KR20220122467A - 사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220122467A
KR20220122467A KR1020210156064A KR20210156064A KR20220122467A KR 20220122467 A KR20220122467 A KR 20220122467A KR 1020210156064 A KR1020210156064 A KR 1020210156064A KR 20210156064 A KR20210156064 A KR 20210156064A KR 20220122467 A KR20220122467 A KR 20220122467A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
sars
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020210156064A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102748987B1 (ko
Inventor
조영식
김정호
이세정
배수민
Original Assignee
주식회사 바이오노트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오노트 filed Critical 주식회사 바이오노트
Publication of KR20220122467A publication Critical patent/KR20220122467A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102748987B1 publication Critical patent/KR102748987B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/102—Coronaviridae (F)
    • C07K16/104—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

사스-코로나바이러스-2(SARS-CORONAVIRUS-2)의 스파이크 단백질(Spike protein)에 특이적으로 결합하여 중화활성을 나타내는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합단편은 사스-코로나바이러스-2에 우수한 바이러스 중화능을 나타낼 뿐 아니라, RBD 에 변이가 나타난 변이주 바이러스에 대하여도 높은 바이러스 중화능을 나타낼 수 있으므로 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 상기 항체 또는 항원 결합단편은 타겟에 대한 우수한 결합력이 나타날 수 있으므로 사스-코로나바이러스-2를 효과적으로 검출하여 진단키트 및 진단 방법에 유용하게 활용가능하다.

Description

사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 {Antibody against SARS-coronavirus-2 and the uses thereof}
사스-코로나바이러스-2(SARS-coronavirus-2)의 스파이크 단백질(Spike protein)에 특이적으로 결합하여 중화활성을 나타내는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다.
사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)은 사스-코로나바이러스-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: SARS-CoV-2)에 의해 일어나는 감염성 호흡기 질환으로 발열, 마른 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증을 나타낸다. 특히 기저질환 환자의 경우 높은 사망률을 보이는 질환으로 2019년 12월 중국에서 시작한 코로나19 감염증으로 인해 2020년 3월 11일 WHO에서는 팬데믹 선언을 하였다.
SARS-CoV-2는 양성 단일가닥 바이러스로 약 3만 개의 염기서열로 이뤄져 있고, 사람과 동물에게 감염되는 베타코로나바이러스 속으로 전자 현미경으로 관찰 시 구형을 띄며 외부 스파이크 단백질이 크라운 형태로 둘러싸여 있다. SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질은 숙주세포의 수용체와 특이적인 결합을 하는 것으로 알려져 있다.
SARS-CoV-2가 숙주세포와 결합하는 부분은 SARS-CoV와 같은 ACE2 (Angiotensin-converting enzyme 2)로 알려져 있으며, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 SARS-CoV의 스파이크 단백질보다 인간세포의 ACE2에 10-20배 더 잘 결합하는 것과 스파이크 단백질의 S1 부분의 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain : RBD)과 숙주세포의 ACE2와 결합해 숙주 세포의 세포질 내로 침입할 수 있음이 알려져 있다.
사스-코로나바이러스 감염증의 급속한 확산에 따라 치료제 및 백신의 중요성이 대두되고 있고 현재 여러 백신들이 FDA 승인되어 일부 사용 가능 및 접종 권장을 하고 있다. 하지만 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질에 돌연변이가 생기면서 백신 또는 특정 단일 클론 항체 치료로는 변이에 대한 효과가 떨어지는 결과를 보여 새로운 변이체 발생에 따른 방어능 하락에 대한 우려가 큰 상황이다. 특히 사스-코로나바이러스 감염증 감염 후 회복된 환자의 혈액 생산물로 감염된 환자의 치료에 이용도 하고 있으나 인간 혈장에서 정제되어 제조된 생산물은 잠정적 감염원에 대하여 안전하지 않고, 대량 생산에 비효율적이다.
따라서 효과적인 사스-코로나바이러스 감염증 치료를 위하여는 혈액에서 유래하지 않아 잠재적 감염에 대한 우려성이 없으면서도 배양을 통한 생산으로 대규모 생산 공급이 가능한 균일한 품질을 가진 항체 치료제의 개발이 시급한 실정이다. 특히 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 돌연변이가 생긴 변이주 바이러스에 대하여도 중화능을 가지는 항체 치료제의 필요성과 함께 상기 항체를 이용하여 코로나 감염증 특이적인 SARS-CoV-2 항체를 이용한 신속 정확한 진단의 필요성이 대두되고 있다.
일 양상은 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 생산용 재조합 발현 벡터 및 상기 제조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
일 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
일 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 사스-코로나바이러스-2를 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 일 양상의 사스-코로나바이러스-2 의 RBD 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 조합 a), b) 및 c) 중 하나의 중쇄 상보성 결정영역(Heavy chain complementarity determining region: HCDR) 및 경쇄 상보성 결정영역(Light chain complementarity determining region, LCDR)을 포함한다: a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 11 의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 12 의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL);
b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL); 및
c) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL).
상기 일 양상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 조합 중 선택된 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 이루어진 아미노산;
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 22로 이루어진 아미노산; 및
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23으로 이루어진 아미노산을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 24로 이루어진 아미노산.
일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein, NCBI accession No.: YP_009724390.1)의 S1영역의 수용체 결합 영역(Receptor binding domain : RBD)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 서열번호 25로 이루어진 폴리펩타이드의 N말단으로부터 319 내지 541번째 아미노산으로 이루어진 부위를 에피토프로 인식하는 것을 특징으로 한다.
일 양상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　에 대한 바이러스 중화능을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 일 양상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 에 변이가 나타나지 않은 우한발 사스-코로나바이러스-2 (Standard Wuhan-Hu-1)에 바이러스 중화능이 나타낼 수 있으며, 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 하나 이상의 변이가 나타난 변이주 바이러스에 대하여도 바이러스 중화능이 나타낼 수 있다. 예를 들면 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열의 501번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine, N) 에서 티로신(Tyrosine, Y)으로 치환된 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 변이 단백질을 가진 사스-코로나바이러스-2 영국 변이주 (VUI 202012/01) 바이러스에 중화능을 나타낼 수 있고, 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열의 417번째 아미노산이 라이신(Lysine, K)에서 아스파라긴(Asparagine, N)로 치환된 것; 484번째 아미노산이 글루타메이트(Glutamate, E)에서 라이신(Lysine, K)로 치환된 것; 및 501번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine, N) 에서 티로신(Tyrosine, Y)으로 치환된 것으로 이루어진 군으로부터 1종 이상의 변이를 포함하는 사스-코로나바이러스-2　스파이크 변이 단백질을 가진 사스-코로나바이러스-2 남아프리카공화국(이하 '남아공'으로 지칭) 변이주 501.V2 바이러스에 중화능을 나타낼 수 있다. 상기 바이러스 중화능은 바이러스 중화항체에 의해 바이러스의 감염력이 특이적으로 억제 또는 소실되는 것을 의미할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원분자 내의 특정한 입체분자구조를 의미한다.
용어 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 범위에는 전체 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.
전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 마우스 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-결합 Fvs(sdFV), scFv 단편, scFv-Fc 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디, 및 테트라바디로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region: CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낼 수 있다.
상기 일 양상에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD인 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 특이적 결합 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 90%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일 양상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하이브리도마 세포로부터 생산되는 것일 수 있다. 상기　하이브리도마　세포란 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와　비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데　항체　생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일 클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 이외 본 발명서 내의 하이브리도마 세포는 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포 등도 포함할 수 있으며, 본 명세서 내의 하이브리도마 세포는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 IgG 단일 클론　항체를 생산할 수 있는　하이브리도마　세포 또는 이의 세포주라면 제한없이 포함할 수 있다.
일 양상은 하기 조합 중 선택된 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor binding domain) 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다:
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 이루어진 아미노산; 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 22로 이루어진 아미노산; 및 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23으로 이루어진 아미노산을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 24로 이루어진 아미노산.
용어 '재조합(recombinant)'은 '유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝 (molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다. 상기 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.
상기 '재조합 발현벡터'란 적합한 숙주세포 (host cell) 에서 목적하는 단백질 또는 핵산 (RNA) 을 발현할 수 있는 벡터로서, DNA (유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작동가능하게 연결된 (operably linked)'이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage) 되어 있는 것으로, 발현 조절 서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열 (expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
일 양상의 재조합 발현벡터는 클로닝과 항체 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-21b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다. 파지 표시 등에 통상적으로 사용되는 pComb3 계열의 벡터를 사용할 수도 있고, 항체를 포유류 세포에서 발현하기 위하여 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위하여 통상적으로 사용되는 벡터, 예를 들어 pcDNA 나 pVITRO 등의 벡터를 사용할 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 또는 추가로 발현시킨다.
상기 "핵산"은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 핵산은 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
일 양상은 상기 재조합 발현 벡터로 시험관(in vitro) 내 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
용어, "형질전환"은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 본 발명의 목적상 형질전환은 상기 서열번호 19, 21, 또는 23로 표시되는 중쇄 가변 영역 아미노산 및 서열번호 20, 22, 또는 24로 표시되는 경쇄 가변 영역 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산이 숙주세포 내로 삽입되어 본 발명의 항체를 생산하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 박테리아, 효모, HEK 세포, CHO 세포, F2N 세포, HEK293 세포, HEK93T세포, COS 세포 및 항체 생산 하이브리도마세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
상기 하이브리도마 세포주는 골수종 세포(myeloma cell)와　비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데　항체　생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포를 포함할 수 있으며, 이를 통해 생성된 단일 클론항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor binding domain) 에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 하이브리도마 세포주는 면역화된 마우스의 비장을 적출하여 세포를 분리하고, 비장세포와 골수종세포를 확보하여 제조된 하이브리도마 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명서 내의 하이브리도마 세포는 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포룰 융합시킨 하이브리도마 세포 등도 포함할 수 있으며, 본 명세서 내의 하이브리도마 세포는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 IgG 단일 클론　항체를 생산할 수 있는　하이브리도마　세포 또는 이의 세포주라면 제한없이 포함할 수 있다.
일 양상은 상기 발현 벡터를 이용하여 시험관(in vitro) 내에서 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산방법을 제공한다.
상기 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 DNA 가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터로 형질전환하는 단계를 포함할 수 있다. 선택된 숙주세포와 재조합 발현벡터의 종류에 따라 앞서 서술한 바와 같으며, 이를 적절한 형질 전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 상기 기재된 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 동일한 숙주세포에 공동 형질 전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.
또한 상기 방법은 추가적으로 상기 형질 전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 일 양상에 따른 항체의 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체의 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있으며, 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화 되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩 시키고 기능성 구조를 갖도록 할 수 있다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
또한 상기 방법은 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩티드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심 분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있고, 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 통해 정제할 수 있다. 추가의 정제 기술, 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호 교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 제한되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
상기 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)은 사스-코로나바이러스-1 또는 사스-코로나바이러스-2 에 의해 일어나는 감염성 호흡기 질환을 포함하는 것일 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 예를 들어 0.1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 예를 들면, 0.1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 0.1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 1 μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 1 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 1 μg/mL 내지 50 μg/mL, 1 μg/mL 내지 25 μg/mL, 5μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 5 μg/mL 내지 100 μg/mL, 5 μg/mL 내지 50 μg/mL, 5 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10μg/mL 내지 1,000 μg/mL, 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 10 μg/mL 내지 100 μg/mL, 10 μg/mL 내지 50 μg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 25 μg/mL, 10 μg/mL 내지 350μg/mL, 12.5 μg/mL 내지 300μg/mL, 25 μg/mL 내지 270μg/mL, 50 μg/mL 내지 150μg/mL, 또는 100 μg/mL 내지 200μg/mL로 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분인 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제, 등장화제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물은 정맥내(intravenous), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 척수강내(intrathecal), 뇌실질내(intracerebroventricular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내로 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약학적 조성물은 주사제, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 제형, 경구형 제형, 외용제, 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택된 제형일 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 에 특이적으로 결합함으로서 시료 내 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질을 검출하거나 발현 수준을 측정할 수 있다. 따라서, 상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질을 검출하거나 발현 수준을 측정하여, 질병에 걸리지 않은 개체의 검출 및 발현 수준과 비교하여 상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질을 검출하거나 발현 수준이 높은 경우 개체를 사스-코로나바이러스 감염증을 가진 개체로 진단할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상,　진단이란 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 발병 여부를 판별하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "발현 수준의 측정"은 특정 단백질(펩타이드)의 존재 여부, 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것으로서, 구체적으로 상기 조성물은 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (ELISA), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 방법 (protein chip technology) 또는 바이오센서 (biosensor)일 수 있으며, 구체적으로 상기 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
상기 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 진단용 조성물은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD 에 특이적으로 결합하여 형성된 항원(사스-코로나바이러스-2　스파이크 단백질의 RBD)-항체 복합체를 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography) 또는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 확인하는 것일 수 있으며, 구체적으로 면역크로마토그래피법을 이용하여 확인하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "면역크로마토그래피법 (immunochromatography)"은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 분석물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서,　래피드 테스트(rapid test)법으로도 알려져있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 분석물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석스트립(assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다.　통상적인 분석스트립은 액상 검체를 수용하는 검체(샘플) 패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드, 검체 중의 분석물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 다공성 멤브레인 패드 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다.　이와 같이, 분석스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 검체 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 다공성 멤브레인 패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 이때, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 분석물질을 매개하여 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 결합하거나(통상, "샌드위치(sandwich) 반응"이라 한다.), 접합체와 분석물질이 경쟁적으로 결합제와 결합함으로서(통상, "경쟁(competition) 반응"이라 한다.), 검체 중 분석물질의 존재 여부를 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역크로마토그래피(immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 수행하여 감지하는 것을 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라 당업계에 알려진 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.
또한, 상기 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)으로 검출할 수 있다.
상기 검출 표지는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 효소 표지(enzymatic label), 자성 물질 또는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 검출 표지로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트, 크립테이트, FITC, RITC 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 및 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다. 상기 검출 표지는 발색되는 정도를 육안 또는 센서를 이용하여 정량 또는 정성적으로 분석물질의 존재 여부를 확인할 수 있다. 실시예를 따르면, 검출 표지 중 형광물을 항원, 항체 등의 리간드에 접합시켜 접합체를 만들어 접합체가 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 분석물질을 매개로 결합하거나 경쟁적으로 결합한 복합체에 빛을 조사하면 발색되는 정도에 따라 센서를 이용하여 분석물질의 존재 여부를 확인하여, 사스-코로나바이러스 감염증에 걸리지 않은 정상인의 수치 보다 높은 경우 사스-코로나바이러스 감염증에 걸린 개체로 판단할 수 있다.
상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 진단용 키트는 면역크로마토그래피 키트일 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 포획 항체는 다공성 멤브레인 패드에 고정되고, 검출 항체는 접합체 패드에 고정된 분석스트립을 포함하는 것일 수 있다.
상기 키트는 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD의 면역학적 검출을 위하여, 상기한 기질, 및 검출 표지와 결합된 항체뿐만 아니라, 적당량의 완충용액, 발색 기질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라, 당업계 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 키트는 생물학적 시료 내 포함된 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD와 반응/결합하여 검출 표지가 발광 또는 발색될 수 있으며, 상기 검출 표지의 발광 또는 발색 정도는 추가적인 판독 기기에 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어 상기 판독 기기는 상기 검출 표지의 발광 또는 발색 정도를 통해서 생물학적 시료 내 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD를 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스-2에 대한 중화 항체 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 설명은 전술한 바와 같이, 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 본 중화항체 검출용 조성물에도 공히 적용된다.
상기 중화 항체는 사스-코로나바이러스-2의 감염력이 특이적으로 억제 또는 소실시킬 수 있도록 하는 능력을 가진 항체를 말한다.
일 실시예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개체가 가진 사스-코로나바이러스-2 중화 항체와 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 대하여 경쟁 접촉하므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체의 농도가 높게 검출되는 경우, 개체가 가진 사스-코로나바이러스-2 중화 항체의 항체가가 낮은 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 복합체의 농도가 낮게 검출되는 경우, 개체가 가진 사스-코로나바이러스-2 중화 항체의 항체가가 높은 것으로 판단할 수 있다.
상기 중화 항체 검출용 조성물 또는 키트는 개체의 중화항체를 생성하는 능력 수준을 진단하는 용도로 활용할 수 있다. 따라서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체의 농도가 높게 검출되는 경우, 개체의 중화항체 생성능이 낮은 것으로 진단할 수 있고, 반대로 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체의 농도가 낮게 검출되는 경우, 개체가 가진 사스-코로나바이러스-2 중화 항체의 중화 항체 생성능이 높은 것으로 진단할 수 있다.
예를 들어, 상기 개체로부터 분리된 시료에 사스-코로나바이러스-2 중화 항체가 부재하거나 거의 없는 경우에는, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 시료에 존재하는 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 높은 비율로 결합한다. 반대로, 상기 시료에 사스-코로나바이러스-2 중화 항체가 존재하는 경우에는, 상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 대한 결합 경쟁이 일어나므로 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 낮은 비율로 결합한다. 따라서, 상기 신호 정도가 약하게 나타나는 경우, 상기 개체를 개체의 중화항체 생성능이 낮은 개체로 판단할 수 있고, 상기 신호 정도가 강하게 나타나는 경우, 상기 개체를 중화항체 생성능이 높은 개체로 판단할 수 있다.
상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포 외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 체액, 혈장, 혈청, 혈액, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여, 상기한 기질, 및 검출 표지와 결합된 항체뿐만 아니라, 적당량의 완충용액, 발색 기질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라, 당업계 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 시료와 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 "검출" 이란, 단순히 시료 내에 표적물질이 존재하는지 여부에 대한 "검출"과 시료 내 대상 표적 물질의 "정량 분석"을 모두 일컫는다.
본 명세서에서의 용어 "개체"는 COVID-19가 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미할 수 있다. 상기 개체는 포유동물을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 영장류(예, 인간, 원숭이), 설치류(예, 마우스, 래트(rat), 모르모트(guinea pig)), 그리고 애완동물, 가축 및 사역동물(예, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 돼지)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "생물학적 시료"는 상기 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포 외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 시료로부터 유전자 및/또는 단백질 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함할 수 있으며, 이로부터 특정 유전자/단백질의 발현 수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 접촉시키는 단계는 상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 진단용 조성물을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 검출하는 단계는 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), 효소면역흡착법 (ELISA), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis), 단백질 칩 방법 (protein chip technology) 및 바이오센서 (biosensor)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 선택하여 수행하는 것일 수 있으며, 구체적으로 면역크로마토그래피법을 이용하여 수행하는 것일 수 있다.
상기 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD를 검출하는 방법은 생물학적 시료 내 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD를 정량적 또는 정성적으로 분석할 수 있다. 상기 분석은 개체의 측정된 항체 또는 그의 항원 결합 단편-사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 복합체 수준이 COVID-19에 걸리지 않은 대조군 시료의 항체 또는 그의 항원 결합 단편-사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 복합체 수준 보다 높은 경우, 상기 개체를 COVID-19에 걸린 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 상기 방법에 있어서, 대조군은 COVID-19에 걸리지 않은 정상인으로부터 분리된 시료로 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD를 포함하지 않은 시료를 의미한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합단편은 사스-코로나바이러스-2에 우수한 바이러스 중화능을 나타낼 뿐 아니라, RBD 영역에 변이가 나타난 변이주 바이러스에 대하여도 높은 바이러스 중화능을 나타낼 수 있으므로 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 상기 항체 또는 항원 결합단편은 타겟에 대한 우수한 결합력이 나타날 수 있으므로 사스-코로나바이러스-2를 효과적으로 검출하여 진단키트 및 진단 방법에 유용하게 활용가능하다.
도 1은 단일 클론 항체의 우한 SARS-CoV-2 및 남아공 변이주 RBD에 대한 결합능력을 SARS-CoV-2 의 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 확인하여 평형 해리상수(KD), 결합속도(Kon) 및 해리속도(Kdis) 상수를 확인한 도이다.
도 2는 인간 키메릭 재조합 항체의 우한 SARS-CoV-2 및 남아공 변이주 RBD에 대한 결합능력을 SARS-CoV-2 의 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 평형 해리상수(KD), 결합속도(Kon) 및 해리속도(Kdis) 상수를 확인한 도이다.
이하 일 양상을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 일 양상을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 일 양상의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니며, 일 양상의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 일 양상을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1. SARS-CoV-2 후보 단일 클론 항체의 제조를 위한 하이브리도마의 제조
SARS-CoV-2 바이러스뿐 아니라 변이주 바이러스에서 공통적으로 중화반응성이 있는 단클론항체를 제조하기 위하여 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 제조하였다. SARS-CoV-2 스파이크 재조합 단백질 중 인체의 수용체인 ACE2와 결합하는 부위인 수용체 결합영역(RBD)을 면역원으로 하여 완전 프로인트 항원 보강제(complete Freund's adjuvant)를 1:1로 혼합하여 자성의 6주령 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 동일한 방법을 활용하여 일주일 간격으로 3회간 추가 면역 실험을 수행하였다. 마지막 4차 면역 실험 일주일 후에, 면역원으로 사용하였던 동일한 항원을 상기 마우스의 꼬리 정맥에 1일 간격으로 3회 주사하여 부스팅(boosting)하였다. 세포융합을 수행하기 전에 면역화된 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 확보한 후, ELISA 방법을 통해 면역원에 대한 항체 역가가 증가함을 확인함으로써 면역 여부를 확인하였다. 항체 역가를 확인하여 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합 과정을 수행하였다. 면역화된 마우스의 비장을 적출하여 세포를 분리하고, 비장세포 1개와 골수종세포 5개를 확보하여 하이브리도마 세포를 제조하고, 이를 배양하였다.
하이브리도마 세포군 중에서도 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에만 특이적으로 반응하는 세포를 선별하기 위해, 항원을 코팅한 마이크로플레이트를 이용하여 ELISA를 수행하였다. ELISA를 수행하여 항원과 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다.
실시예 2. SARS-CoV-2 변이바이러스의 재조합 스파이크 단백질과 COVID-19 양성 환자 혈청과의 sVNT 평가
SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 스파이크 단백질과 변이바이러스인 영국 변이주 및 남아공 변이주의 재조합 스파이크 단백질과 해당 변이바이러스가 유행하기 전 수집한 COVID-19 양성 환자 10명의 혈청과 음성으로 판정된 10명의 혈청과의 반응성을 확인하기 위한 RBD-ACE2 대리 바이러스 중화 테스트(surrogate Virus Neutralization Test: sVNT)를 진행하였다. 이의 반응억제율(percentage inhibition :PI) 값을 하기의 식으로 계산하여 확인하고 이를 하기 표 1에 나타내었다. 실험에 사용한 COVID-19 양성 환자의 혈청의 희석배수를 하기 표 1에 나타내었으며, 추가적으로 COVID-19 양성 환자의 혈청과 SARS-CoV-2가 50% 세포병변효과(Cytopathic effect : CPE)가 확인되는 희석 배수에 있어서는 하기 표 1에 (50%)로 표시하였다.
반응억제율(PI) = 100 - (검체신호 / 음성 평균 신호 * 100 (%))
COVID-19
양성 환자 혈청 		SARS-CoV-2 VNT RBD-ACE2 sVNT
RBD
(기존, 우한) 		RBD
(영국 변이주) 		RBD
(남아공 변이주)
Titer PI value PI value PI value
9184 1:8(50%) 41.9 35.8 5.2
9185 1:32 66.6 63.3 35.0
9768 1:32(50%) 53.4 53.5 3.4
9769 1:16 38.1 39.2 10.3
9772 1:8 23.9 31.3 16.0
19777 1:8 25.4 32.0 -1.0
20691 1:16 53.4 57.5 5.9
6886 1:16(50%) 74.3 68.8 21.9
6887 1:64 64.0 63.3 25.0
6888 1:64 70.1 70.3 11.2
NHS(Normal human serum) -1.0 2.8 -5.3
병원음성1 4.3 -4.8 12.2
병원음성2 -8.7 -4.7 6.5
병원음성3 11.4 -1.7 7.4
병원음성4 10.3 -0.4 2.8
병원음성5 6.6 -0.7 4.5
병원음성6 4.3 -5.9 4.5
병원음성7 14.9 4.7 9.2
병원음성8 4.9 -4.1 15.4
병원음성9 11.8 -1.1 -5.2
병원음성10 -0.7 -1.2 -1.3
상기 표 1에서 확인한 바와 같이, COVID-19 양성 환자의 혈청은 1:8 내지 1:64의 희석배수로 활용되었으며, 종전 우한 발 SARS-CoV-2의 바이러스의 RBD에 높은 수준의 중화반응을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 영국 변이주 바이러스의 RBD와 COVID-19 양성환자의 혈청은 대부분 높은 수준의 중화반응을 나타내는 것을 확인하였다. 다만, 남아공 변이주 바이러스의 RBD와 양성환자의 혈청은 낮은 수준의 중화능을 보이거나 음성 판정 혈청과 비슷한 수준으로 나타나 중화능이 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다.
종합적으로, 남아공 변이주 바이러스의 RBD 단백질의 심한 변이로 인하여 기존의 회복환자에서 분리된 중화항체들은 해당 바이러스에는 중화능이 낮거나 없을 수 있음을 확인하였다. 따라서, SARS-CoV-2 바이러스 및 이의 변이주 바이러스에 높은 수준으로 중화할 수 있는 항체를 새롭게 찾아야할 필요성을 확인할 수 있었다.
실시예 3. SARS-CoV-2 VNT를 통한 단일 클론 항체 후보의 선별
상기 실시예 1에서 제조된 마우스의 면역으로 개발된 항체 후보군 중 중화능이 우수한 항체군을 선정하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 제조된 하이브리도마 클론으로부터 유래된 항체 후보군으로부터 한국 분리종 비 변이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 높은 중화능을 나타내는 항체를 확인하기 위한 중화능 평가 실험을 수행하였다. 구체적으로 정제된 단일 클론 마우스 항체를 2배 연속 희석한 샘플과 바이러스 희석액을 혼합한 용액을 배양된 vero 세포에 첨가하여 세포병변효과(Cytopathic effect : CPE) 유무로 중화능을 확인하였다. 항체로 인한 중화가 나타나 CPE가 확인되지 않거나 또는 50%의 CPE가 나타나는 샘플의 희석배수 값을 확인하였고, 최종적으로 31종의 항체를 선별하였다. 상기 선별된 31종의 항체의 바이러스 중화 테스트(VNT)를 수행하여, 희석배수의 값을 확인하여 하기 표 2에 나타내었다.
클론 명 VNT 테스트
(한국 분리종, 스파이크 비변이주)
19B 7 1:40
10 1:640
15 1:640(50%)
35 1:1280
37 1:1280
39 1:640
50 1:160
78 1:1280(50%)
90 1:160
103 1:1280(50%)
104 1:160
125 1:1280(50%)
141 1:1280
143 1:1280
21B 12 1:20480
24 1:640
31 1:10240
38 1:160
58 1:40960
64 1:640
97 1:81920(50%)
100 1:2560(50%)
101 1:163840(50%)
109 1:10240
130 1:20480(50%)
135 1:2560
138 1:20
22B 1 1:5120
7 1:2560(50%)
10 1:40960(50%)
17 1:10240(50%)
실시예 4. RBD-ACE2 sVNT 평가를 통한 단일 클론 항체 후보로부터 최종 단일 클론 항체 선정
단일 클론 항체 후보군으로부터 중화능이 우수한 단일 클론 항체를 선정하기 위하여, SARS-CoV-2의 RBD를 타겟으로 하는 중화항체가를 대리 바이러스 중화 테스트(surrogate Virus Neutralization Test: sVNT)를 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA에서 인체의 ACE2와 RBD 의 상호작용을 경쟁적으로 방해하는 중화항체가를 반응억제율(percentage inhibition :PI) 값을 하기의 식으로 계산하여 확인하였다.
반응억제율(PI) = 100 - (검체신호 / 음성 평균 신호 * 100 (%))
상기 측정은 단일 클론 항체 후보군의 기존 우한 SARS-CoV-2 의 RBD 재조합 단백질뿐 아니라 영국 변이주와 남아공 변이주 바이러스의 RBD 재조합 단백질에 대한 중화항체가를 함께 측정하고, 이의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
RBD-ACE2 대리 바이러스 중화 테스트(sVNT)
항체 클론 No. RBD
(기존, 우한) 		RBD
(영국 변이주) 		RBD
(남아공 변이주)
PI value PI value PI value
19B5 -3.4 -0.5 4.4
19B7 9.6 0.1 8.2
19B10 3.7 11.4 1.3
19B15 25.0 15.1 21.3
19B35 59.2 43.1 34.7
19B37 46.3 51.4 1.2
19B37-4 50.2 54.5 0.7
19B39 13.5 21.8 2.8
19B50 9.7 5.9 0.0
19B68 -1.6 6.1 -7.3
19B78 71.3 62.3 44.3
19B90 12.1 6.4 0.0
19B103 27.5 24.2 -3.8
19B104 13.9 16.9 -4.7
19B116 -1.0 1.8 -5.4
19B121 -1.4 -0.5 -7.9
19B125 5.2 5.6 1.8
19B135 53.4 51.5 -1.3
19B141 52.0 42.3 -4.4
19B143 27.0 14.3 -11.5
21B12 43.4 38.0 31.6
21B24 4.8 -0.7 4.8
21B31 -0.4 0.9 0.3
21B38 -5.7 1.3 -11.8
21B58 39.6 -0.9 0.7
21B64 -11.6 6.1 -0.2
21B97 63.9 56.0 48.1
21B100 -2.7 0.1 2.7
21B101 -4.4 -3.7 -5.4
21B109 -3.9 -1.8 -10.0
21B130 -1.6 -9.8 0.1
21B135 -0.1 6.2 -0.5
21B138 -1.8 1.6 -28.4
22B1 59.3 48.8 43.1
22B7 40.0 32.8 18.1
22B10 48.8 39.1 44.5
22B17 55.4 40.2 56.4
상기 표 3에서 확인한 바와 같이, 모든 단일 클론 항체가 변이가 없는 기존 우한 SARS-CoV-2와 영국 및 남아공 변이주 모두에 높은 중화항체가를 나타내지 않음을 확인하였다. 이중 상기 3가지 바이러스 모두에 공통적으로 SARS-CoV-2의 RBD와 ACE2와의 결합을 억제하는 것으로서 높은 중화 항체가를 나타내는 19B35, 19B78, 21B12, 21B97, 22B1, 22B10 및 22B177의 총 7개의 항체를 선별하였다. 이 중 평균적으로 기존 바이러스 이외 변이주에서도 높은 정도의 중화 항체가를 나타내어 상위 3종에 대한 단일 항체인 총 3종인 19B35, 19B78 및 21B97를 최종적으로 선정하였다. 종합적으로, 상기 최종적으로 선정된 3가지 단일 클론 항체의 클론 3종의 기존 바이러스 및 이외 변이주 바이러스에 대한 PI값과 한국 분리종 SARS-CoV-2의 바이러스 중화 테스트(VNT)을 수행하여 확인한 희석배수의 값을 하기 표 4에 정리하였다.
RBD-ACE2 sVNT VNT test
(한국분리종, 스파이크 비변이주)
항체 클론 RBD
(기존, 우한) 		RBD
(영국 변이주) 		RBD
(남아공 변이주)
PI value PI value PI value
19B-35-7 59.2 43.1 34.7 1:1280
19B-78-9 71.3 62.3 44.3 1:1280(50%)
21B-97-3 63.9 56.0 48.1 1:81920(50%)
또한, 선별된 3종 단클론 항체 후보의 하이브리도마에서 전체 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 항체 중쇄 및 경쇄 가변 부위 시퀀스를 선행문헌을 참고하여 분석하였고(Barbas C. et. al. Phage display a laboratory manual. 2001. CSHL Press), 이의 아미노산 서열을 아래의 표 5 및 6에 나타내었으며, 지정된 서열번호를 괄호안에 표시하였다.
Figure pat00001
Figure pat00002
(가변영역 중 상보성 결정영역은 밑줄로 표시하였다.)
실시예 5. 선정된 단일 클론 항체의 타겟에 대한 결합력의 확인
5.1 마우스 단일 클론 항체의 결합력 측정
최종적으로 선별된 19B35, 19B78, 및 21B97의 마우스 단일 클론 항체 3종과 타겟인 SARS-CoV2 우한 RBD 단백질과 변이주 바이러스인 남아공 RBD 단백질에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 방법으로 옥텟 QK384 (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였고, 이의 친화도를 각각 평형 해리상수(KD), 결합속도(Kon) 및 해리속도(Kdis) 상수로 계산한 결과를 도 1과 표 7에 나타내었다.
Figure pat00003
상기 도 1 및 표 7에서 확인한 바와 같이, 항체의 타겟에 대한 친화도를 나타내는 항체 평형 해리 상수인 KD값은 SARS-CoV2 RBD (우한)에 대하여 19B35, 19B78, 및 21B97 단일 클론 항체에서 각각 2.516x10-9M, 7.336x10-10M 및 6.701x10-9M로 나타나, 21B97, 19B78 및 19B35순으로 친화도가 나타나는 것임을 확인하였다. 또한 이는 SARS-CoV2 RBD (남아공)의 항체 평형 해리 상수 값에서도 동일한 패턴으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
종합적으로, 최종적으로 선별된 3종의 마우스 항체는 모두 타겟에 대한 높은 정도의 친화도가 나타나는 것임을 확인할 수 있었다.
5.2 인간 키메릭 항체의 결합력 측정
상기 실시예를 통하여 중화능이 우수한 단클론 항체 후보로 선별한 하이브리도마(hybridoma) 세포로부터 마우스 단일 클론 항체인 19B35, 19B78, 및 21B97의 중쇄 가변부위(variable heavy chain; VH) 및 경쇄 가변부위(variable light chain; VL)를 인간 IgG 불변영역 유전자와 재조합시켜 키메릭 항체 유전자를 제조한 후, 포유동물세포인 HEK 세포 또는 CHO 세포에 형질도입 시약 (transfection reagent)을 이용하여 형질 감염시켜 상기 키메릭 항체 유전자를 형질 감염시켜 발현시킨 후 그 배양액을 protein A 로 정제하여 정제된 키메릭 재조합 항체를 수득하였다.
이후, 상기 수득한 인간 키메릭 재조합 항체에 대한 결합능력은 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 분석으로 확인하고, 이의 친화도를 각각 평형 해리상수(KD), 결합속도(Kon) 및 해리속도(Kdis) 상수로 계산한 결과를 도 2과 표 8에 나타내었다.
Figure pat00004
상기 도 2 및 표 8에서 확인한 바와 같이, 항체의 타겟에 대한 친화도를 나타내는 항체 평형 해리 상수인 KD값은 SARS-CoV2 RBD (우한)에 대하여 19B35-7, 19B78-9, 및 21B97-3 인간 키메릭 항체에서 각각 4.37x10-9M, 1.24x10-8M 및 1.20x10-8M로 나타나, 19B78-9, 19B35-7 및 21B97-3 순으로 친화도가 나타나는 것임을 확인하였다. 또한 이는 SARS-CoV2 RBD (남아공)에서는 21B97-3, 19B78-9 및 19B35-7순으로 친화도가 나타나는 것으로 확인하였다.
종합적으로, 최종적으로 선별된 3종의 인간 키메릭 항체는 모두 타겟에 대한 높은 정도의 친화도가 나타나는 것임을 확인할 수 있었다.
<110> BIONOTE, INC. <120> Antibody against SARS-coronavirus-2 and the uses thereof <130> PN141219 <150> KR 10-2021-0026717 <151> 2021-02-26 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 amino acid sequence of 19B78 <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 amino acid sequence of 19B78 <400> 2 Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 amino acid sequence of 19B78 <400> 3 Glu Glu Gly Gly Ser Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 amino acid sequence of 21B97 <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Ile His 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 amino acid sequence of 21B97 <400> 5 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 amino acid sequence of 21B97 <400> 6 Asp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 amino acid sequence of 19B35 <400> 7 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 amino acid sequence of 19B35 <400> 8 Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 amino acid sequence of 19B35 <400> 9 Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 amino acid sequence of 19B78 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 amino acid sequence of 19B78 <400> 11 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 amino acid sequence of 19B78 <400> 12 Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 amino acid sequence of 21B97 <400> 13 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 amino acid sequence of 21B97 <400> 14 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 amino acid sequence of 21B97 <400> 15 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 amino acid sequence of 19B35 <400> 16 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 amino acid sequence of 19B35 <400> 17 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 amino acid sequence of 19B35 <400> 18 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy chain variable region of 19B78 <400> 19 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Gly Gly Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light chain variable region of 19B78 <400> 20 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys Arg Ala Asp 115 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy chain variable region of 21B97 <400> 21 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light chain variable region of 21B97 <400> 22 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ala 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Ala Asp 115 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the heavy chain variable region of 19B35 <400> 23 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Val His Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 24 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the light chain variable region of 19B35 <400> 24 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 25 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of SARS-CoV-2 Spike protein <400> 25 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270

Claims (20)

  1. 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor binding domain) 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    하기 조합 a), b) 및 c) 중 하나의 중쇄 상보성 결정영역(Heavy chain complementarity determining region: HCDR) 및 경쇄 상보성 결정영역(Light chain complementarity determining region, LCDR)을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 11 의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 12 의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL);
    b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL); 및
    c) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR2, 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하기 조합 중 선택된 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 이루어진 아미노산;
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 22로 이루어진 아미노산; 및
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23으로 이루어진 아미노산을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 24로 이루어진 아미노산.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 RBD(Receptor binding domain) 은 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열의 N말단으로부터 319 내지 541번째 아미노산으로 이루어진 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 3에 있어서, 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 단백질의 RBD(Receptor binding domain) 에 바이러스 중화능을 나타내는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1에 있어서, 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열의 501번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine, N) 에서 티로신(Tyrosine, Y)으로 치환된 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 변이 단백질에 바이러스 중화능을 나타내는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 1에 있어서, 서열번호 25로 이루어진 아미노산 서열의
    417번째 아미노산이 라이신(Lysine, K)에서 아스파라긴(Asparagine, N)로 치환된 것;
    484번째 아미노산이 글루타메이트(Glutamate, E)에서 라이신(Lysine, K)로 치환된 것; 및
    501번째 아미노산이 아스파라긴(Asparagine, N) 에서 티로신(Tyrosine, Y)으로 치환된 것으로 이루어진 군으로부터 1종 이상의 변이를 포함하는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 변이 단백질에 바이러스 중화능을 나타내는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 마우스 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-결합 Fvs(sdFV), scFv 단편, scFv-Fc 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디, 및 테트라바디로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하이브리도마 세포로부터 생산되는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 하기 조합 중 선택된 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)　스파이크 단백질(Spike protein, S protein)의 RBD(Receptor binding domain) 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 생산용 재조합 발현 벡터 :
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 19로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 이루어진 아미노산;
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 로 이루어진 아미노산 및 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 22로 이루어진 아미노산; 및
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 23으로 이루어진 아미노산을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 24로 이루어진 아미노산.
  10. 청구항 9의 재조합 발현 벡터로 시험관(in vitro) 내 형질전환된 숙주세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아, 효모, HEK 세포, CHO 세포, F2N 세포, HEK293 세포, HEK93T세포, COS 세포 및 항체 생산 하이브리도마 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주.
  13. 청구항 9의 발현 벡터를 이용하여 시험관(in vitro) 내에서 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 RBD 에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산방법.
  14. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 주사제, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 제형, 경구형 제형, 외용제, 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택된 제형인 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단용 조성물.
  17. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스-2에 대한 중화 항체 검출용 조성물.
  18. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 진단용 키트.
  19. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 사스-코로나바이러스-2에 대한 중화 항체 검출용 키트.
  20. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
    상기 시료와 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 결합에 의해 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2를 검출하는 방법.

KR1020210156064A 2021-02-26 2021-11-12 사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 Active KR102748987B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20210026717 2021-02-26
KR1020210026717 2021-02-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220122467A true KR20220122467A (ko) 2022-09-02
KR102748987B1 KR102748987B1 (ko) 2025-01-02

Family

ID=83280834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210156064A Active KR102748987B1 (ko) 2021-02-26 2021-11-12 사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102748987B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116496391A (zh) * 2022-09-30 2023-07-28 武汉科源安博生物技术有限公司 针对新型冠状病毒2019-nCoV株RBD蛋白的单克隆抗体及免疫检测试剂
CN118373905A (zh) * 2024-05-22 2024-07-23 广州海关技术中心 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白RBD的中和抗体ZJ-5及其应用
KR102714027B1 (ko) 2024-03-13 2024-10-15 국방과학연구소 사스-코로나바이러스-2 델타 감염증 치료용 항체 mRNA 및 이를 포함한 조성물
KR102714014B1 (ko) 2024-03-13 2024-10-15 국방과학연구소 사스-코로나바이러스-2 델타 감염증 치료용 항체 mRNA 및 이를 포함한 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10822379B1 (en) * 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
CN111999492A (zh) * 2020-07-30 2020-11-27 山东莱博生物科技有限公司 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡
WO2022022445A1 (zh) * 2020-07-28 2022-02-03 上海市公共卫生临床中心 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10822379B1 (en) * 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
WO2022022445A1 (zh) * 2020-07-28 2022-02-03 上海市公共卫生临床中心 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段
CN111999492A (zh) * 2020-07-30 2020-11-27 山东莱博生物科技有限公司 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116496391A (zh) * 2022-09-30 2023-07-28 武汉科源安博生物技术有限公司 针对新型冠状病毒2019-nCoV株RBD蛋白的单克隆抗体及免疫检测试剂
KR102714027B1 (ko) 2024-03-13 2024-10-15 국방과학연구소 사스-코로나바이러스-2 델타 감염증 치료용 항체 mRNA 및 이를 포함한 조성물
KR102714014B1 (ko) 2024-03-13 2024-10-15 국방과학연구소 사스-코로나바이러스-2 델타 감염증 치료용 항체 mRNA 및 이를 포함한 조성물
CN118373905A (zh) * 2024-05-22 2024-07-23 广州海关技术中心 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白RBD的中和抗体ZJ-5及其应用
CN118373905B (zh) * 2024-05-22 2024-12-03 广州海关技术中心 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV刺突蛋白RBD的中和抗体ZJ-5及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102748987B1 (ko) 2025-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102748987B1 (ko) 사스-코로나바이러스-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
JP5576072B2 (ja) チロトロフィン（ｔｓｈ）受容体の抗原決定領域、その使用およびその抗体
KR20230023664A (ko) 항-클라우딘18.2 항체 및 이의 용도
WO2021218947A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
MX2011001363A (es) Anticuerpos selectivos de anti-hepcidina-25 y usos de los mismos.
JP2023534923A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的にする抗原結合分子
JP2010536043A (ja) 尿ゲルゾリンの検出および定量化
AU2020351274A1 (en) Single-domain antibodies directed against LILRB2
US20230348568A1 (en) Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
TWI734279B (zh) 抗α-突觸核蛋白抗體及其用途
US20230242623A1 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of sars-cov-2 virus infection
CN121358774A (zh) 与nkg2a结合的抗体或抗原结合片段及其用途
WO2022132904A1 (en) Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
CN113999303B (zh) 用于体外诊断的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体
KR101627020B1 (ko) 적 백혈병 세포에서 발현되는 icama4를 인지하는 항체 및 이의 용도
WO2022179535A1 (zh) 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN112574297B (zh) 抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用
JP2025542128A (ja) メタニューモウイルス融合（ｆ）タンパク質に対する抗体及びその使用
CN107286237B (zh) 一种抗丙型肝炎病毒抗体的获取以及应用
WO2022068895A1 (zh) 抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体及其应用
US20260092100A1 (en) Antibodies against metapneumovirus fusion (f) protein and uses thereof
CN113999302B (zh) 用于体外诊断的新型冠状病毒核衣壳蛋白抗体
CN120665199B (zh) 抗human IgG的抗体、其制备方法及用途
WO2012101125A1 (en) Specific antibodies against human cxcl4 and uses thereof
CN115925906B (zh) 抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-3-3-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-3-3-R10-R11-asn-PN2301

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000