KR20250036743A - 재조합 aav 입자를 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에는 재조합 AAV 입자를 생성하는 포유류 세포를 용해하는 방법이 보고되어 있으며, 이 방법은 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제, 바람직하게는 Triton CG 110과 접촉시켜, 재조합 AAV 입자를 생성하는 포유류 세포를 용해하는 단계 및 생성된 재조합 AAV 입자를 방출하는 단계를 포함하며, 이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생성하는 포유류 세포와 상기 재조합 AAV 입자를 생성하는 포유류 세포의 배양에 사용된 배양 배지(소진 배지)를 포함한다.

Description

재조합 AAV 입자를 생산하는 방법
본 발명은 유전자 치료 분야에 속한다. 보다 정확하게 본 명세서는 재조합 AAV 입자를 생산하는 세포로부터 재조합 AAV 입자를 방출하는 방법에 대해 보고하며, 여기서 세포는 Triton CG 110을 사용하여 용해된다.
배경기술
유전자 치료법은 살아있는 세포의 유전자 발현을 수정하여 생물학적 특성을 변경하기 위해 유전 물질을 치료적으로 투여하는 것을 광범위하게 지칭한다. 수십 년간의 연구 끝에 유전자 치료법이 시장에 출시되었으며 앞으로 점점 더 중요해질 것으로 예상된다. 일반적으로 유전자 치료법은 생체내 접근 방식과 생체외 접근 방식으로 나눌 수 있다.
오늘날, 대부분의 생체내 치료법은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터를 통한 DNA 전달에 의존한다. AAV는 병원성이 없는 작은 자연 발생 파보바이러스로, 이는 외피가 없는 이십면체 캡시드로 구성되어 있다. 이는 약 4.7kb 크기의 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 포함하고 있다. 야생형 AAV 벡터의 게놈은 역전된 말단 반복부(ITR)가 연접되어 있는 rep과 cap이라는 두 개의 유전자를 보유한다. 바이러스 복제와 패키징에 시스 형태의 ITR이 필요하다. rep 유전자는 4가지 다른 단백질을 인코딩하는데, 그 발현은 두 가지 대체 프로모터인 P5와 P19에 의해 구동된다. 또한 선택적 스플라이싱을 통해 추가적인 다양한 형태가 생성된다. Rep 단백질은 DNA 결합, 엔도뉴클레아제, 헬리케이스 활성 등 다양한 기능을 가지고 있다. 그들은 유전자 조절, 부위별 통합, 절제, 복제 및 패키징에 소정의 역할을 한다. 캡 유전자는 3개의 캡시드 단백질과 1개의 조립 활성화 단백질을 코딩한다. 이들 단백질의 차등적 발현은 선택적 스플라이싱과 대체 시작 코돈 사용에 의해 달성되며, rep 유전자의 코딩 영역에 위치한 단일 프로모터인 P40에 의해 구동된다.
조작된 치료용 rAAV 벡터에서, 바이러스 유전자는 트랜스진 발현 카세트로 대체되는데, 이 카세트에는 바이러스 ITR이 연접되어 있지만 선택 프로모터의 제어 하에 관심 유전자를 인코딩한다. 야생형 바이러스와는 달리, 조작된 rAAV 벡터는 숙주 게놈에 부위 특이적으로 통합되지 않고, 대신 형질도입된 세포의 핵에 주로 에피솜 형태로 남아 있다.
AAV 자체는 복제 능력이 없고, 헬퍼 유전자의 기능을 필요로 한다. 헬퍼 유전자는 자연에서 예를 들어, 아데노바이러스나 단순 헤르페스 바이러스와 같은 공동감염된 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다. 예를 들어, 5가지 아데노바이러스 유전자, 즉, E1A, E1B, E2A, E4 및 VA가 AAV 복제에 필수적인 것으로 알려져 있다. 단백질을 코딩하는 다른 헬퍼 유전자와 달리, VA는 작은 RNA 유전자이다.
rAAV 벡터를 생산하기 위해, ITR이 연접하고 있는 트랜스진을 보유하는 DNA를 패키징 숙주 세포주에 도입하는데, 이러한 숙주 세포주는 rep 및 cap 유전자는 물론 필요한 헬퍼 유전자도 포함한다. 이들 세 그룹의 DNA 요소를 세포에 도입하는 많은 방법과 이를 다양한 DNA 플라스미드에 결합하는 방법들이 있다(예를 들어, Robert, MA, 외, Biotechnol. J. 12 (2017) 1600193 참고).
널리 사용되는 2가지 일반적인 생산 방법이 있다. 삼중 형질감염법에서, 필요한 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 보유하는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 rep/cap을 포함하는 플라스미드와 rAAV-트랜스진을 포함하는 플라스미드에 일시적으로 공동 형질감염시킨다. 이 과정은 CHO 또는 HEK 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, rep/cap 및 바이러스 헬퍼 유전자를 하나의 큰 플라스미드에 결합시킬 수도 있다(이중 형질감염 방법). 두 번째 방법은 곤충 세포(Sf9)를 두 개의 배큘로바이러스로 감염시키는 것을 포함하는데, 하나는 rAAV 게놈을 보유하고 다른 하나는 rep과 cap을 보유한다. 이 시스템에서, 헬퍼 기능은 배큘로바이러스 플라스미드 자체에 의해 제공된다. 같은 방식으로, 단순 헤르페스 바이러스는 HEK293 세포나 BHK 세포와 조합하여 사용된다. 최근 Mietzsch 외, (Hum. Gene Ther. 25 (2014) 212-222; Hum. Gene Ther. Methods 28 (2017) 15-22)은 rep와 cap이 게놈에 안정적으로 통합된 Sf9 세포를 조작했다. 이러한 세포의 경우, rAAV 트랜스진을 보유한 단일 배큘로바이러스만으로도 rAAV 벡터를 생산하기에 충분하다. Clark 외, (Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341)은 rep/cap 유전자와 rAAV 트랜스진이 게놈에 통합된 HeLa 세포주를 생성했다. 야생형 아데노바이러스로 세포를 형질감염하면 rAAV 벡터 생산이 유도되고 rAAV 벡터와 아데노바이러스의 혼합 스톡이 생산된다.
Arvind Srivastava 외의 문헌은 AAV 바이러스 벡터의 제조 과제와 합리적인 제형 개발에 대해 보고했다(J. Pharm Sci. 110 (2021) 2609-2624).
Mafalda Moleirinho 등은 세포 용해의 대안으로 폴리소르베이트 20을 사용한 임상 등급 종양 용해 아데노바이러스 정제에 대해 보고했다(Curr. Gene Ther. 18 (2018) 1-9).WO 2022/003565는 생물 치료제를 정제하기 위한 세제 및 방법에 대해 보고했다.
발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 재조합 AAV 입자의 회수, 즉, 회수율(캡시드 기반 수율 및 게놈 기반 수율 모두)이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
본 발명은 또한 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득된 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
AAV 친화성 크로마토그래피 단계 전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해시키기 위해 알킬 폴리글루코사이드 세제를 사용함으로써, 채워진 재조합 AAV 입자의 (캡시드 기반 및 게놈 기반) 수율 및 빈 재조합 AAV 입자에 대한 비율을 모두 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
선행기술은 채워진 입자의 수율 및 빈 재조합 AAV 입자에 대한 비율을 높이는 방법을 제공하는 문제를 해결하는 것은 말할 것도 없고, AAV 생산 세포의 용해에 알킬 폴리글루코사이드(APG)를 사용하는 것을 제시하지 못한다.
이에 따라, 본 발명은 다음의 실시형태를 포함한다:
1. 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포를 용해하는 방법으로서:
- 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포를 용해시키며,
이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포 및 상기 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포의 배양에 사용되는 배양 배지(소모 배지)를 포함하는, 방법.
2. 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포로부터 재조합 AAV 입자를 방출하는 방법으로서:
- 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포를 용해시키며,
이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포 및 상기 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포의 배양에 사용되는 배양 배지(소모 배지)를 포함하는, 방법.
3. 재조합 AAV 입자를 정제하는 방법으로서:
- 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계,
- 혼합물로부터 세포 파편을 제거하는 단계, 및
- AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 AAV 입자를 정제하는 단계를 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하며,
이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포 및 상기 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포의 배양에 사용되는 배양 배지(소모 배지)를 포함하는, 방법.
4. 재조합 AAV 입자를 정제하는 방법으로서:
- 각각의 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 상기 생산 포유류 세포로부터 재조합 AAV 입자를 방출하는 단계, 및
- AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 AAV 입자를 정제하는 단계를 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하며,
이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포 및 상기 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포의 배양에 사용되는 배양 배지(소모 배지)를 포함하는, 방법.
5. 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는 방법으로서, 이 방법은:
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계;
(ii) 관심 단백질을 인코딩하거나 AAV ITR들 사이에 삽입되는 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii) 하나 이상의 포유류 세포를 상기 제공된 플라스미드와 접촉시키고, 그리고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여, 핵산을 세포로 도입하는 단계;
(iv) 형질감염된 세포를 배양하는 단계;
(v) 배양된 세포와 배양 배지를 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
(vi) 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계; 및
(vii) 선택적으로 AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양액 용해물로부터 재조합 AAV 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
이에 따라 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는, 방법.
6. 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는 방법으로서, 이 방법은:
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계;
(ii) 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii)
(a) 하나 이상의 포유류 세포를 상기 제공된 (i)의 플라스미드와 접촉시키고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여 상기 핵산을 세포로 도입함으로써 안정적으로 형질감염된 세포를 생성하고; 안정적으로 형질감염된 제1 세포를 선택하고; 선택된, 안정적으로 형질감염된 제1 세포를 상기 제공된 (ii)의 플라스미드와 접촉시키고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여 상기 핵산을 세포로 도입하는 단계; 또는
(b) 상기 제공된 (i) 및 (ii)의 플라스미드와 하나 이상의 포유류 세포를 접촉시키고, 그리고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여, 상기 핵산을 세포로 도입하는 단계;
이에 따라 형질감염 세포를 생성하는 단계;
(iv) (iii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계;
(v) 배양된 세포 및 배양 배지를 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
(vi) 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계; 및
(vii) 선택적으로 AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포유류 세포 배양액 용해물로부터 재조합 AAV 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
이에 따라 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는, 방법.
7. 재조합 AAV 입자를 정제하는 방법으로서:
a) 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포와 rAAV 입자를 포함하는 세포 배양 상층액을 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
b) 선택적으로 (a) 단계에서 생산된 수확물을 농축시켜 농축된 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
c) 단계 (a)에서 생산된 포유류 세포 배양액 또는 단계 (b)에서 생산된 농축된 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 상기 배양액에 포함된 포유류 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계;
d) 단계 (c)에서 생산된 용해물을 용해물 내에서 오염 핵산이 감소하도록 처리하여 핵산 감소된 용해물을 생산하는 단계;
e) 선택적으로 단계 (d)에서 생산된 핵산 감소된 용해물을 여과하여 정제 용해물을 생산하고, 선택적으로 정제된 용해물을 희석하여 희석된 정제 용해물을 생산하는 단계;
f) 단계 (d)에서 수득된 핵산 감소된 용해물, 또는 단계 (e)에서 생산된 정제 용해물 또는 희석된 정제 용해물을 AAV 친화성 컬럼 크로마토그래피 처리하여 재조합 AAV 입자를 포함하는 컬럼 용출액을 생산하고, 이에 따라 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 상기 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 컬럼 용출액을 생산하는 단계를 포함하고;
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하는, 방법.
8. 실시형태 7에 있어서:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 농축된 컬럼 용출액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(SEC) 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제2 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 선택적으로 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계; 및
i) 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 여과하거나, 단계 (h)에서 생산된 제3 컬럼 용출액 또는 농축된 제3 컬럼 용출액을 여과하는 단계를 추가로 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하는, 방법.
9. 실시형태 7에 있어서:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 상기 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 단계 (g)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계를 추가로 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하는, 방법.
10. 실시형태 7에 있어서:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제2 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 단계 (g)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계를 추가로 포함하고,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하는, 방법.
11. 추후 AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득되는 재조합 AAV 입자의 수율을 증가시키기 위한, 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포를 용해시키는 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도.
12. 추후 AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득되는 (용출액 분획 내) 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율을 증가시키기 위한, 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포를 용해시키는 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도.
13. 재조합 AAV 입자의 수율을 증가시키기 위한, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도로서, 이때 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포는 알킬 글루코사이드 세제로 용해되고, 재조합 AAV 입자는 추후 AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득되는, 용도.
14. 재조합 AAV 입자의 수율을 증가시키기 위한, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도로서, 이때 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포는 알킬 글루코사이드 세제로 용해되고, 수율은 추후 AAV 친화성 크로마토그래피 단계 후 결정되는, 용도.
15. 추후 AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득되는 (용출액 분획 내) 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율을 증가시키기 위한, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도로서, 이때 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포는 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 알킬 폴리글루코사이드 세제로 용해되는, 용도.
16. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 58.0-62.0(w/v)% D-글루코피라노스, 올리고머, 데실 옥틸 글리코사이드 및 38.0-42.0(w/v)% 물의 혼합물인, 방법 및 용도.
17. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 CAS 번호가 68515-73-1인, 방법 및 용도.
18. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 미정제(crude) 포유류 세포 배양액인, 방법 및 용도.
19. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 알킬 폴리글루코사이드 세제의 소정 농도에서 소정의 시간 동안 알킬 폴리글루코사이드 세제와 함께 인큐베이션하는 것인, 방법 및 용도.
20. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 용액 내에 존재하는, 방법 및 용도.
21. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 그 부피의 2.5% 내지 20% (2.5%(v/v) 내지 20%(v/v))가 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액과 조합되는, 방법 및 용도.
22. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 그 부피의 5% 내지 10% (5%(v/v) 내지 10%(v/v))가 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액과 조합되는, 방법 및 용도.
23. 실시형태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 알킬 폴리글루코사이드 세제를 5% 내지 20% 농도로 포함하는, 방법 및 용도.
24. 실시형태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 알킬 폴리글루코사이드 세제를 7.5% 내지 15% 농도로 포함하는, 방법 및 용도.
25. 실시형태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 바람직하게는 알킬 폴리글루코사이드 세제를 약 10% 농도로 포함하는, 방법 및 용도.
26. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 30분 내지 90분 동안인, 방법 및 용도.
27. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 45분 내지 75분 동안인, 방법 및 용도.
28. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 바람직하게는 약 60분 동안인, 방법 및 용도.
29. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 온도가 25℃ 내지 45℃인, 방법 및 용도.
30. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 온도가 28℃ 내지 42℃인, 방법 및 용도.
31. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 온도가 32℃ 내지 40℃인, 방법 및 용도.
32. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 바람직하게는 온도가 약 37℃인, 방법 및 용도.
33. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 교반과 함께 또는 진탕과 함께 이루어지는, 방법 및 용도.
34. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 통기 없이 이루어지는, 방법 및 용도.
35. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 중에 pH가 조정되지 않는, 방법 및 용도.
36. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후, 규조토를 첨가하고 혼합물을 5 내지 20분 동안 인큐베이션하는, 방법 및 용도.
37. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제 또는 규조토와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후, 혼합물은 원심분리 또는/및 멸균 여과되는, 방법 및 용도.
38. 실시형태 20 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 완충염을 포함하는, 방법 및 용도.
39. 실시형태 20 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 TRIS를 포함하는, 방법 및 용도.
40. 실시형태 20 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 100 mM 내지 1000 mM 농도의 완충염을 포함하는, 방법 및 용도.
41. 실시형태 20 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 250 mM 내지 750 mM 농도의 완충염을 포함하는, 방법 및 용도.
42. 실시형태 20 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 400 mM 내지 600 mM 농도의 완충염을 포함하는, 방법 및 용도.
43. 실시형태 20 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 약 500 mM 농도의 완충염을 포함하는, 방법 및 용도.
44. 실시형태 20 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 이온성 개질제 염을 포함하는, 방법 및 용도.
45. 실시형태 20 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 바람직하게는 이온성 개질제 염으로서 염화 마그네슘(II)를 포함하는, 방법 및 용도.
46. 실시형태 20 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 5 mM 내지 200 mM 농도의 이온성 개질제 염을 포함하는, 방법 및 용도.
47. 실시형태 20 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 7.5 mM 내지 150 mM 농도의 이온성 개질제 염을 포함하는, 방법 및 용도.
48. 실시형태 20 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 10 mM 내지 50 mM 농도의 이온성 개질제 염을 포함하는, 방법 및 용도.
49. 실시형태 20 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 농도의 이온성 개질제 염을 포함하는, 방법 및 용도.
50. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 6.5-9.0인, 방법 및 용도.
51. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 6.5-8.0인, 방법 및 용도.
52. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 7.0-7.5인, 방법 및 용도.
53. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 6.5-9.0이고, 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후 pH 값은 pH 7.0-7.5로 조정되는, 방법 및 용도.
54. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 6.5-8.0이고, 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후 pH 값은 pH 7.0-7.5로 조정되는, 방법 및 용도.
55. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 pH 값이 pH 7.0-7.5이고, 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후 pH 값은 약 7.5로 조정되는, 방법 및 용도.
56. 실시형태 20 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 pH 값이 pH 7.2 내지 7.8인, 방법 및 용도.
57. 실시형태 20 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 pH 값이 pH 7.3 내지 7.7인, 방법 및 용도.
58. 실시형태 20 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 pH 값이 pH 7.4 내지 7.6인, 방법 및 용도.
59. 실시형태 20 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 바람직하게는 pH 값이 약 7.5인, 방법 및 용도.
60. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 알킬 폴리글루코사이드 세제 및 뉴클레아제와 접촉하게 되는, 방법 및 용도.
61. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 알킬 폴리글루코사이드 세제 및 DNase I과 접촉하게 되는, 방법 및 용도.
62. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 포유류 세포 배양액은 바람직하게는 알킬 폴리글루코사이드 세제 및 벤조나제와 접촉하게 되는, 방법 및 용도.
63. 실시형태 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 25 내지 100 U/mL 뉴클레아제가 첨가되는, 방법 및 용도.
64. 실시형태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 바람직하게는 각 뉴클레아제의 50 U/mL가 첨가되는, 방법 및 용도.
65. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 재조합 AAV 입자 생산 세포는 PEI로 형질감염시켜 수득된 것인, 방법 및 용도.
66. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 친화성 리간드가 공유 결합되는 가교 폴리(스티렌-디비닐 벤젠) 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 물질 상에서 이루어지는, 방법 및 용도.
67. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 친화성 리간드가 공유 결합되는 가교 폴리(스티렌-디비닐 벤젠) 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 물질 상에서 이루어지는, 방법 및 용도.
68. 실시형태 67에 있어서, 친화성 리간드는 단일 도메인 항체 단편(VHH)인, 방법 및 용도.
69. 실시형태 67 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 친화성 리간드는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 및 이를 기반으로 하는 합성 혈청형에 특이적으로 결합하는, 방법 및 용도.
70. 전술한 청구항 중 어느 하나에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 및 이를 기반으로 하는 합성 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 단편(VHH)이 공유 결합되는 가교 폴리(스티렌-디비닐 벤젠) 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 물질 상에서 수행되는, 방법 및 용도.
설명된 그리고 청구범위에 기재된 다양한 실시형태 이외에도, 본 발명은 또한 본 명세서에 개시되고 본 명세서의 청구범위에 기재된 특징들의 그 외 조합들을 가지는 다른 실시형태에도 관련된다. 이와 같이, 본 명세서에 제시된 특정한 특징들은 개시된 발명이 본 명세서에 개시된 특징들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록 개시된 발명의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합 될 수 있다. 상기 개시된 발명의 특정 실시형태에 대한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이는 개시된 발명을 본 명세서에 개시된 실시형태로만 한정하거나 이들로 제한하고자 하는 것이 아니다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 재조합 AAV 입자의 회수, 즉, 회수율(캡시드 기반 수율 및 게놈 기반 수율 모두)이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
본 발명은 또한 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득된 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
AAV 친화성 크로마토그래피 단계 전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해시키기 위해 알킬 폴리글루코사이드 세제를 사용함으로써, 채워진 재조합 AAV 입자의 (캡시드 기반 및 게놈 기반) 수율 및 빈 재조합 AAV 입자에 대한 비율을 모두 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
정의
본 발명의 실시함에 유용한 방법 및 기술들은 예를 들어, Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986); Watson, J.D., 등, Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)에 기재되어 있다.
재조합 DNA 기술을 사용하여 핵산 유도체를 생성 할 수 있다. 이러한 유도체는, 예를 들어 치환, 변경, 교환, 결실 또는 삽입에 의해 개별적인 또는 여러 뉴클레오티드 위치에서 변형 될 수 있다. 예를 들어, 변형 또는 유도체화는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 실시 될 수 있다. 해당 분야의 당업자는 이러한 변형들을 용이하게 실시할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J., 등, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, 영국 참고).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나" 및 "그것"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 그러므로, 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 복수의 이러한 세포들 및 이의 균등물들, 등을 포함한다. 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 용어 "포함하는", "비롯한" 및 "가지는"은 호환적으로 사용될 수 있음을 유의하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나" 및 "그것"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다. 그러므로, 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 복수의 이러한 세포들 및 이의 균등물들, 등을 포함한다. 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 용어 "포함하는", "비롯한" 및 "가지는"은 호환적으로 사용될 수 있음을 유의하여야 한다.
"AAV 헬퍼 기능"이라는 용어는 AAV 유전자 생성물과 AAV 입자를 제공하기 위해 발현될 수 있는 AAV 유래 코딩 서열(단백질)을 의미하며, 이는 생산적인 AAV 복제 및 패키징을 위해 트랜스 형태에서 기능한다. 따라서 AAV 헬퍼 기능에는 rep과 cap을 비롯한 AAV 오픈 리딩 프레임(ORF) 및 특정 AAV 혈청형에 대한 AAP 등이 포함된다. rep 유전자 발현 산물은 다음을 비롯한 많은 기능을 가지고 있는 것으로 나타났다: DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 틈 형성; DNA 헬리케이스 활성; AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사 조절. 캡 유전자 발현 산물(캡시드)은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터 게놈에서 누락된 AAV 기능을 트랜스 형태로 보완하는 데 사용된다.
용어 "약"은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 20 % 범위를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 용어 "약"은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 10 % 범위를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 용어 "약"은 이후에 따라오는 수치값의 +/- 5 % 범위를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다", "비롯하다", "가지는", "가지다", "~ 수 있다", "함유하다" 및 이의 변화형들은, 추가적인 작용 또는 구조 가능성을 배제하지 않는 열린 말단의 변이형 어구들, 용어들 또는 단어들인 것으로 한다. 용어 "~을 포함하는"은 또한 용어 "~로 구성되는"을 포함한다. 본 발명은 또한 명시적으로 제시되었는지 여부와 관계없이, 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 요소들 "을 포함하는", "로 구성된" 및 "로 본질적으로 구성된" 다른 실시형태를 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배양"은 세포를 형질감염시키고 AAV 입자를 생산할 수 있는 조건 하에 배양 배지에서 세포를 유지하는 단계를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배양액"은 배양이 끝난 후의 생물 반응기의 내용물을 나타낸다. "배양액"은 포유류 세포, 죽은 세포와 살아있는 세포, 포유류 세포 잔해, 배양 배지, 포유류 세포에 의해 생산된 재조합 산물 및 포유류 세포에 의해 생산된 기타 대사 산물로 구성된다.
용어 "빈 입자" 및 "빈 재조합 AAV 입자"는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며 AAV 단백질 외피는 있지만 단백질을 인코딩하거나 AAV ITR이 연접한 관심 전사본으로 전사되는 핵산이 전부 또는 부분적으로 없는 AAV 입자, 즉, 벡터를 나타낸다. 따라서, 빈 입자는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 표적 세포로 전달하는 기능을 하지 않는다.
용어 "내인성"은 세포 내에서 자연적으로 발생하는 것; 세포에 의해 자연적으로 생산되는 것; 마찬가지로 "내인성 유전자 좌위/세포-내인성 유전자 좌위"는 세포에서 자연적으로 발생하는 좌위이다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성"은 뉴클레오티드 서열이 특정 세포로부터 유래하지 않고 DNA 전달 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공 또는 바이러스 벡터에 의한 형질 도입에 의해 상기 세포로 도입된다는 것을 나타낸다. 따라서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인공 서열인데, 이러한 인공성은, 예를 들어 상이한 기원의 하위서열들의 조합(예를 들어, 재조합효소 인식 서열과 SV40 프로모터 및 녹색 형광 단백질의 코딩 서열의 조합은 인공 핵산임)으로부터 또는 서열 일부의 결실 (예를 들어, 막-결합 수용체 또는 cDNA의 세포외 도메인만을 코딩하는 서열) 또는 핵염기의 돌연변이로부터 유래될 수 있다. 용어 "내인성"은 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포로부터 유래함을 지칭한다. "외인성" 뉴클레오티드 서열은 기본 조성에 있어서 동일한 "내인성" 대응부를 가질 수 있으나, 여기서 상기 서열은 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 상기 세포로의 이의 도입에 의해 "외인성" 서열이 된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유가식 세포 배양"은 세포들 및 배양 배지가 초기에 배양 생물반응기에 공급되고, 배양 과정 동안 추가 배양 영양소가, 연속하여 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급되고, 배양 종료 전 주기적 세포 및/또는 생성물을 수확하거나 수확하지 않는, 배양을 지칭한다.
용어 "채워진 입자" 및 "채워진 재조합 AAV 입자"는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며 AAV 단백질 외피가 있고 내부에 단백질을 인코딩하거나 AAV ITR이 연접되어 있는 관심 전사본으로 전사되는 핵산이 캡시드화되어 있는 AAV 입자, 즉, 벡터를 나타낸다. 따라서, 채워진 입자는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 캡시드화된 핵산을 표적 세포로 전달할 수 있다.
용어 "채워진 대 빈 비율" 및 "빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자 비율"은 상호 교환적으로 사용 가능하며 재조합 AAV 입자가 포함된 샘플에서 또는 재조합 AAV 입자 제제에서 전체 재조합 AAV 입자(채워진 및 빈)의 수에 대한 채워진 재조합 AAV 입자 수의 수학적 비율을 나타낸다. 채워진 재조합 AAV 입자의 수는 전체 재조합 AAV 입자의 수와 같을 수 있으므로 비율은 최대 1이 될 수 있다. 일반적으로 비율은 1보다 작고 백분율로 표현된다. 채워진 재조합 AAV 입자의 수는 샘플 또는 제제 내의 재조합 AAV 입자 캡시드화 핵산의 수를 결정함으로써 결정된다. 이는 PCR, 특히, 디지털 드롭릿 PCR(ddPCR)을 통해 이루어질 수 있다. 전체 재조합 AAV 입자의 수는 샘플 또는 제제 내의 캡시드 단백질 수를 결정함으로써 결정된다. 이는 ELISA, 특히, 캡시드 단백질 특이적 ELISA를 통해 수행될 수 있다.
"AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산"은 일반적으로 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하며, 이는 형질도입 가능한 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 사용된다. AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산은 일반적으로 AAV 복제에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 발현을 제공하는 데 사용된다; 그러나 핵산 구조체에는 AAV ITR이 없으며 자체적으로 복제되거나 패키징될 수 없다. AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 입자의 형태일 수 있다. 다수의 핵산 구조체, 예를 들어, rep와 cap 유전자 발현 산물 모두를 인코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 설명된 바 있다. 예를 들어, Samulski 외, J. Virol. 63 (1989) 3822-3828; 및 McCarty 외, J. Virol. 65 (1991) 2936-2945를 참고한다. rep 및/또는 cap 유전자 발현 산물을 인코딩하는 다수의 플라스미드가 설명된 바 있다(예를 들어, US 5,139,941 및 US 6,376,237). AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 이들 핵산 중 어느 하나라도 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산을 포함할 수 있다.
"헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산"이라는 용어는 일반적으로 아데노바이러스 헬퍼 기능을 제공하는 단백질 및/또는 RNA 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다. 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 보유한 플라스미드는 적합한 세포에 형질감염 될 수 있으며, 이 플라스미드는 이후 상기 세포에서 AAV 입자 생산을 지원할 수 있다. 헬퍼 단백질을 인코딩하는 이들 핵산 중 어느 하나라도 본 발명에 따른 DNA 요소 또는 핵산을 포함할 수 있다. 자연에 존재하는 감염성 바이러스 입자로는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백신 바이러스 입자 등이 있으며, 이러한 바이러스 입자는 이 용어에서 명확히 제외된다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 구성요소들의 병치를 지칭하며, 여기서 구성요소들은 이들을 의도한 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재한다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 전사를 조절하는 작용을 하는 경우, 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, "작동가능하게 연결된" DNA 서열들은 단일 염색체에서 연속이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 분비 리더 및 폴리펩티드와 같은 2개의 단백질 인코딩 영역들을 연결하는 것이 필요한 경우, 서열들은 연속이며 동일한 리딩 프레임에 존재한다. 특정 실시형태에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 상류에 위치하고 이에 인접 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들어 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 발현을 조절하는 인핸서 서열들과 관련하여, 두 구성성분은 인접하지는 않지만 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서가 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 전사를 증가시키면 인핸서는 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 상류, 내부 또는 하류에 위치 할 수 있고 코딩 서열/오픈 리딩 프레임/유전자의 프로모터로부터 상당한 거리에 위치 할 수 있다.
용어 "패키징 단백질"은 AAV가 복제에 의존하는 비AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다. 따라서 이 용어는 AAV 복제에 필요한 단백질과 RNA를 의미하며, 여기에는 AAV 유전자 전사 활성화, 단계별 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립에 관여하는 모이어티들이 포함된다. 바이러스 기반 보조 기능은 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 헤르페스 바이러스 I형 제외) 및 백시니아 바이러스와 같은 알려진 헬퍼 바이러스에서 유래할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "AAV 패키징 단백질"은 생산적인 AAV 복제를 위해 트랜스 형태에서 기능하는 AAV 유래 서열을 지칭한다. 따라서 AAV 패키징 단백질은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임(ORF), rep 및 cap에 의해 인코딩된다. rep 단백질은 다음을 비롯한 많은 기능을 가지고 있는 것으로 나타났다: DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 틈 형성; DNA 헬리케이스 활성; AAV(또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사 조절. 캡(캡시드)은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 패키징 단백질은 본 명세서에서 AAV 벡터에서 누락된 AAV 기능을 트랜스 형태로 보완하는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 최종 유전자 변형 후의 세포, 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 발현하거나 관심 rAAV 입자를 생산하는 세포를 의미하며, 이는 상기 관심 폴리펩티드 또는 관심 rAAV 입자를 임의의 규모로 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합효소 매개 카세트 교환(RMCE)을 거쳐, 이에 의해 관심 폴리펩티드의 코딩 서열들이 숙주 세포의 게놈 내로 도입되어 있는 "외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 세포"는 "재조합 세포"이다. 세포는 여전히 또 다른 RMCE 반응을 수행할 수 있지만 그렇게 하도록 의도된 것은 아니다.
"재조합 AAV 벡터"는 바이러스(예를 들어, AAV)로부터 야생형 게놈을 제거하는 분자생물학적 방법을 사용하고, 이를 비-천연 핵산, 예를 들어, 전사본으로 전사되거나 단백질을 인코딩하는 핵산으로 대체함에 의해, AAV와 같은 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 일반적으로 AAV의 경우 야생형 AAV 게놈의 역전된 말단 반복부(ITR) 서열들 중 하나 또는 둘 다가 재조합 AAV 벡터에 보유된다. "재조합" AAV 벡터는 바이러스 게놈의 일부 또는 전체가 바이러스 게놈 핵산과 관련하여 비-천연(즉, 이종) 서열로 대체되어 있기 때문에 야생형 바이러스 AAV 게놈과 구별된다. 따라서 비-천연 서열의 통합은 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 "재조합" 벡터로 정의하며, AAV의 경우 "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다.
재조합 벡터(예를 들어, AAV) 서열은 세포의 체외, 시험관내 또는 생체내 추후 감염(형질도입)을 위해 패키징 될 수 있다-본 명세서에서 "입자"라 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자에 캡슐화되거나 패키징된 경우, 입자는 "rAAV"라고도 지칭될 수 있다. 이러한 입자에는 벡터 게놈을 캡슐화하거나 패키지화하는 단백질이 포함된다. 특정한 예에는 바이러스 외피 단백질이 포함되고, AAV의 경우, AAV VP1, VP2, VP3과 같은 캡시드 단백질이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혈청형"은 AAV 캡시드가 혈청학적으로 구별된다는 것을 기반으로 하는 구별이다. 혈청학적 구별성은 하나의 AAV에 대한 항체들 간의 교차 반응성이 또 다른 AAV에 비해 부족한 것을 기준으로 결정한다. 이러한 교차 반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자의 차이(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이)로 인해 발생한다. 캡시드 변이체를 포함한 AAV 변이체가 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 가능성이 있음에도 불구하고, 상기 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교했을 때 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 다르다.
전통적인 정의에 따르면, 혈청형이란 관심 바이러스가 모든 기존 혈청형 및 특성화된 혈청형에 대해 중화 활성에 관해 검사를 거쳤으며 관심 바이러스를 중화하는 항체가 발견되지 않은 것을 의미한다. 자연 발생 바이러스 단리물이 더 많이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 더 많이 생성되기 때문에, 현재 존재하는 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 따라서 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)에 혈청학적 차이가 없는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 해당 혈청형의 하위 그룹 또는 변이체가 될 것이다. 많은 경우, 캡시드 서열이 변형된 돌연변이체 바이러스에 대해 중화 활성을 검사하는 혈청학 검사가 아직 수행되지 않아 해당 바이러스가 기존 혈청형 정의에 따라 또 다른 혈청형인지 여부를 결정할 수 없다. 따라서 편의상 그리고 중복을 피하기 위해 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예를 들어, AAV)와 혈청학적으로 구별되지 않지만 주어진 혈청형의 하위 그룹 또는 변이체에 속할 수 있는 바이러스(예를 들어, AAV)를 모두 광범위하게 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "트랜스진(transgene)"은 세포 또는 유기체에 도입될 예정이거나 도입된 핵산을 편리하게 지칭하는 데 사용된다. 트랜스진에는 전사본으로 전사되거나 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자와 같은 임의의 핵산이 포함된다.
용어 "Triton CG 110"은 알킬 폴리글루코사이드 세제를 나타낸다. Triton CG 110의 CAS 번호는 68515-73-1이다. Triton CG 110은 58.0-62.0(w/v)% D-글루코피라노스, 올리고머, 데실 옥틸 글리코사이드 및 38.0-42.0(w/v)% 물의 혼합물이다.
"벡터"는 재조합 플라스미드 서열의 일부를 지칭하며, 최종적으로 직접적으로 또는 단일 가닥이나 RNA 형태로 패키징되거나 캡슐화되어 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 형성한다. 재조합 플라스미드를 사용하여 재조합 바이러스 입자를 구성하거나 제조하는 경우, 바이러스 입자에는 재조합 플라스미드의 벡터 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 일부가 포함되지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비벡터 부분을 "플라스미드 백본"이라고 하며, 이는 플라스미드의 복제 및 증폭에 중요한데, 이러한 과정은 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요하지만 그 자체로는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자에 패키징되거나 캡슐화되지 않는다. 따라서, "벡터"는 바이러스 입자(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡슐화된 핵산을 지칭한다.
재조합 세포
일반적으로, 재조합 AAV 입자(rAAV 입자)를 효율적이면서도 대량으로 생산하기 위해서는 상기 rAAV 입자를 발현하고, 가능하다면 분비하는 세포가 필요하다. 이러한 세포를 "재조합 세포" 또는 "재조합 생산 세포"라고 한다.
"재조합 생산 세포"를 생성하기 위해, 필요한 AAV 헬퍼 기능을 포함하여 상기 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 핵산 서열을 적합한 포유류 세포에 형질감염시킨다.
코딩 서열, 즉, 오픈 리딩 프레임의 발현을 위해서, 프로모터와 폴리아데닐화 신호(서열)와 같은 추가적인 조절 요소가 필요하다. 따라서, 오픈 리딩 프레임은 전사를 위한 상기 추가 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 이는 소위 발현 카세트에 통합함으로써 달성될 수 있다. 발현 카세트가 포유동물 세포에서 기능하기 위해 필요한 최소한의 조절 요소들은, 오픈 리딩 프레임에 대해 상류, 즉, 5'에 위치하는 상기 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터, 및 오픈 리딩 프레임에 대해 하류, 즉, 3'에 위치하는 상기 포유동물 세포에서 기능하는 폴리아데닐화 신호 (서열)이다. 또한 종결인자 서열은 폴리아데닐화 신호(서열)의 3'에 존재할 수 있다. 발현을 위해서는, 프로모터, 오픈 리딩 프레임/코딩 영역 및 폴리아데닐화 신호 서열이 작동가능하게 연결된 형태로 배열되어야 한다.
마찬가지로, 비-단백질 코딩 RNA로 전사되는 핵산을 "RNA 유전자"라고 한다. RNA 유전자의 발현을 위해서도, 프로모터 및 전사 종결 신호 또는 폴리아데닐화 신호(서열)와 같은 추가적인 조절 요소가 필요하다. 이러한 요소의 성질과 위치는 RNA 유전자의 발현을 촉진하려는 RNA 중합효소에 따라 달라진다. 따라서 RNA 유전자는 일반적으로 발현 카세트에도 통합된다.
다양한 (단량체) 캡시드 폴리펩티드와 단일 가닥 DNA 분자로 구성되고 생산 및 캡슐화를 위해 다른 아데노바이러스 헬퍼 기능이 필요한 AAV 입자의 경우, 포함된 오픈 리딩 프레임/코딩 서열이 상이한 다양한 발현 카세트가 필요하다. 이 경우, 필요한 헬퍼 기능에 대한 각 트랜스진에 대한 발현 카세트, AAV 벡터의 캡시드를 형성하는 서로 다른 폴리펩티드, 및 VA RNA가 필요하다. 따라서 헬퍼 기능인 E1A, E1B, E2A, E4orf6, VA RNA, rep 및 cap 유전자 각각에 대한 개별 발현 카세트가 필요하다. HEK293 세포는 E1A와 E1B 헬퍼 기능을 항시적으로 발현한다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 발현 카세트 각각은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 오픈 리딩 프레임/코딩 서열 또는 RNA 유전자 및 폴리아데닐화 신호 서열, 및/또는 종결인자 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 인코딩하며, 발현 카세트는 추가 종결인자 서열이 있거나 없는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 발현 카세트는 RNA 유전자를 포함하고, 프로모터는 2형 Pol III 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열 또는 폴리U 종결인자가 존재한다. 예를 들어, Song 외, Biochemical and Biophysical Research Communications 323(2004) 573-578을 참고한다. 특정 실시형태에서, 발현 카세트는 RNA 유전자를 포함하고, 프로모터는 2형 Pol III 프로모터 및 폴리U 종결인자 서열이다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 인코딩하고, 프로모터는 인트론 A가 있거나 없는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH(소 성장 호르몬) 폴리 A 신호 서열이고, 종결인자는 hGT(인간 가스트린 종결인자)이다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 프로모터는 인트론 A가 있는 인간 CMV 프로모터이고, 폴리아데닐화 신호 서열은 bGH 폴리아데닐화 신호 서열이고, 종결인자는 hGT이며, RNA 유전자의 발현 카세트 및 선별 마커의 발현 카세트는 예외인데, 이때 선별 마커의 경우 프로모터는 SV40 프로모터이고 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이고 종결인자가 없고, RNA 유전자의 경우 프로모터는 야생형 2형 중합효소 III 프로모터이고 종결인자는 중합효소 II 또는 III 종결인자이다.
아데노 관련 바이러스(AAV)
AAV와 아데노바이러스 또는 헤르페스 헬퍼 기능에 대한 일반적인 검토는 Berns 및 Bohensky의 Advances in Virus Research, Academic Press., 32(1987) 243-306을 참고한다. AAV의 게놈은 Srivastava 외, J. Virol., 45 (1983) 555-564에 기술되어 있다. US 제4,797,368호에는 재조합 AAV 벡터를 구성하기 위한 설계 고려 사항이 기재되어 있다(또한 WO 93/24641 참고). AAV 벡터를 설명하는 추가 참고 문헌은 West 외, Virol. 160 (1987) 38-47; Kotin, Hum. Gene Ther. 5 (1994) 793-801; 및 Muzyczka J. Clin. Invest. 94 (1994) 1351이다. 재조합 AAV 벡터의 제작은 US 제5,173,414호; Lebkowski 외, Mol. Cell. Biol. 8(1988) 3988-3996; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5(1985) 3251-3260; Tratschin 외, Mol. Cell. Biol., 4(1994) 2072-2081; Hermonat and Muzyczka Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984) 6466-6470; Samulski 외. J. Virol. 63(1989) 3822-3828에 기재되어 있다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 복제 결핍 파보바이러스이다. 이 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 어떤 경우에는 폭스바이러스(예를 들어, 백신)와 같은 공동 감염 헬퍼 바이러스에 의해 특정 바이러스 기능이 제공되는 세포에서만 복제될 수 있다. 그럼에도 불구하고, AAV는 적절한 헬퍼 바이러스 기능이 존재하는 한 사실상 인간, 원숭이 또는 설치류 유래의 모든 세포주에서 복제될 수 있다.
헬퍼 바이러스 유전자가 없으면, AAV는 숙주 세포에서 휴면 상태를 확립한다. 이의 게놈은 19번 염색체의 특정 부위[(Chr)19(q13.4)]에 통합되는데, 이 부위를 아데노 관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1)이라고 한다. AAV-2와 같은 특정 혈청형의 경우, 다른 통합 부위, 예를 들어, 5번 염색체[(Chr) 5(p13.3)]에서(AAVS2라 명명), 및 3번 염색체[(Chr) 3(p24.3)]에서(AAVS3라 명명)의 통합 부위가 발견되었다.
AAV는 여러 가지 혈청형으로 범주화된다. 이들은 적혈구 응집 반응, 종양 형성성 및 DNA 서열 상동성과 같은 매개변수를 기반으로 할당되었다. 지금까지 10개 이상의 서로 다른 혈청형과 AAV의 다양한 클레이드(clades)에 해당하는 100개 이상의 서열이 식별되었다.
캡시드 단백질 유형과 대칭성은 해당 AAV의 조직 향성(tropism)을 결정한다. 예를 들어, AAV-2, AAV-4 및 AAV-5는 망막에 특이적이고, AAV-2, AAV-5, AAV-8, AAV-9 및 AAVrh-10은 뇌에 특이적이고, AAV-1, AAV-2, AAV-6, AAV-8 및 AAV-9는 심장 조직에 특이적이고, AAV-1, AAV-2, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 및 AAV-10은 간에 특이적이고, AAV-1, AAV-2, AAV-5 및 AAV-9는 폐에 특이적이다.
유사형화(Pseudotyping)는 다양한 혈청형 간에 AAV 게놈을 교차 패키징하는 과정을 의미한다, 즉, 게놈은 서로 다르게 유래된 캡시드 단백질과 함께 패키징된다.
야생형 AAV 게놈의 크기는 약 4.7kb이다. AAV 게놈은 rep 및 cap이라는 두 개의 중복 유전자를 추가로 포함하는데, 이는 다중 오픈 리딩 프레임을 포함한다(예를 들어, Srivastava 외, J. Viral., 45(1983) 555-564; Hermonat 외, J. Viral. 51(1984) 329-339; Tratschin 외, J. Virol., 51(1984) 611-619 참고). 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40이라고 명명되는 크기가 다른 4가지 단백질을 제공한다. 이들은 AAV의 복제, 구제 및 통합에 관여한다. 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 Cap 단백질은 VP1, VP2, VP3, 및 AAP라 명명되는 4가지 단백질을 제공한다. VP1, VP2 및 VP3는 AAV 입자의 단백질 캡시드의 일부이다. 결합된 rep과 cap 오픈 리딩 프레임은 5'과 3' 말단에 소위 역전된 말단 반복부(ITR)가 연접되어 있다. 복제를 위해, AAV는 Rep 및 Cap 단백질 외에 아데노바이러스의 E1A, E1B, E4orf6, E2A 및 VA 유전자의 산물이나 다른 헬퍼 바이러스의 해당 인자가 필요로 한다.
예를 들어, 혈청형 2(AAV-2)의 AAV의 경우, 각 ITR은 145개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 약 4470개 뉴클레오티드의 코딩 서열 영역에 연접되어 있다. ITR의 145개 뉴클레오티드 중 125개 뉴클레오티드는 회문식 서열을 가지고 있으며 T자 모양의 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 이 구조는 바이러스 복제 중에 프라이머 기능을 한다. 나머지 20개의 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드는 D-서열로 표시된다.
AAV 게놈은 rep 및 cap 유전자 발현을 위한 3개의 전사 프로모터 P5, P19 및 P40을 보유하고 있다(Laughlin 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5567-5571).
ITR 서열은 코딩 영역에 대해 시스 형태로 존재해야 한다. ITR은 표적 세포 게놈으로의 통합에 필요한 신호인 기능적 복제 기점(ori), 숙주 세포 염색체나 재조합 플라스미드로부터의 효율적 절제 및 구제를 제공한다. ITR은 또한 Rep 단백질 결합 부위(RBS) 및 말단 해결 부위(TRS)와 같은 복제 기점 유사 요소를 포함한다. ITR 자체가 AAV 벡터의 전사 프로모터 기능을 가질 수 있음이 발견되었다(Flotte 외, J. Biol. Chem. 268 (1993) 3781-3790; Flotte 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1993) 10163-10167).
바이러스 단일 가닥 DNA 게놈의 복제 및 캡슐화를 위해, 각각, rep과 cap 유전자 산물의 인 트랜스 조직화가 필요하다.
rep 유전자 좌위는 P5와 P19라 명명되는 두 개의 내부 프로모터를 포함한다. 이는 4개의 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 프로모터 P5는 Rep 단백질 Rep78(세포 주기를 정지시키는 크로마틴 니카제)을 인코딩하는 스플라이스되지 않은 4.2kb mRNA 및 Rep 단백질 Rep68(부위 특이적 엔도뉴클레아제)을 인코딩하는 스플라이스된 3.9kb mRNA를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터 P19는 Rep 단백질 Rep52를 인코딩하는 스플라이싱 되지 않은 mRNA 및 Rep 단백질 Rep40(축적 및 패키징을 위한 DNA 헬리카제)을 인코딩하는 스플라이스된 3.3kb mRNA를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
두 개의 더 큰 Rep 단백질인 Rep78과 Rep68은 AAV 이중 DNA 복제에 필수적인 반면, 더 작은 Rep 단백질인 Rep52와 Rep40은 자손 단일 가닥 DNA 축적에 필수적인 것으로 보인다(Chejanovsky & Carter, Virology 173 (1989) 120-128).
더 큰 Rep 단백질인 Rep68과 Rep78은 AAV ITR의 헤어핀 입체 형태에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 AAV 말단에서 복제를 해결하는 데 필요한 정의된 효소 활성을 보인다. Rep78 또는 Rep68의 발현은 감염성 입자 형성에 충분할 수 있다(Holscher, C., 외, J. Virol. 68(1994) 7169-7177 및 69(1995) 6880-6885).
모든 Rep 단백질, 주로 Rep78 및 Rep68은 AAV 유전자의 유도 및 억제와 같은 조절 활동과 세포 성장에 대한 억제 효과를 나타내는 것으로 여겨진다(Tratschin 외, Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894; Labow 외, Mol. Cell. Biol., 7 (1987) 1320-1325; Khleif 외, Virology, 181 (1991) 738-741).
Rep78의 재조합적 과발현은 DNA 손상 유도로 인해 세포 성장이 감소한 표현형을 초래한다. 이에 따라 숙주 세포는 S 단계에서 정지되고, 이로써 바이러스에 의한 잠복 감염이 촉진된다(Berthet, C., 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 13634-13639).
Tratschin 외의 문헌은 P5 프로모터가 Rep78 또는 Rep68에 의해 음성적으로 자가 조절된다고 보고했다(Tratschin 외, Mol. Cell. Biol. 6 (1986) 2884-2894). Rep 단백질 발현의 독성 효과로 인해, AAV의 안정적인 통합 후 특정 세포주에 대해서만 매우 낮은 발현만이 보고되었다(예를 들어, Mendelson 외, Virol. 166 (1988) 154-165 참고).
캡 유전자 좌위는 P40이라 명명되는 하나의 프로모터를 포함한다. 프로모터 P40은 2.6kb mRNA를 제공하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되며, 이는 선택적 스플라이싱 및 대체 시작 코돈의 사용을 통해 Cap 단백질인 VP1(87kDa, 스플라이스되지 않은 mRNA 전사본), VP2(72kDa, 스플라이스된 mRNA 전사본에서 유래), 및 VP3(61kDa, 대체 시작 코돈에서 유래)을 인코딩한다. VP1 내지 VP3은 바이러스 캡시드의 빌딩 블록을 구성한다. 캡시드는 세포 표면 수용체에 결합하여 바이러스의 세포 내 이동(intracellular trafficking)을 가능하게 하는 기능을 한다. VP3는 전체 바이러스 입자 단백질의 약 90%를 차지한다. 그럼에도 불구하고, 세 가지 단백질 모두 효과적인 캡시드 생산에 필수적이다.
세 가지 캡시드 단백질인 VP1 내지 VP3을 모두 비활성화하면 단일 가닥 자손 AAV DNA 축적이 방지되는 것으로 보고된 바 있다. VP1 아미노 말단에 돌연변이("Lip 음성" 또는 "Inf 음성")가 있어도 단일 가닥 DNA가 바이러스 입자로 조립되어 감염 역가가 크게 감소할 수 있다.
AAP 오픈 리딩 프레임은 조립 활성화 단백질(AAP)을 인코딩한다. 크기는 약 22kDa이며, 본래의 VP 단백질을 캡시드 조립을 위해 핵소체 영역으로 운반한다. 이 오픈 리딩 프레임은 VP3 단백질 인코딩 서열의 상류에 위치한다.
개별 AAV 입자에는 단일 가닥 DNA 분자가 하나만 포함되어 있다. 이는 "양" 또는 "음"의 가닥이 될 수 있다. DNA 분자를 함유한 AAV 바이러스 입자는 감염성이 있다. 감염된 세포 내부에서, 모체의 감염성 단일 가닥은 이중 가닥으로 전환되고, 이후 증폭된다. 이러한 증폭으로 인해 이중 가닥 DNA 분자의 큰 풀이 생성되고, 여기서 단일 가닥들이 치환되어 캡시드에 패키징된다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 분열 중인 세포뿐만 아니라 휴면 세포에도 형질도입 될 수 있다. AAV 벡터를 사용하여 표적 세포에 도입된 트랜스진은 장기간 발현될 것으로 추정할 수 있다. AAV 벡터를 사용하는 것의 한 가지 단점은 세포에 도입할 수 있는 트랜스진의 크기가 제한된다는 것이다.
AAV 혈청형 및 그 변종이체를 포함한 파보 바이러스 입자와 같은 바이러스 벡터는 핵산을 생체 외, 시험관 내 및 생체내 세포로 전달하여, 해당 세포가 인코딩된 단백질을 발현하도록 단백질을 인코딩하는 수단을 제공한다. AAV는 세포에 침투하여 핵산/유전 물질을 도입하여 핵산/유전 물질이 세포 내에서 안정적으로 유지될 수 있으므로 유전자 치료 벡터로 유용한 바이러스이다. 또한 이러한 바이러스는 핵산/유전 물질을 특정 부위에 도입할 수도 있다. AAV는 인간의 병원성 질병과 관련이 없기 때문에 AAV 벡터는 상당한 AAV 병원성 또는 질병을 유발하지 않고 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료용 단백질 및 제제)을 인간 환자에게 전달할 수 있다.
효과적인 유전자 전달을 위한 비히클로 사용되는 AAV 입자는 분열 세포와 분열하지 않는 세포에 대한 향성을 비롯하여 이러한 응용 분야에 필요한 여러 가지 바람직한 특성을 보유하고 있다. 이러한 벡터를 사용한 초기 임상 경험에서도 지속적인 독성이 나타나지 않았고 면역 반응은 미미하거나 감지할 수 없을 정도로 적었다. AAV는 수용체 매개 세포내이입 또는 세포 통과과정을 통해 생체내 및 시험관 내에서 다양한 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포를 표적하는 이러한 벡터 시스템은 인간을 대상으로 테스트되었다.
재조합 AAV 입자에는 일반적으로 병원성과 관련된 바이러스 유전자가 포함되지 않는다. 이러한 벡터는 일반적으로 야생형 AAV 유전자 중 하나 이상이 전체 또는 부분적으로 결실되어 있으나(예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자), 재조합 벡터를 AAV 입자 내부로 구제, 복제 및 패키징하는 데 필요한 기능적 연접 ITR 서열 중 적어도 하나는 보유한다. 예를 들어, 벡터의 필수 부분, 즉, ITR 및 LTR 요소만이 포함된다. 따라서 AAV 벡터 게놈에는 시스 형태의 복제 및 패키징에 필요한 서열(예를 들어, 기능적 ITR 서열)이 포함된다.
재조합 AAV 벡터, 및 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비-제한적 예로서, 재조합 AAV 벡터는, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, 2i8, AAV rh74 또는 AAV 7m8과 같은 임의의 AAV 게놈을 기반으로 할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 하위 그룹 또는 변이체)을 기반으로 할 수도 있고, 서로 다를 수도 있다. 비 제한적 예로서, 하나의 혈청형 게놈을 기반으로 하는 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 하나 이상의 캡시드 단백질과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 게놈은 벡터를 패키징하는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질과 구별되는 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈은 AAV2에 기반할 수 있고, 반면 세 가지 캡시드 단백질 중 적어도 하나는, 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, AAV rh74, AAV 7m8 또는 이의 변이체일 수 있다. AAV 변이체에는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, AAV rh74 및 AAV 7m8 캡시드의 변이체 및 키메라가 포함된다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, AAV rh74 및 AAV 7m8로 구성된 군에서 선택된 AAV 및 이의 변이체(예를 들어, 아미노산 삽입, 부가, 치환 및 결실과 같은 캡시드 변이체)로부터 유래되며, 예를 들어, WO 2013/158879, WO 2015/013313 및 US 2013/0059732(LK01, LK02, LK03 등을 공개함)에 제시되어 있다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV Rh74 또는 AAV 7m8 캡시드 서열에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10 ITR 서열에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 ITR 서열을 포함한다.
재조합 입자(예를 들어, rAAV 입자)는 약학 조성물에 통합될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 특히 생체내 또는 생체 외에서 대상체에게 투여 및 전달하는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제에는 조성물을 투여받는 개체에게 해로운 면역 반응을 유발하지 않는 약학 제제가 포함되며, 이는 과도한 독성 없이 투여될 수 있다.
아데노바이러스 벡터 생성을 위한 프로토콜은 US 5,998,205; US 6,228,646호; US 6,093,699호; US 6,100,242호; WO 94/17810호 및 WO 94/23744호에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함되어 있다.
재조합 AAV 입자(rAAV 입자)
rAAV 입자를 생성하기 위한 다양한 방법이 해당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, AAV 플라스미드와 AAV 헬퍼 서열을 사용하는 형질감염과 함께 하나의 AAV 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백신 바이러스)를 동시 감염시키거나, 재조합 AAV 플라스미드, AAV 헬퍼 플라스미드 및 헬퍼 기능 플라스미드로 형질감염시키는 것이 있다. rAAV 입자를 생성하는 비 제한적 방법은, 예를 들어, US 6,001,650, US 6,004,797, WO 2017/096039 및 WO 2018/226887에 기술되어 있다. 재조합 rAAV 입자 생산(즉, 세포 배양 시스템에서 입자 생성) 후, rAAV 입자가 숙주 세포와 세포 배양 상층액으로부터 수득되고 정제될 수 있다.
재조합 AAV 입자를 생성하려면, 단일 포유류 세포에서 Rep 및 Cap 단백질, 헬퍼 단백질 E1A, E1B, E2A 및 E4orf6, 및 아데노바이러스 VA RNA의 발현이 필요하다. 헬퍼 단백질 E1A, E1B, E2A 및 E4orf6는 Matsushita 외, (Gene Ther. 5 (1998) 938-945)에서 보는 바와 같은 임의의 프로모터, 특히, CMV IE 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 따라서 어떠한 프로모터라도 사용할 수 있다.
일반적으로 재조합 AAV 입자를 생산하려면, 서로 다른 상보성 플라스미드들을 숙주 세포에 공동 형질감염시킨다. 플라스미드 중 하나는 시스로 작용하는 두 개의 AAV ITR 사이에 끼어 있는 트랜스진을 포함한다. 복제 및 이후 자손 재조합 게놈들의 패키징에 필요한 누락 AAV 요소, 즉, Rep 및 Cap 단백질의 오픈 리딩 프레임은 두 번째 플라스미드에 트랜스 형태로 포함되어 있다. Rep 단백질의 과발현은 세포 성장에 대한 억제 효과를 초래한다(Li, J., 외, J. Virol. 71 (1997) 5236-5243). 또한, 아데노바이러스의 헬퍼 바이러스 유전자인 E1, E4orf6, E2A 및 VA를 포함하는 세 번째 플라스미드가 AAV 복제에 필요하다.
필요한 플라스미드의 수를 줄이기 위해, Rep, Cap 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 단일 플라스미드에 결합할 수 있다.
혹은 숙주 세포가 이미 E1 유전자 산물을 안정적으로 발현할 수도 있다. 이러한 세포는 HEK293 세포이다. 293으로 명명되는 인간 배아 신장 클론은 1977년에 아데노바이러스 DNA를 인간 배아 신장 세포(HEK 세포)에 통합하여 생성되었다(Graham, FL, 외, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74). HEK293 세포주는 아데노바이러스 혈청형 5 게놈의 염기쌍 1 내지 4344를 포함한다. 여기에는 E1A 및 E1B 유전자와 아데노바이러스 패키징 신호가 포함된다(Louis, N. 외, Virology 233 (1997) 423-429).
HEK293 세포를 사용하는 경우, 누락된 E2A, E4orf6 및 VA 유전자는 아데노바이러스와의 공동 감염 또는 E2A-, E4orf6- 및 VA-발현 플라스미드와의 공동 형질감염을 통해 도입될 수 있다(예를 들어, Samulski, R.J., 외, J. Virol. 63 (1989) 3822-3828; Allen, J.M., 외, J. Virol. 71 (1997) 6816-6822; Tamayose, K., 외, Hum. Gene Ther. 7 (1996) 507-513; Flotte, T.R., 외, Gene Ther. 2 (1995) 29-37; Conway, J.E., 외, J. Virol. 71 (1997) 8780-8789; Chiorini, J.A., 외, Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1531-1541; Ferrari, F.K., 외, J. Virol. 70 (1996) 3227-3234; Salvetti, A., 외, Hum. Gene Ther. 9 (1998) 695-706; Xiao, X., 외, J. Virol. 72 (1998) 2224-2232; Grimm, D., 외, Hum. Gene Ther. 9 (1998) 2745-2760; Zhang, X., 외, Hum. Gene Ther. 10 (1999) 2527-2537 참고). 또는 아데노바이러스/AAV 또는 단순 헤르페스 바이러스/AAV 하이브리드 벡터가 사용될 수 있다(예를 들어, Conway, J.E., 외, J. Virol. 71 (1997) 8780-8789; Johnston, K.M., 외, Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370; Thrasher, A.J., 외, Gene Ther. 2 (1995) 481-485; Fisher, J.K., 외, Hum. Gene Ther. 7 (1996) 2079-2087; Johnston, K.M., 외, Hum. Gene Ther. 8 (1997) 359-370 참고).
특정 조직에 대한 트랜스진 활성을 제한하기 위해, 즉, 통합 부위를 제한하기 위해 트랜스진을 유도적 또는 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결할 수 있다(예를 들어, Yang, Y., 외, Hum. Gene. Ther. 6 (1995) 1203-1213 참고).
E1A, E1B, E2 및 E4
E1A 및 E1B의 코딩 서열(오픈 리딩 프레임)은 인간 아데노바이러스, 특히, 인간 아데노바이러스 혈청형 2 또는 혈청형 5에서 유래될 수 있다. 인간 Ad5(아데노바이러스 혈청형 5)의 예시적인 서열은 GenBank 항목 X02996, AC_000008에서 발견되고, 예시적인 인간 Ad2의 서열은 GenBank 항목 AC_000007에서 발견된다. 뉴클레오티드 505 내지 3522는 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열들을 포함한다. EP 1 230 354에 보고된 플라스미드 pSTK146과 WO 2007/056994에 보고된 플라스미드 pGS119 및 pGS122도 E1A 및 E1B 오픈 리딩 프레임의 소스로 사용될 수 있다.
E1A는 아데노바이러스 DNA가 세포핵에 들어간 후 발현되는 최초의 바이러스 헬퍼 유전자이다. E1A 유전자는 선택적 스플라이싱을 통해 동일한 E1A mRNA를 기반으로 하는 12S 및 13S 단백질을 인코딩한다. 12S와 13S 단백질의 발현은 다른 바이러스 기능인 E1B, E2, E3 및 E4의 활성화를 초래한다. 게다가, 12S와 13S 단백질의 발현은 세포를 세포 주기의 S 단계로 강제로 전환시킨다. E1A 유래 단백질만 발현되는 경우, 세포는 죽는다(세포자멸).
E1B는 발현되는 두 번째 바이러스 헬퍼 유전자이다. 이는 E1A 유래 단백질인 12S와 13S에 의해 활성화된다. E1B 유전자에서 유래된 mRNA는 두 가지 다른 방법으로 스플라이스되어 첫 번째 55 kDa 전사본과 두 번째 19 kDa 전사본이 생성된다. E1B 55 kDa 단백질은 세포주기 조절, 감염 후기의 세포 mRNA 수송 방지, E1A-유도된 세포자멸 방지 등에 관여한다. E1B 19 kDa 단백질은 E1A-유도된 세포자멸 방지에 관여한다.
E2 유전자는 다양한 단백질을 인코딩한다. E2A 전사본은 AAV 복제에 필수적인 단일 가닥 결합 단백질(SSBP)을 코딩한다.
마찬가지로 E4 유전자는 여러 가지 단백질을 인코딩한다. E4 유전자에서 유래된 34 kDa 단백질(E4orf6)은 E1B 55 kDa 단백질과 함께 세포 mRNA가 세포질에 축적되는 것을 방지하고, 또한 바이러스 RNA가 세포핵에서 세포질로 이동하는 것을 촉진한다.
아데노바이러스 VA RNA 유전자
이 바이러스 관련 RNA(VA RNA)는 아데노바이러스(Ad)의 비코딩 RNA로서 번역을 조절한다. 이 아데노바이러스 게놈은 VAI(VA RNAI)와 VAII(VA RNAII)의 두 가지 독립적인 사본을 포함한다. 둘 다 RNA 중합효소 III에 의해 2형 중합효소 III 프로모터로부터 전사된다(예를 들어, Machitani, M. 외, J. Contr. Rel. 154 (2011) 285-289 참고). 재조합 생산의 경우, 아데노바이러스 VA RNA 유전자는 어떠한 프로모터에 의해서도 구동될 수 있다.
Ma, Y. 및 Mathews, MB(J. Virol. 70 (1996) 5083-5099)는 계통발생학적 접근법을 사용하여 아데노바이러스 관련 RNA의 구조, 기능 및 진화를 조사했다. 이들은 47개의 알려진 인간 아데노바이러스 혈청형에 기반하여 정렬 및 합의된 VA RNA 서열들을 제공했다. 상기 개시 내용은 본 명세서에 그 전체가 참고로 포함된다.
VA RNA, VAI 및 VAII는 157-160개의 뉴클레오티드(nt)로 구성된다.
혈청형에 따라, 아데노바이러스는 VA RNA 유전자를 하나 또는 두 개 함유한다. VA RNAI는 우세하게 프로바이러스 역할을 하는 것으로 여겨지며, VA RNAII는 VA RNAI의 부재를 부분적으로 보완할 수 있다(Vachon, VK 및 Conn, GL, Virus Res. 212(2016) 39-52).
VA RNA는 필수적이지는 않지만 세포의 항바이러스 기전을 극복하여 효율적인 바이러스 성장에 중요한 역할을 한다. 즉, VA RNA는 바이러스 성장에 필수적이지는 않지만 VA RNA-결실 아데노바이러스는 세포 하나 당 바이러스 게놈의 사본이 몇 개만 존재하는 벡터 생성의 초기 단계에서는 성장할 수 없는데, 이는 세포의 항바이러스 기전을 차단하는 VA RNA 이외의 바이러스 유전자가 충분히 발현되지 않기 때문일 가능성이 있다(Maekawa, A., 외, Nature Sci. Rep. 3 (2013) 1136 참고).
Maekawa, A. 외(Nature Sci. Rep. 3 (2013) 1136)는 세포 RNAi 기전을 방해하는 바이러스 관련 RNA 유전자가 결핍된 아데노바이러스 벡터의 효율적인 생산을 보고하였는데, 여기서 플리파제 재조합효소를 항시적이고 고도로 발현하는 HEK293 세포를 감염시켜 FLP 재조합효소-매개된 VA RNA 좌위의 절제를 통해 VA RNA가 결실된 아데노바이러스를 수득하였다.
인간 아데노바이러스 2 VA RNAI는 GenBank 항목 AC_000007 서열의 뉴클레오티드 10586-10810에 해당한다. 인간 아데노바이러스 5 VA RNAI는 GenBank 항목 AC_000008 서열의 뉴클레오티드 10579-10820에 해당한다.
rAAV 입자를 생산하는 방법
Carter 외,은 야생형 AAV 게놈의 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임 전체가 결실되고 트랜스진으로 대체될 수 있음을 보여주었다(Carter, B. J., in "Handbook of Parvoviruses", ed. by P. Tijssen, CRC Press, pp. 155-168 (1990)). 또한, 표적 세포 게놈으로 트랜스진을 복제, 구제, 패키징, 및 통합하는 기능을 유지하려면 ITR이 유지되어야 한다고 보고되었다.
각각의 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 세포가 AAV 벡터에 의해 형질 도입되거나, 그 반대로, 통합된 AAV 프로바이러스를 포함하는 세포가 적합한 헬퍼 바이러스에 의해 형질도입될 때, AAV 프로바이러스가 활성화되어 다시 용해 감염 주기를 시작한다(Clark, KR, 외, Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1329-1341; Samulski, RJ, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (1993) 74-80).
생산자 세포에는 rep 및 cap 유전자 서열이 포함되어 있으며, 약물 선별을 통해 유지되는 하나 이상의 플라스미드에 있는 ITR 서열들이 연접한 트랜스진 카세트도 포함되어 있다. 이러한 세포주에서 rAAV 입자의 생산은 일반적으로 필요한 헬퍼 기능에 감염된 후에 발생한다. 따라서 세포는 복제가 가능한 AdV(일반적으로 야생형 Ad5) 또는 해당 헬퍼 유전자를 포함하는 플라스미드로 감염되어 헬퍼 바이러스 단백질을 공급하고 rAAV 입자 생산을 시작한다. 패키징 세포주는 rep 및 cap 유전자만 포함하고 있기 때문에 생산자 세포주와 다르다.
본 발명에 따른 방법은 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 모든 요소를 포함하는 핵산(예를 들어, 플라스미드)을 포유류 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 따라서 플라스미드가 바이러스 패키징 단백질 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하기 때문에 세포는 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하거나 관심 전사본으로 전사되는 서열을 포함하는 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 용해 단계를 포함하는 현재의 '산업 표준' 재조합 AAV 입자 생산 공정과 구별되는 특징을 포함하는 재조합 AAV 바이러스 입자 생산 플랫폼을 제공한다.
보다 일반적으로, AAV 입자의 재조합 생산을 위해 DNA로 형질감염되거나 형질 도입된 세포는 "재조합 세포"라고 지칭할 수 있다. 이러한 세포는 AAV 패키징 단백질과 같은 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산(플라스미드), 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산(플라스미드), 및 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산(플라스미드), 즉, 두 개의 AAV ITR 사이에 배치된 트랜스진의 수용체로 사용되어 왔던 임의의 포유류 세포일 수 있다. 이 용어에는 최초 세포, 즉, 형질도입 또는 형질감염 되어 있는 세포의 자손도 포함된다. 단일 모체 세포의 자손은, 자연적, 우연적 또는 의도적인 돌연변이로 인해, 형태면에서, 또는 게놈 또는 총 핵산 보체면에서 원래 모체와 완전히 동일하지는 않을 수 있다는 것이 알려져 있다.
세포 생존력을 유지하거나 세포 성장 및/또는 증식을 제공하는 데 적합한 다양한 세포 성장 배지가 시중에서 판매되고 있다. 이러한 배지의 예로는 무혈청 진핵 세포 성장 배지, 즉, 포유류(예를 들어, 인간) 세포의 생존력을 유지하거나 성장을 제공하는 배지가 포함된다. 비 제한적 예에는 Ham's F12 또는 F12K 배지(Sigma-Aldrich), FreeStyle (FS) F17 배지(Thermo-Fisher Scientific), MEM, DMEM, RPMI-1640(Thermo-Fisher Scientific) 및 이들의 혼합물이 포함된다. 이러한 배지에 비타민 및/또는 미량 미네랄 및/또는 소금 및/또는 아미노산(예를 들어, 포유류(예를 들어, 인간) 세포에 필수 아미노산)이 보충될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 용해 단계를 사용하여 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법을 제공한다.
이러한 목적을 위해, 세 가지 플라스미드를 포유류 세포에 공동 형질감염시켰다. 트랜스진 플라스미드는 AAV ITR들 사이에서 복제되는 발현 카세트를 인코딩하는 반면, rep 및 cap 유전자는 AAV 복제 및 패키징을 보장하기 위해 두 번째 패키징 플라스미드(rep/cap 플라스미드)를 공동 형질감염시킴으로써 트랜스 형태로 제공된다. 세 번째 플라스미드는 헬퍼 플라스미드라고도 하며, 최소한의 헬퍼 바이러스 인자(일반적으로 아데노바이러스 E2A, EV 및 VA 유전자)를 함유하지만 AAV ITR은 없다.
본 발명의 한 양상은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법이며, 이는
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계;
(ii) 관심 단백질을 인코딩하거나 AAV ITR들 사이에 삽입되는 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii) 하나 이상의 포유류 세포를 상기 제공된 플라스미드와 접촉시키고, 그리고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나; 또는 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여, 핵산을 세포로 도입하는 단계;
(iv) 형질감염된 세포를 배양하는 단계;
(v) 배양된 세포와 배양 배지를 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
(vi) 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계; 및
(vii) 선택적으로 AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양액 용해물로부터 재조합 AAV 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
이에 따라 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는, 방법.
본 발명의 한 양상은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 상기 재조합 AAV 벡터를 포함하는 AAV 입자를 생산하는 방법이며, 이는
(i) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계;
(ii) 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계;
(iii)
(a) 하나 이상의 포유류 세포를 상기 제공된 (i)의 플라스미드와 접촉시키고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여 상기 핵산을 세포로 도입함으로써 안정적으로 형질감염된 세포를 생성하고; 안정적으로 형질감염된 제1 세포를 선택하고; 선택된, 안정적으로 형질감염된 제1 세포를 상기 제공된 (ii)의 플라스미드와 접촉시키고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여 상기 핵산을 세포로 도입하는 단계; 또는
(b) 상기 제공된 (i) 및 (ii)의 플라스미드와 하나 이상의 포유류 세포를 접촉시키고, 그리고 추가로 형질감염 시약을 첨가하고 선택적으로 플라스미드/형질감염 시약/세포 혼합물을 인큐베이션하거나 전류와 같은 물리적 수단을 제공하여, 상기 핵산을 세포로 도입하는 단계;
이에 따라 형질감염 세포를 생성하는 단계;
(iv) (iii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계;
(v) 배양된 세포 및 배양 배지를 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
(vi) 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계; 및
(vii) 선택적으로 AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 포유류 세포 배양액 용해물로부터 재조합 AAV 입자를 단리하는 단계를 포함하고;
이에 따라 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자를 생산하는, 방법.
핵산(플라스미드)을 세포에 도입하는 방법은 여러 가지가 있다.
포유류 세포로 DNA를 전달하는 다양한 방법이 해당 기술 분야에 보고되어 있다. 이 방법들 모두 본 발명에 따른 방법에 유용하다. 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 핵산 전이/형질감염을 위해 전기천공법, 핵감염법 또는 미세주입법이 사용된다. 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서 무기 물질(예를 들어, 인산칼슘/DNA 공침), 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, DEAE-덱스트란) 또는 양이온성 지질(리포펙션)이 핵산 전이/형질감염에 사용된다. 인산칼슘과 폴리에틸렌이민은 대규모 핵산 전이를 위한 형질감염에 가장 흔히 사용되는 시약이며(예를 들어, Baldi 외, Biotechnol. Lett. 29 (2007) 677-684 참고), 그 중에서도 폴리에틸렌이 선호된다.
무혈청 현탁 배양에서 성장시키고 PEI를 형질감염 시약으로 사용하여 형질감염 조건의 효율성과 재현성을 개선하면 쉐이크 플라스크, 파동 또는 교반 탱크 생물 반응기를 사용한 AAV 생산을 손쉽게 확장할 수 있다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 핵산(플라스미드)은 폴리에틸렌이민(PEI)과 조합된, 선택적으로 세포와 조합된 조성물로 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 다음과 같은 다수의 성분들을 갖는 플라스미드/PEI 혼합물을 포함한다: (a) AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드; (b) 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드; 및 (c) 폴리에틸렌이민(PEI) 용액. 특정 실시형태에서, 플라스미드는 몰비 범위가 약 1:0.01 내지 약 1:100이거나, 몰비 범위가 약 100:1 내지 약 1:0.01이며, 성분 (a), (b) 및 (c)의 혼합물은 선택적으로 약 10초 내지 약 4시간의 시기 동안 인큐베이션되었다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 조성물은 세포를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c)의 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 선택적으로 세포와 조합된 조성물은 유리 PEI를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 유리 PEI와 접촉된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c)의 혼합물과 적어도 약 4시간, 또는 약 4시간 내지 약 140시간, 또는 약 4시간 내지 약 96시간 동안 접촉되었다. 한 바람직한 실시형태에서, 세포는 성분 (a), (b) 및/또는 (c)의 혼합물 및 선택적으로 유리 PEI와 적어도 약 4시간 동안 접촉되었다.
본 조성물은 추가 플라스미드 및/또는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드 및 세포는 유리 PEI와 접촉될 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 및/또는 세포는 유리 PEI와 적어도 약 4시간, 또는 약 4시간 내지 약 140시간, 또는 약 4시간 내지 약 96시간 동안 접촉되었다.
본 발명에 따른 방법은 또한 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 그리하여, 상기 방법은 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 플라스미드를 PEI 용액과 혼합하여 플라스미드/PEI 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 혼합물은 약 10초에서 약 4시간 범위의 기간 동안 인큐베이션된다. 이러한 방법에서는 세포를 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉시켜 플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하고; 그 후 생성된 플라스미드/PEI 세포 배양물에 유리 PEI를 첨가하여 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하고; 그 후 생성된 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 배양하여 형질감염된 세포를 생산한다. 특정 실시형태에서, 플라스미드는 rep 오픈 리딩 프레임, cap 오픈 리딩 프레임, E1A, E1B, E2 및 E4orf6 오픈 리딩 프레임 중 하나 이상 또는 전부 및 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생산하는 형질감염된 세포를 생산하는 단계를 포함하는데, 여기에는 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계; 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 전술한 플라스미드를 PEI 용액과 혼합하여(여기서 플라스미드는 몰비 범위가 약 1:0.01 내지 약 1:100이거나, 몰비 범위가 약 100:1 내지 약 1:0.01임), 플라스미드/PEI 혼합물을 생산하는 단계(그리고 선택적으로 플라스미드/PEI 혼합물을 약 10초 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 인큐베이션하는 단계); 포유류 세포를 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉시켜 플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하는 단계; 생산된 플라스미드/PEI 세포 배양물에 유리 PEI를 첨가하여 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하는 단계; 및 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션하는 단계가 포함되며, 이에 의해 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 생산하는 형질감염된 세포를 생산함으로써, 포유류 세포가 본 발명에 따른 방법으로 수득되었다.
또한, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 AAV 입자를 생산하는 방법이 제공되는데, 여기에는 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 제공하는 단계; 관심 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드를 제공하는 단계; 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 전술한 플라스미드를 PEI 용액과 혼합하여(여기서 플라스미드는 몰비가 약 1:0.01 내지 약 1:100이거나, 몰비가 약 100:1 내지 약 1:0.01임), 플라스미드/PEI 혼합물을 생산하는 단계(및 선택적으로 플라스미드/PEI 혼합물을 약 10초 내지 약 4시간 범위의 기간 동안 인큐베이션하는 단계); 설명된 바와 같이 생산된 플라스미드/PEI 혼합물과 포유류 세포를 접촉시켜 플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하는 단계; 설명된 바와 같이 생산된 플라스미드/PEI 세포 배양물에 유리 PEI를 첨가하여 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 생산하는 단계; 플라스미드/PEI 세포 배양물 또는 생산된 유리 PEI/플라스미드/PEI 세포 배양물을 적어도 약 4시간 동안 인큐베이션하여 형질감염 세포를 생산하는 단계; 생산된 형질감염 세포 및/또는 생산된 형질감염 세포로부터 배양 배지를 수확하여 배양액을 생산하는 단계; 본 발명에 따른 방법으로 세포를 용해하고, 선택적으로 AAV 친화성 크로마토그래피 단계를 통해 배양액 용해물로부터 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 단리하는 단계; 그리하여 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터 또는 입자를 생산하는 단계가 포함된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, PEI는 다양한 시점에서 플라스미드 및/또는 세포에 첨가된다. 특정 실시형태에서, 유리 PEI는 플라스미드/PEI 혼합물을 세포와 접촉시키기 전, 동시에, 또는 이후에 세포에 첨가된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 세포는 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 및/또는 유리 PEI와 접촉될 때 특정 밀도 및/또는 세포 성장 단계 및/또는 생존력으로 존재한다. 한 바람직한 실시형태에서, 세포는 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 및/또는 유리 PEI와 접촉될 때 약 1*10^5개 세포/mL 내지 약 1*10^8개 세포/mL 범위의 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 세포의 생존력은 약 60%이거나 또는 60% 보다 크거나, 또는 세포가 플라스미드/PEI 혼합물과 접촉될 때 대수기 성장에 있거나, 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 세포의 생존력은 약 90%이거나 90% 보다 크거나, 또는 세포가 플라스미드/PEI 혼합물 또는 유리 PEI와 접촉될 때 대수기 성장에 있다.
PEI 외에도, 발프로산(VPA)을 사용하여 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다. VPA는 분지형 단쇄 지방산으로 히스톤 탈아세틸화효소의 활성을 억제한다. 이러한 이유로, 포유류 세포 배양물에 재조합 단백질 생산의 인핸서로서 일반적으로 첨가된다.
인코딩된 AAV 패키징 단백질은, 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, AAV rep 및/또는 AAV cap을 포함한다. 이러한 AAV 패키징 단백질은 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서 임의의 AAV 혈청형의 AAV rep 및/또는 AAV cap 단백질을 포함한다.
인코딩된 헬퍼 단백질은 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서 아데노바이러스 E1A 및 E1B, 아데노바이러스 E2 및/또는 E4, VA RNA 및/또는 비-AAV 헬퍼 단백질을 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 핵산(플라스미드)은 특정한 양 또는 비율로 사용된다. 특정 실시형태에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 및 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드의 총량은 세포 1mL당 약 0.1 μg 내지 약 15 μg 범위이다. 특정 실시형태에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 및 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 플라스미드의 몰비는 약 1:5 내지 약 1:1 범위이거나 약 1:1 내지 약 5:1 범위이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 제1 플라스미드는 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 제2 플라스미드는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산을 포함하는 플라스미드 대 AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 플라스미드 대 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 플라스미드의 몰비 범위는 공동 형질감염에서 약 1-5: 1: 1, 또는 1: 1-5: 1, 또는 1: 1: 1-5이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 한 바람직한 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포이다.
배양은 일반적으로 진핵세포 배양에 사용되는 조건인 약 37℃, 95% 습도 및 8 부피% CO2를 이용하여 수행될 수 있다. 배양은 혈청이 함유된 배지 또는 무혈청 배지에서, 부착 배양물에서 또는 현탁 배양물에서 수행될 수 있다. 현탁 배양은, 예를 들어, 교반 탱크 반응기, 파동 반응기, 로킹 생물 반응기, 쉐이커 용기 또는 스피너 용기 또는 소위 롤러 병과 같은 임의의 발효 용기에서 수행할 수 있다. 형질감염은 각각 고처리량 형식 및 스크리닝 형식, 예를 들어, 96웰 또는 384웰 형식으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 임의의 혈청형의 AAV 입자 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 재조합 AAV 입자는 AAV 혈청형 1-12, AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 변형된 또는 변이체 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 야생형 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, AAV 입자는 AAV 혈청형 또는 AAV 유사형을 포함하며, 여기서 AAV 유사형은 ITR 혈청형과 다른 AAV 캡시드 혈청형을 포함한다.
AAV 벡터 또는 입자를 제공하거나 포함하는 본 발명에 따른 방법은 또한 다른 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소의 예에는, 인트론, 발현 제어 요소, 하나 이상의 아데노 관련 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복부(ITR) 및/또는 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 요소는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산 내부에 존재하거나 핵산에 연접될 수 있거나, 발현 제어 요소는 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있거나, AAV ITR은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산의 5' 또는 3' 말단에 연접될 수 있거나, 또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질을 인코딩하거나 관심 전사본으로 전사되는 핵산의 5' 또는 3' 말단에 연접할 수 있다.
발현 제어 요소에는 조직 특이적 발현 제어 요소나 프로모터와 같은 항시적인 또는 조절가능한 조절 요소가 포함된다.
ITR은 AAV2 또는 AAV6 또는 AAV8 또는 AAV9 혈청형 중 어느 하나이거나 이들의 조합일 수 있다. AAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11, AAV-2i8, AAV rh74 또는 AAV 7m8 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질 중 어느 하나에 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함할 수 있거나, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11, AAV-2i8, AAV rh74 및 AAV 7m8 AAV 혈청형 중 어느 하나에서 선택된 변형 또는 변이체 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제시된 바와 같이 재조합 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 생산한 후, 필요에 따라 다양한 기존 방법을 사용하여 바이러스(예를 들어, rAAV) 입자를 숙주 세포로부터 정제 및/또는 단리할 수 있다. 이러한 방법에는 컬럼 크로마토그래피, CsCl 구배, 요오딕사놀 구배 등이 포함된다.
예를 들어, 음이온 교환 컬럼, 친화성 컬럼 및/또는 양이온 교환 컬럼을 통한 정제와 같은 다수의 컬럼 정제 단계가 사용될 수 있다. (예를 들어, WO 02/12455 및 US 2003/0207439 참고). 대안적으로, 또는 이에 추가하여, 요오딕사놀 또는 CsCl 구배 단계를 사용할 수 있다(예를 들어, US 2012/0135515; 및 US 2013/0072548 참고). 또한, 감염성 바이러스를 사용하여 패키징 및/또는 헬퍼 단백질을 발현하는 경우, 다양한 방법을 사용하여 잔류 바이러스를 불활성화할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 대략 60℃의 온도까지 예를 들어, 20분 이상 가열하여 불활성화될 수 있다. AAV는 열에 안정한 반면 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하기 때문에 이 치료법은 헬퍼 바이러스를 효과적으로 불활성화시킨다.
rAAV 벡터 생산 및 정제 시스템의 목적은 단백질, 핵산, 및 벡터 관련 불순물(야생형/유사 야생형 AAV 종(wtAAV) 및 AAV에 캡슐화된 잔류 DNA 불순물 포함)과 같은 생산 관련 불순물의 생성을 최소화/조절하는 전략을 구현하는 것이다.
rAAV 입자가 바이오매스의 아주 작은 일부에 불과하다는 점을 고려하면, rAAV 입자는 임상적 인간 유전자 치료 제품으로 사용될 수 있는 순도 수준까지 정제되어야 한다(예를 들어, Smith PH, 외, Mo. Therapy 7 (2003) 8348; Chadeuf G., et al, Mo. Therapy 12 (2005) 744; CHMP 유전자 치료 전문가 그룹 회의 보고서, European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005, 183989/2004).
초기 단계로서, 일반적으로 rAAV 입자를 생산하는 배양 세포를 수확하고, 선택적으로 이와 함께 rAAV 입자를 생산하는 세포(현탁액 또는 부착액)가 배양되었던 세포 배양 상층액(배지)을 수확한다. 수확된 세포 및 선택적으로 세포 배양 상층액은 그대로 사용하거나, 적절한 경우 용해하거나 농축하여 사용할 수 있다. 또한, 감염을 이용하여 헬퍼 기능을 발현시키는 경우, 잔류 헬퍼 바이러스를 불활성화할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 예를 들어, 20분 이상 대략 60℃의 온도까지 가열하면 불활성화될 수 있고, 이 경우 헬퍼 바이러스만 불활성화되는데, AAV는 열에 안정한 반면 헬퍼 아데노바이러스는 열에 불안정하기 때문이다.
수확된 배양액 내의 세포는 본 발명에 따른 방법에 의해 용해되어 rAAV 입자를 방출한다. 세포 용해 중에 또는 세포 용해 이후에 예를 들어, 벤조나제와 같은 뉴클레아제를 첨가하여 오염된 DNA를 분해한다. 일반적으로 생성된 용해물은 세포 파편을 제거하기 위해 예를 들어, 여과 또는 원심분리를 통해 정제되어 정제된 세포 용해물이 된다. 특정한 예에서, 용해물은 마이크론 직경 기공 크기의 필터(예를 들어, 0.1-10.0 μm 기공 크기 필터, 예를 들어, 0.45 μm 및/또는 기공 크기 0.2 μm 필터)로 여과되어 정제된 용해물을 생산한다.
이러한 용해물(선택적으로 정제됨)은 AAV 입자(rAAV 벡터 및 빈 캡시드 포함) 및 생산/공정 관련 불순물(예를 들어, 숙주 세포의 가용성 세포 성분, 즉, 세포 단백질, 지질 및/또는 핵산 및 세포 배양 배지 성분을 포함할 수 있음)을 함유한다. 선택적으로 정제된 용해물은 크로마토그래피를 사용하여 불순물로부터 AAV 입자(rAAV 벡터 포함)를 정제하는 정제 단계를 거친다. 정제된 용해물은 첫 번째 크로마토그래피 단계 전에 적절한 완충액으로 희석하거나 농축할 수 있다.
세포 용해, 선택적 정제 및 선택적 희석 또는 농축 후, 여러 가지 후속적이고 순차적인 크로마토그래피 단계를 거쳐 rAAV 입자를 정제할 수 있다.
첫 번째 크로마토그래피 단계는 바람직하게는 AAV 친화성 크로마토그래피 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피 단계이다.
첫 번째 크로마토그래피 단계가 친화성 크로마토그래피인 경우 두 번째 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 크로마토그래피가 될 수 있다. 따라서, 모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피 또는/및 양이온 교환 크로마토그래피 또는/및 크기 배제 크로마토그래피를 통한 정제가 임의의 순서 또는 순서 또는 조합으로 이루어진다.
예를 들어, 하류 공정 중에 빈 캡시드를 채워진 캡시드로부터 제거하는 것은 음이온 교환 크로마토그래피에서 이들의 등전점(pI)이 다르다는 사실에 기반한 것이다. 모든 혈청형에 걸쳐 계산된 평균 pI는 채워진 캡시드의 경우 5.9이고 빈 캡시드의 경우 6.3이다(Venkatakrishnan, B. 외, J. Virol. 87 (2013) 4974-4984).
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제, 이후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통한 정제가 이루어진다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자 정제는 친화성 크로마토그래피를 통한 다음, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통한 정제, 이후 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제가 이루어진다.
양이온 교환 크로마토그래피는 친화성 또는 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 용해물 및/또는 컬럼 용출액에 존재하는 세포 및 기타 성분으로부터 AAV 입자를 분리하는 기능을 한다. 넓은 pH 범위에서 rAAV 입자를 결합할 수 있는 강력한 양이온 교환 수지의 예에는, 제한 없이, 술포네이트 작용기의 존재로 나타나는 임의의 술폰산 기반 수지가 포함되며, 여기에는 아릴 및 알킬 치환 술포네이트, 예를 들어, 술포프로필 또는 술포에틸 수지가 포함된다. 대표적인 매트릭스에는 POROS HS, POROS HS 50, POROS XS, POROS SP 및 POROS S(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA에서 구입 가능한 강력한 양이온 교환제)가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 예에는 Capto S, Capto S ImpAct, Capto S ImpRes(GE Healthcare, Marlborough, MA, USA에서 구입가능한 강력한 양이온 교환제) 및 Aldrich Chemical Company(Milliwaukee, WI, USA)에서 구입가능한 시판 DOWEX®, AMBERLITE®, 및 AMBERLYST® 수지 제품군이 포함된다. 약한 양이온교환 수지에는 카르복실산 기반 수지가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 양이온교환 수지에는 카르복시메틸(CM), 인산(인산 작용기 기반), 메틸 술포네이트(S) 및 술포프로필(SP) 수지가 포함된다.
음이온 교환 크로마토그래피는 친화성 또는 양이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 용해물 및/또는 컬럼 용출액에 존재하는 단백질, 세포 및 기타 성분으로부터 AAV 입자를 분리하는 기능을 한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 용출액 내 빈 캡시드의 양을 줄이고 제어하는 데에도 사용할 수 있다. 예를 들어, rAAV 입자가 결합된 음이온 교환 컬럼은 적당한 농도(예를 들어, 약 100-125 mM, 예를 들어, 110-115 mM)의 NaCl을 포함하는 용액으로 세척할 수 있으며, 빈 캡시드의 일부는 rAAV 입자의 실질적인 용출 없이 유동(flow through) 중에 용출될 수 있다. 이어서, 음이온 교환 컬럼에 결합된 rAAV 입자는 더 높은 농도(예를 들어, 약 130-300 mM NaCl)의 NaCl을 포함하는 용액을 사용하여 용출될 수 있으며, 이를 통해 빈 캡시드의 양은 감소되거나 고갈되고 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자의 양은 비례적으로 증가한 컬럼 용출액을 생산할 수 있다.
대표적인 음이온 교환 수지에는 폴리아민 수지 및 기타 수지를 기반으로 한 것들이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 강력한 음이온 교환 수지의 예에는 일반적으로, 예를 들어, 트리알킬벤질 암모늄 수지와 같은 4차 암모늄염 수지를 비롯한(이에 제한되는 것은 아님) 4차화된 질소 원자를 기반으로 하는 수지가 포함된다. 적합한 교환 크로마토그래피 물질에는, 제한 없이, MACRO PREP Q(BioRad, Hercules, CA, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제); UNOSPHERE Q(BioRad, Hercules, CA, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제); POROS 50HQ(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제); POROS XQ(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제); POROS SOD(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA에서 구입가능한 약한 음이온 교환제); POROS 50PI(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA에서 구입가능한 약한 음이온 교환제); Capto Q, Capto XQ, Capto Q ImpRes, 및 SOURCE 30Q(GE healthcare, Marlborough, MA, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제); DEAE SEPHAROSE(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA에서 구입가능한 약한 음이온 교환제); Q SEPHAROSE(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA에서 구입가능한 강력한 음이온 교환제)가 포함된다. 추가적인 대표적인 음이온 교환 수지에는 아미노에틸(AE), 디에틸아미노에틸(DEAE), 디에틸아미노프로필(DEPE) 및 4차 아미노에틸(QAE)이 포함된다.
인간 질환을 치료하기 위한 제품으로 의도된 재조합 AAV 입자를 정제하는 제조 공정은 다음과 같은 목표를 달성해야 한다: 1) 일관된 입자 순도, 효능 및 안전성; 2) 제조 공정 확장성; 및 3) 허용 가능한 제조 비용.
재조합 AAV 입자 정제를 위한 예시적인 프로세스는 WO 2019/006390에 보고되어 있다.
아래에 설명된 재조합 아데노 관련 바이러스 입자(rAAV 입자) 정제 및 생산 방법은 대규모로 확장 가능하다. 예를 들어, 5, 10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500리터 또는 그 이상의 부피의 현탁 배양액이다. 재조합 아데노 관련 바이러스 입자 정제 및 생산 방법은 다양한 AAV 혈청형/캡시드 변이체에 적용 가능하다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자의 정제는:
a) 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포와 rAAV 입자를 포함하는 세포 배양 상층액을 수확하여 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
b) 선택적으로 (a) 단계에서 생산된 수확물을 농축시켜 농축된 포유류 세포 배양액을 생산하는 단계;
c) 단계 (a)에서 생산된 포유류 세포 배양액 또는 단계 (b)에서 생산된 농축된 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 상기 배양액에 포함된 포유류 세포를 용해하여 포유류 세포 배양액 용해물을 생산하는 단계;
d) 단계 (c)에서 생산된 용해물을 용해물 내에서 오염 핵산이 감소하도록 처리하여 핵산 감소된 용해물을 생산하는 단계;
e) 선택적으로 단계 (d)에서 생산된 핵산 감소된 용해물을 여과하여 정제 용해물을 생산하고, 선택적으로 정제된 용해물을 희석하여 희석된 정제 용해물을 생산하는 단계;
f) 단계 (d)에서 수득된 핵산 감소된 용해물, 또는 단계 (e)에서 생산된 정제 용해물 또는 희석된 정제 용해물을 AAV 친화성 컬럼 크로마토그래피 처리하여 재조합 AAV 입자를 포함하는 컬럼 용출액을 생산하고, 이에 따라 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 상기 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 컬럼 용출액을 생산하는 단계를 포함하고;
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하는, 방법.
특정 실시형태에서, 단계 (a) 내지 (f)는 유지되고 다음 단계와 조합되며:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 농축된 컬럼 용출액을 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(SEC) 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제2 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 선택적으로 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계; 및
i) 단계 (g)에서 생산된 제2 컬럼 용출액 또는 희석된 제2 컬럼 용출액을 여과하거나, 단계 (h)에서 생산된 제3 컬럼 용출액 또는 농축된 제3 컬럼 용출액을 여과하는 단계,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제한다.
특정 실시형태에서, 단계 (a) 내지 (f)는 유지되고 다음 단계와 조합되며:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 상기 컬럼 용출액을 희석하여 희석된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 단계 (g)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제한다.
특정 실시형태에서, 단계 (a) 내지 (g)는 유지되고 다음 단계와 조합되며:
g) 단계 (f)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제2 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제2 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제2 컬럼 용출액을 생산하는 단계;
h) 단계 (g)에서 생산된 컬럼 용출액 또는 희석된 컬럼 용출액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 처리하여 rAAV 입자를 포함하는 제3 컬럼 용출액을 생산함으로써 rAAV 입자를 단백질 불순물 또는 기타 생산/공정 관련 불순물로부터 분리하고, 선택적으로 제3 컬럼 용출액을 농축하여 농축된 제3 컬럼 용출액을 생산하는 단계,
이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (b) 및/또는 단계 (f) 및/또는 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 농축은 초여과/정용여과, 예를 들어, 접선 유동 여과(TFF)를 통해 이루어진다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (b)의 농축은 수확된 세포와 세포 배양 상층액의 부피를 약 2-20배 감소시킨다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (f) 및/또는 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 농축은 컬럼 용출액의 부피를 약 5-20배 감소시킨다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (d)는 뉴클레아제를 처리하여 오염 핵산을 감소시키는 단계를 포함한다. 뉴클레아제의 비제한적인 예에는 벤조나제가 포함된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (e)의 정제된 용해물 또는 희석된 정제된 용해물의 여과는 필터를 통해 이루어진다. 필터의 비제한적 예는 약 0.1과 10.0 마이크론 사이(끝점 포함)의 기공 직경을 갖는 필터이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (e)의 정제된 용해물의 희석은 완충된 인산염, 아세트산염 또는 Tris 수용액을 사용하여 이루어진다. 용액 pH의 비제한적 예는 약 pH 4.0과 pH 7.4 사이이다. Tris 용액 pH의 비제한적 예는 pH 7.5 초과, 예를 들어, 약 pH 8.0과 pH 9.0 사이(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g)의 두 번째 컬럼 용출액 또는 단계 (h)의 세 번째 컬럼 용출액을 완충된 인산염, 아세트산염 또는 Tris 수용액으로 희석한다. 용액 pH의 비제한적 예는 약 pH 4.0과 pH 7.4 사이이다. Tris 용액 pH의 비제한적 예는 pH 7.5 초과, 예를 들어, 약 pH 8.0과 pH 9.0 사이(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (i)에서 생성된 rAAV 입자는 계면활성제와 함께 제형화되어 rAAV 입자 제형을 생산한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모듈화된 컬럼 크로마토그래피를 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 컬럼으로부터 rAAV 입자를 용출하기 전에 PEG 용액으로 세척된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, PEG는 약 1,000 g/mol 내지 80,000 g/mol 범위의 평균 분자량을 갖는다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, PEG의 농도는 약 4% 내지 약 10%(w/v) (끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 입자를 용출하기 전에 계면활성제 수용액으로 세척된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 단계 (h)의 양이온 교환 컬럼은 컬럼으로부터 rAAV 입자를 용출하기 전에 계면활성제 용액으로 세척된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, PEG 용액 및/또는 계면활성제 용액은 수성 Tris-HCl/NaCl 완충액, 수성 인산염/NaCl 완충액, 또는 수성 아세트산염/NaCl 완충액을 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 완충액 또는 용액 내의 NaCl 농도는 범위가 약 20-300 mM NaCl(끝점 포함) 또는 약 50-250 mM NaCl(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 계면활성제는 양이온성 또는 음이온성 계면활성제를 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 계면활성제는 12개 탄소 사슬 계면활성제를 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 계면활성제는 도데실트리메틸암모늄 클로라이드(DTAC) 또는 사르코실(Sarkosyl)을 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 수용성 Tris-HCl/NaCl 완충액을 이용하여 단계 (f), (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼으로부터 용출된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, Tris-HCl/NaCl 완충액은 100-400 mM NaCl(끝점 포함)을 포함하며, 선택적으로 pH 범위는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼은 수용성 Tris-HCl/NaCl 완충액으로 세척된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 수용성 Tris-HCl/NaCl 완충액의 NaCl 농도는 범위가 약 75-125 mM(끝점 포함)이다.
모든모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 수용성 Tris-HCl/NaCl 완충액은 pH가 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.0(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼은 2번째 또는 3번째 컬럼 용출액에서 빈 캡시드의 양을 감소시키기 위해 1회 이상 세척된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 음이온 교환 컬럼 세척은 rAAV 입자 용출 전 및/또는 rAAV 입자 용출 대신 컬럼으로부터 빈 캡시드를 제거함으로써, 두 번째 또는 세 번째 컬럼 용출액에서 빈 캡시드의 양을 감소시킨다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 음이온 교환 컬럼 세척은 rAAV 입자 용출 전 및/또는 rAAV 입자 용출 대신 컬럼으로부터 총 빈 캡시드 중 적어도 약 50%를 제거함으로써, 두 번째 또는 세 번째 컬럼 용출액에서 빈 캡시드의 양을 약 50% 감소시킨다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 수용성 Tris-HCl/NaCl 완충액의 NaCl 농도는 범위가 약 110-120 mM(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 용출되는 rAAV 입자와 빈 캡시드의 비율 및/또는 양은 세척 완충액에 의해 제어된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 수용성 인산염/NaCl 완충액, 또는 수용성 아세트산/NaCl 완충액에서 단계 (g) 또는/및 (h)의 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된다. 완충액의 비 제한적 NaCl 농도 범위는 약 125-500 mM NaCl(끝점 포함)이다. 완충액 pH의 비제한적 예는 약 pH 5.5 내지 pH 7.5 사이이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)의 음이온 교환 컬럼은 4차화된 폴리에틸렌이민과 같은 4차 암모늄 작용기를 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 크기 배제 컬럼(SEC)은 분리/분획 범위(분자량)가 약 10,000g/mol 내지 약 600,000g/mol(끝점 포함)이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (g) 또는/및 (h)의 양이온 교환 컬럼은 숲폰산 또는 술포프로필과 같은 작용기를 포함한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, AAV 친화성 컬럼은 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 단백질 또는 리간드를 포함한다. 단백질의 비제한적인 예에는 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 항체가 포함된다. 보다 구체적이고 비제한적인 예에는 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 단일 사슬 라마 항체(카멜리드)가 포함된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 상기 방법은 염화세슘 농도 구배 초원심분리 단계를 제외한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 상기 방법은 단일 AAV 친화성 컬럼 정제에 의해 생산 또는 정제된 rAAV 입자보다 더 높은 순도를 갖는 rAAV 입자를 생산한다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 단계 (c) 및 (d)는 실질적으로 동시에 수행된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, NaCl 농도는 단계 (c) 이후 단계 (f) 이전에 약 100-400 mM NaCl 범위(끝점 포함)로, 또는 약 140-300 mM NaCl 범위(끝점 포함)로 조정된다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 세포는 현탁 성장 세포 또는 부착 성장 세포이다.
모든 양상 및 실시형태 중 특정 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 비제한적인 예에는 HEK 세포, 예를 들어, HEK-293 세포, 및 CHO 세포, 예를 들어, CHO-K1 세포가 포함된다.
트랜스진을 포함하는 rAAV 입자의 감염 역가를 결정하는 방법은 해당 기술 분야에 공지이다(예를 들어, Zhen 외, Hum. Gene Ther. 15 (2004) 709 참고). 패키징된 트랜스진이 있는 빈 캡시드 및 rAAV 입자를 검정하는 방법은 공지이다(예를 들어, Grimm 외, Gene Therapy 6 (1999) 1322-1330; Sommer 외, Malec. Ther. 7 (2003) 122-128 참고).
분해/변성된 캡시드의 존재 또는 양을 확인하기 위해, 정제된 rAAV 입자를 세 가지 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 겔, 예를 들어, 구배 겔로 이루어진 겔로 구성된 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 처리한 다음, 샘플이 분리될 때까지 겔을 흐르게 한 후, 겔을 나일론이나 니트로셀룰로스 막에 블롯팅할 수 있다. 그런 다음 항-AAV 캡시드 항체는 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 1차 항체로서 사용된다(예를 들어, Wobus 외, J. Viral. 74 (2000) 9281-9293 참고). 1차 항체에 결합하는 2차 항체에는 1차 항체를 검출하는 수단이 포함되어 있다. 1차 항체와 2차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 검출하여 캡시드의 양을 결정한다. 또 다른 방법으로는 SEC 컬럼을 사용한 분석용 HPLC나 분석용 초원심분리기가 있다.
발명의 구체적인 실시형태에 대한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 재조합 AAV 입자의 회수, 즉, 회수율(캡시드 기반 수율 및 게놈 기반 수율 모두)이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
본 발명은 또한 적어도 부분적으로, AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득된 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율이 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해하는 데 사용된 세제에 따라 영향을 받거나 달라진다는 발견에 기반한다.
AAV 친화성 크로마토그래피 단계 전에 재조합 AAV 입자를 생산한 세포를 용해시키기 위해 알킬 폴리글루코사이드 세제를 사용함으로써, 채워진 재조합 AAV 입자의 (캡시드 기반 및 게놈 기반) 수율 및 빈 재조합 AAV 입자에 대한 비율을 모두 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 방법은 알킬 폴리글루코사이드 세제의 한 예로서 Triton CG 110을 사용하여 다음과 같이 예시되어 있다. 이는 발명 개념의 예시로만 제시되며 제한으로 해석되어서는 안 된다. 마찬가지로, 다른 알킬 폴리글루코사이드 세제도 사용할 수 있다. 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다.
더 자세히 말하면, AAV 친화성 크로마토그래피에서 절대 AAV 입자 회수율을 현재의 "최적 표준(gold-standard)"인 Triton X-100(폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 있는 p-tert 옥틸페놀 유도체)에 비해 5% 이상 증가시키는 것은, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 한 예로 Triton CG 110을 사용함으로써 달성될 수 있다, 즉, 세포를 용해하는 데 Triton CG 110을 사용했을 때 절대 회수율이 76%인 반면, 세포를 용해하는 데 Triton X-100을 사용했을 때 절대 회수율은 72%이다.
본 방법은 재조합 AAV 입자의 대량 생산을 목적으로 하므로, AAV 입자 회수율에서 상대적 수율이 조금만 증가하더라도 절대 수율이 크게 증가하므로 이점이 있다.
AAV 입자의 절대 회수율이 증가함과 동시에 AAV 친화성 크로마토그래피 용출액에서 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율이 AAV 친화성 크로마토그래피 물질에 적용된 용출액에서의 비율보다 증가했다.
더 자세히 말하면, Triton CG 110을 알킬 폴리글루코사이드 세제의 한 예로 사용한 AAV 친화성 크로마토그래피에서 현재의 "최적 표준"인 Triton X-100에 비해 60% 이상의 게놈 회수 증가를 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다, 즉, Triton CG 110을 사용하여 세포를 용해했을 때 절대 게놈 수율이 mL당 4.7 x 1E11개 바이러스 게놈(vg/mL)이며, 이에 비해 Triton X-100을 사용하여 세포를 용해했을 때 절대 게놈 수율은 mL당 2.8 x 1E11개 바이러스 게놈(vg/mL)이다. 또한 Triton CG 110 용해 배양액의 AAV 친화성 크로마토그래피 용출액에서 총 바이러스 입자 수율은 Triton X-100 용해 배양액에 비해 50% 이상 증가했다, 즉, Triton CG 110을 사용하여 세포를 용해했을 때 절대 입자 수율은 mL당 1.2 x 1E13개 바이러스 입자(vp/mL)이며, 이에 비해 Triton X-100을 사용하여 세포를 용해했을 때 절대 입자 수율은 mL당 0.77 x 1E13개 바이러스 입자(vp/mL)이다.
게놈 수율의 증가가 총 바이러스 입자 수율의 증가보다 높으므로 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율이 증가한다.
해당 데이터는 다음 표에 제시되어 있다:
따라서, 본 발명은 알킬 폴리글루코사이드 세제의 한 예로서 Triton CG 110을 사용하여 재조합 AAV 입자를 생산하는 세포를 용해하는 것이 채워진 재조합 AAV 입자의 회수율을 증가시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다.
Triton CG 110 최종 농도와 용해 시간(Triton CG 110의 존재시 인큐베이션 시간)의 다양한 조합을 삼중 PEI 매개 형질감염 후 72시간 후에 수득한 동일한 배양액의 일부를 사용하여 소규모 실험에서 테스트하였다.
Triton CG 110의 최종 농도가 1% (v/v)일 때 약 60분의 인큐베이션 시간이 가장 좋은 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 알킬 폴리글루코사이드 세제인 Triton CG 110으로 인큐베이션한 후, 약 20분 동안 규조토로 인큐베이션하면 이는 더더욱 개선될 수 있다. 이는 본 발명의 바람직한 실시형태이다.
해당 데이터는 다음 표에 제시되어 있다.
포유류 HEK293 세포는 재조합 AAV 입자 생산에 필요한 플라스미드, 즉, 트랜스진 포함 플라스미드(트랜스진 플라스미드), AAV 패키징 단백질을 인코딩하는 플라스미드(rep/cap 플라스미드) 및 HEK293 세포에 이미 포함되어 있지 않은 필요한 AAV 헬퍼 기능을 포함하는 플라스미드(헬퍼 플라스미드)를 사용하여 형질감염되었다.
더 자세히 말하면, 재조합 AAV 입자를 생산하기 위해 사전 배양된 HEK293 세포를 F17 배지를 사용하여 회분식 공정으로 파동 생물 반응기(작업 부피 10L)에서 배양하였고, 시작 세포 밀도는 대략 1E6개 세포/ml였다.
생물반응기 접종 후 몇 시간 후에 3가지 플라스미드(헬퍼 플라스미드, 트랜스진 플라스미드, rep/cap 플라스미드)를 이용한 PEI(폴리에틸렌이민) 매개 형질감염이 수행되었다. 총 DNA 양은 접종 후 세포 밀도(1 μg DNA/E6 세포)를 기준으로 계산되었다. 세 가지 플라스미드의 몰비는 1:1:1이었다. 형질감염 시약은 플라스미드 1 μg 당 2 μg의 양으로 사용되었다.
배양은 온도 37℃, 습도 70%, pCO2 5%, 교반기 속도 30-35 rpm에서, 산소 및 pH 제어 없이 수행되었다. 통기는 대략 500ml/분의 흐름의 공기를 사용하여 수행되었다. 배양은 형질감염 후 72시간 후에 종료되었다.
또 다른 대체 공정에서, HEK 세포를 약 15 x 1E5개 세포/ml의 시작 세포 밀도로 사료와 포도당을 첨가하는 4일간의 유가식 배양 방법으로 배양할 수 있다.
3가지 플라스미드(헬퍼 플라스미드, 트랜스진 플라스미드, rep/cap 플라스미드)를 이용한 PEI(폴리에틸렌이민) 매개 형질감염은 접종 24시간 후에 수행될 수 있다. 먼저, 배양액에 20 % v/v의 신선한 배지를 첨가한다. 이어서, 형질감염 혼합물을 준비하여 배양액에 첨가한다. 총 DNA 농도는 3 μg/mL이고 세 가지 플라스미드의 몰비는 1:1:1이다. 형질감염 시약은 플라스미드 1 μg 당 2.5 μg 농도로 사용되고, 유리 PEI는 배양액 부피 1ml 당 1.5 μg 농도로 첨가된다.
예를 들어, Xell AG의 HEK FS 사료 보충제와 같은 사료는 발효 2일차(형질감염 24시간 후)에 볼루스 사료로 첨가된다. 포도당은 발효 1일차와 3일차에 볼루스 사료로 첨가된다. pH 값은 CO2와 1 M Na2CO3를 각각 첨가하여 0.05 pH 단위 내에서 조정된다. 필요한 경우 소포제가 첨가된다. 이 과정에서, 온도, pH 값, pO2 등의 매개변수가 모니터링되고 제어된다. 발효 과정은 4일차(삼중 형질감염 후 72시간)에 용해 완충액을 첨가하여 중단된다.
***
본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.
***
다음의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 제시된 절차에서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
물질
세포주
시중에서 구입가능한 HEK293 세포는 3개의 플라스미드를 이용한 일시적 형질감염을 통해 AAV 입자를 생산하는 데 사용되었다.
배양 물질
배양 배지는 공급업체의 사용 지침에 따라 준비되었다(HEK ViP NB 분말 배지, Xell AG). HEK FS 사료(Xell AG) 및 F17 배지는 바로 사용할 수 있도록 구매했다. 배지와 사료는 4℃의 암실에서 보관하였으며, 제조업체의 지시에 따라 섭취하였다. 교정제는 실온(포도당 용액; 탄산나트륨 용액; 소포제 용액)에서 보관하였다.
실시예 1
HEK293 세포의 배양 및 재조합 AAV 입자의 생산
일반적으로, 배양 방법은 표준 프로토콜(예를 들어, Lindl, T., "Zell- und Gewebekultur: Einfuhrung in die Grundlagen sowie ausgewahlte Methoden und Anwendungen", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, 2002) 및 해당 공급업체의 사용 지침으로부터 조정되었다.
사전 배양
HEK 세포를 해동하여 37℃, 습도 70%, pCO2 5%, 및 진탕 빈도 120rpm의 진탕 플라스크에서 2 내지 3주 동안 배양 배지에서 증식시켰다. 세포는 3 내지 4일마다 분열되어 생산 배양에 필요한 접종량까지 배지에서 증식되었다.
생산 배양
재조합 AAV 입자를 생산하기 위해 사전 배양된 HEK293 세포를 F17 배지를 사용하여 회분식 공정으로 파동 생물 반응기(작업 부피 10L)에서 배양하였고, 시작 세포 밀도는 10 x E5개 세포/ml였다.
생물반응기 접종 후 몇 시간 후에 3가지 플라스미드(헬퍼 플라스미드, 트랜스진 플라스미드, rep/cap 플라스미드)를 이용한 PEI(폴리에틸렌이민) 매개 형질감염이 수행되었다. 총 DNA 양은 접종 후 세포 밀도(1 μg DNA/E6 세포)를 기준으로 계산되었다. 세 가지 플라스미드의 몰비는 1:1:1이었다. 형질감염 시약은 플라스미드 1 μg 당 2 μg 양의 DNA가 포함된 PEIpro(Polyplus)였다.
배양은 온도 37℃, 습도 70%, pCO2 5%, 교반기 속도 30-35 rpm에서, 산소 및 pH 제어 없이 수행되었다. 통기는 대략 500ml/분의 흐름의 공기를 사용하여 수행되었다. 배양은 형질감염 후 72시간 후에 종료되었다.
실시예 2
용해
AAV 입자를 세포 배양액으로 방출하기 위해, 다양한 농도의 테스트 세제를 함유한 용해 완충액(500 mM TRIS, 20 mM MgCl2, pH 7.5) 10 % (v/v)를 배양액에 첨가했다. 또한, 50 U/ml DNase I(소 췌장, Roche) 및 37.5 mM MgSO4를 첨가했다. 그런 다음 세포 배양액을 통기 및 pH 제어 없이 교반하면서 37℃에서 서로 다른 시간 동안 인큐베이션했다. 각각의 인큐베이션 후, 용해물을 멸균 여과했다.
실시예 3
AAV 입자 정제
친화성 크로마토그래피 단계에서는 Thermo Fisher의 AAVX 수지 10.5mL를 포함하는 컬럼이 Akta Avant 25 크로마토그래피 시스템에서 사용되었다. 이 시스템은 약 300cm/h의 유속으로 가동되었다. 완충액 A(1x PBS, pH 7.4, 0.001% Pluronic F-68)로 평형시킨 후, 용해된 배양액 200mL를 컬럼에 적용한 다음 평형 완충액과 0.5M NaCl(pH 6.0)로 각각 2단계 세척했다. AAV 입자는 pH 2.4의 0.1 M 시트르산나트륨 용액으로 용출되었다. 용출액의 pH는 2 M Tris(pH 10)를 첨가하여 pH 7.5로 조정되었다.
실시예 4
분석 방법
총 역가 결정을 위한 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)
AAV 캡시드 역가 측정을 위해, PROGEN(카탈로그 번호 PRAAV8)의 키트를 제조업체의 지침에 따라 사용했다.
간단히 말해서, 이 검정법은 재조합 AAV 캡시드 특이적 항체 및 비오틴 표지된 검출 항체를 포획 항체로 사용하는 샌드위치 ELISA이다.
사전 코팅된 다중적정판(MTP)의 웰은 100 μL의 표준물질, 샘플 또는 대조군 각각과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 다음 날, 키트에 제공된 ASSB 완충액(1회)으로 웰들을 세 번 세척했다. 그 후, 비오틴화된 검출 항체를 포함하는 용액 100 μL(제조업체의 지침에 따라 희석)를 웰당 100 μL씩 첨가하고, 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 키트에 제공된 ASSB 완충액(1회)으로 웰들을 세 번 세척했다. 다음 단계에서 스트렙타비딘에 접합된 호스래디시 퍼옥시다아제를 포함하는 용액 100 μl를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션했다. 그 후, 키트에 제공된 ASSB 완충액(1회)으로 웰들을 세 번 세척했다. 발색 반응을 위해 제조업체의 지침에 따라 제조한 ABTS를 함유한 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고 흔들어주면서 인큐베이션했다. 색 강도는 참조 파장을 490nm로 하고 405nm에서의 MTP-ELISA-Reader Versa Max(Molecular Devices)를 사용하여 바탕 물질과 최고 농도의 표준 물질의 흡광도 차이가 약 1.5에 도달할 때까지 결정되었다.
각 샘플, 표준물질 및 대조군은 중복으로 측정되었다.
캡시드의 양(캡시드/mL)은 표준 곡선을 기반으로 계산되었으며, 표준 곡선은 WiemerRodbard 알고리즘에 따라 표준 물질들의 평균값을 사용하여 4-매개변수 적합을 통해 결정되었다.
게놈 역가 결정을 위한 디지털 드롭릿 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)
효소 샘플 처리용 시약:
1) DNase I 완충액(NEB): 100 mM Tris-HCl, pH 7.6, 25 mM MgSO4, 5 mM CaCl2
2) DNase I (NEB): 0.2 U/μL
3) 단백질 분해효소 K (NEB; 대략 20 mg/mL = 800 U/mL): 16 U / mL
4) 단백질 분해효소 K 완충액(BioRad): 400 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2000 mM NaCl, 1 % SDS, pH 8
5) 도데실 황산 나트륨(SDS) 용액: 10 % (w/v)
효소 샘플 처리:
- 30 μL H2O, 5 μL DNase I 완충액, 5 μL DNase I, 10 μL 샘플을 혼합
- 37℃에서 30분 동안 인큐베이션
- 75℃에서 15분 동안 가열하여 인큐베이션된 DNase I-믹스를 수득
- 짧은 냉각 및 원심분리
- 42 μL H2O + 2 μL 단백질 분해효소 K + 5 μL 단백질 분해효소 K 완충액 + 1 μL 10 % SDS 용액을 혼합하고 인큐베이션된 DNase I-믹스를 첨가
- 60분 동안 50℃에서 인큐베이션
- 15분 동안 95℃까지 가열
- 4℃로 냉각
ddPCR:
바이러스 게놈 적정을 위해, 이중 ddPCR 검정을 수행했다. 프라이머와 프로브는 사용된 CMV 프로모터와 폴리A/3'UTR 서열에 맞춰 설계되었다. PCR 마스터믹스는 다음 표(드롭릿 디지털 PCR 가이드 - Bio-Rad)에 따라 준비되었다.
준비된 마스터믹스를 96웰 플레이트에 웰당 16.5 μL씩 피펫으로 옮겼다. 그런 다음, 전처리된 샘플의 연속 희석이 다음과 같이 수행되었다: 10 μL의 샘플을 LoRentention 팁으로 LoBind 튜브에 있는 90 μL의 물에 옮겨 넣고 완전히 혼합했다. 그 후, 96웰 플레이트의 마스터믹스 용액에 샘플 5.5 μL를 여러 번의 희석 단계로 첨가했다. 플레이트를 180℃에서 밀봉하고, 2,200rpm에서 1분간 볼텍싱한 후, 1,000rpm에서 추가 1분간 원심분리했다. 각 웰에서 20μL PCR 믹스를 꺼내는 자동 드롭릿 생성 장치를 사용하여, 웰당 최대 20,000개의 드롭릿을 생성하고 이를 또 다른 96웰 플레이트로 옮겼다. 180℃에서 드롭릿 플레이트를 밀봉한 후, PCR을 실시했다. 각각의 조건을 다음 표에 나타낸다.
드롭릿 리더에서, 각 드롭릿의 형광 신호를 측정했다. QuantaSoft 소프트웨어는 리더 데이터를 처리하고 대상 서열에 대한 20 μL 웰당 복제 수를 계산했다. 초기 샘플 역가는 다음 방정식으로 결정할 수 있다:

Claims (15)

  1. 재조합 AAV 입자를 정제하는 방법으로서:
    - 각각의 포유류 세포 배양액을 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시켜 생산 포유류 세포로부터 재조합 AAV 입자를 방출하는 단계, 및
    - AAV 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 AAV 입자를 정제하는 단계를 포함하고,
    이에 따라 재조합 AAV 입자를 정제하며,
    이때 포유류 세포 배양액은 배양된 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포 및 상기 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포의 배양에 사용되는 배양 배지를 포함하는, 방법.
  2. 재조합 AAV 입자의 수율을 증가시키기 위한, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도로서, 이때 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포는 알킬 폴리글루코사이드 세제로 용해되고, 이때 수율은 추후 AAV 친화성 크로마토그래피 단계 후 결정되는, 용도.
  3. 추후 AAV 친화성 크로마토그래피에서 수득되는 (용출액 분획 내) 빈 재조합 AAV 입자에 대한 채워진 재조합 AAV 입자의 비율을 증가시키기 위한, 알킬 폴리글루코사이드 세제의 용도로서, 이때 재조합 AAV 입자를 생산하는 포유류 세포는 AAV 친화성 크로마토그래피 이전에 알킬 폴리글루코사이드 세제로 용해되는, 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 58.0-62.0(w/v)% D-글루코피라노스, 올리고머, 데실 옥틸 글리코사이드 및 38.0-42.0(w/v)% 물의 혼합물인, 방법 및 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 CAS 번호가 68515-73-1인, 방법 및 용도.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제는 용액 내에 존재하는, 방법 및 용도.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포 배양액은 그 부피의 5% 내지 10% (5%(v/v) 내지 10%(v/v))가 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액과 조합되는, 방법 및 용도.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 알킬 폴리글루코사이드 세제를 약 10% 농도로 포함하는, 방법 및 용도.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 약 60분 동안인, 방법 및 용도.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계는 각각 온도가 약 37℃인, 방법 및 용도.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제와 접촉시키는 단계 또는 접촉 단계 각각 이후, 규조토를 첨가하고 혼합물을 5 내지 20분 동안 인큐베이션하는, 방법 및 용도.
  12. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 10 mM 내지 40 mM 농도의 마그네슘(II) 염화물을 포함하는, 방법 및 용도.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 폴리글루코사이드 세제를 포함하는 용액은 pH 값이 약 7.5인, 방법 및 용도.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 세포 배양액은 알킬 폴리글루코사이드 세제 그리고, DNase I 및 벤조나제로부터 선택된 50 U/mL의 뉴클레아제와 접촉되는, 방법 및 용도.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh10 및 이를 기반으로 하는 합성 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 단편(VHH)이 공유 결합되는 가교 폴리(스티렌-디비닐 벤젠) 매트릭스를 포함하는 크로마토그래피 물질 상에서 수행되는, 방법 및 용도.
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