KR20230077435A

KR20230077435A - 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법 및 분석 시스템

Info

Publication number: KR20230077435A
Application number: KR1020210164698A
Authority: KR
Inventors: 안신애
Original assignee: 안신애
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2023-06-01
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: KR102695246B1

Abstract

본 발명은 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법 또는 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는 준비된 상기 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하고, 어댑터 부착 및 유전체 분석을 수행한다. 본 발명에 따르면, 단일화된 과정을 통해 다양한 핵산 정보 분석을 위한 전처리를 수행하고, 후성유전체 정보, 절단서열의 염기서열 특성, 절단 서열의 메틸레이션 패턴 정도를 한 번에 분석할 수 있다.

Description

유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법 및 분석 시스템{SIMΜLTANEOUS ANALYTIC METHOD AND SYSTEM OF GENOME AND EPIGENOME INFORMATION}

본 발명은 유전체와 후성유전체를 동시 분석하기 위한 분석 방법 및 분석 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 무세포 순환 DNA에서 얻을 수 있는 다양한 유의미한 핵산 정보를 한 번에 분석할 수 있도록 전처리 과정을 간소화하고 단일화하는 기술을 포함한다.

분자생물학에 있어 라이브러리(Library)란 유전자 클로닝을 통해서 각기 다른 DNA 단편 조각을 동일한 벡터에 삽입한 모음을 말한다. 라이브러리는 서로 다른 개체의 총 유전체 DNA를 제한효소로 잘라 만든 유전체 라이브러리(Genomic Library)와 암호화 서열만을 포함하고 있는 cDNA 라이브러리(cDNA Library)가 있다. 이들은 특정 개체의 유전체 염기서열 분석에서 새로운 유전자의 발견과 기능연구까지 넓은 분야에 이용되고 있다. 또한, 유전물질의 염기서열을 분석하기 위한 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)에도 라이브러리의 제작이 필수적이다.

일반적으로 라이브러리 제작 단계는 유전물질의 단편화(fragmentation), 어댑터 분착(adaptor ligation), 라이브러리의 정량 및 사이즈 확인 과정(quality control, QC)로 구성된다. 이때 기존 기술에 따르면, 무세포 순환 DNA를 분석하는데 있어서, 유전체를 분석하기 위해 준비하는 과정과 후성유전체를 분석하기 위해 준비하는 과정이 다른 프로세스로 설계되어 각각의 프로세스를 따로 준비하여 분석할 수밖에 없었다. 이에 따라, 분석 과정이 복잡해지고 분석에 필요한 시료의 양이 늘어나며 비용 또한 증가한다는 문제가 있었다.

예를 들어, 선행기술인 US 2019/0352695 A1에는 무세포 DNA의 프래그먼톰 프로파일링(fragmentome profiling) 분석 방법에 대해서만 언급하며 기원 조직, 질병, 진행 등을 나타낼 수 있는 단편 프로파일을 평가하기 위해 체세포 변이 정보의 유무에 관계없이 거시적 규모의 전체적인 방식으로 서열 정보를 사용할 수 있다고 설명하고 있다. 그러나, 유전체와 메틸레이션된 유전체를 통합 분석하는 기술에 대한 언급은 없다.

따라서, 무세포 순환 DNA에서 얻을 수 있는 유전체 정보, 후성유전체 정보, 절단서열의 염기서열 특성, 절단 서열의 메틸레이션 패턴 정도를 한 번에 분석할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

US 2019/0352695 A1 (GUARDANT HEALTH, INC.) 2019.11.21.

본 발명은 무세포 순환 DNA에서 얻을 수 있는 다양한 유의미한 핵산 정보를 한 번에 분석할 수 있도록 전처리 과정을 간소화하고 단일화하는 데 그 목적이 있다.

또한, 유전체를 분석하기 위한 전처리 과정과 후성유전체를 분석하기 위한 전처리 과정이 다른 종래기술과 달리, 본 발명은 유전체와 후성 유전체의 통합 분석을 위한 전처리 과정을 간소화함으로써 경제성을 확보하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 무세포 순환 DNA에서 얻을 수 있는 다양한 유의미한 핵산 정보를 통합 분석함으로써 새로운 바이오 마커 발굴뿐만 아니라 다양한 질병의 조기진단 정확도를 높이기 위해 효과적으로 활용되는데 그 목적이 있다.

해결하고자 하는 과제의 달성을 위하여, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 제1 단계; 상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 제2 단계; 및 제2 단계에서 수득된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 제3 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 상기 제3 단계에서 유전체 변이 분석, 메틸레이션 분석, 유전체 절단면 특성 분석 및 유전체 절단면 메틸레이션 분석으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 둘 이상의 분석이 동시에 수행된다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 상기 제3 단계는 상기 어댑터가 부착된 상기 시료의 염기서열을 읽는 단계; 상기 염기서열 데이터를 가공하여 알고리즘으로 분석하는 단계를 더 포함한다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 타겟 선별(Target Enrichment) 단계를 더 포함한다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 상기 제2 단계에서 상기 DNA 시료의 절단면의 정보가 보존된다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 상기 DNA 시료는 무세포 DNA를 포함한다.

해결하고자 하는 과제의 달성을 위하여, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템은 준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 전처리부; 상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 라이브러리 제작부; 및 어댑터가 부착된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 분석부를 포함한다.

또한, 본 발명의 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템은 상기 DNA 시료는 무세포 DNA를 포함한다.

본 발명의 일 형태에 따르면, 무세포 순환 DNA의 유전체 정보와 후성유전체 정보를 동시에 분석할 수 있고, 무세포 순환 DNA의 다양한 핵산 정보를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 일 형태에 따르면, 단일화된 과정을 통해 다양한 핵산 정보 분석을 위한 전처리를 할 수 있어 경제적이며, 소량의 시료로부터 유전체 정보, 후성유전체 정보, 절단서열의 염기서열 특성, 절단 서열의 메틸레이션 패턴 정도를 한 번에 분석할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체 분석 방식과 종래 기술에 따른 유전체 분석 방식을 비교한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체 분석 방식과 종래 기술에 따른 유전체 분석 방식을 비교한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 유전체 정보와 후성 유전체 정보를 동시 분석하기 위한 프로세스 과정에서의 핵산 구조 변화를 나타낸 도면이다.
도 6은 무세포 순환 DNA 추출 후 퀄리티 확인(QC) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 바이설파이트 전환 후 무세포 순환 DNA의 최종 라이브러리 퀄리티 확인(QC) 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

아래 설명에서 사용되는 용어는, 연관되는 기술 분야에서 일반적이고 보편적인 것으로 선택되었으나, 기술의 발달 및/또는 변화, 관례, 기술자의 선호 등에 따라 다른 용어가 있을 수 있다. 따라서, 아래 설명에서 사용되는 용어는 기술적 사상을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 되며, 실시예들을 설명하기 위한 예시적 용어로 이해되어야 한다.

또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 설명 부분에서 상세한 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 아래 설명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가지는 의미와 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 이해되어야 한다.

한편, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의하여 한정되지 않는다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다．

한편, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

본 발명의 일 형태에 따르면, 준비된 상기 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하고, 어댑터 부착 및 유전체 분석을 수행한다. 본 발명에 따르면, 단일화된 과정을 통해 다양한 핵산 정보 분석을 위한 전처리를 수행하고, 후성유전체 정보, 절단서열의 염기서열 특성, 절단 서열의 메틸레이션 패턴 정도를 한 번에 분석할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법을 나타낸 순서도이다.

도 1을 참고하면, 준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 제1 단계(S100); 상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 제2 단계(S200); 및 제2 단계(S200)에서 수득된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 제3 단계(S300)를 포함하는 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법에 개시되어 있다.

먼저, 제1 단계(S100)에서 DNA 시료를 준비하고, 준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행한다. 제1 단계(S100) 수행 후 ssDNA(single-stranded DNA) 시료가 준비된다.

제1 단계(S100)에서 준비되는 DNA 시료의 종류에는 제한이 없다. 예를 들어, DNA 시료는 사람을 비롯한 모든 생물, 바이러스 등으로부터 추출한 유전체일 수 있다. 제1 단계(S100)에서 DNA 시료를 준비하기 위하여 세포로부터 DNA 시료를 추출하는 과정이 수행될 수 있다. 이를 위하여 먼저 세포를 용해하는 과정이 수행될 수 있다. 세포는 균질기(homogenizer), 소니케이터(sonicator; 초음파분산기) 또는 비드 비터(bead beater)와 같은 장비를 사용하여 물리적으로 용해할 수 있다. 이때, 세제(detergent)와 같은 물질을 첨가하여 지질 기반 세포막을 화학적으로 파괴하고 핵과 세포에서 DNA를 방출시킬 수 있다. 다음으로, 원심분리기(centrifuge)를 사용해 세포 파편을 바닥에 분리시키고 세포 물질(DNA 포함)을 함유한 용해물(lysate)을 모아서 처리할 수 있다. 구체적으로 용해물에 포함된 DNA를 RNA 또는 단백질과 같은 다른 세포 분자와 분리하기 위해 리보핵산가수분해효소(ribonuclease), 단백질분해효소(proteinase)를 첨가할 수 있다.

제1 단계(S100)에서 상술한 DNA 시료를 준비하는 과정에서 DNA를 안정시키고 용액에서 침전시키는 것을 돕기 위해 염(salt)이 DNA 추출 중에 첨가될 수 있다. DNA 침전(DNA precipitation)을 위해 에탄올(ethanol)이나 이소프로판올(isopropanol; 아이소프로판올)과 같은 알코올을 얼음에 차게 식혀 시료에 추가할 수 있다. 이를 통해 DNA 시료를 침전시켜 준비할 수 있다.

제1 단계(S100)에서 상술한 프로세스를 통해 준비된 DNA 시료는 바이설파이트(bisulfite) 처리된다. 바이설파이트는 중아황산염, 또는 아황산수소염 등의 화합물일 수 있다. 또 다른 경우 바이설파이트 처리를 위해 암모늄 바이설파이트 용액(예를 들어, Lighting Conversion Reagent)을 사용할 수 있다. 바이설파이트 처리에 의해 DNA 시료의 대부분은 단일 가닥 DNA(Single Stranded DNA; ssDNA)로 전환된다. 이때 사용되는 DNA 시료는 무세포 DNA일 수 있는데, 일반 무세포 DNA의 기본 구조는 이중 가닥 DNA 형태이며, 바이설파이트 처리 후의 무세포 DNA는 단일 가닥 DNA로 Uracil을 다량 포함하고 있는 불안정한 구조를 가질 수 있다. 후성유전체 분석을 위해 주로 사용하는 바이설파이트 처리의 경우 대부분의 DNA를 단일 가닥으로 만들어줄 뿐 아니라 다량의 우라실을 포함하고 있어 혹독한 바이설파이트 용액의 특성에 따라 과정 중에 그 결합이 끊어질 확률이 높다.

종래 기술에 따르면 최종적인 형태의 NGS 라이브러리를 형성한 후 바이설파이트 처리를 수행하는 것이 일반적이었다. 그러나, 이 경우, 바이설파이트 과정 중 손상으로 인해 서열 중간의 결합이 끊길 가능성이 생기며 NGS 라이브러리의 완성된 구조가 깨져 염기서열 분석에 활용되지 못하고 손실될 수 있다. 이 손실률은 최대 90% 이상이 될 수도 있다고 알려져 있다.

본 발명에서는 최종적인 구조의 NGS 라이브러리를 만들기 전에 제1 단계(S100)에서 초기에 바이설파이트 처리를 하고, 최대한 많은 복잡도를 가진 유전체로 NGS 라이브러리를 만듦으로써 안정적이고 높은 수율을 얻을 수 있다.

제1 단계(S100)에서 사용되는 시료가 무세포 DNA에 제한되는 것은 아니다. 무세포 DNA뿐 아니라 일반 gDNA에서 손상도가 높은 FFPE DNA 등 다양한 형태의 DNA를 사용할 수 있고, 사람의 DNA 뿐 아니라 다양한 생물의 DNA를 적용하는 것도 가능하다.

제1 단계(S100)에서 DNA 시료는 바이설파이트 처리됨과 함께 열처리된다. 열처리에 의하여 바이설파이트 처리 후 단일 가닥으로 전환되지 않은 이중 가닥 DNA들이 단일 가닥으로 전환될 수 있다. 열처리 온도 및 시간은 시료의 양과 종류를 고려하여 적절히 선택할 수 있다.

제1 단계(S100)에서 바이설파이트 처리 및 열처리를 거쳐, DNA 시료로부터 ssDNA 시료가 준비된다. ssDNA 시료는 시료 내에 이중 가닥 DNA를 포함하지 않으며, 단일 가닥 DNA로 구성될 수 있다. 이때 준비된 단일 가닥 DNA는 바이설파이트 처리에 의해 전환된 단일 가닥 DNA와 열처리에 의해 전환된 단일 가닥 DNA를 포함한다.

제1 단계(S100)에서 시료에 대하여 바이설파이트 처리를 하게 되면 다량의 우라실(Uracil)을 포함한 단일 가닥의 DNA가 생성된다. 이때, 바이설파이트 처리되지 않은 일반 시료도 단일 가닥의 DNA로 만들어주면 바이설파이트 처리된 시료와 일반 시료의 기본적인 형태가 단일 가닥으로 동일하므로 두 가지의 유전체 분석을 위한 NGS 라이브러리를 동시에 진행할 수 있다.

다음으로, 준비된 ssDNA 시료는 어댑터를 부착(ligation) 하는 제2 단계(S200)에 도입된다.

제2 단계(S200)에서 부착되는 어댑터는 NGS 어댑터일 수 있다. NGS 어댑터는 바이설파이트 처리에 의해 전환된 단일 가닥 DNA와 열처리에 의해 전환된 단일 가닥 DNA 모두에 부착될 수 있다. 어댑터는 장비가 인식할 수 있는 특정 염기서열일 수 있다.

제2 단계(S200)에서 어댑터를 부착함으로써 라이브러리(library)가 구축될 수 있다. 라이브러리는 특정 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드, 즉, 어댑터를 부착함으로써 향후 제3 단계(S300)에서 유전체의 정보를 분석할 수 있는 베이스를 구축하는 작업을 의미할 수 있다.

제2 단계(S200)에서 어댑터를 부착하기 위하여 라이게이즈(ligase) 효소를 이용할 수 있다. 라이게이즈 효소는 제공된 ssDNA에 포함된 단일 가닥 DNA의 말단에 어댑터를 부착할 수 있다.

제2 단계(S200)에서 ssDNA 시료의 절단면의 정보가 보존된다. 구체적으로 제2 단계(S200)에서 일반적인 라이브러리 준비에서 사용되는 말단 수리(End-Repair)/폴리싱(Polishing) 단계를 거치지 않을 수 있고, 이에 따라 생체 내에서 자연스럽게 생성된 무세포 DNA의 절단면 정보가 그대로 보존된 채로 Library 구조가 완성될 수 있다. 따라서, 유전체 변이 분석과 메틸레이션 분석뿐만 아니라 절단면 특성과 절단면의 메틸레이션 패턴 분석까지 한 번에 할 수 있다.

제2 단계(S200)에서 어댑터가 붙은 라이브러리는 예기치 않은 부산물 등을 제거하는 정제(clean-up) 과정을 거칠 수 있다.

앞서 검토한 것과 같이 제1 단계(S100) 수행 후 바이설파이트 처리된 시료 및 열처리된 시료가 모두 단일 가닥 형태로 제공되는데, 이들에 대하여 유전체 분석을 위한 NGS 라이브러리와 후성 유전체 분석을 위한 NGS 라이브러리 구조를 만들기 위해 단일 가닥 DNA 상태에서 NGS 어댑터를 라이게이션할 수 있다(제2 단계(S200)). 단일 가닥의 DNA 상태에서 NGS 어댑터를 라이게이션하는 방법은 다양한 방식으로 상용화되어 있고, 모두 이용 가능하다.

다음으로, 제2 단계(S200)에서 수득된 시료(라이브러리)에 대하여 유전체 분석을 수행하는 제3 단계(S300)가 수행된다.

제3 단계(S300)는 상기 어댑터가 부착된 상기 시료의 염기서열을 읽는 단계; 상기 염기서열 데이터를 가공하여 알고리즘으로 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.

제3 단계(S300)에서는 라이브러리의 정량 및 사이즈를 확인하는 과정(Quality Check, QC)을 더 포함할 수 있다. 유전체 분석은 기술적 한계와 실험적 원인에 의한 다양한 오류(error)의 가능성이 있다. 염기서열 분석 결과에서는 추정 오류 확률을 수치로 나타내며 Phred 점수가 각 염기의 품질을 나타내는 지표로 활용될 수 있다.

제3 단계(S300)에서 유전체 변이 분석, 메틸레이션 분석, 유전체 절단면 특성 분석 및 유전체 절단면 메틸레이션 분석으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 둘 이상의 분석이 동시에 수행될 수 있다. 유전체 변이 분석, 메틸레이션 분석, 유전체 절단면 특성 분석 및 유전체 절단면 메틸레이션 분석 각각은 당업계에서 일반적으로 수행되는 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상술한 여러 종류의 분석들이 동시에 수행되기 때문에, 적은 양의 시료만으로도 여러 정보를 한 번에 파악할 수 있다.

제3 단계(S300) 중 유전체 변이 분석은 시퀀싱 리드를 분석하여 특정 위치에서 표준 유전체 서열과 다른 변이(variation)가 있는지 찾아내는 작업일 수 있다. 여기서 여러 개의 시퀀싱 리드를 종합하여 확률적으로 판단하여 에러를 배제하고 진양성(true positive) 변이를 추정하는 통계적 알고리즘들이 이용되며 GATK 프로그램 등이 사용될 수 있다.

제3 단계(S300)의 유전체 변이 분석을 통해 위암, 폐암, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, GIST, 뇌 척수의 악성종양, 소아 신경모세포종, 원발 부위 불명암의 진단이 가능하다. 고형암, 혈액암, 유전질환을 진단하는 경우 시퀀싱 리드로부터 암 유발 유전자 돌연변이를 확인함으로써 진단이 가능하다. 구체적으로 폐암, 소아 신경모세포종의 경우 ALK 유전자 변이 여부를 분석, 유방암과 난소암의 경우 BRCA1 변이를 분석, 폐암의 경우 EGFR, 뇌종양의 경우 IDH1, 흑색종, GIST의 경우 KIT, 뇌종양의 경우 NYC, 대장암의 경우 NRAS, 대장암과 흑색종의 경우 BRAF, 유방암과 난소암의 경우 BRCA2, 위암과 유방암의 경우 HER2, 뇌종양의 경우 IDH2, 대장암의 경우 KRAS, 소아 신경모세포종의 경우 M-myc, GIST의 경우 PDGFRA 유전자 변이 여부를 분석하여 진단할 수 있다.

종래 기술인 액체 생검은 혈액이나 소변 내 핵산(cfDNA,cfRNA), 엑소좀, CTC(ciculating tumor cell) 등에서 다양한 정보를 정교하게 추출하여 분석하는 검사법을 말하는데, 많은 연구를 바탕으로 가장 많이 분석되는 것은 핵산의 한 종류인 cfDNA(cell-free DNA)이다. cfDNA는 세포가 순환계로 방출한 DNA로, 세포핵 안에 존재하지 않기 때문에 '무세포’라고도 불리는데, 이때 건강한 개인의 cfDNA는 주로 조혈 세포로부터 파생되어 ‘무세포 순환 DNA’라 불리는 데 반해, 암 환자의 cfDNA는 조혈 세포뿐 아니라 종양 세포에서도 DNA가 방출되는 특징이 있는데, 이것을 ‘무세포 순환 종양 DNA(ctDNA)’라 한다. 발암 과정은 세포 내에서 광범위한 DNA 메틸화 변화를 동반하며 유전자 프로모터(promoter)와 첫 번째 엑손에 걸친 수많은 ‘5- 사이토신-포스페이트-구아닌(CpG)’섬의 과메틸화 또는 저메틸화된 지놈이 특징이다. 이러한 후성 유전적 변화의 대부분은 종양 형성 초기에 발생하며 종양 유형에 걸쳐 매우 널리 퍼져 있으며 DNA 메틸화 암 바이오 마커는 조기 발견에 적합할 뿐 만 아니라 암 발견 및 치료와 관련된 다양한 영역에서 유용성을 가질 수 있다.

특히, 암과 관련된 DNA 메틸화 변화는 혈액, 대변, 소변 및 기타 생체 시료에 존재하는 cfDNA에서도 정확하게 감지할 수 있으며 이러한 검사는 이미 성공적으로 검증된 몇 가지 사례를 통해 국가 전반에 걸친 선별 검사에 적합한, 간단하고 구체적이며 매우 경제적인 암 검출 검사 개발에 큰 가능성을 제공하고 있다. 초기 단계 종양에서는 혈액 내 ctDNA(circulating tumor DNA, cfDNA 중 종양DNA) 수준이 매우 낮기 때문에 액체 생검 ctDNA 체세포 돌연변이 검사의 민감도는 < 50% 정도로 낮은 편이지만, ctDNA의 DNA 메틸화 기반 액체 생검 테스트가 동반되면 암 조기 진단 확률을 크게 높일 수 있다.

체세포 게놈 변이 검출과 후성 유전체 분석 및 생물 정보 분류를 통합하여 비 종양 유래 변이를 필터링하는 혈장 전용 시퀀싱 분석을 사용하면 초기 CRC(I-III)에서 ctDNA 검출률은 94%(63/67; 95% 신뢰 구간 86%; 98%), 특이도는 94%를 보여 체세포 서열 변이 검출 단독 검출률보다 훨씬 뛰어난 성능을 보인다고 확인되었다. 그러나, 메틸화 패턴과 체세포 돌연변이 검사가 동시에 진행 가능할 경우 민감도를 크게 향상시킬 수 있다는 것이 확인되었으나 상용화된 키트는 아직 없는 상황이다.

따라서 메틸화 패턴과 체세포 돌연변이를 동시에 분석할 수 있는 솔루션이 개발 및 검증된다면, 충분한 특이성과 민감도를 가진 ctDNA 검사법으로 검증되어, 고통이 동반되고 경우에 따라서는 생명이 위험해질 수도 있는 생검 절차를 많은 부분에서 대체하게 될 것으로 예상된다. 본 발명의 경우 앞서 설명한 것과 같이 유전체 변이 분석, 메틸레이션 분석, 유전체 절단면 특성 분석 및 유전체 절단면 메틸레이션 분석을 동시에 수행할 수 있기 때문에 민감도를 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 형태에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 타깃 선별(Target Enrichment) 단계를 더 포함할 수 있다. 타깃 선별은 원하는 유전자 부위만 보기 위해 분석하고자 하는 부분의 DNA를 선별하는 과정을 의미할 수 있다. 타깃 선별은 PCR 프라이머(primer)로 증폭을 하는 앰플리콘(amplicon) 방법과 프로브(probe)를 이용하여 교합(hybridization)하는 캡쳐(capture) 방법을 포함한다. PCR 앰플리콘 방식은 검사 소요시간이 더 짧고, 상대적으로 적은 양의 DNA를 필요로 하여 잘 디자인된 작은 수의 유전자 패널에 대한 검사에 유용하다. 패널의 유전자 수가 많아지거나 엑솜 시퀀싱(exome sequencing)을 수행하는 경우에는 프로브 방식을 사용할 수 있다.

도 1에 개시되어 있는 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 도 2와 같은 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템을 통해 수행될 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템을 나타낸 것이다.

도 2의 시스템은 준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 전처리부(100); 상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 라이브러리 제작부(200); 및 어댑터가 부착된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 분석부(300)를 포함한다.

도 2에 개시되어 있는 시스템은 예시적인 것이며 본 발명의 일 형태에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법은 도 2에 개시된 시스템 외에 다른 시스템을 통해서도 수행될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 일 형태에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법 및 시스템에 대하여 살펴보았다. 이하에서는 종래 기술과 본 발명의 일 형태에 따른 유전체 분석 방법을 비교함으로써, 본 발명의 유리한 효과에 대하여 더 자세히 살펴보고자 한다.

도 3과 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전체 분석 방식과 종래 기술에 따른 유전체 분석 방식을 비교한 모식도이다.

도 3의 (a)에서 확인할 수 있듯이 일반적으로 사용되는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 기반의 NGS(차세대 염기서열분석; Next Generation Sequencing) 라이브러리 준비 방식은 접착성 말단(Sticky End) 부위를 평활 말단(Blunt End)으로 만들어주는 말단 수리(End-Repair) 과정이 필수적이기 때문에 절단 부위의 정보가 보존되지 않는다.

이에 비하여, 도 3의 (b)에 기재된 ssDNA 기반의 NGS 라이브러리 준비 방식을 사용하면 무세포 순환 DNA의 절단 부위의 정보가 보존된 채로 라이브러리 구조를 만들 수 있어 분석 시 해당 정보를 추가로 분석할 수 있다. 구체적으로, 일반 무세포 DNA의 기본 구조는 이중 가닥 DNA 형태이며, 바이설파이트 전환 후의 무세포 DNA는 단일 가닥 DNA로 우라실(Uracil)을 다량 포함하고 있는 불안정한 구조일 수 있다. 두 가지 서로 다른 형태를 가진 시료를 한 가지 방법으로 NGS(차세대 염기서열분석; Next Generation Sequencing) 라이브러리로 제작하기 위해서는 단일 가닥 기반의 라이브러리 준비 방식을 사용하며, PCR 과정에서는 우라실 내성 중합효소(Uracil Tolerant Polymerase)를 사용할 수 있다. 단일 가닥 DNA 기반의 라이브러리 준비 방식은 기본적으로, 단일 가닥 DNA에 NGS 어댑터를 부착(Ligation)하는 방식을 사용하기 때문에, 일반 무세포 DNA를 열 처리로 단일 가닥 DNA로 만들어준 뒤 NGS 어댑터를 부착해주면 아무 처리하지 않은 무세포 DNA와 바이설파이트 전환 후의 무세포 DNA를 동일한 방법으로 라이브러리 제작을 할 수 있게 된다.

다음으로, 도 4의 (a)를 참고하면, 기존 dsDNA 기반 NGS 라이브러리 준비 방식을 사용하면 라이브러리 구조를 모두 완성한 후에 바이설파이트 전환 과정을 수행할 수밖에 없고, 바이설파이트 전환으로 인해 대부분 단일 가닥 형태가 되기 때문에 바이설파이트 전환 직후 PCR 과정이 진행되어야 했다. 이때 바이설파이트 전환 과정에서 DNA 구조가 손상될 가능성이 높아 기존 방식으로 메틸레이션 라이브러리(Methylation Library)를 만들 경우 데이터 손실율이 높아질 수밖에 없었다.

그러나, 도 4의 (b)에 나타난 본 발명의 일 형태와 같이 시작 단계에서 바이설파이트 전환 과정을 수행하면 데이터 손실율을 최소화할 수 있는데, 전환 후에는 DNA 시료가 단일 가닥 형태가 되기 때문에 단일 가닥 기반의 라이브러리 준비 방식을 사용하면 높은 효율로 라이브러리 구조를 만들 수 있다. 따라서, 단일 가닥 기반의 라이브러리 준비 방식을 사용하면 동일한 에세이(Assay)로 유전체 분석을 위한 일반 라이브러리 준비 과정과 후성유전체 분석을 위한 바이설파이트 전환 DNA를 위한 라이브러리 준비 과정을 동시에 진행 가능하다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 유전체 정보와 후성 유전체 정보를 동시 분석하기 위한 프로세스 과정에서의 핵산 구조 변화를 나타낸 도면이다.

도면을 참고하면 일반 gDNA 및 FFDNA는 단편화된 이중 나선 DNA(Short dsDNA)로 파편화(fragmentation)된다. 또한, 시료에 포함되어 있는 cfDNA는 별개의 공정에 의해 마찬가지로 단편화된 이중 나선 DNA(Short dsDNA) 형태로 제공될 수 있다. 이때 cfDNA에 대해서는 파편화 공정이 수행되지 않을 수 있다.

다음으로, 단편화된 이중 나선 DNA는 바이설파이트 처리 및 열 처리된다. 바이설파이트 처리에 따라 단편화된 이중 나선 DNA는 우리실(Uracil)을 포함하는 단일 나선 DNA(ssDNA) 형태로 변환된다. 아울러, 바이설파이트 처리되지 않은 시료는 열 처리되어 마찬가지로 단일 나선 DNA 형태로 변환될 수 있다.

다음으로, 단일 나선 DNA(ssDNA)에 대해 NGS 어댑터 부착이 수행된다. 도면에서 확인할 수 있듯이, NGS 어댑터는 단일 나선 DNA 시료의 양 말단에 부착된다. 이때 열처리된, 우라실을 포함하지 않는 단일 나선 DNA와 바이설파이트 처리되어 우라실을 포함하는 단일 나선 DNA 모두에 NGS 어댑터가 부착될 수 있다.

다음으로, NGS 어댑터가 부착된 단일 나선 DNA는 인덱스 PCR된다. 이때 바이설파이트 처리된 시료와 열 처리된 시료 모두에 NGS 어댑터가 부착되어 있으므로, 바이설파이트 처리되었는지 여부와 관계없이 인덱스 PCR이 가능하다. 인덱스 PCR 후, gDNA, FFDNA로부터 추출된 바이설파이트 처리된 단일 나선 DNA로부터 후성 유전체 분석을 위한 라이브러리가 구축된다. 동시에 cfDNA로부터 추출된 열 처리된 단일 나선 DNA로부터 유전체 분석을 위한 라이브러리가 구축된다. 따라서, 도면에서 볼 수 있듯이 복수 종의 DNA 시료를 동시에 처리하여 후성 유전체 분석을 위한 라이브러리와 유전체 분석을 위한 라이브러리를 한 번에 구축할 수 있다.

구축된 라이브러리에 대하여 풀링(pooling) 후 표적 농축(Target Enrichment) 공정이 추가로 수행될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 일 형태에 따른 유전체와 후성 유전체 동시 분석 실혐 결과를 살펴보고자 한다.

먼저, 도 6은 무세포 순환 DNA 추출 후 퀄리티 확인(QC) 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6에서 무세포 순환 DNA는 전용 키트를 사용하여 추출하며, 본 발명의 검증을 위해서 CatchGene 사의 Catch-cfNDA Serum/ Plasma 4000 키트를 사용하였다. 무세포 순환 DNA는 Blood, Urine, Saliva 등 다양한 체액에서 추출 가능하다. 무세포 순환 DNA는 Qubit로 정량분석 후, 바이오아날라이져(BioAnalyzer) 또는 테이프스테이션(TapeStation)으로 정성 분석하였다. 무세포 순환 DNA 추출 방식 중, carrier RNA를 사용하는 경우 최종 산물에서 Qubit 정량 시 함께 측정되어 실제 정량값보다 높은 값으로 측정될 가능성이 높다. 그러므로 정량 정보도 테이프스테이션(TapeStation)에서 측정된 정량 값을 신뢰하는 것이 좋다.

다음으로, 도 7은 바이설파이트 전환 후 무세포 순환 DNA의 최종 라이브러리 퀄리티 확인(QC) 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7을 참고하면, 혈액 플라즈마에서 무세포 순환 DNA 추출 후 QC 분석한 결과가 기재되어 있는데(TapeStation QC), 무세포 순환 DNA의 기대 size인 160~170bp에서 주요 피크가 확인되었다.

도 7의 분석을 위하여 아래와 같이 시료 DNA에 대하여 바이설파이트 전환 및 NGS 라이브러리 구축을 수행하였다.

1. 무세포 순환 DNA의 바이설파이트 전환 전처리 과정

무세포 순환 DNA의 바이설파이트 전환 과정은 Zymo 사의 EZ DNA Methylation- Lighting Kit를 사용하여 진행하였으며, 진행 방법은 다음과 같다. 먼저, DNA 샘플 20 μl가 들어있는 PCR tube에 라이팅 전환 반응물[Lighting Conversion Reagent] 130 μl를 넣는다. 다음으로, 혼합한 후 튜브 측면에 남아 있는 물방울을 제거하기 위해 튜브를 스핀-다운한다. 다음으로, 써말 사이클(Thermal cycle)에 PCR 튜브를 넣는다. 조건은 (1) 98℃ 8min, (2) 54℃ 60min, (3) 4℃ 보관(20시간까지)과 같이 설정한다. 다음으로 수집 튜브(collection tube)를 장착한 Zymo-spin IC 컬럼에 M-binding 버퍼를 600 μl를 넣는다. 위의 컬럼에 DNA 샘플과 라이팅 전환 반응물[Lighting Conversion Reagent]의 혼합물(150μl)을 넣는다. M-binding 버퍼와 잘 섞기 위해 피펫 혼합 후 컬럼의 뚜껑을 닫고 몇 번 뒤집은 후 상온에 3-5분간 둔다. 11,000 x g로 1분간 원심분리한 후 하층액을 버린다. 컬럼에 [M-wash buffer]를 100 μl 넣는다. 11,000 x g로 1분간 원심분리한 후 하층액을 버린다. 다음으로, 컬럼에 L-디설포네이션 버퍼를 200 μl 넣는다. 상온(20-30℃에서 15-20분간 세워둔다. 11,000 x g로 1분간 원심분리한 후 하층액을 버린다. 다음으로 컬럼에 M-워시 버퍼를 200 μl 넣는다. 11,000 x g로 1분간 원심분리한 후 하층액을 버린다. M-워시 과정을 한 번 더 반복한다. 컬럼을 깨끗한 수집 튜브에 넣고 11,000 x g로 30초 동안 드라이 스핀을 수행하여 잔여 에탄올을 제거한다. 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 컬럼을 넣고, 10 μl EB buffer(60℃예열)를 컬럼 매트릭스에 직접 넣는다. 다음으로, 실온에 3분간 두었다가 11,000 x g로 1분간 원심분리하여 얻어진 산물을 분석에 사용한다.

2. 일반 무세포 DNA와 바이설파이트 전환 후의 무세포 DNA를 동시에 NGS 라이브러리 제작

본 발명의 일 형태에 따라 라이브러리를 제작하기 위해, ClaretBio 사의 SRSLY PicoPlus Library Kit를 사용하여 일반 무세포 DNA와 바이설파이트 전환(Bisulfite Conversion) 후의 무세포 DNA 시료를 가지고 라이브러리를 제작했으며, 그 과정은 아래와 같다.

먼저, PCR 블럭을 98℃로 예열한다. 다음으로, 일정량의 무세포 DNA를 18ul로 준비하고, ss인핸서 2μl를 넣는다. 98℃ 3분간 열 충격을 준 후, 즉시 얼음에 넣고 2분간 둔다. 어댑터 A, 어댑터 B를 각각 2μl 넣고, 반응 마스터 빅스를 26μl 넣는다. 잘 교반한 후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 50μl SRSLY 반응에 탈이온수(DW) 48μl, 100% 아이소프로필 알코올 12μl, Beads 65.2μl를 넣는다. 상온에 10분간 둔 후, 마그넷에 5분간 두고 상층액을 제거한다. 마그넷에 둔 상태로 80% 에탄올(EtOH)을 200μl 넣고, 30초 후에 에탄올(EtOH)을 제거한다. 에탄올(EtOH) 워시를 한 번 더 한다. 마그넷에서 10분간 건조한다. 마그넷에서 제거하고 탈이온수 15μl로 재분산한 후, 2분간 둔다. 마그넷에 2분간 둔 후 상층액을 새 튜브에 옮긴다. 상층액 15μl, NEBNext Q5U MM 25μl, 혼합된 i5/i7 UDI Index 프라이머 10μl를 PCR 튜브에 넣는다. 써말 사이클(Thermal cycles)을 다음과 같이 세팅하여 진행한다.

1 Cycle: 98℃, 30sec/ 10~12 Cycle: 98℃, 10sec, 62℃, 30sec, 65℃, 45sec

1 Cycle: 65℃, 5min

1 Cycle: 4℃, ∞

50 μl PCR 반응에 Beads 50μl를(1x) 넣는다. 상온에 10분간 둔 후, 마그넷에 5분간 두고 상층액을 제거한다. 마그넷에 둔 상태로 80% EtOH를 200μl 넣고, 30초 후에 EtOH를 제거한다. EtOH 세척을 한 번 더 한다. 마그넷에서 10분간 건조한다. 마그넷에서 제거하고 DW 20μl로 resuspend한 후, 2분간 둔다. 마그넷에 2분간 둔 후 상층액을 새 튜브에 옮긴다.

도 7을 참고하면, 상술한 것과 같이 바이설파이트 전환 후 무세포 순환 DNA의 최종 라이브러리 QC 결과 정상적인 라이브러리의 기대 크기인 약 300bp에서 메인 pick 확인되었다. 따라서, 바이설파이트 전환 후 정상적인 라이브러리 구축이 가능함을 확인하였다.

한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시 예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

Claims

준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 제1 단계;
상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 제2 단계; 및
제2 단계에서 수득된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 제3 단계를 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 제3 단계에서 유전체 변이 분석, 메틸레이션 분석, 유전체 절단면 특성 분석 및 유전체 절단면 메틸레이션 분석으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 둘 이상의 분석이 동시에 수행되는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 제3 단계는 상기 어댑터가 부착된 상기 시료의 염기서열을 읽는 단계; 염기서열 데이터를 가공하여 알고리즘으로 분석하는 단계를 더 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
제1항에 있어서,
타깃 선별(Target Enrichment) 단계를 더 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 단계에서 상기 DNA 시료의 절단면의 정보가 보존되는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 DNA 시료는 무세포 DNA를 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 방법.
준비된 DNA 시료에 대하여 바이설파이트 처리 및 열처리를 수행하여 ssDNA(single-stranded DNA) 시료를 준비하는 전처리부;
상기 ssDNA 시료에 대하여 어댑터를 부착(ligation)하는 라이브러리 제작부; 및
어댑터가 부착된 시료에 대하여 유전체 분석을 수행하는 분석부를 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템.
제7항에 있어서,
상기 DNA 시료는 무세포 DNA를 포함하는, 유전체와 후성 유전체 동시 분석 시스템.