KR20220143097A

KR20220143097A - 아르테미시닌 화합물, 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 화학요법제의 약제학적 조합

Info

Publication number: KR20220143097A
Application number: KR1020227032196A
Authority: KR
Inventors: 울리히 엘링; 요제프 마틴 페닝거
Original assignee: 제이엘피 헬스 게엠베하
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2021-02-18
Publication date: 2022-10-24
Also published as: PL3989961T3; IL294856A; CA3165208A1; CN114786661A; JP2023514426A; AU2021222339A1; EP3989961A1; ES2972799T3; PT3989961T; EP3868372A1; WO2021165405A1; EP3989961B1; BR112022014692A2; US20230121771A1; FI3989961T3; JP7719787B2; DK3989961T3

Abstract

본 발명은 아르테미시닌 화합물, 및 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용된다. 바람직하게는, 본원은, 뇌암, 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위한, 아르테미시닌(1a) 또는 디하이드로아르테미니신(1b) 또는 아르테수네이트(1e) 및 5-아미노레뷸린산(2) 또는 메틸-5-아미노레뷸린산(2b) 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

아르테미시닌 화합물, 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 화학요법제의 약제학적 조합

본 발명은 아르테미시닌(artemisinin) 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 염, 공결정(cocrystal), 또는 이의 용매화물, 및 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 조혈성 암(hematopoietic cancer), 뇌암(brain cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간암(liver cancer), 유방암(breast cancer), 및 폐암(lung cancer), 예컨대, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용된다. 바람직하게는, 본 출원은 뇌암, 특히 아교모세포종(glioblastoma)의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 아르테미시닌(artemisinin) 또는 디하이드로아르테미니신(dihydroarteminisin) 또는 아르테수네이트(artesunate) 및 5-아미노레뷸린산(5-aminolevulinic 산) 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 뇌암, 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 아르테미시닌(1a), 아르테수네이트(1e) 또는 디하이드로아르테미니신(1b) 및 5-아미노레뷸린산(2) 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

아르테미시닌은 식물 아르테미시아 아누아(Artemisia annua) 또는 스위트 웜우드(sweet wormwood)로부터 분리될 수 있는 천연 의약 화합물이다. 그러한 물질은 열병(fever), 감기 및 그 밖의 질병을 치료하기 위해서 수 천년 동안 전통 중의학에서 사용되어 왔다. 1970년대에, 아르테미시닌은 중국 과학자 Tu Youyou에 의해서 처음으로 항말라리아 약물로서 설명되었다. 이의 유도체와 함께, 아르테미시닌은 전세계적으로 가장 일반적으로 사용되는 항말라리아 약물 중 하나이다. 그것은 말라리아를 유발시키는 단세포 기생충 피. 팔시파룸(P. falciparum)을 그의 생활 단계 모두에서 치사시킨다{Aweeka, F. T. & German, P. I. Clinical Pharmacology of Artemisinin-Based Combination Therapies. Clinical Pharmacokinetics 47, 91-102 (2008)}. 더욱 최근에는, 아르테미시닌의 효능적인 항암 특성이 인식되었다. 아르테미시닌의 다양한 여러 기능과 그 응용은 진핵 세포에서 화합물의 광범위한 작용 메커니즘을 가리킨다.

아르테미시닌은 생화학적으로는 천연 엔도퍼옥사이드이다. 이의 엔도퍼옥사이드 특성은 이의 항말라리아 효과를 위해서 엄격히 요구된다. 엔도퍼옥사이드 브릿지(endoperoxide bridge)가 분열되면, 아르테미시닌이 활성화되고, 세포에서 민감한 단백질 및 거대 분자를 후속적으로 알킬화시키는 반응성 산소종(reactive oxygen species(ROS)) 및 자유 라티칼의 생성을 유도한다. 이러한 알킬화 반응은 단백질의 구조 및 기능을 변경시키고, DNA를 손상시키고, 세포 스트레스를 유도하여, 결국에는 세포 사망을 발생시킨다. 아르테미시닌은 비특이적 방식으로 광범위한 범위의 세포 단백질과 회합하고, 해당작용, 단백질 생합성, 미토콘드리아 과정 및 항산화 반응을 포함한 복수의 경로를 변경시킨다{Zhang, C.-J. et al. Haem-activated promiscuous targeting of artemisinin in Plasmodium falciparum. Nature Communications 6, 1-11 (2015)} {Ismail, H. M. et al. Artemisinin activity-based probes identify multiple molecular targets within the asexual stage of the malaria parasites Plasmodium falciparum3D7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, 2080-2085 (2016)}. 아르테미시닌의 명확한 조절인자 또는 활성화제가 여전히 논의되고 있지만, 헤모글로빈의 헴에서와 같은 자유 또는 복합 철이 가장 강력한 후보물질로 여겨진다. 아르테미시닌의 불규칙적인 결합 특성은, 많은 보고된 기능과 함께, 지금까지 이의 명확한 세포 표적의 식별을 방해하였다{Tilley, L., Straimer, J., Gnaeg, N. F., Ralph, S. A. & Fidock, D. A. Artemisinin Action and Resistance in Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology 32, 682-696 (2016)}. 아르테미시닌 내성 말라리아 사례가 증가함에 따라서, 의학적 치료법으로의 이의 적용 가능성을 확장하기 위해서는, 화합물 작용 메커니즘을 설명하는 것이 필수적이다.

5-아미노레뷸린산(5-ALA)은 헴 생합성(heme biosynthesis)에서의 중간체 및 수술을 위한 종양을 마킹하기 위해서 사용되는 종양 마커(tumor marker)이다. 그것은 비-단백질 아미노산이다.

직장결장암(colorectal cancer(CRC)) 세포에 대한 아르테미시닌의 특이적 세포독성이 보고되었다. Jigang Wang 등은 아르테미시닌/아미노레뷸린산 조합 요법이 이종 이식 직장결장암 (CRC) 모델에서의 아르테미시닌 단일 요법보다 더욱 효과적인 것을 입증함을 나타낸다(ACS Cent. Sci. 2017, 3, pp. 743-750.)

아교모세포종 다형성(glioblastoma multiforme (GBM))으로도 공지된 아교모세포종(glioblastoma)은 뇌 내에서 시작되는 가장 공격적인 암이다. 아교모세포종으니 뇌 종양의 15%를 나타낸다. 이들은 정상의 뇌 세포로부터 출발하거나 기존의 저등급 성상세포종(low-grade astrocytoma)으로부터 발생한다. 전형적으로는, 치료는 수술과 관련되고, 그 후에 화학요법 및 방사선 요법이 이용된다. 그것은 뇌에서 시작하는 가장 일반적인 암이고, 수막종(meningioma) 후의 두 번째-가장 일반적인 뇌 종양이다. 100,000 명당 약 3명이 매년 이러한 질환을 발생시킨다. 그것은 가장 흔하게는 대략 64살에 시작되며, 여성보다는 남성에서 더욱 흔하게 발생한다.

최대 치료에도 불구하고, 아교모세포종은 일반적으로는 재발한다. 진단 후의 전형적인 생존 기간은 12 내지 15개월이고, 이들 중 3 내지 7% 미만이 5년 넘게 생존한다. 치료 없이는, 생존율은 전형적으로는 3개월이다. 아교모세포종의 효과적인 치료가 여전히 크게 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 및 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 독립항의 교시에 의해서 해결된다. 본 발명의 추가의 유리한 특징, 양태 및 상세사항은 본원의 종속항, 설명, 도면 및 실시예로부터 입증된다.

놀랍게도, 본 발명에서는 아르테미시닌 화합물 및 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물이 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암으로부터 선택되는 암 및 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 유용함이 밝혀졌다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 약제학적 조성물은 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법(electromagnetic field therapy), 및/또는 고열 요법(hyperthermia therapy)과 조합된다.

본 발명은,

a) 아르테미시닌 화합물(1) 또는 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

b) 5-아미노레뷸린산(2), 메틸-5-아미노레뷸린산(2b), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물; 및

c) 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

아르테미시닌 화합물(1)은,

또는 이러한 아르테미시닌 화합물(1)의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물로부터 선택된다.

화학요법제 및 바람직하게는 항-아교모세포종 약물은 바람직하게는 테모졸로미드(temozolomide), 덱사메타손(dexamethasone), 로무스틴(lomustine), 메토트렉세이트(methotrexate), 에베로리무스, 카르무스틴(carmustine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 트립톨리드(triptolide), 호모해링토닌(homoharringtonin), 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 아이다루비신(idarubicin), 리바비린(ribavirin), 토포테칸(topotecan), 플루벤다졸(flubendazole), 이트라코나졸(itraconazole), 빈데신 설페이트(vindesine sulfate), 세리바스타틴(cerivastatin), 빈크리스틴(vincristine), 비노레빈(vinorebine), 니솔다이핀(nisoldipine), 데옥시아데노신(deoxyadenosine), 클로로-2'-데옥시아데노신(chloro-2'-deoxyadenosine), 5-노닐옥시트립타민(5-nonyloxytryptamine), 2(1H)-피리미디논(2(1H)-pyrimidinone), 피타바스타틴(pitavastatin), 세르트랄린(sertraline), 이리노테칸(irinotecan), 클로파지민(clofazimine), 및 도세탁셀(docetaxel)를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에서 개시된 약제학적 조성물은 의약으로서 그리고 특히 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암 및 바람직하게는 뇌암의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

바람직하게는, 아교모세포종은 서브 타입 전신경(proneural(PN)), 중간엽 (MES) 및 클래식(classical(CL)) 아교모세포종으로부터 선택된다.

조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 및 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에서의 사용의 경우에, 아르테미시닌 화합물 및 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산의 몰 비율은 약제학적 조성물 중에 1:5 내지 1:5000, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 1:1000, 더욱더 바람직하게는 1:10 내지 1:500의 범위에 있다.

임의로, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에서의 사용의 경우에, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함한다.

일부 구체예에서, 약제학적 조성물은, 바람직하게는 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법, 고열 요법, 화학요법, 암 면역요법 및/또는 어떠한 다른 소분자 기반 요법과 조합으로, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용된다.

일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 시럽, 용액, 현탁액, 에멀션, 또는 겔의 형태로 사용된다.

일부 구체예에서, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료의 경우에, 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 적용에 의해서 투여된다. 바람직하게는, 비경구 적용은 피부내(intradermal), 위내(intragastral), 피내(intracutaneous), 맥관내(intravasal), 정맥내, 근육내, 피하(subcutaneous), 설하, 국소, 및 경피 적용을 포함한다.

일부 구체예에서, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 및 간암 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는 아교모세포종의 예방 및/또는 치료의 경우에, 약제학적 조성물에 함유되는 아르테미시닌은 일일 0.01 내지 100 mg/체중 kg의 범위로 투여되며, 5-아미노레뷸린산은 일일 0.01 내지 200 mg/체중 kg의 범위로 투여된다.

일부 구체예에서, 약제학적 조성물은, 바람직하게는 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물과 조합하여, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용되며, 여기에서, 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물은 일일 0.01 내지 100 mg/체중kg의 범위로 투여된다.

본 발명은,

a) 아르테미시닌 화합물(1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

놀랍게도, 세 가지 약제학적 활성 성분, 즉, 아르테미시닌 화합물(1) 및 5-아미노레뷸린산(2) 또는 메틸-5-아미노레뷸린산(2b) 및 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 함유하는 본원에서 개시된 약제학적 조성물이 도 13 내지 도 19에서 입증되는 바와 같이 이들 활성 성분 중 단지 둘의 조합에 비해서 상당히 더 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

본원에서 사용된 용어 "아르테미시닌 화합물"은 이하 나타낸 바와 같은 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 아르테메테르(artemether)(1c), 아르테에테르(1d), 및 아르테수네이트(1e), 및 아르테미시닌 화합물(1)의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물을 나타낸다.

본원에서 개시된 모든 약제학적 조성물에서, 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 및 아르테수네이트(1e)는 아르테미시닌 화합물(1)로서 일컬어진다. 아르테미시닌(1a) 및 아르테수네이트(1e)가 더욱 바람직하고 아르테미시닌(1a)가 가장 바람직하다.

따라서, 본원은, 바람직하게는

a) 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 및 아르테수네이트(1e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아르테미시닌 화합물(1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

c) 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

더욱 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테미시닌(1a) 또는 아르테수네이트(1e), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

더욱더 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테수네이트(1e) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

더욱더 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테미시닌(1a) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

성분 b)와 관련하여, 5-아미노레뷸린산(2)이 메틸-5-아미노레뷸린산(2b)에 비해서 바람직하다.

결과적으로, 본 발명은,

a) 아르테미시닌 화합물(1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

b) 5-아미노레뷸린산(2) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물; 및

더욱이, 본원은, 바람직하게는,

a) 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 및 아르테수네이트(1e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아르테미시닌 화합물(1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

더욱 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테미시닌(1a) 또는 아르테수네이트(1e), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

더욱더 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테수네이트(1e) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

더욱더 바람직하게는, 본원은,

a) 아르테미시닌(1a) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

화학요법제, 바람직하게는 항-아교모세포종 약물은 바람직하게는 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 빈크리스틴, 비노레빈, 니솔다이핀, 데옥시아데노신, 클로로-2'-데옥시아데노신, 5-노닐옥시트립타민, 2(1H)-피리미디논, 피타바스타틴, 세르트랄린, 이리노테칸, 클로파지민, 및 도세탁셀을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 빈크리스틴, 비노레빈, 니솔다이핀, 데옥시아데노신, 클로로-2'-데옥시아데노신, 5-노닐옥시트립타민, 2(1H)-피리미디논, 피타바스타틴, 및 세르트랄린을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 및 비노레빈을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 플루벤다졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 및 비노레빈을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 리바비린, 및 비노레빈을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 및 비노레빈을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 및 독소루비신을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 및 닥티노마이신을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 및 호모해링토닌을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 및 호모해링토닌을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 및 트립톨리드를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

더욱더 바람직하게는, 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 테모졸로미드가 가장 바람직하다.

예비적인 데이터는 아르테미시닌 및 5-아미노레뷸린산 및 트립톨리드 또는 호모해링토닌 또는 닥티노마이신 또는 독소루비신 또는 에피루비신 또는 비노레빈의 조합이 아르테미시닌 및 5-아미노레뷸린산 및 테모졸로미드의 조합과 비견됨을 나타냈다.

따라서, 본 발명은,

c) 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 빈크리스틴, 비노레빈, 니솔다이핀, 데옥시아데노신, 클로로-2'-데옥시아데노신, 5-노닐옥시트립타민, 2(1H)-피리미디논, 피타바스타틴, 세르트랄린, 이리노테칸, 클로파지민, 및 도세탁셀;

바람직하게는 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 빈크리스틴, 비노레빈, 니솔다이핀, 데옥시아데노신, 클로로-2'-데옥시아데노신, 5-노닐옥시트립타민, 2(1H)-피리미디논, 피타바스타틴, 및 세르트랄린;

더욱 바람직하게는 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 및 비노레빈;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 플루벤다졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 및 비노레빈;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 리바비린, 및 비노레빈;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 및 비노레빈;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 및 독소루비신;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 및 닥티노마이신;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 및 호모해링토닌;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 및 호모해링토닌;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 및 트립톨리드;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 테모졸로미드가 가장 바람직하다.

더욱이, 본원은,

a) 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 및 아르테수네이트(1e)로 이루어진 군으로부터 선택된 아르테미시닌 화합물(1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 테모졸로미드가 가장 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 본원은,

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 테모졸로미드가 가장 바람직하다.

더욱더 바람직하게는, 본원은,

바람직하게는, 본 발명은,

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 테모졸로미드가 바람직하다.

더욱이, 본원은 바람직하게는,

더욱 바람직하게는 본원은,

더욱더 바람직하게는, 본원은,

본원에서 사용된 용어 "아르테미시닌 화합물"은 아르테미시닌 (ART 또는 Art 또는 1a), 아르테메테르, 아르테에테르, 아르테수네이트 (ARS 또는 1e), 및 디하이드로아르테미니시닌 (아르테미놀 또는 DHA 또는 1b)을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 의미한다.

아르테미시닌 화합물(1)의 활성 대사물질은 디하이드로아르테미니신(DHA)이다. 본원에서 사용된 용어 "아르테미시닌", "ART", "Art"는 상호교환적으로 사용되며, 화학식(1a)을 갖는 잘 공지된 화합물을 포함한다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "아르테미시닌 화합물(1)의 약제학적으로 허용되는 염(들)"은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 기재된 화합물의 산성 또는 염기성 모이어티(moiety)의 염을 포함한다. 염기성 모이어티는 다양한 무기산 및 유기산과 광범위하게 다양한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기성 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 제조하기 위해서 사용될 수 있는 산은 비독성 산 부가염, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염을 형성하는 것들이다. 적합한 유기 산은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 석신산, 아세트산, 포름산, 옥살산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 시트르산, 글루콘산, 락트산, 만델산, 신남산, 올레산, 탄닌산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산, 글루콘산, 글루쿠론산, 사카린산, 이소니코틴산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 또는 팜산(예, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트))를 포함한다. 적합한 무기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 또는 질산을 포함한다. 아민 잔기를 포함하는 화합물은, 상기 언급된 산에 추가로, 다양한 아미노산과 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 본래 산성인 화학적 모이어티는 다양한 약제학적으로 허용되는 양이온과 기본 염을 형성할 수 있다. 그러한 염의 예는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염 및 특히, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 리튬, 아연, 포타슘, 또는 철 염이다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "5-아미노레뷸린산(2)의 약제학적으로 허용되는 염(들)" 또는 "메틸-5-아미노레뷸린산(2b)의 약제학적으로 허용되는 염(들)"은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 기재된 화합물의 산성 또는 염기성 모이어티의 염을 포함한다. 염기성 모이어티는 다양한 무기산 및 유기산과 광범위하게 다양한 염을 형성할 수 있다. 그러한 염기성 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 제조하기 위해서 사용될 수 있는 산은 비독성 산 부가염, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 염을 형성하는 것들이다. 적합한 유기 산은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 석신산, 아세트산, 포름산, 옥살산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 시트르산, 글루콘산, 락트산, 만델산, 신남산, 올레산, 탄닌산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산, 글루콘산, 글루쿠론산, 사카린산, 이소니코틴산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 또는 팜산(예, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트))를 포함한다. 적합한 무기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 또는 질산을 포함한다. 아민 잔기를 포함하는 화합물은, 상기 언급된 산에 추가로, 다양한 아미노산과 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 본래 산성인 화학적 모이어티는 다양한 약제학적으로 허용되는 양이온과 기본 염을 형성할 수 있다. 그러한 염의 예는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염 및 특히, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 리튬, 아연, 포타슘, 또는 철 염이다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "공결정", "아르테미시닌 화합물의 약제학적으로 허용되는 공결정(들)은 동일한 결정 격자 내에 둘 이상의 상이한 분자, 즉, 활성 약제학적 성분(API)으로서의 아르테미신 화합물과 공결정 형성제("코포머(coformer)")로 구서오디는 결정상 물질이다.

공-결정은 약물 분자와 코-포머 사이의 주로 수소 결합의 형성이므로, (산성, 염기성 또는 이온화 가능한 기와는 무관하게 API가 잠재적으로 공결정화될 수 있다. 공결정화는 용해도, 용해율, 화학적 안정성 및 융점과 같은 생리화학적 성질을 개선시킬 수 있다. 공-결정의 형성에 원인이 되는 상호작용은 수소 결합, π-적층(π-stacking) 및 판데스 발스 힘(Van der Waals force)을 포함한다.

아르테미시닌 화합물의 공결정의 바람직한 코포머는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 니코틴아미드, 아스코르브산, 우레아, 트로메타민, 테오필린(theophylline), 테오필린-7-아세트산, 테오브로민, 설파이드, 수크로오스, 소르비톨, 사카린, 피리독신, 플로로글루시놀(phloroglucinol), 파라세타몰(paracetamol), N-메틸글루코사민, 메탄설폰산, D-만니톨, 말론산을 포함할 수 있다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "용매화물"은 비-공유성 분자간 힘에 의해서 결합된 화학양론적 또는 비-화학양론적 양의 용매를 추가로 포함하는 화합물을 의미한다. 용매는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 알코올, 예컨대, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 글리콜, N-메틸-2-피롤리돈, 아세토니트릴, N,N'-디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 물을 포함할 수 있다. 용매가 물인 경우에, 용매화물은 수화물이다.

본원에서 사용되는 용어 "5-아미노레뷸린산", "델타-아미노레뷸린산", "ALA" 및 "5-ALA"는 상호교환적으로 사용되며, 화학식(2)의 5-아미노-4-옥소펜타노산을 포함한다. ALA와 관련하여 사용되는 때에, 용어 "유도체"는 화학적으로 변형된 화합물, 예를 들어, 에스테르, 예컨대, ALA 에스테르를 포함한다. 그러한 화합물은 전형적으로는 5-ALA 카르복실산 기의 변형에 의해서 형성된다. 용어 "유도체"는 또한 5-아미노 기가 치환되거나 비치환될 수 있는 5-아미노레뷸린산 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 달리 설명하면, 5-ALA와 관련하여 사용되는 용어 "유도체"는 화학적 변화가 ALA의 카르복실산 또는 5-아미노 기 중 하나 또는 둘 모두에서 발생하는 화합물을 포함한다. 5-ALA의 유도체는 일반적으로는 종래 기술에, 예를 들어, W096/28412호, WO02/10120호 및 WO2005/092838호에 공지되고 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 5-ALA의 바람직하 유도체는 ALA 에스테르, 특히, 5-아미노 기가 비치환되는 5-ALA 화합물의 에스테르이다.

인간에서, 5-아미노레뷸린산은 햄(heme)의 전구체이다. 5-아미노레뷸린산은 세포질에서 일련으 변형을 거치며, 마지막으로는 미토콘드리아 내의 프로토포르피린 IX으로 전환된다. 이러한 프로토포르피린 분자는 효소 페로킬레이타제(ferrochelatase)의 존재하에 철과 킬레이트화되어 헴을 생성시킨다. 따라서, 5-아미노레뷸린산의 투여는 세포내 헴 수준을 증가시키고 세포내 철 농도를 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 5-아미노레뷸린산은 그와 같이 투여되거나 어떠한 약제학적으로 허용되는 물리적인 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 5-아미노레뷸린산은 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 형태로 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "5-아미노레뷸린산의 약제학적 염"은 전형적으로는 ALA 또는 ALA 유도체 및 모노-양성자산, 예를 들어, 설폰산, 예컨대, 메탄설폰산으로부터 유래되어, 1:1 염을 형성할 것이다. 대안적으로, 염은 ALA 또는 ALA 유도체와 디- 또는 트리-양성자산, 예를 들어, 설폰산, 예컨대, 에탄-1,2-디설폰산, 황산 또는 인산 사이에 형성될 수 있다. 하나 초과의 산성 프로톤을 갖는 산이 사용되는 경우에, 생성되는 화합물은 1:1이 아닌 화학양론적 비율, 예를 들어, 2:1 (ALA:산) 또는 3:1(ALA:산)을 가질 수 있거나 다양한 화학양론 수준을 갖는 염들의 혼합물을 포함할 수 있다. 황산의 경우에, 예를 들어, 2:1(ALA:산) 염이 형성될 수 있는 반면에, 인산의 경우에는 3:1(ALA:산) 염이 형성될 수 있다. 폴리양성자산이 또한 ALA 또는 ALA 유도체와의 다른 염을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 황산은 HSO₄ ^-를 기반으로 하는 1:1(ALA: 산) 염을 제공할 수 있고, 인산은 각각 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^-음이온을 기반으로 하는 2:1(ALA: 산) 및 1:1(ALA: 산) 염(또는 이의 조합물) 중 모두를 제공할 수 있다. 더욱이, 폴리양성자산은 또한 다른 생리학적으로 허용되는 염기와의 염, 예컨대, 소듐 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 및 메글루민(meglumine)의 형태로 ALA 또는 이의 유도체(예, ALA 에스테르와 함께)와의 다른 염, 예를 들어, 1:1 염을 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 염은 바람직하게는 약 4 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 약 3 또는 그 미만의 pKa를 갖는 산으로부터 유래된다. 산은 무기 또는 유기산일 수 있다. 바람직한 무기산은 브롬화수소산, 염산, 황산, 인산 및 질산을 포함한다. 바람직한 유기산은 설폰산 및 설폰산 유도체를 포함한다. 염산, 질산, 설폰산 및 설폰산 유도체로부터 유래된 염이 특히 바람직하다. 용어 "설폰산"은 적어도 하나의 -SO₃H 기를 함유하는 어떠한 유기 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 이는 1, 2 또는 3 개의 -SO₃H 기, 가장 바람직하게는 1 또는 2, 예를 들어, 1개의 -SO₃H 기를 포함할 수 있다. 설폰산과 관련하여 사용되는 때에, 용어 "유도체는 적어도 1(바람직하게는, 1, 2 또는 3, 가장 바람직하게는 1 또는 2, 예를 들어, 1) 개의 -SO3X 기(여기에서, X는 생리학적으로 허용되는 양이온, 예컨대, 소듐, 칼슘, 포타슘, 마그네슘 또는 메글루민 양이온)을 함유하는 어떠한 그러한 화합물을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질환, 장애 또는 병태의 진행을 역전시키거나, 완화시키거나, 억제하거나, 그러한 용어가 적용되는 그러한 질환, 장애, 또는 병태의 하나 이상의 증상의 개선을 포함한다. 본원에서 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 또한, 비치료 대조 집단에 비해서 또는 치료 전의 동일한 포유동물에 비해서, 포유동물에서의 질환, 장애 또는 병태의 발생의 확률 또는 발생률을 감소시킴을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 질환, 장애 또는 병태를 예방하는 것을 나타낼 수 있으며, 질환, 장애 또는 병태의 개시를 지연 또는 예방함을 포함할 수 있거나, 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상을 지연시키거나 예방함을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 또한 질환, 장애 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 질환, 장애 또는 병태에 의한 포유동물의 고통 전에 그러한 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상을 감소시키는 것을 나타낼 수 있다. 고통전의 질환, 장애 또는 병태의 중증도의 그러한 예방 또는 감소는, 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있는 투여 중에 있지 않은 대상체에게, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 조성물의 투여와 관련이 있다. 본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 또한 질환, 장애 또는 병태 또는 그러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 재발을 예방함을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료" 및 "치료학적으로"는, "치료하는"이 상기 정의된 바와 같이, 치료 행위를 나타낸다.

바람직하게는, 질환, 장애는 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택되는 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 특히 아교모세포종이다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은 비치료 환자와 관련된 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택된 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 특히 아교모세포종에 요구되는 양을 나타낸다. 질환의 치료학적 치료를 위해서 본 발명을 실시하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 일반적인 건강에 따라서 다양한다. 궁극적으로는, 주치 의사 또는 수의사가 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 그러한 양이 "유효"량으로 일컬어진다.

본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택된 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는, 뇌암, 특히 아교모세포종과 연관된 병태를 갖고 있거나, 그것을 갖는 것으로 의심되거나, 그것에 민감하거나 민감할 수 있는, 포유동물 대상체(영장류(예, 인간, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트(rat), 및 마우스 등), 바람직하게는 인간 대상체를 나타낸다. 일 구체예에서, 본 발명의 발명은 다발성 경화증을 앓고 있는, 예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 어떠한 증상을 갖고 있는 환자를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 예상 환자가 아교모세포종에 걸리는 것을 예방하기 위해서 사용될 수 있다.

다형성 아교모세포종(glioblastoma multiforme(GBM))으로도 공지된 아교모세포종은 뇌 내에서 시작되는 가장 공격적인 암이다. 아교모세포종은 서브 타입, 전신경(proneural(PN)), 중간엽(MES) 및 클래식(classical(CL)) 아교모세포종을 갖는다. 따라서, 일 구체예에서, 아교모세포종은 바람직하게는 전신경(PN), 중간엽(MES) 및 클래식(CL) 아교모세포종으로부터 선택된다.

본 발명의 출원인은 전장 유전자 돌연변이 생성(genome-wide mutagenesis)을 사용하여 반수체 쥐 줄기 세포(haploid murine stem cell(haESC)) 내의 아르테미시닌의 표적을 확인하기 위한 스크린(screen)을 수행하였다[도 1a]. 스크리닝 조건을 확립시키기 위해서, 본 발명의 출원인은 야생형 haESC에서의 화합물에 대한 LD-값을 측정하였고, 상이한 쥐 종양 세포주에서의 성장률을 분석하였다[도 5a, 도 5b]. 전장 유전자 돌연변이 ESC 라이브러리의 생성을 위해서, 본 발명의 출원인은 삽입 돌연변이 생성: 레트로바이러스 및 Tol2 트랜스포슨에 대한 두 표적화 시스템을 사용하였다{ Schnuetgen, F. et al. Enhanced gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Research 36, e133-e133 (2008)}. 이들 독립적인 라이브러리(library)의 선택은 대조군 세포로부터의 아니지만 돌연변이된 세포 푸울(mutagenized cell pool)로부터 아르테미시닌 새성 콜로니의 회수를 유도한다. 이들 삽입 부위의 확대 및 맵핑(mapping)을 위해서, 기능 상실(loss-of-function (LOF)) 분석을 기반으로 하는 농화 스코어(enrichment score)가 측정되었다. 반수체 돌연변이 생성 및 아르테미시닌 화합물 스크리닝은, 돌연변이 라이브러리 둘 모두에서의 상단 히트(top hit)로서, 효소, 프로토포르피리노겐 옥시다제, PPOX를 확인시켰다. PPOX는 세포내 포르피린 또는 헴 생산과 연루된 내부 미토콘드리아 막 효소이다. 흥미롭게도, 미토콘드리아(Alas1, Cpox, Ppox, Fech) 및 세포질(Alad, Hmbs, Uros, Urod) 둘 모두에서의 포르피린 생합성 경로의 모든 단일 효소의 유전적 돌연변이가 스크린 뿐만 아니라 본질적으로 모든 관련 공-요소-생성 효소(Lias, Ogdh, Dlst, Lip1, Lipt2, Pdxk) 및 프로토포르피린 또는 헴 생합성 내로 공급되는 경로로부터 회수되었다[도 1b; 도 5c]. ESC에서의 아르테미시닌 스크리링 프로필의 GO 기간 분석은 아르테미시닌 독성의 맥락에서 가장 유의한 표적화된 경로로서의 포르피린 생합성을 확인시켰다[도 1c]. 따라서, 반수체 ESC에서의 포워드 유전적 스크리닝(forward genetic screening)은 아르테미시닌 세포독성에 대한 결정적 및 필수 경로로서 포르피린 생합성을 묘사한다.

개별적인 수준에 대한 고-처리량(high-throughput) 아르테미시닌 스크린으로부트이 히트(hit)를 확인하기 위해서, 본 발명의 출원인은 아르테미시닌에 대한 이들의 민감성에 대한 단일 돌연변이 ESC 클론을 시험하였다. 개별적인 콜로니는 스크린으로부터 직접적으로 돌연변이 라이브러리 둘 모두로부터 회수되었고 단일 세포주를 확립시키기 위해서 사용되었다. 이들로부터, 본 발명의 출원인은 표지된 야생형(mCherry_Cre) 및 녹아웃(knockout(GFP)) 자매 세포 클론(녹아웃 카세트(knock-out cassette)의 Cre-재조합효소-매개된 복귀를 통해서)을 생성시켰고, 아르테미시닌의 존재하에 이들의 상대적인 성장률를 각각 모니터링하였다. 혼합 표지된 세포의 비율이 화합물 또는 대조군 세포의 부재하에 일정한 반면에, 아르테미시닌 노출은 야생형(mCherry_Cre)의 선택적인 손실 및 녹아웃 세포(GFP)의 강한 팽창을 생성시켰다. 생성되는 세포의 삽입 부위 매핑(insertion site mapping)(생어 염기서열 분석(Sanger Sequencing)을 이용함)은 포르피린 생합성 경로 성분의 파괴를 확인시켰다[도 1d]. 이들 결과는 포르피린 생합성 경로의 효소의 돌연변이가 마우스 ESC에서의 아르테미시닌 내성을 유도함을 승인한다.

본 발명의 출원인은 다음으로 세포내 포르피린 생합성의 조절이 아르테미시닌에 대한 민감성을 변경시키기에 충분한지를 분석하였다. 본 발명의 출원인은, 프로토포르피린 IX로의 프로토포르피리노겐 IX의 전환을 차단하는, 포르피린 생성 또는 헴 생합성의 약리학적 억제제, 프로토포르피리노겐 옥시다제(PPOX) 억제제 아시플루오르펜(acifluorfen)를 사용하였고, 마우스 ESC에서의 아르테미시닌에 대한 증가된 내성을 관찰하였다[도 2a]{Witkowski, D. A. & Halling, B. P. Inhibition of plant protoporphyrinogen oxidase by the herbicide acifluorfen-methyl. Plant Physiol. 90, 1239-1242 (1989)}. 역으로, 본 발명의 출원인은 비-단백질 생성 아미노산 및 내인성 알라닌 유사체 전구체 δ-아미노레뷸린산(5-ALA)를 사용하여 포르피린 생성을 향상시키는 때에, 본 발명의 출원인은 항말라리아 화합물에 대한 민감성을 증가시켰다[도 2b]. 본 발명의 출원인은 다음으로 상이한 쥐 및 인간 암 세포주가, 기부 성장(basal growth) 및 민감성 비율과 무관하게, 조합처리와 유사하게 반응하는지를 분석하였다[도 5b].

본 발명의 출원인은 모든 시험된 암 세포가 아르테미시닌에 대해서 과민함을 확인할 수 있었다[도 2c; 도 6a]. 그러나, 놀랍게도, 또한 5-ALA가 세 가지의 독립적으로 유래된 임상적으로 관련된 인간 일차 아교모세포종 세포주에서 아르테미시닌 세포독성에 대한 아르테미시닌 과민성을 유도함을 관찰하였다[도 2d; 도 6b, 도 6c].

기계작용적으로, 아르테미시닌은 이전에 반응성 산소 종(ROS) 생산을 유발시키는 것으로 밝혀졌다{Gopalakrishnan, A. M. & Kumar, N. Antimalarial action of artesunate involves DNA damage mediated by reactive oxygen species. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 317-325 (2015)} {Stockwin, L. H. et al. Artemisinin dimer anticancer activity correlates with heme-catalyzed reactive oxygen species generation and endoplasmic reticulum stress induction. Int. J. Cancer 125, 1266-1275 (2009)} {Berman, P. A. & Adams, P. A. Artemisinin enhances heme-catalysed oxidation of lipid membranes. Free Radic. Biol. Med. 22, 1283-1288 (1997)}. ROS 수분을 분석하는 것(레독스-민감성 형관 프로브 디하이드로에티듐(Dihydroethidium: DHE)를 사용함)은 아르테미시닌 처리시에 ROS의 증가된 수준을 확인시켰다[도 6d, 도 6e]. 본 발명의 출원인은 다음으로 5-ALA가 아르테미시닌의 존재 하에 ROS에 대한 어떠한 효과를 갖는지를 확인하였다. 뚜렷하게는, 5-ALA 단독이 ROS를 촉발시켰고, 세포 생존력을 약간 감소시켰다. 그러나, 아르테미시닌과의 5-ALA의 조합은 고도로 상승된 ROS 수분 뿐만 아니라 두 가지 상이한 세포 맥락에서의 세포 사망의 강한 증가를 생성시켰다[도 2e, 도 2f; 도 6f, 도 6g]. 유사하게, 그리고, 아르테미시닌 유도된 ROS 유도와 관련하여 이전에, 미토콘드리아 분극(ΔΨm, 미토콘드리아 막 전위 프로브 JC-1에 의해서 분석됨)이 5-ALA와의 조합으로 강하게 상승되었다[도 6h]{Antoine, T. et al. Rapid kill of malaria parasites by artemisinin and semi-synthetic endoperoxides involves ROS-dependent depolarization of the membrane potential. J. Antimicrob. Chemother. 69, 1005-1016 (2014)}. 뚜렷하게는, 5-ALA 처리 단독이 미토콘드리아 분극을 증가시켜, 동시 아르테미시닌 처리에 대한 민감화를 나타냈다. 중요하게는, 지명된 표현형 모두(ROS 유도, 미토콘드리아 분극, 세포 사망)가 포르피린 생산의 약리학적 억제에 의해서 억제도리 수 있다[도 2e, 도 2f; 도 6f, 도 6g, 도 6h]. 이들 결과는 아르테미시닌 및 5-ALA 유도된 상승된 ROS 수준(및 미토콘드리아 막 분극) 및 세포 사망이 포르피린 생합성의 억제에 의해서 역전될 수 있음을 입증하였다.

변경된 세포 대사 및 포르피린 생산의 상향조절이 인간 암 세포에서 흔히 관찰된다{Navone, N. M., Polo, C. F., Frisardi, A. L., Andrade, N. E. & Battle, A. M. Heme biosynthesis in human breast cancer--mimetic 'in vitro' studies and some heme enzymic activity levels. Int. J. Biochem. 22, 1407-1411 (1990)}. 인간 아교모세포종 환자에서, 상승된 포르피린 생합성이 암 조직을 편재화시키고 표적하기 위해서 치료학적으로 사용되는데, 그 이유는 포르피린 전구체(즉, 프로토포르피린)가 모니터링될 수 있고 기능적으로 이용될 수 있는 강한 형광을 나타내기 때문이다{Zhao, S. et al. Intraoperative fluorescence-guided resection of high-grade malignant gliomas using 5-aminolevulinic acid-induced porphyrins: a systematic review and meta-analysis of prospective studies. PloS one 8, e63682 (2013)}. 임상에서의 종양 조직 절제 동안에, 5-ALA의 경구 또는 정맥내 투여가 건강한 뇌 조직으로부터 악성 종양 조직을 식별하기 위해서 사용되는데, 그 이유는 형광 프로토포르피린, 예컨대, 프로토포르피린 IX가 종양 세포에 특별히 축적되기 때문이다{Marbacher, S. et al. Use of fluorescence to guide resection or biopsy of primary brain tumors and brain metastases. Neurosurg Focus 36, E10 (2014)}. 따라서, 본 발명의 출원인은 뇌암에서의 내인적으로 변경된 포르피린 생합성이 치료학적으로 이용될 수 있는지를 5-ALA 및 아르테미시닌의 조합을 사용하여 분석하였다.

본 발명의 출원인은 뇌 오가노이드 발생의 과정에서 신경 전구체의 유전적 조작을 기반으로 한 최근에 확립된 인간 뇌 종양 오가노이드 모델을 사용하였고, 그에 따라서, 시험관내 인간 종양 형성의 중요한 양태를 재현하였다{Lancaster, M. A. et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379 (2013)}. 종양 세포는 GFP로 동시에 표지되어, 시간에 따른 공간적 모니터링 및 인간 뇌 종양 오가노이드 내의 시험관내 화합물 프로파일링을 가능하게 한다[도 3a]. 본 발명의 출원인은 먼저, c-MYC 종양 유전자의 과발현을 기반으로 하는, 중추 신경계 원시 신경외배엽 종양 (central nervous system primitive neuroectodermal tumor(CNS-PNET))-유사 종양 모델에서 아르테미시닌 및 5-ALA의 존재 하의 성장률을 분석하였다{Bian, S. et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat. Methods 15, 631-639 (2018)}[도 7a]. 고도의 악성 뇌 종양 오가노이드는 상이한 투여량의 5-ALA, 아르테미시닌, 또는 이들 둘의 조합으로 처리되었다[도 3b]. 5-ALA 또는 아르테미시닌 단독의 매우 높은 농도는 GFP-양성 종양 오가노이드의 주목할 만한 성장 억제를 생성시켰기 때문에[도 7a], 농도는 개별적인 화합물이 종양 또는 오가노이드 성장에 주목할만한 효과를 주지 않는 모든 후속 실험을 위해서 선택되었다. 5-ALA 및 아르테미시닌 둘 모두의 조합이 인간 뇌 오가노이드 내의 GFP-양성 종양 세포를 함께 두드러지게 감소시켰다[도 3c, 도 3d; 도 7b]. 상이한 시점에서의 종양 조직 면적의 정량화(d3, d5) [도 3e; 도 7c] 뿐만 아니라, FACS 분석 (d5)[도 3f]은 5-ALA와 아르테미시닌 조합 치료 시의 GFP-양성 세포의 감소를 확인시켰다. 절개된 뇌 오가노이드의 면역 조직 화학은 추가로 5-ALA 처리는 GFP+ 종양 조직의 손실을 생성시켰지만, 뇌 오가노이드 내으 비-형질전환된 신경 조직, 예컨대, Sox2 발현 세포 및/또는 로제트-유사 구조 지시 또는 선조 세포에 대한 명백한 효과가 없었음을 나타냈다[도 7d, 7]. 종합해 보면, 이러한 데이터는 5-ALA와 아르테미시닌 조합 치료법이 원시 신경외배엽 종양(PNET) 오가노이드 모델에서 인간 내 종양 세포의 수를 강하게 감소시킴을 암시한다.

본 발명의 출원인이 ROS 수준에 대한 5-ALA와 아르테미시닌의 뚜렷한 효과를 관찰함에 따라서, 본 발명의 출원인은 Myc 과발현 종양 오가노이드의 DHE 염색 및 분석을 수행하였다. GFP-양성 종양 세포는 GFP 음성 야생형 세포에 비해서 약간 더 높은 기본 ROS 신호를 나타낸 반면에(DHE 염색 및 FACS 분석에 의해서 분석됨), ROS 수준은, 특히, GFP-양성 암 세포에서, 5-ALA와 아르테미시닌 이중 처리시에 추가로 뚜렷하게 증가시켰다[도 3g; 도 9a]. 뚜렷하게는, 5-ALA 처리 단독은 또한, 아르테미시닌 독성을 감작화시키는, 이러한 셋업에서 ROS 생산을 약간 유도하였다. 상승된 세포내 ROS는 또한 널리 퍼진 단백질 및 DNA 손상을 유발시킴에 따라서, 본 발명의 출원인은 처리된 오가노이드의 부분에 대한 DNA 이중 가닥 절단(double strand break(DSB))의 양을 분석하였고, 사실, 5-ALA와 아르테미시닌 이중-처리된 GFP-양성 종양 조직 내의 γH2AX(포스포릴화된 히스톤 H2AX)-양성 세포에서 매우 강한 증가를 관찰할 수 있었지만, 야생형 세포에서는 그러하지 않다[도 3h; 도 9b, 도 9c]. 추가로, 세포 사멸(카스파제 3-양성(Caspase 3-positive)) 및 증식 세포(Ki67-양성)의 기본 수가 정상 조직에 비해서 GFP-양성 종양 세포에서 증가되었지만, 아르테미시닌와 5-ALA에 의한 조합 치료 시에 GFP/양성 종양 세포에서 세포 사멸이 추가로 증가하였다[도 10a-도 10c].

5-ALA가 인간 아교모세포종의 진단 및 치료법에 임상적으로 사용됨에 따라서, 본 발명의 출원인은 시험관내 인간 아교모세포종-유사 종양 오가노이드 모델에서 5-ALA 및 아르테미시닌 조합 치료를 분석하였다{Bian, S. et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat. Methods 15, 631-639 (2018)}. 이들 오가노이드를 GFP와 함께 종양 억제 유전자 p53, NF1 및 PTEN의 돌연변이를 수행하도록 조작하여, 아르테미시닌, 5-ALA 또는 이들 둘 모두의 존재 하에 시간에 따른 종양 성장을 모니터링할 수 있게 하였다. 5-ALA 및 아르테미시닌 단독의 둘 모두는 비형질전화된 세포 뿐만 아니라 형질전환된 세포의 생존에 효과가 거의 없었던 반면에, 화합물 둘 모두의 조합은 특히 시험관내 종양 모델에서 GFP-양성 종양 세포를 제거하였다[도 4a; 도 11a]. 뇌 오가노이드의 정량화 및 이미지 분석은 GFP-양성 종양 세포 및 조직의 점진적인 손실을 확인시켰지만, 비형질전환된 것은 그러하지 않았다[도 4b; 도 4c, 도 11b, 11c]. 이들 데이터는 5-ALA와 아르테미시닌이, 상승된 ROS 수준 및 증가된 DNA 손상을 통해서, 두 개의 고도의 악성 뇌 종양 모델에서 종양 세포의 증가된 사포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.

요약하면, 본 발명의 출원인은 진핵 세포에서의 아르테미시닌-촉발된 세포독성에 대한 중요한 내인성 경로로서의 포르피린 생합성의 교건을 명확하게 설명하고 있다. 고-처리량 유전적 스크리닝 시스템을 사용하여, 본 발명의 출원인은 이러한 항말라리아 및 항암 화합물의 활성에 요구되는 미토콘드리아 기능 및 더욱 특히 포르피린/헴 생합성을 확인하였다. 포르피린 생산의 유전적 뿐만 아니라 약리학적 조절이 아르테미시닌 독성을 조절할 뿐만 아니라, 복수의 세포 맥락 및 상이한 종에서 아르테미시닌-유도된 반응성 산소 종의 수준을 조절하기에 충분하였다. 뚜렷하게는, 헴 생합성 유도 단독이 세포 ROS 수준을 약간 상승시켜, 아르테미시닌-유도된 독성을 감작화시켰다. 더욱이, 본 발명의 출원인은, 몇 개의 독립적인 시험관내 인간 뇌 종양 오가노이드 및 회전타원체 모델 시스템에서, 본 발명의 출원인이, 세포 사멸을 유도하기 위한 5-ALA 및 아르테미시닌의 조합 치료를 이용하여, 뇌암 세포, 특히, 인간 아교모세포종을 특별히 표적할 수 있음을 나타내고 있다.

뇌암의 치료에 대한 아르테미시닌(ART) 및 5-아미노레뷸린산(5-ALA)의 강한 상승작용을 입증한 후에, 본 발명의 출원인은 다음으로 이러한 상승작용이 다른 ART 유도체, 추가의 암 유형으로 확장되는지를 분석하였고, 이러한 이중 조합이 현재 적용되는 암 치료 요법, 특히 화학요법에 대해서 상승작용하는지를 분석하였다. 6-일 생존 분석을 이용하여, 본 발명의 출원인은 5-ALA와 조합되는 ART 자체 및 가장 일반적으로 사용되는 ART 유도체, 디하이드로아르테미시닌(DHA) 및 아르테수네이트(ARS)가 다발성 아교모세포종 세포주 뿐만 아니라, 고도의 증식성 마우스 배아 줄기 세포에 대한 강한 상승작용, 항증식성 효과를 나타냄을 확인하였다(ESC, 도 12). 이들 데이터로부터, 본 발명의 출원인은 이하 분석을 위한 세포-유형 및 화합물-특이적 투여량 조합을 유도하였다. 다형성 아교모세포종은 최대 수술 절제에 이어서 방사선 요법과 동시 및 유지 테모졸로미드(TMZ) 치료에 의해서 현재 치료되는 매우 공격적인 암이다. 본 발명의 발명자들은 5-ALA와 ART 또는 DHA와의 TMZ의 조합이 시험된 모든 아교모세포종 세포주에서 모든 가능한 이중 조합보다 더욱 효과적임을 밝혀냈다(도 13). ESC에서, 예를 들어, DHA 및 5-ALA의 이중 조합만이 명백한 상승작용을 나타내는 TMZ의 세포 독성 효과를 유발시킨다.

이들 발견은 ARS로 연장되고, 5-ALA 및 TMZ와의 ARS의 조합이 시험된 5 개의 아교모세포종 세포주 중 4 개에서 5-ALA를 이의 유도체 메틸-5-ALA (M-5-Ala)로 대체하는 것보다 더욱 효과적이다(도 14).

로무스틴(CCNU)은 뇌암의 치료에서 TMZ에 대한 대안체이고, TMZ와 같이, 이의 세포 증식 억제 효과는, 모든 가능한 이중 조합에 비해서, ART 및 5-ALA와의 조합에 의해서 특히 강화될 수 있다(도 15).

더욱이, 본 발명의 발명자들은 다른 조직으로부터 유래되는 암 세포주에서 5-ALA와의 ART 및 유도체의 조합을 시험하였다. 본 발명의 발명자들은 이들 암 세포주의 생존을 감소시키는데 있어서의 5-ALA와의 ART/DHA/ARS의 강한 상승작용을 발견하였을 뿐만 아니라, 이러한 이중 조합이 광번위하게 사용되는 화학요법제, 시스플라틴 (CP), 카르보플라틴, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 비노레빈, 테모졸로미드, 로무스틴, 및 5-플루오로우라실 (5-FU)을 향상시킨다. 이는 특히 두 폐암 세포주(도 16), HepG2 세포(간, 도 17), MD-MBA-231 세포(유방, 도 18), 및 MiaPaca-2 세포 (췌장, 도 19)에 대해서 시험되었다. 종합적으로, 본 발명의 발명자들은 처음으로, 예를 들어, 조혈성 암, 뇌암, 폐암, 간암, 유방암, 및 췌장암에서의 5-ALA 및 현재 사용되는 화학요법제 및 특히 항-아교모세포종 약물과의 조합으로 ART 및 ART-유도체 치료의 강한 잠재성을 밝히고 있다.

따라서, 본 발명은, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암 및 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한,

바람직하게는, 본 발명은, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암 및 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한,

a) 아르테미시닌(1a), 디하이드로아르테미니신(1b), 및 아르테수네이트(1e)로 이루어진 군으로부터 선택된 아르테미시닌 화합물(1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물; 및

더욱더 바람직하게는, 본 발명은, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암 및 특히 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한,

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실 및 가장 바람직하게는 테모졸로미드를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택된 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는, 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해서, 아르테미시닌 화합물과 5-아미노레뷸린산의 몰 비율은 약제학적 조성물 중의 1:5 내지 1:5000, 바람직하게는 1:5 내지 1:1000, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 1:500, 더욱더 바람직하게는 1:10 내지 1:250, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1:100의 범위 내에 있다.

조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택된 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는, 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해서, 아르테미시닌 화합물과 메틸-5-아미노레뷸린의 몰 비율은 약제학적 조성물 중의 1:5 내지 1:5000, 바람직하게는 1:5 내지 1:1000, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 1:500, 더욱더 바람직하게는 1:10 내지 1:250, 가장 바람직하게는 1:10 내지 1:100의 범위 내에 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 아르테미시닌 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 이의 용매화물 및 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산 및 바람직하게는 5-아미노레뷸린산 및, 특히 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암 및 더욱 바람직하게는 아교모세포종의 치료를 위한 유일한 활성 성분으로서 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은,

c) 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 치료 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 및 특히 아교모세포종으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명은,

더욱이, 본 발명은,

더욱더 바람직하게는, 본 발명은,

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실 및 가장 바람직하게는 테모졸로미드를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는 치료 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 및 특히 아교모세포종으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명은,

임의로, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암으로부터 선택된 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는, 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 공지된 방식으로 통상적인 고체 또는 액체 담체 또는 희석제 및 통상의 약제학적으로 제조된 애주번트(adjuvant)에 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 전형적으로는 의도된 투여 형태와 관련하여 선택된 적합한 허용 가능한 담체와 함께 투여될 것이다. 즉, 경구 투여의 경우에, 정제, 캡슐(고체 충전된, 반고체 충전된 또는 액체 충전된 캡슐), 구성을 위한 분말, 겔, 엘릭시르(elixir), 분산 가능한 과립, 시럽, 및 현탁액 등의 형태로 그리고 통상의 약제학적 실무와 일치되게 투여된다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐의 형태의 경구 투여의 경우에, 활성 약물 성분은 어떠한 경구 비-독성 약제학적으로 허용되는 담체와, 바람직하게는 락토오스, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 탈크(talc), 만니톨, 및 에틸 알코올(액체 충전된 캡슐) 등과 같은 불활성 담체와 함께 조합될 수 있다. 더욱이, 적합한 바인더, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 또한 정제 또는 캡슐내로 통합될 수 있다. 분말 및 정제는 활성 성분으로서 약 5 내지 약 95 중량%의 화학식(I)에 따른 유도체 또는 이의 유사 화합물 또는 각각의 약제학적 활성 염을 함유할 수 있다.

적합한 바인더는 전분, 젤라틴, 천연 당분, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대, 아카시아, 소듐 알기네이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스를 포함한다. 적합한 윤활제 중에, 붕산, 소듐 벤조에이트, 소듄 아세테이트, 및 소듐 클로라이드 등이 언급될 수 있다. 적합한 붕해제는 전분, 메틸셀룰로오스, 및 구아 검(guar gum) 등을 포함한다. 감미제 및 향미제 뿐만 아니라 보존제가 또한 적절한 경우에 포함될 수 있다. 붕해제, 희석제, 윤활제, 바인더 등은 이한 더욱 상세히 논의될 것이다.

더욱이, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료 효과(들), 예를 들어, 항암 활성 또는 암의 전이 등에 대한 활성을 최적화시키기 위한 성분 또는 활성 성분 중 어느 하나 이상의 속도 제어 방출을 제공하기 위해서 서방형(sustained release form)으로 제형화될 수 있다. 지속적인 방출에 적합한 투여 형태는 붕해 속도를 변화시키는 층 또는 활성 성분이 함침되고 정제 형태로 성형되는 제어된 방출 폴리머 매트릭스를 갖는 정제 또는 그러한 함침되거나 캡슐화된 다공성 폴리머 매트릭스를 함유하는 캡슐을 포함한다.

액체 형태 제제는 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 예로서, 비경구 주입을 위한 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액 또는 경구 용액, 현탁액, 및 에멀션을 위한 감미제 및 혼탁화제(opacifier)의 첨가가 언급될 수 있다. 액체 형태 제제는 또한 비강내 투여를 위한 용액을 포함할 수 있다.

흡입 투여에 적합한 에어로졸 제제는, 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 불활성의 압축된 가스, 예를 들어, 질소와 함께 존재할 수 있는, 용액 및 분말 형태의 고형물을 포함할 수 있다.

좌제를 제조하는 경우에, 저융점 왁스, 예컨대, 코코아 버터와 같은 지방산 글리세라이드의 혼합물이 먼저 용융되고, 이어서, 활성 성분이, 예를 들어, 교반에 의해서 그에 균일하게 분산된다. 이어서, 용융된 균일한 혼합물을 통상의 크기 조절된 모울드 내로 부어, 냉각되게 하고, 그에 의해서 고형화시킨다.

또한, 사용 직전에, 경구 또는 비경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 전환되도록 의도되는, 고체 형태 제제가 포함된다. 그러한 액체 형태는 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 캡슐은 활성 성분(들)을 포함하는 조성물을 보유하거나 함유하기 위한, 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 또는 변성 젤라틴 또는 전분으로 제조된 특이적 용기 또는 인클로저(enclosure)를 나타낸다. 경질 쉘을 갖는 캡슐은 전형적으로는 뼈 또는 돼지고기 껍질로부터의 비교적 높은 겔 강도 젤라틴의 배합물로 제조된다. 캡슐 자체가 소량의 염료, 혼탁화제, 가소제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다.

정제 하에, 활성 성분을 적합한 희석제와 함께 포함하는 압축 또는 성형된 고체 투여 형태가 이해된다. 정제는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게 잘 공지된 습식 과립화, 건식 과립화 또는 압축에 의해 얻은 혼합물 또는 과립의 타정에 의해서 제조된다.

경구용 겔은 친수성 반고체 매트릭스에 분산되거나 가용화된 활성 성분을 나타낸다.

구성을 위한 분말은 활성 성분 및 예를 들어, 물 또는 주스에 현탁될 수 있는 적합한 희석제를 함유하는 분말 배합물을 나타낸다.

적합한 희석제는 일반적으로 조성물 또는 투여 형태의 주요 부분을 구성하는 물질이다. 적합한 희석제는 당분, 예컨대, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨, 밀, 옥수수, 쌀 및 감자에서 유래된 전분, 및 셀룰로오스, 예컨대, 미세결정질 셀룰로오스를 포함한다. 조성물 중의 희석제의 양은 전체 조성물의 약 5 내지 약 95 중량%, 바람직하게는 약 25 내지 약 75 중량%, 및 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 60 중량%의 범위일 수 있다.

용어 붕해제는 의약의 약제학적 활성 성분의 분해(붕해) 및 방출을 지지하기 위해 조성물에 첨가되는 물질을 나타낸다. 적합한 붕해제는 전분, "냉수 가용성" 변성 전분, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 전분, 천연 및 합성 검, 예컨대, 로커스트 빈(locust bean), 카라야(karaya), 구아(guar), 트라가칸트(tragacanth) 및 한천, 셀룰로오스 유도체, 예컨대, 메틸셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethyl셀룰로오스), 미세결정상 셀룰로오스, 및 가교된 미세결정상 셀룰로오스, 예컨대, 소듐 크로스카라멜로스(sodium croscaramellose), 알기네이트, 예컨대, 알긴산 및 소듐 알기네이트, 점토, 예컨대, 벤토나이트, 및 발포 혼합물을 포함한다. 조성물 중의 붕해제의 양은 조성물의 약 2 내지 약 20 중량%, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 10 중량%의 범위일 수 있다.

바인더는 분말 입자들을 함께 결합시키거나 "접착(glue)"시키고, 이들을 과립을 형성시킴으로써 유착되게 하여, 제형 내에서 "접착제"로서 작용하는 물질이다. 바인더는 희석제 또는 증량제(bulking agent)에서 이미 사용 가능한 응집력을 부가한다. 적합한 바인더는, 당분, 예컨대, 수크로오스, 밀, 옥수수, 쌀, 감자로부터 유래된 전분, 천연 검, 예컨대, 아카시아, 젤라틴 및 트라가칸트, 해초(seaweed)의 유도체, 예컨대, 알긴산, 소듐 알기네이트 및 암모늄 칼슘 알기네이트, 셀룰로오스 물질, 예컨대, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 및 무기 화합물, 예컨대, 마그네슘 알루미늄 실리케이트를 포함한다. 조성물 중의 바이더의 양은 조성물의 약 2 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 3 내지 약 10 중량%, 및 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 6 중량%의 범위일 수 있다.

윤활제는 투여 형태에 첨가되어 타정된 후에 정제 과립 등을 마찰 또는 마모를 감소시킴으로써 모울드로부터 방출되게 하는 물질의 부류를 나타낸다. 적합한 윤활제는 금속 스테아레이트, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 또는 갈륨 스테아레이트 스테아르산, 고융점 왁스, 및 그 밖의 수용성 윤활제, 예컨대, 소듐 클로라이드, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 올레이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 D,L-류신을 포함한다. 윤활제는 일반적으로 타정 전에 가장 마지막 단계에서 첨가되는데, 이들이 과립의 표면에 존재해야 하기 때문이다. 조성물 중의 윤활제의 양은 조성물의 약 0.2 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2 중량%, 및 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 1.5 중량%의 범위일 수 있다.

활택제는 약제학적 조성물의 케이크화를 방지하고 과립의 흐름 특성을 개선시켜서 흐름이 원활하고 균일하게 하는 물질이다. 적합한 활택제는 실리콘 디옥사이드 및 탈크를 포함한다. 조성물 중의 활택제의 양은 최종 조성물의 약 0.1 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2 중량%의 범위일 수 있다.

착색제는 조성물 또는 투여 형태에 색상을 제공하는 부형제이다. 그러한 부형제는 적합한 흡착제, 예컨대, 점토 또는 알루미늄 옥사이드 상에 흡착된 식품 등급 염료를 포함할 수 있다. 착색제의 양은 조성물의 약 0.1 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 1 중량%로 다양할 수 있다.

따라서, 본 발명은,

c) 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물; 및

d) 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하거나 이로 이루어진 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본원은, 바람직하게는,

d) 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하거나 이로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다.

더욱 바람직하게는, 본원은,

더욱더 바람직하게는, 본원은,

더욱이, 본 발명은,

c) 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물, 및

더욱이, 본원은, 바람직하게는,

더욱 바람직하게는, 본원은,

더욱더 바람직하게는, 본원은,

d) 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하거나 이로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다..

더욱더 바람직하게는, 본원은,

더욱이, 본 발명은,

더욱더 바람직하게는 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실; 가장 바람직하게는 테모졸로미드를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물; 및

더욱이, 본원은, 바람직하게는,

더욱 바람직하게는, 본원은,

더욱더 바람직하게는, 본원은,

바람직하게는, 본 발명은,

더욱이, 본원은, 바람직하게는,

더욱 바람직하게는, 본원은,

더욱더 바람직하게는, 본원은,

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법, 고열 요법, 화학요법, 암 면역 요법 및/또는 소분자 기반 치료요법과 조합하여 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 바람직하게는 단지 하나의 화학요법제, 바람직하게는 단지 하나의 항-아교모세포종 약물과 조합으로, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용되며, 여기에서, 하나의 화학요법제, 바람직하게는 하나의 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드이다.

본원에서 사용되는 용어 "조합물" 또는 "약제학적 조합물"은 하나 초과의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 생성되며 활성 성분의 고정된 및 비-고정된 조합 둘 모두를 포함하는 제품을 의미한다.

용어 "고정된 조합물" 또는 "고정된 투여량"은 활성 성분, 예를 들어, 화학식(1)의 화합물 및 조합 파트너, 즉, 항암제가 둘 모두 단일 성분 또는 투여형의 형태로 동시에 환자에게 투여되는 것을 의미한다. 다른 용어로, 활성 성분은 하나의 투여형에, 예를 들어, 하나의 정제에 또는 하나의 캡슐에 존재한다.

용어 "비-고정된 조합물"은 활성 성분, 예를 들어, 화학식(1)의 화합물 및 조합 파트너, 즉, 항암제가 둘 모두 별도의 성분으로서 동시에, 특정의 시간 제한 없이 순차적으로 환자에게 투여됨을 의미하고, 여기에서, 그러한 투여는 이를 필요로 하는 포유동물 또는 인간의 신체에서 치료 유효량의 두 화합물을 제공한다. 후자는 또한 칵테일 치료요법(cocktail therapy), 예를 들어, 셋 이상의 항암제의 투여에 적용된다.

상기 약제학적 조합물은 동시에 또는 시간 간격을 두고 별도로 독립적으로 투여될 수 있으며, 특히, 여기에서, 이들 시간 간격은 조합 파트너가 상승작용 효가를 나타내게 한다.

용어 "상승작용 효과"는, 각각의 단일 활성 성분의 투여에 의해서 얻어지는 효과보다 더 큰, 둘 이상의 활성 성분(예, 하나의 아르테미시닌 화합물, 5-ALA, 적어도 하나의 화학요법제 또는 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물)의 투여 후에 관찰되는 치료 효과를 의미한다. 따라서, 상승작용 효과는 얻은 효과가 활성 성분의 동시 투여에 의해서 예상되는 추가의 효과보다 더 큰 때에 존재한다.

용어 "상승작용적 증가"는, 활성 성분들의 동시 투여에 의해서 예상되는 추가의 효과를 초과하는 암 세포 사망에서의 증가를 생성시키는, 둘 이상의 활성 성분 (예, 하나의 아르테미시닌 화합물, 5-ALA, 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물)의 조합을 의미한다.

용어 "상승작용적 감소"는, 활성 성분들의 동시 투여에 의해서 예상되는 추가의 효과보다 더 큰 암의 하나 이상의 증상에서의 감소를 생성시키는, 둘 이상의 활성 성분(예, 하나의 아르테미시닌 화합물, 5-ALA, 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물)의 조합을 의미한다.

상승작용의 또 다른 예에서, 치료 효과는, 활성 성분의 하나 이상이 일반적으로 비-치료적인 투여량으로 존재하는, 둘 이상의 활성 성분의 조합에 대해서 관찰된다. 상승작용의 또 다른 예에서, 둘 이상의 활성 성분의 조합이 독성에서의 예상치 못한 감소를 생성시킨다(즉, 단일의 작용제들의 투여 후에 관찰되는 독성의 합보다 작은 독성의 수준).

그러나, 상승작용 효과는 또한 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법, 고열 요법, 화학요법, 암 면역 요법 또는, 상기 개괄된 바와 같은, 어떠한 다른 소분자 기반 요법에 의한 치료와 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여를 조합함으로써 얻어질 수 있다.

일부 구체예에서, 조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암, 예컨대, 비소세포 폐암, 바람직하게는 뇌암, 더욱 바람직하게는, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서, 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 적용에 의해서 투여된다.

바람직한 제제는 경구 적용을 위해서 조절된다. 이들 투여 형태는, 예를 들어, 환제(pill), 정제, 필름 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 분말 및 디포짓(deposit)을 포함한다.

비경구 적용은 피부, 피부내, 위내, 피내, 맥관내, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내, 질내, 구강내, 피부경유(percutan), 직장, 피하, 설하, 국소, 또는 경피 적용을 포함한다. 바람직하게는, 비경구 적용은 피부내, 위내, 피내, 맥관내, 정맥내, 근육내, 피하, 설하, 국소, 경피 적용 및 흡입을 포함한다.

경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀션의 형태를 가질 수 있으며, 본 목적으로 본 기술분야에서 공지된 바와 같은, 매트릭스 또는 저장소 유형의 경피 패치에 포함될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 캡슐은 활성 성분(들)을 포함하는 조성물을 보유하거나 함유하기 위한, 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 또는 변성 젤라틴 또는 전분으로 제조된 특이적 용기 또는 인클로저(enclosure)를 나타낸다. 경질 쉘을 갖는 캡슐은 전형적으로는 뼈 또는 돼지고기 껍질로부터의 비교적 높은 겔 강도 젤라틴의 배합물로 제조된다. 캡슐 자체가 소량의 염료, 혼탁화제, 가소제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다. 정제 하에, 활성 성분을 적합한 희석제와 함께 포함하는 압축 또는 성형된 고체 투여 형태가 이해된다. 정제는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게 잘 공지된 습식 과립화, 건식 과립화 또는 압축에 의해 얻은 혼합물 또는 과립의 타정에 의해서 제조된다.

경구용 겔은 친수성 반고체 매트릭스에 분산되거나 가용화된 활성 성분을 나타낸다. 구성을 위한 분말은 활성 성분 및 예를 들어, 물 또는 주스에 현탁될 수 있는 적합한 희석제를 함유하는 분말 배합물을 나타낸다.

일부 구체예에서, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서, 약제학적 조성물에 함유되는 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌(1a)은 일일 체중 당 0.01 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 15 mg/kg의 범위로 투여되고, 5-아미노레뷸린산은 일일 체중 당 0.01 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 200 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 가장 바람직하게는 1 내지 50 mg/kg의 범위로 투여된다.

바람직하게는, 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌과 관련한 본 발명의 투여량은 일일 체중 당 적어도 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50, 4.00, 4.50, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5 또는 15.0 mg/kg 아르테미시닌으로 투여된다.

바람직하게는, 5-아미노레뷸린산과 관련한 본 발명의 투여량은 일일 체중 당 적어도 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50, 4.00, 4.50, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 17.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 또는 50.0 mg/kg 5-아미노레뷸린산으로 투여된다.

일부 구체예에서, 약제학적 조성물은, 바람직하게는 적어도 하나의 화학요법제, 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물과 조합으로, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용되며, 여기에서, 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물은 일일 체중 당 0.01 내지 100 mg/kg의 범위로 투여된다.

바람직하게는, 화학요법제, 바람직하게는 항-아교모세포종 약물과 관련한 본 발명의 투여량은 일일 체중 당 각각 적어도 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00, 1.05, 1.10, 1.15, 1.20, 1.25, 1.30, 1.35, 1.40, 1.45, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00, 3.50, 4.00, 4.50, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5 또는 15.0 mg/kg 화학요법제 또는 항-아교모세포종 약물로 투여된다.

그러한 약제학적 조성물의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 주사 준비된 용액, 주사를 위한 약제학적으로 허용되는 비히클에 용해되거나 현탁될 준비가 된 건조 제품, 주사 준비된 현탁액, 및 에멀션을 포함한다.

비경구 투여를 위한 약제학적 조성물을 제공하기 위해서 사용될 수 있는 일부 적합한 비히클은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 주사용 물 USP(Water for Injection USP); 수성 비히클, 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니지만, 소듐 플로라이드 주사액, 링거 주사액(Ringer's injection), 덱스트로스 주사액, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드 주사액, 및 락테이트화된 링거 주사액; 물-혼화성 비히클, 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니지만, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜; 및 비수성 비히클, 예컨대, 이로 한정되는 것은 아니지만, 옥수수 오일, 면화씨유(cottonseed oil), 낙화생유(peanut oil), 참기름, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트를 포함한다.

활성 성분의 적합한 투여량은 전문 의료 실무자에 의해서 결정될 수 있다. 활성 성분의 실제 투여 수준은, 환자에 대한 독성 없이, 특정의 환자에 대한 요망되는 치료적 반응, 조성, 및 투여 방식을 당설시키기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 하기 위해서 다양할 수 있다. 따라서, 투여량은 전형적으로는 효과적인 또는 치료학적으로 효과적인 투여량이다.

선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정의 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정의 화합물의 배설율, 치료 기간, 사용되는 특정의 조성물과 조합으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 및 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지된 유사 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.

투여량 요법은 최적의 요망되는 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 투여량이 투여될 수 있거나(예, 일일 단일 투여량), 몇 개의 분할된 투여량이 시간이 지남에 따라서 투여될 수 있거나, 투여량이 치료 상황의 긴급성에 의해서 알 수 있듯이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 투여량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투여량으로 맞춰진 물리적으로 이산된 단위를 나타내며; 각각의 단위는 요망되는 약제학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.

본 발명에 따른 조성물 및 제품에서, 활성 성분은, 각각, 예를 들어, 조성물 또는 제춤의 전체 중량에 대해서, 0.001 내지 20중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 5중량%, 및 더욱 바람직하게는 1 내지 4중량%의 농도로 존재할 수 있다. 특정의 구체예에서, 세 가지 활성 성분의 각각은 1 내지 3중량%의 농도로 존재한다.

한 가지 현재 바람직한 양태에서, 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌은 (대략 70 kg의 체중을 기준으로 하여; 투여량은 체중에 비례하여 조절될 수 있다) 일일 50 내지 500 mg(더욱 바람직하게는 100 내지 300 mg, 예컨대, 약 200 mg)의 투여를 위해서 제형화된다. 바람직하게는, 아르테미시닌은 경구 또는 비경구 투여를 위해서 제형화된다.

바람직하게는, 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌은 3 내지 30 일, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 일, 예컨대, 약 14 일 동안 투여된다. 이러한 기간은 복수의 그러한 치료 사이클을 포함하는 투여 요법에서의 치료 사이클에 상응할 수 있다(예, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 초과 사이클, 예를 들어, 각각의 사이클은 요망되는 치료 결과가 달성될 때까지 계속된다). 각각의 치료 사이클은 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌 투여에서의 휴식에 의해서 분리될 수 있으며; 그러한 휴식은, 예를 들어, 골수 회복을 가능하게 할 수 있다. 투여에서의 휴식은 3 내지 14일, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 일, 예컨대, 약 7 일의 기간 동안 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌을 투여하지 않음을 포함할 수 있다.

한 가지 예시적인 그러한 양태에서, 아르테미시닌 화합물, 특히 아르테미시닌은 2 주의 치료 사이클 동안 매일 약 200 mg으로 투여되고, 각각의 사이클은 1 주일 휴식이 이어진다.

일부 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은, 바람직하게는 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법 및/또는 고열 요법과 조합으로, 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용된다.

한 가지 바람직한 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은, 아교모세포종이 서브타입, 전신경(PN), 중간엽(MES) 및 클래식(CL) 아교모세포종으로부터 선택되는 아교모세포종의 예방 및/또는 치료를 위해서 사용된다.

도 1: 마우스 줄기 세포에서의 반수체 스크리닝은 포유동물 세포에서의 아르테미시닌 독성에 대한 전제 조건으로서의 포르피린 생합성을 묘사한다. 도 1a는 화합물 표적 확인을 위한 반수체 배아 줄기 세포 스크린의 개략도이다. 도 1b는 포르피린 생물발생 경로이다. 서브 세포 위치(시토졸, 미토콘드리아) 및 주요 효소(볼드(bold), 대문자)의 기능 소실 스코어(이탤릭체) 및 스크린(레트로바이러스 돌연변이 생성)의 보조-인자(표준, 대문자)가 표시되어 있다. 도 1c는 GO-기간 분석이 아르테미시닌에 의해서 표적된 주요 경로로서 포르피린 생물발생을 밝히고 있는 도면이다. 도 1d는 아르테미시닌 내성 단일 세포 클론의 경쟁적 성장 분석을 나타내고 있다. 야생형(mCherry+_ Cre) 및 녹아웃(GFP+) 자매 클론은 돌연변이(레트로바이러스 - 인트론 RE, 더 어두운 셰이딩(darker shading), Tol2 트랜스포존 - 인트론 T2, 더 밝은 셰이딩) 내성 콜리니로부터 유도되고, 아르테미시닌으로 처리되고, 유세포 분석(flow cytometry)으로 분석되고, 삽입 부위 매칭을 위해서 생어(sanger) 서열화되었다.
도 2: 포르피린 생합성의 조절이 ROS 생성을 통한 세포 내의 아르테미시닌 독성을 변경시키기에 충분한다. 도 2a 및 도 2b는 Ppox 억제제 아시플루오르펜(도 2a) 또는 5-ALA (0.5mM)(도 2a)와의 조합으로 아르테미시닌 처리된 마우스 배아 줄기 세포의 세포 생존율을 나타내고 있다. Alamar Blue 염색을 이용하여 처리 48 시간 후의 생존율을 평가하였다. 도 2c는 5-ALA(0.5mM)의 존재 및 부재 하의 아르테미시닌 처리된 마우스 유방암 세포(4T1)의 세포 생존율을 나타내고 있다. Alamar Blue 염색을 이용하여 처리 48 시간(h) 후의 생존율을 평가하였다. 도 2d는 5-ALA 투여 시의 암 환자로부터의 아르테미시닌 처리된 일차 인간 아교모세포종 세포의 생존율을 나타내고 있다. 생존율은 72 시간 후에 CellTiter-Glo를 사용하여 평가하였다. 실험은 삼중으로 수행되었다. 값은 평균 ± SD이다. 도 2e는 ROS 수준(DHE 염색, PE 582/15 nm - MFI)을 나타내고, 도 2f는 아르테미시닌 (0.5μM), 5-ALA (0.25mM) 또는 Ppox 억제제(10μM) 처리된 신경아세포종 세포(SHSY5Y)의 세포 생존율을 나타낸다. DHE(ROS 수준)의 형광 및 세포 수(생존)를 유세포 분석 및 자동화된 세포 계수에 의해서 평가하였다. 실험은 각각 삼중으로 2번 수행되었다. 값은 평균 ± SD를 나타낸다.
도 3: 뇌 종양 오가노이드(CNS-PNET)는 아르테미시닌 및 5-ALA 조합 치료법에 대한 증가된 민감성을 나타낸다. 도 3a는 화합물 프로파일링을 위한 인간 뇌 원시신경외배엽 종양 오가노이드를 나타낸다. 도 3b는 5-ALA 및 아르테미시닌 처리된 오가노이드의 개략적인 작업 흐름 표현 및 분석을 나타낸다. 도 3c는 대표적인 형광을 나타내고 있고, 도 3d는 DMSO(대조군), 5-ALA(0.0625mM), 아르테미시닌(1μM), 또는 5-ALA 및 아르테미시닌(0.0625mM 및 1μM) 처리된 종양 오가노이드(CNS-PNET)의 명시야 이미지를 나타낸다. 오가노이드는 1일, 5일 및 7일째에 이미지 채취되었다. 척도 막대 500μm. 도 3e는 처리된 오가노이드의 GFP-양성 종양 면적의 이미지 분석 및 정량화를 나타내고 있다. 그룹 당 8개의 오가노이드가 3일째에 분석되었고, 1일에 대해서 표준화되었다. 데이터는 박스 플롯(box plot)(25번째-75번째 백분위수, 중간)으로서 나타내어져 있다. 도 3f는 해리된 뇌 종양 오가노이드의 유세포 분석을 나타낸다. 대조군(DMSO)에 대해서 표준화된 5일째의 조건 당 적어도 8개의 오가노이드의 GFP+ 종양 세포의 상대적인 백분율이 도시되어 있다. 데이터의 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간)이 표시된다. 도 3g는 해리된 종양 오가노이드(PE, 582/15 nm)의 ROS/DHE 염색 및 유세포 분석을 나타낸다. DHE 염색된 GFP+ 종양 세포 및 GFP- 대조군 세포의 평균 형광 세기(MFI)가 나타내어져 있다. n=2, 값은 평균 ± SD이다. 도 3h는 뇌 종양 오가노이드에서의 γH2AX+ 세포의 정량화를 나타내고 있다. 3 개의 오가노이드 각각의 6개의 크리오-섹션(cryo-section)을 γH2AX에 대해서 염색시키고, 스캐닝하고, 25개의 관심 부위(ROI 2.500μm²)를 조건 당 분석하였다. 가공되지 않은 수를 오가노이드 면적(ROI 당)에 대해서 표준화하였고, 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간)로서 나타내어져 있다.
도 4: 인간 아교모세포종-유사 종양 오가노이드 모델은 아르테미시닌 및 5-ALA 조합 요법에 대한 증가된 민감도를 나타낸다. 도 4a는 5-ALA 및 아르테미시닌 처리된 인간 뇌 종양 오가노이드의 대표적인 형광(좌측 패널) 및 명시야(우측 패널) 이미지를 나타낸다. 오가노이드를 1일째, 5일째, 8일째 및 11일째 모니터링하였다. 척도 막대 500μm. 도 4b는 처리된 오가노이드의 이미지 분석 및 정량화를 나타낸다. 11일째의 GFP-양성 종양 세포의 면적을 1일째에 대해서 표준화하였다. 데이터는 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간) n=4로서 나타내어져 있다. 도 4c는 5-ALA 및 아르테미시닌 처리된 환자 유래된 아교모세포종 회전 타원체(VBT92)의 대표적인 명시야 이미지이다. 이미지는 배양 및 처리 3일째에 취하였다.
도 5(도 1과 관련됨): 아르테미시닌 역가 곡선 및 포르피린 생합성 경로의 개관. 도 5a 및 도 5b는 아르테미시닌 처리된 마우스 ESC(도 5a) 및 일차 섬유아세포(도 5b) 뿐만 아니라 마우스(B16F10, 4T1) 및 인간(MDA-MB-231, Mcf7, Panc1) 암 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 생존율은 Alamar Blue 염색을 이용하여 처리 48 시간 후에 평가되었다. 도 5c는 아르테미시닌 스크린으로부터의 포르피린 생합성 경로 성분 적분 부위를 나타낸다. 유전체 위치 및 표적된 인트론 뿐만 아니라 포르피린 생합성 유전자의 엑손(즉, 효소, 볼드) 뿐만 아니라 포워드(검은색) 및 역(회색) 가닥에 대한 레트로바이러스(상부 패널) 또는 Tol2 트랜스포솜(하부 패널) 적분 부위(수직 막대)가 나타내어져 있다.
도 6(도 2와 관련됨): 암 세포주에서의 생존율, ROS 생산, 및 미토콘드리아 막 전위에 대한 아르테미시닌 및 5-ALA 조합 치료의 효과. 도 6a는 5-ALA(0.5mM)의 존재 및 부재 하의 아르테미시닌 처리된 마우스 암 세포(Mcf7 - 유방암; B16F10 - 흑색종)의 세포 생존율을 나타낸다. Alamar Blue를 사용하여 48 시간 후의 생존율을 측정하였다. 도 6b 및 도 6c는 5-ALA의 존재 또는 부재 하의 아르테미시닌 처리된 일차 인간 아교모세포종 세포의 세포 생존율을 나타낸다. CellTiter-Glo를 상요하여 생존율, 72 시간을 평가하였다. 값은 평균 ± SD이다. 도 6d 및 도 6e는 페이퍼롱구민(piperlongumine) 또는 아르테미시닌 처리된 Jurkat 세포(도 6d) 및 HL-60 세포(도 6e)(48h)의 ROS/DHE 염색 및 유세포 분석을 나타낸다. 값은 평균 ± SD이다. 도 6f는 ROS 수준(DHE 염색, PE 582/15 nm - MFI)을 나타내고, 도 6g는 세포 생존율을 나타내고 도 6h는 아르테미시닌(0.5μM), 5-ALA(0.25mM) 또는 Ppox 억제제(10μM) 처리된 Jurkat 세포, 48h의 JC-1 수준을 나타낸다. JC-1 음성 세포는 아폽프토시스 세포 사멸(apoptotic cell death)과 연관된 손상된 미토콘드리아 막 전위를 갖는다. DHE 형광, 상대적인 세포 수 및 JC-1 음성 세포의 백분율을 고-처리량 유세포 분석 및 자동화된 세포 계수를 이용하여 평가하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었으며, 1회(JC-1) 또는 2회(DHE, 세포 생존) 반복되었다. 값은 평균 ± SD이다.
도 7 (도 3과 관련됨): CNS-PNET 종양 오가노이드 내의 암 세포 집단이 아르테미시닌 및 5-ALA 조합 요법에 높은 민감도를 나타낸다. 도 7a는 해리된 CNS-PNET 종양 오가노이드의 생포 생존율을 나타낸다. 대조군(DMSO)에 대해서 표정된 처리된 오가노이드의 GFP+ 종양 세포 및 GFP- 대조군 세포의 정량화가 나타내어져 있다. 데이터는 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간)로서 나타내어져 있다. 도 7b는대조군(DMSO), 5-ALA (0.0625mM), 아르테미시닌 (1μM) 또는 5-ALA + 아르테미시닌(0.0625mM 및 1μM) 처리된 뇌 종양 오가노이드의 대표적인 형광(좌측 패널) 및 명시야(우측 패널) 이미지를 나타낸다. 척도 막도 500μM. 도 7c는 1일째와 비교된 처리 5일째의 GFP-양성 종양 면적의 이미지 정량화를 나타낸다. 데이터의 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간)이 나타내어져 있다. 도 7d는 아르테미시닌 및 5-ALA 처리된 오가노이드의 항-Sox2, 항-GFP 및 DAPI 염색된 색션의 대표적인 이미지를 나타낸다. 척도 막대 50μm.
도 8(도 3과 관련됨): 아르테미시닌 및 5-ALA 처리 후의 CNS-PNET 종양 오가노이드 섹션의 염색. 대조군 및 처리된 종양 오가노이드의 고정된 크리오-섹션의 대표적인 형관(항-GFP, DAPI) 및 H&E(해마톡실신(haematoxylin) & 에오신 염색됨) 이미지. 로제트-유사 구조(R) 또는 종양 조직(T)의 영역이 나타내어져 있고 확대되어 있다(6.8x). 척도 막대 500μM.
도 9(도 3과 연관됨): 아르테미시닌 및 5-ALA 처리 후의 CNS-PNET 종양 오가노이드의 분석. 도 9a는 ROS/DHE 염색된 해리된 종양 오가노이드의 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다. GFP+ 종양 세포 및 GFP- 야생형 세포의 유세포 분석(PE, 582/15 nm)이 나타내어져 있다. 도 9b는 γH2AX, GFP 및 DAPI 염색된 종양 오가노이드 섹션의 대표적인 현미경 이미지를 나타낸다. 척도 막대 50μM. 도 9c는 γH2AX 염색되고 스캐닝된 종양 오가노이드 슬라이드의 대표적인 이미지 및 분석 마스크(analysis mask)를 나타낸다.
도 10(도 3과 연관됨): 아르테미시닌 및 5-ALA 처리 후의 CNS-PNET 종양 오가노이드의 연속된 분석. 도 10a는 5-ALA 및 아르테미시닌 처리된 종양 오가노이드 내의 Caspase 3(Casp3) 및 B Ki67-양성 세포의 정량화를 나타낸다. 조건 및 그룹 당 3 개의 오가노이드, 각각 6 개의 섹션을 Caspase3 또는 Ki67으로 염색하였고, 고-배율 형광 스케너를 사용하여 이미지화시켰고, 25 개의 관심 영역(ROI 2.500μm²)을 선택하고 분석하였다. Casp3 또는 Ki67 양성 세포의 수를 분석된 면적(ROI 당, GFP+ 또는 GFP-)로 표준화였고, 박스 플롯(중간, 25번째 내지 75번째 백분위수)로서 나타내어져 있다. 도 10c는 항-Casp3, 항-GFP 및 DAPI 염색된 섹션의 대표적인 이미지를 나타낸다. 척도 막대 50μm.
도 11(도 4와 관련됨): 인간 아교모세포종-유사 종양 오가노이드 모델의 아르테미시닌 및 5-ALA 조합 치료. 도 11a는 5-ALA 및 아르테미시닌 처리된 뇌 종양 오가노이드의 형광 이미지를 나타낸다. 오가노이드를 1일째, 5일째, 8일째 및 11일째에 모니터링하였다. 도 11b는 처리된 오가노이드의 GFP-양성 종양 면적의 이미지 분석 및 정량화를 나타내고 있다. 오가노이드를 8일째에 분석하였고, 1일째에 대해서 표준화하였다. 데이터는 박스 플롯(25번째-75번째 백분위수, 중간)로서 나타내어져 있다.
도 12: 아르테미신신(Artemisinsin (ART)) 및 이의 유도체 디하이드로아르테미시닌(DHA) 및 아르테수네이트(ARS)는 5-아미노레뷸린산(5-ALA)와 조합되는 때에 아교모세포종 세포주 및 마우스 배아 줄기 세포(ESC)에 상승작용 항증식성 효과를 발휘한다.
아르테미시닌 화합물 및 5-ALA의 6일 역가 곡선이 나타내어져 있다. 도 12a 내지 도 12r은 미처리 대조군과 비교된 ART 투여(도 12a, 도 12d, 도 12g, 도 12j, 도 12m, 도 12p), 또는 DHA 투여(도 12b, 도 12e, 도 12h, 도 12k, 도 12n, 도 12q) 또는 ARS 투여(도 12c, 도 12f, 도 12i, 도 12l, 도 12o, 도 12r)과 조합으로 5-ALA 처리된 아교모세포종 세포주(표시된 바와 같이) 및 ESC의 세포 생존율을 나타낸다. 값은 ≥ 3의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율을 표시한다.
도 13: 5-ALA와 조합된 ART 또는 DHA는 아교모세포종 세포주 및 ESC 내의 테모졸로미드(TMZ)의 항증식성 효과를 증가시킨다.
도 13a 내지 도 13l은 미처리 대조군과 비교된 ART 투여(도 13a, 도 13c, 도 13e, 도 13g, 도 13i, 도 13k) 또는는 DHA 투여(도 13b, 도 13d, 도 13f, 도 13h, 도 13j, 도 13l)와 조합으로 5-ALA 및 TMZ 처리된 아교모세포종 세포주(표시된 바와 같이) 및 ESC를 나타낸다. 값은 ≥ 5의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 TMZ 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.
도 14: 5-ALA 또는 메틸-5-ALA와 조합된 ARS가 아교모세포종 세포주 및 ESC 내의 테모졸로미드(TMZ)의 항증식성 효과를 증가시킨다. 5-ALA가 본 셋업에서 메틸-5-ALA가 더욱 효능적이다.
도 14a 내지 도 14l은 미처리 대조군과 비교된 ARS 투여와 조합으로 5-ALA 및 TMZ 처리된 아교모세포종 세포주(표시된 바와 같이) 및 ESC를 나타낸다. 값은 ≥ 5의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 TMZ 처리 단독 시의 생존율을 표시한다. 값은 ≥ 3의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 TMZ 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.
도 15: 5-ALA와 조합된 ART가 아교모세포종 세포주 및 ESC에서의 로무스틴 (CCNU) 처리의 항증식성 효과를 상승시킨다.
도 15a 내지 도 15f는 미처리 대조군과 비교한 ART 투여와 조합으로의 5-ALA 및 CCNU 처리된 아교모세포종 세포주(표시된 바와 같음) 및 ESC를 나타낸다. 값은 ≥ 4의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 CCNU 처리 단독에 의한 생존율을 표시한다.
도 16: 5-ALA와 조합된 ART, DHA, 또는 ARS가 두 가지 폐암 세포주에서의 시스플라틴(CP) 및 5-플루오로우라실(5-FU) 처리의 항증식성 효과를 상승시킨다.
도 16a 내지 도 16l은 미처리 대조군과 비교한 ART 투여(도 16a, 도 16d, 도 16g, 도 16j) 또는 DHA 투여(도 16b, 도 16e, 도 16h, 도 16k) 또는 ARS 투여(도 16c, 도 16f, 도 16i, 도 16l)와 조합으로의 5-ALA 처리된 폐암 세포주(표시된 바와 같음)의 세포 생존율을 나타낸다. 값은 ≥ 4의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및화학 요법 (시스플라틴 또는 5-FU) 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.
도 17: 5-ALA와 조합된 ART, DHA, 또는 ARS가 HepG2 세포(간암)에서의 시스플라틴(CP) 및 5-플루오로우라실(5-FU) 처리의 항증식성 효과를 증가시킨다.
도 17a 내지 도 17f는 미처리 대조군과 비교한 ART 투여(도 17a, 도 17d), 또는 ARS 투여(도 17c, 도 17f) 및 시스플라틴(도 17a 내지 도 17c) 또는 5-FU (도 17d 내지 도 17f) 컨디셔닝과 조합으로의 5-ALA 처리된 HepG2 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 값은 ≥ 4의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 화학 요법 (시스플라틴 또는 5-FU) 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.
도 18: 5-ALA와 조합된 ART, DHA, 또는 ARS가 MD-MBA-231 세포(유방암)에서의 시스플라틴 및 5-플루오로우라실(5-FU) 처리의 항증식성 효과를 증가시킨다.
도 18a 내지 도 18f는 미처리 대조군과 비교한 ART 투여(도 18a, 도 18d), 또는 DHA 투여(도 18b, 도 18e) 또는 ARS 투여(도 18c, 도 18f) 및 시스플라틴(도 18a 내지 도 18c) 또는 5-FU (도 18d 내지 도 18f) 컨디셔닝과 조합으로의 5-ALA 처리된 MD-MBA-231 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 값은 ≥ 4의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 화학 요법 (시스플라틴 또는 5-FU) 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.
도 19: 5-ALA와 조합된 ART, DHA, 또는 ARS가 MiaPaca-2 세포(췌장암)에서의 시스플라틴 및 5-플루오로우라실(5-FU) 처리의 항증식성 효과를 증가시킨다.
도 19a 내지 도 19f는 미처리 대조군과 비교한 ART 투여(도 19a, 도 19d), 또는 DHA 투여(도 19b, 도 19e) 또는 ARS 투여(도 19c, 도 19f) 및 시스플라틴(도 19a 내지 도 19c) 또는 5-FU (도 19d 내지 도 19f) 컨디셔닝과 조합으로의 5-ALA 처리된 MiaPaca-2 세포의 세포 생존율을 나타낸다. 값은 ≥ 4의 독립적인 실험으로부터의 평균 ±SEM이다. 점선은 100% 생존율 및 화학 요법(시스플라틴 또는 5-FU) 처리 단독 시의 생존율을 표시한다.

실시예

재료 및 방법

포유동물 조직 배양

마우스 배아 줄기 세포 클론(클론 AN3-12){Elling:2011gla}을 10% 소 태아 혈청(FCS), 페니실린-스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트(1 mM), l-글루타민(2 mM), β-메르캅토에탄올 (0.1 mM), 및 LIF(20μg ml-1)로 보충된 DMEM에서 배양하였다. SH-SY5Y 세포를 10% FCS(태아 송아지 혈청), 페니실린-스트렙토마이신, 및 L-글루타민으로 보충된 DMEM/F12 1:1에서 배양하였다. 4T1 세포를10% 태아 송아지 혈청(FCS), 페니실린-스트렙토마이신 및 L-글루타민으로 보충된 IMDM에서 배양하였다. MEFs, Mcf7, MDA-MB-231, Panc1, LN229, A549, MiaPaca-2, B16F10 및 PlatE 세포를 10% FCS, 페니실린-스트렙토마이신 및 L-글루타민으로 보충된 DMEM에서 배양하였다. HepG2-, T98G-, 및 U87MG 세포를 EMEM에서 배양하였고, SHP77-, VBT92-, 및 VBT281 세포를 RPMI에서 배양하였고, 이들 각각은 10% FCS, 페니실린-스트렙토마이신 및 L-글루타민으로 보충되었다. 모든 세포를 20% O₂ 및 5% CO₂ 상에서 37℃에서 배양하였다.

세포주

마우스 AN3-12 ESC 세포주를 본 발명자들의 실험실에서 생성시켰고 앞서 기재된 바와 같이 특성화시키고 인증되었다{Elling, U. et al. Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells. Cell stem cell 9, 563-574 (2011)}. 반수체 쥐 ESC를 삽입 돌연변이 생성 및 유전자 트랩 녹아웃 세포주의 유도를 위해서 사용하였다. SH-SY5Y를 공급자(Sigma Aldrich)로부터 직접적으로 얻었고, 성장 분석 및 세포 염색을 위해서 사용하였다. 시험관내 생존율 및 DHA 분석에서 사용되는 Jurkat 세포는 인-하우스(in-house) 공급원으로부터 얻었으며, 다른 곳에서 기능적으로 설명되어 있다{Reikerstorfer, A., Holz, H., Stunnenberg, H. G. & Busslinger, M. Low affinity binding of interleukin-1 beta and intracellular signaling via NF-kappa B identify Fit-1 as a distant member of the interleukin-1 receptor family. The Journal of biological chemistry 270, 17645-17648 (1995)}. Mcf7, MDA-MB-231, 4T1, Panc1 및 B16F10 암 세포주를 인 하우스(in house)에서 얻었다. MEF를 본 발명자들의 실험실에서 생성시키고 얻었다. PlatE 세포를 앞서 기재된 바와 같이 재조합 레트로바이러스 및 렌티바이러스 생산을 위해서 사용하였다{Taubenschmid, J. et al. A vital sugar code for ricin toxicity. Cell Research 27, 1351-1364 (2017). Stadlmann, J. et al. Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 538-542 (2017)}. 모든 세포주는 마이코플라즈마(mycoplasma)에 대해서 음성인 것으로 시험되었다. ICLAC에 의해서 열거된 세포주는 사용하지 않았다.

경쟁적 성장 분석

노믹 인트론(nomic intron) 내의 유전자 트랩(gene trap)을 함유하는 반수체 ESC를 정상 ESC 성장 배지에 저밀도로 씨딩하고, 12 시간 동안 두 가지의 바이러스, 즉, mCherry와 Cre 재조합효소를 인코딩는 바이러스와 GFP를 코팅하는 다른 바이러스로 감염시켰으며, 둘 모두 퓨로마이신(Invivogen, ant-pr-1)과 함께 감염시켰다. 감염된 세포를 24 시간 후에 선택(퓨로마이신의 최종 농도, 1 μg/ml)하고 확장시켰다. 아르테미시닌의 존재 및 부재 하에 GFP- 대 mCherry/Cre-발현 세포의 비율을 고-처리량 유세포 분석(BD LSRFortessa HTS Cell Analyzer))을 이용하여 측정하였다.

세포주에서의 화합물 프로파일링

투여량 반응을 위해서, 세포를 96-웰(25.000/ 96-웰, 삼중으로 - 표시된 경우)에 씨딩(seeding)하고, 48 시간 동안 화합물에 가하였다. 세포 생존율을 자동화된 세포 계수(고-처리량 유세포 분석)를 이용하여 평가하였다. 각각 Alamar Blue 염색(Invitrogen, DAL1100) 또는 CellTiter-Glo 발광 분석(Promega, G7570, 제조자의 원안에 따름).

세포 생존율 분석(도 12 내지 19)을 기술적인 이중으로 96-웰 플레이트에서 수행하엿다. 처리를 세포 플레이팅 24 시간 후에 시작하였고, Cell Titer Glo 2.0 발광 분석(Promega, G9242)에 의한 세포 생존율 평가 전에 6일 동안 지속시켰다.

디하이드로에티듐(DHE) 염색

처리된 세포를 수거하고, 1x HBSS(Ca2+ 및 Mg2+ 없이) 세척하고, 1x HBSS중의 1mM DHE(디하이드로에티듐(하이드로에티딘), Invitrogen, D11347)로 45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, 2회 세척하고, 얼음 상에서 10분 동안 DAPI 또는 생존율 염료(viability dye)(eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 780, 65-0865-18)로 대조 염색하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 정제(strain)하고, 레드 형광 스펙트럼 (PE 채널)에서 DHE에 대해서 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.

JC-1 염색

세포를 수거하고, 1xPBS로 세척하고, 1PBS(MitoProbe JC-1 Assay Kit-1, Invitrogen, M34152) 중의 2μM JC-1와 함께 35분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 2회 세척하고, 레드 형광 스펙트럼 (PE 채널) 및 그린 형광 스펙트럼(FITC 채널)에서 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.

뇌 오가노이드 형성

뇌 오가노이드를 앞서 기재된 바와 같이 생성시켰다{Lancaster, M. A. et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379 (2013)}. 인간 배아 줄기 세포(feeder-free H9, WiCell)를 웰 당 9.000 세포의 밀도로 저-부착 96-웰-플레이트(Corning) 내로 옮기고, 인간 줄기 세포 배지 내에서 인큐베이션하였다. 6일 후에, 배지를 둘베코 변형된 이글 베지(Dulbecco's modified eagle medium) DMEM/F12, N2 보충물(Invitrogen), Glutamax(Invitrogen), 최소 필수 배지-비필수 아미노산(MEM-NEAA) 및 1μg/ml 헤파린(Sigma)를 함유하는 신경 유도 배지로 변경하여 외배엽 조직의 성장을 촉진시켰다. 11일째에, 배양체(embryoid body(EB))를 Matrigel 점적 내에 매립하고, 10cm 플레이트 상에 EM/F12: Neurobasal 1:1, N2 보충물(Invitrogen), B27 보충물(비타민 A 없이) (Invitrogen), 50μM 2-메르캅토에탄올, 1:4,000 인슐린(Sigma), Glutamax (Invitrogen), 페니실린-스트렙토마이신, MEM-NEAA를 함유하는 분화 배지에 옮겼다. 5일 후에, 오가노이드를 궤도 쉐이커(orbital shaker)에 옮기고, 비타민 A(B27 보충물 중)를 함유하는 분화 배지에서 유지시켰다.

뇌 종양 오가노이드 형성 + 뉴클레오펙션(Nucleofection)

종양 개시를 슬리핑 비유티(Sleeping Beauty (SB)) 유전자전위효소를 사용한 종양 유전자 증폭 또는 일령 10일의 배양체(embryoid body(EB)) 중의 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 종양 억제 유전자의 돌연변이에 의해서 유도하였다. 유전자 전위 효소뿐만 아니라, GFP 및 요망되는 종양 유전자 또는 발현 Cas9 뉴클레아제를 함유하는 플라스미드를 전기영동에 의해서 도입하였다. 요약하면, 1μg DNA 및 100μl 뉴클레오펙터(nucleofector) 용액의 혼합물을 10 EB에 첨가하고, 뉴클레오펙션 큐벳(nucleofection cuvette)에 옮겼다. 전기영동/뉴클레오펙션을 위해서 론자 뉴클레오펙터 2b(Lonza Nucleofector 2b) 및 A-023 프로그램을 사용하였다. 그 후에, EB를 비타민 A를 함유하는 분화 배지를 함유한 10cm 디쉬(dish)에 옮기고, 24 시간 후에 Matrigel 내로 매립시켰다. 두 가지의 상이한 유형의 종양이 시작되었다{Bian:2018gs}: 중추 신경계 원시 신경외배엽 종양(CNS-PNET)을 Myc의 과발현에 의해서 유도하였다. 아교모세포종-유사 종양 그룹 2(GBM-2)를 종양 억제 유전자 p53, NF1 및 PTEN의 돌연변이 생성에 의해서 유발시켰다. 모든 플라스미드를 Shan Bian에 의해서 설계되었다{Bian, S. et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat. Methods 15, 631-639 (2018)}.

뇌 종양 오가노이드에서의 화합물 프로파일링

뇌 종양 오가노이드를 상이한 화합물로 처리하고, 형질전환된 뉴런뿐만 아니라 형질전화되지 않은 뉴런의 생존 및 성장을 모니터링하였다. 종양 세포의 형광 표지화는 명시야 현미경뿐만 아니라 형광 이미지화를 사용한 실험 전체에 걸쳐서 비-표지된 것에 비해서 형질전환된 세포의 명확한 차별성을 가능하게 하였다. 동일한 오가노이드 내의 형질전환된 종양 조직 및 비형질전환된 뉴런을 실험 전체에 걸쳐서 형광 이미지화뿐만 아니라 명시야 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 처리의 마지막에(각각 5일째 또는 7일째), GFP-양성 세포의 수를 유세포 분석에 의해서 평가하였다.

뇌 종양 오가노이드의 유세포 분석

뇌 (종양) 오가노이드를 1x 트립신을 사용하여 효소적으로 그리고 기계적으로 해리시키고, 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, 가볍게 쉐이킹(shaking)하였다. 오가노이드를 주의해서 재현탁에 의해서 단일화시키고, 분화 배지를 첨가하고, 스트레이닝(straining)(Cell Strainer Cap을 구비한 Falcon Round-Bottom Tube, 5 mL, 35 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너 스냅 캡(nylon mesh cell strainer snap cap))시켰다. 현탁액 내의 단일 세포들을 DAPI 또는 생존율 염료(eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 780, 65-0865-18)로 대조 염색시키고, 유세포 분석(BD LSRFortessa HTS Cell Analyzer)을 이용하여 분석하였다. GFP-양성 세포의 양을 분석하였다.

뇌 종양 오가노이드의 이미지화

5-ALA 또는 아르테미시닌 처리된 오가노이드를 Axio Vert.A1 도립 현미경 시스템(Zeiss Objective EC Plan-Neofluar 2.5x/0.085 Pol M27, 0.5 camera adapter)을 사용하여 지시된 시점에서 이미지화시켰다. 명시야 및 그린 형광 이미지를 동일한 영역으로부터 취하였다. 추가로, 이미지 분석을 위해서, Celldiscoverer 7 (Zeiss), 즉, 완전 일체화된 고급 자동화 라이브 세포(live cell) 이미지화 시스템을 사용하였다.

면역 조직 화학 염색

뇌 오가노이드를 4% PFA(실온, 1 시간)에서 고정시키고, 30% 수크로오스(4℃, o/n), OCT (Tissue-tek OCT Compound, SANOVA PHARMA GESMBH, 4583)과 함께 인큐베이션시키고, 매립시키고, 20μm 섹션을 저온유지 절단하였다((-12/-14℃). 염색을 위해서, 섹션을 차단하고, PBS 중의 0.25% Triton X-100, 4% 당나귀 혈청 중에 실온에서 1 시간 동안 투과시키고, PBS 중의 0.1% Triton X-100, 4% 당나귀 혈청 중에 희석된 일차 항체로 실온에서 밤새 염색시키고, PBS 중의 0.1% Triton X-100, 4% 당나귀 혈청 중에 희석된 일차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시키고, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디락테이트, Invitrogen, D3571)로 실온에서 20분 동안 대조 염색시켰다. 형광 봉입제(Fluorescence Mounting Medium)(Dako, S302380)를 샘플 슬라이드를 탑재하기 위해서 사용하였다. 오가노이드를 레이저 조명(Laser Diode 405 - 25mW, Argon 458, 488, 514 - 30mW, DPSS 561 - 15mW, HeNe 633 - 5mW)을 사용한 20x/0.8 플레인-아포크로매트 대물렌즈(plan-Apochromat objective)(Carl Zeiss)를 통해서 표준 필터 세트(CH1: 371-735, CH2: 479-735, CH3 Quasar (GaAsP): 416-690)를 구비한 LSM780 Axio Imager(45% 의 QE 및 최대 2x SNR를 갖는 점 레이저 스캐닝 공초점 현미경 GaAsP(갈륨 아르제나이드) 검출기) 상에서 이미지화시켰다.

통계 및 재현성

도 1 내지 도 11에서의 모든 값은, 달리 언급되지 않는 한, 평균 ± SD로서 주어진다. 모든 실험은 2 내지 7개의 독립적인 시간에서 재현되었고 유사한 결과를 얻었다.

GraphPad Prism을 사용하여 피겨(figure)를 생성시키고, 통계학적 분석(GraphPad Software)을 수행하였다. 선험적인 샘플 크기 평가는 수행되지 않았다. 실험은 무작위가 아니었다. 조사자들은 실험 및 결과 평가 중에 할당에 대해 맹검으로 하지 않았다. 데이터를 지시된 바와 같이 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-테스트(unpaired two-tailed Student's t-test)를 사용하여 분석하였다. P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 받아 들여졌다. 박스 및 휘스커(whisker) 플롯을 중앙값 및 첫 번째로부터 세 번째 사분위수의 범위로 묘사하다.

도 12 내지 도 19에 나타낸 데이터의 경우에, 모든 값은 +SEM으로 주어진다. 데이터는 실험 셋업과 함께 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-시험을 사용하여 분석되었다. 유의성은 다음과 같이 표시된다: * p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

Claims

약제학적 조성물로서,
a) 아르테미시닌 화합물(artemisinin compound)(1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;
b) 5-아미노레뷸린산(2), 메틸-5-아미노레뷸린산(2b), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물; 및
c) 적어도 하나의 화학요법제(chemotherapeutic agent), 바람직하게는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물(anti-glioblastoma drug)을 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
아르테미시닌 화합물(1)은 하기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물로부터 선택되는, 약제학적 조성물:

.
제1항 또는 제2항에 있어서,
항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드, 덱사메타손, 로무스틴, 메토트렉세이트, 에베로리무스, 카르무스틴, 사이클로포스파미드, 시스플라틴, 카르보플라틴, 5-플루오로우라실, 트립톨리드, 호모해링토닌, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 리바비린, 토포테칸, 플루벤다졸, 이트라코나졸, 빈데신 설페이트, 세리바스타틴, 빈크리스틴, 비노레빈, 니솔다이핀, 데옥시아데노신, 클로로-2'-데옥시아데노신, 5-노닐옥시트립타민, 2(1H)-피리미디논, 피타바스타틴, 세르트랄린, 이리노테칸, 클로파지민, 및 도세탁셀을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
아르테미시닌 화합물(1)과 5-아미노레뷸린산(2) 또는 메틸-5-아미노레뷸린산(2b)의 몰 비율은 1:5 내지 1:5000의 범위에 있는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 항-아교모세포종 약물은 테모졸로미드(temozolomide), 로무스틴(lomustine), 시스플라틴,(cisplatin) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a)
로부터 선택된 아르테미시닌 화합물(1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 공결정, 또는 용매화물;
b) 5-아미노레뷸린산(2) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물; 및
c) 테모졸로미드, 로무스틴, 시스플라틴, 및 5-플루오로우라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-아교모세포종 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
의학에서 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
조혈성 암(hematopoietic cancer), 뇌암(brain cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간암(liver cancer), 유방암(breast cancer), 및 폐암(lung cancer) 및 바람직하게는 뇌암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,
약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 시럽, 용액, 현탁액, 에멀션, 또는 겔의 형태인, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
약제학적 조성물은 경구, 인트라테컬(intratecal), 정맥내, 피하, 비경구 적용에 의해서 또는 흡입에 의해서 투여되는, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
아르테미시닌 화합물(1)은 일일 체중 당 0.01 내지 100 mg/kg의 범위로 투여되고, 5-아미노레뷸린산 또는 메틸-5-아미노레뷸린산이 일일 체중 당 0.01 내지 200 mg/kg의 범위로 투여되는, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 항-아교모세포종 약물은 일일 체중 당 0.01 내지 100 mg/kg의 범위로 투여되는, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
뇌암은 서브타입, 전신경(PN), 중간엽(MES) 및 클래식(CL) 아교모세포종으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
조혈성 암, 뇌암, 췌장암, 간암, 유방암, 및 폐암 및 바람직하게 뇌암의 예방 및/또는 치료는 방사선 요법, 면역 요법, 전자기장 요법, 고열 요법, 화학요법, 암 면역 요법 및/또는 어떠한 다른 소분자 기반 요법(any other small molecule based therapy)과 조합으로 수행되는, 약제학적 조성물.