KR20230168942A - 단백질 정량을 위한 질량분석 피크의 자동 선별 방법 - Google Patents

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KR20230168942A
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Abstract

본 발명은 기존에 연구진의 수동 개입이 필수적이어서 많은 시간과 자원이 낭비되던 타겟 단백질체학에서의 피크 선택에 있어서 인간과 전문가와 동등한 정확도를 가지면서도 처리속도가 월등하게 빠른 자동화된 피크 선별 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 학습모델 또는 이를 실행할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 프로그램의 GUI를 통하여 사용자가 원하는 대로 입력한 복수개의 타겟 펩타이드의 정량화를 위해 최적화된 피크를 신속하고 정확하게 선별하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단백질 정량을 위한 질량분석 피크의 자동 선별 방법{A method for automatic selection for peak of mass spectrometry}
본 발명은 인간 전문가 수준의 정확도를 가짐으로써 수동 피크 선택의 시간적, 자원적 부담을 크게 경감할 수 있게 설계된 객체 감지용 딥러닝 알고리즘을 기반으로 하는 표적 단백질체학 데이터 해석 모델에 관한 것이다.
심층 신경망(Deep Neural Network) 기술은 발견 단백질체학(Discovery Proteomics)에서 획기적인 발전을 이루는데 기여를 하였으나, 이에 반해 특정 타겟 단백질을 탐지하는 분야인 타겟 단백질체학(Targeted Proteomics)에서는 채택이 더뎠다. 한편, 임상 단백질체학 연구실에서는 다중 반응 모니터링(MRM) 또는 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험을 기반으로 하는 표적 단백질체학 기술이 높은 민감도 및 재현도를 가져서 널리 사용되고 있다.
피크 선택(Peak Picking)은 질량분석 기반 단백질체학에서 초기 핵심 단계이며, 데이터 분석에 있어서 중요한 단계이다. 이러한 피크 선택은 스무딩(Smoothing), 베이스라인 보정(Baseline Correction) 및 피크 정렬(Peak Alignment)등으로 이루어지며, 통계분석 및 생물학적 해석을 가능케 하는 데이터의 전처리 과정에 해당하는데, 구체적으로 질량분석 결과 데이터의 전처리는 많은 양의 원시 스펙트럼 데이터(일반적으로 >30K 데이터 포인트)의 양을 경감하여 통계적으로 유효하게 다룰 수 있는 피크의 세트로 만드는 과정을 의미한다. 질량분석 데이터는 샘플에 기질 물질의 간섭과 같은 다양한 자연적 화합물의 존재, 분석 설정에 따라 달라지는 샘플의 오염 또는 전기적 노이즈 등의 원인에 의하여 필연적으로 노이즈를 동반하게 되므로, 정확한 분석을 위하여 피크 선택은 필수적이다.
그러나, MRM 또는 PRM 데이터를 해석하기 위하여 연구원들은 수동으로 피크를 선택해야 하고, 간섭을 식별해야 하며, 피크의 면적 조정에 상당한 시간을 할애해야 한다. 이러한 수동 검사의 부담은 임상에의 적용에 있어서 표적 단백질체학의 재현성 및 확장성을 제한하는 주요 요인으로 꼽힌다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 피크 선택 알고리즘의 개발, 품질 관리 방법(Quality Control Methods) 등의 여러 방법이 개발되었으나, 이러한 방법들도 여전히 높은 수준의 수동적인 개입이 필요하여, 대규모 단백질체학 데이터에 적용하는데 있어서 수동 검사가 난점으로 작용하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 표적 단백질체학의 데이터 해석에 있어서 인간의 수동적인 외부 개입을 최대한 배제하고 자동적으로 해석이 수행될 수 있는 방법을 개발하고자, 심층 신경망 기술을 활용한 딥러닝 모델을 제작하고자 연구를 하였으며, 개발된 모델을 통하여 데이터 해석에서 소요되는 시간과 자원을 획기적으로 줄이는 동시에, 높은 정확도로 피크를 선택할 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 대한민국특허공개공보 제10-2020-0143462호
본 발명자들은 타겟 단백질체학에서 신속하고 효율적인 검사의 걸림돌로 작용하던 크로마토그래피 피크의 수동 선택에 있어서, 인간 전문가의 개입 필요성을 배제하고, 높은 정확도로 신속하게 타겟 펩타이드의 정량에 최적화된 피크를 선별하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다.
그 결과, 본 발명자가 개발한 고유의 신경망 구조를 가지는 딥러닝 학습모델과 함께 데이터의 전처리와 후처리 과정을 포함하는 시스템을 이용하여 전이 크로마토그래피를 해석하는 경우, 인간 전문가만큼 정확하게 타겟 펩타이드의 정량에 최적화된 피크를 선별할 수 있는 동시에, 인간 전문가가 처리하는데 600시간이 넘게 소요되는 작업을 232초만에 해결할 수 있어 처리속도를 획기적으로 높일 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 피크를 선별하는 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 피크 선별 시스템을 실행하여 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 피크를 선별할 수 있는 컴퓨터 판독가능 기록 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 액체 크로마토그래피 질량분석(Liquid Chromatography Mass Spectrometry, LC-MS)에서 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크(Peak) 선별용 시스템을 제공한다:
입력된 학습용 데이터를 가공하는 전처리부;
상기 전처리부에서 가공된 학습용 데이터를 입력값으로 이용하여 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 피크의 경계를 감지하는 방법을 학습하는 합성곱 신경망(Convolutional Neural Network, CNN) 학습모델을 포함하는 학습부;
상기 학습부의 출력값을 가공하는 후처리부; 및
상기 후처리부의 출력값을 이용하여 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크를 선별하는 판단부.
본 명세서에서 용어 ‘액체 크로마토그래피 질량분석’이란, LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)라고도 불리며, 액체 크로마토그래피(또는 HPLC)의 물리적인 분리 기능과 질량 분석(MS)의 질량 분석 기능을 결합한 분석 화학 기술을 의미한다. 크로마토그래피와 질량분석 기술은 결합에 의하여 개별 기능이 상승적으로 향상되어 화학 분석에서 널리 사용되며, 액체 크로마토그래피는 여러 성분이 포함된 혼합물을 분리하는 반면, 질량 분석은 분리된 각 성분을 식별할 수 있는 스펙트럼 정보를 제공한다.
본 명세서에서 용어‘피크 선별’이란, LC-MS 수행 결과 도출된 데이터에서 시각적으로 확인 가능한 피크들 중 목적 펩타이드의 정량에 최적화된 피크를 선택하는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘합성곱 신경망’이란, CNN(Convolutional Neural Network)이라고도 불리며, 인간의 시신경을 모방하여 만든 딥러닝 구조로서 합성곱(Convolution) 연산을 이용하여 이미지의 공간적인 정보를 유지하는 인공신경망(ANN)의 일종이다. 합성곱 신경망은 시각적 이미지 분석에 가장 일반적으로 사용된다.
본 명세서에서 용어 ‘타겟 펩타이드’란, 본 발명에서 사용되는 질량분석 방법을 통하여 검출 및/또는 정량하고자 하는 펩타이드를 의미하며, ‘타겟 펩타이드’는 복수 종류의 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 질량분석은 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM), 병렬 반응 모니터링 (Parallel Reaction Monitoring, PRM), 데이터 의존성 분석법(Data-Dependent Acquisition, DDA) 및 데이터 비의존성 분석법(Data-Independent Acquisition, DIA)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행된다.
본 명세서에서 용어 ‘MRM’이란, 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring)을 의미하며, 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술을 지칭한다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석 방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩티드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다(Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
본 명세서에서 용어 ‘PRM’란, 병렬 반응 모니터링을 의미하며, MRM을 병렬적으로 적용한 것으로써, 한 번에 한 쌍의 어미이온/딸이온을 분석하는 MRM과 달리, 선택된 하나의 어미이온에서 생성되는 모든 딸이온을 동시에 분석하는 방법이다.
본 명세서에서 용어 ‘DIA’란, 데이터 비의존성 획득 분석법(Data-Independent Acquisition)을 의미하며, 이는 특정 어미이온을 선택하는 과정 없이 선택한 범위의 m/z값에 속하는 모든 이온을 분석하는 방법이다.
본 명세서에서 용어 ‘DDA’란, 데이터 의존성 획득 분석법(Data-Dependent Acquisition)을 의미하며, DIA와 달리 특정 어미이온을 선택하여 선택한 어미이온에 대한 딸이온만을 분석하는 방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 학습용 데이터는 정량화를 위한 피크(Peak)가 이미 선택되어 있는 액체 크로마토그래피 질량분석의 결과 값이다.
본 명세서에서‘미리 결정된’은, MRM 데이터 중 학습모델의 학습을 위한 입력값으로 사용하기 위하여 수동으로 최적 피크를 미리 선별하는 과정을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 질량분석의 결과값은 정량하고자 하는 타겟 펩타이드에 대한 라이트 펩타이드의 전이값(Transition) 및 헤비 펩타이드의 전이값(Transition)을 포함한다.
본 명세서에서 용어 ‘전이값(Transition)’이란, 어미이온의 m/z값과, 이에 상응하는 딸이온의 m/z값의 쌍을 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘헤비 펩타이드’란, 동위원소 등으로 표시한 합성 펩타이드를 의미하며, SIL(synthetic isotopically labeled) 펩타이드라고도 지칭될 수 있다. 헤비 펩타이드는 비-방사능의 안정한 동위원소가 결합되어 있으며, 안정한 동위원소는 일반적으로 13C (carbon-13), 15N(nitrogen-15)또는 2H (중수소) 등이 사용되나, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로 헤비 펩타이드는 분석 대상이 되는 ‘라이트 펩타이드’와 동등한 생리화학적 특징 및 화학적 반응성을 가지며, 동위원소에 의한 질량 차이로 인하여 ‘라이트 펩타이드’와 다르게 행동한다. 이러한 헤비 펩타이드는 분석 대상인 ‘라이트 펩타이드’의 절대적인 양을 정량하기 위하여 사용된다. 본 명세서에서 용어 ‘라이트 펩타이드’는 ‘헤비 펩타이드’와 반대로 동위원소로 라벨링되지 않은 펩타이드를 의미하며, 일반적으로 정량분석의 대상이 되는 목적 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전처리부는 입력된 학습용 데이터를, 정량하고자 하는 타겟 펩타이드에 대한 라이트펩타이드 채널 및 헤비펩타이드 채널로 구성된 2개의 채널을 가지는 히트맵으로 변환한다.
본 발명에서 용어 ‘히트맵’은 전처리부에 의하여 처리되어 생성되는 합성곱 신경망에 대한 입력 데이터를 의미한다. 일반적으로 합성곱 신경망에 대한 입력 이미지 데이터는 RGB의 3개의 채널, 즉, 3개의 2차원 어레이(array) 데이터로 구성되지만, 본 발명의 합성곱 신경망에 대한 입력 데이터는 2개의 2차원 어레이 데이터로 구성되어 있으며, 각각의 어레이는 라이트 및 헤비 펩타이드의 전이 크로마토그램 데이터를 포함하고 있다. ‘히트맵’은 질량분석 데이터에서 추출된 전이 크로마토그램 데이터와 전이 리스트(transition list)로부터 가공 또는 변형되어 생성된다. 본 발명에서 용어 ‘전이 리스트’는 본 발명에서 정량의 대상이 되는 각 타겟 펩타이드에서, 어떤 전이(transition)를 타겟팅하는지에 대한 정보를 포함하는 데이터로서, 어미이온(precursor ion)과 딸이온(product ion) 쌍(pair)의 m/z값에 대한 내용을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 히트맵은 한축을 머무름 시간(Retention Time)으로 하고, 다른 한축을 복수의 전이값(Multiple Transition)으로 한다.
본 발명에서 용어 ‘머무름 시간(Retention Time)’이란, 가스 또는 액체 크로마토그래피 분석에서 시료를 주입하고 나서 유출할 때까지 걸리는 시간을 의미하며, 머무름 시간은 칼럼의 종류, 칼럼 온도, 이동상의 종류와 흐름 속도 등의 조건이 일정하면 일반적으로 물질에 따라 고유한 값을 가지므로 물질을 동정하는 지표로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 전처리부는 학습용 데이터를 가공하기 전 단계에서, 학습용 데이터에 대하여 데이터 증강(Data Augmentation)을 수행한다.
본 명세서에서 용어 ‘데이터 증강(Data Augmentation)’이란 이미지의 회전과 같은 무작위 변환을 적용하여 훈련 세트의 다양성을 증가시키는 과정으로서, 일반적으로 데이터세트의 양이 충분하지 않을 때 소량의 데이터를 활용하여 데이터의 양을 증폭하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘훈련 세트’는 학습모델의 알고리즘을 훈련하는데 사용되는 데이터로서 학습(반복적으로 가중치를 수정하는 행위)에 사용되는 데이터인 반면, ‘테스트 세트’는 훈련된 학습모델의 성능을 평가하는데 사용되는 데이터를 의미한다. 일반적으로, 이미지 데이터에 대한 증강방법에는 이미지의 특정 부분을 자른 후 크기를 조정하는 ‘자르기 및 무작위 크기 조정’, 색상 등의 데이터를 무작위적으로 변경하는 ‘지터링’, 이미지를 회전시키거나 반전시키는 ‘로테이션’또는 ‘플립’ 및 밝기를 바꾸는 등의 다양한 방법이 존재한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 데이터 증강은, 무작위 크기 조정(Random Resizing); 자르기(Cropping); 강도 지터링(Intensity Jittering), 머무름 시간 변환(Retention Time Shifting) 및 전이값 리스케일(Transition Rescaling)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 용어 ‘무작위 크기 조정(Random Resizing)’이란, 전이 크로마토그램을 시간 축을 기준으로 그 크기를 줄이거나 늘려서 다양한 스케일의 피크 형태를 만드는 데이터 증강 방법을 의미한다.
본 발명에서 용어 ‘자르기(Cropping)’은 전이 크로마토그램의 시작과 끝 부분을 잘라내어, 시간축에서 피크 위치를 다양하게 변형하는 데이터 증강 방법을 의미한다.
본 발명에서 용어 ‘강도 지터링(Intensity Jittering)’은 의도적으로 노이즈를 추가하는 방식의 데이터 증강 방법을 의미한다.
본 발명에서 용어 ‘머무름 시간 변화’는 ‘자르기(Cropping)’과 반대로 전이 크로마토그램의 전후로 블랭크 시그널(Blank Signal)을 더 붙여서 피크 위치를 다양하게 변형하는 데이터 증강 방법을 의미한다.
본 발명에서 용어 ‘전이값 리스케일링(Transition Rescaling)’은 강도(intensity)축 방향으로 특정 전이 쌍(transition pair)의 시그널을 조정하는 데이터 증강 방법을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 학습모델은 백본 네트워크(Backbone Network) 및 복수개의 하위 네트워크(Sub-networks)를 포함하고, 상기 백본 네트워크는 변형된(Modified) ResNet34이며, 상기 하위 네트워크는 피크 그룹의 정량화 가능성(Quantifiability)를 분류하는 하위 네트워크 및 피크 경계 회귀(Peak Boundary Regression)를 수행하는 하위네트워크를 포함한다.
본 명세서에서 용어 ‘백본 네트워크(Backbone Network)’란, 합성곱 신경망을 구성하는 네트워크 중 하나로서, 이미지를 입력으로 사용하여 나머지 네트워크의 기반이 되는 기능 맵(feature map)을 추출하는 네트워크를 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘하위 네트워크(Sub-networks)’는 백본 네트워크의 출력값을 입력값으로 하여 객체 분류 등의 작업을 수행하는 네트워크를 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘ResNet’은 인공신경망의 일종으로, 신경망이 깊어질수록 발생하는 기울기 손실 문제 및 기울기 폭발 문제를 ‘잔차 학습(residual learning)’기법을 사용하여 해결한 신경망이다. 본 명세서에서 용어 “ResNet34”는 ResNet의 일종으로, 이미지 분류에 사용될 수 있는 합성곱 신경망 네트워크이며, 34개의 레이어를 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 변형된(Modified) ResNet34는, 제 0 내지 5의 레이어를 포함하고,
상기 제 0 레이어는 커널 사이즈가 1 x 7이고, 채널수가 32이며, 스트라이드가 1x1이고;
상기 제 1 레이어는 커널 사이즈가 3x7이고, 채널수가 64이며, 스트라이드가 1x1이며;
상기 제 0 레이어는 및 제 1 레이어는 헤비 펩타이드 채널 및 라이트 펩타이드 채널이 별도로 합성되도록 2개의 그룹으로 이루어져 있고;
상기 제 2 레이어는 커널 사이즈가 1x3이고 스트라이드가 1x2인 최대 풀링(max pooling)층, 적응 평균 풀링층, 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1x3이고 채널수가 128인 2개의 합성곱층으로 구성되고;
상기 제 3 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1x3이고 채널수가 128인 2개의 합성곱층으로 구성되며;
상기 제 4 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1x3이고 채널수가 256인 2개의 합성곱층으로 구성되고;
상기 제 5 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1x3이고 채널수가 512인 2개의 합성곱층으로 구성된다.
본 명세서에서 용어 ‘잔차블록(Residual Block)’은 ResNet을 이루는 블록 단위로, 다음 레이어로 파라미터(parameter)를 전달하기 전에 입력값(input)을 더해주는 방식의 구조를 가지는 블록을 의미한다.
본 명세서에서 용어 ‘채널’은 합성곱 레이어에 유입되는 입력 데이터에 적용되는 필터의 개수를 의미한다. 예를 들어, 컬러 이미지는 RGB로 구성된 3개의 실수로 표현된 3차원 데이터로, 이 경우 3개의 채널을 가지게 된다.
본 명세서에서 용어 ‘커널(kernel)’은 필터(filter)라고 불리기도 하는 가중치의 집합을 지칭하며, 가중치 파라미터(W)를 통하여 입력데이터로부터 합성곱 연산을 통하여 필터와 유사한 이미지의 영역을 강조하는 특성맵(feature map)을 추출하여 다음 레이어로 전달하는 역할을 수행하는 수용영역(receptive field)를 의미한다. 이에, 용어‘커널 사이즈’는 커널의 크기를 의미한다.
본 명세서에서 용어‘풀링층’은 합성곱 신경망에서 흔히 사용되는 유형의 레이어로서, 합성곱 연산에서 계산한 각 특징 맵을 다운샘플링(downsampling)하는 레이어를 의미한다. 예를 들어, 가장 흔히 사용되는 풀링 크기가 2인 최대 풀링을 예로 들면, 특징 맵을 2 x 2 크기로 나눈 후, 각 영역을 이루는 픽셀값의 최댓값(평균 풀링의 경우 평균값)을 픽셀값으로 하는 새로운 이미지로 변환하는 것으로서, 이를 통하여 합성곱 신경망의 계산값을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 ‘스트라이드’는 풀링층 외에 합성곱 신경망의 계산량을 감소시킬 수 있는 방법을 의미한다. 구체적으로, 스트라이드는 입력 이미지 위에서 필터(커널)이 움직이는 간격을 의미한다. 예를 들어, 스트라이드가 1인 합성곱 연산은 필터가 입력의 요소를 1개씩 이동하며 합성곱 연산을 수행하는 반면, 스트라이드가 2인 경우 입력의 요소를 2개씩 이동하며 합성곱 연산을 수행한다. 풀링의 경우 다음 레이어로 전달되는 이미지의 해상도가 절반으로 크게 감소하여 데이터의 손실이 크다는 단점이 있으나, 스트라이드의 경우 계산량을 줄이면서도 입력의 모든 요소가 출력에 영향을 미치기 때문에 풀링과 달리 정보손실이 발생하지 않는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 하위 네트워크는 커널사이즈가 1 x 3이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 후처리부는 상기 선별된 피크의 경계 내의 헤비 펩타이드 피크 모양 및 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하여 유사도가 가장 높은 헤비 펩타이드 전이쌍(Transition pair)와 라이트 펩타이드의 전이쌍을 선택한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 후처리부에서 헤비 펩타이드 피크 모양 및 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하기 전, 헤비 펩타이드 피크 모양의 평균 프로파일(mean profile)과 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하여 라이트 펩타이드의 전이쌍을 선택하는 과정을 추가적으로 포함한다.
본 발명에서 용어 “평균 프로파일(mean profile)”은, 헤비 펩타이드 피크의 평균적인 피크 모양(peak shape)를 의미한다. 헤비 펩타이드는 항상 고정된 양이 생물학적 시료에 포함되므로, 샘플 간에 큰 차이없이 균일하고 깨끗한 시그널의 형태로 관찰되며, 해당 헤비 펩타이드 피크들의 평균적인 피크 모양을 도출하여 이를 “대표적인 피크 모양(representative peak shape)”로 간주한다. 해당 헤비 펩타이드의 평균 프로파일과 라이트 펩타이드들의 피크 모양을 1차적으로 비교함으로써, 이상치(outlier)에 해당하는 라이트 펩타이드 피크를 선제적으로 제거함으로써, 헤비 펩타이드와 유사도가 가장 높은 라이트 펩타이드 피크를 더욱 효율적으로 선택할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유사도는 내적 유사도(Dot-product Similarity)를 이용하여 계산한다.
본 명세서에서 용어 ‘내적 유사도(Dot-product Similarity)’란 두 벡터의 내적(dot-product)를 이용하여 두 벡터의 유사한 정도를 확인할 수 있는 공식을 의미한다. 구체적으로, 두 벡터의 크기와는 상관없이, 방향의 유사성만을 확인할 수 있으며, 두 벡터의 방향이 같아서(θ=0) cosθ값이 1인 경우 가장 유사도가 높게 되며, 두 벡터의 방향이 정반대(θ=π)여서 cosθ 값이 -1 일 때 유사도가 가장 낮게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 피크(Peak) 선별용 시스템을 이용하여, 정량화를 위한 피크가 선택되지 않은 액체 크로마토그래피 질량분석 데이터에서 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크(Peak)를 선별하는 방법을 제공한다. 상기 시스템은 예를 들어 피크 선별을 위한 학습이 완료된 시스템일 수 있다.
본 명세서에서‘학습이 완료된’의 의미는, 입력값을 이용하여 반복학습(이 때, 전체 트레이닝 데이터 세트가 1회 신경망을 통과한 것을 1에포크이며, 반복학습이란 n회의 에포크를 거친 것을 의미함)한 결과, 학습모델이 원하는 수준의 예측 정확도를 가진 상태에 이른 것을 의미한다. 구체적으로, 30 에포크 이상 개선이 없는 경우 학습이 완료된 것으로 볼 수 있으나, 이에 국한되지 않고 다양한 에포크 수를 기준으로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하드웨어와 결합되어 제 1 항의 시스템을 실행하여 복수개의 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 복수개의 피크를 동시에 선별할 수 있는 컴퓨터 판독가능 기록 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
실시예에 따른 방법은 다양한 컴퓨터 수단을 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령 형태로 구현되어 컴퓨터 판독 가능 매체에 기록될 수 있다. 상기 컴퓨터 판독 가능 매체는 프로그램 명령, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 상기 매체에 기록되는 프로그램 명령은 실시예를 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다. 컴퓨터 판독가능 기록 매체의 예에는 하드 디스크, 플로피 디스크 및 자기 테이프와 같은 자기 매체(magnetic media), CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체(optical media), 플롭티컬 디스크(floptical disk)와 같은 자기-광 매체(magneto-optical media), 및 롬(ROM), 램(RAM), 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령을 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다. 프로그램 명령의 예에는 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드를 포함한다. 상기된 하드웨어 장치는 실시예의 동작을 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 GUI(graphic user interface)에 대한 사용자의 입력에 의해 선택된 타겟 펩타이드에 대하여, 해당 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크를 선별한다.
본 발명에서 용어 ‘GUI’는 ‘그래픽 사용자 인터페이스’ 또는 간단히 ‘그래픽 인터페이스’라고도 지칭되며, 이는 마우스, 아이콘 및 윈도우를 이용하는 유저 인터페이스를 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 기존에 연구진의 수동 개입이 필수적이어서 많은 시간과 자원이 낭비되던 타겟 단백질체학에서의 피크 선택에 있어서 인간과 전문가와 동등한 정확도를 가지면서도 처리속도가 월등하게 빠른 자동화된 피크 선별 시스템을 제공한다.
(b) 본 발명의 학습모델 또는 이를 실행할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 프로그램의 GUI를 통하여 사용자가 원하는 대로 입력한 복수개의 타겟 펩타이드의 정량화를 위해 최적화된 피크를 신속하고 정확하게 선별하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 표적 펩타이드의 피크를 검출하기 위한 본 발명의 학습모델인 DeepMRM의 워크플로우를 도시한 그림으로서, DeepMRM은 전이 목록(Transition List)과 MRM/PRM 데이터가 입력으로 주어지면 헤비 펩타이드와 라이트 펩타이드의 전이 크로마토그램이 2채널 히트맵 이미지로 모델에 제공되며, 백본 네트워크에 의하여 추출된 다중 스케일 1D 특징 맵은 두 개의 하위 네트워크에 의하여 처리된다. 두 개의 하위 네트워크는, 후보 피크의 정량화 여부를 결정하는 분류기(Classifier) 및 후보 피크의 경계를 감지하는 회귀자(Regressor)이다.
도 2는 DeepMRM 데스크탑 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 도시한 그림이다.
도 3은 벤치마크 데이터 세트에 대한 평균 정밀도(AP) 및 평균 재현율(AR) 점수를 도시한 막대그래프이다.
도 4는 수동으로 주석을 추가한(manually annotated) 피크와 DeepMRM에서 감지한 피크에 의해 계산된 헤비/라이트 비율의 결과를 비교하는 산점도(Scatter Plot)이다.
도 5는 데이터 증강(Data Augmentation)의 방식을 도시한 그림이다. 도 5a는 원본 전이 크로마토그램이다. 도 5b는 무작위 크기 조정(Random Resizing) 및 자르기(Cropping)을 적용한 전이 크로마토그램이다. 도 5c는 무작위 머무름 시간 변환(Retention Time Shifting)을 적용한 전이 크로마토그램이다. 도 5d는 전이값 리스케일(Transition Rescaling)을 적용한 전이 크로마토그램이다. 도 5e는 강도 지터링(Intensity Jittering)을 적용한 전이 크로마토그램이다. 수동 피크 경계는 점선으로 표시하였다.
도 6은 Skyline 소프트웨어의 결과에 품질 관리 방법인 mProphet 알고리즘을 적용한 경우와 하지 않은 경우의 정량화 성능을 DeepMRM과 비교한 그림이다. a 내지 c는 잡음이 있는 데이터(noisy dataset)의 헤비 펩타이드의 풍부도에 대한 상대적 정량화 및 분포를 도시한 그림이며, d 내지 f는 복잡한 배경 데이터 세트(complex background dataset)의 헤비 펩타이드의 풍부도에 대한 상대적 정량화 및 분포를 도시한 그림이다. 복잡한 배경 데이터 세트에 대한 실험에서 mProphet은 어떠한 결과도 필터링하지 않기 때문에 Skyline 디폴트와 Skyline FDR 5% 사이에 차이가 존재하지 않는다. 빨간색 점선은 헤비 펩타이드의 풍부도를 나타내며, 박스 플롯에서 중심선, 가장자리 및 수염(whiskers)은 각각 중앙값, 1사분위수 및 3사분위수 및 1.5x 사분위수 범위를 나타낸다. 수염 외부의 이상치(outlier points)는 점 기호로 표시하였다.
도 7은 2개의 희석 시리즈 데이터세트에 대한 절대 백분율 오차의 분포를 도시한 그림이다. a 내지 c는 잡음이 있는 데이터 세트의 절대 백분율 오차의 분포를 도시한 것이고, d 내지 f는 복잡한 배경 데이터 세트의 절대 백분율 오차의 분포를 도시한 그림이다. 복잡한 배경 데이터 세트에 대한 실험에서 mProphet은 어떠한 결과도 필터링하지 않기 때문에 Skyline 디폴트와 Skyline FDR 5% 사이에 차이가 존재하지 않는다. 박스 플롯에서 중심선, 가장자리 및 수염(whiskers)은 각각 중앙값, 1사분위수 및 3사분위수 및 1.5x 사분위수 범위를 나타낸다. 수염 외부의 이상치(outlier points)는 점 기호로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법 및 분석방법
데이터 세트
- 데이터세트(Datasets)의 수집
훈련 및 평가를 위해 4개의 LC-MRM/PRM/DIA-MS 실험 데이터 세트를 얻었다. 하나의 데이터 세트는 인-하우스 샘플을 사용하여 생성하였고, 다른 세 개의 데이터 세트는 공개 저장소(Public Repository)에서 다운로드하였다. 내부 데이터세트만 훈련용으로 사용하였고 외부 데이터세트는 평가용으로만 사용하였다(표 1).
- 췌관 선암종 데이터세트(PDAC-MRM)
66개의 췌관 선암종 환자 조직 샘플을 수정된 필터 관련 샘플 준비(Filter-Associated Sample Preparation, FASP) 방법으로 동결 분쇄(cryopulverized), 용해 및 트립신 분해하였다1. Pierce BCA 분석 키트(Thermo Scientific)는 단백질 및 펩티드 정량화에 대한 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 안정 동위원소 표지(Stable Isotope Labeled, SIL) 펩타이드의 경우, 153개의 펩타이드 각각은 C-말단의 라이신 또는 아르기닌에 13C6라이신 또는 13C6아르기닌 유사체로 표지된 안정 동위원소였으며, 상응하는 내인성 펩타이드 서열의 질량과 비교하여 6.02013 Da의 질량 차이를 가졌으며, SIL 펩타이드의 순도는 95% 이상이었다. 정제된 SIL 펩티드는 절대 정량을 위해 AAA-MS 방법2으로 분석된 아미노산을 사용하였다. MRM 조건은 펩타이드 양(Peptide Amount), CS+2 및 CS+3 전구체 이온에 대한 충돌 에너지, 153개의 표적 펩타이드의 머무름 시간에 대하여 최적화시켰다. 펩타이드가 CS+2 및 CS+3 전구체 이온에 대해 유사한 강도를 가졌다면, 두 전이(Transition) 모두 표적 목록에 포함시켰지만, 이후에 더 높은 강도와 더 적은 간섭을 갖는 하나의 전구체만을 선택하여 정량화하였다. LC-MRM-MS 실험에는 Agilent 6495C 삼중 사중 질량 분석기 플랫폼과 결합된 자체 제작 이중 온라인 나노-플로우 LC 시스템3(Ultimate 3000 NCP-3200RS, Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다. PDAC 조직 펩타이드의 주입량은 5㎍이었다. 동적 MRM은 y1 및 y2 이온을 제외한 153개 타겟의 3가지 최상의 y-이온 전이에 대하여, 시간 창(time window)을 3-5분으로 하여 수행하였다. 2500V의 스프레이 전압, 5L min-1의 건조 가스 흐름, 225°C의 가스 온도를 사용하였다. Q1 및 Q3 분해능은 모두 단위로 설정되었고 충돌 에너지는 이전에 최적화된 값에 따라 10-40으로 설정되었으며 800ms의 주기 시간을 사용하였다. Q1 및 Q3 분해능은 모두 단위(Unit)로 설정하였고 충돌 에너지는 이전에 최적화된 값에 따라 10-40으로 설정하였으며 800ms의 주기 시간(Cycle Time)을 사용하였다. 컬럼은 Jupiter C18, 3μm, 300Å 입자를 75μm x 50cm(Phenomenex)로 사용하여 인-하우스에서 제조하였고, 컬럼 온도는 60℃로 유지하였다. 60분 구배(47분에 걸쳐 10% - 40% 용매 B; 5분에 걸쳐 40% - 80%; 6분 동안 80% 및 2분 동안 10%; 400nL min-1)를 각 실험에 사용하였다. 용매 A는 물 중 0.1% 포름산이었고 용매 B는 아세토니트릴(ACN) 중 0.1% FA였다. 생성된 198개의 LC-MRM-MS 데이터는 Skyline 버전 21.1.0.1464로 분석하였고, 헤비 펩타이드(Heavy Peptide)와 라이트 펩타이드(Light Peptide) 간의 동일한 머무름 시간, 피크 모양, 전이 전반에 걸친 강도 비율 일관성(intensity ratio consistency across transitions) 및 피크 간섭에 따른 전이의 제거(removal of transitions with peak interference)와 같은 평가 기준을 통하여 전이를 수동으로 검사하였다. 정량 가능한 펩타이드의 경우 피크 면적을 기준으로 헤비/라이트 펩타이드의 비율을 결정하였다. 총 30,294개의 전이 그룹 레코드에 주석을 달았고 그 중 19,230개의 레코드를 정량화할 수 있었다.
- 외부 데이터 세트(EOC-MRM 및 P100-PRM)
3개의 외부 데이터 세트는 MassIVE 저장소(MassIVE repository)에서 얻었다. 첫 번째 데이터 세트는 상피성 난소암(EOC-MRM) 샘플5에 대한 바이오마커의 MRM 데이터를 사용하였다(MassIVE 식별자: MSV000084048). 두 번째 데이터 세트는 LINCS(Library of Integrated Network-based Cellular Signatures) 프로젝트6(MassIVE 식별자: MSV000079524)를 위해 생성된 ~100개의 포스포펩티드(P100-PRM) 샘플의 PRM 검증 데이터 세트를 사용하였다. 세 번째 데이터 세트로는 Avan-Garde(AvG) 툴의 전문가 수동 큐레이션7(MassIVE 식별자: MSV000085540)의 정확도를 평가하는 데 사용된 데이터 세트와 동일한 인산화 단백질체(Phosphoproteomics) 샘플(P100-DIA)의 DIA 데이터를 사용하였다. 본 발명의 벤치마크 테스트에서 발명자들은 AvG 공개 큐레이션 데이터 세트(AvG open curation dataset)로 본 발명(DeepMRM)을 평가하였다. 이 모든 데이터 세트에 대해 Skyline 파일은 정량화 분석 중에 생성하였다. P100-PRM 데이터 세트의 경우 정량 결과를 필터링하고 인-하우스 다운스트림 분석 프로토콜6에 의해 정규화하였다. 필터링된 정량화 결과를 사용할 수 없었기 때문에 Skyline의 “dotp” 점수 0.7을 사용하여 신뢰할 수 없는 측정값을 필터링하였다. 해당 필터링을 통하여 13,629개의 피크 그룹 중 2,117개를 제외하였다. 제외된 피크 그룹에 대한 수동 검사를 통해, 제외된 피크의 대부분이 헤비 펩타이드 또는 라이트 펩타이드 신호를 갖지 않는다는 것을 발견할 수 있었다.
훈련 및 벤치마크 테스트를 위한 MRM/PRM 데이터 세트.
데이터 세트 기구 샘플 #LC/MS 실행 #타겟
펩타이드 		#펩타이드당 전이 #주석이 달린 피크그룹
PDAC-MRM 6495C triple quadruple (Agilent) Pancreatic Ductal Adenocarcinoma tissue 198 153 3 30,294
EOC-MRM 4000QTRAP and 5500QTRAP (Sciex)
TSQVantage(ThermoFisherScientific)		 Blood plasma 463 78 2-5 20,729
P100-PRM Q-Exactive
(Thermo Fisher Scientific)		 MCF7, PC3, and HL60 144 95 3-17 13,629
P100-PRM Q-Exactive HF Plus
(ThermoFisherScientific)		 MCF7, PC3, and HL60 96 95 3-25 9,025
Dilution series TSQ Quantum Ultra EMR
(ThermoFisherScientific)		 Kc167 275 43 4-9 N/A
PDAC-MRM 데이터 세트는 8:1:1의 비율로 훈련, 검증 및 테스트 세트로 분할하였으며, 세 가지 외부 데이터 세트인 EOC-MRM, P100-PRM 및 P100-DIA 데이터 세트는 평가용으로만 사용하였다.
피크 검출 모델
- 데이터 전처리
LC-MS 데이터와 타겟 목록(Target List)을 포함하는 입력 데이터가 주어지면 본 발명의 피크 검출 모델인 DeepMRM은 먼저 타겟 전구체 이온에 대한 전이 크로마토그램(Transition Chromatograms)을 추출한 다음, 이를 라이트 펩타이드에 대한 채널과 헤비 펩타이드에 대한 채널로 이루어진 2채널-히트맵 이미지로 변환하였다. 표적 펩타이드에 대해 획득한 전체 전이 크로마토그램은 표적 펩타이드에 대해 시간 창(Time Window)과 함께 참조 머무름 시간(Reference Retention Time)이 지정되지 않는 한 추출하였다. 선형 보간(Linear Interpolation)을 모든 전이 크로마토그램에 적용하여 모두 동일한 길이와 0.7초의 동일한 스캔 간격을 갖도록 하였다. 히트맵 이미지의 크기는 [2, 전이 수, 크로마토그램 길이]에 해당한다. 마지막 전처리 단계로서, 각 전이 쌍(Transition Pair)을 0-1 범위로 조정하였다.
- 모델 구조(Model architecture)
피크 감지 모델의 구조는 객체 감지8을 위한 신경망 모델인 RetinaNet을 기반으로 하여 구축하였다. 네트워크는 특징(Feature) 추출을 위한 백본 네트워크(Backbone Network)와 두 개의 작은 하위 네트워크(sub-networks)로 구성된다. 첫 번째 하위 네트워크는 추출된 특징에서 피크 그룹의 정량화 가능성(Quantifiability)을 분류하고, 두 번째 하위 네트워크는 피크 경계 회귀(Peak Boundary Regression)를 수행한다. 본 발명자들은 ResNet34를 백본 네트워크로 선택하고 피크 선택 문제에 적합하도록 수정하였다(표 2).
ResNet34을 변형한 본 발명의 학습모델 DeepMRM의 백본 네트워크의 구조
레이어 명칭 합성곱 레이어 특징맵
conv0 1x7, 32, 스트라이드 1x1, 2 그룹
conv1 3x7 64, 스트라이드 1x2, 2 그룹
conv2 1x3, 최대 풀링, 스트라이드 1x2 C1
적응 평균 풀링
conv3 C2
conv4 C3
conv5 C4
먼저, 백본에서 커널 크기가 1x7인 새로운 합성곱층(convolutional layer)(conv0)을 첫 번째 합성곱층(conv1) 위에 배치하였다. 배치 정규화(Batch Normalization) 및 이에 뒤따라 ReLU 함수를 conv0에 적용하였다. Conv1의 커널 크기(Kernel Size)를 7x7에서 3x7로 변경하였으며, 이에 상응하게 스트라이드(Stride) 및 패딩 크기(Padding Sizes)를 조정하였다. 처음 두 개의 합성곱층에서는 헤비 펩타이드 채널과 라이트 펩타이드 채널이 별도로 합성(convolve)되도록 그룹화된 합성곱(Grouped Convolutions)을 적용하였다. 첫 번째 잔차 블록(Residual Block) 앞에는 특징 맵(Feature Map)의 높이가 1이 되도록 적응 평균 풀링층(Adaptive Average Pooling Layer)이 삽입하였으며, 후속 잔차 블록에서 커널 및 패딩 크기는 각각 1x3 및 0x1로 조정하였다. 이에 따라 백본에서 출력되는 모든 특징 맵은 1차원 벡터로 생성되게 하였다. 두 개의 하위 네트워크도 커널 크기가 1x3이고 패딩 크기가 0x1인 합성곱층을 사용하였다. 회귀자(Regressor)의 경우, 경계 상자(Bounding Box)에 대하여 박스의 4개 포인트가 아닌, 피크 경계에 대해 2개 포인트만 예측하면 되므로 최종 출력 채널 크기는 앵커 수의 2배로 변경된다. 앵커는 각 특징 수준(Feature Level)에 대한 단일 척도(Single Scale)로 생성하였다. 분류기 하위 네트워크(Classifier Subnetwork)는 3가지 분류 문제로 설정하였다: 배경(Background), 불량 피크(Poor Peak), 정량가능 피크(Quantifiable Peak). 이 때, 불량 피크의 경우 피크 경계가 명확하지 않은 경우가 많았다. 이에, 불량 피크 경계에 대한 회귀 손실(Regression Loss)은 절반으로 줄였다.
- 모델 출력 후처리: 전이 선택(Transition Selection)
감지된 경계 내의 일부 전이 크로마토그램은 종종 간섭 또는 노이즈의 영향을 받으므로, 본 발명(DeepMRM)은 정확한 정량화를 위한 최적의 전이 쌍을 찾기 위하여 정량화 과정에서 이상치 전이(Outlier Transition)을 제거하기 위해 모델 출력값에 대하여 후처리를 수행하였다. 감지된 피크 경계에 대해, 먼저 헤비 피크(Heavy Peak) 모양의 평균 프로파일(Mean Profile)을 계산하였다. 그 후, 라이트 피크 모양과 평균 프로파일 간의 내적 유사도(Dot-product Similarity)를 계산하였다. 선택된 라이트 전이값(Light Transition)을 대응하는 헤비 전이 쌍(Heavy Transition Pairs)과 비교하였다. 최종적으로, 내적 유사도가 가장 높은 헤비 전이 쌍과 라이트 전이 쌍이 정량화를 위해 선택되었다.
- 데이터 증강(Data augmentation)
본 발명(DeepMRM)의 강건성(Robustness)과 적용 가능성을 향상시키기 위해 모델 훈련에 데이터 증강 전략을 채택하였다. 데이터 증강 방법으로 무작위 크기 조정(Random Resizing), 자르기(Cropping), 강도 지터링(Intensity Jittering), 머무름 시간 변환(Retention Time Shifting) 및 전이값 리스케일(Transition Rescaling)이 포함된다(도 5a 내지 5e). 머무름 시간 변환(Retention Time Shifting)은 라이트 전이 피크 및 헤비 전이 피크 정렬을 파괴하고, 전이값 리스케일(Transition Rescaling)은 전이 전체에 걸쳐 라이트/헤비 비율이 일관되지 않게 만드는 데 사용하였다. 데이터 증강 과정 동안 레이블 데이터(Label Data)도 그에 따라 변환하였다. 또한 모델을 입력 전환 순서에 따라 변하지 않게 만들기 위해, 훈련하는 동안 무작위로 섞이게 하였다(예: (y3, y5, y9) → (y9, y3, y5)). 상기 증강 방법들은 모두 히트맵 이미지가 생성되기 전에 적용하였다.
- 훈련(Training)
인-하우스 데이터 세트(PDAC-MRM)는 각각 8:1:1의 비율로, 훈련; 검증; 및 테스트 세트로 분할하였다. 본 발명의 모델은 기본 매개변수(lr=1.e-3, β1=0.9, β2=0.999)로 설정한 Adam 옵티마이저를 사용하여 훈련하였다. 훈련은 NVIDIA GeForce 3090 GPU를 이용하여 512 배치 크기(Batch Size)로 100 에포크(Epoch) 동안 수행하였다. 학습률은 10 에포크마다 0.5씩 감소하였다. 30 에포크 이상 동안 개선이 없는 경우 훈련을 중단하였다.
Skyline 소프트웨어와의 정량 효율 비교
- 정량 효율 비교 방법
먼저, 본 발명자들은 공개 MRM 데이터 세트의 2개의 시리즈 희석 데이터세트(Nasso, S., Goetze, S., and Martens, L., 2015)를 사용하여 본 발명의 피크 선택 시스템(DeepMRM)의 정량화 성능을 평가하고, 이를 Skyline 소프트웨어의 정량화 성능과 비교하였다. 해당 데이터 세트에서 헤비 펩타이드의 풍부도(abundances)는 0.1에서 100펨토몰까지 다양했지만, 라이트 펩타이드의 풍부도는 일정하게 유지되었다. 절대적인 정량화는 외부 감량선 방법(external calibration curve)으로 달성되었다. 본 발명자들은 피어슨 상관 계수(PCC)와 스피어만 순위 상관계수(SPC)를 사용하여 헤비 펩타이드의 알려진 풍부도와 측정된 풍부도 사이의 선형 관계를 평가하였으며, 절대 백분율 오류도 계산하였다. 이전 벤치마크 테스트에서 보고된 Skyline 소프트웨어의 정량화 결과는, 원래 결과(Skyline의 디폴트값)와 디코이 전이(decoy transitions)를 기반으로 mProphet 스코어링 모델(FDR 5%의 Skyline)로 필터링된 결과로 구성된 두 가지 시나리오를 통하여 분석하였다. 해당 분석에서, 각 반복실험(technical replicate)은 독립적인 샘플로 간주하였다. 즉, 반복실험에서 동일한 펩타이드에 대한 정량화 값은 별도의 관찰결과로 간주하였다.
- 희석 시리즈 데이터세트
정량화 알고리즘을 벤치마킹하기 위해 생성된 MRM 데이터 세트는 PeptideAtlas 저장소(데이터 세트 식별자: PASS00456)에서 다운로드하였다. 데이터 세트는 43개의 SIL 펩타이드가 첨가된 다양한 샘플 및 수집 조건을 사용하여 2개의 희석 시리즈에서 생성하였다. 즉, 복잡한 배경(complex background)을 통하여 복잡한 배경 데이터 세트(complex background dataset)를 얻었고, 배경이 없는 차선(suboptimal)의 조건에서는 잡음이 있는 데이터 세트(noisy dataset)를 얻었다. 해당 데이터세트에서 헤비 펩타이드의 풍부도는 0.1 에서 100 펨토몰(femtomoles)로 다양했으며, 라이트 펩타이드의 풍부도는 고정되어 있었다. 벤치마크 연구에서 보고된 정량화 분석 결과도 https://github.com/saranasso/Ariadne에서 다운로드하였다.
실험결과
평가(Evaluation)
평가를 위해 데이터 수집 목차에서 전술한 바와 같이, LC-MRM/PRM/DIA-MS 실험의 4가지 데이터 세트를 사용하였다. P100-DIA 데이터 세트에서 전이 크로마토그램(Transition Chromatograms)을 추출할 때 스펙트럼 라이브러리에 지정된 참조 머무름 시간과 함께 20분의 머무름 시간 창을 사용하였다. 다른 MRM 및 PRM 데이터 세트의 경우 표적 펩타이드에 대해 획득한 전체 전이 크로마토그램을 추출하여 DeepMRM에 공급하였다. 크로마토그램을 추출하기 전에 모든 PRM 및 DIA 스펙트럼을 중심화(centroid)하고 추출 창의 너비는 20ppm으로 설정하였다. 물체 감지 작업9에 사용되는 종래 메트릭(Metric)인 AR(Average Recall)과 AP(Average Precision)를 계산하였다. 불량 피크(Poor Peak)는 대부분 배경과 구별할 수 없었기 때문에, 정량화 가능한 피크만 평가에서 고려하였다. 감지된 피크 그룹은 수동으로 주석을 단 피크 그룹(즉, ground-truth)과의 사이에서 특정 임계값보다 IoU(Intersection over Union)가 큰 경우에만 참-양성(True Positive)으로 간주하였다. 크로마토그램 피크는 종종 긴 꼬리를 가지므로 피크의 끝을 결정할 때 큰 편차가 발생할 수 있으나, 이러한 편차는 피크 영역에 큰 영향을 미치지 않기 때문에 객체 감지 연구의 일반적인 IoU 임계값인 0.5가 아닌, 덜 엄격한 0.3의 IoU 임계값을 사용하였다. AR은 히트맵 이미지(AR1 및 AR3)당 상위 1개 및 상위 3개 후보에 대해 계산하였다. 또한, 참-양성 피크의 품질을 검증하기 위해 수동 주석으로 얻은 라이트/헤비 비율(Light/Heavy Ratio)과 DeepMRM으로 얻은 값 간의 Pearson 상관 계수(PCC)와 Spearman의 상관 계수(SPC)도 평가하였다.
결과
본 발명자들은 전술한 데이터 세트(PDAC-MRM)와 3개의 외부 데이터 세트, 상피 난소암 연구에 사용된 MRM 데이터 세트(EOC-MRM)8,인-신호(Phosphosignaling Responses) 반응을 프로파일링하는 데 사용된 PRM 및 DIA 데이터 세트를 사용하여 DeepMRM을 벤치마킹하였다(P100-PRM 및 P100- DIA)9,10(표 2). 해당 데이터 세트에서 본 발명(DeepMRM)은 96-99%의 평균 정밀도(AP)와 98-100%의 평균 재현율(AR)을 보여줌을 확인할 수 있었다(도 3). 아울러, 수정된 구조(Modified Architecture) 및 데이터 증강(Data Augmentation) 방법을 통하여 모델의 정확도(Accuracy)와 강건성(Robustness)을 개선하였음을 확인할 수 있었다(AP 및 AR은 각각 최대 1% 및 0.6% 증가, 표 3). 수동으로 주석을 추가한 피크와 본 발명(DeepMRM)에 의해 감지된 피크 간의 라이트/헤비 비율을 비교할 때 Pearson의 상관 계수(PCC)와 Spearman의 순위 상관 계수(SPC)는 각각 0.97-1.0 및 0.98-1.0이었다(도 4). 수동 라벨링에서 예상되는 편차를 고려할 때, 본 발명(DeepMRM)의 정확도는 인간 전문가의 정확도와 유사함을 알 수 있었다. 아울러, 본 발명(DeepMRM)을 이용하는 경우, 데이터 해석에 소요되는 시간과 리소스를 크게 줄일 수 있었다. PDAC-MRM 데이터 세트의 66개 샘플에 대한 수동 검사에는 600시간 이상이 소요되었으나, 본 발명(DeepMRM)을 이용하는 경우, 동일한 작업을 데스크톱 컴퓨터(AMD Ryzen 7 5800X, 3.8GHz, 32GB RAM)에서 232초 만에 완료하였다. 또한 인간 전문가는 GUI를 이용하여 DeepMRM의 피크 선별을 매우 효율적으로 확인 및 조정할 수 있었다(도 2). 요약하면, 본 발명(DeepMRM)은 검출 결과를 시각화해주는 사용자 인터페이스(User Interface)로 보조되는, 표적 단백질체학 데이터(Targeted Proteomics Data)를 해석하기 위한 강력하고 매우 정확한 피크 검출 모델이다. 아울러, 독립 실행형 소프트웨어 외에도 DeepMRM은 Skyline 소프트웨어에도 통합하여 사용 가능하다.
수정된 백본 네트워크 및 데이터 보강의 적용 여부에 따른 학습모델(DeepMRM) 성능의 비교.
수정된
백본		 데이터
보강		 PDAC-MRM EOC-MRM P100-PRM P100-DIA
AP30 AR1 AR3 AP30 AR1 AR3 AP30 AR1 AR3 AP30 AR1 AR3
0.983 0.995 0.995 0.977 0.981 0.989 0.967 0.976 0.980 0.934 0.945 0.984
O 0.984 0.998 0.998 0.977 0.989 0.997 0.976 0.988 0.991 0.857 0.896 0.980
O 0.986 0.996 0.997 0.977 0.981 0.991 0.976 0.985 0.987 0.934 0.944 0.981
O O 0.984 0.998 0.998 0.986 0.991 0.997 0.977 0.982 0.988 0.942 0.956 0.985
윈도우 데스크탑 애플리케이션
DeepMRM은 피크 검출 작업을 실행하고 결과를 시각화하는 데 도움이 되는 윈도우즈 데스크톱 애플리케이션으로 패키지 되어있다. 데스크탑 애플리케이션의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 통해 사용자는 입력 전이 크로마토그램과 함께 검출 결과를 빠르게 테스트할 수 있으며, 여러 샘플을 함께 로드하여 대상 펩타이드에 대한 모든 결과를 쉽게 비교할 수 있다. 데스크탑 애플리케이션은 질량 분석 데이터(mzML10)에 대한 커뮤니티 표준을 지원한다.
Skyline 소프트웨어와의 정량화 성능 비교결과
DeepMRM은 Skyline 소프트웨어(이하, Skyline 디폴트) 및; 디코이 전이을 기반으로 한 mProphet 알고리즘을 사용하여 5%의 거짓 발견률(false discovery)로 필터링한 Skyline 소프트웨어(이하, Skyline FDR 5%)와 비교하여, 더 많은 수의 정량화 가능한 피크 그룹을 감지하였다(도 6). 또한, 표적 펩타이드의 알려진 풍부도와 측정된 풍부도 사이의 상관관계와 절대 오차를 평가할 때 DeepMRM은 Skyline 디폴트 및 Skyline FDR 5%보다 더 높은 평균 상관계수(표 4 및 도6) 및 더 낮은 평균 절대 백분율 오차(mean absolute percentage error, MAPE)를 보여주었다(도 7).
DeepMRM 및 Skyline의 정량화 성능을 표적 43개 펩타이드에 대한 평균 상관 계수 및 절대 백분율 오차로 비교한 결과
피크 그룹 PCC SPC MAPE
잡음 Skyline 디폴트 1287 0.9284 0.9413 68.09
Skyline FDR 5% 971 0.9482 0.9723 50.99
DeepMRM 1266 0.9760 0.9873 46.59
복잡한

배경		 Skyline 디폴트 386 0.9683 0.9237 94.95
Skyline FDR 5% 386 0.9683 0.9237 94.95
DeepMRM 372 0.9842 0.9287 68.09
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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10. Martens, L. et al. mzML--a community standard for mass spectrometry data. Mol Cell Proteomics 10, R110.000133 (2011).

Claims (17)

  1. 다음을 포함하는 액체 크로마토그래피 질량분석(Liquid Chromatography Mass Spectrometry, LC-MS)에서 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크(Peak) 선별용 시스템:
    입력된 학습용 데이터를 가공하는 전처리부;
    상기 전처리부에서 가공된 학습용 데이터를 입력값으로 이용하여 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 피크의 경계를 감지하는 방법을 학습하는 합성곱 신경망(Convolutional Neural Network, CNN) 학습모델을 포함하는 학습부;
    상기 학습부의 출력값을 가공하는 후처리부; 및
    상기 후처리부의 출력값을 이용하여 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크를 선별하는 판단부.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 질량분석은 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM), 병렬 반응 모니터링 (Parallel Reaction Monitoring, PRM), 데이터 의존성 분석법(Data-Dependent Acquisition, DDA) 및 데이터 비의존성 분석법(Data-Independent Acquisition, DIA)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 학습용 데이터는 정량화를 위한 피크(Peak)가 미리 결정된 액체 크로마토그래피 질량분석의 결과 값인 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 질량분석의 결과값은 정량하고자 하는 타겟 펩타이드에 대한 라이트 펩타이드의 전이값(Transition) 및 헤비 펩타이드의 전이값을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 전처리부는 입력된 학습용 데이터를, 정량하고자 하는 타겟 펩타이드에 대한 라이트 펩타이드 채널 및 헤비 펩타이드 채널로 구성된 2개의 채널을 가지는 히트맵으로 변환하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 히트맵은 한축을 머무름 시간(Retention Time)으로 하고, 다른 한축을 복수의 전이값(Multiple Transition)으로 하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 전처리부는 학습용 데이터를 가공하기 전 단계에서, 학습용 데이터에 대하여 데이터 증강(Data Augmentation)을 수행하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 데이터 증강은, 무작위 크기 조정(Random Resizing); 자르기(Cropping); 강도 지터링(Intensity Jittering), 머무름 시간 변환(Retention Time Shifting) 및 전이값 리스케일(Transition Rescaling)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 학습모델은 백본 네트워크(Backbone Network) 및 복수개의 하위 네트워크(Sub-networks)를 포함하고,
    상기 백본 네트워크는 변형된(Modified) ResNet34이며,
    상기 하위 네트워크는 피크 그룹의 정량화 가능성(Quantifiability)를 분류하는 하위 네트워크 및 피크 경계 회귀(Peak Boundary Regression)를 수행하는 하위네트워크를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 변형된(Modified) ResNet34는,
    제 0 내지 5의 레이어를 포함하고,
    상기 제 0 레이어는 커널 사이즈가 1 x 7이고, 채널수가 32이며, 스트라이드가 1x1이고;
    상기 제 1 레이어는 커널 사이즈가 3 x 7이고, 채널수가 64이며, 스트라이드가 1x1이며;
    상기 제 0 레이어는 및 제 1 레이어는 헤비 펩타이드 채널 및 라이트 펩타이드 채널이 별도로 합성되도록 2개의 그룹으로 이루어져 있고;
    상기 제 2 레이어는 커널 사이즈가 1 x 3이고 스트라이드가 1 x 2인 최대 풀링(max pooling)층, 적응 평균 풀링층, 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1 x 3이고 채널수가 128인 2개의 합성곱층으로 구성되고;
    상기 제 3 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1 x 3이고 채널수가 128인 2개의 합성곱층으로 구성되며;
    상기 제 4 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1x3이고 채널수가 256인 2개의 합성곱층으로 구성되고;
    상기 제 5 레이어는 3개의 잔차블록(Residual Block)으로 구성되며, 상기 잔차블록은 각각 커널 사이즈가 1 x 3이고 채널수가 512인 2개의 합성곱층으로 구성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 하위 네트워크는 커널사이즈가 1 x 3인 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 후처리부는 상기 선별된 피크의 경계 내의 헤비 펩타이드 피크 모양 및 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하여 유사도가 가장 높은 헤비 펩타이드 전이쌍(Transition pair)와 라이트 펩타이드의 전이쌍을 선택하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 후처리부는 헤비 펩타이드 피크 모양 및 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하기 전, 헤비 펩타이드 피크 모양의 평균 프로파일(mean profile)과 라이트 펩타이드 피크 모양의 유사도를 비교하여 라이트 펩타이드의 전이쌍을 선택하는 과정을 추가적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 유사도는 내적 유사도(Dot-product Similarity)를 이용하여 계산하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제 1 항의 피크(Peak) 선별용 시스템을 이용하여, 정량화를 위한 피크가 선택되지 않은 액체 크로마토그래피 질량분석 데이터에서 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크(Peak)를 선별하는 방법.
  16. 하드웨어와 결합되어 제 1 항의 시스템을 실행하여 복수개의 타겟 펩타이드의 정량화에 최적화된 복수개의 피크를 동시에 선별할 수 있는 컴퓨터 판독가능 기록 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 컴퓨터 프로그램은 GUI(graphic user interface)에 대한 사용자의 입력에 의해 선택된 타겟 펩타이드에 대하여, 해당 타겟 펩타이드의 정량화를 위한 피크를 선별하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 프로그램.
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