KR20240155352A - 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체 - Google Patents

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체 Download PDF

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KR20240155352A
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군나르 제이. 핸슨
밍 저우
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사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드
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Abstract

뒤시엔느 근 이영양증(DMD)을 앓고 있는 환자에서 근 이영양증을 치료하기 위한 방법에 있어서의, 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발하는 신규 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도가 기술된다.

Description

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 접합체
관련 출원
본 출원은 2022년 3월 17일에 출원된 미국 가출원 제63/320,773호의 이익을 주장한다. 위에 언급된 출원의 전체 교시는 그 전체가 참조로서 통합된다.
서열 목록
본 출원은 XML 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 2023년 3월 16일에 생성된 상기 XML 사본의 명칭은 4140_055PC01_SequenceListing_ST26이며, 이의 크기는 572,344 바이트이다.
기술분야
본 개시는 특정 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체에 관한 것이다. 본 개시는 또한 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체를 이용해 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 환자에서 근 이영양증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
디스트로핀은 골격, 횡격막, 및 심장 근육에 영향을 미치는, 무리한 반복 사용으로 인한 손상으로부터 근육을 보호하는 중요한 구조 단백질이다. 뒤시엔느 근 이영양증은 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 희귀하고, 심각하며, 생명을 위협하는, X-연관 열성 퇴행성 신경근 질환이다. 이들 돌연변이는 디스트로핀 전령 리보핵산(mRNA)의 판독 프레임을 파괴하여, 기능적 디스트로핀 단백질의 번역을 방지한다. 엑손의 판독 프레임을 변화시키거나, 정지 코돈을 도입하거나, 전체 프레임 외 엑손(들)의 제거 또는 하나 이상의 엑손의 중복을 특징으로 하는 임의의 엑손 돌연변이는 기능적 디스트로핀의 생산을 파괴하여 DMD를 야기할 가능성이 있다. 디스트로핀 단백질의 부재는 질환의 직접적인 원인이 되고, 환자는 유아기부터 골격근 기능이 끊임없는 진행성으로 저하되는 예측 가능한 질환 과정을 따르며, 일반적으로 30세 이전에 조기 사망하게 된다.
뒤시엔느 근 이영양증(DMD)은 단백질 디스트로핀의 발현 결함으로 인해 발생한다. 단백질을 암호화하는 유전자는 DNA의 2백만 개가 넘는 뉴클레오티드에 걸쳐 분산된 79개의 엑손을 포함한다. 엑손의 판독 프레임을 변화시키거나, 정지 코돈을 도입하거나, 전체 프레임 외 엑손(들)의 제거 또는 하나 이상의 엑손의 중복을 특징으로 하는 임의의 엑손 돌연변이는 기능적 디스트로핀의 생산을 파괴하여 DMD를 야기할 가능성이 있다.
덜 심각한 형태의 근 이영양증인 베커 근 이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)은 돌연변이, 일반적으로는 하나 이상의 엑손의 결실이 전체 디스트로핀 전사체를 따라 정확한 판독 프레임을 생성하여 mRNA의 단백질로의 번역이 조기 성숙 종결되지 않는 경우에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이된 디스트로핀 전구체-mRNA(pre-mRNA)의 가공 중에 상류 및 하류 엑손의 결합이 유전자의 정확한 판독 프레임을 유지시키는 경우, 일부 활성을 유지하는 짧은 내부 결실을 포함한 단백질을 코딩하는 mRNA가 생성되어, BMD 표현형이 생성된다.
수년 간, 디스트로핀 단백질의 판독 프레임을 변경시키지 않는 엑손 또는 엑손들의 결실이 BMD 표현형을 야기하는 반면, 프레임-시프트(frame-shift)를 유발하는 엑손 결실은 DMD를 생성하는 것으로 알려져 왔다(Monaco, Bertelson 등의 문헌(1988)). 일반적으로, 점 돌연변이와 엑손 결실을 포함하여, 판독 프레임을 변화시켜 적절한 단백질 번역을 방해하는 디스트로핀 돌연변이는 DMD를 야기한다. 일부 BMD 및 DMD 환자들은 다수의 엑손을 포함하는 엑손 결실을 갖는다는 점에 주목해야 한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오티드(SSO)는 DMD를 치료하는 데 성공적으로 사용되어 스플라이소좀을 입체적으로 차단함으로써 pre-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하였다. SSO는 DMD 유전자의 돌연변이의 스키핑을 유도하도록 pre-mRNA의 특정 영역(일반적으로는 엑손)을 표적화하도록 특이적으로 설계되어 이들 프레임 외 돌연변이를 프레임 내에서 복원함으로써, 내부적으로 단축되었지만 여전히 기능적인 디스트로핀 단백질의 생산을 가능하게 하였다. 이러한 안티센스 올리고머는 완전히 엑손 내에서(소위 엑손 내부 서열) 표적화하거나 엑손으로부터 인트론의 일부 내로 가로지르는 스플라이스 공여자 또는 스플라이스 수용자 연접부에서 표적화하는 것으로 알려져 왔다.
예를 들어, 에테플러센(eteplirsen)은 엑손 51 스키핑에 순응하는 DMD 환자에서 인간 디스트로핀의 엑손 51을 스키핑함으로써 판독 프레임을 복원하고 기능적으로 더 짧은 형태의 디스트로핀 단백질을 생산하도록 설계된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)이다. 미국 식품의약국(FDA)은 엑손 51 스키핑에 순응하는 DMD 유전자의 확인된 돌연변이를 가진 환자를 대상으로 한 DMD 치료용으로 2016년에 Exondys 51®(에테플러센)을 승인하였다. 또 다른 예에서, PMO 하위 부류의 안티센스 올리고뉴클레오티드이기도 한 골로디르센(golodirsen)(Vyondys 53®)은 엑손 53 스키핑에 순응하는 DMD 유전자의 확인된 돌연변이를 가진 환자를 대상으로 한 DMD 치료용으로 승인되었다. 추가적으로, PMO 하위 부류의 안티센스 올리고뉴클레오티드이기도 한 카시메르센(casimersen)(Amondys 45TM)은 엑손 45 스키핑에 순응하는 DMD 유전자의 확인된 돌연변이를 가진 환자를 대상으로 한 DMD 치료용으로 최근 미국에서 승인되었다.
DMD 치료를 위한, 세포 투과성 펩티드에 접합된 안티센스 올리고머(예를 들어, PPMO)의 발견과 개발도 연구의 영역이었다(예를 들어, 미국 특허 제10,888,578호; 미국 특허 출원 제16/469,104호; 미국 특허 제11,000,600호 참조). 세포 투과성 펩티드(CPP), 예를 들어 아르기닌-풍부 펩티드 수송 모이어티는 세포 내로 안티센스 올리고머의 침투를 향상시키고 동물 모델에서 상이한 근육군에서 엑손 스키핑을 유발하는 데 효과적인 것으로 나타났다.
따라서, 세포 투과성 펩티드에 접합된 안티센스 올리고머를 이용해 전임상 모델에서 성공을 달성했음에도 불구하고, 인간 환자에서 이러한 접합체로 DMD 및 BMD를 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
식 (I)에 따른 안티센스 올리고머 접합체는 약리학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다. 식 (I)에 따른 특정 안티센스 올리고머 접합체는 또한, 예를 들어 근육 및 신장 조직과 같은 상이한 조직에 분포하는 것으로 밝혀졌다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체:
및 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이며,
식 중:
n은 1 내지 40이고;
각각의 Nu는 서로 합쳐져, 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
T'은 다음으로부터 선택되는 모이어티이고:
; 식 중
R 100 은 RRRRRG-, RRRRG-, RRRG-, RRG-, RG-, 및 G-로 이루어진 군으로부터 선택되되, R은 아르기닌이고 G는 글리신이고,
R 200 은 수소이고,
R 1 은 C1-C6 알킬이다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 표적화 서열은 H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적이다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 표적화 서열은 H45A(-03+19)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 45 어닐링 부위에 상보적이다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 표적화 서열은 H53A(+36+60)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 53 어닐링 부위에 상보적이다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 또는, 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서의 T'은 모이어티:
이고, 식 중 R 200 은 수소이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 RRRRRG-이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 RRRRG-이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 RRRG-이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 RRG-이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 RG-이다.
일부 양태에서, 본 개시는 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중 R 100 은 G-이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (V)의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (VII)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VII)의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (IX)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (IX)의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IXA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고,
각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 0이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 1이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 2이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 3이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 4이다.
소정의 양태에서, 본 개시는 식 (V), (VA), (VII), (VIIA), (IX), 또는 (IXA) 중 어느 하나의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 m은 5이다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 유리 염기 형태로 제공된다. 소정의 구현예에서, 본원에 제공된 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 염산염이다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체, 예컨대 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구용으로 제형화된다.
본 개시는 또한, 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)의 치료를 필요로 하는, 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)을 앓고 있는, 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체, 예컨대 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발한다. 일부 구현예에서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택된다.
본 개시는 안티센스 올리고머 접합체로 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체, 예컨대 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 양태에서, 본 개시는, DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 51 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 환자에게 식 (VI)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 양태에서, 본 개시는, DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 45 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 환자에게 식 (VIII)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 양태에서, 본 개시는, DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 53 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 환자에게 식 (X)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시는 환자에서 DMD 및 BMD와 같은 근 이영양증을 치료하기 위한 방법에 있어서의 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 방법은, 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑을 유도하기 위해, 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다.
정의
"약(about)"이란 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이가 기준 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 많게는 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 변화하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알킬(alkyl)"은 달리 명시되지 않는 한 포화된 직선형 또는 분지형 탄화수소를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 알킬기는 일차, 이차 또는 삼차 탄화수소이다. 소정의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함한다(C1 내지 C10 알킬). 소정의 구현예에서, 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함한다(C1 내지 C6 알킬). 소정의 구현예에서, 알킬기는 메틸, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, 에틸, CH2CF3, CF2CF3, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 이차-부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 및 2,3-디메틸부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 용어는 할로겐화 알킬기를 포함하여, 치환된 알킬기 및 치환되지 않은 알킬기 둘 다를 포함한다. 소정의 구현예에서, 알킬기는 플루오르화 알킬기이다. 알킬기가 치환될 수 있는 모이어티의 비제한적인 예는, 당업자에게 알려진 바와 같이, 예를 들어, Greene 등의 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991](참조로 본원에 통합됨)에서 교시된 바와 같이 보호되지 않거나 필요에 따라 보호된, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산(sulfonic acid), 황산염(sulfate), 포스폰산(phosphonic acid), 인산염(phosphate), 또는 포스폰산염(phosphonate)으로 이루어진 군으로부터 선택된다,
대상체 또는 환자와 관련하여 본원에서 사용된 "엑손 스키핑에 순응하는(amenable to exon skipping)"은 디스트로핀 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 대상체 및 환자를 포함하도록 의도되는데, 여기서 디스트로핀 pre-mRNA의 특정 엑손의 스키핑이 없는 경우, 판독 프레임이 프레임을 벗어나게 되어 pre-mRNA의 번역을 방해하므로, 대상체 또는 환자는 기능적 또는 반-기능적 디스트로핀을 생산할 수 없게 된다. 환자가 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 가지고 있는지 여부는 당업자가 충분히 결정할 수 있다(예를 들어, Aartsma-Rus 등의 문헌[(2009) Hum Mutat. 30:293-299]; Gurvich 등의 문헌[Hum Mutat. 2009; 30(4) 633-640]; 및 Fletcher 등의 문헌[(2010) Molecular Therapy 18(6) 1218-1223] 참조).
용어 "올리고머" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용되며, 서브유닛 간 결합에 의해 연결된 서브유닛의 서열을 지칭한다. 특정한 경우에, 용어 "올리고머"는 "안티센스 올리고머"와 관련하여 사용된다. "안티센스 올리고머(antisense oligomer)"의 경우, 각각의 서브 유닛이 (i) 리보오스 당 또는 이의 유도체; 및 (ii) 이에 결합된 핵염기로 이루어지므로, 염기 페어링 모이어티의 순서는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링에 의해 핵산(일반적으로는 RNA)의 표적 서열에 상보적인 염기 서열을 형성함으로써, 서브유닛, 서브유닛 간 결합, 또는 둘 다가 자연적으로 발생하지 않을 때 핵산:올리고머 이종 이합체(heteroduplex)를 표적 서열 내에 형성한다. 소정의 구현예에서, 안티센스 올리고머는 PMO이다.
용어 "상보적인(complementary)" 및 "상보성(complementarity)"은 왓슨-크릭 염기-페어링 규칙에 의해 서로 연관된 둘 이상의 올리고머(즉, 각각 핵염기 서열을 포함함)를 지칭한다. 예를 들어, 핵염기 서열 "T-G-A (5'→3')"는 핵염기 서열 "A-C-T (3'→5')"에 상보적이다. 상보성은 주어진 "부분적"일 수 있는데, 이 경우 주어진 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 염기 페어링 규칙에 따라 다른 핵염기 서열과 매칭된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 간의 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다. 또는, 주어진 핵염기 서열과 실시예를 계속하기 위한 다른 핵염기 서열 간에 "완전한(complete)" 또는 "완벽한(perfect)(100%)" 상보성이 존재할 수 있다. 핵염기 서열들 간의 상보성은 서열들 간의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
용어 "유효량(effective amount)" 및 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 원하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 1회 투여량으로서 또는 일련의 투여량의 일부로서 포유류 대상체에게 투여되는 치료적 화합물, 예컨대 안티센스 올리고머 접합체의 양을 지칭한다. 안티센스 올리고머 접합체의 경우, 이러한 효과는 선택된 표적 서열의 번역 또는 천연 스플라이스-프로세싱을 억제하거나 임상적으로 의미 있는 양의 디스트로핀(통계적 유의성)을 생성함으로써 일반적으로 유발된다.
"강화(enhance 또는 enhancing)" 또는 "증가(increase 또는 increasing)" 또는 "자극(stimulate 또는 stimulating)"이란 말은, 안티센스 올리고머 접합체의 부재에 의해 야기되거나 대조군 화합물에 의해 야기된 반응과 비교했을 때, 하나 이상의 안티센스 올리고머 접합체 또는 약학적 조성물이 세포 또는 대상체에서 더 큰 생리학적 반응(즉 하방 효과(downstream effect))를 생성하거나 이를 야기하는 능력을 일반적으로 지칭한다. 더 큰 생리학적 반응은, 당업계의 이해와 본원의 설명으로부터 명백한 다른 반응 가운데, 기능적 형태의 디스트로핀 단백질의 발현 증가, 또는 근육 조직에서 디스트로핀과 연관된 생물학적 활성의 증가를 포함할 수 있다. 근육 기능이 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 만큼 증가하거나 개선되는 것을 포함하여, 근육 기능의 증가를 측정할 수도 있다. 근육 섬유 중 약 1%, 2%, 5%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%에서 디스트로핀 발현이 증가하는 것을 포함하여, 기능적 디스트로핀을 발현하는 근육 섬유의 백분율을 측정할 수도 있다. 예를 들어, 섬유의 25~30%가 디스트로핀을 발현하는 경우, 약 40%의 근육 기능 개선이 발생할 수 있는 것으로 나타났다(예를 들어, DelloRusso 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002] 참조). "증가(increased)"량 또는 "강화(enhanced)"량은 통상적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 안티센스 올리고머 접합체가 없을 때(제제의 부재) 또는 대조군 화합물에 의해 생산된 양의 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50배 또는 이상의 증가(예를 들어, 500, 1000배; 이들 사이의 1을 초과하는 모든 정수 및 소수점을 포함함), 예, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능(function)" 및 "기능적(functional)" 등은 생물학적, 효소적 또는 치료적 기능을 지칭한다.
"기능적" 디스트로핀 단백질은 일반적으로, DMD 또는 BMD를 갖는 특정 대상체에 존재하는 "손상된(defective)" 형태의 디스트로핀 단백질과 비교했을 때, 근육 조직의 점진적 분해(다르게는 근 이영양증의 특징)을 감소시키기에 충분한 생물학적 활성을 갖는 디스트로핀 단백질을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 기능적 디스트로핀 단백질은 당업계의 일상적인 기술에 따라 측정했을 때, 야생형 디스트로핀의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%(이들 사이의 모든 정수를 포함함)의 시험관 내 또는 생체 내 생물학적 활성을 가질 수 있다. 본 개시의 엑손-스키핑 안티센스 올리고머 접합체 중 특정한 하나의 투여 후에 생성되는 형태들과 같은, 절단된 형태의 디스트로핀이 포함된다.
용어 "미스매치(mismatch 또는 mismatches)"는 올리고머 핵염기 서열에서 (연속되거나 분리된) 하나 이상의 핵염기로서, 염기 페어링 규칙에 따라 표적 pre-mRNA와 매칭되지 않은 핵염기를 지칭한다. 완벽한 상보성이 종종 바람직하지만, 일부 구현예는 표적 pre-mRNA에 대해 하나 이상의, 그러나 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 올리고머 내의 임의의 위치에서의 변이가 포함된다. 소정의 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 내부의 말단 변이에 가까운 핵염기 서열에서의 변이를 포함하며, 존재하는 경우, 이들은 일반적으로 5' 및/또는 3'의 약 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 서브유닛 이내에 존재한다.
용어 "모르폴리노(morpholino)", "모르폴리노 올리고머(morpholino oligomer)" 및 "PMO"는 다음의 일반 구조로 이루어지고:
Summerton, J. 등의 문헌[Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997)]의 도 2에 기술된 것과 같은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 지칭한다. 본원에 기술된 것과 같은 모르폴리노는 전술한 일반 구조의 모든 입체이성질체 및 호변이성질체를 포함한다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조 및 결합 특성은 미국 특허 제5,698,685호; 제5,217,866호; 제5,142,047호; 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,521,063호; 제5,506,337호; 제8,076,476호; 및 제8,299,206호에 상세히 설명되어 있으며, 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
일부 양태에서, 모르폴리노 올리고(PMO)는 올리고머의 5' 또는 3' 단부에서 "테일(tail)" 모이어티와 접합되어 올리고머의 안정성 및/또는 용해도를 증가시킨다. 예시적인 테일은 다음을 포함한다:
전술한 예시적인 테일 모이어티 중에서, "TEG" 또는 "EG3"은 다음의 테일 모이어티를 지칭한다:
.
전술한 예시적인 테일 모이어티 중에서, "GT"는 다음의 테일 모이어티를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "RRRRRG-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "RRRRG-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "RRRG-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "RRG-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "RG-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
본원에서 사용되는 용어 "G-"는 다음의 구조를 지칭한다:
.
아르기닌 펩티드의 합성 및 올리고머에 접합시키는 방법은 미국 특허 제9,161,948호, 제10,888,578호, 및 제11,000,600호, 그리고 미국 특허 출원 공개 제2012/0289457호, 및 국제 특허 출원 공개 WO 2004/097017, WO 2009/005793, 및 WO 2012/150960에 기술되어 있으며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
용어 "핵염기(nucleobase, Nu)", "염기 페어링 모이어티(base pairing moiety)" 또는 "염기(base)"는 자연 발생적인 또는 "천연" DNA 또는 RNA(예를 들어, 우라실, 티민, 아데닌, 시토신 및 구아닌)에서 발견되는 퓨린 또는 피리미딘 염기 뿐만 아니라 이들 자연 발생 퓨린과 피리미딘의 유사체를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 이들 유사체는 올리고머에 대한 결합 친화도와 같은 개선된 특성을 부여할 수 있다. 예시적인 유사체는 하이포크산틴(이노신의 염기 성분); 2,6-디아미노퓨린; 5-메틸 시토신; C5-프로피닐-변형 피리미딘; 10-(9-(아미노에톡시)페녹사지닐)(G-클램프) 등을 포함한다.
염기 페어링 모이어티의 추가적인 예는, 아실 보호기에 의해 보호되는 각각의 아미노 기를 갖는 우라실, 티민, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 하이포크산틴 (이노신), 2-플루오로우라실, 2-플루오로시토신, 5-브로모라실, 5-요오드우라실, 2,6-디아미노퓨린, 아자시토신, 피리미딘 유사체(예컨대, 슈도이소시토신 및 슈도우라실) 및 다른 변형된 핵염기, 예컨대 8-치환된 퓨린, 크산틴, 또는 하이포크산틴(마지막 두 개는 천연 분해 산물임)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 다음 문헌에 개시된 변형된 핵염기도 고려된다: Chiu 및 Rana의 문헌[RNA, 2003, 9, 1034-1048]; Limbach 등의 문헌 [Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196]; 및 Revankar 및 Rao의 문헌[Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313](이들의 내용은 참조로서 본원에 통합됨).
염기 페어링 모이어티의 추가적인 예는 하나 이상의 벤젠 고리가 추가된 확장된-크기의 핵염기를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 핵산 염기 교체는 다음 문헌에 기술되어 있으며: Glen Research 카탈로그 (www.glenresearch.com); Krueger AT 등의 문헌[Acc Chem Res., 2007, 40, 141-150]; Kool, ET의 문헌[Acc. Chem Res., 2002, 35, 936-943]; Benner S.A. 등의 문헌[Nat Rev. Genet., 2005, 6, 553-543]; Romesberg, F.E. 등의 문헌[Curr. Opin Chem Biol., 2003, 7, 723-733]; 및 Hirao, I.의 문헌[Curr. Opin Chem Biol., 2006, 10, 622-627]; 이들의 내용은 참조로서 본원에 통합되고, 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체에 유용한 것으로서 고려된다. 확장된 크기의 핵염기의 예는 아래에 도시된 것들 뿐만 아니라 이들의 호변이성질체 형태도 포함한다.
용어 "노출(exposure)"은 (신체 내로 PPMO를) 투여하는 것 및 혈장 및 다른 생물학적 유체에서 PPMO의 급성 농도 또는 통합 농도의 다양한 척도(예를 들어, Cmax, Cmin, Css, AUC)를 지칭한다. 용어 "반응(response)"은 약물의 약리학적 효과의 직접적인 척도를 지칭한다. 반응은 잠재적 또는 허용되는 대리물질에 대한 광범위한 평가변수 또는 바이오마커(예를 들어, 혈압, 마그네슘 수준, 또는 심장 박출량에 미치는 효과)에서부터 효능 및 안전성과 관련된 전체 범위의 단기 또는 장기 임상 효과에 대한 광범위한 평가변수 또는 바이오마커를 포함한다.
본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여(parenteral administration 및 administered parenterally)"는 경구 투여와 국소 투여 이외에 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 경막내(intrathecal), 낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
명료성을 위해, 본 개시의 구조는 5'에서 3' 방향으로 연속되며, 전체 구조를 간단한 형태로 편리하게 예시하기 위해, "BREAK A", "BREAK B", 및 "BREAK C"로 표지된 다양한 도해 연결부(illustration breaks)를 포함시켰다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 예를 들어, "BREAK A"라는 각 표시는 이들 지점에서 구조 도해가 연속됨을 나타낸다. 당업자는, 상기 구조의 "BREAK B"의 각 인스턴스와 "BREAK C"에도 동일하다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 어떠한 도해 연결부도 전술한 구조가 실제로 불연속적임을 나타내는 것으로 의도되지 않으며, 당업자 또한 전술한 구조가 실제로 불연속적인 것으로 이해하면 안 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구조식 내에서 사용되는 괄호 세트는 해당 괄호 사이에 구조적 특징부가 반복됨을 나타낸다. 일부 구현예에서, 사용된 괄호는 "[" 및 "]"일 수 있고, 소정의 구현예에서는, 반복되는 구조적 특징부를 나타내는 데 사용된 괄호가 "(" 및 ")"일 수 있다. 일부 구현예에서, 괄호 사이에서 구조적 특징부의 반복 회수는 2, 3, 4, 5, 6, 7 등과 같이 괄호 밖에 표시된 수이다. 다양한 구현예에서, 괄호 사이의 구조적 특징부의 반복 횟수는 괄호 밖에 표시된 변수, 예컨대 "n" 등에 의해 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구조식 내에서 키랄 탄소 원자 또는 인 원자에 대해 그려진 직선 결합 또는 구불구불한 선 결합은 키랄 탄소 또는 인의 입체화학이 정의되지 않았음을 나타내며, 모든 형태의 키랄 중심을 포함하도록 의도된다. 이러한 도해의 예가 아래에 도시되어 있다.
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체
다양한 양태에서, 본 개시는 식 (I)에 따른 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중:
n은 1 내지 40이고;
각각의 Nu는, 서로 합쳐져 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
이는 디스트로핀 pre-mRNA 내의 엑손 어닐링 부위에 상보성이고;
T'은:
로부터 선택되는 모이어티이며; 식 중
R 100 은 RRRRRG-, RRRRG-, RRRG-, RRG-, RG-, 및 G-로 이루어진 군으로부터 선택되되, R은 아르기닌이고 G는 글리신이고,
R 200 은 수소이고,
R 1 은 C1-C6 알킬이다.
일부 구현예에서, T'은 모이어티:
이고, 식 중 R 200 은 수소이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 RRRRRG-이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 RRRRG-이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 RRRG-이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 RRG-이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 RG-이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이거나, 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 R 100 은 G-이다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고머 접합체의 안티센스 올리고머는 n+2개의 염기쌍을 가지며, 여기에서, 식 (I) 중 n은 1 내지 40, 임의로 13~38, 임의로 13~28, 임의로 13~23, 또는 임의로 13~18이다. 즉, 올리고머는 15~40개, 15~35개, 15~30개, 15~25개, 또는 15~20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 양태에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발한다. 일부 양태에서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택된다. 소정의 양태에서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택된다.
다양한 양태에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (II)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
T'은:
으로부터 선택되는 모이어티이고;
R1은 C1-C6 알킬이며;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
여기에서 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 어닐링 부위에 상보적이다.
다양한 양태에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (III)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이고, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
T'은:
으로부터 선택되는 모이어티이고;
R1은 C1-C6 알킬이며;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
여기에서 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 어닐링 부위에 상보적이다.
다양한 양태에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IV)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
T'은:
으로부터 선택되는 모이어티이고;
R1은 C1-C6 알킬이며;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
여기에서 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 어닐링 부위에 상보적이다.
일부 양태에서, 조성물 중의 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 또는 엑손 53 표적 영역의 15 내지 35개의 핵염기에 상보적인 서열을 포함한다. 이들 디스트로핀 엑손을 표적화하고 스키핑하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 서열이 당업계에 기술되었다. 예를 들어, 다음의 PCT 공개 출원 및 발행된 미국 특허를 참조한다: WO2018/129384, WO2019/060775, WO2020/219820 WO2018/007475, WO2018/091544, WO2020/089325, WO2004/048570, WO2020/028832, WO2017/062862, 미국 특허 제10,683,322호, 미국 특허 제8,969,551호, 미국 특허 제10,781,448호, 미국 특허 제9,988,629호, 미국 특허 제9,840,706호, 미국 특허 제10,851,373호, WO2020/004675, 및 WO2020/0158792(이의 서열 개시는 본원에 통합됨).
다수의 예시적인 표적화 서열이 아래에 기술되어 있다. 이들 서열은 모르폴리노 표적화 서열로서 제공될 수 있고 식 (I)의 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체에 혼입될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 51 어닐링 부위에 상보적이다. 일부 양태에서, 부위는 H51A(+66+95)로서 지정된다. 일부 양태에서, 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 45 어닐링 부위에 상보적이다. 일부 양태에서, 부위는 H45A(-03+19)로서 지정된다. 일부 양태에서, 표적화 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 53 어닐링 부위에 상보적이다. 일부 양태에서, 부위는 H53A(+36+60)로서 지정된다.
다양한 구현예에서, T'은 이다.
다양한 구현예에서, R1은 메틸, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, 에틸, CH2CF3, CF2CF3, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 이차-부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 또는 2,3-디메틸부틸이다.
일부 구현예에서, 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, HCl 염은 .1HCl 염이다.
일부 구현예에서, 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'은 이고, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'은 이고, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이다.
일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'은 이고, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'은 이고, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이다.
일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'은 이고, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다.
다양한 구현예에서, T'는 이고, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이다.
예를 들어, 식 (I) 및 식 (II)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (V)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
예를 들어, 식 (V)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (V) 또는 식 (VA)의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 특정 구현예에서, 각각의 X는 독립적으로 이다.
일부 구현예에서, 식 (V) 또는 식 (VA)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VA)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VB) 또는 식(VC)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이며, 식 중, 각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이다.
예를 들어, 식 (VA)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VD) 또는 식 (VE)에 따른 것이며:
식 중, 각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이다.
일부 구현예에서, 식 (VB), (VC), (VD), 및 (VE) 중 어느 하나에서의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 소정의 구현예에서, 각각의 X는 이다.
예를 들어, 식 (V), 식 (VA), 식 (VB), 식 (VC), 식 (VD), 및 식 (VE)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다. 예를 들어, 식 (V), 식 (VA), 식 (VB), 식 (VC), 식 (VD), 및 식 (VE)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 다양한 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이다.
예를 들어, 식 (I)의 또는 식 (II)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (V)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이며, 식 (VI):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VI)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VI)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIA) 또는 식 (VIB)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이다.
식 (I) 및 식 (II)의 안티센스 올리고머 접합체의 일부 구현예를 포함하는 본 개시의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이고, 식 (VIC):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VIC)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VID) 또는 식 (VIE)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIF) 또는 식 (VIG)에 따른 것이다:
예를 들어, 식 (I) 및 식 (III)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VII)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 H45A(-03+19)로서 지정된 엑손 45 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이며, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
예를 들어, 식 (VII)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 H45A(-03+19)로서 지정된 엑손 45 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이며, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VII) 또는 식 (VIIA)의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 특정 구현예에서, 각각의 X는 독립적으로 이다.
일부 구현예에서, 식 (VII) 또는 식 (VIIA)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIIA)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIB) 또는 식(VIIC)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이며, 식 중, 각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(-03+19)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 45 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이다.
일부 구현예에서, 식 (VIIB) 또는 식 (VIIC)의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 소정의 구현예에서, 각각의 X는 이다.
예를 들어, 식 (VII), 식 (VIIA), 식 (VIIB), 및 식 (VIIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 임의로 우라실(U)이다. 예를 들어, 식 (VII), 식 (VIIA), 식 (VIIB), 및 식 (VIIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 다양한 구현예에서, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이다.
예를 들어, 식 (I) 또는 식 (III)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VII)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는이며, 식 (VIII):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VIII)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIII)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIIA) 또는 식 (VIIIB)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이다.
식 (I) 및 식 (III)의 안티센스 올리고머 접합체의 일부 구현예를 포함하는 본 개시의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이며, 식 (VIIIC):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (VIIIC)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIIIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIID) 또는 식 (VIIIE)에 따른 것:
또는 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 이의 HCl 염이다.
예를 들어, 식 (VIIIC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (VIIIF) 또는 식 (VIIIG)에 따른 것이다:
예를 들어, 식 (I) 또는 식 (IV)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IX)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 H53A(+36+60)로서 지정된 엑손 53 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
예를 들어, 식 (IX)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IXA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중:
각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 H53A(+36+60)로서 지정된 엑손 53 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (IX) 또는 식 (IXA)의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 특정 구현예에서, 각각의 X는 독립적으로 이다.
일부 구현예에서, 식 (IX) 또는 식 (IXA)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (IXA)의 일부 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IXB) 또는 식 (IXC)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이며, 식 중, 각각의 Nu는 서로 합쳐져, H51A(+36+60)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 53 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이다.
일부 구현예에서, 식 (IXB) 또는 식 (IXC)의 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택된다.
다양한 구현예에서, 각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, X는 또는 이다. 소정의 구현예에서, 각각의 X는 이다.
예를 들어, 식 (IX), 식 (IXA), 식 (IXB), 및 식 (IXC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이고, 여기에서 각각의 티민(T)은 선택적으로 우라실(U)이다. 예를 들어, 식 (IX), 식 (IXA), 식 (IXB), 및 식 (IXC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 다양한 구현예에서, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이다.
예를 들어, 식 (I) 또는 식 (IV)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IX)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고,
각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이며, 식 (X):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (XA) 또는 식 (XB)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이다.
식 (I) 및 식 (IV)의 안티센스 올리고머 접합체의 일부 구현예를 포함하는 본 개시의 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 식 (IXA)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고,
각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이며, 식 (XC):
로 제시되거나 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 구현예에서, 식 (XC)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
예를 들어, 식 (XC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (XD) 또는 식 (XE)에 따른 것:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염이다.
예를 들어, 식 (XC)의 안티센스 올리고머 접합체의 구현예를 포함하는 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (XF) 또는 식 (XG)에 따른 것이다:
일 양태에서, 본 개시는 인간 디스트로핀 유전자에서 선택된 표적에 결합하여 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기서 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 어닐링 부위로서 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 표적 영역에 상보적인 염기 서열을 포함하고; 염기 서열 및 어닐링 부위는 다음 중 하나로부터 선택된다:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
일 양태에서, 염기 서열 및 어닐링 부위는 다음 중 하나로부터 선택된다:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이고, U는 이고, Gm은 메틸화 구아닌이고, Am은 메틸화 아데닌이고, m5C는 이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 식 (XI)의 안티센스 올리고머 접합체:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 (n+1)까지, 5'에서 3' 방향으로 다음의 서열에 상응한다:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
일 양태에서, 염기 서열 및 어닐링 부위는 다음 중 하나로부터 선택된다:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이고, U는 이고, Gm은 메틸화 구아닌이고, Am은 메틸화 아데닌이고, m5C는 이다.
일부 구현예에서, 식 (XI)의 안티센스 올리고머 접합체는 이의 HCl 염(염산염)이다. 소정의 구현예에서, m은 5이고 HCl 염은 .5HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 4이고 HCl 염은 .4HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 3이고 HCl 염은 .3HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 2이고 HCl 염은 .2HCl 염이다. 소정의 구현예에서, m은 1이고 HCl 염은 .HCl 염이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 식 (XIA) 또는 식 (XIB)의 안티센스 올리고머:
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 HCl 염을 제공하며, 식 중, 각각의 Nu는 1에서 (n+1)까지, 5'에서 3' 방향으로 다음의 서열에 상응한다:
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 이다.
여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이고, T는 이고, U는 이고, Gm은 메틸화 구아닌이고, Am은 메틸화 아데닌이고, m5C는 이다.
핵염기 변형 및 치환
특정 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 (당업계에서 종종 "염기로" 단순히 지칭되는) RNA 핵염기 및 DNA 핵염기로 구성된다. RNA 염기는 아데닌(A), 우라실(U), 시토신(C) 및 구아닌(G)으로 흔히 알려져 있다. DNA 염기는 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C) 및 구아닌(G)으로 흔히 알려져 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로 구성된다.
소정의 구현예에서, 올리고머의 하나 이상의 RNA 염기 또는 DNA 염기는 RNA 염기 또는 DNA 염기 이외의 염기로 변형되거나 치환될 수 있다. 변형된 염기 또는 치환된 염기를 함유하는 올리고머는, 핵산에서 가장 흔히 발견되는 하나 이상의 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기가 덜 흔한 염기 또는 비-천연 염기로 치환되는 올리고머를 포함한다.
퓨린 염기는 하기 일반식에 의해 설명되는 바와 같이 이미다졸 링에 축합된 피리미딘 고리를 포함한다.
아데닌과 구아닌은 핵산에서 가장 흔히 발견되는 2개의 퓨린 핵염기이다. 다른 자연 발생 퓨린은 N6-메틸아데닌, N2-메틸구아닌, 하이포크산틴 및 7-메틸구아닌을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
피리미딘 염기는 하기 일반식에 의해 기술된 바와 같은 6-원 피리미딘 고리를 포함한다.
시토신, 우라실 및 티민은 핵산에서 가장 흔히 발견되는 피리미딘 염기이다. 다른 자연 발생 피리미딘은 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 슈도우라실 및 4-티오우라실을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 올리고머는 우라실 대신에 티민 염기를 함유한다.
다른 적절한 염기는: 2,6-디아미노퓨린, 오르토산, 아그마티딘(agmatidine), 리시딘, 2-티오피리미딘(예를 들어, 2-티오우라실, 2-티오티민), G-클램프와 이의 유도체, 5-치환 피리미딘(예를 들어, 5-할로우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-아미노메틸우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-아미노메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 수퍼-T), 7-데아자구아니, 7-데아자아데닐, 7-아자-2,6-디아미노퓨린, 8-아자-7-데아자구아닌, 8-아자-7-데아자아데닌, 8-아자-7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 수퍼 G, 슈퍼 A, 및 N4-에틸시토신, 또는 이들의 유도체; N2-시클로펜틸구아닌 (cPent-G), N2-시클로펜틸-2-아미노퓨린 (cPent-AG), 및 N2-프로필-2-아미노퓨린 (Pr-AP), 슈도우라실, 또는 이들의 유도체; 및 2,6-디플루오로오톨루엔과 같은 등의 축퇴행성 또는 범용 염기, 또는 무염기성 부위와 같은 부재 염기(예를 들어, 1-데옥시리보오스, 1,2-디데옥시리보오스, l-데옥시-2-O-메틸리보오스; 또는 고리 산소가 질소로 치환된 피롤리돈 유도체(아자리보오스))를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 수퍼 A, 수퍼 G, 및 수퍼 T의 유도체의 예는 미국 특허 제6,683,173호 (Epoch Biosciences)에서 확인할 수 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. cPent-G, cPent-AP, 및 Pr-AP는 siRNA에 통합될 때 면역 자극 효과를 감소시키는 것으로 나타났다 (Peacock H. 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200] 참조). 슈도우라실은 우라실의 자연 발생 이성질체 버전으로서, 우리딘(uridine)에서와 같이 정상적인 N-글리코시드가 아닌 C-글리코시드를 갖는다. 슈도우리딘-함유 합성 mRNA는 우리딘-함유 mPvNA와 비교해 개선된 안전성 프로파일을 가질 수 있다(WO 2009127230, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
특정 핵염기는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린을 포함하며, 이에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은, 핵산 이중체 안정성을 0.6~1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타났으며, 현재로서는 바람직한 염기 치환이며, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 특히 더 그러하다. 추가의 예시적인 변형된 핵염기는 뉴클레아제의 적어도 하나의 수소 원자가 불소로 치환된 것들을 포함한다.
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 약학적으로 허용 가능한 염
본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체의 특정 구현예는 아미노 또는 알킬아미노와 같은 염기성 작용기를 함유할 수 있으므로, 약학적으로 허용 가능한 산으로 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 이와 관련해서 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 비교적 무독성의 무기산 부가염 및 유기산 부가염을 지칭한다. 이들 염은 투여 비히클 또는 투여 형태 제조 과정에서 인 시튜(in situ) 제조되거나, 유리 염기 형태로 정제된 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 적절한 유기산 또는 무기산과 별도로 반응시키고, 그렇게 형성된 염을 후속 정제 중에 단리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염은 브롬화수소산염, 염산염, 황산염, 중황산염, 인산염, 질산염, 아세트산염, 발레르산염, 올레산염, 팔미트산염, 스테아린산염, 라우릴산염, 벤조산염, 젖산염, 토실산염, 구연산염, 말레인산염, 푸마르산염, 숙신산염, 타르타르산염, 나프틸산염, 메실산염, 글루코헵톤산염, 락토바이온산염, 및 라우릴설폰산염 등을 포함한다. (예를 들어, Berge 등의 문헌[(1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19]을 참조한다).
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 무독성 유기산 또는 무기산에서 유래된, 안티센스 올리고머 접합체의 통상적인 무독성 염 또는 사차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 비독성 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 유기산으로부터 염들; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아린산, 젖산, 말산, 타르타르산, 구연산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말산, 페닐아세트산, 글루타민산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이소티온산, 등과 같은 유기산에서 제조된 염을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있으므로, 약학적으로 허용 가능한 염기를 사용해 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 이들 경우에서의 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 비교적 무독성의 무기염기 부가염 및 유기염기 부가염을 지칭한다. 마찬가지로 이들 염은 투여 비히클 또는 투여 형태 제조 과정에서 인 시튜 제조되거나, 유리 산 형태로 정제된 안티센스 올리고머 접합체를 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염 또는 약학적으로 허용 가능한 금속 양이온과 같은 적절한 염기와 별도로 반응시키거나, 암모니아와 별도로 반응시키거나, 약학적으로 허용 가능한 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다. (예를 들어, Berge 등의 전술한 문헌을 참조한다).
제형 및 투여 방식
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 안티센스 올리고머 접합체의 치료적 전달에 적합한 제형 또는 약학적 조성물을 제공한다. DMD에 대해 세포 투과성 펩티드(예를 들어, PPMO)에 접합된 안티센스 올리고머를 포함하는 약학적 제형은, 예를 들어 미국 특허 제10,888,578호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로서 통합된다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된, 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체 중 하나 이상의 치료적 유효량을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 제공한다. 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 안티센스 올리고머 접합체를 약학적 제형(조성물)으로서 투여하는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 제형의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 안티센스 올리고머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 인산염 완충액을 포함하는 식염수 용액이다.
"약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)"이라는 문구는, 물질 또는 조성물이 제형을 포함하는 다른 성분 및/또는 이를 사용해 치료 중인 대상체와 화학적으로 및/또는 독성학적으로 양립할 수 있어야 함을 의미한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한 담체"라는 문구는, 임의 유형의 비-독성, 불활성 고형, 반고형 또는 액체 필러, 희석제, 캡슐화 물질, 또는 제형화 보조물을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예시는: 락토오스, 포도당 및 수크로오스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아(malt); 젤라틴(gelatin); 탈크(talc); 코코아 버터 및 좌제용 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; 올레산 에틸 및 라우린산 에틸과 같은 에스테르; 한천(agar); 수산화마그세슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제(buffering agent); 알긴산(alginic acid); 발열원 제거수(pyrogen-free water); 등장성 염수(isotonic saline); 링거 용액(Ringer's solution); 에틸 알코올; 인산염 완충액; 라우릴 황산나트륨(sodium lauryl sulfate) 및 스테아린산마그네슘(magnesium stearate)과 같은 적절한 비독성 윤활제; 착색제; 이형제; 코팅제; 감미제; 향미제; 방향제(perfuming agents); 보존제; 및 항산화제 등이며, 제형 업체의 판단에 따른다.
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체에 적용될 수 있는 핵산 분자의 전달 방법은, 예를 들어: Akhtar 등의 문헌 [1992, Trends Cell Bio., 2:139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, CRC Press]; 및 Sullivan 등의 PCT WO 94/02595에 기술되어 있다. 이들 및 다른 프로토콜이 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 포함하는 실질적으로 임의의 핵산 분자를 전달하는 데 이용될 수 있다.
본 개시의 약학적 조성물은 고형물 또는 액체 형태로 투여되도록 특별히 제형화될 수 있으며, 이에는 하기에 맞게 제형화된 것들을 포함한다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제(구강, 설하, 또는 전신 흡수용), 볼루스, 분말, 과립, 혀에 도포하기 위한 페이스트(paste); (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 서방성 제형으로서 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내, 또는 경피 주사에 의한 비경구 투여; (3) 크림, 연고, 또는 방출 조절형 패치 또는 피부에 도포하는 스프레이로서 국소 도포; (4) 페서리(pessary), 크림 또는 발포체로서 질내 또는 직장내 투여; (5) 설하(sublingually) 투여; (6) 안와내(ocularly) 투여; (7) 경피(transdermally) 투여; 또는 (8) 비강(nasally) 투여.
약학적으로 허용 가능한 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 몇몇 예는: (1) 락토오스, 포도당 및 수크로스 등과 같은 당류; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로오스 및 그 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 탈크(talc); (8) 코코아버터 및 좌제용 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유, 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올류; (12) 올레산에틸 및 라우릴산에틴과 같은 에스테르류; (13) 한천(agar); (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원 제거수(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 (22) 약학적 제형에 사용되는 기타 무독성의 호환 가능한 물질을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체와 함께 제형화하기에 적합한 제제의 추가적인 비제한적인 예는 다음을 포함한다: PEG 접합 핵산; 인지질 접합 핵산; 친유성 모이어티 함유 핵산; 포스포로티오에이트; 다양한 조직 내로 약물이 들어가는 것을 향상시킬 수 있는 P-당단백질 억제제(예를 들어, Pluronic P85); 이식 후 서방성 전달을 위한 폴리 (D,L-락타이드-코글리콜리드) 미소구체와 같은 생분해성 중합체(Emerich, D F 등의 문헌[1999, Cell Transplant, 8, 47-58] Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); 혈액 뇌 장벽을 가로질러 약물을 전달할 수 있고 신경 흡수 메커니즘을 변경시킬 수 있는 로딩된 나노입자, 예컨대 폴리부틸시아노아크릴레이트로 만들어진 것들(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).
본 개시는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG") 지질을 함유하는 표면 변형 리포좀(PEG-변형 분지형 및 비분지형 리포좀 또는 이들의 조합, 또는 장기 순환 리포좀 또는 스텔스 리포좀)을 포함하는 조성물의 용도를 또한 포함한다. 본 개시의 안티센스 올리고머는 공유 부착된 다양한 분자량의 PEG 분자를 포함할 수도 있다. 이들 제형은 표적 조직에서 약물의 축적을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 부류의 약물 담체는 단핵 식균 시스템(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌화 및 제거에 저항하여, 캡슐화된 약물이 더 오랜 시간 동안 혈액을 따라 순환하게 하고 조직 노출을 향상시킬 수 있다(Lasic 등의 문헌[Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627]; Ishiwata 등의 문헌[Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011]). 이러한 리포좀은, 짐작컨대 혈관 신생 표적 조직에서의 혈관외 유출(extravasation) 및 포획에 의해, 종양에서 선택적으로 축적되는 것으로 나타났다(Lasic 등의 문헌[Science 1995, 267, 1275-1276]; Oku 등의 문헌(1995) [Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90]). 장기 순환성 리포좀은, 특히 MPS의 조직에 축적되는 것으로 알려진 통상의 양이온성 리포좀과 비교했을 때, DNA 및 RNA의 약동학 및 약력학을 향상시킨다(Liu 등의 문헌[J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870]; Choi 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 96/10391; Ansell 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 96/10390; Holland 등의 국제 PCT 공개 번호 WO 96/10392). 장기 순환성 리포좀도 간 및 비장과 같은 대사적으로 공격적인 MPS 조직에 축적되는 것을 방지하는 이들의 능력에 기초하여 약물이 뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 양이온성 리포좀에 비해 더 많이 보호할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 개시는 미국 특허 제6,692,911호; 제7,163,695호; 및 제7,070,807호에 기술된 것과 같이 전달용으로 제조된 안티센스 올리고머 접합체 약학적 조성물을 포함한다. 이와 관련하여, 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 조성물로서 제공하며, 상기 조성물은 (미국 특허 제7,163,695호; 제7,070,807호; 및 제6,692,911호에 기술된 것과 같은) 리신 및 히스티딘의 공중합체(HK)를 단독으로 포함하거나 PEG(예를 들어, 분지형 또는 비분지형 PEG 또는 이 둘의 혼합물)와 조합하여 포함하거나, PEG 및 표적화 모이어티와 조합하여 포함하거나, 전술한 것 중 어느 하나를 가교제와 조합하여 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 안티센스 올리고머 접합체를 약학적 조성물로서 제공하며, 상기 조성물은 글루콘산-개질 폴리히스티딘 또는 글루코닐화-폴리히스티딘/트랜스페린-폴리리신을 포함한다. 당업자는 His 및 Lys와 유사한 특성을 갖는 아미노산이 조성물 내에서 치환될 수 있다는 것도 인식할 것이다.
습윤제, 유화제 및 윤활제(예컨대, 라우릴 황산 마그네슘 및 스테아린산 마그네슘), 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 방향제, 보존제, 및 항산화제가 또한 조성물 내에 존재할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는, (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산 나트륨, 메타아황산 나트륨, 아황산 나트륨 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 유용성(oil-soluble) 항산화제; 및 (3) 구연산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.
이들 제형 또는 약학적 조성물을 제조하는 방법은 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 담체와 결합시키고, 임의로 하나 이상의 보조 성분과 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 액체 담체, 또는 미세하게 나눈 고형 담체, 또는 둘 다와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음, 필요에 따라, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 개시의 제형은 캡슐, 교갑(cachets), 알약, 정제, (일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 향미 성분을 사용하는) 캔디(lozenges), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비수성 액체 형태의 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 유화제, 또는 엘릭서 또는 시럽, 또는 (젤라틴과 글리세린, 또는 수크로오스와 아카시아와 같은 불활성 염기를 사용하는) 캔디(pastilles) 및/또는 구강 세정액 등의 형태일 수 있으며, 이들은 활성 성분으로서 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 소정의 양을 각각 함유한다. 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 또한 볼루스, 연약(electuary), 또는 페이스트로서 투여될 수도 있다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은, 본 개시의 하나 이상의 올리고머 접합체를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 또는 사용 직전에 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액으로 재구성할 수 있는 멸균 분말과의 조합으로 포함할 수 있으며, 당류, 알코올, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제(bacteriostats), 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 현탁제 또는 증점제(thickening agents)를 함유할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 올레산 에틸과 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 안티센스 올리고머 접합체는 식 (I)에 따른 것이다.
이들 약학적 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수도 있다. 대상 올리고머 접합체에 대한 미생물의 작용을 방지하는 것은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 또한, 조성물에 당류, 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사 가능한 약학적 형태의 흡수를 연장시키는 것은 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아린산알루미늄 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사에 비해 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 당업계에 공지된 다른 방법들 가운데, 수용해도가 낮은 결정질 또는 비정질 물질로 이루어진 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 그런 다음, 약물의 흡수는 현탁액의 용해 속도에 따라 달라지며, 이는 결국 결정 크기 및 결정 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 흡수를 지연시키는 것은 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁함으로써 달성된다.
주사 가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체에 싸인 대상 올리고머 접합체의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조할 수 있다. 올리고머 대 중합체의 비율, 및 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 올리고머의 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사식 제형은, 신체 조직과 비슷한 리포좀 또는 마이크로유화액에 약물을 포획(entrapping)함으로써 제조할 수도 있다.
본 개시의 안티센스 올리고머 접합체가 제약으로서 인간과 동물에게 투여될 때, 이들은 그 자체로서 투여되거나, 0.1 내지 99%(더 바람직하게는 10 내지 30%)의 안티센스 올리고머 접합체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 함유하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다.
본 개시의 제형 또는 제제는 경구, 비경구, 국소 또는 직장 내 투여될 수 있다. 이들은 일반적으로 각각의 투여 경로에 적합한 형태로 투여된다. 예를 들어, 이들은 주사, 흡입, 안구 로션, 연고, 좌제, 또는 주입에 의해 정제 또는 캡슐 형태로 투여되거나; 로션 또는 연고에 의해 국소 투여되거나; 좌제에 의해 직장 내 투여된다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체 및/또는 본 개시의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 허용 가능한 독성이 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다.
선택된 투여량 수준은 다양한 인자에 따라 달라지게 되며, 이에는 사용된 본 개시의 특정 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 기간, 사용 중인 특정 올리고머의 배출 또는 대사 속도, 흡수 속도 및 정도, 치료 기간, 사용된 특정 올리고머와 조합으로 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 나이, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의료 분야에 잘 알려진 유사한 인자들이 포함된다.
당업계에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약학적 조성물에 사용된 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 투여량을, 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 적절한 일일 투여량은 치료 효과를 생성하는 가장 낮은 투여량인 안티센스 올리고머 접합체의 양일 것이다. 이러한 유효 투여량은 일반적으로 본원에 기술된 인자들에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 환자를 위한 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 경구, 정맥내, 뇌실내 및 피하 투여량은, 표시된 효과를 위해 사용될 때, 매일 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg(체중)의 범위일 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 일반적으로 약 10~160 mg/kg 또는 20~160 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 경우에, 160 mg/kg 초과의 투여량이 필요할 수 있다. 일부 구현예에서, i.v. 투여를 위한 투여량은 약 0.5 내지 160 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 약 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 약 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg의 투여량으로 투여되며, 이들 사이의 모든 정수 투여량을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머는 10 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 20 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 30 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 40 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 60 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 80 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 160 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 올리고머는 50 mg/kg으로 투여된다.
일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 일반적으로 약 10 내지 160 mg/kg 또는 20 내지 160 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 투여량은, i.v. 투여의 경우, 약 0.5 mg 내지 160 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 약 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 약 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 18 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 25 mg/kg, 26 mg/kg, 27 mg/kg, 28 mg/kg, 29 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 50 mg/kg, 51 mg/kg, 52 mg/kg, 53 mg/kg, 54 mg/kg, 55 mg/kg, 56 mg/kg, 57 mg/kg, 58 mg/kg, 59 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg의 투여량으로 투여되며, 이들 사이의 모든 정수 투여량을 포함한다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 10 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 20 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 30 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 40 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 60 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 80 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 160 mg/kg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 식 (VI), 식 (VIII), 또는 식 (X)의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 50 mg/kg으로 투여된다.
원하는 경우, 활성 화합물의 유효 일일 투여량은, 하루 전체에 걸쳐 적당한 간격을 두고 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상의 하위 투여량으로 투여될 수 있고, 임의로는 단위 투여량 형태로 투여될 수 있다. 특정 상황에서는, 투여가 매일 1회 이루어진다. 소정의 구현예에서, 투여는 기능성 디스트로핀 단백질의 원하는 발현을 유지하기 위해 필요에 따라 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일마다 1회 이상 투여되거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주마다 1회 이상 투여되거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 마다 1회 이상 투여되는 것이다. 소정의 구현예에서, 투여는 2주마다 1회 이상 투여되는 것이다. 일부 구현예에서, 투여는 2주마다 1회 투여되는 것이다. 다양한 구현예에서, 투여는 매월 1회 이상 투여되는 것이다. 소정의 구현예에서, 투여는 매월 1회 투여되는 것이다.
다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 10 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 20 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 30 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 40 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 60 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 80 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 100 mg/kg으로 매주 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 160 mg/kg으로 매주 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 매주는 당업계에서 인정되는 주 1회의 의미를 갖는 것으로 이해된다.
다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 10 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 20 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 30 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 40 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 60 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 80 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 100 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 160 mg/kg으로 2주마다 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 격주는 당업계에서 인정되는 2주마다 1회의 의미를 갖는 것으로 이해된다.
다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 10 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 20 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 30 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 40 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 60 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 80 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 100 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 160 mg/kg으로 3주마다 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 3주마다는 당업계에서 인정되는 3주마다 1회의 의미를 갖는 것으로 이해된다.
다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 10 mg/kg으로 매월 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 20 mg/kg으로 매월 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 30 mg/kg으로 매월 투여된다. 다양한 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 40 mg/kg으로 매월 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 60 mg/kg으로 매월 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 80 mg/kg으로 매월 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 100 mg/kg으로 매월 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 160 mg/kg으로 매월 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 매월은 당업계에서 인정되는 월 1회의 의미를 갖는 것으로 이해된다.
당업계에서 이해될 수 있는 바와 같이, 매주, 2주마다, 3주마다, 또는 매월 투여는 본원에서 논의된 바와 같이 1회 이상의 투여량 또는 하위 투여량으로 이루어질 수 있다.
본원에 기술된 핵산 분자 및 안티센스 올리고머 접합체는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 세포에 투여될 수 있으며, 상기 방법은 본원에서 기술되고 당업계에 알려진 것과 같은 리포좀으로 캡슐화하기, 이온영동에 의한 방법, 또는 다른 비히클(예를 들어, 하이드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐, 및 생체접착성 미소구체)로의 혼입에 의한 방법을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 미세유화 기술(microemulsification technology)을 이용해 친유성(수 불용성) 약학적 제제의 생체이용률을 개선할 수 있다. 예로는, 트리메트린(Trimetrine) (Dordunoo, S. K. 등의 문헌[Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991] 참조) 및 REV 5901 (Sheen, P. C. 등의 문헌[J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991 참조)이 있다. 다른 이점 중에서, 미세유화는 순환계 대신에 림프계로 우선적으로 흡수를 유도하여 생체이용률을 향상시키고, 간을 우회함으로써 간담즙의 순환(hepatobiliary circulation) 중에 화합물이 파괴되는 것을 방지한다.
본 개시의 일 측면에서, 제형은 본원에서 제공된 것과 같은 올리고머 및 적어도 하나의 양친매성 담체로 형성된 미셀을 함유하며, 여기서 미셀은 약 100 nm 미만의 평균 직경을 갖는다. 보다 바람직한 구현예는 약 50 nm 미만의 평균 직경을 갖는 미셀을 제공하고, 훨씬 더 바람직한 구현예는 약 30 nm 미만, 또는 심지어 약 20 nm 미만의 평균 직경을 갖는 미셀을 제공한다.
모든 적절한 양친매성 담체가 고려되지만, 현재 바람직한 담체는 일반적으로 안전하다고 간주되는 물질(Generally-Recognized-as-safe; GRAS) 상태를 가지며, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 양쪽 모두에서 가용화하여, 용액이 (인간 위장관에서 발견되는 것과 같은) 복잡한 수상과 접촉하는 나중 단계에 이를 미세유화시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 요건을 만족하는 양친매성 성분은 2~20의 HLB(친수성 대 친유성 균형) 값을 가지며, 이들의 구조는 C-6 내지 C-20 범위의 직쇄 지방족 라디칼을 함유한다. 예로는 폴리에틸렌-글리콜화 지방 글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
양친매성 담체의 예는, 포화 및 단일불포화 폴리에틸렌화 글리콜화 지방산 글리세리드, 예컨대 완전히 또는 부분적으로 수소화된 다양한 식물성 오일로부터 수득된 것들을 포함한다. 이러한 오일은 유리하게는, 삼-, 이-, 및 단일-지방산 글리세리드 및 상응하는 지방산의 이- 및 단일-폴리(에틸렌 글리콜) 에스테르로 구성될 수 있으며, 특히 바람직한 지방산 조성물은 카프르산(capric acid) 4~10%, 카프르산 3~9%, 라우르산(lauric acid) 40~50%, 미리스트산(myristic acid) 14~24%, 팔미트산(palmitic acid) 4~14%, 스테아르산 5~15%로 이루어질 수 있다. 또 다른 유용한 부류의 양친매성 담체는, 포화 또는 단일 불포화 지방산(SPAN-시리즈) 또는 상응하는 에톡실화 유사체(TWEEN-시리즈)를 갖는, 부분적으로 에스테르화된 소르비탄 및/또는 소르비톨을 포함한다.
상업적으로 이용 가능한 양친매성 담체가 특히 유용할 수 있으며, 이에는 겔루시어(Gelucire)-시리즈, 라브라필(Labrafil), 라브라솔(Labrasol), 또는 라우로글리콜(Lauroglycol(전부 Gattefosse Corporation(Saint Priest, France)에 의해 제조되고 유통됨), PEG-모노-올레에이트, PEG-디-올레에이트, PEG-모노-라우레이트 및 디-라우레이트, 레시틴(Lecithin), 폴리소르베이트 80 등(미국 및 전 세계 여러 회사에 의해 생산되고 유통됨)이 포함된다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물을 적절한 숙주 세포 내로 도입하기 위한 전달은 리포좀, 나노캡슐, 극미립자, 미소구체, 지질 입자, 소포체 등을 사용해 이루어질 수 있다. 특히, 본 개시의 약학적 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포체, 나노구체, 나노입자 등에 캡슐화되어 전달되도록 제형화될 수 있다. 이러한 전달 비히클의 제형화 및 사용은 알려진 종래의 기술을 사용해 수행될 수 있다.
본 개시에서 사용하기에 적합한 친수성 중합체는, 쉽게 물에 녹고, 소포체 형성 지질에 공유 부착될 수 있으며, 독성 효과 없이 생체 내 내약성이 있는 (즉, 생체 적합한) 것들이다. 적합한 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리락트산(폴리락티드로도 불림), 폴리글리콜산(폴리글리콜리드로도 불림), 폴리락트-폴리글리콜산 공중합체, 및 폴리비닐 알코올을 포함한다. 소정의 구현예에서, 중합체는 약 100 또는 120 달톤 내지 약 5,000 또는 10,000 달톤, 또는 약 300 달톤 내지 약 5,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 다른 구현예에서, 중합체는 약 100 내지 약 5,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖거나, 약 300 내지 약 5,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 소정의 구현예에서, 중합체는 약 750 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜), 예를 들어 PEG(750)이다. 중합체는 또한 그 안의 단량체의 수에 의해 정의될 수 있고; 본 개시의 바람직한 구현예는 적어도 약 3개의 단량체로 이루어진 중합체를 이용하며, 3개의 단량체로 이루어진 이러한 PEG 중합체는 대략 132 달톤의 분자량을 갖는다.
본 개시에서 사용하기에 적합할 수 있는 다른 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 폴리메톡사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 및 유도체화된 셀룰로오스, 예컨대 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 하이드록시에틸셀룰로오스를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시의 제형은 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 아크릴 에스테르와 메타크릴 에스테르의 중합체, 폴리비닐 중합체, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이의 공중합체, 셀룰로오스, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 젖산과 글리콜산의 중합체, 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부트산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 다당류, 단백질, 폴리히알루론산, 폴리시아노아크릴산염, 및 이들의 블렌드, 혼합물, 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 생체적합성 중합체를 포함한다.
시클로덱스트린은 그리스 문자 α, β 또는 γ로 각각 지정된, 6, 7 또는 8개의 포도당 단위로 각각 이루어진 고리형 올리고당이다. 포도당 단위는 α-1,4-글루코시드 결합에 의해 연결된다. 의자 형태로 이루어진 당 단위의 결과로서, (C-2, C-3에서의) 모든 이차 하이록실기는 고리의 일측에 위치하는 한편, C-6에서의 모든 일차 하이록실기는 타측에 위치한다. 그 결과, 외부 면은 친수성이어서, 시클로덱스트린이 수용성이 된다. 대조적으로, 시클로덱스트린의 공동은 소수성인데, 이는 이들이 원자 C-3 및 C-5의 수소, 및 에테르-유사 산소에 의해 채워지기 때문이다. 이들 매트릭스는, 예를 들어, 17α-에스트라디올과 같은 스테로이드 화합물을 포함하는 다양한 상대적으로 소수성 화합물과 복합체를 이룰 수 있게 한다(예를 들어, van Uden 등의 문헌[Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38:1-3-113 (1994)] 참조). 복합체화는 반데르 발스 상호작용과 수소 결합의 형성에 의해 이루어진다. 시클로덱스트린의 화학물질에 대한 전반적인 검토를 위해서는, Wenz, Agnew의 문헌 [Chem Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994)]을 참조한다.
시클로덱스트린 유도체의 물리-화학적 특성은 치환의 종류와 정도에 따라 크게 달라진다. 예를 들어, 이들의 수 용해도는 불용성(예를 들어, 트리아세틸-베타-시클로덱스트린) 내지 147% 가용성(w/v)(G-2-베타-시클로덱스트린)의 범위이다. 또한, 이들은 많은 유기 용매에서 가용성이다. 시클로덱스트린의 특성은 이들의 용해도를 증가시키거나 감소시킴으로써 다양한 제형 성분의 용해도를 조절할 수 있게 한다.
다수의 시클로덱스트린 및 이들의 제조 방법이 기술되어 왔다. 예를 들어, Parmeter (I) 등과 (미국 특허 제3,453,259호) Gramera 등은 (미국 특허 제3,459,731호) 전기적 중성인(electroneutral) 시클로덱스트린을 기술하였다. 다른 유도체에는 양이온성 특성을 갖는 시클로덱스트린[Parometer (II)의 미국 특허 제3,453,257호], 불용성 가교형 시클로덱스트린(Solms의 미국 특허 제3,420,788호), 및 음이온성 특성을 갖는 시클로덱스트린[Parometer (III)의 미국 특허 제3,426,011호]이 포함된다. 음이온성 특성을 갖는 시클로덱스트린 유도체 중에는, 카르복실산, 안인산, 포스핀산(phosphinous acids), 포스폰산(phosphonic acids), 인산(phosphoric acids), 티오포스폰산, 티오술핀산(thiosulphinic acids), 및 설폰산이 부모 시클로덱스트린에 첨가된 것들이 있다[Parmeter (III)의 전술한 문헌 참조]. 또한, 설포알킬 에테르 시클로덱스트린 유도체가 Stella 등에 의해 기술되었다 (미국 특허 제5,134,127호).
리포좀은 수성 내부 구획(compartment)을 둘러싸는 적어도 하나의 지질 이중층 막으로 이루어진다. 리포좀은 막의 유형 및 크기에 따라 특징을 가질 수 있다. 소형 단층상 소포체(Small unilamellar vesicles, SUV)는 하나의 막을 가지고, 일반적으로 그 직경이 0.02 내지 0.05 μm이며, 대형 단층상 소포체(LUV)는 일반적으로 0.05 μm보다 크다. 올리고층 큰 소포체 및 다중층 소포체는 보통은 동심원을 이루는 다수의 막층(membrane layer)을 가지며, 일반적으로 0.1 μm보다 크다. 여러 개의 비동심원 막을 갖는 리포좀, 즉 큰 소포체 내에 담긴 여러 개의 작은 소포체는 다소포체형 소포체(multivesicular vesicles)라 부른다.
본 개시의 일 양태는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 함유하는 리포좀을 포함하는 제형에 관한 것으로서, 여기서 리포좀 막은 증가된 담체 능력(carrying capacity)을 리포좀에 제공하도록 제형화된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 리포좀의 리포좀 이중층 내에 함유되거나 그 위에 흡착될 수 있다. 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 지질 계면활성제와 함께 응집되어 리포좀 내부 공간 내에서 운반될 수 있으며; 이러한 경우, 리포좀 막은 활성제-계면활성제 응집체의 파괴적 효과에 저항하도록 제형화된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 리포좀의 지질 이중층은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)로 유도체화된 지질을 함유하여, PEG 사슬이 지질 이중층의 내부면으로부터 리포좀에 의해 캡슐화된 내부 공간으로 연장되고, 지질 이중층의 외부로부터 주변 환경 내로 연장된다.
본 개시의 리포좀에 함유된 활성제는 가용화된 형태이다. 계면활성제와 활성제의 응집체(예컨대, 관심 활성제를 함유하는 유화액 또는 미셀)는 본 개시에 따른 리포좀의 내부 공간 내에 포획될 수 있다. 계면활성제는 활성제를 분산시키고 가용화시키는 역할을 하며, 다양한 사슬 길이의 (예를 들어, 약 C14 내지 약 C20) 생체 적합성 리소포스파티딜콜린(LPG)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 지방족, 시클로지방족 또는 방향족 계면활성제로부터 선택될 수 있다. PEG-지질과 같은 중합체-유도체화 지질은 미셀을 형성하는 데 이용될 수도 있는데, 이는 이들이 미셀/막 융합을 억제하는 역할을 하게 되고, 계면활성제 분자에 첨가된 중합체가 계면활성제의 CMC를 감소시켜 미셀 형성에 도움을 주기 때문이다. CMO를 마이크로몰 범위로 포함하는 계면활성제가 바람직하며; CMC가 더 높은 계면활성제를 이용해 본 개시의 리포좀 내에 포획된 미셀을 제조할 수 있다.
본 개시에 따른 리포좀은 당업계에 공지된 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,235,871호; 공개된 PCT 출원 WO 96/14057; 신규 RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), pages 33-104; 및 Lasic DD의 문헌[Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993]을 참조한다. 예를 들어, 본 개시의 리포좀은 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 미리 형성된 리포좀으로 확산시킴으로써 제조될 수 있으며, 예컨대, 유도체화된 지질의 최종 몰 백분율에 상응하는 (리포좀에게는 바람직한) 지질 농도에서 지질-이식 중합체로 이루어진 미셀에 미리 형성된 리포좀을 노출시킴으로써 제조될 수 있다. 친수성 중합체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 것과 같은 균질화(homogenization), 지질 분야 수화(lipid-field hydration), 또는 압출 기술에 의해 형성될 수도 있다.
또 다른 예시적인 제형화 절차에서, 활성제는 소수성 분자를 쉽게 가용화시키는 초음파 처리(sonication)에 의해 리소포스파티딜콜린 또는 CMC가 낮은 다른 계면활성제(중합체 이식된 지질 포함)에서 먼저 분산된다. 이어서, 생성된 활성제의 미셀 현탁액을 사용하여, 적절한 몰 백분율의 중합체-이식 지질 또는 콜레스테롤을 포함하는 건조된 지질 샘플을 재수화한다. 이어서, 당업계에 공지된 바와 같은 압출 기술을 사용해 지질과 활성제의 현탁액을 리포좀으로 형성하고, 생성된 리포좀을 표준 컬럼 분리에 의해 캡슐화 용액으로부터 분리한다.
본 개시의 일 양태에서, 리포좀은 선택된 크기 범위에서 실질적으로 균질한 크기를 갖도록 제조된다. 하나의 효과적인 크기 조절 방법(sizing method)은 선택된 균일한 기공 크기를 갖는 일련의 폴리카보네이트 막을 통해 리포좀의 수성 현탁액을 압출하는 단계를 포함하며; 막의 기공 크기는 해당 막을 통해 압출에 의해 생산된 가장 큰 리포좀의 크기와 대략 상응할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제4,737,323호(1988년 4월 12일)를 참조한다. 소정의 구현예에서, DharmaFECT® 및 Lipofectamine®과 같은 시약을 사용해 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 세포 내에 도입할 수 있다.
본 개시의 제형의 방출 특성은 캡슐화 물질, 캡슐화된 약물의 농도, 및 방출 조절제의 존재에 따라 달라진다. 예를 들어, 방출은 가령, 위에서와 같이 낮은 pH에서만 방출하거나 장에서와 같이 높은 pH에서만 방출하는 pH 감수성 코팅을 사용해 pH 의존적으로 조절될 수 있다. 장용 코팅(enteric coating)을 사용해, 위를 통과할 때까지 방출이 일어나지 않게 할 수 있다. 다중 코팅 또는 상이한 물질로 캡슐화된 시안아미드(cyanamide)의 혼합물을 사용해 초기 방출이 위에서 일어나게 하고, 이어서 지연 방출이 장에서 일어나게 할 수 있다. 방출은 염 또는 기공 형성제를 포함시켜 조작할 수도 있는데, 이는 확산에 의해 수분 흡수를 증가시키거나 캡슐로부터 약물 방출을 증가시킬 수 있다. 약물의 용해도를 변형시키는 부형제를 사용해 방출 속도를 조절할 수도 있다. 매트릭스의 분해를 강화하거나 매트릭스로부터의 방출을 향상시키는 제제가 혼입될 수도 있다. 이들은 약물에 첨가되거나, 별도의 상으로서(즉, 미립자로서) 첨가되거나, 화합물에 따라 중합체 상에서 함께 용해될 수 있다. 대부분의 경우에, 양은 0.1 내지 30%(w/w 중합체)이어야 한다. 분해 증강제의 유형에는 황산 암모늄 및 염화 암모늄과 같은 무기산; 구연산, 벤조산 및 아스코르브산과 같은 유기산; 탄산나트륨, 탄산 칼륨, 탄산 칼슘, 탄산 아연, 및 수산화 아연과 같은 무기 염기; 황산 트리아민, 스페르민(spermine), 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 및 트리에탄올아민과 같은 유기 염기; 및 Tween® 및 Pluronic®과 같은 계면활성제가 포함된다. 매트릭스에 미세구조를 첨가하는 기공 형성제(즉, 무기 염 및 당류와 같은 수용성 화합물)가 미립자로서 첨가된다. 범위는 통상적으로 1 내지 30%(w/w 중합체)이다.
입자의 소화관 내 체류 시간을 변경함으로써 흡수를 조작할 수도 있다. 이는, 예를 들어, 점막 접착성 중합체로 입자를 코팅하거나 이를 캡슐화 물질로 선택함으로써 달성될 수 있다. 예에는 유리 카르복실기를 갖는 대부분의 중합체, 예컨대, 키토산, 셀룰로오스, 및 특히 폴리아크릴레이트(본원에서 사용되는 바와 같은, 폴리아크릴레이트는 아크릴레이트기 및 변형된 아클릴레이트 기, 예컨대 시아노아크릴레이트 및 메타크릴레이트를 지칭함)가 포함된다.
안티센스 올리고머 접합체는 수술 도구나 의료 기기 또는 임플란트 내에 담기도록 제형화 되거나 이들에 의해 방출되기 적합하도록 제형화될 수 있다. 특정 양태에서, 임플란트는 안티센스 올리고머 접합체로 코팅되거나 달리 이로 처리될 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔, 또는 다른 중합체, 예컨대 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체가 본 개시의 약학적 조성물로 임플란트를 코팅하는데 사용될 수 있다(즉, 조성물은 하이드로겔 또는 다른 중합체를 사용함으로써 의료 장치와 함께 사용하도록 구성될 수 있다). 의료 장치를 제제로 코팅하기 위한 중합체 및 공중합체는 당업계에 잘 알려져 있다. 이식재의 예로는, 스텐트, 약물-용출 스텐트, 봉합물(sutures), 보형물(prosthesis), 혈관 카테터, 투석 카테터, 혈관 이식편(vascular grafts), 인공 심장 판막(prosthetic heart valve), 심박 조절기(cardiac pacemakers), 이식형 제세동기(implantable cardioverter defibrillators), IV 바늘, 접골 및 골 형성용 장치, 예컨대 핀, 스크류, 플레이트 및 기타 장치, 및 상처 치유를 위한 인공 조직 매트릭스 등이 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 제공되는 방법에 추가하여, 본 개시에 따라 사용하기 위한 안티센스 올리고머 접합체는 다른 약제와의 상사성(analogy)에 따라 인간 또는 수의용 의약에 사용하기 위해, 임의의 편리한 방법으로 투여하도록 제형화될 수 있다. 안티센스 올리고머 접합체 및 이들의 상응하는 제형은 근아세포 이식, 줄기 세포 치료, 아미노글리코시드 항생제, 프로테아좀 억제제 및 상향조절 요법(예를 들어, 디스트로핀의 상염색체 파라로그인 유트로핀의 상향조절)의 투여와 같은 근 이영양증의 치료 시 단독으로 투여되거나 다른 치료 전략과 조합으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체의 투여 이전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고머 접합체는 스테로이드 및/또는 항생제와 조합하여 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 안티센스 올리고머 접합체는 백그라운드 스테로이드 치료 (예를 들어, 간헐적 또는 만성/연속적 백그라운드 스테로이드 치료) 중인 환자에게 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 환자는 안티센스 올리고머의 투여 전에 코르티코스테로이드로 치료 받은 적이 있으며, 계속해서 스테로이드 치료를 받는다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 글루코코르티코이드 또는 프레드니손(prednisone)이다.
당업자는 임의의 특정 동물 및 병태에 맞는 최적 투여 경로 및 임의의 투여량을 쉽게 결정할 수 있으므로, 기술된 투여 경로는 단지 가이드로서 의도된다. 기능적인 신규 유전 물질을 시험관 내 및 생체 내 모두에서 세포 내로 도입하기 위한 다수의 접근법이 시도되어 왔다(Friedmann의 문헌[(1989) Science, 244:1275-1280]). 이들 접근법에는, 발현될 유전자의 변형된 레트로바이러스로의 통합(Friedmann의 전술한 (1989) 문헌; Rosenberg의 문헌[(1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S]); 비-레트로바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터)로의 통합(Rosenfeld 등의 문헌[(1992) Cell, 68:143-155]; Rosenfeld 등의 문헌[(1991) Science, 252:431-434]); 또는 리포좀을 통해 이종 프로모터-인핸서 요소에 연결된 이식 유전자의 전달(Friedmann의 전술한 (1989) 문헌; Brigham 등의 문헌[(1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281]; Nabel 등의 문헌[(1990) Science, 249:1285-1288]; Hazinski 등의 문헌[(1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209]; 및 Wang 및 Huang의 문헌[(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855]); 리간드-특이적 양이온 기반 전송 시스템에의 결합된 이식 유전자의 전달(Wu 및 Wu의 문헌[(1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624]); 또는 네이키드 DNA, 발현 벡터의 사용(Nabel 등의 전술한 (1990) 문헌; Wolff 등의 문헌[(1990) Science, 247:1465-1468])이 포함된다. 이식 유전자를 조직에 직접 주사하면 국부적인 발현만이 생성된다(Rosenfeld의 전술한 (1992) 문헌; Rosenfeld 등의 전술한 (1991) 문헌; Brigham 등의 전술한 (1989) 문헌; Nabel의 전술한 (1990) 문헌; 및 Hazinski 등의 전술한 (1991) 문헌). Brigham 등의 그룹(Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 and Clinical Research (1991) 39 (요약))은 DNA 리포좀 복합체의 정맥내 또는 기관내 투여 후 마우스의 폐에서만 생체 내 형질감염이 나타났음을 보고하였다. 인간 유전자 치료 절차에 대한 검토 논평의 예는 Anderson의 문헌[Science (1992) 256:808-813]에 있다.
추가 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 Han 등의 문헌에서 제공된 것과 같은 탄수화물을 추가로 포함할 수 있다(Han 등의 문헌[Nat. Comms. 7, 10981 (2016), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 5%의 헥소오스 탄수화물(hexose carbohydrate)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 약학적 조성물은 5% 포도당, 5% 과당, 또는 5% 만노오스를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 2.5% 포도당 및 2.5% 과당을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은: 5 부피%의 양으로 존재하는 아라비노오스(arabinose); 5 부피%의 양으로 존재하는 포도당; 5 부피%의 양으로 존재하는 소르비톨; 5 부피%의 양으로 존재하는 갈락토오스; 5 부피%의 양으로 존재하는 과당; 5 부피%의 양으로 존재하는 크실리톨; 5 부피%의 양으로 존재하는 만노오스; 각각 2.5 부피%의 양으로 존재하는 포도당과 과당의 조합; 및 5.7 부피%의 양으로 존재하는 포도당, 2.86 부피%의 양으로 존재하는 과당, 및 1.4 부피%의 양으로 존재하는 크실리톨의 조합으로부터 선택된 탄수화물을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체는 액체 약학적 제형으로 투여되며, 여기서 접합체의 농도는 약 50 mg/ml이다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체 및/또는 본 개시의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 허용 가능한 독성이 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 달라질 수 있다.
사용 방법
본 개시에 기술된 투여 요법은 해당 치료를 필요로 하는 환자에서 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체로 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 DMD 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 대상체는 엑손 스키핑에 순응하는, 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖고, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 엑손은 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 또는 엑손 53이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53 스키핑)에 순응하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖는 대상체에서 디스트로핀 생산을 유도하기 위해 mRNA 판독 프레임을 복원하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, 엑손 스키핑에 순응하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖는 대상체에서 mRNA 프로세싱 도중에 디스트로핀 pre-mRNA로부터 엑손(예를 들어, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53)을 제외시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53 스키핑)에 순응하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖는 대상체에서 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손(예를 들어, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53)을 결합시키는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
디스트로핀 합성 또는 생산에 관한 용어 "복원(restoration)"은 근 이영양증 환자를 대상으로 본원에 기술된 안티센스 올리고머 접합체로 치료한 후 절단된 형태의 디스트로핀을 포함하는 디스트로핀 단백질이 생산되는 것을 일반적으로 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 환자에게서 신규한 디스트로핀 생산을 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%(이들 사이의 모든 정수 포함)만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에서 디스트로핀-양성 섬유의 수를 정상 수준의 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 내지 100%까지 증가시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 환자에서 디스트로핀-양성 섬유의 수를 정상 수준의 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 30% 내지 약 50%까지 증가시킨다. 치료 후 환자에서의 디스트로핀-양성 섬유의 백분율은 공지된 기술을 사용한 근육 생검에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 근육 생검은 환자의 적절한 근육, 예컨대 이두근(biceps brachii muscle)을 취하여 이루어질 수 있다.
양성 디스트로핀 섬유의 백분율 분석은 치료 전 및/또는 치료 후 또는 치료 과정 전체 시점에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 후 생검은 치료 전 생검의 대측성 근육을 취하여 이루어진다. 치료 전 및 후 디스트로핀 발현 분석은 디스트로핀에 대한 임의의 적합한 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역조직화학 검출은 디스트로핀의 마커인 항체, 예컨대 단클론 또는 다클론 항체를 사용해 근육 생점에서의 조직 절편에서 수행된다. 예를 들어, 디스트로핀에 대해 고도로 민감한 마커인 MANDYS106 항체를 사용할 수 있다. 임의의 적절한 이차 항체가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 디스트로핀-양성 섬유의 백분율은 양성 섬유의 수를 계수된 총 섬유로 나눔으로써 계산된다. 정상적인 근육 샘플은 100% 디스트로핀-양성 섬유를 갖는다. 따라서, 디스트로핀-양성 섬유의 백분율은 정상 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 치료 전 근육 뿐만 아니라 비정상적인 섬유에서도 미량 수준의 디스트로핀의 존재를 밝혀내기 위해, 치료 후 근육에서 디스트로핀-양성 섬유를 계수할 때 환자의 치료 전 근육의 절편을 사용해 베이스라인을 설정할 수 있다. 이는 해당 환자의 치료 후 근육의 절편에서 디스트로핀-양성 섬유를 계수하기 위한 임계치로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체-염색된 조직 절편이 Bioquant 이미지 분석 소프트웨어(Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN)를 사용하는 디스트로핀 정량화에 사용될 수도 있다. 총 디스트로핀 형광 신호 강도는 정상 수준의 백분율로서 보고될 수 있다. 또한, 단클론 또는 다클론 항-디스트로핀 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 디스트로핀 양성 섬유의 백분율을 결정할 수 있다. 예를 들어, Leica Biosystems의 항-디스트로핀 항체 NCL-Dys1이 사용될 수 있다. 디스트로핀-양성 섬유의 백분율은 사르코글리칸 복합체(sarcoglycan complex, b,g) 및/또는 신경 NOS의 성분의 발현을 결정함으로써 분석될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 사용하는 치료는 DMD 환자에서 치료 부재 시에 예상되는 점진적 호흡기 근육의 기능 장애 및/또는 부전을 지연시키거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 사용하는 치료는 치료 부재 시에 예상되는 호흡 지원(ventilation assistance)의 필요성을 감소시키거나 없앨 수 있다. 일부 구현예에서, 질환의 과정을 추적하는 것 뿐만 아니라 잠재적 치료 개입을 평가하기 위한 호흡 기능의 척도는 최대 흡기압(maximum inspiratory pressure, MIP), 최대 호기압(maximum expiratory pressure, MEP), 및 노력성 폐활량(forced vital capacity, FVC)을 포함한다. MIP와 MEP는 들숨과 날숨 동안에 사람이 각각 생성할 수 있는 압력 수준을 측정하는 것이며, 호흡 근육 강도의 민감한 척도이다. MIP는 횡격막 근육 취약성의 척도이다.
일부 구현예에서, MIP 및 FVC를 포함하는 다른 폐 기능 시험에서 변화가 나타나기 전에 MEP가 감소할 수 있다. 소정의 구현예에서, MEP는 호흡기 기능 장애의 조기 표시자일 수 있다. 소정의 구현예에서, FVC를 사용해 최대 흡기 후 강제 호기 도중에 배출되는 공기의 총량을 측정할 수 있다. DMD 환자에서, FVC는 10대 초기가 될 때까지 신체의 성장과 동시에 증가한다. 그러나, 성장이 둔화되거나 질환 진행에 의해 성장이 저해되고 근육 약화가 진행됨에 따라, 폐활량은 쇠퇴기에 접어 들어 10세 내지 12세 이후에는 매년 약 8 내지 8.5%의 평균 속도로 감소한다. 소정의 구현예에서, MIP 예측률(체중에 맞게 조정된 MIP), MEP 예측률(나이에 맞게 조정된 MEP), 및 FVC 예측률(나이 및 신장에 맞게 조정된 FVC)은 보조 분석 수단이다.
본원에서 사용된 용어 "대상체(subject)" 및 "환자(patient)"는 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체로 치료될 수 있는 증상을 나타내거나 나타낼 위험이 있는 임의의 동물, 예컨대 DMD 또는 BMD, 또는 이들 병태(예를 들어, 근육 섬유 손실)와 관련된 증상 중 어느 하나를 가졌거나 가질 위험이 있는 대상체(또는 환자)를 포함한다. 적절한 대상체(또는 환자)에는 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그 등), 축산 동물, 가축 또는 애완 동물(예를 들어, 고양이 또는 개)이 포함된다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자(또는 대상체)가 포함된다. 또한 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 엑손 45, 엑손 50, 엑손 51, 엑손 52, 엑손 53 스키핑)에 순응하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 가진 대상체(또는 환자)에서 디스트로핀을 생산하는 방법이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "전신 투여(systemic administration 및 administered systemically)" 및 "말초 투여(peripheral administration 및 administered peripherally)"라는 문구는 화합물, 약물 또는 기타 물질이 환자의 전신에 들어감으로써 대사 및 기타 유사한 과정을 거치도록, 중추 신경계에 직접 투여하는 것을 제외한 투여, 예를 들어, 피하 투여를 의미한다.
"표적화 서열(targeting sequence)"이라는 문구는 표적 pre-mRNA에서 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 올리고머의 핵염기 서열을 지칭한다. 본 개시의 일부 양태에서, 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 H51A(+66+95)로 지정된 엑손 51 어닐링 부위이다. 본 개시의 일부 양태에서, 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 H45A(-03+19)로 지정된 엑손 45 어닐링 부위이다. 일부 양태에서, 표적 pre-mRNA의 뉴클레오티드 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 H53A(+36+60)로 지정된 엑손 53 어닐링 부위이다.
대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유류)의 "치료(treatment)"는 대상체의 자연 과정을 변경시키기 위한 시도에 사용되는 임의 유형의 개입이다. 치료는 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적 조성물의 투여를 포함하되 이에 한정되지는 않으며, 예방적으로 수행되거나 병리적 이벤트의 개시 또는 기병성 인자(etiologic agent)와의 접촉이 있은 후에 수행될 수 있다. 치료는, 특정 형태의 근 이영양증에서와 같이, 디스트로핀 단백질과 관련된 질환 또는 병태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 바람직한 효과를 포함하며, 예를 들어, 치료 중인 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커에서의 최소 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. "예방적(prophylactic)" 치료도 포함되는데, 이는 치료 중인 질환 또는 병태의 진행 속도를 감소시키거나, 해당 질환 또는 병태의 발생을 지연시키거나, 그 중증도를 감소시키는 것에 관한 것일 수 있다. "치료" 또는 "예방"이 반드시 질환 또는 병태, 또는 이의 관련 증상의 완전한 근절, 치유, 또는 예방을 나타내는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머를 사용하는 치료는 신규한 디스트로핀 생산을 증가시키거나, 질환의 진행을 지연시키거나, 보행 상실(loss of ambulation)을 지연 또는 감소시키거나, 근육 염증을 감소시키거나, 근육 손상을 감소시키거나, 근육 기능을 개선하거나, 폐 기능 상실을 감소시키고/시키거나 치료 부재 시에 예상되는 근육 재생을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 질환 진행을 유지시키거나, 지연시키거나, 느리게 한다. 일부 구현예에서, 치료는 보행을 유지시키거나 보행 상실을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 폐 기능을 유지시키거나 폐 기능 상실을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어, 6분 보행 시험(6MWT)으로 측정했을 때, 환자의 안정적인 보행 거리를 유지시키거나 증가시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 10 m를 보행/주행하는 데 걸리는 시간(즉, 10미터 보행/주행 시험)을 유지시키거나 단축시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 누운 자세에서 일어나는 데 걸리는 시간(즉, 기립 소요 시간 시험)을 유지시키거나 단축시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 4개의 표준 계단을 오르는 데 걸리는 시간(즉, 4계단 오르기 시험)을 유지시키거나 단축시킨다. 일부 구현예에서, 치료는, 예를 들어, MRI(예를 들어, 하지 근육의 MRI)에 의해 측정했을 때, 환자에서 근육 염증을 유지시키거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, MRI는 근육 퇴행을 식별하기 위해 T2 및/또는 지방 분획을 측정한다. MRI는 염증, 부종, 근육 손상 및 지방 침윤에 의해 야기된 근육 구조와 조성의 변화를 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체를 사용하는 치료는 신규한 디스트로핀 생산을 증가시키고 치료 부재 시에 예상되는 보행 상실을 느리게 하거나 감소시킨다. 예를 들어, 치료는 대상체에서 보행 능력(예를 들어, 보행 안정화)을 안정화, 유지, 개선 또는 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 예를 들어, McDonald 등에 의해 기술된 6분 보행 시험(6MWT)으로 측정했을 때, 환자의 안정적인 보행 거리를 유지시키거나 증가시킨다 (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74, 참조로서 본원에 통합됨). 6분 보행 거리(6MWD)의 변화는 절대값, 백분율 변화 또는 예측 값의 변화율(%)로서 표현될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 6WMT에 있어서 건강한 동년배에 비해 대상체의 안정한 보행 거리가 20% 부족한 것을 유지시키거나 개선한다. 6MWT에 있어서, 건강한 동년배의 전형적인 수행도(performance)에 대해 상대적인 DMD 환자의 수행도는 예측 값(%)을 계산함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 예측 6MWD(%)는 남성의 경우 다음 식을 사용해 계산할 수 있다: 196.72 + (39.81 x 나이) - (1.36 x 나이2) + (132.28 x 신장(미터 단위)). 여성의 경우, 예측 6MWD(%)는 다음 식을 사용해 계산할 수 있다: 188.61 + (51.50 x 나이) - (1.86 x 나이2) + (86.10 x 신장(미터 단위))(Henricson 등의 문헌[PLoS Curr., 2012, version 2,], 본원에 참조로 통합됨). 일부 구현예에서, 안티센스 올리고머를 사용하는 치료는 환자에서 안정한 보행 거리를 베이스라인 대비 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 또는 50미터(이들 사이의 모든 정수 포함)보다 더 크게 증가시킨다.
DMD 환자에서 근육 기능의 상실은 정상적인 아동기 성장 및 발달 배경과 대조적으로 일어날 수 있다. 실제로, 진행성 근육 장애에도 불구하고 DMD를 가진 아동이 어릴수록 약 1년의 과정에 걸친 6MWT에서 보행 거리의 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서는, DMD 환자의 6MWD를 전형적으로 발달 중인 대조군 대상체와 비교하고 나이와 성별이 일치하는 대상체의 기존 규준(normative data)과 비교한다. 일부 구현예에서, 정상적인 성장 및 발달은 규준에 피팅된 나이와 신장 기반 등식을 사용해 설명될 수 있다. 이러한 등식은 DMD를 가진 대상체에서 6MWD를 예측 값 변화율(예측률(%))로 변환하는데 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, 예상 6MWD(%) 데이터의 분석은 정상적인 성장 및 발달을 설명하는 방법을 나타내며, 초년기(예를 들어, 7세 이하) 획득한 기능이 DMD 환자에서의 개선된 능력보다 더 안정하다는 것을 보여줄 수 있다(예를 들어, Henricson 등의 문헌[PLoS Curr., 2012, version 2]을 참조하고, 동 문헌은 참조로서 본원에 통합됨).
상이한 안티센스 분자들을 구별하기 위한 안티센스 분자 명명 시스템이 제안되고 공개되었다(Mann 등의 문헌[(2002) J Gen Med 4, 644-654] 참조). 이러한 명명법은, 아래에 보이는 바와 같이 모두 동일한 표적 영역에서 유도되었지만 약간 상이한 여러 개의 안티센스 분자를 시험할 때 특히 유의미해졌다:
H#A/D(x:y).
첫 글자는 종(예를 들어, H: 인간, M: 쥣과, C: 개과)을 지정한다. "#"는 표적 디스트로핀 엑손 번호를 지정한다. "A/D"는 엑손의 시작 및 끝에서의 수용자(acceptor) 또는 공여자(donor) 스플라이스 부위를 각각 나타낸다. (x y)는 어닐링 좌표를 나타내며, 여기서 "-" 또는 "+"는 각각 인트론 서열 또는 엑손 서열을 나타낸다. 예를 들어, A(-6+18)은 표적 엑손에 선행하는 인트론의 마지막 6개의 염기 및 표적 엑손의 첫 18개의 염기를 나타내게 된다. 가장 가까운 스플라이스 부위가 수용자이므로, 이들 좌표 앞에 "A"가 붙게 된다. 공여자 스플라이스 부위에서 어닐링 좌표를 설명하는 것이 D(+2-18)일 수 있고, 이 경우, 마지막 2개의 엑손 염기 및 첫 18개의 인트론 염기가 안티센스 분자의 어닐링 부위에 상응한다. A(+65+85)로 표시될 완전한 엑손 어닐링 좌표는, 해당 엑손의 시작으로부터 65번째 뉴클레오티드와 85번째 뉴클레오티드 사이의 부위이다.
엑손 스키핑을 사용하는 디스트로핀 판독 프레임 복원
디스트로핀 유전자의 프레임 이탈 돌연변이에 의해 야기된 DMD의 치료에 대한 잠재적 치료 접근법이, 프레임 내 돌연변이에 의해 야기되고 BMD로서 알려진 더 온순한 형태의 근 이영양증에 의해 제안된다. 프레임 이탈 돌연변이를 프레임 내 돌연변이로 변환하는 능력은 가설적으로 mRNA 판독 프레임을 보존하고, 내부적으로 단축되었지만 여전히 기능적인 디스트로핀 단백질을 생성하게 될 것이다. 본 개시의 안티센스 올리고머 접합체는 이를 달성하도록 설계되었다.
인간 디스트로핀 pre-mRNA의 표적 영역에 상보적이고 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 올리고머 접합체의 효과를 분석하는 임상 결과에는, 디스트로핀 양성 섬유 백분율(PDPF), 6분 보행 시험(6MWT), 보행 상실(LOA), 노스 스타 보행 평가(North Star Ambulatory Assessment, NSAA), 폐 기능 시험(PFT), (누운 위치에서) 외부 도움 없이 일어나는 능력, 드 노보 디스트로핀 생산 및 기타 기능적 척도가 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 53)에 순응하는, 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖는 대상체에서 디스트로핀을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 53)에 순응하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 가진 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 환자에서 mRNA 판독 프레임을 복원하여 디스트로핀 단백질 생성을 유도하는 방법을 제공한다. 단백질 생성은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 웨스턴 블롯 분석, 또는 면역조직화학(IHC)에 의해 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 DMD 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 53)에 순응하는, 디스트로핀 유전자의 돌연변이를 갖고, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 대상체의 치료는 질환 진행의 지연에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 대상체의 치료는 대상체에서의 보행 유지 또는 대상체에서의 보행 상실의 감소에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 보행은 6분 보행 시험(6MWT)을 사용해 측정된다. 특정 구현예에서, 보행은 노스 스타 보행 평가(NSAA)를 사용해 측정된다.
다양한 구현예에서, 본 개시는 DMD를 가진 대상체에서 폐 기능을 유지하거나 폐 기능 상실을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 엑손 스키핑(예를 들어, 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 53)에 순응하는, DMD 유전자의 돌연변이를 갖고, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 폐 기능은 최대 호기압(MEP)으로서 측정된다. 소정의 구현예에서, 폐 기능은 최대 흡기압(MIP)으로서 측정된다. 일부 구현예에서, 폐 기능은 노력성 폐활량(Forced Vital Capacity, FVC)으로서 측정된다.
특정 양태에서, 본 개시의 방법은 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 제형을 DMD 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 제형 중 접합체의 농도는 약 50 mg/ml이다.
특정 구현예에서, 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체가 기술된다. 특정 구현예에서, 뒤시엔느 근 이영양증의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체가 기술된다. 특정 구현예에서, 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체가 기술된다. 특정 구현예에서, 뒤시엔느 근 이영양증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 기술된 것과 같은 안티센스 올리고머 접합체가 기술된다.
실시예
전술한 개시 내용은 이해를 명료하게 하기 위해 도시와 예시를 통해 일부 상세하게 설명되었지만, 당업자는 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고도 이에 대한 소정의 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것을 본 개시의 교시에 비추어 자명하게 알 것이다. 하기 실시예는 단지 예시로서 제공되며 제한하도록 제공되지 않는다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 얻기 위해 변경되거나 수정될 수 있는 다양한 비중요 파라미터를 쉽게 인지할 것이다.
실시예 1: 식 (VIC)의 PPMO에 의한 엑손 51 스키핑 활성의 시험관 내 평가
식 (VIC)의 다음 구조 내의 6개의 PPMO 모두의 엑손 51 스키핑 활성을 평가하였다:
식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 표적화 서열은 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'(서열번호 1)이다.
시험된 6개의 PPMO를 합성하고, 예를 들어 미국 특허 제10,888,578호에 기술된 프로토콜에 따라 자체적으로 특성화하였으며, 표 1은 해당 결과를 기술한다(G는 글리신이고 R은 아르기닌임).
엑손 스키핑 분석
6개 PPMO의 시험관 내 엑손 스키핑 활성은 DMD 유전자의 엑손 52에 엑손 51-스킵 순응 결실을 갖는 공여자로부터 유래된 불멸화된 근아세포를 사용하여 DMD의 세포 모델에서 측정하였다. 검정을 위해, 근아세포를 근관으로 분화시키고, 0.1 내지 100 μM 범위의 PPMO의 농도로 96시간 처리한 후 ddPCR로 엑손 스키핑 활성을 측정하였다. 100 μM에서 측정된 시험된 PPMO의 효능 및 최대 엑손 스키핑 활성은 아래 표 2에 제시되어 있다. 최대 엑손 스키핑 활성은 최대 활성을 나타낸 농도에서 측정된 4개의 기술적 복제물의 스크핑된 카피 백분율의 평균 및 표준 편차로 제시된다.
PPMO-11 및 PPMO-10에 대한 EC50 값은 불완전한 농도 반응 곡선으로 인해 정확하게 결정될 수 없었다.
해당 결과는 시험된 모든 PPMO가 약리학적으로 엑손 스키핑 활성을 나타내는 활성임을 나타낸다. 시험된 모든 PPMO는 해당 검정에서 측정 가능한, 농도 의존적 엑손 스키핑 활성을 가졌다.
물질 및 방법
세포주 및 배양 조건
16세의 건강한 공여자(참조번호 AB1190C16PV) 및 엑손 52에 결실을 갖는 16세 DMD 환자(참조번호 KM1328DMD16PV)의 척추주위 근육으로부터 단리되고 전술한 바와 같이 hTERT 및 CDK4의 이소성 발현(Mamchaoui, K. 등의 문헌[Skeletal Muscle 1(1):34, 2011])으로 Myology Institute에서 불멸화된 근아세포가 본 분석에 사용되었다. 50 μl/cm2의 0.5% MaxGel(Sigma-Aldrich E0282)로 코팅된 조직 배양 플레이트 상의, 1 부피 배지 199, 4 부피 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM), 20% 소 태아 혈청, 50 μg/ml 겐타마이신, 25 μg/ml 페투인, 0.5 μg/ml bFGF, 5 ng/ml EGF, 0.2 μg/ml 덱사메타손, 1% 콜라겐 I 및 5 μg/ml 인슐린을 함유하는 증식 배지에서 세포를 37℃에서 3시간 동안 유지시켰다.
화합물 시험
시험 직전, 모든 화합물을 멸균수에 용해시키고, 분광광도법으로 농도를 확인하였다. 1% 콜라겐 I 및 0.5% MaxGel(Sigma-Aldrich E0282)로 코팅된 96-웰 투명 바닥 이미징 플레이트(Perkin Elmer #6055300)에서 6000 세포/웰의 증식 배지에 근아세포를 37℃에서 3시간 동안 50 μl/웰로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간차 배양물을 DMEM, 2% 열 불활성화 FBS, 50 μg/ml 겐타마이신 및 10 μg/ml 인슐린을 함유하는 분화 배지로 전환시켰다. 분화 배지로 전환 후 48시간차에, PPMO를 첨가하고, 총 약 96시간의 연속 화합물 노출을 위해, 분석 전 배양물을 4일 동안 추가로 인큐베이션하였다.
인간 DMD 엑손51 스키핑에 대한 ddPCR 분석
제조업체의 권장에 따라 DNAase 처리와 함께 RN 용이 마이크로 컬럼(QIAGEN cat#74004)을 사용하여 RNA를 단리하였다. 30 ng의 단리된 RNA를 먼저 70℃에서 2분 동안 변성시키고, 아래 표 3에 따라 1-단계 RT-ddPCR Advanced Kit for Probes(BioRad cat#1864021)으로부터의 시약 및 PNP 혼합물과 혼합하였다. 자동화 액적 발생기를 사용하여 제조된 RNA 샘플 혼합물로부터 액적을 생성하였다. 액적 생성 후, 플레이트를 밀봉하고 아래 표 4의 가열 사이클기 프로그램에 따라 C 1000 thermocycler(BioRad) 상에서 실행하였다. FAM 및 HEX 양성 액적의 카피 수는 QX200 액적 판독기에 의해 결정된다. 엑손 스키핑의 백분율은 FAM 양성 액적의 카피 수/(FAM 양성 액적의 카피 수 + HEX 양성 액적의 카피 수) * 100으로 결정된다. GraphPad Prism 8을 사용하여 모든 데이터를 분석하였고, 4-파라미터 로지스틱 곡선 피팅에 기초하여 EC50을 결정하였다.
실시예 2: 비인간 영장류(NHP) 및 mdx 마우스에서 PPMO-1의 투여 후 식 (VIC)의 PPMO의 노출에 대한 생체 내 연구
1. NHP 연구. 시노몰구스 원숭이에 대한 PPMO-1의 정맥내(IV) 투여 후 식 (VIC)의 PPMO의 혈장 노출 평가.
비인간 영장류(NHP)는 4주마다 1회, 즉 1, 29, 57, 및 85일차에, 30 또는 60 mg/kg의 투여량 수준으로 PPMO-1의 1시간 IV 주입을 투여받았다. 혈액 샘플을 투여 전 1일차, 각각의 주입 시작 후 1, 2, 4, 8, 12, 16 및 24시간차에 채취하였다. 혈액을 액상 크로마토그래피 질량 분광계(LC/MS/MS)로 PPMO-1 및 이의 대사산물의 농도 분석을 위한 혈장으로 처리하였다. PPMO-1은 다음 구조를 갖는 안티센스 올리고머 접합체이다:
2. mdx 마우스에서의 연구. 수컷 이영양증(mdx) 마우스에 대한 14C-PPMO-1의 단일 정맥내(IV) 투여 후 식 (VIC)의 PPMO의 분포 평가.
수컷 mdx 마우스는 51.6 mg/kg의 평균 투여량으로 14C-PPMO-1의 단일 정맥내 주사를 투여받았다. 14C-PPMO-1을 10 mg/mL의 주사용 0.9%(w/v) 염화나트륨 수용액으로 제형화하고, 220 μCi/kg 동물 체중의 방사성 수준으로 투여하였다. 투여 후 약 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간차에 심장 천공으로 각각의 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 및 24시간차에 군 2의 수컷 마우스로부터 수득된 혈장 샘플을 시점별로 풀링하여, 0.3 g의 각각의 샘플을 포함하는, 9개의 풀링된 샘플을 생성하였다. 이어서, 9개의 풀을 풀링하여, 시간 가중 풀링 방법(Hop 등의 문헌(1998))을 사용하여 결정된, 각각의 시점에서의 풀의 2.84 내지 306 μL를 포함하는, 단일 0.083 내지 24시간차의 AUC-대표 풀링 샘플을 생성하였다. 투여 후 0 내지 24시간 및 24 내지 48시간차에 수컷 마우스로부터 채취한 소변 샘플을, 0.3 g 내지 0.5 g의 각각의 샘플을 포함하여, 모든 동물에 걸쳐 풀링하였다. 샘플 중량의 일정 백분율(10%)을 사용하여 샘플을 풀링하였다.
투여 후 0 내지 24, 24 내지 48, 48 내지 72시간차에 수컷 마우스로부터 채취한 대변 샘플을, 해당하는 경우, 1.1 내지 1.6 g의 각각의 샘플을 포함하여, 모든 동물에 걸쳐 풀링하였다. 샘플 중량의 일정 백분율(5%)을 사용하여 샘플을 풀링하였다.
PPMO-1 및 이의 대사산물 정량화 분석을 위해 액상 섬광 계수(LSC) 및 LC/MS로 각각의 풀링된 샘플의 방사성을 결정하였다.
결과
PPMO-1은 NHP 혈장에서 주요 분석물로서 식별되었으며, PPMO-10 및 PPMO11은 각각, 30 및 60 mg/kg의 PPMO-1이 투여된 PPMO-1의 AUC최종의 10.5 및 6.7% 및 3.7% 및 3.1%로, 주요 대사산물로서 식별되었다. 총 노출(AUC최종)은 PPMO-1, PPMO-10 및 PPMO-11에 대해 각각 257±138 시간*ug/mL, 20±7 시간*ug/mL 및 8±4 시간*ug/mL였다. 5개의 다른 대사산물(PPMO-12, PPMO-13, PPMO-14, PPMO-15, 및 PMO)은 PPMO-10 및 PPMO-11보다 낮은 수준으로 검출되고 식별되었다. 관찰된 PPMO-15 데이터는, PPMO-1의 유사한 유지 시간으로 인한 LC-MS/MS 신호의 유출에 적어도 부분적으로 기인하며; 이에 따라, PPMO-15 수준은 과대평가될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
mdx 마우스에서, PPMO-10 및 PPMO-11 대사산물은 모든 기질(혈장, 소변 및 대변)에서 식별되었다. 혈장 추출물의 방사성 화학 분석 및 LC-MS 분석은, 수컷 마우스에 대한 14C-PPMO-1의 정맥내 투여 후 SRP-5051을 가장 풍부한 혈장 성분으로 식별하였다. 초기 LC-MS 조건(구배 1) 하에서, AUC-풀링 혈장 중 14C-PPMO-1의 농도는 1510 ng 당량 14C-PPMO-1/g(ng 당량/g) 또는 샘플 방사성의 66.6%였다. 공동 용리 PPMO-11 및 PPMO-10의 농도는 547 ng 당량/g 또는 샘플 방사성의 24.1%였다. LC-MS에 의해 식별되지 않은 M3은 69.7 ng 당량/g의 혈장 농도 또는 샘플 방사성의 3.1%를 나타냈다. 수정된 LC-MS 조건(구배 2) 하에서, PPMO-1, PPMO-11 및 PPMO-10의 농도는 각각 1370, 251 및 258 ng. 당량/g, 또는 각각 샘플 방사성의 60.5%, 11.1% 및 11.4%였다. 식별되지 않은 M4는 138 ng. 당량/g의 혈장 농도 또는 혈장 방사성의 6.1%를 나타냈다.
소변에서, 방사성 화학 분석 및 LC-MS 분석은 PPMO-1, PPMO10 및 PPMO-11을 식별하였다. 2개의 추가적인 방사성표지된 성분(M4 및 M5)을 방사성 화학 분석으로 정량화하였지만, LC-MS로는 식별할 수 없었다. 초기 LC-MS 조건(구배 1) 하에서, PPMO-1은 방사성 투여량의 24.3%를 차지하였고, 공동 용리 PPMO-11 및 PPMO-10은 투여량의 32.1%를 차지하였다. 수정된 LC-MS 조건(구배 2) 하에서, PPMO-1, PPMO11 및 PPMO-10은 부분적으로 분리되었으며, 투여량의 22.0%, 14.6% 및 17.3%를 각각 차지하였다. 식별되지 않은 피크 M4 및 M5는 미량 수준 내지 소량 수준 성분이었으며, 이는 투여량의 약 0.35% 및 1.1%를 각각 차지하였다. 대변 추출물에 대한 방사성 화학 분석 및 LC-MS 분석은 PPMO-11 및 PPMO-10을 소량 대사산물로서 정량화하고 식별하였으며; PPMO-1은 대변에서 검출되지 않았다. M5는 방사성 화학 분석으로 정량화되었지만 LC-MS로는 식별되지 않았다. 공동 용리(구배 1) 대사산물 PPMO-11 및 PPMO-10은 투여량의 6.3%를 차지하였다. 수정된 LC-MS 조건(구배 2) 하에서, PPMO-11 및 PPMO-10은 투여량의 약 1.6% 및 4.5%를 각각 차지한 반면, 식별되지 않은 미량 성분 M5는 투여량의 0.5% 미만을 차지하였다.
결론
30 및 60 mg/kg로 NHP에 PPMO-1을 IV 주입한 후 LC/MS 방법을 사용하여 PPMO-1 및 이의 7개의 가수분해 대사산물을 검출하고 정량화하였다. PPMO-1은 주입 종료 시 가장 높은 수준이 관찰된 주요 성분으로 식별되었으며, 이어서 이중 지수 방식으로 감소하였다. 모든 대사산물의 양은 특히 투여 후 첫 8시간 동안 PPMO-1의 양보다 훨씬 적었다. PPMO-10은 가장 풍부한 대사산물인 것으로 밝혀졌고, 7 내지 10% PPMO-11, 및 3 내지 4% PPMO-1 AUC가 이에 이어진 한편, 나머지 5개의 대사산물은 훨씬 낮은 농도로 검출되었으며, 가끔씩만 정량화가 가능하였다.
수컷 mdx 마우스에게 14C-PPMO-1을 단일 정맥내 투여한 후, PPMO-1은 혈장 및 소변에서 가장 풍부한 성분이었으며, 혈장 샘플 방사성의 60 내지 67% 및 소변 중 투여량의 22%를 차지하였다. PPMO-1은 대변에서 검출되지 않았다. PPMO-11 및 PPMO-10은 혈장, 소변 및 대변에서 주요 대사산물로서 식별되었다. 3개의 추가 방사성표지된 피크를 방사성 화학 검출로 정량화하였지만 LC-MS로는 식별할 수 없었다.
실시예 3. 14 C-PPMO-2 투여 후 mdx 마우스에서 식 (VIIIC)의 PPMO의 혈장 및 조직 분포에 대한 생체 내 연구
mdx 마우스에서의 연구. 수컷 이영양증(mdx) 마우스에 대한 14C-PPMO-2의 단일 정맥내(IV) 투여 후 식 (VIIIC)의 PPMO의 분포 평가.
Mdx 마우스는 53.6 mg/kg의 평균 투여량으로 14C-PPMO-2의 단일 IV 볼루스 주사를 투여받았다. 14C-PPMO-2를 10 mg/mL의 0.9 염화나트륨 수용액으로 제형화하고, 228 μCi/kg 동물 체중의 평균 방사성 수준으로 투여하였다. 전혈 및 선택된 조직의 샘플을 투여 후 약 0.083, 0.25, 0.5, 1,2 , 4, 8, 24, 48, 96, 144, 288, 360 및 432시간차에 채취하였다. 투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4시간차에 수컷 mdx 마우스로부터 수득된 혈장 샘플을 시점별로 풀링하여, 0.1 g의 각각의 샘플을 포함하는, 0.083-, 0.25-, 0.5, 1-, 2-, 및 4-시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다. 투여 후 0 내지 24시간 및 24 내지 72시간차에 채취된 소변 샘플을 풀링하여, 중량 기준 각 샘플의 15%를 포함하는, 0 내지 24시간 및 24 내지 72시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다. 투여 후 0 내지 24, 24 내지 48, 및 48 내지 72시간차에 채취된 대변 샘플을 채취 간격별로 풀링하여 중량 기준 각 샘플의 6 내지 10%(간격 기준 등가 백분율)를 포함하는, 0 내지 24시간 및 24 내지 72시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다.
투여 후 2, 24, 48, 96, 144, 288, 360 및 432시간차에 마우스로부터 채취한 근육 및 신장 샘플을 채취 간격별로 풀링하여 전체 샘플을 포함하는 2-, 24- 내지 96-, 144- 내지 288, 및 360- 내지 432-시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다. 각각의 풀링된 샘플의 방사성을 LSC로 결정하였다. 풀링된 샘플을 LC/MS로 분석하여 PPMO-2 및 이의 대사산물의 농도를 결정하였다. PPMO-2는 다음 구조를 갖는 안티센스 올리고 CPP 접합체이다:
결과
14C- PPMO-2는 14C-PPMO-2의 단일 정맥내 투여 후 수컷 mdx 마우스에서 대사를 거쳤다. LC-MS으로 혈장, 소변, 대변, 근육 및 신장에서 5개의 대사산물이 식별되고 특성화되었다. 식별된 화합물은 식 (VIIIC)에 따른 구조를 갖는다:
식 중, 표적화 서열은 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3'(서열번호 2)이고, m은 아래 표 5에 기술된 바와 같다:
PPMO-24, PPMO-23, 및 PPMO-22는 대변을 제외한 모든 기질 중에 존재하였으며, PPMO-21 및 PPMO-20은 모든 기질 중에 존재하였다. PPMO-2는 대변을 제외한 모든 기질에서 식별되었다.
가장 풍부한 혈장 성분은 PPMO-2였으며; 피크 농도는 206 μg 당량 14C-PPMO-2/g이었다(PPMO-2 및 식별된 대사산물에 대해 결정된 총 AUC의 67.5%, 및 HPLC 컬럼에 주입된 총 방사성의 33.48 내지 91.52%를 나타냄). PPMO-24, PPMO-23, PPMO-22, PPMO-21, 및 PPMO-20에 대한 피크 농도는 5.56, 4.86, 5.87, 10.8, 및 9.40 μg 당량 14C-PPMO-2/g이었다. AUC0-t에 기초하여, 혈장에서 식별되고 정량화 가능한 모든 대사산물은 식별된 대사산물에 대한 총 AUC의 <10%를 나타냈으며, 이는 경미한 것으로 간주되었다; 예외적으로 PPMO-20은 총 AUC의 14.3%를 나타냈다. 투여 후 0 내지 72시간에 걸쳐 투여된 투여량의 29.8%를 차지하는 PPMO-20은 소변에서 가장 풍부한 성분이었다. PPMO-2는 투여 후 0 내지 24시간에 걸친 소변에서 투여된 투여량의 3.22%를 차지하였으며, 투여 후 24 내지 72시간에 걸친 소변에서는 검출되지 않았다. PPMO-20은 또한 대변에서, 투여 후 0 내지 72시간에 걸친 투여된 투여량의 2.44%를 차지하는 가장 풍부한 성분이었다. PPMO-2는 대변에서 관찰되지 않았다.
조직(이두근 및 신장)의 경우, PPMO-20은 재차 가장 풍부한 성분이었으며, 피크 농도는 각각 3.32 및 960 μg 당량 14C-PPMO-2/g이었다(근육의 경우 HPLC 컬럼에 주입된 총 방사성의 12.03 내지 15.28%, 그리고 신장의 경우 83.73 및 92.32%를 나타냄). PPMO-2는 이두근에서 투여 후 2시간차에 정량화될 수 있었고, 신장의 경우에는 투여 후 432시간까지 모든 샘플 풀에서 정량화될 수 있었으며; 피크 농도는 각각 0.863 및 33.1 μg 당량 14C-PPMO-2/g이었다.
결론
수컷 mdx 마우스에게 14C-PPMO-2를 단일 IV 투여한 후, SRP-5045는 수컷 마우스에서 대사를 거쳐 최대 11개의 14C 연관 피크를 생성했으며, 그 중 5개는 LC-MS로 식별되었다. N-아세틸기의 손실을 갖는 말단 아르기닌(R) 아미노산의 가수분해는 14C-PPMO-2에 대한 주된 생체변환 경로였다. PPMO-20 및 PPMO-21 대사산물은 모든 기질에서 식별되었다. 대변을 제외한 모든 기질에서 다른 대사산물이 식별되었다. PPMO-2는 대변을 제외한 모든 기질에 존재하였다.
PPMO-2는 혈장에서 주요 성분으로 식별되었으며, 투여 후 0.083시간차에서의 피크 농도는 샘플 방사성의 91.52%를 나타냈다. PPMO-20은 총 노출(AUC최종)의 14.3%를 차지하는 주요 대사산물로서 식별되었다. 다른 모든 대사산물 노출은 총 AUC의 2.98 내지 7.52% 범위였다. PPMO-20은 소변, 대변, 이두근 및 신장에서 주요 대사산물로서 식별되었으며, 이는 소변 및 대변에서 샘플 방사성의 29.8%(0 내지 24시간), 2.44%(0 내지 24시간)를 차지하였고, 피크 농도는 이두근 및 신장에서 샘플 방사성의 37.5 및 87.67%였다. 다른 대사산물은 모든 기질에서 소량의 대사산물로서 식별되었다.
실시예 4. 14 C-PPMO-3 투여 후 mdx 마우스에서 식 (XC)의 PPMO의 혈장 및 조직 분포에 대한 생체 내 연구
mdx 마우스에서의 연구. 수컷 이영양증(mdx) 마우스에 대한 14C-PPMO-3의 단일 정맥내(IV) 투여 후 식 (XC)의 PPMO의 분포 평가.
Mdx 마우스는 48.7 mg/kg의 평균 투여량으로 14C-PPMO-3의 단일 IV 볼루스 주사를 투여받았다. PPMO-3을 10 mg/mL의 0.9%(w/v) 염화나트륨 수용액으로 제형화하고, 215 μCi/kg 동물 체중의 평균 방사성 수준으로 투여하였다. 소변 및 대변을 투여 전(밤새) 및 투여 후 336시간차까지 24시간 간격으로 채취하였다. 전혈 및 선택된 조직의 샘플을 투여 후 약 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 및 144시간차에 채취하였다.
투여 후 0.083, 0.25, 0.5, 1, 및 2시간차에 수컷 마우스로부터 수득된 혈장 샘플을 시점별로 풀링하여, 동등한 부피의 각각의 샘플을 포함하는, 0.083-, 0.25-, 0.5, 1-, 및 2-시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다. 투여 후 0 내지 24, 24 내지 48, 48 내지 72, 72 내지 96, 96 내지 120, 120 내지 144, 144 내지 168, 168 내지 192, 192 내지 216, 216 내지 240, 288 내지 312, 및 312 내지 336시간차에 수컷 마우스로부터 채취된 소변 샘플을 풀링하여 중량 기준 각 샘플의 10 내지 20%(간격 기준 등기 백분율)를 포함하는 0- 내지 24-, 24- 내지 48-, 48- 내지 72-, 72- 내지 144-, 144- 내지 240-, 및 288- 내지 336-시간차의 풀링 샘플을 생성하였다. 투여 후 0 내지 24, 24 내지 48, 48 내지 72, 72 내지 96, 96 내지 120, 120 내지 144, 288 내지 312, 및 312 내지 336시간차에 수컷 마우스로부터 채취된 대변 샘플을 풀링하여 중량 기준 각 샘플의 4 내지 5%(간격 기준 등기 백분율)를 포함하는 0- 내지 72-, 72- 내지 144-, 및 288- 내지 336-시간차의 풀링 샘플을 생성하였다.
투여 후 0.25, 1, 4, 8, 24, 48, 96, 120, 및 144시간차에 수컷 마우스로부터 채취된 이두근 샘플을 풀링하여 중량 기준 각 샘플의 100%를 포함하는 0.25- 내지 4-, 8-, 24-, 48-, 및 96- 내지 144-시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다.
투여 후 0.25, 1, 4, 8, 24, 48, 96, 120, 및 144시간차에 수컷 마우스로부터 채취된 신장 샘플을 풀링하여 중량 기준 각 샘플의 100%를 포함하는 0.25- 내지 4-, 8-, 24-, 48-, 및 96- 내지 144-시간차의 풀링된 샘플을 생성하였다.
모든 기질로부터의 샘플을 LSC로 분석하여 방사성을 결정하고 LC/MS로 분석하여 PPMO-3 및 이의 대사산물을 정량화하였다.
PPMO-3은 다음 구조를 갖는 안티센스 올리고 CPP 접합체이다:
결과
14C- PPMO-3은 14C-PPMO-3의 단일 정맥내 투여 후 수컷 마우스에서 대사를 거쳤으며, LC-MS로 4개의 대사산물이 식별되었고 특성화되었다. 식별된 화합물은 식 (XC)에 따른 구조를 갖는다:
식 중, 표적화 서열은 5'-GTTGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3'(서열번호 3)이고, m은 아래 표 6에 기술된 바와 같다:
PPMO-30 및 PPMO-31 또한 자체적으로 합성되었다. PPMO-33 및 PPMO-34는 혈장 및 소변에 존재하였고, PPMO-31은 혈장, 소변 및 대변에 존재하였으며, PPMO-30은 혈장, 소변, 대변 및 신장에 존재하였다. 대사산물 PPMO-30은 소변 및 대변에서 식별된 가장 풍부한 대사산물이었으며, PPMO-31은 또한 소변에서 주목할 만한 수준으로 존재하였다. 가장 풍부한 혈장 성분은 PPMO-3 및 PPMO-33이었으며, 이는 총 피크 농도(Cmax) 109000 ng-당량/g로 공동 용리되었다. 혈장 샘플에서의 넓은 크로마토그래피 피크로 인해, PPMO-3 및 PPMO-33 유지 시간은 유사하므로, PPMO-33 기여도는 과대평가될 수 있고 이의 기여도는 부분적으로 PPMO-3으로 인한 것일 수 있다. PPMO-31은 13200 ng-당량/g의 Cmax를 갖는 가장 풍부한 식별된 대사산물이었다. 주목할 만한 농도의 또 다른 성분은 33100 ng-당량/g의 피크 농도에서의 U5(식별되지 않음)였다. PPMO-3 및 관련 화합물에 대한 혈장 내 방사성의 평균 Cmax는 투여 후 0.083시간차에 관찰되었다. 최고 C0 값은 PPMO-33 및 PPMO-3에 대해 관찰되었으며(공동-용리 피크), 209000 ng-당량/g이었고, 혈장 반감기는 0.502시간이었고 노출(AUC0-t)은 42000 ng-당량·시간/g이었으며; 이는 총 AUC0-t의 43.71%를 나타냈다(약동학적 파라미터가 계산될 수 있는 식별된 대사산물 및 식별되지 않은 성분에 대한 총 AUC를 기준으로 계산됨). PPMO-31은 주목할 만한 농도로, 총 AUC0-t의 11.34%를 나타냈으며, C0은 14600 ng-당량/g이었고 노출은 10900 ng-당량·시간/g이었다.
소변에서 가장 풍부한 성분은 투여 후 0 내지 336시간에 걸쳐 투여된 투여량의 27.3%를 차지하는 PPMO-30이었다. PPMO-31 또한 주목할 만하였으며, 투여 후 0 내지 336시간에 걸쳐 투여된 투여량의 15.3%를 차지하였다. PPMO-33은 투여 후 0 내지 336시간에 걸쳐 소변에서 투여된 투여량의 5.27%를 차지하였으며,, PPMO-3은 1.79%를 차지하였다. 대변에서, 가장 풍부한 성분은 투여 후 0 내지 336시간에 걸친 투여된 투여량의 4.27%를 차지하는 PPMO-30이었으며, PPMO-3은 관찰되지 않았다. 이두근에서 가장 풍부한 성분은 U6(식별되지 않음)이었으며, 이에 대한 피크 농도는 23100 ng 당량 14C-PPMO-3/g이었고; PPMO-3은 해당 조직에서 관찰되지 않았다. PPMO-30은 신장에서 가장 풍부한 대사산물이었으며, 피크 농도는 419000 ng 당량 14C-PPMO-3/g이었고, 샘플 방사성의 15.81%를 나타냈다. PPMO-3은 분석된 제1 풀링 시점(투여 후 0.25 내지 4시간차)에서 152000 ng 당량 14C-PPMO-3/g의 농도로 신장에 존재하였으며, 또한 투여 후 48시간차 및 투여 후 96 내지 144시간차의 풀링 샘플에서 정량화될 수 있었다.
결론
PPMO-3은 14C-PPMO-3의 단일 정맥내 투여 후 수컷 mdx 마우스에서 대사를 거쳤으며, LC-MS로 4개의 대사산물이 식별되었다. 말단 아르기닌(R) 아미노산의 가수분해는 14C-PPMO-3에 대한 주된 생체내변환 경로였다.
말단 아르기닌 아미노산의 가수분해가 식별된 4개의 대사산물의 경우, 혈장 및 소변에 존재하는 PPMO-33 및 PPMO-34, 혈장, 소변 및 대변에 존재하는 PPMO-31, 그리고 혈장, 소변, 대변 및 신장에 존재하는 PPMO-30을 생성하였다. PPMO-3은 혈장, 소변 및 신장에서 식별되었다. 대사산물 PPMO-30은 소변 및 대변에서 식별된 가장 풍부한 대사산물이었으며, 혈장에서는 PPMO-31이었다.
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Claims (52)

  1. 식 (I)의 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서:
    식 중:
    n은 1 내지 40이고;
    각각의 Nu는 서로 합쳐져, 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고;
    T'은:
    로부터 선택되는 모이어티이며; 여기에서
    R 100 은 RRRRRG-, RRRRG-, RRRG-, RRG-, RG-, 및 G-로 이루어진 군으로부터 선택되되, R은 아르기닌이고 G는 글리신이고,
    R 200 은 수소이고,
    R 1 은 C1-C6 알킬인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, 표적화 서열은 H51A(+66+95)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 51 어닐링 부위에 상보적인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 표적화 서열은 H51A(-03+19)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 45 어닐링 부위에 상보적인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, 표적화 서열은 H51A(+36+60)로 지정된 디스트로핀 pre-mRNA의 엑손 53 어닐링 부위에 상보적인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Nu는 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 아데닌(A), 5-메틸시토신(5mC), 우라실(U), 및 하이포크산틴(I)으로부터 독립적으로 선택되는, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, T'은 하기 모이어티이되:
    , 식 중 R 200 은 수소인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 RRRRRG-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 RRRRG-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 RRRG-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 RRG-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 RG-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R 100 은 G-인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (V)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중
    각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (VA)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 30까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:

    여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (VII)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중
    각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  16. 제1항 내지 제12항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (VIIA)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 각각의 Nu는 1에서 22까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:

    여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (IX)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중
    각각의 Nu는 서로 합쳐져 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 어닐링 부위에 상보적인 표적화 서열을 형성하는 핵염기이고,
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  18. 제1항 내지 제12항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (IXA)를 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 식 중 m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고,
    각각의 Nu는 1에서 25까지, 5'에서 3' 방향으로 다음과 같고:

    여기에서, A는 이고, C는 이고, G는 이며, T는 인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  20. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  21. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 2인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  22. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 3인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  23. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 4인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  24. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m은 5인, 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 유리 염기인, 안티센스 올리고머 접합체.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 약학적으로 허용 가능한 염인, 안티센스 올리고머 접합체.
  27. 제1항 내지 제24항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 염산염인, 안티센스 올리고머 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 약학적 조성물은 비경구용으로 제형화되는, 약학적 조성물.
  30. 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)의 치료를 필요로 하는, 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑을 유발하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택되는, 방법.
  34. 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 환자를 안티센스 올리고머 접합체로 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)의 치료를 필요로 하는, 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 제28항 또는 제29항의 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손 스키핑을 유발하는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택되는, 방법.
  39. 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 환자를 안티센스 올리고머 접합체로 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 제28항 또는 제29항의 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 51 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 식 (VI)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 45 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 식 (VIII)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. DMD의 치료를 필요로 하는, 엑손 53 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 식 (X)을 갖는 안티센스 올리고머 접합체:

    또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(식 중, m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임)을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자에서의 뒤시엔느 근 이영양증(DMD) 치료 용도를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  44. 제43항에 따른 용도에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발하는, 안티센스 올리고머 접합체.
  45. 제43항 또는 제44항에 따른 용도에 있어서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택되는, 안티센스 올리고머 접합체.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 용도에 있어서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택되는, 안티센스 올리고머 접합체.
  47. 엑손 스키핑에 순응하는 돌연변이를 갖는 환자에서의 뒤시엔느 근 이영양증(DMD)의 치료 용도를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 약학적 조성물.
  48. 제47항에 따른 용도에 있어서, 안티센스 올리고머 접합체는 인간 디스트로핀 유전자에서 엑손의 스키핑을 유발하는, 약학적 조성물.
  49. 제47항 또는 제48항에 따른 용도에 있어서, 엑손은 엑손 44, 45, 50, 51, 52, 또는 53으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 용도에 있어서, 엑손은 엑손 45, 51, 또는 53으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 용도에 있어서, 약학적 조성물은 비경구용으로 제형화되는, 약학적 조성물.
  52. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고머 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
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