빈-의존성 박테리아는(예를 들어, 대상체, 예를 들어, 인간에서) 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 것 및/또는 치료 용도를 위한 것일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "헤모글로빈 의존성 박테리아"는, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 동물 헤모글로빈, 예를 들어, 돼지 헤모글로빈), 헤모글로빈 유도체 또는 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 함유하는 동일한 성장 배지에 비해서, 통상적인 헤모글로빈(예를 들어, 돼지 헤모글로빈), 헤모글로빈 유도체 또는 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드가 없는 성장 배지에서 배양시킬 때 성장 속도가 느려지고/지거나 최대 세포 밀도가 감소되는 박테리아를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 멜라노게니카(Prevotella melanogenica), 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스 종의 박테리아이다.
일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 알리스티페스 인디스틴쿠스, 알리스티페스 샤히, 알리스티페스 티모넨시스, 바실러스 코아굴란스, 박테로이데스 아시디파시엔스, 박테로이데스 셀룰로실리티쿠스, 박테로이데스 에게르티, 박테로이데스 인테스티날리스, 박테로이데스 유니포르미스, 콜린셀라 아에로파시엔스, 클로아시바실러스 에브리엔시스, 클로스트리디움 카다베리스, 클로스트리디움 코클레아툼, 큐티박테리움 아크네스, 에이센베르기엘라 종, 에리시펠로트리카세애 종, 유박테리움 할리/아나에로부티리쿰 할리, 유박테리움 인퍼뭄, 메가스파에라 마이크로누시포르미스, 파라박테로이데스 디스타소니스, 펩토니필러스 라크리말리스, 라리마이크로비움 호미니스, 셔틀워티아 사텔레스 또는 투리시박터 산쿠이니스이다.
일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 프레보텔라 균주 B 50329의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 유전자 서열, 16S 서열, CRISPR 서열)에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다.
일부 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(2019년 9월 10일자로 기탁된 ATCC 수탁번호 PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 게놈 서열, 16S 서열, CRISPR 서열)에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 게놈 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 16S 서열과 적어도 99%의 서열 동일성(예를 들어, 적어도 99.1%의 서열 동일성, 적어도 99.2%의 서열 동일성, 적어도 99.3%의 서열 동일성, 적어도 99.4%의 서열 동일성, 적어도 99.5%의 서열 동일성, 적어도 99.6%의 서열 동일성, 적어도 99.7%의 서열 동일성, 적어도 99.8%의 서열 동일성, 적어도 99.9% 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 균주이다. 특정 실시형태에서, 프레보텔라 히스티콜라 균주는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)이다.
일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 표 1에 열거된 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의) 단백질 및/또는 표 1에 열거된 단백질을 암호화하는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 이상의) 유전자를 포함하는 프레보텔라 박테리아 균주이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 표 1에 열거된 모든 단백질 및/또는 표 1에 열거된 단백질을 암호화하는 모든 유전자를 포함한다.
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
일부 실시형태에서, 프레보텔라 박테리아는 표 2에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과)의 단백질 및/또는 표 2에 열거된 단백질을 암호화하는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과)의 유전자가 없거나 실질적으로 없는 프레보텔라 박테리아의 균주이다. 일부 실시형태에서, 프레보텔 박테리아는 표 2에 열거된 모든 단백질 및/또는 표 2에 열거된 단백질을 암호화하는 모든 유전자가 없다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
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일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 표 1에 열거된 단백질 중 하나 이상을 포함하고 표 2에 열거된 하나 이상의 단백질이 없거나 실질적으로 없는 프레보텔라 박테리아의 균주이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 프레보텔라 균주는 표 1에 열거된 단백질 모두 및/또는 표 1에 열거된 단백질을 암호화하는 유전자 모두를 포함하고, 표 2에 열거된 단백질 모두 및/또는 표 2에 열거된 단백질을 암호화하는 유전자 모두가 없는, 프레보텔라 박테리아의 균주이다.
특허 절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조건에 따라, 프레보텔라 균주　C는 2019년 9월 10일자로, 미국 20110-2209 버지니아주 매너서스 10801 불러바드 유니버시티 소재의 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁되었으며, ATCC 수탁 번호 PTA-126140이 부여되었다.
출원인은 ATCC가 특허가 허가되는 경우에 기탁의 영속성을 제공하고 공개적으로 이에 대한 접근성을 제공하는 기탁임을 주장한다. 기탁된 물질의 공중에 의한 이용가능성에 대한 모든 제한은 특허의 허가 시 취소할 수 없게 제거될 것이다. 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122에 따라 특허 출원이 진행되는 동안 특허국장이 권한이 있다고 결정한 자는 이 물질을 이용할 수 있을 것이다. 기탁된 물질은 기탁된 플라스미드 샘플의 가장 최근의 제공 요청 후 적어도 5년의 기간 동안 및 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 또는 특허의 유효 기간 중 더 긴 기간 동안 임의의 경우에 생존 및 오염되지 않음을 유지하기 위해 필요한 모든 주의를 기울여 유지될 것이다. 출원인은 기탁 조건으로 인해 요청받을 때 기탁소가 샘플을 제공할 수 없는 경우 기탁을 교체할 의무를 인정한다.
헴-함유 폴리펩타이드
(예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 그 밖의 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 하기 위한 배양 배지에서 사용될 수 있는 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)가 본 명세서에 제공된다. 헴-함유 폴리펩타이드는 헴 모이어티에 공유적 및/또는 비공유적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헴 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 조성물에서 사용되는 헴-함유 폴리펩타이드의 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%는 헴에 의해 결합된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 조성물에서 사용되는 헴-함유 폴리펩타이드의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%는 헴에 의해 결합된다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 글로빈이고, 일련의 7 내지 9개의 알파 나선을 포함하는 글루빈 접힘을 포함할 수 있다. 글로빈 유형 단백질은 임의의 부류(예를 들어, 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III)일 수 있고, 일부 실시형태에서, 산소를 수송 또는 저장할 수 있다. 예를 들어, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈 또는 레그헤모글로빈의 비-공생 유형일 수 있다. 헴-함유 폴리펩타이드는 단량체, 즉, 단일 폴리펩타이드 쇄일 수 있거나, 또는 이량체, 삼량체, 사량체 및/또는 보다 높은 차수의 올리고머일 수 있다.
헴-함유 폴리펩타이드의 비제한적 예는 안드로글로빈, 사이토글로빈, 글로빈 E, 글로빈 X, 글로빈 Y, 헤모글로빈, 레그헤모글로빈, 플라보헤모글로빈, 헬 게이트(Hell's gate) 글로빈 I, 미오글로빈, 에리트로크루오린, 베타 헤모글로빈, 알파 헤모글로빈, 프로토글로빈, 사이아노글로빈, 사이토글로빈, 히스토글로빈, 뉴로글로빈, 클로로크루오린, 절단된 헤모글로빈(예를 들어, HbN 또는 HbO), 절단된 2/2 글로빈, 헤모글로빈 3(예를 들어, Glb3), 사이토크롬 또는 과산화효소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈이다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 (예를 들어, (예를 들어, 피키아 파스토리스에서) 재조합적으로 발현된 또는 자연적으로 공급된) 콩 레그헤모글로빈이다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 물고기 폴리펩타이드는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속 어류의 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 물고기 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 조류 폴리펩타이드는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속 새의 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 조류 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물-유래 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물(예를 들어, 곡물, 협과), 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류 및/또는 원생동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 유기체로부터 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속 유기체의 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 다음 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다: 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 또는 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris)(담배), 제아 메이스(Zea mays)(옥수수), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 협과, 예컨대, 글리신 맥스(Glycine max)(대두), 시세르 아리에티눔(Cicer arietinum)(가르밴조 또는 병아리콩), 피섬 사티붐(Pisum sativum)(완두콩) 변종, 예컨대, 정원완두 또는 슈가스냅피(sugar snap pea), 일반콩의 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 변종, 예컨대, 그린콩, 블랙빈, 흰강낭콩, 노던빈(northern bean) 또는 핀토빈(pinto bean), 비냐 웅구아쿨라타(Vigna unguiculata) 변종(카우피), 비냐 라디아타(Vigna radiata)(녹두), 루피누스 알부스(Lupinus albus)(루핀) 또는 메디카고 사티바(Medicago sativa)(알팔파), 브라시카 나푸스(Brassica napus)(카놀라), 트리티쿰 종(밀알 및 스펠트를 포함하는 밀), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)(목화), 오리자 사티바(Oryza sativa)(벼), 지자니아 종(야생벼), 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)(해바라기), 베타 불가리스(Beta vulgaris)(사탕무), 페니세툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum)(펄기장), 케노포디움 종(퀴노아), 세사뭄 종(참깨), 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum) (아마) 또는 여섯줄 보리(보리)와 같은 식물. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 포유류(예를 들어, 농장 동물, 예컨대, 소, 염소, 양, 돼지, 황소 또는 토끼), 새, 식물, 조류, 진균(예를 들어, 효모 또는 사상성 진균), 섬모류 또는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 헴-함유 폴리펩타이드는 포유류, 예컨대, 농장 동물(예를 들어, 소, 염소, 양, 돼지, 어류, 황소 또는 토끼) 또는 새, 예컨대, 칠면조 또는 닭으로부터 유래될 수 있다. 헴-함유 폴리펩타이드는 식물, 예컨대, 니코티아나 타바쿰 또는 니코티아나 실베스트리스(담배); 제아 메이스(옥수수), 아라비돕시스 탈리아나, 협과, 예컨대, 글리신 맥스(대두), 시세르 아리에티눔(가르밴조 또는 병아리콩), 피섬 사티붐(완두콩) 변종, 예컨대, 정원완두 또는 슈가스냅피, 일반콩의 파세올루스 불가리스 변종, 예컨대, 그린콩, 블랙빈, 흰강낭콩, 노던빈, 또는 핀토빈, 비냐 웅구아쿨라타 변종(카우피), 비냐 라디아타(녹두), 루피누스 알부스(루핀) 또는 메디카고 사티바(알팔파); 브라시카 나푸스(카놀라); 트리티쿰 종(밀알 및 스펠트를 포함하는 밀); 고시피움 히르수툼(목화); 오리자 사티바(벼); 지자니아 종(야생벼); 헬리안투스 안누스(해바라기); 베타 불가리스(사탕무); 페니세툼 글라우쿰(펄기장); 케노포디움 종(퀴노아); 세사뭄 종(참깨); 리눔 우시타티시뭄(아마); 또는 여섯줄 보리(보리)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-공생 헤모글로빈일 수 있다. 비-공생 헤모글로빈은 임의의 식물로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-공생 헤모글로빈은 대두, 발아 대두, 알팔파, 황금 아마, 블랙빈, 블랙 아이드피(black eyed pea), 노던빈, 담배, 완두콩, 가르밴조, 녹두, 동부콩, 핀토빈, 완두콩 꼬투리, 퀴노아, 참깨, 해바라기, 밀알, 스펠트, 보리, 야생벼 및 벼로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 레그헤모글로빈은 콩, 완두콩 또는 동부콩 레그헤모글로빈일 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 레그헤모글로빈은 콩 레그헤모글로빈이다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스, 마그나포르테 오리자에(Magnaporthe oryzae), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 또는 푸사리움 옥시스포룸과 같은 진균으로부터 단리될 수 있다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 콩 레그헤모글로빈)는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드는 1종 이상의 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 시네코시스티스 종(Synechocistis sp.), 바실러스 서브틸리스, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus), 메틸아시디필룸 인페르노룸(Methylacidiphilum infernorum)(헬 게이트) 또는 고온성 박테리아(thermophilic bacteria)(예를 들어, 45℃ 초과의 온도에서 성장함), 예컨대, 써모필러스 또는 써모비피다푸스카(Thermobifidafusca)로부터 단리될 수 있다.
특정 실시형태에서, 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드는 클라미도모나스 에우가메토스(Chlamydomonas eugametos)와 같은 조류로부터 단리될 수 있다.
특정 실시형태에서, 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드는 파라메시움 카우다툼(Paramecium caudatum) 또는 테트라하이메나 피리포르미스(Tetrahymena pyriformis)와 같은 원생동물로부터 단리될 수 있다.
수많은 헴-함유 단백질의 서열 및 구조는 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Reedy, et a, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, Database issue D307-D313] 및 월드와이드웹 상의 http://hemeprotein.info/heme.php에서 입수 가능한 헴 단백질 데이터베이스를 참조한다. 또한 WO2014/110539 및 WO2014/110532를 참조한다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 공생이다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-공생이다. 비-공생 헤모글로빈은 대두, 발아 대두, 알팔파, 황금 아마, 블랙빈, 블랙 아이드피, 노던, 가르밴조, 녹두, 동부콩, 핀토빈, 완두콩 꼬투리, 건조 완두콩, 퀴노아, 참깨, 해바라기, 밀알, 스펠트, 보리, 야생벼 및 벼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 콩으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
본 개시내용은 또한 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드, 예컨대, 농장 동물과 같은 포유류(예를 들어, 소, 염소, 돼지, 황소 또는 토끼), 새, 예컨대, 닭 또는 칠면조 또는 어류, 예컨대, 잉어 또는 연어에서 발견되는 것을 상정한다.
본 개시내용은 또한 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드, 예컨대, 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물에서 발견되는 것을 상정한다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 표 3에 열거된 폴리페타이드가다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 표 3에 열거된 아미노산 서열을 갖는 이들의 전장에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 표 3에 열거된 cDNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 표 3에 열거된 cDNA 서열을 갖는 이들의 전장에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 cDNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4를 갖는 이들의 전장에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 서열을 갖는 이들의 전장에 걸쳐 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%의 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수친화성 지표(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용 생물 기능을 부여함에 있어서 수친화성 아미노산 지표의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 아미노산의 상대적 수친화성 특징은 얻어진 단백질의 2차 구조에 기여하는데, 이는 결국 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정하는 것으로 받아들여진다. 각각의 아미노산은 이들의 소수성 및 전하 특징을 기준으로 수친화성 지표가 부여되었고, 이들은: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트(<RTI 3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신-3.9); 및 알기닌(-4.5)이다.
특정 아미노산이 유사한 수친화성 지표 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성할 수 있다는 것, 즉, 여전히 생물학 기능적으로 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
상기 약술한 바와 같이, 따라서 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등의 상대적 유사성에 기반한다. 다양한 앞서 언급한 특징을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 알기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
Figure pct00026
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Figure pct00033
Figure pct00034
폴리펩타이드 정제
본 명세서에 기재된 바와 같은, 단리 및 정제된 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 공급원, 예컨대, 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리 및 정제된 단백질은 유전자 변형된 유기체, 예컨대, 유전자 변형된 박테리아 또는 효모로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리 및 정제된 폴리펩타이드는 화학적으로 합성되거나, 시험관내 합성을 통해 얻어진다. 일부 실시형태에서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 어류(예를 들어, 잉어, 연어 또는 상업적으로 용이하게 공급되는 임의의 다른 어류), 어분, 또는 어류 단백질 가수분해물로부터 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 또는 상업적으로 용이하게 공급되는 임의의 다른 새)로부터 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 물고기 헴-함유 폴리펩타이드, 조류 헴-함유 폴리펩타이드 또는 비-동물-유래 헴-함유 폴리펩타이드)는 폴리펩타이드 발현 기법(예를 들어, 숙주 세포, 예컨대, 박테리아 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이), 곤충 세포, 진균 세포, 예컨대, 효모 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스), 식물 세포 또는 포유류 세포에서 헴-함유 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 핵산을 클로닝 및 발현)을 이용하여 재조합적으로 생성될 수 있다. 외인성 핵산은 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 외인성 핵산은 벡터, 예컨대, 발현 벡터에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 핵산은 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포, 포유류 세포)에 DNA의 전달에 적합한 바이러스 벡터에 있을 수 있다. 재조합 폴리펩타이드는 세포내 단백질, 분비 단백질, 및/또는 불용성 단백질(예를 들어, 봉입체에 함유됨)로서 발현 및 정제될 수 있는데, 이들은 요소를 이용하여 가용화될 수 있고 천연 조건에서 서서히 재접힘될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 폴리펩타이드의 정제 및/또는 검출에서 유용할 수 있는 이종성 서열(예를 들어, 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 이들의 분자량을 기준으로, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 막을 통한 한외여과, 또는 밀도 원심분리에 의해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 이들의 표면 전하를 기준으로, 예를 들어, 등전침전, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 이들의 용해도를 기준으로, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 등전 침전, 계면활성제, 세정제 또는 용매 추출에 의해 분리될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 반응성 염료 또는 수산화인회석을 이용하여 다른 분자에 대한 이들의 친화도에 의해 분리될 수 있다. 친화도 크로마토그래피는 또한 관심 대상의 단백질에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항체, His-태그된 재조합 단백질에 대한 니켈 NTA, 당단백질 상의 당 모이어티에 결합하는 렉틴 또는 관심 대상의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 다른 분자를 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈이다. 특정 실시형태에서, 레그헤모글로빈은, 예를 들어, 전체 뿌리 또는 뿌리혹(예를 들어, 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹)으로부터 정제될 수 있다. 전체 뿌리 또는 뿌리혹은 그라인더-블렌더를 이용하여, 예를 들어, 20 mM 인산칼륨 pH 7.4, 100 mM 염화 칼륨 및 5 mM EDTA 중에 채취 및 용해될 수 있다. 이 과정 동안에, 레그헤모글로빈은 완충제에 방출된다. 레그헤모글로빈을 함유하는 뿌리혹 용해물은 5 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 세포 파편으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 여과 후에 원심분리(7000×g, 20분)가 이어진다. 이어서, 레그헤모글로빈을 함유하는 정제 용해물은 200 ㎚ 필터를 통해 여과되고, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기계(GE Healthcare) 상의 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼(High Prep Q; High Prep DEAE, GE Healthcare)에 적용된다. 레그헤모글로빈은 통과액 분획에서 수집되고, 3 kDa 여과막을 거쳐서 목적하는 농도로 농축된다. 정제된 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE 겔에 의해 분석되고: 용해물에서, 레그헤모글로빈은 20 내지 40%로 존재할 수 있는 반면, 음이온-교환 정제 후에, 이는 70 내지 80%로 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 음이온-교환 크로마토그래피로부터의 대두 레그헤모글로빈 통과액은 크기-배제 크로마토그래피(Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)에 적용된다. 대두 레그헤모글로빈은 이량체 및 단량체 종에 대응하는 2가지의 분획으로서 용리된다. 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE에 의해 분석되고, 대략 90 내지 100%일 수 있다.
협과 뿌리혹 용해물 중의 단백질은 10 mM 탄산나트륨 pH 9.5, 50 mM 염화나트륨 완충제에 전달될 수 있고, 200 ㎚ 필터를 통해 여과되며, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기(GE Healthcare) 상의 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 적용된다. 레그헤모글로빈은 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스에 결합하고, 결합된 레그헤모글로빈은 염화나트륨 구배를 이용하여 용리될 수 있다. 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있고, 대략 60 내지 80%일 수 있다.
협과 뿌리로부터의 원치않는 소분자는 음이온-교환 수지를 거쳐서 레그헤모글로빈 용액을 통과시킴으로써 정제된 레그헤모글로빈으로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 수지는 FFQ, DEAE, Amberlite IRA900, Dowex 22, 또는 Dowex 1x4이다. 황산암모늄 분획화(60% wt/v 및 90% wt/v 황산암모늄)에 의해 또는 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제된 레그헤모글로빈은 20 mM 인산칼륨 pH 7.4, 100 mM 염화나트륨에 완충제 교환되고, 용액은 상기 언급된 음이온-교환 수지 중 하나를 거쳐서 통과된다. 레그헤모글로빈을 함유하는 통과액이 수집될 수 있다.
헴-함유 폴리펩타이드는 또한 실시예에 기재되는 바와 같이 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 녹두로부터의 비-공생 헤모글로빈은 이콜라이에서 재조합적으로 발현될 수 있고, 음이온-교환 크로마토그래피 또는 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 세포 용해물은 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기(GE Healthcare) 상의 FF-Q 수지를 거쳐서 장입될 수 있다. 녹두 비-공생 헤모글로빈은 통과액 분획에서 용리된다. 녹두 비-공생 헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE에 의해 분석되고, 총 단백질의 분획으로서 결정될 수 있다. 대표적인 존재비 및 순도는 이콜라이 용해물에서 약 12%이고, FFQ 상의 정제 후에 약 31%일 수 있다. 정제된 단백질의 UV-Vis 분석은 헴-결합 단백질의 스펙트럼 특징을 나타낸다.
대안적으로, 녹두 세포 용해물은 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기(GE Healthcare) 상의 FF-S 수지를 거쳐서 장입될 수 있다. 녹두 비-공생 헤모글로빈은 FF-S 칼럼에 결합할 수 있고, 결합된 분획은 염화나트륨 구배(50 mM 내지 1000 mM)를 이용하여 용리될 수 있다. 녹두 비-공생 헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있고, 다음의 범위일 수 있다: 이콜라이 용해물 약 13%, FFQ 상에서 정제 후 약 35%. 정제된 단백질의 UV-Vis 분석은 헴 결합 단백질의 스펙트럼 특징을 나타낼 수 있다.
특정 실시형태에서, 표준 폴리펩타이드 합성 기법(예를 들어, 액체상 폴리펩타이드 합성 기법 또는 고체상 폴리펩타이드 합성 기법)은 헴-함유 폴리펩타이드를 합성에 의해 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 무 세포 번역 기법은 헴-함유 단백질을 합성에 의해 생성하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 단량체 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 레그헤모글로빈) 또는 다량체 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 사량체 헤모글로빈)의 정제를 상정한다. 일부 실시형태에서, 사량체 헤모글로빈의 각 서브유닛은 개개로 발현되고 이콜라이에서 봉입체로부터 단리될 수 있다. 변성된 β-서브유닛은 재접힘되고 기능성, 사량체 헤모글로빈을 생성하기 위해 천연 환원 α-쇄의 존재 하에 헤민에 의해 재구성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fronticelli et al. (1991) J Protein Chem 10:495-501]). 대안적으로, α 및 β 서브유닛은 이콜라이 및 피키아 파스토리스에서 다량의 무손상, 가용성 사량체 헤모글로빈을 생성하기 위해 공동발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoffman et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:8521-8525; Anwised et al. (2016) Protein J 35:256-268] 참조). 특정 실시형태에서, α 유전자는 융합되어 디-α 유전자를 생성할 수 있고, 이는 생리적 조건 하에 α1β1 이량체로 분리되지 않는 사량체를 발현시키기 위해 β-유전자의 복제물을 갖는 오페론에 삽입된다(예를 들어, 문헌[Shen et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:8108-8112]).
일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는, 예를 들어, 성장 배지의 다른 성분과의 조합 전에 멸균된다. 멸균은 초고온(UHT) 처리, 오토클레이빙 또는 여과에 의한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 오토클레이빙된다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 여과되고, 예를 들어, 헴-함유 폴리펩타이드는 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하기 위한 방법에서 사용 전에(예를 들어, 성장 배지에 첨가 전에 또는 성장 배지의 멸균 여과와 함께) 멸균된다. 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드는, 예를 들어, 치료용의 및/또는 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서의 헤모글로빈-의존성 박테리아의 대규모 제조 및/또는 GMP 등급 제조를 가능하게 할 수 있다.
성장 배지
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 지원하기에 충분한 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드의 양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ, 적어도 0.005 g/ℓ, 적어도 0.01 g/ℓ, 적어도 0.02 g/ℓ, 적어도 0.03 g/ℓ, 적어도 0.04 g/ℓ, 적어도 0.05 g/ℓ, 적어도 0.06 g/ℓ, 적어도 0.07 g/ℓ, 적어도 0.08 g/ℓ, 적어도 0.09 g/ℓ, 적어도 0.1 g/ℓ, 적어도 0.2 g/ℓ, 적어도 0.3 g/ℓ, 적어도 0.4 g/ℓ, 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.75 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.25 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 1.75 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ, 적어도 2.25 g/ℓ, 적어도 2.5 g/ℓ, 적어도 2.75 g/ℓ, 적어도 3 g/ℓ, 적어도 3.25 g/ℓ, 적어도 3.5 g/ℓ, 적어도 3.75 g/ℓ, 적어도 4 g/ℓ 또는 적어도 4.25 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ 및 1 g/ℓ 이하의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.05 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 1 g/ℓ의 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.01 g/ℓ to 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ, 적어도 0.005 g/ℓ, 적어도 0.01 g/ℓ, 적어도 0.02 g/ℓ, 적어도 0.03 g/ℓ, 적어도 0.04 g/ℓ, 적어도 0.05 g/ℓ, 적어도 0.06 g/ℓ, 적어도 0.07 g/ℓ, 적어도 0.08 g/ℓ, 적어도 0.09 g/ℓ, 적어도 0.1 g/ℓ, 적어도 0.2 g/ℓ, 적어도 0.3 g/ℓ, 적어도 0.4 g/ℓ, 적어도 0.5 g/ℓ, 적어도 0.75 g/ℓ, 적어도 1 g/ℓ, 적어도 1.25 g/ℓ, 적어도 1.5 g/ℓ, 적어도 1.75 g/ℓ, 적어도 2 g/ℓ, 적어도 2.25 g/ℓ, 적어도 2.5 g/ℓ, 적어도 2.75 g/ℓ, 적어도 3 g/ℓ, 적어도 3.25 g/ℓ, 적어도 3.5 g/ℓ, 적어도 3.75 g/ℓ, 적어도 4 g/ℓ 또는 적어도 4.25 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.05 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 0.01 g/ℓ 내지 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시형태에서, 성장 배지는 동물로부터 공급된 헤모글로빈 또는 이의 유도체(또는 다른 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 동물 생성물을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 당, 효모 추출물, 식물 기반 펩톤, 완충제, 염, 미량 원소, 계면활성제, 소포제 및/또는 비타민을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및/또는 글루코스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 12.5 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 12.5 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 1.59 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 2.5 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 0 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 0.91 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 인산일칼륨을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함한다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 0 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 염화암모늄을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 0 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 글루시덱스 21 D를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 10 g/ℓ의 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 5 g/ℓ의 글루코스를 포함한다.
특정 실시형태에서, 성장 배지는 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드, 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512, 약 12.5 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649, 약 12.5 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885, 약 1.59 g/ℓ의 인산이칼륨, 약 0.91 g/ℓ의 인산일칼륨, 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄, 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D 및/또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 표 4의 성장 배지이다.
특정 실시형태에서, 성장 배지는 본 명세서에 제공된 헴-함유 폴리펩타이드, 약 10 g/ℓ 효모 추출물 19512, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649, 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885, 약 2.5 g/ℓ의 인산이칼륨, 약 0.5 g/ℓ L-시스테인-HCl 및/또는 약 5 g/ℓ의 글루코스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 표 5의 성장 배지이다.
특정 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5이다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 pH가 약 6.5이다.
일부 실시형태에서, 성장 배지에 첨가되기 전에, 헴-함유 폴리펩타이드는 액체 혼합물로서 제조되고, 오토클레이빙 또는 여과에 의해 멸균된다. 일부 실시형태에서, 헴-함유 폴리펩타이드는 성장 배지에 첨가되고, 이어서, 이하에 기재되는 바와 같이 멸균된다.
일부 실시형태에서, 배지는 멸균된다. 멸균은 초고온(UHT) 처리, 오토클레이빙 또는 여과에 의한 것일 수 있다. UHT 처리는 매우 높은 온도에서 짧은 시간 동안 수행한다. UHT 범위는 135 내지 180℃일 수 있다. 예를 들어, 배지는 135℃서 10 내지 30초간 멸균될 수 있다.
배양 방법
특정 양상에서, (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 하는 방법 및/또는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 본 명세서에 제공된 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 성장 배지의 온도 및 pH를 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 배양시키는 단계는 상대적으로 적은 용적의 성장 배지(예를 들어, 1 ℓ)에서 시작할 수 있으며, 여기서, 박테리아는 성장의 대수증식기에 도달하는 것이 가능하게 된다. 이러한 배양물은 더 큰 바이오매스에 도달하기 위한 추가 성장을 위해 보다 큰 용적의 성장 배지(예를 들어, 20 ℓ)에 전달될 수 있다. 바이오매스의 최종적인 양의 필요에 따라서, 이러한 전달은 1회 초과로 반복될 수 있다. 상기 방법은 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아의 인큐베이션을 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 35℃ 내지 39℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 약 37℃의 온도에서 인큐베이션된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 성장하는 속도에 비해서, 헤모글로빈-의존성 박테리아가 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하도록, 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 조성물은 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장 속도를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아가 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 성장하는 속도는 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 또는 적어도 400%만큼 더 높다. 일부 실시형태에서, 성장 속도는 약 200% 내지 약 400%만큼 증가된다. 속도는 주어진 시간의 양 이내에 도달되는 세포 밀도로서 측정될 수 있다(예를 들어, 600 ㎚ 파장에서의 광학 밀도(OD600)에 의해 측정되는 바와 같음). 특정 실시형태에서, 이러한 속도는 측정되고, 박테리아 성장의 대수 증식기(또는 지수기) 동안에 비교되되, 선택적으로, 대수성장기는 초기 대수 증식기이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 더 높은 박테리아 세포 밀도로 성장하도록, 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 조성물은 박테리아 세포 밀도를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아가 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 성장하는 세포 밀도는 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 적어도 300%, 적어도 310%, 적어도 320%, 적어도 330%, 적어도 340%, 적어도 350%, 적어도 360%, 적어도 370%, 적어도 380%, 적어도 390%, 또는 적어도 400%만큼 더 높다. 일부 실시형태에서, 박테리아 세포 밀도는 약 200% 내지 약 400% 더 높다. 세포 밀도는 박테리아 성장의 정지상에서 (예를 들어, OD600에 의해 또는 세포 계수에 의해) 측정될 수 있되, 정지상은 초기 정지상이다. 일부 실시형태에서, 정지상은 성장 속도가 지연된 후에 (예를 들어, 성장 곡선으로부터) 성장의 지수기가 이어지는 상으로서 결정된다. 다른 실시형태에서, 정지상은 성장 배지에서의 낮은 글루코스 수준에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 혐기성 분위기 하에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, CO2를 포함하는 혐기성 분위기 하에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 1% 초과의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 5% 초과의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24% 또는 적어도 25% CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 적어도 10%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 적어도 20%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 10% 내지 40%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 20% 내지 30%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39% 또는 약 40% CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 25%의 CO2를 포함한다.
특정 양상에서, 혐기성 분위기는 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 95% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 90% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 95% 미만, 92% 미만, 90% 미만, 87% 미만, 85% 미만, 82% 미만, 80% 미만, 77% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 85% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 80% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 65% 내지 85%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 70% 내지 80%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 28%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85% N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 75%의 N2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 25% CO2 및 약 75%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 20% CO2 및 약 80%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 30% CO2 및 약 70%의 N2를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 통상적인 혐기성 배양 조건(예를 들어, 1% 초과의 CO2 수준에서, 예를 들어, 5% 초과의 CO2 수준에서, 약 25%의 CO2 수준에서)에 비해서 보다 큰 수준의 CO2를 포함하는 혐기성 조건 하에 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 통상적인 혐기성 배양 조건(예를 들어, 1% 초과의 CO2 수준, 예컨대, 약 25% CO2 수준에서)에 비해서 더 큰 수준의 CO2를 포함하는 조건 하에 배양되는 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 통상적인 배양 조건과 비교할 때 증가된 박테리아 수율을 초래한다.
특정 양상에서, 통상적인 혐기성 배양 조건(예를 들어, 95% 미만의 N2 수준에서, 예를 들어, 90% 미만의 N2 수준에서, 예컨대, 약 75% N2 수준에서)에 비해서 보다 저수준의 N2를 포함하는 혐기성 조건 하에 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 통상적인 혐기성 배양 조건(예를 들어, 95% 미만의 N2 수준, 예컨대, 약 75% N2 수준에서)에 비해서 더 낮은 수준의 N2를 포함하는 조건 하에 배양되는 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 통상적인 배양 조건에 비해서 증가된 박테리아 수율을 초래한다.
특정 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 a) 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 기체 혼합물로 바이오리액터를 퍼지하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 퍼지된 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 1% 초과의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39% 또는 약 40%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 5% 내지 35%의 CO2, 10% 내지 40%의 CO2, 10% 내지 30%의 CO2, 15% 내지 30%의 CO2, 20% 내지 30%의 CO2, 22% 내지 28%의 CO2, 또는 24% 내지 26%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 5% 초과의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 10%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 20%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 10% 내지 40%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 20% 내지 30%의 CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25%의 CO2를 포함한다.
특정 양상에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 a) 95% 미만의 N2를 포함하는 혐기성 기체 혼합물로 바이오리액터를 퍼지하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 퍼지된 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 95% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 95% 미만, 92% 미만, 90% 미만, 87% 미만, 85% 미만, 82% 미만, 80% 미만, 77% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기체 혼합물은 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 28%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85% N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 95% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 90% 미만의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 65% 내지 85%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 70%내지 80%의 N2CO2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 약 75%의 N2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25% CO2 및 약 75%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 20% CO2 및 약 80%의 N2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혐기성 분위기는 약 30% CO2 및 약 70%의 N2를 포함한다.
일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 CO2와 N2를 약 1:99, 약 2:98, 약 3:97, 약 4:96, 약 5:95, 약 6:94, 약 7:93, 약 8:92, 약 9:91, 약 10:90, 11:89, 약 12:88, 약 13:87, 약 14:86, 약 15:85, 약 16:84, 약 17:83, 약 18:82, 약 19:81, 약 20:80, 21:79, 약 22:78, 약 23:77, 약 24:76, 약 25:75, 약 26:74, 약 27:73, 약 28:72, 약 29:71, 약 30:70, 31:69, 약 32:68, 약 33:67, 약 34:66, 약 35:65, 약 36:64, 약 37:63, 약 38:62, 약 39:61, 또는 약 40:50의 CO2 대 N2의 비로 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합된 기체 조성물은 CO2와 N2를 약 25:75의 비로 포함하는 바이오리액터에서의 분위기를 제공한다.
일부 실시형태에서, 혐기성 기체 혼합물은 배양하는 동안 바이오리액터에 지속적으로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 지속적으로 첨가된 혐기성 기체 혼합물은 0.01 내지 0.1 vvm의 속도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 지속적으로 첨가된 혐기성 기체 혼합물은 0.02vvm의 속도로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 지속적으로 첨가된 혐기성 기체 혼합물은 위에서 기재한 기체 혼합물 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 성장 배지를 헤모글로빈-의존성 박테리아로 접종하는 단계를 추가로 포함하되, 박테리아는 본 명세서에 제공된 방법에 따라 성장 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 접종된 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 0.01% 내지 10% v/v의 성장 배지(예를 들어, 약 0.1% v/v의 성장 배지, 약 0.5% v/v의 성장 배지, 약 1% v/v의 성장 배지, 약 5% v/v의 성장 배지)이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 약 1 ㎖이다.
일부 실시형태에서, 접종물은 성장이 모니터링되는 플라스크에서 또는 더 작은 바이오리액터에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 접종물 크기는 총 바이오리액터 용적의 대략 0.1% v/v 내지 5% v/v일 수 있다. 일부 실시형태에서, 접종물은 0.1 내지 3% v/v, 0.1 내지 1% v/v, 0.1 내지 0.5% v/v, 또는 0.5 내지 1% v/v의 총 바이오리액터 용적이다. 일부 실시형태에서, 접종물은 약 0.1% v/v, 약 0.2% v/v, 약 0.3% v/v, 약 0.4%, v/v, 약 0.5% v/v, 약 0.6% v/v, 약 0.7% v/v, 약 0.8% v/v, 약 0.9% v/v, 약 1% v/v, 약 1.5% v/v, 약 2% v/v, 약 2.5% v/v, 약 3% v/v, 약 4%, v/v, 또는 약 5% v/v의 총 바이오리액터 용적이다.
일부 실시형태에서, 접종 전에, 바이오리액터는 목적하는 pH 및 온도에서 성장 배지에 의해 제조된다. 배양 배지의 초기 pH는 공정 설정점과 다를 수 있다. 낮은 세포 농도에서 pH 스트레스가 유해할 수 있으며; 초기 pH는 pH 7.5 내지 공정 설정-점 사이일 수 있다. 예를 들어, pH는 4.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.5에서 설정될 수 있다. 발효 동안 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화암모늄의 사용을 통해 제어될 수 있다. 온도는 25℃ 내지 45℃, 예를 들어 37℃에서 제어될 수 있다.
일부 실시형태에서, 균주 및 접종물 크기에 따라, 바이오리액터 발효 시간이 달라질 수 있다. 예를 들어, 발효 시간은 5시간 내지 48시간에서 변할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발효 시간은 5시간 내지 24시간, 8시간 내지 24시간, 8시간 내지 18시간, 8시간 내지 16시간, 8시간 내지 14시간, 10시간 내지 24시간, 10시간 내지 18시간, 10시간 내지 16시간, 10시간 내지 14시간, 10시간 내지 12시간, 12시간 내지 24시간, 12시간 내지 18시간, 12시간 내지 16시간, or 12시간 내지 14시간일 수 있다.
일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 단계는 50 내지 300의 RPM에서 배양물을 교반하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 약 150의 RPM에서 교반된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 배양시키는 방법은 적어도 5시간(예를 들어, 적어도 10시간) 동안 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 14 내지 16시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 배양된 박테리아의 약 5% v/v를 성장 배지에서 접종하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 20 ℓ의 용적이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 배양된 박테리아의 약 0.5% v/v를 성장 배지에서 접종하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 성장 배지는 약 3500 ℓ의 용적이다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 적어도 정지상에 도달될 때까지 배양된다.
특정 실시형태에서, 배양시키는 방법은 배양된 박테리아를 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 채취 시간은 글루코스 수준이 2 g/ℓ 미만이거나 또는 정지상에 도달될 때 중 하나를 기준으로 할 수 있다. 방법은 (예를 들어, 세포 페이스트를 생성시키기 위해서) 수거 후 배양된 박테리아를 원심분리시키는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 상기 세포 슬러리를 동결건조시켜 분말을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 상기 세포 슬러리를 동결건조시켜 분말을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 분말에 감마 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 일단 발효가 완료되면, 배양물은 (예를 들어, 10℃까지) 냉각되고, 원심분리되어 세포 페이스트를 수집한다. 안정제가 세포 페이스트에 첨가되고, 철저하게 혼합될 수 있다. 채취는 지속적 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 생성물은 원하는 최종 농도까지 다양한 부형제와 함께 재현탁될 수 있다. 부형제는 동결 건조 동안 동결 보호 또는 보호를 위해 첨가될 수 있다. 부형제는 수크로스, 트레할로스 또는 락토스를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들은 대안적으로 완충제 및 항산화제와 혼합될 수 있다. 동결 건조 전에, 세포 펠릿의 점적은 부형제와 혼합되고, 액체 질소에 침지될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 슬러리는 동결건조될 수 있다. 생 박테리아를 포함한 물질의 동결건조는 1차 건조로 시작될 수 있다. 1차 건조 단계 중에, 얼음이 제거된다. 여기서, 진공이 생성되고 얼음을 승화시키기 위해서 물질에 적절한 양의 열을 공급한다. 2차 건조 단계 중에, 생성물에 결합된 물 분자가 제거될 수 있다. 여기서, 물 분자와 생성물 물질 사이에 형성된 물리-화학적 상호작용을 파괴하기 위해서 온도가 1차 건조 단계에서보다 높아진다. 이 단계 중에 탈착을 향상시키기 위해 압력을 더 낮출 수도 있다. 동결건조 공정이 완료된 후, 챔버는 질소와 같은 비활성 기체로 채워질 수 있다. 생성물은 건조한 조건하에 동결 건조기 내에서 밀봉되어, 대기 중 물과 오염물질에 노출되는 것이 방지될 수 있다. 동결건조된 물질은 감마 조사(예를 들어, 17.5 kGy)될 수 있다.
바이오리액터
특정 양상에서, 본 명세서에 제공된 성장 배지(즉, 본 명세서에 개시된 헴-함유 폴리펩타이드(예를 들어, 동물로부터 공급되지 않은 헴-함유 폴리펩타이드)를 포함하는 성장 배지) 및/또는 (예를 들어, 박테리아 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 사용하기 위한 그리고/또는 치료적 용도를 위한) 본 명세서에 제공된 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 박테리아(예를 들어, 본 명세서에 제공된 프레보텔라 균주)이다. 일부 실시형태에서, 이러한 바이오리액터에서 박테리아를 배양시키는 방법이 본 명세서에 제공된다.
특정 실시형태에서, 바이오리액터는 상기 언급한 혐기성 조건 하에 있다. 특정 양상에서, 상기 개시된 혐기성 분위기 하에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 특정 양상에서, 다양한 크기의 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 바이오리액터는 적어도 1 ℓ의 용적, 적어도 5 ℓ의 용적, 적어도 10 ℓ의 용적, 적어도 15 ℓ의 용적, 적어도 20 ℓ의 용적, 적어도 30 ℓ의 용적, 적어도 40 ℓ의 용적, 적어도 50 ℓ의 용적, 적어도 100 ℓ의 용적, 적어도 200 ℓ의 용적, 적어도 250 ℓ의 용적, 적어도 500 ℓ의 용적, 적어도 750 ℓ의 용적, 적어도 1000 ℓ의 용적, 적어도 1500 ℓ의 용적, 적어도 2000 ℓ의 용적, 적어도 2500 ℓ의 용적, 적어도 3000 ℓ의 용적, 적어도 3500 ℓ의 용적, 적어도 4000 ℓ의 용적, 적어도 5000 ℓ의 용적, 적어도 7500 ℓ의 용적, 적어도 10,000 ℓ의 용적, 적어도 15,000 ℓ의 용적 또는 적어도 20,000 ℓ의 용적이다. 일부 실시형태에서, 바이오리액터는 약 1 ℓ의 용적, 약 5 ℓ의 용적, 약 10 ℓ의 용적, 약 15 ℓ의 용적, 약 20 ℓ의 용적, 약 30 ℓ의 용적, 약 40 ℓ의 용적, 약 50 ℓ의 용적, 약 100 ℓ의 용적, 약 200 ℓ의 용적, 약 250 ℓ의 용적, 약 500 ℓ의 용적, 약 750 ℓ의 용적, 약 1000 ℓ의 용적, 약 1500 ℓ의 용적, 약 2000 ℓ의 용적, 약 2500 ℓ의 용적, 약 3000 ℓ의 용적, 약 3500 ℓ의 용적, 약 4000 ℓ의 용적, 약 5000 ℓ의 용적, 약 7500 ℓ의 용적, 약 10,000 ℓ의 용적, 약 15,000 ℓ의 용적 또는 약 20,000 ℓ의 용적이다.
예시적인 실시형태
예시적인 실시형태 1에 따르면, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하되, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 2에 따르면, 실시형태 1의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 3에 따르면, 실시형태 2에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 4에 따르면, 실시형태 1에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 5에 따르면, 실시형태 1에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 6에 따르면, 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 7에 따르면, 실시형태 6에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 8에 따르면, 실시형태 7에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 9에 따르면, 실시형태 6에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 10에 따르면, 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 11에 따르면, 실시형태 10에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 12에 따르면, 실시형태 11에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 13에 따르면, 실시형태 10에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 14에서, 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물-유래 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 15에서, 실시형태 14에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물(예를 들어, 콩), 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 16에 따르면, 실시형태 14 또는 15에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 17에 따르면, 실시형태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 18에 따르면, 실시형태 17에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 19에 따르면, 실시형태 14에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 20에 따르면, 실시형태 1 내지 5, 14 및 19 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114(예를 들어, 서열번호 4 또는 114) 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 21에 따르면, 실시형태 20에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114(예를 들어, 서열번호 4 또는 114) 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성(또는 적어도 99.5% 또는 100%)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 22에 따르면, 실시형태 9, 13 및 19 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 23에 따르면, 실시형태 22에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 24에 따르면, 실시형태 9, 13 및 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 25에 따르면, 실시형태 24에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 26에 따르면, 실시형태 25에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 27에 따르면, 실시형태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 28에 따르면, 실시형태 27에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 29에 따르면, 실시형태 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 30에 따르면, 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 31에 따르면, 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 32에 따르면, 실시형태 31에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 33에 따르면, 실시형태 31에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 34에 따르면, 실시형태 31에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 35에 따르면, 실시형태 31에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99.5%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 36에 따르면, 실시형태 31에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 37에 따르면, 실시형태 31 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 38에 따르면, 실시형태 31 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주로부터 유래된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 39에 따르면, 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 40에 따르면, 실시형태 39에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 50% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 41에 따르면, 실시형태 39에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 100% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 42에 따르면, 실시형태 39에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 200% 내지 400% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 43에 따르면, 실시형태 39에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 300% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 44에 따르면, 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 45에 따르면, 실시형태 44에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 50% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 46에 따르면, 실시형태 44에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 100% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 47에 따르면, 실시형태 44에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 200% 내지 400% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 48에 따르면, 실시형태 44에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 300% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 49에 따르면, 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 분위기 하에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 50에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 10%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 51에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 20%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 52에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 53에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 54에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 55에 따르면, 실시형태 49 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 분위기는 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 56에 따르면, 실시형태 49에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 57에 따르면, 실시형태 46에 있어서, 상기 방법은 a) 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 기체 혼합물로 바이오리액터를 퍼지하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 퍼지된 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 58에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 10%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 59에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 20%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 60에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 61에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 62에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 63에 따르면, 실시형태 57 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 64에 따르면, 실시형태 57에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 65에 따르면, 실시형태 57 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오리액터는 약 1 ℓ, 약 20 ℓ, 약 3,500 ℓ, 또는 약 20,000 ℓ 바이오리액터인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 66에 따르면, 실시형태 57 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 성장 배지를 헤모글로빈-의존성 박테리아로 접종시키는 단계를 더 포함하되, 상기 접종 단계는 단계 b)에 선행하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 67에 따르면, 실시형태 66에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 상기 성장 배지의 약 0.1% v/v인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 68에 따르면, 실시형태 66에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 69에 따르면, 실시형태 66에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 약 1 ㎖인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 70에 따르면, 실시형태 57 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 71에 따르면, 실시형태 70에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 14 내지 16시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 72에 따르면, 실시형태 70 또는 71에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 73에 따르면, 실시형태 72에 있어서, 상기 성장 배지는 약 20 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 74에 따르면, 실시형태 72 또는 73에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 75에 따르면, 실시형태 74에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 76에 따르면, 실시형태 74 또는 75에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 0.5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 77에 따르면, 실시형태 76에 있어서, 상기 성장 배지는 약 3500 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 78에 따르면, 실시형태 76 또는 77에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 79에 따르면, 실시형태 78에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 80에 따르면, 실시형태 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 81에 따르면, 실시형태 80에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 82에 따르면, 실시형태 80에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 83에 따르면, 실시형태 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 84에 따르면, 실시형태 83에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 85에 따르면, 실시형태 83에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 86에 따르면, 실시형태 80 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 87에 따르면, 실시형태 86에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 88에 따르면, 실시형태 86에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 89에 따르면, 실시형태 80 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 90에 따르면, 실시형태 89에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1.59 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 91에 따르면, 실시형태 89에 있어서, 상기 성장 배지는 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 92에 따르면, 실시형태 80 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 93에 따르면, 실시형태 92에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.91 g/ℓ 인산일칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 94에 따르면, 실시형태 80 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 95에 따르면, 실시형태 94에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 96에 따르면, 실시형태 80 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 97에 따르면, 실시형태 96에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 98에 따르면, 실시형태 80 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 20 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 99에 따르면, 실시형태 98에 있어서, 상기 성장 배지는 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 100에 따르면, 실시형태 80 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 101에 따르면, 실시형태 100에 있어서, 상기 성장 배지는 약 5 g/ℓ의 글루코스 또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 102에 따르면, 실시형태 1 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 103에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 104에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 105에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 106에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 107에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 108에 따르면, 실시형태 102에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 109에 따르면, 실시형태 108에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 110에 따르면, 실시형태 108에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 111에 따르면, 실시형태 108에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 112에 따르면, 실시형태 108에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 113에 따르면, 실시형태 108에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 114에 따르면, 실시형태 1 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 35℃ 내지 39℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 115에 따르면, 실시형태 114에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 약 37℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 116에 따르면, 실시형태 1 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 117에 따르면, 실시형태 116에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 약 6.5인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 118에 따르면, 실시형태 1 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계는 50 내지 300의 RPM에서 상기 성장 배지를 교반하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 119에 따르면, 실시형태 118에 있어서, 상기 성장 배지는 약 150의 RPM에서 교반되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 120에 따르면, 실시형태 57 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 인큐베이션 동안에 지속적으로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 121에 따르면, 실시형태 120에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 약 0.02　vvm의 속도로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 122에 따르면, 실시형태 1 내지 실시형태 121에 있어서, 상기 방법은 정지상에 도달될 때 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 채취하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 123에 따르면, 실시형태 122에 있어서, 채취한 후에 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 원심분리시켜 세포 페이스트를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 124에 따르면, 실시형태 123에 있어서, 안정제 용액으로 상기 세포 페이스트를 희석시켜 세포 슬러리를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 125에 따르면, 실시형태 124에 있어서, 상기 세포 슬러리를 동결건조시켜 분말을 생성시키는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 126에 따르면, 실시형태 125에 있어서, 상기 분말에 감마 방사선을 조사하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 127에 따르면, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, (a) 헴-함유 폴리펩타이드 및 헤모글로빈-의존성 박테리아를 성장 배지에 첨가하는 단계; 및 (b) 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하되, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 128에 따르면, 실시형태 127의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 129에 따르면, 실시형태 128에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 130에 따르면, 실시형태 127에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 131에 따르면, 실시형태 127에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 132에 따르면, 실시형태 127 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 133에 따르면, 실시형태 132에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 134에 따르면, 실시형태 133에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 135에 따르면, 실시형태 132에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 136에 따르면, 실시형태 127 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 137에 따르면, 실시형태 136에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 138에 따르면, 실시형태 137에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 139에 따르면, 실시형태 136에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 140에 따르면, 실시형태 127 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물-유래 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 141에 따르면, 실시형태 140에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 142에 따르면, 실시형태 140 또는 141에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 143에 따르면, 실시형태 140 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 144에 따르면, 실시형태 143에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 145에 따르면, 실시형태 140에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 146에 따르면, 실시형태 127 내지 131, 140 및 145 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 147에 따르면, 실시형태 146에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 148에 따르면, 실시형태 135, 139 및 145 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 149에 따르면, 실시형태 148에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 150에 따르면, 실시형태 135, 139 및 145 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 151에 따르면, 실시형태 150에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 152에 따르면, 실시형태 151에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 153에 따르면, 실시형태 150 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 154에 따르면, 실시형태 153에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 155에 따르면, 실시형태 145 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 156에 따르면, 실시형태 127 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 157에 따르면, 실시형태 127 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 158에 따르면, 실시형태 157에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 159에 따르면, 실시형태 157에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 160에 따르면, 실시형태 157에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 161에 따르면, 실시형태 157에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 162에 따르면, 실시형태 157에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 163에 따르면, 실시형태 157 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 164에 따르면, 실시형태 157 내지 163 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 165에 따르면, 실시형태 127 내지 164 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 166에 따르면, 실시형태 165에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 50% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 167에 따르면, 실시형태 165에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 100% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 168에 따르면, 실시형태 165에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 200% 내지 400% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 169에 따르면, 실시형태 165에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 300% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 170에 따르면, 실시형태 127 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 171에 따르면, 실시형태 170에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 50% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 172에 따르면, 실시형태 170에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 100% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 173에 따르면, 실시형태 170에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 200% 내지 400% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 174에 따르면, 실시형태 170에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 300% 더 높은 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 175에 따르면, 실시형태 127 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 분위기 하에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 176에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 10%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 177에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 20%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 178에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 179에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 180에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 181에 따르면, 실시형태 175 내지 180 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 분위기는 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 182에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 183에 따르면, 실시형태 175에 있어서, 상기 방법은 a) 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 기체 혼합물로 바이오리액터를 퍼지하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 퍼지된 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 184에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 10%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 185에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 20%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 186에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 187에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 188에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 189에 따르면, 실시형태 183 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 190에 따르면, 실시형태 183에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 191에 따르면, 실시형태 183 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오리액터는 약 1 ℓ, 약 20 ℓ, 약 3,500 ℓ, 또는 약 20,000 ℓ 바이오리액터인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 192에 따르면, 실시형태 183 내지 191 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 성장 배지를 헤모글로빈-의존성 박테리아로 접종시키는 단계를 더 포함하되, 상기 접종 단계는 단계 b)에 선행하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 193에 따르면, 실시형태 192에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 상기 성장 배지의 약 0.1% v/v인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 194에 따르면, 실시형태 192에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 195에 따르면, 실시형태 192에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 약 1 ㎖인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 196에 따르면, 실시형태 183 내지 195 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 197에 따르면, 실시형태 196에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 14 내지 16시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 198에 따르면, 실시형태 196 또는 197에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 199에 따르면, 실시형태 198에 있어서, 상기 성장 배지는 약 20 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 200에 따르면, 실시형태 198 또는 199에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 201에 따르면, 실시형태 200에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 202에 따르면, 실시형태 200 또는 201에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 0.5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 203에 따르면, 실시형태 202에 있어서, 상기 성장 배지는 약 3500 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 204에 따르면, 실시형태 202 또는 203에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 205에 따르면, 실시형태 204에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 206에 따르면, 실시형태 127 내지 205 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 207에 따르면, 실시형태 206에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 208에 따르면, 실시형태 206에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 209에 따르면, 실시형태 206 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 210에 따르면, 실시형태 209에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 211에 따르면, 실시형태 209에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 212에 따르면, 실시형태 206 내지 211 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 213에 따르면, 실시형태 212에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 214에 따르면, 실시형태 212에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 215에 따르면, 실시형태 206 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 216에 따르면, 실시형태 215에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1.59 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 217에 따르면, 실시형태 215에 있어서, 상기 성장 배지는 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 218에 따르면, 실시형태 206 내지 217 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 219에 따르면, 실시형태 218에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.91 g/ℓ 인산일칼륨을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 220에 따르면, 실시형태 206 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 221에 따르면, 실시형태 220에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 222에 따르면, 실시형태 206 내지 221 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 223에 따르면, 실시형태 222에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 224에 따르면, 실시형태 206 내지 223 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 20 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 225에 따르면, 실시형태 224에 있어서, 상기 성장 배지는 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 226에 따르면, 실시형태 206 내지 225 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 227에 따르면, 실시형태 226에 있어서, 상기 성장 배지는 약 5 g/ℓ의 글루코스 또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 228에 따르면, 실시형태 127 내지 227 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 229에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 230에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 231에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 232에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 233에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 234에 따르면, 실시형태 228에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 235에 따르면, 실시형태 234에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 236에 따르면, 실시형태 234에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 237에 따르면, 실시형태 234에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 238에 따르면, 실시형태 234에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 239에 따르면, 실시형태 234에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 240에 따르면, 실시형태 127 내지 239 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 35℃ 내지 39℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 241에 따르면, 실시형태 240에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 약 37℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 242에 따르면, 실시형태 127 내지 241 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 243에 따르면, 실시형태 242에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 약 6.5인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 244에 따르면, 실시형태 127 내지 243 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계는 50 내지 300의 RPM에서 상기 성장 배지를 교반하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 245에 따르면, 실시형태 244에 있어서, 상기 성장 배지는 약 150의 RPM에서 교반되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 246에 따르면, 실시형태 183 내지 245 중 어느 하나에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 인큐베이션 동안에 지속적으로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 247에 따르면, 실시형태 246에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 약 0.02　vvm의 속도로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 248에 따르면, 실시형태 127 내지 실시형태 247에 있어서, 상기 방법은 정지상에 도달될 때 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 채취하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 249에 따르면, 실시형태 248에 있어서, 채취한 후에 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 원심분리시켜 세포 페이스트를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 250에 따르면, 실시형태 249에 있어서, 안정제 용액으로 상기 세포 페이스트를 희석시켜 세포 슬러리를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 251에 따르면, 실시형태 250에 있어서, 상기 세포 슬러리를 동결건조시켜 분말을 생성시키는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 252에 따르면, 실시형태 251에 있어서, 상기 분말에 감마 방사선을 조사하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 253에 따르면, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터로서, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 254에 따르면, 실시형태 253의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 255에 따르면, 실시형태 254에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 256에 따르면, 실시형태 253의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 257에 따르면, 실시형태 253의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 258에 따르면, 실시형태 253 내지 257 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 259에 따르면, 실시형태 258에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 260에 따르면, 실시형태 259에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 261에 따르면, 실시형태 258에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 262에 따르면, 실시형태 253 내지 257 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 263에 따르면, 실시형태 262에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 264에 따르면, 실시형태 263에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 265에 따르면, 실시형태 262에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 266에 따르면, 실시형태 253 내지 257 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 유래 폴리펩타이드인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 267에 따르면, 실시형태 266에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 268에 따르면, 실시형태 266 또는 267에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 269에 따르면, 실시형태 266 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 270에 따르면, 실시형태 269에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 271에 따르면, 실시형태 266에 있어서, 비-동물 유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 272에 따르면, 실시형태 253 내지 257, 266 및 271 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 273에 따르면, 실시형태 272에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 274에 따르면, 실시형태 261, 265 및 271 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 275에 따르면, 실시형태 274에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 276에 따르면, 실시형태 261, 265 및 271 내지 275 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 277에 따르면, 실시형태 276에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 278에 따르면, 실시형태 277에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 279에 따르면, 실시형태 276 내지 278 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 280에 따르면, 실시형태 279에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 281에 따르면, 실시형태 271 내지 280 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 282에 따르면, 실시형태 253 내지 281 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 283에 따르면, 실시형태 253 내지 281 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 284에 따르면, 실시형태 283에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 285에 따르면, 실시형태 283에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 286에 따르면, 실시형태 283에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 287에 따르면, 실시형태 283에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99.5%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 288에 따르면, 실시형태 283에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 289에 따르면, 실시형태 283 내지 288 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 290에 따르면, 실시형태 283 내지 289 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주로부터 유래된 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 291에 따르면, 실시형태 253 내지 290 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 292에 따르면, 실시형태 291에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 50% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 293에 따르면, 실시형태 291에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 100% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 294에 따르면, 실시형태 291에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 200% 내지 400% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 295에 따르면, 실시형태 291에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 300% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 296에 따르면, 실시형태 253 내지 295 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 297에 따르면, 실시형태 296에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 50% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 298에 따르면, 실시형태 296에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 100% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 299에 따르면, 실시형태 296에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 200% 내지 400% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 300에 따르면, 실시형태 296에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 300% 더 높은 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 301에 따르면, 실시형태 253 내지 300 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 적어도 약 1% CO2를 포함하는 혐기성 분위기 하에서 있는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 302에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 10%의 CO2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 303에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 적어도 20%의 CO2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 304에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 305에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 306에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25%의 CO2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 307에 따르면, 실시형태 301 내지 306 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 분위기는 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 308에 따르면, 실시형태 301에 있어서, 혐기성 분위기는 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 309에 따르면, 실시형태 301 내지 308 중 어느 하나에 있어서, 비바이오리액터는 1 ℓ, 20 ℓ, 3500 ℓ 또는 20,000 ℓ의 바이오리액터인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 310에 따르면, 실시형태 253 내지 309 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및 글루코스를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 311에 따르면, 실시형태 310에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 312에 따르면, 실시형태 310에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 313에 따르면, 실시형태 310 내지 312 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 314에 따르면, 실시형태 313에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 315에 따르면, 실시형태 313에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 316에 따르면, 실시형태 310 내지 315 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 317에 따르면, 실시형태 316에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 318에 따르면, 실시형태 316에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 319에 따르면, 실시형태 310 내지 318 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 320에 따르면, 실시형태 319에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1.59 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 321에 따르면, 실시형태 319에 있어서, 상기 성장 배지는 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 322에 따르면, 실시형태 310 내지 321 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 323에 따르면, 실시형태 322에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.91 g/ℓ 인산일칼륨을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 324에 따르면, 실시형태 310 내지 323 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 325에 따르면, 실시형태 324에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 326에 따르면, 실시형태 310 내지 325 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 327에 따르면, 실시형태 326에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 328에 따르면, 실시형태 310 내지 327 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 20 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 329에 따르면, 실시형태 328에 있어서, 상기 성장 배지는 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 330에 따르면, 실시형태 310 내지 329 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 331에 따르면, 실시형태 330에 있어서, 상기 성장 배지는 약 5 g/ℓ의 글루코스 또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 332에 따르면, 실시형태 253 내지 331 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 333에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 334에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 335에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 336에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 337에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 338에 따르면, 실시형태 332에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 339에 따르면, 실시형태 338에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 340에 따르면, 실시형태 338에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 341에 따르면, 실시형태 338에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 342에 따르면, 실시형태 338에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 343에 따르면, 실시형태 338에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 344에 따르면, 실시형태 253 내지 343 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오리액터는 온도가 35℃ 내지 39℃인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 345에 따르면, 실시형태 344에 있어서, 상기 바이오리액터는 온도가 37℃인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 346에 따르면, 실시형태 253 내지 345 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 347에 따르면, 실시형태 346에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 약 6.5인 바이오리액터가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 348에 따르면, 실시형태 253 내지 347 중 어느 하나의 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, 상기 바이오리액터에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 349에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 기체 혼합물에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 350에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 10%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 351에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 적어도 20%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 352에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 10% 내지 40%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 353에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 20% 내지 30%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 354에 따르면, 실시형태 348에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25%의 CO2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 355에 따르면, 실시형태 348 내지 354 중 어느 하나에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 CO2 및 N2로 본질적으로 이루어진 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 356에 따르면, 실시형태 355에 있어서, 혐기성 기체 혼합물은 약 25% CO2 및 약 75% N2를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 357에 따르면, 실시형태 348 내지 356 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 인큐베이션 전에 상기 성장 배지를 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아로 접종시키는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 358에 따르면, 실시형태 357에 있어서, 접종된 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 상기 성장 배지의 약 0.1% v/v인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 359에 따르면, 실시형태 357에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 360에 따르면, 실시형태 357에 있어서, 접종된 헤모글로빈-의존성 박테리아의 용적은 약 1 ㎖인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 361에 따르면, 실시형태 348 내지 360 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 배양되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 362에 따르면, 실시형태 361에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 14 내지 16시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 363에 따르면, 실시형태 361 또는 362에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 364에 따르면, 실시형태 363에 있어서, 상기 성장 배지는 약 20 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 365에 따르면, 실시형태 363 또는 364에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 366에 따르면, 실시형태 365에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 367에 따르면, 실시형태 365 또는 366에 있어서, 상기 방법은 성장 배지에서 상기 배양된 박테리아의 약 0.5% v/v를 접종하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 368에 따르면, 실시형태 367에 있어서, 상기 성장 배지는 약 3500 ℓ의 용적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 369에 따르면, 실시형태 367 또는 368에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 10 내지 24시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 370에 따르면, 실시형태 369에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 12 내지 14시간 동안 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 371에 따르면, 실시형태 348 내지 370 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 35℃ 내지 39℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 372에 따르면, 실시형태 371에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 37℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 373에 따르면, 실시형태 348 내지 372 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계는 50 내지 300의 RPM에서 상기 성장 배지를 교반하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 374에 따르면, 실시형태 373에 있어서, 상기 성장 배지는 150의 RPM에서 교반되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 375에 따르면, 실시형태 348 내지 374 중 어느 하나에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 인큐베이션 동안에 지속적으로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 376에 따르면, 실시형태 375에 있어서, 상기 혐기성 기체 혼합물은 0.02　vvm의 속도로 첨가되는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 377에 따르면, 실시형태 348 내지 실시형태 376에 있어서, 상기 방법은 정지상에 도달될 때 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 채취하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 378에 따르면, 실시형태 377에 있어서, 채취한 후에 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 원심분리시켜 세포 페이스트를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 379에 따르면, 실시형태 378에 있어서, 안정제 용액으로 상기 세포 페이스트를 희석시켜 세포 슬러리를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 380에 따르면, 실시형태 379에 있어서, 상기 세포 슬러리를 동결건조시켜 분말을 생성시키는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 381에 따르면, 실시형태 380에 있어서, 상기 분말에 감마 방사선을 조사하는 단계를 더 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 382에 따르면, a) 헤모글로빈-의존성 박테리아, 및 b) 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지를 포함하는 조성물로서, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인, 조성물.
예시적인 실시형태 383에 따르면, 실시형태 382의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 384에 따르면, 실시형태 383에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 385에 따르면, 실시형태 382의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 386에 따르면, 실시형태 382의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 387에 따르면, 실시형태 382 내지 386 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 388에 따르면, 실시형태 387에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 389에 따르면, 실시형태 388에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 390에 따르면, 실시형태 387에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 391에 따르면, 실시형태 382 내지 386 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 392에 따르면, 실시형태 391에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 393에 따르면, 실시형태 392에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 394에 따르면, 실시형태 391에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 395에 따르면, 실시형태 382 내지 386 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 유래 폴리펩타이드인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 396에 따르면, 실시형태 395에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 397에 따르면, 실시형태 395 또는 396에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 398에 따르면, 실시형태 395 내지 397 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 399에 따르면, 실시형태 398에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 400에 따르면, 실시형태 395에 있어서, 비-동물 유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 401에 따르면, 실시형태 382 내지 386, 395 및 400 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 402에 따르면, 실시형태 401에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 403에 따르면, 실시형태 390, 394 및 400 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 404에 따르면, 실시형태 403에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 405에 따르면, 실시형태 390, 394 및 400 내지 404 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제되는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 406에 따르면, 실시형태 405에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 407에 따르면, 실시형태 406에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 408에 따르면, 실시형태 405 내지 407 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 409에 따르면, 실시형태 408에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 410에 따르면, 실시형태 400 내지 409 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 411에 따르면, 실시형태 382 내지 410 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 412에 따르면, 실시형태 382 내지 410 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 413에 따르면, 실시형태 412에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 414에 따르면, 실시형태 412에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 415에 따르면, 실시형태 412에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 416에 따르면, 실시형태 412에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 417에 따르면, 실시형태 412에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 418에 따르면, 실시형태 412 내지 417 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 419에 따르면, 실시형태 412 내지 418 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 420에 따르면, 실시형태 382 내지 419 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 421에 따르면, 실시형태 420에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 50% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 422에 따르면, 실시형태 420에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 100% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 423에 따르면, 실시형태 420에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 200% 내지 400% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 424에 따르면, 실시형태 420에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 300% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 425에 따르면, 실시형태 382 내지 424 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 426에 따르면, 실시형태 425에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 50% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 427에 따르면, 실시형태 425에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 100% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 428에 따르면, 실시형태 425에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 200% 내지 400% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 429에 따르면, 실시형태 425에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 300% 더 높은 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 430에 따르면, 실시형태 382 내지 429 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및 글루코스를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 431에 따르면, 실시형태 430에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 432에 따르면, 실시형태 430에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 433에 따르면, 실시형태 430 내지 432 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 434에 따르면, 실시형태 433에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 435에 따르면, 실시형태 433에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 436에 따르면, 실시형태 430 내지 435 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 437에 따르면, 실시형태 436에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 438에 따르면, 실시형태 436에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 439에 따르면, 실시형태 430 내지 438 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 440에 따르면, 실시형태 439에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1.59 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 441에 따르면, 실시형태 439에 있어서, 상기 성장 배지는 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 442에 따르면, 실시형태 430 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 443에 따르면, 실시형태 442에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.91 g/ℓ 인산일칼륨을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 444에 따르면, 실시형태 430 내지 441 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 445에 따르면, 실시형태 444에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 446에 따르면, 실시형태 430 내지 445 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 447에 따르면, 실시형태 446에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 448에 따르면, 실시형태 430 내지 447 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 20 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 449에 따르면, 실시형태 448에 있어서, 상기 성장 배지는 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 450에 따르면, 실시형태 430 내지 416449 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 451에 따르면, 실시형태 450에 있어서, 상기 성장 배지는 약 5 g/ℓ의 글루코스 또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 452에 따르면, 실시형태 382 내지 451 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 453에 따르면, 실시형태 452에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 454에 따르면, 실시형태 453에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 455에 따르면, 실시형태 453에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 456에 따르면, 실시형태 453에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 457에 따르면, 실시형태 453에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 458에 따르면, 실시형태 453에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 459에 따르면, 실시형태 458에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 460에 따르면, 실시형태 458에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 461에 따르면, 실시형태 458에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 462에 따르면, 실시형태 458에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 463에 따르면, 실시형태 458에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 464에 따르면, 실시형태 382 내지 463 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 465에 따르면, 실시형태 464에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 약 6.5인 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 466에 따르면, 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양하는 데 상요하기 위한 성장 배지로서, 성장 배지는 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터로서, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 467에 따르면, 실시형태 466의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 468에 따르면, 실시형태 467에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 469에 따르면, 실시형태 466의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 470에 따르면, 실시형태 466의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 471에 따르면, 실시형태 466 내지 470 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 472에 따르면, 실시형태 471에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 473에 따르면, 실시형태 472에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 474에 따르면, 실시형태 471에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 475에 따르면, 실시형태 466 내지 470 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 476에 따르면, 실시형태 475에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 477에 따르면, 실시형태 476에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 478에 따르면, 실시형태 475에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 479에 따르면, 실시형태 466 내지 470 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 유래 폴리펩타이드인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 480에 따르면, 실시형태 479에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 481에 따르면, 실시형태 479 또는 480에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 482에 따르면, 실시형태 479 내지 481 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 483에 따르면, 실시형태 482에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 484에 따르면, 실시형태 479에 있어서, 비-동물 유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 485에 따르면, 실시형태 466 내지 470, 479 및 484 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 486에 따르면, 실시형태 485에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 487에 따르면, 실시형태 474, 478 및 484 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 488에 따르면, 실시형태 487에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 489에 따르면, 실시형태 474, 478 및 484 내지 488 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제되는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 490에 따르면, 실시형태 489에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 491에 따르면, 실시형태 490에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 492에 따르면, 실시형태 489 내지 491 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 493에 따르면, 실시형태 492에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 494에 따르면, 실시형태 484 내지 493 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 495에 따르면, 실시형태 466 내지 494 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 496에 따르면, 실시형태 466 내지 494 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 497에 따르면, 실시형태 496에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 498에 따르면, 실시형태 496에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 499에 따르면, 실시형태 496에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 500에 따르면, 실시형태 496에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 501에 따르면, 실시형태 496에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 502에 따르면, 실시형태 496 내지 501 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 503에 따르면, 실시형태 496 내지 502 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 504에 따르면, 실시형태 466 내지 503 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 성장하는 속도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 505에 따르면, 실시형태 504에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 상기 속도보다 적어도 50% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 506에 따르면, 실시형태 504에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도보다 적어도 100% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 507에 따르면, 실시형태 504에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도보다 200% 내지 400% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 508에 따르면, 실시형태 504에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도보다 적어도 300% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 509에 따르면, 실시형태 466 내지 508 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 510에 따르면, 실시형태 509에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 50% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 511에 따르면, 실시형태 509에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 100% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 512에 따르면, 실시형태 509에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 200% 내지 400% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 513에 따르면, 실시형태 509에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도는 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도보다 적어도 300% 더 높은 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 514에 따르면, 실시형태 466 내지 513 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 효모 추출물, 소이 펩톤 A2SC 19649, 소이 펩톤 E110 19885, 인산이칼륨, 인산일칼륨, L-시스테인-HCl, 염화암모늄, 글루시덱스 21 D 및 글루코스를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 515에 따르면, 실시형태 514에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 516에 따르면, 실시형태 514에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ의 효모 추출물 19512를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 517에 따르면, 실시형태 514 내지 516 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 518에 따르면, 실시형태 517에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 519에 따르면, 실시형태 517에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 A2SC 19649를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 520에 따르면, 실시형태 514 내지 519 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 10 g/ℓ 내지 15 g/ℓ의 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 521에 따르면, 실시형태 5205에 있어서, 상기 성장 배지는 약 12.5 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 522에 따르면, 실시형태 520에 있어서, 상기 성장 배지는 약 10 g/ℓ 소이 펩톤 E110 19885를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 523에 따르면, 실시형태 514 내지 522 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ의 인산이칼륨을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 524에 따르면, 실시형태 523에 있어서, 상기 성장 배지는 약 1.59 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 525에 따르면, 실시형태 523에 있어서, 상기 성장 배지는 약 2.5 g/ℓ 인산이칼륨을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 526에 따르면, 실시형태 514 내지 525 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ의 인산일칼륨을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 527에 따르면, 실시형태 526에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.91 g/ℓ 인산일칼륨을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 528에 따르면, 실시형태 514 내지 527 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 529에 따르면, 실시형태 528에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 L-시스테인-HCl을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 530에 따르면, 실시형태 514 내지 529 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 0.1 g/ℓ 내지 1.0 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 531에 따르면, 실시형태 530에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.5 g/ℓ의 염화암모늄을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 532에 따르면, 실시형태 514 내지 531 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 20 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 533에 따르면, 실시형태 532에 있어서, 상기 성장 배지는 약 25 g/ℓ의 글루시덱스 21 D를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 534에 따르면, 실시형태 514 내지 533 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 5 g/ℓ 내지 15g/ℓ의 글루코스를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 535에 따르면, 실시형태 534에 있어서, 상기 성장 배지는 약 5 g/ℓ의 글루코스 또는 약 10 g/ℓ의 글루코스를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 536에 따르면, 실시형태 466 내지 535 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 537에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 538에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 539에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 540에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 541에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 542에 따르면, 실시형태 536에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 543에 따르면, 실시형태 542에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.005 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 544에 따르면, 실시형태 542에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.01 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 545에 따르면, 실시형태 542에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.02 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 546에 따르면, 실시형태 542에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.1 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 547에 따르면, 실시형태 542에 있어서, 상기 성장 배지는 약 0.2 g/ℓ의 콩 레그헤모글로빈을 포함하는 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 548에 따르면, 실시형태 466 내지 547 중 어느 하나에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 5.5 내지 7.5인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 549에 따르면, 실시형태 548에 있어서, 상기 성장 배지는 pH가 약 6.5인 성장 배지가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 550에 따르면, 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 하기 위해 성장 배지에서 보충물로서 사용하기 위한 헴-함유 폴리펩타이드로서, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 551에 따르면, 실시형태 550의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 552에 따르면, 실시형태 551에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 553에 따르면, 실시형태 550의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 554에 따르면, 실시형태 550의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 555에 따르면, 실시형태 550 내지 554 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 556에 따르면, 실시형태 555에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 557에 따르면, 실시형태 556에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 558에 따르면, 실시형태 555에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 559에 따르면, 실시형태 550 내지 554 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 560에 따르면, 실시형태 559에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 561에 따르면, 실시형태 560에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 562에 따르면, 실시형태 559에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 563에 따르면, 실시형태 550 내지 554 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 유래 폴리펩타이드인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 564에 따르면, 실시형태 563에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 565에 따르면, 실시형태 563 또는 564에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 566에 따르면, 실시형태 563 내지 565 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 567에 따르면, 실시형태 566에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 568에 따르면, 실시형태 563에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 569에 따르면, 실시형태 550 내지 554, 563 및 568 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 570에 따르면, 실시형태 569에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 571에 따르면, 실시형태 558, 562 및 568 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 572에 따르면, 실시형태 571에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 573에 따르면, 실시형태 558, 562 및 568 내지 572 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 574에 따르면, 실시형태 573에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 575에 따르면, 실시형태 574에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 576에 따르면, 실시형태 573 내지 575 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 577에 따르면, 실시형태 576에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 578에 따르면, 실시형태 568 내지 577 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 579에 따르면, 실시형태 550 내지 578 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 580에 따르면, 실시형태 550 내지 578 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 581에 따르면, 실시형태 580에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 582에 따르면, 실시형태 580에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 583에 따르면, 실시형태 580에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 584에 따르면, 실시형태 580에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 585에 따르면, 실시형태 580에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 586에 따르면, 실시형태 580 내지 585 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 587에 따르면, 실시형태 580 내지 586 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주인 헴-함유 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 588에 따르면, (a) 헤모글로빈-의존성 박테리아, 및 (b) 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 박테리아 조성물로서, 헴-함유 폴리펩타이드는: (i) 물고기 폴리펩타이드; (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는 (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 589에 따르면, 실시형태 588의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 590에 따르면, 실시형태 589에 있어서, 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 591에 따르면, 실시형태 588의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 592에 따르면, 실시형태 588의 방법에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 593에 따르면, 실시형태 588 내지 592 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 594에 따르면, 실시형태 593에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 어류로부터 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 595에 따르면, 실시형태 594에 있어서, 어류는 초어, 멸치, 큰머리잉어, 잉어, 명태, 오레오크로미스, 대두어, 가다랑어, 카틀라, 붕어, 살모, 청어, 고등어, 라베오, 트리키우루스, 대구, 사르디나, 말로투스, 카노스, 고등어, 연어, 청어, 프로캄바루스, 브레보오르티아, 밴댕이, 강청어, 가물치, 대구, 꽁치, 전갱이, 농어, 멜라노그람무스, 메기, 스프라투스, 시리누스, 이크타룰루스, 마이크로메시스티우스, 테누알로사, 갯장어, 정어리, 세텐그라울리스, 폴라키우스, 점다랑어, 줄무늬고등어, 드렁허리, 민대구, 줄무늬고등어, 미꾸리, 쏘가리, 선농어, 정어리, 물천구, 삼치, 에트말로사, 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마, 새가라지, 셀라로이데스 또는 까나리 속인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 596에 따르면, 실시형태 593에 있어서, 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현되는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 597에 따르면, 실시형태 588 내지 592 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 598에 따르면, 실시형태 597에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 새로부터 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 599에 따르면, 실시형태 598에 있어서, 새는 갈루스, 멜레아그리스, 오리, 기러기, 흑기러기, 흰기러기, 아겔라스테스, 누미다, 구테라, 아크릴리움 또는 콜럼바 속인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 600에 따르면, 실시형태 597에 있어서, 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현되는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 601에 따르면, 실시형태 588 내지 592 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 비-동물 유래 폴리펩타이드인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 602에 따르면, 실시형태 601에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물, 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류, 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 603에 따르면, 실시형태 601 또는 602에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스, 니코티아나, 아시도보락스, 아퀴펙스, 써모필러스, 바실러스, 에스케리키아, 브레비바실러스, 코리네박테륨, 프리고리박테륨, 메틸아시디필룸, 리조븀, 시네코코커스, 시네코시스티스, 노스톡, 푸사리움, 아스퍼질러스, 사카로마이세스, 피키아, 쉬조사카로마이세스, 트리코더마, 마이셀리오프테라, 클루이베라, 클라미도모나스, 오리자, 마그나포르테, 제아, 호르데움, 글리신, 시세르, 파세올루스, 루피누스, 메디카고, 브라시카, 트리티쿰, 고시피움, 지자니아, 헬리안투스, 베타, 페니세툼, 케노포디움, 세사뭄, 리눔, 비냐, 리시너스, 피섬, 테트라하이메나 또는 파라메시움 속의 적어도 하나의 유기체로부터 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 604에 따르면, 실시형태 601 내지 603 중 어느 하나에 있어서, 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 605에 따르면, 실시형태 604에 있어서, 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 606에 따르면, 실시형태 601에 있어서, 비-동물 유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현되는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 607에 따르면, 실시형태 588 내지 592, 601 및 606 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 608에 따르면, 실시형태 607에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 609에 따르면, 실시형태 596, 600 및 606 중 어느 하나에 있어서, 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 610에 따르면, 실시형태 609에 있어서, 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 611에 따르면, 실시형태 596, 600, 606, 609 및 555 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 612에 따르면, 실시형태 611에 있어서, 외인성 핵산은 벡터에 있는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 613에 따르면, 실시형태 612에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 614에 따르면, 실시형태 611 내지 613 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 615에 따르면, 실시형태 614에 있어서, 숙주 세포는 피키아 파스토리스 또는 에스케리키아 콜라이인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 616에 따르면, 실시형태 606 내지 615 중 어느 하나에 있어서, 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 617에 따르면, 실시형태 588 내지 616 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스, 알리스티페스, 아나에로부티리쿰, 바실러스, 박테로이데스, 클로아시바실러스, 클로스트리디움, 콜린셀라, 큐티박테리움, 에이센베르기엘라, 에리시펠로트리카세애, 유박테리움/모기박테리움, 파칼리박테리움, 푸르니에렐라, 푸소박테리움, 메가스파에라, 파라박테로이데스, 펩토니필러스, 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 프로피오니박테리움, 라리마이크로비움, 셔틀워티아, 투리시박터 또는 베일로넬라 속의 박테리아인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 618에 따르면, 실시형태 588 내지 616 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 619에 따르면, 실시형태 618에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스, 프레보텔라 암니, 프레보텔라 베르겐시스, 프레보텔라 비비아, 프레보텔라 브레비스, 프레보텔라 브리안티, 프레보텔라 부카에, 프레보텔라 부칼리스, 프레보텔라 콥리, 프레보텔라 덴탈리스, 프레보텔라 덴티콜라, 프레보텔라 디시엔스, 프레보텔라 히스티콜라, 프레보텔라 인터메디아, 프레보텔라 마쿨로사, 프레보텔라 마르쉬, 프레보텔라 멜라니노게니카, 프레보텔라 미칸스, 프레보텔라 멀티포르미스, 프레보텔라 니그레센스, 프레보텔라 오랄리스, 프레보텔라 오리스, 프레보텔라 오울로럼, 프레보텔라 팔렌스, 프레보텔라 살리바에, 프레보텔라 스테르코레아, 프레보텔라 탄네라에, 프레보텔라 티모넨시스, 프레보텔라 제주니, 프레보텔라 아우란티아카, 프레보텔라 바로니아에, 프레보텔라 콜로란스, 프레보텔라 코르포리스, 프레보텔라 덴타시니, 프레보텔라 에노에카, 프레보텔라 팔세니, 프레보텔라 푸스카, 프레보텔라 헤파리놀리티카, 프레보텔라 로에스케이, 프레보텔라 멀티사카리보락스, 프레보텔라 난세이엔시스, 프레보텔라 오리자에, 프레보텔라 팔루디비벤스, 프레보텔라 플레우리티디스, 프레보텔라 루미니콜라, 프레보텔라 사카로리티카, 프레보텔라 스코포스, 프레보텔라 샤히, 프레보텔라 주글레오포르만스 또는 프레보텔라 베로랄리스인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 620에 따르면, 실시형태 618에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라 종인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 621에 따르면, 실시형태 618에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 622에 따르면, 실시형태 618에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 623에 따르면, 실시형태 618에 있어서, 상기 프레보텔라는 상기 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329) 또는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 624에 따르면, 실시형태 618 내지 623 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
예시적인 실시형태 625에 따르면, 실시형태 618 내지 624 중 어느 하나에 있어서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라의 균주인 박테리아 조성물이 본 명세서에 제공된다.
실시예
실시예 1: 헴-함유 폴리펩타이드의 예시적인 정제
모든 단계를 4℃ 또는 실온에서 수행한다. 원심분리 단계는 8000×g에서 20분 동안, 4℃ 또는 실온이다.
이하에 기재하는 바와 같이 준비한 정제한 조직 용해물 또는 단백질 용액을 황산암모늄 침전 처리한다. 간략히 말해서, 정제한 조직 용해물 또는 단백질 용액은 1 M HEPES, pH 7.4 또는 1 M Tris-HCl, pH 7.4로 50 mM의 최종 농도까지 완충시킨다. 50% 및 80% 포화도에서 적어도 2단계로 황산암모늄의 첨가에 의해 단백질을 침전시킨다. 황산암모늄을 갖는 용해물을 최소 4시간 동안 그리고 최대 16시간 동안 4℃에서 부드럽게 교반한다. 용액을 25,000×g에서 1시간 동안 4℃에서 원심분리시킨다.
분획화 시, 관심 대상의 모든 황산암모늄 침전물 분획을 추가 사용까지 -20℃에서 저장한다. 실험에서 이들을 사용하기 전에, 침전물을 0.5 M NaCl을 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.4의 10 용적에서 재현탁시킨다. 현탁액을 원심분리시키고, 상청액을 0.2 마이크론 PES 막을 통해 미세여과시킨다. 여과액을 Spectrum Labs KrosFlo 중공섬유 접선 유동 여과 시스템 상의 3 kDa, 5 kDa 또는 10 kDa 분자량 컷오프 PES 막 상의 한외여과에 의해 농축시킨다. 개개 분획화 단계에서의 단백질 조성을 SDS-PAGE에 의해 모니터링하고, 표준 UV-Vis 방법에 의해 단백질 농도를 측정한다. 헤모글로빈, 미오글로빈 또는 다른 헴-함유 폴리펩타이드를 단백질의 분자 크기에 기반하여 크기 배제 크로마토그래피(Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)에 의해 추가로 분리시킨다. 분획을 선택적으로 이온 교환 크로마토그래피(High Prep Q; Prep S; High Prep DEAE, GE Healthcare)를 이용하여 추가로 정제한다. 헴-함유 폴리펩타이드를 함유하는 분획을 SDS-PAGE 및/또는 질량 분석법에 의해 결정한다.
어류로부터의 헴-함유 폴리펩타이드
잉어는 크게 토막을 내고, 액체 질소에서 빠르게 냉동시킨다. 냉동 조직을 미세한 분말이 형성될 때까지 막자사발로 액체 질소에서 분쇄한다. 추가 사용할 때까지 분말을 -80℃에서 분말을 저장한다.
분쇄된 잉어 분말 또는 상업적으로 입수 가능한 어류 단백질 가수분해물을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 8.0 및 0.4 M 염화나트륨의 10 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 4℃에서 교반하였다. 가용성 단백질을 원심분리에 의해 나머지로부터 분리시킨다. 상청액을 위에서 기재한 황산암모늄 침전 처리한다.
새로부터의 헴-함유 폴리펩타이드
닭고기를 크게 토막내고, 액체 질소에서 냉동시킨다. 냉동 조직을 미세한 분말이 형성될 때까지 막자사발로 액체 질소에서 분쇄한다. 추가 사용할 때까지 분말을 -80℃에서 분말을 저장한다.
분쇄한 닭 분말 또는 상업적으로 입수 가능한 치킨 밀(chicken meal)을 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 8.0 및 0.4 M 염화나트륨의 10 용적에 현탁시킨다. 용해물을 원심분리에 의해 청징시킨다. 상청액을 위에서 기재한 황산암모늄 침전을 위해 사용한다.
비-동물 공급원으로부터의 헴-함유 폴리펩타이드
상업적으로 입수 가능한 협과 가루를 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 8.0 및 0.4 M 염화나트륨의 10 용적에 현탁시킨다. 용해물을 원심분리에 의해 청징시킨다. 상청액을 위에서 기재한 황산암모늄 침전을 위해 사용한다.
완두콩 총 단백질: 총 완두콩 단백질을 추출하기 위해 건조 푸른 또는 노란 완두콩가루를 사용하였다. 가루를 20 mM 인산칼륨 완충제, pH 8 및 100 M 염화나트륨의 10 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 교반한다. 원심분리에 의해 완두콩 종자 파편으로부터 가용성 단백질을 분리시킨다. 상청액을 수집하고, 0.2 마이크론 막을 통해 여과시키고, 10 KDa 컷오프 PES 막을 이용하여 농축시킨다.
렌즈콩 총 단백질: 렌즈콩 단백질의 조질의 단백질을 추출하기 위해 공기-분류된 렌즈콩 분말을 사용한다. 분말을 20 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4 및 0.5 M 염화나트륨의 5 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 교반하였다. 가용성 단백질을 원심분리(8000 g, 20분)에 의해 비추출 단백질 및 렌즈콩 종자 파편으로부터 분리시킨다. 상청액을 수집하고, 0.2 마이크론 막을 통해 여과시키고, 10 KDa 컷오프 PES 막을 이용하여 농축시킨다.
병아리콩/가르반조콩 총 단백질: 가르반조콩 분말을 20 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4 및 0.5 M 염화나트륨의 5 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 교반한다. 가용성 단백질을 원심분리(8000 g, 20분)에 의해 비추출 단백질 및 병아리콩 종자 파편으로부터 분리시킨다. 상청액을 수집하고, 0.2 마이크론 막을 통해 여과시키고, 10 KDa 컷오프 PES 막을 이용하여 농축시킨다.
대두 단백질: 20 mM 탄산나트륨, pH 9(또는 물, 가루의 첨가 후에 pH가 9로 조절됨) 또는 20 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.4 및 100 mM 염화나트륨의 4 내지 15 용적(예를 들어, 5 용적)에서 탈지 대두분말을 현탁함으로써 대두 단백질을 추출하였다. 슬러리를 1시간 동안 교반하고, 8000×g에서 20분 동안 원심분리시킨다. 추출한 단백질을 한외여과시키고, 이어서, 상기와 같이 처리하거나 또는 대안적으로, 상청액을 수집하고, 0.2 마이크론 막을 통해 여과시키고, 10 KDa 컷오프 PES 막을 이용하여 농축시킨다.
아마란스 가루 데하이드린: 아마란스 가루를 0.5 M 염화나트륨, pH 4.0의 5 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 교반한다. 가용성 단백질을 원심분리(8000 g, 20 분)에 의해 비추출 단백질 및 파편으로부터 분리시킨다. 상청액을 수집하고, 0.2 마이크론 막을 통해 여과시키고, 3 KDa 컷오프 PES 막을 이용하여 농축시킨다. 농축된 단백질 물질을 비등시키고, 8000×g에서 10분 동안 교반하고, 상청액을 수집함으로써 이 분획으로부터의 데하이드린의 추가적인 풍부화를 얻는다.
완두콩 글로불린: 완두콩 글로불린 단백질을 추출하기 위해 건조 푸른 완두콩가루를 사용한다. 가루를 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 8 및 0.4 M 염화나트륨의 10 용적에 현탁시키고, 1시간 동안 교반한다. 원심분리에 의해 완두콩 종자 파편으로부터 가용성 단백질을 분리시킨다. 상청액을 50% 및 80% 포화도에서 2개 단계로 황산암모늄 분획화 처리한다. 추가 사용까지 -20℃에서 관심 대상의 글로불린을 함유하는 80% 펠릿을 저장한다. 단백질을 펠릿으로부터 회수하고, 위에서 기재한 바와 같이 사용하기 위해 준비한다.
대두 7S 및 11S 글로불린: 20 mM 인산칼륨 pH 7.4의 4 내지 15 용적에서 저지방/탈지 대두분말을 처음 현탁시킴시킴으로써 대두 가루로부터의 글로불린을 단리시킨다. 슬러리를 8000×g에서 20분 동안 원심분리시키거나 5 마이크론 여과에 의해 정제하고, 상청액을 수집한다. 조질의 단백질 추출물은 7S와 11S 글로불린을 둘 다 함유한다. 0.2 마이크론 필터를 이용하여 용액을 여과시키고, Spectrum Labs KrosFlo 중공섬유 접선 유동 여과 시스템 상에서 10 kDa 분자량 컷오프 PES 막을 이용하여 또는 실험에서 사용하기 전에 음이온-교환 수지를 통과시킴으로써 농축시킨다. 11S 글로불린을 등전침전에 의해 7S 단백질로부터 분리시킨다. 묽은 HCl로 조질의 단백질 추출물의 pH를 6.4로 조절하고, 30 min-1 시간 동안 교반하고, 이어서, 원심분리시켜 상청액 중 11S 침전물 및 7S 단백질을 수집한다. 11S 분획을 10 mM 인산칼륨 pH 7.4로 재현탁시키고, 단백질 분획을 미세여과시키고, 사용 전에 농축시킨다.
녹두 8S 글로불린: 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7, 0.5M NaCl의 4 용적에서 가루를 처음 현탁시킴으로써 8S 글로불린을 추출하기 위해 녹두 가루를 사용한다. 원심분리 후에, 각각 50% 및 90% 포화도에서 2 단계로 황산암모늄의 첨가에 의해 상청액 중 단백질을 분획화한다. 90% 분획으로부터의 침전물은 8S 글로불린을 함유하고, 이를 추가 사용까지 -20℃에서 저장한다. 8S 글로불린을 펠릿으로부터 회수하고, 위에서 기재한 바와 같이 사용하기 위해 준비한다.
녹두 글로불린: 또한 20 mM 탄산나트륨 완충제, pH 9(또는 녹두가루의 첨가 후에 pH 9로 조절된 물)의 4 용적에 가루를 현탁시킴으로써 녹두 글로빈을 추출한다. 고체를 제거하기 위해 슬러리를 원심분리하고(또는 여과시키고), 한외여과시키고, 이어서, 위에서 기재한 바와 같이 처리한다.
레그헤모글로빈. 콩 뿌리혹을 현탁시키고, 그라인더-블렌더를 이용하여 20 mM 인산칼륨 pH 7.4, 100 mM 염화칼륨 및 5 mM EDTA에 용해시킨다. 이 과정 동안에, 레그헤모글로빈은 완충제에 방출된다. 레그헤모글로빈을 함유하는 뿌리혹 용해물은 5 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 세포 파편으로부터 제거한다. 여과 후에 원심분리(7000×g, 20분)가 이어진다. 이어서, 레그헤모글로빈을 함유하는 정제 용해물은 0.2 마이크론 필터를 통해 여과되고, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기(GE Healthcare) 상의 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼(High Prep Q; High Prep DEAE, GE Healthcare)에 적용한다. 레그헤모글로빈을 통과액 분획에 수집하고, Spectrum Labs KrosFlo 중공섬유 접선 유동 여과 시스템 상의 3 kDa 분자량 컷오프 PES 막을 거쳐서 목적하는 농도로 농축시킨다. 정제된 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)를 SDS-PAGE 겔에 의해 분석한다. 용해물에서, 레그헤모글로빈은 전형적으로 20 내지 40%로 존재하는 반면, 음이온-교환 정제 후에, 이는 70 내지 80%로 존재할 수 있다. 음이온-교환 크로마토그래피로부터의 대두 레그헤모글로빈 통과액은 크기-배제 크로마토그래피(Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)에 선택적으로 적용된다. 대두 레그헤모글로빈은 이량체 및 단량체 종에 대응하는 2가지의 분획으로서 용리된다. 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)는 SDS-PAGE에 의해 분석되고, 대략 90 내지 100% 범위일 수 있다. UV-VIS 스펙트럼(250 내지 700 ㎚)의 분석은 헴 로딩 레그헤모글로빈과 일치되는 스펙트럼 특징을 나타낼 수 있다.
실시예 2: 예시적인 재조합 헴-함유 폴리펩타이드 발현 및 정제
단량체 헴-함유 폴리펩타이드
녹두로부터의 비-공생 헤모글로빈을 pJexpress401 벡터(DNA2.0)에 클로닝하고, 이콜라이 BL21로 형질전환시킨다. 트립톤, 카나마이신, 0.1 mM 염화제이철 및 10 ㎍/㎖ 5-아미노레불린산 대신에 소이톤(soytone)을 함유하는 LB 배지에서 세포를 성장시킨다. 0.2mM IPTG에 의해 발현을 유도하고, 세포를 30℃에서 20시간 동안 성장시킨다. 녹두 비-공생 헤모글로빈을 발현시키는 이콜라이 세포를 수집하고, 20 mM MES 완충제 pH 6.5, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, DNAase I 및 프로테아제 저해제에서 재현탁시킨다. 세포를 음파처리에 의해 용해시킨다. 용해물을 16,000×g에서 20분 동안 원심분리에 의해 세포 파편으로부터 제거한 후에 200 ㎚ 필터를 거쳐서 여과시킨다. 이어서, 세포 용해물을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기(GE Healthcare) 상의 FF-S 칼럼을 거쳐서 장입한다. 녹두 비-공생 헤모글로빈은 FF-S 칼럼에 결합하고, 염화나트륨 구배(50 mM 내지 1000 mM)를 이용하여 결합된 단백질을 용리될 수 있다. 녹두 비-공생 헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)를 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 전형적인 경우에, 이콜라이 용해물 중의 순도(부분적 존재비)는 약 13%이고, FF-Q 상의 정제 후에 약 35%이다. 정제된 단백질의 UV-Vis 분석은 헴 결합 단백질의 스펙트럼 특징을 나타낼 수 있다.
단량체 헴-함유 폴리펩타이드를 N-말단의 His6 에피토프 태그 및 TEV 절단 부위로 합성하고, pJexpress401 벡터(DNA2.0)에 클로닝하고, 이콜라이 BL21로 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 트립톤, 카나마이신, 0.1 mM 염화제이철 및 10 g/㎖ 5-아미노레불린산 대신에 소이톤을 함유하는 LB 배지에서 성장시킨다. 0.2mM IPTG에 의해 발현을 유도하고, 세포를 30℃에서 20시간 동안 성장시킨다. 헴 단백질을 발현시키는 이콜라이 세포를 수집하고, 50 mM 인산칼륨 pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 1 mM MgCl2, 1mM CaCl2, DNAase I 및 프로테아제 저해제에 재현탁시킨다. 세포를 음파처리에 의해 용해시키고, 9000×g에서 원심분리에 의해 정제한다. 용해물을 NiNTA 수지(MCLAB)와 함께 인큐베이션시키고, 이를 후속적으로 50 mM 인산칼륨 pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM 이미다졸의 5 칼럼 용적(CV)으로 세척한다. 결합된 단백질을 50 mM 인산칼륨 pH 8, 150 mM NaCl, 500 mM 이미다졸로 용리시킨다. SDS-PAGE 및 UV-vis 스펙트럼은 예상된 분자량뿐만 아니라 헴-로딩을 각각 확인할 수 있다.
일부 경우에, 형질전환된 세포를 10 g/ℓ의 글루코스 일수화물, 8 g/ℓ 인산일칼륨, 2.5 g/ℓ Sensient Amberferm 6400, 2.5　g/ℓ Sensient Tastone 154, 2 g/ℓ 인산이암모늄, 1 ㎖/ℓ 미량의 금속 혼합물(Teknova 1000×미량의 금속 혼합물 카탈로그 번호 T1001), 1 g/ℓ 황산마그네슘, 0.25 ㎖ 0.1 M 용액 염화제이철, 0.5 ㎖/ℓ Sigma 거품 방지 204, 1 ㎖/ℓ 황산카나마이신 1000×용액을 포함하는 종자 배지에서 성장시킨다. 4개의 1 ℓ 배플(baffled) 진탕 플라스크에 250 ㎖의 배지를 사용하고, 글리세롤 저장액 배양물의 단일 바이알로부터의 각각 0.25 ㎖로 접종한다. 진탕 플라스크를 37℃에서 250 RPM으로 교반하면서 5.5시간 동안 성장시킨다. 40 ℓ의 종자 배지를 100 ℓ 바이오리액터에서 증기 멸균시키고, 37℃까지 냉각시키고, 7.0까지 pH-조절하고 나서, 일단 2.5의 진탕 플라스크 OD가 달성되면 800 ㎖의 진탕 플라스크 배양물로 접종한다. 바이오리액터에 에어레이션(Aeration)을 40 ℓ/m로 공급하고, 250 RPM에서 교반한다. 2.2시간의 성장 후에 또는 2.2의 OD에 도달될 때, 22 ℓ의 배양물을 바이오리액터에 옮긴다. 최종 바이오리액터에 대한 시작 배지는 스팀 가동 중인(steamed-in-place) 다음의 구성성분으로 이루어진다: 1775 ℓ 탈이온수, 21.75 ㎏ 인산일칼륨, 2.175 ㎏ 인산이암모늄, 4.35 ㎏ 시트르산 제2철암모늄, 8.7 ㎏ 황산암모늄, 10.875 ㎏ Sensient Amberferm 6400 및 10.875 ㎏ Sensient Tastone 154. 30분의 스티밍 후에, 배지 구성성분을 37℃까지 냉각시키고, 멸균 후 첨가한다: 2.145 ℓ의 0.1 M 염화제이철 용액, 59.32 ㎏ 55% w/w 글루코스 일수화물, 3.9 ℓ의 미량의 금속 혼합물(Teknova 1000×미량의 금속 혼합물 카탈로그 번호 T1001), 10.88 ℓ의 200 g/ℓ 인산이암모늄, 36.14 ℓ 1 M 황산마그네슘, 및 2.175 ℓ Sigma 거품 방지 204, 2.175 ℓ 황산카나마이신 1000×용액. 30% 수산화암모늄의 첨가를 통해 pH를 7.0으로 조절한다. 2.175 ㎥/분으로 에어레이션을 공급하고, 교반을 60 내지 150 RPM로 변화시킴으로써 용존 산소를 25%에서 제어한다. 2개 시점에서, 추가 영양분의 볼루스 첨가물을 공급한다. 각 첨가물에 오토클레이빙 용액(Amberferm 및 Tastetone의 경우 100 g/ℓ 용액, 인산이암모늄의 경우 200 g/ℓ) 중 5.5 ㎏의 Sensient Amberferm 6400, 5.5 ㎏의 Sensient Tastone 154 및 4.4 ㎏의 인산이암모늄을 첨가한다. 55% w/w 글루코스 일수화물의 멸균 글루코스 용액을 2 내지 5 g/ℓ의 잔여 글루코스 수준을 유지하도록 바이오리액터에 공급한다. 일단 2.5의 OD에 도달되면, 온도를 25℃로 떨어뜨리고, 0.648 ℓ의 1 M 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드로 배양을 유도한다. 배양물을 탈이온수로 1:1 희석시키는 시점인 25시간의 총 시간 동안 배양물을 성장시키고, 이어서, 원심분리시키고, 농축물을 50% v/v 고체 함량으로 농축시킨다. 세포 농축물을 -20℃에서 냉동시킨다. 농축물을 4℃까지 해동시키고, 20 mM 인산칼륨 p 7.8, 00 mM NaCl, 0 mM 이미다졸에서 희석시키고, 15,000 PSI에서 균질화시킨다. 균질화된 세포를 접선 유동 여과(TFF)에 의해 0.2 ㎛ 여과시키고, 여과된 용해물을 아연-하전된 IMAC 칼럼(GE) 상에 직접 장입한다. 결합된 단백질을 20 mM 인산칼륨 pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM 히스티딘의 10 칼럼 용적(CV)으로 세척하고, 10 CV 500 mM 인산칼륨 일염기성, 100 mM NaCl로 용리시킨다. 용리된 레그헤모글로빈을 농축시키고, 3 kDa 분자량 컷오프 PES 막 및 TFF를 이용하여 정용여과시킨다. 농축된 샘플을 20 mM 디티온산나트륨으로 환원시키고, G-20 수지(GE)를 이용하여 탈염시킨다. 탈염된 레그헤모글로빈 샘플을 액체 질소에서 냉동시키고, -20℃에서 저장한다. 레그헤모글로빈 농도 및 순도를 SDS-PAGE 및 UV-vis 분석에 의해 결정한다.
헴을 갖는 미오글로빈의 클로닝, 발현 및 재구성의 비제한적 예는 문헌[Varadarajan et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5681-5684]을 포함한다. 이들 방법을 이용하여 헴-함유 폴리펩타이드를 대규모로 용이하게 제조할 수 있다.
사량체 헴-함유 폴리펩타이드
이콜라이에서의 발현 및 정제
이콜라이에서의 가용성 단백질 발현을 위해 플라스미드 벡터 pCold TFTM DNA(TaKaRa, Bio Inc, 일본 소재)를 사용한다. 닭 헤모글로빈 서브유닛 α 및 β를 공동 발현에 대해 기재한 바와 같이 발현 벡터에 클로닝한다(예를 들어, 문헌[Aniwised et al. (2013) Protein J 32:172-182]). 대안적으로, 서브유닛을 공동 발현시키는 작제물을 합성한다(Blue Heron Biotech, 미국 워싱턴주 보셀 소재).
37℃에서 5시간 동안 유도한 글로빈 유전자의 과발현은 봉입체를 형성하는 발현 단백질의 응집을 초래한다. 이를 피하기 위해, 글로빈 유전자의 과발현을 15℃에서 밤새 유도한다. 구체적으로는, 600 ㎚에서 광학 밀도가 0.4 내지 0.5까지 도달될 때까지 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 형질전환된 이콜라이 JM109 세포를 37℃에서 배양시킨다. 이어서, 15℃에서 밤새 1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가함으로써 발현을 유도한다. 100 ㎖ 배양물(대략 0.9 g)로부터의 세포를 6000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시킨다. 조질의 추출물을 제조하기 위해, 세포를 10 ㎖의 용해 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 이어서, 0.1 ㎎/㎖의 라이소자임을 조질의 추출물 용액에 첨가한 후에 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.
세포를 음파처리에 의해 붕괴시키고, 12,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리시킨다. 가용성 단백질을 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl로 평형상태로 만든 Co2+-하전 Talon 수지 칼럼(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재) 상에 장입한다. 동일한 완충제로 칼럼을 세척한 후에, 50 내지 500 mM의 이미다졸 용리액의 단계적 구배를 적용함으로써 단백질을 칼럼으로부터 용리시킨다. 쿠마씨 브릴리언트 블루 R250으로 염색함으로써 SDS-PAGE 겔 상의 단백질 밴드가 시각화된다.
300 mM 이미다졸을 첨가함으로써 표적 융합 단백질을 용리시키고, 4℃에서 밤새 10 mM Tris-HCl 완충제, pH 8.0으로 투석한다. 센트리콘(centricon) 필터(30,000 MW 컷 오프; Millipore Ireland, 아일랜드 코크 소재)를 이용하여 정제된 융합 단백질을 농축시킨다. 융합 단백질을 절단시키기 위해, 30단위의 HRV3C 프로테아제(Nacalai tesque, Inc. 일본 소재)를 사용한다. 모든 절단 반응을 4℃에서 밤새 수행하고, SDS-PAGE 및 천연-PAGE에 의해 추가로 분석한다. 이어서, 절단된 단백질 용액을 150 mM NaCl을 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)로 평형상태로 만든 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(Co2+-IMAC) 칼럼(10×40 ㎜, Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재) 상에 장입한다. 동일한 완충제로 칼럼을 세척한 후에, 단백질을 용리 완충제 중 0.3　M 이미다졸을 이용하여 2 ㎖ 분획에서 칼럼으로부터 용리시킨다. 용리된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 시각화된다.
피키아 파스토리스에서의 발현 및 정제(재조합 단백질의 분비)
피키아 파스토리스에 대한 발현 작제물: 효모에서의 재조합 단백질의 직접 분비를 위해 플라스미드 pPIC9K 벡터(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스베드 소재)를 사용한다. 효모 형질전환 및 단백질 발현을 위해 피키아 파스토리스 GS115 균주인 유전자형 his4(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스베드 소재)를 사용한다. 닭 헤모글로빈 서브유닛 α 및 β를 기재된 바와 같이(예를 들어, 문헌[Aniwised et al. (2013) Protein J 32:172-182]) 발현 벡터에 클로닝한다. 대안적으로, 서브유닛을 공동 발현시키는 작제물은 상업적 판매 회사(예를 들어, Blue Heron Biotech, 미국 워싱턴주 보셀 소재)를 통해 합성한다.
재조합 cHb(pPIC9K(His6x)-cHb)로서 표기되는 피키아 파스토리스/GS115 형질전환을 Invitrogen 프로토콜에 의해 기재된 방법에 따라 처리한다. 형질전환 전에, pPIC9K(His6x)-cHb 재조합 플라스미드를 이콜라이로부터 추출한다. 간단히 말해서, 이콜라이 세포를 37℃에서 밤새 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 40 ㎖의 LB에서 배양한다. 재조합 플라스미드를 알칼리성 추출 방법을 이용하여 추출하고, 제한 효소(예를 들어, SalI)로 선형화하고, 이어서, 제조업자의 지침(Invitrogen)에 따라 염화리튬 방법에 의해 피키아 파스토리스/GS115로 형질전환시킨다. 제조업자의 권고에 따라 30℃에서 2 내지 3일 동안 효모 세포를 최소 덱스트로스(MD) 배지에서 성장시킨다.
양성 다중 복제물 콜로니를 2 ㎖의 BMGY 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 40 mM(NH4)2SO4, 100 mM 인산칼륨, pH 6.0, 4×10-5% 바이오틴 및 1% 글리세롤)에서 배양시키고, 진탕 인큐베이터(160 rpm)를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 8000 rpm에서 5분 동안 주위 온도에서 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 1% 메탄올을 글리세롤 대신 배지에 첨가한 것을 제외하고 동일한 배지에서 재현탁시킨다. 균질화한 배양물을 1 ㎖의 새로운 BMMY 브로스에 옮긴다. 피키아 파스토리스에서 재조합 pPIC9K(His6x)-cHb의 발현 수준을 향상시키기 위해, 온도(25 및 30 ℃) 및 메탄올 농도(0.5, 1, 1.5 및 2%)를 최적화한다. 배양물을 72시간 동안 유지한다. 3일 후에, 배양물 배지를 12,000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집한다. 배양 배지 내 분비된 재조합 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 모니터링한다.
72시간의 배양 후에, 전체 배지를 12,000 rpm 및 4℃에서 20분 동안 원심분리에 의해 채취하고, 상청액을 농축시키고, 센트리콘 필터(Millipore Ireland, 아일랜드 코크 소재)를 이용하여 세척한다. 이어서, 조질의 단백질을 150 mM NaCl을 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)로 미리 평형 상태로 만든 친화도 크로마토그래피(Co2+-IMAC) 칼럼(10×40 ㎜, Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재) 상에 장입한다. 동일한 완충제로 칼럼을 세척한 후에, 결합된 단백질을 용리 완충제 중 0.5　M 이미다졸을 이용하여 2 ㎖ 분획에서 칼럼으로부터 용리시킨다. 용리된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
실시예 3: 정제된 헴-함유 폴리펩타이드에서 헴 그룹의 적절한 혼입을 결정하는 것
임의의 유기체(예를 들어, 이콜라이 또는 피키아 파스토리스)로부터 생성된 재조합 헴-함유 단백질을 프로토헴 IX의 헤모크로모겐의 557 ㎚에서의 α-피크의 분자 흡광계수(ε = 34.4 mM-1㎝-1)를 이용하는 피리딘 헤모크로모겐 방법(Oinuma et al., (2003) J Biol Chem 278:29600-29608)을 이용하여 헴 그룹의 적절한 혼입에 대해 분석한다. 간략히 말해서, 200 ㎕의 0.5 M NaOH를 500 ㎕의 정제된 단백질에 첨가하고, 이어서, 이 혼합물에 200 ㎕의 피리딘 및 5 ㎕의 0.1 M K3Fe(CN)6를 첨가한다. 이어서, 헴-함유 단백질에 10 ㎕의 0.5 M Na2S2O4를 첨가한다. Halo DB-20 UV-Vis 분광광도계(Dynamica Ltd., 호주 빅토리아주 소재)를 이용하여 340에서 700 ㎚까지 샘플의 흡수 스펙트럼을 모니터링한다. 글로빈의 ㏖당 헴의 ㏖로서 헴 함량을 기록하고, 비어-램버트 법칙(Beer-Lambert law)에서의 대체에 의해 헴의 몰 흡광계수를 계산한다. 더 나아가, 원자 흡수 불꽃 방출 분광광도계(PerkinElmer, Analyst 800, 미국)를 이용하여 재조합 α-글로빈의 철 함량을 측정한다. UV-VIS 실험에서 사용한 전형적인 단백질 농도는 8 내지 9 μM의 정제된 재조합 α-글로빈이다.
실시예 4: 헤모글로빈-의존성 박테리아의 예시적인 제조 과정
0.01 M NaOH 중에 물고기 헤모글로빈, 조류 헤모글로빈, 진균 헤모글로빈, 식물 헤모글로빈 또는 박테리아 헤모글로빈을 용해시킴으로써 헤모글로빈 용액을 제조한다. 오토클레이빙에 의해 용액을 멸균시킨다. 0.02 g/ℓ 또는 0.2 g/ℓ의 작업 농도를 사용한다. 미오글로빈 용액, 레그헤모글로빈 용액 또는 다른 헴-함유 폴리펩타이드 용액(예를 들어, 과산화효소, 사이토크롬 c)을 인산염 완충제 식염수, pH 7.4, 또는 0.01 M NaOH에서 유사하게 제조한다. 오토클레이빙에 의해 용액을 멸균시키고, 다양한 작업 농도(예를 들어, 0.02 g/ℓ, 0.05 g/ℓ, 0.1 g/ℓ, 0.2 g/ℓ 또는 0.5 g/ℓ)에서 성장 배지에 첨가한다.
헤모글로빈-의존성 박테리아, 예를 들어, 프레보텔라 히스티콜라의 예시적인 제조 과정이 본 명세서에서 제시된다. 본 예시적인 방법에서, 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 4에 열거된 성분을 포함하는 성장 배지에서 성장된다. 배지는 사용 전에 필터 멸균시킨다.
Figure pct00035
Figure pct00036
간략히 말해서, -80℃에서 저장되었던 세포 은행 샘플 1 ㎖를 1ℓ 보틀에 접종한다. 이러한 접종된 배양물을 이러한 균주의 호기성 조건에 대한 민감성으로 인해서 37℃, pH = 6.5에서 혐기성 챔버 내에서 인큐베이션시킨다. 보틀이 대수성장기에 도달하면(대략 14 내지 16시간 성장 후), 배양물을 사용하여 20 ℓ 생물반응기를 5% v/v로 접종한다. 대수성장기 동안(대략 10 내지 12시간 성장 후), 배양물을 사용하여 3500 ℓ 생물반응기를 0.5% v/v에서 접종한다.
25%의 CO2 및 75%의 N2의 조성을 갖는 혼합 기체를 0.02 VVM으로 첨가하면서 발효 배양물을 연속적으로 혼합한다. 수산화암모늄을 사용하여 pH를 6.5로 유지시키고, 온도를 37℃로 제어한다. 수거 시간은 정상기 도달(대략 12 내지 14시간 성장 후)에 기초한다.
일단 발효가 완료되면, 배양물을 10℃로 냉각시키고, 원심분리시키고, 얻어진 세포 페이스트를 수집한다. 세포 페이스트에 10% 안정제를 첨가하고, 철저하게 혼합한다(안정제 농도(슬러리 중): 1.5% 수크로스, 1.5% 덱스트란, 0.03% 시스테인).
사용할 수 있는 다른 성장 조건에 대해, 예를 들어, WO 2019/051381을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
Figure pct00037
성장 분석
각 성장 분석을 위해 4회의 복제를 수행한다. 각 배양물에 대해 냉동 세포 은행으로부터의 0.1% 접종물을 사용하였다. 박테리아를 위에서 기재한 바와 같은 표 5의 배지에서 성장시킨다. 48시간 동안 플레이트 판독기 상에서 30분마다 광학 밀도(OD600)를 측정하는 한편, 37℃에서 혐기성 환경에서 배양시킴으로써 박테리아 성장의 동력학을 측정한다.
실시예 5: 콩 레그헤그모글로빈의 단리 및 정제
N-말단의 His6 에피토프 태그 및 TEV 절단 부위를 갖는 글리신 맥스 레그헤모글로빈 C2(Uniprot KB P02236)를 암호화하는 핵산을 pJexpress401 벡터(DNA2.0)에 클로닝하고, 이콜라이 BL21로 형질전환시킨다. 카나마이신, 0.1 mM 염화제이철 및 10 ㎕/㎖ 5-아미노레불린산을 보충한 유가 배양 발효에 의해 형질전환된 세포를 성장시킨다. 0.3 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 발현을 유도하고, 세포를 30℃에서 24시간 동안 성장시킨다. 세포를 원심분리에 의해 농축시키고, 20 mM 인산칼륨 pH 7.8, 100 mM NaCl에서 재현탁시킨다. 세포를 고압 균질화에 의해 용해시키고, 원심분리 및 미세여과에 의해 정제한다. 아연-하전된 IMAC 세파로스 고속 유동 수지(GE Healthcare)를 이용하여 가용성 용해물로부터 레그헤모글로빈을 정제한다. 500 mM 인산칼륨 일염기성, 100 mM NaCl로 수지에서 결합된 레그헤모글로빈을 용리시킨다. 정제된 레그헤모글로빈을 중화시키고, 한외여과를 이용하여 농축시킨다. 농축된 레그헤모글로빈을 20 mM 아디티온산Na으로 환원시킨다. 아디티온산Na을 정용여과에 의해 제거한다. 레그헤모글로빈 농도를 soret 피크 흡광도에 의해 결정하고, 60 내지 70 ㎎/㎖로 조절한다. 최종 레그헤모글로빈 생성물을 액체 질소에서 냉동시키고, 동결건조시키고, -20℃에서 저장한다. 레그헤모글로빈의 순도(부분적 존재비)를 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 약 80%가 되는 것으로 결정한다. UV-VIS 스펙트럼(250 내지 700 ㎚)의 분석은 헴 로딩 레그헤모글로빈과 일치되는 스펙트럼 특징을 나타낸다.
글리신 맥스 레그헤모글로빈 C2 및 8개의 피키아 파스토리스 헴 생합성 유전자(표 7에 열거)를 pAOX1 메탄올 유도성 프로모터의 제어 하에 피키아 파스토리스 발현 벡터 pJA(BioGrammatics Inc.; 캘리포니아주 칼스베드 소재)에 클로닝한다. 피키아 파스토리스 균주 Bg11(BioGrammatics, Inc.)을 선형화된 플라스미드로 형질전환시키고, 항생제 내성에 의해 안정적인 구성 부분을 선택한다.
Figure pct00038
형질전환된 피키아 세포를 유가 배양식 발효에 의해 성장시키고, 레그헤모글로빈 발현을 120시간 동안 30℃에서 메탄올로 유도한다. 세포를 원심분리에 의해 농축시키고, 수 중에 재현탁시키고 나서, 고압 균질화에 의해 용해시킨다. Tramfloc 863A, 원심분리 및 0.2 마이크론 미세여과(Koch Membrane Systems)에 의한 처리로 고체를 제거한다. 가용성 용해물을 농축시키고, 3 kDa 한외여과(Spectrum Laboratories)를 이용하여 물로 정용여과시킨다. HPA25L 음이온 교환 수지(Mitsubishi)를 이용하여 제형화된 용해물을 약 40%의 최종 순도로 부분적으로 정제한다. 부분적으로 정제된 레그헤모글로빈 용액을 농축에 의해 재제형화하고, 3 kDa 한외여과(Spectrum Laboratories)를 이용하여 물로 정용영과하고, 추가로 Fast Flow 음이온 교환 수지(GE Lifesciences)를 이용하여 정제한다. 3 kD 한외여과를 이용하여 최종 레그헤모글로빈 생성물을 농축시키고, -20℃에서 냉동시킨다. 최종 생성물은 약 80% 순수하며, 80 g/ℓ 레그헤모글로빈을 함유한다.
미국 특허 제10,798,958호 참조.
실시예 6: 성장 배지에서 동물-공급 헤모글로빈의 대체물로서의 콩 레그헤모글로빈 시험
상업적인 식료품 잡화상으로부터 획득한 Impossible™ 고기의 샘플을 사용하여 표 7에 열거된 바와 같은 상이한 농도의 콩 레그헤모글로빈을 함유하는 용액을 생성하였다.
Figure pct00039
동물-공급 헤모글로빈 또는 스피루리나 저장액에 대해 사용한 농도와 유사한 농도를 달성하기 위해 증류수 중 Impossible™ 고기를 재현탁시키고 0.01 M NaOH를 첨가함으로써 IM1 및 IM2의 용액을 제조하였다. 재현탁 후에, 고체를 원심분리에 의해 용액으로부터 제거하였다. 물 또는 0.01 M NaOH 용액 중에 Impossible™ 고기를 재현탁시킨 후에 비등할 때까지 가열함으로써 용액 IM3 및 IM4를 제조하였다. 이어서, 거즈 필터를 통한 이중 여과에 의해 고체를 제거하였다. 고체 제거 후에 모든 용액을 오토클레이빙하고, 이어서, 3가지 농도 범위를 시험하기 위해 성장 배지에 첨가하였다: 20 ㎎/ℓ 최종 농도의 콩 레그헤모글로빈(이는 동물 공급된 헤모글로빈에 대해 현재 사용하는 농도임); 100 ㎎/ℓ 최종 농도의 콩 레그헤모글로빈; 및 200 ㎎/ℓ 최종 농도의 콩 레그헤모글로빈.
양성 대조군으로서, 1 g/ℓ 농도의 스피루리나 용액 또는 20 ㎎/ℓ 농도의 동물-공급된 헤모글로빈 용액을 첨가하였다. 임의의 다른 첨가물 없이 글루코스가 있는 SPY 배지(표 8)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
다음의 레시피의 성장 배지를 사용하였다:
Figure pct00040
모든 성장 배지에 대해 탄소 공급원으로서 5 g/ℓ의 글루코스를 사용하였다.
모두 4가지의 IM 용액(IM1-IM4)에 대해, 균주 A(프레보텔라 히스티콜라 균주 B 50329(NRRL 수탁번호 B 50329))의 성장은 동물-공급된 헤모글로빈 또는 스피룰리나와 함께 배양할 때와 유사한 수준으로 회복되었다(도 1).
보다 고농도의 콩 레그헤모글로빈은 균주 A(프레보텔라 히스티콜라 균주 B 50329(NRRL 수탁번호 B 50329))의 성장을 양성 대조군 이상으로 개선시키지 않았고, 보다 저농도의 콩 레그헤모글로빈과 유사한 결과를 나타내고(도 2), 이에 의해 20 ㎎/ℓ 농도가 성장을 지원하는 데 충분한 레그헤모글로빈을 제공한다는 것을 입증한다. 균주 A(프레보텔라 히스티콜라 균주 B 50329(NRRL 수탁번호 B 50329))에 대한 성장 지원과 일치되는 동물-공급된 헤모글로빈 및 스피루리나 용액을 제공하였다(도 2).
실시예 7: 상이한 미생물에서 동물 공급원 헤모글로빈을 대체하는 콩 레그헤모글로빈의 시험
콩 레그헤모글로빈이 헤모글로빈-의존성 미생물의 성장을 지원하는 데 충분할 것임을 확인하기 위해, Impossible™ 고기의 샘플을 구입하고, 이 샘플을 이용하여 콩 레그헤모글로빈-함유 용액을 제조하였다.
제조한 용액:
Figure pct00041
Impossible™ 고기가 2%의 콩 레그헤모글로빈(패키지 상태 2% 이하)을 함유한다는 추정에 기반하여 용액의 백분율을 계산하였다. 용액 중 콩 레그헤모글로빈의 실제 수준은 계산한 추정치와 같거나 더 적은 것으로 예상된다.
0.01 M NaOH 용액 중에 Impossible™ 고기를 재현탁시킴으로써 용액을 제조한 후에, 비등할 때까지 가열하고, 이어서, 거즈 필터를 통해 이중 여과시킴으로써 Impossible™ 고기 고체를 제거하였다. 최종 용액을 오토클레이빙하고, 이어서, 2가지 농도 범위를 시험하기 위해 성장 배지에 첨가하였다: 20 ㎎/ℓ의 콩 레그헤모글로빈(IM) 최종 농도; 및 200 ㎎/ℓ의 콩 레그헤모글로빈 최종 농도.
양성 대조군으로서, 동물(돼지) 공급된 헤모글로빈 용액을 20 ㎎/ℓ 농도에서 사용하였다. 임의의 다른 첨가물 없이 글루코스가 있는 SPY 염기를 음성 대조군으로서 사용하였다.
다음의 레시피에 따라, 실험을 위해 사용한 성장 배지는 SPY였다:
Figure pct00042
모든 배지 조성에 대해 탄소 공급원으로서 5 g/ℓ의 글루코스를 사용하였다. 글루코스를 첨가한 완전 배지는 도 3 내지 도 5에서 SPYG5로서 지칭한다.
48시간 동안 BioTek Epoch2 플레이트판독기에서 혐기성 조건 하에 성장 역학 시험을 수행하였다.
도 3의 성장 역학 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 임의의 첨가제가 없는 음성 대조군인 SPYG5 배지는 파라박테로이데스 균주의 성장을 지원할 수 없었다. IM 농도 둘 다에서, 파라박테로이데스 균주인 파라박테로이데스 균주 A의 성장은 동물 공급원 헤모글로빈과 유사한 수준으로 회복되었다. 보다 고농도의 IM은 심지어 동물 공급된 헤모글로빈을 갖는 성장 배지를 초과하였고, 따라서 콩 레그헤모글로빈이 이 미생물의 전체 성장을 지원하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3과 유사하게, 도 4의 성장 역학 그래프에서, 임의의 첨가제가 없는 음성 대조군인 SPYG5 배지는 박테로이데스 균주의 성장을 지원할 수 없었다. 본 명세서의 IM 농도 둘 다에서, 박테로이데스 균주인 박테로이데스 균주 B의 성장은 양성 대조군 - 동물 공급원 헤모글로빈의 수준과 유사한 수준까지 회복되었다. 이 미생물의 성장을 완전히 지원하기 위해 콩 레그헤모글로빈을 사용할 수 있다.
알리스티페스 균주인 알리스티페스 균주 C에 대한 도 5의 성장 역학 그래프에서, 음성 대조군, 즉, 임의의 첨가제가 없는 SPYG5 배지는 이 미생물의 성장을 지원할 수 없었다. IM 농도 둘 다에서, 알리스티페스 균주 C의 성장은 양성 대조군-동물 공급된 헤모글로빈의 수준과 동일한 수준까지 회복되었다.
참고문헌에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 공개 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 원용된 것으로 표시된 것처럼 그의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하는 본 출원으로 조절할 것이다.
균등론
당업자라면 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태와 많은 균등물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물을 하기 청구범위에 의해 포함하고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> EVELO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR CULTURING HEMOGLOBIN-DEPENDENT BACTERIA <130> ETB-04935 <140> <141> <150> PCT/US2020/062167 <151> 2020-11-25 <150> 63/008,233 <151> 2020-04-10 <150> 62/941,076 <151> 2019-11-27 <160> 115 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Vigna radiata <400> 1 Met Thr Thr Thr Leu Glu Arg Gly Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu 1 5 10 15 Val Val Lys Ser Trp Asn Val Met Lys Lys Asn Ser Gly Glu Leu Gly 20 25 30 Leu Lys Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Ser Thr Val Pro Leu Glu Gln Asn Pro 50 55 60 Lys Leu Lys Pro His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Asp Ser 65 70 75 80 Ala Val Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Val Thr Val Arg Glu Ser Asn 85 90 95 Leu Lys Lys Leu Gly Ala Thr His Phe Arg Thr Gly Val Ala Asn Glu 100 105 110 His Phe Glu Val Thr Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala 115 120 125 Val Pro Glu Met Trp Ser Pro Ala Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala 130 135 140 Tyr Asp Gln Leu Val Asp Ala Ile Lys Tyr Glu Met Lys Pro Pro Ser 145 150 155 160 Ser <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Methylacidiphilum infernorum sequence <400> 2 Met Ile Asp Gln Lys Glu Lys Glu Leu Ile Lys Glu Ser Trp Lys Arg 1 5 10 15 Ile Glu Pro Asn Lys Asn Glu Ile Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Asn Leu 20 25 30 Phe Lys Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Leu Phe Gln Asn Pro Ile Ser 35 40 45 Ser Gln Ser Arg Lys Leu Met Gln Val Leu Gly Ile Leu Val Gln Gly 50 55 60 Ile Asp Asn Leu Glu Gly Leu Ile Pro Thr Leu Gln Asp Leu Gly Arg 65 70 75 80 Arg His Lys Gln Tyr Gly Val Val Asp Ser His Tyr Pro Leu Val Gly 85 90 95 Asp Cys Leu Leu Lys Ser Ile Gln Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Phe Thr 100 105 110 Glu Glu Ala Lys Ala Ala Trp Thr Lys Val Tyr Gly Ile Ala Ala Gln 115 120 125 Val Met Thr Ala Glu 130 <210> 3 <211> 139 <212> PRT <213> Aquifex sp. <400> 3 Met Leu Ser Glu Glu Thr Ile Arg Val Ile Lys Ser Thr Val Pro Leu 1 5 10 15 Leu Lys Glu His Gly 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Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys 100 105 110 Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser 115 120 125 Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala 130 135 140 Phe 145 <210> 5 <211> 162 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 5 Met Ser Ala Ala Glu Gly Ala Val Val Phe Ser Glu Glu Lys Glu Ala 1 5 10 15 Leu Val Leu Lys Ser Trp Ala Ile Met Lys Lys Asp Ser Ala Asn Leu 20 25 30 Gly Leu Arg Phe Phe Leu Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Arg 35 40 45 Gln Met Phe Pro Phe Leu Arg Asp Ser Asp Val Pro Leu Glu Thr Asn 50 55 60 Pro Lys Leu Lys Thr His Ala Val Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Lys Ile Thr Val Arg Glu Thr 85 90 95 Thr Leu Lys Arg Leu Gly Gly Thr His Leu Lys Tyr Gly Val Ala Asp 100 105 110 Gly His Phe Glu Val Thr Arg Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu 115 120 125 Ala Leu Pro Ala Asp Met Trp Gly Pro Glu Met Arg Asn Ala Trp Gly 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20 25 30 Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn 85 90 95 Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile 100 105 110 Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala 115 120 125 Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala 130 135 140 Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly 145 150 <210> 20 <211> 154 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 20 Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Val Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg 20 25 30 Leu Phe Lys Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys 35 40 45 His Leu Lys Ser Glu Asp Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys 50 55 60 His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys 65 70 75 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125 Gln Gly Ala Met Thr Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Ile Ala 130 135 140 Ala Lys Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly 145 150 <210> 22 <211> 152 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 22 Met Ser Ser Phe Thr Glu Glu Gln Glu Ala Leu Val Leu Lys Ser Trp 1 5 10 15 Asp Ser Met Lys Lys Asn Ala Gly Glu Trp Gly Leu Lys Leu Phe Leu 20 25 30 Lys Ile Phe Glu Ile Ala Pro Ser Ala Lys Lys Leu Phe Ser Phe Leu 35 40 45 Lys Asp Ser Asn Val Pro Leu Glu Gln Asn Ala Lys Leu Lys Pro His 50 55 60 Ala Lys Ser Val Phe Val Met Thr Cys Glu Ala Ala Val Gln Leu Arg 65 70 75 80 Lys Ala Gly Lys Val Val Val Arg Asp Ser Thr Leu Lys Lys Leu Gly 85 90 95 Ala Ala His Phe Lys Tyr Gly Val Ala Asp Glu His Phe Glu Val Thr 100 105 110 Lys Phe Ala Leu Leu Glu Thr Ile Lys Glu Ala Val Pro Asp Met Trp 115 120 125 Ser Val Asp Met Lys Asn Ala Trp Gly Glu Ala Phe Asp Gln Leu Val 130 135 140 Asn Gly Ile Lys Thr Glu Met Lys 145 150 <210> 23 <211> 132 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 23 Met Gly Gln Ser Phe Asn Ala Pro Tyr Glu Ala 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Ala 20 25 30 Pro Val Phe Ala Gly Thr Asp Met Val Lys Gln Arg Asn His Leu Val 35 40 45 Ala Phe Leu Ala Gln Ile Phe Glu Gly Pro Lys Gln Tyr Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Met Asp Lys Thr His Ala Gly Leu Asn Leu Gln Gln Pro His Phe 65 70 75 80 Asp Ala Ile Ala Lys His Leu Gly Glu Arg Met Ala Val Arg Gly Val 85 90 95 Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Ala Leu Asp Arg Val Thr Asn Met Lys 100 105 110 Gly Ala Ile Leu Asn Lys 115 <210> 28 <211> 136 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 28 Met Arg Glu Lys Ile His Ser Pro Tyr Glu Leu Leu Gly Gly Glu His 1 5 10 15 Thr Ile Ser Lys Leu Val Asp Ala Phe Tyr Thr Arg Val Gly Gln His 20 25 30 Pro Glu Leu Ala Pro Ile Phe Pro Asp Asn Leu Thr Glu Thr Ala Arg 35 40 45 Lys Gln Lys Gln Phe Leu Thr Gln Tyr Leu Gly Gly Pro Ser Leu Tyr 50 55 60 Thr Glu Glu His Gly His Pro Met Leu Arg Ala Arg His Leu Pro Phe 65 70 75 80 Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ala Lys Ala Trp Leu Thr Cys Met His Glu 85 90 95 Ala Met Asp Glu Ile Asn Leu Glu Gly Pro Glu Arg Asp Glu Leu Tyr 100 105 110 His 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ttctggggca agattaaagg aaaggcagat 120 gtcgtcggcg ctgaggcttt gggaaggatg ctgactgctt acccccagac taagacctac 180 ttctcccact gggctgacct gagccccggc tctgccccag tcaagaagca tggaggcgtc 240 atcatgggtg caattggtaa tgctgtcgga ctgatggacg acctcgtggg gggaatgagt 300 ggtctcagcg atctgcacgc cttcaagctg cgcgttgacc ctggaaactt caagattctg 360 tcccacaaca tccttgtcac cctggctatt cacttccctg cggatttcac tcccgaagtg 420 cacattgctg tggataaatt ccttgcagcc ttgtccgctg ccctggctga caaatacaga 480 taagaccatc atgaagtcca aaattggact ccagttcctg ctctgttgtt atcacaaaat 540 aaacaggcaa tgaatg 556 <210> 31 <211> 147 <212> PRT <213> Salmo salar <400> 31 Met Val Asp Trp Thr Asp Ala Glu Lys Ser Thr Ile Ser Ala Val Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asp Ile Asn Glu Val Gly Pro Leu Ala Leu Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Tyr Phe Gly Ser Phe Gly Asp 35 40 45 Val Ser Thr Pro Ala Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Ala Ala His 50 55 60 Gly Lys Val Val Cys Gly Ala Leu Asp Lys Ala Val Lys Asn Met Gly 65 70 75 80 Asn Ile Leu Ala Thr Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Thr His Ala Asn Lys 85 90 95 Leu Phe Val Asp Pro Asp Asn Phe Arg Val Leu Ala Asp Val Leu Thr 100 105 110 Ile Val Val Ala Ala Lys Phe Gly Ala Ser Phe Thr Pro Glu Ile Gln 115 120 125 Ala Thr Trp Gln Lys Phe Met Lys Val Val Val Ala Ala Met Gly Ser 130 135 140 Arg Tyr Phe 145 <210> 32 <211> 545 <212> DNA <213> Salmo salar <400> 32 tttaatcttg ttgcaaaacc ggagatcaaa cactgacaac atggttgact ggacagacgc 60 cgagaagagc accatcagtg ctgtctgggg aaaagtagat atcaatgagg tcggaccact 120 ggctctggca agagtcctga tcgtctaccc ctggactcag cgttatttcg gctctttcgg 180 agatgtgtct actcccgcag caatcatggg caaccccaaa gttgctgctc acggcaaggt 240 cgtgtgtgga gctctggata aagctgtgaa gaacatgggc aacatcttgg ccacatacaa 300 gtcactgagc gagacacacg ccaacaaact cttcgtcgac cctgacaatt tcagggtgtt 360 ggctgacgtc ctcacaattg tcgttgccgc caagttcgga gcctctttca ctcctgaaat 420 ccaggcaacc tggcagaagt tcatgaaagt ggttgtcgca gccatgggca gccggtactt 480 ctaaatgcac acgagacaag tgattatgtt ctgacatccc tgcctgagtg aaaataaaga 540 cgttg 545 <210> 33 <211> 143 <212> PRT <213> Cyprinus carpio <400> 33 Met Ser Leu Ser Asp Lys Asp Lys Ala Ala Val Lys Ala Leu Trp Ala 1 5 10 15 Lys Ile Ser Pro Lys Ala Asp Asp Ile Gly Ala Glu Ala Leu Gly Arg 20 25 30 Met Leu Thr Val Tyr Pro Gln Thr Lys Thr Tyr Phe Ala His Trp Ala 35 40 45 Asp Leu Ser Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Lys His Gly Lys Val Ile 50 55 60 Met Gly Ala Val Gly Asp Ala Val Ser Lys Ile Asp Asp Leu Val Gly 65 70 75 80 Gly Leu Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Ala Phe Lys Leu Arg Val Asp 85 90 95 Pro Ala Asn Phe Lys Ile Leu Ala His Asn Val Ile Val Val Ile Gly 100 105 110 Met Leu Tyr Pro Gly Asp Phe Pro Pro Glu Val His Met Ser Val Asp 115 120 125 Lys Phe Phe Gln Asn Leu Ala Leu Ala Leu Ser Glu Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 34 <211> 600 <212> DNA <213> Cyprinus carpio <400> 34 aaaatcctct tttcgccaac atctttttct gaagacaatc taacttgaga aaaagaagac 60 gcagcaatga gtctctctga taaggacaag gctgctgtga aagccctatg ggctaagatc 120 agccccaaag ccgatgatat cggcgctgaa gctctcggca gaatgctgac cgtctaccct 180 cagaccaaga cctacttcgc tcactgggct gacctgagcc ctgggtccgg tcctgtgaag 240 aagcatggca aggttatcat gggtgcagtc ggcgatgccg tttcaaaaat agacgacctt 300 gtgggaggtc tggctgccct gagcgaactt catgctttca agctgcgtgt tgacccggcc 360 aacttcaaga tcctcgcaca caatgtcatc gtggtcatcg gcatgctcta ccctggagac 420 ttccccccag aggttcacat gtcagttgac aagtttttcc agaacttggc tctggctctc 480 tctgagaagt accgctaaat ttccggtggg cattcatacg cgacactgtg cggcactcct 540 gaccaactca agtgtgatgt ctgaataaaa tttctcaata aaaggcagag aattaaatga 600 <210> 35 <211> 148 <212> PRT <213> Cyprinus carpio <400> 35 Met Val Glu Trp Thr Asp Ala Glu Arg Ser Ala Ile Ile Gly Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Leu Asn Pro Asp Glu Leu Gly Pro Gln Ala Leu Ala Arg Cys 20 25 30 Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Tyr Phe Ala Ser Phe Gly Asn 35 40 45 Leu Ser Ser Pro Ala Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Ala Ala His 50 55 60 Gly Arg Thr Val Met Gly Gly Leu Glu Arg Ala Ile Lys Asn Met Asp 65 70 75 80 Asn Ile Lys Ala Thr Tyr Ala Pro Leu Ser Val Met His Ser Glu Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro 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ataaaatatt gttaaaagca 630 <210> 37 <211> 142 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 37 Met Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Asn Asn Val Lys Gly Ile Phe Thr 1 5 10 15 Lys Ile Ala Gly His Ala Glu Glu Tyr Gly Ala Glu Thr Leu Glu Arg 20 25 30 Met Phe Ile Thr Tyr Pro Pro Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp 35 40 45 Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Ile Lys Gly His Gly Lys Lys Val Val 50 55 60 Ala Ala Leu Ile Glu Ala Val Asn His Ile Asp Asp Ile Ala Gly Thr 65 70 75 80 Leu Ser Lys Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro 85 90 95 Val Asn Phe Lys Leu Leu Gly Gln Cys Phe Leu Val Val Val Ala Ile 100 105 110 His His Pro Ala Ala Leu Thr Pro Glu Val His Ala Ser Leu Asp Lys 115 120 125 Phe Leu Cys Ala Val Gly Thr Val Leu Thr Ala Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 38 <211> 579 <212> DNA <213> Meleagris gallopavo <400> 38 agcagactgc aggggcaccc gtgctggggg ctgccaacgc ggaggtgcaa ccatggtgct 60 gtccgctgct gacaagaaca acgtcaaggg catcttcacc aaaatcgccg gccatgctga 120 ggagtatggc gccgagaccc tggagaggat gttcatcacc taccccccga ccaagaccta 180 cttcccccac tttgatctgt cacacggctc cgctcagatc aaggggcacg gcaagaaggt 240 agtggctgcc ctgatcgagg ctgtcaacca cattgatgac atcgcaggca ccctctccaa 300 gctcagcgac ctccatgccc acaagctccg cgtggaccct gtcaacttca aactcctggg 360 ccaatgcttc ctggtggtgg tggccatcca ccaccctgct gccctgaccc cagaggtcca 420 tgcttccctg gacaagttct tgtgcgctgt gggcaccgtg ctgactgcca agtaccgtta 480 agacagcatg gcagctagag ctggggccaa cccatcgcca gccttccaac agcgagcagc 540 caaatgagat gaaataaaat ctgttgcatt tgtgctcca 579 <210> 39 <211> 147 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 39 Met Val His Trp Ser Ala Glu Glu Lys Gln Leu Ile Thr Gly Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Ala Asp Cys Gly Ala Glu Ala Leu Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Ala Ser Phe Gly Asn 35 40 45 Leu Ser Ser Pro Thr Ala Ile Leu Gly Asn Pro Met Val Arg Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Phe Gly Asp Ala Val Lys Asn Leu Asp 65 70 75 80 Asn Ile Lys Asn Thr Phe Ser Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asp Ile Leu Ile 100 105 110 Ile Val Leu Ala Ala His Phe Ser Lys Asp Phe Thr Pro Glu Cys Gln 115 120 125 Ala Ala Trp Gln Lys Leu Val Arg Val Val Ala His Ala Leu Ala Arg 130 135 140 Lys Tyr His 145 <210> 40 <211> 644 <212> DNA <213> Meleagris gallopavo <400> 40 acggccgctc accagcgtgc gatccccgcg ggagcaagag cccagacctc ctccgtaccg 60 acagccacac gctaccctcc aaccgccgcc atggtgcact ggtctgctga ggagaagcag 120 ctcatcaccg gcctctgggg caaggtcaat gtggccgact gcggggccga agccctggcc 180 aggctgctga ttgtctaccc ctggacccag aggttctttg cgtcctttgg gaacctctcc 240 agccccaccg ccatccttgg caaccccatg gtccgtgccc atggcaagaa agtgctcacc 300 tcctttgggg atgctgtgaa gaacctggac aacatcaaga acaccttctc ccaactgtcc 360 gagctgcact gtgacaagct gcatgtggac cccgagaact tcaggctcct gggtgacatc 420 ctcatcatcg tcctggccgc ccacttcagc aaggacttca ctcctgaatg ccaggctgcc 480 tggcagaagc tggtccgtgt ggtggcccat gccctggctc gcaagtacca ctaagcacca 540 gcagcaaaga tcccggagcg ccctacagca attgtatgca cctgcagaaa 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cacctacccc ccaaccaaga cctacttccc ccacttcgat ctgtcacacg 180 gctccgctca gatcaagggg cacggcaaga aggtagtggc tgccttgatc gaggctgcca 240 accacattga tgacatcgcc ggcaccctct ccaagctcag cgacctccat gcccacaagc 300 tccgcgtgga ccctgtcaac ttcaaactcc tgggccaatg cttcctggtg gtggtggcca 360 tccaccaccc tgctgccctg accccggagg tccatgcttc cctggacaag ttcttgtgcg 420 ccgtgggcac tgtgctgacc gccaagtacc gttaagacgg cacggtggct agagctgggg 480 ccaacccatc gccagccctc cgacagcgag cagccaaatg agatgaaata aaatctgttg 540 catttgtgct ccag 554 <210> 43 <211> 147 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 43 Met Val His Trp Thr Ala Glu Glu Lys Gln Leu Ile Thr Gly Leu Trp 1 5 10 15 Gly Lys Val Asn Val Ala Glu Cys Gly Ala Glu Ala Leu Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Ile Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Ala Ser Phe Gly Asn 35 40 45 Leu Ser Ser Pro Thr Ala Ile Leu Gly Asn Pro Met Val Arg Ala His 50 55 60 Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Phe Gly Asp Ala Val Lys Asn Leu Asp 65 70 75 80 Asn Ile Lys Asn Thr Phe Ser Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys 85 90 95 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Claims (56)

  1. 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하되, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는:
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류(avian) 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 헤모글로빈인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 헤모글로빈은 공생 헤모글로빈, 비-공생 헤모글로빈 및/또는 절단된 헤모글로빈인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 레그헤모글로빈(leghemoglobin)인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 미오글로빈인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 물고기 폴리펩타이드인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 어류는 초어(Ctenopharyngodon), 멸치(Engraulis), 큰머리잉어(Hypophthalmichthys), 잉어(Cyprinus), 명태(Theragra), 오레오크로미스(Oreochromis), 대두어(Hypophthalmichthys nobilis), 가다랑어(Katsuwonus), 카틀라(Catla), 붕어(Carassius), 살모(Salmo), 청어(Clupea), 고등어(Scomber), 라베오(Labeo), 트리키우루스(Trichiurus), 가두스(Gadus), 사르디나(Sardina), 말로투스(Mallotus), 카노스(Chanos), 고등어, 연어(Oncorhynchus), 청어, 프로캄바루스(Procambarus), 브레보오르티아(Brevoortia), 밴댕이(Sardinella), 강청어(Mylopharyngodon), 가물치(Channa), 대구(Gadus), 꽁치(Cololabis), 전갱이(Trachurus), 농어(Larimichthys), 멜라노그람무스(Melanogrammus), 메기(Silurus), 스프라투스(Sprattus), 시리누스(Cirrhinus), 이크타룰루스(Ictalurus), 마이크로메시스티우스(Micromesistius), 테누알로사(Tenualosa), 갯장어(Muraenesox), 정어리(Sardinops), 세텐그라울리스(Cetengraulis), 폴라키우스, 점다랑어(Euthynnus), 줄무늬고등어(Rastrelliger), 드렁허리(Monopterus), 민대구(Merluccius), 줄무늬고등어, 미꾸리(Misgurnus), 쏘가리(Siniperca), 선농어(Lates), 정어리, 물천구(Harpadon), 삼치(Scomberomorus), 에트말로사(Ethmalosa), 오레오크로미스, 브레보오르티아, 오피스토네마(Opisthonema), 새가라지(Selar), 셀라로이데스(Selaroides) 또는 까나리(Ammodytes) 속인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 물고기 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된, 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 조류 폴리펩타이드인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 새는 갈루스(Gallus), 멜레아그리스(Meleagris), 오리(Anas), 기러기(Anser), 흑기러기(Branta), 흰기러기(Chen), 아겔라스테스(Agelastes), 누미다(Numida), 구테라(Guttera), 아크릴리움(Acryllium) 또는 콜럼바(Columba) 속인, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 조류 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된, 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-동물-유래 폴리펩타이드는 식물(예를 들어, 콩), 박테리아, 사이아노박테리아, 진균, 조류(algae), 곡물, 협과 및/또는 원생동물로부터 정제된, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비-동물-유래 폴리펩타이드는 아라비돕시스(Arabidopsis), 니코티아나(Nicotiana), 아시도보락스(Acidovorax), 아퀴펙스(Aquifex), 써모필러스(Thermophilus), 바실러스, 에스케리키아(Escherichia), 브레비바실러스(Brevibacillus), 코리네박테륨(Corynebacterium), 프리고리박테륨(Frigoribacterium), 메틸아시디필룸(Methylacidiphilum), 리조븀(Rhizobium), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 노스톡(Nostoc), 푸사리움(Fusarium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 트리코더마(Trichoderma), 마이셀리오프테라(Myceliopthera), 클루이베라(Kluyvera), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 오리자(Oryza), 마그나포르테(Magnaporthe), 제아(Zea), 호르데움(Hordeum), 글리신(Glycine), 시세르(Cicer), 파세올루스(Phaseolus), 루피누스(Lupinus), 메디카고(Medicago), 브라시카(Brassica), 트리티쿰(Triticum), 고시피움(Gossypium), 지자니아(Zizania), 헬리안투스(Helianthus), 베타(Beta), 페니세툼(Pennisetum), 케노포디움(Chenopodium), 세사뭄(Sesamum), 리눔(Linum), 비냐(Vigna), 리시너스(Ricinus), 피섬(Pisum), 테트라하이메나(Tetrahymena) 또는 파라메시움(Paramecium) 속의 유기체로부터 정제된, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 비-동물-유래 폴리펩타이드는 상기 글리신(Glycine) 속의 유기체로부터 정제된, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-동물-유래 폴리펩타이드는 콩 레그헤모글로빈인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 콩 레그헤모글로빈은 콩 뿌리 또는 콩 뿌리혹으로부터 정제된, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 콩 레그헤모글로빈은 재조합적으로 발현된, 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-동물-유래 폴리펩타이드는 재조합적으로 발현된, 방법.
  19. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 114 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제5항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 서열번호 114 또는 UniProtKB - P02236(LGB2_SOYBN)의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제8항, 제11항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합적으로 발현된 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩타이드는 히스티딘 태그, TAP(탠덤 친화도 정제) 태그, TEV 절단 부위, FLAG 태그, GST 태그 및/또는 면역글로불린 도메인을 포함하는, 방법.
  29. 제8항, 제11항, 제17항, 제18항, 제27항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 외인성 핵산으로부터 발현되고 정제된, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 벡터에 있는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포주인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris)인, 방법.
  34. 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는 피키아 파스토리스에서 재조합적으로 발현된 콩 레그헤모글로빈인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 악티노마이세스(Actinomyces), 알리스티페스(Alistipes), 아나에로부티리쿰(Anaerobutyricum), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 클로아시바실러스(Cloacibacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 콜린셀라(Collinsella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에이센베르기엘라(Eisenbergiella), 에리시펠로트리카세애(Erysipelotrichaceae), 유박테리움(Eubacterium)/모기박테리움(Mogibacterium), 파칼리박테리움(Faecalibacterium), 푸르니에렐라(Fournierella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 메가스파에라(Megasphaera), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 펩토니필러스(Peptoniphilus), 펩토스트렙토코커스, 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 라리마이크로비움(Rarimicrobium), 셔틀워티아(Shuttleworthia), 투리시박터(Turicibacter) 또는 베일로넬라(Veillonella) 속의 박테리아인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 속인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 알벤시스(Prevotella albensis), 프레보텔라 암니(Prevotella amnii), 프레보텔라 베르겐시스(Prevotella bergensis), 프레보텔라 비비아(Prevotella bivia), 프레보텔라 브레비스(Prevotella brevis), 프레보텔라 브리안티(Prevotella bryantii), 프레보텔라 부카에(Prevotella buccae), 프레보텔라 부칼리스(Prevotella buccalis), 프레보텔라 콥리(Prevotella copri), 프레보텔라 덴탈리스(Prevotella dentalis), 프레보텔라 덴티콜라(Prevotella denticola), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens), 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 프레보텔라 마쿨로사(Prevotella maculosa), 프레보텔라 마르쉬(Prevotella marshii), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 미칸스(Prevotella micans), 프레보텔라 멀티포르미스(Prevotella multiformis), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 프레보텔라 오랄리스(Prevotella oralis), 프레보텔라 오리스(Prevotella oris), 프레보텔라 오울로럼(Prevotella oulorum), 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens), 프레보텔라 살리바에(Prevotella salivae), 프레보텔라 스테르코레아(Prevotella stercorea), 프레보텔라 탄네라에(Prevotella tannerae), 프레보텔라 티모넨시스(Prevotella timonensis), 프레보텔라 제주니(Prevotella jejuni), 프레보텔라 아우란티아카(Prevotella aurantiaca), 프레보텔라 바로니아에(Prevotella baroniae), 프레보텔라 콜로란스(Prevotella colorans), 프레보텔라 코르포리스(Prevotella corporis), 프레보텔라 덴타시니(Prevotella dentasini), 프레보텔라 에노에카(Prevotella enoeca), 프레보텔라 팔세니(Prevotella falsenii), 프레보텔라 푸스카(Prevotella fusca), 프레보텔라 헤파리놀리티카(Prevotella heparinolytica), 프레보텔라 로에스케이(Prevotella loescheii), 프레보텔라 멀티사카리보락스(Prevotella multisaccharivorax), 프레보텔라 난세이엔시스(Prevotella nanceiensis), 프레보텔라 오리자에(Prevotella oryzae), 프레보텔라 팔루디비벤스(Prevotella paludivivens), 프레보텔라 플레우리티디스(Prevotella pleuritidis), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 프레보텔라 사카로리티카(Prevotella saccharolytica), 프레보텔라 스코포스(Prevotella scopos), 프레보텔라 샤히(Prevotella shahii), 프레보텔라 주글레오포르만스(Prevotella zoogleoformans) 또는 프레보텔라 베로랄리스(Prevotella veroralis)인, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 프레보텔라는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는, 방법.
  40. 제36에 있어서, 상기 프레보텔라는 프레보텔라 균주 B 50329(NRRL 수탁 번호 B 50329)인, 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 프레보텔라는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 게놈, 16S 및/또는 CRISPR 서열 동일성을 포함하는, 방법.
  42. 제36항에 있어서, 상기 프레보텔라는 프레보텔라 균주 C(PTA-126140)인, 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 1에 열거된 하나 이상의 단백질을 포함하는 프레보텔라 박테리아의 균주인, 방법.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는 표 2에 열거된 단백질이 실질적으로 없는 프레보텔라 균주로부터 유래된, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 속도에 비해서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 증가된 속도로 성장하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아는, 상기 헴-함유 폴리펩타이드가 없다는 것을 제외하고 동일한 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아가 성장하는 세포 밀도에 비해서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에서 더 높은 세포 밀도로 성장하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 1% 초과의 CO2를 포함하는 혐기성 분위기 하에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 배지는 적어도 0.001 g/ℓ의 상기 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
  49. 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, (a) 헴-함유 폴리펩타이드 및 헤모글로빈-의존성 박테리아를 성장 배지에 첨가하는 단계; 및 (b) 상기 성장 배지에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하되, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는:
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 방법.
  50. 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지에 헤모글로빈-의존성 박테리아를 포함하는 바이오리액터로서, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는:
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인 바이오리액터.
  51. 바이오리액터에서 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 방법으로서, 제50항의 바이오리액터에서 상기 헤모글로빈-의존성 박테리아를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 바이오리액터는 약 1 ℓ, 약 20 ℓ, 약 3,500 ℓ, 또는 약 20,000 ℓ 바이오리액터인, 방법.
  53. 조성물로서,
    a) 헤모글로빈-의존성 박테리아, 및
    b) 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하는 성장 배지
    를 포함하되, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 조성물.
  54. 헤모글로빈-의존성 박테리아를 배양시키는 데 사용하기 위한 성장 배지로서, 헴-함유 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는:
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 성장 배지.
  55. 헤모글로빈-의존성 박테리아의 성장을 용이하게 하기 위해 성장 배지에서 보충물로서 사용하기 위한 헴-함유 폴리펩타이드로서,
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 헴-함유 폴리펩타이드.
  56. 박테리아 조성물로서,
    (a) 헤모글로빈-의존성 박테리아, 및
    (b) 헴-함유 폴리펩타이드
    를 포함하되, 상기 헴-함유 폴리펩타이드는:
    (i) 물고기 폴리펩타이드;
    (ii) 조류 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 비-동물-유래 폴리펩타이드
    인, 박테리아 조성물.
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