KR20220131233A - Semg2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Semg2 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220131233A
KR20220131233A KR1020227023643A KR20227023643A KR20220131233A KR 20220131233 A KR20220131233 A KR 20220131233A KR 1020227023643 A KR1020227023643 A KR 1020227023643A KR 20227023643 A KR20227023643 A KR 20227023643A KR 20220131233 A KR20220131233 A KR 20220131233A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
ser
semg2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020227023643A
Other languages
English (en)
Inventor
자오리 리
Original Assignee
상하이 바이오트로이 바이오테크니크 컴퍼니, 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 바이오트로이 바이오테크니크 컴퍼니, 리미티드 filed Critical 상하이 바이오트로이 바이오테크니크 컴퍼니, 리미티드
Publication of KR20220131233A publication Critical patent/KR20220131233A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G01N33/574—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 소분자 억제제, 폴리펩티드, 항체, 또는 항원-결합 단편을 포함하는, SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 효능화하거나 길항시키는 화합물을 제공한다. 본 발명은 추가로 폴리펩티드를 면역원으로 사용하여 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하기 위한 항체를 고효율로 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명은 종양 세포에 의해 발현되는 SEMG2와 면역세포에 의해 발현되는 CD27의 접촉을 차단함으로써 항종양 면역을 촉진시키는 방법을 개시하며, 또한 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단함으로써 치료 약물을 스크리닝하는 스크리닝 방법을 개시한다.

Description

SEMG2 항체 및 이의 용도
본 발명은 생물의학 분야, 구체적으로 SEMG2 항원성 에피토프 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
CD27 분자는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리에 속하고 분자량이 약 55kDa인 타입 I 막 단백질이며, 이황화 결합으로 연결된 두 개의 단량체의 이량체로 존재한다. CD27은 주로 림프구에서 발현된다. CD27 녹아웃 마우스를 기반으로 한 최근 연구에서는 CD27 신호전달 경로의 활성화가 고형 종양에서 리프레서 T 세포(Treg)의 침투를 증가시키고 항종양 면역을 감소시킬 수 있음을 보여주었다(Claus C, Riether C, Sch
Figure pct00001
rch C, Matter MS, Hilmenyuk T, Ochsenbein AF . Cancer Res. 2012 Jul 15;72(14) :3664- 76). 일관되게, 연구에서는 또한 피부 조직의 Treg 세포가 CD27 발현을 상실한 후 정상적인 면역 조절 기능을 수행하지 못한다는 것을 발견하였다(Remedios KA, Zirak B, Sandoval PM, Lowe MM, Boda D, Henley E et al., Sci Immunol . 2018. Dec 21;3(30).pii:eaau2042). 또한, CD27의 활성화는 고지혈증 마우스에서 Treg 수를 증가시키고 죽상동맥경화증을 감소시킨다(Winkels H, Meiler S, Lievens D, Engel D, Spitz C, B
Figure pct00002
rger C, et al., Eur Heart J. 2017; 38(48):3590- 3599). 최근 연구들은 CD27이 특정 Treg 세포(종양-침윤 Treg 포함)의 기능적 활성화에 중요한 역할을 하므로 종양-침윤 Treg 세포에 의해 발현되는 CD27의 활성화를 피하는 것이 잠재적인 암 치료 전략임을 일관되게 입증한다.
리간드에 대한 결합은 CD27의 다운스트림 신호 전달을 활성화하며, 현재 알려진 CD27 리간드 분자는 CD70이다. CD70은 TNF 계열에 속하는, 20개 아미노산의 친수성 N-말단 도메인과 2개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는 C-말단 도메인을 갖는 193개 아미노산 폴리펩티드이다(Goodwin，R . G . et al. (1993) Cell 73:447-56; Bowman et al. (1994) Immunol 152:1756 - 61). 이러한 특성은 CD70이 세포외 C-말단 부분을 갖는 타입 II 막관통 단백질임을 시사한다. CD70은 활성화된 T 및 B 림프구와 수지상 세포에 일시적으로 존재한다(Hintzen et al., (1994) J. Immunol . 152:1762-1773; Oshima et al., (1998) Int . Immunol . 10:517-26; Tesselaar et al., (2003) J. Immunol . 170:33- 40). 정상 세포 외에도, CD70 발현은 신장 세포 암종, 전이성 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종 및 비인두 암종을 포함한 상이한 유형의 암에서 보고되었다(Junker et al., J. Urol . 2005; 173: 2150 -3; Sloan et al., Am J Pathol . 2004; 164:315-23; Held- Feindt and Mentlein et al., Int J Cancer 2002; 98:352- 6). 현재, CD70과 CD27 사이의 결합을 차단하는 것이 종양 면역요법을 위해 조사되고 있는 전략이다.
이전 연구에서는 CD27이 CD70 이외의 다른 리간드를 가지고 있음을 시사하지 않았다. 그러나, 면역 체크포인트 경로 수용체의 신규 리간드(특히 비교적 높은 특이성을 갖는 종양 세포에 의해 발현되는 신규 리간드)는 보다 효과적인 항종양 치료제의 개발에 대단히 중요하다. 본 발명은 신규한 항종양 치료제 및 약물을 개발하는 것을 목적으로 한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 효능화(agonizing) 또는 길항(antagonizing)시키는 화합물을 개시한다. 여기서, SEMG2와 CD27 사이의 상호작용은 SEMG2의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 및 508의 아미노산 부위에 위치하고, SEMG2 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나타나 있다. 여기서, 화합물은 소분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드를 개시하며, 폴리펩티드는 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 86 (QIEKLVEGKS(x)I(x)), 서열 번호 87 (QIEKLVEGKS(x)I), 또는 서열 번호 88 (QIEKLVEGKS(x))의 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2-5에 제공된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 폴리펩티드는 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 효능화시킨다. 여기서, SEMG2와 CD27 사이의 상호작용의 아미노산 부위는 SEMG2의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 508에 위치하고, SEMG2 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나타나 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하며, 항체는 SEMG2 단백질로부터 유래된 항원성 에피토프 펩티드에 결합하고, 항원성 에피토프 펩티드는 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열을 포함한다. 여기서, 항체는 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 길항시킨다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하며, 항체는 천연 SEMG2 단백질의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 508의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 인식하거나 돌연변이 SEMG2 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기를 인식하고, 천연 SEMG2 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나타나 있다. 여기서, 항체는 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 길항시킨다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하며, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 IMGT에 의해 정의된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 IMGT에 의해 정의된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며,
HCDR1은 서열 번호 6-11, 서열 번호 60-61 및 서열 번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
HCDR2는 서열 번호 12-16 및 서열 번호 62-64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
HCDR3은 서열 번호 17-20, 서열 번호 65-67 및 서열 번호 77-81로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
LCDR1은 서열 번호 21-25, 서열 번호 68-70 및 서열 번호 82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
LCDR2는 서열 번호 26-29, 서열 번호 71-72, 서열 번호 83-84 및 서열 번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
LCDR3은 서열 번호 30-34, 서열 번호 73-75, 서열 번호 85 및 서열 번호 99로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 항체의 CDR 서열은 (a)-(k)의 조합 중 어느 하나로부터 선택된다:
(a) HCDR1은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고;
(b) HCDR1은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2의 아미노산은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 31 또는 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) HCDR1은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고;
(d) HCDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하고;
(e) HCDR1은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하고;
(f) HCDR1은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
(g) HCDR1은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
(h) HCDR1은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하고;
(i) HCDR1은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하고;
(j) HCDR1은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하고;
(k) HCDR1은 서열 번호 60 또는 76의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 64 또는 62의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
LCDR1은 서열 번호 70 또는 82의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2는 서열 번호 28, 83 또는 84의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 75 또는 85의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하며, 여기서 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호 35-41, 48-51, 54-56 및 96-100으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 35-41, 48-51, 54-56 및 96-100의 어느 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호 42-47, 52-53, 57-69 및 101-103으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 42-47, 52-53, 57-69 및 101-103의 어느 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 (a)-(o)의 조합 중 어느 하나로부터 선택된다:
(a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 35 또는 서열 번호 35와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 42 또는 서열 번호 42와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 36 또는 서열 번호 36과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 43 또는 서열 번호 43과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 37 또는 서열 번호 37과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 44 또는 서열 번호 44와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(d) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 38 또는 서열 번호 38과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45 또는 서열 번호 45와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(e) 중쇄 가변 영역 서열 번호 39 또는 서열 번호 39와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 46 또는 서열 번호 46과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(f) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 40 또는 서열 번호 40과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47 또는 서열 번호 47과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(g) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 41 또는 서열 번호 41과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47 또는 서열 번호 47과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(h) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48, 49, 50, 51 또는 서열 번호 48, 49, 50 또는 51과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 52, 53 또는 서열 번호 52 또는 53과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54 또는 서열 번호 54와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 57 또는 서열 번호 57과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(j) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55 또는 서열 번호 55와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 58 또는 서열 번호 58과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(k) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56 또는 서열 번호 56과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59 또는 서열 번호 59와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(l) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 96 또는 서열 번호 96과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59, 101, 102, 103 또는 서열 번호 59, 101, 102 또는 103과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(m) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 97 또는 서열 번호 97과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59 또는 서열 번호 59와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(n) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 98 또는 서열 번호 98과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 103 또는 서열 번호 103과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(o) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 99 또는 100 또는 서열 번호 99 또는 100과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 57 또는 서열 번호 57과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 폴리펩티드에 연결된 커플링 모이어티(coupling moiety)를 추가로 포함하며, 커플링 모이어티는 방사성핵종(radionuclide), 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 플루오레세인(fluroscein), 운반 단백질(carrier protein), 지질 및 비오틴(biotin) 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 폴리펩티드 또는 항체는 링커(linker)에 의해 커플링 모이어티에 선택적으로 연결되고, 바람직하게는 상기 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
여기서 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody), 다클론 항체(polyclonal antibody), 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택된다.
여기서 항체는 다중-특이 항체, 단일-쇄 가변 단편(scFv), 단일-쇄 항체, 항-이디오타입(anti-idiotype; 항-Id) 항체, 디아바디(diabody), 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합 이중특이적 Fv(sdFv) 및 세포내 항체로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원성 에피토프(epitope) 펩티드를 개시하며, 여기서 항원성 에피토프 펩티드는 SEMG2 단백질로부터 유래되고, 항원성 에피토프 펩티드의 아미노산은 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 및 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 단백질을 개시하며, 여기서 단백질은 아미노산 서열을 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 86 (QIEKLVEGKS(x)I(x)), 서열 번호 87 (QIEKLVEGKS(x))I), 또는 서열 번호 88 (QIEKLVEGKS(x))에 나타낸 아미노산 서열로서 포함하고, 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2-5, 보다 바람직하게는 서열 번호 89-94 및 서열 번호 3 (각각 P1-P6, 및 P7에 상응함) 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 및 N-말단 또는 C-말단에서 선택적으로 연결될 수 있는 태그(tag) 서열을 포함한다. 당업계의 숙련가들은 단백질 태그의 추가가 SEMG2와 CD27 간의 결합에 대한 제조된 항체의 관여에 영향을 미치지 않는다는 것을 이해해야 하며, 단백질 태그는 C-Myc, His, GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제), HA, MBP (말토스-결합 단백질), Flag, SUMO, eGFP/eCFP/eYFP/mCherry 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 3 (P7: QIEKLVEGKSQIQ) 또는 서열 번호 93 (P5)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 개시하며, 여기서 단백질을 면역원으로 사용하여 마우스 또는 스크리닝 천연 라이브러리와 같은 대상체(subject)에 주사하여 항체를 제조하고, 항체의 아미노산 서열은 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 86 (QIEKLVEGKS(x)I(x)), 서열 번호 87 (QIEKLVEGKS(x)I), 또는 서열 번호 88(QIEKLVEGKS(x))의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 폴리펩티드는 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2-5, 보다 바람직하게는 서열 번호 93 (P5) 또는 서열 번호 3 (P7) 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 면역원으로서 SEMG2와 CD27 사이의 결합의 핵심 에피토프 폴리펩티드를 사용하고 인간 및 낙타 천연 라이브러리에서 뮤린 하이브리도마 및 파지 디스플레이를 스크리닝하는, 단리된 항체를 수득하는 방법이 개시되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 화합물, 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화(encoding)하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 개시한다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드 및 임의의 조절 서열을 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector)를 개시하며; 바람직하게는, 재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다.
여기서, 조절 서열은 리딩(leading) 서열, 폴리아데닐화 서열, 폴리펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 전사 종결인자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 발명은 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 개시한다.
여기서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 화합물, 항원성 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 및 하나 이상의 유형의 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.
여기서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 효능화 또는 길항시키기 위한 생성물의 제조에 있어서의 화합물, 항원성 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 또는 숙주 세포의 용도를 개시하며, 바람직하게는 SEMG2는 종양 세포에서 발현되고 CD27은 면역 세포에서 발현된다.
본 발명은 또한 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약물 또는 종양에 대해 유도된 면역 반응을 조절하기 위한 약물의 제조에 있어서의 화합물, 항원성 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 또는 숙주 세포의 용도를 개시한다.
하나의 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장암, 폐암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암 및 난소암 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 억제하는 억제제 또는 항체를 스크리닝하여 후보 약물 또는 시약을 수득함을 포함하여, 종양을 예방하거나 치료하는 약물 또는 시약을 스크리닝하는 방법을 개시한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하여 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 개시한다:
대상체의 림프구(T 림프구)와 같은 면역 세포 또는 종양 세포를 화합물 중 어느 하나의 유효량과 접촉시키는 단계; 여기서 종양 세포에서 SEMG2의 발현은 대상체의 림프구와 같은 면역 세포 및/또는 종양 세포를 유효량의 화합물과 접촉시키기 전에 선택적으로 검출될 수 있다.
여기서 대상체는 추가 항암 요법을 받았거나 받고 있거나 받을 예정이다.
여기서 추가 항암 요법은 수술, 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 화합물, 항원성 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 및 하나 이상의 유형의 숙주 세포를 포함하는 키트(kit)를 개시하고, 상기 성분들은 적합한 용기에 포함된다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플을 화합물과 접촉시키는 것을 포함하여, 시험관내 생물학적 샘플에서 SEMG2의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 개시한다.
하기 단계를 포함하는, 종양 세포의 종양 세포 성장을 억제하는 방법: A) 종양 세포에서 SEMG2의 발현을 분석하는 단계; B) 종양 세포를 SEMG2를 인식하는 항체와 접촉시키는 단계(SEMG2에 대한 항체의 결합은 KD <2Х10- 8이다); C) T 림프구를 항체 및 종양 세포와 접촉시키는 단계. 여기서 KD<2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10이다.
도 1은 상단 패널과 하단 패널로 나누어 공동-면역침전 분석의 결과를 도시한다. 상단 패널은 인간 CD27과 SEMG2(Flag) 사이의 물리적 상호작용의 존재를 입증한다. 하단 패널은 마우스 CD27과 SEMG2(Flag) 사이의 물리적 상호작용의 존재를 입증한다.
도 2는 면역형광 염색 및 ELISA 결과를 도시한다. 도 2(a)는 종양 세포에서 과발현 후 CD27과 SEMG2 사이의 상당한 공동국소화를 입증한다. 도 2(b)는 마이크로플레이트에서 SEMG2 결합에 대한 CD27 농도-의존적 영향을 입증하는 ELISA의 결과를 보여주는 반면 CD27은 음성 대조군 단백질에 결합하지 않고 농도 효과가 없다.
도 3은 SEMG2 단편(즉, P1 내지 P6)이 CD27에 결합하는지 여부를 조사하기 위한 공동-면역침전 분석의 결과를 도시한다. 여기서 P5 단편은 CD27에 유의하게 결합하는 것으로 검출되었다.
도 4는 SEMG2 단편(즉, P4, P5, P6, P7)이 CD27에 결합하는지 여부를 조사하기 위한 공동-면역침전 분석의 결과를 도시한다. 여기서 P7 서열은 "QIEKLVEGKSQIQ"인 P5의 일부로부터 유래된다. 결과는 왼쪽 패널과 오른쪽 패널을 포함한다. 왼쪽 패널은 SEMG2 단편과 인간 CD27 사이의 결합을 보여주고, 오른쪽 패널은 SEMG2 단편과 마우스 CD27 사이의 결합을 보여준다. 결과는 인간 및 마우스 CD27 둘 다가 P5 및 P7 단편에 결합할 수 있음을 보여준다.
도 5는 패널 A 및 패널 B를 포함하여 알라닌 스캐닝 방법에 의해 정확하게 입증된 CD27 단백질 결합에 대한 P7의 각 아미노산의 기여를 도시한다. 패널 A는 P7의 각 아미노산을 글리신으로 하나씩 치환하여 생성된 서열. 즉, 1 내지 13으로 번호매겨진 돌연변이된 아미노산 서열을 보여준다. 패널 B는 돌연변이 1-13 폴리펩티드의 GFP 융합 단백질이 CD27에 결합하는 정도를 나타내는 공동-면역침전 실험의 결과이고; 여기서 돌연변이체 5 및 9는 CD27에 대한 결합을 완전히 상실하였고; 돌연변이체 11 및 13은 SEMG2(497-509)와 CD27 사이의 결합에 영향을 미치지 않았고; 다른 부위(1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12)의 돌연변이체는 SEMG2(497-509)와 CD27 사이의 결합을 다소 약화시켰다. SEMG2의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 508에 위치한 아미노산은 CD27에 대한 결합에 명백한 영향을 미친다.
도 6은 SEMG2 에피토프 폴리펩티드와 CD27 사이의 결합, 및 CD27에 대한 전장 SEMG2 결합의 경쟁적 억제를 도시한다. (A) 도 6a는 BSA-접합된 인간 SEMG2(497-509) 폴리펩티드 및 원숭이 SEMG2 폴리펩티드가 각각 마이크로플레이트에서 CD27 단백질에 결합할 수 있음을 보여주며, 이는 음성 BSA 대조군보다 유의하게 더 높으므로 CD27이 인간 및 원숭이 SEMG2(497-509) 단편 둘 다에 결합할 수 있음을 나타낸다. (B) 도 6b는 전장 SEMG2와 CD27 사이의 결합에 대한 SEMG2-유래 폴리펩티드 및 유도체 QIEKLVEGKSQIQ, QIEKLVEGKSQI, QIEKLVEGKSQ 및 QIAKLVEGKSQ의 억제 효과를 보여준다. 도면에 나타낸 바와 같이, 상이한 농도의 펩티드를 먼저 결합을 위해 CD27-Fc와 공동-배양한 다음 SEMG2 단백질로 미리 코팅된 미세-반응 플레이트에 첨가한다. 공동-배양 후, 접합되지 않은 분자를 세척하고, 항-Fc 이차 항체-HRP를 검출 및 개발에 사용한다. 결과는 폴리펩티드 분자가 전장 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 억제할 수 있음을 보여준다.
도 7은 SEMG2 또는 대조군 빈 벡터로 안정적으로 형질감염되고 활성화된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 공동-배양된 HCT116 세포의 아폽토시스 분석을 도시한다. (A) 도 7a는 아폽토시스 분석의 대표적인 이미지이고, 그린 필드는 아폽토시스성 세포를 보여준다. (B) 도 7b는 세 가지 독립적인 생물학적 실험의 통계에 기반한다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄).
도 8은 상이한 종양 세포에서 SEMG2 단백질의 발현을 보여주는 면역블롯팅 분석을 도시한다. 종양 세포의 명칭은 위에 나타내어져 있다(글꼴이 45도 기울어짐). 시험된 세포주의 약 절반은 검출 가능한 SEMG2 단백질 발현을 갖는다.
도 9는 상이한 종양 조직에서 SEMG2 단백질의 발현을 나타내는 면역조직화학(IHC) 분석의 결과를 도시한다. (A) 도 9a는 정상 결장직장 조직을 대조군으로 하여 상이한 결장직장암 종양 조직에서의 SEMG2의 발현을 보여주고; (B) 도 9b는 정상 폐 조직을 대조군으로 하여 상이한 폐암 조직에서의 SEMG2의 발현을 보여주고; (C) 도 9c는 전립선암, 흑색종 및 위암에서 SEMG2 양성 발현의 대표적인 이미지를 보여준다. 공간 제한으로 인해, 모든 종양 유형의 검출 결과는 여기에 상세히 나열되지 않는다; (D) 도 9d는 상이한 유형의 종양 중에서 SEMG2 양성 발현의 비율이다. 양성 발현은 면역조직화학 염색에 의한 중등도 또는 강한 양성 발현으로서 정의된다. 조직 칩(각 칩에는 50개 이상의 조직 샘플이 포함됨)을 기반으로 한 통계적 결과가 백분율로 플롯팅되어 SEMG2의 양성 발현 비율을 보여준다.
도 10은 카플란-마이어 인자 생존 분석의 통계적 결과를 도시하며, 이는 SEMG2의 높은 발현(SEMG2 면역조직화학 염색에 의한 중등도, 강한 양성 염색으로 정의됨)이 결장직장암 환자의 전체 생존 기간 단축과 유의하게 관련되어 있음을 시사한다. 0.001 미만의 P 값은 매우 유의한 관련성을 나타낸다.
도 11은 면역조직화학 분석의 결과를 도시한다. 상단 패널은 폐암에서 조절 T 림프구, 즉 Treg와 SEMG2의 염색 간의 상관관계에 대한 통계적 결과를 보여준다. SEMG2 면역조직화학 염색의 강도를 상이한 수준으로 나누고, 각 시야에서 Treg(Foxp3 항체로 표지됨)의 수를 별도로 계산하여 비교한다. 하단 패널은 각각 SEMG2 양성 및 음성 발현의 Treg 표시된 대표적인 이미지이다.
도 12는 ELISA의 결과를 보여준다. 세로 좌표는 SEMG2와 CD27 간의 결합 정도를 나타내는 ELISA 판독값으로 표준화된 A405 흡광도 값을 보여주고; 가로 좌표는 첨가된 항체의 농도를 보여준다. 실선은 항원으로서 SEMG2(497-509)에 의해 생성된 다클론 항체의 차단 효과를 나타내고; 점선은 면역원으로서 SEMG2의 전장 단백질에 의해 생성된 다클론 항체의 차단 효과를 나타낸다. SEMG2(497-509)에 의해 생성된 다클론 항체는 차단 효과를 발휘하기 위해 더 낮은 농도가 필요하며, 즉 SEMG2(497-509)에 의해 생성된 항체의 차단 역가는 SEMG2 전장 단백질보다 더 높다. 이것은 핵심 역할 에피토프인 SEMG2(497-509)의 인식이 차단 항체의 개발을 훨씬 쉽게 만든다는 것을 시사한다.
도 13은 면역원으로서 SEMG2(497-509) 에피토프 펩티드 및 전장 SEMG2 단백질을 마우스에 주사한 후 수득된 항체의 총 수 및 차단 단클론 항체의 수를 도시한다. 하이브리도마 융합에 의해 수득된 마우스 단클론 항체 중에서, SEMG2와 CD27 사이의 결합을 억제할 수 있는 ELISA로 확인된 항체를 계수하여 검은색 막대로 표시한다. SEMG2(497-509) 에피토프 단편을 면역원으로 하여 제조된 항체의 대부분은 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단할 수 있으며, 양성률이 전장 SEMG2를 면역원으로 사용하여 제조된 항체보다 유의하게 더 높다.
도 14는 SEMG2 단백질에 대한 마우스 단클론 항체 및 인간화 마우스 단클론 항체의 결합 능력을 도시한다. ELISA의 판독값인 OD450 흡광도를 세로 좌표로 사용하고, 가로 좌표는 첨가된 항체의 상이한 농도를 보여준다. ELISA 시스템에서 항체의 농도가 증가함에 따라, OD450 값이 점차적으로 증가하며, 이는 뮤린 단클론 항체(도 14a) 또는 인간화 단클론 항체(도 14b)에 대한 SEMG2의 결합이 점차적으로 증가함을 나타낸다. 피팅 곡선은 세 가지 독립적인 생물학적 실험으로부터의 통계에 기반한 대표적인 결과이다.
도 15는 BSA-SEMG2(497-509)에 결합하고 SEMG2와 수용체 단백질 사이의 결합을 차단하는 마우스 단클론 항체의 능력을 도시한다. (A) 패널 A는 ELISA 판독값인 OD450 흡광도를 세로 좌표로 사용하고, 가로 좌표는 상이한 농도를 갖는 첨가된 항체를 보여주며, 이것은 SEMG2(497-509)와 마우스 단클론 항체 간의 결합이 점차적으로 증가함을 나타낸다. (B) 패널 B는 마우스 단클론 항체가 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하고, 차단 효과가 농도 증가에 따라 증가함을 보여준다. 대조군 마우스 IgG 항체는 차단 기능을 보이지 않는다. 세로 좌표는 정규화된 차단율인 차단율이고; 가로 좌표는 첨가된 항체의 상이한 농도를 보여준다. SEMG2와 CD27 사이의 결합은 ELISA 시스템에서 항체 농도가 증가함에 따라 점차적으로 감소하였다. 피팅 곡선은 세 가지 독립적인 생물학적 실험의 통계에 기반한다(오차 막대는 표준 편차를 나타냄).
도 16은 ELISA의 결과를 도시한다. 세로 좌표는 ELISA 판독값으로서의 정규화된 OD450 흡광도를 보여주며, SEMG2(ELISA 플레이트의 표면에 고정됨)와 첨가된 CD27-Fc 사이의 결합 정도를 나타내고; 가로 좌표는 상이한 실험 조건, 즉 공동-배양된 상이한 항체(농도는 10μg/mL임)를 보여주고: HPA042767 및 HPA042835는 각각 SEMG2(354-403) 및 SEMG2(563-574)에 대한 토끼 다클론 항체이고; MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14는 SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 마우스 단클론 항체이다. 결과는 SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 마우스 단클론 항체는 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하지만 다른 에피토프에 대한 항체는 차단하지 않는다는 것을 보여준다. 이 실험은 SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 마우스 단클론 항체가 기능적으로 동일한 유형의 항체에 속한다는 것을 입증한다.
도 17은 T 세포에 의한 종양 세포 사멸 효과에 대한 상이한 유형의 항체의 효과를 도시한다. 활성화된 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 각각 SEMG2를 고도로 발현하는 인간 흑색종 세포 A375 또는 결장직장암 세포 LOVO와 공동-배양하며, 그 동안 다른 항체를 첨가한다: 비관련 마우스 IgG, HPA042767, HPA042835, MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, 또는 MM14. 세로 좌표는 아폽토시스 종양 세포의 백분율을 보여주고; 가로 좌표는 실험에서 상이한 처리 조건, 즉 첨가된 상이한 항체를 보여준다. SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 마우스 단클론 항체(MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, 또는 MM14)는 T 세포에 의한 종양 사멸 효과를 유의하게 촉진하는 반면 SEMG2(354-403) 및 SEMG2(563-574) 항원 에피토프에 대한 대조군 비관련 IgG 또는 HPA042767 및 HPA042835 항체는 이러한 기능을 보이지 않는다. 이것은 SEMG2(497-509) 에피토프가 면역 회피 기능에서 종양 세포에 의해 발현되는 SEMG2의 핵심 부위이며, 이 에피토프에 대해 지시된 항체는 항종양 면역조절 기능 측면에서 동일한 유형에 속한다는 것을 입증한다.
도 18은 SEMG2 차단 항체의 존재하에서 상이한 종양 세포에 대한 T 세포 사멸 실험의 결과를 도시한다. 여기서 A375 및 LOVO는 SEMG2 단백질을 고도로 발현하는 종양 세포인 반면 DLD1, NCM460 및 NCI-H1975는 SEMG2-음성 세포이다. 종양 세포에 대한 T 세포 사멸 실험 동안, 상이한 항체, 즉 비관련 뮤린 IgG 항체, MM02 또는 MM05 마우스 단일클론 항체가 첨가된다. 가로 좌표는 상이한 종양 세포주를 나타내는 반면 세로 좌표는 아폽토시스 종양 세포의 백분율을 나타낸다. SEMG2(A375 및 LOVO)의 더 높은 발현을 갖는 종양 세포는 항체 처리 후 T 세포에 의해 보다 효과적으로 사멸될 수 있지만, SEMG2 차단 항체 MM02 및 MM05의 투여 후 SEMG2 발현이 없는 종양 세포(DLD1, NCM460 및 NCI-H1975)의 아폽토시스 수준의 명백한 증가는 없다. 이것은 SEMG2의 양성 발현이 SEMG2-차단 항체의 투여를 위한 선택적 마커로서 사용될 수 있음을 입증한다. SEMG2 차단 항체가 항종양 면역 약물로서 사용될 때, SEMG2의 발현은 적합한 환자의 선택을 위한 중요한 지침이 된다.
도 19는 상이한 항체에 대한 SEMG2 결합의 정도를 검출하기 위한 ELISA에서 판독값으로서의 A450 흡광도를 도시한다. SEMG2로부터의 상이한 항원(왼쪽에 표시됨)을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고 HPA04276, HPA042835, MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14와 접합한 다음 항-마우스 이차 항체(HPA04276, HPA042835, MM02, MM05, MM07 및 MM08에 대해) 또는 항토끼 이차 항체(HPA04276, HPA042835에 대해)를 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. MM02, MM05, MM07, MM08, MM13 및 MM14는 모두 SEMG2(497-509) 에피토프에 결합하며 동일한 유형에 속하고; HPA04276은 SEMG2(354-403) 에피토프에 결합하고, HPA042835는 SEMG2(563-574) 에피토프에 결합한다.
도 20은 ELISA에 의해 검출된 값, 즉 OD450 흡광도를 도시한다. 이 실험에서, SEMG2(497-509) 에피토프 펩티드 및 이의 글리신 스캔 돌연변이체(즉, 아미노산이 하나씩 글리신으로 치환) 폴리펩티드를 ELISA 플레이트에 고정하고, 도면에 나타낸 바와 같이 상이한 항체에 추가로 결합시킨다. 이 실험은 상이한 단클론 항체가 결합하는 정확한 아미노산 에피토프, 및 결합 항체에 대한 각 아미노산의 상대적 중요성을 결정하는데 사용된다. 대조 항체 HPA04276 및 HPA042835는 에피토프 및 돌연변이체에 결합하지 않고; 상이한 부위의 아미노산은 항체의 결합에 다르게 기여하며; SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는 각 항체(MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14)에 의해 결합되는 중요한 아미노산은 유사하다. 이것은 차단 기능을 가진 항체가 결합 에피토프 측면에서 동일한 유형에 속한다는 것을 입증한다.
도 21은 SEMG2 및 BSA-SEMG2(497-509) 폴리펩티드에 대한 결합에 대한 완전 인간 항체 H88-67, H88-93, H88-96 및 친화도 성숙 완전 인간 항체의 농도 의존적 효과를 보여주는 ELISA의 결과를 도시한다. ELISA의 판독값인 OD450 흡광도를 세로 좌표로 사용하고, 가로 좌표는 첨가된 항체의 상이한 농도를 보여준다.
도 22는 ELISA의 결과가 SEMG2에 대한 경쟁적 결합에 대한 완전 인간 항체 및 마우스 단클론 항체의 농도 의존적 효과를 보인다는 것을 도시한다. 세로 좌표는 SEMG2와 마우스 항체 사이의 결합을 차단하는 완전 인간 항체의 비율을 보여준다. 완전 인간 항체의 농도가 증가함에 따라, SEMG2에 결합하는 마우스 항체의 검출된 신호가 점차 감소한다.
도 23은 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는 상이한 인간 항체 H88-93, H88-96 및 H88-67의 효과를 보여주는 ELISA의 결과를 도시한다. 모든 항체 농도는 10μg/mL이다. 항체 클론 H88-93, H88-96 및 H88-67은 모두 SEMG2(497-509) 에피토프를 사용하여 천연 파지 라이브러리에서 스크리닝된 완전 인간 항체이다.
도 24는 T 세포에 의한 공동-배양된 A375 및 LOVO 종양 세포의 사멸 정도, 및 사멸 효과에 대한 인간 항체 H88-93, H88-96 및 H88-67의 영향을 도시한다. 결과는 SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 3개의 항체가 T 세포에 의한 SEMG2-발현 종양 세포의 사멸을 유의하게 촉진한다는 것을 입증한다.
도 25는 생물층 간섭(Bio-Layer Interferometry)에 의해 결정된 SEMG2와 완전 인간 항체 분자 사이의 결합이 바이오센서에 고정된 SEMG2 단백질 분자에 대한 용액에서 완전 인간 항체의 결합 및 해리의 변화를 보인다는 것을 도시하며, 이에 기반하여 완전 인간 항체와 SEMG2 사이의 친화도 상수가 계산된다.
도 26은 SEMG2 항체가 A375 흑색종 마우스 생체내 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제한다는 것을 도시한다.
도 27은 총체적 형태, 다양한 조직 및 기관의 생검 검사, T 림프구의 상이한 아형의 비율 분석, 혈액 생화학, 간 기능 및 일상적인 혈액 검사의 구체적인 결과를 포함하여, 야생형 마우스와 비교한 인간 SEMG2에 상응하는 마우스 유전자 Svs3a의 동형 녹아웃에 대한 표현형 분석 결과를 도시한다.
다음은 상세한 설명에 의해 본 발명을 추가로 설명한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 출원에서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 영장류"는 포유동물 또는 비포유동물과 같은 모든 척추동물, 예를 들면 비인간 영장류, 양, 개(canine), 고양이(feline), 말(equine), 소(bovine), 닭, 래트, 마우스, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 본 발명에서, 대상체는 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "SEMG2"는 정소에 의해 분비되는 인간 정액의 주요 성분 중 하나인 인간 세메노겔린 2(human semenogelin 2)이며, 콜로이드성 물질을 형성하여 정자 세포를 코팅하여 이들의 움직임을 제한한다. 정액에서 전립선에 의해 분비되는 단백질 분해 효소 및 섬유소 분해 효소는 세메노겔린을 분해하고 정액 액화를 촉진하여, 정자가 더 자유롭게 움직일 수 있도록 한다. 문헌[Yoshida K, Karzai ZT, Krishna Z, Yoshika M, Kawano N, Yoshida M, et al., Cell Motil Cytoskeleton. 2009;66(2):99-108]을 참조한다. SEMG2 단백질로부터 단리된 "SgII A" 폴리펩티드는 항균 활성을 가지며, 서열은 H-KQEGRDHDKSKGHFHMIVIHHKGGQAHHG-OH이다. 본 발명에 기술된 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 위한 주요 아미노산 서열과는 달리, 항균 펩티드 서열은 SEMG2의 완전히 상이한 영역에 위치한다는 것을 주지해야 한다. 문헌[Edstrom AM, Malm J, Frohm B, Martellini JA, Giwercman A, Morgelin M, et al., J Immunol. 2008;181(5):3413-21]을 참조한다. 또한, SEMG2는 아연 이온에 결합하여 전립선 단백질 분해 효소 PSA의 활성에 영향을 미치는 것으로 또한 보고되었다. 문헌[Jonsson M, Linse S, Frohm B, Lundwall A, Malm J. Biochem J. 2005;387(Pt 2):447-53]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 임의의 항원-결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 함유하는 단백질 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 알려진 보다 보존적인 영역에 흩어져 있는 상보적 결정 영역(CDR)으로 알려진 초가변 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원 상호작용을 위한 결합 도메인을 함유한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 유도체를 지칭하며, 시험관내 또는 생체내에서 생성되든 간에 항원 결합 부위를 함유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 다중-클론, 단클론, 단일-특이, 다중특이, 비특이, 인간화, 단일-쇄, 키메라, 합성, 재조합, 혼성화, 돌연변이 및 이식 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "항체"는 또한 Fab, F(ab') 2, Fv, scFv, Fd, dAb 및 항원 결합 기능을 보유하는, 즉 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 항체 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 일반적으로, 이러한 단편은 항원 결합 단편을 함유할 것이다.
용어 "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인" 및 "결합 단편"은 특정 항체와 항원 사이의 결합을 담당하는 아미노산을 함유하는 항체 분자를 지칭한다. 예를 들면, 항원이 크고 항원 결합 단편이 항원의 일부에만 결합하는 경우. 즉, 항원 결합 단편과의 특이적 상호작용을 담당하는 항원 분자의 부분을 "에피토프" 또는 "항원 결정기"라고 한다.
항원 결합 단편은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 반드시 둘 다 포함할 필요는 없다. 예를 들면, 소위 Fd 항체 단편은 VH 도메인으로만 구성되지만, 온전한 항체의 항원 결합 기능 중 일부는 여전히 보유한다.
용어 "에피토프"는 결합 단편에 특이적으로 결합/인식하는 항원 결정기로서 정의된다. 결합 단편은 표적 구조 또는 인접한 에피토프에 고유한 입체형태와 특이적으로 결합/반응할 수 있으며, 입체형태 또는 불연속 에피토프는 폴리펩티드 항원이 1차 서열에서 2개 이상의 분리된 별개의 아미노산 잔기이지만, 폴리펩티드가 천연 단백질/항원으로 접힐 때 분자 표면에서 함께 응집되는 것을 특징으로 한다. 에피토프의 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄의 별도의 부분에 존재한다. 폴리펩티드 쇄가 3차원 구조로 접힐 때, 이러한 잔기가 분자 표면에 모여 에피토프를 형성한다. 대조적으로, 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기로 구성된 연속 또는 선형 에피토프는 폴리펩티드 쇄의 단일 선형 세그먼트에 존재한다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적/보호적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료가 필요한 사람들은 이미 특정 질병을 갖는 개인 뿐만 아니라 결국 질병에 걸릴 수 있는 개인을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 함유된 관심 외인성 유전자(예를 들면, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드)의 표적 세포에서의 수송, 형질도입 및 발현을 위한 분자 도구를 지칭한다. 이 도구는 전사를 개시하는 적합한 뉴클레오티드 서열, 즉 프로모터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "태그 단백질" 및 "단백질 태그"는 상호교환 가능하며, 단백질 발현, 검출, 추적 및 정제를 용이하게 하기 위해, DNA 시험관내 재조합 기술을 사용하여 표적 단백질과 융합 및 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 태그 단백질은 His6, Flag, GST, MBP, HA, GFP 및 Myc를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
실시예
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 하기 실시예에서 구현 방법은 모두 통상적인 방법이다. 본 발명은 하기의 비제한적인 실험예를 참조하여 추가로 이해될 것이다.
실시예 1: SEMG2와 CD27 사이의 결합의 검출.
인간 HEK293 세포를 10cm 직경의 배양 접시에서 공동-형질감염시켰다. pcDNA3-Flag-SEMG2 플라스미드 및 pcDNA3-HA-CD2 플라스미드를 포함하는 복합체로 공동-형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 수집하고 용해시키고, 용해물 중 CD27을 표준 면역침전 절차에 의해 농축시켰다. 면역침전에 사용된 항체는 Flag 항체이고, IgG 비특이적 항체가 대조군에 사용되었다. 면역블롯팅(웨스턴 블롯) 실험은 공동-면역침전된 CD27의 양을 검출하기 위해 HA 항체를 사용하고 면역침전된 SEMG2의 양을 검출하기 위해 Flag 항체를 사용하여 나중에 수행하였다. 면역블롯팅 분석에서, 세포를 빙상에서 30분 동안 1% Triton X-100(TBS pH7.6) 중의 Roche Complete 프로테아제 억제제에 의해 용해시키고, 불용성 물질을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 50mM DTT를 갖는 SDS 샘플 완충액 중의 용해물을 10분 동안 100℃로 가열하고, SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막(Millipore)으로 옮겼다. 세포막을 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 TBS에서 차단시키고 표시된 항체로 프로빙(probed)하였다. 밴드를 West Pico(Thermo Fisher Scientific)로 시각화하였다.
공동-면역침전 실험에서, 세포를 IP 완충액(Thermo Scientific) 및 Roche 완전 프로테아제 억제제에서 10분 동안 용해시킨 다음 실온에서 25분 동안 벤조나제(sigma)를 첨가하였다. 그후 용해물을 4℃에서 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 그후 상청액을 4℃에서 밤새 천천히 회전시키면서 일차 항체와 함께 배양한 다음 단백질 A 또는 단백질 G dynabead를 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 배양하고, PBST(0.01% Tween 20을 갖는 PBS)에서 4회 세척하고, 100℃에서 10분 동안 SDS 샘플 완충액 중의 50mM DTT로 용출시키고, SDS로 분리하고, 앞서 기술된 바와 같이 면역블롯팅하였다.
결과는 침전된 복합체를 만드는 Flag 항체를 사용한 침전은 SEMG2와 CD27을 모두 함유하는 반면 대조군은 SEMG2 또는 CD27을 함유하지 않음을 보여주었다. 실험 결과에 대해서는 도 1을 참조한다. 이 실험은 SEMG2와 인간 CD27 사이의 물리적 상호작용을 나타낸다. 또한, SEMG2와 마우스 CD27 사이의 상호작용은 상기한 동일한 방법을 사용하여 검출하였다. 이 실험에서는, HEK293 세포 형질감염을 위해 인간 CD27 대신 마우스 CD27을 사용하였으며, 다른 실험 조건은 변하지 않고 유지하였다. 실험 결과는 도 1에 나타내어져 있다. 이 실험은 SEMG2와 마우스 CD27 사이의 물리적 상호작용을 나타낸다.
상기 공동-형질감염 실험 조건하에서, 10cm 접시에 미리 배치된 세포 슬라이드를 고정하고, 투과화하고, 차단하고, CD27 및 SEMG2에 대해 동시에 HA 태그(마우스 항) 및 Flag 태그(토끼 항)를 함유하는 항체로 추가 면역표지한 다음 이차 항체로 표지하여 각각 적색 및 녹색을 보인다. 세포에서 SEMG2와 CD27의 공동-국소화를 형광 공초점 현미경하에 관찰하였다. 결과는 도 2에 나타내어져 있다. 공동-발현된 SEMG2 및 CD27 단백질은 세포에서 명백한 공동-국소화를 보였으며, 국소화 패턴은 심지어 거의 동일하였다. 이것은 SEMG2와 CD27 단백질 간의 결합의 발견과 일치한다.
실시예 2: SEMG2(497-509) 단편과 CD27 단백질 사이의 결합
SEMG2의 어느 부분이 CD27에 결합하는지 추가로 확인하기 위해, SEMG2 단백질의 단편을 설계하였다. 전장 SEMG2 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 서열의 6개 세그먼트로 나누고, GFP와 융합하여 SEMG2-P1, SEMG2-P2, SEMG2-P3, SEMG2-P4, SEMG2-P5 및 SEMG2-P6으로 명명하였다(특정 서열에 대해서는 표 1 참조, 약어는 각각 P1-P6에 상응함). 이러한 아미노산 서열을 발현하는 플라스미드를 CD27로 HEK293 세포에 동시-형질감염시키고, CD27에 결합하는 SEMG2의 주요 단편을 확인하기 위해 공동-면역침전 실험을 수행하였다. 공동-면역침전 결과는 도 3에 나타내어져 있다. SEMG2-P5만 CD27에 유의한 결합을 가진 반면 SEMG2-P1, SEMG2-P2, SEMG2-P3, SEMG2-P4 및 SEMG2-P6은 CD27에 결합하지 않았다. 상기 결과는 SEMG2-P5 단편이 CD27에 결합하는 주요 부분임을 나타낸다.
서열 번호 1 (인간 SEMG2):
MKSIILFVLSLLLILEKQAAVMGQKGGSKGQLPSGSSQFPHGQKGQHYFGQKDQQHTKSKGSFSIQHTYHVDINDHDWTRKSQQYDLNALHKATKSKQHLGGSQQLLNYKQEGRDHDKSKGHFHMIVIHHKGGQAHHGTQNPSQDQGNSPSGKGLSSQCSNTEKRLWVHGLSKEQASASGAQKGRTQGGSQSSYVLQTEELVVNKQQRETKNSHQNKGHYQNVVDVREEHSSKLQTSLHPAHQDRLQHGPKDIFTTQDELLVYNKNQHQTKNLSQDQEHGRKAHKISYPSSRTEERQLHHGEKSVQKDVSKGSISIQTEEKIHGKSQNQVTIHSQDQEHGHKENKISYQSSSTEERHLNCGEKGIQKGVSKGSISIQTEEQIHGKSQNQVRIPSQAQEYGHKENKISYQSSSTEERRLNSGEKDVQKGVSKGSISIQTEEKIHGKSQNQVTIPSQDQEHGHKENKMSYQSSSTEERRLNYGGKSTQKDVSQSSISFQIEKLVEGKSQIQTPNPNQDQWSGQNAKGKSGQSADSKQDLLSHEQKGRYKQESSESHNIVITEHEVAQDDHLTQQYNEDRNPIST
표 1: SEMG2 발현 단편의 작제를 위한 상응하는 아미노산 서열
Figure pct00003
SEMG2-P5 서열과 CD27 사이의 결합에서 주요 아미노산을 추가로 확인하기 위해, SEMG2(497-509) 단편을 선택하고 SEMG2-P7로 명명하였다(특정 서열은 QIEKLVEGKSQIQ이고, P7 또는 SP7로 약칭됨). SEMG2-P7(497-509), SEMG2-P5(양성 대조군), SEMG2-P4(음성 대조군) 또는 SEMG2-P6(음성 대조군)을 각각 인간 CD27 및 마우스 CD27을 포함하는 HEK293 세포에 CD27로 공동-형질감염시켰다. 나중에 수행된 공동-면역침전 실험의 결과는 SEMG2-P7과 SEMG2-P5가 모두 CD27에 결합하며, 인간 CD27과 마우스 CD27의 결과는 동일하였음을 보여주었다. 실험 결과는 도 4에 나타내어져 있다. 이 공동-면역침전 실험은 SEMG2(497-509)가 인간 및 마우스 CD27에 결합하는 주요 구조임을 확인시켜 주었다.
실시예 3: 글리신 스캐닝 방법을 사용하여 CD27에 결합하는 SEMG2의 주요 아미노산의 정확한 특성화
더 높은 분해능(resolution)으로 CD27에 결합하는 SEMG2의 에피토프를 특성화하고, CD27 단백질에 결합하는 SEMG2(497-509)의 각 아미노산의 기여도를 보다 정확하게 입증하기 위해, SEMG2(497-509)의 각 아미노산을 글리신으로 하나씩 대체하였으며 생성된 서열은 1-13으로 번호가 매겨진 돌연변이 아미노산 서열이다(도 5 참조). 이러한 돌연변이 플라스미드 및 CD27 발현 벡터를 HEK293 세포에 공동-형질감염시키고, CD27에 결합하는 GFP-융합된 1-13개 폴리펩티드 변이체의 정도를 공동-면역침전 분석에 의해 검출하였다. 실험 결과는 도 5에 나타내어져 있으며, 여기서 돌연변이체 5 및 9는 CD27에 대한 결합을 완전히 상실하고; 돌연변이체 11 및 13은 CD27에 대한 SEMG2(497-509)의 결합에 영향을 미치지 않았고; 다른 부위(1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12)의 돌연변이체는 SEMG2(497-509)와 CD27 사이의 결합을 어느 정도 약화시켰다. 따라서, SEMG2의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 508의 아미노산이 CD27에 대한 결합에 명백한 효과를 가짐을 알 수 있다. 펩티드 서열 497-509를 BSA에 결합시키고, 96-웰 마이크로플레이트에 코팅하였다. 상이한 농도의 CD27-hFc를 일차 항체로 사용하여 펩티드 서열에 결합하는 CD27의 능력을 검출하였다. 실험 결과는 도 6에 나타내어져 있다. 결과는 SEMG2에 대한 결합에 대한 CD27 농도의 영향이 존재함을 입증한다.
실시예 4: 종양 세포에 의해 발현되는 SEMG2는 면역 세포에 의한 종양 사멸 효과를 억제한다
종양 세포의 T 세포-매개된 사멸 분석. HCT116 인간 결장직장암 세포를 SEMG2 발현 벡터 또는 대조군 빈 벡터로 안정적으로 형질감염시키고, 활성화된 PBMC와 공동-배양한 후 아폽토시스성 세포의 비율을 카스파제3/7 용해 분석(녹색 형광 분석)에 의해 결정하였다. 구체적으로, SEMG2를 안정적으로 발현하는 HCT116 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; #70025, 줄기 세포)를 각각 100ng/mL의 CD3 항체, 100ng/mL의 CD28 항체 및 10ng/mL의 IL2(#317303, #302913, #589102, BioLegend)로 활성화시키고, 형광 카스파제-3/7 기질의 존재하에 10:1의 비율로 결장직장암 세포(#4440, Essen Bioscience)와 공동-배양하였다. 10시간 후, 형광 현미경하에서 세포를 관찰하였다. 결과는 도 7에 나타내어져 있다. 대조군 세포와 비교하여, SEMG2를 과발현하는 종양 세포는 활성화된 PBMC와의 공동-배양 후 유의하게 감소된 아폽토시스를 나타내었다. 이 실험의 결과는 SEMG2가 면역 세포 기능을 억제하는 역할을 한다는 것을 뒷받침한다.
실시예 5: 상이한 종양 세포에서 SEMG2 발현의 검출
LOVO 결장직장암, RKO 결장직장암, PC3 전립선암, A375 악성 흑색종, SW1116 결장직장암, DLD1 결장직장암, HEK293 인간 신장 상피 세포주, HepG2 간세포 암종, NCM460 인간 정상 결장 상피 세포, NCI-H1975 인간 비소세포 폐 선암종, CaCo2 결장 선암종, HT29 결장직장 선암종, SW1990 인간 췌장 선암종, AGS 인간 위 선암종, SW480 결장직장암, SaOS2 골육종, GES-1 인간 위점막 세포 등을 포함하는 상이한 유형의 인간 종양 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소를 갖는 세포 배양기에서 10% 송아지 혈청을 함유하는 DMEM 배지와 함께 배양하였다.
면역블롯팅 분석에서, 세포를 빙상에서 30분 동안 1% Triton X-100(TBS pH7.6) 중의 Roche 완전 프로테아제 억제제에 의해 용해시키고, 불용성 물질을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 50mM DTT를 갖는 SDS 샘플 완충액 중의 용해물을 100℃로 10분간 가열하고, SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막(Millipore)으로 옮겼다. 세포 막을 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 TBS에서 차단시키고 SEMG2 및 내부 대조군 GAPDH에 대해 특이적으로 각각 일차 항체로 프로빙하였다. 일차 항체를 HRP-접합된 이차 항체로 표지하였다. 밴드를 West Pico(Thermo Fisher Scientific)로 시각화하였다. 결과는 도 8에 나타내어져 있으며, 이것은 SEMG2는 GES-1 인간 위 점막 세포 및 NCM460 인간 정상 결장 상피 세포에서는 발현되지 않았지만, LOVO 결장직장암, RKO 결장직장암, PC3 전립선암, A375 악성 흑색종, SW1116 결장직장암, HEK293 인간 신장 상피 세포주, HepG2 간세포 암종, CaCo2 결장 선암종, HT29 결장직장 선암종, AGS 인간 위 선암종, SW480 결장직장암 및 SaOS2 골육종을 포함하는 다중 유형의 악성 종양 세포에서 관찰 가능하게 발현되었음을 나타낸다. 이 결과는 SEMG2가 종양에서 편재적으로 발현되는 단백질임을 입증한다.
실시예 6: 면역조직화학(IHC)을 사용한 상이한 종양 세포에서의 SEMG2 발현의 검출
면역조직화학 염색을 위해, Shanghai Xinchao Biotechnology Company로부터 다양한 종양의 조직 칩을 수득하였다. 간단히 말해서, 조직 표본을 항-SEMG2 항체(HPA042767, Sigma Aldrich에서 구입, 1:100 희석) 및 비오틴-접합된 이차 항체와 함께 배양한 다음 항-비오틴-비오틴-퍼옥시다제 복합체와 배양하고, 발색 시약 아미노에틸카바졸로 관찰하였다. 조직학적 점수로서, 염색 강도를 4개 그룹으로 나누었다: 높음(3), 중간(2), 낮음(1), 및 음성(0).
첫째, 결장직장암 종양의 조직 칩에서 SEMG2의 발현을 염색하고, 정상 결장직장 조직을 대조군으로서 사용하였다; 결장직장암 조직에서 SEMG2의 발현이 광범위하게 높은 것으로 밝혀졌다. 결과는 도 9에 나타내어져 있다.
다음으로, 상이한 폐암 조직에서 SEMG2의 발현을 염색하고, 정상 폐 조직을 대조군으로 사용하였다; 폐암 조직에서 SEMG2의 발현이 광범위하게 높은 것으로 밝혀졌다. 결과는 도 9에 나타내어져 있다.
다시, 전립선암, 흑색종 및 위암에서 SEMG2의 양성 발현을 염색하였고, 결과는 도 9에 나타내어져 있다.
마지막으로, 조직 칩 염색에 기반하여, 표시된 상이한 종양 유형에서 SEMG2 발현의 양성 비율을 계산하였다. 양성 발현은 면역조직화학 염색에서 중등도 또는 강한 양성 발현으로서 정의하였다. 조직 칩(각 칩은 50개 이상의 조직 샘플을 포함함)에 기반한 통계적 결과는 도 9에 백분율로 나타내어져 있다.
실시예 7: 높은 SEMG2 발현과 불량한 종양 예후 사이의 연관성의 입증
면역조직화학 염색에서, Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltd.로부터 다양한 종양의 조직 칩을 수득하였으며, 이들 모두 생존 시간 정보의 추적 데이터를 갖는다. 면역조직화학적 검출은 실시예 6에 기술된 방법으로 수행하였다. 결장직장암을 예로 들면, 환자를 SEMG2의 발현에 따라 분류하고 두 개 그룹으로 나누었다: 높은 SEMG2(면역조직화학 점수 2, 3)와 낮은 SEMG2(면역조직화학 점수 0, 1). 카플란-마이어 방법을 사용하여 두 환자 그룹의 전체 생존을 비교하였다. 결과는 도 10에 나타내어져 있다. 높은 SEMG2 발현을 갖는 환자의 생존은 낮은 SEMG2 발현을 갖는 종양 환자의 생존보다 유의하게 짧은 것으로 밝혀졌다. 또한 폐암(P<0.05) 및 위암(P<0.05)과 같은 다른 종양에서도 이러한 유의한 상관관계가 있었다. 상기 결과는 SEMG2가 종양 면역 회피의 핵심 분자이며 새로운 항종양 표적으로 작용할 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 높은 SEMG2 발현과 면역억제 기능을 갖는 조절 T 세포( Treg )의 침윤 간의 상관관계의 확인
종양 조직에서 SEMG2 발현과 면역억제 기능을 갖는 조절 T 세포(Treg)의 침윤 간의 상관관계를 분석하기 위해, 면역조직화학 분석을 사용하여 Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltd로부터 구입한 다양한 종양 조직 칩을 조사하였다. 폐암을 예로 들면, (Foxp3 항체로 표지된) 종양 조직에서 Treg의 침윤을 SEMG2의 발현에 따라 비교하였다. SEMG2의 발현이 높을수록 Treg가 더 많이 침윤되는 것으로 밝혀졌다(조직간 통계적으로 유의한 차이가 있었다, P<0.05), 도 11 참조. 결과는 SEMG2의 발현이 종양의 국소 면역 미세환경과 유의하게 상관관계가 있으며, SEMG2의 발현이 면역억제 상태의 바이오마커 및 종양 면역조절제의 동반 진단 마커로서 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 9: SEMG2(497-509) 단편을 면역원으로 사용한 항체의 제조
구체적으로, 다음 단계가 포함된다: (1) 항원 준비, SEMG2(497-509), 즉 "QIEKLVEGKSQIQ" 서열에 따라 폴리펩티드를 합성하고, 면역화를 위해 VLP 담체에 결합시키고; 전장 SEMG2 단백질(Cusabio로부터 구입, 카탈로그 번호 CSB-YP021002HU)을 다른 그룹을 위한 면역원으로 사용한다. (2) 1차 면역화: 가위로 토끼의 양쪽 뒷발 토끼털 일부를 제거하고, 알코올과 요오드로 피부를 소독한다. 2mL 주사기를 사용하여 프로인트 완전 아쥬반트(FCA)로 유화된 1mL의 항원 용액을 흡인시키고, 0.5mL를 각 발바닥에 피하 주사한다. (3) 2차 면역화: 10-14일 간격 후, 항원 용액을 양측 함요 및 사타구니의 부어오른 림프절에, 각 림프절에 0.1mL, 나머지 림프절 근처 피부 아래에 1mL를 주사한다. 림프절이 부어오르지 않거나 부어오름이 뚜렷하지 않은 경우에는, 양측 함요와 사타구니 피하에 직접 주사한다. (4) 7-10일 간격 후, 귀정맥에서 0.5-1.0mL의 혈액을 채취하고, 혈청을 분리하고, 10μg/mL의 항원을 코팅한 간접 ELISA를 이용하여 혈청 역가를 측정한다. 역가가 1:64,000 이상인 경우 혈액을 수집한다. (5) 역가가 요건을 충족하지 않으면, 면역화를 위해 아쥬반트(adjuvant) 없는 항원 액체를 귀 정맥에 주사한다. 즉, 1주일 이내에 각각 0.1, 0.3, 0.5mL씩 3회 주사한다. 1주일 간격 후 혈액 검사를 반복한다. 역가가 요건을 충족하면, 즉시 혈액을 채취하고, 모든 항혈청을 수집한다.
다클론 항체 정제를 위한 특정 실험 단계는 다음을 포함한다: (1) 단백질 A 세파로스 CL-4B 친화성 컬럼의 제조. 10mL의 단백질 A 세파로스 CL-4B 패킹을 제조하기 위해, 진공 플라스크에 동일한 용적의 패킹 및 TBS 완충 용액을 혼합하고, 교반하고 15분 동안 진공처리하여 패킹 내의 기포를 제거한다. 펌프를 사용하여 유리 컬럼에 단백질 A 세파로스 CL-4B 패킹을 천천히 첨가하여 충전 속도를 1mL/min-2mL/min으로 제어하고, 컬럼 건조를 방지하고, 미리 냉각된 TBS 완충 용액을 베드 용적의 10배로 사용하여 컬럼을 평형화시킨다. (2) 항혈청의 제조. 단백질 응집을 피하기 위해 항혈청을 얼음물 또는 4℃ 냉동고에서 천천히 해동시킨다. 단백질 해동 과정에서 나타나는 응집물을 37℃에서 예열하여 용해시킬 수 있다. 고체 아지드화나트륨을 0.05% 농도로 가하고, 15,000 Х g로 4℃에서 5분간 원심분리하고, 청정화된 항혈청을 제거하고 필터를 통해 여과하여 과잉 지질을 제거한다. (3) 친화성 크로마토그래피. 항체를 TBS 완충 용액으로 1:5로 희석시키고 필터를 통해 여과한다. 0.5mL/min의 속도로 항혈청을 컬럼에 부하한다. 항혈청이 패킹에 결합되도록 하기 위해, 컬럼을 연속적으로 2회 부하해야 하며 부하 유출물은 유지되어야 한다. Aλ280nm<0.008이 될 때까지 TBS 완충 용액으로 컬럼을 세척하고, pH 2.7 용출 완충 용액을 첨가하고, 모든 단백질이 아래로 흘러내릴 때까지 0.5mL/min의 속도로 용출시킨다. 별도의 튜브에 용출물을 수집하기 위해 100μL의 중화 완충 용액이 추가된 1.5mL EP 튜브를 사용한다. 혼합 후, 용출물의 pH를 pH 시험지로 확인한다. pH가 7보다 낮으면, 중화 완충액을 사용하여 약 pH 7.4로 조정하여 항체 변성을 방지한다. 10mL의 용출 완충 용액, pH 1.9를 컬럼에 추가하고, Aλ280nm<0.008이 될 때까지 방법에 따라 용출물을 수집한다. 분광광도계를 사용하여 각 튜브의 단백질 함량을 결정하였다.
실시예 10: 항체 제제에서 면역원으로서 SEMG2(497-509)와 전장 SEMG2 간의 차단 효과 비교
SEMG2(497-509) 서열 단편은 SEMG2가 CD27에 결합하는 핵심 에피토프이고 비교적 짧은 서열을 갖기 때문에, SEMG2(497-509)를 면역원으로 사용하여 항체를 제조하며, 이것은 항체를 제조하기 위해 전장 SEMG2를 사용하는 것보다 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는 기능을 가진 기능성 항체 분자를 수득하는데 이론적으로 더 쉽다. 직접 비교를 위해, 실시예에서 ELISA를 이용하여 두 방법에 의해 항체를 생산하는 유효 농도의 차이를 확인하였다. SEMG2(497-509)를 면역원으로 사용하여 생산된 항체 및 전장 SEMG2로 생산된 항체를 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 반응 시스템에 상이한 농도(10^-2, 10^-1, 10^0, 10^1, 10^2, 10^3, 10^4 μg/mL)로 추가하였으며, ELISA 결합 값을 측정하였다. 효소-결합 면역흡착 분석의 구체적인 단계는 다음과 같다: (1) SEMG2 단백질 항원을 50mM 탄산염 코팅 완충액(pH 9.6)으로 용해시켜 항원 농도가 10μg/mL가 되도록 하고, 96-웰 ELISA 플레이트(Corning에서 구입)에 100μL/웰로 첨가하고, 4℃에서 밤새 둔다. (2) 다음날 코팅 용액을 버린 후, PBST로 3회 세척하고, 150μL의 1% BSA를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 차단한다. (3) PBST로 3회 세척한 후, 지시된 항체(SEMG2(497-509)를 면역원으로 하여 생산된 다클론 항체, 전장 SEMG2를 면역원으로 하여 생산된 다클론 항체)를 각 웰에 첨가하여 도 12에 나타낸 바와 같은 상이한 최종 농도를 만들고, 10μg/mL의 CD27-Fc 융합 단백질(즉, 인간 항체의 Fc 단편에 융합된 인간 CD27 단백질의 세포외 영역)을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양한다. (4) PBST로 5회 세척한 후, 100μl의 희석된 HRP-표지된 항인간 Fc 이차 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. (5) PBST로 5회 세척한 후, 발색제로 현상한지 20분 후에 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 A450 흡광도 값을 판독하였다.
실험 결과는 도 10에 나타내어져 있다. SEMG2(497-509)를 항원으로 하여 생산한 항체는 더 낮은 농도에서 ELISA로 검출된 SEMG2와 CD27 간의 결합을 50%까지 감소시킨 반면 SEMG2의 전장 단백질을 면역원으로 하여 생산한 다클론 항체는 더 높은 농도에서 단지 이러한 효과를 발휘하였다(필요한 용량은 전자의 300배 이상이다). 즉, SEMG2(497-509)에 의해 생산된 항체의 차단 역가는 전장 SEMG2 단백질에 의해 생산된 항체보다 300배 이상 높았다. 이것은 핵심 에피토프 SEMG2(497-509)의 인식이 차단 항체의 개발을 더 쉽게 만들고, 당업계의 숙련가들이 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 더 쉽게 차단할 수 있는 항체를 수득할 수 있게 함을 나타낸다.
실시예 11: SEMG2 (497-509) 에피토프 펩티드 및 SEMG2 전장 단백질을 사용한 마우스 단클론 항체의 제조
SEMG2(497-509) 서열을 사용하여 폴리펩티드를 합성하고 면역화를 위해 VLP 담체에 커플링시켰다; HEK293 세포를 사용하여 전장 SEMG2 단백질을 발현시키고, 순도가 92%에 도달하도록 시험하였고, CD27에 대한 SEMG2 단백질의 결합 활성을 ELISA로 확인하였다. 단백질 및 폴리펩티드 항원을 사용하여 각각 10마리의 마우스를 면역화하고, 효과를 향상시키기 위해 다중 면역화를 수행하였다: (1) 1차 면역화, 50μg/마우스의 항원, 프로인트 완전 아쥬반트(Freund's complete adjuvant)와 함께 3주 간격으로 다중 피하 주사; (2) 2차 면역화; 불완전 프로인트 아주반트와 함께 3주 간격으로 상기와 동일한 투여량 및 경로; (3) 3차 면역화, 아주반트 없이 상기와 동일한 투여량, 3주 간격으로 복강내 주사; (4) 추가 면역화, 용량 50μg, 복강내 주사. 마지막 주사한지 3일 후, 혈액을 채취하여 역가 및 면역 효과를 측정하고, 하이브리도마 융합 스크리닝을 위해 역가가 더 높은 마우스를 선택하였다. 서브클로닝 후, 표적 항원에 대한 단클론 항체의 결합을 ELISA로 검출하고, SEMG2와 CD27 간의 결합을 차단하는데 있어서의 상이한 단클론 항체의 기능을 ELISA로 측정하였다.
하이브리도마에 의해 생산된 단클론 항체를 ELISA로 스크리닝하였다. SEMG2(497-509)를 면역원으로 하여 제조된 단클론 항체 중, 19개 균주가 도 13에 나타낸 바와 같이 항체의 27개 균주의 첫 번째 배치에서 차단 기능(SEMG2와 CD27 사이의 결합을 억제)을 가졌다. SEMG2의 전장 단백질을 면역원으로 하여 제조된 단클론 항체 중, 도 13에 나타낸 바와 같이 배치에서 검증 후 총 항체의 총 108개 균주에서 차단 기능을 갖는 항체의 단지 1개의 균주가 수득되었다.
따라서, SEMG2(497-509) 에피토프 펩티드를 면역원으로 사용하여 단클론 항체를 제조하는 것이 차단 항체를 발견하는 효율을 유의하게 개선하였다. 뮤린 단클론 항체의 하위유형(표 2) 및 서열(표 3)은 다음 표에 나타내어져 있다.
표 2. 뮤린 단클론 항체의 하위유형
Figure pct00004
표 3. 뮤린 단클론 항체의 중쇄 및 가변 영역 서열
Figure pct00005
표 4. 마우스 항체의 CDR 아미노산 서열
Figure pct00006
ELISA 플레이트를 SEMG2 단백질로 코팅하고, 연속 희석된 뮤린 단클론 항체를 일차 항체로 사용하고, 항-마우스 이차 항체를 사용하여 SEMG2에 대한 뮤린 단클론 항체의 결합 능력을 검출하였다. 결과는 도 14a에 나타내어져 있다. 뮤린 단클론 항체는 SEMG2 단백질에 대해 좋은 친화성을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 12: 항-SEMG2 mAb의 인간화(humanization)
마우스 항-SEMG2 단클론 항체 MM05를 인간 환자에게 사용될 때 면역원성을 감소시키기 위해 인간화하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)의 서열을 PDB(Protein Data Bank)의 인간 항체 서열과 비교하여 상동성 모델을 확립하였다. 마우스 mAb의 중쇄 및 경쇄의 CDR을 항원 결합에 필요한 적절한 구조를 유지할 가능성이 가장 높은 인간 프레임 영역에 이식하였다. 필요한 경우 인간 잔기에서 마우스 잔기로의 역 돌연변이 또는 기타 돌연변이를 설계하였으며, 예를 들면: 인간화 경쇄 VL-V2의 위치 95에 있는 아미노산을 K에서 Q로 돌연변이시켰고 경쇄의 상응하는 CDR3 서열을 IMGT 분석에 따라 QQSYSLPWT(서열 번호 95)로 전환하였다. 인간화 VH 및 VL 영역을 각각 인간 IgG1의 중쇄 및 κ 경쇄의 불변 영역에 융합시켰다. mAb 서열에 상응하는 작제 벡터를 사용하여 293E 세포에서 일시적 형질감염을 수행하고, SEMG2 단백질에 대한 정제된 mAb의 결합 능력을 ELISA를 사용하여 분석하였다. 결과는 흡광도로 표시되며, 여기서 더 높은 흡광도는 인간화 항체와 SEMG2 사이의 더 높은 수준의 상호작용을 나타낸다. 본 발명에서 수득된 8개 인간화 항체의 CDR, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역, 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 아래 표 4 및 표 5에 나타내어져 있다. 도 14b는 SEMG2 단백질에 대한 연속 희석된 인간화 단클론 항체의 결합의 피팅 곡선을 보여주며, 결과는 인간화 항체가 SEMG2 단백질에 대한 뮤린 단클론 항체의 결합 능력을 유지함을 보여준다.
표 5. MM05 인간화 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열
Figure pct00007
실시예 13: SEMG2와 CD27 결합을 차단하는데 있어서의 SEMG2 (497-509) 에피토프 -특이 항체와 기타 에피토프-특이 항체 간의 기능적 비교
차단 항체의 제조를 위한 SEMG2(497-509) 에피토프의 중요성을 입증하기 위해, SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는데 있어서의 상이한 SEMG2 에피토프에 대한 항체의 기능을 추가로 비교하였다. 기존의 상용 항체인 HPA042767 및 HPA042835(둘 다 Sigma Aldrich Company에서 구입)는 각각 SEMG2(354-403) 및 SEMG2(563-574)의 에피토프에 대한 토끼 다클론 항체인 것으로 알려져 있다.
먼저, SEMG2(497-509) 에피토프-특이 항체(예를 들면, MM02, MM05)를 상이한 농도 범위에서 SEMG2와 CD27 간의 결합을 차단하는데 있어서의 이들의 기능에 대해 다른 에피토프-특이 항체(예를 들면, HPA042767)와 비교하였다. SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 상기 항체의 결합은 ELISA에 의해 확인하였다: 도 15a에 도시된 바와 같이 MM02 및 MM05는 SEMG2(497-509)에 결합할 수 있는 반면 HPA042767은 광범위한 농도에서 이 에피토프에 결합할 수 없었다. SEMG2와 CD27 사이의 결합에 대한 상이한 항체(비관련 마우스 IgG, MM02, MM05, HPA042767)의 차단 기능을 실시예 11에 기술된 바와 같이 ELISA 실험에 의해 분석하였다. 도 15b에 나타낸 바와 같이, MM02 및 MM05의 농도가 증가함에 따라, SEMG2와 CD27의 결합은 점차 감소하였고, 이 현상은 비관련 마우스 IgG 및 HPA042767 항체 둘 다에 대해 관찰되었으며, 이는 후자가 광범위한 농도에서 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는 기능을 가지고 있지 않음을 나타낸다. 이러한 결과는 차단 항체를 제조하는데 있어서의 SEMG2(497-509) 에피토프의 중요성을 뒷받침한다.
또한, SEMG2와 CD27 사이의 결합에 대한 상이한 항체의 효과를 동일한 항체 농도 조건하에서 비교하였다. ELISA에서는, 동일한 농도(10μg/mL)의 항체를 사용하였으며, SEMG2와 CD27 사이의 결합 강도를 측정하였다. 결과는 도 16에 나타내어져 있다. SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 MM02, MM05, MM07, MM08, MM13 및 MM14 항체는 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 유의하게 감소시킨 반면; SEMG2의 다른 에피토프에 대한 HPA042767 및 HPA042835 항체 중 어느 것도 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 감소시키지 않았다.
실시예 14: 활성화된 PBMC에 의한 종양 세포 사멸에서 SEMG2 (497-509) 에피토프 -특이 항체와 기타 에피토프-특이 항체 간의 효과적인 비교
실시예에서, SEMG2는 활성화된 PBMC가 종양 세포를 사멸시키는 것을 억제하는 기능을 발휘한다. SEMG2는 CD27에 결합함으로써 위의 역할을 할 수 있고 SEMG2(497-509) 에피토프가 CD27 결합을 위한 핵심 부위이기 때문에, SEMG2(497-509) 에피토프-특이 항체는 PBMC에 의한 종양 세포 사멸에 대한 SEMG2의 영향을 중화시킬 수 있다.
상기 가설을 시험하기 위해, 활성화된 PBMC에 의한 종양 세포 사멸에 대한 상이한 에피토프-특이 항체의 효과를 비교하였다. 구체적으로, SEMG2를 고도로 발현하는 A375 인간 흑색종 및 LOVO 인간 결장직장암 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; #70025, 줄기 세포)를 각각 100ng/mL의 CD3 항체, 100ng/mL의 CD28 항체, 및 10ng/mL의 IL2(#317303, #302913, #589102, BioLegend)로 활성화시키고, 형광 카스파제-3/7 기질(#4440, Essen Bioscience)의 존재하에 상기 종양 세포와 10:1의 비율로 공동-배양하였다. 10시간 후, 세포를 형광 현미경하에서 세포를 관찰하였다. 결과는 도 17에 나타내어져 있다. HPA042767 또는 HPA042835 항체 중 어느 것도 종양 세포를 사멸시키는데 활성화된 PBMC에 영향을 미치지 않은 반면; SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 MM02, MM05, MM07, MM08, MM13 및 MM14 항체는 아폽토시스 종양 세포 비율을 유의하게 증가시켰다. 상기 결과는 SEMG2(497-509) 에피토프-특이 항체가 SEMG2의 활성을 중화할 수 있음을 나타낸다(즉, PBMC에 의한 종양 세포 사멸에 대한 SEMG2의 억제 효과를 제거).
실시예 15: PBMC에 의한 종양 세포 사멸에서 SEMG2의 발현 수준과 차단 항체의 촉진 기능 사이의 상관관계 확인
SEMG2의 발현은 종양-특이 면역의 억제를 위한 전제조건이기 때문에, SEMG2의 발현은 SEMG2-차단 항체 투여의 적합성을 위한 잠재적 조건이기도 하다. 이론적으로, 높은 SEMG2 발현을 갖는 종양 세포는 SEMG2 활성의 중화 후 PBMC에 의한 종양 세포 사멸의 상대적 증가를 가질 것이며; SEMG2를 발현하지 않는 종양 세포는 면역 회피 기능을 수행하기 위해 SEMG2에 의존하지 않을 수 있으며, 따라서 PBMC에 의한 종양 세포 사멸은 SEMG2 활성의 중화 후 유의한 변화를 생성하지 않을 수 있다.
상기 가설을 검증하기 위해, 높은 SEMG2 발현을 갖는 종양 세포(A375, LOVO) 및 SEMG2-음성 종양 세포(DLD1, NCM460 및 NCI-H1975)를 선택하였다. 종양 세포에 대한 PBMC 사멸 실험 동안 상이한 항체(비관련 마우스 IgG 항체, MM02 또는 MM05 항체)를 첨가하였다. 결과는 도 18에 나타내어져 있다. MM02 및 MM05 항체는 활성화된 PBMC에 의한 SEMG2-양성 종양 세포(A375, LOVO)의 사멸을 유의하게 증가시켰지만 SEMG2-음성 종양 세포(DLD1, NCM460 및 NCI-H1975)의 사멸에는 명백한 영향을 미치지 않았다. 따라서, 상기 실험 결과는 SEMG2의 양성 발현이 SEMG2 및 CD27 차단 항체의 투여에 대한 스크리닝 조건, 즉 상응하는 바이오마커임을 나타낸다.
실시예 16: SEMG2와 CD27 간의 결합을 차단하기 위한 항체의 관련 에피토프의 정확한 정의
차단 항체(즉, SEMG2와 CD27 간의 결합을 억제할 수 있는 항체)와 비차단 항체의 결합 에피토프를 명확하게 구별하기 위해, 상응하는 ELISA 분석 방법을 확립하였다. 구체적으로, SEMG2 전장 단백질(1-582), SEMG2(354-403) 단편, SEMG2(442-453) 단편, SEMG2(497-509) 단편 및 SEMG2(563-574) 단편을 ELISA 플레이트에 고정하고, 동일한 농도의 항체(MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14, HPA042767 및 HPA042835)를 추가하였다. 그후 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체를 사용하여 상응하는 결합된 항체를 검출하였다. 결과는 도 19에 나타내어져 있다. MM02, MM05, MM07, MM08, MM13 및 MM14는 모두 SEMG2(497-509) 에피토프에 결합하고, HPA042767은 SEMG2(354-403) 에피토프에 결합하며, HPA042835는 SEMG2(497-509) 에피토프에 결합하는 반면 항체 중 어느 것도 SEMG2(442-453) 대조군 단편에 결합하지 않았다. 이러한 결과는 항체의 표지 특이성을 뒷받침친다.
차단 항체 MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14가 결합하는 정확한 에피토프(단일 아미노산의 수준에 특이적임)를 추가로 정확하게 정의하기 위해, 상응하는 ELISA 분석 방법을 확립하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, SEMG2(497-509) 폴리펩티드 및 글리신으로 하나씩 치환된 폴리펩티드 서열의 그룹(글리신 돌연변이 스캐닝 서열 그룹)을 ELISA 플레이트에 고정하고, 동일한 농도의 항체(MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14, HPA042767 및 HPA042835)를 각각 추가하였다. 그후 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체를 사용하여 상응하는 결합된 항체를 검출하였다. 결과는 도 20에 나타내어져 있다. HPA042767 및 HPA042835 항체는 서열에 결합하지 않았으며, 이는 실험의 특이성 및 두 가지 유형의 항체의 상이한 에피토프 부류를 나타낸다. 한편, SEMG2(497-509) 서열의 상이한 아미노산은 글리신으로 치환 후 유사한 차단 항체(MM02, MM05, MM07, MM08, MM13, MM14)의 결합에 대해 상이한 정도의 영향을 미쳤다. 예를 들면: 위치 507 및 509에서 아미노산의 치환은 MM02 및 유사한 항체의 결합에 유의한 영향을 미치지 않았고; 위치 501 및 506에서 아미노산의 치환은 MM02 및 유사한 항체의 결합에 유의한 영향을 미쳤고(70% 이상의 감소); 다른 부위의 아미노산은 글리신으로 치환 후 MM02 및 유사한 항체의 결합에 어느 정도 영향을 미쳤다. 결과는 MM02 및 유사한 항체(즉, SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는 항체)와 관련된 에피토프 아미노산, 및 결합에 대한 각 아미노산의 기여를 정확하게 정의한다. 또한, 차단 항체에 대한 결합에 관여하는 SEMG2의 주요 아미노산은 CD27에 대한 결합에 관여하는 아미노산과 매우 일치하며, 이는 MM02 및 이의 유사한 항체가 SEMG2에 결합하기 위해 CD27과 경쟁한다는 것을 나타내며, 이는 항체 기능의 분자 메커니즘을 검증한다.
실시예 17: SEMG2와 CD27 간의 결합을 차단하고 PBMC에 의한 종양 세포 사멸을 촉진하기 위해 SEMG2 (497-509) 에피토프를 사용한 완전 인간 항체의 제조 및 스크리닝
실시예의 결과는 차단 항체의 제조에 있어서의 SEMG2(497-509) 에피토프의 중요성을 보여주었으며, 이 에피토프가 완전 인간 항체의 스크리닝에 적용되었다. 구체적으로, 폴리펩티드 항원의 제조 및 인간 천연 항체 라이브러리(natural antibody library)의 스크리닝(screening)을 먼저 수행하였다. SEMG2(497-509) 폴리펩티드를 합성하고 BSA 및 KLH에 각각 커플링시키고, 완전 인간 파지 디스플레이 항체 라이브러리에서 스크리닝하였다. ELISA를 사용하여 예비 스크리닝을 위해 항원성 에피토프에 결합하는 클론을 선택하였다. 단일 콜로니를 서열분석한 후 상이한 고유 서열을 수득하고, 친화도 분류에 따라 분류하였으며, 전장 항체는 비교적 높은 친화도를 갖는 항원-결합 단편(Fab)으로부터 작제하였다. 결합 능력 및 차단 기능 시험은 정제 후 수행하였으며, 즉 SEMG2와 CD27 간의 결합에 대한 항체의 효과는 ELISA 실험에 의해 결정하였다.
동일한 스크리닝 배치에서, SEMG2(497-509) 에피토프에 결합하고 SEMG2 및 CD27의 결합을 억제하는 항체의 총 3개의 고유 서열을 수득하였다. 3개의 클론은 각각 H88-93, H88-96 및 H88-67로 명명되었다. SEMG2 결합에 대한 상응하는 전장 항체 농도의 효과는 도 22a에 나타내어져 있다. 3개의 완전 인간 항체 및 상응하는 CDR 서열에 상응하는 VH 및 VL의 아미노산 서열은 표 6 및 표 7에 나타나 있다.
표 6. 완전 인간 항체의 가변 영역 서열
Figure pct00008
표 7. 인간 항체의 CDR 아미노산 서열
Figure pct00009
SEMG2에 대한 완전 인간 항체 및 뮤린 항체의 결합 능력을 시험하였으며, 즉 뮤린 항체 MM02 및 MM05 및 농도 구배 희석된 완전 인간 항체 H88-93을 혼합하고 SEMG2로 코팅된 96-웰 마이크로플레이트에서 일차 항체로서 첨가하였다. SEMG2에 결합된 뮤린 단클론 항체를 항-마우스 HRP 이차 항체를 사용하여 측정하였다. 차단률 퍼센트는 다음 공식에 따라 계산된다:
차단률 = [1-(실험 항체 그룹의 A450-블랭크 대조군)/(양성 대조군 항체의 A450 - 빈 대조군의 A450)]Х100%
결과는 도 22에 나타낸 바와 같이 H88-93이 SEMG2에 결합하기 위해 MM02 및 MM05와 경쟁한다는 것을 보여준다. 이는 완전 인간 항체 및 뮤린 단클론 항체가 SEMG2에 결합하는 동일한 유형의 항체이고, MM02, MM05 및 H88이 모두 짧은 펩티드 SEMG2(497-509)에 결합하기 때문에, 이러한 유형의 항체는 SEMG2(497-509) 결합 항체의 부류로서 정의될 수 있음을 보여준다.
또한, SEMG2와 CD27 사이의 결합을 차단하는데 있어서의 인간 항체 H88-93, H88-96 및 H88-67의 효과를 ELISA에 의해 검출하였다. 10μg/mL 농도의 모든 항체는 도 23에 나타낸 바와 같이 다양한 정도로 SEMG2와 CD27 사이의 결합을 억제하였다.
종양 세포 사멸에 대한 활성화된 PBMC의 기능에 대한 인간 항체의 효과를 확인하기 위해, A375 및 LOVO 세포를 활성화된 PBMC와 공동-배양하고, H88-93, H88-96 또는 H88-67 항체를 동일한 시간에 첨가하고, 종양 세포의 아폽토시스 비율을 검출하였다. 결과는 도 24에 나타내어져 있으며, 이는 SEMG2(497-509) 에피토프에 대한 3개의 완전 인간 항체가 PBMC 세포에 의한 SEMG2-발현 종양 세포의 사멸을 유의하게 촉진할 수 있음을 나타낸다.
실시예 17: 생물광학 간섭계에 의한 항원에 대한 본 발명의 단클론 항체의 결합 동역학 결정
인간 SEMG2에 결합하는 본 발명의 항체의 평형 해리 상수(KD)는 생물층 간섭계(ForteBio Bltz 또는 Gator 기기)에 의해 결정하였다. 예를 들면, ForteBio 친화도 분석은 기존 방법에 따라 수행하였으며, 즉, 시작 30분 전에, 적당량의 AMQ(Pall, 1506091)(샘플 검출용) 또는 AHQ(Pall, 1502051)(양성 대조군 검출용) 센서를 취하고 SD 완충액(PBS 1Х, BSA 0.1%, Tween-20 0.05%)에 침지시켰다. 100μl의 SD 완충액, 항체 및 SEMG2를 각각 96웰 흑색 폴리스티렌 반 면적 마이크로플레이트에 첨가하였다. 샘플 위치 레이아웃을 기반으로 센서 위치를 선택한다. KD 값을 분자 상호작용 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 검정의 실험에서, 뮤린 단클론 항체 및 인간 항체 H88-67, H88-93 및 H88-96의 친화도 상수는 표 8에 나타내어져 있고, SEMG2 및 상응하는 단백질의 친화도 및 해리 곡선은 도 25에 나타내어져 있다.
표 8. 생물층 광학 간섭계에 의한 항원-항체 결합 검출을 위한 친화도 상수(평형 해리 상수)
Figure pct00010
실시예 18: 완전 인간 단클론 항체의 친화도 성숙
완전 인간 항체 H88-96 및 H88-67의 VH 및 VL 코딩 서열로부터 작제된 플라스미드를 주형으로 사용하여, 유전자 합성에 의해 플라스미드를 수득한 다음 단일점 및 이중점 포화 돌연변이를 만들었다. 그후, 항체 유전자를 재조합하기 위해 시험관내 결찰 방법을 수행하였다. 마지막으로, 재조합 항체의 Fab 유전자 서열을 벡터에 삽입한 다음 형질전환하여 108CFU 이상의 역가를 갖는 4개의 파지 친화도-성숙 항체 라이브러리를 수득하였다. 항체 돌연변이 라이브러리를 면역관(immunotube) 구배 스크리닝 분석에 의해 스크리닝하고, 야생형에 비해 친화도가 잘 개선된 돌연변이체를 수득하였다. 그후 검출된 Fab 서열 또는, Fab 서열에서 VH 및 VL 서열의 재조합에 따라 전장 친화도 성숙 인간 항체를 작제하였다. 친화도 성숙 후 H88-67로부터 유래된 VH 및 VL 서열 및 H88-96의 VH 서열의 CDR 영역이 표 9에 나타내어져 있고, 항체의 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역이 표 9에 나타내어져 있다.
표 9. 친화도 성숙된 완전 인간 항체에 상응하는 CDR 서열
Figure pct00011
표 10. 친화도 성숙된 완전 인간 항체에 상응하는 VH 및 VL 서열
Figure pct00012
상기 친화도 성숙 과정을 통해, 67-3으로 번호매겨진 친화도-성숙 중쇄 및 67-3, 67-4, 67-5 및 67-6으로 번호매겨진 친화도-성숙 경쇄 서열의 조합으로 구성된 67-3-67-3, 67-3-67-4, 67-3-67-5 및 67-3-67-6과 같은 친화도가 개선된 항인간 SEMG2 단클론 항체를 수득하였으며, 항체 67-9-67-3은 67-9로 번호매겨진 중쇄 및 67-3으로 번호매겨진 경쇄의 조합으로 구성되고, 항체 67-6-67-6은 67-6으로 번호매겨진 경쇄 및 중쇄의 조합으로 구성되고, 항체 96-10R-10 및 96-10V-10은 96-10R 및 96-10V로 번호매겨진 중쇄 및 H88-96L의 경쇄에 의해 재구성된다. 이들 경쇄 및 중쇄로 구성된 재조합 단클론 항체는 SEMG2 및 BSA-S2(497-509)(즉, BSA-SP7)에 대해 모 항체의 친화도보다 10배 이상 높은 친화도를 갖는다(도 21b-d 참조).
실시예 19: 인간 악성 흑색종 A375 세포에서 PBMC -HIS 모델의 이종이식 모델에서의 SEMG2 항체의 항종양 효과의 검증
6-8주령의 수컷 NPSG 마우스 모델 30마리의 체중을 측정하였다. A375 세포(SEMG2의 내인성 발현이 확인됨)를 시험관내에서 배양하여 1.8×108개 세포를 수득하였다. 30마리의 마우스에 PBMC를 접종한 후, 3일째에 A375 종양 세포를 접종하였다. 그후, 마우스 혈액에서 hCD45+ 세포의 비율 및 체중을 주 1회 측정하였다. 접종 후, 종양 체적을 주 1회 측정하고, 평균 종양 체적이 약 40-80mm3에 도달했을 때 마우스 혈액에서 hCD45+ 세포의 비율을 측정하였다. 마우스를 종양 체적 및 마우스 혈액에서의 hCD45+ 세포의 비율에 기반하여 무작위로 그룹화하고, 투여를 즉시 시작하였다. 투여를 시작한 날짜를 0일로 간주하였다. 투여 섭생: SEMG2 항체(MM05 클론)를 5mg/kg으로 주 3회 복강내 주사하였다. 투여 시작 후, 매주 마우스의 종양 성장 상태를 관찰하였다. 종양 성장 후, 체중 및 종양 체적을 주 3회 측정하고, 마우스 혈액에서 hCD45+ 세포의 상대적인 수를 주 3회 유세포 분석법으로 모니터링하였다. 종양 체적이 종점에 도달했을 때, 혈액을 채취하고 동일한 인덱스를 검출하고 실험을 종료하였다. 마우스의 관찰은 다음을 포함한다: 매일 관찰, 접종 후 모든 작업일에 동물 이환율 및 사망 관찰. 종양 체적의 측정: 접종 후 및 그룹화 전, 종양이 보일 때, 실험 동물의 종양 체적을 주 1회 측정하였다. 접종 및 그룹화 후, 실험에서 동물의 종양 체적을 주 2회 측정하였다. 종양 체적은 양방향 측정 방법으로 측정하였다. 먼저, 버니어 캘리퍼스를 사용하여 종양의 장경과 단경을 측정한 다음, 공식 TV=0.5*a*b2를 사용하여 종양 체적을 계산하였으며, 여기서 a는 종양의 장경이고 b는 단경이다. 실험 결과는 도 26에 나타내어져 있다. SEMG2 항체는 마우스에서 종양의 성장을 유의하게 억제하였다. 이 결과는 SEMG2가 효과적인 항종양 표적임을 나타낸다.
실시예 20: 마우스에서 상응하는 유전자 Svs3a의 녹아웃은 SEMG2의 기능 차단 후 유의한 부작용이 없음을 입증한다
약물 표적으로서 SEMG2의 기능적 차단 후 가능한 독성 및 부작용을 입증하기 위해, 마우스에서 상응하는 유전자 Svs3a를 전신적으로 녹아웃시켰다. 구체적인 계획은 다음과 같았다: CRISPR/cas9 기술을 프로젝트에 채택하고, 비상동 재조합을 사용하여 돌연변이를 도입하여, 판독 프레임의 이동 및 Svs3a 유전자의 기능 상실을 초래하였다. 간단한 과정은 다음과 같다: Cas9 mRNA 및 gRNA를 시험관내 전사에 의해 수득하고; Cas9 mRNA 및 gRNA를 C57BL/6J 마우스의 수정란에 미세주입하여 F0 세대 마우스를 수득하였다. PCR 증폭 및 서열분석에 의해 확인된 양성 F0 마우스를 C57BL/6J 마우스와 교배하여 양성 F1 마우스를 수득하였다.
gRNAs 서열 (5'-3'):
gRNA1，CAGCCGCAGAGAGGCACTCAGGG；
gRNA2，ATGCACCACCAAGAAACACTGGG。
녹아웃 전 및 후의 서열 정렬:
Figure pct00013
후속 생식: 수득된 유전자 녹아웃 이형접합 마우스(유전자+/-)를 두 부분으로 나누었다: 이형접합 마우스의 일부를 더 많은 이형접합 마우스의 확장을 위해 야생형 마우스와 교배시키고; 이형접합 마우스의 일부를 자가-증식시켜 유전자 녹아웃 효과 검증 및 후속 표현형 분석을 위해 유전자 녹아웃 동형접합 마우스(유전자-/-)를 수득하였다.
표현형 분석: 유세포 분석을 위해 마우스로부터 항응고된 전혈을 채취하고, 혈액에서 CD8+, CD4+, CD3+, CD27+ 양성 세포의 비율을 분석하였다. 마우스를 2일 동안 휴식시킨 후, 항응고된 전혈을 내안각으로부터 수집하고, 분자 부서에서 혈액 일상 검사를 수행하였다. 마우스를 3일 동안 휴식시킨 후, 마우스의 체중을 측정하고 마취하고, 마우스의 전신을 이미지화하였으며; 마우스의 안구를 제거하고, 혈액을 수집하고, 혈청을 분리하였다. 분자 부서가 혈청 생화학적 매개변수를 측정할 것이다. 안구를 제거하고 혈액을 수집한 후, 마우스를 물질 수집을 위해 안락사하였다: 뇌: 전체 뇌를 제거하여 시상면으로 분할하고, 좌측은 고정하고, 우측은 급속-동결하였고; 간: 전체 간을 제거하여 둘로 나누고, 좌엽은 고정하고 나머지는 급속-동결하였으며; 비장: 전체 비장을 제거하고 둘로 나누고, 반은 고정하고 반은 급속-동결하였고; 신장: 왼쪽 신장을 고정을 위해 제거하고, 오른쪽 신장을 제거하고 급속-동결하였고; 위: 전체 위를 제거하고 시상을 분할하고, 더 큰 만곡은 고정하고 더 적은 만곡은 급속-동결하였으며; 대장: 스위스 롤 고정을 위해 온전한 대장을 제거하였고; 소장: 전체 소장을 제거하고 스위스 롤 고정을 위해 세 부분(십이지장, 회장, 공장)으로 나누었으며; 폐: 고정을 위해 왼쪽 폐를 제거하고, 급속 동결을 위해 오른쪽 폐를 제거하였고; 심장: 확장 후 고정을 위해 전체 심장을 제거하였다. 모든 고정 샘플을 파라핀 포매를 위해 병리학으로 보냈으며, 여기서 한 마리의 KO 마우스(#98)의 11개 기관(뇌, 심장, 폐, 신장, 비장, 간, 위, 십이지장, 공장, 회장 및 결장)을 절편화하고, HE 염색하고, 분석을 위해 판독하였다.
야생형(WT) 및 동형접합 녹아웃 마우스(KO)의 표현형 분석 결과는 도 27에 나타내어져 있다. 결과는 Svs3a 동형접합 녹아웃 마우스를 교배한 후 자손이 태어나지 않았지만 이형접합 녹아웃 상황에 대해서는 생식 기능에 영향이 없었음을 보여준다. 다른 분석에서는 이상이 발견되지 않았다. 따라서, Svs3a 기능의 완전한 상실 또는 차단은 다른 시스템에 대한 유의한 독성 영향 없이 생식력에 영향을 미칠 수 있다. 이는 SEMG2 표적 차단의 가능한 독성 또는 부작용이 제한적이며 높은 안전성을 가짐을 시사한다.
본 발명의 실시양태가 본 발명자들에 의해 기술되었지만, 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 당업계의 숙련가는 본 발명의 목적 범위 내에서 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 수 있다. 수정 및 변경의 방식은 본 발명의 보호 범위에 속해야 한다.
Sequence list <110> Shanghai Biotroy Biotechnique Co., Ltd. <120> SEMG2 antibody and use thereof <130> AJ6248PCT2001 <150> 202010072952.X <151> 2020-01-21 <160> 103 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 582 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1)..(582) <223> Human SEMG2 <400> 1 Met Lys Ser Ile Ile Leu Phe Val Leu Ser Leu Leu Leu Ile Leu Glu 1 5 10 15 Lys Gln Ala Ala Val Met Gly Gln Lys Gly Gly Ser Lys Gly Gln Leu 20 25 30 Pro Ser Gly Ser Ser Gln Phe Pro His Gly Gln Lys Gly Gln His Tyr 35 40 45 Phe Gly Gln Lys Asp Gln Gln His Thr Lys Ser Lys Gly Ser Phe Ser 50 55 60 Ile Gln His Thr Tyr His Val Asp Ile Asn Asp His Asp Trp Thr Arg 65 70 75 80 Lys Ser Gln Gln Tyr Asp Leu Asn Ala Leu His Lys Ala Thr Lys Ser 85 90 95 Lys Gln His Leu Gly Gly Ser Gln Gln Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Glu 100 105 110 Gly Arg Asp His Asp Lys Ser Lys Gly His Phe His Met Ile Val Ile 115 120 125 His His Lys Gly Gly Gln Ala His His Gly Thr Gln Asn Pro Ser Gln 130 135 140 Asp Gln Gly Asn Ser Pro Ser Gly Lys Gly Leu Ser Ser Gln Cys Ser 145 150 155 160 Asn Thr Glu Lys Arg Leu Trp Val His Gly Leu Ser Lys Glu Gln Ala 165 170 175 Ser Ala Ser Gly Ala Gln Lys Gly Arg Thr Gln Gly Gly Ser Gln Ser 180 185 190 Ser Tyr Val Leu Gln Thr Glu Glu Leu Val Val Asn Lys Gln Gln Arg 195 200 205 Glu Thr Lys Asn Ser His Gln Asn Lys Gly His Tyr Gln Asn Val Val 210 215 220 Asp Val Arg Glu Glu His Ser Ser Lys Leu Gln Thr Ser Leu His Pro 225 230 235 240 Ala His Gln Asp Arg Leu Gln His Gly Pro Lys Asp Ile Phe Thr Thr 245 250 255 Gln Asp Glu Leu Leu Val Tyr Asn Lys Asn Gln His Gln Thr Lys Asn 260 265 270 Leu Ser Gln Asp Gln Glu His Gly Arg Lys Ala His Lys Ile Ser Tyr 275 280 285 Pro Ser Ser Arg Thr Glu Glu Arg Gln Leu His His Gly Glu Lys Ser 290 295 300 Val Gln Lys Asp Val Ser Lys Gly Ser Ile Ser Ile Gln Thr Glu Glu 305 310 315 320 Lys Ile His Gly Lys Ser Gln Asn Gln Val Thr Ile His Ser Gln Asp 325 330 335 Gln Glu His Gly His Lys Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Ser Ser Ser 340 345 350 Thr Glu Glu Arg His Leu Asn Cys Gly Glu Lys Gly Ile Gln Lys Gly 355 360 365 Val Ser Lys Gly Ser Ile Ser Ile Gln Thr Glu Glu Gln Ile His Gly 370 375 380 Lys Ser Gln Asn Gln Val Arg Ile Pro Ser Gln Ala Gln Glu Tyr Gly 385 390 395 400 His Lys Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg 405 410 415 Arg Leu Asn Ser Gly Glu Lys Asp Val Gln Lys Gly Val Ser Lys Gly 420 425 430 Ser Ile Ser Ile Gln Thr Glu Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Gln Asn 435 440 445 Gln Val Thr Ile Pro Ser Gln Asp Gln Glu His Gly His Lys Glu Asn 450 455 460 Lys Met Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg Arg Leu Asn Tyr 465 470 475 480 Gly Gly Lys Ser Thr Gln Lys Asp Val Ser Gln Ser Ser Ile Ser Phe 485 490 495 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Gln Ile Gln Thr Pro Asn 500 505 510 Pro Asn Gln Asp Gln Trp Ser Gly Gln Asn Ala Lys Gly Lys Ser Gly 515 520 525 Gln Ser Ala Asp Ser Lys Gln Asp Leu Leu Ser His Glu Gln Lys Gly 530 535 540 Arg Tyr Lys Gln Glu Ser Ser Glu Ser His Asn Ile Val Ile Thr Glu 545 550 555 560 His Glu Val Ala Gln Asp Asp His Leu Thr Gln Gln Tyr Asn Glu Asp 565 570 575 Arg Asn Pro Ile Ser Thr 580 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(10) <223> Epitope peptides <400> 2 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(13) <223> Epitope peptides <400> 3 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Gln Ile Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> Epitope peptides <400> 4 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Gln 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(12) <223> Epitope peptides <400> 5 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Gln Ile 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 6 Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Ala Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 8 Asp Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 9 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 10 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Ala 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 11 Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr Gly 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 12 Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 13 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 14 Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Asn 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(7) <223> VH CDR2 <400> 15 Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 16 Ile Asn Thr His Ser Gly Val Ala 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR3 <400> 17 Ala Arg Leu Gly Leu Leu Gly Tyr 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(13) <223> VH CDR3 <400> 18 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(7) <223> VH CDR3 <400> 19 Asn Val Gly Gly Ala His Tyr 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(16) <223> VH CDR3 <400> 20 Ala Lys Gln Glu Arg Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(6) <223> VL CDR1 <400> 21 Gln Ser Ile Gly Thr Thr 1 5 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(12) <223> VL CDR1 <400> 22 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(12) <223> VL CDR1 <400> 23 Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VL CDR1 <400> 24 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(5) <223> VL CDR1 <400> 25 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 26 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 26 Tyr Ala 1 <210> 27 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 27 Trp Ala 1 <210> 28 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 28 Lys Val 1 <210> 29 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 29 Ser Thr 1 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 30 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 31 Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 32 Lys Gln Ser Tyr Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 33 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 34 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(115) <223> VH <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Ala 20 25 30 Gly Ile Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Glu Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Phe Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Leu Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(134) <223> VH <400> 37 Met Asp Trp Leu Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Ile Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Ala Glu Phe Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Arg Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly Leu Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 38 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His His Asn Gln Met Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(114) <223> VH <400> 39 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Asn Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Asn Val Gly Gly Ala His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 40 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(122) <223> VH <400> 40 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Glu Arg Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(122) <223> VH <400> 41 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Glu Arg Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 42 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(109) <223> VL <400> 42 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Thr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(115) <223> VL <400> 43 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Ala 115 <210> 44 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(129) <223> VL <400> 44 Met Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Thr Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Ser Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala <210> 45 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(115) <223> VL <400> 45 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met 100 105 110 Lys Arg Ala 115 <210> 46 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(114) <223> VL <400> 46 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(108) <223> VL <400> 47 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(120) <223> VH <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Leu Gly Gly Lys Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(113) <223> VL <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(113) <223> VL <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 54 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(124) <223> VH <400> 54 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(123) <223> VH <400> 55 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Asn Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Gln Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys His Thr Ser Lys Asp Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Val Gly Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Leu Ser Tyr Gly Pro Gly Trp Gly Tyr Tyr Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Asn Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(118) <223> VH <400> 56 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Gly Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(107) <223> VL <400> 57 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Pro Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Asn Gln Gly Ile Asp Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu Ser Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(108) <223> VL <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Thr Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly His Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(112) <223> VL <400> 59 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 60 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(10) <223> VH CDR1 <400> 61 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Val Gly 1 5 10 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 62 Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(7) <223> VH CDR2 <400> 63 Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Gln 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR2 <400> 64 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(16) <223> VH CDR3 <400> 65 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Thr Gly Thr Thr Ser Gly Ala Phe Asp 1 5 10 15 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(15) <223> VH CDR3 <400> 66 Ala His Leu Ser Tyr Gly Pro Gly Trp Gly Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VH CDR3 <400> 67 Ala Arg Met Asp Gly Ser Gly Ser Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(6) <223> VL CDR1 <400> 68 Gln Gly Ile Asp Ser Trp 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VL CDR1 <400> 69 Ser Gln Ser Val Arg Asn Asn Tyr 1 5 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VL CDR1 <400> 70 Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 71 Ser Ala 1 <210> 72 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 72 Gly Ala 1 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 73 Gln Gln Ala Leu Ser Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 74 Gln Gln Tyr Gly His Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 75 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Ala 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(8) <223> VH CDR1 <400> 76 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Arg Ala 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VH CDR3 <400> 77 Ala Arg Met Asp Asn His Gly Ser Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VH CDR3 <400> 78 Ala Arg Met Asp Gly His Gly Ser Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VH CDR3 <400> 79 Ala Arg Met Asp Ser Gly Gly Ser Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(17) <223> VH CDR3 <400> 80 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Gly Ser Thr Thr Ser Gly Ala Phe Asp 1 5 10 15 Ile <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(17) <223> VH CDR3 <400> 81 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Gly Ser Thr Val Ser Gly Ala Phe Asp 1 5 10 15 Ile <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> VL CDR1 <400> 82 Gln Ser Leu Val Tyr Lys Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 83 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 83 Glu Val 1 <210> 84 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(2) <223> VL CDR2 <400> 84 Gly Val 1 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 85 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Arg 1 5 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(13) <223> Peptide <220> <221> UNSURE <222> (11)..(11) <223> Arbitrary amino acid <220> <221> UNSURE <222> (13)..(13) <223> Arbitrary amino acid <400> 86 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Xaa Ile Xaa 1 5 10 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(12) <223> Peptide <220> <221> UNSURE <222> (11)..(11) <223> Arbitrary amino acid <400> 87 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Xaa Ile 1 5 10 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(11) <223> Peptide <220> <221> UNSURE <222> (11)..(11) <223> Arbitrary amino acid <400> 88 Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Xaa 1 5 10 <210> 89 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(79) <223> SEMG2-P1 <400> 89 Gly Ser Phe Ser Ile Gln His Thr Tyr His Val Asp Ile Asn Asp His 1 5 10 15 Asp Trp Thr Arg Lys Ser Gln Gln Tyr Asp Leu Asn Ala Leu His Lys 20 25 30 Ala Thr Lys Ser Lys Gln His Leu Gly Gly Ser Gln Gln Leu Leu Asn 35 40 45 Tyr Lys Gln Glu Gly Arg Asp His Asp Lys Ser Lys Gly His Phe His 50 55 60 Met Ile Val Ile His His Lys Gly Gly Gln Ala His His Gly Thr 65 70 75 <210> 90 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(142) <223> SEMG2-P2 <400> 90 Gln Asn Pro Ser Gln Asp Gln Gly Asn Ser Pro Ser Gly Lys Gly Leu 1 5 10 15 Ser Ser Gln Cys Ser Asn Thr Glu Lys Arg Leu Trp Val His Gly Leu 20 25 30 Ser Lys Glu Gln Ala Ser Ala Ser Gly Ala Gln Lys Gly Arg Thr Gln 35 40 45 Gly Gly Ser Gln Ser Ser Tyr Val Leu Gln Thr Glu Glu Leu Val Val 50 55 60 Asn Lys Gln Gln Arg Glu Thr Lys Asn Ser His Gln Asn Lys Gly His 65 70 75 80 Tyr Gln Asn Val Val Asp Val Arg Glu Glu His Ser Ser Lys Leu Gln 85 90 95 Thr Ser Leu His Pro Ala His Gln Asp Arg Leu Gln His Gly Pro Lys 100 105 110 Asp Ile Phe Thr Thr Gln Asp Glu Leu Leu Val Tyr Asn Lys Asn Gln 115 120 125 His Gln Thr Lys Asn Leu Ser Gln Asp Gln Glu His Gly Arg 130 135 140 <210> 91 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(116) <223> SEMG2-P3 <400> 91 Lys Ala His Lys Ile Ser Tyr Pro Ser Ser Arg Thr Glu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Leu His His Gly Glu Lys Ser Val Gln Lys Asp Val Ser Lys Gly Ser 20 25 30 Ile Ser Ile Gln Thr Glu Glu Lys Ile His Gly Lys Ser Gln Asn Gln 35 40 45 Val Thr Ile His Ser Gln Asp Gln Glu His Gly His Lys Glu Asn Lys 50 55 60 Ile Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg His Leu Asn Cys Gly 65 70 75 80 Glu Lys Gly Ile Gln Lys Gly Val Ser Lys Gly Ser Ile Ser Ile Gln 85 90 95 Thr Glu Glu Gln Ile His Gly Lys Ser Gln Asn Gln Val Arg Ile Pro 100 105 110 Ser Gln Ala Gln 115 <210> 92 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(98) <223> SEMG2-P4 <400> 92 Glu Tyr Gly His Lys Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr 1 5 10 15 Glu Glu Arg Arg Leu Asn Ser Gly Glu Lys Asp Val Gln Lys Gly Val 20 25 30 Ser Lys Gly Ser Ile Ser Ile Gln Thr Glu Glu Lys Ile His Gly Lys 35 40 45 Ser Gln Asn Gln Val Thr Ile Pro Ser Gln Asp Gln Glu His Gly His 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Met Ser Tyr Gln Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg Arg 65 70 75 80 Leu Asn Tyr Gly Gly Lys Ser Thr Gln Lys Asp Val Ser Gln Ser Ser 85 90 95 Ile Ser <210> 93 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(45) <223> SEMG2-P5 <400> 93 Phe Gln Ile Glu Lys Leu Val Glu Gly Lys Ser Gln Ile Gln Thr Pro 1 5 10 15 Asn Pro Asn Gln Asp Gln Trp Ser Gly Gln Asn Ala Lys Gly Lys Ser 20 25 30 Gly Gln Ser Ala Asp Ser Lys Gln Asp Leu Leu Ser His 35 40 45 <210> 94 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(42) <223> SEMG2-P6 <400> 94 Glu Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Gln Glu Ser Ser Glu Ser His Asn Ile 1 5 10 15 Val Ile Thr Glu His Glu Val Ala Gln Asp Asp His Leu Thr Gln Gln 20 25 30 Tyr Asn Glu Asp Arg Asn Pro Ile Ser Thr 35 40 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 <400> 95 Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 96 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(118) <223> VH <400> 96 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Asn His Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 97 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(118) <223> VH <400> 97 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Ser Gly Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 98 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(118) <223> VH <400> 98 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Gly His Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(124) <223> VH <400> 99 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Gly Ser Thr Thr Ser Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(124) <223> VH <400> 100 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Gly Ser Thr Val Ser Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(112) <223> VL <400> 101 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 102 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(112) <223> VL <400> 102 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 103 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1)..(112) <223> VL <400> 103 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Arg Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (36)

  1. SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 효능화(agonizing) 또는 길항(antagonizing)시키는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, SEMG2와 CD27 사이의 상호작용이 SEMG2의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 및 508의 아미노산 부위에 위치하고, SEMG2 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호 1에 나타나 있는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 화합물이 소분자 억제제, 폴리펩티드, 항체, 또는 항원 결합 단편인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 86 (QIEKLVEGKS(x)I(x)), 서열 번호 87 (QIEKLVEGKS(x)I), 또는 서열 번호 88 (QIEKLVEGKS(x))의 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는 폴리펩티드가 서열 번호 2, 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 2-5에 제공된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 x가 임의의 아미노산으로부터 선택되는 화합물.
  5. 제3항에 있어서, 항체가 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하고, 항체가 SEMG2 단백질로부터 유래된 항원성 에피토프 펩티드에 결합하며, 항원성 에피토프 펩티드가 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
  6. 제3항에 있어서, 항체가 천연 또는 돌연변이 SEMG2 단백질에 특이적으로 결합하고, 항체가 천연 SEMG2 단백질의 위치 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 및 508의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 인식하거나, 돌연변이 SEMG2 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기를 인식하고, 천연 SEMG2 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호 1에 나타나 있는 화합물.
  7. 제3항에 있어서, 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 IMGT에 의해 정의된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 IMGT에 의해 정의된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고,
    HCDR1이 서열 번호 6-11, 서열 번호 60-61 및 서열 번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
    HCDR2가 서열 번호 12-16 및 서열 번호 62-64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
    HCDR3이 서열 번호 17-20, 서열 번호 65-67 및 서열 번호 77-81로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
    LCDR1이 서열 번호 21-25, 서열 번호 68-70 및 서열 번호 82로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
    LCDR2가 서열 번호 26-29, 서열 번호 71-72, 서열 번호 83-84 및 서열 번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하고;
    LCDR3이 서열 번호 30-34, 서열 번호 73-75, 서열 번호 85 및 서열 번호 95로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 IMGT에 의해 정의된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 IMGT에 의해 정의된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 항체의 CDR 서열이 하기 (a)-(k)의 조합 중 어느 하나로부터 선택되고:
    (a) HCDR1이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) HCDR1이 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 31 또는 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) HCDR1이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) HCDR1이 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) HCDR1이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) HCDR1이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
    (g) HCDR1이 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하고;
    (h) HCDR1이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하고;
    (i) HCDR1이 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하고;
    (j) HCDR1이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1이 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하고;
    (k) HCDR1이 서열 번호 60 또는 76의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2가 서열 번호 64 또는 62의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR3이 서열 번호 77, 78 또는 79의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
    LCDR1이 서열 번호 70 또는 82의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR2가 서열 번호 28, 83 또는 84의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3이 서열 번호 75 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
  9. 제3항에 있어서, 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    중쇄 가변 영역이 서열 번호 35-41, 48-51, 54-56 및 96-100으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 35-41, 48-51, 54-56 및 96-100의 어느 화합물과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    경쇄 가변 영역이 서열 번호 42-47, 52-53, 57-69 및 101-103으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 42-47, 52-53, 57-69 및 101-103의 어느 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 하기 (a)-(o)의 조합 중 어느 하나로부터 선택되고:
    (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 35 또는 서열 번호 35와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 42 또는 서열 번호 42와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (b) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 36 또는 서열 번호 36과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 43 또는 서열 번호 43과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (c) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 37 또는 서열 번호 37과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 44 또는 서열 번호 44와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (d) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 38 또는 서열 번호 38과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 45 또는 서열 번호 45와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (e) 중쇄 가변 영역 서열 번호 39 또는 서열 번호 39와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 46 또는 서열 번호 46과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (f) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 40 또는 서열 번호 40과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47 또는 서열 번호 47과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (g) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 41 또는 서열 번호 41과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 47 또는 서열 번호 47과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (h) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48, 49, 50, 51 또는 서열 번호 48, 49, 50 또는 51과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 52, 53 또는 서열 번호 52 또는 53과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (i) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54 또는 서열 번호 54와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 57 또는 서열 번호 57과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (j) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55 또는 서열 번호 55와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 58 또는 서열 번호 58과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (k) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56 또는 서열 번호 56과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59 또는 서열 번호 59와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (l) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 96 또는 서열 번호 96과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59, 101, 102, 103 또는 서열 번호 59, 101, 102 또는 103과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (m) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 97 또는 서열 번호 97과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 59 또는 서열 번호 59와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (n) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 98 또는 서열 번호 98과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 103 또는 서열 번호 103과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    (o) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 99 또는 100 또는 서열 번호 99 또는 100과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호 57 또는 서열 번호 57과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
  11. 제5항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 폴리펩티드에 연결된 커플링 모이어티(coupling moiety)를 추가로 포함하고, 커플링 모이어티가 방사성핵종(radionuclide), 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 플루오레세인(fluroscein), 운반 단백질(carrier protein), 지질 및 비오틴(biotin) 중 하나 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 폴리펩티드 또는 항체가 링커(linker)에 의해 커플링 모이어티에 선택적으로 연결되고, 바람직하게는 링커가 펩티드 또는 폴리펩티드인 화합물.
  12. 제5항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 단클론 항체(monoclonal antibody), 다클론 항체(polyclonal antibody), 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 화합물.
  13. 제5항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중특이적 항체(multispecific antibody), 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, 항-이디오타입(anti-idiotype; 항-Id) 항체, 디아바디(diabody), 미니바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합 이중특이적 Fv(sdFv) 및 세포내 항체로부터 선택되는 화합물.
  14. SEMG2 단백질로부터 유래되고, 항원성 에피토프(epitope) 펩티드의 아미노산이 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 및 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원성 에피토프 펩티드.
  15. 제14항의 항원성 에피토프 펩티드, 및 N-말단 또는 C-말단에서 선택적으로 연결될 수 있는 태그(tag) 서열을 포함하는 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 단백질이 서열 번호 2 (QIEKLVEGKS), 서열 번호 86 (QIEKLVEGKS(x)I(x)), 서열 번호 87 (QIEKLVEGKS(x))I), 또는 서열 번호 88 (QIEKLVEGKS(x))의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 폴리펩티드가 서열 번호 3 (QIEKLVEGKSQIQ), 서열 번호 4 (QIEKLVEGKSQ), 또는 서열 번호 5 (QIEKLVEGKSQI)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2-5, 보다 바람직하게는 서열 번호 89-94 및 서열 번호 3 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  17. 제14항의 항원성 에피토프 펩티드, 또는 제15항 또는 제16항의 단백질을 면역원으로 사용하여 동물을 면역화하거나 천연 항체 라이브러리(natural antibody library)를 스크리닝(screening)함으로써 수득된, 항체의 제조방법.
  18. 제3항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 또는 제15항 또는 제16항의 단백질을 암호화(encoding)하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드 및 임의의 조절 서열을 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector)로서, 바람직하게는, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 재조합 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 조절 서열이 리딩(leading) 서열, 폴리아데닐화 서열, 폴리펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 전사 종결인자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  21. 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 제15항 또는 제16항의 단백질, 제18항의 폴리뉴클레오티드, 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터, 및 제20항 또는 제21항의 하나 이상의 유형의 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트(adjuvant)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  25. SEMG2와 CD27 사이의 상호작용(바람직하게는 SEMG2는 종양 세포에서 발현되고 CD27은 면역 세포에서 발현된다)을 효능화 또는 길항시키기 위한 생성물의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 제15항 또는 제16항의 단백질, 제18항의 폴리뉴클레오티드, 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터, 또는 제21항 또는 제22항의 숙주 세포의 용도.
  26. 종양(tumor)을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 제15항 또는 제16항의 단백질, 제18항의 폴리뉴클레오티드, 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터, 또는 제21항 또는 제22항의 숙주 세포의 용도.
  27. 종양에 대해 유도된 면역 반응을 조절하기 위한 약물의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 제15항 또는 제16항의 단백질, 제18항의 폴리뉴클레오티드, 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터, 또는 제21항 또는 제22항의 숙주 세포의 용도.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 종양이 결장직장암(colorectal cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 림프종(lymphoma), 간암(liver cancer), 두경부암(head and neck cancer), 위암(stomach cancer), 신장암(kidney cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testicular cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 유방암(breast cancer) 및 난소암(ovarian cancer) 중 하나 이상으로부터 선택되는 용도.
  29. SEMG2와 CD27 사이의 상호작용을 억제하는 억제제 또는 항체를 스크리닝하여 후보 약물 또는 시약을 수득함을 포함하여, 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약물 또는 시약을 스크리닝하는 방법.
  30. 대상체(subject)의 림프구와 같은 면역 세포 및/또는 종양 세포를 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물의 유효량과 접촉시킴을 포함하여, 종양을 예방 또는 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 종양 세포에서의 SEMG2의 발현이 대상체의 림프구와 같은 면역 세포 및/또는 종양 세포를 유효량의 화합물과 접촉시키기 전에 검출되는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 대상체가 추가 항암 요법을 받았거나 받고 있거나 받을 예정인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 추가 항암 요법이 수술, 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 또는 호르몬 요법을 포함하는 방법.
  34. 하나 이상의 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물, 제14항의 항원성 펩티드, 제15항 또는 제16항의 단백질, 제18항의 폴리뉴클레오티드, 및 제19항 또는 제20항의 재조합 벡터, 및 제21항 또는 제22항의 하나 이상의 유형의 숙주 세포를 포함하고, 상기 성분들이 적합한 용기에 포함되어 있는 키트(kit).
  35. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항의 화합물과 접촉시킴을 포함하여, 시험관내 생물학적 샘플에서 SEMG2의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  36. A) 종양 세포에서 SEMG2의 발현을 분석하는 단계; B) 종양 세포를 SEMG2를 인식하는 항체와 접촉시키는 단계(SEMG2에 대한 항체의 결합은 KD <2Х10- 8이다); C) T 림프구를 항체 및 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
KR1020227023643A 2020-01-21 2021-01-21 Semg2 항체 및 이의 용도 Withdrawn KR20220131233A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010072952 2020-01-21
CN202010072952.X 2020-01-21
PCT/CN2021/073100 WO2021147954A1 (zh) 2020-01-21 2021-01-21 Semg2抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220131233A true KR20220131233A (ko) 2022-09-27

Family

ID=76993162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227023643A Withdrawn KR20220131233A (ko) 2020-01-21 2021-01-21 Semg2 항체 및 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230080534A1 (ko)
EP (1) EP4079758A4 (ko)
JP (1) JP2023511189A (ko)
KR (1) KR20220131233A (ko)
CN (1) CN113939530A (ko)
AU (1) AU2021209740A1 (ko)
CA (1) CA3161701A1 (ko)
WO (1) WO2021147954A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117062832A (zh) * 2021-03-16 2023-11-14 上海柏全生物科技有限公司 精液凝固蛋白的中和抗体及其表位和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002254524A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health A Use of semenogelin in the diagnosis, prognosis and treatment of cancer
US7481997B1 (en) * 2004-02-12 2009-01-27 Montana State University Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use
US7618793B2 (en) * 2004-10-20 2009-11-17 The Regents Of The University Of Washington Identifying agents for decreasing cellular toxicity associated with huntingin polypeptide
WO2015138919A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Small molecules for inhibiting male fertility
TW202523682A (zh) * 2015-05-20 2025-06-16 美商博德研究所有限公司 共有之gata3相關之腫瘤特異性新抗原
JOP20170154B1 (ar) * 2016-08-01 2023-03-28 Omeros Corp تركيبات وطرق لتثبيط masp-3 لعلاج أمراض واضطرابات مختلفة

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021209740A1 (en) 2022-07-14
JP2023511189A (ja) 2023-03-16
EP4079758A4 (en) 2024-02-14
US20230080534A1 (en) 2023-03-16
WO2021147954A1 (zh) 2021-07-29
EP4079758A1 (en) 2022-10-26
CA3161701A1 (en) 2021-07-29
CN113939530A (zh) 2022-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7295146B2 (ja) 抗－ｒｏｒ１抗体およびその用途
US20210269549A1 (en) Anti-sas1b antibodies, associated methods of use, and compositions and methods for detecting and treating cancer
CN101820910B (zh) 结合细胞内prl-1多肽或prl-3多肽的抗体
JP2018532401A (ja) 新規抗‐メソテリン抗体およびそれを含む組成物
CN109988240B (zh) 抗gpc-3抗体及其用途
KR20230009459A (ko) 인간 ceacam1/3/5에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 그의 용도
JP2025517759A (ja) Ｐｒｌｒ抗原結合タンパク質、その製造方法及び使用
CN113227148A (zh) 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
KR20230165902A (ko) Vegfa-결합 분자
JP2023544140A (ja) 新規の抗クローディン１８抗体
WO2025261506A1 (zh) 抗Nectin-4抗体以及其用途
KR20220131233A (ko) Semg2 항체 및 이의 용도
Masuko et al. Towards therapeutic antibodies to membrane oncoproteins by a robust strategy using rats immunized with transfectants expressing target molecules fused to green fluorescent protein
KR20220050182A (ko) 항-cd22 항체 및 그의 용도
CN107614524A (zh) 治疗
CN118047871A (zh) 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用
HK40080158A (en) Semg2 antibody and use thereof
KR20220048028A (ko) 항-cd19 항체 및 그의 용도
JP7851924B2 (ja) 抗ｔｒｏｐ－２抗体、その抗原結合断片又はその変異体、及びそれらの医学的使用
WO2017147247A1 (en) Anti-sas1b antibodies and methods of use
EP4722246A1 (en) Tem8-targeted antibody or antigen-binding fragment thereof, and use thereof
AU2021362977A1 (en) Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
CN119816519A (zh) 抗ror1抗体、包含其的双特异性抗体及其用途
TW202313681A (zh) Ｍａｇｅｂ２結合構建體
CN119431584A (zh) Muc1结合分子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

PC1202 Submission of document of withdrawal before decision of registration

St.27 status event code: N-1-6-B10-B11-nap-PC1202

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000