KR20220151426A - 병원성 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주요 병원성 비브리오 종들의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 병원성 인자의 발현을 교란 혹은 억제시켜 치명적인 병원성 세균에 의한 질병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

병원성 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting the expression of virulence factors in pathogenic Vibrio species}

본 발명은 세균의 병원성 인자 발현 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

병원성 비브리오(pathogenic Vibrio) 종은 인간과 동물에 치명적인 감염성 질환을 유발하며 오늘날 인류에게 커다란 피해를 야기하고 있다(예, Vibrio cholerae - 콜레라, V. vulnificus - 패혈증, V. haemolyticus - 설사병, V. anguillarum - 어병 등). 현재 이들 질병을 치료하기 위하여 일부 항생제를 사용하고 있으나, 그 효과가 높지 않으며, 또한 최근 문제가 되고 있는 항생제 내성 문제 등으로 인하여 적절한 새로운 항생제 개발 필요성이 대두되고 있다. 특히 기존의 항생제들은 세균의 성장을 억제하거나 죽이는 작용 메커니즘을 가지고 있다. 이러한 특징들은 병원성 세균 내에 발생하는 돌연변이나 혹은 항생제 저항 유전자의 획득 등을 통하여 항생제에 내성을 가진 개체들의 자연선택(natural selection)을 일으키는 강력한 자연선택압력(Selection pressure)으로 작용하게 된다. 그러므로 생태계에 있는 세균 종들은 점점 인간이 개발한 항생제에 내성을 가진 개체들이 우점종으로 대체되는 결과를 낳게 된다. 이러한 기존의 항생제의 문제점들을 극복하기 위한 전략으로서 병원성 비브리오 종에 대해 특이적으로 나타나는 병원성 인자들의 발현을 조절하는 신호전달체계를 교란 혹은 억제함으로써 세균들의 생장에는 영향을 미치지 않고 병원성 인자의 정상적인 발현을 억제함으로써 발병 요인을 제거하는 방법에 대한 연구가 요구된다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제2171321호는패혈증 비브리오균에서 특이적으로 나타나는 독소인 Rtx 독소 생성 저해제를 이용한 치료제를 제시하고 있으며, 등록특허 제11243696호는 의사소통에 관여하는 신호단백질 SmcR의 저해제를 이용한 병원성 억제제에 관하여 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 그 타겟 단백질이 본 발명과는 상이하고 패혈증 비브리오균에만 적용될 수 있는 증식 억제 용도에 관한 것으로 다양한 비브리오균의 병원성인자 발현을 억제할 수 있는 항병원성 조성물에 대한 기술은 미개척 분야이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 모든 비브리오균들만 특이적으로 가지고 있는 ToxR 신호수용체 막단백질을 타겟으로 함으로써 주요 병원성 비브리오 종들의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 병원성 인자의 발현을 교란 혹은 억제시켜 치명적인 병원성 세균에 의한 질병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 비브리오균 감염증 치료용 약학적 조성물이 제공된다:

(화학식 1).

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비브리오 감염증 예방용 사료첨가제가 제공된다:

(화학식 1).

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오균에 의한 감염증 치료방법이 제공된다:

(화학식 1).

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 비브리오균의 병원성인자 발현 억제용 약학적 조성물은 기존의 세균의 생장을 억제하는 항생제의 작용 메커니즘을 넘어서 세균의 생장에는 유의적으로 영향을 미치지 않고 병원성 인자의 발현을 억제함으로써 항병원성 효과가 있는 조성물을 개발할 수 있다. 또한 상기 조성물을 이용하여 패혈증 비브리오균 및 비브리오 콜레라균에 의한 발병, 및 cFP 조절 네트워크를 가지고 있는 병원성 비브리오 종들의 병원성을 억제할 수 있는 치료제로 활용가능하다. 따라서 항생제의 오남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점, 식품 내의 항생제 잔류문제, 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 비브리오균 병원성 인자 발현 cFP 조절 네트워크의 신호전달 과정을 억제하는 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 2는 패혈증 비브리오균을 대상으로 cFP 신호전달 네트워크에 있어서 신호 수용체 막단백질인 ToxR의 하단부 주요조절자인 LeuO의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해 구축한 리포트 시스템의 구조를 나타내는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 V. vulnificus의 leuO 전사량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 V. vulnificus의 H₂O₂에 대한 저항성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 V. vulnificus의 vvhA 전사량을 결과를 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 V. cholerae의 외독소 코딩 유전자인 ctx의 전사량을 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 V. vulnificus에 감염된 마우스의 생존율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 인간 HaCat 세포의 생존율 결과를 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 인간 HaCat 세포의 표현형을 분석한 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 화합물 SG0020 처리에 따른 인간 Raw 세포의 사이토카인 발현량 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "비브리오(Vibrio)"는 지금까지 34종이 알려져 있는데, 그람 음성균이고 세포 모양이 막대형(rod-shape)이며 휘어져 있고, 단립하거나 몇 개가 연결되어 나선상이 되는 특징이 있다. 몸의 한쪽 끝에는 1개 또는 여러 개의 편모가 나 있고, 이것으로 활발히 유영하여 움직인다. 비브리오는 야생종은 바다에 널리 분포하며, 담수와 토양에서도 많이 발견된다. 비브리오 중에는 사람이나 어패류에서 병원성을 나타내는 종이 많은데, 병원성이 있는 대표 종으로는 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(V. vulnificus), 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus)가 있다.

발명의 상세한 설명:

본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 비브리오균 감염증 치료용 약학적 조성물이 제공된다:

(화학식 1).

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 비브리오균은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus) 등이 병원성 비브리오종으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고 leuO, VvhA 및 ctxAB 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 병원성 인자의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비브리오 감염증 예방용 사료첨가제가 제공된다:

(화학식 1).

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오균에 의한 감염증 치료방법이 제공된다:

(화학식 1).

본 발명의 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 직접 투여하거나, 개체의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 비브리오균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료방법에서 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 투여되는 약학적 조성물의 적합한 총 1 일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 비브리오균에 의한 질병은 장염비브리오성 식중독, 콜레라, 비브리오 패혈증 및 어류 비브리오 감염증인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은, 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 혼합하여 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜, 기타 상용되는 것을 포함한다. 경구투여용 고체 조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체 조성물에서는 유효성분인 식물 추출물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 고체 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트등의 물질로 이루어진 필름으로 피복될 수 있고, 경우에 따라서는 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다. 경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제, 현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염수가 포함된다. 비수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80^ㄾ 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균 방법으로 무균화될 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 시에 용해시켜 사용할 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다. 바람직하게는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 물론 경구투여방법도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환축 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환축의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 1 내지 500mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

현재 비브리오균(vibrio)에 의한 질병을 치료하기 위하여 일부 항생제가 사용되고 있으나 효과가 높지 않고 최근 문제가 되고 있는 항생제 내성 문제 등으로 인하여 적절하고 새로운 항생제 개발이 요구되고 있다. 한편, 병원성 미생물은 숙주(host)에 독성을 나타내는 여러 독성인자(virulence factor)의 생성을 통해 숙주 내에서 생존하고 증식하며, 발병 과정 동안 다양한 독성 인자들이 총체적으로 발현되고 작용할 수 있도록 하는 조절 기전을 발달시켜 왔다. 이러한 독성 인자들의 조절 기전은 매우 정교하며, 조절 기전을 저해함으로써 독성인자의 생성을 억제할 수 있다. 이를 통해 병원성 미생물의 독성을 약화시킬 수 있고, 숙주의 면역 반응에 의해 미생물의 독성을 쉽게 저해할 수 있게 된다. 독성 인자의 생성 기전 저해는 미생물의 생장을 인위적으로 저해하지 않기 때문에 항생제 내성을 유발할 가능성이 매우 낮아, 새로운 병원성 미생물 치료 전략 중 하나로 최근 들어 전문가들 사이에서 크게 주목받고 있다. 하지만, 현재까지는 특정 미생물에 한정된 연구만이 활발히 진행되고 있으며, 그 외의 병원성 미생물에 관한 독성 인자 생성 조절 기전의 저해에 관한 연구는 미진한 실정이다.

이에 본 발명자들은 인간에 질병을 일으키는 병원성 비브리오균의 병원성을 억제하는 물질을 개발하기 위하여 병원성 비브리오균의 병원성 인자 발현 신호전달체계의 신호전달과정을 완전히 규명하고, 이 과정을 억제하는 물질을 탐색하였다. cFP 조절 네트워크에 있어서 처음 신호를 수용하는 막수용단백질인 ToxR의 작용을 억제하는 물질을 탐색하고 그러한 역가가 있는 물질들을 찾아내어, 상기 물질들 중 패혈증 비브리오균의 생장에는 영향을 미치지 아니하면서 인간 세포에 독성이 없고, 병원성 인자 발현에는 유의한 수준의 억제 효과가 있는 물질을 탐색하고 선별하여 비브리오균의 병원성인자 발현 저해제 효과를 나타내는 항병원성 물질을 선별하였다. 구체적으로 본 발명자들은 비브리오 종들에서 특이적으로 나타나는 병원성인자 발현 조절 네트워크(cFP 조절 네트워크)를 발견하였다. 상기 네트워크는 비브리오 종의 주요 병원성인자의 발현 조절에 있어서 핵심적인 역할을 하는 것과 상기 네트워크에 관여하는 인자들과 그들의 작용 메커니즘을 규명하였다.(Park et al., J. Bacteriol. 188:2214-2221, 2006; Kim et al., Infect. Immun. 9:e00932-17, 2018; Park et al., Sci. Rep. 9:20135, 2019; Park et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-020-01646-4, 2020; Park et al., J. Microbiol. Biotechnol. DOI 10.4014/jmb.2001.01021, 2020).

구체적으로 본 발명자들은 패혈증 비브리오균을 대상으로 cFP 신호전달 네트워크에 있어서 신호 수용체 막단백질인 ToxR의 하단부 주요조절자인 LeuO의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해서 리포트 시스템을 구축하였다(도 2). 먼저 LeuO의 발현을 정량적으로 측정하기 위해서 leuO 상단부위를 pHK0011 벡터의 luxAB 유전자의 상단부위에 클로닝하여 전사 접합(transcriptional fusion)을 구축하기 위해 leuO 유전자의 상단 부위 442-bp 부위(도 2의 염기서열에서 노란 형광색으로 표시한 부분)를 PCR 기법을 이용하여 증폭하였고 이의 결과물을 pHK0011 벡터의 luxAB 유전자 상단부에 전사접합형태로 클로닝하였다. 상기 442-bp 부위는 leuO의 발현에 필수적인 다음의 요소들을 모두 포함한다(Park et al., Scientific Reports, 9: 20135, 2019): 1) ToxR이 결합하기 위한 ToxR box(하늘색 표시), 2) 전사를 위한 RNA polymerase 결합 부위인 프로모터 지역(파란색으로 밑줄 표시), 3) leuO 상단부위 지역의 굴곡 형성에 필요한 AT-rich 부위(염기서열 A와 T의 빈도가 높은 지역; 이탈릭체 밑줄 표시). 상기 442-bp의 길이는 상술한 필수적인 요소들을 모두 포함하는 최소한의 길이이다. 상기 구축한 pHK0011::leuO를 leuO 유전자를 결실시켜서 구축한 돌연변이체인 MO6ΔleuO 균주에 형질전환 시킴으로써 MO6ΔleuO (pHK0011::leuO) 균주를 구축하여 이를 indicator 균주로 활용하였다.

본 발명자들이 제조한 재조합 리포터 균주는 종래 발표한 논문의 leuO 전사접합체와 비교하여 하기와 같은 차이점 있다: 1)기존의 전사접합체에서는 리포터 유전자로 lacZ를 사용, 2)접합시킨 leuO 상단부 지역의 길이가 더 길다 (약 540-bp), 3) 상기 lacZ와 달리 luxAB 유전자의 발현은 루미노미터(luminometer) 기기를 사용하여 보다 정확하고 빠르게 측정이 가능함.

본 발명의 cFP 조절 네트워크를 간단히 설명하면 비브리오 세균 종들이 생산·분비하는 신호물질인 diketopiparazine(DKP)계열의 cyclo(Phenylalanine-Proline)(cFP) 물질은 비브리오 세균의 막 단백질인 ToxR의 막간 공간 영역(periplasmic domain)에 결합하여 신호를 개시시킨다. 상기 ToxR은 세포질 신호전달 양성조절자인 leuO 유전자의 발현을 유도하고, 상기 LeuO는 OmpU를 비롯한 여러 독성인자의 발현을 유도함과 동시에 vHUαβ 단백질을 통하여 시그마 인자(sigma factor)인 RpoS의 mRNA의 안정성을 증진시키고, 이에 따라 일련의 독성 인자들의 발현을 항진시킨다(도 1). 상기 신호전달 네트워크에 의해서 조절되는 주요 병원성 인자는 패혈증 비브리오균의 경우에는 OmpU, KatG, VvpE 등이 포함되며 비브리오 콜레라균의 경우에는 CtxAB가 포함된다. 상기 콜레라 종 이외 다른 병원성 비브리오종에도 상기 네트워크가 있는 것으로 파악되어 많은 주요 병원성 인자들이 상기 네트워크에 의하여 발현이 조절될 것이라 예상된다. 따라서 상기 신호전달 네트워크에 의한 조절 과정을 저해할 수 있는 물질 SG0020은 주요 병원성 비브리오균 종들의 생장에는 영향을 미치지 않으면서 병원성 인자의 발현을 교란 혹은 억제시켜 치명적인 병원성 세균에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 사료된다.

본 발명자들은 본 발명에서 상기 선별한 비브리오 균을 특이적으로 저해하는상기 물질을 대상으로 하기와 같이 역가를 정량·정성적으로 측정하였다. 1) 패혈증 비브리오균의 master regulator인 leuO의 전사에 미치는 영향, 2) 패혈증 비브리오균의 H₂O₂에 대한 저항성 측정, 3) 패혈증 비브리오균의 병원성 인자인 VvhA의 전사에 미치는 영향, 4) 콜레라균의 주요 병원성인자인 ctxAB (콜레라 독소 코딩 유전자)의 전사에 미치는 영향, 5) 마우스를 대상으로 LD₅₀ 측정, 6) 인간세포의 생존에 미치는 영향을 정량적으로 측정 (MTT assay와 세포 형태 관찰과 사이토카인 생산 측정).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실험 방법

시약

본 발명에서는 LB(Difco, Detroit, MI), 항생제(Sigma-Aldrich), 메탄올(methanol), n-decylaldehyde, DMSO, 화합물 SG0020, PBS, Z-buffer, SDS, 클로로포름(chloroform), ONPG, Na₂CO₃, H₂O₂, 철 덱스트란(iron dextran), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), EZ-cytox, DMEM, FBS(Gibco)를 사용하였다.

균 배양

본 발명에서 사용한 Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae 균주들은 Luria-Bertani(LB)배지에서 적절한 항생제를 처리한 후 37℃, 230 rpm에서 배양하였고, Vibrio vulnificus 균주는 LB배지에서 적절한 항생제를 처리한 후 30℃, 230 rpm에서 배양하였다. 상기 항생제들의 농도는 E. coli의 경우 앰피실린 50 μg/mL, 카나마이신 25 μg/mL, 테트라사이클린 10 μg/mL, 클로람페니콜 25 μg/mL으로 처리하였고 비브리오 종들의 경우, 카나마이신 100 μg/mL, 테트라사이클린 1 μg/mL, 클로람페니콜 2 μg/mL로 처리하였다.

실험동물 및 사육

몸무게가 평균 11g인 3주령 C57BL/6 암컷 마우스들을 DBL(Eumseong-gun, Chungcheongbuk-do, Republic of Korea)로부터 구입하였고, 7일의 적응기간(acclimatization period)후 본 발명에 이용하였다. 실험동물들은 플라스틱 케이지당 4~6마리씩, 20~25℃의 온도, 40%~45%의 습도 및 12시간 주기의 낮/밤 순환 조건에서 사육하였고 적응기간 동안 설치류 펠렛사료를 급이하였다.

세포 배양

본 발명에서 사용한 인간각질형성세포(HaCaT)는 FBS가 포함된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO₂의 조건의 포화상태로 배양하였다.

리포트 시스템

본 발명자들은 패혈증 비브리오균을 대상으로 cFP 신호전달 네트워크에 있어서 신호 수용체 막단백질인 ToxR의 하단부 주요조절자인 LeuO의 발현을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해서 리포트 시스템을 구축하였다. 상기 시스템에서는 ToxR이 cFP 신호물질에 부착되면 하위 조절자인 LeuO의 발현을 항진시킨다는 점에 착안하여 LeuO 유전자의 5'- 말단부위 442 bp 부위 및 암호화 서열 일부를 포함하는 핵산서열을 pHK0011 벡터(Jeong et al., J. Biol. Chem. 276: 13875-13880, 2001) 내에 존재하는 생물발광 유전자인 luxAB 유전자 상단부에 연결함으로서 리포터 컨스트럭트를 제조하였다(도 2). 상기 리포터 컨스트럭트 LeuO 코딩유전자를 결실시킨 돌연변이 패혈증 비브리오 균주 MO6ΔleuO에 형질도입하여 리포터 균주(MO6ΔleuO(pHK0011::leuO)를 제작하였다. 상기 리포터 균주에 한국화합물은행으로부터 제공받은 대표 라이브러리 총 6,566 개의 화합물들을 각각 처리하고 luminometer를 이용하여 Lux 활성도를 정량적으로 측정하였다. 이때 음성대조군은 DMSO를, 양성대조군은 DMSO에 희석한 cFP(최종 농도 5 mM)를 사용하였다. 그 결과 수치가 0.3 이하를 보이는 물질들을 1차로 스크리닝하였고 상기 선별된 물질들을 대상으로 동일한 조건하에서 2차 스크리닝을 수행하여 최종적으로 유의적인 역가를 나타내는 물질 (6-(4-methoxyphenyl)-3-(p-tolyl)-3,4-dihydro-1,3,5-triazine-2(1H)-thione, 화학식 1)을 선별하였으며, 화학식 1의 화합물을 "SG0020"으로 명명하였다. 상기 화합물 SG0020의 구조는 하기 화학식 1과 같다:

(화학식 1).

생물발광 분석(Bioluminescence Assays)

본 발명자들은 밤새 LB 배지에서 성장한 V. vulnificus, V. cholerae, 또는 V. parahaemolyticus를 새로운 LB 배지에 O.D.₆₀₀가 0.005가 되도록 접종하였다. 접종전에 화합물 SG0020를 50 μM 농도로 처리하였고 대조군으로 DMSO를 처리하였다. 그 후, 50% 메탄올로 녹인 0.0006%(v/v) n-decylaldehyde를 luminometer(Mithras LB 940; Berthold, Bad Wildbach, Germany)에 넣어주었고 luminometer를 이용하여 다양한 성장 조건에서 루미네선스(luminescence)를 측정하였다. 이어서, 전사량은 발광 유닛(luminescence unit)을 세포의 농도로 정규화(normalization)하여 표현하였다(상대적 광 유닛, RLU).

β-갈락토시다아제 분석

본 발명자들은 밤새 LB 배지에서 성장한 V. vulnificus, V. cholerae, 또는 V. parahaemolyticus를 새로운 LB 배지에 OD₆₀₀이 0.005가 되도록 접종하였다. 접종전에 화합물 SG0020를 50 μM 농도로 처리하였고 대조군으로 DMSO를 처리하였다. 그 후 Z buffer 400 μl가 담긴 E-tube에 0.05% SDS, 클로로포름을 각각 1방울, 2방울씩 처리하고 균을 100 μl씩 넣어 30℃ 항온수조(water bath)에서 10분 동안 반응시켰으며 ONPG를 100 μl씩 첨가하고 색깔이 노란색으로 변할 때까지 시간을 측정하였다. 이어서, Na₂CO₃ 250 μl를 처리 후 원심분리기(centrifuge)로 11000 rpm 2분 돌려 상층액 100 μl를 96 웰 플레이트에 뿌려주었고 420 nm에서 흡광도를 측정 후 밀러 유닛(miller unit)으로 변환하여 표현하였다.

ROS 내성 측정

본 발명자들은 밤새 LB 배지에서 자란 V. vulnificus를 새로운 LB에 OD₆₀₀이0.005가 되도록 접종하였다. 접종 전에 화합물 SG0020 50 μM이 되도록 처리하였고 대조군으로 DMSO를 처리하였다. OD₆₀₀이 대략 0.1이 되었을 때 균을 반으로 나눈 후 H₂O₂를 625 μM이 되도록 처리하였고 대조군으로 H₂O를 처리하였다. 그 후 균들을 희석하여 LA플레이트에 깔아 측정한 세포수를 비율로 나타냈다.

마우스 감염 분석

본 발명자들은 몸무게가 평균 11 g인 3주령 C57BL/6 암컷 마우스들을 DBL으로부터 구입하였고, 7일의 적응기간(acclimatization period) 후에 본 발명에 이용하였다. 사료를 전부 제거한 뒤에 iron dextran을 100 μg/g 만큼 복강주사를 통해 접종하여 철 투여를 한 후, 8.5%(w/v) 중탄산나트륨 용액(50 μl)을 경구투여하여 위산의 작용을 억제하여 균의 생존율을 높였다. 그 후 PBS를 이용해 10¹⁰ cell/ml의 농도로 농축한 균과 PBS를 100 μl 급이하였고, 화합물 SG0020 50 mM 및 DMSO를 30 μl 급이한 후 24시간 동안 쥐의 생존율을 확인하였다.

실시예 1: leuO 의 전사에 미치는 영향

본 발명자들은 화합물 SG0020 처리에 따른 패혈증 비브리오균의 master regulator인 leuO의 전사량을 측정하였다. 상기 leuO의 하단부에 lacZ reporter 유전자를 전사 접합시키고, 이를 leuO 유전자가 결실된 패혈증 비브리오균에 형질전환 시킨 후, 상기 균주에 SG0020를 다양한 농도로 처리하였으며 β-galatosidase의 활성도를 정량측정하였다. 그 결과 본 발명의 화합물 SG0020는 통계적으로 유의한 수준에서 leuO의 전사를 억제함을 확인하였다(도 3).

실시예 2: 과산화수소에 대한 저항성

본 발명자들은 화합물 SG0020 처리에 따른 패혈증 비브리오균의 H₂O₂에 대한 저항성을 분석하였다. ToxR-LeuO-Vhuα-RpoS-KatG 신호전달체계에서 가장 하단부에 존재하는 KatG는 과산화수소분해효소(catalase)로서 비브리오균의 ROS(활성산소)에 대한 저항성을 높인다. 따라서 본 발명의 SG0020을 처리했을 때 leuO의 발현이 감소하였으므로 상기 katG의 발현 또한 억제됨으로써 H₂O₂에 대한 저항성이 감소되는지 조사하였다. 그 결과 50 μM의 SG0020를 처리하였을 때 H₂O₂에 대한 저항성이 감소하는 것을 확인하였다(도 4).

실시예 3: 외독소인 VvhA의 발현에 미치는 영향

본 발명자들은 화합물 SG0020 처리에 따른 패혈증 비브리오 균의 VvhA의 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 종래 연구에서 패혈증 비브리오균의 대표적인 외독소인 용혈소(hemolysin)를 코딩하는 유전자 vvhA가 제거되었을 때 V. vulnificus에 의해 감염된 마우스의 생존율이 4~5배 정도 증가한다고 보고하였다. 선행연구를 통하여 ToxRS가 vvhA의 전사를 증가시킨다는 것을 밝힌 바 있다. 이에 본 발명의 SG0020이 ToxR로부터 시작되는 일련의 신호전달체계에 관여하기 때문에 상기 물질도 vvhA 억제시키는 조사하기 위해 vvhA의 하단부에 lacZ reporter 유전자를 전사 접합시키고, 상기 균주에 각각 50 μM의 SG0020를 각각 처리한 후 β-galatosidase의 활성도를 정량측정하였다. 그 결과 본 발명의 화합물 SG0020는 모두 유의한 수준에서 vvhA의 전사를 억제하는 것으로 나타났다(도 5).

실시예 4: CtxAB(콜레라톡신)의 전사에 미치는 영향

본 발명자들은 화합물 SG0020 처리에 따른 비브리오 콜레라균의 주요 병원성 인자인 CtxAB(콜레라톡신)의 전사에 미치는 영향을 분석하였다. 비브리오(Vibrio)속에는 패혈증 비브리오균(V. vulnificus) 외에도 대표적인 병원성 세균인 콜레라균(V. cholerae)도 있는데 상기 콜레라균은 외독소 단백질인 콜레라톡신(cholera toxin)을 분비하여 인간에 치명적인 설사병을 일으킨다. 콜레라 외독소를 코딩하고 있는 ctx는 ToxR에 의해서 발현이 조절된다. 따라서 상기 V. vulnificus의 ToxR과 높은 상동성을 갖는 V. cholerae의 ToxR 또한 SG0020에 의해 영향을 받는지 조사하기 위해 SG0020이 야생형 콜레라균인 El Tor 균주의 ctxAB의 전사량에 미치는 영향을 정량측정하였다. 그 결과 본 발명의 화합물 SG0020의 처리에 의해 ctxAB의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 5: 마우스 생존율 분석

V. vulnificus는 모델실험동물인 마우스를 감염하여 사망에 이르게 한다. 본 발명의 화합물 SG0020이 V. vulnificus의 병원성에 어떠한 영향을 미치는 보기 위한 방법으로써 마우스를 대상으로 실험하였다. 마우스에 상기 균주를 경구 투여 후, 본 발명의 화합물 SG0020을 상기 마우스에게 투여하여 24시간 동안 생존율을 관찰하였다. 그 결과, 화합물 SG0020을 투여한 그룹의 생존율이 대조군(양성대조군: MO6)과 비교하여 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(도 7)

실시예 6: 인간세포의 생존율 분석

본 발명자들은 화합물 SG0020 처리에 따른 인간각질세포의 생존율을 조사하였다. 본 발명의 화합물 SG0020을 병원성 억제물질로 활용하기 위해서는 숙주(인간)세포에는 위해성이 없어야 한다. 이에 상기 물질이 인간세포에 미치는 독성을 확인하기 위해서 인간각질세포인 HaCaT에 50 μM의 화합물 SG0020를 처리하였고 MTT 분석을 수행하였으며 현미경을 통해 세포의 모양을 관찰하였다. 그 결과 화합물 SG0020 처리에 의한 HaCaT 세포의 생존과 표현형에 영향이 없는 것으로 나타났다(도 8 및 9).

실시예 7: 면역 반응

본 발명자들은 본 발명의 SG0020이 진핵 세포의 면역반응에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 마우스 단핵구인 원시 세포(raw cell)를 LPS로 활성화시킨 후 1 μM의 화합물 SG0020를 처리하여 IL-1β, IL-6의 발현량을 분석하였다. 그 결과, 원시세포에서 IL-1β 및 IL-6 발현 모두 억제되는 것을 확인하였다(도 10). 상기 결과는 본 발명의 실시예에 따라 선별한 항병원성 조성물인 화합물 SG0020이 비브리오균의 병원성인자의 발현을 교란 혹은 억제시켜 병원성 세균에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 비브리오균 감염증 치료용 약학적 조성물:
   

   

   (화학식 1).
2. 제1항에 있어서,
   상기 비브리오균은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   leuO, VvhA 및 ctxAB로 구성되는 군으로부터 선택되는 병원성 인자의 발현을 억제하는, 약학적 조성물.
4. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비브리오 감염증 예방용 사료첨가제:
   

   

   (화학식 1).
5. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비브리오균에 의한 감염증 치료방법:
   

   

   (화학식 1).

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