KR20220137542A

KR20220137542A - 로베글리타존을 유효성분으로 하는 안과질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220137542A
Application number: KR1020220036181A
Authority: KR
Inventors: 김선웅; 셀리켐
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-10-12
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: KR102739882B1

Abstract

본 발명은 로베글리타존(lobeglitazone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 안과질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명자들은 로베글리타존이 각막섬유아세포에서 TGF-β1에 의한 Smad 신호전달을 억제하는 것을 확인하였다. 이에, 로베글리타존을 TGF-β1으로 인한 안과질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 활용할 수 있다.

Description

로베글리타존을 유효성분으로 하는 안과질환 치료용 조성물{Composition for treating ophthalmological diseases comprising lobeglitazone as an active ingredient}

본 발명은 로베글리타존(lobeglitazone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 안과질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 로베글리타존을 유효성분으로 함유하는, TGF-β1에 의한 Smad 신호전달 억제를 통한 안과질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

각막 섬유증(corneal fibrosis)은 각막 흉터 및 혼탁의 원인이며 이로 인해 전 세계 많은 사람들은 시력이 약화되거나 완전히 실명되어 왔다. 각막 흉터는 임상의들에게 큰 도전으로 남은 수술 후 흉터와 함께 안과 임상학적으로 주요한 문제로 남아있다. 각막의 혼탁화는 많은 양의 비정상적 세포외 기질(aberrant ECM) 단백질 및 적은 양의 수용성 각막 결정 효소(water-soluble corneal crystalline enzymes)를 합성하는 근섬유아세포(myofibroblasts)가 확산되는 비정상적인 각막 상처 치유에 의해 일어난다.

다면 발현성 사이토카인인 전환 성장 인자 베타 1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)은 각막 기질 상처(corneal stromal wound)를 치유할 때 휴면기(quiescent)의 각막기질세포(keratocytes)를 활성화된 근섬유아세포로 전환분화시키는 데 있어 중요한 역할을 한다. 이러한 근섬유아세포는 손상된 조직을 재건하기 위해 손상 부위에서 많은 양의 비정상적 ECM 단백질을 축적하고, 교차결합 시킨다. 또한, 근섬유아세포는 상처 봉합을 용이하게 하기 위해서 ECM에 수축성 힘을 가하는 α-SMA(alpha-smooth muscle actin) 단백질을 발현한다. 상처의 회복 후에 근섬유아세포는 세포자살(apoptosis)하고, ECM 단백질은 다시 채워진 각막기질세포에 의해 분해되어 각막 무결성을 회복한다. 하지만 지속적인 TGF-β1의 분비는 손상 부위에서 근섬유아세포를 유지하여 지속적이고, 장기적으로 비정상적 ECM 단백질 합성을 유발하고, 결국 기형적 구조를 가지는 섬유화된 안구 조직이 형성된다. 손상 부위에서 TGF-β1 합성과 효과를 조절하는 치료제 및 방법은 안과질환을 예방하는 효과가 있다.

글리타존(glitazones)과 같은 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones, TZDs)계 화합물은 합성 퍼옥시솜 증식체-활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPAR-γ) 리간드로, 제 2형 당뇨 관리를 위해 포도당과 지질의 대사작용을 조절하는데 사용된다. 몇몇 연구들은 이들 합성 PPAR-γ 리간드가 다양한 장기와 조직에서 PPAR-γ 의존적 또는 비의존적인 기전들을 통해 항염증 및 항섬유증 효과를 가진다는 것을 밝혀냈다. 몇몇 PPAR-γ 비의존적 항섬유증 효과는 TGF-β1 생성 억제 또는 그의 하위 신호전달경로의 억제 결과로 밝혀졌다. PPAR-γ 유전자 과발현은 쥐에서 각막의 알칼리 손상 후에 상처의 치유를 촉진하는 것으로 보인다.

또 다른 티아졸리딘디온 계열 화합물인 로베글리타존은 2013년에 식약처(한국)로부터 승인받은 PPAR-α 및 PPAR-γ 수용체의 이원적 활성인자이다. 로베글리타존은 구조적으로 로시글리타존(rosiglitazone)과 유사하지만 로시글리타존의 피리딘(pyridine) 모이어티 부위에 피리미딘 모이어티를 가지고, 피리미딘 모이어티의 4번 자리에 p-메톡시페놀 작용기(p-methoxyphenol functional group)를 가진다. 이러한 구조적 변경은 로베글리타존의 PPAR-γ에 대한 높은 친화성을 유발하고, 상당히 적은 용량에서 더 강한 효과를 가지게 하여 로시글리타존과 비교하여 제 2형 당뇨의 관리에 있어서 부작용이 적다.

한편, 로시글리타존은 TGF-β1-유도 섬유증을 억제한다고 보고되고 있다. 그러나 로시글리타존의 심혈관 안정성에 대한 위험이 보고되면서 부작용이 적고, 적은 용량으로 더 나은 효과를 낼 수 있는 새로운 약물이 요구되고 있다.

이에 본 발명의 발명자는 부작용이 적으면서 효과가 우수한 안과성 섬유증 치료제를 개발하기 위하여 로베글리타존의 각막 섬유아세포에서 TGF-β1에 의한 안과질환 예방, 개선 효과 및 그러한 효과의 분자적 기전을 밝히는 연구를 수행하였고, 그 결과 본 발명에 이르게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1841589호

본 발명의 목적은 TGF-β1에 의한 Smad 신호전달 억제 효과가 있는 로베글리타존(lobeglitazone)을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로베글리타존(lobeglitazone)이 각막섬유아세포(corneal fibroblast)에서 Smad 신호전달을 차단하여 TGF-β1으로 인한 안과질환 예방 및 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 의약외품 및 식품 조성물, 콘택트렌즈 또는 인공수정체 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 로베글리타존(lobeglitazone)은 TGF-β1으로 인한 Smad 신호전달을 차단하여 α-SMA 및 피브로넥틴(fibronectin) 생성을 억제하고, Nox4 mRNA 전사 및 ROS 생성을 억제하는 효과가 있으므로, TGF-β1으로 인한 안과질환을 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 하는 약학 조성물, 의약외품, 식품 조성물, 콘택트렌즈 또는 인공수정체 보존용 조성물 등의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 TGF-β1-유도 근섬유아세포(myofibroblast) 분화에서 로베글리타존(lobeglitazone)의 효과를 확인한 도로서, 도 1A는 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 통한 TGF-β1-유도 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현 수준을 나타내고, 도 1B는 정량분석을 통한 TGF-β1-유도 α-SMA 발현 수준을 나타내고, 도 1C는 정량분석을 통한 TGF-β1-유도 피브로넥틴 발현 수준을 나타내며, 도 1D는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 TGF-β1-유도 콜라겐 1(collagen 1)의 mRNA 전사량 변화를 나타낸 도이며, 도 1E는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 TGF-β1-유도 EDA-피브로넥틴(EDA-fibronectin)의 mRNA 전사량 변화를 나타낸 도이며, 도 1F는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 TGF-β1-유도 α-SMA의 mRNA 전사량 변화를 나타낸 도이며, 도 1G는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 TGF-β1-유도 피브로넥틴의 mRNA 전사량 변화를 나타낸 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때, ###은 P-value＜0.001을 나타내고; TGF-β1만을 처리한 세포와 비교할 때, ***은 P-value＜0.001을, **은 P-value＜0.01을 나타낸다.).
도 2는 항섬유증 효과 농도에서 로베글리타존 및 로시글리타존(rosiglitazone)의 효능을 비교한 도로서, 도 2A는 웨스턴 블롯 분석을 통해 10 μM 로베글리타존을 투여하였을 때와 10 μM 로시글리타존을 투여하였을 때 TGF-β1-유도 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현을 확인한 도이고, 도 2B는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존을 투여하였을 때 TGF-β1-유도 α-SMA의 발현을 10 μM 로시글리타존을 투여하였을 때와 비교한 도이며, 도 2C는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존을 투여하였을 때 TGF-β1-유도 피브리넥틴 발현을 10 μM 로시글리타존을 투여하였을 때와 비교한 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때, ###은 P-value＜0.001을 나타내고; TGF-β1만을 처리한 세포와 비교할 때, ***은 P-value＜0.001을 나타낸다.).
도 3은 로베글리타존의 단백질 발현 억제 효과가 세포 생존력 감소로 인한 것이 아님을 확인하기 위해 로베글리타존의 세포독성을 확인한 도로서, 도 3A는 셀카운팅 키트-8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)을 이용하여 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM의 로베글리타존을 투여하고 48시간 후 세포의 생존력을 확인한 도이고, 도 3B는 셀카운팅 키트-8(CCK-8)을 이용하여 5 ng/mL TGF-β1, 5 ng/mL TGF-β1 과 10 μM 로베글리타존 및 vehicle을 투여하고 48시간 후 세포의 생존력을 확인한 도이며, 도 3C는 혈구계산판(hemocytometer)를 이용하여 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM의 로베글리타존을 투여하고 48시간 후 세포의 생존력을 확인한 도이고, 도 3D는 혈구계산판(hemocytometer)를 이용하여 5 ng/mL TGF-β1, 5 ng/mL TGF-β1 과 10 μM 로베글리타존 및 vehicle을 투여하고 48시간 후 세포의 생존력을 확인한 도이며, 도 3E는 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM의 로베글리타존을 투여하고 24시간 동안 생존한 세포 밀도의 변화를 나타낸 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때 #은 P-value＜0.05, ##은 P-value＜0.01을 나타낸다.).
도 4는 로베글리타존의 항섬유증 활성에서 PPAR 신호전달경로의 역할을 확인한 도로서, 도 4A는 정량분석을 통해 PPAR 작용제(agonist)인 로베글리타존 및 PPAR 길항제(antagonist)인 GW9662 투여시 Plin2 mRNA 전사량을 확인한 도이고, 도 4B는 웨스턴 블롯을 통해 10 μM 로베글리타존을 PPAR-α 억제제 GW6471 또는 PPAR-γ 억제제 GW9662과 함께 투여하였을 때 TGF-β1-유도 α-SMA 및 피브로넥틴 발현을 확인한 도이며, 도 4C는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존을 PPAR-α 억제제 GW6471 또는 PPAR-γ 억제제 GW9662과 함께 투여하였을 때 TGF-β1-유도 α-SMA 발현을 확인한 도이며, 도 4D는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존을 PPAR-α 억제제 GW6471 또는 PPAR-γ 억제제 GW9662과 함께 투여하였을 때 TGF-β1-유도 피브로넥틴의 발현을 확인한 도이고, 도 4E는 10 μM 로베글리타존 투여시 및 10 μM 로베글리타존과 GW9662를 함께 투여시 TGF-β1-유도 α-SMA(초록색) 및 피브로넥틴(빨간색) 발현 및 DAPI로 대비염색(counterstained)한 핵(파란색)을 형광 사진으로 나타낸 도이며, 도 4F는 도 4E에서 α-SMA(초록색) 및 피브로넥틴(빨간색)의 빛의 강도를 정량 분석을 통해 확인한 도이며, 도 4G는 10 μM 로베글리타존 투여시 및 10 μM 로베글리타존을 GW9662와 함께 투여시 TGF-β1-유도 겔 수축의 정도를 확인한 도이며, 도 4H는 도 4G에서 겔 부분 크기 비율을 정량분석을 통해 확인한 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때, ###은 P-value＜0.001을, ##은 P-value＜0.01을, #는 P-value＜0.05를 나타내고; TGF-β1만을 처리한 세포와 비교할 때, ***은 P-value＜0.001을, **은 P-value＜0.01을 나타낸다.).
도 5는 TGF-β1에 의한 Smad 및 MAPK 신호전달에서 로베글리타존의 효과를 나타낸 도로서, 도 5A는 웨스턴 블롯을 통해 로베글리타존에 의한 Smad 및 MAPK 신호전달 단백질들의 발현을 확인한 도이고, 도 5B는 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 p-Smad2의 발현을 확인한 도이고, 도 5C는 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 p-ERK1/2의 발현을 확인한 도이고, 도 5D는 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 P-p38의 발현을 확인한 도이고, 도 5E는 정량분석을 통해 로베글리타존에 의한 P-SAPK/JNK의 발현을 확인한 도이다. 도 5F는 웨스턴 블롯을 통해 10 μM 로베글리타존 및 5 μM Smad3 억제제 SIS3을 투여시 α-SMA 및 피브로넥틴 단백질의 발현 수준을 확인한 도이고, 도 5G는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존 및 5 μM Smad3 억제제 SIS3을 투여시 α-SMA의 발현을 확인한 도이며, 도 5H는 정량분석을 통해 10 μM 로베글리타존 및 5 μM Smad3 억제제 SIS3을 투여시 피브로넥틴의 발현을 확인한 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때, ###은 P-value＜0.001을, ##은 P-value＜0.01을, #는 P-value＜0.05를 나타내고; TGF-β1만을 처리한 세포와 비교할 때, ***은 P-value＜0.001을 나타낸다.).
도 6은 로베글리타존에 의한 TGF-β1-유도 Nox4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4) 전사 및 ROS(Reaction oxygen species) 생성 억제를 확인한 도로서, 도 6A는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 로베글리타존 투여에 의한 TGF-β1-유도 Nox4 mRNA 전사의 변화를 확인한 도이고, 도 6B는 Real-Time qPCR 정량분석을 통해 5 μM SIS3-HCL(Smad3 억제제) 투여시와 10 μM 로베글리타존 투여시 Nox4의 mRNA 발현의 변화를 확인한 도이고, 도 6C는 정량분석을 통해 5 ng/mL TGF-β1 투여시 및 5 ng/mL TGF-β1와 10 μM 로베글리타존을 함께 투여시 ROS 생성을 확인한 도이다(vehicle-투여 대조군과 비교할 때, ###은 P-value＜0.001을, ##은 P-value＜0.01을, #는 P-value＜0.05를 나타내고; TGF-β1만을 처리한 세포와 비교할 때, ***은 P-value＜0.001을, **은 P-value＜0.01을, *은 P-value＜0.05을 나타낸다.).
도 7은 0.5N NaOH 용액로 알칼리 화상을 유발한 각막 알칼리 화상 동물모델에서 로베글리타존의 효과를 확인한 도이다.
도 8은 1.0N NaOH 용액로 알칼리 화상을 유발한 각막 알칼리 화상 동물모델에서 로베글리타존의 효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 하기 [화학식 1]의 로베글리타존(lobeglitazone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 로베글리타존은 TGF-β1에 의해 유도된 Smad 신호전달을 차단하여 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현을 억제하고, Nox4 mRNA 전사를 억제하며, ROS 생성을 억제하여 안과질환, 구체적으로 TGF-β1 관련 안과질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 로베글리타존은 3 내지 20 μM로 포함할 수 있고, 구체적으로 5 내지 15 μM로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 10 μM로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 로베글리타존이 3 μM 미만으로 포함될 경우, 효과가 미비할 수 있고, 20 μM 초과하여 포함될 경우 세포 독성으로 인해 효과가 저해될 수 있다.

본 발명에서 상기 안과질환은 섬유증식성 눈 장애 또는 각막화상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 섬유증식성 눈 장애는 안섬유증, 각막 섬유증, 각막 간질의 섬유증, 망막 섬유증, 망막하 섬유증, 망막신경교종, 망막앞 섬유증, 결막 섬유증, 각막 및 결막에서의 반흔, 수정체낭의 섬유증을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 섬유증식성 장애는 안구 조직이 손상되는 증상이 동반되는 것이면 기계적 상처 또는 염증, 허혈 및 퇴행성 질병에 대한 반응을 포함한 다양한 대사 기능 장애로 인한 것 일 수 있고 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 발명에서 섬유증식성 장애는 안구 수술에 의한 섬유증, 알칼리 화상에 의한 섬유증, 외상에 의한 눈의 섬유증, 감염성 또는 비감염성의 포도막염으로 인한 것 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 안구 수술은 안구를 절개하는 모든 수술을 의미하며, 대표적으로 백내장 수술, 녹내장 수술, 망막 수술, 라식 수술 및 라섹 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 외상은 화학물질, 열, 방사선, 열상 또는 이외의 외부 자극에 의한 안구 손상일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 섬유증식성 눈 장애는 각막섬유증일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 5 μM 내지 10 μM 로베글리타존이 Smad 신호전달을 차단하여 5 ng/mL TGF-β1에 의해 유도된 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 10 μM 로베글리타존이 Smad 신호전달을 차단하여 5 ng/mL TGF-β1에 의해 유도된 Nox4 mRNA 전사 및 ROS 생성을 억제하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 각막 알칼리 화상 동물모델에서 로베글리타존의 치료 효과를 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 로베글리타존을 유효성분으로 함유하는 조성물이 TGF-β1에 의해 유도된 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현, Nox4 mRNA 전사 및 ROS 생성을 억제하여 안과질환을 예방, 개선하는 효과를 가짐을 확인하였으므로, 본 발명의 로베글리타존을 의한 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유효하게 이용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 근육 내, 정맥 내, 피하, 피내, 복강 내 주사 등)할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제, 점안제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.

구체적으로 본 발명의 조성물은 용액, 현탁액, 시럽제, 에멀젼, 리포좀, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형제제, 점안제(eye drop), 캡슐제, 콘택트렌즈 세정제 또는 콘택트렌즈 윤활제로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로 본 발명의 조성물은 점안제일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 로베글리타존을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물의 일일 투여량은 로베글리타존 유효성분을 기준으로 0.0002 내지 1000 mg/kg이고, 하루 1 내지 10회 투여될 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 의미로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 의약외품을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 로베글리타존 및 안과질환에 대한 내용은 상기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 설명한 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 의약외품의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품일 수 있다.

상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진, 콘택트 렌즈 세척액 또는 보존액 등으로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 로베글리타존 및 안과질환에 대한 내용은 상기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 설명한 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 식품 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 각각의 조성물을 먹거나 마시는 데에 독성증상을 유발함이 없이 먹고/먹거나 마실 수 있는 임의 종류의 조성물을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "건강기능식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FOSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품이다.

본 발명에서, 상기 식품 조성물은 음료, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품, 통상적인 의미에서의 가공 식품 및 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 음료조성물은 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제(천연 향미제, 예를 들어 타우마틴, 스테비아추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등) 또는 천연 탄수화물(모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜) 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 10 g이다.

또한, 상기 외에 본 발명의 식품은 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산, 펙트산 염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육 등을 함유할 수 있다, 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 0.1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 1 g 내지 20 g일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 건강기능식품은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]의 로베글리타존을 유효성분으로 함유하는 콘택트렌즈 또는 인공수정체 보존용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 로베글리타존에 대한 내용은 상기 [화학식 1]의 로베글리타존을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 설명한 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 콘택트렌즈 또는 인공수정체 보존용 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.

본 발명의 콘택트렌즈 보존용 조성물의 경우, 콘택트렌즈를 저장하기 위한 수용액으로서 일반적으로 염수, 기타 완충용액 또는 탈이온수를 포함할 수 있고, 바람직하게는 붕산, 붕사 등의 붕소계 완충제, 아세트산, 아세트산 나트륨, 아세트산 칼륨 등의 아세트산계 완충제, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨 등의 인산계 완충제, 탄산 나트륨, 탄산수소나트륨 등의 탄산계 완충제, 구연산, 구연산 나트륨 등의 구연산계 완충제 또는 트로메타몰 완충제를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 염화나트륨, 붕산나트륨, 인산나트륨, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨 또는 이의 상응하는 칼륨염을 포함하는 염 함유 염수를 포함할 수 있다. 또한, 습윤제, 계면활성제, 안정화제, 점도 조절제, 등장화제, 용해보조제, 항산화제, 방부제, 청량화제, 킬레이트화제 또는 연화제 등을 추가로 포함할 수 있다.

인공수정체란 환자의 수정체에 질환이 발생하거나 손상되었을 때 본래의 수정체를 대신하도록 사용되는 것으로, 주로 백내장 수술시 눈에서 적출된 본래의 수정체를 대체하기 위하여 눈에 이식된다. 인공수정체는 인체에 사용되는 것이므로 이식시까지 감염 또는 오염되지 않도록 안전하게 보존하는 것이 중요하다. 본 발명의 조성물은 안과질환과 관련된 치유적 효과를 나타내므로, 인공수정체 보존 용액에 포함되어 외부 감염 또는 오염으로부터 인공수정체를 보호하고, 인체에 이식시 각막손상을 일으키지 않도록 작용할 수 있다. 본 발명의 인공수정체 보존용 조성물은 추가적으로 습윤제, 항균제, 안정화제, 등장화제, 용해 보조제, 점도 조절제, 항산화제 또는 완충액 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것을 의도하지 않는다.

초기 인간 각막섬유아세포(primary human corneal fibroblast)의 분리 및 배양

초기 인간 각막 섬유아세포(primary human corneal fibroblast)는 SA Nuwormegbe et al.(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.: 44, 1850-1858; 61, 43)에서 기술한 바와 같이 각막 가장자리 또는 중앙의 각막이식편(corneal central button)으로부터 획득하였다. 구체적으로, 기질층은 상피 및 내피층을 디스파제 Ⅱ(Dispase Ⅱ; Sigma-Aldrich)로 분해 후 현미경을 통해서 수집하였다. 수집한 기질층은 2 mg/mL 콜라겐분해효소(collaenase) 및 0.5 mg/mL 히알루로니다제(hyaluronidase; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, 미국)를 이용하여 37℃에서 하룻밤 동안 분해하였다. 분해 후, 1500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 모으고, 10 % 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1 % 항생제/항진균제(antibiotics/antimycotics) (스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 및 암포테리신 B(amphotericin B); Gibco Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 미국)이 포함된 둘베코 변형 이글배지(Dulbeco's modified Eagle's medium, DMEM; Welgene, 경산, 한국)에서 37℃, 5% CO₂, 습한 조건에서 배양하였다. 2 내지 10 계대배양 후 실험 전까지 -80℃에 보관하였다.

통계적 분석

자료들은 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, 미국)을 이용하여 분석하였다. 통계적 비교는 students's T-test, 일원분산분석(one-way analysis of variance) 및 Tukey's multiple comparisons test를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 모든 경우에서 P-value＜0.05로 정의하였다.

<실시예 1> 로베글리타존(lobeglitazone)의 각막섬유아세포(corneal fibroblast)에서 TGF-β1-유도 근섬유아세포(myofibroblast)로의 전환분화 억제 효과 확인

로베글리타존의 TGF-β1-유도 안섬유증 억제 효능을 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)과 Real-Time qPCR을 통해 각막섬유아세포에서 로베글리타존의 전환분화 및 ECM 단백질 합성 억제 효과를 분석하였다.

<실시예 1-1> 웨스턴 블롯을 통한 로베글리타존의 근섬유아세포로의 전환분화 억제 효과 분석

로베글리타존의 TGF-β1-유도 안섬유증 억제 효능을 확인하기 위해 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 각막섬유아세포에서 근섬유아세포로의 분화 표지인 α-SMA 및 피브로넥틴 합성 억제 효과를 분석하였다.

구체적으로, 분석을 위해 1% 항생제/항진균제(antibiotics/antimycotics)가 포함된 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; Sigma-Aldrich)에 용해된 5 μM 및 10 μM의 로베글리타존(종근당, 서울, 한국)을 3 내지 4시간 동안 전처리하고, 섬유증을 유도하기 위해 5 ng/mL TGF-β1(PeproTech, 서울, 한국)을 투여한 후 48시간 동안 배양하였다.

모든 단백질은 단백질분해효소(protase; Sigma-Aldrich) 및 인산화효소 억제제(phosphatase inhibitor; Sigma-Aldrich)와 혼합한 방사선 면역 촉진 분석 완충액(radioimmunoprecipitation assay buffer; Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 추출하였다. 단백질 정량은 Bradford assay 시약(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 수행하였다. 같은 양의 단백질을 10% 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membranes; Millipore, Milan, 이탈리아)으로 이동시킨 후 5 % 스킴밀크(skimmed milk) 용액으로 차단시켰다. 막은 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻 밤 동안 정치시킨 후, 1X TBST(0.1% Tween20 세정제를 포함하는 Tris-buffered saline)로 세척(3회, 5분)하였다. 이후 홀스래디쉬 과산화효소-결합 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)와 함께 2시간 동안 상온에서 정치하고, 1X TBST로 세척(3회, 5분)하였다. 블롯은 화학발광 웨스턴 블롯 기질(chemiluminescence western blotting substrate; Thermo Fisher Scientific)을 강화한 Pierce^™을 이용하여 탐지하였다. 이미지는 Image Lab^™ 소프트웨어 버전 6.0(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 미국)을 사용하여 수집하였다. 목표 단백질들의 상대적인 발현 수준은 ImagJ 소프트웨어 Java 1.8.0_66(64-bits)를 이용하여 농도계로 평가하였다(http/imagej.nih.gov/ij/index.html). 사용된 항체 리스트는 표 1과 같다.

항체	제조사	종(Species)	희석도(Dilution)
Tubulin	Cell Signaling Technologies	쥐	1:2000
α-SMA	Sigma Aldrich	쥐	1:2000
Fibronectin	Cell Signaling Technologies	쥐	1:2000

그 결과, 도 1A 내지 도 1C에서 나타낸 바와 같이 각막섬유아세포에 로베글리타존 투여시 근섬유아세포 분화 표지인 α-SMA(P-value＜0.001) 및 피브로넥틴(P-value＜0.001)의 발현이 효과적으로 억제되고, 10 μM 로베글리타존 투여시 그 효과가 보다 우수함을 확인하였다.

<실시예 1-2> Real-Time qPCR을 통한 로베글리타존의 근섬유아세포로의 전환분화 억제 효과 분석

로베글리타존의 TGF-β1-유도 안섬유증 억제 효능을 확인하기 위해 Real-Time qPCR을 통해 각막섬유아세포에서 근섬유아세포 분화 표지인 α-SMA 및 피브로넥틴, ECM 단백질 콜라겐 1(collagen 1) 및 EDA-피브로넥틴(EDA-fibronectin) 억제 효과를 분석하였다.

구체적으로, 세포를 분주하고, 5 μM 또는 10 μM 로베글리타존 및 5 ng/mL의 TGF-β1을 투여한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 모아 RNA 추출 키트(Qiagen, Hilden, 독일)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. RNA 추출의 질과 양은 NanoDrop One spectrophothmeter(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분석하였다. RNA는 LaboPass^™ cDNA 합성 키트(Cosmo Genetech, 서울, 한국)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사하였다. 10 μL의 목표 유전자 프라이머 쌍 반응 혼합물과 SYBR 그린 PCR 믹스(SYBR green PCR mix; Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA, 미국)을 사용하여 Real-Time qPCR 분석을 수행하였다. 사용한 프라이머 쌍의 서열은 표 2와 같다.

유전자	서열	Amplicon size
EDA-Fidronectin	F: 5'-TCC AAG CGG AGA GAG T-3' (서열번호 1) R: 5'-GTG GGT GTG ACC TGA G-3' (서열번호 2)	360 bp
Collagen 1A	F: 5'-TTC TGC AAC ATG GAG ACT GG-3' (서열번호 3) R: 5'-CGC CAT ACT CGA ACT GGA ATC-3'(서열번호 4)	151 bp
GAPDH	F: 5'-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3' (서열번호 5) R: 5'-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3' (서열번호 6)	138 bp

그 결과, 도 1D 내지 도 1G에 나타낸 바와 같이 로베글리타존 투여시 근섬유아세포 분화 표지인 α-SMA(P-value＜0.001) 및 피브로넥틴(P-value＜0.001)의 mRNA 및 ECM 단백질 콜라겐 1(P-value＜0.001)과 EDA-피브로넥틴(P-value＜0.001)의 mRNA가 억제됨을 확인하였다.

<실시예 2> 로베글리타존과 로시글리타존(rosiglitazone)의 항섬유증 효과 비교

로베글리타존과 구조적으로 유사한 티아졸리딘디온(Thiazolidinediones, TZDs)계 화합물인 로시글리타존의 각막섬유아세포에서의 항섬유증 효과를 비교하기 위해 웨스턴 블롯 및 정량적 분석을 수행하였다.

구체적으로, <실시예 1-1>에 개시된 방식으로 세포에 로베글리타존과 로시글리타존을 각각 투여하고 <실시예 1-1>에 개시된 방식에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 2A 내지 도 2C에 나타낸 바와 같이 10 μM 로시글라티존 투여군이 TGF-β1만 투여한 경우와 비교해서 α-SMA 및 피브로넥틴의 합성을 의미있는 수준으로 억제시키지 못한 반면, 10 μM 로베글리타존 투여군은 TGF-β1만을 투여한 경우와 비교해 α-SMA(P-value＜0.001) 및 피브로넥틴(P-value＜0.004)의 합성을 강하게 억제함을 확인하였다.

<실시예 3> 로베글리타존의 세포 독성 분석

섬유증 관련 단백질 합성의 감소가 세포 생존력 감소의 결과가 아니라는 것을 확인하기 위해서 셀카운팅 키트-8(Cell Counting Kit-8, CCK-8 ; Dojindo Laboratories, Kumamoto, 일본)와 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 로베글리타존의 항섬유증 효과 농도에서 세포 독성을 분석하였다.

<실시예 3-1> CCK-8 분석을 통한 로베글리타존의 세포 독성 분석

로베글리타존에 따른 세포 생존력 변화를 확인하기 위해 CCK-8을 이용하여 로베글리타존의 세포 독성을 분석하였다.

구체적으로, 세포를 96-웰 플레이트에 5000 cells/well의 밀도로 분주하고, DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. 한 세트의 세포에 서로 다른 농도(0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM)의 로베글리타존을 투여하고, 또 다른 세트의 세포에 5 ng/mL TGF-β1, 5 ng/mL TGF-β1 과 10 μM 로베글리타존 및 vehicle을 투여한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 제조사의 프로토콜에 따라 분석 키트를 사용하여 세포 생존력을 확인하였다. 흡광도는 2시간 배양 후 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Beckman Coulter DTX 880 Multimode Detector)를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이 10 μM 로베글루타존의 항섬유증 효과 농도에서 세포 독성 효과가 나타나지 않고, 도 3B에 나타낸 바와 같이 vehicle-투여 대조군과 10 μM 로베글리타존 투여군 사이에 의미 있는 차이가 없음을 확인하였다. 하지만, 도 3E에 나타낸 바와 같이 40 μM 로베글리타존을 투여한 후 24시간 동안 세포 생존력은 급격히 감소하는 것을 확인하였다.

<실시예 3-2> 혈구계산판(hemocytometer)를 이용한 생존가능한 세포 집계

로베글리타존에 따른 세포 생존력 변화를 확인하기 위해 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 로베글리타존의 세포 독성을 분석하였다.

구체적으로, 60 mm 배양 플레이트에서 상기 <실시예 3-1>에 개시된 방법으로 로베글리타존을 투여하고, 배양하였다. 48시간 배양 후, 부착된 세포들은 트립신/EDTA(trypsin/EDTA)로 떼어내 원심분리 후 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS; Welgene, 경산, 한국)로 부유시켰다. 같은 부피의 트리판 블루(trypan blue) 및 세포 부유물을 혼합하여, 10 μM의 혼합물을 혈구계산판 챔버에 채웠다. 생존 가능한 세포들(염색되지 않음) 및 생존 불가능한 세포들(푸른색으로 염색됨)을 EVOS^™ XL 코어 현미경(EVOS^™ XL core microscope; Thermo Fisher Scientific, Bothell, WA, 미국)으로 집계하였다. 생존 가능한 세포들의 비율은 각 투여군마다 계산하였다. 실험은 각 세트마다 세번씩 수행하였다.

그 결과, 도 3C에 나타낸 바와 같이 10 μM 로베글루타존의 항섬유증 효과 농도에서 세포 독성 효과가 나타나지 않고, 도 3D에 나타낸 바와 같이 vehicle-투여 대조군과 10 μM 로베글리타존-투여군 사이에 의미 있는 차이가 없음을 확인하였다. 하지만, 도 3E에 나타낸 바와 같이 40 μM 로베글리타존을 투여한 후 24시간 동안 세포 생존력은 급격히 감소하는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과의 PPAR 신호전달 의존성 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여 로베글리타존과 PPAR 억제제 GW9662 및 GW6471에 의한 PLIN2 mRNA, α-SMA, 피브로넥틴의 발현 수준을 Real-Time qPCR과 웨스턴 블롯, 정량적 분석 및 면역형광법을 통해 분석하였다. 또한, 로베글리타존과 PPAR 억제제 GW9662에 의한 콜라겐 겔 매트릭스 수축 분석(Collagen gel matrix contraction assay)을 통해 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 여부를 확인하였다.

<실시예 4-1> Plin2(perilipin) mRNA 전사 분석을 통한 로베글리타존에 의한 PPAR 신호전달 조절 효과 확인

신체 내 넓은 범위에서 발현되는 지방소립 관련 단백질로 PPAR 신호전달에 의해 전사적으로 활성화된다고 알려진 Plin2 mRNA를 Real-Time qPCR을 통해 분석하여 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 확인하였다.

구체적으로, <실시예 1-1>에 개시된 방법으로 세포에 로베글리타존 및 GW9662를 투여하고, <실시예 1-2>에 개시된 방법으로 Plin2의 mRNA에 대하여 Real-Time qPCR을 수행하였다. 사용한 프라이머 서열은 표 3과 같다.

유전자	서열	Amplicon size
PLIN2	F: 5'-GTT CAC CTG ATT GAA TTT GC-3' (서열번호 7) R: 5'-GAG GTA GAG CTT ATC CTG AG-3' (서열번호 8)	81 bp

그 결과, 도 4A에서 나타낸 바와 같이 로베글리타존 투여군이 TGF-β1 투여군과 비교해 PPAR 신호전달경로를 자극하여 Plin2 mRNA 전사(5 μM일 때 P-value=0.002, 10 μM일 때 P-value＜0.001)가 증가함을 확인하였고, PPAR 억제제 GW9662 투여군은 PPAR 신호전달을 상당히 억제하여 Plin2 mRNA 전사가 감소함을 확인하였다(P-value＜0.001).

<실시예 4-2> 웨스턴 블롯을 통한 로베글리타존의 항섬유증 효과의 PPAR 신호전달 의존성 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여 로베글리타존과 PPAR 억제제 GW9662 및 GW6471에 의한 α-SMA, 피브로넥틴의 발현 수준을 웨스턴 블롯 및 정량적 분석을 통해 분석하였다.

구체적으로, 각막섬유아세포에 1 μM GW6741 및 GW9662(Tocris Bioscience, Bristol, UK)를 각각 투여하고, 10 μM 로베글리타존을 투여한 후 3 내지 4시간 동안 배양하였다. 이후 5 ng/mL TGF-β1을 투여하고, 48시간 동안 배양한 후 <실시예 1-1>에 개시된 방법으로 웨스턴 블롯 및 정량적 분석을 실행하였다. 로베글리타존을 투여하지 않은 세포를 음성대조군으로 하였다.

그 결과, 도 4B 내지 도 4D에 나타낸 바와 같이 로베글리타존을 PPAR 신호전달 억제제와 함께 투여하였을 때도 로베글리타존을 투여하였을 때와 유사하게 α-SMA 및 피브리넥틴의 수준이 감소하여 로베글리타존의 항섬유증 효과는 PPAR-α 및 PPAR-γ 신호전달에 비의존적이라는 것을 확인하였다.

<실시예 4-3> 면역형광법을 통한 로베글리타존의 항섬유증 효과의 PPAR 신호전달 의존성 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여 로베글리타존과 PPAR 신호전달 억제제 GW9662에 의한 α-SMA, 피브로넥틴의 발현 수준을 면역형광법을 통해 분석하였다.

구체적으로, 유리 챔버 슬라이드에서 2계대 배양한 섬유아세포에 <실시예 4-2>에 개시된 방법으로 1 μM GW9662, 10 μM 로베글리타존을 투여한 후 혈청이 없는 배지에서 3 내지 4시간 동안 배양하고, 5 ng/mL TGF-β1을 투여하였다. 이후 72시간 동안 배양한 세포를 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)로 고정하고, 0.3% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 포함한 PBS(PBS-T)를 투과시킨 후, 5% BSA로 단백질을 차단하고, 4℃에서 α-SMA, 피브로넥틴과 함께 하룻밤 동안 배양하였다. 세척 후에 세포를 Alexa Fluor 접합 2차 항체(Alexa Fluor conjugated secondary antibody; Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 미국)와 함께 어두운 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 핵은 고정배지에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 대비염색(countersained)하고, 면역형광 이미지는 형광현미경(flourescence microscope; Olympus BX51 Flourescence Microscope; Tokyo, 일본)으로 수집하였다. 1차 항체 투여 없이 PBS 및 2차 항체를 투여하여 내적 대조군(internal control)로 사용하였다. ImigeJ 소프트웨어를 사용하여 형광 정량 분석하였고, 모든 실험은 3회 수행하였다.

그 결과, 도 4E 및 도 4F에 나타낸 바와 같이, vehicle-투여 대조군과 비교해 5 ng/mL TGF-β1을 투여 후 72시간 배양한 세포에서 α-SMA, 피브로넥틴의 발현이 3배 증가하였고, 10 μM 로베글리타존 투여군은 TGF-β1-유도 α-SMA, 피브로넥틴의 생성을 억제하며 10 μM 로베글리타존과 1 μM GW9662를 함께 투여한 군에서도 로베글리타존의 항섬유증 효과가 변하지 않아 로베글리타존의 각막섬유아세포에서 항섬유증 효과는 PPAR 신호전달 비의존적임을 확인하였다.

<실시예 4-4> 콜라겐 겔 매트릭스 수축 분석(Collagen gel matrix contraction assay)을 통한 로베글리타존의 항섬유증 효과의 PPAR 신호전달 의존성 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과가 PPAR 신호전달에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여 로베글리타존과 PPAR 신로전달 억제제 GW9662에 의한 세포의 형태학적 변화를 콜라겐 겔 매트릭스 수축 분석을 통해 분석하였다.

구체적으로, 각막섬유아세포를 무혈청 DMEM 배지에 1.5 × 10⁵ cell/mL 농도로 부유한 후 400 μL의 세포 부유물을 200 μL 콜라겐 1(collagen 1; Gibco Life Technologies)과 혼합하고, 1 M의 NaOH 5 μL로 중화하였다. 그 후, 600 μL 세포 및 겔 혼합물을 24-웰 플레이트에 옮겨 담은 후 37℃에서 30분 동안 중합하고, 세포들을 웰에서부터 200-μL 피펫 팁으로 겔의 가장자리를 따라 조심스럽게 옮겼다. DMEM 배지에서 4가지 방식으로 처리된 세포들-vehicle-투여 대조군, 5 ng/mL TGF-β1 투여군, 5 ng/ML TGF-β1 및 10 μM 로베글리타존 투여군, 5 ng/mL TGF-β1 10 및 10 μM 로베글리타존 및 1 μM PPAR-γ 억제제 GW9662 투여군-을 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 각 투여방식마다 3회 수행되었다. 겔 이미지는 겔 위의 고정된 위치에서 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간마다 디지털 카메라(Sony Cyber-Shot DSC-RX100 V 20.1)로 기록하였다. 겔 표면 수축을 측정하여 ImageJ 소프트웨어를 통해 정량화하였다.

그 결과, 도 4G 및 도 4H에 나타낸 바와 같이 5 ng/mL TGF-β1만을 투여한 군에서 3일째부터 활성화된 근섬유아세포의 특징인 콜라겐 겔 수축이 관찰되었고, 5 ng/mL TGF-β1 및 10 μM 로베글리타존 투여군, 5 ng/mL TGF-β1 10, μM 로베글리타존 및 1 μM PPAR-γ 억제제 GW9662 투여군은 콜라겐 겔의 수축이 관찰되지 않아 로베글리타존이 PPAR 비의존적으로 TGF-β1-유도 근섬유아세포 분화를 억제함을 확인하였다.

<실시예 5> 각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과 기전 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과의 기전을 알아보기 위해 웨스턴 블롯을 통해 TGF-β1 신호전달 하류의 표준 Smad 신호전달경로(canonical Smad signaling pathway) 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 경로(on-canonical MAPK pathway)를 분석하였다.

<실시예 5-1> 웨스턴 블롯을 통한 로베글리타존의 Smad 신호전달 억제 효과 분석

각막섬유아세포에서 로베글리타존 항섬유증 효과의 기전을 알아보기 위해 웨스턴 블롯을 통해 Smad 신호전달 및 MAPK 신호전달 관련 단백질의 발현 수준을 분석하였다.

구체적으로, 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양한 세포에 3 내지 4시간 동안 5 μM 및 10 μM 로베글리타존을 투여하고, 5 ng/mL TGF-β1을 투여한 후 6시간 동안 배양한 후, 단백질을 추출하여 신호전달 단백질의 발현을 분석하기 위해 <실시예 1-1>에 개시된 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 사용한 항체는 표 4와 같다.

항체	제조사	종(Species)	희석도(Dilution)
p-Smad2	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
Smad2/3	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
p-p38	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
p38	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
p-ERK1/2	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
ERK1/2	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
p-JNK	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000
JNK	Cell Signaling technologies	토끼	1:2000

그 결과, 도 5A 내지 도 5E에 나타낸 바와 같이 24시간 동안 무혈청 배지에서 배양 후 Smad 신호전달은 거의 완전히 차단되었고, MAPK 신호전달은 감소하였지만 지속적으로 나타났다. TGF-β1 투여군은 vehicle-투여 대조군과 비교해 표준 Smad 신호전달이 증가한 반면, 로베글리타존 투여군은 TGF-β1-유도 Smad 신호전달이 상당히 감소하였고(P-value＜0.001), 로베글리타존 투여군은 MAPK 신호전달에는 의미 있는 효과가 없어 로베글리타존이 Smad 신호전달을 억제하는 효과를 확인하였다.

<실시예 5-2> 웨스턴 블롯을 통한 각막섬유아세포의 TGF-β1-유도 섬유증에서 Smad 신호전달의 역할 분석

각막섬유아세포의 TGF-β1-유도 섬유증에서 Smad 신호전달의 역할을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 통해 Smad 신호전달 억제제와 로베글리타존에 의한 α-SMA 및 피브로넥틴 억제 효과를 비교 분석하였다.

구체적으로, 세포에 <실시예 5-1> 개시된 방법으로 5 μM Smad3 억제제 SIS3-HCl 및 10 μM 로베글리타존을 각각의 세포에 투여하고, 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과, 도 5F 내지 도 5H에 나타낸 바와 같이 5 μM SIS3-HCl 투여군은 로베글리타존 투여군과 같이 α-SMA(P-value＜0.001) 및 피브로넥틴(P-value＜0.001) 발현을 상당히 차단함을 확인하여 로베글리타존이 각막섬유아세포의 TGF-β1-유도 섬유증에서 Smad 신호전달을 차단하여 항섬유증 효과를 가진다는 것을 확인하였다.

<실시예 6> 각막섬유아세포에서 로베글리타존의 TGF-β1-유도 Nox4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4) 전사 및 ROS 생성 억제 효과 확인

TGF-β1-유도 Smad 신호전달에 의해 매개되는 섬유화 반응은 Nox4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4)-의존적 산화 환원 신호전달(Nox4-dependent redox signaling)과 연관되어 있으므로 각막섬유아세포에서 로베글리타존의 항섬유증 효과를 확인하기 위하여 Real-Time qPCR을 통한 Nox4 mRNA 전사 및 ROS 분석(Reactive oxygen species assay, ROS assay)를 통한 ROS 생성을 분석하였다.

<실시예 6-1> Real-Time qPCR을 통한 로베글리타존의 Nox4 mRNA 전사 억제 효과 확인

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 Nox4 전사 억제를 통한 항섬유증 효과를 확인하기 위하여 Real-Time qPCR을 실시하였다.

구체적으로, <실시예 1-1>에 개시된 방법에 따라 10 μM 로베글리타존 및 SIS3을 처리한 후. <실시예 1-2>에 개시된 방법에 따라 Real-Time qPCR을 실행하였다. 사용한 프라이머 서열은 표 5와 같다.

유전자	서열	Amplicon size
NOX4	F: 5'-GCA GGA GAA CCA GGA GAT TG-3' (서열번호 9) R: 5'-CAC TGA GAA GTT GAG GGC ATT-3' (서열번호 10)	125 bp

그 결과, 도 6A 및 도 6B에 나타낸 바와 같이 5 ng/mL TGF-β1 투여군은 vehicle-투여 대조군과 비교하여 Nox4 mRNA 발현이 증가하였으나 로베글리타존 투여군에서는 TGF-β1-유도 mRNA 전사 수준이 상당히 감소하였고(P-value＜0.001), 5 μM SIS3-HCl 투여군 또한 Nox4 mRNA전사가 로베글리타존 투여군과 유사하게 감소하였음을 확인하여 로베글리타존이 Smad 신호전달을 차단하여 Nox4 mRNA 전사를 억제하고 항섬유증 효과를 가진다는 것을 확인하였다.

<실시예 6-2> ROS 분석(Reactive oxygen species assay, ROS assay)을 통한 로베글리타존의 ROS 생성 억제 효과 확인

각막섬유아세포에서 로베글리타존의 TGF-β1-유도 ROS 생성 억제를 효과를 확인하기 위하여 DCFDA-세포 ROS 제거 분석(DCFDA-cellular ROS delection assay)을 실시하였다.

구체적으로, 96-웰 마이크로플레이트의 어둡고 투명한 바닥(dark, clear bottom)에 분주하고, 하룻밤 동안 부착하도록 둔 세포에 5 ng/mL TGF-β1, 5 ng/mL TGF-β1 및 10 μM 로베글리타존을 각각 투여하고, 3시간, 6시간, 12시간 동안 배양한 후, 1X 완충액으로 세척하였다. 희석한 DCFDA 용액 100 μL/well을 세포에 추가하고, 37℃, 어두운 장소에서 45분 동안 배양하였다. 그 후, DCFDA 용액을 제거하고 1X 완충액 100 μL/well을 첨가하였다. 형광 발광은 DTX-800 멀티모드 마이크로플레이트 리더(multimode microplate reader)를 이용하여 자극 파장 485 nm 및 배출 파장 535 nm에서 측정하였다. vehicle-투여 세포는 대조군으로 사용하였고, 모든 실험은 3회 수행하였다.

그 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이 5 ng/mL TGF-β1 투여군은 vehicle-투여 대조군과 비교하여 ROS 생성이 증가하였으나 로베글리타존 투여군에서는 상당히 감소하였음을 확인하였다(P-value＜0.001). ROS 수준은 6시간 배양 시에 가장 높았고, 12시간 배양에서는 약간 감소하여 섬유화 반응의 초기 단계에서 ROS의 역할 및 로베글리타존의 ROS 생성 억제를 통한 항섬유증 효과를 확인하였다.

<실시예 7> 각막 알칼리 화상 동물모델에서 로베글리타존의 효과 확인

각막 알칼리(alkali) 화상은 빠른 진행과 각막혼탁이 심하게 남아 처치가 어려운 안과질환이다. 로베글리타존의 각막 알칼리 화상 치료 효과를 확인하기 위하여, 각막 알칼리 화상 동물모델을 제작하고, 상기 동물모델에 로베글리타존을 처리한 후 각막의 변화를 관찰하였다.

구체적으로, Balb/C 마우스를 구매하여 1주일 동안 적응 기간을 거친 뒤 실험을 진행하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암 주기가 12시간인 상태 아래 사육하였다. 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 사료는 멸균 사료를 이용하여 자유롭게 섭취하게 하였다.

실험을 위해 마우스를 대조군(control, n=6) 및 실험군(lobeglitazone, n=6)으로 나누고 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취한 후, 0.5N NaOH 또는 1N NaOH 용액을 적신 2 mm 여과지를 오른쪽 중앙 각막에 1분 동안 놓아 알칼리 손상을 유발하였다. 각막에서 여과지를 제거하고 멸균된 생리식염수로 눈을 충분히 세척한 후, 초기 상피 손상을 기록하기 위해 플루레세인 염료(flourescein dye)로 염색하고 즉시 사진 촬영하였다. 14일 동안 매일 오전 9시, 오후 12시, 오후 3시, 오후 6시에 대조군의 경우 항생제로 0.5% 크라비트주(레보플로사신) 점안액을 점안하고, 실험군의 경우 0.5% 크라비트주 점안액에 0.5 mg/ml 로베글리타존을 녹여 점안하였다. 또한, 각막 상피 치유에 대한 약물의 효과를 기록하기 위해 매일 한 번 각막 사진을 촬영하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 0.5N NaOH 용액으로 알칼리 화상을 유발한 경우 대조군은 수상 7일 및 14일 후 각막혼탁이 남아 있으나, 실험군은 각막혼탁이 거의 없이 회복되는 것을 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 1.0N NaOH 용액으로 알칼리 화상을 유발한 경우 대조군은 수상 3일, 7일, 14일 후 각막혼탁이 남아 있으나, 실험군은 시간이 지날수록 각막혼탁이 줄어들어 14일에는 각막혼탁이 미약한 것을 확인하였다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS <120> Composition for treating ophthalmological diseases comprising lobeglitazone as an active ingredient <130> PB2022-030 <150> KR 10-2021-0043071 <151> 2021-04-02 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EDA-Fidronectin primer_forward <400> 1 tccaagcgga gagagt 16 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EDA-Fidronectin primer_reverse <400> 2 gtgggtgtga cctgag 16 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 1A primer_forward <400> 3 ttctgcaaca tggagactgg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Collagen 1A primer_reverse <400> 4 cgccatactc gaactggaat c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer_forward <400> 5 gcaccgtcaa ggctgagaac 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer_reverse <400> 6 tggtgaagac gccagtgga 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLIN2 primer_forward <400> 7 gttcacctga ttgaatttgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PLIN2 primer_reverse <400> 8 gaggtagagc ttatcctgag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NOX4 primer_forward <400> 9 gcaggagaac caggagattg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NOX4 primer_reverse <400> 10 cactgagaag ttgagggcat t 21

Claims

하기 [화학식 1]의 로베글리타존(lobeglitazone) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 용액, 현탁액, 시럽제, 에멀젼, 리포좀, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형제제, 점안제(eye drop), 캡슐제, 콘택트렌즈 세정제 및 콘택트렌즈 윤활제로 구성된 군으로부터 선택된 제형으로 제형화되는 것인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 점안제로 제형화되는 것인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 안과질환은 섬유증식성 눈 장애 또는 각막화상인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 섬유증식성 눈 장애는 안섬유증, 각막 섬유증, 각막 간질의 섬유증, 망막 섬유증, 망막하 섬유증, 망막신경교종, 망막앞 섬유증, 결막 섬유증, 각막 및 결막에서의 반흔, 및 수정체낭의 섬유증으로 구성된 군으로부터 선택된 섬유증식성 눈 장애인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 안과질환은 TGF-β1에 의해 유도된 것인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 로베글리타존이 Smad 신호전달을 차단하는, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 로베글리타존이 α-SMA 및 피브로넥틴의 발현을 억제하는, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 로베글리타존이 Nox4 mRNA 전사를 억제하는, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 로베글리타존이 ROS 생성을 억제하는, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 로베글리타존의 농도는 3 내지 20 μM인, 안과질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 개선용 의약외품:
[화학식 1]

.
하기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안과질환 예방 또는 개선용 식품 조성물:
[화학식 1]

.
하기 [화학식 1]의 로베글리타존 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 콘택트렌즈 또는 인공수정체 보존용 조성물:
[화학식 1]

.