KR20220160010A - 핵산 올리고머의 제조 방법 - Google Patents

핵산 올리고머의 제조 방법 Download PDF

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KR20220160010A
KR20220160010A KR1020227035118A KR20227035118A KR20220160010A KR 20220160010 A KR20220160010 A KR 20220160010A KR 1020227035118 A KR1020227035118 A KR 1020227035118A KR 20227035118 A KR20227035118 A KR 20227035118A KR 20220160010 A KR20220160010 A KR 20220160010A
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도시후미 가노
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Abstract

본 발명은, 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은, 식 (1) :
Figure pct00044

(식 중, 기호는 명세서에 기재된 의미를 갖는다.) 로 나타내는 핵산 올리고머와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 90 × 10-6 이하인 디클로로아세트산 용액을 반응시키는 공정을 포함하는, 식 (2) :
Figure pct00045

(식 중, 기호는 명세서에 기재된 의미를 갖는다.) 로 나타내는 핵산 올리고머의 제조 방법을 제공한다.

Description

핵산 올리고머의 제조 방법
본 출원은 2020년 3월 27일에 출원된 일본 특허출원 제2020-058880호에 대한 우선권 및 그 이익을 주장하는 것으로, 그 전체 내용은 참조함으로써 본 출원에 받아들여진다.
본 발명은, 핵산 올리고머의 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 핵산 올리고머의 의료 분야로의 응용에 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산, 압타머, 리보자임, 및 siRNA 등의 RNA 간섭 (RNAi) 을 유도하는 핵산 등을 들 수 있고, 이들은 핵산 의약품이라고 불리고 있다.
핵산 올리고머는, 고상 합성법에 의해 합성 가능하고, 고상 담체 상에서 핵산을 신장시켜 합성된 핵산 올리고머는, 고상 담체로부터 절단하고, 이어서, 리보스를 포함하는 핵산 올리고머는, 리보스의 2' 위치의 수산기의 보호기를 탈보호하여 제거하여, 목적으로 하는 핵산 올리고머가 제조되고 있다. 고상 합성법에서는 뉴클레오시드의 포스포르아미다이트 (이하,「아미다이트」라고 칭한다) 가 원료로서 사용되며, 5' 위치의 수산기의 보호기는, 디클로로아세트산 용액을 사용하여 탈보호하는 것이 알려져 있지만, 종래의 디클로로아세트산 용액을 사용하여 합성된 핵산 올리고머의 수율은, 반드시 만족스러운 것은 아니며, 합성은 효율적이지는 않았다 (특허문헌 1).
국제 공개공보 제99/43694호
본 발명은, 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 핵산 올리고머를 합성할 때에, 포름알데히드 농도가 일정 이하인 디클로로아세트산 용액을 사용하거나, 혹은 디클로로아세트산의 품질을 향상시킨 후에 사용하는 것을 특징으로 하는, 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다.
본 발명은, 이하의 양태를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
1. 식 (1) :
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중,
G2 는, 수산기의 보호기를 나타내고,
Ba 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자 또는 알콕시기를 나타내고,
R 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타내고,
Y 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
n 은, 1 ∼ 200 중 어느 정수를 나타내고,
W1 은, OZ 기를 나타내고, 또한, X1 은, R 기를 나타내거나, 혹은
W1 은, OV 기를 나타내고, 또한, X1 은, OZ 기를 나타내고,
V 는, 수산기의 보호기를 나타내고,
Z 는, 고상 담체 및 연결기로 이루어지는 구조를 갖는 기이다.
그리고, n 이 2 이상의 정수일 때, 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머는, 각각의 뉴클레오티드 사이에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
로 나타내는 핵산 올리고머와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 90 × 10-6 이하인 디클로로아세트산 용액을 반응시키는 공정을 포함하는, 식 (2) :
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중,
G2, Ba, R, Y, X1, W1 및 n 은, 상기와 같고, 그리고,
식 (1) 에 있어서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 사이에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
로 나타내는 핵산 올리고머의 제조 방법.
2. 전항 1 에 기재된 공정과, 추가로, 당해 공정에서 생성하는 식 (2) 로 나타내는 핵산 올리고머로부터 Z 로 나타내는 기를 제거하는 공정, 그리고 수산기 및 핵산 염기의 보호기를 제거하는 공정을 포함하는, 식 (2') :
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중,
Y 및 n 은, 상기와 같고,
Bc 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 핵산 염기를 나타내고,
G4 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
Q' 는, 상기와 같고,
X3 및 W3 은 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
X3 은, R' 기를 나타내고, 또한, W3 은, 수산기를 나타낸다.)
로 나타내는 핵산 올리고머의 제조 방법.
3. 식 (2) 로 나타내는 핵산 올리고머를, 아미다이트법으로 임의로 사슬 길이를 신장시킨 식 (3) :
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중,
G2, Ba, R, Y, X1 및 W1 은, 상기와 같고,
G5 는,
[화학식 5]
Figure pct00005
로 나타내는 수산기의 보호기, 혹은 수소 원자를 나타내고,
R1, R2 및 R3 은, 상기와 같고,
m 은, m ≥ n 을 만족하는 정수이다.)
으로 나타내는 핵산 화합물을 얻는 공정, 그리고
식 (3) 으로 나타내는 화합물로부터 식 (4) :
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중,
G5, R, Y 및 m 은, 상기와 같고,
G4 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
BC 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 핵산 염기를 나타내고,
X2 는, 수산기를 나타내고, 또한, W2 는, OV 기를 나타내거나, 혹은
X2 는, R 기를 나타내고, 또한, W2 는, 수산기를 나타내고,
V 는, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
로 나타내는 화합물을 절단하고,
추가로 식 (4) 로 나타내는 화합물을 탈보호하여, 식 (5) :
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중,
G4, Bc, Y 및 m 은, 상기와 같고,
R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
Q' 는, 상기와 같고,
X3 및 W3 은 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
X3 은, R' 기를 나타내고, 또한, W3 은, 수산기를 나타낸다.)
로 나타내는 핵산 올리고머를 제조하는 공정을 추가로 포함하는, 전항 1 에 기재된 제조 방법.
4. 비뉴클레오티드 링커가, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커인, 전항 1 ∼ 3 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
5. 아미노산 골격으로 이루어지는 링커가, 하기 식 (A14-1), (A14-2) 및 (A14-3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 구조를 갖는 링커인, 전항 4 에 기재된 제조 방법.
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중, Y 는, 상기와 같다.)
6. 디클로로아세트산 용액이, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 방향족 유기 용매로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 포함하는, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
7. 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 43 × 10-6 이하인, 전항 1 ∼ 6 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
8. 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 22 × 10-6 이하인, 전항 1 ∼ 6 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
9. 핵산 올리고머가, 리보핵산 (RNA) 인, 전항 1 ∼ 8 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
10. 핵산 올리고머가, 리보핵산 (RNA) 이고, 그 리보스의 2' 위치의 수산기의 보호기가, 식 (6) 으로 나타내는 보호기인, 전항 1 ∼ 8 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
식 (6) :
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중,
q 는, 1 ∼ 5 중 어느 정수를 나타내고,
Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타내고,
* 표시는, 리보스의 2' 위치의 수산기 유래의 산소 원자와의 결합점을 나타내고, 그리고,
EW 는, 전자 구인기를 나타낸다.)
11. Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자이고, 또한, EW 가 시아노기인, 전항 10 에 기재된 제조 방법.
12. 핵산 올리고머가, 40 사슬 길이 이상의 올리고머인, 전항 1 ∼ 11 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
13. 핵산 올리고머가, 50 사슬 길이 이상의 올리고머인, 전항 1 ∼ 11 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
14. 핵산 올리고머가, 60 사슬 길이 이상의 올리고머인, 전항 1 ∼ 11 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
15. 핵산 올리고머가, 80 사슬 길이 이상의 올리고머인, 전항 1 ∼ 11 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
16. 핵산 올리고머가, 100 사슬 길이 이상의 올리고머인, 전항 1 ∼ 11 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
17. 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 90 × 10-6 이하인, 디클로로아세트산 용액.
18. 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 43 × 10-6 이하인, 전항 17 에 기재된 디클로로아세트산 용액.
19. 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 22 × 10-6 이하인, 전항 17 에 기재된 디클로로아세트산 용액.
20. 포름알데히드를 포함하는 미정제 디클로로아세트산 용액과 포름알데히드와 공비하는 용매를 포함하는 용액으로부터 포름알데히드를 공비시켜 증류 제거함으로써 정제 디클로로아세트산 용액을 얻는 공정을 포함하는, 전항 17 ∼ 19 중 어느 한 항에 기재된 디클로로아세트산 용액의 제조 방법.
21. 공비 용매의 비점이, 194 ℃ 이하인, 전항 20 에 기재된 제조 방법.
22. 공비 용매가, 디클로로메탄, 아세토니트릴 또는 방향족 유기 용매인, 전항 20 또는 21 에 기재된 제조 방법.
23. 방향족 유기 용매가 톨루엔인, 전항 22 에 기재된 제조 방법.
24. 전항 20 에 기재된 디클로로아세트산 용액의 정제 공정 및 당해 공정에서 얻어진 정제 디클로로아세트산 용액을 사용하는 전항 1 ∼ 3 중 어느 한 항에 기재된 공정을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
본 발명은, 효율적인 핵산 올리고머의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법에 의해, 제조되는 핵산 올리고머의 수율 향상을 기대할 수 있다.
도 1 은, 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머로부터 식 (5) 로 나타내는 핵산 올리고머를 제조하는 전형예를 나타내는 스킴 A 이다. 도면 중, G1 로는, 수산기의 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. 또, G3 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 알킬기를 나타내거나, 혹은 2 개의 G3 은 서로 결합하여 고리형 구조를 형성하고 있어도 된다. G3 으로는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 알킬기, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 프로필기, 또는 이소프로필기인 것이 바람직하고, 양방이 이소프로필기인 것이 보다 바람직하다. 그 밖의 기호는 상기와 같다.
상기 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머에, 포름알데히드 농도가 일정 이하인 디클로로아세트산 용액을 반응시켜, 상기 식 (2) 로 나타내는 핵산 올리고머를 얻는 방법에 대해 설명한다.
본 발명의 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 는, 통상적으로 90 × 10-6 이하, 바람직하게는 43 × 10-6 이하, 보다 바람직하게는 22 × 10-6 이하이다. 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드 농도 측정 방법에는, 가스 크로마토그래프법 또는 고속 액체 크로마토그래프법이 있다. 가스 크로마토그래프법에서는 포름알데히드를 직접 분석하여 농도를 산출한다. 고속 액체 크로마토그래프법에서는, 포름알데히드와 아세틸아세톤을 반응시켜, 얻어진 3,5-디아세틸-1,4-디하이드로루티딘의 양을 측정하고, 포름알데히드의 농도를 산출한다.
디클로로아세트산 용액 중의 디클로로아세트산의 농도는, 통상적으로 0.1 ∼ 2.4 M, 바람직하게는 0.1 ∼ 1.2 M, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 0.6 M, 더욱 바람직하게는 0.2 ∼ 0.4 M 이다.
디클로로아세트산의 희석 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 방향족 유기 용매, 물 또는 임의의 혼합 용매를 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 방향족 유기 용매로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 방향족 유기 용매를 들 수 있다. 방향족 유기 용매로는, 톨루엔을 들 수 있다.
상기 반응에 있어서의 반응 온도는, 0 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 ∼ 30 ℃ 이다.
디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드는, 임의의 용매 또는 임의의 혼합 용매와의 공비에 의해 제거할 수 있고, 공비 용매로는, 디클로로아세트산보다 비점이 낮은 용매이면, 특별히 한정되지 않지만, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 방향족 유기 용매 또는 임의의 혼합 용매를 들 수 있고, 바람직하게는 디클로로메탄, 아세토니트릴, 또는 방향족 유기 용매를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 방향족 유기 용매를 들 수 있다. 방향족 유기 용매로는, 톨루엔을 들 수 있다.
공비 용매의 비점은, 200 ℃ 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 194 ℃ 이하이다.
디클로로아세트산 용액의 보관에는, 유리제 용기, 플라스틱제 용기, 또는 금속제 용기를 사용할 수 있다. 플라스틱제 용기로는, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌제 등의 용기를 사용할 수 있고, 금속제 용기로는, SUS 제 용기 또는 하스텔로이제 등의 용기를 사용할 수 있다.
공기 분위기하 또는 불활성 가스 분위기하에서 산화 용액을 보관할 수 있으며, 불활성 가스로는, 아르곤, 질소, 이산화탄소 또는 헬륨 등을 사용할 수 있다.
5' 위치의 수산기에 보호기를 갖는 핵산 화합물로는, 상기 식 (1) 의 핵산 화합물이 예시된다. 디클로로아세트산 용액을 반응시켜 생성하는 핵산 화합물로는, 상기 식 (2) 로 나타내는 핵산 화합물이 예시된다.
상기 식 (1) 및 (2) 에 있어서, Q' 로 나타내는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하고, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타내는 화합물로서, 구체적으로는 하기 식 (7) 의 LNA-1, LNA-2, 또는 LNA-3 으로 나타내는 구조를 들 수 있다.
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타낸다.)
Z 로 나타내는, 고상 담체, 및 고상 담체와 핵산 올리고머의 3' 말단의 리보스의 2' 위치 혹은 3' 위치의 수산기의 산소 원자를 연결하는 연결기로 이루어지는 구조를 갖는 기로는, 보다 구체적으로는, 하기 식 (8) 로 나타내는 구조를 들 수 있다.
[화학식 11]
Figure pct00011
식 (8) 에 있어서, Sp 는, 스페이서를 나타낸다.
스페이서 (Sp) 로는, 예를 들어, 하기 식 (9) 에 나타내는 구조식을 갖는 것이 예시된다.
[화학식 12]
Figure pct00012
Linker 는, 예를 들어, 하기 식 (10) 에 나타내는 구조여도 되고, 또는 식 (10) 의 구조에 있어서 헥사메틸렌아미노기 부분을 갖지 않는 구조로서, 아미노프로필기가 Si 에 결합된 구조여도 된다. 또는, Linker 는 하기 식 (11) 로 나타내는 구조여도 된다.
[화학식 13]
Figure pct00013
(식 중,
A 는, 수산기, 알콕시기, 또는 알킬기 중 어느 것이어도 된다. 알콕시기로는, 예를 들어 메톡시기 및 에톡시기를 들 수 있다. 알킬기로는, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, n-프로필기를 들 수 있다. Si 는, 담체 표면의 수산기의 산소와 결합되어 있는 것을 나타낸다.)
Solid support 로는, 무기 다공질 담체나 유기계 수지 담체 등을 들 수 있다. 무기 다공질 담체에는, 예를 들어, Controlled Pore Glass (CPG) 를 들 수 있다. 유기계 수지 담체에는, 예를 들어, 폴리스티렌으로 이루어지는 담체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 핵산 올리고머 내에 포함되는 뉴클레오시드 (리보스, 및 데옥시리보스) 로는, DNA, RNA, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-Me, 2'-F RNA, 및 상기의 LNA 가 예시되지만, 상기 뉴클레오시드는, 이들에 한정되지 않는다.
상기의 디클로로아세트산 용액에 의한 탈보호 공정을 포함하는, 고상 합성법에 의한 핵산 올리고머의 합성 방법은, 전형적으로는, 이하의 공정을 포함한다.
(1) 고상 담체에 링커를 개재하여 결합되어 있는 수산기가 보호된 뉴클레오시드의 5' 위치의 수산기를 탈보호하는 공정,
(2) 상기 공정에서 생성한 5' 위치의 수산기를 포스포르아미다이트 화합물과 커플링 반응시켜 아인산트리에스테르 화합물을 얻는 공정,
(3) 상기 공정에서 생성한 아인산트리에스테르를 산화시켜 인산트리에스테르로 변환하여 신장시킨 핵산 분자를 제조하는 공정, 혹은, 티오인산트리에스테르로 변환하는 임의의 공정,
(4) 상기 공정 (1) ∼ (3), 즉, 생성한 핵산 분자의 5' 위치의 수산기의 탈보호 공정, 5' 위치의 수산기와 아미다이트 화합물의 커플링 공정, 및, 생성한 아인산트리에스테르의 산화 공정으로 구성되는 일련의 반응의 사이클을, 임의의 횟수 반복하여, 고상 담체 상에 핵산 분자를 합성하는 공정, 및
(5) 공정 (4) 에서 생성한 고상 담체 상의 핵산 분자를, 절단 및 탈보호하는 공정에 제공하고, 고상 담체로부터 유리시켜, 보호기가 제거된 핵산 올리고머를 제조하는 공정.
단, 상기 핵산 올리고머의 합성 방법에 있어서는, 공정 (2) 또는 (3) 에 이어서, 포스포르아미다이트 화합물과의 커플링 반응이 진행되지 않은 5' 위치의 수산기를 캐핑하는 공정을 포함하고 있어도 되고, 공정 (4) 를 구성하는 일련의 반응의 사이클 중 어느 공정 사이에 캐핑 공정이 부가되어 있어도 된다.
상기 (5) 의 공정은, 보다 구체적으로는, 공정 (4) 에서 생성한 고상 담체 상의 핵산 분자를, 이하의 공정 (5-1) 및 (5-2) 의 반응의 순서로 실시하고, 이어서 공정 (5-3) 의 반응에 제공함으로써 실시된다. 여기서 공정 (5-1) 의 반응의 실시는, 임의여도 되고, 공정 (5-2) 의 반응의 실시는, 일본 특허공보 제4705716호에 기재된 방법을 사용해도 된다. 그 결과, 고상 담체로부터 유리시킨 핵산 분자로부터 보호기가 제거된 핵산 올리고머, 혹은, 5' 말단의 수산기가 보호된 핵산 올리고머를 제조할 수 있다.
(5-1) 핵산 분자의 5' 말단의 수산기의 보호기를 탈보호하는 반응,
(5-2) 핵산 분자를 고상 담체로부터 절단하여 유리시키는 반응, 및,
(5-3) 핵산 분자를 구성하는 리보스의 2' 위치 혹은 3' 말단의 3' 위치의 수산기의 보호기를 탈보호하는 반응.
상기 공정 (1) 내지 (5) 의 스킴을 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 나타내는 공정 (1) 또는 공정 (4) 에 있어서의 탈보호 반응이, 상기의 디클로로아세트산 용액을 사용하여 실시된다. 스킴 A 에 있어서의 화학식 중의 치환기의 정의는, 상기 정의와 같다.
상기 식 (1) 의 핵산 화합물은, 추가로 아미다이트법에 의해 뉴클레오티드형 또는 비뉴클레오티드형의 링커를 사용하여 임의의 사슬 길이만큼 신장시켜, 상기 식 (3) 으로 나타내는 핵산 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 상기 식 (3) 의 고상 담체에 결합된 핵산 화합물로부터 핵산 화합물만을 절단하여, 상기 식 (4) 로 나타내는 핵산 올리고머를 얻은 후, 추가로 탈보호하여 상기 식 (5) 로 나타내는 핵산 올리고머를 얻을 수도 있다. 이하, 각 식 중의 치환기에 대해 더욱 상세하게 설명한다.
Ba 로 나타내는 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 및 Bc 로 나타내는 핵산 염기는, 특별히 한정되지 않는다. 당해 핵산 염기로는, 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민, 5-메틸시토신, 슈도우라실, 및 1-메틸슈도우라실 등을 들 수 있다. 또, 당해 핵산 염기는, 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 그와 같은 치환기로는, 예를 들어, 플루오로기나 클로로기나 브로모기나 요오드기와 같은 할로겐 원자, 아세틸기와 같은 아실기, 메틸기나 에틸기와 같은 알킬기, 벤질기와 같은 아릴알킬기, 메톡시기와 같은 알콕시기, 메톡시에틸기와 같은 알콕시알킬기, 시아노에틸기와 같은 시아노알킬기, 하이드록시기, 하이드록시알킬기, 아실옥시메틸기, 아미노기, 모노알킬아미노기, 디알킬아미노기, 카르복시기, 시아노기, 및 니트로기 등, 그리고 그들의 2 종류 이상의 치환기의 조합을 들 수 있다.
Ba 로 나타내는 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기의 보호기로는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 핵산 화학에서 사용되는 보호기를 사용할 수 있고, 그와 같은 보호기로는, 예를 들어, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 4-메틸벤조일기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 및 (디메틸아미노)메틸렌기 등, 그리고 그들의 2 종류 이상의 보호기의 조합을 들 수 있다.
Ba 는, 보다 구체적으로는,
[화학식 14]
Figure pct00014
(상기 식 중,
R4 는, 수소 원자, 메틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 벤조일기를 나타내고,
R5 는, 수소 원자, 아세틸기, 이소부티릴기 또는 벤조일기를 나타내고,
R6 은, 수소 원자, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 이소부티릴기를 나타내고,
R7 은, 2-시아노에틸기를 나타내고,
R8 은, 수소 원자, 메틸기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기 또는 4-메틸벤조일기를 나타내고, 그리고,
R9 는, 디메틸아미노메틸렌기를 나타낸다.)
중 어느 것으로 나타내는 기를 나타낸다.
Bc 로는, 보다 구체적으로는, 상기 Ba 의 구체예로부터 보호기를 제거한 기를 들 수 있다.
G5 는, 바람직하게는 이하의 기이다.
[화학식 15]
Figure pct00015
(식 중,
R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자 또는 알콕시기를 나타낸다.)
R1, R2 및 R3 은, 1 개가 수소 원자이고, 나머지 2 개가 동일 또는 상이한 (동일이 바람직하다) 알콕시기인 것이 바람직하고, 알콕시기로는 메톡시기가 특히 바람직하다. 보다 바람직하게는, G5 는, 4,4'-디메톡시트리틸기 (DMTr 기) 이다.
G2 로는, 수산기의 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. G2 로는, 예를 들어, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 할로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 시클로알케닐기, 시클로알킬알킬기, 시클릴알킬기, 하이드록시알킬기, 아미노알킬기, 알콕시알킬기, 헤테로시클릴알케닐기, 헤테로시클릴알킬기, 헤테로아릴알킬기, 실릴기, 실릴옥시알킬기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴옥시알킬기 등을 들 수 있고, 이들은 1 개 이상의 전자 구인기로 치환되어 있어도 된다.
G2 는, 바람직하게는, 전자 구인기로 치환된 알킬기이다. 당해 전자 구인기로는, 예를 들어, 시아노기, 니트로기, 알킬술포닐기, 할로겐 원자, 아릴술포닐기, 트리할로메틸기, 및 트리알킬아미노기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 시아노기이다.
G2 로는, 특히 바람직한 것은 이하의 기이다.
[화학식 16]
Figure pct00016
상기 R1, R2, R3 및 G2 의 정의에 있어서의 알킬기는, 직사슬형 또는 분기 사슬형 중 어느 것이어도 되고, 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기이다. 구체적인 알킬기의 예로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, 및 헥실기를 들 수 있다. 상기 치환기의 정의에 있어서의 알콕시기를 구성하는 알킬기 부분은, 여기서의 알킬기의 정의와 동일한 정의를 갖는다.
또, 본 발명의 방법에 있어서, 아미다이트 화합물은, 프리의 상태 또는 염의 상태로 사용할 수 있다. 아미다이트 화합물의 염으로는, 염기 부가 염 또는 산 부가 염을 들 수 있지만, 특별히 제한되지 않는다. 염기 부가 염으로는, 구체적으로는, 나트륨염, 마그네슘염, 칼륨염, 칼슘염, 알루미늄염 등의 무기 염기와의 염 ; 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민 등의 유기 염기와의 염 ; 리신, 오르니틴, 아르기닌 등의 염기성 아미노산과의 염 ; 및 암모늄염을 들 수 있다. 산 부가 염으로는, 구체적으로는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 광산 ; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 말산, 타르타르산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 말레산, 시트르산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 에탄술폰산 등의 유기산 ; 및, 아스파르트산, 글루탐산 등의 산성 아미노산과의 산 부가 염을 들 수 있다. 아미다이트 화합물에는, 염, 수화물, 용매화물, 및 결정 다형 등의 형태도 포함된다.
R 은, 바람직하게는, 보호된 수산기를 나타낸다. R 이 보호된 수산기를 나타낼 때의 보호기, 또는 V 로 나타내는 수산기의 보호기는, 아미다이트법에 있어서 사용할 수 있는 것이면 되고, 예를 들어, 2'-tert-부틸디메틸실릴 (TBS) 기, 2'-비스(2-아세톡시)메틸 (ACE) 기, 2'-(트리이소프로필실릴옥시)메틸 (TOM) 기, 2'-(2-시아노에톡시)에틸 (CEE) 기, 2'-(2-시아노에톡시)메틸 (CEM) 기, 2'-파라-톨루일술포닐에톡시메틸 (TEM) 기, 2'-EMM 기 (국제 공개공보 제2006/022323호) 외에, 국제 공개공보 제2013/027843호 및 국제 공개공보 제2019/208571호에 기재된 것을 사용할 수 있다. V 는, 바람직하게는 2'-tert-부틸디메틸실릴 (TBS) 기이다. 또, 본 발명의 방법으로 제조되는 핵산 올리고머가 리보핵산 (RNA) 인 경우 등, 핵산 올리고머 내에 리보스가 포함되는 경우, 그 리보스의 2' 위치의 수산기의 보호기로서, 상기 식 (6) 으로 나타내는 보호기가 바람직한 보호기로서 예시된다. 더욱 바람직하게는, EW 로 나타내는 전자 구인기로서 시아노기를 갖는 식 (12) 로 나타내는 보호기가 예시된다.
[화학식 17]
Figure pct00017
(식 중,
q, Ra 및 Rb 는, 상기 식 (6) 에 있어서의 정의와 동일한 의미이다.)
더욱 바람직하게는, 식 (12) 로 나타내는 기에 있어서, q 가 1 이고, Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자인 기가 예시된다.
식 (12) 로 나타내는 보호기는, 예를 들어 국제 공개공보 제2013/027843호 및 국제 공개공보 제2019/208571호의 기재에 따라 합성할 수 있고, 이러한 보호기를 갖는 아미다이트 화합물을 핵산 화합물의 제조에 사용할 수 있다.
핵산의 신장 반응에는, 도 1 의 스킴 A 에 기재된 식 (13) 의 아미다이트 화합물이 사용된다.
비뉴클레오티드 링커로는, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커 (예를 들어, 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 아미노산 골격으로 이루어지는 링커) 가 예시된다. 구체적으로는, 비한정적인 예로서, 예를 들어, 식 (A14-1) 혹은 (A14-2) 혹은 (A14-3) (예를 들어, 국제 공개공보 제2019/074110호에 기재) 으로 나타내는 링커가 예시된다. 이들 링커 이외에 국제 공개공보 제2012/005368호, 국제 공개공보 제2018/182008호 또는 국제 공개공보 제2019/074110호에 기재된 링커가 예시된다.
[화학식 18]
Figure pct00018
(식 중, Y 는, 상기와 같다.)
식 (13) 에 있어서의 R 기 및 식 (5) 에 있어서의 R' 기가, 수산기 이외의 치환기인 뉴클레오티드 및 아미다이트는, 일본 특허공보 제3745226호 등에 기재된 공지된 방법, 국제 공개공보 제2001/053528호 혹은 일본 공개특허공보 2014-221817호 및 그것들에 인용되는 공지된 방법으로 합성되는 뉴클레오시드로 제조할 수도 있고, 나아가서는, 시판품으로서 입수 가능한 것을 사용하여, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준거하여 또는 이들 방법에 적절히 변경을 가한 방법에 의해 제조할 수 있다.
G4 는, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타낸다. 알칼리 금속 이온으로는, 예를 들어, 나트륨 이온, 및 리튬 이온을 들 수 있다. 또, 알킬암모늄 이온으로서, 구체적인 알킬기의 예로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, n-펜틸기, 이소펜틸기, 및 헥실기를 들 수 있지만, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 디에틸암모늄 이온, 트리에틸암모늄 이온, 테트라부틸암모늄 이온, 헥실암모늄 이온, 및 디부틸암모늄 이온 등을 들 수 있다. 또, 하이드록시알킬암모늄 이온으로서, 구체적인 하이드록시알킬 부분의 예로는, 예를 들어, 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 하이드록시-n-프로필, 하이드록시이소프로필, 하이드록시-n-부틸, 및 트리스하이드록시메틸을 들 수 있지만, 보다 구체적인 하이드록시알킬암모늄 이온의 예로는, 트리스하이드록시메틸암모늄 이온 등을 들 수 있다. G4 는, 바람직하게는 수소 원자를 나타낸다.
G5 는, 수소 원자, 또는 상기 수산기의 보호기를 나타내고, 보호기를 나타내는 경우에는 G1 도 동일한 보호기를 나타낸다. G5 는 탈보호된 경우에는 수소 원자이지만, 그 경우의 뉴클레오티드 화합물도 또한 일련의 핵산 신장 반응의 공정에 제공된다.
Y 는, 바람직하게는 산소 원자이다.
W1 및 X1 은, 바람직하게는 W1 이 OZ 기를 나타내고, 또한, X1 이 R 기를 나타낸다.
W2 및 X2 는, 바람직하게는 W2 가 수산기를 나타내고, 또한, X2 가 R 기를 나타낸다.
W3 및 X3 은, 바람직하게는 각각 독립적으로, 수산기를 나타낸다.
R' 는, 바람직하게는 수산기이다.
상기 공정 (1) 내지 (5) 의 아미다이트법에 의한 핵산 화합물의 합성은, 도 1 의 스킴 중의 공정 (1) 또는 공정 (5) 에 있어서의, 본 발명에 관련된 탈보호 공정 이외에는, 일반적으로 공지된 방법 (예를 들어, 상기의 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 방법) 에 따라, 핵산 신장 반응을 실시할 수 있다. 이하, 각 공정에 대해 설명한다.
(핵산 신장 반응)
본 명세서에 있어서,「핵산 신장 반응」이란, 포스포디에스테르 결합을 통하여, 뉴클레오티드를 순차 결합시킴으로써, 올리고뉴클레오티드를 신장시키는 반응을 의미한다. 핵산 신장 반응은, 일반적인 포스포르아미다이트법의 순서에 따라 실시할 수 있다. 핵산 신장 반응은, 포스포르아미다이트법을 채용하는 핵산 자동 합성 장치 등을 사용하여 실시해도 된다.
핵산 올리고머의 사슬 길이는, 예를 들어, 20 mer 이상 (즉, n ≥ 19), 40 mer 이상 (즉, n ≥ 39), 50 mer 이상 (즉, n ≥ 49), 60 mer 이상 (즉, n ≥ 59), 80 mer 이상 (즉, n ≥ 79), 100 mer 이상 (즉, n ≥ 99), 2 ∼ 200 mer (즉, 1 ≤ n ≤ 199), 10 ∼ 150 mer (즉, 9 ≤ n ≤ 149), 15 ∼ 110 mer (즉, 14 ≤ n ≤ 109) 이어도 된다.
공정 (1) 의 탈보호 공정은, 고상 담체 상에 담지된 올리고뉴클레오티드 사슬 말단의 5' 수산기의 보호기를 탈보호하는 공정이다. 일반적인 보호기로는, 4,4'-디메톡시트리틸기 (DMTr 기) 나 4-모노메톡시트리틸기, 4,4',4"-트리메톡시트리틸기가 사용된다. 탈보호는, 산을 사용하여 실시할 수 있다. 탈보호용의 산으로는, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리클로로아세트산, 메탄술폰산, 염산, 아세트산, 및 p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다.
공정 (2) 의 축합 공정은, 상기 탈보호 공정에 의해 탈보호한 올리고뉴클레오티드 사슬 말단의 5' 수산기에 대해, 도 1 의 스킴 A 에 기재된 하기 식 (13) 으로 나타내는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 결합시키는 반응이다. 또한, 핵산 신장에 사용하는 포스포르아미다이트로는, 식 (13) 또는 (A9) ∼ (A12) 로 나타내는 아미다이트 화합물을 사용한다. 또, 그 밖에 사용 가능한 포스포르아미다이트로서, 2'-OMe, 2'-F, 2'-O-tert-부틸디메틸실릴기, 2'-O-메톡시에틸기, 2'-H, 및 2'-플루오로-2'-데옥시-β-D-아라비노푸라노실기 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오시드 포스포르아미다이트로는, 5' 수산기가 보호기 (예, DMTr 기) 로 보호된 것을 사용한다. 축합 공정은, 상기 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 활성화하는 활성화제 또는 축합제를 사용하여 실시할 수 있다. 활성화제 또는 축합제로는, 예를 들어, 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT) (5-벤질메르캅토-1H-테트라졸이라고도 칭한다), 1H-테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT), N-메틸벤즈이미다졸륨트리플레이트 (N-MeBIT), 벤즈이미다졸륨트리플레이트 (BIT), N-페닐이미다졸륨트리플레이트 (N-PhIMT), 이미다졸륨트리플레이트 (IMT), 5-니트로벤즈이미다졸륨트리플레이트 (NBT), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBT) 또는 5-(비스-3,5-트리플루오로메틸페닐)-1H-테트라졸 등을 들 수 있다.
도 1 의 스킴 A 에 기재된 식 (13) 으로 나타내는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 (이하, 아미다이트라고 호칭한다) 란, 이하와 같다.
식 :
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중,
G1, G2, G3, Ba, 및 R 은, 상기와 같다.) 으로 나타내는 화합물.
축합 공정 후에는, 적절히 미반응의 5' 수산기를 캐핑해도 된다. 캐핑은, 무수 아세트산-테트라하이드로푸란 용액, 또는 페녹시아세트산 무수물/N-메틸이미다졸 용액 등의 공지된 캐핑 용액을 사용하여 실시할 수 있다.
공정 (3) 의 산화 공정은, 상기 축합 공정에 의해 형성된 아인산기를 인산기 또는 티오인산기로 변환하는 공정이다. 본 공정은, 3 가의 인으로부터 5 가의 인으로 산화제를 사용하여 변환하는 반응으로, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고 핵산 유도체에 산화제를 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
아인산기를 인산기로 변환하는 경우에는,「산화제」로서, 예를 들어, 요오드를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.005 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 조제하여 사용할 수 있다. 산화의 산소원으로는 물을 사용할 수 있고, 반응을 진행시키는 염기로는 피리딘, N-메틸이미다졸 (NMI), N-메틸모르폴린, 또는 트리에틸아민 등을 사용할 수 있다. 또, 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란 (THF) 또는 이들의 임의의 비율의 혼합 용매를 들 수 있다. 예를 들어, 요오드/물/피리딘/아세토니트릴, 혹은 요오드/물/피리딘 혹은 요오드/물/피리딘/NMI, 혹은 요오드/물/피리딘/THF 를 사용할 수 있다. 반응 온도는, 5 ℃ ∼ 50 ℃ 가 바람직하다. 반응 시간은, 통상적으로 1 분 ∼ 30 분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물 1 mol 에 대해 1 ∼ 100 mol 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 mol 이다.
아인산트리에스테르기를 티오인산트리에스테르기로 변환하는 경우에는,「산화제」로서, 예를 들어, 황, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드 (Beaucage 시약), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ADTT), 5-페닐-3H-1,2,4-디티아졸-3-온 (POS), [(N,N-디메틸아미노메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-디티아졸린-3-티온 (DDTT), 및 페닐아세틸디술파이드 (PADS) 를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.001 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석시켜 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 피리딘 또는 이들의 임의의 비율의 혼합 용매를 들 수 있다. 산화 공정은, 상기 캐핑 조작 후에 실시해도 되고, 반대로 산화 공정 후에 캐핑 조작을 실시해도 되며, 이 순서는 한정되지 않는다.
공정 (5-1) 에 있어서, 신장의 마지막에 도입한 뉴클레오티드의 5' 위치의 수산기의 보호기는, 후술하는 고상 담체로부터의 절단 및 보호기의 탈보호 후, 5' 위치의 수산기의 보호기를 태그로 하는 칼럼 정제를 위해 사용해도 되고, 칼럼 정제 후, 5' 위치의 수산기의 보호기를 탈보호해도 된다.
공정 (5-2) 에 있어서, 인산 보호기를 탈보호하는 공정은, 원하는 서열을 갖는 핵산의 합성이 완료된 후에는, 인산 부분의 보호기를 탈보호하기 위해 아민 화합물을 작용시킨다. 아민 화합물로는, 예를 들어, 일본 특허공보 제4705716호에 기재되는 디에틸아민 등을 들 수 있다.
공정 (5-2) 에 있어서의, 고상 담체 상에서 원하는 사슬 길이로 신장시킨 핵산 올리고머의, 고상 담체로부터의 절단은, 통상적으로 절단제로서 농암모니아수를 사용하여 실시된다.
또한 암모니아 또는 아민 화합물 등을 사용하여, 예를 들어, 고상 담체로부터 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단하여 회수한다. 아민 화합물로는, 예를 들어, 메틸아민, 에틸아민, 이소프로필아민, 에틸렌디아민, 또는 디에틸아민 등을 들 수 있다.
공정 (5-3) 에 있어서, 공정 (5-2) 에 있어서 고상 담체로부터 절단된 핵산 화합물 (4) 의 리보스의 2' 위치 혹은 3' 위치의 수산기의 보호기는, 국제 공개공보 제2006/022323호, 국제 공개공보 제2013/027843호, 또는 국제 공개공보 제2019/208571호에 기재된 방법에 따라 제거할 수 있고, 탈보호한 핵산 올리고머 (5) 를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조 방법을 사용하여 제조 가능한 핵산 올리고머로는, 핵산 올리고머 내에 포함되는 뉴클레오시드가, RNA, DNA, 그리고 2'-O-MOE, 2'-O-Me, 2'-F 를 갖는 RNA, 및 LNA 인 핵산 올리고머를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Xiulong, Shen 등 저술, Nucleic Acids Research, 2018, Vol.46, No.46, 1584-1600, 및 Daniel O'Reilly 등 저술, Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2, 546-558 에 기재된, 여러 가지 뉴클레오시드의 예를 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 제조되는 핵산 올리고머는 RNA 이다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 사용 가능한 핵산 올리고머의 전형적인 예를, 실시예에 기재된 예에 더하여 하기의 예를 나타내지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이하, 서열의 설명 중, U 는 우리딘을, C 는 시티딘을, A 는 아데노신을, 또 G 는 구아노신을 나타낸다.
국제 공개공보 제2019/060442호에 기재되어 있는, 하기의 서열 (A) 및 (B) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (A) : 5'-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3' (Antisense) (서열 번호 1) 21 mer
서열 (B) : 5'-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT-3' (Sense) (서열 번호 2) 21 mer
서열 (A) 및 (B) 중, Um 은 2'-O-메틸우리딘을, Cm 은 2'-O-메틸시티딘을, 또 dT 는 티미딘을 나타낸다.
Daniel O'Reilly 등 저술, Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2, 546-558 에 기재되어 있는 핵산 올리고머 (553 페이지 참조) 를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (C) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (C) : 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (서열 번호 3) 36 mer
일본 특허공보 제4965745호에 기재되어 있는 핵산 올리고머를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (D) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (D) : 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3' (서열 번호 4, 5) 49 mer
서열 (D) 중, "P" 는, 이하의 식 (A5) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다.
또한, 서열표 중의 서열 번호 4 의 기재는, 서열 (D) 의 5' 말단부터「P」전까지의 하기의 서열 (D1) 의 염기 서열을 나타내고, 서열 번호 5 의 기재는, 서열 (D) 의「P」후부터 3' 말단까지의 하기의 서열 (D2) 의 염기 서열을 나타낸다.
서열 (D1) : 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3' (서열 번호 4) 23 mer
서열 (D2) : 5'-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3' (서열 번호 5) 25 mer
Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2 : 547 에 기재되어 있는, 하기의 서열 (E) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (E) : 5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3' (서열 번호 6) 67 mer
일본 공표특허공보 2015-523856호, 173 페이지에 기재되어 있는, 하기의 서열 (F) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (F) : 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (서열 번호 7) 94 mer
일본 공표특허공보 2017-537626호에 기재되어 있는 핵산 올리고머를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (G), (H), (I), 및 (J) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (G) : 5'-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호 8) 100 mer
서열 (H) : 5'-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (서열 번호 9) 113 mer
서열 (I) : 5'-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (서열 번호 10) 113 mer
서열 (I) 중, dT 는 티미딘을, dC 는 2'-데옥시시티딘을, dA 는 2'-데옥시아데노신을, 또 dG 는 2'-데옥시구아노신을 나타낸다.
서열 (J) : 5'-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3' (서열 번호 11) 113 mer
서열 (J) 중, Um 은 2'-O-메틸우리딘을, Am 은 2'-O-메틸아데노신을, Gm 은 2'-O-메틸구아노신을, 또 s 는 포스포로티오에이트 수식을 나타낸다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
＜측정 방법＞
먼저, 이하의 시험에서 사용한 각종 측정 방법을 이하에 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 순도는, HPLC 를 사용하여 측정하였다.
HPLC 측정 조건을 하기 표 1 에 나타낸다.
(측정 방법 1 : 올리고뉴클레오티드 순도의 측정)
Figure pct00020
(측정 방법 2 : 올리고뉴클레오티드 수량의 측정)
미정제 생성물의 OD260 을 측정하였다. OD260 이란 1 mL 용액 (pH ＝ 7.5) 에 있어서의 10 ㎜ 광로 길이당의 UV 260 ㎚ 의 흡광도를 나타낸다. 일반적으로 RNA 에서는 1O D ＝ 40 μg 인 것이 알려져 있는 점에서, 상기 OD260 의 측정값에 기초하여 수량을 산출하였다.
(측정 방법 3 : 포름알데히드 농도의 측정)
디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드 농도 측정 방법에는, 가스 크로마토그래프법 또는 고속 액체 크로마토그래프법이 있다. 가스 크로마토그래프법에서는 포름알데히드를 직접 분석하여 농도를 산출한다. 고속 액체 크로마토그래프법에서는, 포름알데히드와 아세틸아세톤을 반응시켜, 얻어진 3,5-디아세틸-1,4-디하이드로루티딘의 양을 측정하고, 포름알데히드의 농도를 산출한다.
＜디클로로아세트산 용액의 조제＞
이하의 시험에서 사용한 포름알데히드 농도가 상이한 디클로로아세트산 용액은, 미리 포름알데히드 농도가 낮은 디클로로아세트산 용액을 조제하고, 얻어진 디클로로아세트산 용액에 포름알데히드 수용액을 첨가하여 조제하였다.
＜올리고뉴클레오티드의 고상 합성＞
서열 (I) : 5'-GGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호 12) 20 mer
서열 (II) : 5'-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호 13) 50 mer
서열 (III) : 5'-AUAACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호 14) 100 mer
상기 서열 (I), (II) 및 (III) 중, "A" 는, 이하의 식 (A1) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다. "C" 는, 이하의 식 (A2) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다. "G" 는, 이하의 식 (A3) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다. "U" 는, 이하의 식 (A4) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다. 또한, 3' 말단의 "U" 는, 이하의 식 (A8) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다. 또, 서열 (I) 중, 5' 말단의 "G" 는, 이하의 식 (A6) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내고, 서열 (II) 및 (III) 중, 5' 말단의 "A" 는, 이하의 식 (A7) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타낸다.
[화학식 20]
Figure pct00021
[화학식 21]
Figure pct00022
[화학식 22]
Figure pct00023
[화학식 23]
Figure pct00024
[화학식 24]
Figure pct00025
[화학식 25]
Figure pct00026
[화학식 26]
Figure pct00027
[화학식 27]
Figure pct00028
고상 담체로서, Controlled Pore Glass (CPG) 를 사용하고, 핵산 합성기로서 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 를 사용하여, 포스포르아미다이트 고상 합성법에 의해, 상기 서열 (I), (II) 및 (III) 으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성은, 약 1 μmol 스케일로 실시하였다. 또, 합성에는, US2012/0035246 의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트 (A11), 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트 (A9), 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트 (A12), 및 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트 (A10) 를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캐핑 용액으로서 페녹시아세트산 무수물 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다.
[화학식 28]
Figure pct00029
[화학식 29]
Figure pct00030
[화학식 30]
Figure pct00031
[화학식 31]
Figure pct00032
다음으로, 본 발명의 제법에 의해 제조되는 올리고뉴클레오티드 (핵산 올리고머) 의 구체적인 제조예를 나타낸다. 여기서, 하기의 실시예에 있어서 본 발명의 제법에 의해 제조되는 올리고뉴클레오티드는, 상기 서열 (I), (II) 및 (III) 을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
또, 이하의 실시예 및 비교예 중에 기재하는 우리딘 유도체란, 하기의 구조식으로 나타내는 화합물을 의미한다. 하기 구조식에 있어서 도시된 서클은, CPG 를 모식적으로 나타내는 것이다.
[화학식 32]
Figure pct00033
(실시예 1)
0.98 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 식 (A9), 식 (A10), 식 (A11), 또는 식 (A12) 에 나타내는 아미다이트를 사용하여, 서열 (I) 에 나타내는 핵산 올리고머를 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 에 의해, 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 자동 합성하였다. 자동 합성의 순서는, 먼저, 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 트리틸 보호기를 탈보호하였다. 이 때, 사용한 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드 농도는, 측정 방법 3 에 의해 측정할 수 있고, 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 는, 43 × 10-7 이었다. 계속해서, 각종 아미다이트와 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 수산기에 커플링 반응을 진행시켰다. 계속해서, 50 mM 요오드를 포함하는 산화 용액을 송액하고, 아인산기를 인산기로 변환하였다. 계속해서, 캐핑 용액으로서 0.1 M 페녹시아세트산 무수물 아세토니트릴 용액과 10 ％ N-메틸이미다졸/10 ％ 2,6-루티딘아세토니트릴 용액을 사용하여, 커플링이 진행되지 않은 반응점에 캐핑을 실시하였다. 추가로 이들 공정을 합계 19 회 반복한 후, 5' 말단의 염기에 있어서의 보호기 (DMTr 기) 를 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액으로 탈보호하고, 서열 (I) 에 나타내는 서열의 핵산 올리고뉴클레오티드를 CPG 담체 상에 합성하였다. 그 후, 0.98 μmol 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체에 대해, 28 ％ 암모니아수 1.5 mL 와 에탄올 0.5 mL 를 유입하고, 혼합물을 40 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 유리시킨 후, 농축에 의해 용매를 제거하였다. 이어서 유리 올리고뉴클레오티드를 디메틸술폭시드 1.5 mL 에 용해 후, 아세토니트릴 1.0 mL, 니트로메탄 20 μL 와 교반자를 넣은 후, 몰레큘러시브 4A 로 탈수 처리를 실시한 1 M 의 불화테트라-n-부틸암모늄 (TBAF) 의 디메틸술폭시드 용액 2.08 mL 를 스터러에 의한 교반하 실온에서 유입하고, 혼합물을 33 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 2'-EMM 보호기의 탈보호를 실시하였다. 그 후, 핵산 올리고머의 생성물을 침전 조작에 의해 얻었다. 얻어진 생성물에 대해, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 순도는 76.2 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 4032 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 4114 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 2)
실시예 1 의 실험에 있어서, 1.02 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 90 × 10-6 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 75.0 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 4147 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 4066 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(참고예 1)
실시예 1 의 실험에 있어서, 1.03 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 20 × 10-5 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 73.8 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 3979 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 3863 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 3)
1.03 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 식 (A9), 식 (A10), 식 (A11), 또는 식 (A12) 에 나타내는 아미다이트를 사용하여, 서열 (II) 에 나타내는 핵산 올리고머를 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 에 의해, 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 자동 합성하였다. 자동 합성의 순서는, 먼저, 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 트리틸 보호기를 탈보호하였다. 이 때, 사용한 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드 농도는, 측정 방법 3 에 의해 측정할 수 있고, 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 는, 43 × 10-7 이었다. 계속해서, 각종 아미다이트와 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 수산기에 커플링 반응을 진행시켰다. 계속해서, 50 mM 요오드를 포함하는 산화 용액을 송액하고, 아인산기를 인산기로 변환하였다. 계속해서, 캐핑 용액으로서 0.1 M 페녹시아세트산 무수물 아세토니트릴 용액과 10 ％ N-메틸이미다졸/10 ％ 2,6-루티딘아세토니트릴 용액을 사용하여, 커플링이 진행되지 않은 반응점에 캐핑을 실시하였다. 추가로 이들 공정을 합계 49 회 반복한 후, 5' 말단의 염기에 있어서의 보호기 (DMTr 기) 를 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액으로 탈보호하고, 서열 (II) 에 나타내는 서열의 핵산 올리고뉴클레오티드를 CPG 담체 상에 합성하였다. 그 후, 1.03 μmol 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체에 대해, 28 ％ 암모니아수 1.5 mL 와 에탄올 0.5 mL 를 유입하고, 혼합물을 40 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 유리시킨 후, 농축에 의해 용매를 제거하였다. 이어서 유리 올리고뉴클레오티드를 디메틸술폭시드 1.5 mL 에 용해 후, 아세토니트릴 1.0 mL, 니트로메탄 20 μL 와 교반자를 넣은 후, 몰레큘러시브 4A 로 탈수 처리를 실시한 1 M 의 불화테트라-n-부틸암모늄 (TBAF) 의 디메틸술폭시드 용액 2.08 mL 를 스터러에 의한 교반하 실온에서 유입하고, 혼합물을 33 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 2'-EMM 보호기의 탈보호를 실시하였다. 그 후, 핵산 올리고머의 생성물을 침전 조작에 의해 얻었다. 얻어진 생성물에 대해, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 순도는 50.8 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 9156 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 8889 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 4)
실시예 3 의 실험에 있어서, 1.05 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 90 × 10-6 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (II) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 47.8 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 9378 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 8931 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(참고예 2)
실시예 3 의 실험에 있어서, 1.05 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 20 × 10-5 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (II) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 42.8 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 9307 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 8864 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 5)
0.99 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 식 (A9), 식 (A10), 식 (A11), 또는 식 (A12) 에 나타내는 아미다이트를 사용하여, 서열 (III) 에 나타내는 핵산 올리고머를 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 에 의해, 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 자동 합성하였다. 자동 합성의 순서는, 먼저, 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 트리틸 보호기를 탈보호하였다. 이 때, 사용한 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드 농도는, 측정 방법 3 에 의해 측정할 수 있고, 디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 는, 43 × 10-7 이었다. 계속해서, 각종 아미다이트와 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 CPG 에 송액하고, 5' 위치의 수산기에 커플링 반응을 진행시켰다. 계속해서, 50 mM 요오드를 포함하는 산화 용액을 송액하고, 아인산기를 인산기로 변환하였다. 계속해서, 캐핑 용액으로서 0.1 M 페녹시아세트산 무수물 아세토니트릴 용액과 10 ％ N-메틸이미다졸/10 ％ 2,6-루티딘아세토니트릴 용액을 사용하여, 커플링이 진행되지 않은 반응점에 캐핑을 실시하였다. 추가로 이들 공정을 합계 99 회 반복한 후, 5' 말단의 염기에 있어서의 보호기 (DMTr 기) 를 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액으로 탈보호하고, 서열 (III) 에 나타내는 서열의 핵산 올리고뉴클레오티드를 CPG 담체 상에 합성하였다. 그 후, 1.03 μmol 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체에 대해, 28 ％ 암모니아수 1.5 mL 와 에탄올 0.5 mL 를 유입하고, 혼합물을 40 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 유리시킨 후, 농축에 의해 용매를 제거하였다. 이어서 유리 올리고뉴클레오티드를 디메틸술폭시드 1.5 mL 에 용해 후, 아세토니트릴 1.0 mL, 니트로메탄 20 μL 와 교반자를 넣은 후, 몰레큘러시브 4A 로 탈수 처리를 실시한 1 M 의 불화테트라-n-부틸암모늄 (TBAF) 의 디메틸술폭시드 용액 2.08 mL 를 스터러에 의한 교반하 실온에서 유입하고, 혼합물을 33 ℃ 에서 4 시간 보온함으로써 2'-EMM 보호기의 탈보호를 실시하였다. 그 후, 핵산 올리고머의 생성물을 침전 조작에 의해 얻었다. 얻어진 생성물에 대해, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 순도는 33.1 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 12889 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 13019 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 6)
실시예 5 의 실험에 있어서, 1.04 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 90 × 10-6 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (III) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 29.7 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 13375 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 12861 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(참고예 3)
실시예 5 의 실험에 있어서, 0.99 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 20 × 10-5 인 3 ％ 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 서열 (III) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 순도를 측정한 결과, 생성물의 순도는 26.4 ％ 였다. 또, 상기 측정 방법 2 에 기재된 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오티드의 수량을 측정한 결과, 수량은 12675 μg 이고, 1.00 μmol 의 우리딘 유도체를 담지한 CPG 당의 수량으로 환산하면 12803 μg 이었다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
(실시예 7)
포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가 25 × 10-5 인 디클로로아세트산 용액 30 g 에, 톨루엔 300 mL 를 첨가하고, 이배퍼레이터를 사용하여, 40 ℃ 에서 톨루엔과 포름알데히드를 공비 증류 제거하여, 미황색 유상의 디클로로아세트산 용액 34 g 을 얻었다. 얻어진 디클로로아세트산 용액에 포함되는 포름알데히드를 측정 방법 3 에 기재된 방법으로 분석한 결과, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비는, 43 × 10-7 이었다.
Figure pct00034
상기 표 2 의 결과로부터, 포름알데히드 농도가 일정 이하인 본 발명의 디클로로아세트산 용액을 사용한 경우에는, 참고예 1, 참고예 2 및 참고예 3 의 디클로로아세트산 용액을 사용한 경우와 비교하여, 고수율로 핵산 올리고머가 얻어졌다.
본 발명은, 효율적인 핵산 올리고머의 제조 방법을 제공한다. 또, 핵산 올리고머의 제조 방법에 따라 제조되는 핵산 올리고머의 수율 향상을 기대할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열표의 서열 번호 1 ∼ 14 는, 본 발명의 제조 방법에 따라 제조되는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> METHOD FOR PRODUCING NUCLEIC ACID OLIGOMER <130> S44572WO01 <150> JP 2020-058880 <151> 2020-03-27 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7), (17)..(17) <223> um <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> dT <400> 1 auggaanacu cuuggunacn n 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (12)..(12), (14)..(15), (19)..(19) <223> um <220> <221> modified_base <222> (5)..(6), (16)..(17) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> dT <400> 2 gnaannaaga gnannnnann n 21 <210> 3 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 agagccagcc uucuuauugu uuuagagcua ugcugu 36 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ccaugagaag uaugacaaca gcc 23 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 ggcuguuguc auacuucuca ugguu 25 <210> 6 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu 60 cggugcu 67 <210> 7 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 guuuucccuu uucaaagaaa ucuccugggc accuaucuuc uuaggugccc ucccuuguuu 60 aaaccugacc aguuaaccgg cugguuaggu uuuu 94 <210> 8 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 aguccucauc ucccucaagc guuuuagagc uaguaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 9 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gcagauguag uguuuccaca guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 113 <210> 10 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1), (8)..(8), (17)..(18) <223> dA <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (19)..(19) <223> dG <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (6)..(6), (9)..(9), (11)..(11), (15)..(15) <223> dT <220> <221> modified_base <222> (4)..(5), (7)..(7), (10)..(10), (12)..(14), (16)..(16), (20)..(20) <223> dC <400> 10 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uaugcuggua acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 113 <210> 11 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> am <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (110)..(112) <223> um <400> 11 nnnccucauc ucccucaagc guuuaagagc uaugcuggua acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuun nnu 113 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 ggcaccgagu cggugcuuuu 20 <210> 13 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 50 <210> 14 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 auaacucaau uuguaaaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (24)

  1. 식 (1) :
    Figure pct00035

    (식 중,
    G2 는, 수산기의 보호기를 나타내고,
    Ba 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
    R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자 또는 알콕시기를 나타내고,
    R 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
    Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합되어 있는 에틸리덴기를 나타내고,
    Y 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    n 은, 1 ∼ 200 중 어느 정수를 나타내고,
    W1 은, OZ 기를 나타내고, 또한, X1 은, R 기를 나타내거나, 혹은
    W1 은, OV 기를 나타내고, 또한, X1 은, OZ 기를 나타내고,
    V 는, 수산기의 보호기를 나타내고,
    Z 는, 고상 담체 및 연결기로 이루어지는 구조를 갖는 기이다.
    그리고, n 이 2 이상의 정수일 때, 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머는, 각각의 뉴클레오티드 사이에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
    로 나타내는 핵산 올리고머와, 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 90 × 10-6 이하인 디클로로아세트산 용액을 반응시키는 공정을 포함하는, 식 (2) :
    Figure pct00036

    (식 중,
    G2, Ba, R, Y, X1, W1 및 n 은, 상기와 같고, 그리고,
    식 (1) 에 있어서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 사이에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
    로 나타내는 핵산 올리고머의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 기재된 공정과, 추가로, 당해 공정에서 생성하는 식 (2) 로 나타내는 핵산 올리고머로부터 Z 로 나타내는 기를 제거하는 공정, 그리고 수산기 및 핵산 염기의 보호기를 제거하는 공정을 포함하는, 식 (2') :
    Figure pct00037

    (식 중,
    Y 및 n 은, 상기와 같고,
    Bc 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 핵산 염기를 나타내고,
    G4 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
    R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
    Q' 는, 상기와 같고,
    X3 및 W3 은 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
    X3 은, R' 기를 나타내고, 또한, W3 은, 수산기를 나타낸다.)
    로 나타내는 핵산 올리고머의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    식 (2) 로 나타내는 핵산 올리고머를, 아미다이트법으로 임의로 사슬 길이를 신장시킨 식 (3) :
    Figure pct00038

    (식 중,
    G2, Ba, R, Y, X1 및 W1 은, 상기와 같고,
    G5 는,
    Figure pct00039

    로 나타내는 수산기의 보호기, 혹은 수소 원자를 나타내고,
    R1, R2 및 R3 은, 상기와 같고,
    m 은, m ≥ n 을 만족하는 정수이다.)
    으로 나타내는 핵산 화합물을 얻는 공정, 그리고
    식 (3) 으로 나타내는 화합물로부터 식 (4) :
    Figure pct00040

    (식 중,
    G5, R, Y 및 m 은, 상기와 같고,
    G4 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
    BC 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 핵산 염기를 나타내고,
    X2 는, 수산기를 나타내고, 또한, W2 는, OV 기를 나타내거나, 혹은
    X2 는, R 기를 나타내고, 또한, W2 는, 수산기를 나타내고,
    V 는, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
    로 나타내는 화합물을 절단하고,
    추가로 식 (4) 로 나타내는 화합물을 탈보호하여, 식 (5) :
    Figure pct00041

    (식 중,
    G4, Bc, Y 및 m 은, 상기와 같고,
    R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
    Q' 는, 상기와 같고,
    X3 및 W3 은 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
    X3 은, R' 기를 나타내고, 또한, W3 은, 수산기를 나타낸다.)
    로 나타내는 핵산 올리고머를 제조하는 공정을 추가로 포함하는, 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비뉴클레오티드 링커가, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커인, 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    아미노산 골격으로 이루어지는 링커가, 하기 식 (A14-1), (A14-2) 및 (A14-3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 구조를 갖는 링커인, 제조 방법.
    Figure pct00042

    (식 중, Y 는, 상기와 같다.)
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디클로로아세트산 용액이, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 방향족 유기 용매로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 포함하는, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 43 × 10-6 이하인, 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    디클로로아세트산 용액 중의 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 22 × 10-6 이하인, 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 리보핵산 (RNA) 인, 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 리보핵산 (RNA) 이고, 그 리보스의 2' 위치의 수산기의 보호기가, 식 (6) 으로 나타내는 보호기인, 제조 방법.
    식 (6) :
    Figure pct00043

    (식 중,
    q 는, 1 ∼ 5 중 어느 정수를 나타내고,
    Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타내고,
    * 표시는, 리보스의 2' 위치의 수산기 유래의 산소 원자와의 결합점을 나타내고, 그리고,
    EW 는, 전자 구인기를 나타낸다.)
  11. 제 10 항에 있어서,
    Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자이고, 또한, EW 가 시아노기인, 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 40 사슬 길이 이상의 올리고머인, 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 50 사슬 길이 이상의 올리고머인, 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 60 사슬 길이 이상의 올리고머인, 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 80 사슬 길이 이상의 올리고머인, 제조 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 올리고머가, 100 사슬 길이 이상의 올리고머인, 제조 방법.
  17. 포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 90 × 10-6 이하인, 디클로로아세트산 용액.
  18. 제 17 항에 있어서,
    포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 43 × 10-6 이하인, 디클로로아세트산 용액.
  19. 제 17 항에 있어서,
    포름알데히드와 디클로로아세트산의 몰비 (포름알데히드 mol/디클로로아세트산 mol) 가, 22 × 10-6 이하인, 디클로로아세트산 용액.
  20. 포름알데히드를 포함하는 미정제 디클로로아세트산 용액과 포름알데히드와 공비하는 용매를 포함하는 용액으로부터 포름알데히드를 공비시켜 증류 제거함으로써 정제 디클로로아세트산 용액을 얻는 공정을 포함하는, 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 디클로로아세트산 용액의 제조 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    공비 용매의 비점이, 194 ℃ 이하인, 제조 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    공비 용매가, 디클로로메탄, 아세토니트릴 또는 방향족 유기 용매인, 제조 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    방향족 유기 용매가 톨루엔인, 제조 방법.
  24. 제 20 항에 기재된 디클로로아세트산 용액의 정제 공정 및 당해 공정에서 얻어진 정제 디클로로아세트산 용액을 사용하는 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 공정을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
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