KR20240121902A

KR20240121902A - 친화성 크로마토그래피에서의 숙주 세포 단백질 감소 방법

Info

Publication number: KR20240121902A
Application number: KR1020247025729A
Authority: KR
Inventors: 폴 맥도날드; 존 리차드 세인트; 마크 웡; 로베르토 팔켄슈타인; 볼프강 쾬라인; 볼프강 ??라인; 클라우스 슈벤드너; 베른하르트 슈펜스베르거; 미하엘 비드만; 프랑크 체틀; 아니카 클라인얀스; 카리나 코프; 벤자민 트렌; 라이언 에릭슨
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게; 제넨테크, 인크.
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2016-08-18
Publication date: 2024-08-09
Also published as: BR112018001511A2; JP2025031829A; US20260085090A1; ES2877532T3; JP2018531895A; HRP20211026T1; CA2992420A1; US12503487B2; AU2016312909A1; JP7610638B2; WO2017032686A1; KR102691585B1; IL257146B1; MX388197B; EP3337812B1; MX2018001536A; CN107849087A; CN107849087B; AU2016312909B2; JP2021176900A

Abstract

본 발명은 숙주 세포 단백질 함량을 감소시킴으로써 항체를 정제하는 방법을 보고하고 있다. 상기 방법은 친화성 크로마토그래피에서 저 전도도 수용액을 사용하는 세척 단계를 이용한다.

Description

친화성 크로마토그래피에서의 숙주 세포 단백질 감소 방법 {METHOD FOR THE REDUCTION OF HOST CELL PROTEINS IN AFFINITY CHROMATOGRAPHY}

본 발명은 폴리펩티드의 정제 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 항체 함유 용액 중 숙주 세포 단백질 예컨대 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린의 감소에 관한 것이다.

단백질 및 특히 면역글로불린은 현대 의학 포트폴리오에서 중요한 역할을 담당한다. 인간 적용을 위해 모든 치료 단백질은 분명한 기준을 충족해야만 한다. 인간에 대한 생물약제학적 제제의 안전성을 보장하기 위해, 제조 공정 동안 축적되는 부산물은 특히 제거되어야만 한다. 규제 규격을 충족하기 위해 하나 이상의 정제 단계가 생산 공정에 이어져야만 한다. 다른 것들 중에서, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는데 있어서 중요한 역할을 담당한다.

친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피, 단일 사슬 Fv 리간드 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (술포프로필 또는 카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 이온 교환), 황친화성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 (arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동적 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) 과 같은 상이한 방법이 잘 확립되어 있으며 단백질 정제에 널리 사용된다.

재조합적으로 생성된 면역글로불린의 정제를 위해, 종종 상이한 컬럼 크로마토그래피 단계의 조합이 이용된다. 정제 동안 비-면역글로불린 오염물 예컨대 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA 뿐 아니라 엔도톡신 및 바이러스가 감소된다. 따라서, 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계, 예컨대 단백질 A 친화성 크로마토그래피에는 하나 이상의 추가적 분리 단계가 이어진다. 일반적으로, 고 전도도 완충제는 친화성 크로마토그래피 방법의 세척 단계에서 이용되는 것으로 기재된다.

US 6,127,526 에서는 하기 단계: (a) 실리카 또는 유리를 포함하는 고체상에 고정된 단백질 A 에 단백질을 흡착시키는 단계; (b) 고체상을 소수성 전해질 용매로 세척하여 고체상에 결합된 오염물을 제거하는 단계; 및 (c) 고체상으로부터 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제하는 방법이 기재되어 있다.

WO2011/038894 에서는 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 면역글로불린 회수 전에 특이적 세척 단계에 의해 숙주 세포 단백질 및 DNA 가 확연히 감소된 단백질 A 크로마토그래피가 보고되어 있다.

WO2013/177118 에서는 샘플 매트릭스로부터의 항체의 단리 및 정제를 위한 조성물 및 방법이 보고되어 있다.

WO2013/033517 에서는 바이러스로부터 관심 폴리펩티드 (예컨대 항체) 를 분리하는 방법이 보고되어 있다.

아미노산; 또는 그의 디펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리아미노산이 하나 이상의 크로마토그래피 공정에서 사용한 완충제 용액 (평형 완충제, 세척 완충제 및 용리 완충제) 에 포함되는 하나 이상의 크로마토그래피 공정을 포함하고, 그로써 매우 소량의 불순물 (예를 들어 중합체 또는 숙주 세포 단백질) 을 갖는 고순도 단백질을 정제하는, 단백질 정제 방법이 EP2583973 에 보고되어 있다.

본원에서는 친화성 크로마토그래피 단계로 항체를 정제하여 감소된 함량의 숙주 세포 단백질을 갖는 항체를 생성하는 방법이 보고된다.

보다 상세히, 크로마토그래피 물질로부터 항체를 회수하기 전에 친화성 크로마토그래피의 세척 단계에서 저 전도도 수용액을 사용하는 본 발명의 방법에 의해, 항체를 포함하는 용액 중 특정 숙주 세포 단백질의 함량이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 포스포리파아제 (특히 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2)) 의 함량이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 항체가 IgG4 동형의 것인 경우, PLBL2 함량이 100 배 이상 감소될 수 있다는 것이 발견되었다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 숙주 세포 단백질의 함량을 감소시키기 위한 단백질 A 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도이며, 여기서 단백질 A 크로마토그래피는 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 동형 항체를 정제하는데 사용된다.

이러한 양상의 한 구현예에서 인간 IgG4 동형 항체는 P-셀렉틴에 대한 항체, 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체, 또는 IL-13 에 대한 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이다. 이러한 양상의 한 구현예에서 인간 IgG1 동형 항체는 인플루엔자 B 에 대한 항체, 또는 VEGF-A 에 대한 항체, 또는 CD22 에 대한 항체, 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체, 또는 Her2 에 대한 항체, 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체, 또는 암배아 (carcinoembryonic) 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

이러한 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다.

이러한 양상의 한 구현예에서 숙주 세포 단백질은 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린이다.

이러한 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함한다.

이러한 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함한다.

이러한 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7 이상을 갖는다.

이러한 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액 세척 단계는 고 전도도 수용액 세척 단계에 후속되거나 선행된다.

이러한 양상의 한 구현예에서 고 전도도 수용액은 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는다.

이러한 양상의 한 구현예에서 중간 세척 단계는 저 전도도 수용액 세척 단계와 고 전도도 수용액 세척 단계 사이에서 중간 전도도 수용액으로 수행된다.

이러한 양상의 한 구현예에서 중간 전도도 수용액은 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는다.

이러한 양상의 한 구현예에서 고 (또는 중간) 전도도 수용액은 히스티딘을 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 생성 방법이다:

a) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 회수하는 단계,

c) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 단백질 A 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

d) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계,

e) 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 회수하고,

그로써 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 단계.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 정제 방법이다:

a) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

b) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 단백질 A 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는 단계.

모든 양상의 한 구현예에서 인간 IgG4 동형 항체는 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이다. 모든 양상의 한 구현예에서 인간 IgG1 동형 항체는 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체, 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다.

모든 양상의 한 구현예에서 숙주 세포 단백질의 함량은 감소되고 (특이적) 숙주 세포 단백질은 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린이다.

모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함한다.

모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함한다.

모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7 이상을 갖는다.

모든 방법 양상의 한 구현예에서 방법은 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함한다.

모든 양상의 한 구현예에서 고 전도도 수용액은 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는다.

모든 양상의 한 구현예에서 중간 전도도 수용액은 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는다.

모든 양상의 한 구현예에서 고 또는 중간 전도도 수용액은 히스티딘을 포함한다.

발명의 상세한 설명

친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는 개선된 친화성 크로마토그래피 방법 및 용도가 보고된다.

저 전도도 수용액으로의 세척 단계가 친화성 크로마토그래피 단계, 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피 단계에서 사용되는 경우, 특이적 숙주 세포 단백질이 저 전도도 수용액으로의 세척 단계로 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 친화성 크로마토그래피 단계는 항체에 대한 정제 또는 생성 방법에서 사용된다. 저 전도도 수용액 세척 단계는 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 의 함량을 감소시키는데 특히 효과적이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, (특이적) 숙주 세포 단백질의 함량을 감소시키기 위한 친화성 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 인간 IgG 동형 항체의 생성 방법이다:

a) 인간 IgG 동형 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 인간 IgG 동형 항체를 회수하는 단계,

c) 인간 IgG 동형 항체 (를 포함하는 용액) 를 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

d) 90% 이상의 이중특이적 항체가 친화성 크로마토그래피 물질에 결합되어 있게 하면서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계,

e) 친화성 크로마토그래피 물질로부터 인간 IgG 동형 항체를 회수하고,

그로써 인간 IgG 동형 항체를 생성하는 단계.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 인간 IgG 동형 항체의 정제 방법이다:

a) 인간 IgG 동형 항체를 포함하는 (완충된 수성) 샘플을 제공하는 단계,

b) 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 친화성 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG 동형 항체를 정제하는 단계.

CHO 세포에서 생성된 재조합 폴리펩티드를 본원에 기재된 방법에 따라 정제하여, 숙주 세포 단백질을 제거하거나 수준을 감소시킬 수 있다.

예시적 재조합 폴리펩티드는 치료 항체 및 면역접합체 (immunoadhesin), 예컨대 비제한적으로, 하기 항원 중 하나 이상에 대한 항체 단편을 비롯한 항체를 포함한다: HER1 (EGFR), HER2 (예를 들어, 트라스투주맙, 퍼투주맙), HER3, HER4, VEGF (예를 들어, 베바시주맙, 라니비주맙), MET (예를 들어, 오나르투주맙), CD20 (예를 들어, 리툭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙), CD22, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, ICAM, VLA-4, VCAM, IL-17A 및/또는 F, IgE (예를 들어, 오말리주맙), DRS, CD40, Apo2L/TRAIL, EGFL7 (예를 들어, 파르사투주맙), NRP1, 인테그린 베타7 (예를 들어, 에트롤리주맙), IL-13 (예를 들어, 레브리키주맙), Abeta (예를 들어, 크레네주맙, 간테네루맙), P-셀렉틴 (예를 들어, 인클라쿠맙), IL-6R (예를 들어, 토실루주맙), IFNa (예를 들어, 론탈리주맙), M1prime (예를 들어, 퀼리주맙), 미코겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK), OX40L, TSLP, 인자 D (예를 들어, 람팔리주맙) 및 수용체 예컨대: IL-9 수용체, IL-5 수용체, IL-4수용체 알파, IL-13수용체알파1 및 IL-13수용체알파2, OX40, TSLP-R, IL-7R 알파 (TSLP 에 대한 보조-수용체), IL17RB (IL-25 에 대한 수용체), ST2 (IL-33 에 대한 수용체), CCR3, CCR4, CRTH2, FcepsilonRI 및 FcepsilonRII/CD23 (IgE 에 대한 수용체). 다른 예시적 항체는 비제한적으로, 항에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항카텝신 D 항체, 항Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CDllc 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-사이토케라틴 항체, 항비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항S-100 항체, 항-tau 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항Tn- 항원 항체에서 선택되는 것들을 포함한다.

일부 구현예에서, 예시적 항체는 Abeta 에 대한 항체, IL17 A/F 에 대한 항체 및 CMV 에 대한 항체를 포함한다. 예시적 항-Abeta 항체 및 이러한 항체의 생성 방법은 예를 들어 W02008011348, W02007068429, W02001062801 및 W02004071408 에서 이전에 기재된 바 있다. 예시적 항-IL17 A/F 항체 및 이러한 항체의 생성 방법은 예를 들어 WO 2009136286 및 U.S. 특허 번호 8,715,669 에서 이전에 기재된 바 있다. 항-CMV-MSL 을 비롯한 예시적 항-CMV 항체, 및 이러한 항체의 생성 방법은 예를 들어 WO 2012047732 에서 이전에 기재된 바 있다.

일부 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 인간 IgG 동형 항체를 정제하는데 사용된다. 일부 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 IgG4 항체를 정제하는데 사용된다. 한 구현예에서 IgG4 동형 항체는 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 (이중특이적) 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이다. 일부 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용된다. 한 구현예에서 IgG1 동형 항체는 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 (이중특이적) 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 동형 항체 (함유 용액) 의 생성 방법이다:

a) 인간 IgG4 동형 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 인간 IgG4 동형 항체를 회수하는 단계,

c) 인간 IgG4 동형 항체를 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

d) 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계,

e) 친화성 크로마토그래피 물질로부터 인간 IgG4 동형 항체를 회수하고,

그로써 인간 IgG4 동형 항체를 생성하는 단계.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 IgG4 동형 항체 (함유 용액) 의 생성 방법이다:

a) IgG4 동형 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,

b) 세포 또는 배양 배지로부터 IgG4 동형 항체를 회수하는 단계,

c) IgG4 동형 항체를 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

e) 친화성 크로마토그래피 물질로부터 IgG4 동형 항체를 회수하고,

그로써 IgG4 동형 항체를 생성하는 단계.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 인간 IgG4 동형 항체의 정제 방법이다:

a) 인간 IgG4 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

b) 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 친화성 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 동형 항체를 정제하는 단계.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은, 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 IgG4 동형 항체의 정제 방법이다:

a) IgG4 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

b) 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 친화성 크로마토그래피 방법/단계로 IgG4 동형 항체를 정제하는 단계.

세척 단계에서 사용한 수용액의 전도도가 낮은 경우, 즉 저 전도도 수용액이 세척에 사용되는 경우, 숙주 세포 단백질 함량이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 1 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다. 모든 양상의 한 바람직한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.03 μS/㎝ 내지 약 0.5 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.05 μS/㎝ 내지 약 0.35 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는다. 모든 양상의 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 탈이온수이다. 일부 적용에 대해 탈이온수는 세척 단계에서 사용하기에 적합하지 않다. 일부 구현예에서 저 전도도 수용액은 탈이온수가 아니다.

단백질 A 친화성 크로마토그래피가 본원에서 보고한 바와 같은 목적에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 모든 양상의 한 바람직한 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 친화성 크로마토그래피이다. 한 구현예에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 MabSelectSure 친화성 크로마토그래피, ProSep vA 친화성 크로마토그래피, Poros Mab Capture A 친화성 크로마토그래피, ProSep Ultra Plus 친화성 크로마토그래피, MabSelect SuRe LX, MabSelect, Eshmuno A, Toyopearl AF-rProtein A-650F; Toyopearl AF-rProtein A HC-650HF 를 포함하는 군에서 선택된다. 한 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 단백질 G 친화성 크로마토그래피이다. 한 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 리간드로서 재조합 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피인데, 이는 친화성 크로마토그래피가 재조합 단백질 리간드 친화성 크로마토그래피라는 것을 의미한다. 한 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 리간드로서 단일 사슬 Fv 를 사용하는 친화성 크로마토그래피인데, 이는 친화성 크로마토그래피가 단일 사슬 Fv 리간드 친화성 크로마토그래피라는 것을 의미한다. 한 구현예에서 친화성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 돌연변이화된 단백질 A 또는 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 단백질 A 의 단편을 포함한다.

(특이적) 숙주 세포 단백질 함량이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 특히 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 함량이 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 (특이적) 숙주 세포 단백질은 중국 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포 단백질이다. 모든 양상의 한 바람직한 구현예에서 (특이적) 숙주 세포 단백질은 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린이다. 한 구현예에서 (특이적) 숙주 세포 단백질은 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 이다.

저 전도도 수용액이 특정 완충 물질 예를 들어 Tris 또는 인산칼륨을 낮은 양으로 포함할 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 을 함유한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM Tris 를 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mM 내지 약 6.5 mM Tris 를 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 2 mM Tris 를 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 인산칼륨을 함유한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.05 mM 내지 약 5 mM 인산칼륨을 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mM 인산칼륨을 포함한다.

저 전도도 수용액이 특정 pH 를 갖는 경우, 숙주 세포 단백질 함량 감소의 효과가 표명된다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7 이상을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7.5 이상을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7 내지 약 pH 9.5 를 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5 를 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 8 을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 9 를 갖는다.

저 전도도 수용액의 pH 가 약 8.5 이상이고 저 전도도 수용액이 약 1.2 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는 경우, 숙주 세포 단백질 함량 감소의 효과가 또한 이루어질 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 8.5 이상을 가지며 저 전도도 수용액은 약 1.2 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 8.5 이상을 가지며 저 전도도 수용액은 약 1 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 8.5 이상을 가지며 저 전도도 수용액은 약 55 mM 이하 Tris 를 포함한다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액은 약 pH 8.5 이상을 가지며 저 전도도 수용액은 약 30 mM 이하 Tris 를 포함한다.

한 구현예에서 저 전도도 수용액은 pH 범위가 pH 7 내지 pH 8.5 미만이고 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 가지며 pH 8.5 이상의 값에서 약 1.2 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는다.

예를 들어 친화성 크로마토그래피 단계와 같은 정제 단계 전의 PLBL2 의 로딩량과 비교하는 경우, 본원에서 보고한 바와 같은 용도 및 방법에 의해 숙주 세포 단백질 예컨대 PLBL2 의 함량이 특정 수준으로 감소될 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 20 배 이상 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 40 배 이상 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 50 배 이상 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 90 배 이상 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 100 배 이상 감소된다. 일부 경우, 감소 수준은 더 높다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 200 배 이상 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 250 배 이상 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 300 배 이상 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 는 400 배 이상 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 1000 배 이상 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 적어도 50% 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 적어도 66% 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 적어도 80% 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 적어도 90% 감소된다. 한 구현예에서 PLBL2 의 함량은 적어도 95% 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 항체 1 mg 당 10 ng 미만으로 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 항체 1 mg 당 5 ng 미만으로 감소된다. 일부 구현예에서 PLBL2 의 함량은 항체 1 mg 당 2 ng 미만으로 감소된다.

본원에서 보고한 바와 같은 방법 및 용도에서, 추가 세척 단계가 중간 및/또는 고 전도도 수용액과 함께 이용될 수 있다. 한 구현예에서 저 전도도 수용액 세척 단계는 고 전도도 수용액 세척 단계에 후속되거나 선행된다. 한 구현예에서 고 전도도 수용액은 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 고 전도도 수용액은 약 20 mS/㎝ 내지 약 100 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는다. 한 구현예에서 중간 세척 단계는 저 전도도 수용액 세척 단계와 고 전도도 수용액 세척 단계 사이에서 중간 전도도 수용액으로 수행된다. 한 구현예에서 중간 전도도 수용액은 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는다.

높은 또는 중간 전도도 수용액이 아미노산을 추가로 포함하는 경우, 숙주 세포 단백질 감소 효과가 개선될 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 높은 또는 중간 전도도 수용액은 아미노산을 포함한다. 한 구현예에서 높은 또는 중간 전도도 수용액은 히스티딘 또는 아르기닌을 포함한다. 한 구현예에서 높은 또는 중간 전도도 수용액은 히스티딘을 포함한다. 한 구현예에서 높은 또는 중간 전도도 수용액은 히스티딘 및 Tris 를 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 방법 및 용도는 하나 이상의 추가 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 한 구현예에서 하나 이상의 추가적 크로마토그래피 방법/단계가 수행된다. 한 구현예에서 추가적 이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행된다. 한 구현예에서 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행된다. 한 구현예에서 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계 및 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행된다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 사용이 생략될 수 있다는 것이 발견되었다. 한 구현예에서 용도 또는 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법/단계가 없다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양상은 PLBL2 또는 클루스테린 함량을 감소시키기 위한 단백질 A 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도이며, 여기서 단백질 A 크로마토그래피는 IgG4 또는 IgG1 동형, 예를 들어, 인간 IgG4 또는 IgG1, 항체를 정제하는데 사용되고, 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값 및 약 pH 7 이상을 갖는다.

한 양상은 PLBL2 또는 클루스테린 함량을 감소시키기 위한 단백질 A 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도이며, 여기서 단백질 A 크로마토그래피는 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용되고, 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값 및 약 pH 7 이상을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG4 동형 항체, 예를 들어, P-셀렉틴에 대한 항체, 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체, 또는 IL-13 에 대한 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 동형 항체, 예를 들어, 인플루엔자 B 에 대한 항체, 또는 VEGF-A 에 대한 항체, 또는 CD22 에 대한 항체, 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체, 또는 Her2 에 대한 항체, 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체, 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

한 양상에서, 본 개시물은 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 생성 방법을 제공하며:

c) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

d) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계,

e) 친화성 크로마토그래피 물질로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 회수하고,

그로써 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 단계,

여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값 및 약 pH 7 이상을 갖는다.

그로써 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 단계,

여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값 및 약 pH 7 이상을 갖고,

인간 IgG4 동형 항체는 P-셀렉틴에 대한 항체, 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체, 또는 IL-13 에 대한 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이고, 인간 IgG1 동형 항체는 인플루엔자 B 에 대한 항체, 또는 VEGF-A 에 대한 항체, 또는 CD22 에 대한 항체, 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체, 또는 Her2 에 대한 항체, 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체, 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

한 양상에서, 본 개시물은 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 정제 방법을 제공하며:

b) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는 단계,

인간 IgG4 동형 항체는 P-셀렉틴에 대한 항체, 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체, 또는 IL-13 에 대한 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체이고, 인간 IgG1 동형 항체는 인플루엔자 B 에 대한 항체, 또는 VEGF-A 에 대한 항체, 또는 CD22 에 대한 항체, 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 항체, 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체, 또는 Her2 에 대한 항체, 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체, 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체이다.

한 양상에서, 본 개시물은 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 동형 항체의 생성 방법을 제공하며:

c) 인간 IgG4 동형 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

그로써 인간 IgG4 동형 항체를 생성하는 단계,

인간 IgG4 동형 항체는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체이다.

한 양상에서, 본 개시물은 하기 단계를 포함하는 샘플로부터의 인간 IgG4 동형 항체의 정제 방법을 제공하며:

a) 인간 IgG4 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

b) 단백질 A 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 것을 포함하는, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 동형 항체를 정제하는 단계,

인간 IgG4 동형 항체는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체이다.

용어 "항-P-셀렉틴 항체" 및 "P-셀렉틴에 결합하는 항체" 또는 "P-셀렉틴에 대한 항체" 는 충분한 친화성으로 P-셀렉틴에 결합할 수 있어, P-셀렉틴을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용한 항체를 나타낸다. 한 구현예에서, 관련되지 않은, 비- P-셀렉틴 단백질에 대한 항-P-셀렉틴 항체의 결합 정도는 예를 들어 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, P-셀렉틴에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 항- P-셀렉틴 항체는 상이한 종으로부터의 P-셀렉틴 중에서 보존되는 P-셀렉틴의 에피토프에 결합한다. 상기는 또한 용어 "인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체" 또는 "IL-13 에 대한 항체" 또는 "아밀로이드 베타에 대한 항체" 등에도 적용된다.

일부 구현예에서, P-셀렉틴에 대한 항체는 WO 2005/100402 또는 SEQ ID NO: 07 ~ 12 에서 기재된 바와 같은 인클라쿠맙 (IgG4 동형) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체, 예를 들어 WO 2012/067176 에서 기재된 바와 같은 항-FIXa/X 항체 (IgG4 동형) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 Her2 에 대한 항체, 예를 들어 WO 1992/022653 에서 기재된 바와 같은 트라스투주맙 (IgG1 동형) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 안지오포이에틴 2 (Ang2) 및 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A) 에 대한 이중특이적 항체, 예를 들어 WO 2011/117329 또는 SEQ ID NO: 01 ~ 04 에서 기재된 바와 같은 바누시주맙 (IgG1 동형) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 아밀로이드 베타에 대한 항체, 예를 들어 WO 2003/070760 또는 SEQ ID NO: 05 ~ 06 에서 기재된 바와 같은 간테네루맙 (IgG1 동형), 또는 크레네주맙 (IgG4 동형) 이다. 일부 구현예에서, 항체는 CD22 에 대한 항체, IL13 에 대한 항체 (예를 들어, 레브리키주맙), Her3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체 (예를 들어, 둘리고투주맙), VEGF-A 에 대한 항체 (예를 들어, 베바시주맙), 및 인플루엔자 B 에 대한 항체이다. 용어 VEGF 또는 VEGF-A 는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 은 시험관내 (in-vitro) 검정, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 공정 (SPR, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 나타낸다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), k_d (해리 상수) 및 K_D (k_d/k_a) 에 의해 정의된다. '결합하는' 또는 '특이적으로 결합하는' 은 10^-7mol/L 이하의 결합 친화성 (K_D) 을 의미한다.

본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조, 예컨대 비제한적으로 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 비제한적으로, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. Fab 단편은 (전장/전체) 항체의 파파인 소화에 의해 수득된 항체 단편이다.

"이중특이적 항체" 는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "이중특이적" 항체는 각각 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종류로부터 유래하는 한편, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄가 상이한 공급원 또는 종류로부터 유래하는 항체를 나타낸다.

항체의 "클래스" 는 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변부의 유형을 나타낸다. 항체의 5 개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위클래스 (동형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂ 로 더 분화될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.

용어 "인간 IgG 동형 항체" 는 인간 야생형 IgG 동형에서 유래하는 불변부를 포함하는 항체를 나타내는데, 즉 예를 들어 이는 돌연변이, 예를 들어 P329G 돌연변이 (Kabat 에 따른 번호화) 를 갖는 인간 IgG 동형에서 유래한 불변부를 포함할 수 있다.

용어 "인간 IgG4 동형 항체" 는 인간 야생형 IgG4 동형에서 유래하는 불변부를 포함하는 항체를 나타내는데, 즉 예를 들어 이는 돌연변이, 예를 들어 P329G 돌연변이 및/또는 S228P, L235E 돌연변이 (Kabat 에 따른 번호화) 를 갖는 인간 IgG4 동형에서 유래한 불변부를 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "Fc-부위" 는 불변부의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다. 용어는 자연적 (native) 서열 Fc-부위 및 변이체 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단으로 확장된다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 또는 C-말단 글리실-리신 디펩티드 (Gly446Lys447) 는 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 다르게 명시되지 않는 한, Fc-부위 또는 불변부에서의 아미노산 잔기의 번호화는, Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에서 기재하는 바와 같은, EU 지표로도 지칭하는 EU 번호화 시스템에 따른다.

"골격" 또는 "FR" 은 과가변부 (HVR) 잔기 외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기 서열에서 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환가능하게 사용되며, 세포의 자손을 포함하는, 외인성 핵산이 도입되는 세포를 나타낸다. 숙주 세포는 1 차 형질전환된 세포 및 계대 수와 관계없이 이로부터 유래한 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 용어 "세포" 는 핵산의 발현에 사용되는 세포를 포함한다. 한 구현예에서 숙주 세포는 CHO 세포 (예를 들어 CHO K1, CHO DG44), 또는 BHK 세포, 또는 NS0 세포, 또는 SP2/0 세포, 또는 HEK 293 세포, 또는 HEK 293 EBNA 세포, 또는 PER.C6® 세포, 또는 COS 세포이다. 또 다른 구현예에서 세포는 CHO 세포, 또는 BHK 세포, 또는 PER.C6® 세포이다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 표현 "세포" 는 대상 세포 및 이의 자손을 포함한다.

용어 "세척" 은 크로마토그래피 물질로부터 비-특이적으로 결합한 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 화합물을 제거하기 위해, 특히 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA 를 제거하기 위해, 친화성 크로마토그래피 물질에 용액을 적용하는 것을 나타낸다. 용어 "세척" 은 친화성 크로마토그래피 물질로부터의 결합 물질 용리를 포함하지 않는다.

상이한 방법이 잘 확립되어 있으며 단백질 회수 및 정제에 널리 사용되고 있다 {예컨대 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 리간드로서 재조합 단백질을 사용하는 (예를 들어 리간드로서 단일 사슬 Fv, 예를 들어 Kappa select) 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 황친화성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동)}. 이들 방법은 본원에 보고한 바와 같은 상이한 구현예에서 독립적으로 조합될 수 있다.

용어 "단백질 A" 는 천연 공급원으로부터 수득되거나 합성적으로 생성된 단백질 A 폴리펩티드를 나타낸다.

용어 "단백질 A 크로마토그래피 물질" 은 단백질 A 가 공유 연결되는 불활성 고체상을 나타낸다.

한 구현예에서 단백질 A 크로마토그래피 물질은 MabSelectSure, ProSep vA, Mab Capture A, ProSep Ultra Plus, Mab Select, Mab Select Xtra, Poros A 또는 ProSep A 에서 선택된다.

용어 "고 전도도 수용액" 은 고 전도도 값을 갖는 수용액을 나타낸다. 전도도 값은 약 20 mS/㎝ 이상일 수 있다.

용어 "중간 전도도 수용액" 은 중간 전도도 값을 갖는 수용액을 나타낸다. 전도도 값은 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만일 수 있다.

용어 "저 전도도 수용액" 은 저 전도도 값을 갖는 수용액을 나타낸다. 전도도 값은 약 0.5 mS/㎝ 이하일 수 있다. pH 가 약 8.5 이상인 경우, 전도도 값은 약 1.2 mS/㎝ 이하일 수 있다. 전도도 값은 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 측정될 수 있다.

하기 실시예 및 순서를 제공하여 본 발명의 이해를 도우며, 이의 참된 범주를 첨부된 특허청구범위에서 나타낸다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.

본 발명의 특정 구현예

1. 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키기 위한 친화성 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도.

2. 구현예 1 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 인간 IgG 동형 항체를 정제하는데 사용되는 용도.

3. 구현예 2 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용되는 용도.

4. 구현예 3 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 그의 Fab 단편에서 글리코실화된 글리코실화 부위를 갖지 않는/정확히 1 개의 글리코실화 부위를 갖는 (위치 Asn 297 에서 (Kabat 에 따른 번호화)) 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용되는 용도.

5. 구현예 4 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는 용도.

6. 구현예 5 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.03 μS/㎝ 내지 약 0.5 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 용도.

7. 구현예 5 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 μS/㎝ 내지 약 0.35 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 용도.

8. 구현예 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 탈이온수가 아닌 용도.

9. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 또는 단일 사슬 Fv 리간드 (KappaSelect) 친화성 크로마토그래피인 용도.

10. 구현예 9 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피인 용도.

11. 구현예 10 에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 MabSelectSure 친화성 크로마토그래피, ProSep vA 친화성 크로마토그래피, Poros Mab Capture A 친화성 크로마토그래피, ProSep Ultra Plus 친화성 크로마토그래피, MabSelect SuRe LX, MabSelect, Eshmuno A, Toyopearl AF-rProtein A-650F; Toyopearl AF-rProtein A HC-650HF 를 포함하는 군에서 선택되는 용도.

12. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포 단백질이 중국 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포 단백질인 용도.

13. 구현예 12 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제인 용도.

14. 구현예 13 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 A, 포스포리파아제 B, 포스포리파아제 C 또는 포스포리파아제 D 인 용도.

15. 구현예 12, 13 또는 14 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 인 용도.

16. 구현예 12 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린인 용도.

17. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 을 함유하는 용도.

18. 구현예 17 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 10 mM Tris 를 포함하는 용도.

19. 구현예 18 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함하는 용도.

20. 구현예 19 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 내지 약 6.5 mM Tris 를 포함하는 용도.

21. 구현예 20 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 2 mM Tris 를 포함하는 용도.

22. 구현예 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 인산칼륨을 함유하는 용도.

23. 구현예 22 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 mM 내지 약 5 mM 인산칼륨을 포함하는 용도.

24. 구현예 23 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함하는 용도.

25. 구현예 24 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 인산칼륨을 포함하는 용도.

26. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 이상을 갖는 용도.

27. 구현예 26 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 이상을 갖는 용도.

28. 구현예 27 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 내지 약 pH 9.5 를 갖는 용도.

29. 구현예 28 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5 를 갖는 용도.

30. 구현예 29 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 8 을 갖는 용도.

31. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액 세척 단계가 고 전도도 수용액 세척 단계에 후속되거나 선행되는 용도.

32. 구현예 31 에 있어서, 저 전도도 수용액 세척 단계가 고 전도도 수용액 세척 단계에 후속되는 용도.

33. 구현예 31 에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는 용도.

34. 구현예 33 에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 내지 약 100 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 용도.

35. 구현예 31 에 있어서, 중간 세척 단계가 저 전도도 수용액 세척 단계와 고 전도도 수용액 세척 단계 사이에서 중간 전도도 수용액으로 수행되는 용도.

36. 구현예 35 에 있어서, 중간 전도도 수용액이 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는 용도.

37. 구현예 33 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 아미노산을 포함하는 용도.

38. 구현예 37 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘을 포함하는 용도.

39. 구현예 37 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘 및 Tris 를 포함하는 용도.

40. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 추가적 크로마토그래피 방법/단계가 수행되는 용도.

41. 구현예 40 에 있어서, 추가적 이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행되는 용도.

42. 구현예 41 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행되는 용도.

43. 구현예 40 에 있어서, 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행되는 용도.

44. 구현예 40 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계 및 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 수행되는 용도.

45. 구현예 40 에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법/단계를 갖지 않는 용도.

46. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG4 동형 항체가 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체인 용도.

47. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG1 동형 항체가 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 항체인 용도.

48. 하기 단계를 포함하는 인간 IgG 동형 항체의 생성 방법:

c) 인간 IgG 동형 항체를 친화성 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,

그로써 인간 IgG 동형 항체를 생성하는 단계.

49. 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 동형 항체의 생성 방법:

그로써 인간 IgG4 동형 항체를 생성하는 단계.

50. 구현예 48 에 있어서, 인간 IgG 동형 항체가 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체인 방법.

51. 구현예 48 에 있어서, 인간 IgG 동형 항체가 그의 Fab 단편에서 글리코실화된 글리코실화 부위를 갖지 않는/정확히 1 개의 글리코실화 부위를 갖는 (위치 Asn 297 에서 (Kabat 에 따른 번호화)) 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체인 방법.

52. 구현예 48 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는 방법.

53. 구현예 52 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.03 μS/㎝ 내지 약 0.5 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

54. 구현예 53 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 μS/㎝ 내지 약 0.35 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

55. 구현예 54 에 있어서, 저 전도도 수용액이 탈이온수가 아닌 방법.

56. 구현예 48 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 또는 단일 사슬 Fv 리간드 (KappaSelect) 친화성 크로마토그래피인 방법.

57. 구현예 56 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피인 방법.

58. 구현예 56 에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 MabSelectSure 친화성 크로마토그래피, ProSep vA 친화성 크로마토그래피, Poros Mab Capture A 친화성 크로마토그래피, ProSep Ultra Plus 친화성 크로마토그래피, MabSelect SuRe LX, MabSelect, Eshmuno A, Toyopearl AF-rProtein A-650F; Toyopearl AF-rProtein A HC-650HF 를 포함하는 군에서 선택되는 방법.

59. 구현예 48 또는 49 에 있어서, 숙주 세포 단백질의 함량이 감소되는 방법.

60. 구현예 59 에 있어서, 상기 숙주 세포 단백질이 중국 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포 단백질인 방법.

61. 구현예 60 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제인 방법.

62. 구현예 61 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 A, 포스포리파아제 B, 포스포리파아제 C 또는 포스포리파아제 D 인 방법.

63. 구현예 62 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 인 방법.

64. 구현예 60 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린인 방법.

65. 구현예 48 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 을 함유하는 방법.

66. 구현예 65 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 10 mM Tris 를 포함하는 방법.

67. 구현예 66 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함하는 방법.

68. 구현예 67 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 내지 약 6.5 mM Tris 를 포함하는 방법.

69. 구현예 68 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 2 mM Tris 를 포함하는 방법.

70. 구현예 65 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 인산칼륨을 함유하는 방법.

71. 구현예 70 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.2 mM 내지 약 5 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

72. 구현예 71 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

73. 구현예 72 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

74. 구현예 48 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 이상을 갖는 방법.

75. 구현예 74 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 이상을 갖는 방법.

76. 구현예 75 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 내지 약 pH 9.5 를 갖는 방법.

77. 구현예 76 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5 를 갖는 방법.

78. 구현예 77 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 8 을 갖는 방법.

79. 구현예 48 또는 49 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

80. 구현예 79 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

81. 구현예 79 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

82. 구현예 79 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

83. 구현예 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는 방법.

84. 구현예 83 에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 내지 약 100 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

85. 구현예 81 또는 82 에 있어서, 중간 전도도 수용액이 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는 방법.

86. 구현예 79 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 아미노산을 포함하는 방법.

87. 구현예 86 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘을 포함하는 방법.

88. 구현예 86 또는 87 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘 및 Tris 를 포함하는 방법.

89. 구현예 48 또는 49 에 있어서, 하나 이상의 추가적 크로마토그래피 방법/단계가 단계 e) 후에 수행되는 방법.

90. 구현예 89 에 있어서, 추가적 이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 e) 후에 수행되는 방법.

91. 구현예 90 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 e) 후에 수행되는 방법.

92. 구현예 90 에 있어서, 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 e) 후에 수행되는 방법.

93. 구현예 90 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계 및 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 e) 후에 수행되는 방법.

94. 구현예 48 또는 49 에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법/단계를 갖지 않는 방법.

95. 구현예 49 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG4 동형 항체가 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체인 방법.

96. 구현예 48 또는 50 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 인간 IgG1 동형 항체가 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 항체인 방법.

97. 하기 단계를 포함하는, 샘플로부터의 인간 IgG 동형 항체의 정제 방법:

a) 인간 IgG 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,

98. 구현예 97 에 있어서, 인간 IgG 동형 항체가 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체인 방법.

99. 구현예 98 에 있어서, 인간 IgG 동형 항체가 그의 Fab 단편에서 글리코실화된 글리코실화 부위를 갖지 않는/정확히 1 개의 글리코실화 부위를 갖는 (위치 Asn 297 에서 (Kabat 에 따른 번호화)) 인간 IgG4 동형 항체 또는 인간 IgG1 동형 항체인 방법.

100. 구현예 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는 방법.

101. 구현예 100 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.03 μS/㎝ 내지 약 0.5 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

102. 구현예 101 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 μS/㎝ 내지 약 0.35 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

103. 구현예 102 에 있어서, 저 전도도 수용액이 탈이온수가 아닌 방법.

104. 구현예 97 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 또는 단일 사슬 Fv 리간드 (KappaSelect) 친화성 크로마토그래피인 방법.

105. 구현예 104 에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피인 방법.

106. 구현예 105 에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 MabSelectSure 친화성 크로마토그래피, ProSep vA 친화성 크로마토그래피, Poros Mab Capture A 친화성 크로마토그래피, ProSep Ultra Plus 친화성 크로마토그래피, MabSelect SuRe LX, MabSelect, Eshmuno A, Toyopearl AF-rProtein A-650F; Toyopearl AF-rProtein A HC-650HF 를 포함하는 군에서 선택되는 방법.

107. 구현예 97 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포 단백질의 함량이 감소되는 방법.

108. 구현예 107 에 있어서, 상기 숙주 세포 단백질이 중국 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포 단백질인 방법.

109. 구현예 108 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제인 방법.

110. 구현예 109 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 A, 포스포리파아제 B, 포스포리파아제 C 또는 포스포리파아제 D 인 방법.

111. 구현예 110 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 인 방법.

112. 구현예 107 에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린인 방법.

113. 구현예 97 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 을 함유하는 방법.

114. 구현예 113 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 10 mM Tris 를 포함하는 방법.

115. 구현예 114 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함하는 방법.

116. 구현예 115 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 내지 약 6.5 mM Tris 를 포함하는 방법.

117. 구현예 116 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 2 mM Tris 를 포함하는 방법.

118. 구현예 113 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 인산칼륨을 함유하는 방법.

119. 구현예 118 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.2 mM 내지 약 5 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

120. 구현예 119 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.2 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

121. 구현예 120 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.5 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.

122. 구현예 97 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 이상을 갖는 방법.

123. 구현예 122 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 이상을 갖는 방법.

124. 구현예 123 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 내지 약 pH 9.5 를 갖는 방법.

125. 구현예 124 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5 를 갖는 방법.

126. 구현예 125 에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 8 을 갖는 방법.

127. 구현예 97 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

128. 구현예 127 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

129. 구현예 127 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

130. 구현예 127 에 있어서, 친화성 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.

131. 구현예 127 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는 방법.

132. 구현예 131 에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 내지 약 100 mS/㎝ 의 전도도 값을 갖는 방법.

133. 구현예 129 또는 130 에 있어서, 중간 전도도 수용액이 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는 방법.

134. 구현예 127 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 아미노산을 포함하는 방법.

135. 구현예 134 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘을 포함하는 방법.

136. 구현예 134 에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘 및 Tris 를 포함하는 방법.

137. 구현예 97 또는 98 에 있어서, 하나 이상의 추가적 크로마토그래피 방법/단계가 단계 b) 후에 수행되는 방법.

138. 구현예 137 에 있어서, 추가적 이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 b) 후에 수행되는 방법.

139. 구현예 138 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 b) 후에 수행되는 방법.

140. 구현예 138 에 있어서, 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 b) 후에 수행되는 방법.

141. 구현예 138 에 있어서, 추가적 음이온 교환 크로마토그래피 방법/단계 및 추가적 양이온 교환 크로마토그래피 방법/단계가 단계 b) 후에 수행되는 방법.

142. 구현예 97 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법/단계를 갖지 않는 방법.

143. 구현예 97 또는 98 에 있어서, 인간 IgG4 동형 항체가 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체인 방법.

144. 구현예 97 또는 98 에 있어서, 인간 IgG1 동형 항체가 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 (이중특이적) 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체인 방법.

145. 단백질 A 크로마토그래피가 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용되고 저 전도도 수용액이 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는, 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키기 위한 단백질 A 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도.

146. 하기 단계를 포함하는 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 생성 방법:

d) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계 (여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 가짐),

그로써 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 단계.

147. 하기 단계를 포함하는, 샘플로부터의 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체의 정제 방법:

b) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액 (여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 가짐) 으로 세척하는 것을 포함하는, 단백질 A 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는 단계.

148. 구현예 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 저 전도도 수용액이 탈이온수인 용도.

149. 구현예 54 에 있어서, 저 전도도 수용액이 탈이온수인 방법.

서열 목록의 기재

SEQ ID NO: 01 <VEGF> 의 가변 중쇄 도메인 VH

SEQ ID NO: 02 <VEGF> 의 가변 경쇄 도메인 VL

SEQ ID NO: 03 <ANG-2> 의 가변 중쇄 도메인 VH

SEQ ID NO: 04 <ANG-2> 의 가변 경쇄 도메인 VL

SEQ ID NO: 05 항-아밀로이드 베타 항체 (IgG1 동형) 의 가변 중쇄 도메인 VH

SEQ ID NO: 06 항-아밀로이드 베타 항체 (IgG1 동형) 의 가변 경쇄 도메인 VL

SEQ ID NO: 07 항-P-셀렉틴 항체의 가변 중쇄 도메인 VH1

SEQ ID NO: 08 항-P-셀렉틴 항체의 가변 중쇄 도메인 VH2

SEQ ID NO: 09 항-P-셀렉틴 항체의 가변 중쇄 도메인 VH3

SEQ ID NO: 10 항-P-셀렉틴 항체의 가변 경쇄 도메인 VL1

SEQ ID NO: 11 항-P-셀렉틴 항체의 가변 경쇄 도메인 VL2

SEQ ID NO: 12 항-P-셀렉틴 항체의 가변 경쇄 도메인 VL3

실시예 1

물질 및 방법

항체

P-셀렉틴에 대한 항체 (항-P-셀렉틴 항체; 인클라쿠맙; IgG4 동형) (WO 2005/100402 또는 SEQ ID NO: 07 ~ SEQ ID NO: 12 에서 기재된 바와 같음); 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 이중특이적 항체 (항-FIXa/X 항체; IgG4 동형) (WO 2012/067176 에 기재된 바와 같음); Her2 에 대한 항체; Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 (항-Ang2/VEGF-A 항체; 바누시주맙; IgG1 동형) (WO 2011/117329 또는 SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 04 에 기재된 바와 같음); 아밀로이드 베타에 대한 항체 (항-아밀로이드 베타 항체; 간테네루맙; IgG1 동형) (WO 2003/070760 또는 SEQ ID NO: 05 ~ SEQ ID NO: 06 에서 기재된 바와 같음) 를 포함하는 다수의 예시적 항체를 사용하여 본 발명을 예시한다. 하기 실시예에서 기재된 바와 같은 다수의 IgG1 항체 및 IgG4 항체가 또한 본원에 포함된다.

전체 숙주 세포 단백질 (HCP), 포스포리파아제 B-유사 2 단백질 (PLBL2) 및 클루스테린에 대한 검출 방법

a) CHO HCP 검정

방법 샘플에서의 잔류 CHO HCP 함량을, cobas e 411 면역검정 분석기 (Roche Diagnostics) 에서 전기화학발광 면역검정 (ECLIA) 에 의해 측정한다.

검정은 양으로부터의 다중클론 항-CHO HCP 항체를 사용하는 샌드위치 원리를 기반으로 한다.

제 1 인큐베이션: 15 μL 샘플 (순 (neat) 및/또는 희석) 로부터의 중국 햄스터 난소 숙주 세포 단백질 (CHO HCP) 및 비오틴 접합 다중클론 CHO HCP 특이적 항체는 샌드위치 복합체를 형성하는데, 이는 비오틴과 스트렙타비딘의 상호작용을 통해 스트렙타비딘-코팅된 미세입자에 결합하게 된다.

제 2 인큐베이션: 루테늄 복합체 (트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체) 로 표지된 다중클론 CHO HCP-특이적 항체를 첨가한 후, 3원 샌드위치 복합체가 미세입자 상에 형성된다.

전극 표면에 미세입자가 자기적으로 포획되는 측정 셀 내로 반응 혼합물을 흡인시킨다. 미결합 물질을 이후 세척 단계에서 제거한다. 전극에 대한 전압 적용은 광전자증배관에 의해 측정되는 화학발광 방사를 유도한다.

시험 샘플 중의 CHO HCP 의 농도를 공지된 농도의 CHO HCP 표준 곡선으로부터 최종적으로 계산한다.

b) CHO PLBL2 검정

방법 샘플에서의 잔류 중국 햄스터 난소 (CHO) 포스포리파아제 B-유사 2 단백질 (PLBL2) 함량을, cobas e 411 면역검정 분석기 (Roche Diagnostics) 에서 전기화학발광 면역검정 (ECLIA) 에 의해 측정한다.

검정은 마우스로부터의 단일클론 항-CHO PLBL2 항체를 사용하는 샌드위치 원리를 기반으로 한다.

제 1 인큐베이션 단계에서, 30 μL 샘플 (순 및/또는 희석) 로부터의 CHO PLBL2, 비오틴 표지된 단일클론 CHO PLBL2-특이적 항체, 및 루테늄 복합체 (트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체) 로 표지된 단일클론 CHO PLBL2-특이적 항체는 샌드위치 복합체를 형성한다.

스트렙타비딘-코팅된 미세입자 첨가 후 제 2 단계에서, 3원 복합체는 비오틴 및 스트렙타비딘의 상호작용을 통해 고체상에 결합하게 된다.

전극 표면에 미세입자가 자기적으로 포획되는 측정 셀 내로 반응 혼합물을 흡인시킨다. 미결합 물질을 이후 세척 단계에서 제거한다. 전극에 대한 전압 적용은 광전자증배관에 의해 측정되는 화학발광을 유도한다.

시험 샘플 중의 CHO PLBL2 의 농도를 공지된 농도의 CHO PLBL2 표준 곡선으로부터 최종적으로 계산한다.

c) 클루스테린 검정

방법 샘플에서의 잔류 클루스테린 함량을, 제조사의 지시사항에 따라 사용한 Merck Millipore 로부터의 시판 검정 (GyroMark HT Kit GYRCLU-37K) 에 의해 측정한다.

간략하게, 이 검정은 순차적으로 하기를 기반으로 하는 샌드위치 ELISA 이다:

1) 랫트 클루스테린 비오틴화 포획 항체를 Bioaffy 1000nL CD 의 스트렙타비딘 코팅된 친화성 컬럼에 결합시킴,

2) 샘플로부터의 랫트 클루스테린 분자를 항 클루스테린 항체에 포획시킴,

3) 제 2 염료-표지 항 클루스테린 검출 항체를 포획된 분자에 결합시킴,

4) Gyrolab Evaluator 를 사용하여 랫트 클루스테린을 정량함.

실시예 2

단백질 A 크로마토그래피에서의 항-P-셀렉틴 항체 (IgG4 동형) 의 정제

항체: 항-P-셀렉틴

일반적 크로마토그래피 조건

컬럼 수지: 단백질 A 물질 "Mab Select SuRe" (GE-Healthcare) Ø 1 ㎝, 높이: 20.1 ㎝, CV: 15.79 ㎖

장비: Akta Avant 150

유량: 모든 단계 동안 300 ㎝/시간

항-P-셀렉틴 항체를 함유하는 용액을, 컬럼의 평형화 (단계 1) 후에 단백질 A 친화성 컬럼에 적용하였다. 항-P-셀렉틴 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 335 ng PLBL2/mg (항체). 항-P-셀렉틴 항체를 함유하는 용액 중 측정된 클루스테린의 초기 로딩: 2874.8 ng 클루스테린/mg (항체). 항-P-셀렉틴 항체를 함유하는 용액 중 측정된 CHOP 의 초기 로딩: 100971 ng CHOP/mg (항체).

크로마토그래피 단계를 하기의 일반적 도식에 따라 수행하였다:

단계 1: 평형화

단계 2: 항체 함유 용액의 로딩

단계 3: 세척 I

단계 4: 세척 II

단계 5: 세척 III

단계 6: 세척 IV (추가적 세척)

단계 7: 용리

단백질 A 친화성 컬럼으로부터의 용리 후 단백질을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 에 의해, 그리고 분광광도적 (OD) 분석론에 의해 측정하였다.

SEC:

수지: TSK 3000 (Tosoh)

컬럼: 300 x 7.8 mm

유량: 0.5 ㎖/분

완충제: pH 7.0 으로 조정된, 250 mM 염화칼륨을 함유하는 200 mM 인산칼륨

파장: 280 nm

OD:

특이적 계수: 1.54

파장: 280 nm - 320 nm

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건 (항-P-셀렉틴 항체)

a) 대조군 (평형화 완충제로만 세척)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: ---

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

c) 저 전도도 세척 (인산칼륨 (KP) 으로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 0.5 mM 인산칼륨, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

d) 고 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

e) 저 전도도 세척 (Tris 완충제로만; pH 6.0)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 6.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

f) 고 전도도 세척 (히스티딘 (His)/Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

g) 저 전도도 Tris + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

h) 저 전도도 인산칼륨 (KP) + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 0.5 mM 인산칼륨, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

i) 저 전도도 Tris + 고 전도도 Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

j) 저 전도도 Tris; pH 6.0 + 고 전도도 Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 6.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

결과:

실시예 3

단백질 A 크로마토그래피에서의 항-아밀로이드 베타 항체 (IgG1 동형) 의 정제

일반적 조건은 실시예 2 에서 기재된 조건에 따랐다.

항체: 항-아밀로이드 베타.

항-아밀로이드 베타 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 2019.7 ng PLBL2/mg (항체). 항-아밀로이드 베타 항체를 함유하는 용액 중 측정된 CHOP 의 초기 로딩: 578908 ng CHOP/mg (항체).

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건

a) 대조군 (평형화 완충제로만 세척)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: ---

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

c) 고 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

d) 저 전도도 Tris + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV : 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

실시예 4

단백질 A 크로마토그래피에서의 항-Her2 항체 (IgG1 동형) 의 정제

일반적 조건은 실시예 2 에서 기재된 조건에 따랐다.

항체: 항-Her2

항-Her2 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 1662.5 ng PLBL2/mg (항체). 항-Her2 항체를 함유하는 용액 중 측정된 CHOP 의 초기 로딩: 727070 ng CHOP/mg (항체).

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건

a) 대조군 (평형화 완충제로만 세척)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: ---

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

c) 고 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

d) 저 전도도 Tris + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

실시예 5

단백질 A 크로마토그래피에서의 이중특이적 항-Ang2/VEGF-A 항체 (IgG1 동형) 의 정제

일반적 조건은 실시예 2 에서 기재된 조건에 따랐다.

항체: 항-Ang2/VEGF-A

이중특이적 항-Ang2/VEGF-A 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 919.7 ng PLBL2/mg (항체). 항-Ang2/VEGF-A 를 함유하는 용액 중 측정된 CHOP 의 초기 로딩: 682304 ng CHOP/mg (항체).

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건

a) 대조군 (평형화 완충제로만 세척)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: ---

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

c) 고 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

d) 저 전도도 Tris + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

실시예 6

단백질 A 크로마토그래피에서의 이중특이적 항-FIXa/X 항체 (IgG4 동형) 의 정제

항-FIXa/X 항체의 정제를 하기 2 가지 상이한 크로마토그래피 설정에서 시험하였다.

설정 1

일반적 조건은 실시예 2 에서 기재된 조건에 따랐다.

항체: 항-FIXa/X

항-FIXa/X 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 557 ng PLBL2/mg (항체). 항-FIXa/X 를 함유하는 용액 중 측정된 CHOP 의 초기 로딩: 387377 ng CHOP/mg (항체).

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건

a) 고 전도도 세척 (Tris 완충제로만)

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 700 mM Tris, pH 7.2

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: ---

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 Tris + 고 전도도 히스티딘 (His)/Tris

단계 1: 평형화: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 5: 세척 III: 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.0

단계 6: 세척 IV: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 7: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

설정 2

일반적 크로마토그래피 조건

장비: Akta Avant 150

유량: 모든 단계 동안 300 ㎝/시간

항-FIXa/X 항체를 함유하는 용액을, 컬럼의 평형화 (단계 1) 후에 단백질 A 친화성 컬럼에 적용하였다.

항-FIXa/X 항체를 함유하는 용액 중 측정된 PLBL2 의 초기 로딩: 557 ng PLBL2/mg (항체).

단계 1: 평형화:

단계 2: 항체 함유 용액의 로딩

단계 3: 세척 I

단계 4: 세척 II

단계 5: 세척 III (추가적 세척)

단계 6: 용리

단백질 A 크로마토그래피에 대한 특이적 완충제 조건

a) 고 전도도 세척 (NaSO4 완충제로만)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: ---

단계 6: 용리: 35 mM 아세트산, pH 4.0

b) 저 전도도 세척 (Tris 1 mM) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 1 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

c) 저 전도도 세척 (Tris 2 mM) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 35 mM 아세트산, pH 4.0

d) 저 전도도 세척 (Tris 4 mM) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 4 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

e) 저 전도도 세척 (Tris 6 mM) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 6 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

f) 저 전도도 세척 (Tris 4 mM, pH 7.8) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 4 mM Tris, pH 7.8

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

g) 저 전도도 세척 (Tris 4 mM, pH 8.2) + 고 전도도 세척 (NaSO4 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 450 mM NaSO4, 20 mM NaAc, pH 4.8

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 4 mM Tris, pH 8.2

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

h) 저 전도도 세척 (Tris 2 mM) + 고 전도도 세척 (히스티딘 (His)/Tris 1 M 로)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 200 mM His/1000 mM Tris, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 35 mM 아세트산, pH 4.0

i) 저 전도도 세척 (Tris 2 mM) + 고 전도도 세척 (히스티딘 (His)/Tris 0.85 M)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 200 mM His/850 mM Tris, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

j) 저 전도도 세척 (Tris 2 mM) + 고 전도도 세척 (히스티딘 (His)/Tris 0.7 M)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 200 mM His/700 mM Tris, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

k) 저 전도도 세척 (Tris 2 mM) + 고 전도도 세척 (히스티딘 (His)/Tris 0.55 M)

단계 1: 평형화: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 2: 로딩

단계 3: 세척 I: 200 mM His/550 mM Tris, pH 7.0

단계 4: 세척 II: 20 mM NaPO4, pH 7.5

단계 5: 세척 III: 2 mM Tris, pH 8.0

단계 6: 용리: 50 mM 아세트산, pH 4.0

실시예 7

일반적 절차/조건:

모의 (Mock) 세포 배양액

널 (Null) 수확된 세포 배양액을, 무혈청 배지에서 배양한 비-트랜스펙션된 CHO-DP12 세포를 사용하여 생성하였다. 대표적 세포 배양 방법을 사용하여 2 L-규모에서 발효를 수행하였다. 발효 14 일의 말미에, 세포 배양액을 원심분리 및 멸균 여과를 통해 수확하였다. 이러한 수확된 세포 배양액 (HCCF) 을 이후 실험 때까지 -70℃ 에서 저장하였다.

정제된 PLBL2

이전에 기재된 바와 같이, C-말단 헥사히스티딘-태그를 갖는 재조합 CHO PLBL2 를 35 L-규모 일시적 트랜스펙션에서 발현시키고 수확된 세포 배양액으로부터 정제하였다 (Vanderlaan et al., 2015). 그런 다음, 정제된 PLBL2 를 PBS 용액 중 제형화하고, 실험 때까지 -70℃ 에서 저장하였다.

정제된 항체

재조합 인간화 항체를 CHO 세포에서 발현시키고 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하여, PLBL2 농도가 20 ng/mg 미만임을 확실히 하였다. 각 연구를 시작하기 전에, 각 항체를 PD-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 PBS 로 완충제-교환하였다.

단백질 A 크로마토그래피에 대한 로딩 물질의 제조

항체 전체에 걸친 단백질 A 로딩에서의 숙주 세포 단백질의 개체군 및 존재도 (population and abundance) 를 정규화하기 위해, 정제된 항체를 PBS 로 동일한 농도로 희석하고 비-생성 세포주로부터 HCCF 로 스파이킹하여, 5 g/L 의 최종 항체 역가를 제공하였다. 정제된 항체 대신 PBS 를 첨가한 대조군을 또한 제조하여, 항체의 부재 하에 단백질 A 수지에 결합하는 비-특이적 숙주 세포 단백질을 평가하였다.

충전층 (Packed-Bed) 컬럼 크로마토그래피

모든 충전층 컬럼 크로마토그래피 실험을, 0.66 ㎝ 내부 직경, 20 ㎝ 층 높이 MabSelect SuRe (GE Healthcare) 단백질 A 수지 컬럼을 사용하여 수행하였다. 각 정제를 위해, 컬럼을 먼저 25 mM tris, 25 mM NaCl, pH 7.7 (평형화 완충제) 로 3 컬럼 부피 (CV) 에 대해 평형화하였다. 그런 다음, 단백질 A 로딩을 30 g 항체/L 수지의 표적 로딩 밀도로 적용하고, 이후 컬럼을 평형화 완충제로 3 CV, 상이한 유형의 세척 완충제 3 CV, 및 다시 평형화 완충제 3 CV 에 대해 세척하였다. 이후, 항체를 0.1 내지 0.15 M 아세트산으로 낮은 pH 에서 용리하고, 용리물 풀 (eluate pool) 을 용리 피크의 초반에서 0.5 OD 에서 시작하여 수집하고; 풀링 (pooling) 을 2.8 CV 후 종료하였다. PBS-스파이킹된 널 HCCF 로의 대조군 실행 (run) 에 대해, 2.8 CV 모의 용리 풀을 용리상 시작 후 1 CV 로부터 시작하여 3.8 CV 까지 생성시켰다. 매 실행 말미에, 각 단백질 A 용리물을 1.5 M tris 염기를 사용하여 pH 5.0 으로 적정하였다. 그런 다음, 컬럼을 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 세정하였다. 로딩, 제 1 평형화 세척 및 용리상 (15 CV/시간의 유량을 가짐) 을 제외하고는, 모든 상은 20 CV/시간의 체적 유량을 가졌다.

A) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG4 동형), 항체 A 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차 (상기 개략적으로 나타낸 바와 같음) 를 사용하는 항체 A (IgG4 동형) 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 0.4 M 인산칼륨, pH 7.0

b) 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.7

c) 0.75 M Arg-HCl, pH 7.0

d) 0.6 M NaCl, pH 7.0

e) 탈이온수

결과:

B) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG1 동형), 항체 B 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차를 사용하는 항체 B (IgG1 동형) 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 탈이온수

결과:

C) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG4 동형), 항체 C 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차를 사용하는 항체 C (IgG4 동형) 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 0.4 M 인산칼륨, pH 7.0

b) 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.7

c) 0.75 M Arg-HCl, pH 7.0

d) 0.6 M NaCl, pH 7.0

e) 탈이온수

결과:

D) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG1 동형), 항체 D 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차를 사용하는 항체 D (IgG1 동형) 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 탈이온수

E) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG1 동형), 항체 E 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차를 사용하는 항체 E (IgG1 동형) 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 0.4 M 인산칼륨, pH 7.0

b) 31 mM Tris, pH 8.5

c) 55 mM Tris, pH 9.0

d) 탈이온수

결과:

F) 단백질 A 크로마토그래피에서의 예시적 항체 (IgG1 동형), 항체 F 의 정제

실시예 7 의 일반적 절차를 사용하는 항체 F 의 정제에 대한 특이적 세척 완충제 조건:

a) 25 mM Tris, pH 9.0

결과:

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Genentech, Inc. <120> Method for the reduction of host cell proteins in affinity chromatography <130> P32999 <150> US 62/208,523 <151> 2015-08-21 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain domain VH of <VEGF> bevacizumab <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable light chain domain VL of <VEGF> bevacizumab <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain domain VH of <ANG-2> E6Q <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable light chain domain VL of < ANG-2> E6Q <400> 4 Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Ile Ser Met Asp Arg Gly Val Lys Asn Asn Trp Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Ala Ala Gly Asp Ile Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Asp Trp Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Pro Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asn Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asn Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Ala Gly Gly Ser Asp Phe Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims

숙주 세포 단백질 함량을 감소시키기 위한 단백질 A 크로마토그래피의 세척 단계에서의 저 전도도 수용액의 용도로서, 단백질 A 크로마토그래피가 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는데 사용되고 저 전도도 수용액이 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 갖는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항에 있어서, 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린인, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함하는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함하는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 이상을 갖는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 저 전도도 수용액 세척 단계가 고 전도도 수용액 세척 단계에 후속되거나 선행되는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 6 항에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 고 전도도 수용액이 히스티딘을 포함하는, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG4 동형 항체가 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체인, 저 전도도 수용액의 용도.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 동형 항체가 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체인, 저 전도도 수용액의 용도.
하기 단계를 포함하는, 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 방법:
a) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배양 배지로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 회수하는 단계,
c) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 단백질 A 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계,
d) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하는 단계 (여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 가짐),
e) 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 회수하고,
그로써 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 생성하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 샘플로부터 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는 방법:
a) 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액 (여기서 저 전도도 수용액은 약 0.5 mS/㎝ 이하의 전도도 값을 가짐) 으로 세척하는 것을 포함하는, 단백질 A 크로마토그래피 방법/단계로 인간 IgG4 또는 IgG1 동형 항체를 정제하는 단계.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 숙주 세포 단백질의 양이 감소되고 상기 숙주 세포 단백질이 포스포리파아제 B-유사 2 (PLBL2) 또는 클루스테린인 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.1 mM 내지 약 8 mM Tris 를 포함하는 방법.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 0.05 mM 내지 약 2 mM 인산칼륨을 포함하는 방법.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 저 전도도 수용액이 약 pH 7 이상을 갖는 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 물질을 저 전도도 수용액으로 세척하기 전 또는 후에 친화성 크로마토그래피 물질을 고 전도도 수용액 및/또는 중간 전도도 수용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 17 항에 있어서, 고 전도도 수용액이 약 20 mS/㎝ 이상의 전도도 값을 갖는 방법.
제 17 항에 있어서, 중간 전도도 수용액이 0.5 mS/㎝ 초과 내지 20 mS/㎝ 미만의 전도도 값을 갖는 방법.
제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 높은 또는 중간 전도도 수용액이 히스티딘을 포함하는 방법.
제 11 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG4 동형 항체가 P-셀렉틴에 대한 항체 또는 인자 IXa 및 인자 X 에 대한 항체 또는 IL-13 에 대한 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체인 방법.
제 11 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 동형 항체가 인플루엔자 B 에 대한 항체 또는 VEGF-A 에 대한 항체 또는 CD22 에 대한 항체 또는 HER3 및 EGFR 에 대한 이중특이적 항체 또는 아밀로이드 베타에 대한 항체 또는 Her2 에 대한 항체 또는 Ang2 및 VEGF-A 에 대한 이중특이적 항체 또는 암배아 항원 (CEA) 및 CD3 에 대한 이중특이적 항체인 방법.