본 개시내용의 측면은 변형된 중합 효소 및 그의 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 변형된 재조합 중합 효소를 사용하는 방법 및 이러한 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 시험관내 중합 반응을 시행하기 위해 사용될 수 있는 변형된 재조합 중합 효소 및 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 중합 효소는 변형된 재조합 핵산 폴리머라제, 예를 들어, 변형된 재조합 DNA 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 변형된 재조합 DNA 폴리머라제는 DNA의 조작 (예를 들어, DNA 시퀀싱)과 관련된 시험관내 반응을 위해 사용될 수 있다.
다른 측면 중에서, 본 개시내용은 시험관내 중합 반응을 시행하기 위해 사용될 수 있는 변형된 중합 효소 (예를 들어, 폴리머라제)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리머라제는 개별적으로 또는 조합하여, 시퀀싱 반응을 시행하는 데 유용한 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형 중 하나 이상을 활용하여, 시퀀싱 반응을 시행하는 데 유용한 하나 이상의 특성, 예를 들어, 폴리머라제 전진성, 충실도 (예를 들어, 정확도), 기질 (예를 들어, 뉴클레오시드 폴리포스페이트) 결합 친화성, 기질 활용률 (예를 들어, 뉴클레오시드 폴리포스페이트가 주형 가닥에 상보적인 성장 가닥 내로 혼입되는 비율), 변형된 기질 (예를 들어, 표지된 뉴클레오시드 폴리포스페이트)과의 폴리머라제 상호 작용, 또는 그의 일부 조합과 같은 특성을 갖는 폴리머라제를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 변형 중 하나 이상은 폴리머라제의 교정 능력을 최소화하거나 또는 없앤다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 변형은 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성 상의 손실을 초래하는 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 도메인에 대해 이루어질 수 있다.
일부 측면에서, 본 출원은 단일 분자 핵산 시퀀싱 기술에 유리한 변경된 생화학적 특성을 갖는 변형된 폴리머라제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변이체 폴리머라제는 단일 분자 시퀀싱 반응에서 개선된 시그널 판독정보를 제공하도록 변형되었다. 도 1은 실시간 시그널 판독정보와 관련하여 시퀀싱 반응의 진행을 예시하는 예를 제공한다. 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 일부 단일 분자 핵산 시퀀싱 반응은 계획 (100)에 따라서 진행되는 것으로 여겨진다.
반응의 시작에서 (패널 I), 폴리머라제 (파선)는 관찰 영역에 한정되고 주형 가닥 및 프라이머 가닥과 결합된다. 도시된 바와 같이, 상이한 유형의 검출 가능한 표지를 각각 갖는 상이한 유형의 뉴클레오티드 (예를 들어, A, G, T, C, U)가 동일한 반응 혼합물에 존재한다. 폴리머라제가 발광성 표지된 뉴클레오티드와 연합되면 (패널 II), 이러한 표지는 일정 기간 동안 관찰 영역에 한정된다. 혼입 이벤트 동안에는, 예를 들어, 이러한 기간이 상기 표지가 관찰 영역에서의 그의 존재를 검출하고 확인하기에 충분한 양의 에너지를 수용 및/또는 방출하기에 충분할 수 있다. 시그널 판독정보 (102)와 관련하여 계획 (100)의 패널 I 및 II에 의해 예시된 바와 같이, 혼입 이벤트는 펄스 폭 (pw)에 상응하는 일정 기간 동안 시그널 펄스와 연관될 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼입 이벤트와 연관된 개별 시그널 펄스는 혼입되는 뉴클레오티드의 유형 또는 특이적 시점에서의 폴리머라제의 활성과 같은 각종 조건에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 인지해야 한다. 일부 실시양태에서, 개별 시그널 펄스는 약 10밀리초 내지 약 10초의 개별 펄스 폭을 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개별 펄스 폭은 비교 목적을 위한 파라미터를 제공하기 위해 평균될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, "펄스 폭"은 각각의 개별 시그널 펄스가 개별 펄스 폭을 갖는 복수 개의 개별 시그널 펄스의 평균에 상응하는 값을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 중합 효소는 약 10밀리초 내지 약 10초의 펄스 폭을 생산한다. 일부 실시양태에서, 펄스 폭은 적어도 10밀리초 내지 10초 이하, 적어도 10밀리초 내지 5초 이하, 적어도 10밀리초 내지 1초 이하, 또는 약 10밀리초 내지 약 1초이다. 일부 실시양태에서, 펄스 폭은 약 10 내지 약 500밀리초, 약 10 내지 약 200밀리초, 약 10 내지 약 100밀리초, 약 10 내지 약 50밀리초, 약 50밀리초 내지 약 1초, 약 50 내지 약 500밀리초, 약 50 내지 약 200밀리초, 약 50 내지 약 100밀리초, 약 100밀리초 내지 약 1초, 약 100 내지 약 500밀리초, 약 100 내지 약 200밀리초, 약 200밀리초 내지 약 1초, 약 200 내지 약 500밀리초, 또는 약 500밀리초 내지 약 1초이다.
뉴클레오티드가 성장 가닥 내로 혼입되고 발광 표지가 절단된 후, 이러한 표지는 조명 용적으로부터 확산되어 관찰 영역에서 더 이상 검출 가능하지 않다 (패널 III). 또한, 패널 III에 예시된 바와 같이, 혼입 이벤트 후, 폴리머라제는 주형 가닥을 따라 진행하여 후속의 발광성 표지된 뉴클레오티드와 연합될 수 있다. 패널 I에서 패널 II로의 진행과 유사하게, 시그널 트레이스 (102)에서 패널 III에서 패널 IV로의 진행에 상응하는 시그널은 비교적 낮은 세기 수준에서부터 연합 이벤트를 표시하는 시그널 펄스로 그 세기가 증가한다. 시그널 트레이스 (102)의 관점에서, 혼입 이벤트와 후속 연합 이벤트 사이의 기간은 인터펄스 거리 (ipd)와 연관될 수 있다.
펄스 폭과 관련하여 전술한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 제1 시그널 펄스와 제2 시그널 펄스 사이의 기간과 연관된 개별 인터펄스 거리는 특이적 시점에서의 폴리머라제의 활성 또는 전진성과 같은 각종 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 개별 인터펄스 거리는 약 10밀리초 내지 약 1분 이상 (예를 들어, 약 1 내지 약 60초, 약 1 내지 약 30초, 약 1 내지 약 20초, 약 1 내지 약 10초, 또는 약 1초 미만)의 기간에 상응한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개별 인터펄스 거리는 비교 목적을 위한 파라미터를 제공하기 위해 평균될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, "인터펄스 거리"는 복수 개의 개별 인터펄스 거리의 평균에 상응하는 값을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 중합 효소는 약 10밀리초 내지 약 10초의 인터펄스 거리를 초래한다. 일부 실시양태에서, 인터펄스 거리는 적어도 10밀리초 내지 10초 이하, 적어도 10밀리초 내지 5초 이하, 적어도 10밀리초 내지 1초 이하, 또는 약 10밀리초 내지 약 1초이다. 일부 실시양태에서, 인터펄스 거리는 약 10 내지 약 500밀리초, 약 10 내지 약 200밀리초, 약 10 내지 약 100밀리초, 약 10 내지 약 50밀리초, 약 50밀리초 내지 약 1초, 약 50 내지 약 500밀리초, 약 50 내지 약 200밀리초, 약 50 내지 약 100밀리초, 약 100밀리초 내지 약 1초, 약 100 내지 약 500밀리초, 약 100 내지 약 200밀리초, 약 200밀리초 내지 약 1초, 약 200 내지 약 500밀리초, 또는 약 500밀리초 내지 약 1초이다.
펄스 폭 및/또는 인터펄스 거리의 특징은, 일부 실시양태에서, 특이적 발광 표지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 주형 가닥의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 발광성 표지된 뉴클레오티드의 연합을 표시하는 일련의 펄스 폭을 관찰함으로써 시퀀싱 반응에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 프로세스에서의 인공물은 부정확한 시퀀싱 정보를 야기할 수 있다. 예를 들어, 패널 V는 발광성 표지된 뉴클레오티드가 시그널 펄스를 발생시키기에 충분한 기간 동안 관찰 영역에 한정되지만 혼입 이벤트가 없는 결합 및 방출 이벤트를 예시한다.
패널 V에 제시된 바와 같이, 패널 IV에서 검출된 혼입 후에, 절단된 발광 표지는 관찰 가능한 영역 밖으로 확산한다 (i). 추가로 발광성 표지된 뉴클레오티드는 관찰 가능한 영역에서 폴리머라제와 연합하여 검출 가능한 시그널을 발생시킨다 (ii). 성장 가닥 내로 혼입되기 보다는, 발광성 표지된 뉴클레오티드가 폴리머라제로부터 해리되어 다시 반응 혼합물 내로 확산된다 (iii). 따라서, 동일한 유형의 뉴클레오티드의 후속적으로 성공적인 혼입 후 (도시되지 않음), 패널 V에 상응하는 시그널 펄스는 시퀀싱 정보 판독에 명백한 삽입을 초래할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 이들 및 다른 인공물 이벤트로부터의 진실한 혼입 이벤트를 판별하기에 충분한 길이의 펄스 폭을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 폴리머라제 활성 부위로부터의 조기 기질 방출 가능성을 감소시키는 하나 이상의 변형을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 일단 기질이 폴리머라제 활성 부위와 연합되면 기질 혼입의 가능성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 제공된 변형된 폴리머라제는 하나 이상의 변형을 수반한 표 1에 제시된 야생형 폴리머라제 서열 [서열식별번호 (SEQ ID NO): 1-19]에 따르는 폴리머라제 서열을 포함한다 (예를 들어, 표 2-5에 예시된 바와 같거나, 또는 그의 2개 이상의 조합).
<표 1>
야생형 폴리머라제 아미노산 서열
일부 실시양태에서, 야생형 폴리머라제 서열 (예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같음)은 하나 이상의 변형이 재조합 변이체 폴리머라제를 생성하기 위해 만들어질 수 있는 대다수의 폴리머라제 서열을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 변형된 폴리머라제의 "대다수의 폴리머라제 서열" 또는 "대다수의 서열"은 변형된 폴리머라제 서열 내에서 우세한 야생형 폴리머라제 서열을 지칭한다 (예를 들어, 변형된 폴리머라제 내의 아미노산의 적어도 50%가 대다수의 서열 내의 아미노산에 상응한다). 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제 서열은 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하는 대다수의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 상동 단백질 내의 위치에 상응하는 위치에 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 (서열식별번호: 1) 내의 A484에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 다른 폴리머라제 내의 A484에 상응하는 아미노산은 상동성 정렬을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석의 비-제한적 예로서, 상동성 정렬은 표 1에 보고된 수많은 폴리머라제를 사용하여 시행되었으며, Φ29 폴리머라제 내의 A484가 M2Y 내의 A481, 바실루스(Bacillus) 파지 VMY22 내의 A492, 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium) 내의 K500, 및 루실리아 쿠프리나(Lucilia cuprina) 내의 K827에 상응하는 것으로 결정되었다. 따라서, 상동성 정렬 및 관련 기술분야에 공지된 유사한 방법을 사용하여, 본원에 기재된 변형된 잔기의 위치에 상응하는 다른 폴리머라제 내의 아미노산을 확인할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 변형이 본원에 기재된 폴리머라제 (예를 들어, 표 1에 열거된 것)로 제한하려는 것이 아니고, 공지된 기술을 사용하여 임의의 중합 효소로 연장될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 표 1에 열거된 폴리머라제 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 또는 표 1에 열거된 다른 서열)에 대해 적어도 25% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 표 1에 열거된 폴리머라제 중 하나 이상 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 또는 표 1에 열거된 다른 서열)에 대해 25-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형된 폴리머라제는 본 출원에 제공된 상이한 변형된 폴리머라제 입체 배치 및/또는 예의 문맥에서 기재된 아미노산 돌연변이 및/또는 도메인 치환 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상이한 폴리머라제로부터의 하나 이상의 절편 또는 영역은 본 출원에 기재된 특이적 서열에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것으로 기재된다. 이러한 영역은, 예를 들어, 명시된 서열 (예를 들어, 표 1의 자연 발생 폴리머라제 내의 상응하는 절편 또는 영역)에 대해 80-90%, 90-95%, 95-99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 대체 실시양태에서, 이러한 절편 영역은 명시된 서열 (예를 들어, 표 1의 자연 발생 폴리머라제 내의 상응하는 절편 또는 영역)에 대해 더 낮은 서열 동일성 (예를 들어, 50-60%, 60-70%, 또는 70-80%)의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
2개 이상의 아미노산 서열을 비교할 목적으로, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 간의 "서열 동일성" (본원에서 "아미노산 동일성"으로서 지칭되기도 함)의 백분율은 [제2 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고 이에 [100%]를 곱합으로써 계산될 수 있으며, 여기서 제1 아미노산 서열과 비교해서 제2 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기 (위치)에서의 차이로서 간주되는데, 즉 본원에 정의된 바와 같은 "아미노산 차이"로서 간주된다. 또 다른 한편으로, 두 아미노산 서열 간의 서열 동일성의 정도는 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 블라스트(Blast), 클러스털 오메가(Clustal Omega), 또는 다른 서열 정렬 알고리즘으로서 이용 가능한 알고리즘의 컴퓨터화된 구현에 의해, 및 예를 들어, 표준 설정을 이용하여 계산될 수 있다. 통상적으로, 상기 그 개요가 서술된 계산 방법에 따라 두 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"의 백분율을 결정할 목적으로, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열로서 간주될 것이고, 다른 아미노산 서열이 "제2" 아미노산 서열로서 간주될 것이다.
부가적으로, 또는 또 다른 한편으로, 2개 이상의 서열은 서열 간의 동일성에 관하여 평가될 수 있다. 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 2개의 서열이 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이 비교 창 또는 지명된 영역에 걸쳐 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬되는 경우, 명시된 영역에 걸쳐 또는 전체의 서열에 걸쳐 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일함)을 갖는 경우에 이러한 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 25, 50, 75, 또는 100개 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게 100 내지 150, 200개 또는 그 초과의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
부가적으로, 또는 또 다른 한편으로, 2개 이상의 서열은 서열 간의 정렬에 관하여 평가될 수 있다. 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "정렬" 또는 퍼센트 "정렬"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 2개의 서열이 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이 비교 창 또는 지명된 영역에 걸쳐 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬되는 경우, 명시된 영역에 걸쳐 또는 전체의 서열에 걸쳐 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일함)을 갖는 경우에 이러한 2개의 서열은 "실질적으로 정렬된다". 임의로, 정렬은 적어도 약 25, 50, 75, 또는 100개 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게 100 내지 150, 200개 또는 그 초과의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 K131, K135, L142, Y148, Y224, E239, V250, L253, R306, R308, E375, A437, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571에 상응하는 위치에 하나 이상 (예를 들어, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 예를 들어 모두)의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는 앞서 열거된 바와 같은 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하지 않는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는, 예를 들어, 상동성 정렬 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 상기 열거된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 Y148, Y226, V250, N251, T368, E375, K379, Q380, A437, P477, K478, 및 A484에 상응하는 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 Y148, Y226, V250, N251, T368, E375, K379, Q380, A437, P477, K478, 및 A484 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484C 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484S 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484T 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484Q 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484N 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484E 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484D 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484K 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484H 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484Y 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y148I, Y226F, V250A, N251R, T368F, E375K, K379R, Q380R, A437G, P477D, K478D, 및 A484X 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 비-자연 아미노산을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, 하나 이상은 상기 열거된 아미노산 치환 중 2개 이상, 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 예를 들어 모두일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 M8, V51, N62, I71, L107, K131, K135, L142, G197, Y224, E239, V250, L253, Y281, I288, T301, R306, R308, D325, D341, K354, T368, E375, A437, A444, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571에 상응하는 하나 이상의 위치 (예를 들어, 1 내지 35개 위치 또는 그 사이의 임의의 정수, 예를 들어 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 예를 들어 모두)에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 M8, V51, N62, I71, L107, K131, K135, L142, G197, Y224, E239, V250, L253, Y281, I288, T301, R306, R308, D325, D341, K354, T368, E375, A437, A444, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 하기 돌연변이 M8R, V51A, N62D, I71V, L107I, K131E, K135Q, L142K, G197D, Y224K, E239G, V250A, V250I, L253A, L253H, Y281H, I288L, T301C, R306Q, R308L, D325E, D341E, K354R, T368F, E375Y, A437G, A444T, E466K, D476H, A484E, E508R, D510K, D510R, K512Y, E515Q, K539E, D570S, 및 T571V 중 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 35개 또는 그 사이의 임의의 정수, 예를 들어 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 예를 들어 모두)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 K135, L142, Y224, E239, V250, L253, E375, A437, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571에 상응하는 하나 이상의 위치 (예를 들어, 1 내지 18개의 위치 또는 그 사이의 임의의 정수, 예를 들어 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 예를 들어 모두)에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 K135, L142, Y224, E239, V250, L253, E375, A437, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 K135Q, L142K, Y224K, E239G, V250I, L253A, E375Y, A437G, E466K, D476H, A484E, E508R, D510R, K512Y, E515Q, K539E, D570S, 및 T571V 중 하나 이상 (예를 들어, 1 내지 18개 또는 그 사이의 임의의 정수, 예를 들어 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 예를 들어 모두)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 TPR1 영역 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 (서열식별번호: 1) 내의 S260-L359에 상응하는 TPR1 영역 대신 이. 파에시움으로부터의 TPR1 영역 (예를 들어, 서열식별번호: 5 내의 V271-M375)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 엑소뉴클레아제 영역 내의 하나 이상의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 (서열식별번호: 1) 내의 M1-V54에 상응하는 아미노산 대신 M2Y로부터의 엑소뉴클레아제 영역의 부분 (예를 들어, 서열식별번호: 2 내의 M1-I51)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 (서열식별번호: 1) 내의 E75-N91에 상응하는 아미노산 대신 이. 파에시움으로부터의 엑소뉴클레아제 영역의 부분 (예를 들어, 서열식별번호: 5 내의 F72-S89)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 M1-V54 및 E75-N91에 각각 상응하는 아미노산 대신 M2Y로부터의 엑소뉴클레아제 영역의 부분 및 이. 파에시움으로부터의 엑소뉴클레아제 영역의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 변형된 팜 영역을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 (서열식별번호: 1) 내의 M429-I433에 상응하는 아미노산 대신 이. 파에시움으로부터의 팜 영역의 부분 (예를 들어, 서열식별번호: 5 내의 L445-V449)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 A444에 상응하는 위치에 알라닌에서 티민으로의 돌연변이 (예를 들어, A444T)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 이. 파에시움으로부터의 팜 영역의 부분 및 Φ29 폴리머라제 내의 A444T에 상응하는 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 G197, I71, 및 L107에 상응하는 하나 이상의 위치 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 G197, I71, 및 L107 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 G197D, I71V, 및 L107I 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 폴리머라제의 하나 이상의 영역 또는 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분) 내의 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 엑소뉴클레아제 영역, 팜 영역, TPR1 영역, 핑거 영역, TPR2 영역, 및 섬 영역 중 하나 이상 내의 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 엑소뉴클레아제 영역 내의 하나 이상의 위치 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 영역의 엑소뉴클레아제 루프)에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 갖는 변형된 폴리머라제는 엑소뉴클레아제 영역 내의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 영역 내의 E75, R76, S82, A83, D84, G85, L86, P87, N88, Y90, 및 N91 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 E75, R76, S82, A83, D84, G85, L86, P87, N88, Y90, 및 N91에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하지 않는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는, 예를 들어, 상동성 정렬 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 상기 열거된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 E75F, R76K, S82C, A83K, D84E, G85A, L86K, P87E, N88R, Y90F, 및 N91S 중 하나 이상을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 엑소뉴클레아제 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 절편은 상이한 폴리머라제로부터의 상응하는 엑소뉴클레아제 도메인에 대해 교환된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나의 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 도메인의 플랭킹 아미노산 및 루프를 포함하는 절편은 또 다른 폴리머라제로부터의 상응하는 절편으로 대체된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Φ29 E75-N91 절편은 이. 파에시움으로부터의 상응하는 F72-S89 절편으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 엑소뉴클레아제 루프를 포함하는 절편을 교환하는 것은 폴리머라제의 인터펄스 거리를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 TPR1 영역 내의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 Y281, I288, T301, D325, D341, 및 K354에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 Y281, I288, T301, D325, D341, 및 K354 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, Y281, I288, T301, D325, D341, 및 K354 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)에서의 아미노산은 다른 폴리머라제 (예를 들어, M2Y, 루실리아 쿠프리나, 바실루스 균주, 예를 들어 GA-1) 내의 상응하는 위치에서의 아미노산으로 변화된다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Y281H, I288L, T301C, D325E, D341E, 및 K354R 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Φ29 폴리머라제 내의 Y281, I288, T301, D325, D341, 및 K354에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 위치에서의 돌연변이는 (예를 들어, 단일 분자 시퀀싱 반응에서의) 혼입 속도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 팜 영역 내의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 M429, G430, V431, I433, 및 A444에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 M429, G430, V431, I433, 및 A444 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, M429, G430, V431, I433, 및 A444 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)에서의 아미노산은 다른 폴리머라제 (예를 들어, M2Y, 루실리아 쿠프리나, 바실루스 균주, 예를 들어 GA-1) 내의 상응하는 위치에서의 아미노산으로 변화된다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 M429L, G430A, V431S, I433V, 및 A444T 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Φ29 폴리머라제 내의 M429, G430, V431, I433, 및 A444에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 위치에서의 돌연변이는 (예를 들어, 단일 분자 시퀀싱 반응에서의) 정확도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 팜 영역 내의 하나 이상의 위치 및 엑소뉴클레아제 영역 내의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 G197, M8, 및 V51에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 G197, M8, 및 V51 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 G197D, M8R, 및 V51A 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Φ29 폴리머라제 내의 G197, M8, 및 V51에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 또는 3개)의 위치에서의 돌연변이는 생산 수율, 열 안정성을 개선시키고/시키거나 부하 (예를 들어, 어레이의 샘플 웰 내로의 부하)의 효율을 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 팜 영역 내의 하나 이상의 위치 및 섬 영역 내의 하나 이상의 위치에 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 E466, D476, K539, D570, 및 T571에 상응하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 E466, D476, K539, D570, 및 T571 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)에 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 E466K, D476H, K539E, D570S, 및 T571V 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 M2Y 폴리머라제 내의 N59, Y145, V247, L250, E372, A481, 및 K509에 상응하는 위치에 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 M2Y 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는 앞에 열거된 바와 같은 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 M2Y 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하지 않는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는, 예를 들어, 상동성 정렬 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 상기 열거된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 야생형 폴리머라제 (예를 들어, 표 1에 제시된 바와 같음)의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분) (예를 들어, 서열식별번호: 5의 하나 이상의 절편)이 서열식별번호: 1-4, 및 6-19 중 임의의 것의 하나 이상의 절편을 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분)이 Φ29 폴리머라제의 하나 이상의 절편을 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분)이 M2Y 폴리머라제의 하나 이상의 절편을 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분)이 Φ29 폴리머라제 및/또는 M2Y 폴리머라제의 하나 이상의 절편을 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제의 하나 이상의 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분) (예를 들어, 서열식별번호: 5의 도메인 또는 그의 변형된 형태, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 함유함)이 본원에 기재된 변이체 폴리머라제 (예를 들어, 표 2에 열거된 변이체 폴리머라제, 또는 표 2에 예시되거나 또는 표 3-5에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환 또는 다른 도메인 치환을 함유하는 변이체 폴리머라제)의 하나 이상의 절편을 대체할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제의 대다수의 서열은 예로서 상기 열거된 폴리머라제 내의 위치에 상응하는 하나 이상의 상동 아미노산을 포함하지 않는다. 이러한 경우, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 원하는 아미노산 서열을 본원에 기재된 폴리머라제 서열과 비교할 때 주변 상동 잔기가 확인 가능한 경우, 돌연변이된 아미노산은 상기 주변 상동 잔기에 기초하여 추론되는 폴리머라제 내의 특정 부위에서의 삽입으로서 상기 변형된 폴리머라제에 포함된다. 돌연변이된 폴리머라제 변이체는 본원에 기재된 실시양태에 따라서 조작되었고 표 2에 열거된다 (서열식별번호: 20-96).
<표 2>
상동 폴리머라제 변이체
일부 실시양태에서, 아미노산은 폴리머라제의 구조 및/또는 기능에 기초하여 변형을 위해 선택된다. 예를 들어, 도 2는 Φ29 폴리머라제 (200)의 카툰 예시를 도시한다. 폴딩된 3차원 구조는 오버레이 (202)에 상응하는 별개의 도메인 및 서브 도메인을 포함한다: N-말단 엑소뉴클레아제 도메인 (1); 및 팜 서브 도메인 (2), 말단 단백질 영역 1 서브 도메인 (TPR1) (3), 핑거 서브 도메인 (4), TPR2 서브 도메인 (5), 및 섬 서브 도메인 (6)을 함유하는 C-말단 폴리머라제 도메인. 이들 도메인 및 서브 도메인은 N-말단에서 C-말단 방식으로 배향되는, 폴리펩티드 구축물 (204)에 따르는 폴리펩티드 가닥의 부위에 매핑된다. 도시된 바와 같이, N-말단 엑소뉴클레아제 도메인 (1)은 야생형 Φ29 폴리머라제의 잔기 1-189에 걸쳐 있고, C-말단 폴리머라제 도메인은 잔기 190-575에 걸쳐 있다. C-말단 폴리머라제 도메인 내에서, 팜 서브 도메인 (2)은 야생형 Φ29 폴리머라제의 잔기 190-260 및 427-530에 걸쳐 있고, TPR1 서브 도메인 (3)은 잔기 261-358에 걸쳐 있으며, 핑거 서브 도메인 (4)은 잔기 359-394에 걸쳐 있고, TPR2 서브 도메인 (5)은 잔기 395-426에 걸쳐 있으며, 섬 서브 도메인 (6)은 잔기 531-575에 걸쳐 있다. 본 출원에 기재된 상이한 폴리머라제의 등가 절편 (예를 들어, 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 도메인 또는 그의 부분)이 서로 대체되어 키메라 폴리머라제를 생산할 수 있다. 예를 들어, 하나의 폴리머라제 (예를 들어, 표 1에 제시된 야생형 서열을 갖거나 또는 표 2에 예시되거나 또는 표 3-5에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 갖는다)로부터의 엑소뉴클레아제 도메인, 팜 서브 도메인, TPR1 서브 도메인, 하나 이상의 핑거 서브 도메인, TPR2 서브 도메인, 및/또는 섬 서브 도메인 중 하나 이상이 또 다른 폴리머라제 (예를 들어, 표 1에 제시된 야생형 서열을 갖거나 또는 표 2에 예시되거나 또는 표 3-5에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 갖는다) 내의 상응하는 도메인을 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 플랭킹 아미노산을 임의로 포함한, 이들 도메인 중 하나 이상의 부분을 포함하는 절편이 대체할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 이외의 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 대다수의 폴리머라제 서열은 (예를 들어, 상동성 정렬, 계산 모델링, 구조적 분석, 또는 임의의 적합한 방법에 기초하여) Φ29 폴리머라제 (200)로 유추될 수 있는 하나 이상의 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 폴리머라제의 "영역"은 폴리머라제 효소의 별개의 도메인 또는 서브 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리머라제의 영역은 N-말단 엑소뉴클레아제 도메인 또는 C-말단 폴리머라제 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제의 영역은 팜 서브 도메인, TPR1 서브 도메인, 핑거 서브 도메인, TPR2 서브 도메인, 또는 섬 서브 도메인을 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 폴리머라제의 영역은 소정의 도메인 또는 서브 도메인을 포함하는 모든 아미노산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 대다수의 폴리머라제 서열의 하나 이상의 영역에 대한 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 대다수의 폴리머라제 서열의 하나 이상의 부분에 대한 변형을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 폴리머라제의 "부분"은 폴리머라제 서열 내의 2개 이상의 연속되는 잔기의 연장물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 서열의 부분은 단일 폴리머라제 도메인 또는 단일 폴리머라제 서브 도메인 내의 2개 이상의 연속되는 아미노산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 서열의 부분은 2개 이상의 폴리머라제 도메인 및/또는 서브 도메인 전역에 걸쳐 있는 2개 이상의 연속되는 아미노산을 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 폴리머라제 서열의 부분은 폴리머라제 서열 이내의 연속되는 아미노산의 임의의 연장물이다. 일부 실시양태에서, 부분은 5-10개의 연속되는 아미노산, 10-25개의 연속되는 아미노산, 25-50개의 연속되는 아미노산, 50-75개의 연속되는 아미노산, 75-100개의 연속되는 아미노산 또는, 예를 들어, 폴리머라제 영역 또는 도메인의 부분을 구성하는 다른 수의 연속되는 아미노산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 일반적으로 도 2에 도시된 바와 같은 도메인 및/또는 서브 도메인 중 하나 이상 내에서의 하나 이상의 단일 부위 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 도 3은 각각의 폴리펩티드 가닥 이내의 돌연변이 부위 (화살표로 그 근차치가 제시됨)를 수반한 표 2의 선택된 돌연변이 변이체를 도시한다. M2Y 및 M2Y 돌연변이 변이체 H016 (열린 채움), 루실리아 쿠프리나 및 루실리아 쿠프리나 돌연변이 변이체 H018 (점자 채움), 엔테로코쿠스 파에시움 및 엔테로코쿠스 파에시움 돌연변이 변이체 H020 (파선 채움), 및 바실루스 파지 VMY22 및 바실루스 파지 VMY22 돌연변이 변이체 H022 (대각선 채움)에 대한 폴리펩티드 가닥이 도시된다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 다른 절편 교환 및/또는 아미노산 돌연변이를 포함하는 키메라가 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 단일 부위 돌연변이 변형 이외에 또는 그에 대한 대안으로, 대다수의 폴리머라제 서열 내의 아미노산의 연장물 (예를 들어, 2개 이상의 연속되는 아미노산)이 변형된다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 연장물은 상이한 폴리머라제 서열의 부분에 상응하는 아미노산의 연장물이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대다수의 폴리머라제 서열의 도메인/서브 도메인 (또는 그 내에서의 부분)은 상이한 폴리머라제 서열의 상응하는 도메인/서브 도메인 (또는 그 내에서의 부분)으로 교환된다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제는 키메라 폴리머라제, 키메라 폴리머라제 변이체, 또는 키메라로서 지칭된다. 키메라 폴리머라제는 본원에 기재된 실시양태에 따라서 조작되었고, 표 3에 열거된다 (서열식별번호: 97-516).
<표 3>
키메라 폴리머라제 변이체
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 재조합 폴리머라제 효소는 표 3으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체 (예를 들어, 표 3에 열거된 바와 같음)는 상이한 폴리머라제 서열의 영역 또는 부분으로 치환된 대다수의 서열의 영역 또는 부분을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대다수의 폴리머라제 서열 내의 영역 (예를 들어, 도메인 및/또는 서브 도메인)을 포함하는 잔기 모두는 상이한 폴리머라제 서열 내의 상응하는 영역을 포함하는 잔기 모두로 치환된다. 일부 실시양태에서, 대다수의 폴리머라제 서열 내의 영역을 포함하는 잔기의 적어도 특정 부분은 상이한 폴리머라제 서열 내의 상응하는 영역을 포함하는 잔기의 적어도 특정 부분으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 대다수의 서열 내의 단일 서브 도메인 만이 상이한 서열의 상응하는 서브 도메인으로 치환된다. 예를 들어, 도 4는 표 3으로부터 선택된 키메라 폴리머라제 변이체를 도시한다. 6개의 선택된 변이체가, 아미노 말단에서 카르복시 말단 배향으로 폴리펩티드 이내에 일반적으로 발생하는 바와 같이 서브 도메인을 갖는 폴리펩티드 가닥으로서 제시된다. 도 4의 폴리펩티드 가닥 각각은 Q001의 폴리머라제 대다수의 서열 (흑색 채움)을 포함하며, 하나 이상의 도메인 및/또는 서브 도메인이 M2Y 폴리머라제 (서열식별번호: 2, 열린 채움)의 하나 이상의 상응하는 도메인 및/또는 서브 도메인 또는 루실리아 쿠프리나 (서열식별번호: 3, 점자 채움)의 하나 이상의 상응하는 도메인 및/또는 서브 도메인 및/또는 하나 이상의 플랭킹 아미노산으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 엑소뉴클레아제 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 도 4에 도시된 바와 같이, C017은 M2Y 폴리머라제 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같음)로부터 치환된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하는 키메라 폴리머라제 변이체이다. 유사하게, C020은 루실리아 쿠프리나 폴리머라제 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같음)로부터 치환된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제 변이체 내의 엑소뉴클레아제 도메인의 변형 또는 대체는 폴리머라제의 교정 능력이 바람직하지 않은 경우 (예를 들어, 시퀀싱 반응에서)에 유용할 수 있다. 그러나, 부가의 및 대안 도메인 및/또는 서브 도메인 치환이 본 개시내용의 변형된 재조합 폴리머라제를 위해 고려된다는 것을 인지해야 한다.
일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 엑소뉴클레아제 루프를 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 일부 실시양태에서, "엑소뉴클레아제 루프"는 엑소뉴클레아제 도메인 내에 루프 영역을 형성하는 연속되는 아미노산의 연장물을 지칭한다. 예를 들어, 도 5a는 전체 투시도 (500) 및 확대 투시도 (502)에서의 Φ29 폴리머라제의 카툰 예시를 도시한다. 전체 투시도 (500)로 도시된 박스 내에 있는 영역의 확대도인 확대 투시도 (502)는 Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 도메인 내의 루프 영역을 나타낸다. 선택된 루프 잔기는 잔기 N77 내지 N88에 걸쳐 있는 엑소뉴클레아제 루프를 형성하는 연속되는 아미노산의 연장물과 함께 확대 투시도 (502)의 스틱 형태로 도시된다. 이러한 엑소뉴클레아제 도메인의 영역에 대한 진화 보존 분석 결과, 루프 및 몇 개의 플랭킹 잔기가 비교적 잘 보존되지 않은 것으로 밝혀졌다. 도 5b는 Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 영역과 표 1로부터 선택된 다른 폴리머라제의 비-제한적 세트 간의 상동성 정렬 (504)을 도시한다. 또한, Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 루프 N77-N88 및 다른 폴리머라제 내의 상응하는 엑소뉴클레아제 루프를 보여주는 루프 상동성 정렬 (506)이 도시된다.
Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 루프 N77-N88에 상응하는 영역 내에서 비교적 낮은 보존성을 보여주는 상동성 분석에 기초하여, 이는 폴리머라제 변이체에서 바람직한 생화학적 특성 (예를 들어, 시퀀싱 반응에서 사용하기에 바람직하다)에 대한 검색에서 변이 공급원을 제공하였다. 따라서, 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 엑소뉴클레아제 루프를 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함하며, 여기서 "엑소뉴클레아제 루프"는 Φ29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 루프 N77-N88과 상동이다 (예를 들어, 도 5b 내의 루프 상동성 정렬 (506)에 의해 도시된 바와 같음).
도 5b 내의 예시적인 정렬에 의해 도시된 바와 같이, 서열 상동성 분석은 Φ29 폴리머라제의 N77-N88과 상동인 엑소뉴클레아제 루프 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 한 예로서 제한 없이, 루프 상동성 정렬 (506)은 M2Y (H74-N85), 루실리아 쿠프리나 (N64-G76), 이. 파에시움 (N74-R86), 바실루스 GA-1 (N74-K88), 바실루스 VMY22 (K80-K91), 악티노마이세스(Actinomyces) AV-1 (H93-K105), 감자 낭 선충류 (L86-K99), 이베리아 스라소니 내장(Iberian lynx gut) (D73-R87), 칸디다투스(Candidatus) (N85-N98), 및 에게르텔라 종(Eggerthella sp.) (V73-K88)에 대한 상동 엑소뉴클레아제 루프 서열을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 치환된 엑소뉴클레아제 루프는 Φ29 폴리머라제의 N77-N88과의 상동성 영역 내의 약 12개 내지 약 16개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 엑소뉴클레아제 루프는 Φ29 폴리머라제의 N77-N88과의 상동성 영역 내의 약 10개 아미노산 내지 20개 이하의 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 15개 이하의 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 20개 이하의 아미노산, 또는 약 5개 아미노산 내지 25개 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제의 N77-N88과의 상동성의 엑소뉴클레아제 루프를 포함하는 엑소뉴클레아제 도메인의 영역 내의 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 E75, R76, S82, A83, D84, G85, L86, P87, N88, Y90, 및 N91 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는 변형된 Φ29 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 E75F, R76K, S82C, A83K, D84E, G85A, L86K, P87E, N88R, Y90F, 및 N91S 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 Φ29 폴리머라제 내의 E75, R76, S82, A83, D84, G85, L86, P87, N88, Y90, 및 N91에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제가 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하지 않는 경우, 이러한 변형된 폴리머라제는, 예를 들어, 상동성 정렬 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 상기 열거된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 TPR1 서브 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 예를 들어, C018은 M2Y 폴리머라제 서열로부터 치환된 TPR1 서브 도메인을 포함하는 키메라 폴리머라제이다. 유사하게, C021은 루실리아 쿠프리나 폴리머라제로부터 치환된 TPR1 서브 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 팜 서브 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 핑거 서브 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 TPR2 서브 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 섬 서브 도메인을 갖는 대다수의 폴리머라제 서열을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은, 변형된 재조합 폴리머라제는 2개 이상의 도메인 및/또는 서브 도메인 치환을 포함하는 키메라 폴리머라제 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대다수의 서열 내의 2개의 영역 (예를 들어, 도메인/서브 도메인)이 상이한 서열의 2개의 상응하는 영역 (예를 들어, 상응하는 도메인/서브 도메인)으로 치환된다. 예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, C019는 M2Y 폴리머라제 서열의 상응하는 엑소뉴클레아제 도메인 및 TPR1 서브 도메인으로 치환된 엑소뉴클레아제 도메인 및 TPR1 서브 도메인을 포함하는 키메라 폴리머라제이다. 유사하게, C022는 루실리아 쿠프리나 폴리머라제의 상응하는 엑소뉴클레아제 도메인 및 TPR1 서브 도메인으로 치환된 엑소뉴클레아제 도메인 및 TPR1 서브 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 부가의 도메인 및/또는 서브 도메인 치환이 본원에 기재된 변형된 폴리머라제와 함께 고려된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대다수의 서열 내의 3개 이상 (예를 들어, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 영역 (예를 들어, 도메인/서브 도메인)이 상이한 서열의 3개 이상 (예를 들어, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 상응하는 영역으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체의 대다수의 폴리머라제 서열은 표 1-3 내의 서열로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 대다수의 폴리머라제 서열은 표 1-3으로부터 선택된 상이한 폴리머라제 서열로부터 치환된 하나 이상의 영역 및/또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 표 4는 표 3으로부터 선택된 키메라 폴리머라제 변이체의 개요를 제공하고, 치환된 영역(들)/부분(들) 및 그 치환이 기초하는 서열에 관한 설명과 함께 각각에 대한 대다수의 폴리머라제 서열을 열거한다.
<표 4>
키메라 폴리머라제 - 치환된 부분
그러나, 예를 들어 본원의 표 중 하나 이상에 기재되고 예시된 바와 같은 다른 키메라가 사용될 수 있고/있거나 추가로 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제 변이체는 하나 이상의 부위 특이적 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이 중 임의의 것 (예를 들어, 표 2 내의 각각의 서열에 포함된 하나 이상의 돌연변이 중 임의의 것)이 본 개시내용에 고려된 키메라 폴리머라제 (예를 들어, 상기에 언급되고 표 3에 열거된 바와 같음) 중 임의의 것에 적용될 수 있다. 도 6은 일반적으로, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 키메라 폴리머라제 변이체를 도시한다. 예를 들어, 돌연변이체 키메라 폴리머라제 (602)는 치환된 M2Y 엑소뉴클레아제 도메인 및 이러한 치환된 도메인 이내에서의 돌연변이를 갖는 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 키메라 폴리머라제는 2개 이상의 상이한 폴리머라제 서열에 상응하는 영역으로 치환된 2개 이상의 영역을 수반한 대다수의 서열을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 키메라 폴리머라제 (604)는 치환된 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제 TPR1 서브 도메인 및 치환된 M2Y 폴리머라제 TPR2 서브 도메인을 갖는 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하며, 폴리머라제 서열 내의 다양한 위치에서 이루어진 부위 특이적 돌연변이를 수반한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 키메라 폴리머라제는 상이한 폴리머라제에 상응하는 영역으로 치환된 2개 이상의 영역을 수반한 대다수의 서열을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체 키메라 폴리머라제 (606)는 치환된 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제 TPR1, TPR2, 및 섬 서브 도메인을 갖는 Φ29 폴리머라제 대다수의 서열을 포함하며, 폴리머라제 서열 내의 다양한 위치에서 이루어진 부위 특이적 돌연변이를 수반한다.
표 5는 표 3으로부터 선택된 키메라 폴리머라제 변이체의 개요를 제공하고, 특별한 변이체가 되도록 이루어진 아미노산 돌연변이에 관한 설명과 함께 각각에 대한 대다수의 폴리머라제 서열을 제공한다.
<표 5>
키메라 폴리머라제 - 부위 특이적 돌연변이체
그러나, 다른 아미노산 돌연변이가 본원에 기재된 하나 이상의 키메라 폴리머라제 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 변화가 Φ29 폴리머라제 서열과 관련하여 위치 M8, V51, N62, I71, L107, 및/또는 K131 중 하나 이상, 및/또는 위치 K135, L142, G197, Y224, E239, V250, L253, Y281, I288, T301, R306, R308, D325, D341, K354, T368, E375, A437, A444, E466, D476, A484, E508, D510, K512, E515, K539, D570, 및 T571 중 하나 이상에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키메라 폴리머라제는 또한, 하기 아미노산 치환: M8R, V51A, N62D, I71V, L107I, 및/또는 K131E 중 하나 이상, 및/또는 하기 아미노산 치환: K135Q, L142K, G197D, Y224K, E239G, V250A, V250I, L253A, L253H, Y281H, I288L, T301C, R306Q, R308L, D325E, D341E, K354R, T368F, E375Y, A437G, A444T, E466K, D476H, A484E, E508R, D510K, D510R, K512Y, E515Q, K539E, D570S, 및/또는 T571V 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리머라제" 및 "중합 효소"는 일반적으로, 중합 반응을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 열 안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형된 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 φ29 (파이29) DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, VENT® 폴리머라제, Deep VENT™ 폴리머라제, Ex TAQ™ 폴리머라제, LA TAQ™ 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tca 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, PLATINUM® Taq 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Tth 폴리머라제, PFUTURBO® 폴리머라제, PYROBEST™ 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 클레노우 단편, 3'에서 5'로의 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 폴리머라제, 및 그의 변이체, 변형된 산물 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제이다. 폴리머라제의 부가의 예는 M2Y 폴리머라제, 루실리아 쿠프리나 폴리머라제, 엔테로코쿠스 파에시움 폴리머라제, 바실루스 파지 VMY22 폴리머라제, 바실루스 파지 GA-1 폴리머라제, 악티노마이세스 파지 AV-1 폴리머라제, 칸디다투스 모란박테리아(Moranbacteria) 폴리머라제, 바실루스 파지 MG-B1 폴리머라제, 에게르텔라 종 폴리머라제, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 파지 CP-7 폴리머라제, 박테로이데스 종(Bacteroides sp.) 폴리머라제, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 폴리머라제, 및 글로보데라 팔리다(Globodera pallida) 폴리머라제를 포함한다. DNA 폴리머라제의 비-제한적 예 및 그의 특성은 특히, 문헌 [DNA Replication 2nd edition, Kornberg and Baker, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)]에 상세히 기재되어 있다. 이러한 서열의 비-제한적 예는 표 1에서 찾을 수 있다 (서열식별번호: 1-19).
표적 핵산의 핵 염기와 상보적인 dNTP 간의 염기쌍을 형성할 때, 폴리머라제는 새로이 합성된 가닥의 3' 히드록실 말단과 dNTP의 알파 포스페이트 간에 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 dNTP를 새로이 합성된 핵산 가닥 내로 혼입시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 높은 전진성을 지닌 폴리머라제이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 감소된 전진성을 지닌 폴리머라제이다. 폴리머라제 전진성은 일반적으로, 핵산 주형을 방출하지 않고서도 dNTP를 핵산 주형 내로 연속적으로 혼입할 수 있는 폴리머라제의 능력을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 낮은 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 3'-5' 엑소뉴클레아제를 수반한 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 상응하는 야생형 폴리머라제와 비교하여 감소된 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 3'-5' 활성을 갖는 것으로 변형된다 (예를 들어, 아미노산 치환에 의함). DNA 폴리머라제의 추가의 비-제한적 예는 9°NM™ DNA 폴리머라제 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)], 및 클레노우 엑소-폴리머라제의 P680G 돌연변이체를 포함한다 (Tuske et al. (2000) JBC 275(31):23759-23768). 일부 실시양태에서, 감소된 전진성을 갖는 폴리머라제는 뉴클레오티드 반복 서열의 하나 이상의 연장물 (예를 들어, 동일한 유형의 2개 이상의 순차적 염기)을 함유하는 주형을 시퀀싱하기 위한 증가된 정확도를 제공한다.
핵산 폴리머라제의 전진성, 엑소뉴클레아제 활성, 상이한 유형의 핵산에 대한 상대적 친화성, 또는 다른 특성은 상응하는 야생형 폴리머라제와 비교하여 돌연변이 또는 다른 변형에 의해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리머라제는 하나 이상의 비-자연 아미노산 치환을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "비-자연 아미노산"은 하기 20개의 유전적으로 코딩된 알파-아미노산 이외의 임의의 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 아미노산 유사체를 지칭한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린. 일부 실시양태에서, 비-자연 아미노산은 상기 20개의 알파-아미노산 이외의 자연 발생 화합물을 포함할 수 있다. 비-자연 아미노산 및 비-자연 아미노산을 단백질 서열 내로 혼입하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,045,337 (그의 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 기재된 바와 같은, 폴리머라제 및/또는 폴리머라제 서열은 이들이 공통 조상의 단백질 또는 단백질 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "상동"이다. 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 이들이 공통 조상의 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 상동이다. 예를 들어, 임의의 자연 발생 핵산은 폴리펩티드 내의 소정의 위치에서 자연 발생하지 않는 아미노산을 코딩하는 적어도 하나의 특이적 코돈을 포함하도록 임의의 이용 가능한 돌연변이 유발 방법에 의해 변형될 수 있다. 발현될 때, 이와 같이 돌연변이 유발된 핵산은 하나 이상의 돌연변이된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 상동성은 일반적으로, 2개 이상의 핵산 또는 단백질 (또는 그의 서열) 간의 서열 유사성으로부터 추론된다. 상동성 확립에 유용한 서열 간의 유사성의 정확한 백분율은 문제가 되는 핵산 및 단백질에 따라 다양하지만, 25% 정도의 서열 유사성이 상동성을 확립하는 데 일상적으로 사용된다. 더 높은 수준의 서열 유사성, 예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 그 초과가 또한, 상동성을 확립하는 데 사용될 수 있다. 서열 유사성 백분율을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 유사성은, 예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여, 예를 들어 BLASTP 및 BLASTN 알고리즘을 포함한, 상기 기재된 것과 같은 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리머라제를 발현하기 위해, 이러한 폴리머라제를 코딩하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터 내로 삽입하여, 이와 같이 코딩된 폴리머라제가 전사 및 번역 제어 서열과 작동적으로 연결되도록 한다 [예를 들어, 미국 특허 번호 6,914,128 (그의 내용이 본원에 참조로 포함된다) 참조]. 이와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"이란 폴리머라제를 코딩하는 서열이 벡터 내로 라이게이션되어 이러한 벡터 내에서의 전사 및 번역 제어 서열이 폴리머라제의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 수행하도록 하는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 화합성이 되도록 선택된다. 폴리머라제-코딩 서열이 표준 방법 (예를 들어, 폴리머라제-코딩 서열 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 및 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다.
변형된 폴리머라제의 발현을 위하여, 변형된 폴리머라제를 코딩하는 발현 벡터를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는 데 흔히 사용되는 광범위한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 폴리머라제를 발현하는 데 적합한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포를 포함한다.
이러한 목적에 적합한 원핵 생물은 유박테리아, 예컨대 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 원핵 생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 섬유상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 흔히 사용되고 있다. 그러나, 수많은 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus), 케이. 위케라미이(K. wickeramii), 케이. 왈티이(K. waltii), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 쉬반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예컨대, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니제르(A. niger)가 통상적으로 이용 가능하고 본원에 유용하다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리머라제 생산을 위하여 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 폴리머라제를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 배지, 예컨대 햄스(Ham's) F10™ [시그마(Sigma)], 최소 필수 배지™ (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘벡코 변형된 이글 배지™ (DMEM) (시그마)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포를 이용하여 앞서 사용된 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제 변이체는 세포 내에서, 세포질 주위 공간에서 생산되거나 또는 세포의 배지로 직접 분비될 수 있다. 폴리머라제 변이체가 세포 내에서 생산되는 실시양태에서, 숙주 세포 또는 용해된 세포 (예를 들어, 균질화로부터 생성됨)의 미립자 부스러기는 원심 분리 또는 한외 여과를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 수단에 의해 제거될 수 있다. 폴리머라제가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액은 상업적으로 이용 가능한 단백질 농축 필터를 사용하여 먼저 농축될 수 있으며, 그 후 하나 이상의 부가의 정제 기술을 수행할 수 있으며, 이는 단백질 친화성 크로마토그래피를 포함한 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 측면은 생물학적 샘플의 검정과 관계된 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 샘플 내의 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열을 결정하고/하거나 샘플 내의 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 관심 유전자 내의 하나 이상의 돌연변이)의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용되는 기술에 유용하다. 일부 실시양태에서, 시험은 핵산 서열 정보를 제공하거나 또는 진단, 예후, 및/또는 치료 목적으로 하나 이상의 관심 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 환자 샘플 (예를 들어, 인간 환자 샘플) 상에서 수행될 수 있다. 일부 예에서, 진단 시험은, 예를 들어 대상체의 생물학적 샘플 내의 무세포 DNA 분자 및/또는 발현 산물 (예를 들어, RNA)을 시퀀싱함으로써, 대상체의 생물학적 샘플 내의 핵산 분자를 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 공동 계류중인 미국 특허 출원 번호: 14/543,865, 14/543,867, 14/543,888, 14/821,656, 14/821,686, 14/821,688, 15/161,067, 15/161,088, 15/161,125, 15/255,245, 15/255,303, 15/255,624, 15/261,697, 15/261,724, 62/289,019, 62/296,546, 62/310,398, 62/339,790, 62/343,997, 62/344,123, 및 62/426,144 (각각의 내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 기술에 유리하게 활용될 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 출원의 일부 측면은 생물학적 중합체, 예컨대 핵산 및 단백질을 시퀀싱할 수 있는 기술에 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물은 (예를 들어, 일련의 표지된 뉴클레오티드 또는 아미노산 단량체의 시간 과정에 따른 혼입을 검출함으로써) 핵산 또는 단백질 내로 혼입되는 일련의 뉴클레오티드 또는 아미노산 단량체를 확인해 주는 기술에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법 및 조성물은 중합 효소에 의해 합성된 주형 의존성 핵산 시퀀싱 반응 산물 내로 혼입되는 일련의 뉴클레오티드를 확인해 주는 기술 내로 혼입될 수 있다.
시퀀싱 동안, 중합 효소는 표적 핵산 분자 (예를 들어, 시퀀싱 주형의 핵산 분자)의 프라이밍 위치에 커플링 (예를 들어, 부착)될 수 있다. 프라이밍 위치는 표적 핵산 분자의 부분에 상보적인 프라이머를 포함할 수 있다. 대안으로서 프라이밍 위치는 표적 핵산 분자의 이중 가닥 절편 내에 제공되는 갭 또는 닉(nick)이다. 갭 또는 닉은 0 내지 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 닉은 이중 가닥 서열의 한 가닥에서 브레이크를 제공할 수 있으며, 이는 중합 효소, 예컨대, 예를 들어 가닥 치환 폴리머라제 효소를 위한 프라이밍 위치를 제공할 수 있다.
일부 경우에, 시퀀싱 프라이머는 고체 지지체에 고정화될 수 있거나 또는 고정화되지 않을 수 있는 표적 핵산 분자에 어닐링될 수 있다. 고체 지지체는, 예를 들어, 핵산 시퀀싱에 사용되는 통합 장치 상의 샘플 웰을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 프라이머는 고체 지지체에 고정화될 수 있고, 표적 핵산 분자의 혼성화는 또한, 표적 핵산 분자를 고체 지지체에 고정화시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 고체 지지체에 고정화되고 가용성 프라이머 및 표적 핵산은 폴리머라제에 접촉된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 표적 핵산 및 프라이머를 포함하는 복합체가 용액 중에 형성되고, 이러한 복합체는 (예를 들어, 폴리머라제, 프라이머, 및/또는 표적 핵산의 고정화를 통해) 고체 지지체에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 내의 어떠한 성분도 고체 지지체에 고정화되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 표적 핵산, 및 프라이머를 포함하는 복합체가 용액 중에 형성되고, 이러한 복합체는 고체 지지체에 고정화되지 않는다.
적절한 조건 하에, 어닐링된 프라이머/표적 핵산에 접촉되는 폴리머라제 효소는 하나 이상의 뉴클레오티드를 프라이머 상에 부가하거나 혼입시킬 수 있으며, 뉴클레오티드는 프라이머에 5'에서 3'로의 주형 의존성 방식으로 부가될 수 있다. 이와 같이 뉴클레오티드를 (예를 들어, 폴리머라제의 작용을 통해) 프라이머 상으로 혼입하는 것은 일반적으로, 프라이머 연장 반응으로서 지칭될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는 핵산 연장 반응 동안 검출 및 확인될 수 있고 (예를 들어, 그의 발광 수명 및/또는 다른 특징에 기초한다), 연장된 프라이머 내로 혼입된 각각의 뉴클레오티드를 결정하고, 이에 따라 새로이 합성된 핵산 분자의 서열을 결정하는데 사용될 수 있는 검출 가능한 태그와 연합될 수 있다. 새로이 합성된 핵산 분자의 서열 상보성을 통해, 표적 핵산 분자의 서열을 결정할 수도 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 프라이머를 표적 핵산 분자에 어닐링시키고 뉴클레오타이드를 시퀀싱 프라이머에 혼입시키는 것은 유사한 반응 조건 (예를 들어, 동일하거나 또는 유사한 반응 온도) 또는 상이한 반응 조건 (예를 들어, 상이한 반응 온도)에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 방법에 의한 시퀀싱은 표적 핵산 분자의 집단 (예를 들어, 표적 핵산의 카피)의 존재 및/또는 표적 핵산의 집단을 달성하기 위한 표적 핵산의 증폭 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 합성에 의한 시퀀싱은 평가되는 각각의 반응에서 단일 분자의 서열을 결정하는데 사용된다 (그리고 핵산 증폭은 시퀀싱을 위한 표적 주형을 제조하는데 필요하지 않다). 일부 실시양태에서, 복수 개의 단일 분자 시퀀싱 반응은 본 출원의 측면에 따라서 병렬식으로 (예를 들어, 단일 통합 장치 상에서) 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수 개의 단일 분자 시퀀싱 반응은 통합 장치 상의 별도의 반응 챔버에서 각각 수행된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 중합 효소는 상당히 작은 용적의 샘플 웰에서 시행되는 단일 분자 시퀀싱 반응에 유용하다. 예를 들어, 샘플 웰의 용적은 일부 구현에서 약 10-21 리터 내지 약 10-15 리터일 수 있다. 샘플 웰이 작은 용적을 갖기 때문에, 단일 샘플 이벤트 (예를 들어, 단일 분자 이벤트)의 검출이 달성 가능하다. 일부 실시양태에서, 표면 (예를 들어, 샘플 웰의 표면)은 본원에 기재된 폴리머라제를 수용하도록 설정된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 바닥면과 같은 샘플 웰의 표면 상에 배치될 수 있는 폴리머라제를 수용한다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 통합 장치 내에 형성되며, 여기서 샘플 웰의 바닥면은 그것이 형성되는 통합 장치의 표면에 대해 원위이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 기술은 샘플 웰에 부가될 수 있는 중합 효소, 및 그의 복합체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합 효소는 샘플 웰의 표적 용적 (예를 들어, 반응 용적)에 한정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 용적은 샘플 웰 내의 영역이다. 하나 이상의 중합 효소가 바닥면 위에 고정화되어야 하는 실시양태에서, 하나 이상의 중합 효소 (예를 들어, 중합 효소 및 그의 복합체)의 부착을 허용하도록 바닥면을 기능화하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바닥면은 커플링 기를 포함하는 물질로 기능화된다. 예를 들어, 커플링 기는 화학적 모이어티, 예컨대 아민 기, 카르복실 기, 히드록실 기, 술프히드릴 기, 금속, 킬레이트제 등을 포함할 수 있다. 또 다른 한편으로, 이들은 특이적 결합 요소, 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 렉틴, SNAP-태그™ 또는 그에 대한 기질, 연합 또는 결합 펩티드 또는 단백질, 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 핵산 유사체 등을 포함할 수 있다. 부가적으로, 또는 또 다른 한편으로, 커플링 기는 일부 경우에 화학적 작용기와 특이적 결합 요소 둘 다를 포함할 수 있는 관심 분자 (예를 들어, 중합 효소 또는 그의 복합체)와 커플링 또는 결합하는데 사용되는 부가의 기와 커플링하기 위해 사용될 수 있다. 한 예로서, 커플링 기, 예를 들어, 비오틴은 기질 표면 상에 증착될 수 있고 소정의 영역에서 선택적으로 활성화될 수 있다. 이어서, 중간 결합제, 예를 들어, 스트렙타비딘이 제1 커플링 기와 커플링될 수 있다. 이러한 특별한 예에서 비오티닐화될 것인 관심 분자 (예를 들어, 중합 효소 또는 그의 복합체)는 스트렙타비딘과 커플링된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합 효소는 폴리머라제를 표면 (예를 들어, 샘플 웰의 표면)에 고정화시키는 커플링 기와의 상호 작용을 형성할 수 있는 커플링 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 중합 효소는 아비딘 단백질과 결합할 수 있는 N-말단 또는 C-말단 비오티닐화 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비오티닐화 서열은 링커 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, C-말단 링커/비오티닐화 서열은 아미노산 서열 GGGSGGGSGGGSGLNDFFEAQKIEWHE (서열식별번호: 517)을 포함한다.
실시예
실시예 1. 변형된 폴리머라제의 발현 및 평가
재조합 폴리머라제 변이체는 이. 콜라이에서 발현되었고, 이를 His-스핀 컬럼을 사용하여 150 mL 규모의 배양물로부터 정제하였다. 단백질 순도는 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색함으로써 분석되었다 (도 7). 완충액 교환 및 단백질 농축 후, 30℃에서 30분 동안 트랩 체이스(trap chase)를 이용하여 dNTP의 존재하에 재조합 변이체를 활성 및 전진성에 관하여 평가하였다. 키메라 폴리머라제 변이체 C017 및 C020은 트랩의 존재하에 활성, 전진성, 및 합성 길이를 나타내었다. 변이체 폴리머라제에 의한 dNTP 유사체의 활용률을 측정하여 시퀀싱 반응에서의 폴리머라제의 적합성을 평가하였다. 상동 돌연변이체 변이체와 키메라 폴리머라제 변이체 둘 다는 dN6P의 활용률을 표시하였다. 단일 분자 시퀀싱으로부터의 결과가 하기 표 6에 제시된다.
<표 6>
변형된 폴리머라제를 이용한 시퀀싱 결과
등가물 및 범위
몇 가지 발명적 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/하거나 그 결과 및/또는 본원에 기재된 이점 중 하나 이상을 수득하기 위한 각종 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이며, 이러한 변이 및/또는 변형 각각은 본원에 기재된 발명적 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 입체 배치가 예시적인 것으로 의도되고 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 입체 배치가, 본 발명의 교시가 사용하는 특이적 적용(들)에 의존한다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기재된 특이적 발명적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 한 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서, 발명적 실시양태는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용의 발명적 실시양태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 서로 불일치하지 않는 경우, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법 중 2개 이상의 임의의 조합이 본 개시내용의 발명적 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용된 바와 같은 모든 정의가, 사전적 정의, 참조로 포함된 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상적인 의미에 비해 우선하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용되는 주제에 관해서 참조로 포함되며, 일부 경우에는 그 문서의 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 달리 명백하게 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 문구 "및/또는"은, 이와 같이 결합된 요소 중 "어느 하나 또는 양쪽", 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 다수의 요소는 동일한 방식으로, 즉 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있거나 관련이 없든지 간에, "및/또는" 구절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외에 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, "포함하는" 것과 같이 제한을 두지 않은 언어와 연계해서 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서 A 만을 지칭할 수 있고 (B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시 양태에서, B 만을 지칭할 수 있으며 (A 이외의 요소를 임의로 포함함); 또한 또 다른 실시양태에서, A와 B 둘 다를 지칭할 수 있다 (다른 요소를 임의로 포함함).
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하는데, 즉 수많은 요소 또는 요소 목록, 및 임의로 부가의 목록에 없는 항목 중 적어도 하나뿐만 아니라 2개 이상을 포함한다. 그 반대로 명백하게 표시된 용어, 예컨대 "오직 하나" 또는 "정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 이루어진"이란 용어만이 수많은 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 "어느 하나", "하나", "오직 하나" 또는 "정확히 하나"와 같이 배타적인 용어가 선행될 때, 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 것이지만, 둘 다가 아닌")을 표시하는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용된 바와 같은 그의 통상적인 의미를 지닐 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 상기 요소의 목록 내의 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어로 하나를 반드시 포함하지 않고, 요소의 목록 내의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지의 여부와 상관없이, "적어도 하나"라는 문구가 지칭된 요소 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외에 요소가 임의로 존재할 수 있게 해준다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A와 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, 적어도 하나, 임의로 2개 이상의 A를 포함하고, B가 존재하지 않은 것 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함함)을 지칭할 수 있고; 또 다른 실시 양태에서, 적어도 하나, 임의로 2개 이상의 B를 포함하고, A가 존재하지 않은 것 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함함)을 지칭할 수 있으며; 또한 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나, 임의로 2개 이상의 A를 포함하고, 적어도 하나, 임의로 2개 이상의 B를 포함하는 것 (및 임의로 다른 원소를 포함함)을 지칭할 수 있다.
반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서는, 그러한 방법의 단계 또는 동작의 순서가 반드시, 그 방법의 단계 또는 동작이 나열되는 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
청구범위뿐만 아니라 상기 명세서에서, "포함하는", "포함하는", "수반하는", "갖는", "함유하는", "포함하는", "보유하다", "구성된" 등과 같은 모든 이행 어구는 제한을 두지 않는 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이행 어구 "~로 이루어지는" 및 "본질적으로 ~로 이루어지는" 것 만이 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 명시된 바와 같이, 각각 폐쇄 또는 반-폐쇄 이행 어구일 것이다. 제한을 두지 않은 이행 어구 (예를 들어, "포함하는")를 사용하여 본 명세서에 기재된 실시양태는 또한, 대안 실시양태에서 제한을 두지 않은 이행 어구에 의해 기재된 특색으로 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진" 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 개시내용이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우, 본 개시내용은 또한, 대안 실시양태에서 "A 및 B로 이루어진 조성물" 및 "본질적으로 A 및 B로 이루어진 조성물"을 고려한다.