KR20220121844A - 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20220121844A
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저스틴 안토니 셀바라즈
프리드리히 멧츠거
에르베 샤프하우저
페트라 힐만-뷜너
Original Assignee
베르사멥 아게
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Abstract

본 발명은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물의 조성물에 관한 것이다. 또한 질환 또는 병태를 치료하고 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는데 있어서 조성물의 용도가 본원에 개시되어 있다.

Description

유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 23일자로 출원된 유럽 특허원 제EP19219276.3호 및 2020년 6월 23일자로 출원된 미국 가특허원 제63/042,890호의 이익을 청구하며, 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 양식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다. 2020년 12월 18일자로 생성된, 상기 ASCII 카피(copy)는 57623_701_601_SL.txt로 명명되고 크기는 326,570 바이트이다.
다수의 사람 질환 및 장애는 질환 또는 장애없이 사람에서 이러한 단백질의 발현 수준과 비교하여 특정 단백질의 보다 높고/높거나 보다 낮은 발현 수준의 조합에 의해 유발된다.
표적 단백질의 발현 및/또는 분비를 증가시키고 다른, 상이한 표적 단백질의 발현을 감소시키기 위한 조합 치료요법(combinatorial therapy)은 치료학적 효과를 가질 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 표적 유전자 생성물의 생산을 효과적으로 및 특이적으로 감소시키고 다른 것의 생산을 동시에 증가시키는, 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 의한 감염으로 유발된 질환인, 코로나바이러스 감염, 예컨대, COVID-19에 대한 치료요법이 요구된다.
요약
본 발명은 하나의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물(construct)을 동시 사용하여 2개 이상의 단백질 또는 핵산 서열의 발현을 조절하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 특정 표적 및 과발현을 위한 단일 또는 다수 단백질을 암호화(encoding)하는 핵산 서열에 결합할 수 있는 단일 또는 다수의 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 암호화하는 핵산 서열을 제공함으로써 2개 이상의 단백질 또는 핵산 서열의 발현을 동시에 상향조절(upregulating) 및 하향조절(downregulating)한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 질환 및 장애를 치료하는데 유용하며 여기서 특정의 생리학적 메카니즘(예컨대, 이화작용)은 siRNA에 의해 제어될 수 있지만 다른 생리학적 메카니즘은 치료학적 단백질의 동시 과발현에 의해 활성화될 수 있다(예컨대, 동화작용).
본 발명은 또한 하나 이상의 코로나바이러스 표적 RNA 및/또는 숙주 단백질, 예컨대, 바이러스 도입 성분(viral entry element) 또는 전염증성 사이토킨을 암호화하는 하나 이상의 RNA에 결합할 수 있는 하나 이상의 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 과발현(overexpression)을 위한 하나 이상의 단백질, 예컨대, 숙주 소염성 사이토킨 또는 데코이 단백질(decoy protein), 예컨대, 가용성 안지오텐신 전환 효소-2 (Angiotensin Converting Enzyme-2; ACE2)를 암호화하는 핵산 서열을 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 또는 RNA를 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 하나 이상의 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA, 또는 비암호화(noncoding) RNA이다. 따라서, 본 발명은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자가 바이러스 억제하고 숙주 염증성 반응 조절 둘 다를 수행하는 구현예를 제공한다.
일부 양태에서, (i) 표적 RNA(예컨대, mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다.
일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함된다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (i)과 (ii)를 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 적어도 6개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 80개 핵산 잔기 이하이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 80개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 15개의 핵산 잔기이다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 환형(circular)이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 선형이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 DNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 RNA이다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)의 1 내지 220개의 염기 쌍(서열 번호: 191)을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡(cap)은 안티-리버스 캡 유사체(anti-reverse cap analog), 클린 캡(Clean Cap), 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 록킹 핵산 캡(Locked Nucleic Acid cap; LNA-cap)을 포함하다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 m27,3'-OG(5')ppp(5')G, m7G, m7G(5')G, m7GpppG, 또는 m7GpppGm을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T3, T7, SP6, P60, Syn5, 및 KP34로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T7 프로모터이다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 있다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 TAATACGACTCACTATA(서열 번호: 25)를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 코작 서열(Kozak sequence)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, siRNA는 siRNA의 1 내지 10개의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스(sense) siRNA 가닥(strand)을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 및 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 중 적어도 2개 각각은 동일한 표적 mRNA 또는 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 종양 괴사 인자 알파(Tumor Necrosis Factor alpha)(TNF-알파), 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2 (Angiotensin Converting Enzyme-2; ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, SARS CoV-2 N, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)-1(SOD1), 및 액티빈 수용체-유사 키나제(Activin receptor-like kinase)-2(ALK2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R-알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R-베타(IL-6R-베타), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R-알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R-베타(IL-6R-베타), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, SARS CoV-2 N, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1), 및 액티빈 수용체-유사 키나제-2(ALK2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA는 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17 (IL-17), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 코로나바이러스 표적 RNA 또는 코로나바이러스 숙주 세포 표적 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 코로나바이러스 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 단백질은 스파이크 단백질(Spike protein)(S), 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)(N), 비-구조 단백질(non-structural protein; NSP), 또는 ORF1ab(다단백질 PP1ab) 단백질, 예컨대, SARS CoV-2 NSP1 단백질이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 SARS CoV-2 NSP12 및 13 암호화(coding) RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 숙주 세포 표적은 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 사람 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질은 ACE2, IL-6, IL-6R-알파, 또는 IL-6R-베타이다.
일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 발현은 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 중 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 분비 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포내 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포내기관 단백질(intraorganelle protein)을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 막 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 2A 펩타이드 링커 또는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth Factor) 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 인터페론 알파(IFN 알파), ACE2 가용성 수용체, 인터류킨 37(IL-37), 및 인터류킨 38(IL-38)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 및 ACE2 가용성 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), ACE2 가용성 수용체, 및 에리트로포이에틴(EPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 및 인터류킨 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자는 코로나바이러스 숙주 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자에 의해 암호화된 숙주 단백질은 다음으로부터 선택된다: IFN-α, 예컨대, 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 또는 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, IFN-ω, IFN-γ, IFN-λ, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 상향조절된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 코돈-최적화되지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal; NLS), 핵소체 국재화 신호(nucleolar localization signal; NoLS), 라이소솜 표적화 신호(lysosomal targeting signal), 미토콘드리아 표적화 신호(mitochondrial targeting signal), 퍼옥시소말 표적화 신호(peroxisomal targeting signal), 미세튜블 팁 국재화 신호(microtubule tip localization signal; MtLS), 엔도솜 표적화 신호(endosomal targeting signal), 클로로플라스트 표적화 신호(chloroplast targeting signal), 골지 표적화 신호(Golgi targeting signal), 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호(proteasomal targeting signal), 막 표적화 신호, 막관통 표적화 신호(transmembrane targeting signal), 또는 센트로솜 국재화 신호(centrosomal localization signal; CLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 천연 발생 아미노산 서열. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환에 의해 변형되고, 단 단백질이 옥시도리덕타제가 아닌, 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드; 및 (d) 천연적으로 신호 펩타이드의 기능을 갖지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 천연 발생 아미노산 서열. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9는 상기 2의 평균 소수성 점수를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 유전자 치료요법에 적합한 벡터이다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부(upstream)에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부(downstream)에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손(exon)에 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론(intron) 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱(splicing)없이 발현된다.
일부 양태에서, (i) 표적 RNA(예컨대, mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA (siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다.
일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함된다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 링커를 추가로 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (i) 및 (ii)를 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 폴리(A) 테일을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)의 1 내지 220개 염기 쌍(서열 번호: 191)을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 안티-리버스 캡 유사체, 클린 캡, 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 록킹된 핵산 캡(LNA-cap)을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 m27,3'-OG(5')ppp(5')G, m7G, m7G(5')G, m7GpppG, 또는 m7GpppGm을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코작 서열(Kozak sequence)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, siRNA는 siRNA의 1 내지 10개의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 및 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 중 적어도 2개는 동일하거나 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, SARS CoV-2 N, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1), 및 액티빈 수용체-유사 키나제-2(ALK2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R-알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R-베타(IL-6R-베타), 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17 (IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R (IL-6R), 인터류킨 6R-알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R-베타(IL-6R-베타), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, SARS CoV-2 N, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1), 및 액티빈 수용체-유사 키나제-2(ALK2)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA는 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적 RNA는 코로나바이러스 표적 RNA 또는 코로나바이러스 숙주 세포 표적 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 코로나바이러스 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 단백질은 스파이크 단백질(Spike protein)(S), 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)(N), 비-구조 단백질(NSP), 또는 ORF1ab(다단백질 PP1ab) 단백질, 예컨대, a SARS CoV-2 NSP1 단백질이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA는 SARS CoV-2 NSP12 및 13 암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 숙주 세포 표적은 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 사람 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질은 ACE2, IL-6, IL-6R-알파, 또는 IL-6R-베타이다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 분비 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포내 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포소기관내 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 막 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 링커를 암호화하는 링커 또는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 2A 펩타이드 링커, tRNA 링커 또는 가요성(flexible) 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐란-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4 (IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 인터페론 알파(IFN 알파), ACE2 가용성 수용체, 인터류킨 37(IL-37), 및 인터류킨 38(IL-38)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4 (IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 및 ACE2 가용성 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), ACE2 가용성 수용체, 및 에리트로포이에틴(EPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 및 IL-4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자는 코로나바이러스 숙주 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 숙주 단백질은 다음으로부터 선택된다: IFN-α, 예컨대, 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 또는 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, IFN-ω, IFN-γ, IFN-λ, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 상향조절된다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화되지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(microtubule tip localization signal; MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(centrosomal localization signal; CLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는 아미노산 서열.
일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드로서, 여기서목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되고, 단 단백질은 옥시도리덕타제가 아닌, 신호 펩타이드; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 신호 펩타이드는 목적한 유전자 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인, 신호 펩타이드; 및 (d) 천연적으로 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9는 상기 2의 평균 소수성 점수를 갖는다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 조성물을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물 및 약제학적으로 허용되는 부형제의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 질환 또는 병태(condition)를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(intervertebral disc disease)(IVDD), 골관절염(osteoarthritis), 및 건선(psoriasis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 건선, 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva; FOP) 및 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 건선, 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP), 근위축성 측색 경화증(ALS), 및 코로나바이러스 감염, 또는 코로나바이러스 감염으로부터 발생하거나 이와 관련된 질환 또는 병태로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다.
일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체에서 질환 또는 병태는 코로나바이러스 감염, 또는 코로나바이러스 감염으로부터 생성되거나 이와 관련된 질환 또는 병태이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, 또는 SARS-CoV-2이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 SARS, MERS, 또는 COVID-19이다.
일부 양태에서, 세포 내로 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 조성물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 단일 RNA 전사체로부터 siRNA 및 mRNA를 동시 발현시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령(messenger) RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA 및 목적한 유전자의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되며; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA의 발현은 하향조절되고 목적한 유전자의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 상향조절된다.
일부 양태에서, 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA), 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는, RNA 작제물을 생산하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하고, 이러한 방법은 (a) 시험관내(in vitro) 전사 반응을 위해: (i) 프로모터, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 폴리(A) 테일을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물; (ii) RNA 폴리머라제; 및 (iii) 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP)의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) 시험관 내 전사 반응 혼합물로부터 전사된 RNA를 단리 및 전제함으로써, RNA 작제물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, P60 RNA 폴리머라제, Syn5 RNA 폴리머라제, 및 KP34 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, NTP의 혼합물은 변형되지 않은 NTP를 포함한다. 일부 구현예에서, NTP의 혼합물은 변형된 NTP를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NTP는 N1-메틸슈도우리딘, 슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-메톡시메틸슈도우리딘, N1-프로필슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-카복시메틸에스테르우리딘, 5-포르밀우리딘, 5-카복시우리딘, 5-하이드록시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 6-아자우리딘, 티에노우리딘, 3-메틸우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-메틸사이티딘, 5-메톡시사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, 5-카복시사이티딘, 5-하이드록시사이티딘, 5-요오도사이티딘, 5-브로모사이티딘, 2-티오사이티딘, 5-아자사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘, N4-아세틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, N4-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, N1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-메틸-2-아미노아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)는 캡핑 효소를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전사된 RNA를 단리 및 정제하는 단계는 컬럼 정제를 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 8(IL-8) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 이를 암호화한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 1 베타(IL-1 베타) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)을 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 17(IL-17) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 이를 암호화한다.
일부 양태에서, (i) 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다.
일부 양태에서, (i) 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 인터류킨 17(IL-17) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다.
일부 양태에서, 서열 번호: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) 인터페론 베타(IFN-베타)를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 또는 30에 나타낸 서열(화합물 B1 또는 B2)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R(IL-6R) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 31에 나타낸 서열(화합물 B3)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 각각 지시된 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 32에 나타낸 서열(화합물 B4)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 33에 나타낸 서열(화합물 B5)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 34 또는 35에 나타낸 서열(화합물 B6 또는 B7)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예컨대, 화합물 B8(서열 번호: 36)을 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다에 의한 감염과 관련하여 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 37 또는 39에 나타낸 서열(화합물 B9 또는 B11)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 38에 나타낸 서열(화합물 B10)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, MERS-CoV, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS-CoV의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42 중 어느 하나에 나타낸 서열(화합물 B12, B13, 및 B14)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45 중 임의의 하나에 나타낸 서열(화합물 B15, B16, 및 B17)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 46에 나타낸 서열(화합물 B18)을 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190에 나타낸 서열(화합물 B18)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 47에 나타낸 서열(화합물 B19)을 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) 인터페론-베타(IFN-베타)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 IL-6 mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 29 또는 30에 나타낸 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R(IL-6R) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 31에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 32에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 33에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 34 또는 35에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3 siRNA를 포함하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예컨대, 화합물 B8(서열 번호: 36)를 포함하는 조성물은, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 37 또는 39에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 재조합 RNA 작제물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 38에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA는 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, MERS, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타 신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 46에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다.
관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 47에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리핵산 작제물은: (i) 다음으로부터 선택된 RNA를 표적화하는 siRNA: IL-8 mRNA, IL-1 베타 mRNA, IL-17 mRNA, TNF-알파mRNA, SARS CoV-2 ORF1ab RNA(다단백질 PP1ab, 예컨대, 비암호화 영역 내 또는 이것이 다음으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 경우: SARS CoV-2 비구조 단백질(NSP), Nsp1, Nsp3 (Nsp3b, Nsp3c, PLpro, 및 Nsp3e), Nsp7_Nsp8 복합체, Nsp9-Nsp10, 및 Nsp14-Nsp16, 3CLpro, E-채널(E 단백질), ORF7a, C-말단 RNA 결합 도메인(CRBD), N-말단 RNA 결합 도메인(NRBD), 헬리카제, 및 RdRp), SARS CoV-2 스파이크 단백질 (S) mRNA, SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N) mRNA, 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) mRNA, 인터류킨 mRNA(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터류킨 1(예컨대, IL-1알파, IL-1베타), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R (IL-6R), 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타), 인터류킨 18 (IL-18), 인터류킨 36-알파(IL-36-알파), 인터류킨 36-베타(IL-36-베타), 인터류킨 36-감마(IL-36-감마), 인터류킨 33 (IL-33)), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2) mRNA, 막관통 프로테아제(transmembrane protease), 세린 2(TMPRSS2) mRNA, 및 암호화 NSP12 및 13 RNA; 및 (ii) 과발현될 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 목적한 유전자, 또는 발현될 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA로서, 여기서 단백질은 다음으로부터 선택된다: IGF-1, IL-4, IGF-1(예를 들면, 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 이의 유도체), 카복시펩티다제(예컨대, ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ, SCPEP1); 사이토킨(예컨대, BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, 및 XCL2); 세포외 리간드 및 트랜스포터(예컨대, APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25, VWC2L); 세포외 매트릭스 단백질(예컨대, ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR, TNXB); 글루코시다제(AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5, SPACA5B); 글리코트랜스퍼라제(예컨대, ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1, XYLT1); 성장 인자(예컨대, AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF-1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, WISP3); 성장 인자 결합 단백질(예컨대, CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1, 및 WIF1); 헤파린 결합 단백질(예컨대, ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1, VTN); 호르몬(예컨대, ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B, 및 VIP); 하이드록실라제(예컨대, AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1, 및 THSD4); 면역글로불린(예컨대, IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2, IGLC3); 이소머라제(예컨대, NAXE, PPIA, PTGDS); 키나제(예컨대, ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS, PKDCC); 리아제(예컨대, PM20D1, PAM, CA6); 금속효소 억제제(예컨대, FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1, WFIKKN2); 메탈로프로테아제(예컨대, ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1, TLL2); 밀크 단백질(예컨대, CSN1S1, CSN2, CSN3, LALBA); 신경활성 단백질(예컨대, CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1, 및 TAC3); 프로테아제(예컨대, ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, TPSD1); 프로테아제 억제제(예컨대, A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7, SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6, WFDC8); 단백질 포스파타제(예컨대, ACP7, ACPP, PTEN, PTPRZ1); 에스테라제(예컨대, BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM, SIAE); 트랜스퍼라제(예컨대, METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9, B3GAT1); 혈관활성 단백질(예컨대, AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3, NTS), 제I형 인터페론(예컨대, IFN-α, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, 및 IFN-ω), 제II형 인터페론(예컨대, IFN-γ), 제III형 인터페론(예컨대, IFN-λ), 인터류킨, 예컨대, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체.
일부 양태에서, (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRN를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 각각 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 표적 RNA는 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)을 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적 방식으로 포함된다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)을 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되거나 이에 포함되지 않는다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱없이 발현된다. 일부 양태에서, 표적 RNA는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 양태에서, 표적 RNA는 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17 (IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R (IL-6R), 인터류킨 6R-알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R-베타(IL-6R-베타), 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 양태에서, 표적 RNA는 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17 (IL-17), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 목적한 유전자를 각각 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 목적한 유전자는 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 분비 단백질, 세포내 단백질, 세포소기관내 단백질, 및 막 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1), 및 인터류킨 4(IL-4)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미세소관 팁(microtubule tip) 국재화 신호(MtLS), 엔도소옴 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테아솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함한다. 일부 양태에서, 표적 모티프는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결십, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열(Kozak sequence)을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시킨다. 일부 양태에서, 링커는 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커 또는 가요성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 길이가 적어도 6개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 50개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 80개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 50개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 80개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 15개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하다. 일부 양태에서, 조성물은 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 양태에서, 조성물은 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되지 않거나 이에 포함되지 않는다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱없이 발현된다.
일부 양태에서, 대상체에서 바이러스 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 작제물은: (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자의 mRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 양태에서, siRNA는 목적한 유전자의 mRNA의 발현에 영향을 미치지 않고/않거나 목적한 유전자의 mRNA에 결합할 수 없다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 핵산 서열은 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 적어도 하나의 핵산 서열은 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적 RNA는 동일하거나, 상이하다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다: 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2); SARS CoV-2 ORF1ab; SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N. 일부 구현예에서, 인터류킨은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: IL-1알파, IL-1베타, IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, 인터류킨 IL-6R-베타, IL-18, IL-36-알파, IL-36-베타; IL-36-감마, 및 IL-33. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다: IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, IL-6R-베타, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2); SARS CoV-2 ORF1ab; SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N. 일부 구현예에서, 조성물은 (ii) 목적한 유전자를 각각 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 mRNA는 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 mRNA는 동일하고 적어도 하나의 mRNA는 적어도 2개의 동일한 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, (ii)의 목적한 유전자는 다음을 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택된다: IFN 알파-n3, IFN 알파-2a, IFN 알파-2b, IFN 베타-1a, IFN 베타-1b, ACE2 가용성 수용체, IL-37, 및 IL-38. 일부 구현예에서, (ii)의 목적한 유전자는 다음을 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택된다: IFN 베타 및 ACE2 가용성 수용체. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 목적한 유전자의 mRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호 (NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미세소체 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 갖지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A)테일, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커, 또는 가요성 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 적어도 6개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 50개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 80개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 50개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 80개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 15개의 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 유전자 치료요법에 적합한 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체 내에서 바이러스 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)을 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)을 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) (i)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되지 않거나 이에 포함되지 않는다. 일부 양태에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱없이 발현된다.
일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 작제물은 (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자의 mRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고; 여기서 (i)의 표적 RNA는 (ii)의 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 mRNA의 발현에 영향을 미치지 않고 이에 결합할 수 없다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 핵산 서열은 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 적어도 하나의 핵산 서열은 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적 RNA는 동일하거나, 상이하다. 일부 구현예에서, 표적은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA이다: IL-8 mRNA, IL-1 베타 mRNA, IL-17 mRNA, TNF-알파 mRNA, SARS CoV-2 ORF1ab RNA(다단백질 PP1ab, 예컨대, 비암호화 영역 내 또는 이것이 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 경우: SARS CoV-2 비구조 단백질(NSP), Nsp1, Nsp3(Nsp3b, Nsp3c, PLpro, 및 Nsp3e), Nsp7_Nsp8 복합체, Nsp9-Nsp10, 및 Nsp14-Nsp16, 3CLpro, E-채널(E 단백질), ORF7a, C-말단 RNA 결합 도메인(CRBD), N-말단 RNA 결합 도메인(NRBD), 헬리카제, 및 RdRp), SARS CoV-2 스파이크 단백질(S) mRNA, SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N) mRNA, 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) mRNA, 인터류킨 mRNA(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터류킨 1(예컨대, IL-1알파, IL-1베타), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타), 인터류킨 18 (IL-18), 인터류킨 36-알파(IL-36-알파), 인터류킨 36-베타(IL-36-베타), 인터류킨 36-감마(IL-36-감마), 인터류킨 33(IL-33)), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2) mRNA, 막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) mRNA, 및 암호화 NSP12 및 13 RNA. 일부 구현예에서, 조성물은 (ii) 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 각각은 목적한 유전자의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 mRNA는 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 mRNA는 동일하고 적어도 하나의 mRNA는 적어도 2개의 동일한 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, (ii)의 목적한 유전자는 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택된다: IGF-1, IL-4, IGF-1(예를 들면, 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 이의 유도체), 카복시펩티다제(예컨대, ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ, SCPEP1); cytokines (예컨대, BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, 및 XCL2); 세포외 리간드 및 트랜스포터(예컨대, APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25, VWC2L); 세포외 매트릭스 단백질(예컨대, ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR, TNXB); 글루코시다제(AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5, SPACA5B); 글리코실트랜스퍼라제(예컨대, ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1, XYLT1); 성장 인자(예컨대, AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF-1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, WISP3); 성장 인자 결합 단백질(예컨대, CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1, 및 WIF1); 헤파린 결합 단백질(예컨대, ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1, VTN); 호르몬(예컨대, ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B, 및 VIP); 하이드롤라제(예컨대, AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1, 및 THSD4); 면역글로불린(예컨대, IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2, IGLC3); 이소머라제(예컨대, NAXE, PPIA, PTGDS); 키나제(예컨대, ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS, PKDCC); 리아제(예컨대, PM20D1, PAM, CA6); 금속효소 억제제(예컨대, FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1, WFIKKN2); 메탈로프로테아제(예컨대, ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1, TLL2); 밀크 단백질(예컨대, CSN1S1, CSN2, CSN3, LALBA); 신경활성 단백질(예컨대, CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1, 및 TAC3); 프로테아제(예컨대, ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, TPSD1); 프로테아제 억제제(예컨대, A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7, SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6, WFDC8); 단백질 포스파타제(예컨대, ACP7, ACPP, PTEN, PTPRZ1); 에스테라제(예컨대, BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM, SIAE); 트랜스퍼라제(예컨대, METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9, B3GAT1); 혈관활성 단백질(예컨대, AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3, NTS), 제I형 인터페론(예컨대, IFN-α, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, 및 IFN-ω), 제II형 인터페론(예컨대, IFN-γ), 제III형 인터페론(예컨대, IFN-λ), 인터류킨, 예컨대, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 목적한 유전자의 mRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시솜 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 사입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 갖지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 일커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커, 또는 가요성 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 적어도 6개 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 적어도 50개 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 80개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 50개 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 80개 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6 내지 약 15개 핵산 잔기이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 유전자 치료요법에 적합한 벡터이다. 일부 구현예에서, 조성물은 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되지 않거나 이에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱없이 발현된다. 일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태, 또는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태, 또는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 병태, 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP) 및 근위축성 측색 경화증(ALS)를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되지 않거나 이에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 RNA 스플라이싱없이 발현된다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호: 80 내지 109 및 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 서열 번호: 80 내지 109 및 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 110 내지 139 및 서열 번호: 146 내지 151로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호: 80 내지 92로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 서열 번호: 80 내지 92로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 110 내지 122로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호: 93 내지 109로부터 선택된 서열로부터 암호화된 센스 가닥 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 서열 번호: 93 내지 109로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 123 내지 139로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 ?O리핵산 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 146 내지 151로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허원은 각각의 개개 공보, 특허, 또는 특허원이 참고에 의해 혼입된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 바와 동일한 정도로 참고에 의해 본원에 포함된다.
본 개시내용의 특징은 첨부된 청구범위에 특별히 나타낸다. 본 개시내용의 특징 및 장점의 보다 우수한 이해는 설명적 구현예로 나타낸 다음의 상세한 설명을 참고로 수득될 것이며, 여기서 본 개시내용의 원리가 활용되며, 이의 첨부된 도며은 다음과 같다:
도 1은 작제물 설계의 개략적인 표시를 나타낸다. T7: T7 프로모터, siRNA: 작은 간섭 RNA.
도 2a는 HEK-293 세포에서 IGF-1 발현에 있어서 IGF-1 mRNA 작제물과 화합물 A1(Cpd. 1)의 비교를 나타내지만 도 2b는 HEK-293 세포에서 IL-8 과발현 모델에서 IL-8-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A1의 동시 RNA 참고를 나타낸다. 대조군: IL-8 과발현 작제물 단독.
도 3은 HEK-293 세포에서 IL-8 과발현시 IL-8-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A1(Cpd. 1)의 용량-의존적 RNA 간섭을 나타낸다.
도 4a는 THP-1 세포에서 화합물 A2(Cpd. 2)에 의한 IL-8 발현의 조절을 나타낸다. 대조군: IL-8 과발현 작제물 단독.
도 4b는 HEK-293 세포에서 화합물 A2(Cpd. 2)의 IGF-1 발현을 나타낸다.
도 5a는 THP-1 세포에서 화합물 A3(Cpd. 3)에 의한 IL-8 발현의 조절을 나타낸다. 대조군: IL-8 과발현 작제물 단독.
도 5b는 HEK-293 세포에서 화합물 A3(Cpd. 3)의 IGF-1 발현을 나타낸다.
도 6a는 THP-1 세포내에서 IL-8 발현시 화합물 A4(Cpd. 4) 및 화합물 A5(Cpd. 5)의 비교를 나타낸다. 대조군: IL-8 과발현 작제물 단독.
도 6b는 THP1 세포 내에서 IL-8 발현시 화합물 A3(Cpd. 3) 및 화합물 A5(Cpd. 5)의 비교를 나타낸다.
도 7은 HEK-293 세포 내에서 IL-8 발현시 화합물 A4(Cpd. 4) 및 화합물 A5(Cpd. 5)의 비교를 나타낸다.
도 8a는 THP-1 세포내에서 내인성 IL-1 베타(IL1b) 발현시 화합물 A6(Cpd. 6)의 효과를 나타낸다.
도 8b는 THP-1 세포내에서 내인성 IL-1 베타(IL1b) 발현시 화합물 A6(Cpd. 6)의 효과를 나타낸다. 대조군: LPS + dsDNA 단독.
도 8c는 HEK-293 세포 내에서 화합물 A6(Cpd. 6)의 IGF-1 발현을 나타낸다.
도 9a는 THP-1 세포 내에서 내인성 IL-1 베타(IL1b) 발현시 화합물 A7(Cpd. 7)의 효과를 나타낸다.
도 9b는 THP-1 세포내에서 내인성 IL-1 베타(IL1b) 발현시 화합물 A7(Cpd. 7)의 효과를 나타낸다. 대조군: LPS + dsDNA 단독.
도 9c는 HEK-293 세포 내에서 화합물 A7(Cpd. 7)의 IGF-1 발현을 나타낸다.
도 10a는 HEK-293 세포 내에서 TNF-α 과발현 모델 내 TNF-α-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A8(Cpd. 8)의 RNA 간섭을 나타낸다. 대조군: TNF-α 과발현 작제물 단독.
도 10b는 THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 발현 모델에서 TNF-α-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A8(Cpd. 8)의 RNA 간섭을 나타낸다. 대조군: LPS + R848 단독.
도 10c는 도 10a에서와 동일한 세포(HEK-293) 배양물 속에서 화합물 A8(Cpd. 8)의 IL-4 발현을 나타낸다.
도 10d는 도 10b에서와 동일한 세포(THP-1) 배양물 상층액 속에서 화합물 A8(Cpd. 8)의 IL-4 발현을 나타낸다.
도 11은 마지막 20년 내에 사람 질병발생(outbreak)을 초래하는 3개의 코로나바이러스, MERS-CoV(상단), SARS-CoV-2(중간), 및 SARS-CoV(하단)의 계통발생 분석을 나타낸다. 게놈 서열은 공공 이용가능하고(NCBI 뉴클레오타이드로부터 수득함) Geneious Prime v.2019.2.3에서 타무라-네이(Tamura-Nei) 유전 거리 모델을 사용하여 분석하였다. 유전 거리 모델; 계통수는 UPGMA 알로리즘을 사용하여 제조하였다.
도 12a는 THP-1 세포내에서 내인성 TNF-α 발현 모델에서 TNF-α-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A9(Cpd. 9) 및 화합물 A10(Cpd. 10)의 RNA 간섭을 나타낸다. 대조군: LPS + R848 단독, sc-siRNA: 스크램블된(scrambled) siRNA. 데이타는 4개의 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(*, <0.05)은 siRNA 활성에 대한 스튜던츠 t-시험(Student's t-test)으로 평가하였다. 유의성(***, p<0.001)은 일원 ANOVA(one way ANOVA)에 이어 대조군과 관련된 던넷 다중 비교 시험(Dunnet's multiple comparing test)으로 평가하였다.
도 12b는 THP-1 세포 내에서 화합물 A9(Cpd. 9) 및 화합물 A10(Cpd. 10)의 IL-4 발현을 나타낸다. 데이타는 4회 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(**, <0.01)은 iL-4 발현에 대해 스튜던츠 t-시험으로 평가하였다.
도 13a는 HEK-293 세포 내에서 TNF-α 과발현 모델에서 TNF-α-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A9(Cpd. 9) 및 화합물 A10(Cpd. 10)의 TNF 간섭을 나타낸다. 대조군: TNF-α 과발현 작제물 단독. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(**, p<0.01)은 일원 ANOVA에 이어 대조군과 관련된 던넷 다중 비교 시험으로 평가하였다.
도 13b는 HEK-293 세포 내에서 화합물 A9(Cpd. 9) 및 화합물 A10(Cpd. 10)의 IL-4 발현을 나타낸다. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(***, <0.001)은 스튜던츠 t-시험으로 평가하였다.
도 14는 A549 세포 내에서 내인성 ALK2 발현 모델내 ALK2-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A11(Cpd. 11)의 용량-의존성 RNA 간섭 및 A549 세포에서 화합물 A11(Cpd. 11)의 IGF-1 발현을 나타낸다. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15a는 IMR32 세포에서 내인성 SOD1 발현 모델에서 SOD1-표적화 siRNA를 포함하는 화합물 A12(Cpd. 12) 및 화합물 13(Cpd. 13)의 용량-의존성 RNA 간섭을 나타낸다. 데이타는 3개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15b는 IMR32 세포에서 화합물 A13(Cpd. 13)의 용량-의존성 EPO 발현을 나타낸다. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 15c는 IMR32 세포에서 화합물 A12(Cpd. 12)의 용량-의존성 IGF-1 발현을 나타낸다. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 16a는 HEK-293 세포에서 IL-1 베타 과발현 모델에서 siRNA 표적화 IL-1 베타를 포함하는 화합물 A14(Cpd. 14) 및 화합물 A15(Cpd. 15)의 RNA 간섭을 나타낸다. 대조군: IL-1 베타과발현 작제물 단독. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(*, <0.05)은 스튜던츠 t-시험으로 평가하였다. 유의성(***, p<0.001)은 일-원 ANOVA에 이어 대조군과 관련된 던넷 다중 비교 시험으로 평가하였다.
도 16b는 HEK-293 세포에서 화합물 A14(Cpd. 14) 및 화합물 A15(Cpd. 15)의 IGF-1 발현을 나타낸다. 데이타는 4개 반복물의 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성(*, <0.001)은 스튜던츠 t-시험으로 평가하였다.
도 17a는 eGFP로 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 pcDNA3+ 벡터로 형질감염된 eGFP 양성 A549 세포의 발현을 나타낸다.
도 17b는 3개의 siRNA를 포함하고, 이들 중 하나가 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 표적화하는, eGFP 및 화합물 B18(Cpd. B18)로 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 pcDNA3+ 벡터로 동시-형질감염된 eGFP 양성 A549 세포의 발현을 나타낸다.
도 17c는 eGFP로 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 A549 세포에서 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 표적화하는 siRNA를 포함하는 화합물 B18(Cpd. B18)의 RNA 간섭을 나타낸다. 대조군: SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질-eGFP 작제물 단독. 유의성(***, <0.001)은 대조군과 비교하여 화합물 B18(Cpd. B18)의 스튜던츠 t-시험으로 평가하였다.
상세한 설명
본 설명의 특정의 구체적인 세부사항을 다양한 구현예의 이해를 통해 제공하기 위하여 나타낸다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 본 개시내용이 이러한 세부사항없이도 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 예에서, 잘-알려진 구조는 나타내지 않거나 구현예의 모호한 설명을 피하기 위하여 상세히 기술된다. 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 이의 변이체, 예를 들면, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"을 수반하는 명세서 및 청구범위는 개방의, 포괄적인 의미, 즉, "포괄하나(including), 이에 한정되지 않는"으로 고려되어야 한다. 또한, 본원에 제공된 제목은 단지 편의를 위한 것이며 청구된 개시내용의 영역 또는 의미를 해석하기 위한 것이 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 당해 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용된 수 있는 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질, 적합한 방법, 및 물질은 하기 기술되어 있다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형("a", "an", 및 "the")은 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수의 지시대상(referent)을 포함한다. 용어 "또는"은 일반적으로 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 한, "및/또는"을 포함하는 이의 의미로 일반적으로 사용됨을 주목하여야 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는" 및 "이의 임의의 조합" 및 이의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려됨을 전달할 수 있다. 나열 목적을 위해 단독으로, 다음의 어구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이의 임의의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. 용어 "또는"은 내용이 구체적으로 분리적 사용을 지칭하지 않는 한, 공동으로 또는 분리하여 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 측정된 바와 같은 특수한 값에 대해 허용되는 오차 범위 내 임을 의미할 수 있고, 이는 값이 측정되거나 결정된 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 실시 당 1 또는 1 이상의 표준 오차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어는 크기의 차수내, 값의 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특수한 값이 명세서 및 청구범위에 기술된 경우, 달리 기술하지 않는 한, 특수한 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 사용될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"(및 '포함하는'의 임의의 형태, 예를 들면, "포함하다"("comprise" 및 "comprises"), "갖는(having)"(및 '갖는'의 임의의 형태, 예를 들면, "갖다("have" 및 "has"), "포괄하는"(및 "포괄하다("includes" 및 "include") 또는 "함유하는(containing)"(및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들면, "함유하다"("contains" 및 "contain")는 포괄적이거나 제약이 없으며(open-ended) 추가의 인용되지 않은 성분 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있으며, 이의 역도 가능하다. 또한, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
"구현예", "특정 구현예", "바람직한 구현예", "구체적인 구현예", "일부 구현예", "일 구현예", "하나의 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 명세서에서의 참고는 구현예와 관련하여 기술된 특수한 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 구현예에서 포함되나, 필수적으로 본 개시내용의 모든 구현예가 아님을 의미한다. 본 개시내용의 이해를 촉진시키기 위하여, 다수의 용어 및 어구가 하기 정의되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNA"는 아미노산 서열을 암호화하는 RNA(예컨대, mRNA 등) 뿐만 아니라 아미노산 서열을 암호화하지 않는 RNA(예컨대, siRNA, shRNA 등)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 RNA는 암호화 RNA, 즉, 아미노산 서열을 암호화하는 RNA일 수 있다. 이러한 RNA 분자는 또한 mRNA(전령 RNA)로서 지칭되며 단일 가닥 RNA 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은 RNA는 비-암호화 RNA, 즉, 아미노산 서열을 암호화하지 않거나 단백질로 해독되지 않은 RNA일 수 있다. 비-암호화 RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 또는 작은 헤어핀(harpin) RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), piwi-결합(interacting) RNA(piRNA), 및 긴 비-암호화(long non-coding) RNA(IncRNA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 siRNA는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 영역, 헤어핀 구조, 루프 구조, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 siRNA는 적어도 하나의 shRNA, 적어도 하나의 dsRNA 영역, 또는 적어도 하나의 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 siRNA는 dsRNA 또는 shRNA로부터 프로세싱될 수 있다. RNA는 당해 분야의 통상의 숙련가에게 공지된 합성 및 효소 방법론에 의해, 또는 재조합 기술을 사용함에 의해 제조될 수 있거나, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 이의 조합으로부터 제조될 수 있다. RNA는 당해 분야에 공지된 비천연 및 천연적으로 발생하는 뉴클레오사이드 변형, 예를 들면, 예컨대, 본원에서 메틸슈도우리딘으로 지칭된 N1-메틸슈도우리딘을 임의로 포함할 수 있다.
용어 "핵산 서열", "폴리핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열", 및 "뉴클레오타이드 산 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 본원에서 동일한 의미를 갖고 바람직하게는 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열", 및 "뉴클레오타이드 산 서열"은 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"과 동의어로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 뉴클레오타이드 단량체를 포함하거나 이루어진 중합체이고, 이는 당/포스페이트-골격의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유결합으로 연결된다. 용어 "핵산 서열"은 또한 변형된 핵산 서열, 예를 들면, 염기-변형된, 당-변형된 또는 골격-변형된 등의 DNA 또는 RNA를 포함한다.
본원에 기술된 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 하나 이상의 뉴클레오타이드 변이체, 예를 들면, 비표준 뉴클레오타이드(들), 비-천연 뉴클레오타이드(들), 뉴클레오타이드 유사체(들), 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드의 예는 디아미노푸린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이폭산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡시노신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오o우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5- 옥시아세트산 메틸에스테르, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드는 이의 포스페이트 모이어티(moiety)내 변형, 예를 들면, 트리포스페이트 모이어티에 대한 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적 예는 보다 큰 길이의 포스페이트 쇄(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스페이트 모이어티를 갖는 포스페이트 쇄) 및 티올 모이어티를 지닌 변형(예컨대, 알파-티오트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트)를 포함한다.
본원에 기술된 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 염기 모이어티에서(예컨대, 상보성 뉴클레오타이드와 수소 결합을 형성하기에 전형적으로 이용가능한 하나 이상의 원자에서 및/또는 상보성 뉴클레오타이드와 전형적으로 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서), 당 모이어티에서, 또는 포스페이트 골격에서 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 골격 변형은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로디아미데이트 연결을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 포스포로티오에이트 연결은 포스페이트 골격내에서 비-브릿징 산소에 대해 황 원자를 치환하며 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제 분해를 지연시킨다. 포스포로디아미데이트 연결(N3'→P5')은 뉴클레아제 인식 및 분해를 방지하도록 한다. 일부 구현예에서, 골격 변형은 골격 구조 내 인 대신에 펩타이드 결합(예컨대, 펩타이드 핵산 내 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위), 또는 카바메이트, 아미드, 및 선형 및 환형 탄화수소 그룹을 포함하는 연결 그룹을 갖는 것을 포함한다. 변형된 골격을 지닌 올리고뉴클레오타이드는 문헌: Micklefield, Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications, Curr. Med. Chem., 8 (10): 1157-79, 2001 및 Lyer et al., Modified oligonucleotides-synthesis, properties and applications, Curr. Opin. Mol. Ther., 1 (3): 344-358, 1999에서 고찰된다.
용어 "펩타이드"는 전형적으로 인접한 아미노산 잔기의 α-아미노와 카복실 그룹 사이에 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 모티프" 또는 "표적화 모티프"는 세포질 또는 사이토졸을 제외한 세포 막, 세포외 구획, 또는 세포내 구획의 임의의 부분에 정해진 새로이 합성된 폴리펩타이드 또는 단백질 속에 존재하는 임의의 짧은 펩타이드를 지칭할 수 있다. 세포내 구획은 세포내 소기관, 예를 들면, 핵, 핵소체(nucleolus), 엔도솜, 프로테오솜, 리보솜, 크로마틴, 핵 엔벨로프, 핵 공극(nuclear pore), 엑소좀(exosome), 멜라노솜(melanosome), 골지 장치, 퍼옥시솜, 소포체(ER), 라이소솜, 중심체, 미소관, 미토콘드리아, 엽록체, 미세섬유, 중간체 섬유(intermediate filament), 또는 혈장 막을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 용어는 신호 서열, 표적화 신호, 국재화 신호, 국재화 서열, 변화 펩타이드(transit peptide), 리더 서열, 또는 리더 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함할 수 있다.
신호 펩타이드, 또는 프레-도메인(pre-domain)으로 본원에서 또한 지칭된 용어 "신호 펩타이드"는 분비 경로를 향해 지정된 새로이 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 펩타이드(일반적으로 16 내지 40개 아미노산 길이)이다. 본 발명의 신호 펩타이드는 길이가 바람직하게는 10 내지 50개, 보다 바람직하게는 11 내지 45개, 심지어 보다 바람직하게는 12 내지 45개, 가장 바람직하게는 13 내지 45개, 특히 14 내지 45개, 보다 특히 15 내지 45개, 심지어 보다 특히 16 내지 40개 아미노산이다. 본 발명에 따른 신호 펩타이드는 목적한 단백질의 n-말단 끝에 또는 목적한 단백질의 프로-단백질 형태(pro-protein form)의 N-말단 끝에 위치한다. 본 발명에 따른 신호 펩타이드는 일반적으로 진핵세포 기원, 예컨대, 진핵세포 단백질, 바람직하게는 포유동물 기원의 신호 펩타이드, 예컨대, 포유동물 단백질, 보다 바람직하게는 사람 기원의 신호 펩타이드, 예컨대, 포유동물 단백질의 신호 펩타이드이다. 일부 구현예에서 변형될 이종 신호 펩타이드 및/또는 동종 신호 펩타이드는 진핵세포 단백질의 천연 발생 신호 펩타이드, 바람직하게는 포유동물 단백질의 천연 발생 신호 펩타이드, 보다 바람직하게는 사람 단백질의 천연 발생 신호 펩타이드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 전형적으로 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 분자를 지칭한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 쇄이다. 펩타이드는 일반적으로 2 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 폴리펩타이드는 일반적으로 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 단백질은 전형적으로 3-차원 형태로 폴딩되고, 이는 단백질이 이의 생물학적 기능을 발휘하는데 요구될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 단백질 및 융합 단백질의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 포유동물, 예컨대, 사람 기원인데, 즉, 사람 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 세포로부터 정상적으로 분비된 단백질, 즉, 천연에서 세포로부터 분비된 단백질, 또는 바이러스에 의해 생산된 단백질이다. 일부 구현예에서, 본원에서 지칭된 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 카복시펩티다제; 사이토킨; 세포외 리간드 및 트랜스포터(transporter), 예를 들면, 수용체(receptor); 세포외 매트릭스 단백질; 글루코시다제; 글리코실트랜스퍼라제; 성장 인자; 헤파린 결합 단백질; 호르몬; 하이드롤라제; 면역글로불린; 이소머라제; 키나제; 리아제; 금속효소 억제제; 메탈로프로테아제; 밀크(milk) 단백질; 신경활성 단백질; 프로테아제; 프로테아제 억제제; 단백질 포스파타제; 에스테라제; 트랜스퍼라제; 및 혈관활성 단백질. 일부 구현예에서, 단백질은 바이러스 단백질, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 코로나바이러스 단백질이다.
카복시펩티다제는 단백질의 카복시-말단(C-말단) 끝에서 펩타이드 결합을 가수분해(절단)하는 프로테아제 효소인 단백질이고; 사이토킨은 분비되어 흔히 면역학적 반응에 관여되는, 이의 표면 상의 수용체를 통해 표적 세포 신호전달의 조절인자로서 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 단백질이고; 세포외 리간드 및 트랜스포터는 분비되어 다른 단백질에 대한 결합 또는 다른 단백질 또는 다른 분자를 수반함을 통해 작용함으로써 특정의 생물학적 기능을 발휘하는 단백질이고; 세포외 매트릭스 단백질은 주변 세포에 대해 구조적 및 생화학적 지지체를 제공하는 지지체 세포에 의해 분비된 단백질의 수집물이고; 글루코시다제는 복합 탄수화물, 예를 들면, 전분 및 글리코겐을 이의 단량체로 분해하는데 관여하는 효소이고; 글리코실트랜스퍼라제는 천연의 글리코시드성 연결을 확립하는 효소이고; 세포 성장 인자는 영양 반응 및 생존 또는 세포 항상성 신호전달에 흔히 관여하는, 이의 표면 상의 수용체를 통해 표적 세포 신호전달의 조절인자로서 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 세포 성장, 증식, 치유, 및 세포 분화를 자극시킬 수 있는 분비된 단백질이고; 성장 인자 결합 단백질은 성장 인자에 결합함으로써 이의 생물학적 활성을 조절하는 분비된 단백질이고; 헤파린 결합 단백질은 흔히 성장 인자 또는 호르몬에 대한 다른 결합과 함께, 헤파린과 상호작용하여 이의 생물학적 기능을 조절하는 분비된 단백질이고; 호르몬은 분비되어 순환계에 의해 먼 표적 기관으로 수송됨으로써 이의 표적 세포 상에서 특이적인 수용체에 대한 결합을 통해 생리학 및 거동을 조정하는 다세포 유기체 내에서 선(gland)에 의해 생산된 신호전달 분자의 부류의 구성원이고; 하이드롤라제는 물을 이용하여 화학 결합을 파괴함으로써, 보다 큰 분자의 보다 작은 분자로의 분할을 야기하는 분자 분해(cleavage)를 생화학적으로 촉매하는 효소의 부류이고; 면역글로불린은 면역계에 의해 병원성 세균 및 바이러스와 같은 병원체를 중화시키는데 사용된 혈장 세포에 의해 주로 생산되는 큰, Y-형의 분비된 단백질이고; 이소머라제는 하나의 이성체로부터 다른 것으로 분자를 전환시킴으로써, 결합이 분해되고 형성되는 분자내 재정렬을 촉진시키는 효소의 일반적인 부류이고; 키나제는 고-에너지의, 포스페이트-기증 분자(phosphate-donating molecule)로부터 특정 기질로 포스페이트 그룹의 전달을 촉매하는 효소이고; 리아제는 가수분해 및 산화 이외의 수단에 의해 다양한 화학적 결합의 파괴를 촉매하여, 흔히 새로운 이중 결합 또는 새로운 환 구조를 형성하는 효소이고; 금속효소는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 세포 억제제를 억제하고; 메탈로프로테아제는 이의 촉매 메카니즘이 금속 이온을 포함하는 프로테아제 효소이고; 밀크 단백질은 국소적으로 또는 먼 거리를 통해 작용하여 뉴우런 기능, 생존 및 생리학을 뒷받침하는 분비된 단백질이고; 프로테아제(또한 펩티다제 또는 프로테이나제로 불림)는 펩타이드 결합의 가수분해에 의해 단백질 분해를 수행하는 효소이고; 프로테아제 억제제는 프로테아제의 기능을 억제하는 단백질이고; 단백질 포스파타제는 이의 기질 단백질의 포스포릴화된 아미노산 잔기로부터 포스페이트 그룹을 제거하는 효소이고; 에스테라제는 아미노산 잔기에서 물을 사용한 화학 반응에서 에스테르를 산 및 알코올로 쪼개는 효소이고; 트랜스퍼라제는 분자(공여체로 불림)로부터 다른 것(수용체로 불림)로 특이적인 작용 그룹(예컨대, 메틸 또는 글리코실 그룹)의 전달을 촉매하는 효소의 부류이고; 혈관활성 단백질은 혈관의 기능에 생물학적으로 영향을 미치는 분비된 단백질이다. 본원에 지칭된 바와 같은 카복시펩티다제; 사이토킨; 세포외 리간드 및 트랜스포터; 세포외 매트릭스 단백질; 글루코시다제; 글리코실트랜스퍼라제; 성장 인자; 성장 인자 결합 단백질; 헤파린 결합 단백질; 호르몬; 하이드롤라제; 면역글로불린; 이소머라제; 키나제; 리아제; 금속효소 억제제; 메탈로프로테아제; 밀크 단백질; 신경활성 단백질; 프로테아제; 프로테아제 억제제; 단백질 포스파타제; 에스테라제; 트랜스퍼라제; 및 혈관활성 단백질는 UniProt 데이타베이스에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 지칭된 바와 같은 단백질은, 예컨대, 사이토킨, 분비되고, 면역학적 반응에 흔히 포함된, 이의 표면 상에서 수용체를 통해 표적 세포 신호전달의 조절인자로서 국소적으로 또는 전신계적으로 작용하는 단백질, 바이러스 감염에 포함된 다른 숙주 단백질, 및 바이러스 단백질이다. 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질을 포함하는, 본 발명의 문맥에서 유용한 단백질의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있고 문헌, 예컨대, UniProt 데이타베이스에서 이용가능하다.
본원에서 동일한 의미를 갖는 용어 "단편", 또는 "서열의 단편"은 예컨대, DNA 또는 RNA 또는 단백질과 같은 핵산 분자의 전체 길이 서열의 보다 짧은 부위이다. 따라서, 단편은 전형적으로, 전체 길이 서열 내에 상응하는 스트레치(stretch)와 동일한 서열로 이루어진다. 본 발명의 문맥에서 서열의 바람직한 단편은 실체의 연속된 스트레치, 예를 들면, 단편이 유래된 분자내 실체의 연속된 스트레치에 상응하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로 이루어며, 이는 단편이 유래된 총(즉, 전체 길이의) 분자의 적어도 5%, 일반적으로 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 60%, 심지어 보다 바람직하게는 적어도 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 세포 내에서 핵산의 흡수, 증식, 발현 또는 전파를 위한 천연적으로 존재하거나 합성적으로 생성된 작제물, 예컨대, 플라스미드, 미니서클(minicircle), 파아지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 인공 염색체/미니-염색체(mini-chromosome), 박테리오파아지(bacteriophage, 바이러스, 예를 들면, 바큘로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 단성 바이러스(herpes simplex virus), 박테리오파아지를 지칭한다. 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내에서 자가 복제하는 작제물로서 남아있다. 작제물 벡터에 사용된 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고 다양한 공보에 기술되어 있다. 특히 적합한 벡터를 작제하기 위한 기술, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호, 선택 마커, 복제 오리진, 및 스플라이싱 신호와 같은 기능 및 조절 구성성분의 설명은 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 진핵세포 발현 벡터는 전형적으로 또한 세균 내에서 벡터의 증식을 촉진시키는 원핵세포 서열, 예를 들면, 복제 오리진 및 진핵 세포의 형질감염 전에 제거될 수 있는 세균 내 선택을 위한 항생제 내성 유전자를 함유할 것이다. 이의 내부로 폴리뉴클레오타이드가 작동적으로 연결될 수 있는 클로닝 부위를 함유하는, 다양한 진핵세포 발현 벡터는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 일부는 회사, 예를 들면, 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 Agilent Technologies; 캘리포니아주 칼스바드 소재의 Invitrogen; 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega 또는 캘리포니아주 산 디에고 소재의 Invivogen으로부터 상업적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 단위", "발현 단위", 또는 "발현 카세트"는 전사될 하나 이상의 유전자를 함유하는 벡터, 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드 내 영역을 지칭하고, 여기서 분절(segment) 내 함유된 유전자는 서로 작동적으로 연결되어 있다. 이는 단일 프로모터로부터 전사되며 전사는 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호에 의해 종결된다. 그 결과, 상이한 유전자는 적어도 전사적으로 연결되어 있다. 하나 이상의 단백질 또는 생성물은 각각의 전사 단위(다중시스트론성 전사 단위(multicistronic transcription unit))로부터 전사되고 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는 단위 내에 함유된 임의의 선택된 서열의 전사 및 해독에 필수적인 조절 성분을 포함할 것이다. 그리고 각각의 전사 단위는 동일하거나 상이한 조절 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 각각의 전사 단위는 동일한 종결인자(terminator)를 함유할 수 있다. IRES 성분 또는 인트론은 전사 단위 내에서 유전자의 기능적 연결을 위해 사용될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 전사 단위를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골격근 손상"은 골격근의 임의의 손상 및 파열, 바람직하게는 신장성 근 수축(eccentric muscle contraction), 신장(elongation) 및 근육 과부하에 의해 유도된, 골격근의 파열을 지칭한다. 원칙적으로 임의의 골격근은 이러한 손상 또는 파열에 의해 영향받을 수 있다. 바람직하게는 골격근 손상은 골격근의 손상 및 파열이며 여기서 골격 근은 머리, 목, 흉곽, 등, 복부, 골반, 팔, 다리 및 엉덩이의 근육 그룹으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는 골격근 손상은 골격근이 발바닥, 측두(temporal), 유두(papillary), 대흉근(pectoralis major), 후방 경골(tibialis posterior), 전방 경골(tibialis anterior), 비복근(gastrocnemius), 오구완근(coracobrachialis), 횡격막(diaphragma), 장장근(palmaris longus), 복직근(rectus abdominis), 외부 항문 괄약근(external anal sphincter), 내부 항문 괄약근(internal anal sphincter), 견갑하근(subscapularis), 이두근(biceps), 삼두근(triceps), 사두근(quadriceps), 종아리(calf), 사타구니(groin), 햄스트링(hamstring), 삼각근(deltoid), 대원근(teres major), 회전 근개 극하근(rotator cuff supraspinatus), 회전근개 소근(rotator cuff infraspinatus), 회전근개 견갑하근(rotator cuff teres minor), 회전근개 견갑거근(rotator cuff subscapularis), 대퇴 직근(rectus femoralis), 대퇴 복근(rectus abdominis), 외복 사근(abdominal external oblique), 교근(masseter), 승모근(trapezius), 광배근(latissimus), 흉근(pectoralis), 척추 세움근(erector spinae), 장늑근(iliocostalis), 최장근(longissimus), 가시근(spinalis), 활배근(latissimus dorsi), 횡돌기극근(transversospinales), 반지느러미 등골(semispinalis dorsi), 반척추 경부(semispinalis cervices), 머리반 가시슨(semispinalis capitis), 다열근(multifidus), 회전근(rotatores), 극간근(interspinales), 횡돌기간근(intertransversarii), 두판상근(splenius capitis), 자궁 경관(splenius cervices), 늑골간(intercostals), 늑하근(subcostales), 흉횡근(transversus thoracis), 늑골거근(levatores costarum), 하후거근(serratus posterior inferior), 상후 거근(serratus posterior superior), 복횡근(Transversus abdominis), 복직근(rectus abdominis), 추제근(pyramidalis), 거고근(cremaster), 요방형근(quadratus lumborum), 외 복사근(external oblique), 내 복사근(internal oblique)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 심지어 보다 바람직하게는 골격 근 손상은 골격 근이 발바닥, 측두, 유두, 대흉근, 후방 결골, 전방 경골, 비복근, 오구완근, 횡격막, 장장근, 복직근, 외부 항문 괄약근, 내부 항문 괄약근, 견갑하근, 이두근, 삼두근, 사두근, 종아리, 사타구니, 햄스트링, 삼각근, 대원근, 회전근개 극하근, 회전근개 소근, 회전근개 견갑 하근, 견갑 거근, 대퇴 직근, 대퇴 복직근, 외복 사근, 교근, 승모근, 광배근, 흉근으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는 골격근의 임의의 손상 및 파열, 바람직하게는 신장성 근 수축, 연장 또는 근육 과부하에 의해 유도된, 골격근의 파열은 본 발명의 방법으로 치료된다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 포유동물 부류의 임의의 구성원; 사람, 비-사람 영장류, 예를 들면, 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예를 들면, 소, 말, 양, 염소, 양; 애완 동물, 예를 들면, 토끼, 개, 및 고양이; 실험 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 랫트, 마우스 및 기니아 피그 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 양태에서, 포유동물은 사람이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동물"은 사람 및 비-사람 동물을 포함한다. 일 구현예에서, "비-사람 동물"은 포유동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 랫트 또는 마우스이다. 일 구현예에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
용어 "약제학적 조성물" 및 "약제학적 제형"(또는 "제형")은 상호교환적으로 사용되며 치료학적 유효량의 활성 약제학적 성분과 함께 환자, 예컨대, 이를 필요로 하는 사람에게 투여될 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 혼합물 또는 용액을 나타낸다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 생물학적이지 않거나 달리 바람직하지 않고 가축 뿐만 아니라 사람 약제학적 용도를 위해 허용가능한 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 물질의 자질을 나타낸다. "약제학적으로 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기하지 않고, 비교적 무독성인 물질, 예를 들면, 담체 또는 희석제를 지칭할 수 있는데, 즉, 물질은 목적하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 이것이 함유된 조성물의 임의의 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개체(individual)에게 투여될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 부형제", "약제학적으로 허용되는 담체" 및 "치료학적으로 불활성인 부형제"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 치료학적 활성이 없고 투여된 대상체에게 무독성인 약제학적 조성물 내 임의의 약제학적으로 허용되는 성분, 예를 들면, 약제학적 제품을 제형화하는데 사용된 붕해제, 결합제, 충전제, 용매, 완충제, 독성제, 안정화제, 항산화제, 표면활성제, 담체, 희석제, 부형제, 방부제 또는 윤활제를 나타낸다.
용어 "재조합 폴리핵산" 또는 "재조합 RNA"는 천연적으로 존재하지 않으며 시험관 내(in vitro)에서 합성 또는 조작되는 폴리핵산 또는 RNA를 지칭할 수 있다. 재조합 폴리핵산 또는 RNA는 실험실에서 합성될 수 있고 DNA 또는 RNA의 효소적 변형, 예를 들면, 효소 제한 분해, 연결, 및 클로닝을 사용함으로써 재조합 DNA 또는 RNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 재조합 폴리핵산은 시험관 내에서 전사되어 전령 RNA(mRNA)를 생산할 수 있고 재조합 mRNA는 단리, 정제되고, 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 재조합 폴리핵산 또는 RNA는 단백질, 폴리펩타이드, 표적 모티프, 신호 펩타이드, 및/또는 비-암호화 RNA, 예를 들면, 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화할 수 있다. 적합한 조건 하에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA는 세포 내로 혼입되어 세포 내에서 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 폴리 핵산, 유전자, DNA, 또는 RNA의 "발현"은 폴리핵산, 유전자, DNA, 또는 RNA의 전사 및/또는 해독을 지칭할 수 있다. 단어 본원에 사용된 바와 같은 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA의 발현을 "조절하는", "증가시키는", "상향조절하는", "감소시키는", 또는 "하향조절하는"은 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA의 전사 및/또는 해독에 영향을 미침으로써 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 수준을 조절, 증가, 상향조절, 감소, 하향조절함을 지칭할 수 있다. 용어 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA의 발현을 "억제하는"은 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA의 전사 및/또는 해독에 영향을 미쳐서 폴리핵산, 유전자, 예를 들면, 목적한 유전자, DNA, 또는 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질이 수준이 감소되거나 폐기되도록 함을 지칭할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 2개 이상의 핵산 서열 사이의 기능적 관계, 예컨대, 전사된 서열에 대한 전사 조절 또는 신호 서열의 기능적 관계를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 표적 모티프 또는 표적 모티프를 암호화하는 핵산은 이것이 암호화 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 세포 막, 세포내, 또는 세포외 구획으로 표적화하는데 관여하는 프레단백질로서 발현되는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 신호 펩타이드 또는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산은 이것이 암호화 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 프레단백질로서 발현된 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 프로모터는 이것이 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 작동적으로 연결된다.
용어 "코작 서열(Kozak sequence)", "코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)", 또는 "코작 컨센서스(Kozak consensus)"는 단백질 해독 개시 부위로서 기능하는 핵산 서열 모티프를 지칭할 수 있다. 코작 서열은 문헌, 예컨대, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Kozak, M., Gene 299(1-2):1-34에 의해 길이에서 기술되어 있다.
작제물 설계
본원에 개시된 본 발명은 (i) 하나 이상의 표적 RNA(예컨대, mRNA)에 결합할 수 있는 siRNA 및 (ii) 단일 RNA 전사체로부터의 하나 이상의 목적한 유전자를 발현하는 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 지칭한다. 본 발명은 (i) 하나 이상의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 (ii) 단일 RNA 전사체로부터의 동시에 하나 이상의 목적한 단백질을 발현시키기 위한 수단을 제공한다. 본 발명은 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물 내 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 발현을 하향조절하지만 동시에 목적한 유전자는 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질의 수준을 증가시키기 위해 발현되거나 과발현된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 (i) 다수의 mRNA 및 다수의 목적한 유전자를 표적화할 수 있는 siRNA, (ii) 하나의 mRNA 및 동일한 목적한 유전자의 다수의 카피를 표적화할 수 있는 siRNA의 다수의 카피, 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 다수의 mRNA 및 동일한 목적한 유전자의 다수의 카피를 표적화하는 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 하나의 mRNA 및 다수의 목적한 유전자를 표적화할 수 있는 siRNA의 다수의 카피를 포함한다.
일부 양태에서, (i) 표적 전령 RNA(mRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, 표적에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 분리된다. 일부 구현예에서, 표적에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 핵산 서열에 의해 분리된다. 일부 구현예에서 분리되는 핵산 서열은 링커를 암호화하거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 무작위(in tandem)로 정렬되어 있다. 예를 들면, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 내에 삽입되지 않는다. 예를 들면, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 인트론 서열 내에 삽입되지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물은 링커를 추가로 포함하거나 이를 암호화한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (i) 및 (ii)를 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. tRNA 시스템은 살아있는 유기체에 거쳐 진화적으로 보존되어 있고 내인성 RNases P 및 Z를 활용하여 다중시스트론성 작제물(multicistronic construct)을 프로세싱한다(Dong et al., 2016). 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA (서열 번호: 24)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 포함되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서 (i) 및 (ii)는 3' 내지 5' 방향으로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 순차적인 방식으로 포함되지 않거나 존재하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 순차적인 방식으로 포함되거나 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)은 순차적인 방식으로 포함되거나 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 표적 mRNA의 엑손에 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되지 않거나 이에 포함된다. 일부 양태에서, 목적한 유전자 RNA는 스플라이싱없이 발현된다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 나란히(in tandem) 정렬될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA는 분리된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA는 나란히 정렬된다. 예를 들면, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA는 조성물 내에 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA의 상부 또는 하부에 위치한다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 조성물이 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 상부(또는 에 대해 5')의 상부의 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 3')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 경우 증가된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 조성물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 5' 내지 3' 방향으로 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자 발현과 비교하여, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 3' 내지 5' 방향으로 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우 증가된다.
본원에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 포함된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물에서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물은 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 순차적인 방식으로 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 3' 내지 5' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 5' 내지 3' 방향으로 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 복적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 3')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 상부(또는 에 대해 5')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 순차적인 방식이 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부(에 대해 5')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 5' 내지 3' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열및 목적한 유전자를 3' 내지 5' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우 증가된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 상부(또는 에 대해 3')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 5')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 경우 증가된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 순차적인 방식이 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부(에 대해 5')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우 증가된다.
일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향 조절은, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 5')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 3')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 경우 향상된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향 조절은, 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 5' 내지 3' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 3' 내지 5' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우 향상된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향조절은 순차적인 방식이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부(에 대해 5')에 위치한 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 순차적인 방식이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우 향상된다.
일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향조절은 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부(또는 에 대해 3')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 상부(또는 에 대해 5')의 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향조절은 표적 RNA에 결합할 수 있는 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 3' 내지 5' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물로부터의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 조성물이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 5' 내지 3' 방향으로 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA의 하향조절은 순차적인 방식이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여, 순차적인 방식이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 5')에 위치한 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우 감소된다.
일부 구현예에서, 순차적인 방식이 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 순차적인 방식이 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의, siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 5')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우, 목적한 유전자의 발현은 증가되고, 표적 RNA의 하향조절은 향상된다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 약 2배 내지 약 30배이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 약 2배 내지 약 30배이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 15배, 약 2배 내지 약 17배, 약 2배 내지 약 18배, 약 2배 내지 약 19배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 21배, 약 2배 내지 약 22배, 약 2배 내지 약 25배, 약 2배 내지 약 30배, 약 5배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 15배, 약 5배 내지 약 17배, 약 5배 내지 약 18배, 약 5배 내지 약 19배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 21배, 약 5배 내지 약 22배, 약 5배 내지 약 25배, 약 5배 내지 약 30배, 약 10배 내지 약 15배, 약 10배 내지 약 17배, 약 10배 내지 약 18배, 약 10배 내지 약 19배, 약 10배 내지 약 20배, 약 10배 내지 약 21배, 약 10배 내지 약 22배, 약 10배 내지 약 25배, 약 10배 내지 약 30배, 약 15배 내지 약 17배, 약 15배 내지 약 18배, 약 15배 내지 약 19배, 약 15배 내지 약 20배, 약 15배 내지 약 21배, 약 15배 내지 약 22배, 약 15배 내지 약 25배, 약 15배 내지 약 30배, 약 17배 내지 약 18배, 약 17배 내지 약 19배, 약 17배 내지 약 20배, 약 17배 내지 약 21배, 약 17배 내지 약 22배, 약 17배 내지 약 25배, 약 17배 내지 약 30배, 약 18배 내지 약 19배, 약 18배 내지 약 20배, 약 18배 내지 약 21배, 약 18배 내지 약 22배, 약 18배 내지 약 25배, 약 18배 내지 약 30배, 약 19배 내지 약 20배, 약 19배 내지 약 21배, 약 19배 내지 약 22배, 약 19배 내지 약 25배, 약 19배 내지 약 30배, 약 20배 내지 약 21배, 약 20배 내지 약 22배, 약 20배 내지 약 25배, 약 20배 내지 약 30배, 약 21배 내지 약 22배, 약 21배 내지 약 25배, 약 21배 내지 약 30배, 약 22배 내지 약 25배, 약 22배 내지 약 30배, 또는 약 25배 내지 약 30배. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 21배, 약 22배, 약 25배, 또는 약 30배이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 적어도 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 21배, 약 22배, 또는 약 25배이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현에서의 상대적인 증가는 최대 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배, 약 21배, 약 22배, 약 25배, 또는 약 30배이다.
구현예에서, 표적 RNA 하향조절의 상대적인 향상은 약 1.1배 내지 약 5배이다. 구현예에서, 표적 RNA 하향조절의 상대적인 향상은 약 1.1배 내지 약 1.75배, 약 1.1배 내지 약 2배, 약 1.1배 내지 약 2.25배, 약 1.1배 내지 약 2.5배, 약 1.1배 내지 약 3배, 약 1.1배 내지 약 3.5배, 약 1.1배 내지 약 4배, 약 1.1배 내지 약 4.5배, 약 1.1배 내지 약 5배, 약 1.5배 내지 약 1.75배, 약 1.5배 내지 약 2배, 약 1.5배 내지 약 2.25배, 약 1.5배 내지 약 2.5배, 약 1.5배 내지 약 3배, 약 1.5배 내지 약 3.5배, 약 1.5배 내지 약 4배, 약 1.5배 내지 약 4.5배, 약 1.5배 내지 약 5배, 약 1.75배 내지 약 2배, 약 1.75배 내지 약 2.25배, 약 1.75배 내지 약 2.5배, 약 1.75배 내지 약 3배, 약 1.75배 내지 약 3.5배, 약 1.75배 내지 약 4배, 약 1.75배 내지 약 4.5배, 약 1.75배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 2.25배, 약 2배 내지 약 2.5배, 약 2배 내지 약 3배, 약 2배 내지 약 3.5배, 약 2배 내지 약 4배, 약 2배 내지 약 4.5배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2.25배 내지 약 2.5배, 약 2.25배 내지 약 3배, 약 2.25배 내지 약 3.5배, 약 2.25배 내지 약 4배, 약 2.25배 내지 약 4.5배, 약 2.25배 내지 약 5배, 약 2.5배 내지 약 3배, 약 2.5배 내지 약 3.5배, 약 2.5배 내지 약 4배, 약 2.5배 내지 약 4.5배, 약 2.5배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 3.5배, 약 3배 내지 약 4배, 약 3배 내지 약 4.5배, 약 3배 내지 약 5배, 약 3.5배 내지 약 4배, 약 3.5배 내지 약 4.5배, 약 3.5배 내지 약 5배, 약 4배 내지 약 4.5배, 약 4배 내지 약 5배, 또는 약 4.5배 내지 약 5배이다. 구현예에서, 표적 RNA 하향조절의 상대적인 향상은 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 또는 약 5배이다. 구현예에서, 표적 RNA 하향조절의 상대적인 향상은 적어도 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 또는 약 4.5배이다. 구현예에서, 표적 RNA 하향조절의 상대적인 향상은 최대 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 또는 약 5배이다.
일부 구현예에서, 순차적인 방식이 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 3')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우의 목적한 유전자의 발현과 비교하여, 순차적인 방식이 2개 이상의 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(에 대해 5')에 위치한 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 경우, 목적한 유전자의 발현은 약 2배 내지 약 30배까지 증가되고, 표적 RNA의 하향조절은 약 1.1배 내지 약 5배까지 향상된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 링커를 추가로 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (i) 및 (ii)를 연결한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA (서열 번호: 24)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 링커는 2A 펩타이드 링커이다. 일부 양태에서, 재조합 핵산 작제물에 의해 암호화되거나 포함된 링커는 길이가 적어도 6개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물에 의해 암호화되거나 포함된 링커는 길이가 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 또는 적어도 40개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 50개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 80개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 10개 이하, 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 35개 이하, 40개 이하, 45개 이하, 50개 이하, 55개 이하, 60개 이하, 65개 이하, 70개 이하, 또는 75개 이하의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 80개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커는 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 60개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 70개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 80개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 길이가 약 40개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 길이가 약 40개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 45개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 50개의 핵산 잔기. 일부 양태에서, 링커는 길이가 약 6개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 50개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커는 적어도 길이가 약 6개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 45개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커는 최대 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 20개의 핵산 잔기, 길이가 약 25개의 핵산 잔기, 길이가 약 30개의 핵산 잔기, 길이가 약 35개의 핵산 잔기, 길이가 약 40개의 핵산 잔기, 길이가 약 45개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 50개의 핵산 잔기이다.
일부 양태에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 약 6 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커는 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 약 7 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 약 9 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 11 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14 핵산 잔기, 길이가 약 6개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 7 핵산 잔기 내지 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 9개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 9개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 길이가 약 13개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 길이가 약 13개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 14개의 핵산 잔기 내지 길이가 약 15개의 핵산 잔기. 일부 양태에서, 링커는 길이가 약 6개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 15개의 핵산 잔기. 일부 양태에서, 링커는 적어도 길이가 약 6개의 핵산 잔기, 길이가 약 7개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 14개의 핵산 잔기이다. 일부 양태에서, 링커는 최대 길이가 약 7개의 핵산 잔기, 길이가 약 8개의 핵산 잔기, 길이가 약 9개의 핵산 잔기, 길이가 약 10개의 핵산 잔기, 길이가 약 11개의 핵산 잔기, 길이가 약 12개의 핵산 잔기, 길이가 약 13개의 핵산 잔기, 길이가 약 14개의 핵산 잔기, 또는 길이가 약 15개의 핵산 잔기이다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물는 환형이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 선형이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산은 RNA이다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재한다. 프로모터의 비-제한적 예는 T3, T7, SP6, P60, Syn5, 및 KP34 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 T3 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 SP6 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 P60 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 Syn5 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 KP34 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 T7 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 TAATACGACTCACTATA(서열 번호: 25)를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 코작 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 코돈-최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 RNA 작제물을 전사하기 위해 본 발명에서 사용된 재조합 폴리핵산 및 본 발명의 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화된다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예컨대, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 이러한 숙주 세포의 유전자 내에서 보다 흔하게 또는 가장 흔하게 사용된 코돈으로 대체함으로써 목적한 숙주 세포 내에서 발현시키기 위한 핵산 서열을 변형시키는 공정을 지칭한다. 코돈 사용 표는 예를 들면, "코돈 사용 데이타베이스(Codon Usage Database)"에서 용이하게 이용가능하고 이러한 표는 다수의 방식으로 채택될 수 있다. 특수한 숙주 세포내에서 발현시키기 위해 특수한 서열을 최적화시키는 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘, 예를 들면, Gene Forge®(Aptagen, 펜실베니아주) 및 GeneOptimizer®(ThermoFischer, 매사츄세츠주)가 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 코돈-최적화되지 않을 수 있다.
일부 양태에서, (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA 또는 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 목적한 유전자를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 당해 구현에에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일하거나 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다. 일 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화할 수 있고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의, 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 및 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 암호화하고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 상이한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1 및 제2의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1 및 제2의 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 3개는 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 다른 2개는 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1 및 제2의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1 및 제2의 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 다른 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 다른 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제3의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1, 제2, 및 제3의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1, 제2, 및 제3의 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 2개는 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제3의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1의 표적 mRNA, 제2의 표적 mRNA, 및 제3의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 동일한 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1, 제2, 및 제3의 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 3개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 목적한 유전자를 암호화하고 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 3개는 제1의 목적한 유전자를 암호화하고 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 2개는 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 3개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 목적한 유전자를 암호화하고, 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제3의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 3개는 제1의 목적한 유전자를 암호화하고, 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제3의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 및 3개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1 및 제2의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 목적한 유전자를 암호화하고 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1 및 제2의 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 다른 2개는 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1 및 제2의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 3개는 제1의 목적한 유전자를 암호화하고 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 2개는 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자 및 제2의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1 및 제2의 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 및 3개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 다른 하나 이상은 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열 중 다른 하나 이상은 제3의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1의, 제2의, 및 제3의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제1의 목적한 유전자를 암호화하고, 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 및 목적한 유전자를 암호화하는 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 제3의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는 siRNA가 결합할 수 있는 제1, 제2, 및 제3의 표적 mRNA와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 2개는 제1의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제2의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, siRNA를 암호화 또는 포함하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제3의 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 여기서 제1의 표적 mRNA, 제2의 표적 mRNA, 및 제3의 표적 mRNA는 상이하고, 여기서 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 3개는 제1의 목적한 유전자를 암호화하고, 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제2의 목적한 유전자를 암호화하고, 및 목적한 유전자를 암호화하는 5개의 핵산 서열 중 하나는 제3의 목적한 유전자를 암호화하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자는 상이하고, 여기서 제1의 목적한 유전자, 제2의 목적한 유전자, 및 제3의 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는siRNA가 결합할 수 있는 제1, 제2, 및 제3의 표적 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서 여기서 다수의 목적한 유전자는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되고, 모든 목적한 유전자는 동일한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 모든 목적한 유전자는 상이한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 목적한 유전자는 동일한 단백질을 암호화하고 적어도 하나의 목적한 유전자는 상이한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 여기서 다수의 siRNA는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되거나 포함되고, 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되거나 포함된 모든 siRNA는 동일한 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 siRNA는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 siRNA는 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있고 적어도 하나의 siRNA는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 여기서 폴리뉴클레오타이드 작제물에 의해 암호화되거나 포함된 다수의 siRNA는 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있고, siRNA 중 모두 또는 일부는 동일하거나 상이한 표적 RNA 결합 부위에 결합할 수 있다.
재조합 RNA 작제물
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물는 재조합 RNA 작제물이다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 네이크드(naked) RNA이다. 바람직한 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 5' 캡(예컨대, 항-리버스 캡 유사체, 클린 캡(Clean Cap), 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 록킹된(Locked) 핵산 캡(LNA-cap) 등), 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosome entry site; IRES), 및/또는 폴리(A) 테일을 3' 말단에서 포함함으로써 해독을 증진시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 임의의 숙련가에게 공지된 해독을 증진시키는 영역을 추가로 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 항-리버스 캡 유사체, 클린 캡, 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 록킹된 핵산 캡 (LNA-cap)을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 m27,3'-OG(5')ppp(5')G, m7G, m7G(5')G, m7GpppG, 또는 m7GpppGm를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A) 테일을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 폴리(A) 테일을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)(서열 번호: 192)의 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 또는 220개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)(서열 번호: 191)의 1 내지 220개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)(서열 번호: 194)의 1 내지 20, 1 내지 40, 1 내지 60, 1 내지 80, 1 내지 100, 1 내지 120, 1 내지 140, 1 내지 160, 1 내지 180, 1 내지 200, 1 내지 220, 20 내지 40, 20 내지 60, 20 내지 80, 20 내지 100, 20 내지 120, 20 내지 140, 20 내지 160, 20 내지 180, 20 내지 200, 20 내지 220, 40 내지 60, 40 내지 80, 40 내지 100, 40 내지 120, 40 내지 140, 40 내지 160, 40 내지 180, 40 내지 200, 40 내지 220, 60 내지 80, 60 내지 100, 60 내지 120, 60 내지 140, 60 내지 160, 60 내지 180, 60 내지 200, 60 내지 220, 80 내지 100, 80 내지 120, 80 내지 140, 80 내지 160, 80 내지 180, 80 내지 200, 80 내지 220, 100 내지 120, 100 내지 140, 100 내지 160, 100 내지 180, 100 내지 200, 100 내지 220, 120 내지 140, 120 내지 160, 120 내지 180, 120 내지 200, 120 내지 220, 140 내지 160, 140 내지 180, 140 내지 200, 140 내지 220, 160 내지 180, 160 내지 200, 160 내지 220, 180 내지 200, 180 내지 220, 또는 200 내지 220개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 폴리(A)(서열 번호: 195)의 1, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 또는 220개 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 은 폴리(A)(서열 번호: 199)의 적어도 1, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 은 폴리(A)(서열 번호: 196)의 최대 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 또는 220개 염기 쌍을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 폴리(A) 테일은 은 폴리(A)(서열 번호: 193)의 120개 염기 쌍을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 변형된 및 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 변형된 재조합 RNA 작제물에서, 우리딘 뉴클레오타이드의 1 내지 100%, 바람직하게는 10 내지 100%, 보다 바람직하게는 50 내지 100%, 심지어 보다 바람직하게는 90 내지 100%, 가장 바람직하게는 100%는 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 DNA 작제물로부터 전사된 재조합 RNA 작제물은 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 DNA 작제물로부터 전사된 재조합 RNA 작제물 내 우리딘 뉴클레오타이드의 100%는 변형된다. 일부 구현예에서, 아데노신-, 구아노신-, 및 사이티딘-함유 뉴클레오타이드는 변형되지 않거나 부분적으로 변형되고, 이는 바람직하게는 변형되지 않은 형태로 존재한다. 바람직하게는 재조합 RNA 작제물 내 변형된 우리딘 뉴클레오타이드의 함량은 5 내지 25%의 범위에 놓을 수 있다. 변형된 우리딘 뉴클레오타이드의 비-제한적 예는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 또는 N1-메틸슈도-UTP을 포함하고 당해 분야에 공지된 변형된 우리딘 뉴클레오타이드를 활용할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 변형된 및 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 여기서 이러한 변형된 재조합 RNA 작제물에서, 우리딘 뉴클레오타이드의 1 내지 100%, 바람직하게는 10 내지 100%, 보다 바람직하게는 50 내지 100%, 심지어 보다 바람직하게는 90 내지 100%, 가장 바람직하게는 100%는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-메틸슈도-UTP, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 변형된 우리딘 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 변형된 및 변형되지 않은 뉴클레오타이드의 조합을 함유할 수 있고, 여기서 이러한 변형된 재조합 RNA 작제물에서, 우리딘 뉴클레오타이드의 1 내지 100%, 바람직하게는 10 내지 100%, 보다 바람직하게는 50 내지 100%, 심지어 보다 바람직하게는 90 내지 100%, 가장 바람직하게는 100%는 N1-메틸슈도우리딘을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 DNA 작제물로부터 전사된 재조합 RNA 작제물은 N1-메틸슈도우리딘을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 DNA 작제물로부터 전사된 재조합 RNA 작제물내 우리딘 뉴클레오타이드 중 100%는 N1-메틸슈도우리딘으로 변형된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연의 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예컨대, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 이러한 숙주 세포의 유전자 내에서 흔히 또는 가장 흔히 사용된 코돈으로 대체시킴으로써 목적한 숙주 세포 내 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 지칭한다. 코돈 사용 표는 예를 들면, "코돈 사용 데이타베이스"에서 용이하게 이용가능하고, 이러한 표는 다수의 방식으로 채택될 수 있다. 특수한 숙주 세포에서 발현시키기 위한 특수한 서열을 최적화하기 위한 코돈에 대한 컴퓨터 알고리즘, 예를 들면, Gene Forge® (Aptagen, 펜실베니아주) 및 GeneOptimizer®(ThermoFischer, 매사츄세츠주)이 또한 이용가능하하며, GeneOptimizer®(ThermoFischer, 매사츄세츠주)가 바람직하다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화되지 않을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 인터류킨 8(IL-8) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)을 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 인터류킨 1 베타(IL-1 베타) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)을 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 인터류킨 17(IL-17) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파 또는 TNF-α) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 인터류킨 17(IL-17) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인터류킨 4(IL-4)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 폴리핵산 작제물, 예컨대, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 8 및 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 액티빈 수용체-유사 키나제-2(ALK2) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (i) 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1) 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 에리트로포이에틴(EPO)을 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열 번호: 152 내지 158로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 177 내지 189 중 어느 하나에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 서열 번호: 177 내지 189로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이다.
다른 바람직한 구현예에서 본 발명은 서열 번호: 190의 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이다.
일부 양태에서, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 RNA 작제물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, RNA 작제물은 시험관 내 전사에 의해 생산된다. 당해 구현예에서, (i) 프로모터, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 폴리(A) 테일을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물; (ii) RNA 폴리머라제; 및 (iii) 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP)의 혼합물이 시험관 내("세포 유리된") 전사를 위해 제공된다. 시험관 내 전사를 사용하여 RNA를 생산하는 것 뿐만아니라 전사된 RNA를 단리 및 정제하는 것에 대한 세부사항은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌: Beckert & Masquida ((2011) Synthesis of RNA by In vitro Transcription. RNA. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 703. Humana Press)에서 찾을 수 있다. 시험관 내 전사 키트의 비-제한적 목록은 MEGAscript™ T3 전사 키트, MEGAscript T7 키트, MEGAscript™ SP6 전사 키트, MAXIscript™ T3 전사 키트, MAXIscript™ T7 전사 키트, MAXIscript™ SP6 전사 키트, MAXIscript™ T7/T3 전사 키트, MAXIscript™ SP6/T7 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ T3 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ T7 전사 키트, mMESSAGE mMACHINE™ SP6 전사 키트, MEGAshortscript™ T7 전사 키트, HiScribe™ T7 소 수율 RNA 합성 키트, HiScribe™ T7 시험관 내 전사 키트, AmpliScribe™ T7-Flash™ 전사 키트, AmpliScribe™ T7 고 수율 전사 키트, AmpliScribe™ T7-Flash™ 바이오틴-RNA 전사 키트, T7 전사 키트, 고수율 T7 RNA 합성 키트, DuraScribe® T7 전사 키트 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리핵산 작제물은 선형일 수 있다. 시험관 내 전사 반응은 전사 완충제 시스템, 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP), 및 RNase 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 완충제 시스템은 디티오트레이톨(DTT) 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있다. NTP는 천연적으로 존재하거나 비-천연 발생(변형된) NTP일 수 있다. 비-천연 발생(변형된) NTP의 비-제한적 예는 N1-메틸슈도우리딘, 슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-메톡시메틸슈도우리딘, N1-프로필슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-카복시메틸에스테르우리딘, 5-포르밀우리딘, 5-카복시우리딘, 5-하이드록시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 6-아자우리딘, 티에노우리딘, 3-메틸우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-메틸사이티딘, 5-메톡시사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, 5-카복시사이티딘, 5-하이드록시사이티딘, 5-요오도사이티딘, 5-브로모사이티딘, 2-티오사이티딘, 5-아자사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘, N4-아세틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, N4-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, N1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-메틸-2-아미노아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다. DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 비-제한적 예는 T3, T7, SP6, P60, Syn5, 및 KP34 RNA 폴리머라제를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, P60 RNA 폴리머라제, Syn5 RNA 폴리머라제, 및 KP34 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 SP6 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 P60 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 Syn5 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 KP34 RNA 폴리머라제이다. 바람직한 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다.
추가의 구현예에서, 전사된 RNA는 시험관 내 전사 반응 혼합물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 당해 구현예에서, 전사된 RNA는 단리 및 컬럼 정제를 사용하여 정제할 수 있다. 시험관 내 전자 반응 혼합물로부터 전사된 RNA의 단리 및 정제의 세부사항은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 임의의 상업적으로 이용가능한 키트를 사용할 수 있다. RNA 정제 키트의 비-제한적인 목록은 MEGAclear kit, Monarch® RNA 클린업 키트(Cleanup Kit), EasyPure® RNA 정제 키트, NucleoSpin® RNA 클린-업 등을 포함한다.
바이러스 질환 또는 병태를 치료하기 위한 재조합 폴리핵산 작제물
본 발명의 재조합 폴리핵산 작제물은 바이러스 감염과 관련된 질환 및 병태의 치료를 향해 지시될 수 있다. 이러한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 특정의 표적(들)에 결합할 수 있는 단일 또는 다수의 작은 간섭 RNA(siRNA) 종을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 및 과발현을 위한 단일 또는 다수의 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공함으로써 동시에 하나 이상의 단백질의 발현을 하향조절하고 하나 이상의 단백질의 발현을 상향조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산은 RNA이다.
일부 양태에서, (i) 표적 RNA(예컨대, mRNA 또는 비암호화 RNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고; 여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향으로 배향된다((i)의 성분은 (ii)의 성분의 상부에 존재한다). 일부 구현예에서, (i) 및 (ii)는 5' 내지 3' 방향에 배향되지 않는다(예컨대, (ii)의 성분(들)은 (i)의 성분의 상부에 존재한다). 일부 구현예에서, 표적 RNA(예컨대, mRNA 또는 비암호화 RNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA(예컨대, mRNA 또는 비암호화 RNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부에 존재한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 (i) 및 (ii)를 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 RNA(예컨대, mRNA 또는 비암호화 RNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 환형이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 선형이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 DNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 RNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 1 내지 8 또는 29 내지 47 중 하나에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 152 내지 158중 하나에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 177 내지 190 중 하나에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 1 내지 220 A 잔기(서열 번호: 191)를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 항-리버스 캡 유사체(anti-reverse cap analog), 클린 캡, 캡 0, 캡 1, 캡 2, 또는 록킹된 핵산 캡(LNA-cap)을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 m27,3'-OG(5')ppp(5')G, m7G, m7G(5')G, m7GpppG, 또는 m7GpppGm을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T3, T7, SP6, P60, Syn5, 및 KP34로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T7 프로모터이다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 목적한 유전자를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재한다. 일부 구현예에서, T7 프로모터는 서열 TAATACGACTCACTATA(서열 번호: 25)를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 코작 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 코작 서열은 GCCACC(서열 번호: 26)이다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 1 내지 10개의 siRNA 종을 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 종은 동일하다. 일부 구현예에서, siRNA 종은 상이하다. 일부 구현예에서, 일부 siRNA 종은 동일하고 일부는 상이하다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 및 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) 인터페론 베타(IFN-베타)를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 또는 30(화합물 B1 또는 B2)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R(IL-6R) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 31(화합물 B3)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 32(화합물 B4)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 33(화합물 B5)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) ACE2 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 34 또는 35(화합물 B6 또는 B7)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA (siRNA), SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예컨대, 화합물 B8(서열 번호: 36)를 포함하는 조성물은 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 37 또는 39(화합물 B9 또는 B11)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 38(화합물 B10)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된, 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 예컨대, SARS CoV, MERS-CoV, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS-CoV의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42(화합물 B12, B13, 및 B14) 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, (ii)에서의 재조합 폴리핵산 작제물은 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45(화합물 B15, B16, 및 B17) 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 46(화합물 B18)에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190(화합물 B18)에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된, 1개의 siRNA를 포함하거나 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하거나 암호화하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 47(화합물 B19)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, IFN-베타 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 변형된 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 190에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재 또는 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 조성물 및 관련된 방법을 제공하고, 여기서 조성물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하고; 여기서: siRNA는 IL-8 mRNA, IL-1 베타 mRNA, IL-17 mRNA, TNF-알파mRNA, SARS CoV-2 ORF1ab RNA(다단백질 PP1ab, 예컨대, 비암호화 영역 또는 이것이 다음으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 경우: SARS CoV-2 비구조 단백질(NSP), Nsp1, Nsp3(Nsp3b, Nsp3c, PLpro, 및 Nsp3e), Nsp7_Nsp8 복합체, Nsp9-Nsp10, 및 Nsp14-Nsp16, 3CL프로, E-채널(E 단백질), ORF7a, C-말단 RNA 결합 도메인(CRBD), N-말단 RNA 결합 도메인(NRBD), 헬리카제, 및 RdRp), SARS CoV-2 스파이크 단백질(S) mRNA, SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N) mRNA, 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) mRNA, 인터류킨 mRNA(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 인터류킨 1(예컨대, IL-1알파, IL-1베타), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타), 인터류킨 18(IL-18), 인터류킨 36-알파(IL-36-알파), 인터류킨 36-베타(IL-36-베타), 인터류킨 36-감마(IL-36-감마), 인터류킨 33(IL-33)), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2) mRNA, 막 관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) mRNA, 및 암호화 NSP12 및 13 RNA로부터 선택된 RNA를 표적화하고; 목적한 유전자는 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화하고: IGF-1, IL-4, IGF-1(예를 들면, 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 이의 유도체), 카복시펩티다제(예컨대, ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ, SCPEP1); 사이토킨(예컨대, BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, 및 XCL2); 세포외 리간드 및 트랜스포터(예컨대, APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25, VWC2L); 세포외 매트릭스 단백질(예컨대, ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR, TNXB); 글루코시다제(AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5, SPACA5B); 글리코실트랜스퍼라제(예컨대, ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1, XYLT1); 성장 인자(예컨대, AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF-1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, WISP3); 성장 인자 결합 단백질(예컨대, CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1, 및 WIF1); 헤어핀 결합 단백질(예컨대, ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1, VTN); 호르몬(예컨대, ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B, 및 VIP); 하이드롤라제(예컨대, AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1, 및 THSD4); 면역글로불린(예컨대, IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2, IGLC3); 이소머라제(예컨대, NAXE, PPIA, PTGDS); 키나제(예컨대, ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS, PKDCC); 리아제(예컨대, PM20D1, PAM, CA6); 금속효소 억제제(예컨대, FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1, WFIKKN2); 메탈로프로테아제(예컨대, ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1, TLL2); 밀크 단백질(예컨대, CSN1S1, CSN2, CSN3, LALBA); 신경활성 단백질(예컨대, CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1, 및 TAC3); 프로테아제(예컨대, ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, TPSD1); 프로테아제 억제제(예컨대, A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7, SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6, WFDC8); 단백질 포스파타제(예컨대, ACP7, ACPP, PTEN, PTPRZ1); 에스테라제(예컨대, BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM, SIAE); 트랜스퍼라제(예컨대, METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9, B3GAT1); 혈관활성 단백질(예컨대, AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3, NTS), 제I형 인터페론(예컨대, IFN-α, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, 및 IFN-ω), 제II형 인터페론(예컨대, IFN-γ), 제III형 인터페론(예컨대, IFN-λ), 인터류킨, 예컨대, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바이러스 질환 또는 병태 치료용의 재조합 RNA 작제물
상기 기술된 바와 같이, 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 재조합 RNA 작제물이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물 또는 재조합 RNA 작제물은 바이러스 감염, 질환, 또는 병태의 치료 또는 예방용 조성물에서 유용하다. 일부 양태에서, 본 발명은 (i) 표적 RNA(예컨대, mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및 (ii) 목적한 유전자의 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공하고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 1 내지 10개의 siRNA 종을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA 종은 동일한데, 예컨대, 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 종은 상이한데, 예컨대, 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 siRNA 종은 동일하고 일부는 상이하다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 센스 및 안티-센스 siRNA 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 링커를 추가로 포함하거나 암호화한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결한다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 2A 펩타이드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 목적한 유전자(및 이에 의해 목적한 mRNA 및/또는 목적한 유전자에 상응하는 목적한 단백질을 암호화하는)를 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 각각은 목적한 유전자를 포함함으로써 각각은 목적한 mRNA 및/또는 유전자에 상응하는 목적한 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 mRNA 및/또는 목적한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 3개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 각각은 목적한 유전자를 포함함으로써 목적한 mRNA 및/또는 유전자에 상응하는 목적한 단백질을 각각 암호화한다. 일부 구현예에서, 3개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화할 수 있고/있거나, 동일한 목적한 mRNA를 암호화하고/하거나, 동일한 목적한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 3개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 포함할 수 있고/있거나, 상이한 목적한 mRNA를 암호화하고/하거나 상이한 목적한 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 3개 이상의 핵산 서열 중 2개 이상은 동일한 목적한 유전자를 포함할 수 있고/있거나, 동일한 목적한 mRNA를 암호화할 수 있고/있거나, 동일한 목적한 단백질을 암호화할 수 있지만, 3개 이상의 핵산 서열 중 하나 이상은 3개 이상의 핵산 서열 중 2개 이상으로부터 상이한 목적한 유전자를 암호화하고/하거나, 상이한 목적한 mRNA를 암호화하고/하거나 상이한 목적한 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자 또는 단백질의 발현 수준은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현함으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현 수준은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현함으로써 상향조절된다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 코돈-최적화되지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 RNA 작제물은 또한 표적화 모티프로서 지칭된, 표적 포티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및 (d) 천연에서 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되고, 단 단백질은 옥시도리덕타제가 아닌, 신호 펩타이드; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 신호 펩타이드; 및 (d) 천연에서 신호 펩타이드의 기능을 갖지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9는 2 초과의 평균 소수성 점수(average hydrophobic score)를 갖는다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 조성물을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 COVID-19이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2에 의한 감염에 의해 유발된 SARS(중증 급성 호흡기 증후군)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다. 일부 구현예에서, 대상체는 성인, 어린이, 또는 유아이다. 일부 구현예에서, 대상체는 반려 동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 고양이과, 개과, 또는 설치류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 개 또는 고양이이다.
일부 양태에서, 세포 내로 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 단일 RNA 전사체로부터 siRNA 및 mRNA를 동시 발현시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자의 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA 및 목적한 유전자의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자의 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA의 발현은 하향조절되고 목적한 유전자의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 상향조절된다.
일부 양태에서, 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA), 및 목적한 유전자의 mRNA를 포함하는 RNA 작제물을 생산하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이하고, 이러한 방법은: (a) 시험관 내 전사 반응을 위해: (i) 프로모터, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 목적한 유전자를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 폴리(A) 테일을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리핵산 작제물; (ii) RNA 폴리머라제; 및 (iii) 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP)의 혼합물을 제공하는 단계; 및 (b) 시험관 내 전사 반응 혼합물로부터 전사된 RNA를 단리 및 정제함으로써, RNA 작제물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, P60 RNA 폴리머라제, Syn5 RNA 폴리머라제, 및 KP34 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, NTP의 혼합물은 변형되지 않은 NTP를 포함한다. 일부 구현예에서, NTP의 혼합물은 변형된 NTP를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 NTP는 N1-메틸슈도우리딘, 슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, N1-메톡시메틸슈도우리딘, N1-프로필슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸우리딘, 5-카복시메틸에스테르우리딘, 5-포르밀우리딘, 5-카복시우리딘, 5-하이드록시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 6-아자우리딘, 티에노우리딘, 3-메틸우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-메틸사이티딘, 5-메톡시사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, 5-카복시사이티딘, 5-하이드록시사이티딘, 5-요오도사이티딘, 5-브로모사이티딘, 2-티오사이티딘, 5-아자사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘, N4-아세틸사이티딘, 5-포르밀사이티딘, N4-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, N1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-메틸-2-아미노아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)는 캡핑 효소를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전사된 RNA를 단리 및 정제하는 단계는 컬럼 정제를 포함한다.
일부 구현예에서, 이의 mRNA 표적에 대한 siRNA의 특이적인 결합은 조절, 예컨대, 기능 및/또는 활성의 하향조절을 유발하는 표적 mRNA의 정상적인 기능을 간섭하고, 여기서 특이적인 결합이 요구되는 조건 하에서, 즉, 생체 내 검정 또는 치료학적 치료의 경우에 생리학적 조건 하에서, 및 검정이 시험관 내 검정의 경우에 수행되는 조건 하에서, 비-표적 핵산 서열에 대한 siRNA의 비-특이적인 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 IL-6 mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 29 또는 30(화합물 B1 또는 B2)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R(IL-6R) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 IL-6R mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 31(화합물 B3)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-알파mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 IL-6R-알파mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 32(화합물 B4)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 33(화합물 B5)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) ACE2 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 CE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 ACE2 mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 34 또는 35(화합물 B6 또는 B7)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA (siRNA), SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 이러한 조성물, 예컨대, 화합물 B8(서열 번호: 36)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 37 또는 39(화합물 B9 또는 B11)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 38(화합물 B10)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 예컨대, SARS CoV, MERS, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위한, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42(화합물 B12, B13 및 B14) 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) IL-6 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 1개는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45(화합물 B15, B16, 및 B17) 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 46(화합물 B18)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 190에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 조성물은 3개의 siRNA를 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 RNA 작제물은 서열 번호: 47(화합물 B19)에 나타낸 바와 같은 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, IFN-베타 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 변형된 신호 펩타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 190에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 조성물 및 관련된 방법을 제공하고, 여기서 조성물은, 표적 RNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하고; 여기서:
siRNA는 다음으로부터 선택된 RNA를 표적화하고: IL-8 mRNA, IL-1 베타 mRNA, IL-17 mRNA, TNF-알파 mRNA, SARS CoV-2 ORF1ab RNA(다단백질 PP1ab, 예컨대, 비암호화 영역 내 또는 이것이 다음으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 경우: SARS CoV-2 비구조 단백질(NSP), Nsp1, Nsp3 (Nsp3b, Nsp3c, PLpro, 및 Nsp3e), Nsp7_Nsp8 복합체, Nsp9-Nsp10, 및 Nsp14-Nsp16, 3CLpro, E-채널(E 단백질), ORF7a, C-말단 RNA 결합 도메인(CRBD), N-말단 RNA 결합 도메인(NRBD), 헬리카제, 및 RdRp), SARS CoV-2 스파이크 단백질 (S) mRNA, SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N) mRNA, 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파) mRNA, 인터류킨 mRNA(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터류킨 1(예컨대, IL-1알파, IL-1베타), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R (IL-6R), 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타), 인터류킨 18 (IL-18), 인터류킨 36-알파(IL-36-알파), 인터류킨 36-베타(IL-36-베타), 인터류킨 36-감마(IL-36-감마), 인터류킨 33(IL-33)), 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2) mRNA, 막 관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) mRNA, 및 암호화 NSP12 및 13 RNA; 목적한 유전자는 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화한다: IGF-1, IL-4, IGF-1(예를 들면, 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 이의 유도체), 카복시펩티다제(예컨대, ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ, SCPEP1); 사이토킨(예컨대, BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, 및 XCL2); 세포외 리간드 및 트랜스포터(예컨대, APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25, VWC2L); 세포외 매트릭스 단백질(예컨대, ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR, TNXB); 글루코시다제(AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5, SPACA5B); 글리코실트랜스퍼라제(예컨대, ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1, XYLT1); 성장 인자(예컨대, AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF-1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, WISP3); 성장 인자 결합 단백질(예컨대, CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1, 및 WIF1); 헤파린 결합 단백질(예컨대, ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1, VTN); 호르몬(예컨대, ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B, 및 VIP); 하이드롤라제(예컨대, AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1, 및 THSD4); 면역글로불린(예컨대, IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2, IGLC3); 이소머라제(예컨대, NAXE, PPIA, PTGDS); 키나제(예컨대, ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS, PKDCC); 리아제(예컨대, PM20D1, PAM, CA6); 금속효소 억제제(예컨대, FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1, WFIKKN2); 메탈로프로테아제(예컨대, ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1, TLL2); 밀크 단백질(예컨대, CSN1S1, CSN2, CSN3, LALBA); 신경활성 단백질(예컨대, CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1, 및 TAC3); 프로테아제(예컨대, ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, TPSD1); 프로테아제 억제제(예컨대, A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7, SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6, WFDC8); 단백질 포스파타제(예컨대, ACP7, ACPP, PTEN, PTPRZ1); 에스테라제(예컨대, BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM, SIAE); 트랜스퍼라제(예컨대, METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9, B3GAT1); 혈관활성 단백질(예컨대, AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3, NTS), 제I형 인터페론(예컨대, IFN-α, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, 및 IFN-ω), 제II형 인터페론(예컨대, IFN-γ), 제III형 인터페론(예컨대, IFN-λ), 인터류킨, 예컨대, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체. 일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 바이러스 감염, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 피부 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 피부 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 피부 질환 또는 병태는 염증성 피부 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 염증성 피부 장애는 건선을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 근 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 근 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 근 질환 또는 병태는 골격근 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 골격근 장애는 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 신경변성 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 신경변성 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 신경변성 질환 또는 장내는 운동 뉴우런 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 운동 뉴우런 장애는 근위축성 측색 경화증(ALS)을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 관절 질환 또는 병태의 치료에 유용하다. 일부 양태에서, 조성물은 관절 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 충분한 양으로 존재하거나 투여된다. 일부 구현예에서, 관절 질환 또는 병태는 관절 변성을 포함한다. 일부 구현예에서, 관절 변성은 추간판 질환(IVDD) 또는 골관절염(OA)을 포함한다.
RNA 간섭 및 작은 간섭 RNA(siRNA)
RNA 간섭(RNAi) 또는 RNA 사일런싱은 RNA 분자가 표적 mRNA 분자를 중화시킴으로써, 유전자 발현 또는 해독을 억제하는 공정이다. RNAi 공정은 문헌: Mello & Conte (2004) Nature 431, 338-342, Meister & Tuschl (2004) Nature 431, 343-349, Hannon & Rossi (2004) Nature 431, 371-378, 및 Fire (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6966-6984에 기술되어 있다. 요약하면, 천연 공정에서, 반응은 dsRNA-특이적인 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의한 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 작은 dsRNA 단편 또는 헤어핀 또는 루프 구조를 지닌 siRNA로의 분해를 개시한다. 이러한 작은 dsRNA 단편 또는 siRNA는 이후에 RNA-유도된 슬라이싱 복합체(RISC)로 통합되어 RISC를 표적 mRNA 서열로 안내한다. 간섭 동안에, siRNA 듀플렉스(duplex)는 풀려서(unwind), 안티센스 가닥이 RISC와의 복합체 속에 남아 RISC가 mRNA 서열을 표적화하도록 함으로써 분해 및 단백질 해독의 순차적인 억제를 유도한다. 시판되는 합성 siRNA(예컨대, 파티시란 등)와 달리, 본 발명의 siRNA는 세포의 세포질 내에서 내인성 다이서 및 RISC 경로를 활용하여 본 발명의 mRNA 전사체로부터 절단되어 상술한 천연 공정을 따라간다. 또한, mRNA의 나머지로서 본 발명의 전사체는 다이서에 의한 siRNA의 절단 후 완전하게 남으며, 본 발명의 mRNA 전사체 내 목적한 유전자로부터 목적한 단백질 발현이 획득된다.
일부 양태에서, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 센스 siRNA 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 안티-센스 siRNA 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 센스 siRNA 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 안티-센스 siRNA 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명에 포함된 siRNA의 세부사항은 본원에 참고로 포함되는, 문헌: Cheng, et al. (2018) J. Mater. Chem. B., 6, 4638-4644에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA, 즉, siRNA의 센스 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 및 siRNA의 안티-센스를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열의 적어도 1개의 카피를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은, siRNA의 1개의 카피는 센스 siRNA의 1개의 카피 및 안티-센스 siRNA의 1개의 카피를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA의 1개 이상의 카피, 즉, siRNA의 센스 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열의 1개 이상의 카피 및 siRNA의 안티-가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열의 1개 이상의 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA1 내지 10개의 카피, 즉, siRNA의 센스 가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열의 1 내지 10개의 카피 및 siRNA의 안티-가닥을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열의 1 내지 10개의 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA의 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 2 내지 3, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 10, 3 내지 4, 3 내지 5, 3 내지 6, 3 내지 7, 3 내지 8, 3 내지 9, 3 내지 10, 4 내지 5, 4 내지 6, 4 내지 7, 4 내지 8, 4 내지 9, 4 내지 10, 5 내지 6, 5 내지 7, 5 내지 8, 5 내지 9, 5 내지 10, 6 내지 7, 6 내지 8, 6 내지 9, 6 내지 10, 7 내지 8, 7 내지 9, 7 내지 10, 8 내지 9, 8 내지 10, 또는 9 내지 10개의 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 카피를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 siRNA의 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 카피를 갖는다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 siRNA를 각각 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 연결시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 절단불가능한 링커일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 자가-절단가능한 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커일 수 있다. tRNA 시스템은 살아있는 유기체에 걸쳐 진화적으로 보존되어 있고 내인성 RNases P 및 Z를 활용하여 다중시스트론성 작제물(multicistronic construct)을 프로세싱한다(Dong et al., 2016). 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA (서열 번호: 24)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. siRNA가 결합할 수 있는 표적 mRNA의 비-제한적 예의 목록은 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파, 또는 TNF-α)를 암호화하는 mRNA를 포함한다. siRNA가 결합할 수 있는 표적 RNA의 추가의 예의 목록은 액티빈 수용체-유사 키나제-2(ALK2) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1(SOD1)를 암호화하는 mRNA를 포함한다.
일부 양태에서, siRNA는 코로나바이러스 RNA인 표적 RNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 RNA는 코로나바이러스 단백질을 암호화하는 표적 mRNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 RNA는 표적 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스는 알파코로나바이러스, 베타코로나바이러스, 감마코로나바이러스 또는 델타코로나바이러스이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 mRNA는 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화한다: SARS CoV-2 ORF1ab(다단백질 PP1ab); SARS CoV-2 스파이크 단백질(S), 및 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N). 일부 구현예에서, siRNA는 영역 내에서 또는 이것이 다음으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 경우 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있다: SARS CoV-2 비구조 단백질(NSP), Nsp1, Nsp3(Nsp3b, Nsp3c, PLpro, 및 Nsp3e), Nsp7_Nsp8 복합체, Nsp9-Nsp10, 및 Nsp14-Nsp16, 3CLpro, E-채널(E 단백질), ORF7a, C-말단 RNA 결합 도메인(CRBD), N-말단 RNA 결합 도메인(NRBD), 헬리카제, 및 RdRp. 일부 구현예에서, 표적 암호화 RNA는 SARS CoV-2 NSP12 및 13이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 코로나바이러스, 예컨대, SARS-CoV, SARS-CoV-2, 및/또는 MERS-CoV 중에서 보존된 코로나바이러스 단백질을 암호화하고, 상응하는 siRNA는 2개 이상의 상이한 질환 또는 병태, 예컨대, 하나 이상의 코로나바이러스에 의해 또는 이와 관련된 2개 이상의 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법에 유용하다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 SARS-CoV-2 Nsp15를 암호화하고, 이는 SARS-CoV의 유사한 단백질에 대해 89% 동일하고, 폴리핵산 작제물은 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 하나 이상의 코로나바이러스에 대해 일반적인 mRNA 표적 또는 비암호화 RNA 표적에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화 RNA 표적은 SARS CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV와 관련하여 Nsp12-Nsp13이다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 표적 RNA 및 임의의 상응하는 암호화된 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 공지되거나 본원에 참고로 포함된, 문헌, 예컨대, Wu, et al., 27 Feb 2020, Acta Pharmaceutica Sinica, preproof at doi.org/10.1016/j.apsb.2020.02.008에 기술된 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 숙주 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 사이토킨을 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이토킨을 암호화한다: 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터류킨(예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 인터류킨 1(예컨대, IL-1알파, IL-1베타), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 6R(IL-6R), 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파), 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타), 인터류킨 18(IL-18), 인터류킨 36-알파(IL-36-알파), 인터류킨 36-베타(IL-36-베타)), 인터류킨 36-감마(IL-36-감마), 및 인터류킨 33(IL-33)). 코비드-19에서 TNF-알파의 역할은 본원에 참고로 포함된, 문헌, 예컨대, Feldmann, et al., 9 Apr 2020, The Lancet S0140-6736(20)30858-8에서 논의되어 있다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 염증성 사이토킨을 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 숙주 바이러스 도입 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 숙주 바이러스 도입 단백질은 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2)이다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA는 숙주 효소를 암호화한다. 일부 구현예에서, 효소는 막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2)이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 비암호화 RNA이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 3개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 4개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 2 내지 10개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 작제물은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 2 내지 6개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화한다.
일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 이의 5' 해독되지 않은 영역 내에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 이의 3' 해독되지 않은 영역 내에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 해독된 영역 내에서 표적 mRNA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 억제된다. 본원에 기술된 바와 같은 표적 mRNA의 발현의 억제 또는 하향조절은 표적 mRNA를 간섭하여 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물 각각에 의해 암호화되거나 이에 포함된 표적 mRNA로부터 단백질의 해독을 간섭함을 지칭할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며; 따라서, 표적 mRNA의 발현의 억제 또는 하향조절은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 부재하에서 표적 mRNA로부터 발현된 단백질의 수준과 비교하여 표적 mRNA로부터 발현된 단백질의 감소된 수준을 지칭할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 발현의 수준은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있고 이는 웨스턴-블롯팅(Western-blotting), 유동 세포분석법(flow cytometry), ELISA, RIA, 및 다양한 단백질 유전 정보학(proteomics) 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드를 측정하거나 검출하기 위한 예시적인 방법은 면역검정, 예를 들면, ELISA이다. 단백질 정량화의 이러한 유형은 특정 항원을 포획할 수 있는 항체, 및 포획된 항원을 검출할 수 있는 제2의 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩타이드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 검정은 문헌: Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물이 본원에 제공되고 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자를 암호화하는 핵산에 결합할 수 없다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는다. 다른 바람직한 구현예에서, siRNA는 목적한 유전자의 발현을 하향조절하지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이, 목적한 유전자의 발현의 억제 또는 하향조절은 DNA의 전사 및/또는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물로부터의 단백질의 해독을 간섭함을 지칭할 수 있으나, 이에 한정되지 않으므로, 목적한 유전자의 발현의 억제 또는 하향조절은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물의 부재하에서 발현된 단백질의 수준과 비교하여 단백질의 감소된 수준을 지칭할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 발현의 수준은 당해 분야에 잘 공지된 임의의 방법으로 측정할 수 있고 이는 웨스턴-블롯팅, 유동 세포분석법, ELISA, RIA, 및 다양한 단백질 유전 정보학 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드를 측정하거나 검출하기 위한 예시적인 방법은 면역검정, 예를 들면, ELISA이다. 단백질 정량화의 이러한 유형은 특정 항원을 포획할 수 있는 항체, 및 포획된 항원을 검출할 수 있는 제2의 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩타이드를 검출 및/또는 측정하기 위한 예시적인 검정은 문헌: Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술되어 있다.
일부 양태에서, siRNA는 서열 번호: 80 내지 109로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, siRNA는 서열 번호: 80 내지 109로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 110 내지 139로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-8 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 80 내지 83으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-8 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 80 내지 83으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 110 내지 113으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-1 베타 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 84 내지 86으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-1 베타 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 84 내지 86으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 114 내지 116으로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 TNF-알파mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 87 내지 89로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 TNF-알파 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 87 내지 89로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 117 내지 119로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-17 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 90 내지 92로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-17 mRNA이고, 및 siRNA는 서열 번호: 90 내지 92로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 120 내지 122로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 93 내지 95로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 93 내지 95로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 123 내지 125로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6R 알파 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 96 내지 97로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6R 알파 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 96 및 97로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 125 및 127로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6R 베타 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 98에 나타낸 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 IL-6R 베타 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 98에 나타낸 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 128에 나타낸 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 ACE2 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 99 내지 101로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 ACE2 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 99 내지 101로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 129 내지 131로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 102 내지 105로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 102 내지 105로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 132 내지 135로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 스파이크 단백질 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 106 내지 108로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함된다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 스파이크 단백질 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 106 내지 108로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 136 내지 138로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 109에 나타낸 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 109에 나타낸 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 139에 나타낸 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 양태에서, siRNA는 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함된다. 일부 양태에서, siRNA는 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 146 내지 151로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 ALK2 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 140 내지 142로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 ALK2 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 140 내지 142로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 146 내지 148로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SOD1 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 143 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 RNA는 SOD1 mRNA이고, siRNA는 서열 번호: 143 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥, 및 서열 번호: 149 내지 151로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 상응하는 안티센스 가닥 각각을 포함한다.
목적한 유전자
일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 3개의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 4개의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 핵산 또는 RNA 작제물은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자를 암호화할 수 있다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 핵산 서열 각각은 상이한 목적한 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 제2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포내 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 세포소기관내 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각은 막 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열은 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 절단불가능한 링커일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 자가-절단가능한 링커일 수 있다. 링커의 비-제한적 예는 2A 펩타이드 링커(또는 2A 자가-절단하는 펩타이드), 예를 들면, T2A, P2A, E2A, 또는 F2A, 또는 tRNA 링커 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 T2A 펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 P2A 펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 E2A 펩타이드 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 F2A 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 tRNA 링커일 수 있다. tRNA 시스템은 살아있는 유기체에 걸쳐 진화적으로 보존되어 있고 내인성 RNases P 및 Z를 활용하여 다중시스트론성 작제물을 프로세싱한다(Dong et al., 2016). 일부 구현예에서, tRNA 링커는 AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA (서열 번호: 24)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질을 발현시킴으로써 상향조절된다. 본원에 사용된 바와 같은, 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 단백질의 발현의 상향조절은 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질의 수준을 증가시킴을 지칭할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 발현의 수준은 당해 분야에 잘 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있고 이는 웨스턴-블롯팅, 유동 세포분석법, ELISA, RIA, 및 다양한 단백질 유전 정보학 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드를 측정하거나 검출하기 위한 예시적인 방법은 면역검정, 예를 들면, ELISA이다. 단백질 정량화의 이러한 유형은 특정 항원을 포획할 수 있는 항체, 및 포획된 항원을 검출할 수 있는 제2의 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩타이드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 검정은 문헌: Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자는 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 단백질은 치료학적 단백질이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 단백질은 사람 기원인데, 즉, 사람 단백질이다. 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: 모두 사람 기원의 카복시펩티다제; 사이토킨; 세포외 리간드 및 트랜스포터, 세포외 매트릭스 단백질; 글루코시다제; 글리코실트랜스퍼라제; 성장 인자; 성장 인자 결합 단백질; 헤파린 결합 단백질; 호르몬; 하이드롤라제; 면역글로불린; 이소머라제; 키나제; 리아제; 금속효소 억제제; 메탈로프로테아제; 밀크 단백질; 신경활성 단백질; 프로테아제; 프로테아제 억제제; 단백질 포스파타제; 에스테라제; 트랜스퍼라제; 및 혈관활성 단백질. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단백질은 사람 카복시펩티다제; 사람 사이토킨; 사람 세포외 리간드 및 트랜스포터; 사람 세포외 매트릭스 단백질; 사람 글루코시다제; 사람 글리코실트랜스퍼라제; 사람 성장 인자; 사람 성장 인자 결합 단백질; 사람 헤파린 결합 단백질; 사람 호르몬; 사람 하이드롤라제; 사람 면역글로불린; 사람 이소머라제; 사람 키나제; 사람 리아제; 사람 금속효소 억제제; 사람 메탈로프로테아제; 사람 밀크 단백질; 사람 신경활성 단백질; 사람 프로테아제; 사람 프로테아제 억제제; 사람 단백질 포스파타제; 사람 에스테라제; 사람 트랜스퍼라제; 또는 사람 혈관활성 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 단백질이다.
일 구현예에서, 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 카복시펩티다제로서, 여기서 카복시펩티다제는 ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ, 및 SCPEP1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 사이토킨으로서, 여기서 사이토킨은 BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, 및 XCL2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 세포외 리간드 및 트랜스포터로서, 여기서 세포외 리간드 및 트랜스포터는 APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25, 및 VWC2L로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 세포외 매트릭스 단백질로서, 여기서 세포외 매트릭스 단백질은 ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR 및 TNXB로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 글루코시다제로서, 여기서 글루코시다제는 AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5, 및 SPACA5B로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 글리코실트랜스퍼라제로서, 여기서 글리코실트랜스퍼라제는 ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1, 및 XYLT1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 성장 인자로서, 여기서 성장 인자는 AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF-1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, 및 WISP3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 성장 인자 결합 단백질로서, 여기서 성장 인자 결합 단백질은 CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1, 및 WIF1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 헤파린 결합 단백질로서, 여기서 헤파린 결합 단백질은 ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1, 및 VTN으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 호르몬으로서, 여기서 호르몬은 ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B, 및 VIP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 하이드롤라제로서, 여기서 하이드롤라제는 AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1, 및 THSD4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 면역글로불린으로서, 여기서 면역글로불린은 IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2, 및 IGLC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 이소머라제로서, 여기서 이소머라제는 NAXE, PPIA, 및 PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 키나제로서, 여기서 키나제는 ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS, 및 PKDCC로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 리아제로서, 여기서 리아제는 PM20D1, PAM, 및 CA6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 금속효소 억제제로서, 여기서 금속효소 억제제는 FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1, 및 WFIKKN2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 메탈로프로테아제, 여기서 메탈로프로테아제는 ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7, ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1, 및 TLL2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 밀크 단백질로서, 여기서 밀크 단백질은 CSN1S1, CSN2, CSN3, 및 LALBA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 신경활성 단백질로서, 여기서 신경활성 단백질은 CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1, 및 TAC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 프로테아제로서, 여기서 프로테아제는 ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, 및 TPSD1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 프로테아제 억제제로서, 여기서 프로테아제 억제제는 A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7, SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6, 및 WFDC8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 단백질 포스파타제로서, 여기서 단백질 포스파타제는 ACP7, ACPP, PTEN, 및 PTPRZ1으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 에스테라제로서, 여기서 에스테라제는 BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM, 및 SIAE로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 트랜스퍼라제로서, 여기서 트랜스퍼라제는 METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9, 및 B3GAT1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 및 혈관활성 단백질로서, 여기서 혈관활성 단백질은 AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3, 및 NTS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 인터페론 알파(IFN 알파), ACE2 가용성 수용체, 인터류킨 37(IL-37), 및 인터류킨 38(IL-38)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), 및 ACE2 가용성 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 인터페론 베타(IFN 베타), ACE2 가용성 수용체, 및 에리트로포이에틴(EPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 및 인터류킨 4(IL-4)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 단백질은 IGF-1이다. 일부 구현예에서, 단백질은 IL-4이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인터페론 베타(IFN 베타)이다. 일부 구현예에서, 단백질은 ACE2 가용성 수용체이다. 일부 구현예에서, 단백질은 에리트로포이에틴(EPO)이다.
본 발명의 일 구현예에서, 핵산 서열 또는 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 사람 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 네이크드(naked) DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명의 이러한 구현에에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 프로펩타이드, 바람직하게는 사람 IGF-1의 프로펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 IGF-1의 성숙한 단백질, 또는 바람직하게는 사람 IGF-1의 성숙한 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않고, 바람직하게는 IGF-1, 즉, 카복실-말단 연장된 IGF-1의 사람 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 프로펩타이드, 바람직하게는 사람 IGF-1의 프로펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, IGF-1의 성숙한 단백질, 또는 바람직하게는 사람 IGF-1의 성숙한 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않거나, 보다 바람직하게는 IGF-1의 사람 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 프로펩타이드, 바람직하게는 사람 IGF-1의 프로펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, IGF-1의 성숙한 단백질, 또는 바람직하게는 사람 IGF-1의 성숙한 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 a 뇌-유래된 신경영양 인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF)의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 IGF-1의 사람 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1, 바람직하게는 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 불림), 및 성숙한 IGF-1, 바람직하게는 70개 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열, 및 성숙한 IGF-1, 바람직하게는 70개의 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드을 포함하지 않고, 바람직하게는 IGF-1의 사람 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1, 바람직하게는 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 불림)을 암호화하는 핵산 서열, 성숙한 IGF-1, 바람직하게는 70개의 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열 및 뇌-유래된 신경 영양 인자(BDNF)의 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 IGF-1의 사람 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 불림)를 암호화하는 핵산 서열, 및 70개의 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고 바람직하게는 사람 IGF-1의 E-펩타이드(또한 E-도메인으로 불림)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않고, 여기서 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 불림)를 암호화하는 핵산 서열, 및 70개의 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열 및 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 Uniprot database에서 UniProtKB - P05019로서 및 Genbank 데이타베이스에서 NM_000618.4, NM_001111285.2 및 NM_001111283.2로서 각각 지칭된 바와 같다.
일부 구현예에서, 목적한 유전자(이는 예컨대, 목적한 mRNA 및/또는 목적한 유전자에 상응하는 목적한 단백질을 암호화할 수 있다)를 암호화하고, 목적한 단백질을 암호화하며, 여기서 목적한 단백질은 소염성 사이토킨이다. 일부 구현예에서, 소염성 사이토킨은 인터페론 또는 인터류킨이다. 일부 구현예에서, 인터페론은 제I형 인터페론(예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, 및 IFN-ω), 제II형 인터페론(IFN-γ), 또는 제III형 인터페론(IFN-λ)이다. 일부 구현예에서, 알파인터페론은 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파-2b로부터 선택된다. 바이러스 감염에 대한 인터페론의 활성은 예컨대, 둘 다 본원에 참고로 포함된, IFN-ω의 항-SARS 효과를 기술하는 제WO 2004/096852호(Chen, et al.), 및 IFN-λ 변이체의 항-바이러스 효과를 기술하는 제WO 2005/097165호(Klucher, et al.)에 기술되었다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 인터류킨이다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 인터류킨 1F 계열 구성원이다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 인터류킨 37(IL-37, 이전에는 인터류킨-1 계열 구성원 7 또는 IL-1F7로 공지되고 예컨대, 둘 다 본원에 참고로 포함된, 문헌: Yan, et al., 2018, Mediators of Inflammation Volume 2019, Article ID 2650590, 및 Conti, et al., March-April 2020, Journal of biological regulators and homeostatic agents 34(2), doi: 10.23812/CONTI-E [Epub ahead of print]에 기술됨)이다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 인터류킨 38(이전에 IL-1HY2로 공지되고, 예컨대, 본원에 참고로 포함된, 문헌: Xu, et al., June 2018, Frontiers in Immunology vol. 9, article. 1462에 기술됨)이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 데코이 단백질(decoy protein)을 암호화한다. 일부 구현예에서, 데코이 단백질은 바이러스 숙주 세포 수용체의 가용성 형태이다. 일부 구현예에서, 데코이 단백질은 가용성 ACE2 수용체이다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 제I형 인터페론, 제II형 인터페론, 제III형 인터페론, 인터류킨, 및 데코이 단백질로부터 선택된 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자는 다음으로부터 선택된 단백질을 암호화한다: IFN-α, 예컨대, 인터페론 알파-n3, 인터페론 알파-2a, 또는 인터페론 알파-2b, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, IFN-ω, IFN-γ, IFN-λ, IL-37, IL-38, 및 가용성 ACE2 수용체.
표적 모티프(Target Motif)
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 표적 모티프를 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 모티프" 또는 "표적화 모티프"는 세포 막, 세포외 구획, 또는 세포내 구획 중 임의의 부분으로 정해진 새로이 합성된 폴리펩타이드 또는 단백질 속에 존재하는 임의의 짧은 펩타이드를 지칭할 수 있다. 세포내 구획은 세포내 세포소기관, 예를 들면, 핵, 핵소체, 엔도솜(endosome), 프로테아솜(proteasome), 리보솜, 크로마틴, 핵 엔벨로프(nuclear envelope), 핵 공극(nuclear pore), 엑소솜(exosome), 멜라노솜(melanosome), 골지체(Golgi apparatus), 퍼옥시솜(peroxisome), 소포체(ER), 라이소솜, 중심체, 미소관, 미토콘드리아, 엽록체, 미세섬유, 중간 섬유(intermediate filament), 또는 혈장막을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 용어는 시그날 서열, 표적화 신호, 국재화 신호, 국재화 서열, 수송 펩타이드(transit peptide), 리더 서열, 또는 리더 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 모티프는 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 표적 모티프의 비-제한적 예는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 중심체 국재화 신호(CLS) 또는 단백질을 세포막, 세포외 구획, 또는 세포내 구획으로 표적화하는 임의의 다른 신호를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 모티프는 (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는 표적 모티프; (d) 천연에서 표적 모티프의 기능을 가지지 않은 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적 모티프는 신호 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드; (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드는 목적한 유전자 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되고, 단 단백질은 옥시도리덕타제가 아닌, 신호 펩타이드; (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 신호 펩타이드; 및 (d) 천연에서 신호 펩타이드의 기능을 갖지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9는 2 초과의 평균 소수성 점수를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프" 또는 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드"는 단백질의 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 상이한 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드를 지칭하는데, 즉, 표적 모티프 또는 신호 펩타이드는 단백질의 동일한 유전자로부터 유래되지 않는다. 일반적으로, 주어진 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프 또는 신호 펩타이드는 다른 단백질로부터의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드이고, 이는 주어진 단백질과 관련되지 않는데, 즉, 이는 주어진 단백질의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 상이한 아미노산 서열을 갖고, 예컨대, 이는 주어진 단백질의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 심지어 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상, 또는 특히 95% 이상까지 상이하다. 바람직하게는 주어진 단백질에 대한 표적 모티프 또는 이종성인 신호 펩타이드는 주어진 단백질의 천연 발생(동종의) 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 미만, 바람직하게는 90% 미만, 보다 바람직하게는 80% 미만, 심지어 보다 바람직하게는 70% 미만, 가장 바람직하게는 60% 미만, 또는 특히, 50% 미만까지의 서열 동일성을 갖는다. 이종 서열이 동일한 유기체로부처 유래될 수 있지만, 이는 천연적으로(천연에서) 동일한 mRNA와 같이, 동일한 핵산 분자내에서 발생하지 않는다. 단백질 또는 표적 모티프 또는 신호 펩타이드가 이종성인 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프 또는 신호 펩타이드는 동일하거나 상이한 기원일 수 있고 일반적으로 동일한 기원, 바람직하게는 진핵세포 기원, 보다 바람직하게는 동일한 진핵세포 유기체의 진핵세포 기원, 심지어 보다 바람직하게는 포유동물, 특히 동일한 포유동물 유기체의 포유동물 기원, 또는 보다 특히 사람 기원일 수 있다. 예를 들면, 사람 BDNF 신호 펩타이드 및 사람 IGF-1 유전자, 즉, 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물이 개시되어 있고, 여기서 신호 펩타이드 및 단백질은 동일한 기원이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프" 또는 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드"는 단백질의 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드를 지칭한다. 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프 또는 신호 펩타이드는 이것이 천연에서 존재하므로 단백질의 유전자에 의해 암호화된 표적 모티프 또는 신호 펩타이드이다. 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프 또는 신호 펩타이드는 일반적으로 진핵세포 기원, 예컨대, 진핵세포 단백질, 바람직하게는 포유동물 기원의 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드, 예컨대, 포유동물 단백질, 또는 보다 바람직하게는 사람 기원의 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드, 예컨대, 사람 단백질의 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연에서 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열" 또는 "천연에서 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열"은 천연에서 존재하고 천연에서 존재하는 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 아미노산 서열과 동일하지 않은 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명에서 지칭된 천연에서 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산은 바람직하게는 10 내지 50, 보다 바람직하게는 11 내지 45, 심지어 보다 바람직하게는 12 내지 45, 가장 바람직하게는 13 내지 45, 특히 14 내지 45, 보다 특히 15 내지 45, 또는 심지어 보다 특히 16 내지 40개 아미노산 길이이다. 바람직하게는 본 발명의 천연에서 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열은 진핵 세포 기원이고 진핵세포 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 동일하지 않거나, 포유동물 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 동일하지 않거나, 보다 바람직하게는 사람 기원이고 천연에서 존재하는 사람 기원의 임의의 표적 모티프 또는 신호 펩타이드와 동일하지 않다. 천연에서 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않은 천연 발생 아미노산 서열은 일반적으로 단백질의 암호화 서열의 아미노산 서열이다. 본 발명에 따라 천연에서 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열은 일반적으로 진핵세포 기원, 바람직하게는 포유동물 기원, 또는 보다 바람직하게는 사람 기원이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 발생", "천연의", 및 "천연에서"는 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 펩타이드의 N-말단 끝(N-terminal end)의 아미노산 1 내지 9"는 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 제1의 9개 아미노산을 지칭한다. 유사하게 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 7"은 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 제1의 7개 아미노산을 지칭하고 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 펩타이드의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 5"는 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 제1의 5개 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된 아미노산 서열"은 아미노산 서열 내 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된다" 또는 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된다"는 이의 천연 발생 아미노산 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 단백질에 대해 이종성인 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된다" 또는 "목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 신호 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된다"는 이의 천연 발생 아미노산 서열 내 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 단백질에 대해 동종성인 천연 발생 표적 모티프 또는 신호 펩타이드를 지칭한다. 용어 "천연 발생 아미노산 서열은적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형된다"는 이의 천연 발생 아미노산 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 천연 발생 아미노산 서열을 지칭한다. 본원의 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 단백질 서열 내 특수한 위치에서 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 치환 R34K는 34번 위치에서의 아르기닌이 라이신으로대체된 폴리펩타이드를 지칭한다. 선행의 예에서, 34K는 34번 아미노산의 라이신으로의 치환을 나타낸다. 본원의 목적을 위해, 다수의 치환은 전형적으로 슬래쉬(slash)에 의해 분리된다. 예를 들면, R34K/L78V는 치환 R34K 및 L38V를 포함하는 이중 변이체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 단백질 서열내 특수한 위치에서 아미노산의 첨가를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 삽입체-34는 34번 위치에서의 삽입을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 단백질 서열 내 특수한 위치에서 아미노산의 제거를 지칭할 수 있다. 예를 들면, R34-는 34번 위치에서 아르기닌의 결실을 나타낸다.
바람직하게는 결실된 아미노산은 -0.8 이하, 바람직하게는 1.9 이하의 소수성 점수를 지닌 아미노산이다. 바람직하게는 치환체 아미노산은 치환된 아미노산의 소수성 점수보다 더 높은 소수성 점수를 지닌 아미노산이고, 보다 바람직하게는 치환체 아미노산은 2.8 이상의 소수성 점수, 또는 보다 바람직하게는 3.8 이상의 소수성 점수를 지닌 아미노산이다. 바람직하게는 삽입된 아미노산은 2.8 이상의 소수성 점수, 또는 보다 바람직하게는 3.8 이상의 소수성 점수를 지닌 아미노산이다.
일반적으로, 주어진 아미노산 서열 내 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 11개 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 아미노산, 심지어 보다 바람직하게는 1 내지 9개 아미노산, 특히 1 내지 8개 아미노산, 보다 특히 1 내지 7개 아미노산, 심지어 보다 특히 1 내지 6개 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개 아미노산, 보다 특히 바람직하게는 1 내지 4개 아미노산, 또는 심지어 보다 특히 바람직하게는 1 내지 2개 아미노산은 삽입, 결실, 및/또는 치환된다. 일반적으로 주어진 아미노산 서열 내 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 11개 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 아미노산, 심지어 보다 바람직하게는 1 내지 9개 아미노산, 특히 1 내지 8개 아미노산, 보다 특히 1 내지 7개 아미노산, 심지어 보다 특히 1 내지 6개 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개 아미노산, 보다 특히 바람직하게는 1 내지 4개 아미노산, 또는 심지어 보다 특히 바람직하게는 1 내지 2개 아미노산은 표적 모티프 또는 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 11개 내, 바람직하게는 아미노산 1 내지 10개 내, 보다 바람직하게는 아미노산 1 내지 9개 내, 심지어 보다 바람직하게는 아미노산 1 내지 8개 내, 특히 아미노산 1 내지 7개 내, 보다 특히 아미노산 1 내지 6개 내, 심지어 보다 특히 아미노산 1 내지 5개 내, 특히 바람직하게는 아미노산 1 내지 4개 내, 보다 특히 바람직하게는 아미노산 1 내지 3개 내, 또는 심지어 보다 특히 바람직하게는 아미노산 1 내지 2개 내에서 삽입, 결실, 및/또는 치환된다. 바람직하게는 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형된다.
바람직하게는, 변형된 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 제1의 9개 아미노산의 평균 소수성 점수는 변형이 없는 신호 펩타이드와 비교하여 1.0 단위 이상 증가한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인슐린 유사 성장 인자 1", "인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1 또는 IGF-1)", "IGF1", 또는 "IGF-1"은 신호 펩타이드가 없는 IGF-1 단백질의 천연 서열을 지칭하고 프로펩타이드 및/또는 E-펩타이드를 포함할 수 있고 바람직하게는 신호 펩타이드 및 E-펩타이드가 없는 IGF-1 단백질의 천연 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)"은 사람 IGF-1 (Uniprot 데이타베이스에서 UniProtKB - P05019로서 및 Genbank 데이타베이스에서 NM_000618.4, NM_001111285.2 및 NM_001111283.2로서 지칭된 pro-IGF-1, 또는 이의 단편)의 천연 서열을 지칭한다. 사람 인슐린 유사 성장 인자 1을 암호화하는 천연 DNA 서열은 코돈-최적화(codon-optimizing)될 수 있다. 사람 IGF-1의 천연 서열은 21개의 아미노산(뉴클레오타이드 1 내지 63번)을 갖는 사람 신호 펩타이드, 27개 아미노산(뉴클레오타이드 64 내지 144번)을 갖는 사람 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 지칭됨), 70개 아미노산(뉴클레오타이드 145 내지 354번)을 갖는 성숙한 사람 IGF-1 및 소위 E-펩타이드(또는 E-도메인)인 사람 IGF-1의 C-말단 도메인으로 이루어진다. 사람 IGF-1의 C-말단 도메인(소위 E-펩타이드 또는 E-도메인)은 대안의 스플라이싱 현상(splicing event)에 의해 생성된 Ea-, Eb-, 또는 Ec-도메인을 포함한다. Ea-도메인은 35개 아미노산(105개 뉴클레오타이드)으로 이루어지고, Eb-도메인은 77개 아미노산(231개 뉴클레오타이드)로 이루어지고, Ec-도메인은 40개 아미노산(120개 뉴클레오타이드)로 이루어진다(참고: 예컨대, Wallis M (2009) New insulin-like growth factor (IGF)-precursor sequences from mammalian genomes: the molecular evolution of IGFs and associated peptides in primates. Growth Horm IGF Res 19(1):12-23. doi: 10.1016/j.ghir.2008.05.001). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)"는 일반적으로 신호 펩타이드가 없는 사람 IGF-1 단백질의 천연 서열을 지칭하고 프로펩타이드 및/또는 E-펩타이드를 포함할 수 있고 바람직하게는 신호 펩타이드가 없고 E-펩타이드가 없는 사람 IGF-1 단백질의 천연 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)"는 일반적으로 성숙한 사람 IGF-1을 포함한다. 용어 "성숙한 단백질"은 단백질을 발현하여 분비하는 세포 내에서 소포체 내에서 합성되어 골지체를 통해 분비된다. 용어 "성숙한 IGF-1"은 IGF-1을 발현하고 분비하는 세포 내에서 소포체 내에서 합성되어 골지체를 통해 분비된 단백질을 지칭한다. 용어 "성숙한 사람 IGF-1"은 사람 IGF-1을 발현하고 분비하는 사람 세포 내에서 소포체 내에서 합성되어 골지체를 통해 분비된 단백질을 지칭하며 일반적으로 서열 번호: 19에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산을 함유한다.
서열 번호: 19
GGACCTGAGACACTTTGTGGCGCTGAACTGGTGGACGCCCTGCAGTTTGTGTGTGGCGACAGAGGCTTCTACTTCAACAAGCCCACAGGCTACGGCAGCAGCTCTAGAAGGGCTCCTCAGACCGGAATCGTGGACGAGTGCTGTTTCAGAAGCTGCGACCTGCGGCGGCTGGAAATGTATTGTGCCCCTCTGAAGCCTGCCAAGAGCGCC
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 인슐린 성장 인자 1(IGF-1)의 신호 펩타이드", "IGF-1의 변형된 신호 펩타이드", 또는 "변형된 IGF-1의 신호 펩타이드"는 IGF-1의 변형된 신호 펩타이드를 지칭하고 여기서 Uniprot 데이타베이스에서 P05019로서 및 Genbank 데이타베이스에서 NM_000618.4, NM_001111284.1 및 NM_001111285.2로서 지칭된 IGF-1의 천연 신호 펩타이드는 치환 G2L/S5L/T9L/Q10L 및 결실 K3- 및 C15-에 의해 변형되고 바람직하게는 서열 번호: 20에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고/갖거나 바람직하게는 서열 번호: 21에 나타낸 바와 같은 DNA 서열에 의해 암호화된다.
서열 번호: 20
Met-Leu-Ile-Leu-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Cys-Phe-Cys-Asp-Phe-Leu-Lys
서열 번호: 21
ATGCTGATTCTGCTGCTGCCCCTGCTGCTGTTCAAGTGCTTCTGCGACTTCCTGAAA
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 인슐린 성장 인자 1(IGF-1) 프로 도메인", "변형된 IGF-1 프로 도메인", 또는 "IGF-1-Pro-변형된"은 Uniprot 데이타베이스에서 P05019로서 및 Genbank 데이타베이스에서 NM_000618.4, NM_001111284.1 및 NM_001111285.2로서 지칭된 천연에서 신호 펩타이드의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열인 IGF-1의 프로-펩타이드를 지칭하고 이는 프로 펩타이드의 N-말단에서 22 내지 31개를 플랭킹하는 10개의 아미노산 잔기(VKMHTMSSSH (서열 번호: 198))의 결실에 의해 변형되고 바람직하게는 서열 번호: 22에 나타낸 바와 같은 아미노산을 갖고/갖거나 바람직하게는 서열 번호: 23에 나타낸 바와 같은 DNA 서열에 의해 암호화된다.
서열 번호: 22
Met-Leu-Phe-Tyr-Leu-Ala-Leu-Cys-Leu-Leu-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser-Ala-Thr-Ala
서열 번호: 23
ATGCTGTTCTATCTGGCCCTGTGCCTGCTGACCTTTACCAGCTCTGCTACCGCC
본원에 사용된 바와 같은 용어 "mRNA는 IGF-1의 프로펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 성숙한 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 IGF-1의 E-펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다"는 일반적으로 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 지칭됨)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 70개 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1 mRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 사람 IGF-1의 E-펩타이드(또한 E-도메인으로 지칭됨)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하지 않는, 즉, Ea-, Eb-, 또는 Ec-도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 mRNA를 지칭한다. 27개의 아미노산을 갖는 사람 IGF-1의 프로펩타이드(또한 프로-도메인으로 지칭됨)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 70개 아미노산을 갖는 성숙한 사람 IGF-1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화될 수 있다.
용어 "소수성 점수"("hydrophobic score" 또는 "hydrophobicity score")는 본원에서 용어 "소수성 점수(hydropathy score)"와 동의어로 사용되고 Kyte-Doolittle 규모(Kyte J., Doolittle R.F.; J. Mol. Biol. 157:105-132(1982))에 따라 계산된 것으로서 아미노산의 소수성의 정도를 지칭한다. Kyte-Doolittle 규모에 따른 아미노산 소수성 점수는 다음과 같다:
Figure pct00001

아미노산 서열의 "평균 소수성 점수", 예컨대, 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9의 평균 소수성 점수는 아미노산의 수로 나눈, 예컨대, 9로 나눈, 아미노산 서열의 아미노산 끝의 Kyte-Doolittle 점수에 따른 소수성 점수, 예컨대, N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9번의 9개 아미노산 각각의 소수성 점수를 가하여 계산한다.
극성은 Zimmerman 극성 지수(Zimmerman J.M., Eliezer N., Simha R.; J. Theor. Biol. 21:170-201(1968))에 따라 계산한다. 아미노산 서열의 "평균 극성", 예컨대, 신호 펩타이드의 아미노산 서열의 N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9번의 평균 극성은 아미노산 서열의 아미노산 각각의 Zimmerman 극성 지수, 예컨대, 9로 나누어진, N-말단 끝의 아미노산 1 내지 9번의 9개 아미노산 각각의 평균 극성에 따라 계산된 극성 값을 가함으로써 계산한다. Zimmerman 극성 지수에 따른 아미노산의 극성은 다음과 같다:
Figure pct00002

질환 및 치료
일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 약제학적 조성물은 활성 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진시키는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 불활성 성분을 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존하며 약제학적 조성물의 요약은 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms 및 Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 화합물의 유기체로의 투여를 촉진시킨다.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기술된 약제학적 조성물,세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된, 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물의 용도가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS(중증 급성 호흡기 증후군), 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome; ARDS), 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism), 심혈관 합병증(cardiovascular complication), 급성 신장 손상(acute kidney injury), 급성 간 손상(acute liver injury), 신경학적 합병증(neurologic complication), 사이토킨 방출 증후군(cytokine release syndrome), 소아 다기관 염증 증후군(pediatric multisystem inflammatory syndrome), 패혈성 쇼크(septic shock), 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation), 급성 호흡 부전(acute respiratory failure), 및 이의 임의의 조합, 추간판 질환(intervertebral disc disease; IVDD), 골관절염, 건선, 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva)(FOP), 및 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS(중증 급성 호흡기 증후군), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 정맥 혈전색전증, 심혈관 합병증, 급성 신장 손상, 급성 간 손상(acute liver injury), 신경학적 합병증, 사이토킨 방출 증후군, 소아 다기관 염증 증후군, 패혈성 쇼크, 파종성 혈관내 응고, 급성 호흡 부전, 및 이의 임의의 조합, 추간판 질환(IVDD), 골관절염 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS(중증 급성 호흡기 증후군), 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 건선, 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP), 및 근위축성 측색 경화증(ALS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS(중증 급성 호흡기 증후군), 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 건선, 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP), 및 근위축성 측색 경화증(ALS)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 추간판 질환(IVDD), 골관절염, 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 피부 질환 또는 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 질환 또는 병태는 염증성 피부 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 염증성 피부 장애는 건선을 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 근육 질환 또는 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 질환 또는 병태는 골격근 장애를 포함한다. 일부 구현예에서, 골격근 장애는 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)을포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 또는 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 신경변성 질환 또는 병태는 운동 뉴우런 장애(motor neuron disorder)를 포함한다. 일부 구현예에서, 운동 뉴우런 장애는 근위축성 측색 경화증(ALS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 관절 질환 또는 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 관절 질환 또는 병태는 관절 변성(joint degeneration)을 포함한다. 일부 구현예에서, 관절 변성은 추간판 질환(IVDD) 또는 골관절염(OA)을 포함한다.
추간판 질환(IVDD)은 매년 개발도상국에서 국민의 약 5%가 영향을 받는 것으로 평가된 병태이며 척추의 각각의 척추 골을 분리하는 디스크 중 하나 이상의 변성에 의해 특성화된다. 추간판은 척추 사이에 큐셔닝(cushioning)을 제공하여 척추 상에 가해지는 압력을 흡수한다. 척추의 하부 영역 내 디스크가 가장 IVDD에 의해 영향받지만, 척추의 임의의 부분은 디스크 변성을 가질 수 있으므로, 이러한 병태는 등, 목, 다리, 및 팔에서 통증을 유발한다. 또한, 영향받은 디스크 또는 디스크들의 위치에 따라서, IVDD는 주기적인 또는 만성적인 통증을 유발할 수 있고, 이는 앉거나, 굽히거나, 비틀거나, 물건을 들어올릴 때 악화될 수 있다. IVDD는 유전 및 환경 요인의 조합으로부터 야기되며, 이들 중 대부분은 알려져 있지 않다. 수개의 유전자가 IVDD로 진행되는 위험에 영향을 줄 수 있는 변화를 가진 것으로 확인되었고 이는 콜라겐, 면역 기능, 및 추간판 및 척추골의 발달 및 유지에 역할을 담당하는 단백질과 관련된 유전자를 포함한다. 비유전적 인자는 노화, 흡연, 비만, 만성염증, 및 장기간 동안의 운전을 포함한다. 이러한 유전자 중 2개는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1) 및 이의 수용체(인슐린 유사 성장 인자 1 수용체, IGF-1R)이고, 이는 세포외 매트릭스 합성을 조정할 수 있고 추간판의 정상 기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다.
골관절염은 관절 연골의 점진적인 변형으로, 염증, 뻣뻣함, 및 상태가 악화되면서 제한된 운동을 유발함을 특징으로 하는, 관절의 일반적인 질환이다. 연골에 의해 더 이상 큐셔닝되지 않는 골의 부위는 서로에 대해 맞비벼져서 파괴되기 시작하여, 염증과 같은 추가의 손상을 유발하므로 면역계는 이러한 조직을 복구 및 재구축하려고 시도한다. 또한, 골증식체(또는 골 및 다른 조직의 비정상적인 성장)이 또한 발생할 수 있고 이는 관절이 확장되면서 가시적으로 될 수 있다. 이화작용과 동화작용의 균형은 골관절염 환자에서 상실되어, 연골손상 및 완전한 파괴를 초래하는 것으로 고려된다. 이의 발현이 골관절염 위험에 영향을 미치는 유전자는 전형적으로 골 및 연골의 형성 및 유지에 관여되어 있다.
IVDD 및 골관절염 둘 다에서, 염증을 감소시키지만(예컨대, IL-1 베타, IL-8 등을 감소시키지만), 동화작용 신호(예컨대, IGF-1 등)을 증가시키는 것은 치료학적 효과를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 표적 mRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, siRNA는 IL-8 mRNA에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA는 IGF-1을 암호화한다.
일부 양태에서, 대상체에서 관절 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 관절 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IGF-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 관절 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 관절 질환 또는 병태는 관절 변성이다. 일부 구현예에서, 관절 변성은 추간판 질환(IVDD) 또는 골관절염(OA)이다.
일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는, 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IGF-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 추간판 질환(IVDD)을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 표적 mRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, siRNA는 IL-8 mRNA에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA는 IGF-1을 암호화한다.
일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 핵산에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 핵산 서열에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 골관절염을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-8 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
건선은 적색의 패치(patches of red), 흔히 백색의 각질 비늘(flaky white scale)로 덮힌 자극된 피부에 의해 특징화된, 만성 염증성 피부 장애이다. 건선 환자는 또한 관절 염증을 포함하는 병태인, 건선 관절염으로 발달할 수 있다. 이러한 질환의 정확한 원인은 현재 이해되어 있지 않지만, 질환은 T 세포(예컨대, 건강한 피부 세포를 공격하는 T 세포) 및 다른 백혈 세포, 예를 들면, 호중구를 지닌 면역계 문제에 의해 유발된 자가면역 질환인 것으로 고려된다.
일부 양태에서, 대상체에서 피부 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 피부 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1를 암호화하는 핵산에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 피부 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 피부 질환 또는 병태는 염증성 피부 장애이다. 일부 구현예에서, 염증성 피부 장애는 건선이다.
일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 표적 mRNA 및 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 IL-17 mRNA에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, siRNA는 TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA는 IL-4를 암호화한다.
일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-17 mRNA 및 IL-4를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IL-4를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 IL-17 mRNA 및 IL-4를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 TNF-알파 mRNA 및 IL-4를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 TNF-알파 mRNA 및 IL-4를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 건선을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 TNF-알파 mRNA 및 IL-4를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)은 골격근 장애이고 여기서 근 조직 및 연결 조직, 예를 들면, 건(tendon) 및 인대는 서서히 경화되어 운동을 구속시키는 골격외 또는 이소성 골(heterotopic bone)을 형성한다. 골격 외 골의형성은 관절이 영향을 받으면서 운동성의 점진적인 손실을 유발한다. FOP를 지닌 개체의 근육에 대한 임의의 외상, 예를 들면, 낙상 또는 침입성 의학 과정(invasive medical procedure)은 손상된 부위에서 근육 팽윤 및 염증의 에피소드에 이은 근육 및 연결 조직의 보다 신속한 경화를 개시할 수 있다.
일부 양태에서, 대상체에서 근 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 ALK2 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 근 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 ALK2 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IGF-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 근 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 ALK2 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 근 질환 또는 병태는 골격 근 장애이다. 일부 구현예에서, 골격 근 장애는 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)이다.
근위축성 측색 경화증(ALS), 또는 루게릭 질환(Lou Gehrig's disease)은 뇌 및 척수내 신경 세포에 영향을 미쳐서 근육의 손실을 유발하는 진행성 신경변성 질환이다. 이는 상부 및 하부 운동 뉴우런 둘 다의 변형에 의해 특징화된 운동 뉴우런 질환이며, 이는 근육 약화 및 궁극적으로 마비를 초래한다. ALS의 원인은 아직 알려져 있지 않지만, ALS와 관련된 일부 바이오마커(biomarker) 및 유전자, 예를 들면, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1)가 발견되었다. 유전학에 의해 차등화된 2개 유형의 ALS가 존재한다: 가족성 및 산발성(특발성).
일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 이러한 방법은 대상체에게 SOD mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 IGF-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 SOD1 mRNA 및 IGF-1을 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경변성 질환 또는 병태는 운동 뉴우런 장애이다. 일부 구현예에서, 운동 뉴우런 장애는 근위축성 측색 경화증(ALS)이다.
일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 SOD1 mRNA 및 EPO를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 SOD1 mRNA 및 EPO를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 양태에서, 대상체에서 신경변성 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 대상체에게 SOD1 mRNA 및 EPO를 암호화하는 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 신경변성 질환 또는 병태는 운동 뉴우런 장애이다. 일부 구현예에서, 운동 뉴우런 장애는 위축성 측색 경화증(ALS)이다.
일부 양태에서, 대상체게에 본원에 기술된 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 코로나바이러스에 의한 감염과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS(중급 급성 호흡기 증후군)-관련된 코로나바이러스에 의한 감염에 의해 유발된 SARS이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 코로나바이러스에 의한 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 질환 또는 장애, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 코로나바이러스의 합병증을 치료하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 SARS-관련된 코로나바이러스에 의한 감염에 의해 유발된 호흡기 증후군, 예컨대, SARS(중증 급성 호흡기 증후군)이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 예컨대, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)(ARDS), 정맥 혈전색전증, 심혈관 합병증, 급성 신장 손상, 급성 간 손상, 신경학적 합병증, 사이토킨 방출 증후군, 소아 다기관 염증 증후군, 패혈성 쇼크, 파종성 혈관내 응고, 급성 호흡 부전, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 치료된 코로나바이러스 감염과 관련된 질환 또는 병태는 당해 분야의 숙련가에게 임의로 공지되어 있고 문헌에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 siRNA에 의한 특정 생리학적 메카니즘의 병행하는 제어 및/또는 하향조절, 및 치료학적 단백질의 과발현에 의해, 다른 생리학적 메카니즘, 예컨대, 염증의 활성화 및/또는 증가에 의해 이러한 질환 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV(또한 SARS-CoV-1으로서 공지됨; 2002 내지 2003년 동안 SARS 유행병에 관여된 바이러스), SARS-CoV-2(신규 코로나바이러스 질환-2019, 또는 COVID-19를 유발한 바이러스), 또는 MERS-CoV(중동 호흡기 증후군 바이러스(Middle East Respiratory Syndrome virus))이다. 일부 구현예에서, SARS-CoV, SARS-CoV-2, 및 MERS 중 하나 이상은 본 발명을 사용하여 치료된다. 이러한 및 관련된 바이러스는 예컨대, 본원에 참고로 포함된, 문헌: Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses, March 2020, Nature Microbiology 5:536-44에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 약제학적 조성물, 세포, 재조합 폴리핵산 작제물, 또는 재조합 RNA 작제물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 코로나바이러스에 의한 감염과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) mRNA IFN-베타를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 또는 30(화합물 B1 또는 B2)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) 인터류킨 6R(IL-6R) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 31(화합물 B3)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 32(화합물 B4)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 또한 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 33(화합물 B5)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 34 또는 35(화합물 B6 또는 B7)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호하하거나 포함하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B8(서열 번호: 36)을 포함하는 조성물은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 37 또는 39(화합물 B9 또는 B11)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 38(화합물 B10)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, MERS, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42(화합물 B12, B13 및 B14) 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45(화합물 B15, B16, 및 B17) 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 46(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 대상체에게 투여된 조성물은 (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 폴리핵산 작제물을 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 47(화합물 B19)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 190의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제형 및 전달 방법은 일반적으로 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 조성물은 대상체에게 다양한 방식, 예를 들면, 비경구적으로, 정맥내로, 피내로, 근육내로, 결장으로, 직장으로, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 대상체의 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로 또는 경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 임의의 조성물은 설명서 매뉴얼과 함께 제공될 수 있다. 설명서 매뉴얼은 숙련가 또는 주치의에게 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 장애(예컨대, IVDD, 골관절염, 건선, 또는 골격근 손상)를 본 발명에 따라 치료하는 방법에 관한 안내를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 설명서 매뉴얼은 전달/투여 방식 및 전달/투여 요법 각각(예컨대, 전달/투여 경로, 투여량 요법, 전달/투여 시간, 전달/투여 빈도 등)의 본원에 기술된 방식에 대한 안내를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 설명서 매뉴얼은 본 발명의 조성물이 투여되거나 주사되고/되거나 투여 또는 주사용으로 제조되는 방법에 관한 안내를 포함할 수 있다. 원칙적으로, 전달/투여 방식 및 전달/투여 요법 각각과 관련하여 본원의 어딘가에 기술된 것은 설명서 매뉴얼에서의 각각의 설명서로서 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유전자 치료요법에서 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 유전자 치료요법 벡터내에서 세포에 전달될 수 있다. 유전자 치료요법 벡터 및 유전자 전달 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 방법의 비-제한적 예는 세포에 전달 후 에포솜 또는 통합된 게놈을 갖는, DNA 및 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스 벡터 전달 시스템, 비-바이러스 벡터 전달 시스템, 예를 들면, DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 전달 비히클과 복합된 핵산, 트랜스포손 시스템(transposon system)(숙주 게놈 내로 전달 및 통합 용; Moriarity, et al. (2013) Nucleic Acids Res 41(8), e92, Aronovich, et al., (2011) Hum. Mol. Genet. 20(R1), R14-R20), 레트로바이러스-매개된 DNA 전달(예컨대, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Mouse Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스(spleen necrosis virus), 레트로바이러스(retrovirus), 예를 들면, 로우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하베이 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 사람 면역결핍성 바이러스(human immunodeficiency virus), 아데노바이러스(adenovirus), 척수증식성 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus), 및 유방 종양 바이러스(mammary tumor virus); 참고: 예컨대, Kay et al. (1993) Science 262, 117-119, Anderson (1992) Science 256, 808-813), 및 DNA 바이러스-매개된 DNA 전달, 예를 들면, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes virus), 파르보바이러스(parvovirus) 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)(예컨대, Ali et al. (1994) Gene Therapy 1, 367-384)를 포함한다. 바이러스 벡터는 또한 아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스성 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 및 헤르페스 단성 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 게놈 내에서 통합할 수 있는 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 직접적인 DNA 전달을 통해 세포로 전달될 수 있다(Wolff et al. (1990) Science 247, 1465-1468). 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 세포 막의 온화한 기계적 파열, 세포로 일시적인 투과 후 세포에 전달될 수 있다. 막의 이러한 온화한 기계적 파열는 작은 구멍을 통해 세포에 약하게 힘을 가하여 달성할 수 있다(Sharei et al. PLOS ONE (2015) 10(4), e0118803). 다른 구현예에서, 본원에 기술된 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물을 포함하는 조성물은 리포솜-매개된 DNA 전달을 통해 세포로 전달될 수 있다(예컨대, Gao & Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280-285, Crystal (1995) Nature Med. 1, 15-17, Caplen et al. (1995) Nature Med. 3, 39-46). 용어 "리포솜"은 봉입된 지질 이층 또는 응집물의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 비히클을 포함할 수 있다. 재조합 폴리핵산 또는 RNA 작제물은 리포솜의 수성 내부 내에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이증 내에 배치되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 관련된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에서 인트랩(entrap)되거나, 리포솜과 복합화된다.
유전자 발현의 조절
일부 양태에서, 세포 내로 본원에 기술된 임의의 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 단일 RNA 전사체로부터 siRNA 및 mRNA를 동시 발현시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령 RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA 및 목적한 유전자의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-1 베타 mRNA 및 IGF-1의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-8 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-8 mRNA 및 IGF-1의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-17 mRNA 및 IL-4의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 TNF-알파 mRNA 및 IL-4의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 TNF-알파 mRNA, IL-17 mRNA 및 IL-4의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) ALK2 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 ALK2 mRNA 및 IGF-1의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 SOD mRNA 및 IGF-1의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) EPO를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 SOD mRNA 및 EPO의 발현은 동시에 조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA; 및 (ii) mRNA IFN-베타를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 또는 30(화합물 B1 또는 B2)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R (IL-6R) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 31(화합물 B3)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 32(화합물 B4)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 33(화합물 B5)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 34 또는 35(화합물 B6 또는 B7)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA (siRNA); 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B8(서열 번호: 36)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 37 또는 39(화합물 B9 또는 B11)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 38(화합물 B10)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, MERS, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42(화합물 B12, B13 및 B14) 중 임의의 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45(화합물 B15, B16, 및 B17) 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 46(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 47(화합물 B19)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 표적 전령 RNA (mRNA)에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 표적 mRNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고, 여기서 표적 mRNA의 발현은 하향조절되고 목적한 유전자의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, 표적 mRNA의 발현은 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, 목적한 유전자의 발현은 mRNA 또는 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현시키거나 과발현시킴에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-1 베타 mRNA의 발현은 하향조절되고 IGF-1의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, IL-1 베타 mRNA의 발현은 IL-1 베타 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IGF-1의 발현은 IGF-1 mRNA 또는 IGF-1 단백질을 발현시키거나 과발현시킴에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-8 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-8 mRNA의 발현은 하향조절되고 IGF-1의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, IL-8 mRNA의 발현은 IL-8 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IGF-1의 발현은 IGF-1 mRNA 또는 IGF-1 단백질의 발현 또는 과발현에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 IL-17 mRNA의 발현은 하향조절되고 IL-4의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, IL-17 mRNA의 발현은 IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IL-4의 발현은 IL-4 mRNA 또는 IL-4 단백질의 발현 또는 과발현에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 TNF-알파 mRNA의 발현은 하향조절되고 IL-4의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, TNF-알파 mRNA의 발현은 TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IL-4의 발현은 IL-4 mRNA 또는 IL-4 단백질을 발현 또는 과발현시킴으로써 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IL-4를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 TNF-알파 mRNA의 발현 및/또는 IL-17 mRNA의 발현은 하향조절되고 IL-4의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, TNF-알파 mRNA의 발현 및 IL-17 mRNA의 발현은 TNF-알파 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA 및 IL-17 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IL-4의 발현은 IL-4 mRNA 또는 IL-4 단백질의 발현 또는 과발현에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) ALK2 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 ALK2 mRNA의 발현은 하향조절되고 IGF-1의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, ALK2 mRNA의 발현은 ALK2 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IGF-1의 발현은 IGF-1 mRNA 또는 IGF-1 단백질을 발현 또는 과발현시킴으로써 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) IGF-1을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 SOD1 mRNA의 발현은 하향조절되고 IGF-1의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, SOD1 mRNA의 발현은 SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, IGF-1의 발현은 IGF-1 mRNA 또는 IGF-1 단백질을 발현시키거나 과발현시킴으로써 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 (ii) EPO를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공되고; 여기서 SOD1 mRNA의 발현은 하향조절되고 EPO의 발현은 동시에 상향조절된다. 일부 구현예에서, SOD1 mRNA의 발현은 SOD1 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 하향조절된다. 일부 구현예에서, EPO의 발현은 EPO mRNA 또는 EPO 단백질을 발현시키거나 과발현시킴에 의해 상향조절된다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) mRNA IFN-베타를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 29 또는 30(화합물 B1 또는 B2)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R (IL-6R) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 31(화합물 B3)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R 알파(IL-6R-알파) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-알파 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 32(화합물 B4)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) 인터류킨 6R 베타(IL-6R-베타) mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 IL-6R-베타 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 33(화합물 B5)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 ACE2 mRNA에 대해 각각 지시된, 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 34 또는 35(화합물 B6 또는 B7)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA(siRNA), SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B8(서열 번호: 36)을 포함하는 조성물은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 36에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 37 또는 39(화합물 B9 또는 B11)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 38(화합물 B10)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B12(서열 번호: 40)를 포함하는 조성물은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, MERS, 또는 둘 다의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 특정의 양태에서, 이러한 조성물, 예를 들면, 화합물 B13(서열 번호: 41)을 포함하는 조성물은 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위해, 예컨대, SARS CoV, SARS CoV-2, 및/또는 MERS의 감염과 관련된 유전자 발현을 조절 또는 조정하기 위해 고려된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 40, 41 및 42 (화합물 B12, B13 및 B14) 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) IL-6 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, ACE2 mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) IFN-베타를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, ii)의 mRNA는 ACE2 가용성 수용체를 암호화하거나 추가로 암호화한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 IL-6 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 ACE2 mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, IFN-베타를 암호화하는 mRNA는 천연의 IFN-베타 신호 펩타이드, 또는 변형된 신호 펩타이드를 암호화한다. 관련된 양태에서, 변형된 IFN-베타신호 펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 SP1 또는 SP2(각각 서열 번호: 52 및 54)이다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 43, 44, 및 45(화합물 B15, B16, 및 B17) 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 내로 (i) SARS CoV-2 ORF1ab mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 간섭 RNA, SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA, 및 SARS CoV-2 N mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 하나는 ORF1ab mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시되고, 하나는 SARS CoV-2 N mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 46(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 190(화합물 B18)에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 양태에서, (i) SARS CoV-2 S mRNA에 결합할 수 있는 적어도 하나의 siRNA; 및 (ii) ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 mRNA를 암호화 또는 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 도입시킴을 포함하는, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 상향조절 및 하향조절하는 방법이 본원에 제공된다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 적어도 1, 2, 또는 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된 1개의 siRNA를 암호화하거나 포함한다. 관련된 양태에서, 폴리핵산 작제물은 3개의 siRNA를 암호화하거나 포함하고, 각각은 SARS CoV-2 S mRNA에 대해 지시된다. 관련된 양태에서, 적어도 3개의 siRNA 각각은 동일하거나, 상이하거나, 또는 이의 조합이다. 관련된 양태에서, 재조합 폴리핵산 작제물은 서열 번호: 47(화합물 B19)에 나타낸 서열을 포함한다.
예시적인 구현예
구현예 1. (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
(ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서;
여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA는와 상이한, 조성물.
구현예 2. 구현예 1의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물은 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
구현예 3. 구현예 1 또는 2의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 mRNA인, 조성물.
구현예 4. 구현예 1 또는 2의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물은 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화하는, 조성물.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 목적한 유전자는 분비 단백질, 세포내 단백질, 세포소기관내 단백질, 및 막 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 7. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 목적한 유전자가 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 및 인터류킨 4(IL-4)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함하는, 조성물.
구현예 9. 구현예 8의 조성물로서, 여기서 표적 모티프가:
(a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프;
(b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프;
(c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및
(d) 천연에서 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 Kozak 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 11. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시키는, 조성물.
구현예 13. 구현예 11 또는 12의 조성물로서, 여기서 링커가 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커 또는 가요성 링커를 포함하는, 조성물.
구현예 14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 적어도 6개의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 15. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 50개 이하의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 16. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 50개의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 17. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 15개의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 18. 서열 번호: 1 내지 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물.
구현예 19. (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및
(ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하는 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물로서;
여기서 표적 RNA가 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이한, 조성물.
구현예 20. 구현예 19의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 mRNA인, 조성물.
구현예 21. 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시에 조절하는데 사용하기 위한 구현예 1 내지 20 중 어느 하나의 조성물.
구현예 22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)이 순차적인 방식으로 포함된, 조성물.
구현예 23. 구현예 22의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재하는, 조성물.
구현예 24. 구현예 22의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재하는, 조성물.
구현예 25. 구현예 22의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재하는, 조성물.
구현예 26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 표적 mRNA의 엑손에 결합하는, 조성물.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화되거나 이에 포함되지 않은, 조성물.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 목적한 유전자가 RNA 스플라이싱없이 발현되는, 조성물.
구현예 30. 대상체에서 바이러스 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용의 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
(i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
(ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
구현예 31. 구현예 30의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
구현예 32. 구현예 30의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 핵산 서열은 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화하거나 포함하고 적어도 하나의 핵산 서열은 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
구현예 33. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 mRNA인, 조성물.
구현예 34. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 비암호화 RNA인, 조성물.
구현예 35. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2); SARS CoV-2 ORF1ab; SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
구현예 36. 구현예 35의 조성물로서, 여기서 인터류킨이 IL-1알파, IL-1베타, IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, 인터류킨 IL-6R-베타, IL-18, IL-36-알파, IL-36-베타; IL-36-감마, 및 IL-33으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 37. 구현예 30 내지 32 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA가 IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, IL-6R-베타, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2); SARS CoV-2 ORF1ab; SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
구현예 38. 구현예 30 내지 37 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화하는, 조성물.
구현예 39. 구현예 30 내지 38 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 (ii)의 목적한 유전자가 IFN 알파-n3, IFN 알파-2a, IFN 알파-2b, IFN 베타-1a, IFN 베타-1b, ACE2 가용성 수용체, IL-37, 및 IL-38를 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 40. 구현예 30 내지 38 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 (ii)의 목적한 유전자가 IFN 베타 및 ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 41. 구현예 30 내지 40 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막 관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함하는, 조성물.
구현예 42. 구현예 41의 조성물로서, 여기서 표적 모티프가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
(a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프;
(b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는 표적 모티프;
(c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는 표적 모티프; 및
(d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열이 적어도 하나의 아미노산이 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열.
구현예 43. 구현예 30 내지 42 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 44. 구현예 30 내지 43 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 45. 구현예 44의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시키는, 조성물.
구현예 46. 구현예 44 또는 45의 조성물로서, 여기서 링커가 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커, 또는 가요성 링커를 포함하는, 조성물.
구현예 47. 구현예 44 내지 46 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 적어도 6개 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 48. 구현예 44 내지 46 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 50개 핵산 잔기 이하인, 조성물.
구현예 49. 구현예 44 내지 46 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 50개의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 50. 구현예 44 내지 46 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 15개의 핵산 잔기인, 조성물.
구현예 51. 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물.
구현예 55. 대상체에서 바이러스 질환 또는 병태의 치료 또는 예방용 재조합 RNA 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
(i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA); 및
(ii) 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA를 포함하고;
여기서 표적 RNA가 목적한 유전자를 암호화하는 mRNA와 상이한, 조성물.
구현예 53. 세포내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는데 사용하기 위한, 구현예 30 내지 52 중 어느 하나의 조성물.
구현예 54. 구현예 30 내지 53 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 조성물이 대상체에서 바이러스 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 존재하는, 조성물.
구현예 55. 구현예 30 내지 54 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 (i) 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)이 순차적인 방식으로 포함되는, 조성물.
구현예 56. 구현예 55의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부에 존재하는, 조성물.
구현예 57. 구현예 55의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 하부에 존재하는, 조성물.
구현예 58. 구현예 55의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열 (i)이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 (ii)의 상부 또는 하부에 존재하는, 조성물.
구현예 59. 구현예 30 내지 58 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 표적 mRNA의 엑손에 결합하는, 조성물.
구현예 60. 구현예 30 내지 59 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
구현예 61. 구현예 30 내지 60 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 목적한 유전자의 인트론 서열에 의해 암호화 또는 포함되지 않는, 조성물.
구현예 62. 구현예 30 내지 61 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 목적한 유전자 RNA가 스플라이싱없이 발현되는, 조성물.
구현예 63. 구현예 30 내지 62 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 siRNA가 서열 번호: 93 내지 109로부터 선택된 센스 가닥 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 64. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 siRNA가 서열 번호: 80 내지 92로부터 선택된 센스 가닥 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 65. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 서열 번호: 177 내지 189 중 어느 하나에 대해 적어도 85% 서열 동일성인 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 66. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 서열 번호: 177 내지 189로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 67. 구현예 30 내지 63 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 서열 번호: 190에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 지닌 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 68. 구현예 30 내지 63 중 어느 하나의 조성물로서, 여기서 재조합 폴리핵산 작제물이 서열 번호: 190의 서열을 포함하는, 조성물.
실시예
본 실시예는 단지 나열 목적으로 제공되며 본원에 제공된 청구범위의 영역을 제한하지 않는다.
실시예 1: 작제물 설계, 서열, 및 합성
작제물 설계
본 발명은 siRNA 및 임의의 목적한 단백질이 시험관 내 전사에 의해 생성된 단일 전사체로부터 동시에 발현될 수 있음을 개시하고 있다. 본원에 개시된 RNA 작제물은 siRNA 서열의 하부 또는 상부의 하나 이상의 목적한 유전자를 지닌 문헌: Cheng, et al. (2018) J. Mater. Chem. B., 6, 4638-4644에 기술된 바와 같은 siRNA 설계를 포함하도록 설계되었다(도 1). 본 발명의 작제물은 동일하거나 상이한 유전자를 순차적으로 표적화하는 하나 이상의 siRNA 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 작제물은 사이에 링커 서열 또는 링커 암호화 서열(예컨대, 2A 펩타이드 링커 또는 tRNA 링커)을 지닌 2개 이상의 목적한 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
작제물은 RNA 폴리머라제 결합 및 siRNA 및 목적한 유전자 둘 다의 성공적인 시험관 내 전사를 위한 siRNA 서열의 상부의 T7 프로모터(5' TAATACGACTCACTATA 3'; 서열 번호: 25) 서열을 추가로 포함한다. 대안의 프로모터를 활용할 수 있으며, 대안의 프로모터는 SP6, T3, P60, Syn5, 및 KP34 프로모터를 포함하고, 이는 시험관 내 전사에 균일하게 기능성이다.
작제물 합성
설계된 작제물(표 1, 화합물 확인 번호 A1-A8)을 독일의 GeneArt(Thermo Fisher Scientific)로부터 유전자-합성하였다. 작제물을 pMA-RQ 벡터로서 합성하였고, 이는 GeneOptimizer 알고리즘을 사용하여 코돈 최적화된, T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유한다. 표 1은 단백질 발현을 하향조절하기 위한 이의 각각의 siRNA 표적, 및 상향조절된 단백질 발현을 위한 단백질 표적과 함께, 본 개시내용에서의 실시예에서 사용된 화합물을 요약한다. 본원에 기술된 실시예에서 사용된 화합물 A1 내지 A8 내 모든 우리딘은 N1-메틸슈도우리딘으로 변형시켰다. 각각의 화합물의 경우, siRNA 서열의 위치는 목적한 유전자와 관련하여 나타나 있다. 예를 들면, "5' siRNA 위치"는 siRNA 서열이 화합물 내 목적한 유전자의 상부 또는 이에 대해 5'에 있음을 나타낸다. A1 내지 A8의 작제물의 서열은 표 2에 나타내고 하기 표에 나타낸 바와 같이 주석이 달려있다.
[표 1]
Figure pct00003
[표 2]
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 3]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 2: RNA 작제물의 시험관 내 전사 및 데이타 분석
화합물 A1 내지 A8을 암호화하는 pMA-RQ 벡터 및 상동성 프라이머 쌍(표 4)을 시험관 내 전사 mRNA 생산을 기반으로 한 PCR을 위해 사용하였다. 전사 주형을 표 4에서 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 PCR로 생성하였다. 폴리(A) 테일은 주형 내에서 암호화되었고; 수득되는 PCR 생성물은 120 bp 폴리(A) 테일(서열 번호: 193)을 암호화하였다. siRNA 플랭킹 영역의 반복 서열로 인하여 약간의 최적화를 이루어(참고: 표 2 및 표 3) 특이적인 증폭을 달성하였다. 이러한 최적화는: 1) 적은 양의 벡터의 플라스미드 DNA; 2) 특정 DNA 폴리머라제(Q5 핫 스타트(hot start) 폴리머라제, New England Biolabs)의 사용; 3) PCR의 각각의 주기에 대해 변성(30초 내지 10초) 및 연장(45초/kb 내지 10초/kb)을 위한 감소된 시간; 4) PCR의 각각의 주기에 대해 어닐링을 위한 증가된 시간(10초 내지 30초), 및 5) PCR의 각각의 주기에 대해 최종 연장을 위한 증가된 시간(15분 이하). 또한, 비-특이적인 프라이머 결합을 피하기 위해, PCR 반응 혼합물을 해동 시약을 포함하여, 빙상에서 제조하고, PCR 주기의 수를 25로 감소시켰다.
시험관 내 전사를 위해, T7 RNA 폴리머라제(MEGAscript 키트, Thermo Fisher Scientific)를 37℃에서 2시간 동안 사용하여 합성된 RNA를 100% N1-메틸슈도-UTP로 화학적으로 변형시키고 5' 말단에서 항-역 캡 유사체(anti-reverse CAP analog)(ARCA; [m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G])로 동시-전사적으로 캡핑하였다. 시험관 내 전사 후, mRNA를 MEGAclear 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 컬럼-정제하고 Nanophotometer-N60(Implen)를 사용하여 정량화하였다.
[표 4]
Figure pct00014
시험관 내 전사를 사용하여, 화합물 A1 내지 A5를 50 내지 200 μg 범위에서 생성하고 HEK-293(실시예 3) 및 THP-1 세포(실시예 4)의 과발현 모델에서 IL-8 하향 조절 및 IGF-1 발현에 대해 시험하였고 여기서 IL-8는 각각의 mRNA를 사용하여 과발현시켰다. 또한, 화합물 A6 및 A7을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고, IL-1 베타(실시예 4)의 내인성 분비를 위해 LPS 및 dsDNA에 의해 자극된 THP-1 세포 내에서 내인성 IL-1 베타 하향 조절 및 IGF-1 발현에 대해 시험하였다. 화합물 A8을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고 THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 하향 조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였으며 여기서 내인성 TNF-α 발현은 LPS 및 R848(실시예 4)로 처리함으로써 자극시켰다. 유사하게, 화합물 A8을 HEK-293 세포의 과발현 모델에서 TNF-α 하향 조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였고 여기서 TNF-α는 TNF-α 암호화 mRNA(실시예 3)를 사용하여 과발현시켰다.
데이타는 GraphPad Prism 8(캘리포니아주 샌 디에고 소재)을 사용하여 분석하였다. 표준 또는 샘플에서 ELISA를 사용하여 단백질(IGF-1, IL-4, IL-8, IL-1 베타또는 TNF-α) 수준을 평가하기 위해, 블랭크의 평균 흡광도 값을 표준 또는 샘플의 평균 흡광도로부터 감하였다. 표준 곡선을 생성시키고 제조업자의 프로토콜에 따라 4개의 매개변수 비선형 회귀(four parameters nonlinear regression)를 사용하여 플롯팅하였다. 각각의 샘플 속에서 단백질(IGF-1, IL-4, IL-8, IL-1 베타 또는 TNF-α)의 농도를 측정하기 위해, 단백질의 농도를 표준 곡선으로부터 내삽하였다. 샘플의 최종 단백질 농도는 희석 인자를 곱하여 계산하였다. 통계적 분석을 스튜던츠 t-시험을 사용하여 이루었다.
실시예 3: HEK-293의 시험관 내 형질감염 및 HEK-293 세포 내에서 IL-8 과발현 모델
HEK-293의 시험관 내 형질감염
사람 배아 신장 세포 293(HEK-293; ATCC CRL-1573)를 10%(v/v) 태아 소 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 혼합물(882087, Biozym Scientific)이 보충된 둘베코-변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)(DMEM, Biochrom) 속에 유지시켰다. 세포를 96 웰 배양 플레이트 속에서 20,000개의 세포/웰에서 씨딩하고 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 37℃에서 24시간 동안 항온처리한 후 형질감염시켰다. 세포를 항생제가 없는 FBS 10%를 함유하는 DMEM 성장 배지 속에서 성장시켜 합치 < 60%에 이르게 한 후 형질감염시켰다. 이후에, HEK-293 세포를 다양한 농도(100-900 ng)의 특정 mRNA 작제물로 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 1:1 w/v의 mRNA 대 리포펙타민 비로 형질감염시켰다. 100 μl의 DMEM을 제거하고 50 μl의 Opti-MEM 및 50 μl의 mRNA 및 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific) 중 리포펙타민 2000 복합체로 대체하였다. 5시간 후, 배지를 신선한 배지로 대체하고 플레이트를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리하였다.
HEK-293 세포 내에서 IL-8 과발현 모델
HEK-293 세포 내에서 IL-8 RNA 간섭(RNAi) 및 RNA 작제물(화합물 A1 내지 A5)의 IGF-1 발현의 동시 효과를 평가하기 위하여, IL-8 과발현 모델을 IL-8 mRNA 형질감염(300 ng/웰)을 사용하여 확립하였다. IL-8 발현을 간섭하고 동시에 IGF-1을 발현하는 IL-8-표적화 siRNA를 함유하는 mRNA 작제물(화합물 A1 내지 A5)의 능력을 평가하기 위하여, mRNA 작제물(화합물 A1 내지 A5; 300 내지 900 ng/웰)을 IL-8 mRNA(300 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 25시간 동안 항온처리한 후 세포 배양 상층액 속에서 ELISA에 의해 IL-8(하향조절하는 표적 유전자) 및 IGF-1(과발현하는 목적한 유전자)을 정량화하였다.
HEK-293 세포 내에서 TNF-α 과발현 모델
HEK-293 세포 내에서 화합물 A8의 TNF-α RNA 간섭(RNAi) 및 IL-4 발현의 동시 효과를 평가하기 위해, TNF-α 과발현 모델을 TNF-α mRNA 형질감염(600 ng/웰)을 사용하여 확립하였다. TNF-α 하향조절 및 동시 IL-4 발현에서 TNF-α 표적화 siRNA를 함유하는 화합물 A8의 능력을 평가하기 위하여, 세포를 화합물 A8(600 ng/웰) 및 TNF-α mRNA(600 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후 동일한 세포 배양 상층액 속에서 ELISA에 의해 TNF-α(하향조절된 표적 유전자) 및 IL-4(과발현된 목적한 유전자)를 정량화하였다.
결과
IL-8-표적화 siRNA 및 IGF-1 단백질 암호화 서열을 포함하는 화합물 A1을 HEK-293 세포(100 내지 900 ng/웰) 내에서 IL-8 하향조절 및 동시 IGF-1 발현에 대해 시험하였다. 데이타는 화합물 A1이 도 2a에 나타낸 바와 같이 대조군 IGF-1 mRNA에 의해 발현된 수준과 동일하거나 이를 초과하는 IGF-1 단백질을 발현함을 입증한다(빈 원(open circle) - 대조군 IGF-1 mRNA로부터 IGF-1의 발현; 채워진 원(closed circle) - 화합물 A1 IGF-1 발현). 동일한 실험에서, IL-8 발현에 대한 화합물 A1(300 ng/웰)의 RNA 간섭을 IL-8 과발현 작제물(300 ng/웰)에 이어 IL-8로 ELISA에 의해 평가하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 화합물 A1(우측 바아)은 처리되지 않은 대조군(좌측 바아)와 비교하여 IL-8 수준을 하향조절하였다(P < 0.01). 이러한 검정은 화합물 A1이 IL-8을 IGF-1의 발현을 감소시키지 않고 적어도 대략 3배(65%)까지 하향조절하였다.
HEK-293 IL-8 과발현 모델에서 IL-8 발현을 간섭하는데 있어서 화합물 A1의 용량-의존성 능력을 평가하기 위하여, HEK-293 세포를 증가하는 용량의 화합물 A1(300 내지 900 ng의 화합물 A1/웰) 및 불변 IL-8 mRNA(300 ng/웰)으로 동시-형질감염시키고 ELISA로 IL-8 발현에 대해 평가하였다. 도 3에서 입증된 바와 같이, IL-8-표적화 siRNA 및 IGF-1 단백질 암호화 서열을 포함하는 화합물 A1 mRNA 작제물은 HEK-293 세포 내에서 IL-8 발현을 용량-의존적 방식으로 억제하였다. 도 3은 300 ng/웰에서 화합물 A1이 IL-8 발현을 적어도 대략 3.5배(70%) 까지 감소시켰고 600 또는 900 ng/웰에서, 화합물 A1이 IL-8 발현을 적어도 대략 4.25배(75%)까지 감소시켰음을 나타낸다.
1X 및 3X siRNA 표적화 IL-8 각각을 포함하는, 화합물 A2 및 화합물 A3, 및 IGF-1 단백질 암호화 서열을 시험하여 동일한 작제물 속에서 siRNA 서열의 존재가 IGF-1 발현에 영향을 미치는지의 여부를 평가하였다. HEK-293 세포를 IGF-1 mRNA(600 ng/웰)로 형질감염시켰다. 도 4b(화합물 A2) 및 도 5b(화합물 A3)에서, 결과는 IGF-1가 화합물 A2 및 A3으로부터 발현됨을 나타낸다.
1X 및 3X siRNA 표적화 IL-1 베타를 각각 포함하는 화합물 A6 및 화합물 A7, 및 IGF-1 단백질 암호화 서열을 시험하여 동일한 작제물 속에서 siRNA의 존재가 IGF-1 발현에 영향을 미치는지의 여부를 평가하였다. HEK-293 세포를 IGF-1 mRNA(600 ng/웰)로 형질감염시켰다. 도 8c(화합물 A6) 및 도 9c(화합물 A7)에서, 결과는 IGF-1이 화합물 A6 및 A7로부터 발현됨을 나타낸다.
TNF-α-표적화 siRNA 및 IL-4 단백질 암호화 서열을 포함하는, 화합물 A8을 외인성 전달된 TNF-α mRNA(600 ng/웰)을 지닌 HEK-293 세포(600 ng/웰)에서 동시에 TNF-α 하향조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였다. 데이타는 화합물 A8이 도 10c에 나타낸 바와 같이 IL-4를 발현함을 입증한다. 동일한 세포 배양물 상층액을 사용한 동일한 시험에서, TNF-α 과발현 작제물(600 ng/웰)로부터 TNF-α 발현에 대한 화합물 A8(600 ng/웰)의 RNA 간섭을 TNF-α ELISA로 평가하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 화합물 A8(우측 바아)은 처리되지 않은 대조군(좌측 바아)와 비교하여 TNF-α 수준을 하향조절하였다(P < 0.05). 당해 검정에서, 화합물 A8은 TNF-α 수준을 적어도 대략 50%까지 하향조절하였다. 이러한 데이타는 화합물 A8이 IL-4 발현에 영향을 미치지 않고 TNF-α를 하향조절하였음을 입증한다.
다음에, 1X 및 3X siRNA 표적화 IL-8 각각을 포함하지만 IGF-1 암호화 서열을 포함하지 않는 화합물 A4 및 화합물 A5를 HEK-293 세포 내에서 IL-8 발현을 간섭하는데 있어서 용량-의존적 능력에 대해 평가하였다. IL-8(600 ng의 IL-8 mRNA)을 과발현하는 HEK-293 세포를 다양한 농도(300 내지 900 ng/웰)의 화합물 A4(1X siRNA) 및 화합물 A5(3X siRNA)로 형질감염시켰다. 도 7에서 입증된 바와 같이, 화합물 A4 및 화합물 A5는 HEK-293 세포 내에서 IL-8 발현을 용량-의존적 방식으로 억제하였다.
실시예 4: THP-1 세포의 시험관 내 형질감염, THP-1 세포 내에서 내인성 IL-1 베타/TNF-α 발현 모델 및 THP-1 세포 내에서 IL-8 과발현 모델
THP-1 세포의 시험관 내 형질감염
사람 단핵구 백혈병 세포주 THP-1(Sigma-Aldrich, 제품 번호 #88081201)을 성장 배지(10% FBS 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640) 속에서 유지시켰다. 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트 속에서 30,000개의 THP-1 세포로 72시간 동안 씨딩(seeding)한 후 형질감염시키고 성장 배지 속에서 희석된 50 nM의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Sigma-Aldrich, 제품 번호 P8139)로 활성화시켰다. 세포를 특정 mRNA로 단독 형질감염으로서 형질감염시키거나 리포펙타민 2000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 동시-형질감염(300-1200 ng/웰)시켰다. 100 μl의 DMEM을 각각의 웰로부터 제거하고 50 μl의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific) 및 50 μl의 mRNA 및 Opti-MEM 중 리포펙타민 2000 복합체를 사용하여 동시-형질감염시켰다. 5시간 후, 배지를 50 nM PMA가 보충된 신선한 성장 배지로 대체시키고 플레이트를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리하였다.
THP-1 세포 내에서 내인성 IL-1 베타 발현 모델
THP-1 세포 내에서 IL-1 베타의 내인성 분비를 위해, THP-1 세포를 이. 콜라이(E. coli)-유래된 지다당류(LPS-L4391; Sigma Aldrich)로 10 μg/mL의 최종 농도에서 dsDNA(특이적인 PCR 앰플리콘; 50 ng/웰)를 사용하여 자극시키고 90분 동안 항온처리하였다. IL-1 베타의 유도된 생산은 골관절염 및 IVDD에서 관찰된 생리학적 상태에 상응한다. 자극 후, 50 μl의 배지를 제거하고 Opti-MEM 속에서 리포펙타민 2000으로 복합체화된 특정 mRNA 작제물(화합물 A6 및 A7)을 함유하는 형질감염 복합체로 대체하고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리함 후, ELISA로 IL-1 베타 정량화하였다.
THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 발현 모델
THP-1 세포 내에서 TNF-α의 내인성 분비를 위해, THP-1 세포를 이. 콜라이-유래된 지다당류(LPS-L4391; Sigma Aldrich)로 10 μg/mL의 최종 농도에서 R848 (TLR7/8 효능제; Invivogen)를 1 μg/mL의 최종 농도에서 사용하여 자극시키고 90분 동안 항온처리하였다. TNF-α의 유도된 생산은 건선에서 관찰된 생리학적 상태에 상응한다. 자극 후, 50 μl의 배지를 제거하고 Opti-MEM 속에서 리포펙타민 2000으로 복합체화된 특정 mRNA 작제물(화합물 A8)을 함유하는 형질감염 복합체로 대체하고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 형질감염 후, 세포 배양 상층액을 수집하고 TNF-α(하향조절된 표적 유전자) 및 IL-4(과발현된 목적한 유전자)를 ELISA로 정량화하였다.
THP-1 세포 내에서 IL-8 과발현 모델
THP-1 세포 내에서 mRNA 작제물의 RNA 간섭(RNAi)를 평가하기 위하여, IL-8 과발현 모델을 IL-8 mRNA 형질감염(300 ng/웰)을 사용하여 확립하였다. IL-8 발현을 간섭하는 IL-8-표적화 siRNA를 함유하는 mRNA 작제물(화합물 A1 내지 A5)의 능력을 평가하기 위하여, mRNA 작제물(300 내지 900 ng/웰)을 IL-8 mRNA(300 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후 ELISA로 IL-8 및 IGF-1을 정량화하였다.
결과
화합물 A2 및 화합물 A3을 설계하여 1X 및 3X siRNA 표적화 IL-8 각각, 및 IGF-1 암호화 서열(표 1 및 표 2)을 갖도록 하고 하나 이상의 siRNA를 가지는 것이 표적화된 RNAi의 효과를 극대화시킬 수 있는지의 여부를 평가하였다. 화합물 A4 및 화합물 A5를 내부 대조군으로서 설계하였으며, 이는 1X 및 3X siRNA 표적화 IL-8 각각 만을, IGF-1 암호화 서열(표 1 및 표 2)없이, 포함하였다. 도 4a, 5a, 6a, 및 6b에 입증된 바와 같이, 화합물 A2 내지 A5는 화합물이 IGF-1 암호화 서열을 가지고 있는지의 여부에 상관없이 THP-1 세포내에서 IL-8 발현을 억제하였다. 화합물 A2는 IL-8 발현을 적어도 대략 30%까지 억제하였다(도 4a). 화합물 A3은 IL-8 발현을 적어도 대략 45%까지 억제하였다(도 6b). 화합물 A4는 IL-8 발현을 대략 40%까지 억제하였다(도 6a). 화합물 A5는 IL-8 발현을 적어도 대략 70%까지 억제하였다(도 6a 및 6b). 따라서, 3개의 siRNA를 갖는 화합물(화합물 A3 및 A5)은 IL-8 발현을 적어도 대략 45% 내지 적어도 대략 70%까지 억제한 반면, 1개의 siRNA를 갖는 화합물(화합물 A2 및 A4)은 IL-8 발현을 적어도 대략 30% 내지 적어도 대략 40%까지 억제하였다.
다음에, IL-1 베타 발현을 간섭하는데 있어서 화합물 A6(1X siRNA 표적화 IL-1 베타+ IGF-1 암호화 서열) 및 화합물 A7(3X siRNA 표적화 IL-1 베타+ IGF-1 암호화 서열)의 효과를 10 μg/mL LPS 및 50 ng/웰 dsDNA로 자극시킨 THP-1 세포 속에서 평가하여 내인성 IL-1 베타 분비를 유도하였다. 평가된 THP-1 모델은 골관절염 및 IVDD의 생리학적 면역 조건을 모사한다. 도 8a, 8b, 9a, 및 9b에서 입증된 바와 같이, 화합물 A6 및 화합물 A7은 THP-1 세포 내에서 내인성 IL-1 베타 발현의 발현을 하양조절하였다(P < 0.001). 화합물 A6은 IL-1 베타 발현을 적어도 대략 40%까지 하향조절하였다(도 8a 및 8b). 화합물 A7은 IL-1 베타발현을 적어도 대략 45% 내지 적어도 대략 50%까지 하향조절하였다(각각 도 9a 및 도 9b).
TNF-α의 하향조절에서 있어서 화합물 A8(siRNA 표적화 TNF-α 및 IL-4 암호화 서열을 포함함)의 효과를 10 μg/mL LPS 및 1 μg/mL R848로 자극시킨 THP-1 세포 내에서 평가하여 내인성 TNF-α 분비를 유도하였다. 확립된 THP-1 모델은 건선의 생리학적 면역 상태를 모사한다. 도 10b에서 입증되는 바와 같이, 화합물 A8은 THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 발현을 하향조절하였다(P < 0.05). 당해 검정에서, 화합물 A8은 TNF-α 발현을 적어도 대략 20% 까지 하향조절하였다. 동일한 세포 배양 상층액을 IL-4 발현에 대해 측정하였으며 IL-4 발현이 손사오디지 않았음이 입증되었다(도 10d).
실시예 5: 항-바이러스 작제물 설계, 서열, 및 합성
항-바이러스 작제물 설계
siRNA 및 목적한 단백질은 시험관 내 전사에 의해 생성된 단일 전사체로부터 동시 발현된다. 폴리뉴클레오타이드 또는 RNA 작제물은 문헌: Cheng, et al. (2018) J. Mater. Chem. B., 6, 4638-4644에 기술된 바와 같이 siRNA 설계를 포함하도록 가공되며, siRNA 서열(도 1에서의 도식)의 하부 또는 상부의 하나 이상의 목적한 유전자를 추가로 포함한다. 작제물은 동일하거나 상이한 표적 mRNA를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 서열을 암호화하거나 포함할 수 있다. 유사하게, 작제물은 2개 이상의 목적한 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 작제물의 임의의 2개 성분(예컨대, 2A 펩타이드 링커 또는 tRNA 링커) 사이에 존재할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 폴리핵산 작제물은 RNA 폴리머라제 결합 및 단일 전사체 내 목적한 유전자 및 siRNA 둘 다의 성공적인 시험관 내 전사를 위해, 목적한 유전자 서열의 상부의 T7 프로모터 서열(5' TAATACGACTCACTATA 3'; 서열 번호: 25)을 포함할 수 있다. 대안의 프로모터, 예컨대, SP6, T3, P60, Syn5, 및 KP34를 사용할 수 있다. 전사 주형을 T7 프로모터, IFN-베타 및 siRNA 서열을 플랭킹하기 위해 설계된 프라이머를 사용하여, PCR에 의해 생성함으로써 mRNA를 생산한다. 역 프라이머는 T(120) 스트레치(서열 번호: 197)를 포함함으로써 폴리(A) 테일(서열 번호: 193)의 120 bp 길이를 mRNA에 가한다.
항-바이러스 작제물 합성
표 5에 나타낸 바와 같은 작제물은 코돈 최적화(GeneOptimizer 알고리즘)로 T7 RNA 폴리머라제 프로모터(pMX, 예컨대, pMA-T 또는 pMA-RQ)를 함유하는 벡터로서 독일의 GeneArt(Thermo Fisher Scientific)에 의해 합성된다. 표 5는 각각의 화합물에 대해, 상응하는 mRNA에 결합하는 siRNA를 통해 하향조절될 단백질, 작제물의 siRNA(예컨대, 동일한 mRNA를 표적화하는 다수의 siRNA, 또는 상이한 mRNA를 각각 표적화하는 다수의 siRNA)의 수, 및 상향조절용 단백질 표적, 즉, 목적한 유전자의 생성물을 나타낸다. 본원에 기술된 실시예에서 사용된 화합물 B1 내지 B19 내 모든 우리딘은 N1-메틸슈도우리딘으로 변형되었다. 각각의 작제물의 서열은 표 6에 나타내며 하기에 표에 나타낸 바와 같이 주석이 달려 있다.
[표 5]
Figure pct00015
[표 6]
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 6: 항-바이러스 RNA 작제물의 시험관 내 전사 및 데이타 분석
PCR-기반 시험관 내 전사를 화합물 B1 내지 B19를 암호화하는 pMX 벡터를 사용하여 수행함으로써 mRNA를 생산한다. 전사 주형은 표 4에서 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 PCR로 생성한다. 폴리(A) 테일은 주형 내에서 암호화되어 120 bp 폴리(A) 테일(서열 번호: 193)을 생성한다. 최적화는 siRNA 플랭킹 영역이 주어진 특이적인 증폭을 달성하기 위해 필요한 경우 수행한다. 최적화는: 1) 벡터 DNA의 양을 감소시키고, 2) DNA 폴리머라제(Q5 핫 스타트 폴리머라제, New England Biolabs)를 변화시키고, 3) PCR의 각각의 주기에 대해 변성 시간(30초 내지 10초)을 감소시키고, 4) PCR의 각각의 주기에 대해 어닐링 시간(10초 내지 30초)을 증가시키고, 5) PCR의 각각의 주기에 대해 최종 연장 시간(15초 이하)을 증가시킴을 포함한다. 또한, 비-특이적인 프라이머 결합을 피하기 위하여, PCR 반응 혼합물을 해동 시약을 포함하는, 빙상에서 제조하고, 다수의 PCR 주기를 25회로 감소시킨다.
시험관 내 전사를 위해, T7 RNA 폴리머라제(MEGAscript kit, Thermo Fisher Scientific)를 37℃에서 2시간 동안 사용한다. 합성된 RNA를 100% N1-메틸슈도-UTP로 화학적으로 변형시키고 항-리버스 캡 유사체(ARCA; [m2 7,3'-OG(5')ppp(5')G])로 5' 말단(Jena Bioscience)에서 동시-전사적으로 캡핑한다. 시험관 내 전사 후, mRNA를 MEGAclear 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 컬럼-정제하고 Nanophotometer-N60(Implen)를 사용하여 정량한다.
시험관 내 전사를 사용하여, 화합물 B1 내지 B17을 생성하고 표적 mRNA/단백질 및 목적한 유전자/목적한 단백질의 하향 조절에 대해 시험하고 과발현 모델과 비교하였으며 여기서 목적한 유전자/목적한 단백질은 과발현된다.
데이타를 GraphPad Prism 8(미국, 샌 디에고 소재)을 사용하여 분석한다. 표준 또는 샘플 내에서 ELISA를 사용한 단백질 수준의 평가를 위해, 블랭크의 평균 흡광도 값을 표준 또는 샘플의 평균 흡광도로부터 감한다. 표준 곡선을 생성하고 제조업자의 프로토콜에 따라 4개의 매개변수 비선형 회귀를 사용하여 플롯팅한다. 각각의 샘플에서 단백질의 농도를 측정하기 위해, 각각의 단백질의 농도를 표준 곡선으로부터 내삽한다. 샘플의 최종 단백질 농도를 희석 인자를 곱하여 계산한다. 통계적 분석을 스튜던츠 t-시험을 사용하여 수행한다. GFP 양성 세포의 퍼센트를 SoftMax Pro 도구를 사용하여 계산한다. qPCR에 의한 바이러스 RNA의 상대적인 정량을 REST 2009 소프트웨어를 사용한 쌍-식 고정 재할당 랜덤화 시험(pair-wise fixed reallocation randomization test)으로 분석한다.
실시예 7: A549 세포 IFN-베타 과발현 모델
IFN-베타 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
A549 세포는 사람 폐 암종으로부터 유래된 대표적인 제II형 폐포(alveolar type II; ATII) 세포이다. COVID-19 사망률은은 숙주 ATII 세포 내에서 높은 바이러스 도입 수용체(ACE2) 발현으로 인한 호흡기 질병과 주로 관련되므로, A549 세포를 사용하여 임상 상황을 모사한다. A549 세포(Sigma-Aldrich, 스위스 부흐 소재, 제품 번호 6012804)는 10% FBS(Thermofischer, 스위스 바젤 소재, 제품 번호 10500-064)가 보충된, 둘베코 변형 이글 배지-고 글루코스(Dulbecco's Modified Eagle's medium-high glucose)(DMEM, Sigma-Aldrich, 스위스 브흐 소재, 제품 번호 D0822) 상에 유지시킨다. IFN-베타 발현을 평가하기 위하여 A549 세포를정규 성장 배지 속에서 10,000개의 세포/웰로 24시간 동안 플랜팅하고 형질감염시킨다. 이후에, 세포를 화합물 B1-19(0.3 내지 0.6 마이크로그램)로 리포펙타민 2000(www.invitrogen.com)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시킨다. 100 μl의 DMEM을 제거하고 50 μl의 Opti-MEM(www.thermofisher.com)에 이어서 50 μl의 Opti-MEM 중 mRNA 및 리포펙타민 2000 복합체를 각각의 웰에 가한다. 5시간의 항온처리 후, 배지를 신선한 성장 배지로 대체하고 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리 한 후 ELISA 키트 2.0(사람 IFN-베타 생물발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen)으로 정량화한다.
실시예 8: A549 세포 내에서 내인성 IL-6 자극 모델
IL-6 억제 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
A549 세포 내에서 IL-6의 내인성 분비를 위해, A549 세포를 재조합 사람 IL1-베타(20 ng/mL; 제품 코드: rcyec-hil1b; Invivogen) 및 재조합 사람 TNF-알파(20 ng/mL; 제품 코드: rcyc-htnfa; Invivogen)로 자극하고 120분 동안 항온처리한다. IL-6의 유도된 생산은 COVID-19에서 관찰된 생리학적 상태에 상응한다. 자극 후, 50 μl의 배지를 제거하고 특이적인 Opti-MEM 중 리포펙타민 2000으로 복합체화된 특이적인 mRNA 작제물(화합물 B1, B2, B15, B16 및 B17)을 함유하는 형질감염 복합체로 대체하고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리한 후, ELISA(ThermoFisher Scientific, 제품 번호 88-7066-22)에 의해 IL-6 정량화한다. 비처리된 샘플과 비교하여 IL-6에서의 감소를 확립한다. IL-6의 기능성 억제를 입증하기 위해, IL-6R 및 STAT3-유도성 SEAP 리포터 유전자(제품 코드: hkb-hil6, Invivogen)로 안전하에 형질감염된 HEK-Blue™ IL-6 리포터 세포를 사용한다. 처리하에 또는 처리없이 IL-6 자극된 샘플의 세포 배양 상층액을 생활성 사람 IL-6에 대해 측정하여 siRNA 매개된 간섭로 인하여, 화합물 B1, B2, B15, B16 및 B17의 처리로 세포 배양 상층액이 비처리된 대조군과 비교하여 감소된 생활성 사람 IL-6을 초래하는지를 측정한다. 세포 상층액을 사용하여 ELISA(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen)에 의한 IFN-베타를 정량적으로 측정한다.
실시예 9: THP-1 세포 내에서 내인성 IL-6R 억제 모델
IL-6R 억제 화합물을 사용한 THP-1 세포의 시험관 내 형질감염
A549 세포는 IL-6R을 내인성으로 발현하지 않으므로, 이의 수용체의 높은 내인성 발현으로 인하여 THP-1 세포가 사용된다(54x, www.proteinatlas.org). 사람 단핵 백혈병 세포주 THP-1(Sigma-Aldrich, 제품 번호 88081201)를 성장 배지(10% FBS 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640) 속에 유지시킨다. 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트 속에서 30,000 THP-1 세포를 씨딩한 후 형질감염시키고, 성장 배지 속에 희석된 50 nM의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Sigma-Aldrich, 제품 번호 P8139)로 활성화시킨다. 세포를 화합물 B3-B5(300 내지 1200 ng/웰)로 리포펙타민 2000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 형질감염시킨다. 100 μl의 DMEM을 각각의 웰로부터 제거하고 50 μl의 Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific) 및 50 μl의 Opti-MEM 중 mRNA 및 리포펙타민 2000 복합체로 대체한다. 5시간 후, 배지를 50 nM PMA가 보충된 신선한 성장 배지로 대체하고 플레이트를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한다. 형질감염 후, 세포 배양 상층액(ThermoFisher Scientific, 제품 번호 BMS214) 및 세포 분해물을 가공하여(LSBio, 제품 번호 LS-F1001) ELISA에 의해 IL-6R을 정량적으로 검출한다. IL-6R의 기능적 억제를 입증하기 위해, IL-6R 및 STAT3-유도성 SEAP 리포터 유전자(제품 코드: hkb-hil6, Invivogen)로 안정하게 형질감염시킨 HEK-Blue™ IL-6 리포터 세포를 사용한다. 화합물 B3 내지 B5의 형질감염은 HEK-Blue™ 세포 내에서 IL-6R의 siRNA 매개된 억제를 초래하므로, 재조합 사람 IL-6(제품 코드: rcyec-hil6, Invivogen)의 첨가는 STAT-3 유도성 SEAP 리포터 유전자를 활성화시키지 않는다. 이는 IL-6R 신호전달 경로의 차단을 입증하는데 효과적인 기능성 검정이다. 세포 상층액을 사용하여 ELISA(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen)에 의해 IFN-베타를 정량적으로 측정한다.
실시예 10: A549 세포 내에서 ACE2 과발현 모델
ACE2 mRNA 및 ACE2 억제/IFN-베타 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
ACE2 과발현 모델을 사용하여 A549 세포 내에서 mRNA 화합물 B6, B7, B15, B16 및 B17에 의한 동시 ACE2 RNA 간섭(RNAi) 및 IFN-베타 과발현을 평가한다. 모델은 ACE2 mRNA(서열 번호: 57로부터)로 형질감염시켜 확림한다. 세포의 각각의 샘플을 mRNA 화합물 B6, B7, B15, B16 및 B17 중 하나(300 내지 900 ng/웰), 및 ACE2 mRNA(300 ng/웰)로 동시-형질감염시킨다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후, 세포 배양 상층액(Aviva Systems Biology, 제품 번호 OKBB00649) 속에서 ELISA에 의해 ACE2(하향조절된 표적 mRNA) 및 IFN-베타(과발현된 목적한 유전자)를 정량화한다.
실시예 11: A549 세포 내에서 SARS CoV-2 스파이크 단백질 과발현 모델
SARS CoV-2 스파이크 단백질 mRNA 및 SARS CoV-2 스파이크 단백질 억제/IFN-베타 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
SARS CoV-2 스파이크(S) 단백질 과발현 모델을 사용하여 A549 세포 내에서 mRNA 화합물 B8, B9, B11, B15, B16 및 B17에 의한 동시 SARS CoV-2 스파이크 단백질 RNA 간섭(RNAi) 및 IFN-베타 과발현을 평가한다. 모델을 SARS CoV-2 스파이크 단백질(S-RBD, 서열 번호: 60)의 수용체 결합 도메인(RBD)을 암호화하는 mRNA로 형질감염시켜 확립한다. 각각의 세포의 샘플을 mRNA 화합물 B8, B9, B11, B15, B16 및 B17(300-900 ng/웰), 및 S-RBD mRNA(300 ng/웰) 중 하나로 동시-형질감염시킨다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후, ELISA(Sino biological, 제품 번호 KIT40591)에 의해 S-RBD를 정량화한다. 유사하게, IFN-베타 발현을 ELISA로 세포 배양 상층액(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen) 속에서 측정한다.
실시예 12: A549 세포 내에서 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 과발현 모델
SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 mRNA 및 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 억제/IFN-베타 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
SARS CoV-2 스파이크 단백질 과발현 모델을 사용하여 A549 세포 중 mRNA 화합물 B8 및 B10에 의한 동시 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 RNAi 억제 및 IFN-베타 과발현을 평가한다. 모델은 3' eGFP로 태그된 SARS CoV-2 N 단백질(서열 번호: 62)의 완전한 암호화 도메인을 암호화하는 mRNA로 형질감염시켜 확립한다. 별도의, 추가의 시도에서, SARS CoV-2 N 단백질을 플라스미드(pcDNA3+ 벡터)로부터 과발현시켜 2개의 독립된 시스템을 제공함으로써 화합물 B8 및 B10에 의한 RNAi 억제의 효과를 평가한다. SARS CoV-2 N 단백질을 표적화하는 화합물 B8 및 B10의 RNAi는 eGFP 해독 및 발현을 파괴한다.
세포(mRNA-형질감염된 세포 또는 플라스미드를 수반하는 세포)의 각각의 샘플을 mRNA 화합물 B8 및 B10(300 내지 900 ng/웰), 및 SARS CoV-2 N mRNA (300 ng/웰) 중 하나로 동시-형질감염시킨다.
형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 흡윤화된 대기 속에서 항온처리한 후, SARS CoV-2 N 단백질을 ELISA(Sino biological, 제품 번호 KIT40588)로 정량화한다. 유사하게, IFN-베타 발현을 세포 배양 상층액(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen) 속에서 ELISA로 측정한다. 화합물 B8 및 B10에 의한 RNAi 억제가 eGFP 해독의 파괴를 초래하는지를 측정하기 위하여, eGFP로 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(플라스미드 및 mRNA 둘 다의 발현으로부터)을 eGFP 발현에 대해 SpectraMax i3X 다중-방식 미세플레이트 판독기(multi-mode microplate reader)(Molecular Devices)를 사용하여 현미경적으로 시험한다. eGFP 양성 세포의 퍼센트를 처리된 및 대조군 비처리된 샘플 속에서 계산한다.
실시예 13: A549 세포 내에서 SARS CoV-2 Nsp1 과발현 모델
SARS CoV-2 비구조 단백질 mRNA 및 SARS CoV-2 비구조 단백질 억제/IFN-베타 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
RNA 수준에서 SARS CoV 및 MERS-CoV를 사용한 SARS CoV-2의 게놈 서열 정렬은 아미노산 비교보다 거의 보존되지 않음을 나타내었다. 계통수 분석(phylogenetic tree analysis(유전 거리 모델: Tamura-Nei; 수 구축 방법(Tree build method): UPGMA)은 MERS-CoV가 높은 수준의 다른 RNA 서열(>45%)을 가진 반면 SARS CoV 및 SARS CoV-2는 낮은 수준의 차이점을 나타내었음(21% 이하)을 나타내었다(참고: 도 11). 본 발명자는 SARS CoV를 SARS CoV-2와 별도로 정렬하고 siRNA 설계를 위한 보존된 최소 20 bp 유전자자리에 대해 조사하였다. 본 발명자는 바이러스 게놈의 시작부위 근처에서 47 bp의 상동성을 확인하였고(235 내지 281 bp) 이를 siRNA(화합물 B8 및 B14)를 설계하는데 사용하였다. siRNA를 비-구조 단백질 1(Nsp1)의 제1의 코돈(ATG)에 위치시킨다. 바이러스 게놈의 표적화 제1의 코돈(메티오닌; AUG)은 대안의 해독을 개시하기 위해 84개 아미노산 떨어져서 위치하는 다음 메티오닌(AUG)로서 바이러스 복제 상에 큰 충격을 이상적으로 이끈다.
SARS CoV-2 Nsp1 과발현 모델을 사용하여 A549 세포에서 mRNA 화합물 B8 및 B14에 의한 동시 SARS CoV-2 Nsp1 RNAi 억제 및 IFN-베타 과발현을 평가한다.
모델은 3' eGFP로 태그된 SARS CoV-2 Nsp1(서열 번호: 64)의 부분 도메인(처음 100개 아미노산)을 암호화하는 mRNA를 사용한 형질감염에 의해 확립한다. 별개의, 추가의 접근법에서, SARS CoV-2 Nsp1은 플라스미드(pcDNA3+ 벡터)로부터 과발현됨으로써 화합물 B8 및 B14에 의한 RNAi 억제의 효과를 평가하기 위한 2개의 독립된 시스템을 제공한다. 화합물 B8 및 B14 표적화 SARS CoV-2 Nsp1의 RNAi는 eGFP 해독 및 발현을 파괴한다.
세포(mRNA-형질감염된 세포 또는 플라스미드를 수반하는 세포)의 각각의 샘플을 mRNA 화합물 B8 및 B14(300-900 ng/웰), 및 SARS CoV-2 Nsp1 mRNA(300 ng/웰) 중 하나로 동시-형질감염시킨다.
형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한다. 화합물 B8 및 B14에 의한 RNAi 억제가 eGFP 해독의 파괴를 초래하는지를 측정하기 위하여, eGFP로 태그된 SARS CoV-2 Nsp1(플라스미드 및 mRNA 둘 다로부터)를 eGFP 발현에 대해 SpectraMax i3X 다중-방식 미세플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 현미경적으로 시험한다. eGFP 양성 세포의 퍼센트는 처리된 및 대조군 비처리된 샘플에서 계산한다. 동시에, IFN-베타 발현은 세포 배양 상층액(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen) 속에서 ELISA로 측정한다. 화합물 B8 및 B14에 의한 RNAi 억제가 eGFP 해독의 파괴를 초래하는지의 여부를 측정하기 위하여, eGFP로 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(플라스미드 및 mRNA 둘다의 발현으로부터)를 eGFP 발현에 대해 현미경적으로 시험한다. eGFP 양성 세포의 퍼센트를 처리된 및 대조군 비처리된 샘플에서 계산한다.
실시예 14: A549 세포 내에서 Nsp12-Nsp13 과발현 모델 및 SARS CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV mRNA 표적화 Nsp12-Nsp13 siRNA의 설계
SARS CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV mRNA 표적화 Nsp12-Nsp13 siRNA의 설계
모든 3개의 SARS CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV를 표적화하는 siRNA를 설계하기 위하여, 본 발명자는 17 bp로서 짧은 siRNA를 확인하여 서열을 따라 1개 이하의 미스매치(mismatch)를 조정한다. 이러한 여유있는 접근법을 사용하여, 본 발명자는 길이가 17 bp인 하나의 siRNA(14299 내지 14318, SARS CoV-2 게놈을 참고함) 및 3개의 게놈 서열(15091 내지 15107 및 17830 내지 17849, SARS CoV-2 게놈을 참고함) 중에서 1 bp 미스매치를 각각 갖는 2개의 추가의 siRNA를 설계하고, 이를 IFN-베타 과발현된 작제물 내에서 합한다.
SARS CoV-2 Nsp12-13 과발현 모델을 사용하여 A549 세포 내에서 mRNA 화합물 B12 및 B13에 의한 동시 SARS CoV-2 Nsp12-13 RNAi 억제 및 IFN-베타 과발현을 평가한다. 모델은 3' eGFP로 태그된 SARS CoV-2 게놈(서열 번호: 67)의 NSP12 및 NSP13 (14202-17951 bp; 3749 bp)의 비-암호화 도메인을 암호화하는 mRNA로 형질감염시켜 확립한다. 각각의 세포의 샘플(mRNA-형질감염된 세포 또는 플라스미드를 수반하는 세포)를 mRNA 화합물 B12 및 B13(300-900 ng/웰), 및 SARS CoV-2 NSP12 및 NSP-13 부분 게놈성 RNA(300 ng/웰)로 동시-형질감염시킨다.
형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후, Taqman-qPCR 기반 검정을 수행하여 형질감염되지 않은 대조군과 비교한 것으로서, 바이러스 RNA 분해를 평가한다. 동시에, IFN-베타 발현을 세포 배양 상층액(사람 IFN-베타 생발광성 ELISA 키트 2.0, 제품 코드: luex-hifnbv2, Invivogen) 속에서 ELISA로 측정한다.
실시예 15: A549 세포 ACE2 가용성 수용체 과발현 모델
ACE2 가용성 수용체 과발현 화합물을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
A549 세포는 사람 폐 암종으로부터 유래된 대표적인 제II형 폐포(ATII) 세포이다. COVID-19 사망률은 숙주 ATII 세포 내에서 주로 고 바이러스 도입 수용체(ACE2) 발현으로 인한 호흡기 질병과 관련되므로, A549 세포를 사용하여 임상 상황을 모사한다. A549 세포(Sigma-Aldrich, 스위스 부흐 소재, 제품 번호 6012804)는 10% FBS(Thermofischer, 스위스 바젤 소재, 제품 번호 10500-064)가 보충된, 둘베코 변형 이글 배지-고 글루코스(DMEM, Sigma-Aldrich, 스위스 브흐 소재, 제품 번호 D0822) 상에 유지시킨다. ACE2 가용성 수용체 발현을 평가하기 위하여 A549 세포를 정규 성장 배지 속에서 10,000개의 세포/웰로 24시간 동안 플랜팅하고 형질감염시킨다. 이후에, 세포를 화합물 B1-19(0.3 내지 0.6 마이크로그램)로 리포펙타민 2000(www.invitrogen.com)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시킨다. 100 μl의 DMEM을 제거하고 50 μl의 Opti-MEM(www.thermofisher.com)에 이어서 50 μl의 Opti-MEM 중 mRNA 및 리포펙타민 2000 복합체를 각각의 웰에 가한다. 5시간의 항온처리 후, 배지를 신선한 성장 배지로 대체하고 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 항온처리 한 후 ELISA 키트(Aviva Systems Biology, 제품 번호 OKBB00649)로 ACE2 정량화한다. 화합물 B18 및 화합물 B19의 항-바이러스 활성을 실시예 11 내지 13에서 시험한다.
실시예 16: 추가의 작제물
작제물 설계, 서열, 및 합성
작제물 설계 및 합성의 세부사항은 실시예 1에 기술되어 있다. 표 8은 단백질 발현을 하향조절하는 이의 각각의 siRNA 표적, 및 상향조절된 단백질 발현에 대한 단백질 표적을 사용하여 본 개시내용의 실시예에서 사용된 추가의 화합물을 요약한다. A9 내지 A15의 작제물의 서열은 표 9에 나타나 있고 하기 표에서 나타난 바와 같이 주석이 달려있다. 본원에 기술된 실시예에 사용된 화합물 A9 내지 A15 내 모든 우리딘을 N1-메틸슈도우리딘으로 변형시킨다. 각각의 화합물에 대해, siRNA 서열의 위치를 목적한 유전자와 관련하여 나타낸다. 예를 들면, "5' siRNA 위치"는 siRNA 서열이 화합물 내 목적한 유전자의 상부 또는 이에 대해 5'에 존재함을 나타낸다. 역으로, "3' siRNA 위치"는 siRNA 서열이 화합물 내 목적한 유전자의 하부 또는 이에 대해 3'에 위치함을 나타낸다. A9 내지 A15의 작제물의 플라스미드 서열은 표 10에 나타낸다.
[표 8]
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[표 9]
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[표 10]
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RNA 작제물의 시험관 내 전사 및 데이타 분석
시험관 내 전사의 세부사항을 실시예 2에 제공한다. 시험관 내 전사를 사용하여, 화합물 A9 및 화합물 A10을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고 THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 하향조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였으며 여기서 내인성 TNF-α 발현은 LPS 및 R848(실시예 17)로 처리함으로써 자극시켰다. 유사하게, 화합물 A9 및 화합물 A10을 HEK-293 세포의 과발현 모델에서 TNF-α 하향조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였고 여기서 TNF-α는 TNF-α 암호화 mRNA를 사용하여 과발현시켰다(실시예 18).
추가로, 화합물 A11을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고 A549 세포 내에서 내인성 ALK2 하향조절 및 IGF-1 발현에 대해 시험하였다(실시예 19). 또한, 화합물 A12 및 화합물 A13을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고 IMR32 세포 내에서 내인성 SOD1 하향조절에 대해 IGF-1 및 에리트로포이에틴(EPO) 각각의 발현과 함께 시험하였다(실시예 20). 화합물 A15 및 A16을 50 내지 200 μg 범위로 생성시키고 HEK293 세포를 사용하여 과발현 모델에서 IGF-1 및 IL-1 베타 하향조절의 발현에 대해 시험하였다. IL-1-베타 단백질을 IL-1 베타 암호화 mRNA를 사용하여 과발현시켰다(실시예 21).
화합물 B18을 50 내지 200 μg 범위에서 생성시키고 A549 세포를 사용하여 과발현 모델에서 가용성 ACE2 수용체의 발현 및 eGFP 태그된 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질의 하향조절에 대해 시험하였고 여기서 eGFP 태그-SARS CoV-2 뉴크렐오캡시드 단백질을 pCDNA3+ 벡터로부터 과발현시켰다(실시예 22).
데이타를 GraphPad Prism 8(미국 샌 디에고 소재)을 사용하여 분석하였다. 표준 또는 샘플에서 ELISA를 사용하여 단백질(IGF-1, IL-4, IL-1 베타, ALK2, SOD1, EPO, 및 TNF-α) 수준의 평가를 위해, 블랭크의 평균 흡광도 값을 표준 또는 샘플의 평균 흡광도로부터 감하였다. 표준 곡선을 생성시키고 제조업자의 프로토콜에 따라 4개 매개변수 비선형 회귀를 사용하여 플롯팅하였다. 각각의 샘플 속에서 단백질(IGF-1, IL-4, IL-1 베타, ALK2, SOD1, EPO, 및 TNF-α)의 농도를 측정하기 위하여, 단백질의 농도를 표준 곡선으로부터 내삽하였다. 샘플의 최종 단백질 농도를 희석 인자로 곱하여 계산하였다. 통계적 분석을 스튜던츠 t-시험 또는 일원 ANOVA에 이어서 대조군과 관련된 던넷 다중 비교 시험(Dunnet's multiple comparing test)을 사용하여 이루었다. GFP 양성 세포의 퍼센트를 실시예 22에서 SoftMax Pro 도구를 사용하여 계산하였다. 화합물을 사용한 처리 후 남아있는 mRNA의 대표적인 정량화를 연구 그룹 사이에서 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 수행하였다. 유의성 수준은 <0.05의 P-값으로 설정하였다. 화합물 A11의 분자량의 측정은 하기와 같이 측정하였다. 화합물 A11의 분자량은 각각의 염기의 수를 곱하고 염기의 분자량을 곱하여 이의 mRNA 서열을 기반으로 계산하였다(예컨대, A: 347.2 g/mol; C 323.2 g/mol; G 363.2 g/mol; N1-UTP:338.2 g/mol). 화합물 분자량은 각각의 염기에 대해 수득된 총 중량를 817.4 g/mol의 ARCA 분자량에 가함으로써 측정하였다. 작제물의 분자량을 사용하여 웰 속의 형질감염된 mRNA의 양을 nM 농도로 전환시켰다.
실시예 17: THP-1 세포 내 내인성 TNF-α 발현 모델
화합물 A9 및 화합물 A10을 THP-1 세포 내에서 TNF-α 발현을 하향조절하고, IL-4를 과발현하는 이의 능력에 대해 검정하였다. THP-1 세포 내 TNF-α의 내인성 분비를 위해, THP-1 세포를 이. 콜라이-유래된 지다당류(LPS-L4391; Sigma Aldrich)로 10 μg/mL의 최종 농도에서 R848(TLR7/8 효능제; Invivogen)를 1 μg/mL의 최종 농도에서 사용하여 자극시키고 90분 동안 항온처리하였다. TNF-α의 유도된 생산은 건선에서 관찰된 생리학적 상태에 상응한다. 자극 후, 50 μl의 배지를 제거하고 Opti-MEM 속에서 리포펙타민 2000으로 복합체화시킨 특이적인 mRNA 작제물(화합물 A9 및 A10) 또는 스크램블드(scrambled) siRNA(sc-siRNA)를 함유하는 형질감염 복합체로 대체하고 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리하였다. sc-siRNA를 사용하여 형질감염 관련 세포 사멸(Universal siRNA, Sigma; Cat. SIC002)을 제외시켰다. 형질감염 후, 세포 상층액을 수집하고 ELISA에 의해 TNF-α(하향조절된 표적 유전자) 및 IL-4(과발현된 목적한 유전자)에 대해 정량화하였다. TNF-α mRNA 만으로 형질감염시킨 샘플 속에서 TNF-α 수준을 대조군으로 사용하고 100%로 설정하고 TNF-α 녹 다운(knock down)의 퍼센트를 계산하였다.
결과
TNF-α의 하향 조절에서 화합물 A9(IL-4 암호화 서열에 대해 5'로 TNF-α를 표적화하는 siRNA를 포함) 및 화합물 A10(IL-4 암호화 서열에 대해 3'로 TNF-α를 표적화하는 siRNA를 포함)의 효과를 내인성 TNF-α 분비를 유도하는 10 μg/mL의 LPS 및 1 μg/mL의 R848로 자극시킨 THP-1 세포 내에서 평가하였다. 확립된 THP-1 모델은 건선의 생리학적 면역 상태를 모사한다. 도 12a에 입증된 바와 같이, 화합물 A9 및 화합물 A10은 THP-1 세포 내에서 내인성 TNF-α 발현의 발현을 대조군에 대해 적어도 대략 80%까지 하향조절하였다(P < 0.001). 흥미롭게도, 화합물 A10은 IL-4 ORF의 하부(또는 이에 대해 5')에 위치한 siRNA를 갖는 화합물 A9와 비교하여 유의적으로 보다 강력한 TNF-α 하향조절을 유도하였다(도 12a; P < 0.05). 화합물 A10은 TNF-α 하향조절을 대조군에 대해 적어도 대략 85%, 및 화합물 A9보다 대략 5 내지 10% 더 크게 유도하였다. 동일한 세포 배양 상층액을 IL-4 발현에 대해 측정하고 데이타는 화합물 A10에 의한 IL-4의 발현은 도 12b에 나타난 바와 같이 화합물 A9에 의한 IL-4의 발현보다 2.5배 더 높다(P < 0.01). 이러한 검정은 화합물 A10(IL-4 유전자의 3'에 위치한 TNF-α-표적화 siRNA)이, 화합물 A9(IL-4 유전자의 5'에 위치한 TNF-α-표적화 siRNA), 5 내지 10% 더 높은 TNF-α-표적화(하향조절) siRNA 활성 및 2.5배 더 높은 IL-4 발현(70% 증가)를 가짐을 입증한다.
실시예 18: HEK-293 세포 내에서 TNF-α 과발현 모델
화합물 A9 및 화합물 A10을 HEK-293 세포 내에서 TNF-α 발현을 하향조절하고, IL-4를 과발현하는 이의 능력에 대해 검정하였다. TNF-α RNA 간섭(RNAi) 및 IL-4 발현의 동시 효과를 평가하기 위하여, TNF-α 과발현 모델을 TNF-α mRNA 형질감염(600 ng/웰)을 사용하여 확립하였다. 기술된 바와 같이, 화합물 A9는 IL-4 암호화 서열의 5'(IL-4 유전자의 상부)로 TNF-α-표적화 siRNA를 포함하지만 화합물 A10은 IL-4 암호화 서열의 3'(IL-4 유전자의 하부)로 TNF-α-표적화 siRNA 3'를 포함한다. TNF-α 하향조절 및 동시 IL-4 발현에서 TNF-α 표적화 siRNA를 함유하는 화합물 A9 및 화합물 A10의 능력을 평가하기 위하여, 세포를 화합물 A9 또는 화합물 A10(900 ng/웰) 및 TNF-α mRNA(600 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤화된 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후 동일한 세포 배양 상층액 속에서 ELISA에 의해 TNF-α(하향조절된 표적 유전자) 및 IL-4(과발현된 목적한 유전자)를 정량화하였다. TNF-α mRNA 만으로 형질감염된 세포 내에서 TNF-α 수준을 대조군으로 사용하여 100%로 설정하고 TNF-α 녹 다운의 퍼센트를 계산하였다.
결과
화합물 A9 및 화합물 A10를 HEK-293 세포(900 ng/웰) 내에서 외인성으로 전달된 TNF-α mRNA (600 ng/웰)와 함께 동시에 TNF-α 하향조절 및 IL-4 발현에 대해 시험하였다. 데이타는 도 13b에 나타낸 바와 같이, 화합물 A9로부터보다 화합물 A10으로부터 20배 더 높은 IL-4 발현을 나타낸다(P < 0.001). 동일한 세포 배양 상층액을 사용한 동일한 실험에서 TNF-α 발현에 대한 화합물 A9 및 화합물 A10(900 ng/웰)의 RNA 간섭을 TNF-α 과발현 작제물(600 ng/웰)을 사용한 다음, TNF-α ELISA에 의해 평가하였다. 화합물 A9 및 화합물 A10 둘 다는 도 13a에 나타낸 바와 같이 비처리 대조군과 비교하여 TNF-α 수준을 80%(P < 0.01)까지 하향조절하였다. 도 13a 및 13b에 나타낸 검정 데이타는 화합물 A10(이는 IL-4 암호화 서열의 3'로 TNF-α-표적화 siRNA를 포함한다)은 적어도 TNF-α 뿐만 아니라 화합물 A9(이는 IL-4 암호화 서열의 5'로 TNF-α-표적화 siRNA를 포함한다)를 대략 80%까지 하향조절하였다. 또한, 화합물 A10은 화합물 A9와 비교하여 IL-4 발현에서 적어도 20배 증가를 유도하였다.
실시예 19: A549 세포 내에서 내인성 ALK2 발현 모델
화합물 A11을 사용한 A549 세포의 시험관 내 형질감염
A549 세포는 사람 폐 암종으로부터 유래된 대표적인 제II형 폐포(ATII) 세포이다. A549 세포는 중간 수준에서 내인성 ALK2 RNA 전사체를 발현하므로, A549 세포를 사용하여 IGF-1 발현을 측정하는 것과 병행하여 ALK2 mRNA를 감소시키는데 있어서 화합물 A11의 효과를 연구하였다. A549 세포(Sigma-Aldrich, 스위스 부흐 소재, 제품 번호 6012804)를 10% FBS(Thermo Fisher Scientific, 스위스 바젤 소재; 제품 번호 10500-064)가 보충된 둘베코 변형 이들 배지-고 글루코스(DMEM, Sigma-Aldrich, 스위스 부흐 소재, 제품 번호 D0822) 상에 유지시켰다. 화합물 A11 활성을 평가하기 위하여, A549 세포를 10,000개의 세포/웰의 밀도에서 24시간 동안 정규 성장 배지 속에서 플레이팅한 후 형질감염시켰다. 이후에, 세포를 증가하는 농도의 화합물 A11(각각 0, 19, 38, 75, 150, 300 또는 600 ng/웰에 상응하는 0, 0.61, 1.25, 2.54, 5.08, 10.16 및 20.33 nM)로 리포펙타민 2000(www.invitrogen.com)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시켰다. 100 μl의 DMEM을 제거하고 50 μl의 Opti-MEM(www.thermofisher.com)에 이어서 Opti-MEM 중 50 μl mRNA 및 리포펙타민 2000 복합체를 각각의 웰에 가하였다. 5시간의 항온처리 후, 배지를 신선한 성장 배지로 대체하고 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 속에서 항온처리한 후, ELISA에 의한 IGF-1 정량화 및 사람 ALK2 mRNA를 표적화하는 프라이머(전방 프라이머: 5'-GACGTGGAGTATGGCACTATCG-3' 및 역방 프라이머: 5'-CACTCCAACAGTGTAATCTGGCG-3'; 각각 서열 번호: 171 및 172)를 사용한 qPCR을 사용하여 CT 키트(Thermo Fisher Scientific, 스위스 바젤 소재, 제품 번호 A25599)에 대한 SYBR 1-줄기 세포를 사용하는 상대적인 정량화에 의한 ALK2 mRNA를 정량화하였다. 사람 18S rRNA를 참고 대조군(전방 프라이머: 5'- ACCCGTTGAACCCCATTCGTGA-3' 및 역방 프라이머: 5'-GCCTCACTAAACCATCCAATCGG-3'; 각각 서열 번호: 173 및 174)으로서 사용하였다.
결과
화합물 A11(IGF-1 단백질 암호화 서열에 대해 3'로 3x ALK2-표적화 siRNA를 포함함)을 용량 반응(0.6 nM 내지 20.33 nM)을 사용하여 A549 세포에서 ALK-2 하향조절 및 동시 IGF-1 발현에 대해 평가하였다. 데이타는 화합물 A11이 IGF-1 단백질 용량을 의존적으로 발현하여, 도 14에 나타낸 바와 같이 150 ng/ml 초과의 범위에 도달함을 입증한다. 동일한 세포 배양 상층액에서, 남아있는 ALK-2 발현에 대한 화합물 A11의 RNA 간섭을 평가하였다. 도 14에 입증된 바와 같이, 화합물 A11은 내인성 ALK2 RNA 전사체 발현을 대략 75%까지 하향조절하였다. 당해 검정은 화합물 A11이 ALK2 발현을 75%까지 하향조절하고 IGF-1을 용량-의존적 방식으로 적어도 150 ng/ml까지 동시 발현하였음을 입증하였다.
실시예 20: IMR32 세포 내에서 내인성 SOD1 발현 모델
화합물 A12 및 화합물 A13을 사람 백인 신경아세포종(Human Caucasian Neuroblastoma)(IMR32) 세포 내에서 SOD-1 발현을 하향조절하고, IGF-1(화합물 A12) 또는 EPO(화합물 A13)를 과발현하는 이의 능력에 대해 평가하였다. IMR32 세포(제품 번호 86041809, ECACC, 영국)를 웰 당 20,000개의 세포의 밀도에서 96 예비-코팅된 BRAND 미세역가 플레이트(제품 번호 782082) 내에서 10% (v/v) 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS), L-글루타민(2 mM) 및 비-필수 아미노산(NEAA, 1x)이 보충된 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle)(EMEM, Bioconcept 제품 번호 1-31S01-I, www.bioconcept.ch) 속에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 속에서 밤새 성장시켰다. 세포를 3개 용량의 화합물 A12 또는 화합물 A13(150, 300 또는 900 ng/웰) 작제물로 JetMessenger(www.polyplus-transfection.com)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 형질감염시켰다. 스크램블드 siRNA(sc-siRNA)를 사용하여 형질감염-관련된 세포 사멸(Universal siRNA, Sigma; 제품 번호 SIC002)를 제외시켰다. 요약하면, mRNA/JetMessenger 복합체를 0.1 μg의 mRNA 작제물 당 0.25 μl의 JetMessenger 시약을 혼합함으로써 형성시켰다. 실온에서 15분 항온처리한 후, JetMessenger 복합체를 10 μl로서 가하고 5시간 후 형질감염 배지/mRNA/JetMessenger를 웰로부터 제거하고 신선한 100 μl의 성장 배지로 대체하고 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 속에서 항온처리하였다. 남아있는 SOD1 mRNA의 측정은 qPCR로 세포 분해물 속에서 화합물 A12 및 화합물 A13을 사용한 형질감염 후 24시간 째에 사람 SOD1 mRNA를 표적화하는 프라이머(전방 프라이머: 5'- CTCACTCTCAGGAGACCATTGC-3' 및 역방 프라이머: 5'- CCACAAGCCAAACGACTTCCAG-3'; 각각 서열 번호: 175 및 176)로 qPCR을 사용한 상대적인 정량화에 의해 CT 키트(Thermo Fischer Scientific, 스위스 바젤; 제품 번호: A25599)에 대한 SYBR 1-Step 세포를 사용하여 측정하였다. 사람 18S rRNA는 실시예 19에 명시된 동일한 프라이머를 사용하여 참고 대조군으로서 사용하였다. 동일한 세포 배양 상층액을 사용하여 IGF-1 및 EPO(Thermo Fisher Scientific, 스위스 바젤; 제품 번호 BMS2035)를 ELISA로 측정하였다.
결과
증가하는 일련의 3개 용량의 화합물 A12(3x SOD1-표적화 siRNA 및 IGF-1 단백질 암호화 서열을 포함함) 및 화합물 A13(3x SOD1-표적화 siRNA 및 EPO 단백질 암호화 서열을 포함함)의 IMR32 세포 내 SOD1 하향조절에 대한 효과를 평가하였다(150, 300 및 900 ng/웰). 검정은 화합물 A12 및 화합물 A13이 SOD1 전사체를 용량-의존적 방식(적어도 대략 70%까지)으로 감소시켰음을 나타내었다(도 15a, 각각 빈 원 및 채워진 원). 스크램블드 siRNA는 효과를 나타내지 않았다(도 15a, 음영처리된 원). 동일한 세포 배양 상층액(IMR32 세포)에서, 화합물 A13의 EPO 단백질의 발현을 평가하였다. 도 15b에서 입증된 바와 같이, 화합물 A13은 EPO 발현을 용량-의존적 방식으로 유도하였다. 유사하게, 동일한 IMR32 세포 배양 상층액 속에서 화합물 A12로부터 IGF-1 단백질의 발현을 평가하였다. 도 15c에 나타낸 바와 같이, 화합물 A12는 IGF-1을 동시 발현하였다.
실시예 21: HEK-293 세포 내에서 IL-1 베타 과발현 모델
화합물 A14 및 화합물 A15를 HEK-293 세포 내에서 IL-1 베타 발현을 하향조절하고, IGF-1을 과발현하는 이의 능력에 대해 평가하였다. IL-1 베타 과발현 모델을 HEK-293 세포 내에서 IL-1 베타 mRNA 형질감염(300 ng/웰)을 사용하여 확립하였다. 화합물 A14는 IGF-1 암호화 서열에 대해 5'(IGF-1 유전자의 상부)로 IL-1 베타를 표적화하는 siRNA를 포함하지만 화합물 A15는 IGF-1 암호화 서열에 대해 3'(IGF-1 유전자의 하부)로 IL-1 베타를 표적화하는 siRNA를 포함한다. IL-1 베타 하향조절 및 동시 IGF-1 발현에서 IL-1 베타를 표적화하는 siRNA를 함유하는 화합물 A14 및 화합물 A15의 능력을 평가하기 위하여, HEK-293 세포를 화합물 A14 또는 화합물 A15(900 ng/웰) 및 IL-1 베타 mRNA(300 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 다음 동일한 세포 배양 상층액 속에서 ELISA로 IL-1 베타(하향조절하는 표적 유전자) 및 IGF-1(과발현하는 목적한 유전자)를 정량화하였다.
결과
화합물 A14 및 화합물 A15는 IGF-1 암호화 서열의 5' 또는 3' 각각에서 IL-1 베타-표적화 siRNA를 포함한다. 작제물을 HEK-293 세포(900 ng/웰)내에서 외인성 전달된 IL-1 베타 mRNA(300 ng/웰)를 사용하여 IL-1 베타 하향조절 및 IGF-1 발현에 대해 동시에 시험하였다. 데이타는 화합물 A15가 도 16b에 나타낸 바와 같이 화합물 A14보다 IGF-1을 대략 13배 더 높게 발현함을 입증한다(P < 0.001). 동일한 세포 배양 상층액을 사용한 동일한 실험에서, IL-1 베타 과발현 작제물(300 ng/웰)로부터 IL-1 베타 발현에 대한 화합물 A14 및 화합물 A15(900 ng/웰)의 RNA 간섭을 IL-1 베타 ELISA로 측정한 바와 같이, 평가하였다. 화합물 A14 및 화합물 A15는 IL-1 베타 수준을 도 16a에 나타낸 바와 같이 비처리 대조군과 비교하여, 각각 대략 150배 및 290배 이상까지 하향조절하였다(P < 0.001). 화합물 A15는 화합물 A14와 비교하여 IL-1 베타 하향조절을 적어도 대략 2배까지 유도하였고 여기서 siRNA는 OGF-1 ORF의 상부(에 대해 5')에 위치한다(도 16a; P < 0.05). 이러한 데이타는 화합물 A15(IGF-1 유전자에 대해 3'로 위치한 IL-1 베타-표적화 siRNA를 가짐)는 IGF-1 발현을 유의적으로 증가시키면서, IL-1 베타를 290배까지 하향조절하고, IGF-1 발현을 증가시켰음을 입증하였다. 화합물 A14(IGF-1 유전자에 대해 5'에 위치한 IL-1 베타-표적화 siRNA를 가짐)는 IGF-1 발현을 유의적으로 증가시키면서, IL-1 베타를 150배까지 하향조절하였고, IGF-1 발현을 증가시켰다. 따라서, IL-1 베타의 화합물 A15 하향조절은 화합물 A14에 대해 관찰된 것보다 2배 더 높았다. 추가로, IGF-1의 화합물 A15 발현은 화합물 A14에 대해 관찰된 것보다 13배 더 높았다.
실시예 22: A549 세포 내에서 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 과발현 모델
eGFP 태그 pCDNA3 + 벡터 및 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 억제/가용성 ACE2 과발현 화합물을 사용한 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 지닌 A549 세포의 시험관 내 형질감염
SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 과발현 모델을 사용하여 A549 세포 내에서 화합물 B18에 의한 동시 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 RNAi 억제 및 가용성 ACE2 과발현을 평가하였다. 모델은 eGFP 태그를 지닌 SARS CoV-2 N 단백질을 함유하는 플라스미드 pcDNA3+ 벡터(300 ng/웰)의 형질감염으로 확립하였다. SARS CoV-2 N 단백질을 표적화하는 화합물 B18의 RNAi는 하부 eGFP 해독 및 발현을 파괴한다. 화합물 B18은 ACE2 ORF에 대해 3'(의 하부)로 ORF 및 3x SARS CoV-2-표적화 siRNA(1x 표적 ORF1ab 영역, 1x 표적 스파이크 단백질 및 1x 표적 뉴클레오캡시드 단백질)을 암호화하는 가용성 ACE2를 함유한다. 세포를 화합물 B18(600 ng/웰) 및 SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 과발현 플라스미드 작제물(300 ng/웰)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 속에서 24시간 동안 항온처리한 후 화합물 B18에 의한 RNAi 억제가 eGFP 해독의 파괴를 초래하는지의 여부를 측정하였다. eGFP로 태그된(플라스미드의 발현으로부터) SARS CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 eGFP 발현에 대해 SpectraMax i3X 다중-방식 미세플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 시험하였다. eGFP 양성 세포의 퍼센트를 처리된 및 대조군 비처리된 샘플에서 계산하였다.
결과
화합물 B18(가용성 ACE2 단백질 암호화 서열에 대해 3'로 3x SARS CoV-2 표적화 siRNA를 포함함)의 효과를 A549 세포 내에서 SARS CoV-2 N-단백질 하향조절에 대해 평가하였다. eGFP 양성 세포의 감소된 수를 관찰하였으며, mRNA를 암호화하는 SARS CoV-2 N-단백질에 대한 화합물 B18의 표적화 효과를 나타낸다(도 17a 및 17b). 상이한 샘플에 대한 누적된 분석은 비처리된 대조군과 비교하여 화합물 B18에 의한 eFGP 양성 세포에서 대략 8배 감소를 나타내었다(도 17c).
본원에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 나열 목적을 위한 것이며 당해 분야의 숙련가에게 제안된 다양한 변형 또는 변화는 본 출원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구범위의 영역 내에 포함되어야 한다.
[표 7]
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SEQUENCE LISTING <110> VERSAMEB AG <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SIMULTANEOUSLY MODULATING EXPRESSION OF GENES <130> 57623-701.601 <140> <141> <150> 63/042,890 <151> 2020-06-23 <150> EP 19219276 <151> 2019-12-23 <160> 199 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 atagtgagtc gtattaacgt accaacaaca aggaagtgct aaagaaactt gttctttagc 60 acttccttgt ttatcttaga ggcatatccc tgccaccatg accatcctgt ttctgacaat 120 ggtcatcagc tacttcggct gcatgaaggc cgtgaagatg cacaccatga gcagcagcca 180 cctgttctat ctggccctgt gcctgctgac ctttaccagc tctgctaccg ccggacctga 240 gacactttgt ggcgctgaac tggtggacgc cctgcagttt gtgtgtggcg acagaggctt 300 ctacttcaac aagcccacag gctacggcag cagctctaga agggctcctc agaccggaat 360 cgtggacgag tgctgcttca gaagctgcga cctgcggcgg ctggaaatgt attgtgcccc 420 tctgaagcct gccaagagcg cctaatttat cttagaggca tatccct 467 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial 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of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 54 Met Leu Leu Lys Leu Leu Leu Val Ile Ala Leu Leu Ala Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser 20 <210> 55 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 55 atgctcctga agctcctgct ggtgattgcc ctgctggcct gcttcagcac aacagccctg 60 agc 63 <210> 56 <211> 805 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr 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<213> Middle East respiratory syndrome-related coronavirus <400> 79 gatttaagtg aatagcttgg ctatctcact tcccctcgtt ctcttgcaga actttgattt 60 taacgaactt aaataaaagc cctgttgttt agcgtatcgt tgcacttgtc tggtgggatt 120 gtggcattaa tttgcctgct catctaggca gtggacatat gctcaacact gggtataatt 180 ctaattgaat actatttttc agttagagcg tcgtgtctct tgtacgtctc ggtcacaata 240 cacggtttcg tccggtgcgt ggcaattcgg ggcacatcat gtctttcgtg gctggtgtga 300 ccgcgcaagg tgcgcgcggt acgtatcgag cagcgctcaa ctctgaaaaa catcaagacc 360 atgtgtctct aactgtgcca ctctgtggtt caggaaacct ggttgaaaaa ctttcaccat 420 ggttcatgga tggcgaaaat gcctatgaag tggtgaaggc catgttactt aaaaaggagc 480 cacttctcta tgtgcccatc cggctggctg gacacactag acacctccca ggtcctcgtg 540 tgtacctggt tgagaggctc attgcttgtg aaaatccatt catggttaac caattggctt 600 atagctctag tgcaaatggc agcctggttg gcacaacttt gcagggcaag cctattggta 660 tgttcttccc ttatgacatc gaacttgtca caggaaagca aaatattctc ctgcgcaagt 720 atggccgtgg tggttatcac tacaccccat tccactatga gcgagacaac acctcttgcc 780 ctgagtggat ggacgatttt 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Claims (77)

  1. (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 암호화(encoding)하거나 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물(recombinant polynucleic acid construct)을 포함하는 조성물로서,
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이하고,
    여기서 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열은 순차적인 방식으로 포함되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 분리되는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부(downstream)에 존재하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부에 존재하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, siRNA가 목적한 유전자의 발현을 억제하지 않는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 목적한 유전자의 발현이 조절되고, mRNA 또는 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질을 발현시킴으로써 임의로 상향조절되는, 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 목적한 유전자의 발현이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물로부터의 목적한 유전자의 발현과 비교하여 증가되고, 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 상부에 존재하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 표적 RNA의 발현이 조절되고, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA에 의해 임의로 하향조절되는, 조성물.
  9. 제3항에 있어서, 표적 RNA의 하향조절이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물로부터의 표적 RNA의 하향조절과 비교하여 향상되고; 여기서 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열의 하부에 존재하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 링커(linker)를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 (a) 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시키는, 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 링커가 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커 또는 가요성(flexible) 링커를 포함하는, 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 80개 핵산 잔기인, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 mRNA인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 액티빈 수용체-유사 키나제 2(ALK2), 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide Dismutase) 1(SOD1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 유전자가 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 및 에리트로포이에틴(EPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프(target motif)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal; NLS), 핵소체(nucleolar) 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지(Golgi) 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막관통(transmembrane) 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 표적 모티프가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프;
    (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프;
    (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및
    (d) 천연적으로 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생(naturally occurring) 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 폴리(A) 테일(poly (A) tail)을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡(cap)을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열(Kozak sequence)을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 RNA 작제물인, 조성물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 유전자 치료요법(gene therapy)에 적합한 벡터(vector)인, 조성물.
  24. 서열 번호: 1 내지 8 및 서열 번호: 152 내지 159로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 서열 번호: 80 내지 92 및 서열 번호: 140 내지 145로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥 서열(sense strand sequence)을 포함하는, 조성물.
  26. 대상체(subject)에서 바이러스 질환 또는 병태(condition)의 치료 또는 예방을 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
    (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 표적 RNA 또는 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 3개 이상의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 핵산 서열은 동일한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함하고 적어도 하나의 핵산 서열은 상이한 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는, 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 mRNA인, 조성물.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 비암호화(noncoding) RNA인, 조성물.
  31. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 인터류킨, 안지오텐신 전환 효소-2 (ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 인터류킨이 IL-1-알파, IL-1-베타, IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, 인터류킨 IL-6R-베타, IL-18, IL-36-알파, IL-36-베타; IL-36-감마, 및 IL-33으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  33. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 IL-6, IL-6R, IL-6R-알파, IL-6R-베타, 안지오텐신 전환 효소-2(ACE2), SARS CoV-2 ORF1ab, SARS CoV-2 S, 및 SARS CoV-2 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 2개 이상의 목적한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 2개 이상의 핵산 서열 각각은 동일한 목적한 유전자 또는 상이한 목적한 유전자를 암호화하는, 조성물.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 유전자가 IFN 알파-n3, IFN 알파-2a, IFN 알파-2b, IFN 베타-1a, IFN 베타-1b, ACE2 가용성 수용체, IL-37, 및 IL-38을 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  36. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 유전자가 IFN 베타 및 ACE2 가용성 수용체를 암호화하는 유전자의 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  37. 제26 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표적 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 표적 모티프는 신호 펩타이드, 핵 국재화 신호(NLS), 핵소체 국재화 신호(NoLS), 라이소솜 표적화 신호, 미토콘드리아 표적화 신호, 퍼옥시좀 표적화 신호, 미소관 팁 국재화 신호(MtLS), 엔도솜 표적화 신호, 엽록체 표적화 신호, 골지 표적화 신호, 소포체(ER) 표적화 신호, 프로테오솜 표적화 신호, 막 표적화 신호, 막관통 표적화 신호, 또는 중심체 국재화 신호(CLS)를 포함하는, 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 표적 모티프가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물:
    (a) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프;
    (b) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 이종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프;
    (c) 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프로서, 여기서 목적한 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대해 동종성인 표적 모티프가 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되는, 표적 모티프; 및
    (d) 천연에서 표적 모티프의 기능을 가지지 않는 천연 발생 아미노산 서열로서, 여기서 천연 발생 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 임의로 변형되는, 아미노산 서열.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재하는, 조성물.
  40. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부에 존재하는, 조성물.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 폴리(A) 테일을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 5' 캡을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 프로모터를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열, 또는 코작 서열을 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이 (a) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, (b) 표적 mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 2개 이상의 핵산 서열 각각, 및/또는 (c) 목적한 유전자를 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열 각각을 연결시키는, 조성물.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 링커가 tRNA 링커, 2A 펩타이드 링커, 또는 가요성 링커를 포함하는, 조성물.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 암호화 또는 포함하는 핵산 서열이, 길이가 약 6 내지 약 80개 핵산 잔기인, 조성물.
  46. 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리핵산 작제물이 RNA 작제물인, 조성물.
  47. 서열 번호: 29 내지 47로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물.
  48. 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에서 바이러스 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물.
  49. 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA가 서열 번호: 93 내지 109로부터 선택된 서열에 의해 암호화된 센스 가닥을 포함하는, 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내에서 2개 이상의 유전자의 발현을 동시 조절하는데 사용하기 위한, 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 표적 RNA의 엑손(exon)에 결합하는, 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 하나의 표적 RNA에 특이적으로 결합하는, 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA가 목적한 유전자의 인트론(intron) 서열에 의해 암호화 또는 포함되지 않은, 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 유전자가 RNA 스플라이싱(splicing)없이 발현되는, 조성물.
  55. 대상체에서 피부 질환(skin disease) 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
    (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
  56. 대상체에서 근육 질환(muscular disease) 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
    (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
  57. 대상체에서 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
    (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
  58. 대상체에서 관절 질환(joint disease) 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 재조합 폴리핵산 작제물을 포함하는 조성물로서, 작제물이:
    (i) 표적 RNA에 결합할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및
    (ii) 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고;
    여기서 표적 RNA는 목적한 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상이한, 조성물.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 순차적인 방식으로 포함되는, 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 상부에 존재하는, 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 표적 RNA에 결합할 수 있는 siRNA를 암호화 또는 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열이 목적한 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 하부에 존재하는, 조성물.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA가 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 1 베타(IL-1 베타), 인터류킨 17(IL-17), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 액티빈 수용체-유사 키나제 2(ALK2), 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
  63. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 목적한 유전자가 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 인터류킨 4(IL-4), 및 에리트로포이에틴(EPO)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 사람인, 조성물.
  65. 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제25항 및 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 피부 질환 또는 병태의 치료 방법.
  66. 제65항에 있어서, 피부 질환 또는 병태가 염증성 피부 장애(inflammatory skin disorder)를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 염증성 피부 장애가 건선(psoriasis)을 포함하는, 방법.
  68. 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제25항 및 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 근육 질환 또는 병태의 치료 방법.
  69. 제68항에 있어서, 근육 질환 또는 병태가 골격근 장애(skeletal muscle disorder)를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 골격근 장애가 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressiva; FOP)을 포함하는, 방법.
  71. 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제25항 및 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 또는 병태의 치료 방법.
  72. 제71항에 있어서, 신경변성 질환 또는 병태가 운동 뉴우런 장애(motor neuron disorder)를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 운동 뉴우런 장애가 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)을 포함하는, 방법.
  74. 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제25항 및 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여함을 포함하는, 관절 질환(joint disease) 또는 병태의 치료 방법.
  75. 제74항에 있어서, 관절 질환 또는 병태가 관절 변성(joint degeneration)을 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 관절 변성이 추간판 질환(intervertebral disc disease; IVDD) 또는 골관절염(osteoarthritis; OA)을 포함하는, 방법.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 사람인, 방법.
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