KR20220164111A

KR20220164111A - 줄기세포 유래 스페로이드형 초자연골세포 분화방법 내지 이의 용도

Info

Publication number: KR20220164111A
Application number: KR1020210072171A
Authority: KR
Inventors: 김동성; 주지현; 남유준; 임예리; 이성진; 김도희
Original assignee: 셀로이드 주식회사
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: WO2022255841A1; KR102747632B1; US20240200032A1

Abstract

본 발명은 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법 내지 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 줄기 세포를 응집하여 줄기세포응집체로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로 웰에서 저산소 조건으로 배양한 후, 이를 산소, 연골 분화 유도 인자 (TGF-β, BMP-2) 및 성장인자를 포함하는 배지는 투과하여 이동할 수 있는 나노 섬유로 이루어진 투과성 튜브 또는 마이크로웰으로 옮겨 분화하는 방법은, 기존의 지속적으로 불투과성 웰에서만 배양 및 분화를 수행하는 방법과 비교하여 스페로이드형 줄기세포로부터 초자연골로의 분화 효율이 높아지는 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우 초자연골 함유량이 높은 줄기세포 유래 세포응집체형 연골 치료제의 생산이 가능하며, 체내에 이식한 경우 유의적으로 증가된 치료 효과를 제공할 수 있다.

Description

줄기세포 유래 스페로이드형 초자연골세포 분화방법 내지 이의 용도 {Method for differentiation　to　stem cell derived hyaline cartilage spheroid and uses thereof}

본 발명은 줄기세포응집체로 응집한 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법 내지 이의 용도에 대한 것이다.

퇴행성관절염, 연골판 및 인대 파열 등과 같은 연골 질환은 관절연골이 파괴되는 질환으로 관절을 이루는 뼈와 인대에 까지 손상이 이어져 염증과 심한 통증을 동반하여 체형변화 및 행동 제약을 유발하는 심각한 난치성 질환이다. 건강한 관절 연골은 뼈 끝의 관절 단면이 탄성 유리질(Hyaline)으로 구성되어 외부 충격을 완화하거나 뼈 사이의 마찰을 줄인다. 연골 관절의 손상 또는 퇴행 과정 중에 기계적 물성이 높으며 탄성 특성의 초자연골(유리질 연골, Hyaline cartilage)이 점차 기계적 물성이 낮은 섬유연골(Fibrous cartilage)로 변화되면서 연골 관절의 제 기능을 수행 할 수 없게 된다. 관절 연골은 손상 또는 퇴행을 겪으면 혈관과 신경 그리고 림프선이 없으므로 스스로 재생할 수 있는 능력이 거의 없는 비가역적 조직이기 때문에 연골재생 치료를 위해서는 미세천공술(Microfracture), 자가연골세포 이식술(Autologous chondrocyte implantation, ACI) 또는 줄기세포치료(Stem cell therapy)등의 내생(Endogenous) 또는 외생(Exogenous)의 세포 기반 치료방법이 필수적이다.

미세천공술을 통해 재생시킨 연골 조직은 초자연골이 아닌 섬유연골로 구성되기 때문에 정상 연골 조직 대비 기계적으로 약한 물성을 갖게 되는 한계가 있으며, 자가연골세포이식술은 신체 전반의 노화가 진행된 환자의 경우 연골재생에 적합한 건강한 연골세포를 분리하는 것이 불가능 하기 때문에 제한된 환자에게만 적용 가능하는 등 제한된 치료법이다. 이에 반해 최근에 각광 받고 있는 줄기세포치료는 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, MSC)로부터 유도되는 주변분비효능(Paracrine effect)에 의한 연골재생 효과를 기대할 수 있어 차세대 연골재생 치료법으로 그 가능성을 인정받고 있다.

상기 줄기세포치료처럼 다분화능(Multipotent)의 미분화 중간엽줄기세포(Undifferentiated MSC)를 이식하는 치료법은 환자에 따라 그 효과가 상이할 수 있다. 이는 이식된 미분화 줄기세포가 다양한 환자 특이적 병변 환경에 의해 분화 양상의 예측 및 조절이 불가능하기 때문이다. 이를 극복하기 위해서는 중간엽줄기세포를 체외에서 안정적으로 양질의 초자연골로 사전 분화시켜 체내에 이식하는 방법이 필요하다.

실제 몸속의 세포는 3차원의 형상을 이루고 있으며 세포와 주변 조직 및 세포외기질(Excellular matrix, ECM) 등의 세포 미세환경과도 3차원으로 상호작용 한다. 체외에서 세포를 3차원이 아닌 2차원의 단일층(Monolayer)으로 배양할 경우 체내의 세포와 유사성이 크게 결여 되어 전반적인 세포의 기능이 저하된다. 줄기세포도 일반적인 세포와 마찬가지로 2차원 단일층 세포배양법의 한계를 극복하기 위해 3차원 세포 응집체(3D cell aggregation) 즉, 스페로이드(Spheroid) 배양 방법이 최근에 널리 활용 되고 있다. 스페로이드형의 줄기세포를 타겟 세포로 분화하는 과정에서 높은 분화 수율을 보장 하기 위해서는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드 주변에 균일한 세포미세환경(Cellular microenvironment)를 유도하는 것이 중요하다. 그 이유는 스페로이드 주변 환경이 공간적으로 균일하지 않다면 스페로이드의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 나머지 일부분은 타겟 세포로 분화되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되기 때문이다.

대한민국 등록특허 제10-2224065호 는 다공성 마이크로웰 및 이를 구비한 멤브레인과 그 제조 방법에 대한 것으로서, 멤브레인 내지 다공성 마이크로웰의 공극률을 조절하여 3차원 세포 스페로이드(Spheroid)를 배양하는 발명을 제공한다. 그러나 본원발명과 같이 웰 또는 튜브의 확산에 의한 물질 투과성을 활용하여 스페로이드형 줄기세포 주변 산소농도 또는 분화 인자 농도를 조절하여 초자연골세포로 분화시킬 수 있는 방법 내지 구체적인 조건은 연구되거나 개시된 바 없다.

Kim, Y., Rim, Y. A., Yi, H., Park, N., Park, S. H., & Ju, J. H. (2016). The generation of human induced pluripotent stem cells from blood cells: an efficient protocol using serial plating of reprogrammed cells by centrifugation. Stem Cells International, 2016. 1329459

본 발명자들을 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 줄기세포응집체 주변의 세포미세환경을 균일하게 유도하여 줄기세포로부터 분화된 세포응집체형 연골 세포치료제를 만드는 방법을 연구하던 중 줄기세포를 스페로드형으로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로웰에서 저산소 환경에서 배양한 후, 상기 스페로이드형 줄기세포를 산소 및 분화 인자를 포함한 배지의 투과 및 이동은 허용하나 세포의 이동을 허용하지 않는 나노 섬유로 구성된 투과성 튜브 또는 마이크로웰로 옮겨 배양하면 줄기세포로부터 초자연골세포로의 분화 효율을 향상 시키는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법 내지 이의 용도에 대한 것이다.

본 발명은 a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 제조된 줄기세포응집체를 산소 수준이 0.001 내지 0.15 mol/m³ 인 저산소 조건에서 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포응집체를 투과성 웰 또는 투과성 튜브로 옮긴 후 초자연골세포응집체로 분화시키는 단계;

를 포함하는, 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛ 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 b) 의 배양은 불투과성 웰 또는 불투과성 튜브에서 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소, 연골 분화 유도 인자 및 성장인자는 이동 가능하지만 세포는 이동할 수 없는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 10 nm 내지 1000 nm 직경의 나노섬유 로 구성된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 공극률(Porosity)은 0.05 내지 0.5 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기 세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 재생용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 줄기 세포를 응집하여 줄기세포응집체로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로 웰에서 저산소 조건으로 배양한 후, 이를 산소, 연골 분화 유도 인자 (TGF-β, BMP-2) 및 성장인자를 포함하는 배지는 투과하여 이동할 수 있는 나노 섬유로 이루어진 투과성 튜브 또는 마이크로웰으로 옮겨 분화하는 방법은, 기존의 지속적으로 불투과성 웰에서만 배양 및 분화를 수행하는 방법과 비교하여 스페로이드형 줄기세포로부터 초자연골로의 분화 효율이 높아지는 효과를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우 초자연골 함유량이 높은 줄기세포 유래 세포응집체형 연골 치료제의 생산이 가능하며, 체내에 이식한 경우 유의적으로 증가된 치료 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 스페로이드형 줄기세포를 연골세포로 분화 하는 기존 방법과 본 발명을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에서 활용되는 투과성 튜브 또는 마이크로웰을 딥 드로잉 공정을 활용하여 제작하는 방법으로서, 이의 실제 사진 (전경뷰, 측면뷰), 벽면 두께 (Wall thickness), 나노섬유의 현미경 사진을 나타낸다.
도 3은 기존 방법과 본 발명(개발된 방법)에서 각각 배양되는 스페로이드형 줄기세포 주변의 세포미세환경 (산소 및 TGF-β3)을 각각 나타내는 시뮬레이션과 이의 분석 데이터 관련 도면이다.
도 4는 본 발명(발명된 방법)으로 제조된 세포치료제와 기존 방법으로 배양된 세포치료제의 잠재적 치료효과를 비교분석결과 관련 도면이다.
도 5는 본 발명(발명된 방법)으로 제조된 세포치료제와 기존 방법으로 배양된 세포치료제를 동물 모델에 이식 후 치료효과를 비교분석결과 관련 도면이다.

본 발명에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(Totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (Pluripotent stem cells) 또는 다분화능(다능성) 줄기세포(Multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.

본 발명에서 "세포치료제(Cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미할 수 있다.

본 발명에서 "연골 재생"이란 손상된 연골을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골을 재생(Regeneration)하는 것을 의미할 수 있다.

세포를 2차원 단일층으로 배양할 경우 세포 기능이 저하는 되는 한계를 극복하기 위해 3차원 세포응집체(cell aggregate), 특히 스페로이드(spheroid) 배양 방법을 활용할 수 있다. 이때, 스페로이드형의 줄기세포를 타겟 세포로 분화하는 과정에서 양질의 분화 수율을 보장 하기 위해서는 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드 주변에 균일한 세포미세환경을 유도하는 것이 중요하다. 그 이유는 스페로이드 주변 환경이 공간적으로 균일하지 않다면 스페로이드의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 나머지 일부분은 타겟 세포로 분화되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되기 때문이다.

기존의 줄기 세포를 스페로이드형 연골 세포로 분화 하에 활용 되는 세포는 [도 1] 과 같이 인간 유래 유도 만능 줄기 세포 (Human induced pluripotent cells)를 배아체(embryonic body, EB)를 형성한 후 얻은 줄기 세포인 EB 돌기세포(EB outgrowth cell) 이다. 그 후, 줄기 세포를 불투과성 튜브에서 원심 분리기를 활용하여 응집함으로써 스페로이드형 줄기세포를 제조한 뒤 불투과성 튜브에서 배양 및 분화를 수행하였다. 그러나 이는 스페로이드형 줄기세포 주변에 공간적으로 불균일한 환경이 유도되어 스페로이드형 줄기세포의 일부분은 타겟 세포로 분화가 유도되는 반면 일부 세포는 타겟 세포로 분화 되지 못하고 비 타겟 세포로 분화가 진행되어 분화 수율이 낮다는 한계가 있었다.

이에 본 발명자들을 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 분화하여 세포치료제를 만드는 방법을 연구하던 중 줄기 세포를 스페로드형으로 제조한 뒤 불투과성 튜브 또는 마이크로웰 에서 배양한 후, 상기 스페로이드형 줄기세포를 산소 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β 또는 BMP-2 등), 성장인자를 포함하는 배지의 투과 및 이동은 허용하나 세포의 이동을 허용하지 않는 나노 섬유로 구성된 투과성 튜브 또는 마이크로웰에 배양하면 스페로이드형 줄기세포로부터 초자연골세포로의 분화를 증가시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명자들은 줄기 세포를 원심 분리기를 활용하여 응집함으로써 스페로이드형 줄기세포를 제조한 뒤 저산소 환경의 불투과성 튜브에서 배양하다가 나노섬유로 구성된 투과성 튜브로 옮겨 스페로이드형 초자연골세포로 분화시켰다(도 2). 스페로이드형 줄기 세포를 투과성 튜브로 옮겨서 분화를 수행했기 때문에 수백 ㎛ 내지 수 mm 직경의 스페로이드형 줄기세포 주변의 세포미세환경을 균일하게 유도 및 조성하여 줄기세포로부터 분화된 스페로이드형 초자연골세포를 제조할 수 있었다.

본 발명은 기체 질량 투과성 튜브(tube) 또는 마이크로웰 (microwell)을 제작하기 위해 평평한 나노 섬유막의 마이크로 딥 드로잉 공정을 개발하여 50㎛ 두께의 나노 섬유 벽으로 구성된 3.5 mm 깊이의 튜브 웰을 제작하였다(도 2). 상기 튜브는 기존의 상용 0.4 ㎛ 공극 크기의 투과성 멤브레인 (Polyestere, PET) 보다 투과성이 높았으며 (도 3 a), 불투과성 튜브에서 스페로이드형 줄기세포를 배양 및 분화 하는 방법 보다 산소 (도 3 b) 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β3, BMP-2), 성장인자 (도 3 c) 관련 세포미세환경을 균일하게 유도하는 것을 시뮬레이션으로 확인 하였다.

본 발명의 방법으로 제조한 스페로이드형 초자연골세포 및 기존의 불투과성 튜브로 제조한 스페로이드형 초자연골세포를 비교한 결과, 본 발명의 제조한 스페로이드형 초자연골세포가 COL2a1의 발현량이 증가한 반면에 COL10A1의 발현량은 감소하는 것을 확인하였다(도 4 a). 또한, 본 발명의 방법으로 투과성 웰에서 14일 동안의 분화를 진행한 스페로이드형 줄기세포의 경우 불투과성 원추형 웰에서 21일 동안의 분화를 진행한 스페로이드 대비 연골 관련 유전자 발현량이 비슷하거나 (도 4 b, COL2A1) 우수했다 (도 4 c, ACAN). 이를 통해 본 발명의 방법이 불투과성 튜브만을 활용하여 제작된 제조하는 방법 보다 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 더 빠르게 성숙시키는 것을 확인하였다.

또한, 결손된 쥐의 연골에 본 발명의 연골 치료제와 기존방법으로 제작한 연골 치료제를 각각 이식한 8주 후 이식 부위를 면역 형광 염색법을 통하여 분석하였다. 그 결과, 투과성 웰을 활용하여 제작한 치료제의 경우, 이식 부위에서 초자연골 관련 세포외기질인 Type II collagen이 불투과성 원추형 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제 대비 우수하게 발현 되는 반면에, 뼈 관련 세포외기질인 Type X collagen은 오히려 적게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

따라서, 본 발명은 a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조하는 단계;

를 포함하는, 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법 을 제공할 수 있다.

본 발명의 '줄기세포응집체', '초자연골세포응집체'또는 세포응집체형은 즐기세포, 초자연골세포 등의 세포가 평면(2차원 단일층)이 아닌 입체적(3차원)으로 응집되어 있는 모든 형태를 의미할 수 있으며, 바람직하게는 스페로이드(Spheroid)형 을 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1500 ㎛일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1000 ㎛ (1 mm) 일 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 줄기세포응집체를 초자연골로 안정적으로 배양 및 분화하기 위해 나노섬유로 설계 및 구성 되었으며 제작할 스페로이드형 초자연골세포의 크기에 따라 펀치 및 다이의 규격을 조절하여 투과성 웰 또는 투과성 튜브의 입구 직경 및 깊이는 조절할 수 있다. 상기 웰 또는 튜브의 입구 직경은 1 mm 내지 10 mm 일 수 있으며, 바람직하게는 3 mm 내지 7 mm 일 수 있고, 보다 바람직하게는 5mm 일 수 있다. 상기 웰 또는 튜브의 깊이는 1 mm 내지 5 mm 일 수 있으며, 바람직하게는 2 mm 내지 4 mm 일 수 있고, 보다 바람직하게는 3.5 mm 일 수 있다. 또한 상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브의 벽면 두께는 전기방사로 제작된 나노섬유 멤브레인의 두께에 따라 조절 가능하다. 상기 웰 또는 튜브의 벽면 두께는 10 ㎛ 내지 50 ㎛ 일 수 있으며, 바람직하게는 25 ㎛ 내지 40 ㎛ 일 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소 및 연골 분화 유도 인자 (TGF-β, BMP-2), 성장인자를 포함하는 배지의 이동을 허용하나 세포 이동을 허용하지 않을 수 있다.

상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브를 구성하는 나노섬유는, 직경이 10 nm 내지 1000 nm 이며, 배지 및 공기의 이동을 허용하나 세포 이동을 허용하지 않을 수 있다. 상기 투과성 웰은 투과성 마이크로 웰일 수 있으나, 이에 제한되는 않는다. 나노 섬유의 직경은 이에 국한 되는 것은 아니며 상기 PCL 용액의 농도에 따라 조절 가능하다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 투과성 웰 또는 투과성 튜브의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s 인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 줄기 세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 제대혈 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 TGF-β 는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 TGF-β3 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 재생용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

상기 연골은 초자연골(Hyaline cartilage), 섬유연골(Fibrocartilage) 또는 탄성연골(Elastic cartilage)등을 포함하며, 예를 들어, 관절연골(Articular cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(Meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 또는 척추 연골일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

투과성 튜브의 제작

<1-1> 기체 및 질량 투과성 나노 섬유 막의 제조를 위한 전기 방사

폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL; Mn = 80,000 g mol^-1), 클로로포름 및 메탄올은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다. 전기 방사를 위한 PCL 용액은 7.5w t% 농도의 클로로포름/메탄올(3/1 vol/vol)의 혼합물에 PCL을 용해하여 준비하였다. 준비된 PCL 용액을 5 ㎖ 정밀 주사기(Gastight syringe; Hamilton)에 넣고 상업용 전기 방사 기계(ES-robot, NanoNC)를 사용하여 직경 5cm의 고리 모양 전극 위에 10cm 거리를 두고 배치된 23 게이지 금속 바늘을 통하여 1 ㎖/h 의 유속으로 토출 하였다. 금속 바늘과 고리 모양의 전극 사이에 상기 상업용 전기방사 기계를 활용하여 15kV의 고전압을 가하여 전기 방사를 수행하였다. 전기 방사된 PCL 나노 섬유(As-electrospun PCL nanofiber)는 고리 모양 전극 사이에 증착되어 기체 및 질량 투과성 나노 섬유 멤브레인을 생성하였다. 전기 방사는 상대 습도 50 ~ 60 %, 온도 20 ~ 25 ℃에서 실시하였다.

<1-2> 펀치 및 다이 제작

폴리디메틸실록산 (Polydimethylsiloxane; PDMS)로 구성된 펀치를 제작하기 위해 10:1의 중량비로 PDMS와 경화제의 혼합물 (Sylgard 184, Dow Corning, USA)을 15 ㎖ 원뿔형 튜브 (Corning, USA)에 붓고 55℃ 에서 12 시간 동안 경화 했다. 레이저 절단기 (ML-7050A, Machineshop)를 사용하여 두께 20 mm의 폴리메틸메타크릴레이트 (Poly (methyl methacrylate); PMMA) 플레이트를 천공하여 관통 구멍을 가진 다이를 제조하였다.

<1-3> 투과성 웰(well)의 제작

펀치의 높이는 높이 조절이 가능하며 모터로 구동되는 스테이지(KS162-200, Suruga Seiki, Japan) 로 조절되었다. 평평한 나노 섬유 멤브레인은 펀치와 다이 사이에 위치하였다. 펀치를 다이의 관통 구멍 2.0 mm/s 의 속도로 다이에 삽입함에 따라 평평한 나노 섬유 멤브레인이 투과성 튜브 웰로 형상을 변형하여 제작하였다 (도 2). 제작된 투과성 웰의 입구 직경은 5 mm 이며 깊이는 3.5 mm 이다 (도 2 (b) i, ii). 이는 1 mm 크기의 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 안정적으로 배양 및 분화하기 위해 설계되었으며 제작할 스페로이드형 초자연골세포의 크기에 따라 펀치 및 다이의 규격을 조절하여 투과성 웰의 입구 직경 및 깊이는 조절 가능하다. 또한, 투과성 웰의 벽면 두께 (S1 - S3, 약 40 ㎛ 내지 25 ㎛)는 실시예 <1-1> 에서 제작한 나노 섬유 멤브레인의 두께(약 100 ㎛) 대비 얇게 제작 되었다. 투과성 웰의 벽면 두께는 이에 국한되는 것은 아니며, 전기방사로 제작된 나노섬유 멤브레인의 두께에 따라 조절 가능하다.

투과성 웰의 특성평가 (모양, 투과도, 벽면 두께, 나노섬유 구조)

투과성 웰(well)의 모양은 카메라 (EOS650, Canon, Japan)로 촬영하였다. 투과성은 멤브레인을 투과도는 20kDa Fluorescein(FITC)-dextran의 확산을 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 제작된 투과성 나노 섬유 웰을 12 웰 플레이트에 넣은 후, 1.5 ㎖ 의 인산 완충 식염수를 웰 인서트의 기저 측면에 붓고, 웰 인서트의 상측액에 0.5 ㎖ 의 200 ㎍/㎖ FITC-dextran 용액을 첨가하였다. 실온에서 1 시간 후, 샘플 용액의 100 ㎕ 를 기저 측면에서 수집하여 96 웰 플레이트에 넣었다. 96 웰 챔버의 형광 이미지를 위상차 반전 형광 현미경 (Eclipse TS100, Nikon, Japan)으로 얻고 이를 MATLAB 프로그램으로 분석하였다. PDMS 내부에 투과성 웰을 위치시킨 샘플을 제작하고 이의 단면을 광학현미경 (Eclipse 80i, Nikon, Japan)으로 촬영하여 벽면 두께를 측정하였다. 투과성 웰의 주사 전자 현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이미지는 전계 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM, SU6600, Hitachi, Japan)으로 촬영 하였다. 제작된 투과성 웰을 구성하는 나노섬유의 직경은 800 nm - 1000 nm 이었다 (도 2 (b) iv). 나노섬유의 직경은 이에 국한 되는 것은 아니며 상기 PCL 용액의 농도에 따라 조절 가능하다. 나노 섬유에 의해 형성된 공극의 크기는 0.1 ㎛ - 10 ㎛ 이며 (도 2 (b) iv) 이는 세포는 투과 및 이동 할 수 없는 크기이나 배지는 투과 및 이동이 가능하다. 또한, 투과성 웰의 투과도(Permeability)는 3.7Х10^-5 cm/s 이었으며 이는 상용 0.4 ㎛ 공극 크기의 투과성 멤브레인 대비 2배 이상 높았다 (도 3 a). 반면, 불투과성 원추형 튜브의 투과도는 0 이었다 (도 3 a).

스페로이드 주변의 산소 수준 및 TGF-β3 농도 분석

스페로이드형 줄기세포 주변의 산소 수준과 TGF-β3 농도의 수치 시뮬레이션은 COMSOL Multiphysics 소프트웨어 (Version 5.0, USA)에 의해 수행되었다. 수치 시뮬레이션에 사용된 모든 형상은 불투과성 원추형 튜브 및 투과성 웰의 형상과 동일하였다. 불투과성 원추형 튜브와 투과성 웰 내에서 스페로이드형 줄기세포 (구형)의 평균 직경 1 mm 에 해당하는 영역을 지정 하였다. 초기 산소 수준은 0.181 mol/m³으로 설정되었으며, 이는 세포 배양 인큐베이터의 140 mm Hg 에서의 초기 산소 수준을 인용하였다. 스페로이드형 줄기세포 표면을 따라 산소 소비율은 이전 연구에서 실험적으로 측정된 연골 조직의 산소 소비율을 인용하여 8.2Х10^-3 mol/m³ s 로 설정되었다. 배양액 내 산소의 확산 계수는 2Х10^-9 m²/s이었다. TGF-β3의 실험 농도가 10 ng/㎖ 인 상황을 반영하여 TGF-β3의 초기 조건은 0.4 μmol m^-3으로 설정되었다. TGF-β3의 소비율을 추정하기 위해, 스페로이드형이 2 일마다 제공되는 신선한 배지에서 TGF-β3의 90 % 를 소비한다고 가정하고, 스페로이드의 TGF-β3 소비율을 5.6 Х 10^-11 mol/m³s 로 설정하였다. TGF-β3 의 확산 계수는 분자량을 반영하여 2.7 Х 10^-11 m²/s 이었다. 투과성 웰의 공극률(Porosity)은 Millington-Quirk 모델을 사용하여 투과성 물질 내에서의 용질 확산성을 예측하기 위해 0.1 로 설정하였다.

그 결과, 불투과성 원추형 웰 내에서는 스페로이드형 줄기세포의 아랫부분(Lower)과 윗부분(Upper)의 산소 수준 차이는 극명하게 시뮬레이션을 통해 확인되었으며 (도 3 b (i); 기존 방법) 스페로이드형 줄기세포의 표면의 산소 수준을 수치화 하였을 때도 아랫부분과 윗부분의 산소 수준 차이를 확인할 수 있었다 (도 3 b (ii); 기존 방법). 반면, 투과성 웰 내부에서는 스페로이드형 줄기세포 주변에 균일한 산소 수준이 확인되었다 (도 3 b (i), (ii); 개발된 방법). 산소 결과와 유사하게, 불투과성 원추형 웰 (기존 방법) 대비 투과성 웰(개발된 방법) 내 스페로이드형 줄기세포 주변 TGF-β3의 농도도 균일하게 형성 되는 것을 확인하였다(도 3 c). 이틀 간격으로 사용된 배지가 신선한 배지로 교환 되는 상황을 시뮬레이션 하여, 불투과성 원추형 웰 내 스페로이드형 줄기세포 대비 투과성 웰 내 스페로이드형 줄기세포 주변에 높은 TGF-β3 농도가 배양 기간 (15일) 동안 인가되는 것을 확인하였다. 산소 수준 및 TGF-β3 농도를 대표적으로 분석하였지만, 스페로이드형 줄기세포를 초자연골로 분화 하는 것에 영향을 끼칠 수 있는 다른 분화 인자 (예, BMP-2) 또는 성장인자 등도 추가적으로 고려되어 분석될 수 있다.

인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)를 이용한 연골 분화

<4-1> 인간 유도만능줄기세포 (hiPSC)의 배양

제대혈 단핵 세포 (CBMC) 유래 iPSC 계통을 사용하였다. 재 프로그래밍 및 특성화는 이전 연구(비특허문헌 1)에서 설명한대로 수행하였다. 세포주는 비트로-넥틴 코팅된 플레이트 (Vitronectin-coated dish; Thermo Fisher Scientific)에서 유지되었고, 배지는 매일 신선한 Essential 8 (E8) 배지 (Thermo Fisher Scientific)로 교체하였다.

<4-2> 투과성 튜브 웰을 사용한 연골 형성 분화

상기 실시예 <4-1> 에서 유지된 iPSC를 분리하고 수확하였다. E8 배지와 Aggrewell 배지 (STEMCELL Technologies)의 1:1 혼합물을 hiPSC 에 첨가하여 배아체 (Embryoid bodies; EBs)를 생성하였다. 세포는 5% CO₂, 37℃에서 24 시간 동안 유지되었다. 생성된 EB를 수확하여 E8 배지에서 5일 동안 유지한 다음 E7 배지에서 5% CO₂, 37℃에서 추가로 5일 동안 유지하였다. E7 배지는 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, Thermo Fisher Scientific), 7.5% NaHCO₃ (Thermo Fisher Scientific), 14 ng/㎖ sodium selenite (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 64 ㎍/㎖ ascorbic acid 2-phosphate (Sigma Aldrich), 10.7 ㎍/㎖ transferrin (Sigma Aldrich), 20 ㎍/㎖ insulin (Thermo Fisher Scientific), 및 2 ng/㎖ TGF-β1 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)로 구성되었다. EB를 계수하고, cm² 당 50-70 EB를 DMEM(Thermo Fisher Scientific), 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific)으로 구성된 Outgrowth (OG) 유도 배지를 포함하는 젤라틴-코팅 플레이트에 분주하였다. OG 세포의 유도는 37℃ 에서 5 % CO₂에서 72 시간 동안 수행되었다. 단일 OG 세포를 수확하고 새로운 젤라틴 코팅 플레이트에 분주하고 (1 Х 10⁴ ~ 5 Х 10⁴ cells/cm²) 사용할 때까지 유지하였다. 연골 분화를 위해 OG 세포를 수확하였다. OG 세포를 계수하고, 튜브 당 3 Х 10^-5 세포를 연골 분화 배지 (Chondrogenic differentiation medium, CDM)가 있는 15 ㎖ 원뿔형 튜브에서 수확하였다. CDM은 DMEM supplemented with 20% knockout serum replacement, 1Х non-essential amino acids, 1 mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate, 1% ITS+ Premix, 10^-7 M dexamethasone, 50 mM ascorbic acid, 40 ㎍/㎖ L-proline 및 10 ng/㎖ TGF-β3 을 포함한다. 원뿔형 튜브를 750Хg에서 5분 동안 원심 분리하였다. 기존의 방법은 15 ㎖ 원뿔형 튜브에 스페로이드를 14일 또는 20일 동안 유지하며 격일로 배지를 교체하여 연골 분화를 하였다. 개발된 방법은 스페로이드는 3 일째에 상기 [실시예 1] 의 투과성 튜브 웰로 옮겨서 배양하였다.

PCR 반응

연골 스페로이드(펠렛, pellet) 샘플을 액체 질소에 동결하여 수확하고 실험 전에 -80 ℃에서 보관하였다. 스페로이드를 TRIzol (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 RNA를 추출하였다. RevertAid™ First Strand cDNA 합성 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 추출된 RNA에서 cDNA를 합성하였다. LightCycler 480 SYBR Green I Master를 사용하여 mRNA를 측정하였다. 실험에 사용된 프라이머는 하기 [표 1] 과 같다. LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 사용하여 계산하였다.

마커 종류	타겟 유전자	REFSEQ_ID	프라이머 서열	크기(bp)	서열번호
저산소마커(Hypoxia marker)	HIF1A	NM_181054.3	F:CACAGGCCACATTCACGTA R:ATCCAGGCTGTGTCGACTG	166	1 2
연골원성마커 (Chondrogenic marker)	COL2A1	NM_001844	F:GGCAATAGCAGGTTCACGTACA R:CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA	79	3 4
	COL1A1	NM_000088.3	F:TCTGCGACAACGGCAAGGTG R:GACGCCGGTGGTTTCTTGGT	146	5 6
	COL10A1	NM_000493.3	F:CAGGCATAAAAGGCCCACR:GTGGACCAGGAGTACCTTGC	108	7 8
하우스키핑 유전자 (House-keeping gene)	GAPDH	NM_002046.5	F:ACCCACTCCTCCACCTTTGA R:CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT	101	9 10

동물 실험

동물과 관련된 모든 절차는 한국 가톨릭 대학교 의과 대학의 동물 실험 및 이용위원회에서 제공한 실험실 동물 복지법, 실험실 동물 관리 및 이용 지침, 설치류 실험 지침 및 정책에 따라 수행되었다. 본 실시예 프로토콜은 가톨릭 대학교 기관 심의위원회 (CUMC-2019-0281-07)의 승인을 받았다. 연골 스페로이드(펠렛)의 재생 능력을 평가하기 위해 골 연골 결손 골관절염 쥐 모델을 사용하였다. Sprague Dawley 쥐를 마취하고 원위 대퇴골의 활차 홈의 관절 연골에 마이크로 드릴을 사용하여 골 연골을 결손(1.5 Х 1.5 Х 1.5 mm)시켰다. 14 일째 연골 스페로이드를 결손 부위에 배치하였다(결손 부위 당 1 스페로이드(펠렛), n = 5). 관절 절개 및 피부는 단속 나일론 봉합사(interrupted nylon sutures)로 봉합하였다. 8 주 재생 후, 총체적 및 조직 학적 분석을 위해 관절을 수득하였다. 관심 영역은 샘플에서 잘라내어 조직학적 분석을 위해 파라핀 처리 전 상온에서 하루동안 인산 완충 식염수에 보관하였다.

조직학적 분석

연골 스페로이드 또는 관절 유래 조직을 인산 완충 식염수로 세척하고 상온에서 4 % 파라포름알데히드(Biosesang)에 고정시켰다 (스페로이드: 2시간, 관절 샘플: 48 시간). 고정 후, 6 시간 동안 석회화 제거 용액 (Sigma Aldrich)으로 관절 샘플만 석회화를 제거하였다. 이후 농도가 증가하는 에탄올 (Biosesang) 용액과 함께 순차적으로 배양하여 시료를 탈수시켰다. 그 다음, 에탄올-자일렌 혼합물과 함께 순차적으로 배양하여 샘플을 제거하고 밤새 파라핀으로 침투시켰다. 파라핀 블록을 고정하고 마이크로톰을 사용하여 5 ㎛ 두께의 섹션을 얻었다. 염색하기 전에 슬라이드를 60℃ 핫 플레이트에 10분 이상 두었다. 슬라이드는 자일렌을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 슬라이드를 감소하는 농도의 에탄올 용액과 함께 순차적으로 배양하여 재수화하고 흐르는 물에 각각 1 분 동안 세척하였다. 면역 조직 화학 염색을 위해 슬라이드를 3 % 과산화수소 (Sigma Aldrich)로 15 분 동안 차단하였다. 그런 다음 슬라이드를 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 Tris 완충 식염수 (TBS)로 30 분 동안 차단하였다. 1 차 항체는 다음 비율로 차단 용액에 희석되었다: Type I collagen (1/200; Abcam), Type II collagen (1/100; Abcam) 및 Type X collagen (1/500; Abcam). 1 차 항체 용액으로 덮인 슬라이드를 4℃ 에서 하루동안 배양하였다. 슬라이드를 0.1 % Tween-20 (TBST)을 포함하는 TBS로 세척하였다. 2 차 항체 (1/200; Vector Laboratories)를 RT에서 40 분 동안 슬라이드에 처리하였다. TBST로 세척한 후 슬라이드를 ABC 시약 방울 (Vector Laboratories)로 30 분 동안 처리한 후 DAB 용액 (Vector Laboratories)으로 5 분 동안 처리하였다. 슬라이드를 수돗물로 세척하고 Mayer의 헤마톡실린 (Sigma Aldrich)으로 1 분 동안 대조 염색하였다. 각 염색 과정 후, 증가하는 농도의 에탄올 용액과 함께 순차적으로 배양하여 슬라이드를 탈수 시켰다. 에탄올은 100 % 자일렌의 두 사이클로 제거되었고, 염색된 슬라이드는 VectaMount™ Permanent Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)으로 장착하였다. 불투과성 원추형 웰과 투과성 웰 내에서 분화된 스페로이드형 줄기세포를 각각 초자연골로 분화된 정도를 비교하기 위하여 Type II collagen 과 Type X collagen 의 발현 정도를 비교하기위하여 면역 형광 염색법을 활용 하였다. 추가적으로, PCR 분석을 통해 연골 관련 유전자 발현량 또한 비교 분석 하였다.

그 결과, 불투과성 원추형 웰에서 분화를 진행 하였을 때 보다, 투과성 웰에서 분화를 진행 하였을 때 Type II collagen의 발현량은 증가 되었으며 Type X collagen 발현양은 감소되었다 (도 4 a). 이는 초자연골을 얻기 위한 분화는 촉진 되었으며 뼈 분화는 감소되었음을 의미한다. 또한, 투과성 웰에서 14일 동안의 분화를 진행한 스페로이드형 줄기세포의 경우 불투과성 원추형 웰에서 21일 동안의 분화를 진행한 스페로이드 대비 연골 관련 유전자 발현량이 비슷하거나 (도 4 b, COL2A1) 우수 했다 (도 4 c, ACAN).

또한, 불투과성 원추형 웰과 투과성 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제를 각각 연골을 손상한 쥐 모델에 이식하여 실제 치료능을 비교 분석하였다.

그 결과, 이식 8주 후 이식 부위를 면역 형광 염색법을 통하여 분석하였을 때, 투과성 웰을 활용하여 제작한 치료제의 경우, 이식 부위에서 초자연골 관련 세포외기질인 Type II collagen이 불투과성 원추형 웰을 활용하여 제작한 연골 치료제 대비 우수하게 발현되는 것을 확인하였다. 반면에, 뼈 관련 세포외기질인 Type X collagen은 오히려 적게 발현 되었다 (도 5).

SEQUENCE LISTING <110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for differentiation to stem cell-derived hyaline cartilage spheroid and uses thereof <130> 1068738 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HIF1A NM_181054.3_F <400> 1 cacaggccac attcacgta 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HIF1A NM_181054.3_R <400> 2 atccaggctg tgtcgactg 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL2A1 NM_001844_F <400> 3 ggcaatagca ggttcacgta ca 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL2A1 NM_001844_R <400> 4 cgataacagt cttgccccac tta 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL1A1 NM_000088.3_F <400> 5 tctgcgacaa cggcaaggtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL1A1 NM_000088.3_R <400> 6 gacgccggtg gtttcttggt 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL10A1 NM_000493.3_F <400> 7 caggcataaa aggcccac 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> COL10A1 NM_000493.3_R <400> 8 gtggaccagg agtaccttgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH NM_002046.5_F <400> 9 acccactcct ccacctttga 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH NM_002046.5_R <400> 10 ctgttgctgt agccaaattc gt 22

Claims

a) 줄기세포를 응집하여 줄기세포응집체를 제조하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 제조된 줄기세포응집체를 산소 수준이 0.001 내지 0.15 mol/m³ 인 저산소 조건에서 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 배양된 세포응집체를 투과성 웰 또는 투과성 튜브로 옮긴 후 초자연골세포응집체로 분화시키는 단계;
를 포함하는, 줄기세포를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포응집체는 직경 50 ㎛ 내지 2000 ㎛ 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b) 의 배양은 불투과성 웰 또는 불투과성 튜브에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 산소, 연골 분화 유도 인자 및 성장인자는 이동 가능하지만 세포는 이동할 수 없는 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브는 10 nm 내지 1000 nm 직경의 나노섬유 로 구성된 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 공극률(Porosity)은 0.05 내지 0.5 인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 투과성 웰 또는 투과성 튜브 벽면의 확산에 의한 물질 투과성은 1.0Х10^-5 cm/s 내지 1.0Х10^-4 cm/s인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 골수, 뇌, 피부, 지방, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 연골 분화 유도 인자는 TGF-β 및 BMP-2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포응집체를 초자연골세포응집체로 분화시키는 방법.
제1항의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 질환 치료용 세포 치료제.
제10항에 있어서, 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 연골 질환 치료용 세포 치료제.
제1항의 방법으로 제조한 초자연골세포응집체를 포함하는 연골 재생용 세포 치료제.