KR20240000007A

KR20240000007A - 생체조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 전기영동 투명화 방법

Info

Publication number: KR20240000007A
Application number: KR1020220075921A
Authority: KR
Inventors: 박순현; 김기석; 박성훈; 이재면
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: KR102827998B1

Abstract

본 발명은 CHAPS, 이의 입체이성질체 또는 이의 염; 우레아; 및 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 및 EDTA 중 1 이상을 포함하는, 생체조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체조직의 투명화 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여 전기영동을 이용하여 투명화하는 방법은 고전류가 유발되지 않아 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체조직의 투명성이 향상되어 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요 없이 단순한 전기영동 장치로 생체조직 투명화를 매우 빠른 시간내에 수행할 수 있게 한다.

Description

생체조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 전기영동 투명화 방법{A clearing composition for biological tissue and a method of eletrophoretic clearing using the same}

본 발명은 생체조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 초고속 생체조직 투명화 방법에 관한 것이다.

x-ray를 통한 의료 진단 기술은 CT나 MRI와 같은 2차원 스캐닝 후 3차원으로 재구성하는 기술에 의하여 입체적으로 관찰, 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 광원이 아니라 초음파 등을 활용하는 경우 역시 3차원적 영상을 구현하는 기술이 진단에 활발하게 이용되고 있다. 그러나 현재 개발된 기술 대부분은 밀리미터 수준의 상대적으로 마크로 해상력을 가진 기술들로, 세포 수준에서의 분석이 가능한 마이크로 수준의 3차원 측정하는 기술은 상대적으로 그 발전이 미흡하여, 현재 대부분의 세포 수준 분석은 전통적인 2차원 기술을 이용하고 있다. 즉, 생검 또는 부검 조직 등 생체조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 투과 이미지를 광학 또는 전자현미경을 이용하여 취득하는 기술을 사용하여 미세구조를 분석한다.

이러한 미세 이미징 기술을 이용하여 3차윈 이미지를 획득하기 위해서는 콘포칼 현미경 등을 이용해야 하며, 이 경우 일반적으로 수십 마이크로미터 수준의 두께 정보를 획득할 수 있다. 대략적으로 이 두께는 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의하여 그 한계가 그어진다. 그러나 대부분의 생체조직 내 유의미한 구조물들이 수백 마이크로미터 이상의 크기를 가지고 있으므로, 이와 같은 방법으로는 일부의 정보만을 취득할 수 있다. 따라서, 보다 두꺼운 조직 내 이미지를 획득하기 위해서는 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작하고, 이를 일일이 현미경으로 통하여 이미징 한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다. 특히 뇌조직의 경우 하나의 뉴런 전체를 이미징한다고 할 때, 경우에 따라서는 하나의 뉴런이 수 Cｍ까지도 그 액손(Axon)을 뻗기 때문에, 조직을 자르고 붙이는 일련의 과정을 진행하면서 일어날 수 있는 문제점이 기하급수적으로 발생한다.

조직 투명화 기술은 조직의 손상없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.

최근에 개발된 조직 투명화 방법인 'CLARITY' 기술은 조직 내 아크릴아마이드를 통해 하이드로겔을 형성하는 기술이며, 'SHIELD' 기술은 폴리에폭사이드를 통해 단백질 등을 가교시키는데, DNA나 단백질 등 진단에 중요한 중요 물질들을 붙잡아주는 일종의 조직 내 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다(비특허문헌 1).

상기 방법은 아크릴아마이드와 폴리에폭사이드 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 높아지며, 보다 촘촘한 그물형 구조가 만들어지기 때문에 조직이 더 단단해진다. 반면 조직이 단단해지면 계면활성제에 의해서 지질이 빠져나가기 어려워지기 때문에 투명화에 걸리는 시간이 길어진다. 또한, 상기 방법은 투명화 속도를 단축하기 위해 고전압을 인가하면 고전류를 유발하기 때문에 투명화 과정중에 고열이 발생하여 조직의 손상을 유발한다. CLARITY용액 조건에서 조직을 투명화 하기위한 최소한의 25V의 전압을 인가하면 약 200 mA의 전류가 흐른다(비특허문헌 2). 또한 고전류로 인하여 조직 표면에 공기 및 검은 입자 침착을 야기하거나, 조직을 노랗게 변색시키는 문제점이 있다. 위의 문제점들을 해결하기 위해 너무나 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 예를 들면 뇌 하나를 투명화하기 위해서는 전용 투명화 장치 및 부가적인 필름막과 투명화 용액으로 많은 비용을 필요로 한다. 뿐만 아니라 한번에 하나의 뇌만 투명화하는 것이 가능하므로 경제적, 시간적으로 많은 손실이 유발된다. 보다 큰 문제는 항체을 이용한 염색이 그물망 구조를 이루는 폴리아크릴아마이드 사이를 투과하기에 어려움이 있다.

따라서, 조직 내 단백질의 분포정보를 얻기 위해서는 조직 투명화 이후 항원성의 보존 정도와 항체의 조직 내 침투력을 고려하여 항체의 물리적인 확산 능력을 향상시켜야 하나, 결합조직이 많은 단단한 조직들의 경우 항체의 확산 속도는 현저히 떨어지므로, 이들을 보완하기 위한 새로운 기법이 요구 된다.

더 나아가 조직내 아크릴아마이드와 에폭사이드의 침습과 그물망 구조 형성을 위해서 3~4일 동안 조직을 저온에서 보관하는 전처리과정이 필요하다. 전처리 과정으로 인해, 전기영동을 통한 투명화 과정이 3~4일 소비되어서 최종적으로 투명화 조직을 실험자가 얻는데 7일의 시간이 필요하다.

본 발명자는 CHAPS를 포함하는 조성물이 전기영동 장치 없이 빠른 시간내에 조직을 투명화할 수 있음을 밝힌바 있다(특허문헌 1)

이후 본 발명자는 추가 연구를 통해서 CHAPS를 포함하는 조성물에 고전압을 인가하고 저전류를 유지하면서, 포름알데히드 외의 추가적인 아크릴아마이드 또는 폴리에폭사이드에 의한 조직 고정 없이 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체조직에 손상 없이 투명화가 가능할 뿐만 아니라, 생체조직의 조직을 고정하고 생체조직을 투명화까지 하는데 총 소요되는 시간이 24시간 안에 가능하게 되었다. 또한 고전류가 유발되지 않아 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체조직의 투명성이 향상되어 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요 없이 단순한 전기영동 장치로 생체조직 투명화가 가능하다는 점을 확인하였다.

1. 대한민국 공개특허 제 2018-0118514

1. Chung K, et al., "Structural and molecular interrogation of intact biological systems", Nature 497,332-337, 2013. 2. Lee et al., "Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine", BMC Developmental Biology,14:48,2014.

일 목적은 간단한 전기영동 장치에서 고전압 저전류를 통해서 짧은 시간내에 생체조직을 투명화할 수 있는 생체조직 투명화용 조성물을 제공하는데 있다.

다른 목적은 짧은 시간내에 생체조직을 투명화할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 일 측면에서, 아래 화학식으로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염; 우레아; 및 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 및 EDTA 중 1 이상을 포함하는,

생체조직 투명화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기의 생체조직 투명화용 조성물 내에 생체조직을 침지하는 단계; 및

상기 조성물에 전압을 인가하여 조성물내에 전류를 유도하는 단계;를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고전압 저전류 유도 생체조직의 투명화용 조성물 및 이를 이용한 초고속 생체조직 투명화 방법은 아크릴아마이드나 폴리에폭사이드를 사용하여 추가적인 조직 고정 없이 저가의 전기 영동 장치와 저가의 용액을 사용하여, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 기존 전기영동 장치를 사용한 투명화 용액에서 발생하는 고 전류로 인한 부작용인, 고열, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 최 단시간으로 생체조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 빠른 진단, 그리고 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 전기영동 없이 투명화한 마우스 전뇌의 투명화된 외관 사진이다.
도 1b는 전기영동 없이 투명화한 마우스 전뇌의 YFP 형광 사진이다.
도 1c는 전기영동 없이 투명화하되, 우레아 농도에 따른 마우스 전뇌의 YFP 형광 사진이다.
도 2는 전기영동 장치의 개념도이다.
도 3은 전기영동을 통해 투명화하는 과정 중의 마우스 전뇌의 외관 변화를 보여준다.
도 4a는 전기영동을 통해 투명화한 마우스 전뇌의 YFP 형광 사진이다.
도 4b는 전기영동을 통해 투명화한 마우스 전뇌의 YFP 형광 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아래 화학식으로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염; 우레아; 및 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 및 EDTA 중 1 이상을 포함하는,

생체조직 투명화용 조성물:

이하, 본 발명에 따른 생체조직 투명화용 조성물에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다. 상기 투명화용 조성물과 관련하여 서로 상충되지 않는 한 특허문헌 1에 기재된 사항에 의해서 보충될 수 있다.

상기 조성물은 수용액의 형태로 제공될 수 있며, 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 상기 성분들이 용해된 형태의 수용액으로 제공될 수 있으며, 보다 구체적으로는 증류수, PBS(phosphate buffer saline), TBS(tris buffer solution) 등에 용해된 수용액의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 “투명화”는 생체조직의 관찰을 위한 처리 과정 중에서 통상 클리어링(clearing)의 과정을 의미하며, 투명화 단계는 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분을 생체조직으로부터 일부 또는 거의 제거하되, 관찰하고자 하는 기관들, 예를 들면, 염색체, 단백질 등을 포함하는 세포 기관들은 유지하는 상태에서, 바람직하게는 단백질의 구조적 변성을 일으키지 않으며, 조직의 구조를 유지하게 하는 것이 바람직하다. 통상적으로 투명화 이전 단계에서 조직 내 관찰하고자 하는 단백질 등의 유실을 막고, 조직의 내부 구조를 유지하기 위한 고정화(fixation)의 과정을 거치게 된다.

조성물 내에 침지되는 생체조직은 일반적으로 고정화를 거친 고정화된 생체조직일 수 있다.

생체조직은 투명화하기 전에 통상적으로 항원성의 손실을 유발하지 않으면서 생체조직을 고정화하는 방법이라면 특별한 제한없이 적용하여 고정화할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 생체조직의 고정화는 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 아크릴아마이드, 폴리에폭사이드, 에폭사이드 또는 이들의 조합을 사용하여 통상적인 방법을 통해 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 포름알데히드(파라포름알데히드)에 의한 고정화를 수행한다. 바람직하게는 포름알데히드(파라포름알데히드)만을 이용한 고정화를 수행하며, 포름알데히드 외의 다른 아크릴아마이드나 폴리에폭사이드에 의한 고정화를 수행하지 않고도 전류 유도에 의한 투명화를 통해서 조직의 손상 또는 단백질 등의 소실 없이 투명화하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 생체조직 투명화용 조성물에 있어서, 상기 화학식으로 표시되는 화합물은 CHAPS 라는 이름으로 널리 알려진 양쪽성 디터전트(zwitterionic detergent)로서, IUPAC 이름은 3-((3-콜라미도프로필) 다이메틸암모니오)-1-프로판설포네이트(3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)이다.

CHAPS의 농도는 2 내지 55 %(w/v)(%(중량/부피))의 농도로 포함될 수 있으며, 4 내지 50, 10 내지 55, 4 내지 55, 10 내지 55, 10 내지 40, 15 내지 35, 20 내지 30 %(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.

상기 화학식으로 표시되는 화합물의 농도가 낮은 경우에는 생체조직의 투명화 속도가 느려질 수 있고, 높은 경우에는 CHAPS가 완전히 용해되지 않기 때문에, 55 %(w/v) 이상으로 포함하는 것은 불필요하다.

나아가, 본 발명에 따른 생체조직 투명화용 조성물은 삼투압을 조절하여 생체조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 역할을 하는 물질을 더 포함할 수 있는데, 본 발명은 우레아를 포함하고 있다.

이때, 상기 생체조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질로서 우레아(urea)는 10 내지 70 %(w/v)의 농도가 포함될 수 있으며, 10 내지 60, 20 내지 60, 10 내지 40 %(w/v) 농도로 포함될 수 있다. 우레아의 농도는 상기 CHAPS의 바람직한 농도 범위와 적절하게 조합하여 사용할 수 있다.

한편, 우레아는 조직 내의 단백질과 같은 관찰 대상 물질의 소실 측면에서, 바람직하게는 저농도 영역에서 사용되는 것이 바람직하며, 구체적으로는 10 내지 45, 10 내지 40, 10 내지 35, 10 내지 30, 15 내지 45, 15 내지 40, 15 내지 35, 15 내지 30, 20 내지 45, 20 내지 40, 20 내지 35, 20 내지 30 %(w/v), 25 내지 30% 의 농도로 사용될 수 있다.

그리고, 생체조직 투명화용 조성물의 적용 이전에, 당류, 예를 들면 수크로스 용액에의 전처리를 더 포함할 수 있다. 생체 조직에 상기 당류 용액을 처리하면 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분이 생체 조직으로부터 미리 제 거되고, 탈수가 유도되어 결과적으로 조직을 고정화하는 시약과 생체조직 단백질과의 구조적 결합력이 증가하여 변성을 일으키지 않고, 조직을 더 단단하게 할 수 있으며, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어오름을 방지하고, 항체 처리과정, 세척 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있는 현저한 효과가 발생한다. 당류의 농도는 10 내지 70 w/v% 범위일 수 있고, 20 내지 60 w/v% 범위일 수 있고, 25 내지 50 w/v% 범위일 수 있고, 30 내지 40 w/v% 범위일 수 있다.

다만, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 0.1 w/v% 미만일 경우 상기 효과가 발생하지 않는 문제가 있고, 상기 당류를 함유하는 용액의 당류 농도가 70 w/v% 초과일 경우 경제적이지 못한 문제가 있다.

당류 전처리와 관련해서는 본 명세서의 내용과 상충되지 않는 범위내에서 대한민국 등록특허 10-1849704에 개시된 사항이 그대로 편입될 수 있다. 특히, 상기 우레아의 농도가 고농도일 때, 예를 들면, 30 내지 70, 40 내지 65, 40 내지 65, 40 내지 60, 45 내지 70, 45 내지 65, 45 내지 60, 45 내지 55 %(w/v)의 농도로 우레아를 사용하는 경우에는 투명화 이전에 수크로스 용액에 침지하는 전처리를 통하여 단백질 등의 소실을 막을 수 있다.

당류 수용액을 이용한 전처리는 0 내지 20℃ 범위에서 1 내지 48시간 또는 1 내지 24시간, 4 내지 24 시간, 8 내지 24 시간 또는 12 내지 24 시간동안 침지하여 수행될 수 있다.

종래의 투명화 방법을 사용하기 위해서는 조직과 용액의 굴절률을 맞추기 위해 마운팅 용액을 따로 추가로 구입 및 제작이 필요하였으나, 본 발명에 따른 생체조직 투명화용 조성물은 굴절률을 맞추는 용액이 필요 없으나, 필요에 따라서는 마운팅 용액에의 침지를 수행할 수도 있다. 마운팅 용액과 관련해서는 대한민국 등록특허 제 10-1849698호에 개시된 바의 내용이 적용될 수 있다.

CHAPS와 우레아를 포함하는 생체조직투명화 용액에 전압인가에 따른 전기장 형성, 즉 전류를 유도하기 위해서는 전해질을 더 포함시켜야 한다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 전압 인가에 따른 전류가 유도되며, 조성물 내에 침지된 조직은 전류의 흐름하에서 투명화가 진행된다.

CHAPS/우레아 용액에 추가적으로 고전압 인가시 적절한 전류가 흐를 수 있도록 하는 전해질을 첨가한 용액을 준비하였다. CHAPS/우레아 용액에서는 높은 200V 전압을 가하여도 전류가 전혀 흐르지 않았다.

전해질로는 염, 유기산, 아민류를 사용할 수 있다. 과도한 전류 흐름으로 인한 발열의 억제 측면에서 유기산이나 아민류가 바람직하며, 유기산으로는 EDTA를 사용할 수 있고, 아민류는 Tris로 알려진 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예는 트리스와 EDTA로 중 1 이상의 전해질을 더 포함한다.

트리스(히드록시메틸)아미노메테인은 일반적으로 Tris(트리스)라는 이름으로 통용된다.

상기 전해질은 적절한 전류의 흐름을 유도하기에 적절한 범위로 선택될 수 있다. 전해질의 농도는 인가하는 전압과도 관련된다. 인가 전압이 높은 경우에는 전해질의 농도가 상대적으로 낮아도 되고, 인가 전압이 낮은 경우에는 전해질의 농도가 상대적으로 높아야 한다.

과도한 발열을 억제하기 위해서 선택되는 적절한 전류는, 30 mA 이하, 25 mA 이하, 20 mA 이하의 전류 발생이 적절함을 확인하였다.

구체적으로, 4 내지 30 mA, 4 내지 25 mA, 4 내지 20 mA, 10 내지 30 mA, 10 내지 25 mA, 10 내지 20 mA일 수 있다.

상기 전류를 발생시키기 위해서 인가되는 전압은 특별히 제안되지는 않는다. 본 발명에서의 구체적인 일례로는, 10 내지 1000 V, 10 내지 500 V, 20 내지 1000 V, 20 내지 500 V, 50 내지 200 V 일 수 있으나, 이는 전해질의 농도에 따라서 달라질 수 있으며, 주변에서 적용 가능한 전압 소스에 따라서 선택될 수 있으며, 전압에 따라서 전해질의 농도를 조절할 수 있다.

전해질의 농도는 0.1 내지 100 mM, 0.1 내지 50 mM, 0.1 내지 20 mM, 0.1 내지 10 mM, 1 내지 100 mM, 1 내지 50 mM, 1 내지 20 mM, 1 내지 10 mM 에서 선택될 수 있다.

트리스와 EDTA를 혼합하여 사용하는 경우, 몰비로 트리스 100에 대해서 EDTA는 0.1 내지 100, 0.1 내지 50, 0.1 내지 20, 0.5 내지 100, 0.5 내지 50, 0.5 내지 20, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 20 사용할 수 있다.

한편, 생체조직 내의 핵산, 단백질과 같은 타겟 들은 열에 의하여 변성이 되기 쉽기 때문에, 조성물에 인가되는 전류가 과도한 경우에는 조성물의 온도가 과도하게 올라가므로 변성이 발생할 수 있다. 따라서, 조성물의 온도는 가능한 한 낮게 유지되는 것이 바람직하다. 다만, 수용액의 냉각으로 인하여 물이 어는 경우에는 생체 조직의 손상을 유발하게 되고, 과도한 냉각을 위해서는 고가의 냉각 장치가 요구될 수 있으므로, 조성물의 온도는 30 ℃ 이하, 28 ℃ 이하, 25 ℃ 이하로 유지하면서, 4 ℃ 이상, 7 ℃ 이상, 10 ℃ 이상, 15 ℃ 이상, 20 ℃ 이상에서 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 5mM Tris와 0.125 mM의 EDTA를 첨가하였다. 25% CHAPS와 25% Urea에 5mM Tris와 0.125 mM의 EDTA을 첨가하면 200V 전압을 인가하면 용액의 온도가 15도에서 25도 사이에서 20 mA의 저 전류가 유발되고 4시간 내에 마우스 전체 뇌가 투명화된다. 저 전류의 유지는 투명화 과정에서 발생하는 열을 최소화 하여 전기영동기반의 투명화 과정에서 발생하는 조직의 손상을 막을 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체조직의 투명화용 조성물은 저가의 전기 영동 장치와 저가의 용액으로 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 조직의 부풀어짐, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 초 고속으로 생체조직의 투명성이 향상되므로 생체조직의 투명화용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 생체조직의 투명화 조성물은 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체조직의 투명성을 향상시키며 단백질 변성 등에 의하여 원하는 조직 내 정보가 손실 또는 왜곡되지 않아, 특히 GFP단백질 등 다양한 형광원(Fluorophore)을 조직 내 정보 검출 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 생체조직 투명화용 조성물 내에 생체조직을 침지하는 단계; 및

상기 조성물에 전압을 인가하여 조성물내에 전류 또는 전기장을 유도하는 단계;를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법을 제공한다.

전술한 조성물에 대한 사항은 상충되지 않는한 투명화 방법에 대한 사항에 대해서도 동일하게 적용된다.

상기 전류 또는 전기장을 유도하는 단계는 간단한 전기영동 장치 내에서 수행될 수 있다. 침지하는 단계는 별도로 수행될 수 있으며, 전기영동 장치 내에서 전압 인가 없는 상태에서 수행될 수도 있다.

침지된 상태에서 바로 전압을 가하여 전류 및 전기장이 유도하면 된다. 고정화된 생체조직을 용액 내에 그대로 넣은 경우에 생체조직이 용액에 완전하게 침지되지 않고 뜰 수 있는바, 물리적인 강제수단을 사용하여 완전히 침지되도록 할 수 있다. 경우에 따라서는 자연적인 침지를 위하여 일정한 시간 동안 고정화된 생체조직이 용액내에 완전히 침지되도록 일정 시간 동안 방치할 수 있다.

용액내에서 방치는 10℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 12 내지 48℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 14 내지 46℃ 범위에서 수행할 수 있고, 16 내지 44℃ 범위에서 수행할 수 있고, 18 내지 42℃ 범위에서 수행할 수 있고, 20 내지 40℃ 범위에서 수행할 수 있고, 24 내지 39℃ 범위에서 수행할 수 있고, 28℃ 내지 38℃에서 수행할 수 있고, 30℃ 내지 37℃에서 수행할 수 있고, 33 내지 34℃에서 수행할 수 있다.

이때 방치하는 시간은 1 내지 12 시간, 1 내지 8 시간, 1 내지 4 시간, 2 내지 12 시간, 2 내지 8 시간, 2 내지 4 시간의 범위내에서 완전하게 자연적으로 침지가 되도록 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방치 과정을 통하여 일부 자발적인 투명화가 유발될 수도 있다.

본 발명에 따른 생체조직의 투명화 방법은 다양한 척추 동물의 조직(tissue)에 적용할 수 있으며, 특히, 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 장(intestine) 등에 적용하는 것이 바람직하고, 상기 생체조직의 전체 부분을 빠른 시간 내에 한번에 투명화할 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서,

전술한 방법에 따라서 생체조직을 투명화하는 단계; 및

투명화된 생체조직을 면역염색하는 단계를 포함하는,

생체조직의 면역염색 방법을 제공한다.

본 발명은 또 하나의 측면에서,

상기 투명화 방법을 이용하여 생체조직을 투명화하는 단계; 및

투명화된 생체조직 내의 바이오 정보물질을 면역염색하는 단계;를 포함하는

생체조직 내의 바이오 정보물질의 검출 방법을 제공한다.

상기 바이오 정보물질은 생체조직 내 중요 정보를 담고 있는 물질이며, 예를 들면, DNA, RNA, 단백질일 수 있으며, 이들 정보가 형광신호를 표지하는 면역염색의 과정을 통해서 형광신호로서 검출될 수 있다.

한편, 상기 중요 정보물질은 처음부터 생체조직내에 형광신호가 표지된 것일 수 있으며, 형광신호의 표지는 실험을 위하여 설계된 동물 모델 내에 발현된 것일 수 있다.

단백질의 경우 고정 과정 동안 아미노산에 존재하는 아미노기끼리의 공유결합을 이루면서 서로 네트워크를 이루기 때문에, 매우 안정적인 반면, RNA나 DNA와 같은 핵산의 경우 아미노기가 존재하지 않기 때문에, 고정된 조직에서도 상대적으로 불안정하다.

본 발명은 또 다른 측면에서,

상기 생체조직 투명화 조성물을 이용한 현미경 관찰용 생체조직 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고전압 저전류 유도 생체조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 투명화 방법은 전기영동 과정에서도 손상되지 않은 생체조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 수백 마이크로미터 이상의 크기로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 뇌질환 등의 다양한 질환의 원인을 규명하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1) 실험 동물 준비

2-4 개월된 이형(heterozygous) GAD67-GFP/Thy1-YFP 녹인(knock-in) 마우스 를 조직 투명화 실험에 사용했다. GAD67-GFP/Thy1-YFP 마우스는 Jackson Lab(JAX#007677, JAX#003782, JAX#34830)에서 구입했다.

마우스를 23 ± 3°C 및 상대 습도 50% ± 10%에서 칩 베딩에서 12시간 명암 주기(오전 8시부터 오후 8시까지 켜짐)로 사육되었다. 살균된 음식과 물은 임의로 제공되었다. 모든 동물 실험은 안전성평가연구소(Korea Institute of Toxicology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(연구 번호 RS19003)에서 승인한 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었다.

2) 샘플 준비

마우스를 식염수내 Zoletil(Virbac, France, Caross)과 Rompun(Bayer Korea)의 혼합물을 i.p. 주입하여 마취시켰다.

마우스를 빙냉시킨 인산염 완충 식염수(PBS)로 경심(transcardially) 관류한 후, PBS(pH 7.4) 중 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 뇌, 심장, 폐, 신장, 간 및 비장을 절개하고 4°C에서 12시간 동안 4% 파라포름알데히드로 후 고정(post-fix)했다. 선택적으로, 보다 안정적인 고정을 위해 샘플이 4°C에서 가라앉을 때까지 조직을 30% 수크로스에 담그었다. 관상 뇌 섹션은 뇌 매트릭스에서 절단되었다. 조직의 투명화 진행 중 조직의 투명도와 형광 강도를 시각화하기 위해 명시야 이미지 및 형광 이미지(Thy1-YFP)를 일반 광학 또는 형광현미경으로 촬영했다.

실시예 2. 고전압 저전류 인가 없이 전뇌(whole brain)의 투명화

CHAPS와 우레아의 조합으로 마우스 전뇌를 투명화시켰다. 전뇌 샘플을 pH 8의 CHAPS/우레아(25%/25%) 용액에 침지한 후 38°C에서 인큐베이션하였다.

보다 구체적으로 48시간 동안 침지하고, 12시간 동안 세척한 후, 다시 48시간 동안 침지하고 12시간 동안 세척하고, 12시간 동안 마운팅 용액에 침지하였다.

37°C에서 마운팅 용액으로서 더 높은 RI(1.46)를 가지면서 염이 첨가된 DRIM 2 용액(38% CHAPS, 38% 우레아, 0.05% 염화나트륨)에서 12시간동안 인큐베이션하였다. 이러한 과정을 거쳐 얻은 전뇌 샘플의 현미경 사진은 도 1에 제시되어 있다.

광학 현미경(Leica)에서 1X 대물렌즈를 이용하여 투명화된 뇌를 확인하였다.

도 1a에서 확인할 수 있듯이 충분히 뇌 전체가 투명화된 것을 확인할 수 있었다.

투명화된 전뇌 샘플에서 Thy1 양성 뉴런의 형광 단백질 YFP가 라이트시트(lightsheet) 현미경으로 검출되었다(도 1b).

용액내 우레아의 농도가 투명화에 영향을 미치지는 않으나, 조직 내 단백질 보전이라는 측면에서는 우레아의 농도가 영향을 미치는 것을 확인하였다. 즉, 우레아의 농도를 각각 25% 및 50%로 하는 경우, 상대적으로 50%의 농도에서 YFP의 형광 신호가 약해지는 것을 통해서 일부 단백질의 소실이 발견되었다.

도 1c를 참조하면 우레아 50 %(w/v)의 조건에서 초록색의 형광이 약간 소실된 것을 확인할 수 있다.

다만, 사전에 수크로스 전처리를 통해서 형광 소실이 줄어드는 것을 확인하였다. 수크로스 전처리에 따른 효과는 25 %(w/v) 및 50 %(w/v) 모든 영역에서 동일하게 나타났다. 이를 통하여 투명화 진행 과정에 있어서 조직 내 단백질의 보호를 위해서는 고농도 보다는 저농도의 우레아 조건이 바람직하다는 점을 확인하였다.

실시예 3. 고전압 저전류 유도용 투명화 용액의 준비

CHAPS/우레아 용액에 추가적으로 고전압 인가시 적절한 전류가 흐를 수 있도록 하는 전해질을 첨가한 용액을 준비하였다. CHAPS/우레아 용액에서는 200 V의 전압을 가하여도 전류가 전혀 흐르지 않았다.

전해질로는 염, 유기산, 아민류를 사용할 수 있다. 발열의 억제 측면에서 유기산이나 아민류가 바람직하며, 유기산으로는 EDTA를 사용할 수 있고, 아민류는 Tris로 알려진 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 EDTA와 트리스의 혼합을 사용하였고, 그 농도는 적절한 전류의 흐름을 발생시키는 조건하에서 조절될 수 있다. 바람직한 전류는 10-30 mA이며, 이러한 전류를 발생시키기 위하여 인가되는 전압은 제한되지는 않으나, 10-1000 V, 50-500 V, 100-500 V 범위에서 사용가능한 전압 발생장치에 따라서 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명을 위하여 전해질의 농도를 상이하게 하여 2 종의 투명화 용액을 준비하였다.

구분	eDRIM 용액 1	eDRIM 용액 2
CHAPS	25% (w/v)	25% (w/v)
우레아	25% (w/v)	25% (w/v)
트리스	20 mM	5 mM
EDTA	0.5 mM	0.125 mM
pH	8.2	8.2

각 용액에 따라 전압, 온도 조건을 변경해 가면서 발생되는 전류를 측정하였다.

	용액	eDRIM 용액 1	eDRIM 용액 1	eDRIM 용액 1	eDRIM 용액 2
	인가 전압 (V)	50	100	200	200
용액 온도 (^oC)	4	-	10 mA	60 mA	10 mA
	7	-	10 mA	80 mA	10 mA
	10	-	10 mA	80 mA	10 mA
	15	4 mA	10 mA	90 mA	10 mA
	20	4 mA	10 mA	110 mA	10 mA
	25	10 mA	20 mA	120 mA	20 mA
	30	10 mA	20 mA	130 mA	20 mA
	37	30 mA	30 mA	150 mA	30 mA

전류가 30 mA 초과하여 발생하는 경우에는 전류 유도로 인한 온도 상승이 심해져서 추가적인 냉각이 요구되었다. 추가적인 냉각을 방지하기 위해서는 30 mA 이하, 25 mA 이하, 20 mA 이하의 전류 발생이 적절함을 확인하였다.

실시예 4. 고전압 저전류 유도를 통한 생체조직의 투명화

마우스의 전뇌 샘플을 준비하여 전기영동 장치내에서 투명화를 수행하였다.

12시간의 후 고정화 후에, 37℃ 온도에서 220 rpm으로 4시간 동안 e-DRIM 용액으로 인큐베이션하였다.

그 후에 용액에 침지시킨 상태에서 전기영동 장치(도 2)에 설치하여 고전압하에서 전류를 유도하였다.

50 V의 전압 인가 후 10 mA의 전류를 유도한 경우에는 투명화에 전기영동을 통한 투명화에 16시간이 소요되었고, 100 V의 전압 인가 후 20 mA의 전류를 유도한 경우에는 투명화에 12시간이 소요되었다.

전기영동 수행동안 투명화 과정은 도 3에 제시된 바와 같다. 200V이고 10mA 15 ^oC에서의 투명화 과정을 보여주고 있다. 이 때 투명화에는 3 시간이 소요되었다.

본 발명에 따른 투명화 방법으로 투명화된 뇌의 형광을 확인하기 위해 광학 현미경(Leica)과 Lishtsheet 현미경을 이용하여 마우스 뇌의 Yellow fluorescent protein(YFP) 신호를 확인하였다.

그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

Claims

아래 화학식으로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염; 우레아; 및 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 및 EDTA 중 1 이상을 포함하는,
생체조직 투명화용 조성물:
.
제1항에 있어서, 상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염은 2 내지 55 %(w/v)로 포함되는, 생체조직 투명화용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 우레아는 10 내지 70 %(w/v)로 포함되는, 생체조직 투명화용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 우레아는 10 내지 40 %(w/v)로 포함되는, 생체조직 투명화용 조성물.
제1항에 있어서, 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 및 EDTA 중 1 이상은 0.1 내지 100 mM로 포함되는, 생체조직 투명화용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 생체조직 투명화용 조성물은 전압 인가하에서 전류가 유도되는 조건하에서 사용되는, 생체조직 투명화용 조성물.
제1항에 따른 생체조직 투명화용 조성물 내에 생체조직을 침지하는 단계; 및
상기 조성물에 전압을 인가하여 조성물내에 전류를 유도하는 단계;를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법.
제7항에 있어서, 상기 전류는 4 내지 30 mA인, 생체조직의 투명화 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 전류를 유도하는 단계에서 10 내지 30 ℃로 유지되는, 생체조직의 투명화 방법.
제7항의 방법에 따라 생체조직을 투명화하는 단계; 및
투명화된 생체조직을 면역염색하는 단계를 포함하는,
생체조직의 면역염색 방법.
제7항의 방법에 따라 생체조직을 투명화하는 단계; 및
투명화된 생체조직 내의 타겟 단백질을 면역염색하는 단계;를 포함하는
생체조직 내의 타겟 단백질 검출 방법.
제1항의 생체조직 투명화 조성물을 이용한 현미경 관찰용 생체조직 제조방법.