KR20220121867A - 분자의 세포 내 전달을 위한 다량체화 전달 시스템 - Google Patents

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Abstract

세포 내로 카고 분자(cargo molecule)를 전달하는 데 사용할 수 있는 다량체화 전달 시스템(multimerization delivery system)이다. 다량체화 전달 시스템은 카고 분자의 고효율 엔도사이토시스(high-efficiency endocytosis) 및 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)로부터의 고효율 방출을 달성할 수 있어, 카고 분자의 세포질 전달 효율을 크게 향상시킬 수 있다. 일단 카고 분자가 세포질에서 이용가능하게 되면, 카고 분자는 이와 관련된 어떤 역할도 할 수 있다. 다량체화 전달 시스템은 세포의 생물학적 메커니즘 및 경로에 영향을 미치는 효과적인 수단을 제공하며, 연구, 치료 및 진단 등 다양한 분야에서 사용될 수 있다.

Description

분자의 세포 내 전달을 위한 다량체화 전달 시스템
본 발명은 분자생물학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카고 분자(cargo molecule)의 세포 내 전달을 위한 다량체화 전달 시스템(multimerization delivery system)에 관한 것이다.
선택적 투과성 장벽으로서 세포막은 세포의 생존과 기능에 중요하다. 작은 분자는 세포의 자연적인 과정이나 지질 이중층의 직접적인 확산에 의해 세포막을 통과할 수 있지만, 대부분의 경우 활성 생물학적 거대분자와 같은 세포 내 카고(cargo)의 효율적인 통과는 세포막을 통한 세포 내 수송 과정의 주요 장애물로 남아 있다. 따라서, 생체 의학 등의 분야에서 세포 내 카고의 살아있는 세포로의 수송 효율을 효과적으로 향상시킬 수 있는 분자 수송 도구는 매우 중요하다.
현재, 생물학적 거대분자의 세포 진입을 매개하기 위한 세포 투과성 펩타이드(cell-penetrating peptides, CPPs)의 사용은 생물 의학 분야의 연구 핫스팟(hotspot) 중 하나이다. CPP는 일반적으로 5-30개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드로, 단백질을 포함한 생물학적 거대분자를 매개하여 화학적 가교(cross-linking), 융합 발현 또는 비-공유 결합에 의해 세포막을 침투하고 세포로 들어갈 수 있다. 세포-투과성 펩타이드는 생물학적 거대분자의 세포 내 진입을 매개할 때 저용량, 짧은 수송 시간, 조절 가능한 용량, 간단한 조작, 낮은 면역 반응 및 낮은 부작용의 장점으로 인해 생물 의학의 다양한 분야에서 사용되어 왔다.
CPP는 생물학적 거대분자를 운반하는 데 있어 위와 같은 장점을 가지고 있지만, 주로 자체적으로 낮은 전달 효율과 혈청 존재 시 더욱 감소되는 전달 효율 등 여전히 일부 한계가 있다.
이전 연구에 따르면 CPP에 의해 운반되는 생체 거대분자의 1%만이 성공적으로 세포 내 이입 소포(endocytic vesicles)에서 빠져나올 수 있으며, 대부분은 결국 분해되기 위해 리소좀으로 보내진다. 따라서, 세포 내 카고의 엔도솜 탈출 효율(endosomal escape efficiency)은 전체 전달 효율을 결정하는 CPP의 세포 내 전달 과정의 핵심 제한 요소이기도 하다. CPP의 낮은 전달 효율 문제를 해결하기 위해 많은 연구가 수행되었다. 엔도솜 탈출 효율을 개선하기 위한 주요 전략은 성숙 및 산성화 과정에서 소포막의 완전성을 파괴하여 그 내용물(전달된 세포 내 카고 포함)이 세포질로 방출될 수 있도록 하는 것이다. 현재 가장 효과적인 방법은 바이러스, 박테리아, 동식물 또는 인간으로부터 유래한 pH-민감성 융합 펩타이드를 사용하는 것이다. pH-민감성 펩타이드는 소수성 아미노산의 특정 비율을 포함하고 낮은 pH에서 급격한 구조적 변화를 겪는다. CPP-매개 세포 내 도입(endocytosis) 후 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)의 성숙 및 산성화 과정에서, pH 값이 임계점으로 떨어지면 CPP에 결합된 pH-민감성 펩타이드가 구조적 변화를 겪고 소포막의 지질 이중층에 결합한다. 그 결과, 인지질 이중층막의 완전성이 심하게 교란되고, 그 위에 작은 기공이 형성되거나, 소포막이 파열되어 최종적으로 수송된 생물학적 거대분자가 세포질로 방출된다. 그러나, 후속 연구에 따르면 pH-민감성 펩타이드와 융합된 CPP를 사용한 거대분자의 세포 내 전달 시스템의 세포 내 이입 소포 탈출 효율(endocytic vesicle escape efficiency)이 실제로 향상되었지만, 수송된 거대분자의 상당 부분이 여전히 내세포 소포에 남아 있음을 발견하였다(형광 단백질을 수송된 거대분자로 사용했을 때 명백한 스팟 분포가 관찰될 수 있었음).
세포 투과성 펩타이드의 적용을 제한하는 또 다른 요인은 혈청 불내성(serum intolerance)이다. 즉, 높은 혈청 농도 조건에서 CPP의 양전하와 헤모글로빈의 음전하 사이의 정전기적 상호 작용으로 인해 CPP가 세포막과 충분히 상호작용 할 수 없기 때문에, 이의 전달 효율이 급격히 떨어지고, 생체 내 CPP의 광범위한 적용이 심각하게 제한된다.
요약하면, CPP 매개 거대분자의 세포 내 진입 효율을 향상시키기 위해 많은 노력을 기울였지만, 그 효과는 여전히 만족스럽지 못하다. 세포로의 진입 효율은 세포 내 표적을 표적으로 하는 생체 거대분자 약물 개발 분야에서 CPP의 광범위한 적용에 대한 주요 제한 요소로 남아 있다. 동시에, 혈청 내성은 CPP를 의약품 개발에 사용하기 위해 반드시 해결해야 할 문제이기도 하지만, 이에 대한 연구 보고는 없다.
광범위한 실험 및 반복된 탐색 후에, 본 출원의 발명자들은 다량체화 도메인(multimerization domain)의 도입이 카고 분자의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)를 상당히 향상시키고 혈청 내성(serum tolerance)을 상당히 개선시킬 수 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 또한, pH-민감성 펩타이드 및 특정 프로테아제(protease) 인식 서열의 조합이 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)로부터 카고 분자의 방출을 크게 향상시키고, 카고 분자의 세포질 전달 효율을 더욱 향상시키며, 카고 분자가 상응하는 생물학적 기능을 완전히 발휘할 수 있도록 한다. 이러한 발현에 기초하여, 본 발명자들은 효율적인 세포질 전달을 달성하기 위한 다량체화 전달 시스템 (multimerization delivery system)을 개발하였다.
융합 폴리펩타이드
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 다량체화(multimerization) 도메인 서열, 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성(fusogenic) 펩타이드, 및 프로테아제 인식 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)를 제공한다.
본 발명에서, 용어 “다량체화 도메인(multimerization domain)”은 본 명세서에 기재된 융합 폴리펩타이드의 여러 카피를 다량체화(즉, 생체분자 복합체를 형성함)할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 다량체화 도메인은 동일한 융합 폴리펩타이드를 응집시켜 다량체(multimer)를 형성하는 동종다량체화 도메인(homomultimerization domain)이다.
특정 구현예에서, 상기 다량체화 도메인은 도메인이 2개 이상의 도메인(및 도메인이 부분을 구성하는 폴리펩타이드) 사이의 상호작용을 촉진할 수 있는 한, 이량체화(dimerization) 도메인, 삼량체화(trimerization) 도메인, 사량체화(tetramerization) 도메인, 또는 임의의 고차 다량체화(higher-order multimerization) 도메인일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 다량체화 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper), NOE(서열번호 3), GCN4-P1(서열번호 4), Delta(서열번호 5) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 다량체화 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 다량체화 도메인은 서열번호 1 또는 2에 나타낸 서열을 포함한다.
본 발명에서, “pH-민감성 융합생성 펩타이드(pH-sensitive fusogenic peptide)”는 “pH-민감성 펩타이드”와 상호교환적으로 사용되며, 이는 산성 조건(예: pH<6.5)에서 구조적 변화를 겪을 수 있는 폴리펩타이드 부류를 의미하고, 이에 의해 세포 내 이입 소포막과의 융합을 촉진한다. pH-민감성 펩타이드가 세포에 의해 세포 내 이입된(is endocytosed) 후 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)의 성숙 및 산성화 과정에서 pH 값이 임계점으로 떨어지면 이러한 펩타이드는 구조적 변화를 겪고 소포막의 지질 이중층에 결합하여 인지질 이중층 막의 완전성을 격렬하게 방해한다. 그 결과, 인지질 이중층 막의 완전성이 심각하게 교란되고, 그 위에 작은 기공이 형성되거나, 소포막이 파열되어, 최종적으로 수송된 생물학적 거대분자가 세포질로 방출된다. 이러한 폴리펩타이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Varkouhi, Amir K., et al. Journal of Controlled Release 151.3 (2011): 220-228; Erazo-Oliveras A, Muthukrishnan N, Baker R, et al. Pharmaceuticals, 2012, 5(11): 1177-1209에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있는 pH-민감성 펩타이드는 다음의 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 선택되거나 유래될 수 있다:
바이러스 단백질 공급원: HA2 (인플루엔자 바이러스) 및 이의 돌연변이체 KALA, GALA; 펜톤 베이스(penton base) (아데노바이러스(adenovirus) 또는 라이노바이러스(rhinovirus)), gp41 (HIV), L2 (파필로마바이러스(papillomavirus)), 외피 단백질(envelope protein) (웨스트 나일 바이러스(West Nile virus));
박테리아 단백질 공급원: 리스테리오리신 O(Listeriolysin O, LLO), 뉴코코컬 뉴몰리신(Pneumococcal pneumolysin, PLO), 스트렙토코컬 스트렙톨리신 O(Streptococcal streptolysin O, SLO), 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin), 슈도모나스 에어루기노사 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A), 시가 톡신(Shiga toxin), 콜레라 톡신(cholera toxin);
식물 단백질 공급원: 리신(Ricin), 사포린(Saporin), 겔로닌 톡신(Gelonin toxin);
인간/동물 단백질 공급원: 인간 칼시토닌(human calcitonin), 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor), 멜리틴(melittin);
합성 펩타이드: (R-Ahx-R) (4) AhxB, 페네트라틴(penetratin (pAntp)), EB1, 소 프리온 단백질(bovine prion protein (bPrPp)), 스윗 애로우 펩타이드(sweet arrow peptide, SAP), 폴리(L-히스티딘)(poly(L-histidine)), 프롤린이 풍부한 펩타이드(proline-rich peptide).
특정 구현예에서, 상기 pH-민감성 융합생성 펩타이드는 인플루엔자 바이러스 HA2(서열번호 36) 또는 이의 돌연변이체, 멜리틴(서열번호 39), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 HA2의 돌연변이체는 INF7(서열번호 12), KALA(서열번호 37) 또는 GALA(서열번호 38)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, pH-민감성 융합생성 펩타이드는 INF7을 포함한다. 특정 구현예에서, pH-민감성 융합생성 펩타이드는 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호 12.
본 발명에서, 용어 “세포-투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP)”는 “세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)”, “단백질 전위 도메인(protein translocation domain, PTD)”, 트로이 목마 펩타이드(Trojan horse peptide)” 또는 “형질도입 펩타이드(transduction peptide)” 등을 의미하고, 이는 다양한 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산을 포함한 다양한 거대분자)의 세포 흡수를 촉진할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 폴리펩타이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Stewart KM, et al. Org Biomol Chem. 2008 Jul 7;6(13):2242-55, 및 중국 특허 출원 CN101490081A(이들 모두는 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있고; 또는 미국 특허 출원 US2008/0234183에 기재된 방법과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있는 CPP는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 양이온성 유형(cationic type): 페네트라틴(Penetratin), HIV-TAT-47-57, HIV-1 Rev 34-50, FHV coat-35-49, 올리고아르기닌(Oligoarginines) (R9-R12), CCMV Gag-7-25, S413-PV, VP22, BP16, DPV3, DPV6, FAH coat, 프로타민 1(Protamine 1), 인간 cJun(human cJun), Engrailed-2, Islet-1, HoxA-13, TP10 등; 양친매성 유형(amphipathic type): 트랜스포탄(transportan), 트랜스포탄 10(Transportan 10), Pep-1, MPGα, MPGβCADY, Pepfect6, Pepfect14, Pepfect15, NickFect, Hel, sC18, pVEC, ARF(1-22), YTA2, PAR1 (Palmitoyl-SFLLRN), F2Pal10 (Palmitoyl-SFLLRN), BPrPp(1-30), hLF peptide (19-40), 부포린 2(Buforin 2), 크로타민(Crotamine), 아주린 p18(Azurin p18), hCT 펩타이드(hCT peptide) (18-32), S413-PVrev 등; 소수성 유형(hydrophobic type): 카포시 육종 섬유아세포 성장 인자(Kaposi's sarcoma fibroblast growth factor), 카이만 크로코딜러스로부터 유래된 Ig 경쇄 신호 펩타이드(signal peptide of Ig light chain derived from Caiiman crocodylus), 인테그린 β3 단편(integrin β3 fragment), Grb2-SH2 도메인, HIV-1 gp41 (1-23), HBV 전위 모티프(HBV translocation motif), 정자-난자 융합 단백질(sperm-egg fusion protein) (89-111), 인간 칼시토닌(human calcitonin) (9-32), Pep-7, C105Y, K-FGF 등.
또한, 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 CPP는 폴리펩타이드 서열이 여전히 이의 생물학적 활성, 즉, 분자의 세포 흡수 촉진을 유지하는 한, 상기 기재된 임의의 폴리펩타이드 서열에 대해 약 60, 70, 80, 90, 95, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 세포-투과성 펩타이드는 페네트라틴(Penetratin)(서열번호 40), Tat 유래 펩티드, Rev(34-50)(서열번호 42), VP22(서열번호 43), 트랜스포탄(transportan)(서열번호 44), Pep-1(서열번호 45), Pep-7(서열번호 46), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, Tat-유래 펩타이드는 Tat(48-60)(서열번호 14) 또는 Tat(47-57)(서열번호 41)로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 세포-투과성 펩타이드는 Tat(48-60)와 같은 Tat-유래 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포-투과성 펩타이드는 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: 서열번호 14.
특정 구현예에서, 프로테아제는 퓨린 및/또는 리소좀 시스테인 프로테아제로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열, 리소좀 시스테인 프로테아제 인식 서열, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: R-X1-X2-R↓(서열번호 47), 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 K 또는 R이며, ↓는 절단 부위를 나타낸다.
특정 구현예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: R-R-X1-X2-R↓ (서열번호: 48).
특정 구현예에서, X1은 알라닌(A), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 이소류신(I), 글리신(G), 아스파르트산(N), 류신(L), 라이신(K), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판 (W), 티로신(Y) 및 발린(V)으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: RRHK R↓ (서열번호: 49).
특정 구현예에서, 상기 퓨린 인식 서열은 다음을 포함하거나 이로 이루어진다: QSVASSRRHKR↓FAGV (서열번호 8).
특정 구현예에서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카텝신(cathepsin) B, 카텝신 C, 카텝신 X, 카텝신 S, 카텝신 L, 카텝신 D, 또는 카텝신 H로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카텝신 L이다.
특정 구현예에서, 카텝신 L 인식 서열은 다음 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: NNTHDLVGDVRLAGV (서열번호 10).
특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지의 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지의 카텝신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 단일-쇄 폴리펩타이드이다.
특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 RRHKR (서열번호 49) 및 NNTHDLVGDVRLAGV (서열번호 10)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 8 및 서열번호 10을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하고: 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성 펩타이드 및 프로테아제 인식 서열, 및 다량체화(multimerization) 도메인 서열은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치한다. 특정 예시적인 구현예에서, 상기 다량체화 도메인 서열은 융합 폴리펩타이드의 N-말단에, 또는 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 있다.
다른 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하고: pH-민감성 융합생성 펩타이드, 세포-투과성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열, 및 다량체화 도메인 서열은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치한다. 특정 예시적인 구현예에서, 상기 다량체화 도메인 서열은 융합 폴리펩타이드의 N-말단에, 또는 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 있다.
특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드에 포함된 임의의 인접한 도메인은 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 링커는 (GmS)n이고, 여기에서 m은 1내지 4의 정수(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4)로부터 선택되고 n은 1 내지 3의 정수(예를 들어, 1, 2 또는 3)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 50이다. 특정 구현예에서, 임의의 인접한 도메인 사이의 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 예시적인 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 서열번호 16 내지 18중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
두번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 측면의 융합 폴리펩타이드의 다량체(multimer)를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 다량체는 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 특정 구현예에서, 상기 다량체는 이량체이다.
특정 구현예에서, 상기 다량체는 동종다량체(homomultimer)이다.
융합 단백질
세번째 측면에서, 본 발명은 첫 번째 측면의 융합 폴리펩타이드 및 추가의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 추가의 폴리펩타이드는 효소, 형광 단백질 또는 바이오틴 등과 같은 검출가능한 표지를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 추가의 폴리펩타이드는 에피토프 태그, 리포터 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열, 및/또는 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, NLS) 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 에피토프 태그는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그의 예는 His, V5, FLAG, HA, Myc, VSV-G, Trx 등을 포함하나 이에 제한되지 않고, 당업자는 원하는 목적(예: 정제, 검출, 또는 추적)에 적합한 에피토프 태그를 선택하는 방법을 알고 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 추가 폴리펩타이드는 His-태그를 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 리포터 유전자는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그 예로는 GST, HRP, CAT, GFP, HcRed, DsRed, CFP, YFP, BFP 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, NLS)는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그 예로는 SV40 바이러스 대형 T 항원의 NLS를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 예시적인 구현예에서, 상기 NLS 서열은 서열번호 22에 나타낸다.
특정 예시적인 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드는 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)(예: ZFP9), 또는 단백질 포스파타제(예: Ppmlb)이다. 특정 예시적인 구현예에서, 징크 핑거 단백질은 NLS 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드는 핵산 결합 도메인 서열이다.
특정 구현예에서, 상기 핵산 결합 도메인 서열은 징크 핑거 단백질(예: ZFP9)이다.
특정 구현예에서, 상기 핵산 결합 도메인 서열은 서열번호 31에 나타낸 서열을 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드가 징크 핑거 단백질(예: ZFP9)인 경우, 다량체화 도메인 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열을 포함한다.
특정 예시적인 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 19 내지 21 중 어느 하나에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하고: 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 추가의 폴리펩타이드, 및 다량체화(multimerization) 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치한다. 특정 예시적인 구현예에서, 상기 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단에, 또는 프로테아제 인식 서열에 대한 C-말단에 위치한다. 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함하고: pH-민감성 융합생성 펩타이드, 세포-투과성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 추가의 폴리펩타이드; 및 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치한다. 특정 예시적인 구현예에서, 상기 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단에, 또는 프로테아제 인식 서열의 C-말단에 있다. 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 인식 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다.
특정 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드는 10000 Da 미만, 예를 들어, 5000 Da 미만, 3000 Da 미만, 또는 1000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 세 번째 측면의 융합 단백질의 다량체(multimer)를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 다량체는 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 특정 구현예에서, 상기 다량체는 이량체이다.
특정 구현예에서, 상기 다량체는 동종다량체(homomultimer)이다.
다량체(multimer)의 제조
본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 유전 공학 방법(재조합 기술)또는 화학적 합성 방법(예: Fmoc 고상 방법)에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(예: 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지(phage) 등이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 E.coli 세포와 같은 원핵 세포, 효모 세포와 같은 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예: 마우스 세포, 인간 세포 등과 같은 포유동물 세포)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 제조 방법이 제공되며, 이는 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 다량체의 형태로 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 다량체의 제조 방법이 제공되며, 이는 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포의 배양물로부터 다량체를 회수하는 단계를 포함한다.
복합체(Complex)
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 두 번째 측면의 다량체 및 카고 분자를 포함하는 복합체를 제공하고; 또는, 네 번째 측면의 다량체 및 카고 분자를 포함하는 복합체를 제공한다. 상기 카고 분자는 임의의 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 화학적 화합물, 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 10000 Da 미만, 예를 들어 5000 Da 미만, 3000 Da 미만, 또는 1000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 효소, 방사성핵종(radionuclide), 형광 염료, 화학발광 물질, 또는 바이오틴(biotin) 등과 같은 검출가능한 표지를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 약제학적 활성제를 포함한다.
펩타이드 또는 단백질
일부 구현예에서, 카고 분자는 펩타이드 또는 단백질이다. 특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 다량체를 형성하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질에 융합된다. 특정 구현예에서, 복합체는 두 번째 측면의 다량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 복합체는 단일-쇄 폴리펩타이드를 포함하고, 여기에서:
(i) 단일-쇄 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단까지 다음을 포함하고: 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자; 및 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치하며; 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다; 또는
(ii) 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 다음을 포함하고: pH-민감성 융합생성 펩타이드, 세포-투과성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 카고 분자; 및 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치하며; 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함한다; 또는
(iii) 상기 카고 분자는 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다.
핵산 분자
다른 구현예에서, 카고 분자는 핵산이다. 특정 구현예에서, 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 복합체는 네 번째 측면의 다량체를 포함하고, 여기에서 상기 다량체를 구성하는 융합 단백질은 핵산 결합 도메인 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 결합 도메인 서열은 징크 핑거 단백질(예: ZFP9)이다. 특정 구현예에서, 핵산 결합 도메인 서열은 서열번호 31에 나타낸 서열을 포함한다. 특정 예시적인 구현예에서, 추가의 폴리펩타이드가 징크 핑거 단백질(예: ZFP9)인 경우, 다량체 도메인 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열을 포함한다.
연결 방식
특정 구현예에서, 카고 분자는 다량체(또는 다량체를 구성하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질)에 융합되고, 화학적으로 결합되거나 비-공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 두 번째 또는 네 번째 측면의 다량체(또는 다량체를 구성하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질)은 카고 분자에 융합된다. 일부 구현예에서, 상기 카고 분자는 펩타이드 또는 단백질이다.
일부 구현예에서, 두 번째 또는 네 번째 측면의 다량체(또는 다량체를 구성하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질)은 카고 분자에 화학적으로 결합된다. 상기 “화학적 결합(chemical coupling)”은 다량체(또는 다량체를 구성하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질)에 포함된 반응기(reactive group)와 카고 분자에 포함된 반응기 사이의 화학 반응에 의해 얻어지는 결합을 의미하며, 두 부분은 화학 반응 후에 공유 결합으로 연결된다. 상기 화학 반응(결합 반응) 전에, 다량체, 카고 분자, 또는 둘 모두는 각각 화학적 결합에 필요한 반응기를 포함하도록 링커 분자와 별도의 반응으로 변형될 수 있다. 다량체 또는 카고 분자를 변형하는 데 사용되는 링커 분자의 선택은 사용된 결합 전략에 따라 다르다.
특정 구현예에서, 공유 결합은 이황화 결합(disulfide bond), 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond), 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond), 아미드 결합(amide bond), 아민 결합(amine bond), 티오에테르 결합(thioether bond), 에테르 결합(ether bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 탄소-탄소 결합(carbon-carbon bond)이다.
특정 구현예에서, 카고 분자는 다량체의 C-말단에 결합된다.
특정 구현예에서, 카고 분자는 핵산이다.
다른 구현예에서, 두 번째 또는 네 번째 측면의 다량체는 카고 분자에 비-공유적으로 연결된다.
특정 구현예에서, 다량체는 카고 분자에 정전기적으로 접합된다.
특정 구현예에서, 카고 분자는 핵산이다.
복합체의 제조
일부 구현예에서, 복합체가 화학적으로-연결된 다량체 및 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 다음의 예시적인 방법에 의해 얻어질 수 있다: 다량체와 카고 분자에 별도로 포함된 반응기 사이의 화학 반응을 허용하는 조건에서 다량체와 카고 분자를 혼합하여 두 부분이 공유 결합되도록 하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 방법은 다음을 추가로 포함한다: 링커 분자를 사용하여 다량체, 카고 분자, 또는 둘 모두를 변형시켜 이들이 각각 상기 기재된 화학 반응에 필요한 반응기를 포함하도록 하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다.
다른 구현예에서, 복합체가 정전기적 상호작용에 의해 접합된 다량체 및 카고 분자를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체는 다음의 예시적인 방법에 의해 얻어질 수 있다: (1) 본 발명의 다량체를 카고 분자와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및 (2) 다량체와 카고 분자가 복합체를 형성하도록 혼합물을 인큐베이션하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 카고 분자는 핵산이다. 이러한 구현예에서, 다량체를 구성하는 융합 단백질은 바람직하게 핵산 결합 도메인 서열을 추가로 포함한다.
용도 및 방법
본 발명의 다량체 또는 복합체는 카고 분자의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)를 크게 향상시킬 수 있어, 카고 분자를 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)로부터 효율적으로 방출할 수 있으며, 일단 카고 분자가 세포질에서 이용가능하게 되면, 그것들과 관련된 어떤 역할도 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다량체 또는 복합체는 치료 및 진단 용도 뿐만 아니라 추가 연구를 위한 세포 내 전달제로서 사용될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 다섯 번째 측면의 복합체를 포함한다.
특정 구현예에서, 복합체에 포함된 카고 분자는 약제학적 활성제 또는 검출가능한 표지이다. 이러한 표지는 진단, 약물 성향(예: 흡수, 분포, 대사, 배설) 연구, 치료 또는 약물의 효능 또는 부작용 연구 등에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 질병 치료용 의약품의 제조에 있어서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것으로; 여기에서, 상기 복합체에 포함된 카고 분자는 질병을 치료할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체, 또는 상기 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포를 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로; 여기에서, 상기 복합체에 포함된 카고 분자는 질병을 치료할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 질병은 프로그램된 괴사(programmed necrosis)와 관련된 질병이고, 여기에서 카고 분자는 단백질 포스파타제 1B(Ppm1b)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 프로그램된 괴사와 관련된 질병은 간 손상(예를 들어, 약물-유발 간 손상, 예컨대 아세트아미노펜 APAP에 의해 유발된 급성 간 손상), 염증성 질환(예를 들어, 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)), 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 및/또는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 질병은 TNF-α, 예를 들어 TNF-α에 의해 유발된 전신 염증 반응 증후군(SIRS)에 의해 유발된 프로그램된 괴사와 관련된 질병이다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체 또는 약제학적 조성물은 의약 분야에 공지된 임의의 형태일 수 있으며, 예를 들어, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼(emulsion), 용액, 겔, 캡슐, 산제, 과립제, 엘릭시르(elixir), 로젠지(lozenge), 좌약, 주사제(주사액, 동결건조분말 포함), 흡입제, 스프레이 등의 형태일 수 있다. 바람직한 투여 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 따라 다르다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체 또는 약제학적 조성물은 경구, 직장, 비경구 또는 국소 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.
예시적인 투여 경로는 경구 투여이다. 경구 투여를 위한 액체 제형은 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액(suspension), 시럽, 엘릭시스(elixir) 등을 포함한다. 유효 성분 이외에, 액체 제형은 물 또는 기타 용매, 가용화제(solubilizer) 및 유화제(emulsifier)와 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤질 벤조에이트 에스테르(benzyl benzoate ester), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 1,3-부탄디올(1,3-butanediol), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참기름 등), 글리세린, 테트라히드로푸르푸릴알코올(tetrahydrofurfuryl alcohol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 지방산 소르비탄 에스테르(fatty acid sorbitan ester) 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 투여용 액체 제형은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 등과 같은 보조제를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지(lozenge), 산제, 과립제 등을 포함한다. 유효 성분 이외에, 고체 제형은 약제학적으로 허용되는 불활성 부형제 또는 담체, 예컨대 충전제(filler)(예를 들어, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 전분, 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 칼락토오스, 크로스포비돈(crospovidone), 및 황산칼슘); 결합체(binder)(예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose), 알기네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 수크로오스, 및 아카시아(acacia)); 습윤제(humectant)(예를 들어, 세틸 알코올(cetyl alcohol) 및 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate)); 붕해제(disintegrant)(예를 들어, 아가(agar), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 전분, 알긴산(alginic acid), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 스타치(sodium carboxymethyl starch)); 윤활제(lubricant)(예를 들어, 활석(talc), 칼슘 스테아레이트(calcium stearate), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 솔리드 폴리에틸렌 글리콜(solid polyethylene glycol), 라우릴 소듐 설페이트(lauryl sodium sulfate)); 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체 또는 약제학적 조성물은 또한 비-경구 경로로 투여될 수 있다.
따라서, 다른 예시적인 투여 경로는 비경구 투여, 예를 들어, 피하 주사(subcutaneous injection), 정맥내 주사(intravenous injection), 복강내 주사(intraperitoneal injection), 근육내 주사(intramuscular injection), 흉골 주사(intrasternal injection) 및 주입(infusion)이다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사용 용액, 주사용 멸균 분말, 또는 주사용 농축 용액을 포함하는 주사용 제제일 수 있다. 주사용 제형은, 유효 성분 이외에, 멸균수, 링거액, 등장성 염화나트륨 용액(isotonic sodium chloride solution) 등의 약제학적으로 허용되는 담체, 및 항산화제, 완충액 및 정균제 등의 적절한 첨가제를 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 투여 경로는 국소 투여, 예를 들어 경피 투여(예를 들어, 경피 패치(transdermal patch) 또는 이온삼투 장치(iontophoresis device)를 통한 투여), 안내(intraocular) 투여, 또는 비강내(intranasal) 또는 흡입 투여이다. 경피 투여를 위한 제형은 국소 겔, 스프레이, 연고 및 크림일 수 있다. 국소 투여 형태는, 유효 성분 이외에, 피부 또는 다른 작용 부위를 통한 유효 성분의 흡수 또는 침투를 향상시키는 성분을 포함할 수 있다.
다른 예시적인 투여 경로는 직장 투여이다. 직장 투여를 위한 제형은 좌제일 수 있다.
또한, 약학 분야에 공지된 다른 담체 물질 및 투여 방식도 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체 또는 약제학적 조성물은 효과적인 제형화 및 투여 방법과 같은 임의의 공지된 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 키트는 형질감염 및/또는 세포 내 전달을 위한 지침서를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 키트는 카고 분자(예를 들어, 핵산, 펩타이드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화학적 화합물, 또는 이들의 임의의 혼합물)의 형질감염 및/또는 세포 내 전달을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질, 다량체, 복합체, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 전달 시약(예를 들어, 형질감염 시약 또는 세포 내 전달 시약)으로서의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 전달 시약은 카고 분자(예를 들어, 핵산, 펩타이드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화학적 화합물, 및 이들의 임의의 혼합물)의 세포 내 전달을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포를 다섯 번째 측면의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 카고 분자를 세포 내로 전달하는 방법을 제공하며, 상기 카고 분자는 복합체에 포함된 카고 분자이다.
특정 구현예에서, 상기 세포와 복합체를 접촉시키는 단계는 생체 내(in vivo)에서 수행된다.
특정 구현예에서, 상기 세포와 복합체를 접촉시키는 단계는 생체 외(ex vivo)에서 수행된다.
특정 구현예에서, 상기 세포와 복합체를 접촉시키는 단계는 시험관 내(in vitro)에서 수행된다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포와 같은 진핵 세포이다.
용어의 정의
본 발명에서 있어서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 세포 배양, 생화학, 핵산 화학, 면역학 연구실 등의 조작 단계는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 관례적인 단계(routine steps)이다. 한편, 본 발명의 이해를 돕기 위해 관련 용어에 대한 정의 및 설명은 아래와 같다.
본 명세서에 사용된 용어 “벡터”는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 상기 벡터는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction) 또는 형질감염(transfection)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 이에 의해 운반되는 유전 물질 요소는 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 플라스미드; 파지미드(phagemid); 코스미드; 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome, YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial arcificial chromosome, BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(P1 derived artificial chromosome, PAC)와 같은 인공 염색체; λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스. 상기 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus)(렌티바이러스(lentivirus) 포함), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스바이러스(herpesvirus)(예: 단순포진바이러스(herpes simplex virus)), 폭스바이러스(poxvirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 및 파필로마바이러스(papillomavirus), 파포바바이러스(papovavirus)(예: SV40)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별 인자, 및 리포터 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 발현을 조절하는 다양한 인자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “숙주 세포”는 E. coli 또는 Bacillus subtilis와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 Aspergillus 등과 같은 진균 세포, S2 Drosophila 세포 또는 Sf9과 같은 곤충 세포, 또는 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터를 도입하는 데 사용될 수 있는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “동일성(identity)”는 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산 간의 일치 정도를 의미한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정 부위에 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브-유닛을 갖는 경우(예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각이 특정 부위에 아데닌을 갖거나, 2개의 폴리펩타이드 각각이 특정 부위에 라이신을 가짐), 두 분자는 그 부위에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 비교를 위한 총 부위 수 X 100에 대해 두 서열이 공유하는 동일한 부위 수의 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열의 10개 부위 중 6개가 일치하는 경우, 이 2개의 서열의 동일성은 60%이다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT은 50%의 동일성을 공유한다(6개 부위 중 3개의 부위가 일치함). 일반적으로, 2개의 서열의 비교는 최대 동일성을 생성하는 방식으로 수행된다. 이러한 얼라인먼트(alignment)는 Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)의 방법에 기반한 Align 프로그램(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 중량 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(gap length penalty) 및 4의 갭 페널티(gap penalty)를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 패키지(http://www.gcg.com에서 사용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. 48: 444-453(1970))의 알고리즘에 의해 결정될 수 있습니다.
본 명세서에 포함된 20개의 통상적인 아미노산은 관례적인 방식으로 발현된다. 예를 들어, 참조로 본 명세서에 통합된 Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))을 참조한다. 본 발명에서, 용어 “폴리펩타이드” 및 “단백질”은 동일한 의미를 가지며, 상호 교환적으로 사용된다. 그리고 본 발명에서 아미노산은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 1-글자 및 3-글자 약어로 표현된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제”는 대상(subject) 및 유효 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 양립가능한 담체 및/또는 부형제를 의미하고, 이는 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995을 참조), pH 조절제, 계면 활성제, 이온 강도 향상제, 삼투압 유지제, 흡수 지연제, 희석제, 보조제, 방부제, 안정화제 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 버퍼를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 계면 활성제는 Tween-80과 같은 양이온성, 음이온성 또는 비-이온성 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 삼투압 유지제는 설탕, NaCl 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 흡수 지연제는 모노스테아레이트(monostearate) 및 젤라틴이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 희석제는 물, 수성 완충액(예: 완충 식염수), 알코올 및 폴리올(예: 글리세롤) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 보조제는 알루미늄 보조제(예: 수산화알루미늄), 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)(예: 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant)) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 방부제는 티메로살(thimerosal), 2-페녹시에탄올(2-phenoxyethanol), 파라벤(paraben), 트리클로로-tert-부탄올(trichloro-tert-butanol), 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 안정화제는 약물 내 유효 성분의 원하는 활성(예를 들어, PSD-95 유비퀴틴화의 억제 활성)을 안정화시킬 수 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가지며, 이는 글루타민산나트륨(sodium glutamate), 젤라틴 SPGA, 당류(예: 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 락토오스, 덱스트란 또는 글루코오스), 아미노산(예: 글루탐산, 글리신), 단백질(예: 건조 유청(dried whey), 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 생성물(예: 락트알부민 가수분해물(lactalbumin hydrolysate) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 용어 “치료”는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위해 수행되는 방법을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는 증상 완화, 질병의 범위 축소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행 지연 또는 감속, 및 감지 가능 여부에 관계없이 증상의 (부분적으로 또는 완전히) 완화하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, “치료”는 예상 생존 시간(치료를 받지 않는 경우)과 비교하여 생존 시간을 연장하는 것을 의미할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “대상(subject)”는 인간과 같은 영장류와 같은 포유동물을 의미한다.
본 발명의 다량체화 전달 시스템은 카고 분자의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency) 및 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle) 방출 효율을 크게 향상시킬 수 있어, 카고 분자의 세포질 전달 효율을 크게 향상시키므로, 카고 분자가 그에 상응하는 생물학적 기능을 충분히 발휘할 수 있다. 특히, 본 발명의 다량체화 전달 시스템은 혈청 내성을 현저히 향상시켜 생체 내 전달이 가능하다. 따라서, 본 발명의 전달 시스템은 세포의 생물학적 메커니즘 및 경로에 영향을 미치는 효과적인 수단을 제공하고, 연구, 치료, 진단 등의 많은 분야에서 사용될 수 있어 광범위한 적용 전망과 임상적 가치를 갖는다.
이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하나, 하기 도면 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라 본 발명을 예시하기 위해 사용되는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 측면은 첨부된 도면 및 바람직한 실시예들에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 류신 지퍼(leucine zipper)를 기반으로 하는 다량체화 전달 시스템-eGFP에 대한 클론 디자인을 나타낸다.
도 2는 류신 지퍼(leucine zipper)가 단백질 응집체(protein aggregate) 상태에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domain) 첨가 후 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency) 및 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency) 평가를 나타낸다.
도 4는 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domain) 첨가 후 혈청 조건에서 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율 평가를 나타낸다.
도 5는 다중 다량체 도메인 기반의 전달 시스템-eGFP에 대한 클론 디자인을 나타낸다.
도 6은 다양한 다량체화 도메인의 엔도사이토시스 효율에 대한 효과의 형광 현미경 영상화(fluorescence microscopy imaging)를 나타낸다.
도 7은 다양한 다량체화 도메인의 엔도사이토시스 효율에 대한 효과의 평가를 나타낸다.
도 8은 TINNeL-eGFP/GFPβ1-10에 대한 클론 디자인을 나타낸다.
도 9는 TINNeL 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율의 평가를 나타낸다.
도 10은 TINNeL 전달 시스템의 소포 탈출 효율이 평가를 나타낸다.
도 11은 상이한 혈청 농도에서 TINNeL 전달 시스템의 전달 효율의 평가를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 다량체화 전달 시스템의 수송 메커니즘의 개략도를 나타낸다.
도 13은 TINNeL-Ppm1b 전달 시스템의 단백질 및 기타 대조군 단백질의 클론 구성을 나타낸다.
도 14는 TINNeL-Ppm1b의 TNF-α-유도 세포 괴사를 억제하는 효과를 나타낸다.
도 15는 TINNeL-Ppm1b에 의한 TNF-α-유도 사멸 억제 후 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 16은 TINNeL-Ppm1b에 의한 억제 후 TNF-α에 의해 유발된 마우스 SIRS 맹장의 HE 염색을 나타낸다.
도 17은 TINNeL-Ppm1b에 의한 억제 후 TNF-α에 의해 유발된 마우스 SIRS 맹장의 손상 스코어를 나타낸다.
도 18은 마우스에서 APAP-유도 급성 간 손상의 TINNeL-Ppm1b 처리 후 ALT/AST 수준의 변화를 나타낸다.
도 19는 APAP에 의해 유발된 사멸에 대한 TINNeL-Ppm1b 처리 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 20은 TINNeL-ZFP9 전달 시스템의 단백질 및 기타 대조군 단백질의 클론 구성을 나타낸다.
도 21은 ZFP9 전달을 위한 진핵생물 발현 플라스미드 구조의 개략도를 나타낸다.
도 22는 TINNeL-ZFP9에 의한 적색 형광 단백질 발현 플라스미드의 형질도입 효율(transduction efficiency)에 대한 유세포 분석을 나타낸다.
도 23은 혈청 조건에서 TINNeL-ZFP9 및 X-tremeGNEN에 의해 형질도입된 적색 형광 단백질 발현 플라스미드에 대한 유세포 분석을 나타낸다.
도 24는 TINNeL-ZFP9에 의해 형질도입된 루시퍼라제(luciferase) 플라스미드의 형광 발현에 대한 마우스의 이미지를 나타낸다.
도 25는 전달 시스템에 의한 GFPβ1-10의 형질도입에 대한 형광 현미경 관찰을 나타낸다.
서열 정보
본 발명과 관련된 부분 서열에 대한 정보는 하기 표 1과 같다.
[표 1]
서열 설명
Figure pct00001
실시예
이제 본 발명을 제한하기보다는 본 발명을 예시하기 위한 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 설명할 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 분자생물학 실험방법 및 면역분석법은 기본적으로 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 F. M. Ausubel et al., Refined Molecular Biology Laboratory Manual, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 기재된 방법을 참고하여 수행하였고; 제한 효소는 제조사에서 권장하는 조건에 따라 사용하였다. 당업자는 실시예가 예로서 본 발명을 설명하고 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않음을 이해한다.
다음 예와 관련된 주요 시약의 출처는 다음과 같다:
클론 컨스트럭션(clone construction) 관련 시약에 필요한 재료는 다음과 같고: DNA 중합효소 (TaKaRa, R040A), DNA recovery kit (TianGen, DP214-03), plasmid mini kit (TianGen, DP103-03), plasmid Maxi kit (QIAGEN), 12663), Gibson assembly Master Mix (NEB, E2611L), DNA 마커 (ThmeroFisher, SM0331), 아가로스(agarose) (Biowest, BW-R0100);
대규모 단백질 발현에 필요한 재료는 다음과 같으며: 펩톤(peptone) (BiSIGMA-ALDRICH, T7293-1KG), 효모 파우더(yeast powder) (OXOID, LP0021B), 염화나트륨(sodium chloride) (Xilong Chemical Industry, 10011012AR), IPTG (Inalco, 1758-1400);
단백질 정제에 필요한 배지는 다음과 같고: SP SEPHAROSE FAST FLOW (GE Healthcare, 17-0729-01), NI SEPHAROSE (GE Healthcare, 17-5268-02);
단백질 정제 및 보존에 필요한 시약은 다음과 같으며: glycerol/glycerol/C3H8O3 (SIGMA-ALDRICH, G5516), KCl (Xilong Chemical Industry, 1002007), Na2HPO4·12H2O (Xilong Chemical Industry, 1001067AR), KH2PO4 (Xilong Chemical Industry, 1002048AR500), 이미다졸(imidazole) (SIGMA-ALDRICH, V900153), 트리스 염기(Tris base) (Seebio, 183995), 글루코오스 (Xilong Chemical Industry, 1064008AR500), BCA protein concentration assay kit (Thermo Scientific, 23227);
세포 배양에 필요한 시약: FBS (GIBCO, 10099-133), DMEM (GIBCO, 11965092), 트립신(trypsin) (AMRESCO, 0458);
렌티바이러스 패키징 및 감염에 필요한 시약: 렌티바이러스 패키징 플라스미드: pCMV-VSV-G (Addgene, 8454), pRSV-Rev (Addgene, 12253), pMDLg/pRRE (Addgene, 12251); X-tremeGENE 형질감염 시약 (Roche, 06366244001), 퓨로마이신(Puromycin) (InvivoGen, ant-pr-5), 블라스티시딘(Blasticidin) (InvivoGen, ant-bl-5b), 폴리브렌(polybrene) (Santa Cruz, sc-134220);
실험에 사용된 GFPβ1-10, ZFP9, Ppm1b, dsRed, mCherry, Histone-H3 관련 플라스미드는 Sangon Bio에서 합성하였으며, Cas9 서열 증폭에 사용된 플라스미드는 pCasKP-hph(Addgene, 117232)이었고;
기타 시약: TNF-α (Novoprotein, CF09), PI (ThmeroFisher, P3566)
세포주: HEK-293T (인간 신장 상피 세포(human kidney epithelial cells)), L929 (마우스 섬유아세포(mouse fibroblasts))는 ATCC에서 구입하였다.
실시예 1: TL 다량체화 전달 시스템의 구축 및 성능 평가
본 실시예에서, 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용하여 다량체화 전달 시스템을 구출하였다. 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)에 대한 다량체화 효과는 녹색 형광 단백질 eGFP를 전달함으로써 관찰되었다. Split-GFP 평가 방법을 기반으로 GFP β1-10-NLS(간단히 GFP β1-10이라고 함)를 전달함으로써 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency)에 대한 다량체화의 효과를 관찰하였다. 이를 통해, 다량체화가 전달 시스템의 전달 효율성에 미치는 영향에 대한 종합적인 평가가 수행되었다. 동시에, 혈청(FBS)을 시스템에 첨가하여 다량체화 전후의 엔도사이토시스 효율의 차이를 관찰하여 혈청 내성의 변화를 평가하였다.
1.1 다량체화 전달 시스템(TAT-Leu zipper)-카고 분자 복합체용 발현 벡터의 구축
TAT, Leu-Zipper(류신 지퍼(leucine zipper)) 및 카고 분자를 포함하는 재조합 단백질의 발현 벡터를 제작하였고, 각 재조합 단백질을 암호화하는 핵산의 구조를 도 1에 나타내었다. N-말단에서 C-말단까지 각 성분의 아미노산 서열은 아래 표와 같다. 구축 방법은 다음과 같았다: 먼저, 전달 시스템에서 TAT, 류신 지퍼(leucine zipper) 및 카고 분자(eGFP 또는 GFP β1-10)를 암호화하는 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 획득하고, 이 모든 부분을 여러 라운드의 PCR에 의해 연결하며, PCR의 마지막 라운드 동안, NdeI 제한 부위와 pET21b(+)에서 상응하는 NdeI 제한 부위의 업스트림에 대한 중첩된 부분이 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입되었고, BamHI 제한 부위와 pET-21b(+)에서 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림에 대한 중첩된 부분이 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입되었다. pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI로 이중 절단하였다. 중첩된 삽입 단편을 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 벡터 pET-21b(+)에 결찰시켰다.
전달 시스템-카고 분자 복합체에 포함된 구성 성분
복합체 명칭 N-말단 → C-말단 구성요소 및 이들의 서열
CPP 류신 지퍼(Leucine zipper) 카고(cargo)
T-eGFP Tat
서열번호 14		 None eGFP
서열번호 23
TL-eGFP 서열번호 1
T-GFP β1-10 None GFP β1-10-NLS
서열번호 25
TL-GFP β1-10 서열번호 1
1.2 다량체화 전달 시스템-카고 분자 복합체의 발현 및 정제:
1.1에 기재된 발현 플라스미드를 발현 균주 E.coli BL21(DE3)로 형질전환시켰다; 형질전환된 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하여 암피실린(ampicillin) 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 밤새 배양한 균액(bacterial liquid) 1 ml를 취하여 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml에 옮겼다. 균액의 OD600이 약 0.6이 될 때까지 37℃, 180 rpm에서 배양한 후, 인듀서(inducer) IPTG를 최종 농도 0.2 mM이 되도록 첨가하고, 25℃에서 8시간 동안 유도시키고; 유도된 발현이 종료된 후, 4℃에서 10분 동안 7000 g으로 원심분리한 후 세포를 수집하였다; 그런 다음 세포를 10 ml의 단백질 정제 평형 완충액(protein equilibration buffer)(PBS, 5% 글리세롤)으로 재현탁하고, 초음파 처리하여 깨뜨렸다. 그 다음, 상층액을 원심분리에 의해 취하고 단백질 정제 시스템의 SP 강한 양이온 크로마토그래피 컬럼(SP strong cation chromatography column)에 로딩하였다; 그런 다음 단백질 정제 시스템을 사용하여 단백질 용출 완충액(protein elution buffer)(불순 단백질을 제거하기 위한 PBS+0.2 M NaCl~PBS+0.6 M NaCl, 용출 생성물을 수집하기 위한 PBS+1.6 M NaCl)으로 표적 단백질을 용리시켰다. 단백질 농도는 분광 광도계 또는 BCA 단백질 농도 분석 키트에 따라 결정할 수 있다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분취하여 -20℃에서 보관하였다.
1.3 전달 시스템-카고 복합체에 대한 류신 지퍼(leucine zipper)의 다량체화 효과 평가
상기 1.2에서 얻은 TAT-eGFP(T-eGFP) 및 류신 지퍼 베어링(leucine zipper-bearing) TAT-Leu-eGFP(TL-eGFP)를 비환원성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 응집체 형성 상태를 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 단량체 상태의 T-eGFP 단백질의 크기는 약 35 kD인 반면, 류신 지퍼(leucine zipper)를 첨가한 TL-eGFP의 단백질 크기는 70 kD였다. 상기 실험은 류신 지퍼(leucine zipper)가 전달 시스템 단백질을 촉진하여 이량체를 형성할 수 있음을 나타내었다.
1.4 다량체화 전달 시스템-eGFP 복합체의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency) 평가
HEK-293T 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, 각각 5 μM의 TL-eGFP 및 T-eGFP를 무혈청 배지에 첨가하였다; 3시간 인큐베이션 후 미리 냉각된 20 U/mL 헤파린이 함유된 무혈청 DMEM으로 3회 헹굼을 수행하여 세포막에 흡착되어 세포 내로 들어가지 못한 단백질을 제거하고, 세포를 모아서 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이량체화된 단백질 TL-eGFP의 세포 내 형광 강도는 단량체(T-eGFP)의 4-5배였으며, 이는 다량체화 과정이 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)을 향상시킴을 입증하였다.
1.5 다량체화 전달 시스템-GFP β1-10 복합체의 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency) 평가
Split-GFP 시스템에서, GFP의 11개 β-시트(β-sheet)는 큰 단편(β1-10)과 작은 단편(β11)으로 분할되었으며, 둘 다 형광 활성을 잃었지만 만나게 되는 경우 GFP 형광 형광 속성을 연결하고 복원할 수 있다. 이를 기반으로, Histone-β11을 안정적으로 발현할 수 있는 HEK293T 세포를 구축하고, 평가하고자 하는 다량체화 전달 시스템과 융합 발현을 위한 카고(Cargo)로 핵 진입 신호(nuclear entry signal, NLS)를 갖는 GFPβ1-10을 사용하였으며, 그런 다음 안정한 세포주의 형질도입을 실시하였다. GFPβ1-10이 전달 시스템에 의해 형질도입되었을 때, GFPβ11에 결합하여 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)에서 성공적으로 탈출하여 세포질이나 핵으로 들어간 후에야 완전한 GFP를 생성할 수 있으므로, 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle) 탈출 효율은 GFP의 비율과 상대적인 형광 강도의 비에 의해 평가할 수 있었다.
1.5.1 HEK293T-GFPβ11 세포주의 구축
(1) GFPβ11 세포주의 렌티바이러스 플라스미드(lentiviral plasmid) 구축:
Histone-H3(서열번호 27)의 코딩 서열은 PCR로 증폭하였고, GFPβ11(서열번호 28)의 코딩 서열은 짧고 업스트림 프라이머에 직접 설계하였다. 여러 차례의 PCR을 통해 구성 성분을 연결하고, 마지막 PCR에서 Hind III 제한 부위와 Lenti 벡터 상의 상응하는 Hind III 제한 부위의 업스트림에 중첩된 부분을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하였고, 및 BamHI 제한 부위와 Lenti 벡터 상의 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림 상의 중첩된 부분이 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입되었다. Lenti 플라스미드는 Hind III 및 BamHI로 이중 절단되었다. 중첩된 삽입 단편은 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 Lenti 벡터에 결찰되었다.
(2) 렌티바이러스 패키징, 세포주의 감염 및 저항성 스크리닝:
HEK-293T 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 플라스미드 형질감염 전에, 웰당 세포 수가 약 2*107/ml인 것이 확인되었고; 형질감염 전에 세포를 무혈청 DMEM 배지로 옮겼으며; 1.5 ㎍의 Lenti 재조합 플라스미드, 0.75 ㎍의 pMDL 플라스미드, 0.45 ㎍의 pVSV-G 플라스미드, 0.3 ㎍의 pREV(5:3:2:1의 질량비)를 300 ㎕의 무혈청 DMEM에 첨가한 후, 천천히 흔들어주었다. 9 ㎕(1:3)의 X-tremeGENE 형질감염 시약을 첨가하고 천천히 흔들어주었으며, 실온에서 15분 동안 방치하고, 세포 상청액에 적가하였으며; 8시간 후, 배지를 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 교체하여 배양을 계속하고; 60시간 후, 세포 배양 상청액을 나중에 감염을 위해 수집하였다.
HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 렌티바이러스 감염 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106/ml(50% 밀도)이고; 원래의 세포 배양 상층액을 버리고, 300 ㎕의 렌티바이러스(moi=3) 및 700 ㎕의 10% FBS DMEM를 첨가하고, 폴리브렌(polybrene)을 10 ㎍/ml의 농도로 첨가하며, 세포 플레이트를 무균 조건 하의 2500 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, 배양을 계속하였다.
48시간 동안 렌티바이러스 감염 후, 세포를 1/3의 비율로 계대하고, 저항성 스크리닝을 위해 퓨로마이신(puromycin)을 2.5 ㎍/ml의 농도로 첨가하였고; 스크리닝을 통해 얻은 양성 세포를 클로닝하여 HEK-293T-Hitone-GFPβ11 단일클론 세포주를 얻었다.
1.5.2 Split-GFP 시스템에 의한 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency) 검출
상기 HEK-293T Histone H3-β11 세포(줄여서 HEK-293T β11)를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 무혈청 DMEM 배지를 사용하여 세포를 3회 세척한 다음, 각각 5 μM의 TL-GFP β1-10 및 T-GFP β1-10을 무혈청 배지에 첨가하였으며; 3시간 동안 배양한 후 미리 냉각된 20 U/ml 헤파린이 함유된 무혈청 DMEM을 사용하여 3회 헹굼을 수행하여 세포막에 흡착되어 세포 내로 들어가지 못한 단백질을 제거한 후 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 배지를 변경한 후 추가로 9시간 동안 더 배양하였다. 그리고 세포를 수집하여 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 수행하였다. 결과는 이량체화된 단백질 TL-GFP β1-10의 소포 탈출 효율이 단량체 T-GFP β1-10과 비교하여 변하지 않음을 보여주었다(도 3).
1.6 혈청 상태에 대한 다량체화 전달 시스템의 내성 평가
HEK-293T 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, 각각 5 μM의 TL-eGFP 및 T-eGFP를 무혈청, 5%, 10%, 20%, 50% 및 100% FBS DMEM 배지에 첨가하였으며; 3시간 동안 배양한 후, 미리 냉각된 20 U/mL 헤파린이 함유된 무혈청 DMEM을 사용하여 세포막에 흡착되어 세포에 들어가지 못한 단백질을 제거한 후 그런 다음 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교체하고, 유세포 분석을 위해 세포를 수집하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 혈청 함량이 증가함에 따라 TL-eGFP 및 T-eGFP의 형질도입 효율은 감소하였으나, TL-eGFP의 형질도입 효율은 혈청의 영향을 상대적으로 적게 받았으며, 50% FBS 조건에서, 세포가 T-eGFP에 의해 형질도입된 후 검출 가능한 세포 내 녹색 형광 신호는 거의 없었지만, 이량체화된 단백질 TL-eGFP는 혈청이 없는 것과 비교하여 여전히 70%의 형질도입 효율을 가졌다. 다량체화는 단백질의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)을 향상시킬 뿐만 아니라 단백질에 대한 더 높은 혈청 내성을 부여함을 알 수 있었다.
1.7 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)에 대한 상이한 다량체화 도메인의 효과
본 실시예에서, 전달 시스템의 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)에 대한 상이한 다량체화 도메인 서열의 효과를 비교하였다. 상이한 다량체화 도메인을 포함하는 전달 시스템-카고 분자 복합체의 구성 성분은 하기 표에 나타내었다. 상술한 복합체를 발현시키기 위한 발현 벡터는 상기 1.1 내지 1.2에 기재된 방법으로 제조하였고, 상술한 복합체를 발현 및 정제하였다. 구축된 플라스미드의 개략도를 도 5에 나타내었다.
복합체의 명칭 N-말단 → C-말단 구성 성분 및 이들의 서열
CPP 다량체화 도메인 카고
T-eGFP Tat
서열번호 14		 None eGFP
서열번호 23
TL-eGFP 류신 지퍼(Leucine zipper)
서열번호 1
TL2-eGFP 류신 지퍼(Leucine zipper) 2서열번호 2
TN-eGFP NOE 서열번호 3
TG-eGFP GCN4-P1서열번호 4
TD-eGFP Delta서열번호 5
MA104 세포를 12웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, T-eGFP, TL-eGFP, TL2-eGFP, TN-eGFP, TG-eGFP 및 TD-eGFP를 각각 5 μM에서 무혈청 배지에 첨가하였으며; 3시간 동안 배양한 후, 미리 냉각된 20 U/mL 헤파린이 함유된 무혈청 DMEM으로 세포를 3회 세척하여 세포막에 흡착되었으나 세포 내로 들어가지 못한 단백질을 제거하였고, 배지를 무혈청 배지로 교체한 후 형광 이미징을 수행하고 유세포 분석을 위해 세포를 수집하였다. 형광 이미징 결과를 도 6에 나타내었다. T-eGFP 그룹의 세포 내 녹색 형광 강도는 매우 낮은 반면, 다량체화 도메인이 추가된 다른 실험 그룹의 세포 내 형광 강도는 유의하게 증가하였다. 유세포 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 다른 다량체화 도메인은 모두 TAT에 의해 매개되는 eGFP의 평균 형광 강도를 향상시킬 수 있었으며, 즉, TAT 매개 엔도사이토시스의 효율(efficiency of TAT-mediated endocytosis)을 향상시키고, 류신 지퍼(leucine zipper) 기반 TL-eGFP 및 TL2-eGFP가 가장 분명한 효과를 나타냈다.
실시예 2: TINNeL 다량체화 전달 시스템 구축 및 성능 평가
본 실시예에서는 실시예 1의 다량체화 전달 시스템을 기반으로, pH-민감성 펩타이드(INF7)와 세포 내 이입 소포 프로테아제-특이적 절단 부위(endocytic vesicle protease-specific cleavage site)(CTSL 프로테아제: N, 퓨린(Furin) 프로테아제: Ne)를 더 추가하여 TINNeL 전달 시스템을 구축하고 세포 내 이입 효율(endocytic efficiency)과 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency)을 평가하였다.
2.1 TINNeL-카고 분자 복합체에 대한 발현 벡터의 구축
TINNeL-카고 분자 재조합 단백질의 발현 벡터를 구축하였으며, 각 재조합 단백질에 포함된 각 성분의 N-말단에서 C-말단까지의 아미노산 서열은 하기 표와 같다. 구축 방법은 다음과 같다: 먼저, 전달 시스템에서 TAT, INF7, 류신 지퍼(leucine zipper), N, Ne 및 카고 분자(eGFP 또는 GFP β1-10)를 암호화 하는 핵산 서열을 PCR 증폭에 의해 획득하고, 이 부분들은 여러 차례의 PCR을 통해 결찰되었으며, PCR의 마지막 라운드에서, NdeI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 NdeI 제한 부위의 업스트림에 중첩된 부분이 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입되었고, 및 BamHI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림에 중첩된 부분을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입하였다. pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI로 이중 절단하였다. 중첩된 삽입 단편은 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 벡터 pET-21b(+)에 결찰되었다. 플라스미드의 개략도를 도 8에 나타내었다.
전달 시스템-카고 분자 복합체의 구성 성분
N-말단 → C-말단 구성 성분 및 이들의 서열
복합체의 명칭 CPP pH-민감성 펩타이드 프로테아제 인식 서열 다량체화 도메인 카고 분자
TINNe-eGFP TAT
서열번호 14		 INF7
서열번호 12		 N+Ne
 None eGFP
서열번호 23
TINNeL-eGFP 류신지퍼(Leucine zipper) 서열번호 1
TINNe-GFP β1-10 None GFP β1-10-NLS
서열번호 25
TINNeL-GFP β1-10 류신 지퍼(Leucine zipper) 서열번호 1
2.2 TINNeL-카고 복합체의 발현 및 정제
먼저, 2.1에서 얻은 발현 플라스미드를 발현 균주 E.coli BL21(DE3)로 형질전환시키고; 형질전환된 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하고 암피실린(ampicillin) 저항성을 포함하는 5 ml의 LB 액체 배지에 접종하여 밤새 배양하고, 그 다음 밤새 배양된 1 ml의 균액(bacterial liquid)을 암피실린 저항성을 포함하는 500 ml의 LB 액체 배지에 옮기고, 균액의 OD600이 약 0.6이 될 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양한 다음, 인듀서(inducer) IPTG를 최종 농도 0.2 mM에 도달하도록 첨가하여 인덕션(induction)을 25℃에서 8시간 동안 수행하였고, 유도된 발현이 종료된 후, 세포를 4℃, 7000 g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하였고; 그런 다음 세포를 10 ml의 단백질 정제 평형 완충액(protein purification equilibration buffer)(PBS, 5% 글리세롤)으로 재현탁하고 초음파 처리하여 깨뜨렸다. 그 다음, 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 단백질 정제 시스템의 SP 강한 양이온 크로마토그래피 컬럼(SP strong cation chromatography column)에 로딩하였고; 그 다음 단백질 정제 시스템을 사용하여 표적 단백질을 단백질 용출 완충액(protein elution buffer)(불순 단백질을 제거하기 위한 PBS+0.2 M NaCl~PBS+0.7 M NaCl, 용출 생성물을 수집하기 위한 PBS+1.8 M NaCl)으로 표적 단백질을 용리시켰다. 단백질 농도는 분광광도계 또는 BCA 단백질 농도 분석 키트에 따라 결정할 수 있다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분취하여 -20℃에서 보관하였다.
2.3 TINNeL 전달 시스템의 세포 내 전달 효율 평가
엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency) 평가: HEK-293T를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전 웰당 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, 전달 시스템 단백질 TINeL-eGFP 및 대조군 단백질 TINe-eGFP를 각각 5 μM에서 무혈청 배지에 첨가하였으며; 3시간 동안 배양한 후, 미리 냉각된 20 U/mL 헤파린이 함유된 무혈청 DMEM을 사용하여 3회 세척하여 세포막에 흡착되어 있지만 세포에 들어가지 못한 단백질을 제거한 후 세포를 제거하였고, 그 다음 세포는 유세포 분석을 위해 수집되었다. 본 발명자는 이량체화 후의 TINNeL-eGFP의 형광 강도가 4배 더 높다는 것을 발견하였고, 즉, 류신 지퍼 도메인(lucine zipper domain)의 첨가 후에 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)이 유의하게 개선되었음을 발견하였다(도 9).
소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency) 평가: 본 발명자는 탈출 효율의 변화를 관찰함으로써 TINNeL 시스템의 전달 효율을 추가로 평가하기 위해 Split-GFP 시스템을 사용하였다. HEK-293T β11을 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, 전달 시스템 단백질 TINeL-GFP β1-10 및 대조군 단백질 TINe-GFP β1-10을 각각 1 μM로 무혈청 배지에 첨가하였으며; 3시간 동안 인큐베이션한 후, 20 U/mL 헤파린을 함유하는 미리 냉각된 무혈청 DMEM을 사용하여 3회 세척하여 세포막에 흡착되었지만 세포로 들어가지 못한 단백질을 제거하였다. 배지를 혈청 함유 배지(10% FBS)로 변경한 후 추가로 9시간 동안 배양을 계속하였고고, 세포를 유세포 분석을 위해 수집하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었고, 여기에서 TINNeL-GFP β1-10이 더 높은 형광 강도를 가짐으로써 TINNeL 전달 시스템이 엔도사이토시스 효율(endocytosis efficiency)과 소포 탈출 효율을 모두 향상시킬 수 있으며 더 효율적인 전달 방법임을 나타낸다.
2.4 혈청 조건에서 TINNeL 전달 시스템의 전달 효율 평가
HEK-293T 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양한 후, 단백질 처리 전에 각 웰의 세포 수가 약 2*106이 되도록 하였고; 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹구고, 5 μM의 TINeL-GFP β1-10 및 대조군 단백질 TINe-GFP β1-10을 각각 무혈청, 10%, 20%, 50%, 및 100% FBS DMEM 배지 첨가하였으며; 3시간 동안 배양한 후, 미리 냉각된 20 U/mL 헤파린을 함유한 무혈청 DMEM을 사용하여 4회 세척하여 세포막에 흡착되었지만 세포에 들어가지 못한 단백질을 제거하였다. 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교체한 후, 추가로 9시간 동안 배양을 계속하였고, 그런 다음 유세포 분석을 위해 세포를 수집하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 혈청 함량이 증가함에 따라 TINNeL-GFP β1-10 및 TINNe-GFP β1-10 그룹의 형광 강도는 감소했지만, TINNeL-GFP β1-10은 영향을 덜 받았다. 100% FBS 농도 조건에서 TINNe-GFP β1-10 그룹의 녹색 형광 신호는 거의 검출되지 않은 반면, TINNeL-GFP β1-10은 여전히 혈청이 없는 경우에 비해 70% 효율을 보였다. TINNeL은 고효율 전달 능력을 가졌을 뿐만 아니라, 이의 전달 효율은 혈청 존재 하에서도 큰 영향을 받지 않는다. 도 12는 TINNeL 전달 시스템의 원리의 개략도를 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 Split-GFP 시스템을 기반으로 프로테아제 인식 서열 N(TIN-GFP β1-10)을 포함하는 전달 시스템 및 프로테아제 인식 서열 Ne(TINe-GFP β1-10)를 포함하는 전달 시스템의 소포 탈출 효율(vesicle escape efficiency)도 평가하였다. 상술한 전달 시스템은 프로테아제 인식 서열이 N 또는 Ne 단독으로 대체되었다는 점에서만 TINe-GFP β1-10과 다르다. 그 결과를 도 25에 나타내었다. 프로테아제 인식 서열이 없는 TI-GFP β1-10 또는 TIN-GFP β1-10과 비교하여, 프로테아제 인식 서열 N만을 포함하는 전달 시스템(TIN-GFP β1-10)또는 프로테아제 인식 서열 Ne를 포함하는 전달 시스템(TINe-GFP β1-10) 중 하나에서, 세포 내 이입 소포(endocytic vesicle)의 탈출 효율이 크게 향상되었다. 상기 결과는 프로테아제 인식 서열 N 또는 Ne 단독이 소포 탈출 효율을 향상시키는 능력을 가짐을 보여주었다.
실시예 3: TNF-α에 의해 유도된 세포 자멸사(apoptosis) 억제에 TINNeL-Ppm1b의 적용
세포 사멸(cell death)은 세포 자멸사(apoptosis)와 괴사(necrosis)로 나눌 수 있다. 이 중 세포 괴사는 세포막 파열(rupture), 부종(swelling) 및 내용물 누출(leakage of contents)로 이어질 수 있으며, 이는 주로 수용체-상호작용 키나제 3(receptor-interaction kinase 3, RIP3)에 의해 조절되는 심각한 염증 반응을 초래한다. TNF-α의 자극 하에서, Rip1 및 Rip3을 포함하는 괴사가 세포에서 형성되고, 괴사 내의 Rip3이 Mlkl을 모집하고 인산화한다. 인산화된 Mlk1은 세포막으로 이동하여 괴사를 수행하며, 그 동안 Rip3의 인산화는 Mlk1을 괴사에 동원하는 데 필요로 한다. 따라서, Rip3의 인산화는 세포 괴사를 억제하고 이로 인한 염증 반응을 제어하는 중요한 표적일 가능성이 있다. 연구에 따르면 단백질 포스파타제 1B(protein phosphatase 1B, Ppm1b)는 Rip3을 탈인산화하여 배양된 세포와 마우스에서 괴사를 억제할 수 있으며 Ppm1b 단백질은 프로그램된 괴사(programmed necrosis)를 제어하는 중요한 도구가 되었다. 프로그램된 세포 괴사가 염증성 질환, 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 신경퇴행성 질환 및 기타 질병의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀진 점을 감안할 때, Ppm1b 단백질은 상술한 프로그램된 세포 괴사와 관련된 질병의 치료에 큰 잠재력을 보여주었다.
3.1 TINNeL-Ppm1b 복합체 및 기타 대조군 단백질에 대한 발현 벡터의 구축
TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 다량체화 도메인 및 카고 분자 Ppm1b(서열번호 29)를 포함하는 재조합 단백질에 대한 발현 벡터를 구축하였다. 각 재조합 단백질의 구조 모식도를 도 13에 나타내고, N-말단에서 C-말단까지의 각 구성 성분의 아미노산 서열은 하기 표에 나타내었다. 구축 방법은 다음과 같다: TAT, INF7, N, Ne 및 Ppm1b의 핵산 서열은 PCR 증폭에 의해 획득되었고, 이들 부분은 여러 차례의 PCR에 의해 연결되었으며, PCR의 마지막 라운드에서, NdeI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 NdeI 제한 부위의 업스트림에 중첩된 부분이 정방향 프라이머에 의해 단편의 5' 말단에 도입되었고, 및 BamHI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림에 중첩된 부분은 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입되었다. pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI로 이중 절단되었다. 중첩된 삽입 단편은 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 벡터 pET-21b(+)에 결찰되었다.
전달 시스템-카고 분자 복합체의 구성 성분
복합체 명칭 N-말단 → C-말단 구성 성분 및 이들의 서열
CPP pH-민감성 펩타이드 프로테아제 인식 서열 류신 지퍼(Leucine zipper) 카고
Ppm1b None None None None Ppm1b
서열번호 29
T- Ppm1b Tat
서열번호 14
TI- Ppm1b INF7
서열번호 12
TINNe-Ppm1b N+Ne
TINNeL-Ppm1b 서열번호 1
3.2 TINNeL-Ppm1b 단백질 및 기타 대조군 단백질의 발현 및 정제
먼저, 3.1에서 얻은 발현 플라스미드를 발현 균주 E.coli BL21(DE3)로 형질전환시켰고; 형질전환된 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하여 암피실린(ampicillin) 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 5 ml에 접종하여 밤새 배양하고, 밤새 배양한 균액 1 ml를 취하여 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체 배지 500 ml에 옮기고, 37℃ 및 180 rpm에서 균액의 OD600이 약 0.6이 될 때까지 배양한 후, 인듀서(inducer) IPTG를 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가하고 25℃에서 8시간 동안 유도하였으며, 유도 발현이 완료된 후, 세포를 4℃, 7000 g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하고, 세포의 일부를 취해 단백질의 유도된 발현을 검출하고; 그 다음, 세포를 10 ml의 단백질 정제 평형 완충액(protein purification equilibration buffer)(1 L 이차 증류수에 50 ml C3H8O3, 3.6342 g 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane)을 용해시키고 pH 8.0으로 조정)으로 재현탁시키고, 초음파 처리에 의해 깨뜨려주었다. 그 다음, 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 AKTA 단백질 정제 시스템의 설포프로필(SP) 양이온 교환 컬럼(Sulphopropyl (SP) cation exchange column)에 로딩하였으며; 그런 다음 다른 비율의 평형 완충액(equilibration buffer) 및 고염 용리액(high-salt eluent)(1L의 이차 증류수에 50 ml C3H8O3, 116.88 g NaCl, 3.6342 g 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane)을 용해시키고 pH 8.0으로 조정)을 사용하여 구배 용출을 수행하여 표적 단백질을 얻었다. 단백질 농도는 분광광도계 또는 BCA 단백질 농도 분석 키트에 따라 결정할 수 있다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분취하여 -20℃에서 보관하였다.
3.3 TINNeL-Ppm1b가 L292 세포의 TNF-α-유도되는 괴사에 미치는 영향
L929 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전 각 웰의 세포수는 약 2*106이 되도록 하였고, 상기 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 세척한 후, 전달 시스템 단백질 TINNeL-Ppm1b 및 기타 대조군 단백질을 각각 무혈청 배지에 첨가하였다. 3시간의 인큐베이션 후, 1 ml의 20 ng/ml TNF-α 및 10% FBS DMEM으로 희석된 20mM z-VAD를 첨가하였다. 10시간의 인큐베이션 후, 세포를 PI 염색을 위해 수집하였다. 세포 내 세포 괴사의 비율은 유세포 분석으로 관찰하였다. 동시에, Ppm1b(Lenti-Ppm1b)가 형질도입된 렌티바이러스(lentivirus)와 렌티바이러스(Lenti-vec)를 대조군으로 사용하였고, Ppm1b 발현 서열을 가진 렌티바이러스와 대조군 렌티바이러스를 HEK-293T 세포에 패키징하여 수집하였으며, L929 세포를 24시간 동안 감염시켜 세포에서 Ppm1b가 완전히 발현되도록 한 후, 감염된 L929 세포를 추후 TNF-α 자극을 위해 다시 플레이팅하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다. TINNeL-Ppm1b를 처리한 L929에서는 TNF-α에 의한 세포 괴사의 비율이 약 10%로 가장 낮았고, 억제 효과도 양성 대조군인 렌티바이러스 감염군(20%)보다 우수한 것으로 나타났다.
동시에 Ppm1b는 Rip3 인산화 과정을 억제하여 세포 괴사를 억제하므로, 본 발명자는 TINNe-Ppm1b가 세포질에 진입한 후 Rip3의 인산화를 보다 효율적으로 억제함으로써 TNF-α 세포의 괴사를 억제함을 추가로 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 다른 처리 그룹(위와 동일한 처리 방법)의 L929 세포에서 Rip3 및 인산화된 Rip3(p-Rip3)의 함량을 확인하려고 시도하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었고, 여기에서 모든 처리군의 L929 세포에서 Rip3의 함량은 기본적으로 동일한 반면, 인산화된 p-Rip3의 경우 TINNeL-Ppm1b군이 다른 단백질군에 비해 유의하게 낮은 결과를 나타내었으며, 이는 TINNeL-Ppm1b가 L929 세포질에 보다 효율적으로 진입하고 Rip3의 인산화를 억제함으로써 TNF-α에 의한 괴사를 억제할 수 있음을 나타낸다.
3.4 TNF-α에 의한 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome)에 대한 TINNeL-Ppm1b의 억제 활성 평가
마우스에서, TNF-α-유도된 세포 괴사는 마우스에서 전신 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)을 추가로 유발하고 궁극적으로 마우스 사망으로 이어진다. TINNeL 전달 시스템은 높은 전달 효율을 가질 뿐만 아니라, 혈청이 있는 상태에서도 높은 전달 효율을 유지할 수 있어야 한다. 즉, 생체 내에서(in vivo) 여전히 전달 효율을 잘 발휘할 수 있어야 한다. 따라서, 본 발명자는 TNF-α-유도 SIRS 모델을 기반으로 TINNeL-Ppm1b가 여전히 생체 내에서(in vivo) 이상적인 전달 효율을 갖는지를 관찰하려고 시도하였다.
꼬리 정맥 경로를 통해, 25 mmol의 TINNeL-Ppm1b 및 기타 대조군 단백질을 6주령 암컷 BALB/C 마우스(그룹당 12마리)에 주입하고, 그리고 2시간 후에 꼬리 정맥 경로를 통해 15 ㎍의 TNF-α를 마우스에 주입하였으며, 그 후 2시간 간격으로 마우스의 생존을 관찰하였다(도 15). 그 결과 관찰 기간(40시간 이후 생존율은 기본적으로 안정) 동안 대조군의 모든 마우스는 20시간 이내에 TNF-α에 의한 염증으로 사망한 반면, TINNeL-Ppm1b 그룹의 마우스는 관찰 기간이 끝날 때에도 여전히 100% 살아 있었다(도 15). 동시에, TNF-α에 의해 유도된 SIRS는 마우스의 맹장 손상 정도에서 직접 관찰할 수 있었기 때문에, 본 발명자는 6주령 암컷 BALB/C 마우스(그룹당 6마리)에 꼬리 정맥 경로를 통해 25 nmol의 TINNeL-Ppm1b 및 기타 대조군 단백질을 주입하였고, 2시간 후 꼬리 정맥을 통해 쥐에게 15 ㎍의 TNF-α도 투여하고, 10시간 후에 안락사시켰다. 그리고 맹장은 HE 염색을 위해 제거되어 다른 처리 그룹에서 마우스의 맹장 손상을 관찰하고 손상 점수를 부여하였다. 결과는 TINNeL-Ppm1b 그룹의 마우스가 거의 손상되지 않은 맹장을 가지는 것을 보여주었고(도 16), 점수는 모의군(Mock group)(TNF-α를 받지 않은 대조군)의 점수와 비슷했으며, 다른 단백질과 비교하여 TNF-α-유도된 SIRS를 보다 효과적으로 억제할 수 있었다(도 17). 따라서, 상기 결과를 바탕으로 본 발명자는 TINNeL-Ppm1b가 마우스에서 TNF-α로 유도된 SIRS를 효과적으로 억제할 수 있으며, TINNeL이 보다 효과적인 전달체임을 확인하였다.
실시예 4: APAP에 의해 유발된 급성 간 손상의 치료에 TINNeL-Ppm1b의 적용
아세트아미노펜(APAP)은 임상 실습에서 일반적으로 사용되는 해열 및 진통제이지만 과다 복용은 급성 간 손상 및 사망의 위험을 초래할 수 있다. 최근 몇 년 동안, APAP에 의해 유발된 급성 간 손상이 Rip3에 의해 매개되는 프로그램된 세포 괴사(programmed cell necrosis)에 의해 유발된 염증 반응에 의해 유발된다는 연구 결과가 확인되었다. 따라서, Ppm1b에 의한 Rip3의 탈인산화는 APAP-유발 급성 간 손상 치료 효과를 달성할 가능성이 매우 높다.
먼저, 5-7주령 마우스(16-18 g)에 꼬리 정맥 경로를 통해 500 mg/kg(비-치사 용량)의 APAP를 주사하고, 25 nmol의 TINNeL-Ppm1b 및 실시예 3에서 제조된 다른 대조군 단백질의 2회 주사(각 그룹의 7마리 마우스)는 각각 2시간 및 6시간 후에 꼬리 정맥 경로를 통해 주사되었고; APAP 주입 6시간 후(12시간) 안와 출혈(orbital bleeding)로 혈액 샘플을 채취하여, 혈청 내 ALT 및 AST 수치를 검출하고 마우스의 간 손상을 평가하였다. 그 결과 TINNeL-Ppm1b군의 ALT 및 AST 수치가 가장 낮았으며, 이는 기본적으로 APAP 희석 완충액 DMSO군과 동일하였다(ALT/AST의 증가는 DMSO에 의해 유발되었으며 이 부분은 Rip3 경로에 의해 생성되지 않음). 따라서, TINNeL-Ppm1b는 APAP 유발 급성 간 손상의 이상적인 치료 효과를 달성할 수 있다(도 18).
APAP의 용량을 더 증량하면, 더 심각한 간 손상을 일으켜 마우스의 죽음을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명자는 TINNeL-Ppm1b가 APAP의 치사량에서의 마우스의 간 손상을 치료할 수 있는지 여부를 관찰하려고 하였다. 한편, APAP-유발 간 손상 치료제로 FDA에서 현재 승인된 유일한 약물인 NAC를 대조군으로 사용하였다. 먼저, 5~7주령 BALB/C 마우스(16-18 g)에 꼬리 정맥 경로를 통해 APAP 800 mg/kg(치사량)을 주사한 다음, 25 mmol의 TINNeL-Ppm1b, NAC 및 PBS(각 그룹당 7마리 마우스)는 각각 2시간 및 6시간 후에 꼬리 정맥 경로를 통해 주입되었고; 그런 다음, 2시간마다 마우스의 생존을 관찰하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. PBS 그룹의 모든 마우스는 18시간 이내에 사망하였다. 72시간의 관찰 기간(급성기는 24시간 내에 발생) 동안, NAC 그룹의 마우스 생존율은 20%인 반면, TINNeL-Ppm1b 그룹은 60%에 도달할 수 있었다. 따라서, APAP로 인한 더 심각한 급성 간 손상에도 TINNeL-Ppm1b는 현재 임상 약물인 NAC보다 우수한 치료 효과를 보였다. 상기 결과는 생체 내(in vivo) 전달에서 TINNeL의 이점을 완전히 입증하였다.
실시예 5: TINNeL-ZFP9의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 핵산 전달 효율 평가
5.1 TINNeL-ZFP9 및 기타 대조군 단백질에 대한 발현 벡터의 구축
TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 다량체화 도메인 및 카고 분자 ZFP9(서열번호 31)를 포함하는 재조합 단백질의 발현 벡터를 구축하였으며, 각각의 재조합 단백질의 구조는 도 20에 나타내었고, N-말단에서 C-말단까지 각 구성 성분의 아미노산 서열은 하기 표와 같다. 구축 방법은 다음과 같다: TAT, INF7, 프로테아제 절단 부위, 류신 지퍼(leucine zipper) 및 ZFP9를 암호화 하는 핵산 서열은 PCR 증폭에 의해 획득되었고, 이들 부분은 여러 차례의 PCR에 의해 결찰되었으며, PCR 과정의 마지막 라운드에서, NdeI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 NdeI 제한 부위의 업스트림에 중첩된 부분을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입하였고, 및 BamHI 제한 부위와 pET-21b(+) 상의 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림에 대한 중첩된 부분은 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입되었다. pET-21b(+) 플라스미드를 NdeI 및 BamHI로 이중 절단하였다. 중첩된 삽입 단편은 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 벡터 pET-21b(+)에 결찰되었다.
전달 시스템-카고 분자 복합체의 구성 성분
복합체의 명칭 N-말단 → C-말단 구성 성분 및 이들의 서열
류신 지퍼(Leucine zipper) CPP pH-민감성 펩타이드 프로테아제 인식 서열 카고
T-ZFP9 None Tat
서열번호 14		 None None ZFP9-NLS
서열번호 31
TI-ZFP9 INF7
서열번호 12
TINNe-ZFP9 N+Ne
TINNeL-ZFP9 서열번호 2
5.2 TINNeL-ZFP9 및 대조군 단백질의 발현 및 정제
먼저, 5.1에서 얻은 발현 플라스미드를 발현 균주 E.coli BL21(DE3)로 형질전환시켰고; 형질전환된 플레이트에서 단일 콜로니를 채취하여 암피실린(ampicillin) 저항성을 포함하는 LB 액체배지 5 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 밤새 배양한 균액(bacterial liquid) 1 ml를 취하여 암피실린 저항성을 포함하는 LB 액체배지 500 ml에 옮기고, 균액의 OD600이 약 0.6이 될 때까지 37℃ 및 180 rpm에서 배양한 후, 인듀서 IPTG를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하여 유도는 25℃에서 8시간 동안 수행되었으며; 유도 발현이 완료된 후, 세포를 4℃, 7000 g에서 10분 동안 원심분리하여 수집하고, 단백질의 유도된 발현을 검출하기 위해 세포의 일부를 취하였으며; 그런 다음, 세포를 10 ml의 단백질 정제 평형 완충액(protein purification equilibration buffer)(1 L 이차 증류수에 50 ml C3H8O3, 3.6342 g 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane)을 용해시키고 pH 8.0으로 조정)으로 재현탁시키고, 초음파 처리에 의해 깨뜨려주었다. 그런 다음, 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 AKTA 단백질 정제 시스템의 설포프로필(SP) 양이온 교환 컬럼(Sulphopropyl (SP) cation exchange column)에 로딩하고; 그런 다음 다른 비율의 평형 완충액(equilibration buffer) 및 고염 용리액(high-salt eluent)(50 ml C3H8O3, 116.88 g NaCl, 3.6342 g 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane)을 1 L의 이차 증류수에 용해시키고 pH 8.0으로 조정)을 사용하여 구배 용출을 수행하여 표적 단백질을 얻었다. 상기 단백질 농도는 분광광도계 또는 BCA 단백질 농도 분석 키트에 따라 결정할 수 있다. 각각의 정제된 융합 단백질을 분취하여 -20℃에서 보관하였다.
5.3 ZFP9 결합 부위를 포함하는 진핵생물 발현 플라스미드의 구축
tdTomato 암호화 서열 및 ZFP9 결합 부위를 포함하는 발현 벡터(pTT5-tdTomato-6BS 플라스미드)를 구축하고, 그 도식적 구조를 도 21에 나타내었다. tdTomato 암호화 서열(서열번호 33) 및 ZFP9 결합 부위의 서열(6* 결합 부위)(서열번호 34)은 PCR을 통한 증폭에 의해 획득되었고, 둘은 2회의 PCR에 의해 결찰되었으며, 2차례의 PCR 동안, Hind III 제한 부위와 pTT5 벡터 상의 상응하는 Hind III 제한 부위의 업스트림에 있는 중첩된 부분을 정방향 프라이머를 통해 단편의 5' 말단에 도입되었고, 및 BamHI 제한 부위와 pTT5 벡터 상의 상응하는 BamHI 제한 부위의 다운스트림에 있는 중첩된 부분을 역방향 프라이머를 통해 단편의 3' 말단에 도입하였다. pTT5 플라스미드는 Hind III 및 BamHI로 이중 절단되었다. 중첩된 삽입 단편을 GIBSON 어셈블리에 의해 절단된 pTT5 벡터에 결찰시켰다.
5.4 플라스미드 DNA 전달에 있어서 TINNeL-ZFP9의 전달 효율 평가
먼저, HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 5*106인 것이 확인되었고; 5 μM의 전달 시스템 단백질 또는 다른 대조군 단백질과 5 g pTT5-tdTomato-6BS 플라스미드를 37℃에서 30분 동안 공동 인큐베이션하여 복합체를 완전히 형성하였고; 상기 세포를 무혈청 DMEM 배지로 3회 헹군 다음, 복합체를 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션하였으며; 배지를 10% FBS DMEM으로 교체하고 배양을 계속하였고, 배지를 각각 12시간, 24시간, 36시간 교체한 후 유세포 분석을 통해 적색 형광 단백질 발현을 관찰하였다. 그 결과를 도 22에 나타내었다. 다른 대조군 단백질과 비교하여, TINeL-ZFP9 그룹의 적색 형광 비율은 3개의 검출 시점에서 가장 높았다. 따라서, TINNeL-ZFP9는 그것에 부착된 pTT5-tdTomato-6BS를 핵으로 전달하는 데 더 효과적이어서 플라스미드에서 적색 형광 유전자의 발현을 달성하였다.
5.5 혈청 조건하에서 TINNeL-ZFP9의 전달 효율 평가
본 실시예에서, 혈청 조건에서 TINNeL-ZFP9의 형질감염 효과를 조사하였으며, 혈청 조건에서 작용할 수 있는 상용 형질감염 시약 X-tremeGENE을 대조군으로 사용하였다.
먼저, HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 단백질 처리 전, 각 웰의 세포 수는 약 5*106인 것이 확인되었고; 5 μM의 TINNeL-ZFP9 및 5 ㎍ pTT5-tdTomato-6BS 플라스미드를 37℃에서 30분 동안 공동 인큐베이션하여 복합체를 완전히 형성하였고; 상기 복합체를 100% FBS 혈청 조건 및 무혈청 조건에서 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션하였으며; 배지를 10% FBS DMEM으로 교체하고 배양을 계속하였고; 대조군 X-tremeGENE 그룹에서는 5 ㎍의 pTT5-tdTomato-6BS 플라스미드와 X-tremeGENE을 1 ㎍ DNA:3 ㎕ X-tremeGENE의 비율로 혼합하였으며, 그런 다음, 실온에서 30분 동안 방치하고 100% FBS 혈청 조건 및 무혈청 조건에서 8시간 동안 인큐베이션을 수행하였고, 그 다음 배지를 10% FBS DMEM으로 교체하고 배양을 계속하였다. 상기 처리군의 경우, 각각 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 및 84시간 동안 배지를 교체한 후 유세포 분석을 통해 적색 형광 단백질의 발현을 관찰하였다. 그 결과를 도 23에 나타내었다. 무혈청 조건에서, TINNeL-ZFP9 그룹에서 적색 형광 세포의 비율이 더 빠르게 증가했으나, 안정기에 도달한 후, 비율은 기본적으로 X-tremeGENE 그룹과 동일하였다. 그러나, 100% FBS 조건에서는, 각 시점에서 거의 10%에 가까운 적색 형광 세포의 비율 차이가 있었고, 이는 TINNeL-ZFP9가 혈청 조건 하에 보다 효율적인 형질감염 능력을 나타냄을 의미한다.
5.5 마우스에서 TINNeL-ZFP9의 전달 효율 평가
루시페라제 암호화 유전자(서열번호 35) 및 ZFP9 결합 부위(서열번호 34)를 갖는 pTT5-Luc-6BS 발현 플라스미드를 구축하였으며, 구축 방법은 상기 5.3과 동일하였다. 4 nmol의 TINNeL-ZFP9 또는 다른 대조군 단백질인 TINNe-ZFP9, T-ZFP9를 5 ㎍ pTT5-Luc-6BS 발현 플라스미드와 30분 동안 혼합한 후, 누드 마우스의 왼쪽 다리 근육에 주사하고, 형광 강도를 이미지화하고 24시간 후에 분석하였다. 그 결과를 도 24에 나타내었다. T-ZFP9 및 무처리 그룹은 형광이 거의 검출되지 않은 반면, TINNe-ZFP9는 약한 형광을 갖는 반면, TINNeL-ZFP9 그룹은 강한 형광이 검출되었다. 따라서, TINNeL-ZFP9가 DNA에 효율적으로 결합하여 전달할 수 있음을 마우스에서 확인하였다.
이상, 본 발명의 구체적인 구현예를 상세히 설명하였지만, 당업자는 출판된 모든 교시에 비추어 세부사항에 대해 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이며, 그리고 이러한 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 있음을 알 수 있다. 본 발명의 완전한 구분은 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 의해 주어진다.

Claims (31)

  1. 다량체화(multimerization) 도메인 서열, 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성(fusogenic) 펩타이드, 및 프로테아제(protease) 인식 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide).
  2. 제1항에 있어서, 상기 다량체화 도메인은 이량체화(dimerization) 도메인, 삼량체화(trimerization) 도메인, 사량체화(tetramerization) 도메인, 또는 임의의 고차 다량체화(higher-order multimerization) 도메인 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 다량체화 도메인은 류신 지퍼(leucine zipper), NOE, GCN4-P1, Delta 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 다량체화 도메인은 류신 지퍼로부터 선택되며;
    바람직하게, 상기 다량체화 도메인은 서열번호 1 또는 2에 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포-투과성 펩타이드는 페네트라틴(Penetratin), Tat-유래 펩타이드(예: Tat(48-60) 또는 Tat(47-57)), Rev(34-50), VP22, 트랜스포탄(transportan), Pep-1, Pep-7 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 세포-투과성 펩타이드는 Tat(48-60)와 같은 Tat-유래 펩티드를 포함하고;
    바람직하게, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열 번호 14에 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pH-민감성 융합생성 펩타이드는 인플루엔자 바이러스 HA2(influenza virus HA2) 또는 그의 돌연변이체(예: INF7, KALA 또는 GALA), 멜리틴(melittin), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 pH-민감성 융합생성 펩타이드는 INF7을 포함하고;
    바람직하게, 상기 pH-민감성 융합생성 펩타이드는 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 퓨린(furin) 및/또는 리소좀 시스테인 프로테아제(lysosomal cysteine protease)로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열, 리소좀 시스테인 프로테아제 인식 서열, 및 이들의 조합으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 퓨린 인식 서열은 R-X1-X2-R (서열번호 47)을 포함하고, 상기 X1은 임의의 아미노산이며, 상기 X2는 K 또는 R인 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 퓨린 인식 서열은 R-R-X1-X2-R (서열번호 48)을 포함하고;
    바람직하게, 상기 퓨린 인식 서열은 서열번호 49에 나타낸 서열을 포함하며;
    바람직하게, 상기 퓨린 인식 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제(lysosomal cysteine protease)는 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 C, 카텝신 X, 카텝신 S, 카텝신 L, 카텝신 D 또는 카텝신 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 리소좀 시스테인 프로테아제는 카텝신 L이고;
    바람직하게, 상기 카텝신 L은 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열은 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 49 및 서열번호 10을 포함하고;
    바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 서열번호 8 및 서열번호 10을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성 펩타이드, 및 N-말단에서 C-말단으로의 프로테아제 인식 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드, 또는 pH-민감성 융합생성 펩타이드, 세포-투과성 펩타이드, 및 N-말단에서 C-말단으로의 프로테아제 인식 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드로서; 다량체화 도메인 서열은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치하고;
    바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 인식 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 임의의 2개의 인접한 도메인은 펩타이드 링커에 의해 선택적으로 연결되는 것인, 융합 폴리펩타이드로서;
    바람직하게, 상기 펩타이드 링커는 (GmS)n이고, 여기에서 m은 1 내지 4의 정수로부터 선택되고 n은 1 내지 3의 정수로부터 선택되는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 16 내지 18 중 어느 하나로 나타낸 서열을 포함하는 것인, 융합 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드의 다량체(multimer)로서;
    바람직하게, 상기 다량체는 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 또는 사량체(tetramer)이고;
    바람직하게, 상기 다량체는 동종다량체(homomultimer)인 것인, 다량체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드 및 추가 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질로서;
    바람직하게, 상기 추가 폴리펩타이드는 검출가능한 표지를 포함하고;
    바람직하게, 상기 추가 폴리펩타이드는 에피토프 태그(epitope tag), 리포터 유전자에 의해 암호화되는 단백질 서열 및/또는 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, NLS) 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 추가 폴리펩타이드는 핵산 결합 도메인 서열인 것인, 융합 단백질로서;
    바람직하게, 상기 핵산 결합 도메인 서열은 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)(예: ZFP9)이고;
    바람직하게, 상기 핵산 결합 도메인 서열은 서열번호 31에 나타낸 서열을 포함하며;
    바람직하게, 상기 융합 단백질은 서열번호 19 내지 21 중 어느 하나로 나타내는 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    (i) 세포-투과성 펩타이드, pH-민감성 융합생성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 N-말단에서 C-말단으로의 추가 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서; 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치하고; 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질; 또는
    (ii) pH-민감성 융합생성 펩타이드, 세포-투과성 펩타이드, 프로테아제 인식 서열 및 N-말단에서 C-말단으로의 추가 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서; 다량체화 도메인 서열은 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단, 또는 상기 기재된 2개의 인접한 도메인 사이에 위치하고; 바람직하게, 상기 프로테아제 인식 서열은 N-말단에서 C-말단까지 퓨린 인식 서열 및 카텝신 L 서열을 포함하거나, N-말단에서 C-말단까지 카텝신 L 서열 및 퓨린 인식 서열을 포함하는 것인, 융합 단백질; 또는
    (iii) 상기 추가 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된 것인, 융합 단백질.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 다량체(multimer)로서;
    바람직하게, 상기 다량체는 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 또는 사량체(tetramer)이고;
    바람직하게, 상기 다량체는 동종다량체(homomultimer)인 것인, 다량체.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 것인, 벡터.
  19. 제17항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제18항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 제조 방법으로서, 적합한 조건 하에 제19항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 다량체(multimer)로 존재하는 것인, 제조 방법.
  21. 제12항에 따른 다량체(multimer) 또는 제16항에 따른 다량체, 및 카고 분자를 포함하는, 복합체(complex)로서;
    바람직하게, 상기 카고 분자는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 화학적 화합물 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 카고 분자는 다량체에 융합되고, 화학적으로 결합되거나 비-공유적으로 연결되는 것인, 복합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 카고 분자는 펩타이드 또는 단백질인, 복합체로서;
    바람직하게, 상기 카고 분자는 다량체에 융합되는 것인, 복합체.
  23. 제21항에 있어서, 상기 카고 분자는 핵산인, 복합체로서;
    바람직하게, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 다량체는 제14항에 따른 융합 단백질의 다량체인 것인, 복합체.
  24. 제21항에 있어서, 상기 다량체(multimer)는 카고 분자에 화학적으로 결합된 것인, 복합체로서;
    바람직하게, 상기 화학적 결합은 이황화 결합(disulfide bond), 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond), 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond), 아미드 결합(amide bond), 아민 결합(amine bond), 티오에테르 결합(thioether bond), 에테르 결합(ether bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 탄소-탄소 결합(carbon-carbon bond)를 통해 달성되는 것인, 복합체.
  25. 제21항에 있어서, 상기 다량체는 카고 분자에 비-공유적으로 연결된 것인, 복합체로서;
    바람직하게, 상기 다량체는 카고분자에 정전기적으로 접합되는 것인, 복합체.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물로서;
    바람직하게, 상기 카고 분자는 약제학적 활성제 또는 검출가능한 표지인 것인, 약제학적 조성물.
  27. 질병 치료용 약제의 제조에 있어서, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 제26항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서;
    바람직하게, 상기 질병은 프로그램된 괴사(programmed necrosis)와 관련된 질병이고, 상기 카고 분자는 단백질 포스파타제 1B(phosphatase 1B)를 포함하며; 상기 프로그램된 괴사와 관련된 질병은 간 손상(예를 들어, 약물-유발 간 손상), 염증성 질병, 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 및/또는 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease)를 포함하는 것인, 복합체 또는 약제학적 조성물의 용도.
  28. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병 치료 방법으로서; 상기 복합체에 포함된 카고 분자는 질병을 치료할 수 있고;
    바람직하게, 상기 질병은 프로그램된 괴사(programmed necrosis)와 관련된 질병이며, 상기 카고 분자는 단백질 포스파타제 1B(phosphatase 1B)를 포함하고; 바람직하게, 상기 프로그램된 괴사와 관련된 질병은 간 손상(예를 들어, 약물-유발 간 손상), 염증성 질병, 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 및/또는 신경퇴행성 질병(neurodegenerative disease)를 포함하는 것인, 질병 치료 방법.
  29. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드, 제12항에 따른 다량체, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제16항에 따른 다량체, 제17항에 따른 단리된 핵산 분자, 제18항에 따른 벡터, 제19항에 따른 숙주 세포, 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는, 키트로서;
    바람직하게, 상기 키트는 형질감염(transfection) 및/또는 세포 내 전달(intracellular delivery)에 대한 지침을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  30. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩타이드, 제12항에 따른 다량체, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 제16항에 따른 다량체, 제17항에 따른 단리된 핵산 분자, 제18항에 따른 벡터, 제19항에 따른 숙주 세포, 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체의 전달 시약으로서의 용도.
  31. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 복합체와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 카고 분자를 세포 내로 전달하는 방법으로서, 상기 카고 분자는 복합체에 함유된 카고 분자이고;
    바람직하게, 상기 복합체와 세포를 접촉시키는 단계는 시험관 내(in vitro)에서 수행되며;
    바람직하게, 상기 카고 분자는 핵산, 펩타이드 또는 단백질, 탄수화물, 지질, 화학적 화합물 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 핵산은 DNA 분자, RNA 분자, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임(ribozyme), 앱타머(aptamer) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 카고 분자를 세포 내로 전달하는 방법.
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