KR20220137032A - 신규 lilrb2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220137032A
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지치앙 안
닌귀안 장
지치앙 쿠
청청 장
샤오예 리우
헤유 첸
징징 시에
마리아 호세 코스타
안 송
엑스 샬린 리아오
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더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
이뮨-온크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 LILRB2에 결합하는 항체 및 암 및 자가면역 질환의 검출 및 치료에 있어서의 항체의 용도가 제공된다.

Description

신규 LILRB2 항체 및 이의 용도
우선권 주장
본 출원은 2020년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/970,496호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
213KB(Microsoft Windows에서 측정)이고 2021년 1월 27일에 생성된 "UTFHP0359WO_ST25"라는 파일에 포함된 서열 목록은 전자 제출에 의해 함께 제출되었으며 본원에 참고로 포함된다.
1. 분야
본 개시내용은 일반적으로 의학, 종양학, 면역학 및 면역종양학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 LILRB에 결합하고 백혈병 및 고형 종양을 포함한 암을 치료할 수 있는 항체에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
현재의 면역 체크포인트 차단제 전략은 특정 유형의 고형 암을 치료하는데 성공적이었다. 그러나, 대부분의 암 환자는 현재의 체크포인트 차단제에 반응하지 않거나 치료 후 재발한다. 또한, 체크포인트 차단제 단독요법은 다발성 골수종(multiple myeloma) 및 백혈병(leukemia)을 포함한 대부분의 혈액 암(hematologic malignancy)에 대해 성공적이지 못했다.
종양 미세환경(TME)은 종양에 대한 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 믿어진다. 종양 미세환경을 구성하는 복잡한 요인 및 구성 요소 중에서, 골수 유래 억제 세포(MDSC), 종양 관련 대식세포(TAM) 및 세포외 기질은 모두 종양에 대한 면역 반응을 억제하는데 중요한 역할을 한다.
최근에는, 억제성 백혈구 면역글로불린-유사 수용체(LILRB) 및 관련 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)-함유 수용체인 LAIR1이 다양한 조혈 및 고형 암 세포에서 및 면역억제 종양 미세환경에서 종양-촉진 기능을 갖는 것으로 나타났다. ITIM-함유 수용체는 광범위한 면역 세포에서 발현되고 포스파타제 SHP-1, SHP-2 또는 SHIP의 모집에 의해 신호를 전달하여, 면역 세포 활성화의 음성 조절을 유도한다. CTLA-4 및 PD-1과 유사하게, LILRB는 면역 체크포인트 인자로 간주된다.
LILRB2는 다양한 리간드에 의한 이의 활성화가 골수 세포의 전염증 활성을 억제하기 때문에 시험관내 및 생체내에서 골수 세포표현형의 핵심 조절자로 확인되었다. 억제성/항염증성 표현형을 가진 골수 세포는 고형 종양 미세환경에서 T 세포의 활성화, 증식 및 세포독성 활성을 하향-조절할 수 있기 때문에, 골수-풍부 고형 종양에서 LILRB2의 치료적 차단은 T 세포 체크포인트 억제제에 반응하지 않거나/재발한 질병을 나타내는 환자에서 항-종양 면역 반응을 재활성화하거나 향상시킬 가능성을 갖는다.
LILRB는 종양 면역 회피를 촉진하는 다수의 면역 세포 유형의 활성을 억제할 수 있다. LILRB2는 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막관통 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 클래스에 속한다. 수용체는 골수 세포에서 발현된다; 이것은 HLA 클래스 I 분자, ANGPTL, 미엘린 억제제(Nogo66, MAG 및 OMgp 포함) 및 b-아밀로이드를 포함한 다중 유형의 리간드에 결합하여, 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. 염증 반응과 세포독성을 조절하여 면역 반응에 집중하는 것을 돕고 자가 반응성을 제한하는 것으로 생각된다. 이러한 유전자에 대해 상이한 이소형을 암호화하는 다수의 전사체 변이체가 발견되었다.
반대로, 수용체의 LILRB 패밀리를 효능화함으로써, 본 발명자들은 자가면역 또는 염증성 질환에서 발견되는 면역 반응 또는 염증을 억제할 수 있다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 개시내용은 LILRB2에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2의 활성화를 조절한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2를 활성화시킨다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2의 활성화를 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2에 대한 MHC 및 기타 리간드의 결합을 특이적으로 차단한다.
하나의 측면에서, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 2에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 CDR 서열(clone-paired CDR sequence)을 포함하는 중쇄(HC) 가변 영역(VH) 및 경쇄(LC) 가변 영역(VL); 및 LC-CDR 중 하나 이상이 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 이의 조합을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 제1항의 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 상기 단리된 단클론 항체는 뮤린(murine), 설치류, 토끼, 키메라(chimeric), 인간화, 또는 인간 항체이다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 부록 II 및 IV의 클론-쌍을 이룬 서열과 적어도 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 쇄를 가질 수 있다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 부록 I 및 III의 클론-쌍을 이룬 서열과 적어도 80% 또는 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 VH 및 VL 쇄를 가질 수 있다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각 부록 II 및 IV의 클론-쌍을 이룬 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 쇄를 가질 수 있다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 부록 I 및 III의 클론-쌍을 이룬 서열과 동일한 핵산 서열에 의해 암호화된 VH 및 VL 쇄를 가질 수 있다.
변이체는 HC-CDR 또는 LC-CDR 중 하나 이상이 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 이들의 조합을 갖는 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 각 CDR은 Kabat 정의, Chothia 정의, Kabat 정의와 Chothia 정의의 조합, AbM 정의, 또는 CDR의 계약 정의에 따라 정의된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체와 동일한 에피토프(epitope)에 대해 경쟁하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 결합된 에피토프는 인간 LILRB2의 D1 및 D2 도메인 사이의 링커 영역 내에 위치한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 단리된 단클론 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 단리된 단클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유형이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 항원-결합 단편은 재조합 ScFv(단일 쇄 가변 단편) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편이다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터(vector)가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 CHO 세포일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단리된 단클론 항체를 암호화하거나 생산하는 하이브리도마가 제공된다.
또 다른 측면에서, 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 항체를 발현하는데 적합한 조건하에서 본원에 제공된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 CAR 단백질을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 조작된 세포(engineered cell)가 제공된다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, 또는 골수 세포이다.
또 다른 측면에서, 본원에 정의된 바와 같은 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암의 영향(effect)을 치료하거나 개선하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나 근절할 수 있고, 종양 성장 속도를 늦출 수 있고/있거나, 종양 세포의 수를 감소시킬 수 있고, 종양 크기를 감소시킬 수 있고, 종양 침윤(infiltration)을 감소시킬 수 있고, 종양 전이를 감소시킬 수 있고, 대상체에서 종양을 근절할 수 있다. 암은 고형 종양(solid tumor) 또는 혈액 암(hematologic malignancy)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 암은 부신암(adrenal cancer), 담관 암종(bile duct carcinoma), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 융모막암종(choriocarcinoma), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 안암(eye cancer), 위암(gastric cancer), 교모세포종(glioblastoma), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 중피종(mesothelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포암(merkel cell cancer), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 구강암(oral cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 송과체종(pinealoma), 전립선암(prostate cancer), 신세포암(renal cell cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 육종(sarcoma), 피부암(skin cancer), 고환암(testicular cancer), 흉선 암종(thymic carcinoma), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 및 질암(vaginal cancer)을 포함하는 고형 종양이다.
일부 실시양태에서, 암은 전이성, 재발성 또는 약물-내성 암이다.
일부 실시양태에서, 상기 암은 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), B-세포 백혈병(B-cell leukemia), 모세포 형질세포양 수지상 세포 신생물(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, BPDCN), 만성 림프모구성 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 만성 골수단핵구 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia, CMML), 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic leukemia, CML), pre-B 급성 림프구성 백혈병(pre-B acute lymphocytic leukemia, Pre-B ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 외부 결정성 NK/T-세포 림프종(extranodal NK/T-cell lymphoma), 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), HHV8-관련 원발성 삼출 림프종(HHV8-associated primary effusion lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte-rich B-cell lymphoma), 중쇄 질환(heavy chain disease), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 다발성 골수종(multiple myeloma, MM), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS), 골수증식성 신생물(myeloproliferative neoplasm), 및 진성 다혈구증(polycythemia vera)을 포함하는 혈액 암이다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정맥내, 동맥내, 종양내 또는 피하 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오시드 대사 억제제, 시타라빈, 저메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신과 시타라빈의 조합, 주사용 다우노루비신과 시타라빈 리포솜, Vyxeos®, 아자시티딘, Vidaza®, 데시타빈, 전-트랜스 레티노산(ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, Ceplene®, 인터루킨-2, 알데스루킨, Proleukin®, 젬투주맙 오조가마이신, Mylotarg®, FLT-3 억제제, 미도스타우린, Rydapt®, 클로파라빈, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 아이보시데닙, Tibsovo®, IDH2 억제제, 에나시데닙, Idhifa®, SMO(smoothened) 억제제, 글라스데깁, 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, Venclexta®, 백금 착물 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, IMBRUVICA®, 아칼라브루티닙, CALQUENCE®, 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, CD70 항체, 및 CLL1 항체, CD123 항체, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사산물, 항종양 항생제, 식물 유래 알칼로이드, 호르몬 치료제, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제, 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이에 연결된 항종양 약물을 포함할 수 있다. 항종양 약물은 광불안정성 링커(photolabile linker)를 통해 상기 항체에 연결될 수 있다. 항종양 약물은 효소적으로 절단된 링커를 통해 상기 항체에 연결될 수 있다. 항종양 약물은 독소, 방사성 동위원소, 사이토카인 또는 효소일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, (a) 대상체 또는 대상체로부터의 샘플을 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 대상체 또는 샘플에서 암 세포 또는 암 줄기 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하여 샘플 또는 대상체에서 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 샘플은 체액 또는 생검(biopsy), 또는 혈액, 골수, 가래, 눈물, 타액, 점액, 혈청, 소변 또는 대변일 수 있다. 검출은 면역조직화학, 유세포분석(flow cytometry), 면역분석(ELISA, RIA 등 포함) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함할 수 있다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 2번째로 수행하고 첫 번째와 비교하여 검출 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 펩티드 태그, 효소, 자성 입자, 발색단, 형광 분자, 화학-발광 분자, 또는 염료와 같은 표지(label)를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 리포솜 또는 나노입자(nanoparticle)에 접합될 수 있다.
여전히 추가의 측면에서, 대상체에게 치료학적 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 자가면역 질환의 영향을 치료하거나 개선하는 방법이 제공된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정맥내, 동맥내, 종양내 또는 피하로 투여될 수 있다. 상기 방법은 스테로이드 또는 NSAID로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 자가면역 질환은 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 장병증성 관절염(enteropathic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 미분화 척추관절병증(undifferentiated spondyloarthropathy), 소아 척추관절병증(juvenile spondyloarthropathy), 베체트병(Behcet's disease), 골부착부위염(enthesitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 섬유근육통(fibromyalgia), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 전신 염증 질환과 관련된 통증 상태(pain conditions associated with systemic inflammatory disease), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 소아 발병 당뇨병(juvenile onset diabetes mellitus)(I형 당뇨병으로도 알려짐), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 다발성 내분비 부전(multiple endocrine failure), 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Grave's Disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 자가면역 갑상선병(autoimmune thyroid disease), 악성 빈혈(pernicious anemia), 위 위축(gastric atrophy), 만성 간염(chronic hepatitis), 루푸스 간염(lupoid hepatitis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 부갑상선 기능 저하증(hypoparathyroidism), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 이튼-램버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 자가면역 혈소판 감소증(autoimmune thrombocytopenia), 특발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 천포창(pemphigus), 포진 피부염(dermatitis herpetiformis), 탈모증(alopecia), 경피증(scleroderma), 진행성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis), CREST 증후군(석회증(calcinosis), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 식도 운동성 장애(esophageal dysmotility), 수지경화증(sclerodactyly), 모세혈관 확장증(telangtasia)), 성인 발병 당뇨병(adult onset diabetes mellitus)(II형 당뇨병으로도 알려짐), 혼합 결합 조직 질환(mixed connective tissue disease), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 전신 괴사 혈관염(systemic necrotizing vasculitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 아토피성 비염(atopic rhinitis), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 샤가스병(Chagas' disease), 사르코이드증(sarcoidosis), 류마티스 열(rheumatic fever), 천식(asthma), 항인지질 증후군(anti-phospholipidsyndrome), 다형 홍반(erythema multiforme), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 자가면역 만성 활동성 간염(autoimmune chronic active hepatitis), 알레르기 질환(allergic disease), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 수혈 반응(transfusion reaction), 나병(leprosy), 말라리아(malaria), 레슈마니아증(leshmaniasis), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 측두 동맥염(temporal arteritis), 주혈흡충증(shistosomiasis), 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 습진(eczema), 림프종모양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 가와사키병(Kawasaki's disease), 내안구염(endophthalmitis), 건선(psoriasis), 태아 적아구증(erythroblastosis fetalis), 호산구성 안면염(eosinophilic faciitis), 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 푸흐 모양체염(Fuch's cyclitis), IgA 신병증(IgA nephropathy), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 이식편 대 숙주병(graft versus host disease), 이식 거부(transplantation rejection), 야토병(tularemia), 주기성 발열 증후군(periodic fever syndrome), 화농성 관절염(pyogenic arthritis), 가족성 지중해 열(Familial Mediterranean Fever), TNF-수용체 관련 주기성 증후군(TNF-receptor associated periodic syndrome, TRAPS), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome), 또는 고-IgD 증후군(hyper-IgD syndrome)일 수 있다.
또한, LILRB2에 결합하고 (a) LILRA 또는 다른 LILRB에 결합하지 않고; (b) LILRB2 도메인 1 또는 4에 결합하고; (c) LILRB2를 활성화하거나 길항하고; (d) 단핵구 염증 잠재력을 향상시키고; (e) 골수-유래 억제 세포 기능을 방지하고/하거나; (f) 생체내 백혈병 세포 이동 및/또는 침윤을 억제하는 단클론 항체가 제공된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 단어 "약"은 명시된 숫자의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 구성과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이기 때문에 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 나타내면서 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-c. LILRB2에 대한 특정 단클론 항체 스크리닝. (도 1a) 단클론 항체가 LILRB2 리포터 세포에 결합함을 보여주는 대표적인 유세포 분석 프로파일. 단클론 항체의 결합은 LILRB2 리포터 세포에서 유세포 분석기를 사용하여 스크리닝되었다. 결합된 항체는 알로피코시아닌(APC)-표지된 염소 항-인간 IgG 이차 항체로 검출되었다. (도 1b) LILRB2 리포터 세포에 대한 단클론 항체의 결합 능력의 정량. B2-7, B2-15, B2-16, B2-17, B2-19, B2-8, B2-24, B2-25, B2-10, B2-12 및 B2-18은 LILRB2 리포터 세포에 고돌 결합한다. (도 1c) LILRA, LILRB 및 LAIR1 리포터 세포에 대한 단클론 항체 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17, B2-19, B2-8, B2-24, B2-25, B2-10, B2-12 및 B2-18의 결합 능력의 정량.
도 2a-b. 항체 B2-8, B2-24, B2-10, B2-10 및 B2-15는 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 증가시킨다. (도 2a) 가용성 항체와 함께 배양된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달. (도 2b) K562와 조합된 가용성 항체와 함께 배양된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달.
도 3a-c. 항체 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19는 코팅된 ANGPTL2에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 차단한다. (도 3a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 코팅된 ANGPTL2가 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 자극한다는 것을 보여주었다. (도 3b) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 코팅된 ANGPTL2에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. (도 3c) 코팅된 ANGPTL2에 의해 유도된 GFP 발현에 대한 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19의 용량-의존적 억제 능력. B2-19, B2-16, B2-7, B2-15 및 B2-17의 차단 효능(IC50)은 각각 48.54 ng/ml, 131.4 ng/ml, 221.1 ng/ml, 341.3 ng/ml 및 405.1 ng/ml였다.
도 4a-c. 항체 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19는 코팅된 SEMA4A에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 차단한다. (도 4a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 코팅된 SEMA4A가 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 자극한다는 것을 보여주었다. (도 4b) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 코팅된 SEMA4A에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. (도 4c) 코팅된 SEMA4A에 의해 유도된 GFP 발현에 대한 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19의 용량-의존적 억제. B2-19, B2-16, B2-7, B2-15 및 B2-17의 차단 효능(IC50)은 각각 167.1 ng/ml, 449 ng/ml, 701 ng/ml, 1001 ng/ml 및 1034 ng/ml였다.
도 5a-c. 항체 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19는 K562 세포에서 과발현된 HLA -G에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 차단한다. (도 5a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 K562 세포에서 과발현된 HLA-G가 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 자극한다는 것을 보여주었다. (도 5b) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 B2-7, B-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 K562 세포에서 과발현된 HLA-G에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. (도 5c) 도 5b에 나타낸 GFP 백분율의 정량.
도 6a-c. 1차 인간 단핵구에서 LPS 반응에 대한 LILRB2 항체의 효과. (도 6a-b) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 CD33+ 단핵구에 게이트된 세포의 표면 CD86 및 세포내 TNFα 염색을 보여주었다. PBMC를 항-LILRB2 항체(10ng/ml)와 함께 48시간 동안 배양한 다음 브레펠딘 A의 존재하에 6시간 동안 LPS 자극(50ng/ml)을 수행하였다. (도 6c) 배수 변화의 정량은 도 6a-b에 나타낸 IgG 처리된 샘플에서 이들 각각의 MFI에 비한 항-LILRB2 처리된 샘플에서의 CD86 및 TNFα의 평균 형광 강도(MFI)의 비율로 정의되었다. MFI 값은 CD33+ 단핵구에 게이트된 세포를 나타낸다.
도 7a-j. 길항성 LILRB2 mAb는 C1498- LILRB2 종양-보유 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. (도 7a) 마우스 C1498 모 세포 및 인간 LILRB2 레트로바이러스 형질도입된 C1498 세포에서의 인간 LILRB2 발현. (도 7b) LILRB2는 백혈병-보유 마우스의 죽음을 촉진한다. LILRB2 과발현된 또는 대조군(ctrl) C1498 세포(마우스당 1 Х 106개 세포)를 i.v. 주사한 인간화 NSG 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (도 7c-d) LILRB2-과발현된 또는 ctrl C1498 세포(마우스당 1 Х 106개 세포)를 i.v. 주사한 C57BL/6으로부터의 골수(BM), 말초 혈액(PB), 간(LV) 및 비장(SP)에서 백혈병 세포 침윤의 대표적인 유세포 분석 플롯 및 요약. (도 7e) LILRB2-과발현된 또는 ctrl C1498 세포(마우스당 1 Х 106개 세포)를 i.v. 주사한 C57BL/6 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (도 7f-g) LILRB2-과발현된 또는 ctrl C1498 세포(마우스당 1 Х 106개 세포)를 i.v. 주사한 C57BL/6으로부터의 말초 혈액(PB)에서 골수 세포침윤의 대표적인 유세포 분석 플롯 및 요약. (도 7h-i) 백혈병 세포 이식 후 LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 C56BL/6 마우스로부터의 말초 혈액(PB)에서 백혈병 세포 침윤의 대표적인 유세포 분석 플롯 및 요약. LILRB2-과발현된 C1498 세포(마우스당 1 Х 106개 세포)를 C57BL/6 마우스에 주사한 다음 LALAPG Fc 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 LALAPG Fc 돌연변이된 IgG로 처리하였다. 말초 혈액(PB)으로부터의 백혈병 세포(GFP+)의 백분율은 이식 20일 후에 유세포 분석에 의해 결정되었다. (도 7j) LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 LALAPG Fc 돌연변이된 IgG 대조군으로 백혈병 세포 이식 후 지정된 시간에 처리된 C56BL/6 마우스로부터의 말초 혈액(PB)에서 골수 세포침윤의 요약.
도 8a-f. 길항성 LILRB2 mAb는 MLL -AF9 백혈병 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. (도 8a) LILRB2(LILRB2) 또는 대조군(Ctrl) 백혈병 세포로 형질도입된 PIRB-KO MLL-AF9 백혈병 세포에서 LILRB2의 발현. (도 8b-c) LILRB2(LILRB2) 또는 대조군 PirB-KO MLL-AF9(Ctrl) 백혈병 세포로 형질도입된 PirB-KO MLL-AF9 백혈병 세포로 이식된 C56BL/6 마우스로부터의 말초 혈액(PB)에서 백혈병 세포 침윤의 대표적인 유세포 분석 플롯 및 요약. (도 8d) LILRB2-과발현된 또는 Ctrl PirB-KO MLL-AF9 세포가 이식된 백혈병 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. (도 8e-f) PirB-KO LILRB2 백혈병 세포를 이식한 다음 LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 C56BL/6 마우스로부터의 말초 혈액(PB)에서 백혈병 세포 침윤의 대표적인 유세포 분석 플롯 및 요약.
도 9a-g. 항- LILRB2 항체는 AML 세포의 이동 및 침윤을 억제한다. (도 9a) THP-1 세포에 대한 LILRB2 발현은 상업적 피코에리트린(PE)-항-LILRB2 항체를 사용하여 확인하였다. (도 9b) 백혈병 이식 후 LALAPG Fc 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 LALAPG Fc 돌연변이된 IgG 대조군으로 처리된 NSG 마우스에서 백혈병 세포의 단기(20시간) 침윤. THP-1 세포(마우스당 1 Х 107개 세포)를 NSG 마우스에 주사한 다음 LALAPG 돌연변이된 IgG 대조군 또는 항-LILRB2 항체로 즉시 처리하였다. 골수(BM), 간(LV) 및 비장(SP)으로부터의 백혈병 세포(GFP+)의 수를 이식 20시간 후 유세포 분석에 의해 결정하고 말초 혈액(PB)에서의 수로 정규화하였다. (도 9c) THP-1 주사 후 LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 IgG 대조군으로 처리된 NSG 마우스에서 이식 후 21일째에 간(LV), 골수(BM), 비장(SP) 및 말초 혈액(PB)과 같은 표시된 기관에서 백혈병 세포(GFP+)의 백분율. (도 9d) 도 9b에 나타낸 각 마우스의 체중은 THP-1 세포 주사 후 지시된 날에 측정하였다. (도 9e) THP-1 이식 후 28일째에 및 LALAPG Fc 돌연변이를 포함하는 IgG 또는 항-LILRB2 항체로 처리된 NSG 마우스로부터의 간 크기의 비교. (도 9f) 각각의 개별 마우스 체중에 대해 정규화된 도 9e에 나타낸 간 중량의 정량화. (도 9g) THP-1 이식 후 LALAPG Fc 돌연변이된 IgG 대조군 또는 항-LILRB2 항체로 처리된 NSG 마우스의 생존 곡선.
도 10a-e. 길항성 LILRB2 mAb는 환자-유래 이종이식( PDX ) 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. (도 10a) AML M5 환자로부터의 1차 백혈병 세포에 대한 LILRB2 발현 패턴. (도 10b) 카플란-마이어 로그-순위 검정에 의한 TCGA 데이터베이스(https://xena.ucsc.edu)에서 AML-M5 환자(n = 132, 유전자 발현에 따라 두 그룹으로 나뉨)의 LILRB2 mRNA 수준과 전체 생존율 간의 상관관계 분석. (도 10c) 1차 AML-M5 백혈병 샘플로 이식되고 항-LILRB2 항체 또는 대조군 IgG로 처리된 NSG 마우스의 말초 혈액(PB), 골수(BM), 비장(SP) 및 간(LV)에서의 인간 CD45+CD33+ 백혈병 세포 침윤. (도 10d) LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 IgG 대조군의 존재하에서 배양된 1차 AML-M5 백혈병 세포의 대표적인 명시야 현미경 이미지. 항-LILRB2 처리된 세포는 더 부착된 분화 형태를 나타내었다. (도 10e) LALAPG 돌연변이된 항-LILRB2 항체 또는 IgG 대조군의 존재하에서 배양된 1차 AML-M5 백혈병 세포에 대한 CD68의 세포내 발현.
도 11a-g. 길항성 LILRB2 mAb는 시험관내에서 골수-유래 억제 세포( MDSC )의 T 세포 억제 기능을 예방할 수 있다. (도 11a) 하나의 대표적인 히스토그램은 길항성 LILRB2 mAb가 CD8+ T 세포에 대한 MDSC의 억제 기능을 약화시킴을 보여주었다. MDSC는 HLD-DRbright 세포를 고갈시킨 다음 autoMACS를 사용하여 CD14+ 세포를 농축함으로써 고형 종양 환자의 PBMC로부터 단리하였다. MDSC를 세포 증식을 모니터링하기 위해 CSFE로 미리 염색된 동일한 기증자(E: T = 1)로부터의 T 세포와 공동배양하였다. 10μg/mL LALAPG 돌연변이된 IgG, B2-7 또는 B2-19를 세포 배양물에 첨가하였다. CFSE 신호의 감소된 강도로 표시되는 증식성 T 세포의 백분율은 처리 5일 후 유세포 분석에 의해 결정되었다. (도 11b) T 세포에 대한 MDSC의 억제 기능에 대한 항-LILRB2 mAb의 효과의 정량화. CFSE 신호의 감소된 강도로 표시되는 증식성 T 세포(좌측 패널: CD8+ T 세포, 우측 패널 CD4+ T 세포)의 백분율은 처리 5-7일 후에 유세포 분석에 의해 결정되었다. (도 11c) 항-LILRB2 mAb는 T 세포 배양물의 상청액에서 IFN-γ 분비를 측정함으로써 평가되는, T 세포에 대한 MDSC의 억제 기능을 약화시켰다. (도 11d) 항-LILRB2 mAb는 MDSC에서 M2 대식세포 마커의 발현을 감소시키면서 M1 대식세포 마커의 발현을 증가시켰다. 고형 종양 환자의 말초 혈액으로부터 단리된 MDSC를 10μg/mL 항-LILRB2 항체와 함께 7일 동안 배양하였다. CD163, CD206 및 CD86의 발현을 유세포 분석으로 분석하였다. (도 11e) 항-LILRB2 mAb는 건강한 기증자로부터의 단핵구-유래 대식세포에서 M2 마커 발현을 감소시키면서 M1 마커 발현을 증가시켰다. 건강한 기증자의 말초 혈액으로부터 단리된 단핵구를 배양하고 10μg/mL 항-LILRB2 항체와 함께 7일 동안 항온처리하였다. CD163, CD206 및 CD86의 발현을 유세포 분석으로 분석하였다. (도 11f) 항-LILRB2 mAb는 난소암 환자로부터의 복수에서 종양 관련 대식세포/단핵구의 세포 표면에서의 M2 마커 발현을 감소시키면서 M1 마커 발현을 증가시켰다. CD14+ 세포를 autoMACS에 의해 복수로부터 단리하고 7일 동안 IgG4 Fc를 갖는 항-LILRB2 mAb와 함께 배양하였다. CD163, CD206 및 CD86을 유세포 분석으로 분석하였다. (도 11g) 항-LILRB2 mAb는 고형 종양 환자 4명 내지 5명으로부터의 MDSC에서 분비되는 M1 대식세포 사이토카인 및 케모카인을 증가시켰다.
도 12a-b. 양성 파지의 항체 서열 분석. (도 12a) 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 계통수. (도 12b) 24개의 양성 파지의 LILRB2에 대한 ELISA 결합.
도 13a-b. LILRB2에 대한 ELISA 결합 EC 50 . (도 13a) LILRB2 항체의 ELISA 결합 곡선. (도 13b) LILRB2 항체의 계산된 EC50 값.
도 14a-d. LILRB2 항체의 결합 특이성. (도 14a) LILR 패밀리의 다른 구성원의 항원에 대한 LILRB2 항체의 ELISA 결합. (도 14b-d) 항체 (도 14b) B2-10, (도 14c) B2-12 및 (도 14d) B2-18의 LILRB2 및 LILRA1에 대한 ELISA 결합 곡선의 비교.
도 15. LILRB2 항체의 에피토프 비닝(epitope binning) . 에피토프 비닝은 Octet RED 96 시스템에서 샌드위치 형식으로 수행되었다. 각각의 항체는 1차 항체로서 단백질 A 바이오센서에 부하되었다. 무관련 IgG로 바이오센서를 차단한 후, LILRB2 항원을 포획하고 바이오센서를 나머지 다른 항체(2차 항체)와 함께 추가로 배양하였다. "+"는 1차 항체가 2차 항체의 신호를 차단했음을 나타낸다. 동일한 빈에 속하는 항체는 다른 색상으로 강조 표시되었다.
도 16a-d. 항체에 의한 LILRB2 상의 결합 도메인. (도 16a) 개략도는 Fc 융합을 갖는 상이한 절단된 ECD 단백질을 보여준다. (도 16b) 정제된 융합 단백질의 SDS-PAGE. (도 16d) 상이한 절단된 단백질에 대한 항체의 ELISA 결합. (도 16d) 항체 결합 도메인의 요약.
도 17a-f. D1 및 D4에 대한 주요 잔기의 매핑. (도 17a-b) LILRB2 및 LILRB1의 (도 17a (서열 번호 593-595)) D1 및 (도 17b (서열 번호 596-597)) D4 도메인의 정렬. LILRB2와 LILRB1 사이에 상이하고 루프 영역에 노출되고 위치하는 영역은 상자로 표시된다. (도 17c-d) (도 17c (서열 번호 598-605)) D1 및 (도 17d (서열 번호 606-613)) D4 도메인에 대한 돌연변이의 서열. (도 17e-f) ELISA에 기반한 (도 17e) D1 및 (도 17f) D4 도메인의 돌연변이체에 대한 항체의 결합 소실. 야생형 B2-ECD에 비한 각 돌연변이체와의 결합의 퍼센트를 스택 막대 그래프로 플롯팅하였다.
도 18. 차단 항체의 친화도. 항체를 단백질 A 바이오센서에 포획하였다. 센서를 연속 희석된 LILRB2 용액에 300초 동안 침지시켜 결합시킨 다음 600초 동안 운동 완충액에 침지시켜 해리시켰다. 결합 및 해리 곡선은 파란색 실선으로 표시되고 두 상은 빨간색 점선으로 나뉜다.
도 19a-b. HEK293 세포에서 재조합적으로 생산된 인간 및 비인간 영장류( 시노몰구스 원숭이, cyno ) LILRB2에 대한 항체의 ELISA 결합 측정. (도 19a) 인간 LILRB2에 대한 ELISA 결합. (도 19c) cyno-LILRB2에 대한 ELISA 결합. 인간 LILRB2 또는 NHP-LILRB2의 세포외 도메인(ECD)과 마우스 IgG2a의 Fc의 융합 단백질을 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하고 항체를 그래프에 표시된 바와 같이 상이한 농도에서 적정하였다.
도 20a-b. 유세포 분석에 의한 단클론 항체에 의한 세포 표면 LILRB2 결합의 측정. (도 20a) LILRB2 리포터 세포에 대한 단클론 항체의 결합 능력의 정량화. 알로피코시아닌(APC) 염소 항-인간 IgG 2차 항체로 표지된 LILRB2 리포터 세포에서 유세포 분석기를 사용하여 단클론 항체를 스크리닝하였다. (도 20b) HCB2-5 및 HCB2-10 단클론 항체가 LILRB2 리포터 세포에 고도로 결합하고 HCB2-2가 LILRB2 리포터 세포에 약간 결합한다는 것을 보여주는 대표적인 유세포 분석 프로파일. NC: 표지되지 않은 리포터 세포. ISO: 리포터 세포 단독(ISO)을 APC와 접합된 2차 Ab(항-인간 Fc 특이적)와 함께 배양함. 숫자는 APC 또는 AF647의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 21. 세포 표면에서 발현되는 cyno - LILRB2에 결합하는 LILRB2 항체의 검출. N-말단 FLAG 태그가 있는 전장 cyno-LILRB2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 항체 결합을 검출하였다. 이소형 인간 IgG1은 흑색 선으로 표시된 대조군으로 사용되었으며 분홍색 실선 피크는 세포 표면 상의 cyno-LILRB2에 대한 LILRB2 항체의 결합을 나타낸다. 마우스-항-Flag 단클론 항체를 유세포 분석에 의한 검출에 사용하였다.
도 22. 고정된 LILRB2 항체에 의한 GFP 리포터 신호전달의 관여의 결정. NC, 음성 대조군 및 IgG, 이소형 대조군.
도 23a-b. K562 세포의 존재 또는 부재하에서 LILRB2 리포터 세포에서의 GFP 신호전달의 가용성 항체 관여의 결정. (도 23a) 가용성 항체와 함께 배양된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달. (도 23b) K562와 조합된 가용성 항체와 함께 배양된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달.
도 24a-b. LILRB2 단클론 항체에 의한 LILRB2의 특이 결합. (도 24a) LILRB2 mAb가 아닌 양성 대조군 mAb(POS)만 LILRA 리포터 세포(RC)에 결합한다는 것을 보여주는 대표적인 유세포 분석 프로파일. (도 24b) LILRB2 mAb가 LILRB2-발현 리포터 세포에는 결합하지만 LILRB 및 LAIR1을 발현하는 리포터 세포에는 결합하지 않는다는 것을 보여주는 대표적인 유세포 분석 프로파일. 양성 대조군 mAb(POS)의 결합은 각 수용체의 발현 수준을 입증한다. LILRB2 단클론 항체의 결합은 알로피코시아닌(APC)-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 특이 이차 항체를 사용하여 LILRA, LILRB 또는 LAIR1-발현 리포터 세포에서 유세포 분석을 사용하여 검출하였다. Non: 염색되지 않은 리포터 세포. NEG: 이차 Ab와만 배양된 세포. POS: 각각의 LIL 또는 LAIR-1 수용체에 대해 APC 또는 AF647과 접합된 상업용 항체와 함께 배양된 세포. 숫자는 APC 또는 AF647의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 25a-b. K562 세포에서 과발현된 HLA -G에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달에서 분석된 LILRB2 항체의 차단 활성. (도 25a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 K562 세포에서 과발현된 HLA-G가 LILRB2 리포터 세포의 GFP 유도를 자극한다는 것을 보여주었다. (도 25b) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 HCB2-5 및 HCB2-10이 K562 세포를 과발현하는 HLA-G에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. IgG, 이소형 대조군.
도 26a-c. 코팅된 ANGPTL2에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달에서 분석된 LILRB2 항체의 차단 활성. (도 26a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 HCB2-5 및 HCB2-10이 코팅된 ANGPTL2에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. (도 26b) 도 26a에 나타낸 GFP 백분율의 정량화. (도 26c) 코팅된 ANGPTL2에 의해 유도된 GFP 신호전달에 대한 HCB2-5 및 HCB2-10의 용량-의존적 억제 능력.
도 27a-c. 코팅된 SEMA4A에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달에서 분석된 HCB2 -5 및 HCB2 -10의 차단 활성. (도 27a) 대표적인 유세포 분석 프로파일은 HCB2-5 및 HCB2-10이 코팅된 SEMA4A에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포의 GFP 신호전달을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다. (도 27b) 도 27a에 나타낸 GFP 백분율의 정량화. (도 27c) 코팅된 SEMA4A에 의해 유도된 GFP 신호전달에 대한 HCB2-5 및 HCB2-10의 용량-의존적 억제 능력.
도 28a-b. 항체 VH 및 VL 계통수.
도 29. 세포 표면 상의 LILR 패밀리 단백질의 엑토도메인을 발현하는 리포터 세포주에 대한 LILRB2 항체의 결합. 결합된 항체는 AF647에 접합된 항-인간 Fc-특이 2차 항체(2차 Ab)로 검출되었다. AF647 또는 APC와 직접 접합된 상업적으로 이용 가능한 항체(Ctl+ Ab)를 사용하여 각 LILR의 발현을 확인하였다. 모든 배양은 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 표시된 데이터는 유세포 분석기에서 샘플 획득 후 평균 형광 강도이다.
도 30. 건강한 기증자로부터 채취한 인간 전혈로부터의 백혈구에 대한 LILRB2 항체의 결합. LILRB2 항체는 AF647과 직접 접합되었다. 100 마이크로리터의 전혈을 문헌(Hensley et al., J Vis Exp 2012; 67: 4302)에서 이용 가능한 프로토콜에 따라 세포 표면 마커에 대한 항체 및 LILRB2 항체와 함께 배양하였다. 표시된 데이터는 유세포 분석기(BD FACS Celesta)에서 샘플 획득 후 평균 기하 평균 형광 강도 ± 평균의 표준 오차(s.e.m., N=2명 기증자)이며 LILRB2 항체가 생략된 염색된 샘플의 배경 형광이 공제된다.
도 31. 전장 인간 LILRB2를 안정적으로 발현하는 HEK293에 대한 LILRB2 항체의 결합. 50,000개의 세포를 100μL의 최종 용적으로 LILRB2 항체의 연속 희석물(40-0.0006μg/mL)와 함께 배양하였다. 결합된 항체는 AF647에 접합된 항-인간 Fc-특이 2차 항체로 검출되었다. 모든 배양은 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 표시된 데이터는 유세포 분석기(BD FACS Celesta)에서 (이중으로) 샘플 획득 후 평균 기하 평균 형광 강도 ± 평균의 표준 오차(s.e.m.)이며 2차 항체 단독과 함께 배양된 샘플의 배경 형광이 공제된다.
도 32. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC로부터 단리된 CD14 + CD16 - 단핵구에 대한 LILRB2 항체의 결합. 50,000개의 세포를 100μL의 최종 용적에서 AF647에 직접 접합된 LILRB2 항체의 연속 희석물(40-0.0006μg/mL)과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 표시된 데이터는 한 기증자로부터의 유세포 분석기(BD FACS Celesta)에서 획득된 중복 샘플의 형광 강도의 평균 기하 평균이며 다른 기증자로부터 단리된 세포를 사용한 2개의 실험을 대표한다.
도 33. 경쟁 LILRB2 항체의 연속 희석물(40-0.0098μg/mL)의 존재하에서 전장 LILRB2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 대한 HLA -G-His( 5μg /mL) 결합의 억제. 결합된 HLA-G는 APC에 직접 접합된 항-His 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 검출되었다. 모든 배양은 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 표시된 데이터는 유세포 분석기(BD FACS Celesta)에서 획득된 중복 샘플로부터의 형광 강도의 평균 기하 평균 ± 평균의 표준 오차(s.e.m.)이다.
도 34. 경쟁 LILRB2 항체의 연속 희석물(40-0.0098μg/mL)의 존재하에서 HEK293_LILRB2 세포에 대한 SEMA4A -hFc-AF647(5㎍/mL) 결합의 억제. 배양은 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 표시된 데이터는 유세포 분석기(BD FACS Celesta)에서 획득된 중복 샘플로부터의 형광 강도의 평균 기하 평균 ± 평균의 표준 오차(s.e.m.)이다.
도 35. 50ng/mL LPS로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 TNF -α의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 LPS(Sigma-Aldrich) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석(Human Cytokine Premixed Magnetic Luminex Performance Assay)을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 36. 50ng/mL LPS로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IFN -γ의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 5명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 LPS(Sigma-Aldrich) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 37. 50ng/mL LPS로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IL-12p40의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체(40μg/mL)의 효과(총 N=3 공여자로부터). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 LPS(Sigma-Aldrich) 및 40μg/mL의 B2-19 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. IL-12p40 농도는 인간 IL-12 ELISA 분석(BD Biosciences)을 사용하여 배양 배지 상등액에서 측정하였다.
도 38. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IFN-γ의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 39. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 TNF-α의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 40. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 GM-CSF의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 41. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IL-1α의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 42. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IL-1β의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 43. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 IL-6의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 5명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 44. 10ng/mL 항-CD3 활성화 항체 HIT3a로 자극된 PBMC에 의해 분비되는 CXCL2의 수준에 대한 LILRB2 차단 항체의 효과. 표시된 데이터는 2명의 기증자로부터의 것이며 6명의 기증자로부터의 것을 대표한다(총 N=6명의 기증자). 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 HIT3a(Biolegend) 및 다양한 농도의 항체와 함께 3일 동안 (이중으로) 배양하였다. 인간 사이토카인 사전혼합 자기 루미넥스 성능 분석을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인을 측정하였다.
도 45. 단핵구-유래 대식세포 표면 마커에 대한 10μg /mL B2-19 항체의 효과. 건강한 기증자로부터의 인간 PBMC로부터 단리된 CD14+CD16- 단핵구를 100ng/mL의 인간 CSF-1의 존재하에 6일 동안 대식세포로 분화시킨 다음 100ng/mL의 인간 CSF-1, 20ng/mL 인간 IL-4 및 B2-19 항체 또는 이소형 대조군과 함께 24시간 배양하였다. 세포를 분리하고 표준 프로토콜을 사용하여 유세포 분석(FACS Celesta)을 위해 염색하였다. 표시된 데이터는 B2-19로 처리된 세포 대 이소형 대조군으로 처리된 세포에 대한 기하 평균 형광 강도(MFI)의 배수 변화이다.
도 46. CD8 + T 세포 상의 CD25의 세포 표면 발현에 대한 40μg /mL B2-19 항체의 효과. 건강한 기증자로부터 단리된 PBMC를 10ng/mL의 HIT3a(Biolegend) 및 40μg/mL의 B2-19 항체와 함께 3일 동안 배양하였다. CD8+ T 세포를 표준 프로토콜을 사용하여 유세포 분석(FACS Celesta)에 의해 세포 표면 CD25 발현에 대해 분석하였다. 표시된 데이터는 B2-19로 처리된 세포 대 이소형 대조군으로 처리된 세포에 대한 기하 평균 형광 강도(MFI)의 변화율 퍼센트이다.
도 47. B2-19 항체는 ( 관용원성 DC를 유도하기 위해) IL-10으로 2일 동안 처리된 미성숙 DC에서 사이토카인 및 케모카인의 생산을 향상시킨다. 각 선은 다른 기증자로부터의 결과를 나타낸다.
도 48. B2-19 항체는 여러 세포 표면 마커의 발현 변화에 의해 입증된 바와 같이 LPS로 처리된 DC의 전염증성 표현형을 향상시켰다. 각 선은 다른 기증자로부터의 결과를 나타낸다.
도 49. B2-19 항체는 C57BL /6J 야생형 마우스에서 5mg/kg으로 투여된 인간 IgG4의 예상되는 약동학 프로파일(CL 및 반감기)을 나타낸다.
도 50a-b. (도 50a) B2-19 항체 단일요법은 SK- MEL -5 흑색종 세포주로 이종이식된 인간화 NSG - SGM3 마우스에서 종양 성장 속도를 감소시킨다. ( 도 50b) B2-19 항체 단일요법은 SK- MEL -5 흑색종 세포주로 이종이식된 인간화 NSG -SGM3 마우스에서 종양 성장 억제를 유발한다.
도 51. 대표적인 유세포 분석 프로파일은 코팅된 인간 ANGPTL2 ( hANGPLT2 ) 및 마우스 Angptl2(mAngptl2)가 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 자극하고 B2-19가 코팅된 hANGPLT2 및 mAngptl2에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다.
도 52. 대표적인 유세포 분석 프로파일은 코팅된 인간 CD1d ( hCD1d ) 및 마우스 CD1d(mCD1d)가 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 자극하고 B2-19가 코팅된 hCD1d 및 mCD1d에 의해 활성화된 LILRB2 리포터 세포에서 GFP 발현을 효과적으로 차단한다는 것을 보여주었다.
예시적인 실시양태의 설명
본 발명자들은 LILRB2가 선천성 면역과 후천성 면역 둘 다의 조절에서 중요한 역할을 한다는 것을 알아내었다. LILRB2는 정상 단핵구, 수지상 세포, 과립구 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)와 같은 여러 유형의 면역 세포에서 발현된다. 본 발명자들은 암 및 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있는 LILRB2 단백질을 인식하는 신규 단클론 항체 패널을 단리하였다. 이러한 항-LILRB2 항체 패널 내에는, LILRB2 신호전달의 길항제 및 효능제의 예가 있다.
본 개시내용의 하기 설명은 단지 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이, 논의된 특정 수정은 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 등가물, 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이며, 이러한 등가 실시양태는 본원에 포함되는 것으로 이해된다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다
I. 정의
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적인 것이며 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 특별히 달리 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including)" 뿐만 아니라 "포함한다(includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소(element)" 또는 "성분(component)"과 같은 용어는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 성분 및 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분 둘 다를 포함한다. 또한, "일부"라는 용어의 사용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±10%까지의 변동을 포함하는 것을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 개시된 주제에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 자릿수의 관점에서 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 야기되는 특정 오류를 함유한다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 온전한 면역글로불린, 또는 이의 단편을 지칭하며, 예를 들어, 키메라, 인간화, 완전 인간, 및 이중특이 항체를 포함한다. "항체"는 항원 결합 단백질의 종류이다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에는 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 자연적으로 발생하는 항체와 같이 더 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터 단독으로 유래될 수 있거나 "키메라"일 수 있으며, 즉 항체의 상이한 부분은 하기에 추가로 기술된 바와 같이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체 또는 결합 단편은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예는 아래에 기술되어 있다. 또한, 명시적으로 제외되지 않는 한, 항체는 단클론 항체, 이중특이 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨) 및 이의 단편을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어는 또한 펩티바디를 포함한다.
자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 이러한 각각의 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄"(특정 실시양태에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중쇄"(특정 실시양태에서, 약 50-70kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 서브클래스를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 서브클래스를 갖는다. IgA는 유사하게 IgA1 및 IgA2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 서브클래스로 세분화된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology, Ch.　7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (모든 목적을 위해 전문이 참고로 포함됨)]을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에 대략 아미노-말단 120 내지 130개 아미노산 및 경쇄에 약 100 내지 110개 아미노산 말단 아미노산을 포함하는, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체간에도 아미노산 서열이 크게 다르다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 이의 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.
가변 영역은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에의 아미노산의 할당은 전형적으로 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987) or Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989).
특정 실시양태에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재하에서 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재하에서 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄의 부재하에서 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄의 부재하에서 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 개별 가변 영역은 다른 가변 영역의 부재하에서 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, CDR의 명확한 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해결하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해결함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 X-선 결정학과 같은 당업계의 숙련가들에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다양한 분석 방법을 사용하여 CDR 영역을 확인하거나 근사화할 수 있다. 이러한 방법의 예는 Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의 및 계약 정의를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Kabat 정의는 항체의 잔기 번호를 매기기 위한 표준이며 전형적으로 CDR 영역을 식별하는데 사용된다. 예를 들면, 문헌[Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000)]을 참조한다. Chothia 정의는 Kabat 정의와 유사하지만, Chothia 정의는 특정 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다. 예를 들면, 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]을 참조한다. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 Oxford Molecular Group에 의해 생산된 통합 컴퓨터 프로그램 제품군을 사용한다. 예를 들면, 문헌[Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]을 참조한다. AbM 정의는 지식 데이터베이스 및 Samudrala 등에 의해 기술된 것[참조; "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)]과 같은 ab initio 방법의 조합을 사용하여 1차 서열로부터의 항체의 3차 구조를 모델링한다. 계약 정의는 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 예를 들면, 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)]을 참조한다.
관례상, 중쇄의 CDR 영역은 전형적으로 H1, H2 및 H3으로 지칭되며 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다. 경쇄의 CDR 영역은 전형적으로 L1, L2 및 L3으로 지칭되며 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호가 매겨진다.
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 포함한다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카복실-말단에 있으며, CH3은 폴리펩티드의 카복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위유형 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 하위유형 포함), IgM 및 IgE를 포함한 모든 이소형일 수 있다.
이중특이 또는 이기능성 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면 문헌[Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)]을 참조한다.
용어 "항원"은 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 구체적으로, 항원은 적응 면역 반응의 수용체에 대한 표적으로 작용하는 물질이다. 전형적으로, 항원은 항원-특이 수용체에 결합하지만 스스로 체내에서 면역 반응을 유도할 수 없는 분자이다. 항원은 통상적으로 단백질 및 다당류이며 덜 빈번하게는 지질이기도 하다. 적합한 항원은 박테리아의 일부(피막, 캡슐, 세포벽, 편모, 섬유소, 및 독소), 바이러스 및 기타 미생물을 제한 없이 포함한다. 항원은 또한 종양 항원, 예를 들어 종양의 돌연변이에 의해 생성된 항원을 포함한다. 본원에 사용된 항원은 또한 면역원 및 합텐을 포함한다.
본원에 사용된 "항원 결합 단백질"("ABP")은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 본 출원에서, 특정 표적 항원은 LILRB 단백질 또는 이의 단편이다. "항원 결합 단백질"은 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티바디는 항원 결합 단백질의 또 다른 예이다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 일부를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체, 또는 항원에 결합하지만 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 항체로부터 유래되지 않고 오히려 수용체로부터 유래된다. 항원-결합 단편의 예는 제한 없이 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 안정화된 디아바디(ds 디아바디), 단일-쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 디아바디), 다중특이 항체, 단일 도메인 항체(sdAb), 낙타과 항체 또는 나노바디, 도메인 항체, 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 이식된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 수용체로부터 유래되고 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 항원-결합 단편이 유래되는 수용체의 천연 리간드에 결합하지 않는다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 VH 도메인과 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 일부 및 하나의 경쇄를 포함한다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성되도록 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역이 없다.
"단일-쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하고, 이것이 항원 결합 영역을 형성하는 Fv 분자이다. 단일 쇄 항체는 국제 특허 출원 공개 제WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에 상세하게 논의되어 있으며, 이의 개시내용은 참고로 포함된다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 영역은 2가 도메인 항체를 생성하기 위해 펩티드 링커와 공유 결합된다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
"2가 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 2가 항원 결합 단백질 및 2가 항체는 이중특이적일 수 있다(하기 참조). "다중특이성" 또는 "다기능성" 항체 이외의 2가 항체는, 특정 실시양태에서, 전형적으로 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다.
"다중특이 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이 항체"는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
"이중특이성(bispecific)", "이중특이성(dual-specific)" 또는 "이기능성(bifunctional)" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이 항원 결합 단백질 및 항체는 다중특이 항원 결합 단백질 항체의 종류이며, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, 1990,　Clin. Exp. Immunol.　79:315-321; Kostelny et al., 1992,　J. Immunol.　148:1547-1553]을 참조한다. 이중특이 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 예시 및 예시적 실시양태는 하기에 기술되어 있다.
특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적인" 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 그 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 예를 들면, 본 발명의 LILRB2 특이 항체는 LILRB2에 특이적이다. 일부 실시양태에서, LILRB2에 결합하는 항체는
Figure pct00001
100 nM,
Figure pct00002
10 nM,
Figure pct00003
1 nM,
Figure pct00004
0.1 nM,
Figure pct00005
0.01 nM, 또는
Figure pct00006
0.001 nM (예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어 10-9M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 본원에서 사용된 해리 상수 Kd는 결합 속도에 대한 해리 속도의 비율(koff/kon)을 지칭하며, 이는 표면 플라즈몬 공명 방법, 미세규모 열영동법, HPLC-MS법 및 유세포 분석법(예를 들어 FACS)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, Kd 값은 유세포 분석을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)과 관련하여 사용될 때 용어 "경쟁하다"는 시험되는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)이 공통 항원(예를 들어, LILRB 또는 이의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 참조 항체)의 특이 결합을 방지 또는 억제(예를 들어, 감소)하는 분석에 의해 결정된 바와 같은 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 의미한다. 다수 유형의 경쟁적 결합 분석, 예를 들면: 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, 참조; Stahli et al., 1983,　Methods in Enzymology　9:242-253); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 참조; Kirkland et al., 1986,　J. Immunol.　137:3614-3619) 고체상 직접 표지된 분석, 고체상 직접 표지된 샌드위치 분석(예를 들어, 참조; Harlow and Lane, 1988,　Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); 1-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 참조; Morel et al., 1988,　Molec. Immunol.　25:7-15); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 참조; Cheung, et al., 1990,　Virology　176:546-552); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand.　J. Immunol.　32:77-82)을 사용하여 한 항원 결합 단백질이 다른 단백질과 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질(경쟁 항원 결합 단백질)은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 입체 장애가 발생하기 위해 참조 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가 세부사항은 본원의 실시예에 제공된다. 통상적으로, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 이상 억제(예를 들어 감소)할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 이상까지 억제된다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 그룹을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성되고 이들의 1차 구조를 기반으로 하는 항체와 상호작용한다. 반면에, 구조적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속적인 부분으로 구성되며 항원의 3차원 구조를 기반으로 하는 항체와 상호작용한다. 일반적으로, 에피토프는 길이가 대략 5개 또는 6개의 아미노산이다. 2개의 항체가 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우 항원 내에서 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 "세포"는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 원핵 세포는, 예를 들면, 박테리아를 포함한다. 진핵 세포는, 예를 들면, 진균, 식물 세포 및 동물 세포를 포함한다. 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포 또는 인간 세포)의 유형은, 예를 들면, 순환/면역계 또는 기관으로부터의 세포, 예를 들어 B 세포, T 세포(세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포 , 조절 T 세포, T 헬퍼 세포), 자연 살해 세포, 과립구(예를 들어, 호염기구 과립구, 호산구 과립구, 호중구 과립구 및 과분절 호중구), 단핵구 또는 대식세포, 적혈구(예를 들어, 망상적혈구), 비만 세포, 혈소판 또는 거핵구, 및 수지상 세포; 내분비계 또는 기관으로부터의 세포, 예를 들어, 갑상선 세포(예를 들어, 갑상선 상피 세포, 난포방 세포), 부갑상선 세포(예를 들어, 부갑상선 주 세포, 호산 세포), 부신 세포(예를 들어, 크롬친화 세포), 및 송과체 세포(예를 들어, 송과체 세포); 신경계 또는 기관의 세포, 예를 들어, 교모세포(예를 들어, 성상교세포 및 희돌기아교세포), 소교세포, 대세포성 신경분비 세포, 성상 세포, 보에처 세포(boettcher cell) 및 뇌하수체 세포(예를 들어, 고나도트로프, 코르티코트로프, 티로트로프, 소마토트로프, 및 락토트로프); 호흡기계 또는 기관의 세포, 예를 들어, 폐포세포(I형 폐포세포 및 II형 폐포세포), 클라라 세포, 배상 세포, 및 폐포 대식세포; 순환계 또는 기관으로부터의 세포(예를 들어, 심근세포 및 혈관주위세포); 소화계 또는 기관으로부터의 세포, 예를 들어 위 주세포, 체벽 세포, 배상 세포, 파네스 세포, G 세포, D 세포, ECL 세포, I 세포, K 세포, S 세포, 장내분비 세포, 장크롬친화 세포, APUD 세포, 및 간 세포(예를 들어, 간세포 및 쿠퍼 세포); 외피계 또는 기관으로부터의 세포, 예를 들어 뼈 세포(예를 들어, 골아세포, 골세포, 및 파골세포), 치아 세포(예를 들어, 백아모세포 및 법랑모세포), 연골 세포(예를 들어, 연골모세포 및 연골세포), 피부/모발 세포(예를 들어, 삼모세포, 각질세포, 및 멜라닌 세포(모반 세포), 근육 세포(예를 들어, 근세포), 지방세포, 섬유아세포 및 힘줄 세포; 비뇨기 계통 또는 기관으로부터의 세포(예를 들어, 족세포, 방사구체 세포, 사구체내 혈관사이 세포, 사구체외 혈관사이 세포, 신장 근위 세뇨관 털 연변부 세포 및 치밀 반점 세포); 및 생식계 또는 기관으로부터의 세포(예를 들어, 정자, 세르톨리 세포, 라이디히 세포, 난자, 난모세포)를 포함한다. 세포는 정상적이고 건강한 세포; 또는 병에 걸리거나 건강하지 않은 세포(예를 들어, 암세포)일 수 있다. 세포는 포유동물 접합자 또는 배아 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포를 추가로 포함한다. 줄기 세포는 미분화 상태를 유지하여 특수한 세포 유형으로 분화하면서 세포 분열의 주기를 겪을 수 있는 세포이다. 줄기 세포는 전능 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 다능 줄기 세포, 올리고능 줄기 세포 및 단능 줄기 세포일 수 있으며, 이들 중 어느 것은 체세포로부터 유도될 수 있다. 줄기 세포는 또한 암 줄기 세포를 포함할 수 있다. 포유동물 세포는 설치류 세포, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 토끼목(lagomorpha) 세포, 예를 들어 토끼 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 또한 영장류 세포, 예를 들어 인간 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 도메인 또는 신호전달, 예를 들어 면역 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포를 활성화하는 T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인에 연결된 항체(예를 들어, 단일 쇄 가변 단편(scFv))의 항원 결합 도메인을 함유하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다(예를 들어, 참조; Kershaw et al., supra, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), and Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol. 21(2): 215-223 (2009)). CAR은 단클론 항체의 항원-결합 특성을 이용하여 MHC-비제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 면역 세포 특이성 및 반응성을 재지정할 수 있다. MHC-비제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 면역 세포에 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 부여하여 종양 탈출의 주요 메커니즘을 우회한다. 또한, T-세포에서 발현될 때, CAR은 유리하게 내인성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 명시된 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 명시된 성분 중 어느 것도 조성물로 의도적으로 제형화되지 않고/않거나 오염 물질로서 또는 미량으로만 존재한다는 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서 조성물의 의도하지 않은 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있어 관심 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 이 용어는 관심 유전자가 존재하는 한, 자손이 형태나 유전적 구성이 원래의 모세포와 동일한지 여부에 관계없이 모세포의 자손을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는 바와 같이 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트"는 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자 중 가장 작은 크기를 기준으로 하여 계산된다. 이러한 계산을 위해, 정렬의 갭(있는 경우)은 바람직하게는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 처리된다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988,　SIAM J. Applied Math.　48:1073]에 기술된 것들을 포함한다.
동일성 퍼센트를 계산하는데 있어서, 비교되는 서열은 전형적으로 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이며, 이는 GAP를 포함한다(Devereux et al., 1984,　Nucl. Acid Res.　12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트를 결정하고자 하는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 사용되다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드(알고리즘에 의해 결정된 "일치된 범위")의 최적 일치를 위해 정렬된다. 갭 개방 패널티(3X 평균 대각선으로 계산되며, 여기서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각 완벽한 아미노산 일치에 할당된 점수 또는 숫자이다) 및 갭 확장 패널티(통상적으로 갭 개방 패널티의 1/10이다) 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, 표준 비교 매트릭스(참조; Dayhoff et al., 1978,　Atlas of Protein Sequence and Structure　5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992,　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.　89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있는 매개변수의 예는 문헌[Needleman et al., 1970,　J. Mol. Biol.　48:443-453]에서 찾을 수 있다.
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 2개의 서열 중 단지 짧은 영역의 매칭을 초래할 수 있고, 이러한 작은 정렬된 영역은 2개의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 원하는 경우 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 또는 다른 갯수의 연속 아미노산에 걸쳐 있는 정렬을 생성하도록 조정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결"은 분자내 상호작용, 예를 들어 공유 결합, 금속 결합, 및/또는 이온 결합, 또는 분자간 상호작용, 예를 들어 수소 결합 또는 비공유 결합을 통한 회합을 지칭한다.
백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2(LILRB2)는 인간에서 LILRB2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 이 유전자는 염색체 영역 19q13.4의 유전자 클러스터에서 발견되는 백혈구 면역글로불린-유사 수용체(LIR) 패밀리의 구성원이다. 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막관통 도메인, 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 포함하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 클래스에 속한다. 수용체는 골수 세포에서 발현된다; 이것은 HLA 클래스 I 분자, ANGPTL, 미엘린 억제제(Nogo66, MAG 및 OMgp 포함) 및 β-아밀로이드를 포함한 다수 유형의 리간드에 결합하여 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 전달한다. 염증 반응과 세포독성을 조절하는 것이 면역 반응을 집중시키고 자가반응성을 제한하는데 도움을 주는 것으로 생각된다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기술된 성분들이 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성되어 있는 구성요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드에 작동 가능하게 연결된 주어진 신호 펩티드는 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 지시한다. 프로모터의 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 발현을 지시할 것이다. 프로모터 또는 다른 조절 요소는 이의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 예를 들면, 번역되지 않고 아직 전사된 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하기 위해 명시적으로 나타내지 않거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 본 개시내용은 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침한다. 본원에 사용된 " 또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 다를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 두 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드간 연결 변형을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질, 즉 자연 발생 및 비재조합 세포에 의해 생성된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미하거나; 이것은 유전자-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생성되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생-아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 부가 및/또는 치환을 갖는 LILRB 항원 결합 단백질, 항체 또는 서열을 구체적으로 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 천연 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 단편은 또한 천연 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단편은 길이가 약 5 내지 500개 아미노산이다. 예를 들면, 단편은 길이가 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적 기능 단편을 포함한다. LILRB-결합 항체의 경우, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 영역 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 유용한 약제학적으로 허용되는 담체는 관례적이다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 본원에 개시된 융합 단백질의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다. 일반적으로, 담체의 특성은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 통상적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 산제, 환제, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는, 예를 들면, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 더하여, 투여될 약제학적 조성물은 습윤제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등과 같은 무독성 보조 물질, 예를 들면 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 소량 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 다수의 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시되는 인간을 지칭하는 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸리거나 이에 취약할 수 있지만 질환 또는 장애의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효 투여량"은 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 약물의 투여량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들면, 암을 치료하기 위한 본원에 개시된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용과 관련하여, 치료학적 유효량은 종양 용적을 감소시키고, 종양의 전부 또는 일부를 박멸하고, 종양 성장 또는 다른 기관으로의 암세포 침윤을 억제 또는 감속시키고, 암성 상태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하고, 종양 세포 전이를 억제 또는 감속시키고, 종양 또는 암성 상태와 관련된 임의의 증상 또는 마커를 개선하고, 종양 또는 암성 상태, 또는 이들의 일부 조합의 발병을 예방 또는 지연시킬 수 있는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여량 또는 농도이다.
본원에 사용된 상태의 "치료하는" 또는 "치료"는 상태를 예방 또는 완화하고, 상태의 발병 또는 발병 속도를 늦추고, 상태가 발생할 위험을 감소시키고, 상태와 관련된 증상의 발달을 예방하거나 지연시키고, 상태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키고, 상태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 생성하고, 상태를 치유하거나 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내로 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 복제 기점과 같은 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 선택 가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시켜 세포가 세포에 고유의 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅 등과 같은 세포 내로의 핵산의 진입을 달성하는데 도움이 되는 물질을 포함한다.
II. LILRB2 관련 질환
LILRB2는 골수 세포표현형의 주요 조절자로 확인되었다. LILRB2의 활성화는 골수 세포의 전염증 활성을 억제한다. 억제/항염증 표현형을 갖는 골수 세포는 T 세포의 활성화, 증식 및 세포독성 활성을 하향조절할 수 있는 반면, LILRB2의 조절은 암, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 포함한 상태 및 장애에서 치료적 사용에 잠재성을 갖는다.
과증식성 질환은 세포가 통제할 수 없을 정도로 번식하기 시작하는 임의의 질환과 연관될 수 있지만, 대표적인 예는 암이다.
암의 예는 일반적으로 고형 종양 및 혈액 암으로 분류될 수 있다. 고형 종양은 부신암, 담관 암종, 골암, 뇌암(예를 들어, 성상세포종(astrocytoma), 뇌간 신경교종(brain stem glioma), 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌실막종(ependymoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 수모세포종(medulloblastoma), 수막종(meningioma), 희돌기교종(oligodendroglioma), 척수 축 종양(spinal axis tumor)), 유방암(청각 신경종(acoustic neuroma), 기저 유방 암종(basal breast carcinoma), 유관 암종(ductal carcinoma) 및 소엽 유방 암종(lobular breast carcinoma) 포함), 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 결장직장암, 식도암, 안암, 위암, 교모세포종, 두경부암, 신장암(빌름스 종양(Wilms tumor) 포함), 간암(간세포 암종(hepatocellular carcinoma)(HCC) 포함), 폐암(기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)(편평/비편평), 세기관지폐포 세포 폐암(bronchioloalveolar cell lung cancer), 유두 선암종(papillary adenocarcinomas) 포함), 중피종(mesothelioma), 흑색종, 메르켈 세포암(merkel cell cancer), 비인두 암종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 음경암, 송과체종(pinealoma), 전립선암, 신세포암, 망막모세포종(retinoblastoma), 육종(연골육종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 골원성 육종(osteogenic sarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 활막 육종(synovial sarcoma) 포함), 피부암(기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma) 포함), 고환암(정상피종(seminoma) 포함), 흉선 암종, 갑상선암(예를 들어, 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 갑상선 유두 암종(papillary thyroid carcinoma)), 자궁암, 및 질암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈액 암은 모세포 형질세포양 수지상 세포 신생물(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, BPDCN), 중쇄 질환(heavy chain disease), 백혈병(급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia)(ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML)(급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia)(APL) 또는 M3 AML, 급성 골수단구성 백혈병(acute myelomonocytic leukemia) 또는 M4 AML, 급성 단핵구 백혈병(acute monocytic leukemia) 또는 M5 AML을 포함하지만 이에 제한되지 않음), B-세포 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia)(CLL), 만성 골수단구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia)(CMML), 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic leukemia)(CML), 전-B 급성 림프구성 백혈병(pre-B acute lymphocytic leukemia)(Pre-B ALL), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)(DLBCL), 외부 결정성 NK/T-세포 림프종(extranodal NK/T-cell lymphoma), 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), HHV8-관련 원발성 삼출 림프종(HHV8-associated primary effusion lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), T-세포/조직구 풍부 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte-rich B-cell lymphoma)을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 림프종(호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)을 포함하지만 이에 제한되지 않음), 다발성 골수종(multiple myeloma)(MM), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes)(MDS), 골수증식성 신생물(myeloproliferative neoplasm), 및 진성 다혈구증(polycythemia vera)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역요법은 오래 지속되는 항종양 효과를 달성할 수 있는 큰 가능성을 지닌다. 면역 체크포인트 PD-1 및 CTLA-4 차단 요법은 일부 유형의 암을 치료하는데 성공적이었지만 다른 암은 치료하지 못했다. 이러한 면역요법은 T 세포 상의 억제 분자를 표적으로 하여 종양 미세환경(TME) 내에서 기능 장애 T 세포를 재활성화한다. 단핵구 세포를 포함한 다른 면역 세포 집단은 T 세포보다 훨씬 더 많은 수로 TME에 존재한다. 사실, 단핵구-유래 대식세포는 종양 조직에서 가장 풍부한 면역 세포 집단이다. 이러한 선천적 세포는 종양 세포를 죽이고 T 세포를 프라이밍하거나 재활성화하는 능력을 가지고 있지만, TME에서 기능을 제대로 못하게 되어 종양 발달을 지원하고 면역 감시 및 공격을 억제하는 MDSC 및 종양 관련 대식세포(TAM)로 변한다. 단핵구 MDSC(M-MDSC) 및 다형핵 MDSC(PMN-MDSC)를 포함한 MDSC는 최종 분화에 실패한 미성숙 골수 세포의 이종 집단을 나타낸다. TAM은 TME에서 혼합 대식세포 집단이다. 이들은 항염증성이며 나쁜 예후와 관련이 있다. 표현형 적응성에도 불구하고, MDSC 및 TAM은 이들의 면역억제 기능에 의해 정의된다. 이러한 면역-억제 단핵구 세포의 트래피킹을 제거, 재프로그래밍 또는 차단하는 것이 매력적인 항암 치료 전략이 되고 있다.
LILRB2는 TME에서 MDSC 및 TAM 상에서 발현된다. 골수-풍부 고형 종양에서 LILRB2의 치료적 차단은 T 세포 체크포인트 억제제에 반응하지 않거나 재발하는 질환을 나타내는 환자에서 항종양 면역 반응을 재활성화하거나 향상시킬 가능성을 갖는다.
골수 세포에서의 LILRB2 발현은 자가면역 및 염증성 질환에 관여된 시스템을 조절할 수 있다. 치료적 활성화 또는 효능화 LILRB2는 자가면역 또는 염증성 질환을 치료할 가능성을 갖는다.
자가면역 또는 염증성 질환은 후천성 면역결핍 증후군(Acquired Immunodeficiency Syndrome)(AIDS, 자가면역 성분이 있는 바이러스성 질환), 원형 탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역 애디슨병(autoimmune Addison's disease), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 내이 질환(autoimmune inner ear disease)(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome)(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(autoimmune thrombocytopenic purpura)(ATP), 베체트병(Behcet's disease), 심근병증(cardiomyopathy), 복강 스프루-피부염 헤페티포르미스(celiac sprue-dermatitis hepetiformis); 만성 피로 면역 기능장애 증후군(chronic fatigue immune dysfunction syndrome)(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)(CIPD), 반흔성 유천포창(cicatricial pemphigold), 한랭응집소병(cold agglutinin disease), 크레스트 증후군(crest syndrome), 크론병(Crohn's disease), 디고병(Degos' disease), 소아 피부근염(dermatomyositis-juvenile), 원판상 루푸스(discoid lupus), 본태성 혼합 한랭글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근육통-섬유근육염(fibromyalgia-fibromyositis), 그레이브스병(Graves' disease), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 감소증 자반병(idiopathic thrombocytopenia purpura)(ITP), IgA 신병증(IgA nephropathy), 인슐린-의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus), 소아 만성 관절염(juvenile chronic arthritis)(스틸병(Still's disease)), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 메니에르병(Meniere's disease), 혼합 결합 조직 질환(mixed connective tissue disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 중증 빈혈(pemacious anemia), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다발연골염(polychondritis), 다선성 증후군(polyglandular syndrome), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발근염(polymyositis) 및 피부근염(dermatomyositis), 원발성 무감마글로불린혈증(primary agammaglobulinemia), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's phenomena), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스 열(rheumatic fever), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 전신 피부경화증(systemic scleroderma), 진행성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis)(PSS), 전신 경화증(systemic sclerosis)(SS), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 강직-인간 증후군(stiff-man syndrome), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)(SLE), 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 측두 동맥염(temporal arteritis)/거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)(IBD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 콘병(Cohn's disease), 장 점막 염증(intestinal mucosal inflammation), 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증과 관련된 소모성 질환(wasting disease associated with colitis, uveitis, vitiligo and Wegener's granulomatosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 천식(asthma), 아토피성 알레르기(atopic allergy), 알레르기(allergy), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 기관지 천식(bronchial asthma), 습진(eczema), 사구체신염(glomerulonephritis), 이식편 대 숙주병(graft vs. host disease), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 골관절염(osteoarthritis), 패혈증(sepsis), 뇌졸중(stroke), 조직 및 장기의 이식, 혈관염(vasculitis), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 인공호흡기 유도된 폐 손상(ventilator induced lung injury), 바이러스 감염, 자가면역 당뇨병(autoimmune diabete) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염증성 장애는, 예를 들면, 만성 및 급성 염증성 장애를 포함한다.
III. 단클론 항체 및 이의 생산
본원에 기술된 단클론 항체는 표준 방법을 사용하여 제조한 다음 스크리닝, 특성화 및 기능 평가를 수행할 수 있다. 가변 영역을 서열분석한 다음 인간 발현 벡터에 서브클로닝하여 키메라 항체 유전자를 생성할 수 있으며, 이를 그후 발현 및 정제한다. 이러한 키메라 항체는 항원 결합, 신호전달 차단 및 이종이식 실험에서 시험할 수 있다. 본원에 기술된 단클론 항체는 또한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 여기서 파지 디스플레이된 인간 scFv의 큰 라이브러리는 표적 단백질에 대해 패닝된다. 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 선택된 인간 scFv를 서열분석한 다음 인간 발현 벡터로 서브클로닝하여 원하는 인간 항체를 생산할 수 있다.
A. 일반적인 방법
LILRB2에 결합하는 단클론 항체는 여러 용도를 가짐을 이해할 것이다. 이들은 암을 검출 및 진단하는데 뿐만 아니라 암 치료법에도 사용하기 위한 진단 키트의 생산을 포함한다. 이러한 맥락에서, 이러한 항체를 진단제 또는 치료제에 연결하거나, 이들을 경쟁 분석에서 포획제 또는 경쟁자로 사용하거나, 추가 제제를 부착하지 않고 개별적으로 사용할 수 있다. 항체는 아래에 추가로 논의되는 바와 같이 돌연변이되거나 변형될 수 있다. 항체를 제조 및 특성화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 참조; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호).
단클론 항체(MAb)를 생성하는 고전적인 방법은 일반적으로 다클론 항체를 제조하는 방법과 동일한 라인을 따라 시작된다. 이 두 가지 방법의 첫 번째 단계는 적절한 숙주의 면역화이다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 면역화를 위한 주어진 조성물은 면역원성이 다양할 수 있다. 따라서 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 운반체에 커플링함으로써 달성될 수 있는 바와 같이 숙주 면역계를 부스트하는 것이 종종 필요하다. 예시적이고 바람직한 운반체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 난백알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 다른 알부민도 운반체로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 운반 단백질에 접합시키는 수단은 당업계에 잘 알려져 있으며, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카르보디이미드 및 비스-비아조화 벤지딘을 포함한다. 또한 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 아주반트로 알려진 면역 반응의 비특이 자극제의 사용에 의해 향상될 수 있다. 예시적이고 바람직한 아주반트는 완전 프로인트 아주반트(사멸된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 함유하는 면역 반응의 비특이 자극제), 불완전 프로인트 아주반트 및 수산화알루미늄 아주반트를 포함한다.
다클론 항체의 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 특성 뿐만 아니라 면역화에 사용되는 동물에 따라 다르다. 면역원을 투여하는데 다양한 경로가 사용될 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 다클론 항체의 생산은 면역화 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링하여 모니터링할 수 있다. 두 번째 부스터 주사도 제공될 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지 부스팅 및 역가 과정을 반복한다. 원하는 수준의 면역원성이 수득될 때, 면역화된 동물을 채혈하고 혈청을 단리 및 저장할 수 있고/있거나 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
면역화 후, 항체 생성 가능성이 있는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)를 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택한다. 이 세포는 생검된 비장 또는 림프절로부터 또는 순환 혈액으로부터 수득할 수 있다. 면역화된 동물로부터의 항체-생산 B 림프구를 일반적으로 면역화된 동물 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 동일한 종의 하나인 불멸성 골수종 세포의 세포와 융합시킨다. 하이브리도마-생산 융합 절차에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비-항체-생산성이며, 높은 융합 효율, 및 원하는 융합 세포(하이브리도마) 만의 성장을 지원하는 특정 선택 배지에서 성장할 수 없게 하는 효소 결핍을 갖는다. 당업계의 숙련가들에게 알려진 바와 같이 다수의 골수종 세포 중 어느 하나가 사용될 수 있다(Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984).
항체-생산 비장 또는 림프절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 통상적으로 체세포와 골수종 세포를 2:1 비율로 혼합하는 단계를 포함하지만, 비율은 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재하에서 각각 약 20:1 내지 약 1:1까지 다양할 수 있다. 센다이 바이러스(Sendai virus)를 사용한 융합 방법은 Kohler 및 Milstein(1975; 1976)에 의해 기술되었으며 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어 37%(v/v) PEG를 사용한 융합 방법은 Gefter 등(1977)에 의해 기술되었다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용도 적절하다(Goding, pp. 71-74, 1986). 융합 절차는 통상적으로 약 1 x 10-6 내지 1 x 10-8의 낮은 빈도로 생존 가능한 하이브리드를 생산한다. 그러나, 이것은 생존 가능한 융합된 하이브리드가 선택 배지에서 배양함으로써 모체의 주입된 세포(특히 통상적으로 무한 분열을 계속하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에 문제를 일으키지 않는다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 데노보(de novo) 합성을 차단하는 제제를 함유하는 배지이다. 예시적이고 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린과 피리미딘 둘 다의 데노보 합성을 차단하는 반면 아자세린은 퓨린 합성만 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지에는 뉴클레오티드의 공급원으로서 하이포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지에 하이포크산잔틴이 보충된다. B 세포 공급원이 엡스타인 바 바이러스(EBV) 형질전환된 인간 B 세포주인 경우, 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환된 세포주를 제거하기 위해 와베인(Ouabain)이 추가된다.
바람직한 선택 배지는 HAT 또는 와베인이 있는 HAT이다. 뉴클레오티드 샐비지 경로(salvage pathway)를 작동할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 샐비지 경로의 핵심 효소, 예를 들어, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)에 결함이 있으며, 이들은 생존할 수 없다. B 세포는 이 경로를 작동할 수 있지만 이들은 배양 수명이 제한되어 있으며 일반적으로 약 2주 이내에 사멸한다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종 및 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합에 사용되는 B 세포의 공급원이 여기에서와 같이 EBV-형질전환된 B 세포주일 때, 와베인이 EBV-형질전환된 B 세포가 약물 사멸에 민감하기 때문에 하이브리드의 약물 선택에도 사용되는 반면 사용된 골수종 파트너는 와베인 내성으로 선택된다.
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 미세적정 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 세포를 배양한 다음 원하는 반응성에 대해 개별 클론 상청액(약 2 내지 3주 후)을 시험함으로써 수행된다. 방사면역분석, 효소 면역분석, 세포독성 분석, 플라크 분석 도트 면역결합 분석 등과 같은 분석은 민감하고 간단하며 신속해야 한다. 그후 선택된 하이브리도마를 연속 희석하거나 유세포 분석 분류에 의해 단일-세포 분류하고 개별 항체-생산 세포주로 클로닝하며, 이 클론은 그후 무한 증식하여 mAb를 제공할 수 있다. 세포주는 두 가지 기본 방식으로 MAb 생산을 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플을 동물(예를 들어, 마우스)에 (종종 복강 내로) 주사할 수 있다. 임의로, 동물을 주사 전에 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)과 같은 오일로 프라이밍한다. 이러한 방식으로 인간 하이브리도마를 사용하는 경우, 종양 거부반응을 방지하기 위해 SCID 마우스와 같은 면역저하 마우스에게 주사하는 것이 최적이다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산된 특정 단클론 항체를 분비하는 종양을 발달한다. 그후 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액을 태핑하여 MAb를 고농도로 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내에서 배양될 수 있으며, 여기서 MAb는 고농도에서 쉽게 수득될 수 있는 배양 배지로 자연적으로 분비된다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주가 세포 상청액에서 면역글로불린을 생산하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. 세포주는 고순도의 인간 단클론 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화하기 위해 무혈청 배지에서의 성장에 적합할 수 있다.
두 수단 중 어느 하나에 의해 생성된 MAb는, 원하는 경우, 여과, 원심분리 및 FPLC 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 개시내용의 단클론 항체의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단을 포함하는 방법에 의해 정제된 단클론 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 의해 포함되는 단클론 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
또한 분자 클로닝 접근법을 사용하여 단클론을 생성할 수 있는 것으로 고려된다. 이를 위해, 하이브리도마 계통 및 RT-PCR에 의해 수득된 항체 유전자로부터 RNA를 단리하고 면역글로불린 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 대안적으로, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 선택된다. 종래의 하이브리도마 기술을 능가하는 이러한 접근 방식의 장점은 단일 라운드에서 대략 104배 더 많은 항체가 생산 및 스크리닝될 수 있고 H 및 L 쇄 조합에 의해 새로운 특이성이 생성되어 적절한 항체를 찾을 가능성을 더욱 증가시킨다는 것이다.
최근, scFv 파지 디스플레이와 같은 mAb를 생성하기 위한 추가 방법이 개발되었다(참조; CM Hammers and JR Stanley, Antibody phage display: technique and applications, J Invest Dermatol (2014) 134: e17). 일반적으로, 표적 단백질, 예를 들어 인간 LILRB2에 결합하는 인간 mAb의 패널은 매우 다양한 인간 scFv 파지 디스플레이된 항체 라이브러리를 패닝함으로써 생성된다.
인간 scFv 파지 디스플레이된 항체 라이브러리를 생성하기 위해, RNA를 선택된 세포 공급원, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포로부터 추출한다. 그후 RNA를 암호화된 항체의 VH 및 VL 쇄의 PCR에 사용되는 cDNA로 역전사한다. 상이한 VH 및 VL 쇄 영역 유전자 패밀리에 대해 특이적인 정의된 프라이머 세트는 특정 개체의 모든 항체 특이성을 반영하여 주어진 면역글로불린 레퍼토리 내에서 전사된 모든 재배열된 가변 영역의 증폭을 가능하게 한다.
항체 레퍼토리를 나타내는 VH 및 VL PCR 산물을 원래 M13 박테리오파지로부터 유래된 대장균(E. coli)의 사상 박테리오파지의 pIII 마이너 캡시드 단백질에 융합된 scFv로서 VH 및 VL을 발현하도록 조작된 파지 디스플레이 벡터에 결찰시킨다. 이것은 각각이 표면에 scFv를 발현하고 내부에 각각의 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 보유하는 파지의 라이브러리를 생성한다.
그후 라이브러리를 바이오-패닝(bio-panning)이라는 기술에 의해 이의 발현된 표면 scFv를 통해 표적 항원에 결합하는 파지에 대해 스크리닝한다. 요컨대, 표적 단백질을 파지 라이브러리와 함께 배양하기 위해 고체상에 코팅한다. 세척 및 용출 후, 항원이 풍부한 파지를 회수하여 다음 라운드의 파지 패닝에 사용한다. 파지 패닝의 적어도 3 라운드 후, 단일 박테리아 콜로니를 파지 ELISA 및 기타 기능/유전 분석을 위해 선택한다.
양성 히트(positive hit)를 scFv 영역에 대해 서열분석하고 완전 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 작제물로 전환시키며, 이는 상기 개시된 방법을 사용하여 관심 mAb를 생성하는데 사용된다. 예를 들면, IgG 발현 플라스미드를 형질감염 시약 PEI를 사용하여 Expi293 세포로 공동형질감염시킨다. 발현 7일 후, 상청액을 수확하고, 항체를 단백질 A 수지를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 정제한다.
본 개시내용에 유용한 항체의 생성을 교시하는 각각이 본원에 참고로 포함된 다른 미국 특허는 조합 접근법을 사용한 키메라 항체의 생성을 기술하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 제제를 기술하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료제 접합체를 기술하는 미국 특허 제4,867,973호를 포함한다.
B. 본 개시내용의 항체
1. LILRB2에 대한 항체
본 개시내용에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 우선 먼저, 이 경우에 LILRB2에 대한 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당업계의 숙련가들은, 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 기술을 사용하여 주어진 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함으로써, 이러한 항체가 본 청구항의 범위 내에 속하는지 여부를 결정할 수 있다.
하나의 측면에서, LILRB2에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, LILRB2에 결합될 때, 이러한 항체는 LILRB2의 활성화를 조절한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2를 활성화시킨다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2의 활성화를 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, LILRB2에 결합될 때, LILRB2와 이의 결합 파트너 간의 상호 작용을 특이적으로 방해하거나 차단하거나 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 MDSC 및 기타 고형 종양-침윤 골수 세포, 예를 들어 종양-관련 대식세포(TAM) 및 관용원성 수지상 세포(DC)의 면역억제 활성을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LILRB2에 특이적으로 또는 선택적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 LILRB2에 특이적으로 결합하고/하거나 HLA-G, ANGPTL, SEMA4A에 대한 인간 LILRB2의 결합을 적어도 약 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80 -85%, 또는 그 이상(예를 들어, 실시예에 개시된 바와 같은 분석에 의해)까지 실질적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13　M 미만의 Kd(더욱 단단히 결합)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 LILRB2에 대한 HLA-G, ANGPTLs, SEMA4A의 결합을 차단하기 위한 10 uM 미만, 10 uM 내지 1 uM, 1000 nM 내지 100 nM, 100 nM 내지 10 nM, 10 nM 내지 1 nM, 1000 pM 내지 500 pM, 500 pM 내지 200 pM, 200 pM 미만, 200 pM 내지 150 pM, 200 pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM의 IC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 표 2에 예시된 클론-쌍을 이룬 CDR을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항체는 추가 "프레임워크" 영역을 포함하는 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 항체는 부록 I 및 III으로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 특징으로 한다. 더욱이, 항체 서열은 특히 CDR 외부의 영역에서 이러한 서열과 다를 수 있다. 예를 들면, 아미노산은 주어진 백분율, 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성으로 상기 제시된 것과 다를 수 있거나, 아미노산은 보존적 치환(아래에서 논의됨)을 허용함으로써 상기 제시된 것과 다를 수 있다. 상기 각각은 부록 I 및 III의 아미노산 서열에 적용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 유도체는 여전히 원하는 결합 및 기능적 특성을 나타내면서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환을 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 항체가 IgG로서 생성되었지만, 불변 영역을 변형하여 이의 기능을 변경하는 것이 유용할 수 있다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다. 따라서, 용어 "항체"는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 유형의 온전한 면역글로불린(및 이의 하위유형)을 포함하며, 여기서 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 유형일 수 있다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 35개 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 항체를 암호화하는 핵산에 혼성화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일반적으로, 핵산은 본원에 개시된 항체를 암호화하고 또한 LILRB2에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체를 암호화하는 핵산에 중간 또는 높은 엄격성 조건하에서 혼성화한다. 첫 번째 핵산 분자는 첫 번째 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 적절한 온도 및 용액 이온 강도 조건하에서 두 번째 핵산 분자에 어닐링될 수 있는 경우 두 번째 핵산 분자에 "혼성화 가능"하다(참조; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001). 온도 및 이온 강도의 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 전형적인 중간 엄격성 혼성화 조건은 42℃에서 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS를 갖는 40% 포름아미드이다. 고 엄격성 혼성화 조건은 42℃ 또는, 임의로, 보다 높은 온도(예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃)에서 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC(0.15M NaC1 및 0.015M Na-시트레이트)이다. 혼성화는 두 핵산이 상보적 서열을 포함하는 것을 필요로 하지만, 혼성화의 엄격성에 따라 염기 간의 불일치가 가능하다. 핵산을 혼성화하기 위한 적절한 엄격성은 핵산의 길이 및 상보성 정도, 당업계에 잘 알려진 변수에 의존한다. 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 핵산이 혼성화할 수 있는 엄격성이 높아진다. 100개 이상의 뉴클레오티드 길이의 하이브리드의 경우, 용융 온도를 계산하는 방정식이 유도되었다(참조; Sambrook et al., supra). 보다 짧은 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화의 경우, 불일치의 위치가 더 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 이의 특이성을 결정한다(참조; Sambrook et al., supra).
2. 예시적인 에피토프 및 경쟁 항원 결합 단백질
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항-LILRB2 항체가 결합하는 에피토프를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체에 의해 결합되는 에피토프가 유용하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는 LILRB2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는 LILRB2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프 또는 에피토프를 포함하는 서열은 LILRB2에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 에피토프 또는 본원에 기술된 에피토프를 포함하는 서열은 LILRB2의 생물학적 활성을 방해하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는, 항체에 의해 결합될 때, LILRB2의 생물학적 활성을 조절한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는, 항체에 의해 결합될 때, LILRB2를 활성화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는, 항체에 의해 결합될 때, LILRB2의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는, 항체에 의해 결합될 때, LILRB2와 이의 결합 파트너 간의 상호작용을 차단한다.
일부 실시양태에서, 항체와 접촉하거나 항체에 의해 묻혀 있는 잔기를 포함하는 도메인(들)/영역(들)은 LILRB2의 특정 잔기를 돌연변이시키고 항체가 돌연변이된 LILRB2 단백질에 결합할 수 있는지 여부를 결정함으로써 확인할 수 있다. 다수의 개별 돌연변이를 생성함으로써, 결합에 직접적인 역할을 하거나 돌연변이가 항체와 항원 사이의 결합에 영향을 미칠 수 있도록 항체에 충분히 근접해 있는 잔기를 확인할 수 있다. 이들 아미노산의 지식으로부터, 항원 결합 단백질과 접촉하거나 항체에 의해 덮인 잔기를 함유하는 항원의 도메인(들) 또는 영역(들)이 규명될 수 있다. 이러한 도메인은 항원 결합 단백질의 결합 에피토프를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 LILRB2에 대한 특이 결합을 위해 본원에 기술된 에피토프에 결합하는 예시된 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나와 경쟁하는 항원-결합 단백질을 제공한다. 이러한 항원 결합 단백질은 또한 본원에 예시된 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나와 동일한 에피토프, 또는 중첩 에피토프에 결합할 수 있다. 예시된 항체와 동일한 에피토프와 경쟁하거나 이에 결합하는 항원-결합 단백질은 유사한 기능적 특성을 나타낼 것으로 예상된다. 예시된 항체는 표 2에 포함된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR, 부록 I 및 III에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄, 및 부록 II 및 IV에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 갖는 것을 포함하여 상기 기술된 것들을 포함한다.
C. 항체 서열의 조작
다양한 실시양태에서, 개선된 발현, 개선된 교차-반응성 또는 감소된 표적외 결합과 같은 다양한 이유로 확인된 항체의 서열을 조작하도록 선택할 수 있다. 다음은 항체 조작을 위한 관련 기술의 일반적인 논의이다.
하이브리도마를 배양한 다음 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출할 수 있다. 무작위 6량체를 RT와 함께 사용하여 RNA의 cDNA 카피를 생성한 다음 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭시킬 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝한 다음 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동화 DNA 서열분석에 의해 서열분석할 수 있다. 결합 및 중화의 분석은 하이브리도마 상청액으로부터 수집되고 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC로 정제된 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 클로닝 벡터로부터의 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 IgG 플라스미드 벡터로 서브클로닝함으로써 재조합 전장 IgG 항체를 생성하고, 293 Freestyle 세포 또는 CHO 세포로 형질감염시키고, 항체를 293 또는 CHO 세포 상청액으로부터 정제하여 수집할 수 있다.
최종 cGMP 제조 공정과 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 공정에서 생산된 항체의 신속한 이용 가능성은 공정 개발 프로그램의 기간을 단축할 가능성이 있다. Lonza는 CHO 세포에서 소량(최대 50g)의 항체를 신속하게 생산하기 위해 CDACF 배지에서 성장한 혼주된 형질감염체를 사용하는 일반적인 방법을 개발하였다. 진정한 일시적인 시스템보다 약간 느리긴 하지만, 장점은 더 높은 생성물 농도 및 생산 세포주와 동일한 숙주 및 공정의 사용을 포함한다. 일회용 생물반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 유가식 모드에서 작동되는 일회용 백 생물반응기 배양물(5L 작업 용적)에서 2g/L의 수확 항체 농도가 형질감염 9주 이내에 달성되었다.
항체 분자는, 예를 들면, mAb의 단백질분해 절단에 의해 생성되는 단편(예를 들어, F(ab'), F(ab')2), 또는 예를 들면 재조합 수단을 통해 생성 가능한 단일-쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. 이러한 항체 유도체는 1가이다. 하나의 실시양태에서, 이러한 단편은 서로 조합되거나, 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 유의하게도, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있다.
1. 항원 결합 변형
관련 실시양태에서, 항체는 개시된 항체의 유도체, 예를 들어, 개시된 항체에서와 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체(예를 들어, 키메라 또는 CDR-이식된 항체)이다. 대안적으로, 항체 분자에 보존적 변화를 도입하는 것과 같은 변형을 만들고 싶어 할 수 있다. 이러한 변경을 만드는데 있어서, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 단백질에 상호 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해되고 있다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 정의한다.
유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있는 것으로 또한 당업계에서 이해된다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 바와 같은 단백질의 최대 국부 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 명시한다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 다음 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌 (+3.0), 리신 (+3.0), 및 히스티딘 (-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트 (+3.0 ± 1), 글루타메이트 (+3.0 ± 1), 아스파라긴 (+0.2), 및 글루타민 (+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린 (+0.3), 아스파라긴 (+0.2), 글루타민 (+0.2), 및 트레오닌 (-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인 (-1.0) 및 메티오닌 (-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린 (-1.5), 류신 (-1.8), 이소류신 (-1.8), 프롤린 (-0.5 ± 1), 알라닌 (-0.5), 및 글리신 (0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판 (-3.4), 페닐알라닌 (-2.5), 및 티로신 (-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다.
위에서 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 다양한 전술한 특성을 고려하는 예시적인 치환은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
본 개시내용은 또한 이소형 변형을 고려한다. 상이한 이소형을 갖도록 Fc 영역을 변형함으로써, 상이한 기능이 달성될 수 있다. 예를 들면, IgG1으로의 변경은 항체 의존성 세포성 세포독성을 증가시킬 수 있고, 클래스 A로의 전환은 조직 분포를 개선할 수 있고, 클래스 M으로의 전환은 원자가를 개선할 수 있다.
변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 포함하는 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현을 위한 방법은 이 문서의 다른 곳에서 다루어진다.
2. Fc 영역 변형
본원에 개시된 항체는 또한 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능(예를 들어, 항원-의존성 세포성 세포독성)을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 이의 글리코실화를 변경하고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 이러한 실시양태 각각은 아래에 추가로 상세히 기술된다. Fc 영역에서 잔기의 번호매김은 Kabat의 EU 인덱스의 번호매김이다. 본원에 개시된 항체는 또한 변경된 이펙터 기능을 제공하기 위해 변형된(또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체를 포함한다. 예를 들어 미국 특허 제5,624,821호; 제WO2003/086310호; 제WO2005/120571호; 제WO2006/0057702호를 참조한다. 이러한 변형은 진단 및 치료에서 가능한 유익한 효과와 함께 면역계의 다양한 반응을 향상 또는 억제하는데 사용될 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화(치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc의 추가를 포함한다. Fc에 대한 변화는 또한 치료 항체에서 항체의 반감기를 변경할 수 있어, 덜 빈번한 투여를 가능하게 하여 편의성을 증가시키고 물질의 사용을 감소시킬 수 있다. 이 돌연변이는 힌지 영역에서 중쇄간 이황화 다리의 이질성을 없애는 것으로 보고되었다.
하나의 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역의 시스테인 잔기의 수가 증가하거나 감소하도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기술되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 CH1의 힌지 영역에 있는 시스테인 잔기의 수를 변경한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들면, 다음 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 제6,277,375호에 기술된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기술된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능(들)을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들면, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화성을 갖지만 모 항체의 항원 결합 능력을 보유하도록 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화성이 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들면, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더욱 상세히 기술되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 PCT 공개 제WO 94/29351호에 추가로 기술되어 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역은 하기 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가 또는 감소시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키도록 변형된다: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공개 제WO 00/42072호에 추가로 기술되어 있다. 또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 매핑되었으며 개선된 결합을 갖는 변이체가 기술되었다. 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 나타났다. 또한, 다음 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선하는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
하나의 실시양태에서, Fc 영역은 잔기 243 및 264를 변형함으로써 이펙터 기능을 매개하는 항체의 능력을 감소시키고/시키거나 항염증 특성을 증가시키도록 변형된다. 하나의 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 위치 243 및 264의 잔기를 알라닌으로 변경함으로써 변형된다. 하나의 실시양태에서, Fc 영역은 잔기 243, 264, 267 및 328을 변형함으로써 이펙터 기능을 매개하는 항체의 능력을 감소시키고/시키거나 항염증 특성을 증가시키도록 변형된다.
하나의 실시양태에서, Fc 영역은 잔기 234, 235 및 329를 알라닌 또는 글리신(L234A-L235A-P329G)으로 변형함으로써 이펙터 기능을 매개하는 항체의 능력을 없애도록 변형된다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 항체는 특정 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들면, 글리코실화되지 않은 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체에는 글리코실화가 없음). 항체의 글리코실화 패턴은, 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체 서열 내의 글리코실화 부위 중 하나 이상을 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위 중 하나 이상이 제거되어 그 부위에서 글리코실화가 제거되게 하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화(aglycosylation)는 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호를 참조한다.
글리코실화 패턴이 저푸코실화되거나 푸코실화되지 않은 글리칸을 포함하는 항체가 또한 만들어질 수 있으며, 예를 들어 저푸코실화된 항체 또는 탈푸코실화된 항체는 글리칸 상에서 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는다. 항체는 또한 증가된 양의 이등분 GlcNac 구조를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 변형은, 예를 들면, 글리코실화 경로가 특정 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 이러한 세포는 당업계에 기술되어 있으며 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(α(1,6)-푸코실트랜스퍼라제)이 없어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체는 이들의 탄수화물에 푸코스가 없다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허 공개 제20040110704호 참조). 또 다른 예로서, 제EP 1 176 195호는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기술하며, 이는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하여, 이러한 세포주에서 발현된 항체가 α-1,6 결합-관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타내도록 한다. 제EP 1 176 195호는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖거나 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들면 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술한다. PCT 공개 제WO 03/035835호는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소하여 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 초래하는 변이 CHO 세포주인 Lec13 세포를 기술한다. 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 PCT 공개 제WO 06/089231호에 기술된 바와 같이 계란에서도 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 Lemna와 같은 식물 세포에서 생산될 수 있다(미국 특허 제7,632,983호). 식물계에서 항체를 생산하는 방법은 미국 특허 제6,998,267호 및 제7,388,081호에 개시되어 있다. PCT 공개 제WO 99/54342호는 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시키도록 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술한다.
대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있으며; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다. 본원에 개시된 항체는 하등 진핵생물 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포, 예를 들어 효모 및 사상 진균이 포유동물- 또는 인간-유사 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생성하도록 유전적으로 조작된 것을 추가로 포함한다. 현재 사용되는 포유동물 세포주를 능가하는 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포의 특별한 이점은 특정 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성물이 생성될 수 있도록 세포에서 생성되는 당단백질의 글리코실화 프로파일을 제어하는 능력이다(예를 들어, 참조; 미국 특허 제7,029,872호 및 제7,449,308호). 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포는 주로 특정 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산하는데 사용되었다.
또한, 효모 또는 사상 진균과 같은 진균은 푸코실화된 당단백질을 생성하는 능력이 부족하기 때문에, 푸코실화된 당단백질을 생성하기 위한 효소적 경로를 포함하도록 세포를 추가로 변형시키지 않는 한 이러한 세포에서 생성된 항체는 푸코스가 없을 것이다(예를 들면, PCT 공개 제WO2008112092호 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 하등 진핵생물 숙주 세포에서 생산되고 푸코실화 및 비푸코실화 하이브리드 및 GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2과 같은 N-글리칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이등분 및 다중안테나 종을 포함한 복합 N-글리칸을 포함하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; 및 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 측면에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물에서 하이브리드 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 구성하는 특정 N-글리칸 종이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 복합 N-글리칸을 갖는 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 복합 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 구성하는 특정 N-글리칸 종이다. 특정 실시양태에서, N-글리칸은 푸코실화된다. 일반적으로, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와의 α1,3-결합, N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와의 α1,6-결합, N-글리칸의 비환원 말단에서 Gal과의 α1,2-결합, N-글리칸의 비환원 말단에서 GlcNac와의 α1,3-결합, 또는 N-글리칸의 비환원 말단에서 GlcNAc와의 α1,4-결합에 있다.
따라서, 상기 당단백질 조성물의 특정 측면에서, 글리코형은 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글리코형을 생산하기 위해 α1,3-결합 또는 α1,6-결합 푸코스에 있거나; GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글리코형을 생산하기 위해 α1,3-결합 또는 α1,4-결합 푸코스에 있거나; Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글리코형을 생산하기 위해 α1,2-결합 푸코스에 있다.
추가 측면에서, 항체는 Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조로 구성된 N-글리칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고 만노스 N-글리칸을 포함한다. 상기의 추가 측면에서, 복합 N-글리칸은 푸코실화 및 비-푸코실화 이등분 및 다중안테나 종을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "N-글리칸" 및 "글리코형"은 상호교환적으로 사용되며 N-연결된 올리고당, 예를 들면, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 결합에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 당단백질은 단백질에서 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다.
D. 단일 쇄 항체
단일 쇄 가변 단편(scFv)은 짧은 (통상적으로 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합체이다. 이러한 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고 원래 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 이러한 변형은 통상적으로 특이성은 변경하지 않은 채로 있다. 이러한 분자는 항원 결합 도메인을 단일 펩티드로 발현하는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 역사적으로 생성되었다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 쇄 가변 단편에는 완전 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 없으며, 따라서 항체를 정제하는데 사용되는 공통 결합 부위(예를 들어 단백질 A/G)가 없다. 이러한 단편은 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정화될 수 있다.
가요성 링커는 일반적으로 알라닌, 세린 및 글리신과 같은 나선- 및 회전-촉진 아미노산 잔기로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 기능할 수 있다. Tanget 등(1996)은 단백질 링커 라이브러리로부터의 단일-쇄 항체(scFv)에 대한 맞춤형 링커를 신속하게 선택하는 수단으로 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자가 가변 조성의 18개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 세그먼트에 의해 연결된 랜덤 링커 라이브러리를 작제하였다. scFv 레퍼토리(약 5 × 106개의 상이한 구성원)를 필라멘트 파지에 디스플레이하고 합텐을 사용하여 친화성 선택에 적용하였다. 선택된 변이체의 집단은 결합 활성의 유의한 증가를 나타내었지만 상당한 서열 다양성을 보유하였다. 후속적으로 1054개 개별 변이체를 스크리닝하여 가용성 형태로 효율적으로 생산된 촉매 활성 scFv를 수득하였다. 서열 분석은 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 VH C 말단 뒤의 링커 2개 잔기에서의 보존된 프롤린 및 다른 위치에서의 아르기닌 및 프롤린의 풍부를 나타내었다.
본 개시내용의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 J-쇄와 함께 다량체의 형성을 허용하는 IgA로부터 유래된 서열을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 허용하는 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형될 수 있다.
별도의 실시양태에서, 단일-쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학 단위를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다(즉, 중쇄의 N-말단이 적절한 화학적 다리를 통해 경쇄의 C-말단에 부착됨).
가교-결합 시약은 두 가지 상이한 분자, 예를 들어 안정제 및 응고제의 관능 그룹을 묶는 분자 다리를 형성하는데 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 헤테로머 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적 방식으로 연결하기 위해, 원치 않는 단독중합체 형성을 제거하는 이종-이관능성 가교결합제가 사용될 수 있다.
예시적인 헤테로-이관능성 가교결합제는 2개의 반응성 그룹을 함유한다: 하나는 1급 아민 그룹(예를 들어, N-하이드록시 숙신이미드)와 반응하고 다른 하나는 티올 그룹(예를 들어, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)와 반응한다. 1급 아민 반응 그룹을 통해, 가교결합제는 하나의 단백질(예를 들어, 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응 그룹을 통해, 이미 첫 번째 단백질에 연결된 가교결합제는 다른 단백질(예를 들어, 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)과 반응한다.
혈액에서 적정한 안정성을 갖는 가교결합제가 사용되는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합하는데 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 이황화-결합 함유 링커가 알려져 있다. 입체 장애된 이황화 결합을 함유하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하여 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩티드의 방출을 방지하는 것으로 판명될 수 있다. 따라서 이러한 링커는 연결제의 한 그룹이다.
또 다른 가교결합제는 SMPT이며, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 장애된" 이황화 결합을 함유하는 이관능성 가교결합제이다. 이황화 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하여, 표적 부위로의 부착된 제제의 전달 전에 접합체의 디커플링을 방지하는데 도움이 되는 것으로 믿어진다.
다수의 다른 알려진 가교결합 시약과 마찬가지로 SMPT 가교-결합 시약은 시스테인의 SH 또는 1급 아민(예를 들어, 리신의 엡실론 아미노 그룹)과 같은 관능 그룹을 가교결합시키는 능력을 제공한다. 또 다른 가능한 유형의 가교결합제는 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트와 같은 절단 가능한 이황화 결합을 함유하는 헤테로-이관능성 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하고 페닐아지드(광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
장애된 가교결합제에 더하여, 비-장애된 링커도 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 이황화물을 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 기타 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교결합제의 사용은 당업계에 잘 이해된다. 또 다른 실시양태는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생산하는데, 특히 킬레이트제, 약물, 효소, 검출 가능한 표지 등과 항체 접합체를 형성하는데 유용한 이관능성 링커를 기술한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에서 절단 가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단 가능한 접합체를 개시한다. 이러한 링커는 관심 제제가 링커에 직접 결합될 수 있고 절단되어 활성제의 방출을 초래할 수 있다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도는 항체 또는 약물과 같은 단백질에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 추가하는 것을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는 융합 단백질, 예를 들어 단일 쇄 항체를 만들기 위해 폴리펩티드 구성요소를 연결하는데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커는 길이가 약 50개 이하의 아미노산이고, 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 리신)에 이은 프롤린의 적어도 하나의 발생을 포함하고, 더 큰 안정성과 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단 및 분리 기술에서 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시한다.
E. 정제
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 단백질은 이의 자연적으로 수득 가능한 상태에 비해 어느 정도로 정제된다. 따라서 정제된 단백질은 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질을 지칭한다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩티드가, 조성물 중의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성하는 것과 같은 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제 기술은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술은, 한 수준에서, 세포 환경(cellular milieu)을 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로 조악하게 분별하는 것을 포함한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리하면, 관심 폴리펩티드를 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질할 때까지의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 전기영동이다. 단백질 정제를 위한 또 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 열 변성에 의한 침전 후 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 기타 기술의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 항체를 정제함에 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변경될 수 있거나 특정 단계가 생략될 수 있으며, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조를 위한 적합한 방법을 야기하는 것으로 믿어진다.
일반적으로, 완전 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 사용하여 분별된다. 대안적으로, 항원은 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 컬럼, 필터 또는 비드와 같은 지지체에 결합된 선택제를 사용한다. 항체를 지지체에 결합하고, 오염 물질을 제거하고(예를 들어, 세척하고), 항체를 조건(염, 열 등)을 적용하여 방출한다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업계의 숙련가들에게 공지될 것이다. 이들은, 예를 들면, 활성 분획의 특이 활성을 결정하거나 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내 폴리펩티드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 특이 활성을 계산하여 이를 초기 추출물의 특이 활성과 비교하여 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는 물론 정제를 따르기 위해 선택된 특정 분석 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존적일 것이다.
폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 따라 때때로 상당히 달라질 수 있는 것으로 알려져 있다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 산물의 겉보기 분자량이 변할 수 있음을 인지할 것이다.
V. 암의 치료
A. 제형화 및 투여
본 개시내용은 항-LILRB 항체 및 이를 생성하기 위한 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 및 보다 특히 인간에 사용하기 위한 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거됨을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 물과 같은 멸균 액체 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원인 것을 포함한 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 특정 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액에 대한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 또 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은, 원하는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제의 예가 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences."]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적절한 양의 담체와 함께 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을, 바람직하게는 정제된 형태로 함유할 것이다. 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측, 비강내, 분무, 기관지 흡입일 수 있거나 기계적 환기에 의해 전달될 수 있는 투여 방식에 적합해야 한다.
본원에 기술된 바와 같은 본 개시내용의 항체는 비경구 투여용으로 제형화될 수 있으며, 예를 들어 피내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 종양내 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 항체는 대안적으로 점막에 직접 국소 경로, 예를 들면 점비제, 흡입 또는 분무기에 의해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 염 및, 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
인공 획득 수동 면역으로 알려진 항체의 수동 전달은 일반적으로 정맥 주사의 사용을 포함할 것이다. 항체의 형태는 정맥내(IVIG) 또는 근육내(IG) 사용을 위한 혼주된 인간 면역글로불린으로서, 면역화된 또는 질병으로부터 회복된 기증자로부터의 고역가 인간 IVIG 또는 IG로서, 및 단클론 항체(MAb)로서의 인간 또는 동물 혈장 또는 혈청일 수 있다. 이러한 면역은 일반적으로 짧은 기간 동안만 지속되며, 특히 비인간 기원의 감마 글로불린으로 인한 과민 반응 및 혈청병의 잠재적 위험이 있다. 그러나, 수동 면역은 즉각적인 보호를 제공한다. 항체는 주사에 적합한, 즉 멸균성이고 주사기에 적합한 담체에서 제형화될 것이다.
일반적으로, 본 개시내용의 조성물의 구성분은 별도로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들면, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 기밀하게 밀봉된 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물-비함유 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 구성분이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 음이온으로 형성된 염, 및 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
B. 세포 요법
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR은 본원에 제공된 항원-결합 단편을 포함한다. 하나의 실시양태에서, CAR 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 다음을 포함한다: 리더 펩티드, 항-LILRB2 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB2 경쇄 가변 도메인, 인간 IgG1-CH2-CH3 도메인, 스페이서 영역, CD28 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 및 CD3 z 세포내 T 세포 신호전달 도메인.
또한 유효량의 본 개시내용의 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는 면역요법을 위한 방법이 제공된다. 하나의 실시양태에서, 의학적 질병 또는 장애는 면역 반응을 유도하는 면역 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 암 또는 감염은 면역 반응을 유도하는 면역 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 개체에게 유효량의 항원-특이 세포 요법을 투여하는 단계를 포함하여, 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키는 방법이 본원에서 제공된다.
면역 세포는 T 세포(예를 들어, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 또는 대식세포일 수 있다. 또한 면역 세포를 생산하고 조작하는 방법 뿐만 아니라 입양 세포 요법을 위해 세포를 사용하고 투여하는 방법이 제공되며, 이 경우 세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 따라서, 면역 세포는 암세포를 표적으로 하는 것과 같은 면역 요법으로 사용될 수 있다.
면역 세포는 대상체, 특히 인간 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역 세포는 건강한 인간 대상체, 건강한 지원자 또는 건강한 기증자로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 특정 질병 또는 상태를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 상태에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상체, 또는 특정 질병 또는 상태에 대한 치료를 받고 있는 대상체와 같은 관심 대상체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절 및 골수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 대상체에 존재하는 임의의 위치로부터 수집될 수 있다. 단리된 면역 세포는 직접 사용될 수 있거나, 동결에 의해서와 같이 일정 기간 동안 보관될 수 있다.
면역 세포는 혈액(혈액 은행 또는 제대혈 은행에 의해 수집된 혈액 포함), 비장, 골수, 수술 동안 제거되고/되거나 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 수득된 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이들이 존재하는 임의의 조직으로부터 농축/정제될 수 있다. 면역 세포가 농축, 단리 및/또는 정제되는 조직/기관은 생물 대상체 및 무생물 대상체 둘 다로부터 단리될 수 있으며, 여기서 무생물 대상체는 장기 기증자이다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 말초 혈액 또는 제대혈과 같은 혈액으로부터 단리된다. 일부 측면에서, 제대혈로부터 단리된 면역 세포는 CD4- 또는 CD8-양성 T 세포 억제에 의해 측정되는 것과 같이 향상된 면역조절 능력을 갖는다. 특정 측면에서, 면역 세포는 향상된 면역조절 능력을 위해 혼주된 혈액, 특히 혼주된 제대혈로부터 단리된다. 혼주된 혈액은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 또는 그 이상의 공급원(예를 들어, 기증자 대상체)과 같은 2개 이상의 공급원으로부터 유래될 수 있다.
면역 세포의 집단은 치료를 필요로 하거나 감소된 면역 세포 활성과 관련된 질병을 앓고 있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 따라서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체의 자가 조직일 것이다. 대안적으로, 면역 세포의 집단은 기증자, 바람직하게는 조직적합성 일치 기증자로부터 수득될 수 있다. 면역 세포 집단은 말초 혈액, 제대혈, 골수, 비장, 또는 면역 세포가 상기 대상체 또는 기증자에 존재하는 임의의 다른 기관/조직으로부터 수확될 수 있다. 면역 세포는 혼주된 제대혈과 같은 대상체 및/또는 기증자의 풀로부터 단리될 수 있다.
면역 세포의 집단이 대상체와는 다른 기증자로부터 수득되는 경우, 기증자는 바람직하게는 동종이계이며, 단, 수득된 세포는 이들이 대상체에 도입될 수 있다는 점에서 대상체-상용성이다. 동종 기증자 세포는 인간-백혈구-항원(HLA)-상용성이거나 아닐 수 있다. 대상체-상용성으로 되게 하기 위해, 동종이계 세포를 처리하여 면역원성을 감소시킬 수 있다.
면역 세포는 조작된 TCR 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 T-세포)는 암 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, NK 세포는 TCR을 발현하도록 조작된다. NK 세포는 CAR을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 상이한 항원에 대한 다중 CAR 및/또는 TCR이 T 세포 또는 NK 세포와 같은 단일 세포 유형에 추가될 수 있다.
적합한 변형 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., supra; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]을 참조한다. 예를 들면, 세포는 문헌[Heemskerk et al. (2008) and Johnson et al. (2009)]에 기술된 형질도입 기술을 사용하여 암 항원에 대한 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 형질도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 암호화하는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 이러한 핵산의 유전적으로 조작된 산물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이종성이며, 즉, 일반적으로 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같은 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 존재하지 않으며, 이는 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 이러한 세포가 유래된 유기체에서 원래 발견되지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연에서 발견되지 않는 핵산(예를 들어, 키메라)과 같이 자연적으로 발생하지 않는다.
C. 병용 요법
본 개시내용의 항체를 추가의 항암 요법과 함께 사용하는 병용 치료를 제공하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 요법은 하나 이상의 질병 매개변수의 감소를 달성하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 과정은 예를 들어 단일 조성물 또는 두 제제를 모두 포함하는 약리학적 제형을 사용하여 세포/대상체를 두 제제/요법과 동시에 접촉시키거나 세포/대상체를 두 가지 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 항체를 포함하고 다른 조성물은 또 다른 제제를 포함한다.
대안적으로, 항체는 몇 분 내지 몇 주 범위의 간격으로 다른 치료를 선행하거나 뒤따를 수 있다. 일반적으로 치료가 세포/대상체에 유리하게 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않도록 보장한다. 이러한 경우에, 서로 약 12-24시간 이내에, 서로 약 6-12시간 이내에, 또는 단지 약 12시간의 지연 시간으로 세포를 두 방식 모두와 접촉시키는 것으로 고려된다. 일부 상황에서는, 치료를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다; 그러나, 각 투여 사이에 수 십일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일)에서 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과된다.
또한 항-LILRB2 항체 또는 다른 요법의 1회 이상 투여가 바람직할 것이라고 생각할 수 있다. 하기에 예시된 바와 같은 다양한 조합이 사용될 수 있으며, 여기서 항체는 "A"이고 다른 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
다른 조합이 고려된다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, 세포를 사멸시키거나, 세포 성장을 억제하거나, 전이를 억제하거나, 혈관신생을 억제하거나, 달리 종양 세포의 악성 표현형을 역전시키거나 감소시키기 위해, 표적 세포 또는 부위를 항체 및 적어도 하나의 다른 치료법과 접촉시킬 수 있다. 이러한 치료법은 암세포를 사멸하거나 증식을 억제하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 과정은 세포/부위/대상체를 제제/치료법과 동시에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 항체와의 병용 요법을 위해 고려되는 특정 제제는 화학요법 및 조혈 줄기 세포 이식을 포함한다. 화학요법은 시타라빈(ara-C) 및 안트라사이클린(가장 흔히 다우노루비신), 고용량 시타라빈 단독, 강화 요법 완료 후 유도 화학요법, 통상적으로 안트라사이클린, 히스타민 디하이드로클로라이드(Ceplen) 및 인터류킨 2(Proleukin)에 더하여 전-트랜스-레티노산(ATRA), 고용량 화학요법의 후보가 아닌 60세 이상의 AML 재발 환자를 위한 젬투주맙 오조가마이신(Mylotarg), 클로파라빈 뿐만 아니라 표적 요법, 예를 들어 키나제 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, 및 MDR1(다약제-내성 단백질)의 억제제, 삼산화비소 또는 재발성 급성 전골수구성 백혈병(APL)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 병용 요법을 위한 제제는 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오시드 대사 억제제, 시타라빈, 저메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신과 시타라빈의 조합, 주사용 다우노루비신과 시타라빈 리포솜, Vyxeos®, 아자시티딘, Vidaza®, 데시타빈, 전-트래스-레티노산(ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, Ceplene®, 인터류킨-2, 알데스류킨, Proleukin®, 젬투주맙 오조가마이신, Mylotarg®, FLT-3 억제제, 미도스타우린, Rydapt®, 클로파라빈, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 아이보시데닙, Tibsovo®, IDH2 억제제, 에나시데닙, Idhifa®, SMO(smoothened) 억제제, 글라스데깁, 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, Venclexta®, 백금 착물 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, IMBRUVICA®, 아칼라브루티닙, CALQUENCE®, 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, CD70 항체, 및 CLL1 항체, CD123 항체, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사산물, 항종양 항생제, 식물 유래 알칼로이드, 호르몬 치료제, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제, 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물이다.
VI. 항체 접합체
본 개시내용의 항체는 항체 접합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 제제에 연결될 수 있다. 진단제 또는 치료제로서의 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 원하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나 공유 결합하거나 착화시키는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 원하는 활성, 예를 들어 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 항종양제, 치료 효소, 방사성핵종, 항바이러스제, 킬레이트제, 사이토카인, 성장 인자, 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 분석을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들어 비오틴을 포함한다.
항체-약물 접합체는 암 치료제 개발에 획기적인 접근 방식으로 등장하였다. 항체-약물 접합체(ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 단클론 항체(MAb)를 포함한다. 이 접근법은 항원 표적에 대한 MAb의 높은 특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 조합하여, 풍부한 항원 수준을 갖는 종양 세포에 페이로드(약물)를 전달하는 "암드(armed)" MAb를 생성한다. 약물의 표적 전달은 또한 정상 조직에서의 이의 노출을 최소화하여, 독성을 감소시키고 치료 지수를 개선한다. FDA에 의한 2011년 ADCETRIS®(브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년 KADCYLA®(트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)의 두 ADC 약물의 승인으로 접근법을 검증하였다. 현재 암 치료를 위한 다양한 임상 시험 단계에서 30개 이상의 ADC 약물 후보가 있다(Leal et al., 2014). 항체 공학 및 링커-페이로드 최적화가 점점 더 성숙해짐에 따라, 새로운 ADC의 발견 및 개발은 이러한 접근법에 적합한 새로운 표적의 식별 및 검증과 표적 MAb의 생성에 점점 더 의존하고 있다. ADC 표적에 대한 두 가지 기준은 종양 세포에서의 상향조절된/높은 수준의 발현 및 강력한 내재화이다.
항체 접합체는 또한 진단제로서 사용하기에 바람직하다. 항체 진단제는 일반적으로 다양한 면역분석과 같은 시험관내 진단에 사용되는 것 및 일반적으로 "항체-지시된 영상화"로 알려진 생체내 진단 프로토콜에 사용되는 것의 두 가지 부류에 속한다. 항체에 부착하는 방법과 같이 많은 적절한 영상화제가 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호, 및 제4,472,509호 참조). 사용되는 영상화 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광색소, NMR-검출 가능한 물질, 및 X선 영상화제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III)과 같은 이온을 예로 들 수 있으며, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X선 영성화와 같은 다른 상황에서 유용한 이온은 란탄(III), 금(III), 납(II), 특히 비스무트(III)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 특정 실시양태에서 125I가 종종 사용하기에 바람직하며, 테크니슘99m 및/또는 인듐111이 또한 이들의 낮은 에너지 및 장거리 검출에 대한 적합성으로 인해 종종 바람직하다. 본 개시내용의 방사성 표지된 단클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제, 예를 들어 차아염소산나트륨 또는 효소적 산화제, 예를 들어 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 본 개시내용에 따른 단클론 항체는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들면, 퍼테크네이트를 제1주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼 상에 킬레이트화하고, 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 직접 표지화 기술은, 예를 들어, 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충 용액, 및 항체를 배양함으로써 사용될 수 있다. 금속 이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중간 관능 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광 표지 중에는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그라핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드가 포함된다.
본 개시내용에서 고려되는 또 다른 유형의 항체 접합체는 주로 시험관내 사용을 위한 것이며, 여기서 항체는 발색 기질과 접촉시 착색된 생성물을 생성하는 2차 결합 리간드 및/또는 효소(효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (호스래디쉬) 하이드로겐 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기술되어 있다.
항체에 대한 분자의 부위-특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체를 합텐-기반 친화성 표지와 반응시키는 단계를 포함한다. 본질적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위의 아미노산과 반응하여 이 부위를 파괴하고 특이 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이것은 항체 접합체에 의한 항원 결합의 손실을 초래하기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
아지도 그룹을 함유하는 분자는 또한 저강도 자외선에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있다(Potter and Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 식별하기 위한 부위-지시된 광프로브(photoprobe)로서 사용되었다(Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 매핑하는데 사용되었으며(Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989) 항체 결합제로서 사용될 수 있다.
접합체 모이어티에 대한 항체의 부착 또는 접합을 위한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA)과 같은 유기 킬레이트제; 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용한 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948허). 단클론 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응할 수 있다. 플루오레세인 마커가 있는 접합체는 이러한 커플링제의 존재하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 영상화는 단클론 항체를 사용하여 달성되고 검출 가능한 영상화 모이어티가 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
또 다른 실시양태에서, 항체 결합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 이 방법에 따라 생산된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감도를 나타내는 것으로 개시된다(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,196,066호). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역의 탄수화물 잔기에 접합된 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착이 또한 문헌에 개시되어 있다(O'Shannessy et al., 1987). 이 접근법은 현재 임상 평가 중인 진단적으로 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
VII. 면역검출 방법
여전히 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 LILRB-관련 암을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법이 전통적인 의미로 적용될 수 있지만, 또 다른 용도는 백신 및 기타 바이러스 스톡의 품질 관리 및 모니터링에 있을 것이며, 여기서 본 개시내용에 따른 항체는 바이러스에 있는 H1 항원의 양 또는 무결성(즉, 장기간 안정성)을 평가하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 적절한/원하는 반응성 프로파일에 대해 다양한 항체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
일부 면역검출 방법은 몇 가지만 언급하자면 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 면역방사계측 분석, 형광면역분석, 화학발광 분석, 생물발광 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, LILRB의 검출 및 정량을 위한 경쟁 분석이 또한 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는, 예를 들어, 문헌[Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)]와 같은 과학 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 LILRB-관련 암을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 경우에 따라 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 샘플을 본 개시내용에 따르는 제1 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 샘플로부터 LILRB 또는 LILRB-관련 암 세포를 검출하거나 정제하는 방법을 포함한다. 항체를 바람직하게는 컬럼 매트릭스 형태와 같은 고체 지지체에 연결하고, LILRB-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 고정된 항체에 적용할 것이다. 원치 않는 성분을 컬럼으로부터 세척하여, 고정된 항체에 면역착화된 LILRB-발현 세포를 잔류시키며, 이것을 그후 컬럼으로부터 유기체 또는 항원을 제거함으로써 수집한다.
면역결합 방법은 또한 샘플에서 LILRB-관련 암 세포 또는 관련 성분의 양을 검출 및 정량화하는 방법 및 결합 공정 동안 형성된 면역 복합체의 검출 및 정량화 방법을 포함한다. 여기에서, LILRB-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고 샘플을 LILRB 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉시킨 다음 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량화한다. 항원 검출 측면에서, 분석된 생물학적 샘플은 조직 절편 또는 검체, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함한 생물학적 유체, 또는 대변 또는 소변과 같은 분비물과 같이 LILRB-관련 암을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다.
면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에서 선택된 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 단순히 항체 조성물을 샘플에 첨가하고 항체가 면역 복합체를 형성하기에, 즉 LILRB에 결합하기에 충분한 시간 동안 혼합물을 배양하는 문제이다. 이 시간 후, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯과 같은 샘플-항체 조성물을 일반적으로 세척하여 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만 검출되도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있으며 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광, 생물학적 및 효소 태그와 같은 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이 2차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 정렬과 같은 2차 결합 리간드의 사용을 통해 추가적인 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있으며, 여기서 그후 이 표지를 단순히 검출함으로써 조성물 내의 1차 면역 복합체의 양이 결정될 수 있게 한다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에서 결합되는 제1 항체는 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우, 2차 결합 리간드가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이고, 따라서 "이차" 항체로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 그후 2차 면역 복합체는 일반적으로 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하기 위해 세척되고, 그후 2차 면역 복합체에 남아 있는 표지가 검출된다.
추가 방법은 2단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체와 같은 2차 결합 리간드가 상기 기술된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하는데 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 다시 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 효과적인 조건하에 2차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 3차 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 3차 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어, 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이 시스템은 원하는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역검출의 한 방법은 두 가지 다른 항체를 사용한다. 1차 비오틴화된 항체가 표적 항원을 검출하는데 사용되고, 그후 2차 항체가 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는데 사용된다. 이 방법에서, 시험하고자 하는 샘플을 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양한다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부가 항원에 결합하여 비오틴화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 그후 항체/항원 복합체를 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오틴화된 DNA 및/또는 상보성 바이오틴화된 DNA의 연속 용액에서 배양에 의해 증폭시키며, 각 단계는 항체/항원 복합체에 추가 비오틴 부위를 추가한다. 증폭 단계는 적절한 증폭 수준이 달성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 이러헨 제2 단계 항체는 예를 들면 발색 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭으로, 육안으로 볼 수 있는 접합체가 생성될 수 있다.
면역검출의 또 다른 알려진 방법은 면역-PCR(중합 효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오틴화된 DNA와 함께 배양할 때까지 Cantor 방법과 유사하지만, 스트렙타비딘과 비오틴화된 DNA를 여러 차례 배양하는 대신 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 항체를 방출하는 저 pH 또는 고염 완충액으로 세척한다. 그후 생성된 세척 용액을 사용하여 적절한 대조군이 있는 적절한 프라이머로 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는, PCR의 엄청난 증폭 능력과 특이성을 사용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
1. ELISA
면역분석은, 가장 간단하고 직접적인 의미에서, 결합 분석이다. 특정 바람직한 면역분석은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사선면역분석(RIA)이다. 조직 절편을 사용한 면역조직화학 검출이 또한 특히 유용하다. 그러나, 검출은 이러한 기술에 제한되지 않으며, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체를 폴리스티렌 미세적정 플레이트 내의 웰과 같은 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정한다. 그후, LILRB-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 결합 및 세척 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출 가능한 표지에 연결된 또 다른 항-LILRB 항체의 첨가에 의해 검출을 달성할 수 있다. 이 유형의 ELISA이 단순 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 2차 항-LILRB2 항체의 첨가에 이은 2차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 3차 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있으며, 3차 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 있다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, LILRB2-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면에 고정시킨 다음 본 개시내용의 항-LILRB2 항체와 접촉시킨다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 결합 및 세척 후, 결합된 항-LILRB2 항체를 검출한다. 초기 항-LILRB2 항체가 검출 가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체를 직접 검출할 수 있다. 다시, 면역 복합체는 1차 항-LILRB2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 사용하여 검출할 수 있으며, 2차 항체는 검출가능한 표지에 연결되어 있다.
사용된 형식에 관계없이, ELISA는 코팅, 배양 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체 검출과 같은 특정 특성을 공통적으로 가지고 있다. 이들은 아래에 기술되어 있다.
항원 또는 항체로 플레이트를 코팅하는데 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 지정된 시간 동안 배양할 것이다. 그후 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 그후 웰의 나머지 이용 가능한 표면을 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이 단백질로 "코팅"한다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정화 표면의 비특이 흡착 부위를 차단하여 표면에 대한 항혈청의 비특이 결합에 의해 유발되는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더 관례적이다. 따라서, 웰에 단백질 또는 항체를 결합하고, 배경을 감소시키기 위해 비반응성 물질로 코팅하고, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 고정화 표면을 면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 그후 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서"는 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 염수(PBS)/Tween과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함함을 의미한다. 이러한 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한 배양이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도 또는 기간 동안 진행됨을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 정도, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 또는 약 4℃ 정도에서 밤새 이루어질 수 있다.
ELISA에서 모든 배양 단계 후에, 복합체화되지 않은 물질을 제거하도록 접촉된 표면을 세척한다. 바람직한 세척 절차는 PBS/Tween 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이에 특이 면역 복합체의 형성 및 후속 세척 후, 심지어 극소량의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 2차 또는 3차 항체는 검출을 허용하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이것은 적절한 발색 기질과 함께 배양시 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 1차 및 2차 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 하이드로겐 퍼옥시다제-접합된 항체와 일정 기간 동안 추가 면역 복합체 형성의 발달에 유리한 조건하에서 접촉 또는 배양(예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에서 2시간 배양)하고자 할 것이다.
표지된 항체와 함께 배양한 후, 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 이후에, 표지의 양은, 예를 들어, 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우 H2O2와 같은 발색 기질과 배양함으로써 정량화된다. 그후, 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색상의 정도를 측정함으로써 정량화를 달성한다.
2. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(대안적으로, 단백질 면역블롯)은 조직 균질액 또는 추출물의 주어진 샘플에서 특정 단백질을 검출하는데 사용되는 분석 기술이다. 이것은 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩티드의 길이(변성 조건)에 의해 또는 단백질의 3D 구조(고유/비변성 조건)에 의해 천연 또는 변성된 단백질을 분리한다. 그후 단백질은 막(전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮겨지며, 여기서 이들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플을 전체 조직으로부터 또는 세포 배양물로부터 채취할 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(더 큰 샘플 용적의 경우)를 사용하거나, 균질화기(더 작은 용적)를 사용하거나, 초음파 처리에 의해 기계적으로 분해된다. 세포는 또한 위의 기계적 방법 중 하나로 파손 개방될 수 있다. 그러나, 박테리아, 바이러스 또는 환경 샘플이 단백질의 공급원일 수 있으므로 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 제한되지 않는다는 것을 주지해야 한다. 여러가지 세제, 염 및 완충액을 사용하여 세포 용해를 촉진하고 단백질을 가용화할 수 있다. 자체 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 종종 추가된다. 조직 준비는 종종 단백질 변성을 피하기 위해 저온에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이러한 인자의 조합에 의해 수행될 수 있다. 분리의 특성은 샘플의 처리 및 겔의 특성에 따라 좌우된다. 이것이 단백질을 결정하는 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플로부터의 단백질을 2차원으로 퍼뜨리는 2차원(2-D) 겔을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서 등전점(중성 순전하를 갖는 pH)에 따라, 2차원에서 분자량에 따라 분리된다.
단백질이 항체 검출에 접근할 수 있도록 하기 위해, 이들을 겔 내에서 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 만들어진 막으로 이동시킨다. 막을 겔 상단에 놓고, 그 위에 여과지 더미를 놓는다. 전체 스택을 완충 용액에 배치하며, 이것이 모세관 작용에 의해 종이 위로 이동하여 단백질을 가져온다. 단백질을 전달하는 또 다른 방법은 일렉트로블롯팅(electroblotting)이라고 하며 전류를 사용하여 겔에서 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 끌어당긴다. 단백질이 겔 내에서 갖는 조직을 유지하면서 겔 내에서 막으로 단백질을 이동시킨다. 이러한 블롯팅 과정의 결과로, 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(아래 참조). 두 종류의 막 모두는 비특이 단백질 결합 특성(즉, 모든 단백질을 동등하게 잘 결합함)으로 선택된다. 단백질 결합은 소수성 상호작용 뿐만 아니라 막과 단백질 사이의 하전 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로스 막은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 더 취성이며 반복되는 프로빙에 잘 견디지 못한다. 겔에서 막으로의 단백질 전달의 균일성 및 전반적인 효과는 막을 Coomassie Brilliant Blue 또는 Ponceau S 염료로 염색함으로써 확인할 수 있다. 일단 전달되면, 표지된 1차 항체 또는 표지되지 않은 1차 항체를 사용하여 단백질을 검출한 다음 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 표지된 단백질 A 또는 2차 표지된 항체를 사용하여 간접적인 검출을 수행한다.
3. 면역조직화학
본 개시내용의 항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된 신선-동결 및/또는 포르말린-고정, 파라핀-매봉된 조직 블록 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 이러한 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자에 대한 이전의 IHC 연구에서 성공적으로 사용되었으며 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간단히 말해서, 동결-절편은 작은 플라스틱 캡슐 내의 인산염 완충 염수(PBS)에 실온에서 동결 "미분" 조직 50ng을 재수화하고; 원심분리에 의해 입자를 펠릿화하고; 점성 매봉 매질(OCT)에 이들을 재현탁시키고; 캡슐을 역전시키고/시키거나 원심분리에 의해 다시 펠릿화하고; -70℃ 이소펜탄에서 급속 동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 조직의 동결 실린더를 제거하고; 저온유지장치 마이크로톰 척에 조직 실린더를 고정하고/하거나; 캡슐로부터 25-50개의 연속 절편을 절단함으로써 제조할 수 있다. 대안적으로, 전체 동결 조직 샘플을 연속 절편 절단에 사용할 수 있다.
영구-절편은 플라스틱 미세분리 튜브에서 50mg 샘플의 재수화; 펠릿화; 4시간 고정 동안 10% 포르말린에 재현탁; 세척/펠릿화; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁; 펠릿화; 한천을 경화시키기 위해 빙수에서 냉각; 튜브로부터 조직/한천 블록 제거; 파라핀에 블록을 침윤 및/또는 매봉; 및/또는 최대 50개의 연속 영구 절편 절단을 포함하는 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
4. 면역검출 키트
여전히 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기술된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 LILRB-관련 암세포를 검출하는 데 사용될 수 있으므로, 항체가 키트에 포함될 수 있다. 따라서 면역검출 키트는, 적절한 용기 수단에, LILRB에 결합하는 제1 항체, 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 항체는 컬럼 매트릭스 및/또는 미세역가 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체에 미리 결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 주어진 항체와 연관되거나 결합된 검출가능한 표지를 포함하여 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 부착된 검출가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 1차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 2차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 3차 항체와 함께 1차 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 포함하는 2성분 시약을 포함하며, 3차 항체는 검출 가능한 표지에 결합된다. 상기 언급된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지가 당업계에 공지되어 있으며 이러한 모든 표지가 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다.
키트는 검출 분석을 위한 표준 곡선을 제조하는데 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되든 표지되지 않든 간에, LILRB의 적절하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 항체-표지 접합체를 완전히 접합된 형태로, 중간체 형태로, 또는 키트 사용자에 의해 접합될 별도의 모이어티로서 함유할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질에 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 것이며, 그 안에 항체가 놓이거나, 바람직하게는, 적절하게 분취될 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀폐된 항체, 항원, 및 임의의 다른 시약 용기를 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
5. 유세포 분석 및 FACS
본 개시내용의 항체는 또한 유세포 분석 또는 FACS에 사용될 수 있다. 유세포 분석은 세포 계수, 세포 분류, 바이오마커 검출 및 단백질 공학을 포함한 다수의 검출 분석에 사용되는 레이저- 또는 임피던스-기반 기술이다. 이 기술은 세포를 유체 스트림에 현탁시키고 전자 검출 장치를 통과시켜 초당 최대 수천 개의 입자의 물리적 및 화학적 특성의 동시 다중 매개변수 분석을 가능하게 한다. 유세포 분석은 진단 장애, 특히 혈액암에 일상적으로 사용되지만, 기초 연구, 임상 실습 및 임상 시험에서 다른 많은 용도를 갖는다.
형광-활성 세포 분류(FACS)는 특수한 유형의 세포계측법이다. 이것은 각 세포의 특정 광산란 및 형광 특성에 기반으로 한 번에 한 세포씩 2개 이상의 용기에 생물학적 세포의 이종 혼합물을 분류하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 기술은 좁고 빠르게 유동하는 액체 스트림의 중앙에 동반된 세포 현탁액을 포함한다. 유동은 직경에 비해 세포 사이에 큰 간격이 있도록 정렬된다. 진동 메커니즘은 세포의 스트림이 개별 액적으로 부서지도록 한다. 스트림이 액적으로 부서지기 직전에, 유동은 형광 측정 스테이션을 통과하며, 여기서 각 세포의 형광이 측정된다. 스트림이 액적으로 부서지는 바로 그 지점에 전기 충전 링이 배치된다. 형광 강도가 측정되기 직전에 링에 전하가 배치되고, 액적이 스트림으로부터 부서짐에 따라 액적에 반대 전하가 갇히게 된다. 그후 하전된 액적은 이들의 전하에 따라 액적을 용기로 우회시키는 정전 편향 시스템을 통해 떨어진다.
특정 실시양태에서, 유세포 분석 또는 FACS에 사용하기 위해, 본 개시내용의 항체는 형광단으로 표지된 다음 관심 세포에 결합하도록 허용되며, 이는 유세포 분석기에서 분석되거나 FACS 기계에 의해 분류된다.
VIII. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업계의 숙련가들에 의해 인지되어야 한다. 그러나, 당업계의 숙련가들은, 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 실시양태에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 같거나 유사한 결과를 여전히 수득한다는 것을 인지해야 한다.
실시예 1
LILRB2에 대한 특정 단클론 항체 스크리닝. 본 발명자들은 LILRB2에 대한 선택된 단클론 항체의 결합 능력을 검출하기 위해 안정한 리포터 세포 시스템을 사용하였다. 이러한 키메라 수용체 리포터 시스템에서, LILRB2의 세포외 도메인(ECD)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프를 포함하는 어댑터 단백질 DAP12와 결합하는 PILRb의 막관통/세포내 도메인과 융합된다. 27개의 단클론 항체를 스크리닝하였다. LILRB2 리포터 세포를 선택된 단클론 항체와 함께 배양한 다음 (APC) 염소 항-인간 IgG 이차 항체로 표지하였다. 유세포 분석기 분석은 95% 이상의 LILRB2 리포터 세포가 클론 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17, B2-18, B2-19로 표지되었음을 입증하였다. 더 낮은 비율의 LILRB2 리포터 세포가 클론 B2-8, B2-10, B2-12, B2-24, B2-25로 표지되었다. 다른 클론은 LILRB2 리포터 세포에 대한 결합 능력을 갖지 않았다(도 1a-b). LILRA 및 LILRB의 구성원이 높은 서열 상동성을 나타내기 때문에, 본 발명자들은 LILRBA 및 LILRB에 대한 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17, B2-18, B2-19, B2-8, B2-10, B2-12, B2-24 및 B2-25의 잠재적 교차-반응성을 검출하였다. 본 발명자들은 각 수용체의 세포외 도메인(ECD)으로 안정적으로 형질도입된 LILRBA 및 LILRB 리포터를 생성하였다. 유세포 분석기 분석은 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17, B2-18, B2-19, B2-8, B2-24, B2-25가 LILRA 및 LILRB2를 제외한 다른 LILRB와 교차-반응하지 않았음을 보여주었다. B2-10, B2-12 및 B2-18은 LILRA1에 비특이적으로 결합되었다(도 1c 및 도 29). 따라서, 이들은 LILRB2에 대한 특이적 단클론 항체로 확인된 8개의 항체였다. 또한, 본 발명자들은 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19 만이 인간 말초 혈액 샘플에서 골수 세포에 결합함을 입증하였으며(도 30), 이에 의해 내인성 LILRB2를 발현하는 세포에 대한 결합을 추가로 확인시켜 주었다. 본 발명자들은 또한 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 전장 LILRB2를 발현하는 HEK293 세포(HEK293_LILRB2)(도 31) 및 1차 단핵구(도 32)에 용량-의존적 방식으로 결합함을 확인하였다. 결합 EC50 값은 HEK293_LILRB2(도 31)에서 0.101 내지 0.277 μg/mL 및 1차 단핵구(도 32)에서 0.056 내지 > 10 μg/mL 범위이다.
LILRB2에 대한 잠재적인 길항제 및 효능제 항체 스크리닝. 전형적으로, 수용체 차단 항체는 리간드-결합 부위를 표적으로 하고 리간드와 경쟁하고/하거나 수용체와 이의 리간드의 상호작용을 차단한다. LILRB2 리간드는 안지오포이에틴-유사 단백질(ANGPTL), 세마포린 4A(SEMA4A), TIM-3, CD-1 분자, 아밀로이드-β(Aβ) 올리고머, 고전 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자(HLA-A, HLA-B, HLA-C) 및 비고전 HLA-클래스 I 분자(HLA-E, HLA-F, HLA-G, 및 HLA-H)를 포함한다. LILRB2 리포터 시스템은 LILRB2에 대한 잠재적 길항 항체를 스크리닝하는 강력한 도구를 제공하였다. 키메라 수용체가 LILRB2의 ECD에 결합하는 리간드에 의해 활성화되는 경우, ZAP70 또는 Syk 키나제가 어댑터 DAP12의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프에 모집되고 NFAT를 활성화하여 NFAT-반응성 프로모터에 의해 유도되는 GFP 발현을 촉진한다. GFP 신호전달을 유의하게 감소시킨 항체는 잠재적 길항 항체로 간주되었다.
코팅된 ANGPTL2(도 3a-c; 도 51) 및 SEMA4A(도 4a-c)에 의해 자극된 LILRB2 리포터 세포의 활성화를 차단하는 LILRB2 mAb의 기능을 시험하였다. 결과는 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 용량-의존적 방식으로 코팅된 리간드에 의한 LILRB2 리포터 세포의 활성화를 방지할 수 있음을 보여주었다. B2-19 항체는 또한 코팅된 CD1d에 의해 자극된 LILRB2 리포터 세포의 활성화를 차단할 수 있었다(도 52). LILRB2 리포터 세포를 또한 HLA-G로 과발현된 K562 세포와 공동배양한 다음 LILRB2 mAb로 처리하였다. 결과는 또한 이러한 LILRB2 mAb가 K562 세포에서 HLA-G에 의해 자극된 LILRB2 리포터 세포의 활성화를 차단한다는 것을 보여주었다(도 5a-c). LILRB2 항체는 또한 용량-의존적 방식으로 전장 LILRB2를 발현하는 HEK293 세포에 대한 HLA-G 및 SEMA4A의 결합을 차단하는 것으로 나타났다(각각 도 33 및 도 34). 이러한 데이터는 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19가 길항 LILRB2 mAb임을 입증하였다.
대조적으로, 몇몇 LILRB2 mAb(B2-8, B2-24, B2-25, B2-10, B2-12 및 B2-18)는 세포 배양 배지에 첨가되거나(도 2a) K562와 공동배양될 때(도 2b) LILRB2 리포터 세포를 활성화시킬 수 있으며, 이는 이러한 LILRB2 mAb가 효능제 항체임을 입증한다.
1차 인간 단핵구에서 LPS 반응에 대한 항- LILRB2 항체의 효과. LILRB2는 조혈 줄기 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 일부 개체의 호염기구, 탈락막 대식세포, 비만 세포 전구 세포, 내피 세포 및 파골 세포에서 발현되지만 림프성 세포에서는 발현되지 않는다. LILRB2는 면역 억제 수용체로 분류되며 면역 반응의 하향 조절과 관련된다. 스크리닝된 항-LILRB2 항체의 기능을 결정하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 기반 기능 분석을 수행하여 스크리닝된 항체가 단핵구 활성화를 증폭 또는 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19는 LPS의 존재하에서 CD86 및 TNFα 수준을 향상시킬 수 있다. B2-8, B2-24 및 B2-25는 LPS 자극으로 CD86 수준에 대한 억제를 나타내었지만 TNFα 수준에는 영향을 미치지 않는 것으로 보였다(도 6a-c). B2-7, B2-16 및 B2-19는 LPS로 자극된 PBMC로부터의 IFN-γ(도 35) 및 TNF-α(도 36) 분비를 향상시킬 수 있었다. B2-19는 또한 LPS로 자극된 PBMC로부터 IL-12p40의 분비를 향상시킬 수 있었다(도 37). 본 발명자들은 LPS 자극에 대한 반응으로 단핵구 염증 잠재력을 향상시키는 B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19 LILRB2-특이 항체를 확인하였다. 이러한 모든 항체는 기능적 길항 항체이다. B2-8, B2-24 및 B2-25는 LILRB2에 대한 잠재적 활성 항체이다.
항-CD3 활성화 항체에 의해 자극된 PBMC에 대한 항- LILRB2 항체의 효과. 본 발명자들은 활성화 항-CD3 항체에 의한 T 세포 활성화에 대한 LILRB2 차단의 간접적인 효과를 평가하였다. B2-7 및 B2-19 항체는 IFN-γ(도 38), TNF-α(도 39), GM-CSF(도 40), IL-1α(도 41), IL-1β(도 42), IL-6(도 43) 및 CXCL2(도 44)의 분비를 향상시킬 수 있었다. B2-19는 또한 CD8+ T 세포에서 CD25의 세포 표면 발현을 향상시킬 수 있었다(도 46). 본 발명자들은 T 세포 활성화를 향상시키는 B2-7 및 B2-19 LILRB2-특이 항체를 확인하였다.
단핵구 유래 M2a 대식세포에 대한 항- LILRB2 항체의 효과. 본 발명자들은 시험관내에서 M2a 대식세포의 표현형에 대한 B2-19의 효과를 평가하였다. 여러 기증자의 단핵구로부터 분화된 M2a 대식세포에서, B2-19는 CD64, CD163 및 CD14의 발현을 감소시켰다(도 45). 본 발명자들은 B2-19를 M2a 대식세포의 표현형을 조절할 수 있는 LILRB2-특이 항체로서 확인하였다.
항- LILRB2 항체는 C1498- LILRB2 종양-보유 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. 본 발명자들은 LILRB2 차단이 C1498 백혈병 모델에서 종양 진행을 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. 인간 LILRB2를 과발현하는 C1498 서브라인(C1498-LILRB2)을 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성하였다. LILRB2는 C1498-LILRB2에서 안정적으로 발현된다(도 7a). LILRB2는 백혈병 발달을 촉진할 수 있다. 과발현된 LILRB2는 NSG 마우스에서 백혈병 발달을 촉진하였다(도 7b). LILRB2 과발현은 백혈병 침윤(도 7c-d), 생존 곡선(도 7e) 및 근유사 세포 침윤(도 7g)을 악화시킨다. 또한, Fc 돌연변이를 함유하는 B2-7 및 B2-19의 LALAPG 변이체를 생성하여 뮤린 IgG2a 및 인간 IgG1 둘 다에서 보체 결합 및 고정 뿐만 아니라 Fc-γ 의존성 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 제거하였다. LALAPG 돌연변이 길항 항체로의 치료는 골수성 백혈병 성장을 유의하게 억제하였다(도 7h-j).
항- LILRB2 항체는 MLL -AF9 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. 본 발명자들은 LILRB2 차단이 MLL-AF9 백혈병 모델에서 종양 진행을 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. 인간 LILRB2(LILRB2)를 과발현하는 PirB-KO MLL-AF9 백혈병 서브라인을 레트로바이러스 형질도입 및 마우스 이식에 의해 생성하였다. LILRB2의 발현은 PirB-KO MLL-AF9 LILRB2 또는 대조군(Ctrl) 백혈병 세포에서 검출될 수 있었다(도 8a). 이러한 MLL-AF9 모델에서, LILRB2 과발현은 백혈병 침윤(도 8b-x), 생존 곡선(도 8d)을 악화시킨다. 또한, LALAPG 돌연변이 길항 항체로의 치료는 백혈병 침윤을 유의하게 억제하였다(도 8e-f).
LILRB2 차단은 AML 세포의 이동 및 침윤을 억제한다. LILRB2는 암 생물학에서도 다양한 역할을 한다. LILRB2의 발현은 인간 백혈병 세포주인 THP-1에서 검출될 수 있었다(도 9a). 본 발명자들은 백혈병에 대한 LILRB2 기능을 시험하기 위해 인간화 마우스 이종이식 모델을 사용하였다. LILRB2의 차단은 조혈 기관으로의 백혈병 세포의 귀소 및 생착을 감소시켜(도 9b-c), 지연된 체중 감소(도 9d), 간으로의 골수성 백혈병 세포의 덜 심각한 침윤(도 9e-f), 이종이식된 마우스의 연장된 생존을 초래하였다. 이와 함께, LILRB2의 차단은 백혈병 이동 및 침윤을 감소시켰다.
길항성 LILRB2 mAb는 환자-유래 이종이식( PDX ) 모델에서 백혈병 세포의 발달을 억제한다. 유세포 분석기 분석은 원발성 단핵구 AML(M5)의 일부 사례에서 LILRB2가 발현되었음을 보여주었다(도 10a). TCGA 데이터베이스에서, LILRB2 mRNA 수준은 AML 환자 생존과 음의 상관관계가 있었다(도 10b). PDX 모델에서, LALAPG 돌연변이 길항 항체 B2-7 및 B2-19는 백혈병 침윤을 유의하게 억제하였다(도 10c). 시험관 배양 시스템에서, LALAPG 돌연변이 길항 항체는 AML-M5 백혈병 세포의 분화를 촉진하였다(도 10d-e).
길항성 LILRB2 mAb는 시험관내에서 골수-유래 억제 세포( MDSC )의 T 세포 억제 기능을 방지하고 암-유래 복수로부터의 CD14 + 세포를 전염증성 표현형으로 분극 화할 수 있다. MDSC의 T 세포 억제 기능에서 길항 LILRB2 항체의 기능을 시험관내에서 시험하였다. 동일한 종양 환자로부터의 MDSC 및 T 세포 쌍을 공동배양하고 길항 LILRB2 항체로 처리하였다. B2-7 및 B2-19 항체의 처리는 아마도 면역 억제 골수 세포를 전염증성 골수 세포로 전환함으로써 MDSC에 의해 유도된 T 세포 증식 억제를 유의하게 약화시켰다(도 11a-e 및 도 11g). B2-7, B2-15, B2-16, B2-17 및 B2-19는 또한 암-유래 복수로부터 단리된 1차 CD14+ 세포에서 항염증성 마커 CD163 및 CD206을 감소시키고 전염증성 마커 CD86을 증가시킬 수 있었다(도 11f).
실시예 2
LILRB2 항체의 생성 및 특성화. LILRB2 항체는 파지 디스플레이된 인간 항체 scFv 라이브러리를 패닝함으로써 생성하였다. LILRB2-His 항원을 3 라운드의 패닝 동안 고체상에 코팅하였다. 파지 패닝의 각 라운드에서, LILRB1-His 항원을 선택-해제(de-selection)에 사용하였다. 파지 패닝 후, 파지 ELISA 시험을 위해 단일 박테리아 콜로니를 선택하였다. 파지 ELSIA에서 양성인 것을 서열분석하고 이들의 scFv 영역을 분석하였다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 24개의 독특한 항체 서열을 수득하였다. scFv를 제시하는 파지는 파지 ELISA에서 LILRB2 항원에 대한 결합을 나타내었다(도 12b). 그후 이러한 24개의 scFv를 추가 분석을 위해 완전 인간 IgG1으로 전환시켰다.
LILRB2 항체의 ELISA 결합 EC 50 . 이들 24개 항체의 ELISA 결합 EC50을 간접 ELISA로 측정하였다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트를 LILRB2-His 항원으로 코팅하였다. 연속 희석된 항체를 항원 코팅된 플레이트와 함께 배양하였다. 배양 후, HRP-접합된 염소 항-인간 Fc 2차 항체를 플레이트와 함께 배양하였다. TMB 기판은 발색 및 450nm에서의 흡광도 측정을 위해 추가되었다. 도 13a-b에 나타낸 바와 같이, 이들 항체는 용량-의존적 방식으로 LILRB2에 결합하며(도 13a) 이들의 EC50 값은 0.355 내지 46.49nM 범위이다(도 13b).
LILRB2 항체의 결합 특이성. LILRB2 항체의 결합 특이성은 LILR 패밀리의 다른 구성원에 대한 항원과의 ELISA 결합 활성을 결정함으로써 평가하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, 24개 항체 중에서, 21개는 LILRB2에 대해 매우 특이적 결합을 보였으며, 3개 항체(B2-10, -12, -18)는 LILRA1에 대해 약한 교차 결합을 보였다. 이러한 3개 항체를 LILRB2 및 LILRA1 항원으로 추가 적정하면 LILRB2에 대한 이들 3개 항체의 결합 능력이 LILRA1보다 훨씬 더 강력함(>100배)이 나타났다(도 14b).
LILRB2 항체의 에피토프 비닝. OctetRED96 시스템에서 샌드위치 형식으로 22개 항체에 대해 에피토프 비닝을 수행하였다. 각 항체를 나머지 항체와 교차-비닝하여 이들이 서로 경쟁할 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 이들 항체는 3개의 빈으로 나눌 수 있다. 각 빈에서, 항체는 LILRB2 결합에 대해 서로 경쟁한다. 빈 1과 빈 2의 항체는 이들의 차단 프로필이 겹치는 것으로 나타났다.
LILRB2 항체의 도메인 매핑. LILRB2는 4개의 Ig-유사 도메인(D1, D2, D3 및 D4) 및 막 인접 도메인(JM)을 갖는다. LILRB2 항체의 결합 도메인을 결정하기 위해, LILRB2의 전체 세포외 도메인(ECD) 또는 절단된 ECD를 재조합 단백질 발현을 위해 마우스 IgG2a의 Fc 단편에 융합시켰다(도 16a-b). 그후 이들 도메인 단백질에 대한 LILRB2 항체의 결합 능력을 결정하였다. D1 도메인의 결실은 항체 B2-7, -15, -16, -17 및 -19에 대한 결합 손실을 초래하였지만 다른 항체에 대해서는 그렇지 않았으며, 이는 이들 항체가 LILRB2의 D1 도메인에 결합함을 나타낸다(도 16c). 유사하게, 다른 항체의 결합 도메인을 결정하고 요약하였다(도 16d).
항체 결합을 위한 주요 잔기. 항체 결합을 위한 주요 잔기를 미세 맵핑하기 위해, 항체 결합을 결정하기 위해 일련의 돌연변이 B2-ECD 단백질을 생성하였다. 대부분의 항체가 D1 또는 D4 도메인에 결합하기 때문에, 본 발명자들은 D1 또는 D4 도메인에서만 돌연변이를 설계하였으며 돌연변이는 두 가지 기준에 기반한다: 1) LILRB2와 LILRB1 사이에 상이한 잔기; (2) 노출되어 가요성 루프 영역에 위치하는 잔기. 도 17a-c에 나타낸 바와 같이, LILRB2의 D1 도메인 상의 4개 영역이 LILRB1 상의 상응하는 서열로 돌연변이되었다. 유사하게, LILRB2의 D4 도메인 상의 4개 영역도 돌연변이되었다(도 17b-d). 4개의 D1 돌연변이체를 사용하여 D1 도메인에 결합하는 5개 항체(B2-7, -15, -16, -17 및-19)와의 결합을 시험하였으며, D4 영역에 결합하는 항체 B2-18을 대조군으로서 사용하였다. 도 17e에 나타낸 바와 같이, D1M4 및 D1M2 돌연변이체는 항체 B2-7, -15 및 -17에 의한 결합을 완전히 없앴으며, 이는 두 영역이 이러한 항체의 결합 활성에 핵심임을 나타내고; D1M4는 완전히, D1M2는 부분적으로 항체 B2-16 및-19에 의한 결합을 없애며, 이는 M4 영역이 두 항체의 결합 활성에 핵심임을 나타낸다. 대조군으로서, 이들 돌연변이체 중 어느 것도 항체 B2-18에 의한 결합을 없애지 못했다. 유사한 방법에 의해, D4 도메인에서 다른 항체의 결합 활성에 대한 핵심 영역을 결정하였다(도 17f).
차단 항체의 친화도 측정. Octet RED 96 시스템에서 5개 차단 항체의 친화도를 측정하였다. 도 18 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 친화도는 1.87 내지 35.9nM 범위이다.
실시예 3
명백히 건강한 기증자의 PBMC로부터 단리된 고전적 단핵구를 50ng/mL GM-CSF 및 35ng/mL IL-4를 사용하여 6일 동안 미성숙 DC로 분화시켰다. 6일째에, DC를 40ng/mL IL-10(관용원성 자극으로서) 및 10μg/mL B2-19 또는 이의 동형 대조군으로 처리하였다. 48시간 후, Luminex 분석(R&D Systems)을 사용하여 배양 배지 상청액에서 사이토카인 및 케모카인 수준을 측정하였다. B2-19는 단핵구(CCL2) 및 호중구(CXCL8)를 모집하는 것으로 알려진 케모카인 및 전염증성 사이토카인 IL-6의 향상된 생산을 촉발시켰다(도 47).
명백히 건강한 기증자로부터 제조된 PBMC로부터 단리된 고전적 단핵구를 50ng/mL GM-CSF 및 35ng/mL IL-4를 사용하여 6일 동안 미성숙 DC로 분화시켰다. 6일째에, DC를 100ng/mL LPS(성숙 자극으로서) 및 10μg/mL B2-19 또는 이의 동형 대조군으로 처리하였다. 48시간 후, 여러 세포 표면 마커의 발현 수준을 유세포 분석으로 측정하였다. B2-19는 CD83(DC 성숙 마커), CD86(공동자극 분자), HLA-DR(항원 제시)의 발현을 증가시켰다. 다른 한편으로, B2-19는 억제 수용체 LILRB4 및 CD209의 발현 수준을 감소시켰다. 종합하면, 이러한 데이터는 B2-19가 LPS-자극된 DC에서 전염증성 표현형을 더욱 촉진한다는 것을 나타낸다(도 48).
B2-19의 약동학을 야생형 마우스(LILRB2 발현 없음)에서 평가하였다. 9마리의 C57BL/6J 마우스는 단일 5mg/kg 정맥내 용량의 B2-19를 제공받았으며 교대 시점에서 혈액 샘플링을 위해 3개의 그룹으로 무작위화되었다. 혈청을 혈액 샘플로부터 제조하고 B2-19 농도를 ELISA를 사용하여 결정하였다. 혈청 내 항체를 플레이트-코팅된 항원(LILRB2-ECD, R&D Systems)에 의해 포획하고 HRP-접합된 염소-항-인간 IgG Fc 항체(Jackson ImmunoResearch) 및 TMB 기질을 사용하여 검출하였다. 결과는 B2-19 항체가 5mg/kg을 투여받은 C57BL/6J 야생형 마우스에서 인간 IgG4의 예상되는 약동학 프로파일(CL 및 반감기)을 제시한다는 것을 나타낸다. ELISA 형식은 활성 항체를 측정하기 때문에, 이러한 결과는 B2-19 생체내 노출(마우스에서)이 이의 결합 활성을 감소시키지 않는다는 것을 입증한다.
B2-19 항체의 항종양 효능은 SK-MEL-5 흑색종 세포주가 이종이식된 인간화 NSG-SGM3 마우스에서 평가하였다. NSG-SGM3 마우스(The Jackson Laboratory, stock No. 013062)를 개별 기증자의 제대혈로부터 단리된 1 x 105개 CD34+ 조혈 세포로 인간화하였다. 인간화시킨지 6주 후, 마우스에 1 x 106개 SK-MEL-5 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 크기가 70-80mm3에 도달했을 때(종양 이식 후 29일), 다음 기준에 따라 마우스를 그룹당 6마리의 마우스로 2개의 처리 그룹으로 무작위화하였다: 혈액에서의 인간 CD45+CD14+ 세포 %, 종양 용적 및 기증자(치료 코호트당 각 CD34+ 기증자로부터 2마리 마우스). 마우스를 3회 용량에 대해 3일마다 20mg/kg B2-19 또는 이의 동형 대조군으로 정맥내 처리하였다. 동형 대조군과 비교하여, B2-19 단일요법은 종양 성장 속도를 감소시켰고 종양 크기를 29% 감소시켰다(도 50a-b). 이들 데이터는 B2-19 항체 단일요법이 고형 종양의 마우스 모델에서 항종양 효능을 나타낸다는 것을 입증한다.
[표 1]
LILRB2 차단 항체의 친화도
Figure pct00007
[표 2]
LILRB2 항체에 대한 CDR의 아미노산 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 3]
LILRB2 항체에 대한 CDR의 DNA 서열
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 4]
항체 중쇄(HC)의 DNA 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
[표 5]
항체 중쇄(HC)의 아미노산 서열
Figure pct00018
Figure pct00019
[표 6]
LILRB2 항체 경쇄(LC)의 DNA 서열
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
[표 7]
LILRB2 항체 경쇄(LC)의 아미노산 서열
Figure pct00024
Figure pct00025
* * * * * * * * * * * * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 측면에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 방법 및 단계 또는 방법의 단계 순서에 개질이 적용될 수 있음이 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 특히, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음이 자명할 것이다. 당업계의 숙련가들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체물 및 개질은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
예시적인 절차 또는 본원에 제시된 것들을 보충하는 기타 세부 사항을 제공하는 한 하기 참고문헌은 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> NOVEL LILRB2 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> UTFH.P0359WO <150> US 62/970,496 <151> 2020-02-05 <160> 613 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 1 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 3 Ala Arg Gly Asn Gln Gly Asp Thr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 4 Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 5 Asp Val Ser 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 6 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Val 1 5 10 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ccagggaagg gactggagtg gattggctac atctctaaca gtggaagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt cagtctatca gtagacacgt ccaagaatca gttctccctg 240 aagcagacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccacatatt actgtgcgag aggcagcggt 300 tatactgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcctc a 351 <210> 473 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 473 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatgtc 300 gacccctata gtagtggtta ttttgactac tggggccagg gaaccctggt catcgtctcc 360 tca 363 <210> 474 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 474 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcc attagtggta gtagtattag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctttat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtcctcgggt 300 ttcgggtcct ttgactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcttc a 351 <210> 475 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 475 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttaagt agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccaggggagg ggctggagtg ggtctcaagt attaatagtg gtggtagcac atactacgca 180 ggctccgtga ggggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gttgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agcgaagagt 300 tatagcagtg accttgacca ctggggccag ggaaccacgg tcaccgtctc ttca 354 <210> 476 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 476 caggtgcaga tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctt 300 ctcggggata gtgggagcta ccctgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 477 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 477 caggtgcaga tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc cagggcaatc cctgagactc 60 tcctgtgtaa cttctggatt cccctttgcg gactatgcta tgagctggtt ccgccaggct 120 ccagggcagc ggccggagtg gataggttac attaaaagca agactagaga tgggacaaca 180 aaatacgccg agtctctgcg aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240 gcctatctac aaatgaacaa cttaaaaagg gaagacacag ccgtctatta ctgtgccctc 300 gggggagcag cagctctatg gggcccggga accctggtca gcgtctcctc a 351 <210> 478 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 478 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc 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<400> 593 Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly 1 5 10 15 Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr 20 25 30 Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro 35 40 45 Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp 50 55 60 Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Lys Thr Ala Gly 65 70 75 80 Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu 85 <210> 594 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 594 Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser Val Ile Thr Gln Gly 1 5 10 15 Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala Gln Glu Tyr 20 25 30 Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg 35 40 45 Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp 50 55 60 Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp 65 70 75 80 Ser Glu Leu Ser <210> 595 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 595 Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser 1 5 10 15 Pro Val Thr Leu Cys Gln Gly Glu Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu 20 25 30 Lys Lys Ser Ala Trp Ile Thr Arg Ile Glu Leu Val Lys Gly Gln Phe 35 40 45 Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Gly Arg Tyr Cys Tyr Ser Ser 50 55 60 <210> 596 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 596 Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe 1 5 10 15 Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Cys Ala Ser 20 25 30 Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr 35 40 45 Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg 50 55 60 Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro 65 70 75 80 Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser 85 90 95 Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val 100 105 110 Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly Pro Thr 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp 130 135 140 Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val 145 150 155 <210> 597 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 597 Cys Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile 1 5 10 15 Arg Gly Thr Pro Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser 20 25 30 Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr 35 40 45 Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg 50 55 60 Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro 65 70 75 80 Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn 85 90 95 Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser Thr His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu 100 105 110 Val Val Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly Pro 115 120 125 Ile Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly 130 135 140 Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val 145 150 155 <210> 598 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 598 Ser Leu Glu Ala 1 <210> 599 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 599 Gly Gln Glu Thr 1 <210> 600 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 600 Lys Ser Ala Ser 1 <210> 601 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 601 Lys Thr Ala Leu 1 <210> 602 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 602 Ile Arg Pro Glu 1 <210> 603 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 603 Ile Pro Gln Glu 1 <210> 604 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 604 Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu 1 5 <210> 605 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 605 Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser 1 5 <210> 606 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 606 Trp Arg Gln 1 <210> 607 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 607 Gln Gly Trp 1 <210> 608 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 608 Ile His Glu Tyr Pro 1 5 <210> 609 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 609 Thr Tyr Gln Ser Gln 1 5 <210> 610 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 610 Leu Asn Ser Asp 1 <210> 611 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 611 Gln Ser Ser Lys 1 <210> 612 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 612 Ser Glu Pro 1 <210> 613 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody <400> 613 Ser Asp Pro 1

Claims (59)

  1. 표 2에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 CDR 서열(clone-paired CDR sequence)을 포함하는 중쇄(HC) 가변 영역(VH) 및 경쇄(LC) 가변 영역(VL); HC-CDR 및/또는 LC-CDR 중 하나 이상이 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 이의 조합을 갖는 이의 변이체를 포함하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 단리된 단클론 항체가 뮤린(murine), 설치류, 토끼, 키메라(chimeric), 인간화, 또는 인간 항체인 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항원-결합 단편이 재조합 ScFv(단일 쇄 가변 단편) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 단리된 단클론 항체가 인간 항체인 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, VH 및 VL 쇄가 각각 부록 II 및 IV의 클론-쌍을 이룬 서열과 적어도 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, VH 및 VL 쇄가 각각 부록 I 및 III의 클론-쌍을 이룬 서열과 적어도 80% 또는 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제5항에 있어서, VH 및 VL 쇄가 각각 부록 II 및 IV의 클론-쌍을 이룬 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제5항에 있어서, VH 및 VL 쇄가 각각 부록 I 및 III의 클론-쌍을 이룬 서열과 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 단클론 항체가 인간화 항체인 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, LILRB2의 활성화를 유도하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, LILRB2의 활성화를 억제하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 동일한 에피토프(epitope)에 대해 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  16. 제15항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터(vector).
  17. 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
  19. 제17항에 있어서, 숙주 세포가 CHO 세포인 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단클론 항체를 암호화 및/또는 생산하는 하이브리도마 또는 조작된 세포(engineered cell).
  21. 항체를 발현하는데 적합한 조건하에서 제17항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체를 회수하는 단계를 포함하여, 항체를 생산하는 방법.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질.
  23. 제22항의 CAR 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.
  24. 제23항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  25. 제23항의 단리된 핵산을 포함하는 조작된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 T 세포, NK 세포, 또는 대식세포인 조작된 세포.
  27. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제25항 또는 제26항의 조작된 세포를 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 암의 영향(effect)을 치료하거나 개선하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 대상체에서 종양 부담을 감소시키거나 근절하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 종양 세포 수를 감소시키고/감소시키거나 종양 성장 속도를 늦추는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 종양 크기를 감소시키는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 종양 전이를 감소시키거나 방지하는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 대상체에서 종양을 근절하는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 암이 고형 암인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 고형 암이 부신암(adrenal cancer), 담관 암종(bile duct carcinoma), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 융모막암종(choriocarcinoma), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 안암(eye cancer), 위암(gastric cancer), 교모세포종(glioblastoma), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 중피종(mesothelioma), 흑색종(melanoma), 메르켈 세포암(merkel cell cancer), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 구강암(oral cancer), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 송과체종(pinealoma), 전립선암(prostate cancer), 신세포암(renal cell cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 육종(sarcoma), 피부암(skin cancer), 고환암(testicular cancer), 흉선 암종(thymic carcinoma), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 및 질암(vaginal cancer)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  35. 제27항에 있어서, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 호중구 및 기타 골수 세포, 골수-유래 억제 세포, 및 종양-관련 대식세포가 표적화되는 방법.
  36. 제27항에 있어서, 암이 혈액 암(hematologic malignancy)인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 혈액 암이 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), B-세포 백혈병(B-cell leukemia), 만성 림프모구성 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 모세포 형질세포양 수지상 세포 신생물(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, BPDCN), 만성 골수단핵구 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia, CMML), 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic leukemia, CML), pre-B 급성 림프구성 백혈병(pre-B acute lymphocytic leukemia, Pre-B ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 외부 결정성 NK/T-세포 림프종(extranodal NK/T-cell lymphoma), 모양 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 중쇄 질환(heavy chain disease), HHV8-관련 원발성 삼출 림프종(HHV8-associated primary effusion lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 원발성 CNS 림프종(primary CNS lymphoma), 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte-rich B-cell lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 다발성 골수종(multiple myeloma, MM), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes, MDS), 골수증식성 신생물(myeloproliferative neoplasm), 및 진성 다혈구증(polycythemia vera)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  38. 제27항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 정맥내, 동맥내, 종양내 또는 피하로 투여되는 방법.
  39. 제27항에 있어서, 대상체에게 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오시드 대사 억제제, 시타라빈, 저메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신과 시타라빈의 조합, 주사용 다우노루비신과 시타라빈 리포솜, Vyxeos®, 아자시티딘, Vidaza®, 데시타빈, 전-트랜스 레티노산(ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, Ceplene®, 인터루킨-2, 알데스루킨, Proleukin®, 젬투주맙 오조가마이신, Mylotarg®, FLT-3 억제제, 미도스타우린, Rydapt®, 클로파라빈, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 아이보시데닙, Tibsovo®, IDH2 억제제, 에나시데닙, Idhifa®, SMO(smoothened) 억제제, 글라스데깁, 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, Venclexta®, 백금 착물 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, IMBRUVICA®, 아칼라브루티닙, CALQUENCE®, 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, CD70 항체, 및 CLL1 항체, CD123 항체, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사산물, 항종양 항생제, 식물 유래 알칼로이드, 호르몬 치료제, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제, 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 이에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 항종양 약물이 광불안정성 링커(photolabile linker)를 통해 상기 항체에 연결되는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 항종양 약물이 효소적으로 절단된 링커를 통해 상기 항체에 연결되는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 항종양 약물이 독소, 방사성 동위원소, 사이토카인 또는 효소인 방법.
  44. (a) 대상체 또는 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 대상체 또는 샘플에서 암 세포 또는 암 줄기 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하여, 샘플 또는 대상체에서 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 샘플이 체액 또는 생검(biopsy)인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 샘플이 혈액, 골수, 가래, 눈물, 타액, 점액, 혈청, 소변 또는 대변인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 검출이 면역조직화학, 유세포분석(flow cytometry), 면역분석(ELISA, RIA 등 포함) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함하는 방법.
  48. 제44항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 2번째로 수행하고 첫 번째와 비교하여 검출 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제44항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 표지(label)를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 태그, 효소, 자성 입자, 발색단, 형광 분자, 화학-발광 분자, 또는 염료인 방법.
  51. 제27항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 리포솜 또는 나노입자(nanoparticle)에 접합되는 방법.
  52. 대상체에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제25항 또는 제26항의 조작된 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 자가면역 질환의 영향을 치료하거나 개선하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 호중구 및 기타 골수 세포가 표적화되는 방법.
  54. 제52항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 정맥내, 동맥내, 종양내 또는 피하로 투여되는 방법.
  55. 제52항에 있어서, 스테로이드 또는 NSAID로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제52항에 있어서, 자가면역 질환이 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 장병증성 관절염(enteropathic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 미분화 척추관절병증(undifferentiated spondyloarthropathy), 소아 척추관절병증(juvenile spondyloarthropathy), 베체트병(Behcet's disease), 골부착부위염(enthesitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 섬유근육통(fibromyalgia), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), 전신 염증 질환과 관련된 통증 상태(pain conditions associated with systemic inflammatory disease), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 소아 발병 당뇨병(juvenile onset diabetes mellitus)(I형 당뇨병으로도 알려짐), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 봉입체 근염(inclusion body myositis), 다발성 내분비 부전(multiple endocrine failure), 슈미트 증후군(Schmidt's syndrome), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Grave's Disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 자가면역 갑상선병(autoimmune thyroid disease), 악성 빈혈(pernicious anemia), 위 위축(gastric atrophy), 만성 간염(chronic hepatitis), 루푸스 간염(lupoid hepatitis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 부갑상선 기능 저하증(hypoparathyroidism), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 이튼-램버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 자가면역 혈소판 감소증(autoimmune thrombocytopenia), 특발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 천포창(pemphigus), 포진 피부염(dermatitis herpetiformis), 탈모증(alopecia), 경피증(scleroderma), 진행성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis), CREST 증후군(석회증(calcinosis), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 식도 운동성 장애(esophageal dysmotility), 수지경화증(sclerodactyly), 모세혈관 확장증(telangtasia)), 성인 발병 당뇨병(adult onset diabetes mellitus)(II형 당뇨병으로도 알려짐), 혼합 결합 조직 질환(mixed connective tissue disease), 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 전신 괴사 혈관염(systemic necrotizing vasculitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 아토피성 비염(atopic rhinitis), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 샤가스병(Chagas' disease), 사르코이드증(sarcoidosis), 류마티스 열(rheumatic fever), 천식(asthma), 항인지질 증후군(anti-phospholipidsyndrome), 다형 홍반(erythema multiforme), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 자가면역 만성 활동성 간염(autoimmune chronic active hepatitis), 알레르기 질환(allergic disease), 알레르기성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 수혈 반응(transfusion reaction), 나병(leprosy), 말라리아(malaria), 레슈마니아증(leshmaniasis), 트리파노소마증(trypanosomiasis), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 측두 동맥염(temporal arteritis), 주혈흡충증(shistosomiasis), 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 습진(eczema), 림프종모양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 가와사키병(Kawasaki's disease), 내안구염(endophthalmitis), 건선(psoriasis), 태아 적아구증(erythroblastosis fetalis), 호산구성 안면염(eosinophilic faciitis), 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 푸흐 모양체염(Fuch's cyclitis), IgA 신병증(IgA nephropathy), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 이식편 대 숙주병(graft versus host disease), 이식 거부(transplantation rejection), 야토병(tularemia), 주기성 발열 증후군(periodic fever syndrome), 화농성 관절염(pyogenic arthritis), 가족성 지중해 열(Familial Mediterranean Fever), TNF-수용체 관련 주기성 증후군(TNF-receptor associated periodic syndrome, TRAPS), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome), 또는 고-IgD 증후군(hyper-IgD syndrome)인 방법.
  57. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제25항 또는 제26항의 조작된 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 T 세포 활성화를 향상시키는 방법.
  58. 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제25항 또는 제26항의 조작된 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 M2a 대식세포 표현형을 조절하는 방법.
  59. LILRB2에 결합하고
    (a) LILRA 또는 다른 LILRB에 결합하지 않거나;
    (b) LILRB2 도메인 1 또는 4에 결합하거나;
    (c) LILRB2를 활성화 또는 길항하거나;
    (d) 단핵구 염증 잠재력을 향상시키거나;
    (e) T 세포 활성화를 향상시키거나;
    (f) M2a 대식세포 표현형을 조절하거나;
    (g) 골수-유래 억제 세포 기능을 방지하거나;
    (h) 생체내 백혈병 세포 이동 및/또는 침윤(infiltration)을 억제하는 단클론 항체.
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