KR20250035532A - 세포 또는 세포소기관의 공간 추적 및 시퀀싱을 위한 방법 - Google Patents

세포 또는 세포소기관의 공간 추적 및 시퀀싱을 위한 방법 Download PDF

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가엘르 블리벳-베일리
앤드류 그리피스
파블로 이바네즈
필리프 응에
야닉 론델레스
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파리 사이언스 엣 레트레스
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썽뜨르 나쇼날르 드 라 르쉐르쉐 씨엉띠삐끄
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Abstract

본 발명은 단일 또는 복수의 세포 또는 세포소기관, 예를 들어, 약 2 내지 10개의 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 구역에 식별 태그를 할당할 수 있게 하는, 생물학적 샘플 상의 또는 내로의 표지화 용액에 관한 것이다.

Description

세포 또는 세포소기관의 공간 추적 및 시퀀싱을 위한 방법
본 발명은 단일 또는 복수의 세포 또는 세포소기관, 예를 들어, 약 2 내지 10개의 세포를 포함하는 생물학적 샘플의 구역에 식별 태그를 할당할 수 있게 하는, 생물학적 샘플 상의 또는 내로의 표지화 용액에 관한 것이다.
단일 세포의 현재 시퀀싱 기법은 예를 들어, 샘플 내의 세포 각각에 대한 "오믹(omic)" 정보(유전체학, 후성유전체학적, 전사체학적, 단백질체학적 등)에 대한 접근을 가능하게 하므로 매우 강력하지만, 그들은 시작 샘플 내의 세포 각각에 대한 국소화 정보의 손실을 야기하는 세포의 해리를 필요로 한다.
실제로, 예를 들어, 종양학에서 주요 문제는 종양/미세환경 상호작용을 정확하게 특징규명하는 방법이며, 이는 분자 신호 및 이러한 신호를 교환하는 세포의 조직-내 공간적 국소화 둘 모두에 대한 접근을 필요로 한다. 이러한 상호작용은 종양 세포의 생존 또는 사멸에 주요한 역할을 할 수 있다. 이러한 상호작용에 대한 더 나은 이해는 종양 시스템에서 일어나는 적응 메커니즘을 극복하는 데 도움이 될 것이다.
"오믹스(omics)" 기술은 유전체학, 전사체학, 후성유전체학 및 단백질체학 분석을 매우 대규모로 가능하게 함으로써 분자 생물학에 혁신을 가져왔지만, 최근까지, 그들은 건강한 조직 및 병리학적 조직에 존재하는 세포 이질성을 고려하지 않은 다중 세포의 "평균" 프로파일만을 산출하였다. 최근에는, 단일 세포 분석을 위한 다수의 기술이 개발되어 있다. 특히, 개별 세포가 바코딩된 프라이머를 보유하는 비드와 함께 액적에 공동-캡슐화되어 수천 개의 세포로부터 단일-세포 수준의 RNA의 시퀀싱(scRNA-seq)을 가능하게 하는 액적 미세유체 시스템이 있다. 그러나, 이러한 시스템에서, 조직 내의 세포는 분석 이전에 해리되고, 단일 세포 시퀀싱 데이터와 원래 조직 내의 이러한 동일한 세포의 국소화 간에는 상관관계가 없다.
측정된 신호의 공간적 국소화를 가능하게 하는 단일-세포 분석 기술은 현재 표적의 개수(예를 들어, 면역조직화학, RNA 제자리 혼성화) 및 세포의 개수(예를 들어, 레이저 포획 미세절개(LCM) 후 개별 세포의 시퀀싱) 둘 모두의 측면에서 매우 제한된다. "공간적 전사체학"(문헌[Vickovic, Sanja, et al. Nature methods 16.10 (2019): 987-990.]), “Slide-seq”(문헌[Rodriques, Samuel G., et al. Science 363.6434 (2019): 1463-1467]) 및 “DNA 나노볼 스테레오-시퀀싱”(문헌[Chen et al., ≪ Large Field of View-Spatially Resolved Transcriptomics at Nanoscale Resolution ≫ bioRxiv 2021.01.17.427004]) 시스템은 개별 조직 절편에서의 공간적 분해를 가능하게 하지만, 그들은 단일 세포 데이터에 대한 접근을 제공하지 않는다. “XYZ-seq”(문헌[Lee et al., Sci Adv. 2021 Apr 21;7(17):eabg4755])은 게놈-전체 단일-세포 발현을 측정하지만, 표준 scRNA-seq보다 mRNA 판독물이 적고 검출된 유전자가 적어 공간적 분해능이 낮다(500 μm 분해능). 형광 제자리 시퀀싱(FISSEQ)은 제자리 시퀀싱을 사용하여, 고정된 조직에서 다중 유전자의 발현을 공간적으로 국소화하며, 짧은 판독물(30개의 염기) 및 세포당 약 200개의 mRNA 판독물(scRNA-seq의 약 40,000개와 비교)만을 갖는다. 디지털 공간적 프로파일러(DSP)는 UV 노출에 의해 표적화된 조직 구역으로부터 방출되는 광절단 가능한 올리고뉴클레오티드 마커의 시퀀싱에 기반한 Nanostring에 의해 개발된 플랫폼이다. 조직 내의 세포의 국소화에 대한 데이터는 RNA 또는 표적 풍부도의 수치적 및 공간적 프로파일을 제공한다. 그러나, 이 기법은 완전한 전사체에 대한 접근을 제공하지 않고, 단세포 분해능을 갖지 않으며, 소수의 구역의 분석만이 가능할 수 있다.
요약하면, 조직 내의 세포 상호작용, 단일-세포 수준에서의 상호작용을 연구하기 위한 현재의 기술적 도구는 여전히 제한적인 데, 왜냐하면 그들은 단지 다수의 세포에 대한 제한된 개수의 분자 표적으로부터의 신호의 공간적 국소화, 또는 제한된 개수의 국소화된(미세절개된) 세포에 대한 다수의 분자 표적의 측정, 또는 수천 개의 비-국소화된 세포에 대한 다수의 분자 표적의 측정만이 가능하기 때문이다.
현재, 수천 개의 개별 세포에 대해, (i) 각각의 세포의 조직-내 공간적 국소화 정보를 (ii) 이러한 동일한 세포 각각으로부터의 분자 신호의 측정과 커플링하는 것은, 주요 기술적 과제로서 그리고 예를 들어, 종양에서 발생하는 적응 메커니즘을 더 잘 이해하고 그에 따라 환자 치료를 조정하기 위한 임상적 요구로서 명확하게 확인되고 있다.
본 발명에 의해 제공되는 방법 및 키트는 조직으로부터 수십 개 이하의 세포에 대한 공간적 분해능으로 수천 개의 세포의 단일-세포 "오믹스" 분석을 가능하게 하는 시스템에 대한 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 식별 핵산 서열로 표지화하는 방법에 관한 것으로, 방법은 다음을 포함한다:
a) 핵산의 제1 세트("방출체 핵산")을 제공하는 단계(각각의 핵산 분자는 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함함);
b) 제2 세트의 핵산("수용체 핵산")을 제공하는 단계(각각의 수용체 핵산은 공유적으로 또는 비-공유적으로 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 커플링되고, 수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함함);
c) 용액 내의 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 세트를 생물학적 샘플과 접촉시켜, 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 적어도 수용체 핵산으로 표지화하는 단계;
d) 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열, 또는 이의 역 상보체를 포함하는 방출체 핵산의 영역의 카피인 다중 핵산 분자("방출 핵산")를 방출하고, 방출 핵산을 수용체 핵산에 혼성화하는 단계;
e) 생물학적 샘플을 해리하고 개별화된 세포 또는 세포소기관을 회수하는 단계(개별화된 세포 또는 세포소기관의 적어도 하위-집단은 방출 핵산으로 표지됨).
제2 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플의 개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑 및 시퀀싱하는 방법에 관한 것으로, 방법은 다음을 포함한다:
a) 본 발명에 따른 개별 세포 또는 세포소기관을 표지화하기 위한 방법에 의해 수득 가능한 바와 같은 (i) 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 핵산, 또는 (ii) 이의 역 상보체로 표지된 개별화된 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 핵산 또는 이의 역 상보체로 표지된 개별화된 세포 또는 세포소기관을 구획에 포획하는 단계(구획은 구획-특이적 핵산, 및 핵산 표지화 및 추가 시퀀싱을 위한, 다음의 서열 중 적어도 하나를 포함함: 혼성화 부위, 라이게이션 부위 또는 재조합 부위);
c) 선택적으로, 광학적 검출을 사용하여, 포획된 세포, 세포소기관 및/또는 이들이 분비하는 분자를 분석하는 단계;
d) 포획된 세포, 또는 세포 및 세포소기관을 용해하고, 이에 의해 구획 내의 세포 또는 세포소기관으로부터 핵산을 방출하는 단계;
e) i) 구획-특이적 서열을 ii) 구획 내의 세포 또는 세포소기관으로부터 방출된 핵산 및 iii) 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열, 또는 이의 역 상보체를 포함하는 핵산과 회합시키는 단계;
f) 단계 e)에서 생산된 핵산을 구획으로부터 회수하고, 회수된 핵산을 시퀀싱하는 단계; 및
g) 동일한 구획-특이적 서열을 포함하는 핵산을, 동일한 단일 세포로부터 기원한 것으로서 정의하고, 단계 e)에서 생산된 핵산에 함유된 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열에 기반하여 생물학적 샘플에서 원래의 단일 세포의 포지션을 맵핑하여, 이에 의해 생물학적 샘플의 개별 세포의 맵핑 및 시퀀싱 정보를 조합하는 단계;
h) 단계 e)에서 생산된 핵산에 함유된 동일한 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열의 상대적 비율을 결정하여 삼각 측량의 원리로 세포 간의 거리를 추정함으로써 생물학적 샘플에서 원래의 단일 세포의 포지션을 맵핑하는 단계; 및
i) 선택적으로, 해리 전에 촬영된 생물학적 샘플의 현미경으로부터의 이미지에 시퀀싱 정보를 다시 맵핑하는 단계.
제3 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트에 관한 것이다:
a) 방출체 핵산(각각의 방출체 핵산은 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함함);
b) 수용체 핵산(각각의 수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함함);
c) 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드;
d) 선택적으로 닉킹 엔도뉴클레아제 및 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소.
본 발명은 (선택적으로 투과화된)세포를 통해 복수의 세포 또는 세포소기관, 예를 들어, 약 2 내지 10개의 세포를 포함하는 생물학적 샘플, 예컨대, 조직 절편의 구역으로의 확산에 의해 식별 핵산을 할당하는 용액에 관한 것이다. 동일한 식별 핵산을 운반하는 세포가 동일한 구역에 있기 때문에, 생물학적 샘플의 해리 후 이웃 세포의 네트워크의 재구성, 및 세포 핵산의 단일-세포 분석이 가능하며, 따라서 해리 이전 세포의 공간적 조직을 재구성하는 것이 가능하다. 특이적 식별 핵산의 상이한 비율은 삼각 측량의 원리에 기반하여 세포 간의 원래 거리를 추정할 수 있게 한다. 본 발명은 식별 핵산 서열의 국소 등온 증폭 또는 사전-증폭에 이어 이들의 확산에 좌우된다. 식별 핵산 서열은 생산된 핵산과 컨쥬게이션되도록 변형된 리간드를 통해 주변 세포와 회합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 생물학적 샘플의 세포가 현재 기법(액적 미세유체역학, 밸브 미세유체역학, 마이크로플레이트, 열작동 가능한 하이드로겔)을 사용하여 개별적으로(단일 세포) 해리, 분석 및 시퀀싱되는 것을 가능하게 하며, 각각의 세포가 시작 생물학적 샘플에서의 그의 포지션을 결정할 가능성을 갖는다.
개별 세포 또는 세포소기관을 표지화하기 위한 방법
제1 양태에서, 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 식별 핵산 서열로 표지화하는 방법이 제공된다.
제1 실시형태에서, 식별 서열을 포함하는 "방출체 핵산"으로 불리는 핵산의 제1 세트를 운반하는 리간드, 및 "수용체 핵산"으로 불리는 핵산의 제2 세트를 운반하는 리간드를 포함하는 용액이 생물학적 샘플과 접촉하게 된다. 세포 또는 세포소기관에 대한 리간드 컨쥬게이션 후, 생물학적 샘플을 헹군 후, 닉킹 엔도뉴클레아제, 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소, 및 선택적으로 효소 활성과 상용 가능한 완충제에서의 국소 증폭을 개선시키기 위한 추가적인 핵산을 함유하는 제2 용액을 조직의 표면에 첨가한다. 방출체 핵산에 대한 엔도뉴클레아제 및 중합효소의 작용에 의해, 식별 서열을 포함하는 이들 핵산의 일부의 카피가 방출될 것이다. 식별 서열을 포함하는 이러한 "방출 핵산"의 카피는 이어서 수용체 핵산에 대한 혼성화에 의해 "수용체" 리간드 상에 포획될 것이다.
제2 실시형태에서, 식별 서열을 함유하는 방출체 핵산은 롤링 서클 증폭(RCA)을 사용하여 증폭되어, 동일한 핵산의 콘카티머를 형성한 후, 제한 효소로 생물학적 샘플과 접촉시켜, 콘카티머를 파단한다. 수용체 핵산을 운반하는 리간드도 생물학적 샘플과 접촉하게 된다. 절단된 콘카티머 단편은 수용체 핵산에 대한 혼성화에 의해 세포 또는 세포소기관과 회합하게 된다. 대안으로서, 이러한 제2 실시형태에서, 식별 서열을 함유하는 핵산은 동일한 식별 서열을 포함하는 다중 방출체 핵산을 보유하는 비드의 형태로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 샘플, 조직 샘플, 오가노이드, 2D 세포 배양물(특히 2D 합류 세포 배양물), 또는 3D 세포 배양물과 같은 이웃 세포의 임의의 네트워크를 포괄한다. 생물학적 샘플은 신선하거나, 냉동되거나, 고정될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 생물학적 샘플은 종양 조직 샘플이다.
방법의 프레임에서, 핵산의 제1 세트("방출체 핵산")가 제공되며, 여기서 각각의 핵산 분자는 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 연속적으로, 바람직하게는 5'-3' 방향으로 포함한다.
방출체 핵산의 세트의 핵산 분자 중 적어도 일부는 적어도 식별 서열에 의해 다른 핵산 분자와 상이하다. 일 실시형태에 따르면, 방출체 핵산의 세트의 각각의 핵산 분자는 적어도 식별 서열에 의해 다른 핵산 분자와 상이하다. 상이한 식별 서열은 바코드 서열일 수 있거나, 불변 서열(들) 및 바코드 서열 둘 모두를 포함할 수 있다. "바코드 서열"이란, 무작위적인 핵산 서열 또는 정의된(즉, 알려진) 서열을 나타내는 핵산 서열을 의미한다.
일부 실시형태에 따르면, 증폭 서열은 방출체 핵산의 세트의 핵산 분자의 전부 또는 일부(바람직하게는 전부)에서 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 포획 서열은 방출체 핵산의 세트의 핵산 분자의 전부 또는 일부(바람직하게는 전부)에서 동일하다.
방출체 핵산은 바람직하게는 최대 110, 100, 90, 80, 70 또는 바람직하게는 60개의 뉴클레오티드 길이이지만, 더 긴 서열도 사용될 수 있다. 전형적으로, 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열 각각은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 12 내지 25개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 방출체 핵산은 (닉킹 엔도뉴클레아제에 대한) 닉킹 부위, 뿐만 아니라, 닉킹 부위에 인접한 일부 연속 뉴클레오티드 (프라이밍 부위를 형성함)를 추가로 포함하여, 중합 및 닉킹을 통한 증폭을 위한 프라이밍을 가능하게 한다.
방출체 핵산은 바람직하게는 DNA 분자이고, 단일 가닥 DNA 또는 부분적으로 이중 가닥 DNA(헤어핀 DNA)일 수 있다.
예를 들어, 방출체 핵산은 AACACCAAACCCTTCTAAAGCCCAAACCTC NNNNNNNNNNNN AAGCGATCTGTTACCAAGCCGT CCTCAGC AGGATTAGAG TTTTT CTCTAATCCTGC(SEQ ID NO:2)를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 포획 서열을 나타내고, 이탤릭체의 뉴클레오티드는 식별 서열인 바코드 서열을 나타내고, 볼드체의 뉴클레오티드는 닉킹 부위, 프라이밍 부위, 루프 및 (자가-프라이밍을 위한) 프라이밍 부위의 역 상보체와 함께 증폭 서열을 나타낸다.
방법의 제1 실시형태에 따르면, 각각의 방출체 핵산은 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 결합된다.
이러한 실시형태에 따르면, 방출체 핵산은 증폭 서열의 3'에서 닉킹 부위에 상보적인 서열을 추가적으로 포함한다.
방법의 제2 실시형태에 따르면, 방출체 핵산의 세트는 방출체 핵산의 그룹(들)의 형태로 제공되며, 그룹의 모든 방출체 핵산은 동일한 식별 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방출체 핵산은 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 결합되지 않는다.
특히, 방출체 핵산의 그룹은 롤링-서클(rolling-circle) 복제에 의해 생성된 방출체 핵산의 콘카티머의 형태로 제공될 수 있으며, 각각의 콘카티머는 동일한 방출체 핵산을 포함한다. 방출체 핵산의 그룹은 또한 동일한 식별 서열을 포함하는 방출체 핵산을 운반하는 비드 또는 동일한 방출체 핵산을 운반하는 비드의 형태로 제공될 수 있다.
이러한 제2 실시형태에서, 방출체 핵산의 서열은 이어서 제한 부위 또는 (예컨대, 광절단, 다이올 연결, 펩티드 연결 또는 우라실, 메틸화 또는 RNA와 같은 변형된 염기를 통한) 절단 부위를 포함하여, 특히 제한 부위의 경우 제한 효소의 작용 하에 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 방출체 핵산의 영역을 콘카티머 또는 비드로부터 방출한다.
방법의 프레임에서, 핵산의 제2 세트("수용체 핵산")가 제공되며, 여기서 각각의 수용체 핵산은 공유적으로 또는 비-공유적으로 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 커플링된다.
수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함하도록 설계된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "매칭하는"은 서열이 연속 뉴클레오티드의 스트레치, 바람직하게는 적어도 8, 10, 12, 14, 또는 16개 이상의 연속 뉴클레오티드에 걸쳐, 그리고 여전히 바람직하게는 2개의 서열 중 더 짧은 서열의 총 길이에 걸쳐 또 다른 서열과 완전한 동일성을 가짐을 나타낸다.
일부 실시형태에 따르면, 수용체 핵산이 적절한 시간, 예를 들어, 단일-세포 바코딩을 위한 구획에서의 단리 후에 포획된 식별 서열을 방출할 수 있도록, 수용체 핵산은 (엔도뉴클레아제에 대한) 제한 부위 또는 (예컨대, 광절단, 다이올 연결, 펩티드 연결 또는 우라실, 메틸화 또는 RNA와 같은 변형된 염기를 통한) 절단 부위를 추가로 포함한다.
예를 들어, 수용체 핵산은 AACACCAAACCCTTCTAAAGCCCAAACCTC(SEQ ID NO:3, 즉, SEQ ID NO:2 서열의 방출체 핵산의 포획 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있음), 또는 방출체 핵산이 SEQ ID NO:2를 포함하거나 이로 이루어지는 경우 ACACGTTGATCTAGTCGCCACCAACACCAAACCCTTCTAAAGCCCAAACCTCCATTCGTTCCGCTCGCAACAAT (SEQ ID NO:4)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. SEQ ID NO:4에서, 볼드체의 뉴클레오티드는 소광제와 혼성화하는 서열을 나타내고, 표준 문자의 뉴클레오티드의 스트레치는 SEQ ID NO:3으로 이루어지며, 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 비오틴을 갖는 스페이서를 나타낸다.
수용체 핵산은 전형적으로 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 12 내지 25개의 뉴클레오티드 길이이다.
수용체 핵산은 바람직하게는 DNA 분자, 그리고 여전히 바람직하게는 단일 가닥 DNA이다. 수용체 핵산은 또한 이중 가닥 및 부분적으로 단일-가닥 DNA일 수 있어, 방출된 서열과의 라이게이션을 가능하게 한다.
리간드는 생물학적 샘플 내의 세포 표적 또는 세포소기관 표적에 결합한다. 일 실시형태에 따르면, 리간드는 세포 표면 또는 내측의 수용체 또는 수용체들에 결합한다. 또 다른 실시형태에 따르면, 리간드는 세포의 세포소기관의 표면 또는 내측의 수용체 또는 수용체들에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포소기관은 제한 없이, 미토콘드리아, 엽록체, 소포체, 편모, 골지체, 핵 및 액포를 포함한다.
예를 들어, 세포 또는 세포소기관의 표면 또는 내측에 존재하는 표적은 세포 또는 세포소기관 표면 단백질(예를 들어, CD45, CD3, CD19, CD98, CD298, ß2 마이크로글로불린), 탄수화물 (예를 들어, 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민), 및 세포 또는 세포소기관의 지질 이중층의 구성요소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 리간드는 항체, 압타머, 렉틴 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에 따르면, 리간드에 의해 결합된 세포 표적 또는 세포소기관 표적은 생물학적 샘플 내의 모든 또는 대부분의 세포 또는 세포의 세포소기관의 표면 또는 내측에 편재적으로 존재하는 표적(예를 들어, CD98, CD298, ß2 마이크로글로불린, 렉틴, 만노스, 갈락토스, 지질 이중층)이다.
또 다른 실시형태에 따르면, 리간드에 의해 결합된 세포 표적 또는 세포소기관 표적(예를 들어, CD45, CD3, CD19)은 조직 샘플 내의 세포 또는 세포소기관의 서브-세트의 내측 또는 표면에만 존재한다.
수용체 핵산의 리간드는 모두 동일하거나, 상이할 수 있으며, 바람직하게는 모두 동일할 수 있다.
방출체 핵산의 리간드는 모두 동일하거나, 상이할 수 있으며, 바람직하게는 모두 동일할 수 있다.
일 실시형태에서, 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 리간드는 동일하다.
개별 세포 또는 세포소기관을 표지화하기 위한 방법에 따르면, 용액 내의 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 세트가 생물학적 샘플과 접촉되어, 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 적어도 수용체 핵산으로 표지화한다.
세포소기관 분석의 경우, 생물학적 샘플(예를 들어, 조직 샘플)은 핵산의 카피가 투과화된 세포를 통해 확산되고 세포소기관에 도달하게 하기 위해 투과화될 필요가 있을 수 있다. 핵산이 세포소기관에 도달하는 것을 가능하게 하기 위해 당업자에게 알려진 대안적인 방법, 예컨대, 한쪽 말단에 침투성 펩티드를 갖는 방출체 핵산을 운반하는 비드를 사용하거나, 이들이 결합할 때 수용체-매개 엔도사이토시스를 유도하여 항체의 내재화를 야기하는 세포 표면 수용체에 특이적인 항체를 사용하는 것이 사용될 수 있다.
각각의 방출체 핵산이 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 결합되는 방법의 제1 실시형태에 따르면, 수용체 핵산 및 방출체 핵산 둘 모두는 생물학적 샘플의 세포 또는 세포소기관을 표지한다.
본 방법의 제1 실시형태에서, 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열의 역 상보체를 포함하는 방출 핵산의 생산은, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소에 의해 촉매되는 닉킹 및 중합에 의한 방출체 핵산의 등온 증폭에 의해 수행된다. 따라서, 방법의 단계 c)는 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 세트를 포함하고 생물학적 샘플과 접촉되는 용액에 가닥 대체 활성을 갖는 닉킹 엔도뉴클레아제 및 중합효소를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 방출체 핵산의 3' 부분은 중합을 위해 직접 자가-프라이밍될 수 있거나, 국소 증폭을 개선하기 위해 방출체 핵산의 3' 부분에 혼성화하는 유리 올리고뉴클레오티드의 첨가에 의해 프라이밍될 수 있다.
방출체 핵산의 세트가 동일한 식별 서열을 갖는 방출체 핵산의 그룹의 형태로 제공되는 방법의 제2 실시형태에 따르면, 수용체 핵산만이 생물학적 샘플의 세포 또는 세포소기관을 표지한다.
이러한 제2 실시형태에서, 그룹(콘카티머 또는 비드)의 방출체 핵산은 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 방출체 핵산의 영역("방출 핵산")의 다중 카피를 방출한다.
본 방법의 실시형태 둘 모두에서, 생물학적 샘플은 전형적으로 25℃ 내지 37℃에서 10 내지 60 분 동안 방출체 핵산, 수용체 핵산, 및 적절한 경우 (i) 닉킹 엔도뉴클레아제 및 중합효소 또는 (ii) 제한 엔도뉴클레아제와 함께 인큐베이션된다. 용액은 효소 활성과 상용 가능한 완충제를 포함한다. (예컨대, 광절단, 다이올 연결, 펩티드 연결 또는 위에 기재된 바와 같은 우라실, 메틸화 또는 RNA와 같은 변형된 염기를 통한) 절단 부위의 존재의 경우, 생물학적 샘플은 전형적으로 UV 선 또는 상기 연결을 파단할 수 있는 적응된 화학제에 노출된다.
접촉/인큐베이션 후에, 생물학적 샘플은 바람직하게 헹궈진다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플의 이미지는 해리 전에 현미경, 선택적으로 형광 현미경에 의해 촬영된다. 생물학적 샘플의 표지화, 예컨대, 형광 표지화는 수용체 핵산 및 방출 핵산으로 표지화하기 전에, 이와 동시에 또는 심지어 그 후에 행해질 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 몇몇 식별 서열에 특이적인 형광 프로브는, 실제 이미지를 이용한 재구성된 네트워크의 맵핑을 용이하게 하기 위해 사용된다.
생물학적 샘플의 이미지는 단계 d) 전에 또는 단계 e) 전에 또는 단계 d)와 e) 사이에 현미경에 의해 촬영될 수 있다.
본 방법은 생물학적 샘플을 해리하고 개별화된 세포 또는 세포소기관을 회수하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 개별화된 세포 또는 세포소기관의 적어도 하위-집단은 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열, 또는 이의 역 상보체를 포함하는 방출 핵산으로 표지된다.
생물학적 샘플의 해리는 예를 들어, 콜라게나제 I, Dnase I 및 히알루로니다제를 사용하여 달성될 수 있다.
개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑 및 시퀀싱하는 방법
개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑하는 위의 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 바와 같은 방출 핵산으로 표지된 개별화된 세포는 시퀀싱에 추가로 사용될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑 및 시퀀싱하는 방법은 방출 핵산으로 표지된 개별화된 세포 또는 세포소기관을 제공하기 위해 본 발명의 표지화 방법을 구현하는 단계를 포함한다. 따라서, 개별화된 세포는 (i) 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 핵산, 또는 (ii) 이의 역 상보체로 표지된다.
맵핑 및 시퀀싱하는 방법은 방출 핵산으로 표지된 개별화된 세포를 구획에 포획하는 단계를 (추가로) 포함하며, 여기서 구획은 구획-특이적 핵산 및 핵산 표지화 및 추가 시퀀싱을 위한 다음의 서열 중 적어도 하나를 포함한다: 혼성화 부위, 라이게이션 부위 또는 재조합 부위.
일 실시형태에서, 단일 세포 또는 단일 세포소기관은 구획 내에 포획된다.
구획은 상이한 핵산을 특이적으로 표적화하기 위한 복수의 구획-특이적 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 구획-특이적 핵산은 구획에 특이적인 바코드를 포함한다. 바람직하게는, 구획에 포함되는 구획-특이적 핵산은 DNA이다.
구획-특이적 핵산은 예를 들어, mRNA의 폴리(A) 테일에 대한 혼성화를 위한 서열 올리고 d(T) 또는 올리고 d(T)VN의 3'-영역(mRNA 시퀀싱용), 특이적 RNA(표적화된 RNA 시퀀싱용) 또는 DNA(표적화된 DNA 시퀀싱용)의 서열에 상보적인 서열의 3'-영역, 또는 무작위 서열, 예를 들어, d(N)6의 3'-영역(RNA 시퀀싱 또는 DNA 시퀀싱용)을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 이것은 포획된 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터 방출된 핵산에 혼성화하는 구획-특이적 서열을 함유하는 프라이머의 불변 영역이다.
일 실시형태에서, 구획-특이적 핵산은, 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 핵산, 또는 이의 역 상보적 핵산에 존재하는 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 프라이머 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구획"은 예를 들어, 액적, 하이드로겔 매트릭스, 공압 밸브에 의해 분리된 미세제작된 챔버, 작동 가능한 하이드로겔로 제조된 미세제작된 챔버, 미세제작된 웰, 작동 가능한 하이드로겔 케이지 또는 미세플레이트 웰을 나타낸다.
일 실시형태에 따르면, 구획은 마이크로플레이트의 웰이며, 여기서 각각의 웰은 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 웰에 특이적인 구획 특이적 서열을 포함하고, 식별 서열을 포함하는 핵산으로 표지된 개별화된 세포는 웰에 포획된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 구획은 작동 가능한 하이드로겔로 제조된 미세제작된 챔버이다. 작동 가능한 하이드로겔로 제조된 미세제작된 챔버의 이러한 실시형태에서, 구획은 바람직하게는 이후 "미세유체 디바이스" 섹션(section)에 정의된 바와 같은 미세유체 디바이스의 구획이다.
일 실시형태에 따르면, 구획은 표지된 개별화된 세포 또는 세포소기관이 임베딩된 하이드로겔 매트릭스를 포함하거나 이로 이루어져, 별개의 생물학적 단위를 형성한다. 이러한 실시형태에 따르면, 표지된 개별화된 세포 또는 세포소기관을 복수의 바코드 단위와 접촉시켜 생물학적 단위/바코드 단위 복합체를 형성하고, 상기 생물학적 단위/바코드 단위 복합체를 하이드로겔 용액과 접촉시킨 다음, 중합시켜 상기 생물학적 단위/바코드 단위 복합체를 하이드로겔 매트릭스에 임베딩한다(상기 생물학적 단위/바코드 단위 복합체 각각은 고유한 바코드를 포함함). 하이드로겔 매트릭스를 형성하기에 적합한 하이드로겔은, 그 전체가 본원에 포함되는 국제 특허 출원 WO2018203141에 기재된 바와 같다. 하이드로겔은 특히 열민감성 또는 열가역성 하이드로겔, 즉, 형성된 후에, 하이드로겔에 함유된 중합체(들)의 융점 초과로 상승되는 경우 탈중합되는 하이드로겔이다.
일 실시형태에 따르면, 개별화된 세포 또는 세포소기관을 포획한 후에, 그리고 이의 후속 용해 전에, 본 방법은 형광 이미징을 포함한 이미징 또는 형광 검출과 같은 광학적 검출을 사용하여, 포획된 세포, 세포소기관 및/또는 이들이 분비하는 분자를 분석하는 단계를 포함한다.
이어서, 방법은 포획된 세포, 또는 세포 및 세포소기관을 용해하여, 이에 의해 구획 내의 세포 또는 세포소기관으로부터 핵산을 방출하는 단계를 포함한다. 용해는 당업자에게 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 저염분 물, SDS 또는 트리톤 X-100의 용액을 구획 내로 주입하여, 삼투 충격에 의해 세포 및/또는 세포소기관을 용해한다.
방법은 i) 구획-특이적 핵산을 ii) 구획 내의 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터 방출된 핵산과 회합시키는 단계를 추가로 포함한다. 회합은 특히 다음 중 어느 하나에 의해 수행된다:
i) 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터의 방출된 핵산에 대한 상보성에 의해 구획-특이적 핵산을 혼성화하는 것;
ii) 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터의 방출된 핵산에 대한 상보성에 의해 구획-특이적 핵산을 혼성화하고, DNA 중합효소를 사용하여 방출된 핵산에 혼성화된 구획-특이적 핵산을 연장하여, 회합된 구획-특이적 서열을 갖는 방출된 핵산의 상보적 가닥을 생성하는 것;
iii) 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터의 RNA의 역전사에 의해 생산된 cDNA의 3'-말단에 대한 상보성에 의해 구획-특이적 핵산을 혼성화하고, DNA 중합효소를 사용하여 구획-특이적 핵산에 혼성화된 cDNA를 연장하여, 회합된 구획-특이적 서열을 갖는 구획-특이적 핵산의 상보적 가닥을 생성하는 것;
iv) 구획-특이적 핵산을 구획에 존재하는 DNA에 라이게이션시키는 것; 또는
v) 구획-특이적 핵산을 구획에 존재하는 DNA와 재조합하는 것.
세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터 방출된 구획-특이적 서열 및/또는 핵산은 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열, 또는 이의 역 상보체를 포함하는 방출 핵산과 추가로 회합된다. 이를 위해, 구획-특이적 핵산은, 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 방출 핵산, 또는 이의 역 상보적 핵산에 존재하는 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 프라이머 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 이어서, 본 방법은 방출 핵산에 존재하는 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 구획-특이적 핵산을 혼성화하는 단계, 및 DNA 중합효소를 사용하여 하나 또는 둘 모두의 혼성화된 DNA 가닥을 연장하여 식별 서열 또는 이의 역 상보체, 및 구획-특이적 서열 또는 이의 상보체 둘 모두를 포함하는 DNA 분자를 생성하는 단계를 추가적으로 포함한다. 대안적으로, 혼성화 및 연장 단계 대신에, 본 방법은 방출 핵산에 존재하는 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 구획-특이적 핵산을 라이게이션시키거나, 방출 핵산에 존재하는 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 구획-특이적 핵산을 재조합하는 단계를 추가적으로 포함한다.
i) 구획-특이적 핵산과 ii) 구획 내의 세포(들) 또는 세포소기관(들)으로부터 방출된 핵산 및 (iii) 방출 핵산의 회합으로부터 생성된 핵산은 이어서 회수되고 시퀀싱된다.
동일한 구획-특이적 서열을 포함하는 핵산은 동일한 구획으로부터 기원하는 것(즉, 단일 세포 또는 단일 세포소기관이 구획 내로 포획된 경우 동일한 단일 세포 또는 세포소기관으로부터 유래된 것)으로서 정의되거나 식별된다. 생물학적 샘플 내/상의 원래의 단일 세포 또는 세포소기관의 포지션의 맵핑은 이렇게 생산된 핵산에 함유된 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열에 기반하여, 이에 의해 생물학적 샘플의 개별 세포의 맵핑 및 시퀀싱 정보를 조합한다. 실제로, 생물학적 샘플에서의 원래의 단일 세포 또는 세포소기관(또는 단일 구획에 함유된 복수의 세포 또는 세포소기관)의 포지션의 맵핑은 단계 e)에서 생산된 핵산에 함유된 동일한 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열의 상대적 비율을 결정하여 삼각 측량의 원리로 세포 간의 거리를 추정함으로써 수행된다.
시퀀싱 정보는 해리 전에 촬영된 생물학적 샘플의 현미경으로부터의 이미지에 다시 맵핑될 수 있다.
미세유체 디바이스
이러한 실시형태에서, 구획은 다음을 포함하는 미세유체 디바이스의 구획이다:
- 제1 기재(14)를 포함하고 제1 기재 상에 복수의 폐쇄된 패턴(16)이 이식되어 있는, 제1 벽(12),
- 제2 기재(20)를 포함하고 제1 벽(12)을 향하는 제2 벽(18),
- 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 이식된 복수의 핵산(22)(각각의 핵산(22)은 상기 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상의 핵산의 포지션을 인코딩하는 바코드를 포함함),
여기서 적어도 복수의 폐쇄된 패턴(16) 또는 제2 기재(20)는 폐쇄된 패턴(16)과 제2 기재(20)가 접촉하게 되는 팽윤 상태와 수축 상태 사이에서 팽윤성인 작동가능한 하이드로겔로 제조된다(10).
팽윤 상태에서, 디바이스의 폐쇄된 패턴과 제2 기재는 접촉한다. 따라서, 디바이스는 복수의 케이지를 포함하고, 각각의 케이지는 폐쇄된 패턴으로 이루어진 측벽에 의해 그리고 제1 및 제2 기재들로 구성된 말단 벽에 의해 한정된다.
수축 상태에서, 폐쇄된 패턴 및 제2 기재는 더 이상 접촉하지 않는다. 폐쇄된 패턴과 제2 기재 사이의 간극은 유체 및 세포가 디바이스 내측에서 자유롭게 순환할 수 있게 한다.
수축 상태와 팽윤 상태 사이에서, 본 발명에 따른 디바이스는 작동가능한 하이드로겔이 부분적으로만 팽윤되는 다수의 중간 상태를 거친다. 이러한 구성에서, 폐쇄된 패턴과 제2 기재 사이의 간극은 여전히 존재한다. 그러나, 간극의 높이는 수축 상태에 비해 충분히 감소되고, 그에 따라 케이지에 포획된 세포가 케이지 내에 보유된다. 이러한 중간 구성은 전형적으로 세포가 아닌 유체의 선택적 통과를 허용하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 각각의 폐쇄된 패턴은 외부 자극에 의해 폐쇄 및 개방이 개시되는 세포에 대한 포획 부위를 정의한다. 바람직한 실시형태에서, 외부 자극은 pH, 빛의 세기, 온도 또는 전류 세기의 변화이다. 매우 바람직한 실시형태에서, 외부 자극은 온도의 변화이다.
미세유체 디바이스는 적어도 2개의 폐쇄된 패턴을 포함한다. 바람직하게는, 미세유체 디바이스는 다수의 폐쇄된 패턴, 전형적으로 100개, 1,000개, 10,000개, 100,000개 …을 포함한다.
제1 벽 및 제2 벽은 -20 내지 100℃ 범위의 온도 변동에 저항할 수 있는 강성 재료로 제조된다. 제1 실시형태에 따르면, 벽(제1 및/또는 제2 벽)은 고유하고 균질한 재료로 제조된다. 따라서, 벽은 기재로 이루어진다.
제2 실시형태에 따르면, 벽은 기재가 고정/코팅되는 지지 재료를 추가로 포함한다. 전형적으로, 벽은 기재 층으로 덮인, 유리 또는 폴리디메틸실록산으로 제조된 지지 재료로 이루어진다.
미세유체 디바이스는 2개의 단층 벽, 2개의 다층 벽 또는 하나의 단층 벽 및 하나의 다층 벽을 균등하게 포함할 수 있다.
제1 기재는 전형적으로 규소, 석영, 유리, 폴리디메틸실록산, 열가소성 물질, 예컨대, 환형 올레핀 공중합체 및 폴리카르보네이트로부터, 바람직하게는 유리 및 폴리디메틸실록산으로부터 선택되는 재료로 제조된다. 바람직하게는, 제1 기재는 폴리디메틸실록산으로 제조된다.
일 실시형태에 따르면, 제1 기재의 표면의 적어도 일부는 구조화 및/또는 작용화된다.
"구조화된"이란, 기재의 표면이 불규칙하다는 것을 의미한다. 기재의 표면은 다공성이거나 미시적으로 구조화될 수 있다. 특히, 이는 미시적인 줄무늬, 기둥 등을 포함할 수 있다.
기재의 구조화는 임의의 공지된 프로세스에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 잘 문서화되어있는 표준 소프트-리소그래피 기법이 언급될 수 있다.
"작용화된"이란, 기재의 표면 상의 화학 작용기의 고정을 의미한다. 전형적으로, 제1 기재의 표면은 하이드록사이드 기, 실라놀 기 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 화학기, 바람직하게는 실라놀 기로 작용화된다.
기재(들)의 구조화 및/또는 작용화는 그의 표면 상의 폐쇄된 패턴 및/또는 핵산의 이식을 용이하게 하는 것을 허용한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 제1 벽은 구조화 및/또는 작용화된 폴리디메틸실록산 기재, 바람직하게는 구조화되고 작용화된 폴리디메틸실록산 기재로 제조된다.
폐쇄된 패턴은 매우 다양한 형상을 가질 수 있다. 바람직하게는, 폐쇄된 패턴은 직사각형, 정사각형, 원형 또는 육각형이다.
바람직하게는, 폐쇄된 패턴은 제1 기재에 공유적으로 이식된다.
특정 실시형태에 따르면, 제2 기재는 하이드로겔로 제조되고, 폐쇄된 패턴은 비-팽윤성 재료로 제조된다. 바람직하게는, 이러한 특정 실시형태에 따르면, 제2 벽은 팽윤성 하이드로겔이 침착되는 비-팽윤성 지지 재료를 포함한다. 비-팽윤성 지지 재료는 구조화 및/또는 작용화될 수 있다. 비-팽윤성 재료의 구조화 및/또는 작용화는 제1 기재의 맥락에서 위에서 언급되었던 것과 유사하게 이루어진다. 따라서, 이러한 실시형태에 따르면, 폐쇄된 패턴은 비-팽윤성이고, 이는 케이지의 폐쇄를 허용하는 것은 제2 기재의 팽윤이다.
바람직하게는, 이러한 실시형태에 따르면, 폐쇄된 패턴은 규소, 석영, 유리, 폴리디메틸실록산, 열가소성 물질, 예컨대, 환형 올레핀 공중합체 및 폴리카르보네이트로부터, 바람직하게는 유리 또는 폴리디메틸실록산으로부터 선택되는 재료로 제조된다.
바람직하게는, 폐쇄된 패턴은 0.1 내지 100 μm, 바람직하게는 1 내지 30 μm 범위의 높이를 갖는다.
바람직하게는, 폐쇄된 패턴의 벽은 0.1 내지 500 μm, 바람직하게는 1 내지 20 μm 범위의 두께를 갖는다.
유리하게는, 이러한 실시형태에 따르면, 제2 기재는 1 내지 500 μm, 바람직하게는 1 내지 100 μm 범위의, 폐쇄된 패턴과 접촉한 팽윤 상태에서 측정된 두께를 갖는다.
유리하게는, 여전히 이러한 실시형태에 따르면, 하이드로겔을 포함하는 제2 기재는 0.5 내지 150 μm, 바람직하게는 0.5 내지 50 μm 범위의, 건조 상태에서 측정된 두께를 갖는다.
바람직한 실시형태에 따르면, 폐쇄된 패턴은 하이드로겔로 제조되고 제2 기재는 비-팽윤성 재료로 제조된다. 따라서, 이러한 실시형태에 따르면, 제2 기재는 비-팽윤성이고 폐쇄된 패턴은 케이지를 폐쇄하도록 팽윤된다.
바람직하게는, 이러한 바람직한 실시형태에 따르면, 제2 기재는 규소, 석영, 유리, 폴리디메틸실록산, 열가소성 물질, 예컨대, 환형 올레핀 공중합체 및 폴리카르보네이트로부터, 바람직하게는 유리 또는 폴리디메틸실록산으로부터 선택되는 재료로 제조된다. 유리하게는, 하이드로겔 패턴은 0.1 μm 내지 500 μm, 바람직하게는 1 μm 내지 250 μm, 더 바람직하게는 1 μm 내지 100 μm 범위의, 하이드로겔 패턴이 제2 벽과 접촉할 때 팽윤 상태에서 측정된, 높이를 갖는다.
유리하게는, 하이드로겔 패턴은 0.1 μm 내지 150 μm, 바람직하게는 0.5 μm 내지 100 μm, 더 바람직하게는 0.5 μm 내지 50 μm 범위의, 건조 상태에서 측정된, 높이를 갖는다.
바람직하게는, 하이드로겔 패턴의 벽은 0.1 μm 내지 100 μm, 바람직하게는 1 μm 내지 10 μm 범위의, 하이드로겔 패턴이 제2 벽과 접촉할 때 팽윤 상태에서 측정된, 해상도를 갖는다.
바람직하게는, 하이드로겔 패턴의 벽은 0.1 μm 내지 100 μm, 바람직하게는 0.5 μm 내지 5 μm 범위의, 건조 상태에서 측정된, 해상도를 갖는다.
"하이드로겔"은 본 발명의 맥락상 특정 물리-화학적 조건 하에서, 물의 존재 하에 팽윤될 수 있는 3차원 네트워크를 형성하는 중합체 매트릭스를 포함하는 겔을 지칭한다. 하이드로겔의 팽윤은 예를 들어, 열적, 광학적, 화학적 또는 전기적 자극에 의해 개시될 수 있다.
예를 들어, 하이드로겔의 팽윤(또는 수축)은 이것이 배치된 매질의 온도, 압력 또는 pH 값의 변화에 의해 개시될 수 있다.
바람직하게는, 하이드로겔은 온도-반응성 팽윤성 하이드로겔이다. "온도-반응성 팽윤성 하이드로겔"은 본 발명의 맥락에서 온도를 변화시킴으로써 팽윤 또는 수축이 유도되는 하이드로겔을 지칭한다. 온도-반응성 팽윤성 하이드로겔은 전형적으로 온도에 따른 수용해도의 급격한 변화를 나타낸다.
특정 온도 범위에서, 하이드로겔은 수용성이고 다량의 물을 흡수한다.
반대로, 매질의 온도를 변경함으로써, 하이드로겔은 더 이상 수용성이 아니다. 이어서, 하이드로겔은 물을 방출하고 수축한다.
"팽윤 상태"는 본 발명의 맥락에서 디바이스가 복수의 기밀된 케이지를 포함하도록 폐쇄된 패턴과 제2 기재가 접촉하는 하이드로겔의 상태를 지칭한다.
"수축 상태"는 본 발명의 맥락에서 폐쇄된 패턴과 제2 기재가 접촉하지 않는 하이드로겔의 상태를 지칭한다: 폐쇄된 패턴과 제2 기재 사이의 간극이 존재하여 미세유체 디바이스 내측에서 유체 및 세포의 자유로운 순환을 허용한다. "수축 상태"는 하이드로겔에 완전히 물이 없는 것은 아니라는 점에서 아래에 정의된 “건조 상태”와는 상이하다. 수축 상태에서, 하이드로겔은 여전히 적어도 부분적으로 수화되어 있다.
"건조 상태"는 본 발명의 맥락에서 하이드로겔에 물이 거의 완전히 없는 상태로 지칭한다. 전형적으로, 하이드로겔은 미세유체 디바이스의 제조 동안, 특히 하이드로겔 패턴의 이식 동안 또는 하이드로겔 기재로 제2 벽을 코팅하는 동안 건조 상태에 있다.
하이드로겔의 수용성 특성이 급격히 변화하는 온도는 임계 용액 온도(CST)로 지칭된다.
바람직하게는, 하이드로겔은 4℃ 내지 98℃, 더 바람직하게는 20℃ 내지 50℃, 심지어 더 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 범위의 임계 용액 온도(CST)를 갖는다.
제1 변형예에 따르면, 하이드로겔의 임계 용액 온도(CST)는 하한 임계 용액 온도(LCST)이다. LCST보다 높은 온도에서 하이드로겔은 수축 상태에 있고, LCST보다 낮은 온도에서 하이드로겔은 팽윤 상태에 있다.
제2 변형예에 따르면, 하이드로겔의 임계 용액 온도(CST)는 상한 임계 용액 온도(UCST)이다. UCST보다 높은 온도에서 하이드로겔은 팽윤 상태에 있고, UCST보다 낮은 온도에서 하이드로겔은 수축 상태에 있다.
하이드로겔의 중합체 매트릭스를 구성하는 중합체는 전형적으로 아크릴, 알킬 (메트)아크릴레이트, 알킬 (메트)아크릴아미드, 올리고에틸렌 (메트)아크릴레이트, 설포베타인 (메트)아크릴레이트 및 N-아크릴로일 글리신아미드의 단일 중합체, 공중합체 및 삼원공중합체로부터 선택되고, 바람직하게는 알킬 (메트)아크릴아미드 및 이들의 임의의 혼합물의 단일 중합체, 공중합체 및 삼원공중합체로부터 선택되고, 더 바람직하게는 하이드로겔은 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)를 포함한다.
중합체는 LCST 중합체, UCST 중합체 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
하이드로겔의 맥락에서 위에서 언급한 것에서 유추하여:
- 표현 “LCST 중합체”는 하한 임계 용액 온도를 갖는 열-반응성 중합체를 지칭하고,
- 표현 “UCST 중합체”는 상한 임계 용액 온도를 갖는 열-반응성 중합체를 지칭한다.
하이드로겔의 전반적인 거동(UCST 및/또는 LCST 거동)은 하이드로겔에 존재하는 상이한 중합체의 성질 및 양에 좌우된다.
중합체가 UCST 중합체로부터 선택되는 경우, 이는 바람직하게는 아크릴, 알킬 (메트)아크릴레이트, 알킬 (메트)아크릴아미드, 올리고에틸렌 (메트)아크릴레이트, 설포베타인 (메트)아크릴레이트, N-아크릴로일 글리신아미드 및 이들의 혼합물의 단일 중합체, 공중합체 및 삼원공중합체로부터 선택된다.
바람직하게는, UCST 중합체는 메트아크릴아미드, 아크릴아미드 및 알릴메트아크릴레이트의 삼원공중합체이다.
중합체가 LCST 중합체로부터 선택되는 경우, 이는 바람직하게는 아크릴, 알킬 (메트)아크릴레이트, 알킬 (메트)아크릴아미드, 올리고에틸렌 (메트)아크릴레이트 및 이들의 혼합물의 단일 중합체, 공중합체 및 삼원공중합체로부터, 더 바람직하게는 알킬 (메트)아크릴아미드의 단일 중합체, 공중합체 및 삼원공중합체로부터 선택되고, 심지어 더 바람직하게는 LCST 중합체는 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)이다.
바람직하게는, LCST 중합체는 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)이다.
유리하게는, 중합체는 하나 또는 몇몇 UCST 또는 LCST 중합체를 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다.
유리하게는, 미세유체 디바이스는 반응물의 디바이스 내로의 도입 및 제거를 각각 허용하는 적어도 하나의 유입구(24) 및 적어도 하나의 유출구(26)를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 가열 수단이 본 발명에 따른 디바이스에 통합된다.
일 실시형태에 따르면, 각각의 케이지는 독립적인 가열 수단을 포함한다. 이러한 실시형태는 그것이 각각의 케이지를 독립적으로 개방 및 폐쇄하는 것을 허용한다는 점에서 특히 유리하다.
예를 들어, 국소 가열 수단이 광으로 조사될 때 가열되는 (플라즈몬 효과) 나노입자로 이루어질 수 있다. 나노입자는, 예를 들어, 하이드로겔과 그것이 코팅되는 벽 사이에 침착되거나 하이드로겔의 중합체 매트릭스에 분산될 수 있다. 바람직하게는, 나노입자는 금속 나노입자 및 플라즈몬 나노입자로부터 선택되며, 바람직하게는 금, 그래핀, 은, 구리 및 질화티타늄을 포함한다.
또 다른 예에서, 국소 가열은 미세저항기; 예를 들어 크롬/금 이중층 또는 TiO2 구조를 포함하는 미세저항기를 사용하여 수행된다.
미세유체 디바이스는 제1 기재 또는 제2 기재 상에 이식된 복수의 구획 특이적 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 각각의 핵산은 상기 제1 기재 또는 제2 기재 상의 핵산의 포지션을 인코딩하는 서열 바코드를 포함한다.
유리하게는, 하이드로겔이 팽윤 상태에 있을 때, 핵산은 케이지 내측에 배치되도록 이식된다.
더 유리하게는, 핵산은 폐쇄된 패턴 내측에서 제1 기재 상에 또는 폐쇄된 패턴의 반대편에서 제2 기재 상에 이식된다.
바람직하게는, 폐쇄된 패턴이 하이드로겔로 제조될 때, 핵산은 제2 기재의 표면 상에 이식된다. 바람직하게는, 제2 기재가 하이드로겔로 제조될 때, 핵산은 제1 기재의 표면 상에 이식된다.
이식된 핵산은 RNA 또는 DNA, 바람직하게는 DNA이다. 이식된 핵산은 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분 이중-가닥일 수 있다.
이식된 핵산은 바람직하게는 60 내지 100개의 뉴클레오티드 길이이다.
이식된 핵산은 직접 또는 링커에 의해 3’-말단 또는 5’-말단에서 기재에 부착될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 동일한 바코드를 공유하는 이식된 핵산은 복수의 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에 따르면, 동일한 바코드를 공유하는 이식된 핵산은 동일한 서열을 갖는다.
일 실시형태에 따르면, 이식된 핵산의 전부 또는 일부는 또 다른 핵산 또는 복수의 핵산에 혼성화되고, 부분 또는 완전 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA/RNA, 또는 이중 가닥 RNA를 형성한다.
일 실시형태에 따르면, 이식된 핵산은 다음의 서열 중 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다:
1) 핵산 방출을 위한 제한 부위 또는 광절단 가능 부위,
2) 추가 증폭을 위한 증폭 프라이머에 상보적인 서열,
3) 추가적인 시험관내 전사(IVT)를 위한 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열,
4) 핵산 표지화를 위한 혼성화 부위, 핵산 표지화를 위한 라이게이션 부위 또는 핵산 표지화를 위한 재조합 부위, 및
5) 고유 분자 식별자(UMI)로서 기능하는 무작위화된 뉴클레오티드 잔기의 서열.
바람직하게는, 이식된 핵산은 적어도 i) 상기 제1 또는 제2 기재 상의 핵산의 포지션을 인코딩하는 서열 바코드, 및 ii) 제한 부위 또는 광절단 가능 부위, 및 선택적으로는 추가로 iii) 프라이머 서열, 및/또는 T7 서열 및/또는 혼성화, 라이게이션 또는 재조합 부위를 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 미세유체 디바이스의 이식된 핵산은 불변 서열, 즉 모든 이식된 핵산에 존재하는 서열을 포함한다. 미세유체 디바이스의 이식된 핵산은 이식된 핵산의 불변 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 DNA에 혼성화될 수 있다. 불변 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 하나의, 또는 복수의 상이한 DNA가 이식된 핵산에 혼성화될 수 있다.
미세유체 디바이스는 세포 또는 세포소기관을 포획할 수 있는 구조를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 구조는 전형적으로 문헌[Vigneswaran N. et al, 2017, Microfluidic hydrodynamic trapping for single cell analysis: mechanisms, methods and applications, Anal. Methods,9, 3751-3772]과 같은 간행물로부터 선택된다.
바람직하게는, 세포 또는 세포소기관을 포획할 수 있는 구조는 폐쇄된 패턴 내측에서 제1 기재 상에 또는 폐쇄된 패턴의 반대편에서 제2 기재 상에 국소화된다.
바람직하게는, 각각의 케이지는 세포 또는 세포소기관을 포획할 수 있는 적어도 하나의 구조를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 복수의 리간드는 제1 기재(14) 상에 그리고/또는 폐쇄된 패턴의 반대편인 제2 기재(20) 상에 직접적으로 또는 간접적으로, 공유적으로 또는 비-공유적으로 이식된다.
유리하게는, 하이드로겔이 팽윤 상태에 있을 때, 리간드는 케이지 내측에 배치되도록 이식된다.
특히, 제1 기재(14) 상에 이식될 때, 리간드는 전형적으로 폐쇄된 패턴(16) 내측에 이식된다.
대안적으로, 제2 기재(20) 상에 이식될 때, 리간드는 폐쇄된 패턴을 향하고 있다.
리간드 모두는 동일한 기재 상에 이식될 수 있다. 대안적으로, 리간드의 일부는 제1 기재(14) 상에 이식되고 나머지는 제2 기재(20) 상에 이식된다.
바람직하게는, 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 직접적으로 이식될 때, 복수의 리간드는 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 공유적으로 이식된다.
더 구체적인 실시형태에 따르면, 복수의 리간드는 간접적으로 이식된다: 복수의 리간드는 중간 구조에 이식되고, 상기 중간 구조는 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 직접적으로 이식된다. 따라서, 이러한 특정 실시형태에 따르면, 복수의 리간드와 기재(14, 20) 사이에 직접적인 결합은 없다.
바람직하게는, 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 간접적으로 이식될 때, 복수의 리간드는 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 비-공유적으로 이식된다.
제1 예에 따르면, 복수의 리간드는 핵산과 컨쥬게이션되고, 이식된 핵산(22)의 적어도 일부에 혼성화에 의해 결합된다.
또 다른 예에 따르면, 복수의 리간드는 제1 기재(14) 또는 제2 기재(20) 상에 미리 코팅된 접착 코팅에 비-공유적으로 이식된다. 접착 코팅으로서, 스트렙타디빈 코팅이 특히 언급될 수 있다.
이러한 실시형태에서, 바람직하게는, 각각의 리간드는 항체, 항체의 단편, 렉틴, 및 압타머로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
리간드는 통상, 미세유체 디바이스(10)의 제1 벽(14) 및 제2 벽(20), 및 팽윤 상태에서 하이드로겔의 폐쇄된 패턴(16)에 의해 형성된 케이지 내에 포획된 세포(들) 또는 세포소기관의 용해에 의해 분비 또는 방출된 하나 이상의 분석물(들)을 결합하도록 선택된다.
상기 미세유체 디바이스는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 제1 기재를 제공하는 단계,
2) 상기 제1 기재의 표면 상에 복수의 폐쇄된 패턴을 이식하는 단계,
3) 제2 기재를 제공하는 단계,
4) 제1 기재의 표면 상에 또는 제2 기재의 표면 상에 복수의 핵산을 이식하는 단계 - 여기서 각각의 핵산은 상기 제1 기재 또는 제2 기재 상의 핵산의 포지션을 인코딩하는 바코드를 포함함 -;
5) 제1 기재 및 제2 기재 사이에 폐쇄된 패턴 및 핵산을 배치하여 제1 기재 및 제2 기재를 포지셔닝하는 단계,
6) 제1 기재와 제2 기재를 결합하는 단계를 포함한다.
폐쇄된 패턴의 이식은 임의의 공지된 프로세스에 따라 수행될 수 있다.
폐쇄된 패턴이 비-팽윤성 재료로 제조될 때, 폐쇄된 패턴의 이식은 전형적으로 소프트-리소그래피 기법에 의해 수행된다.
특정 실시형태에 따르면, 제1 기재 및 폐쇄된 패턴은 하나의 그리고 고유한 단계에서 함께 제조된다.
폐쇄된 패턴이 하이드로겔로 제조될 때, 폐쇄된 패턴의 이식은 전형적으로, 광패턴화에 의해, 바람직하게는 UV(자외선) 하에서 수행된다. 광패턴화 방법은 하이드로겔의 중합체 매트릭스를 제1 기재 상에 표면-이식하는 것과 동시에 하이드로겔의 중합체 매트릭스를 가교결합하는 것으로 이루어진다.
바람직하게는, 중합체는 공유적으로 가교결합된다.
더 바람직하게는, 중합체의 가교결합은, 예를 들어, 다이티오에리트리톨과 같은 다이티올 분자로부터 선택되는 가교결합제의 존재 하에 제조된다.
하이드로겔의 패턴화는 전형적으로, 표준 포토리소그래피 기법 또는 직접 레이저 각인 장비에 의해 수행된다.
이러한 기법은 특히 문헌[Chollet, B., D’Eramo, L., Martwong, E., Li, M., Macron, J., Mai, T.Q., Tabeling, P. and Tran, Y., 2016. Tailoring patterns of surface-attached multiresponsive polymer networks. ACS applied materials & interfaces, 8(37), pp.24870-24879]에 개시되어 있다.
핵산의 이식은 전형적으로 문헌[DeRisi, J. et al. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression. Nat. Genet 14, 457-460 (1996) and in Fodor, S. P. et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science (80-.). 251, 767-773 (1991)]에 각각 상세히 설명된 스폿팅 또는 제자리(in-situ) 광 유도 합성에 의해 수행된다.
유리하게는, 단계 5) 동안, 하이드로겔이 팽윤 상태에 있을 때, 제1 기재 및 제2 기재는 핵산이 케이지 내측에 있게 하는 방식으로 포지셔닝된다.
더 유리하게는, 핵산은 폐쇄된 패턴 내측에서 제1 기재 상에 또는 폐쇄된 패턴의 반대편에서 제2 기재 상에 이식된다.
결합 단계는 임의의 공지된 프로세스에 따라 수행될 수 있다.
제1 실시형태에 따르면, 결합 단계는 산소 플라즈마 처리에 의해 수행된다. 바람직하게는, 산소 플라즈마 처리는 실온에서, 전형적으로 5 내지 50℃, 더 바람직하게는 10 내지 40℃, 심지어 더 바람직하게는 15 내지 30℃ 범위의 온도에서 이루어진다. 바람직하게는, 산소 플라즈마 처리의 지속기간은 10초 내지 2분, 더 바람직하게는 30초 내지 1분 범위이다.
바람직하게는, 이러한 제1 실시형태에 따르면, 본 프로세스는, 단계 6) 전에, 산소 플라즈마에 노출되는 동안 핵산을 보호할 수 있는 마스크를 핵산 상에 침착하는 제조 단계를 추가로 포함한다. 마스크는 전형적으로 접착 테이프로 제조되며, 바람직하게는 접착제로 코팅된 플라스틱 필름, 종이, 천, 폼 또는 포일로부터 선택된 재료로 제조된다. 마스크는, 전형적으로는 박리에 의해, 플라즈마 처리 후에 최종적으로 제거된다.
제2 실시형태에 따르면, 결합 단계는 디바이스의 표면 상에 압력을 인가함으로써 수행된다. 바람직하게는, 이러한 실시형태에 따르면, 디바이스의 표면 상의 압력은 메인 설계를 둘러싸는 외부 미세유체 채널 내로 음압을 인가함으로써 수행된다.
제3 실시형태에 따르면, 결합 단계는 적어도 하나의 중합체 및 선택적으로 적어도 하나의 가교결합제를 포함하는 가교결합성 조성물을 사용함으로써 수행된다. 이러한 제3 실시형태에 따르면, 결합 단계는 하기와 같이 수행된다:
a) 제1 벽과 제2 벽을 함께 가져오는 단계,
b) 제1 벽과 제2 벽 사이의 간극을 충전하기 위해 적어도 하나의 중합체 및 적어도 하나의 가교결합제를 포함하는 조성물의 층을 2개의 벽들 사이에 침착시키는 단계, 및
c) 적어도 하나의 중합체를 가교결합시키는, 바람직하게는 자가-가교결합시키는 단계.
바람직하게는, 중합체는 폴리에폭사이드 중에서 선택된다.
프로세스는 하기를 추가로 포함할 수 있다:
- 단계 1)과 단계 2) 사이에, 제1 기재의 표면을 구조화 및/또는 작용화하는 중간 단계, 및/또는
- 단계 3)과 단계 4) 사이에, 제2 기재의 표면을 구조화 및/또는 작용화하는 중간 단계.
기재가 하이드로겔로 제조될 때, 기재의 작용화는 전형적으로 문헌[Chollet, B. D’eramo, L., Martwong, E., Li, M., Macron, J., Mai, T.Q., Tabeling, P. and Tran, Y., 2016. Tailoring patterns of surface-attached multiresponsive polymer networks. ACS applied materials & interfaces, 8(37), pp.24870-24879]에 기재된 프로토콜을 따름으로써 수행될 수 있다.
구조가 하이드로겔로 제조되지 않은 경우, 작용화는 전형적으로 문헌[Beal, John H L et al. “A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels.” Biomicrofluidics vol. 6,3 36503. 30 Jul. 2012]에 상세히 설명된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
기재가 하이드로겔로 제조될 때, 기재의 구조화는 전형적으로 문헌[Chollet, B. D’eramo, L., Martwong, E., Li, M., Macron, J., Mai, T.Q., Tabeling, P. and Tran, Y., 2016. Tailoring patterns of surface-attached multiresponsive polymer networks. ACS applied materials & interfaces, 8(37), pp.24870-24879]에 기재된 프로토콜을 따름으로써 수행될 수 있다.
기재가 비-팽윤성 재료로 제조될 때, 기재의 구조화는 전형적으로, 표준 리소그래피 프로토콜, 특히 표준 포토리소그래피 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
특정 실시형태에 따르면, 본 프로세스는, 하이드로겔 재료의 침착 전에, 나노입자 층, 바람직하게는 패턴화된 크롬/금 이중층의 기재의 표면 상에서의 침착으로 이루어진 추가 단계를 추가로 포함할 수 있다.
패턴화된 층의 침착은 예를 들어 표준 포토리소그래피에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시형태에 따르면, 본 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 추가로 포함한다:
a) 제1 기재(14)의 표면 상에 그리고/또는 제2 기재(20)의 표면 상에 복수의 리간드를 (직접적으로) 이식하는 단계, 및/또는
b) 제1 기재(14)의 표면 상에 그리고/또는 제2 기재(20)의 표면 상에 복수의 리간드를 (간접적으로) 이식하는 단계.
상기에 정의된 단계 a)는 상기에 정의된 제조 방법의 임의의 시점에 수행될 수 있다. 특히, 단계 a)는 핵산(22)의 이식 전 또는 후에, 폐쇄된 패턴(16)의 이식 전 또는 후에 수행될 수 있다.
제1 실시형태에 따르면, 리간드의 간접 이식은 복수의 리간드를 복수의 이식된 핵산(22)에 혼성화에 의해 결합시키는 단계에 의해 수행되며, 상기 복수의 리간드는 이식된 핵산(22) 중 적어도 일부에 상보성을 갖는 핵산과 컨쥬게이션된다.
이러한 제1 실시형태에 따르면, 단계 b)는 바람직하게는 핵산(22)의 이식 후에 수행된다. 단계 b)는 하이드로겔이 팽윤 상태로 되게 하는 조건이 변경됨으로써 미세유체 디바이스(10)의 제1 벽(14) 및 제2 벽(20), 및 팽윤 상태의 하이드로겔의 폐쇄된 패턴(16)에 의해 형성된 케이지 내에 세포 또는 세포소기관을 포획할 때까지 수행될 수 있다.
제2 실시형태에 따르면, 리간드의 간접 이식은 i) 제1 기재(14) 및/또는 제2 기재(20)의 표면의 적어도 일부 상에 접착 코팅을 코팅하는 것, 및 ii) 리간드를 상기 접착 코팅에 이식하는 것을 포함한다.
단계 i)은 핵산(22)의 이식 전 또는 후에, 폐쇄된 패턴(16)의 이식 전 또는 후에 수행될 수 있다.
단계 ii)는 바람직하게는 접착 코팅의 침착 후에 수행된다. 단계 ii)는 하이드로겔이 팽윤 상태로 되게 하는 조건이 변경됨으로써 미세유체 디바이스(10)의 제1 벽(14) 및 제2 벽(20), 및 팽윤 상태의 하이드로겔의 폐쇄된 패턴(16)에 의해 형성된 케이지 내에 세포 또는 세포소기관을 포획할 때까지 수행될 수 있다.
미세유체 디바이스의 제조 방법은 하기 단계들 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
1) 이식된 핵산에 존재하는, 특히, 이식된 핵산의 전부 또는 일부에 존재하는 불변 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 DNA를 혼성화하는 단계(특히, 불변 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 포함하는 하나 또는 복수의 상이한 DNA가 사용될 수 있음);
2) 중합에 의해 (예를 들어, Maxima, SuperScript RT, Phusion 또는 Q5 중합효소를 사용하여) 혼성화 DNA를 연장시키는 단계;
3) 이식된 핵산, 특히 이식된 DNA를 하나의 또는 또 다른 DNA 서열과 라이게이션시키는 단계; 및/또는
4) 1), 2) 또는 3)에 따른 혼성화, 연장 또는 라이게이션에 의해 가능하게는 이전에 변형되었을 수 있는 이식된 핵산의 전부 또는 일부를, 절단에 의해(예를 들어, 엔도뉴클레아제에 의해 촉매되는 광절단 또는 절단에 의해), 제1 또는 제2 기재의 표면으로부터 방출하는 단계.
일부 실시형태에서, 혼성화 DNA는 이식된 핵산과 함께 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 함유하는 이중 가닥 DNA를 형성한다.
본 프로세스는 또한 세포 또는 세포소기관을 포획할 수 있는 구조를 고정하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
이러한 추가 단계는 전형적으로 표준 포토리소그래피에 의해 실현된다.
본 발명의 미세유체 디바이스는, 단일 세포 또는 세포소기관에 대한, 또는 예를 들어, 상호작용하는 2개 이상의 세포에 대한 광학 이미징으로부터의 표현형 정보 및 -오믹스 정보를 조합할 수 있는 가능성을 갖는, 세포 또는 세포소기관을 시퀀싱하는 방법에 사용될 수 있으며, 이는 동시에 수천 개의 세포에 대해 사용될 수 있다.
세포 또는 세포소기관의 분석을 수행하는 방법은,
a) 본 발명의 개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑하는 방법에 의해 수득 가능하거나 수득되는 바와 같은, 식별 서열(또는 이의 역 상보체)을 포함하는 방출 핵산으로 표지된 세포 또는 세포소기관의 조제물 및 미세유체 디바이스를 제공하는 단계;
b) 선택적으로, 식별 서열(또는 이의 역 상보체)을 포함하는 방출 핵산으로 표지된 세포 또는 세포소기관의 전부 또는 일부를 공통 표지화 핵산 서열 또는 복수의 상이한 표지화 핵산 서열과 회합시키는 단계;
c) 하이드로겔이 수축 상태에 있는 조건 하에서 현탁액 내의 식별 서열을 포함하는 방출 핵산으로 표지된 세포 또는 세포소기관을 미세유체 디바이스에 주입하는 단계;
d) 하이드로겔이 팽윤 상태로 되게 하는 조건을 변경함으로써, 미세유체 디바이스의 제1 벽 및 제2 벽, 및 팽윤 상태의 하이드로겔의 폐쇄된 패턴에 의해 형성된 케이지 내에 세포 또는 세포소기관을 포획하는 단계;
e) 선택적으로, 광학 이미징을 사용하여, 포획된 세포 또는 세포소기관 및/또는 이들이 분비하는 분자를 분석하는 단계;
f) 선택적으로, 미세유체 디바이스의 제1 기재 또는 제2 기재의 표면으로부터 이식된 핵산을 케이지에서 방출하는 단계;
g) 선택적으로, 포획된 세포 또는 세포소기관을 용해시켜, 세포 또는 세포소기관 핵산을 케이지에서 방출하는 단계;
h) 구획 특이적 핵산의 바코드를 방출된 세포 또는 세포소기관 핵산 및/또는 방출 핵산 서열(들)과 회합시켜, 이에 의해 바코딩된 핵산을 형성하는 단계;
i) 하이드로겔이 수축 상태로 되게 하는 조건을 변경하는 단계;
j) f)에서 방출되지 않는 경우, 미세유체 디바이스의 제1 기재 또는 제2 기재로부터 이식된 핵산을 방출하는 단계;
k) 바코딩된 핵산을 회수 및 시퀀싱하는 단계; 및
l) 선택적으로, 바코딩된 시퀀싱 데이터를 e)에서 얻어진 광학 이미징으로부터의 데이터 상으로 맵핑시키는 단계를 포함한다.
본 방법의 실시형태에 따르면, 단계 b) 및 e)가 구현된다. 일부 양태에서, 단계 b)는 단계 e)에서 분석되는 형광 마커로 세포를 표지화하는 단계를 추가로 포함한다.
단계 c)에서, 하이드로겔이 수축 상태에 있는 조건 하에서 현탁액 내의 식별 서열(또는 이의 역 상보체)을 포함하는 방출 핵산으로 표지된 세포 또는 세포소기관을 미세유체 디바이스에 주입하는 단계는 전형적으로 - 작동가능한 하이드로겔의 특성에 따라 - 온도, 압력 또는 pH를 설정하여 하이드로겔이 수축 상태가 되도록 수행된다. 예를 들어, 미세유체 디바이스가 하한 임계 용액 온도(LCST) 온도-반응성 하이드로겔을 포함하는 경우, 미세유체 디바이스의 온도는 하한 임계 용액 온도(LCST) 초과로 상승되어 하이드로겔을 수축시킨다. 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드(PNIPAM)를 포함하거나 이로 이루어진 온도-반응성 하이드로겔의 경우, 하이드로겔은 28℃ 이하에서 완전히 확장되고, 36℃ 이상에서 완전히 수축되며, 이들 온도 사이에서 부분적으로 확장되어, 세포 또는 세포소기관 로딩을 위해 케이지가 37℃에서 완전히 개방되게 한다(문헌[D'Eramo et al., Microsystems & Nanoengineering (2018) 4, 17069]). 예를 들어, 미세유체 디바이스가 상한 임계 용액 온도(UCST) 온도-반응성 하이드로겔을 포함하는 경우, 미세유체 디바이스의 온도는 상한 임계 용액 온도(UCST) 미만으로 감소되어 하이드로겔을 수축시킨다. P(MA-AM-AMA)를 포함하거나 이로 이루어진 온도-반응성 하이드로겔의 경우, 하이드로겔은 10℃ 이하에서 완전히 수축되고, 50℃ 이상에서 완전히 확장되며, 이들 온도 사이에서 부분적으로 확장되어, 세포 또는 세포소기관 로딩을 위해 케이지가 10℃에서 완전히 개방되게 한다. 일 실시형태에 따르면, 단계 d)에서, 단일 세포 또는 단일 세포소기관이 케이지에 포획된다. 또 다른 실시형태에 따르면, 2개의 (또는 그 이상의) 상호작용하는 세포, 예를 들어, 형질세포 및 리포터 세포; 세포독성 T 세포(또는 CAR T 세포) 및 표적 세포(예를 들어, 종양 세포); T 세포 및 항원-제시 세포가 케이지에 포획된다.
하이드로겔이 팽윤 상태로 되게 하기 위해, 온도, 압력 또는 pH가 - 작동가능한 하이드로겔의 특성에 따라 - 변경되어 하이드로겔이 팽윤되어 제2 기재와 접촉하게 한다. 예를 들어, 미세유체 디바이스가 하한 임계 용액 온도(LCST) 온도-반응성 하이드로겔을 포함하는 경우, 미세유체 디바이스의 온도는 하한 임계 용액 온도(LCST) 미만으로 감소되어 하이드로겔을 팽윤시킨다. 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM)를 포함하거나 이로 이루어진 온도-반응성 하이드로겔의 경우, 온도는 전형적으로, 하이드로겔이 완전히 확장되는 28℃ 이하로 설정될 수 있다(문헌[D'Eramo et al., Microsystems & Nanoengineering (2018) 4, 17069]). 예를 들어, 미세유체 디바이스가 상한 임계 용액 온도(UCST) 온도-반응성 하이드로겔을 포함하는 경우, 미세유체 디바이스의 온도는 상한 임계 용액 온도(UCST) 초과로 상승되어 하이드로겔을 확장시킨다. P(MA-AM-AMA)를 포함하거나 이로 이루어진 온도-반응성 하이드로겔의 경우, 하이드로겔은 50℃ 이상에서 완전히 확장된다.
본 방법은, 단계 d)와 단계 h) 사이에, 세포 또는 세포소기관의 주변 조건을 변경하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 주변 조건을 변경하는 단계는, 예를 들어, 염, 세제, 단백질, 및/또는 핵산 서열을 함유하는 수성 상을 미세유체 디바이스에서 순환시키는 단계를 포함한다. 주변 조건을 변경하는 단계는, 케이지가 또한 세포 또는 세포소기관을 포획할 수 있는 구조를 포함하는 경우에 케이지를 완전히 개방하거나, 케이지를 부분적으로 개방함으로써, 폐쇄된 케이지의 하이드로겔을 통과하는 염과 같은 분자를 교환하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 본 방법은, 예를 들어, 단계 e) 후 및 단계 f) 전에, 다음을 추가로 포함하나, 반드시 그럴 필요는 없다:
e1) 포획된 세포 또는 세포소기관에 의해 분비되거나 방출된 분석물 또는 분석물들을 제1 기재(14)의 표면에 그리고/또는 제2 기재(20)의 표면 상에 직접적으로 또는 간접적으로 이식된 리간드에 결합시키는 단계;
e2) 표지된 제2 리간드 또는 표지된 리간드들과의 결합에 의해 이식된 리간드에 결합된 분석물 또는 분석물들을 검출하는 단계 - 표지된 제2 리간드 또는 표지된 리간드들은 결합된 분석물 또는 분석물들에 특이적임 -.
제1 실시형태에 따르면, 단계 e2에서, 검출하는 단계는 형광 표지된 제2 리간드 또는 리간드들로 직접적으로 수행된다.
제2 실시형태에 따르면, 단계 e2에서, 검출하는 단계는 이식된 리간드에 결합된 분석물 또는 분석물들에 대한 리간드 식별 핵산으로 표지된 제2 리간드 또는 리간드들로 간접적으로 수행되며, 여기서 상기 리간드 식별 핵산의 서열은 리간드 및 이식된 리간드에 결합된 분석물 또는 분석물들의 식별을 가능하게 한다.
이러한 제2 실시형태에 따르면, 본 방법은 상기 리간드 식별 핵산의 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증폭은 바람직하게는 선형 증폭으로 이루어지며, 더 바람직하게는 적어도 하나의 중합효소 및 적어도 하나의 제한 또는 닉킹 효소를 사용함으로써 이루어진다.
본 방법의 이러한 제2 실시형태에 따르면, 단계 h)에서, 본 방법은 핵산(22)의 바코드를 리간드 식별 핵산과 결합하여 바코딩된 핵산을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 단계 b)에서 제공된 공통 표지화 DNA 서열 또는 복수의 상이한 표지화 DNA 서열은 세포 또는 세포소기관의 표현형 분류를 위해 DNA-툴박스 반응(또는 동적 DNA 반응 네트워크)에 사용되어, 이식된 핵산의 방출을 단계 f) 또는 j)에서 실행한다. DNA-툴박스 반응의 원리는 예를 들어 국제 특허 출원 WO2017141068호 및 WO2017141067호에 기재되어 있다.
일 실시형태에 따르면, 단계 g)에서, 포획된 세포 또는 세포소기관은 삼투 충격에 의해 용해된다. 이는 미세유체 디바이스에서 저삼투성 또는 고삼투성 수성 상을 순환시킴으로써 당업자에 의해 용이하게 구현될 수 있다. 케이지는 이러한 동작을 위해 폐쇄 상태로 유지될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 단계 h)는, 여전히 미세유체 디바이스의 제1 또는 제2 기재의 표면에 이식될 수 있거나 미세유체 디바이스의 제1 또는 제2 기재의 표면으로부터 방출될 수 있는, 바코드를 포함하는 구획-특이적 핵산을, 방출된 세포 또는 세포소기관 핵산 및/또는 방출 핵산 서열(들)에 대한 상보성에 의해, 혼성화하는 단계를 포함한다. 특히, 바코드를 포함하는 구획-특이적 핵산이 DNA인 경우, 단계 h)[또는 단계 i)와 단계 j) 사이의 방법]는 DNA 중합효소를 사용하여 방출된 세포 또는 세포소기관 핵산(또는 표지화 방출 핵산 서열(들))에 혼성화된 바코드를 포함하는 DNA를 연장하여 바코드를 포함하는 방출된 세포 또는 세포소기관 핵산(또는 표지화 핵산 서열(들))의 상보적 가닥을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은, 예를 들어, mRNA의 폴리(A) 테일에 대한 혼성화를 위한 서열 올리고 d(T) 또는 올리고 d(T)VN의 3'-영역(mRNA 시퀀싱용), 특정 RNA(표적화된 RNA 시퀀싱용) 또는 DNA(표적화된 DNA 시퀀싱용)의 서열에 상보적인 서열의 3' 영역, 무작위 서열, 예를 들어 d(N)6의 3’-영역(RNA 시퀀싱 또는 DNA 시퀀싱용), 역전사효소 주형 전환을 위한 3개의 리보(G) 뉴클레오티드가 있는 3'-영역(RNA 시퀀싱용), 또는 예를 들어 Tn5 트랜스포사제에 의해 촉매되는 "태그먼트화(tagmentation)" 후에 재조합에 의해 도입된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 3'-영역을 포함할 수 있다. 후자는, 예를 들어, 게놈 DNA 시퀀싱을 위해, 또는 DNA 메틸화(Methyl-seq 또는 바이설파이트 시퀀싱을 사용) 또는 염색질 구조(시퀀싱과 함께 트랜스포사제 접근가능 염색질 사용, ATAC-Seq)의 후성유전체학 분석을 위해, 또는 세포 또는 세포소기관에 의해 방출된 RNA 상에 제1 가닥 cDNA 합성 후 형성된 RNA-DNA 이중체 또는 제1 및 제2 가닥 cDNA 합성 후 형성된 이중 가닥 DNA의 태그먼트화 후 RNA 시퀀싱을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 따르면, 바코드를 포함하는 구획-특이적 핵산은 DNA이고, 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥일 수 있으며, 단계 h)는 세포 또는 세포소기관에 의해 방출된 DNA에 바코드를 포함하는 DNA를 라이게이션시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 바코드는, 예를 들어, 제한 분해 후(게놈 DNA 시퀀싱 또는 DNA 메틸화의 분석용), 또는 마이크로코칼 뉴클레아제를 사용한 분해 후(MNase-seq 또는 ChIP-seq를 사용한 메타게놈 분석용) 게놈 DNA에 라이게이션될 수 있다.
또 다른 실시형태에 따르면, 바코드를 포함하는 구획-특이적 핵산은 DNA이고, 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥일 수 있으며, 단계 h)는 세포 또는 세포소기관에 의해 방출된 DNA와 바코드를 포함하는 DNA를 재조합하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 바코드는 게놈 DNA 시퀀싱을 위해, 또는 DNA 메틸화(Methyl-seq 또는 바이설파이트 시퀀싱을 사용) 또는 염색질 구조(시퀀싱과 함께 트랜스포사제 접근가능 염색질 사용, ATAC-Seq)의 후성유전체학 분석을 위해 게놈 DNA와 재조합될 수 있다. 대안적으로, 바코드를 포함하는 핵산은 세포 또는 세포소기관에 의해 방출된 RNA 상에 제1 가닥 cDNA 합성 후에 형성된 RNA-DNA 이중체와 재조합되거나, 또는 세포 또는 세포소기관에 의해 방출된 RNA 상에 제1 및 제2 가닥 cDNA 합성 후에 형성된 이중 가닥 DNA와 재조합된다(RNA 시퀀싱용). 바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 Tn5 트랜스포자제에 의해 촉매되는 DNA와 재조합되는 모자이크 말단(Mosaic End(ME)) 서열을 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 본 방법은, 단계 d)와 단계 h) 사이에, 케이지 내에서 세포 또는 세포소기관 물질(예를 들어, 표면 분자, 분비된 분자, 또는 용해 생성물)의 존재 시, 예를 들어 근접 라이게이션 검정, 또는 근접 연장 검정에 의해, 바코드를 포함하는 구획-특이적 핵산을 방출하는 단계를 추가로 포함한다.
개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑 및 시퀀싱하기 위한 키트
본 발명은 추가로 위에 정의된 바와 같은 개별 세포 또는 세포소기관 및 구획을 표지화하기 위한 키트의 구성성분을 포함하는 위의 맵핑 및 시퀀싱하는 방법을 구현하기 위한 키트에 관한 것이다.
키트는 다음을 포함한다:
a) 방출체 핵산(각각의 방출체 핵산은 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함함);
b) 수용체 핵산(각각의 수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함함);
c) 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드;
d) 선택적으로 닉킹 엔도뉴클레아제 및 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소.
일부 실시형태에서, 방출체 핵산의 세트는 방출체 핵산의 그룹(들)의 형태로 제공되며, 여기서 그룹의 모든 방출체 핵산은 동일한 식별 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 키트는 엔도뉴클레아제를 추가로 포함한다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예를 고려하여 추가로 예시될 것이다.
도면
도 1: 염색되지 않은 조직(음성 대조군), 조직 해리 전에 염색된 조직(사전-해리 염색) 및 조직 해리 후에 염색된 조직(사후-해리 염색)의 유세포 분석법 형광 측정. 하단 도면은 항체 항-인간 CD98 및 렉틴 PHA를 포함하는 편재적인 그리고 형광 세포 표면 마커를 이용한 표지화에 상응한다. 상단 도면은 스트렙타비딘(ASO: 항체 스트렙타비딘 올리고뉴클레오티드)을 통해 컨쥬게이션된 형광 및 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 운반하는 편재적인 세포 표면 마커를 이용한 표지화에 상응한다. 염색된 형광 세포 및 비-염색된 세포 간에서 분리가 관찰되며, 이는 해리에 대한 염색의 저항성을 나타낸다.
도 2: 용액에 존재하는 효소 및 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하여, 예를 들어, 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소 및 닉킹 엔도뉴클레아제의 작용 하에서 바코딩된 핵산의 국소 증폭을 수행할 수 있다. A는 증폭 서열이고, B는 식별 서열이며, C는 포획 서열이다. A 및 B는 추후 단일-세포 분석 및 라이브러리 준비를 위해 필요하다. N은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 5'에 함유하는 프라이밍 서열이다. 은 각각 A, B, C, N의 상보적 핵산이다. 4개의 상이한 실시형태를 나타내며, 여기서 방출체 핵산이라 불리는 올리고뉴클레오티드는 세포-표면 마커에 특이적인 항체("r")를 통해 세포 표면 상에 포획되지만, 세포 막에 결합하는 다른 리간드도 항체 대신에 사용될 수 있다.
1. 방출체라고 불리는 항체-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드(항체 "e")의 3' 부분은 중합을 위해 직접 자가-프라이밍된다. 중합 후에, 닉킹 엔도뉴클레아제는 방출체 올리고뉴클레오티드에 상보적인 가닥을 대체하면서 가닥-대체 중합효소가 다시 프라이밍 및 중합되도록 하는 닉을 생성할 수 있다. 방출된 핵산은 확산되고, 이용 가능하고 상보적인 항체-컨쥬게이션된 수용체 올리고뉴클레오티드("r")에 혼성화될 수 있다.
2. 방출체라고 불리는 항체-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드(항체 "e")의 3' 부분은 닉킹 및 중합을 위해 유리 올리고뉴클레오티드(N )에 의해 프라이밍된다. 닉킹 엔도뉴클레아제는 방출체 올리고뉴클레오티드의 상보적 핵산을 방출하면서 가닥-대체 중합효소가 다시 프라이밍 및 중합되도록 하는 닉을 생성할 수 있다. 방출된 핵산은 확산되고, 이용 가능하고 상보적인 항체-컨쥬게이션된 수용체 올리고뉴클레오티드("r")에 혼성화될 수 있다. 중합 후에, 닉킹 엔도뉴클레아제는 새로운 방출체 올리고뉴클레오티드를 방출하면서 가닥-대체 중합효소가 다시 프라이밍 및 중합되도록 하는 닉을 생성할 수 있다.
3. 방출체라고 불리는 항체-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드(항체 "e")의 3' 부분은 중합을 위해 직접 자가-프라이밍된다. 중합 후에, 닉킹 엔도뉴클레아제는 방출체 올리고뉴클레오티드의 상보적 가닥을 방출하면서 가닥-대체 중합효소가 다시 프라이밍 및 중합되도록 하는 닉을 생성할 수 있다. 방출된 핵산은 부분적으로 상보적인 유리 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여, 새로운 중합 및 증폭 사이클을 가능하게 할 수 있다. 방출된 핵산은 확산되고, 유리 항체-컨쥬게이션된 수용체 올리고뉴클레오티드("r")에 혼성화될 수 있다.
4. 방출체라고 불리는 항체-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드(항체 "e")의 3' 부분은 닉킹 및 중합을 위해 직접 자가-프라이밍된다. 닉킹 엔도뉴클레아제는 방출체 올리고뉴클레오티드의 상보적 가닥을 방출하면서 가닥-대체 중합효소가 다시 프라이밍 및 중합되도록 하는 닉을 생성할 수 있다. N'은 N과 동일한 서열에 상응하며, 여기서 인식 부위로부터의 적어도 하나의 티민이 우라실로 대체되어 닉킹 엔도뉴클레아제에 의해 인식되고 닉킹되는 것을 회피한다. 중합 후에도, N'에 상보적인 가닥은 이 될 것이다. 방출된 핵산은 헤어핀 구조를 형성하고 제2 중합 및 닉킹 사이클을 가능하게 함으로써 직접 자가-혼성화될 수 있다. 각각의 헤어핀 구조는 원치 않은 접힘을 회피하기 위해 상이한 핵산 서열로 구성된다. 제2 중합 및 닉킹 사이클로부터의 방출된 핵산은 확산되고, 유리 항체-컨쥬게이션된 수용체 올리고뉴클레오티드("r")에 혼성화할 수 있다.
도 3: a. 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 0.1 pM 및 0 pM의 방출체로부터 시작하는 이중 가닥 DNA 생산의 측정. 반응 혼합물을 표 2에 따라 제조한다. 37℃에서 90 분의 인큐베이션 및 형광 측정은 분당 2 회의 사이클로 써모사이클러(CFX384 Touch, Biorad)를 사용하여 수행하였다. b. 도 2.1에 제시된 올리고뉴클레오티드의 등온 생산에 사용된 증폭 전략. A는 증폭 서열이고, B는 식별 서열이며, C는 포획 서열이다. A 및 B는 추후 단일-세포 분석 및 라이브러리 준비를 위해 필요하다. N은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위이다. Q는 흑색 구로서 표현된, 소광제와 혼성화하기 위한 서열이다. S는 사각형으로서 표현된, 비오틴을 멀리 이동시키기 위한 스페이서이다. 및 는 각각 A, B, C, N 및 Q의 상보적 핵산이다. 단계 1에서, 자가-프라이밍된 방출체(SEQ ID NO:2)는 단계 2에서 표현된 핵산을 방출한다. 단계 3에서, 방출된 핵산은 형광 리포터("QAS", SEQ ID NO:4)에 혼성화된다. 리포터는 소광제를 운반하는 서열(“”, SEQ ID NO:5)에 부분적으로 혼성화되며, 이는 형광의 관찰을 방지한다. 단계 4에서, 리포터 상에서의 방출된 핵산의 중합에 의해 소광제를 운반하는 서열이 방출되어, 형광 신호의 출현을 유발한다. c. 증폭 산물 및 표준물질의 전기영동. 라인당 5 μl, 4% 아가로스 겔(Thermo Scientific R2802). 1x TAE(Dutscher 348605)에서 120 V로 30 분 동안 이동. 래더 라인당 3 μl의 FastRuler 저범위 DNA 래더(Thermo Scientific SM1233). 농도 표준물질을 증폭 산물에 대해 기재된 바와 동일한 조건에서, 이중 가닥 ABC 올리고뉴클레오티드의 1 μΜ로부터 10 nM까지의 연속 희석으로 제조하였다.
도 4 내지 5: HUVEC 및 HEPG2 세포의 48-웰 플레이트에서의 공동-배양물. 각각의 썸네일은 동일한 관찰 필드를 나타내지만, 상이한 관찰 채널 및 2개의 상이한 시간: T0 및 T1(T0 이후 40 분)을 나타낸다. A. 두 세포주의 공동-배양을 보여주는 명시야 이미지. B. HUVEC 세포에 특이적인 항-인간 CD146 항체 표지화를 보여주는 Al647 형광 채널(1 초 노출). C. HEPG2 세포에 특이적인 항-인간 CD326 항체 표지화를 보여주는 BV421 형광 채널(1 초 노출). 방출체 서열(SEQ ID NO:2)을 항-인간 CD326 항체와도 컨쥬게이션시킨다. D. 리포터 신호를 나타내는 ATTO488 형광 채널(1 초 노출)은 항-인간 CD146 항체와 컨쥬게이션되어, 이에 따라 HUVEC 세포의 표면에 존재한다. T0에서, 공동-배양물을 37℃에서 표 3에 상세히 설명된 반응 혼합물과 함께 인큐베이션하여, HEPG2 세포에 의해 운반된 자가-프라이밍된 방출체(SEQ ID NO:2)가 부분적으로 무작위 핵산을 방출하게 한다. HUVEC 세포의 표면에 존재하는 형광 리포터(SEQ ID NO:9)는 소광제를 운반하는 서열(SEQ ID NO:5)에 부분적으로 혼성화되어, T0에서의 형광의 관찰을 방지한다. 확산 및 증폭 후, 방출된 핵산을 형광 리포터(SEQ ID NO:9)에 혼성화하였다. T1에서, 리포터 상에서 방출된 핵산의 중합에 의해 소광제를 운반하는 서열이 방출되어, 형광 신호의 출현을 유발한다. 백색 화살표는 Al647 형광 채널에 의해 나타낸 바와 같이 HUVEC 세포를 가리킨다. T0에서는, ATTO488 채널에 신호가 없으며, 이는 해당 세포 상의 모든 형광 리포터(SEQ ID NO:9)가 소광제를 운반하는 서열(ID4)과 부분적으로 혼성화되어 있음을 나타낸다. T1에서는, ATTO488 채널에, 해당 세포 상의 Al647 채널에서의 염색과 공동국소화된 신호가 존재하며, 이는 소광제를 운반하는 서열(SEQ ID NO:3)이 자가-프라이밍된 방출체(SEQ ID NO:2)로부터의 핵산의 방출, 증폭 및 확산의 결과로서 대체되었음을 나타낸다.
도 6: 본 발명에 따라 사용 가능한 미세유체 디바이스의 폐쇄된 패턴의 개략도. 미세유체 디바이스(10)는 테이블의 형태로 배열된 복수의 폐쇄된 패턴(16)을 포함한다. 제시된 폐쇄된 패턴(16)은 정사각형의 형태이지만, 동등하게 직사각형, 원형 또는 심지어 육각형의 형태일 수 있다. 폐쇄된 패턴(16)은 두께(e) 및 높이(h)를 갖는다.
도 7: 패턴이 작동가능한 하이드로겔로 제조된 미세유체 디바이스의 개략도. 미세유체 디바이스(10)는, 제1 기재(14)를 포함하고 제1 기재 상에 복수의 폐쇄된 패턴(16)이 이식되어 있는, 제1 벽(12)을 포함한다. 제1 벽(12)을 향하는 제2 벽(18)은 제2 기재(20)를 포함한다. 복수의 핵산(22)은 제2 기재(20) 상에 이식된다. 폐쇄된 패턴(16)은 폐쇄된 패턴(16)과 제2 기재(20)가 접촉하게 되는 팽윤 상태와 수축 상태 사이에서 팽윤성인 작동가능한 하이드로겔로 제조된다. 미세유체 디바이스(10)는 반응물의 디바이스(10) 내로의 도입 및 제거를 각각 허용하는 유입구(24) 및 유출구(26)를 추가로 포함한다.
도식 A에서, 폐쇄된 패턴(16)은 수축 상태에 있다. 폐쇄된 패턴(14)과 제2 기재(20) 사이의 간극(28)은 디바이스(10) 내측에 존재하는 유체 및 세포가 디바이스 내측에서 자유롭게 순환할 수 있게 한다.
특정 물리-화학 조건에 놓이면, 폐쇄된 패턴(16)은 물을 흡수하기 시작하고 팽윤된다. 따라서, 폐쇄된 패턴(16)은 제2 기재(20)와 접촉할 때까지 신장된다.
도식 B에서, 폐쇄된 패턴(16)은 제2 기재(20)와 접촉하는 팽윤 상태에 있다. 따라서, 디바이스(10)는 복수의 케이지(30)를 포함하고, 각각의 케이지(30)는 폐쇄된 패턴(16) 중 하나로 이루어진 측벽에 의해 그리고 제1(14) 및 제2 기재(20)의 일부로 구성된 말단 벽에 의해 한정된다.
도 8: 제2 기재가 작동가능한 하이드로겔로 제조된 미세유체 디바이스의 개략도. 미세유체 디바이스(10)는, 제1 기재(14)를 포함하고 제1 기재 상에 복수의 폐쇄된 패턴(16)이 이식되어 있는, 제1 벽(12)을 포함한다. 제1 벽(12)을 향하는 제2 벽(18)은 제2 기재(20)를 포함한다. 복수의 핵산(22)은 제1 기재(14) 상에 이식된다. 제2 기재(20)는 폐쇄된 패턴(16)과 제2 기재(20)가 접촉하게 되는 팽윤 상태와 수축 상태 사이에서 팽윤성인 작동가능한 하이드로겔로 제조된다. 미세유체 디바이스(10)는 반응물의 디바이스(10) 내로의 도입 및 제거를 각각 허용하는 유입구(24) 및 유출구(26)를 추가로 포함한다.
도식 A에서, 제2 기재(20)는 수축 상태에 있다. 폐쇄된 패턴(14)과 제2 기재(20) 사이의 간극(28)은 디바이스(10) 내측에 존재하는 유체 및 세포가 디바이스 내측에서 자유롭게 순환할 수 있게 한다.
특정 물리-화학 조건에 놓이면, 제2 기재(20)는 물을 흡수하기 시작하고 팽윤된다. 따라서, 제2 기재(20)의 두께는 폐쇄된 패턴(16)과 접촉할 때까지 증가한다.
도식 B에서, 제2 기재(20)는 폐쇄된 패턴(16)과 접촉하는 팽윤 상태에 있다. 따라서, 디바이스(10)는 복수의 케이지(30)를 포함하고, 각각의 케이지(30)는 폐쇄된 패턴(16) 중 하나로 이루어진 측벽에 의해 그리고 제1(14) 및 제2 기재(20)의 일부로 구성된 말단 벽에 의해 한정된다.
실시예
실시예 1: 해리 동안 세포와 커플링된 DNA 커플링이 보존됨
생물학적 샘플의 코호트에 적용 가능한 개념의 증명을 달성하기 위해, 본 발명자들은, 본 발명자들이 항체, 렉틴 또는 콜레스테롤-태그를 리간드로서 사용하여, 세포 유형과 독립적으로 해리 동안 조직 절편으로부터 세포와 DNA 핵산의 커플링을 보존할 수 있음을 입증하였다.
세포 배양
Jurkat 인간 T 림프구 ATCC® TIB-152 및 Ramos 인간 B 림프구 ATCC® CRL-1923을 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(Gibco 10082147) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco 15140122)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco 61870044)에서 배양하였다. 세포를 ATCC 권장사항에 따라 37℃에서, 5% CO2로 25 cm2 또는 75 cm2 배양 플라스크에 접종하였다. 75 내지 80% 합류도에 도달 시, 세포를 희석하였다. 세포 배양물로부터 회수한 후, 세포를 최종적으로 2.106개의 세포.mL-1의 농도로 TBS 1x에 재현탁시켰다.
항체 및 렉틴 컨쥬게이션
스트렙타비딘 컨쥬게이션 키트 프로토콜(ab102921)을 사용하여 정제된 항체(Biolegend) 및 렉틴(Eurobio Scientific)을 스트렙타비딘과 맨 먼저 컨쥬게이션시켰다. 이어서, 1x 트리스 완충 식염수(TBS, VWR CAYM600232-500)에서 컨쥬게이션된 마커를 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드와 1:12 비율로 혼합하고, 20 내지 25℃의 제어된 온도를 갖는 실내에서 12 시간에 초과 동안 (밤새) 빛으로부터 보호하여 보관하였다. IDTE 완충제(pH 8.0)에서 표준 탈염되고 100 μΜ 농도의, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 구입하였다. 비오티닐화된 형광 올리고뉴클레오티드의 서열은 /56-FAM/CACAGGGTGATCAGGT/3Bio/(SEQ ID NO:1)이다. 56-FAM은 올리고의 5' 말단에 부착된 플루오레세인 형광 염료를 의미하고, 3Bio는 올리고의 3' 말단에 부착된 비오틴을 의미한다.
조직 해리
약 2 g의 신선한 결장 샘플을 약 mm2의 조각으로 절단하였다. 염색을 진행하기 전에, 조직의 조각을 10 ml의 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS, Gibco 10010023)에서 3 회 세척한 후, 400 μg/ml의 DSS(Sigma D8906) 및 5 mM EDTA(Sigma 03690)를 포함하는 세포 염색 완충제(Biolegend 420201)에서 3 회 세척하였다. 조직을 500 μl의 세포 염색 완충제(Biolegend 420201) 내의 형광단 또는 형광 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이션된 항체 또는 렉틴 1 내지 10 μg으로 4℃에서 30 분 동안 염색하였다. 이어서, 조각을 10 ml의 1x 포스페이트 완충 식염수에서 세척한 후, gentleMACS Octo 해리체 및 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec 130-095-929)를 사용하여 해리를 진행하였다. 해리 후에 세포를 40 μm에서 여과하고, 10 ml의 트리스 완충 식염수(TBS, VWR CAYM600232-500)로 세척하고, 1 ml의 TBS에 재현탁시켰다. 선택적으로, 세포를 DAPI로 염색하여 살아있는 세포 및 사멸 세포를 구별하였다.
세포 염색
200,000개의 세포를 400 μg/ml의 DSS(Sigma D8906) 및 5 mM EDTA(Sigma 03690)를 포함하는 100 μL의 세포 염색 완충제(Biolegend 420201)에 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 암흑에서 10 분 동안 5 μL의 Fc 수용체 차단 용액(Biolegend 422301)으로 인큐베이션한 후, 형광단 또는 형광 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이션된 0.2 내지 2 μg의 항체 또는 렉틴 또는 콜레스테롤 변형된 올리고뉴클레오티드의 균등한 수량을 첨가하였다. 세포를 4℃에서 암흑에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, 사전에 기재된 세포 염색 완충제 혼합물에서 2 회, 그리고 트리스 완충 식염수(TBS, VWR CAYM600232-500)에서 2 회 헹구었다. 각각의 세척에 대해, 세포를 130 rcf 및 4℃에서 5 분 동안 원심분리하고, 50 μl를 제외하고 상청액을 제거한 후, 200 μl의 세정 완충제를 첨가하였다. 마지막 세척 후, 세포를 200 μl TBS에 재현탁시켰다.
세포 염색을 통상적으로 조직 해리 후에 수행하지만, 조직에서의 이들의 초기 포지션에 따라 세포를 표지하기 위해, 염색은 해리 이전에 행해질 필요가 있다.
본 발명자들은 투과화의 필요성 없이 조직의 모든 세포를 표지하기 위해 범용 외부 세포 마커를 선택하였다.
본 발명자들은 유세포 분석법(Guava easyCyte 12HT)을 사용하여 Jurkat 및 Ramos 세포주에서 마커의 비특이성 및 염색 후 마커 교환의 부재를 처음으로 입증하였다. 범용 세포 마커를, 비오틴 변형 대신에 올리고의 3' 말단에서 항-인간 CD98(BioLegend 315603, 315602), 항-인간 CD298(BioLegend 341709) 또는 항-인간 β2-마이크로글로불린(BioLegend 316317, 316302), 렉틴 자칼린, 렉틴 LCA, 렉틴 PHA-E 및 콜레스테롤 변형(HPLC 정제를 사용하는 IDT에서의 3CholTeg) 중에서 선정하였다.
본 발명자들은 마커 중 하나로 각각의 집단을 염색한 후, 염색된 각각의 집단의 일부를 함께 30 분 동안 혼합하고, 유세포 분석법을 통해 이들을 분석하였다. 본 발명자들은 표지화의 유형에 관계없이 혼합 후 각각의 집단을 여전히 구별할 수 있었던 것으로 보이며, 이는 염색 후 교차-오염의 부재를 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 콜레스테롤 변형을 갖는 올리고를 사용하는 경우, 분리는 항체 또는 렉틴보다 덜 중요하지만, 여전히 존재한다,
또한, 본 발명자들은 항체 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드가, 형광 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이션된 마커로 염색된 집단 및 비-형광 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이션된 마커로 염색된 집단을 혼합함으로써 비오틴 스트렙타비딘 연결을 통해 이들의 올리고뉴클레오티드를 교환하지 않음을 입증하였다(데이터는 나타내지 않음).
마지막으로, 본 발명자들은 조직 해리에 대한 선택된 세포 마커의 저항을 입증하였다. 매번, 본 발명자들은 염색되지 않은 조직을 해리 전후의 염색된 조직과 비교하였고, 본 발명자들은 유세포 분석법(Guava easyCyte 12HT)에 의해 염색의 존재를 평가하였다.
항체 또는 렉틴을 이용하고, 형광단 또는 형광 올리고뉴클레오티드와의 컨쥬게이션을 사용하여, 조직 해리 동안 표지화를 부분적으로 유지하였다(도 1). 사전- 및 사후-해리 조건 간의 염색의 차이를, 조직 블록의 내부 부분을 완전히 염색하는 것에 대한 마커의 불능에 의해 설명할 수 있다.
동시에, 본 발명자들은, 본 발명자들이 Cite-seq 방법 문헌[(Stoeckius et al., Nat Methods. 2017 Sep; 14(9): 865-868)] 과 유사한 방법을 이용하여 동일한 세포와 회합된 전사체 및 표지화 핵산 정보 둘 모두를회수할 수 있음을확인하였다.
실시예 2: 방출체 핵산의 등온 증폭
또한, 본 발명자들은 조직에 사용될 유사한 정도의 크기의 시약 및 핵산을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 천 배 초과의 증폭을 얻기 위한 목표를 가지고 몇몇 등온 증폭을 시험하였다. 이러한 증폭을 위한 절차의 실시예는 도 2에 설명되어 있다.
올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드를 인 실리코(in silico)로 설계하고, RNA구조 및 PrimerBlast를 사용하여 원치 않은 헤어핀, 동종이량체 또는 이종이량체 구조를 제한하도록 검사하였다. IDTE 완충제(pH 8.0)에서 표준 탈염되고 100 μΜ 농도로, 올리고뉴클레오티드를 IDT로부터 구입하였다. /iBiodT/ 변형은 내부 비오틴을 의미하고, /56-FAM/ 변형은 5' 플루오레세인을 의미하고, /3Bio/ 변형은 3' 비오틴을 의미하고, /3IABkFQ/ 변형은 531 nm에서 피크 흡광도를 갖는 420 내지 620 nm 범위의 흡광도 스펙트럼을 가지는 3' 소광제를 의미하며, /5ATTO488N/ 변형은 5' ATTO 488 형광단을 의미한다.
[표 1]
반응 혼합물 조립체
모든 반응을, 30 초마다 SYBR 형광의 측정을 사용하여 써모사이클러(CFX384 Touch, Biorad)에서 37℃에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 표 2에 따라 제조하였다.
[표 2]
이러한 조건에서, 본 발명자들은 방출체 올리고뉴클레오티드가, 0.1 pM까지 낮아진 농도로부터 시작하여 100만 개 초과의 서열을 생산할 수 있음을 발견하였다(도 3).
증폭의 일관성을, 아가로스 겔 전기영동으로부터의 DNA 추출 후 프라이머(SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8)를 사용하여 생어 시퀀싱 (Eurofins으로부터의 LightRun)에 의해 확인하였다(도 3c에 나타낸 것과 유사함).
본 발명자들은 다른 중합효소(bst, bsu, phi29), 닉킹 엔도뉴클레아제(Nt.AlwI, Nb.BtsI) 및 상이한 완충제(NEB Cutsmart)의 사용도 시험하였다. 본 발명자들은 동일한 증폭 전략에 기반하여 그리고 상이한 증폭 전략도 이용하여 다른 올리고뉴클레오티드 설계도 설계 및 시험하였다(도 2에 기재된 바와 같음). 결과는 이러한 실시형태도 올바르게 수행될 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 살아있는 세포의 2D 층에 기반한 방출체 핵산의 등온 증폭 및 수용체 핵산에 대한 포획.
이어서, 본 발명자들은 살아있는 세포의 2D 층 상에 직접 무작위 바코드를 생성 및 포획하는 능력을 입증하였다.
세포 배양
HEPG2(ATCC HB-8065)를 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(Gibco 10082147) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco 15140122)을 갖는 DMEM(41965039)에서 배양하였다. 세포를 ATCC 권장사항에 따라 37℃에서, 5% CO2로 25 cm2 또는 75 cm2 배양 플라스크에 접종하였다. 75 내지 80% 합류도에 도달 시, 세포를 계대배양하였다.
HUVEC(Lonza C2519A) 세포를 내피 세포 성장 배지(Promocel C-22010) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco 15140122)에서 배양하였다. 세포를 Lonza 권장사항에 따라 37℃에서, 5% CO2로 12.5 cm2 또는 25 cm2 배양 플라스크에 접종하였다. 매 48시간마다, 배지의 절반을 교체하고, 75 내지 80% 합류도에 도달 시, 세포를 계대배양하였다.
이어서, HUVEC를 전술한 배지로부터 250 μl의 배지에서 48-웰 플레이트에서 계대배양하였다. 48 시간 후, 배지의 절반을 교체하고, 웰당 25 cm2 배양물의 0.3%를 HEPG2에 첨가하였다. 48 내지 72시간 후, 공동-배양물은 염색될 준비가 되었다.
항체 컨쥬게이션
정제된 항-인간 CD146(Biolegend 361002) 및 정제된 항-인간 CD326(Biolegend 324202)을 스트렙타비딘 컨쥬게이션 키트(Abcam 102921)를 사용하여 스트렙타비딘과 컨쥬게이션시킨다. 이어서, 1x 트리스 완충 식염수(TBS, VWR CAYM600232-500)에서 컨쥬게이션된 항체를 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드와 1:12 비율로 혼합하고, 20 내지 25℃의 제어된 온도를 갖는 실내에서 12 시간에 초과 동안 (밤새) 빛으로부터 보호하여 보관하였다. 정제된 항-인간 CD146을 SED ID NO: 8로 이루어진 서열과 컨쥬게이션시키고, 정제된 항-인간 CD146을 SEQ ID NO: 1로 이루어진 서열과 컨쥬게이션시켰다.
SEQ ID NO:9는 사전 실시예로부터의 SEQ ID NO:4와 유사하지만, 올리고의 5' 말단에서의 플루오레세인 변형이 광표백에 덜 민감한 변형인 ATTO 488 형광단으로 교체되고, 비오틴 변형과 A로 칭하는 PCR 프라이머 사이의 스페이서 서열이 제거되었다(본 방법에 필요하지 않으며, 데이터가 표시되지 않음).
세포 염색
48-웰 플레이트의 웰 내의 세포를 1 ml의 세포 염색 완충제(Biolegend 420201)로 세척하였다. 총 200 μl의 세포 염색 완충제 내의 20 μl의 각각의 항체 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드(0.1 μg/μl의 항체), 1 μl의 Alexa Fluor 647(Al647) 항-인간 CD146 항체(Biolegend 361013) 및 2 μl의 Brilliant Violet 421(BV421) 항-인간 CD326(Biolegend 324219)의 혼합물을 세포에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 암흑에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 항체 혼합물을 제거하고, 1 ml의 세포 염색 완충제를 첨가한다.
항-인간 CD146 항체는 HUVEC 세포를 포함하는 내피 세포에 특이적인 반면, 항-인간 CD326 항체는 HEPG2 세포를 포함하는 상피 세포에 특이적이다. 이는 HUVEC 세포가 Al647 형광단 및 리포터 서열(SEQ ID NO:9)로 염색되는 반면, HEPG2 세포는 BV421 형광단 및 방출체 서열(SEQ ID NO:2)로 염색됨을 의미한다.
반응 혼합물 조립체
반응 혼합물을 표 3에 따라 제조하였고, 세포 염색 완충제를 제거한 후 각각의 웰에 첨가하였다.
[표 3]
플레이트를 덮고, 10x 대물렌즈(MRD70170) 및 필터 휠(TI2-P-FWB-E), 사중대역(quadriband) 이색성 및 방출 필터(Semrock, FF409/493/573/632-Di03-25x36 및 FF01-432/515/595/730-25), 형광 공급원(Lumencor SPECTRA X) 및 세포 위치에서 37℃의 온도에 도달하도록 40℃로 설정된 가열 스테이지(Tokai Hit TP-TIZH26)가 장착된 역위 니콘 Ti-2 현미경 하에서 인큐베이션하였다.
2 시간의 인큐베이션 동안, 5개의 스티칭된 이미지당 5개의 이미지를 각각의 웰, 명시야, BV421, ATTO 488 및 Al647 채널에서 10 분마다 촬영한다.
따라서, HUVEC 세포는 Al647 채널에서 관찰되고 HEPG2는 BV421 채널에서 관찰되는 반면, 리포터 신호는 ATTO488 채널에서 관찰된다.
HUVEC 세포의 표면에 존재하는 형광 리포터(SEQ ID NO:9)는 소광제를 운반하는 서열(SEQ ID NO:5)에 부분적으로 혼성화되어, 형광의 관찰을 방지한다. HEPG2 세포에 의해 운반된 자가-프라이밍된 방출체(SEQ ID NO:2)는 핵산을 방출한다. 확산 및 증폭 후, 방출된 핵산을 형광 리포터(SEQ ID NO:9)에 혼성화하였다. 이어서, 리포터 상에서 방출된 핵산의 중합에 의해 소광제를 운반하는 서열이 방출되어, 형광 신호의 출현을 유발한다.
본 발명자들은 인큐베이션의 시작 40 분 후 에 ATTO488에서, Al647 채널에서의 HUVEC 염색과 공동국소화된 신호의 출현을 관찰하였다(도 5).
실시예 4: 신선한 조직 염색 및 해리
정제된 항-인간 β2-마이크로글로불린 항체(Biolegend 316302)를 스트렙타비딘 컨쥬게이션 키트(Abcam 102921)를 사용하여 스트렙타비딘과 컨쥬게이션시켰다. 이어서, 1x 트리스 완충 식염수(TBS, VWR CAYM600232-500)에서 컨쥬게이션된 항체를 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드와 1:12 비율로 혼합하고, 20 내지 25℃의 제어된 온도를 갖는 실내에서 12 시간 초과 동안(밤새) 빛으로부터 보호하여 보관하였다. 스트렙타비딘과의 컨쥬게이션 후, 항-인간 β2-마이크로글로불린 항체를 SEQ ID NO:1과 하나의 튜브에서 혼합하고, SEQ ID NO:10과 또 다른 튜브에서 혼합한다.
조직 슬라이드를 세포 염색 완충제(Biolegend 420201)에서 세척한 후, 4℃에서 15 내지 20 분 동안, 0.5 μg/ml의 SEQ ID NO:1 및 5 μg/ml의 SEQ ID NO:10과 컨쥬게이션된 항-인간 β2-마이크로글로불린 항체의 세포 염색 완충제에서 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 세포 염색 완충제로 세척하였다.
반응 혼합물을 표 4에 따라 제조하였고, 세포 염색 완충제를 제거한 후 조직 슬라이드에 첨가하였다. 최종 농도에 관련되면서 조직의 표면을 덮도록 부피를 조정할 수 있다.
[표 4]
조직 슬라이드를 증발을 회피하기 위해 밀폐된 환경에 두고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 방출체 핵산의 증폭 및 포획에 대한 전략은 도 2.1에 상세히 설명되어 있다.
HBSS(Thermo 14175053) + 5% FBS(Thermo 16140071)에서 세척한 후, 생검을 가능한 작게(약 1 mm) 자른다.
이어서, 샘플을 200 μL의 20 mg/mL 콜라게나제 I(최종: 2 mg/mL, Sigma C0130), 5 μL의 10 mg/mL Dnase I(최종: 25 μg/mL, Sigma 11284932001), 80 μL의 50 mg/mL 히알루로니다제(최종: 2 mg/mL, Sigma H3506)를 갖는 튜브로 옮긴다. 최종 부피를 HBSS를 이용하여 2 mL로 조정한다. 규칙적인 상하 피펫팅으로 37℃에서 50 분간 부드럽게 교반한 후, 소화된 샘플을 세포 스트레이너(100 μm)로 여과하고, 1% HS(Thermo 26050088) 및 2 mM EDTA(Thermo 15575020)를 갖는 TBS 1X(Thermo 14190169)를 사용하여 세척하였다. 세포를 TBS 1X에 재현탁시킨다.
실시예 5: 미세-케이지에서 공간적으로 분해된 scRNA-seq
열-작동 가능한 케이지의 사용을 통해 공간적으로 분해된 scRNA-seq를 얻기 위해, 단일-세포 단리, 바코딩 및 시퀀싱을, 본 발명의 실시예 4로부터 재현탁된 세포를 사용하여 칩에서 수행하였다.
전체적인 방법은 다음과 같다.
열-작동가능한 하이드로겔의 합성
엔(ene)-작용화된 폴리(n-이소프로필 아크릴아미드)를 문헌[D’Eramo L.; et al., Microsystems & Nanoengineering, 2018, 4, 17069, doi:10.1038]의 보충 정보에 설명된 단계에 따라 합성한다.
획득된 중합체의 팽윤 특성을, 온도의 함수로서, 다양한 수용액: 순수한 물, 인산 염 완충제에서, pH 2 및 pH 9에서, 평가하였다. 결과는 도 7에 제공되어 있다.
제1 기재의 제조
폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조된 제1 기재를 미세구조 및 챔버를 포함하는 표준 소프트 리소그래피 기법에 의해 제조하였다. 구조 및 챔버의 높이는 목적에 따라 좌우되며, 0.2 미크론에서 최대 100 미크론일 수 있다.
제1 기재의 작용화
PDMS 기재를 이소프로판올로 세정한 후 50초 동안 산소 플라즈마에 노출시킨다. 표면 활성화 직후, 3 부피%의 메르캅토프로필트라이메톡시실란(ABCR Gelest)을 갖는 무수 톨루엔의 용액을 질소 하의 반응기 내측에서 3시간 동안 기재와 접촉시킨다. 표면의 티올-변형 후, 기재를 톨루엔으로 헹구고, 최종적으로 질소 유동으로 건조시킨다.
제1 기재 상으로의 하이드로겔 필름의 광-패턴화
예비형성된 작용화된 pNIPAM(엔-반응성임)을 다이티올 가교결합제로 티올-변형시키고 미세-구조화된 PDMS 기재 상에 스핀 코팅하였다. 3 내지 15 중량% 농도의 작용화된 pNIPAM 및 3 내지 10 중량% 농도의 다이티오에리트리톨(Sigma Aldrich로부터구입, CAS 번호 3483-12-3) 가교결합제를 함유하는 부탄올 및 메탄올 용액(V/V = 1/1)의 한 쌍의 100μL의 마이크로부피를 기재 상에 침착하였다. 스핀-코팅의 조건을 30초의 스피닝 시간 동안 500 rpm 내지 3000 rpm에서 변하는 각속도로 고정하였다. 확산 필름을 90℃ 오븐에서 5분 동안 열로 건조시켰다. 생성된 층 두께는 몇 십분의 1 미크론 내지 15 미크론으로 다양하다.
수많은 미세-구조화된 케이지를 제공하는 크롬 마스크를 챔버의 설계와 정렬시키고, 심자외선(deep UV) 노출(8 와트, 250 nm 파장)을 위해 UV 램프 하에 배치하였다. 노출 후, 기재를 초순수 배스에서 5분 동안 세척하여 유리 중합체 사슬을 헹궜다. 하이드로겔-패턴화된 기재를 질소 유동으로 건조시켰다.
제2 기재의 제조
사용된 제2 기재는 DNA 가닥으로 스폿팅된 유리 슬라이드이다(Agilent로부터 구입, Agilent Microarray Format으로 지칭됨).
상이한 DNA 가닥이 위에 이식되어 있는 최대 100만 개의 고유한 스폿을 제시하는 이러한 아이템은 각각의 스폿에 상이한 바코드를 제공한다. 각각은 스폿은 수백만 개의 DNA 가닥을 포함하며, 각각의 스폿은 상이한 바코드를 가지고 있다.
위치결정 시스템을 어레이의 설계에 통합하였다. 다수의 고유한 스폿 중 일부는 (둘 이상의) 혼성화에 의해 형광-표지된 DNA 올리고뉴클레오티드의 포획을 위한 특이적 서열을 지닌다. 이들은 삼각형, 정사각형 및 원을 포함하는 다수의 형상을 형성하도록 배치된다.
디바이스의 폐쇄
제1 기재와 제2 기재 사이의 결합을 50초 동안 O2 플라즈마 처리를 사용함으로써 달성하였다. 산소 플라즈마가 활성화되는 것을 피하는 관심 구역 상에 보호 층을 탭핑하였다. 노출의 종료 후, PDMS 기재를 관심 영역이 하이드로겔 구조를 향하도록 DNA 어레이의 상단에 배치하였다. 칩을 70℃ 오븐 내측에 보관하여, 적어도 30분 동안 경화 단계를 적용하였다.
특이적 포획을 위한 칩의 제조: 총 scRNA-seq
올리고뉴클레오티드는 표준 탈염되고 IDTE 완충제, pH 8.0에서 25 내지 100 μM 농도로, 인실리코(in silico)에서 설계되고 IDT로부터 구입하였다.
100 mM 아세트산칼륨, 30 mM HEPES, pH 7.5 및 10 μM의 올리고뉴클레오티드 Q, R 및 S의 용액을, 안착된 DNA 가닥 상에 포획의 추가 서열을 혼성화하고 국소화 단계를 진행하기 위해, 40℃(케이지 개방)에서 미세유체 챔버 내측으로 주입하였다. 유동을 정지시키고, 혼합된 올리고뉴클레오티드를 갖는 칩을 2분 동안 60℃ 초과로 가열한 다음, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 40℃에서 1x SSC 용액(Thermo Scientific #15413549)으로 헹구었다.
올리고뉴클레오티드 Q, R 및 S는 다음의 서열이다:
메인 챔버의 명시야 및 형광 이미징(650 nm에서의 여기 및 670 nm에서의 방출)을 수행하였다. DNA 어레이 스폿 및 케이지의 정보적 식별을 수행하였다. 식별은 두 이미지 모두의 중첩에 기초한다. 명시야 이미지는 케이지를 식별하는 것을 가능하게 한다. 형광 이미지는 형광 DNA 프로브가 사전에 혼성화된 소정 스폿을 식별하는 것을 가능하게 한다. 이러한 원의 상대적 포지션은 칩 상의 고유한 위치를 정의하여, 중첩된 이미지 상으로 DNA 어레이의 원래의 구조(organization)를 맵핑하는 것을 가능하게 한다. 마지막으로, 이러한 식별로 인해, 스폿 특이적 바코드를 각각의 케이지와 회합시킬 수 있다.
프라이머 합성.
1 mM ATP(NEB #P0756S)가 보충된 Thermopol 1x(NEB #B9004S)에 Sulfolobus DNA 중합효소 IV(NEB #M0327S) 및 Hi-T4 리가아제(NEB #M2622S)를 함유하는 혼합물을 40℃에서 주입한 다음, 챔버 내측에서 50℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 바코딩된 프라이머를 중합하고 라이게이션하였다. 이어서, 내부 부피를 40℃에서 1 x SSC 용액으로 헹군다(Thermo Scientific #15413549).
단일 세포의 포획
TBS 내의 1% BSA를 갖는 ml당 1000만개의 농도의 세포의 현탁액을 제조하였다. 세포를 100 μl/h로 칩 내측에 주입하고; 케이지를 개방하기 위해 칩을 37℃에서 가열하였다. 일단 세포가 케이지 주위와 위로 순환하고 있으면, 유동을 정지시키고, 온도를 20℃까지 감소시켜 케이지를 폐쇄하였다. 세포를 케이지 내측에 포획하였다.
용해를 수행하기 위해, 팽윤된 하이드로겔 케이지에 의해 차단되지 않은 추가 유입구를 통해 PBS 내의 0.2% SDS(Sigma 71736)의 용액을 챔버 내측에 주입하였다.
세포의 RNA 가닥을 케이지 주위의 수성 상이 PBS로 변경됨에 따라 포획의 이식된 서열에 후속적으로 혼성화하였다.
10분의 유동 정지 후, 케이지를 개방하고(온도를 37℃로 증가) 챔버 내측에 PBS를 유동시킴으로써 세정 단계를 수행하였다.
바코딩된 cDNA 합성
37℃에서 케이지를 개방하고 챔버의 내부 부피의 20배에 해당하는 부피의 RT 완충제(Thermo Scientific #EP0742)를 챔버를 통해 3분 동안 유동시킴으로써 세정 단계를 수행하였다.
세정 후, 10U/μl의 역전사효소(Thermo Scientific #EP0742), 0.5 mM dNTP(NEB #N0447S) 및 1U/μl의 RNase 억제제(Thermo Scientific #11581505)를 1x RT 완충제에 포함하는 혼합물을 챔버 내측에 주입한 다음, 유동을 고정시키고 50℃에서 2시간 동안 포획된 가닥의 역전사가 뒤따랐다. 효소를 1x SSC 용액으로 즉시 플러싱하어 역전사를 정지시켰다.
1 x 엑소뉴클레아제 I 반응 완충제(NEB #M0293S)에 2U/μl의 엑소뉴클레아제 I을 함유하는 제2 혼합물을 주입하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 효소를 1x SSC 용액으로 즉시 플러싱하어 반응을 정지시켰다.
DNase/RNase-무함유 증류수(Invitrogen #10977023)를 챔버에 주입하고, 최대 98℃까지 가열하여 합성된 cDNA를 탈혼성화하였다. 이어서, 부가적인 물을 유동시켜 내부 부피를 수집하였다.
10 μL의 NEB2 완충제(NEB #M0212L) 및 10 μL의 10 μM의 올리고뉴클레오티드 T를 65 uL의 회수된 샘플에 첨가하였다.
용액을 95℃에서 2분 동안 인큐베이션하고 즉시 얼음으로 옮겼다. 이어서, 8 μL의 10 nM dNTP 및 7 μL의 Klenow exo-(NEB #M0212L)를 첨가하였다.
혼합물을 4℃에서 사전 냉각된 유전자증폭기에 넣고, 온도를 37℃까지 천천히 램핑하고, 30분 동안 유지하여 제2 가닥의 합성을 수행하였다.
이어서, 제조사의 설명서에 따라 SPRIselect 자기 비드(Beckman #B23317)를 사용하여 cDNA를 정제하였다.
이어서, 프라이머 U 및 V 및 Q5 고충실도 DNA 중합효소(NEB #M0491)를 사용하여 정제된 샘플에 대해 30초의 신장을 갖는 2-단계 PCR 증폭을 15 사이클 동안 수행하였다.
올리고뉴클레오티드 U 및 V는 다음의 서열이다:
PCR 생성물을 SPRIselect 자기 비드(Beckman #B23317)를 사용하여 정제하고, illumina 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱하기 전에 정량화한다.
시퀀싱 데이터의 역다중화는 각각의 판독에 대해 인덱스1 판독물의 포지션 1 내지 15로부터의 바코드, 판독물1 판독물의 포지션 1 내지 12로부터의 UMI 및 판독물2 판독물의 포지션 1로부터 시작하는 RNA 전사체를 검색하여 수행된다.
올리고뉴클레오티드 Q 중 10%를 유사한 올리고뉴클레오티드로 대체하지만, 폴리T 테일 대신 3' 말단에 방출체 핵산의 포획 서열(SEQ ID NO:3)을 운반함으로써, 열-작동 가능한 케이지에서의 세포 용해 후, 지금까지 세포 표면 상에 존재하는 방출체 핵산을 케이지-특이적 프라이머와 혼성화시키고, DNA 합성 후 mRNA와 마찬가지로 케이지 바코드와 회합시켰다.
SEQ ID NO:11에 의해 표현된 방출체 핵산의 증폭 서열을 cDNA의 3' 말단에 포함하는 V인 U에 대한 보충 프라이머를 사용하여 cDNA 용액의 하위부분으로 증폭을 수행하였다.
시퀀싱 후, 세포의 방출체 핵산의 식별 서열을, 케이지 바코드 덕분에 동일한 세포의 mRNA 전사체에 연결할 수 있다. 동일한 식별 서열의 존재 및 이들의 상대적인 양을 사용하여, 세포 이웃을 재건하였다.
실시예 6: Drop-seq 플랫폼 상에서 공간적으로 분해된 scRNA-seq
공간적으로 분해된 scRNA-서열을 얻기 위해, Drop-seq를 (문헌[Macosko, E.Z. et al. Cell 161, 1202-1214 (2015)])에 기재된 바와 같이 실시예 4로부터의 재현탁된 세포를 사용하는 변형을 이용하여 수행하였다. 하이드로겔 비드 상의 올리고뉴클레오티드 중 10%는 이들의 3' 말단에서 폴리T 테일을 대체하는 방출체 핵산의 포획 서열(SEQ ID NO:3)을 운반하고 있다. 따라서, 방출체 핵산은 mRNA와 동일한 액적 바코드와 회합된다.
cDNA를 문헌[Stoeckius, M et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods 14, 865-868 (2017)]에 기재된 바와 같은 변형을 이용하여 분리 및 증폭시킨다. 바코딩된 방출체 핵산을, 이들의 3' 말단에 SEQ ID NO:11에 의해 표현된 방출체 핵산의 증폭 서열을 포함하는 보충 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 시퀀싱 후, 세포의 방출체 핵산의 식별 서열을, 케이지 바코드 덕분에 동일한 세포의 mRNA 전사체에 연결할 수 있다. 동일한 식별 서열의 존재 및 이들의 상대적인 양을 사용하여, 세포 이웃을 재건하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 식별 핵산 서열로 표지화하는 방법으로서,
    a) 핵산의 제1 세트("방출체 핵산")를 제공하는 단계(각각의 핵산 분자는 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함함);
    b) 제2 세트의 핵산("수용체 핵산")을 제공하는 단계(각각의 수용체 핵산은 공유적으로 또는 비-공유적으로 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 커플링되고, 상기 수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함함);
    c) 용액 내의 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 세트를 생물학적 샘플과 접촉시켜, 상기 생물학적 샘플 내의 개별 세포 또는 세포소기관을 적어도 상기 수용체 핵산으로 표지화하는 단계;
    d) 상기 증폭 서열, 상기 식별 서열, 및 상기 포획 서열 또는 이의 역 상보체를 포함하는 상기 방출체 핵산의 영역의 카피인 다중 핵산 분자("방출 핵산")를 방출하고, 상기 방출 핵산을 수용체 핵산에 혼성화하는 단계;
    e) 상기 생물학적 샘플을 해리하고 개별화된 세포 또는 세포소기관을 회수하는 단계(상기 개별화된 세포 또는 세포소기관의 적어도 하위-집단은 상기 방출 핵산으로 표지됨)를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 방출체 핵산은 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드에 결합되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 c)에서, 상기 생물학적 샘플은 방출체 핵산 및 수용체 핵산의 세트와 접촉한 후에 헹궈지는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 방출체 핵산은 추가적으로 닉킹 부위에 상보적인 서열을 포함하고, 단계 c)에서 방출 핵산의 생산은 닉킹 및 중합에 의한 등온 증폭에 의해 수행되며, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 가닥 변위 활성을 갖는 중합효소에 의해 촉매되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항에 있어서, 방출체 핵산의 세트는 방출체 핵산의 그룹의 형태로 제공되고, 그룹의 모든 방출체 핵산은 동일한 식별 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 방출체 핵산의 그룹은 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 롤링-서클(rolling-circle) 복제에 의해 생성된 방출체 핵산의 콘카티머(각각의 콘카티머는 동일한 방출체 핵산을 포함함); 또는
    (b) 동일한 식별 서열을 포함하는 방출체 핵산을 운반하는 비드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 단계 d)에서, 그룹의 방출체 핵산은 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어 상기 방출 핵산의 다중 카피를 방출하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체 핵산은 제한 부위 또는 절단 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표적 또는 세포소기관 표적은 상기 생물학적 샘플 내의 모든 또는 대부분의 세포 또는 상기 세포의 임의의 세포소기관의 표면 또는 내측에 편재적으로 존재하는 표적인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 이미지는 단계 d) 전에 또는 단계 e) 전에 현미경에 의해 촬영되는, 방법.
  11. 생물학적 샘플의 개별 세포 또는 세포소기관을 맵핑 및 시퀀싱하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 바와 같은 (i) 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함하는 핵산, 또는 (ii) 이의 역 상보체로 표지된 개별화된 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 핵산 또는 이의 역 상보체로 표지된 상기 개별화된 세포 또는 세포소기관을 구획에 포획하는 단계(상기 구획은 구획-특이적 핵산, 및 핵산 표지화 및 추가 시퀀싱을 위한, 다음의 서열 중 적어도 하나를 포함함: 혼성화 부위, 라이게이션 부위 또는 재조합 부위);
    c) 선택적으로, 광학적 검출을 사용하여, 포획된 세포, 세포소기관 및/또는 이들이 분비하는 분자를 분석하는 단계;
    d) 포획된 세포, 또는 세포 및 세포소기관을 용해하고, 이에 의해 구획 내의 상기 세포 또는 세포소기관으로부터 핵산을 방출하는 단계;
    e) i) 구획-특이적 서열을 ii) 상기 구획 내의 세포 또는 세포소기관으로부터 방출된 상기 핵산 및 iii) 상기 증폭 서열, 상기 식별 서열, 및 상기 포획 서열, 또는 이의 역 상보체를 포함하는 상기 핵산과 회합시키는 단계;
    f) 단계 e)에서 생산된 상기 핵산을 상기 구획으로부터 회수하고, 회수된 핵산을 시퀀싱하는 단계; 및
    g) 동일한 구획-특이적 서열을 포함하는 핵산을, 동일한 단일 세포로부터 기원한 것으로서 정의하고, 단계 e)에서 생산된 상기 핵산에 함유된 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열에 기반하여 상기 생물학적 샘플에서 원래의 단일 세포의 포지션을 맵핑하여, 이에 의해 생물학적 샘플의 개별 세포의 맵핑 및 시퀀싱 정보를 조합하는 단계;
    h) 단계 e)에서 생산된 핵산에 함유된 동일한 식별 서열(들) 또는 이의 역 상보적 서열의 상대적 비율을 결정하여 삼각 측량의 원리로 세포 간의 거리를 추정함으로써 수행된, 생물학적 샘플에서 원래의 단일 세포의 포지션을 맵핑하는 단계; 및
    i) 선택적으로, 해리 전에 촬영된 생물학적 샘플의 현미경으로부터의 이미지에 시퀀싱 정보를 다시 맵핑하는 단계를 포함하는, 맵핑 및 시퀀싱하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 구획은 액적, 하이드로겔 매트릭스, 공압 밸브에 의해 분리된 미세제작된 챔버, 미세제작된 웰, 작동 가능한 하이드로겔 케이지 또는 미세플레이트 웰인, 맵핑 및 시퀀싱하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 구획에 포함된 상기 구획-특이적 핵산은 DNA인, 맵핑 및 시퀀싱하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)는 다음 중 어느 하나를 포함하는, 맵핑 및 시퀀싱하는 방법:
    i) 상기 세포 또는 세포소기관으로부터의 방출된 핵산에 대한 상보성에 의해 상기 구획-특이적 핵산을 혼성화하는 단계;
    ii) 상기 세포 또는 세포소기관으로부터의 방출된 핵산에 대한 상보성에 의해 상기 구획-특이적 핵산을 혼성화하고, DNA 중합효소를 사용하여 상기 방출된 핵산에 혼성화된 상기 구획-특이적 핵산을 연장하여, 회합된 구획-특이적 서열을 갖는 상기 방출된 핵산의 상보적 가닥을 생성하는 단계;
    iii) 상기 세포 또는 세포소기관으로부터의 RNA의 역전사에 의해 생산된 cDNA의 3'-말단에 대한 상보성에 의해 상기 구획-특이적 핵산을 혼성화하고, DNA 중합효소를 사용하여 상기 구획-특이적 핵산에 혼성화된 상기 cDNA를 연장하여, 회합된 구획-특이적 서열을 갖는 상기 구획-특이적 핵산의 상보적 가닥을 생성하는 단계;
    iv) 상기 구획-특이적 핵산을 상기 구획에 존재하는 DNA에 라이게이션시키는 단계; 또는
    v) 상기 구획-특이적 핵산을 상기 구획에 존재하는 DNA와 재조합하는 단계.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 상기 구획-특이적 핵산은, 상기 증폭 서열, 상기 식별 서열, 및 상기 포획 서열을 포함하는 상기 핵산, 또는 이의 역 상보적 핵산에 존재하는 상기 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 프라이머 서열을 포함하고;
    - 단계 e)는, 상기 증폭 서열, 상기 식별 서열, 및 상기 포획 서열을 포함하는 상기 핵산 또는 이의 역 상보적 핵산에 존재하는 상기 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상기 구획-특이적 핵산을 혼성화하고, DNA 중합효소를 사용하여 하나 또는 둘 모두의 혼성화된 DNA 가닥을 연장하여, 상기 식별 서열 또는 이의 역 상보체, 및 상기 구획-특이적 서열 또는 이의 상보체 둘 모두를 포함하는 DNA 분자를 생성하는 단계를 추가적으로 포함하거나, 대안적으로, 상기 혼성화 및 연장 단계 대신에, 단계 e)는 상기 핵산에 존재하는 상기 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상기 구획-특이적 핵산을 라이게이션시키거나, 상기 핵산에 존재하는 상기 증폭 또는 포획 서열의 전부 또는 일부에 상기 구획-특이적 핵산을 재조합하는 단계를 추가적으로 포함하는, 맵핑 및 시퀀싱하는 방법.
  16. 다음을 포함하는 키트:
    a) 방출체 핵산(각각의 방출체 핵산은 증폭 서열, 식별 서열, 및 포획 서열을 포함함);
    b) 수용체 핵산(각각의 수용체 핵산은 i) 방출체 핵산의 세트의 증폭 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 증폭 서열, 또는 이의 상보체, 또는 ii) 방출체 핵산의 세트의 포획 서열의 전부 또는 일부와 매칭하는 포획 서열, 또는 이의 상보체를 포함함);
    c) 세포 표적 또는 세포소기관 표적의 리간드;
    d) 선택적으로 닉킹 엔도뉴클레아제 및 가닥 대체 활성을 갖는 중합효소.
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