KR20250075673A - 암 전이 치료를 위한 rna 복합체 및 나노 구조 - Google Patents

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KR20250075673A
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페이쉬안 구오
신 리
다니엘 빈젤
카이 진
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오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
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Abstract

뉴클레오시드 유사체를 함유하는 RNA 치료 복합체(나노 구조)의 1 단계 CMC 생성을 위한 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 1 단계 생성에서 RNA 합성 동안 RNA 복합체 내로 자가 조립되는 RNA 올리고뉴클레오티드에 내포된다. 따라서 추가 접합 또는 합성 공정이 필요하지 않다.

Description

암 전이 치료를 위한 RNA 복합체 및 나노 구조
본 출원은 2022년 09월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 63/377,390 및 2023년 7월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 63/511,969에 근거한 우선권을 주장하며, 이들은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 미국 국립보건원이 부여한 승인 번호 CA207946 및 EB019036 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리가 있다.
전이는 환자 사망으로 이어지는 주요 결과였다. siRNA는 암 치료를 위한 오랜 꿈이었다. 그러나 현재 단일 FDA에 의해 암 치료를 위해 승인된 단일 siRNA 약물은 하나도 없다. 치료의 비효율성에 대한 주요 장애물은 체내에서 암 세포로의 siRNA를 전달하고 엔도솜에서 siRNA의 포획을 위한 효과적인 절차의 부족이다.
본원은 체내에서 세포로의 억제성 RNA 분자(예를 들어, siRNA)의 효과적인 전달을 위한 특수 설계 및 에스코트 RNA 서열을 절단하기 위한 특수 설계를 통해 RNA 나노 복합체에서 siRNA의 방출을 위한 새로운 방법을 개시한다. 특히, 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치료 RNA 복합체가 본원에 개시되어 있으며, 각각의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 5' 말단과 3' 말단을 갖는 센스 가닥, 5' 말단과 3' 말단을 갖는 안티센스 가닥, 및 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 콜레스테롤 분자를 포함하고, 여기서 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 중심에 콜레스테롤 분자가 포함된 응집체에 있다. 센스 가닥은 센스 가닥에서 산소를 함유하지 않는 모든 피리미딘의 2'-위치가 포함된 25개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다. 안티센스 가닥은 18-25개의 정상 뉴클레오티드가 포함된 siRNA 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥보다 길다. 안티센스 가닥에서 뉴클레오티드의 적어도 95%가 센스 가닥의 상보적인 뉴클레오티드에 혼성화된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 2'-디플루오로-데옥시피리미딘, 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 5 '말단은 GalNAc(N-아세틸갈락토사민), UAMC-1110(SP-13786; (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드), FA(엽산), 또는 DCL(N-[N-[(S)-1,3-디카르복시프로필]카르바모일]-(S)-리신)로 변형된다.
또한 RNA 나노 구조에 자가 조립되도록 설계된(또는 구성된) 하나 이상의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있는 RNA 나노 구조가 본원에 개시된다. 조립 시, RNA 나노 구조는 코어 도메인 주위에 배열될 수 있는 이중 가닥 암(double-stranded arm, DA)으로 구성될 수 있다. 또한, RNA 나노 구조에서 RNA 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 함유한다. 일부 구현예에서, 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 중 적어도 1, 2, 3 또는 4개는 서열번호: 1-448 중 임의의 하나와 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체를 함유하는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 비변형된 RNA 올리고뉴클레오티드와 결합하여 RNA 나노 구조를 형성한다. 예를 들어, 서열번호: 1-448 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 298-394 중 임의의 하나와 약 80-100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드와 결합될 수 있다. RNA 나노 입자를 형성하기 위한 이들 올리고뉴클레오티드의 적절한 조합이 본원에 기재된다.
또한 뉴클레오시드 유사체를 함유하는 RNA 치료 복합체(나노 구조)의 1 단계 CMC 생성을 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 유사체는 1 단계 생성에서 RNA 합성 동안 RNA 복합체 내로 자가 조립되는 RNA 올리고뉴클레오티드에 내포된다. 따라서 추가 접합 또는 합성 공정이 필요하지 않다. 개시된 조성물 및 방법은 약물 접합의 복잡성 없이 순수 RNA 치료제를 산업적으로 대규모로 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 복합체는 적어도 두 가지 종류의 뉴클레오시드 유사체를 함유한다. 일부 구현예에서, RNA 복합체는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 뉴클레오시드 유사체를 함유한다. 일부 구현예에서, RNA 복합체는 우리딘 또는 시티딘 뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에 대한 세부사항은 첨부된 도면과 아래 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징부, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 개시된 RNA 나노 입자에 사용된 변형된 뉴클레오티드를 도시한다.
도 2는 유방암 세포주에서 RNA-UB5F 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다.
도 3은 유방암 세포주에서 RNA-CR2FF 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다.
도 4는 유방암 세포주에서 RNA-CR2FF-UB5F 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다.
도 5는 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥을 보여준다
도 6은 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 이에 연결된 연장부가 포함된 안티 센스 가닥을 보여준다
도 7은 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 인접한 연장부 RNA 구조를 갖는 안티 센스 가닥을 보여준다
도 8은 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥을 보여준다
도 9는 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 이에 연결된 연장부가 포함된 안티 센스 가닥을 보여준다
도 10은 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 인접한 연장부 RNA 구조를 갖는 안티 센스 가닥을 보여준다
도 11은 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체중 변화 연구 결과를 보여주는 곡선.
도 12는 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체중 변화 연구 결과를 보여주는 히스토그램.
도 13은 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체내 전이 억제 연구의 결과를 보여준다.
도 14는 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체외 전이 억제 연구의 결과를 보여준다.
도 15는 RNA 미셀을 형성하기 위한 RNA/약물/siRNA 복합체의 설계를 보여준다. siRNA(서바이빈 또는 RRM2 siRNA)와 젬시타빈의 여러 카피를 운반하는 RNA-미셀.
도 16A 및 도 16B는 HT29 세포의 폐를 대상으로 한 특화(lung tropic) 트레이닝이 두 가지 주요 변화를 가져왔음을 보여준다. 도 16A 및 도 16B는 생체 발광 스캔으로 이미징한 전이성 종양 진행 속도(주사 후 5개월부터 1개월까지(도 16A) 및 전이성 부담의 증가(도 16B)를 보여준다.
도 17A 내지 도 17D는 CRC 폐 전이의 치료를 위한 RNA 미셀의 체내 전달을 보여준다. 도 17A는 종양 GFP 신호 전달 감소를 나타내는 RNA 미셀 전달 후 마우스의 전신 생체 발광 이미징을 보여준다. 도 17B는 종양 부위의 GFP 감소를 나타내는 RNA 미셀 전달 후 종양 생체 발광 이미징을 보여준다. 도 17C는 치료 후 절제된 종양의 증식을 나타내는 Ki-67 염색을 보여준다. 도 17D는 치료 후 절제된 종양의 세포사멸 신호 전달을 나타내는 카스파제 3 염색을 보여준다.
본 개시가 더 자세히 설명되기 전에, 본 개시는 설명된 특정 구현예에 제한되지 않고, 물론 다양할 수 있다는 점을 이해해야 한다. 또한, 본 개시내용의 범주는 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한과 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 또는 개재하는 값 사이의 하한 단위의 10분의 1까지 각각의 개재하는 값은 본 개시내용 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 또한 명시된 범위 내에서 구체적으로 제외된 임의의 한계에 따라 본 개시 내에 포괄된다. 상기 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 것들 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위도 본 개시에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수도 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 설명된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 명시된 것처럼 참조로 본원에 포함되어 있으며, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함되어 있다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전의 개시를 위한 것이며, 본 개시가 사전 개시로 인해 그러한 간행물보다 앞선 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 간행 날짜는 실제 간행 날짜와 상이할 수 있으므로 독립적으로 확인해야 필요가 있을 수 있다.
본 개시내용의 해석 시 당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 본원에 기재 및 예시된 개별적인 각각의 구현예는 본 개시내용의 범주 또는 사상을 벗어나지 않으면서 임의의 다른 몇몇의 구현예의 특성으로부터 용이하게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특성을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본 개시의 구현예는 달리 명시되지 않는 한, 당업계 내의 화학, 생물학 등의 기법을 사용할 것이다.
다음 예는 방법을 수행하고 본원에 개시되고 청구된 프로브를 사용하는 법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 오류 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 온도는 ℃이며, 압력은 대기압 또는 그에 가깝다. 표준 온도와 압력은 20℃ 및 1 기압으로 정의된다.
본 개시의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 달리 명시하지 않는 한, 본 개시는 특정 재료, 시약, 반응 재료, 제조 프로세스 등에 제한되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 구현예만을 기재하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 개시에서는 논리적으로 가능한 경우 단계들이 상이한 순서로 실행될 수 있는 것도 가능하다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수 참조 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에 사용된 "자가 조립"은 핵산(및 일부 경우에, 미리 형성된 핵산 나노 구조(예를 들어, 결정))이 서열 특이적 방식으로, 예측된 방식으로 외부 제어 없이 서로 어닐링하는 능력을 지칭한다. 일부 측면에서, 핵산 나노 구조 자가 조립 방법은 단일 혈관에서 핵산(예를 들어 단일 가닥 핵산 또는 올리고뉴클레오티드)을 결합하고 서열 상보성에 기초하여 핵산이 서로 어닐링되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 이 어닐링 과정은 핵산을 높은 온도에 두었다가 선호 서열 특이적 결합을 위해 온도를 서서히 낮추는 과정을 포함한다. 다양한 핵산 나노 구조 또는 자가 조립 방법이 알려져 있고 본원에 기재된다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적이 되는 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추 동물, 예를 들어, 포유류일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의학적 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예컨대 내과 의사의 치료 하에 있는 대상체를 지칭한다.
용어 "치료 유효한"은 질병 또는 장애의 하나 이상의 원인 또는 증상을 개선하기에 충분한 양으로 사용된 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 개선은 반드시 제거가 아닌 감소 또는 변화만을 요구한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 기타 문제 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
용어 "치료"는 질병, 병리적 상태 또는 장애를 치료, 개선, 안정화 또는 예방하고자 실시하는 환자의 의학적 관리를 지칭한다. 이 용어는 적극적인 치료, 즉 질병, 병리학적 상태 또는 장애의 개선을 위한 치료를 포함하며, 원인 치료, 즉 관련 질병, 병적 상태 또는 장애의 원인 제거를 위한 치료도 포함한다. 또한 이 용어에는 완화 치료, 즉 질병, 병적 상태 또는 장애의 완치보다는 증상 완화를 위해 고안된 치료; 예방적 치료, 즉 관련 질병, 병적 상태 또는 장애의 발달을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위한 치료; 및 지지적 치료, 즉 관련 질병, 병적 상태 또는 장애의 개선을 위한 또 다른 특정 요법을 보충하기 위해 사용된 치료가 포함된다.
용어 "예방"은 질병이나 상태의 발병을 막거나 느리게하거나 질병 또는 상태의 심각성을 줄이는 치료를 지칭한다. 따라서, 치료가 질병의 증상이 있는 대상체에서 질병을 치료할 수 있다면, 아직 증상의 일부 또는 전부를 겪지 않은 대상체에서 질병을 예방할 수 있다.
본원에서의 목적을 위해, 주어진 핵산 서열 D에 대한, D와 또는 D에 대항 되는 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성은(대안적으로는 주어진 서열 D에 대한, D와 또는 D에 대항 되는 특정 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 서열 C로 표현될 수 있음) 다음과 같이 계산된다:
분수 W/Z의 100배,
여기서 W는 C와 D의 해당 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 일치로 점수가 매겨진 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수이고, Z는 D의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 전체 수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 동일하지 않음이 인지될 것이다.
본원에 사용된 용어 "siRNA"는 세포에서 후기 전사적으로 유전자 발현을 침묵시킬 수 있는 짧은 억제성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. siRNA는 일반적으로 이중 가닥이지만, siRNA의 한 가닥만이 유전자 침묵에 관여한다.
억제성 RNA
억제성 핵산을 안정화하고 전달하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에 사용된 억제성 핵산 또는 "siNA"는 짧은 간섭 핵산으로 정의된다. siNA의 예는 RNAi, 이중 가닥 RNA 및 siRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. siNA는 세포에서 유전자의 전사 또는 번역을 억제할 수 있다. siNA는 16 내지 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 특정 구현예에서 18 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, siNA는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 길이이다. siNA는 핵산 및/또는 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 전형적으로, siNA는 세포 내에서 단일 유전자의 번역을 억제할 것이며; 그러나, 특정 구현예에서, siNA는 세포 내에서 하나 이상의 유전자의 번역을 억제할 것이다.
siNA 내에서, 핵산의 구성요소는 전체적으로 동일한 유형 또는 균질일 필요는 없다(예를 들어, siNA는 뉴클레오티드 및 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다). 전형적으로, siNA는 이중 가닥 구조를 형성하고; 이중 가닥 구조는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 두 개의 별도의 핵산으로 인해 발생할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, siNA는 단일 핵산(폴리뉴클레오티드) 또는 핵산 유사체를 포함할 수 있으며, 그 자체로 보완함으로써 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다(예를 들어, 헤어핀 루프 형성). siNA의 이중 가닥 구조는 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 내지 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오베이스를 포함할 수 있으며, 이는 그 사이의 모든 범위를 포함한다. siNA는 상보적인 핵산(동일한 핵산의 다른 부분일 수 있거나 별도의 상보적인 핵산일 수 있음)과 혼성화하여 이중 가닥 구조를 형성하는 17 내지 35개의 연속 뉴클레오베이스, 더 바람직하게는 18 내지 30개의 연속 뉴클레오베이스, 더 바람직하게는 19 내지 25개의 뉴클레오베이스, 더 바람직하게는 20 내지 23개의 연속 뉴클레오베이스, 또는 20 내지 22개의 연속 뉴클레오베이스, 또는 21개의 연속 뉴클레오베이스를 포함할 수 있다.
siNA(예를 들어, siRNA)는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중 가닥 RNA는 미국 특허 번호 6,506,559 및 6,573,099뿐만 아니라 미국 특허 출원 2003/6051263, 2003/0055020, 2004/0265839, 2002/0168707, 2003/0159161, 및 2004/0064842에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
일부 경우에, siRNA는 (i) 각각의 mRNA에 결합하고, (ii) 신호 전달을 간섭하고 및/또는 (iii) 증식 암 또는 종양 세포를 억제할 수 있다.
전형적으로, 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 도입은, 이는 대안적으로 본원에서 작은 간섭 RNA(siRNA)로 언급될 수 있으며, 강력하고 특정한 유전자 침묵, RNA 간섭 또는 RNAi라는 현상을 유도한다. 이 현상은 선충 C. elegans(Fire 등, 1998)에서 광범위하게 문서화되었지만, 트리파노소마에서 마우스에 이르기까지 다른 유기체에서도 광범위하게 나타나고 있다. 논의되는 유기체에 따라, RNA 간섭은 "공동 억제(cosuppression)", "전사 후 유전자 침묵", "센스 억제" 및 "진압(quelling)"이라고 지칭된다. RNAi는 특정 유전자의 활성을 녹아웃하기 위한 수단을 제공하기 때문에 매력적인 생명 공학적 도구이다.
RNAi를 설계할 때 siRNA의 성질, 침묵 효과의 내구성 및 전달 시스템의 선택과 같은 몇 가지 고려해야 할 요인이 있다. RNAi 효과를 생성하기 위해, 유기체에 도입된 siRNA는 전형적으로 엑손(exonic) 서열을 함유한다. 또한 RNAi 과정은 상동성에 의존하기 때문에 유전자 특이성을 극대화하는 동시에 상동성이 있지만 유전자 특이적이 아닌 서열 간의 교차 간섭 가능성을 최소화할 수 있도록 서열을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는 siRNA는 siRNA의 서열과 억제될 유전자 사이의 80, 85, 90, 95, 98% 이상 또는 심지어 100% 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와 약 80% 미만 동일한 서열은 실질적으로 덜 효과적이다. 따라서 FAK, EphA2 및/또는 β2AR의 siRNA와 발현을 억제하고자 하는 FAK, EphA2 및/또는 β2AR 유전자 간의 상동성이 클수록 관련 없는 유전자의 발현이 영향을 받을 가능성이 적다.
siRNA는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경에는 19 내지 25개 뉴클레오티드 RNA의 말단 또는 내부(RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서)와 같은 비뉴클레오티드 물질의 추가가 포함될 수 있다. 특정 측면에서, RNA 분자는 3'-하이드록실기를 함유한다. 본 발명의 RNA 분자에서의 뉴클레오티드는 또한 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오이트 또는 당업계에 공지된 기타 변형된 백본과 같은 변형된 백본을 함유할 수 있거나, 비천연 뉴클레오시드간 결합을 함유할 수 있다. siRNA의 추가 변형(예를 들어, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, "유니버설 염기" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 하나 이상의 포스포로티오이트 뉴클레오티드간 결합 및 역전된 데옥시 비염기성 잔기의 내포)은 미국 출원 공개 20040019001 및 미국 특허 번호 6,673,611에서 확인할 수 있다(이들 각각은 그 전체 내용이 참조로 포함된다). 종합적으로, 위에 기재된 모든 변경된 핵산 또는 RNA를 변형된 siRNA로 지칭한다.
세포로의 siRNA의 도입은 예를 들어, 미세 주입, 전기 천공 또는 siRNA가 전사될 수 있는 핵산을 포함하는 벡터의 형질 감염을 포함하여 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, siRNA는 표적 mRNA 전사체에 결합할 수 있는 형태로 세포에 직접 도입될 수 있다. 내구성 및 막 투과성을 증가시키기 위해 siRNA는 리포솜, 폴리-L-리신, 지질, 콜레스테롤, 리포펙틴 또는 이의 유도체와 결합되거나 이로 변형될 수 있다. 특정 측면에서 콜레스테롤-접합 siRNA가 사용될 수 있다(Song 등, 2003 참조).
치료 RNA 복합체
대상체에서 세포로 siRNA를 전달하기 위한 치료 RNA 복합체가 본원에 개시된다. 치료 RNA 복합체는 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 5' 말단과 3' 말단을 갖는 센스 가닥, 5' 말단과 3' 말단을 갖는 안티센스 siRNA 가닥, 및 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 콜레스테롤 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 함유하는, 치료 RNA 복합체를 포함한다. 이러한 뉴클레오시드 유사체는 센스 가닥을 RNase 분해로부터 보호하지만 세포 내부에서는 소화를 위한 표적이 되기도 한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 생존 또는 세포사멸에 영향을 미치는 항암 siRNA이다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 서바이빈 siRNA 또는 RRM2 siRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 서바이빈 siRNA는 핵산 서열 서열번호: 1을 갖는다. 일부 구현예에서, RRM2 siRNA는 핵산 서열 서열번호: 2를 갖는다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 같은 길이거나 안티센스 가닥보다 더 길다. 중요하게도, 안티센스 가닥 내에서 뉴클레오티드의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%는 RNase 분해로부터 siRNA를 보호하기 위해 센스 가닥의 상보적인 뉴클레오티드에 혼성화되어야 한다. 세포 내부에 들어가면, 센스 가닥이 분해되어 세포에서 siRNA를 방출한다.
일부 구현예에서, 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 중심에 콜레스테롤 분자가 포함된 응집체에 있다. 이는 본원에서 "RNA 미셀"이라고 지칭한다.
일부 구현예에서, RNA 복합체는 센스 가닥의 5' 말단의 GalNAc(N-아세틸갈락토사민), UAMC-1110(SP-13786; (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드), FA(엽산), 또는 DCL(N-[N-[(S)-1,3-디카르복시프로필]카르바모일]-(S)-리신)을 추가로 포함한다.
따라서, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 안티센스 siRNA 가닥을 포함하는 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드가 본원에 개시되어 있으며, 센스 가닥은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한 치료 전달을 위한 siRNA를 안정화시키기 위한 방법이 본원에 개시되어 있으며, 방법은 siRNA 서열에 상보적인 복수의 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하고, 각각의 RNA 올리고뉴클레오티드는 RNase 분해를 방지하도록 구성된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하며, 각각의 RNA 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 접합된 콜레스테롤 모이어티를 포함한다. 그리고 방법은 siRNA가 RNA 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 적절한 조건에서 siRNA를 RNA 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 중심에 콜레스테롤 분자와 함께 응집된 이중 가닥 RNA 분자를 생성하도록 하는 단계를 포함한다.
RNA 나노 구조
또한 RNA 나노 구조에 자가 조립되도록 설계된(또는 구성된) 하나 이상의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있는 RNA 나노 구조가 본원에 개시된다. 조립 시, RNA 나노 구조는 코어 도메인 주위에 배열될 수 있는 이중 가닥 암(double-stranded arm, DA)으로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 나노 입자에서 RNA 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 함유한다.
일부 구현예에서, RNA 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 GalNAc(N-아세틸갈락토사민), UAMC-1110(SP-13786; (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드), FA(엽산), 또는 DCL(N-[N-[(S)-1,3-디카르복시프로필]카르바모일]-(S)-리신)로 변형된다.
일부 구현예에서, 개시된 RNA 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 중 하나를 갖는다:
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 3WJ-A:
5'- XXGYYAXGXGXAXGXGGG-3';
5'-XXGYYAXGXGXAXGXGGGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 6)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGYYAXGXGXAXGXGGGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 7);
5'-XXGYYXGXGXAXGXGGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 8)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGYYAXGXGXAXGXGGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 9)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXGYYAXGXGXAXGXGGG-3';
5'-FA-XXGYYAXGXGXAXGXGGG-3';
5'-DCL-XXGYYAXGXGXAXGXGGG-3';
5'-UAMC1110-XXGYYAXGXGXAXGXGGG-3';
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 3WJ-B:
5'-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY-3';
5'-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 10)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYYGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 11);
5'-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 12)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 13)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY-3';
5'-FA-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY-3';
5'-DCL-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY-3';
5'-UAMC1110-YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY-3';
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 3WJ-C:
5'-GGAXYAAXYAXGGYAA-3';
5'-GGAXYAAXYAXGGYAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 14)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAXYAAXYAXGGYAAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 15);
5'-GGAXYAAXYAXGGYAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 16)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAXYAAXYAXGGYAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 17)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGAXYAAXYAXGGYAA-3'(서열번호: 18);
5'-FA-GGAXYAAXYAXGGYAA-3'(서열번호: 18, 3WJ-c-FA);
5'-DCL-GGAXYAAXYAXGGYAA-3'(서열번호: 19);
5'-UAMC1110-GGAXYAAXYAXGGYAA-3'(서열번호: 20);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 4WJ-A:
5'-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-3'(서열번호: 21);
5'-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 22)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 23)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 24)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 25)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-3'(서열번호: 21);
5'-FA-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-3'(서열번호: 21);
5'-DCL-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-3'(서열번호: 21);
5'-UAMC1110-XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-3'(서열번호: 21);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 4WJ-B:
5'-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-3'(서열번호: 26);
5'-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 27)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 28)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 29)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 30)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-3'(서열번호: 26);
5'-FA-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-3'(서열번호: 26);
5'-DCL-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-3'(서열번호: 26);
5'-UAMC1110-XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-3'(서열번호: 26);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 4WJ-C:
5'-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-3'(서열번호: 31);
5'-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 32)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 33)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 34)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 35)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-3'(서열번호: 31);
5'-FA-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-3'(서열번호: 31);
5'-DCL-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-3'(서열번호: 31);
5'-UAMC1110-YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-3'(서열번호: 31);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 4WJ-D:
5'-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-3'(서열번호: 36);
5'-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 37)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 38)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 39)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 40)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-3'(서열번호: 36);
5'-FA-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-3'(서열번호: 36);
5'-DCL-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-3'(서열번호: 36);
5'-UAMC1110-YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-3'(서열번호: 36);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 6WJ-A:
5'-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-3'(서열번호: 41);
5'-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 42)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 43)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 44)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 45)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-3'(서열번호: 41);
5'-FA-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-3'(서열번호: 41);
5'-DCL-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-3'(서열번호: 41);
5'-UAMC1110-GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-3'(서열번호: 41);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 6WJ-B:
5'-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-3'(서열번호: 46);
5'-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 47)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYYgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 48)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 49)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 50)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-3'(서열번호: 46);
5'-FA-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-3'(서열번호: 46);
5'-DCL-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-3'(서열번호: 46);
5'-UAMC1110-YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-3'(서열번호: 46);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 6WJ-C:
5'-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-3'(서열번호: 51);
5'-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 52)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 53)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 54)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 55)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-3'(서열번호: 51);
5'-FA-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-3'(서열번호: 51);
5'-DCL-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-3'(서열번호: 51);
5'-UAMC1110-GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-3'(서열번호: 51);
플록슈리딘 및 젬시타빈 및 유도체를 포함한 6WJ-D:
5'-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-3'(서열번호: 56);
5'-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 57)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXYgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 58)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 59)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 60)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-3'(서열번호: 56);
5'-FA-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-3'(서열번호: 56);
5'-DCL-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-3'(서열번호: 56); 또는
5'-UAMC1110-XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-3'(서열번호: 56), 여기서 X는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F)이고, Y는 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF)이다.
일부 구현예에서, 개시된 RNA 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 중 하나를 갖는다:
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 3WJ-A:
5'-UUGYYAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 61);
5'-UUGYYAUGUGUAUGUGGGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 280)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUGYYAUGUGUAUGUGGGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 281);
5'-UUGYYAUGUGUAUGUGGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 282)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUGYYAUGUGUAUGUGGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 283)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-UUGYYAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 61);
5'-FA-UUGYYAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 61, 3WJ a FA);
5'-DCL-UUGYYAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 61);
5'-UAMC1110-UUGYYAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 61);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 3WJ-B:
5'-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY-3'(서열번호: 62);
5'-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 63)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYYGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 64);
5'-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 65, 3WJ-b-EpCAMapt)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 66)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY-3'(서열번호: 62);
5'-FA-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY-3'(서열번호: 62);
5'-DCL-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY-3'(서열번호: 62);
5'-UAMC1110-YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY-3'(서열번호: 62);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 3WJ-C:
5'-GGAUYAAUYAUGGYAA-3'(서열번호: 67);
5'-GGAUYAAUYAUGGYAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 68 (소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함));
5'-GGAUYAAUYAUGGYAAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 69);
5'-GGAUYAAUYAUGGYAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 70)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAUYAAUYAUGGYAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 71)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGAUYAAUYAUGGYAA-3'(서열번호: 67);
5'-FA-GGAUYAAUYAUGGYAA-3'(서열번호: 67);
5'-DCL-GGAUYAAUYAUGGYAA-3'(서열번호: 67);
5'-UAMC1110-GGAUYAAUYAUGGYAA-3'(서열번호: 67);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 4WJ-A:
5'-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA-3'(서열번호: 72);
5'-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 73)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 74)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 75)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 76)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA-3'(서열번호: 72);
5'-FA-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA-3'(서열번호: 72);
5'-DCL-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA-3'(서열번호: 72);
5'-UAMC1110-UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA-3'(서열번호: 72);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 4WJ-B:
5'-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG-3'(서열번호: 77);
5'-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 78)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 79)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 80)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 81)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG-3'(서열번호: 77);
5'-FA-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG-3'(서열번호: 77);
5'-DCL-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG-3'(서열번호: 77);
5'-UAMC1110-UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG-3'(서열번호: 77);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 4WJ-C:
5'-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG-3'(서열번호: 82);
5'-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 83)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 84)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 85)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 86)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG-3'(서열번호: 82);
5'-FA-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG-3'(서열번호: 82);
5'-DCL-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG-3'(서열번호: 82);
5'-UAMC1110-YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG-3'(서열번호: 82);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 4WJ-D:
5'-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA-3'(서열번호: 87);
5'-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 88)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 89)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 90)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 91)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA-3'(서열번호: 87);
5'-FA-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA-3'(서열번호: 87);
5'-DCL-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA-3'(서열번호: 87);
5'-UAMC1110-YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA-3'(서열번호: 87);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 6WJ-A:
5'-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG-3'(서열번호: 92);
5'-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 93)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 94)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 95)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 96)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG-3'(서열번호: 92);
5'-FA-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG-3'(서열번호: 92);
5'-DCL-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG-3'(서열번호: 92);
5'-UAMC1110-GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG-3'(서열번호: 92);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 6WJ-B:
5'-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY-3'(서열번호: 97);
5'-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 98)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYYgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 99)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 100)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 101)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY-3(서열번호: 97);
5'-FA-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY-3'(서열번호: 97);
5'-DCL-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY-3'(서열번호: 97);
5'-UAMC1110-YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY-3'(서열번호: 97);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 6WJ-C:
5'-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA-3'(서열번호: 102);
5'-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 103)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 104)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 105)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 106)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA-3'(서열번호: 102);
5'-FA-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA-3'(서열번호: 102);
5'-DCL-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA-3'(서열번호: 102);
5'-UAMC1110-GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA-3'(서열번호: 102);
젬시타빈 및 유도체만을 포함한 6WJ-D:
5'-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY-3'(서열번호: 107);
5'-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUYgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 108)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUYgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 109)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUYgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 110)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUYcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 111)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY-3'(서열번호: 107);
5'-FA-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY-3'(서열번호: 107);
5'-DCL-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY-3'(서열번호: 107); 또는
5'-UAMC1110-UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY-3'(서열번호: 107), 여기서 Y는 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF)이다.
일부 구현예에서, 개시된 RNA 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 중 하나를 갖는다:
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 3WJ-A:
5'-XXGCCAXGXGXAXGXGGG-3'(서열번호: 112);
5'-XXGCCAXGXGXAXGXGGGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 113)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGCCAXGXGXAXGXGGGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 114)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGCCAXGXGXAXGXGGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 115)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGCCAXGXGXAXGXGGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 116, 3WJ-a-CD133apt)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXGCCAXGXGXAXGXGGG-3'(서열번호: 112);
5'-FA-XXGCCAXGXGXAXGXGGG-3'(서열번호: 112);
5'-DCL-XXGCCAXGXGXAXGXGGG-3'(서열번호: 112);
5'-UAMC1110-XXGCCAXGXGXAXGXGGG-3'(서열번호: 112);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 3WJ-B:
5'-CCCACAXACXXXGXXGAXCC-3'(서열번호: 117, 3WJ-b);
5'-CCCACAXACXXXGXXGAXCCgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 118)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCCACAXACXXXGXXGAXCCgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 119)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCCACAXACXXXGXXGAXCCgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 120)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCCACAXACXXXGXXGAXCCcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 121)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-CCCACAXACXXXGXXGAXCC-3'(서열번호: 117);
5'-FA-CCCACAXACXXXGXXGAXCC-3'(서열번호: 117);
5'-DCL-CCCACAXACXXXGXXGAXCC-3'(서열번호: 117);
5'-UAMC1110-CCCACAXACXXXGXXGAXCC-3'(서열번호: 117);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 3WJ-C:
5'-GGAXCAAXCAXGGCAA-3'(서열번호: 122);
5'-GGAXCAAXCAXGGCAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 123)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAXCAAXCAXGGCAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 124)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAXCAAXCAXGGCAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 125)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGAXCAAXCAXGGCAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 126)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGAXCAAXCAXGGCAA-3'(서열번호: 122);
5'-FA-GGAXCAAXCAXGGCAA-3'(서열번호: 122);
5'-DCL-GGAXCAAXCAXGGCAA-3'(서열번호: 122);
5'-UAMC1110-GGAXCAAXCAXGGCAA-3'(서열번호: 122);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 4WJ-A:
5'-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-3'(서열번호: 127);
5'-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 128)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 129)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 130)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 131)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-3'(서열번호: 127);
5'-FA-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-3'(서열번호: 127);
5'-DCL-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-3'(서열번호: 127);
5'-UAMC1110-XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-3'(서열번호: 127);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 4WJ-B:
5'-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-3'(서열번호: 132);
5'-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 133)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 134)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 135)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 136)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-3'(서열번호: 132);
5'-FA-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-3'(서열번호: 132);
5'-DCL-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-3'(서열번호: 132);
5'-UAMC1110-XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-3'(서열번호: 132);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 4WJ-C:
5'-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-3'(서열번호: 137);
5'-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 138)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 139)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 140)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 141)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-3'(서열번호: 137);
5'-FA-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-3'(서열번호: 137);
5'-DCL-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-3'(서열번호: 137);
5'-UAMC1110-CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-3'(서열번호: 137);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 4WJ-D:
5'-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-3'(서열번호: 142);
5'-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 143)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 144)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 145)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 146)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-3'(서열번호: 142);
5'-FA-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-3'(서열번호: 142);
5'-DCL-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-3'(서열번호: 142);
5'-UAMC1110-CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-3'(서열번호: 142);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 6WJ-A:
5'-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-3'(서열번호: 147);
5'-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCGgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 148)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCGgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 149)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCGgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 150)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCGcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 151)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-3'(서열번호: 147);
5'-FA-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-3'(서열번호: 147);
5'-DCL-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-3'(서열번호: 147);
5'-UAMC1110-GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-3'(서열번호: 147);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 6WJ-B:
5'-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-3'(서열번호: 152);
5'-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCCgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 153)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCCgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 154)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCCgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 155)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCCcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 156)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-3'(서열번호: 152);
5'-FA-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-3'(서열번호: 152);
5'-DCL-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-3'(서열번호: 152);
5'-UAMC1110-CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-3'(서열번호: 152);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 6WJ-C:
5'-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-3'(서열번호: 157);
5'-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACAgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 158)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACAgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 159)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACAgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 160)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACAcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 161)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함);
5'-GalNAc-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-3'(서열번호: 157);
5'-FA-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-3'(서열번호: 157);
5'-DCL-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-3'(서열번호: 157);
5'-UAMC1110-GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-3'(서열번호: 157);
플록슈리딘 및 유도체만을 포함한 6WJ-D:
5'-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-3'(서열번호: 162);
5'-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXCgccuuaguaacgugcuuugaugucgauucgacaggaggc-3'(서열번호: 163)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함)
5'-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXCgggaccgaaaaagaccugacuucuauacuaagucuacguuuccc-3'(서열번호: 164)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함)
5'-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXCgcgacugguuacccggucg-3'(서열번호: 165)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함)
5'-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXCcagaacguauacuauucug-3'(서열번호: 166)(소문자로 된 압타머 서열을 표적으로 함)
5'-GalNAc-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-3'(서열번호: 162);
5'-FA-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-3'(서열번호: 162);
5'-DCL-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-3'(서열번호: 162); 또는
5'-UAMC1110-XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-3'(서열번호: 162), 여기서 X는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F)이다.
일부 구현예에서, 개시된 RNA 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 변형되지 않은 서열 중 하나를 갖는다:
3WJ-A:
5'-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 167);
5'-UUGCCAUGUGUAUGUGGGGGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 168);
5'-UUGCCAUGUGUAUGUGGGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 169);
5'-UUGCCUGUGUAUGUGGGGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 170);
5'-UUGCCAUGUGUAUGUGGGCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 171);
5'-GalNAc-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 167);
5'-FA-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 167);
5'-DCL-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 167);
5'-UAMC1110-UUGCCAUGUGUAUGUGGG-3'(서열번호: 167);
3WJ-B:
5'-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3'(서열번호: 172);
5'-CCCACAUACUUUGUUGAUCCGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 173);
5'-CCCACAUACUUUGUUGAUCCGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 174);
5'-CCCACAUACUUUGUUGAUCCGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 175);
5'-CCCACAUACUUUGUUGAUCCCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 176);
5'-GalNAc-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3'(서열번호: 173);
5'-FA-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3'(서열번호: 173);
5'-DCL-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3'(서열번호: 173);
5'-UAMC1110-CCCACAUACUUUGUUGAUCC-3'(서열번호: 173);
3WJ-C:
5'-GGAUCAAUCAUGGCAA-3'(서열번호: 177);
5'-GGAUCAAUCAUGGCAAGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 178);
5'-GGAUCAAUCAUGGCAAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 179);
5'-GGAUCAAUCAUGGCAAGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 180);
5'-GGAUCAAUCAUGGCAACAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 181);
5'-GalNAc-GGAUCAAUCAUGGCAA-3'(서열번호: 177);
5'-FA-GGAUCAAUCAUGGCAA-3'(서열번호: 177);
5'-DCL-GGAUCAAUCAUGGCAA-3'(서열번호: 177);
5'-UAMC1110-GGAUCAAUCAUGGCAA-3'(서열번호: 177);
4WJ-A:
5'-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-3'(서열번호: 182);
5'-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAAGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 183);
5'-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 184);
5'-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAAGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 185);
5'-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAACAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 186);
5'-GalNAc-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-3'(서열번호: 182);
5'-FA-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-3'(서열번호: 182);
5'-DCL-UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-3'(서열번호: 182);
5'-UAMC1110 UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-3'(서열번호: 182);
4WJ-B:
5'-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-3'(서열번호: 187);
5'-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAGGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 188);
5'-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 189);
5'-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAGGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 190);
5'-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAGCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 191);
5'-GalNAc-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-3'(서열번호: 187);
5'-FA-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-3'(서열번호: 187);
5'-DCL-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-3'(서열번호: 187);
5'-UAMC1110-UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-3'(서열번호: 187);
4WJ-C:
5'-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-3'(서열번호: 192);
5'-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 193);
5'-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 194);
5'-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 195);
5'-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGGCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 196);
5'-GalNAc-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-3'(서열번호: 192);
5'-FA-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-3'(서열번호: 192);
5'-DCL-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-3'(서열번호: 192);
5'-UAMC1110-CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-3'(서열번호: 192);
4WJ-D:
5'-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-3'(서열번호: 197);
5'-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAAGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 198);
5'-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 199);
5'-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAAGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 200);
5'-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAACAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 201);
5'-GalNAc-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-3'(서열번호: 197);
5'-FA-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-3'(서열번호: 197);
5'-DCL-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-3'(서열번호: 197);
5'-UAMC1110-CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-3'(서열번호: 197);
6WJ-A:
5'-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-3'(서열번호: 202);
5'-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCGGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 203);
5'-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCGGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 204);
5'-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCGGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 205);
5'-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCGCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 206);
5'-GalNAc-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-3'(서열번호: 202);
5'-FA-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-3'(서열번호: 202);
5'-DCL-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-3'(서열번호: 202);
5'-UAMC1110-GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-3'(서열번호: 202);
6WJ-B:
5'-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-3'(서열번호: 207);
5'-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCCGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 208);
5'-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCCGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 209);
5'-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCCGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 210);
5'-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCCCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 211);
5'-GalNAc-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-3'(서열번호: 207);
5'-FA CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-3'(서열번호: 207);
5'-DCL CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-3'(서열번호: 207);
5'-UAMC1110-CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-3'(서열번호: 207);
6WJ-C:
5'-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-3'(서열번호: 212);
5'-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACAGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 213);
5'-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACAGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 214);
5'-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACAGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 215);
5'-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACACAGAACGUAUACUAUUCUG 3'(서열번호: 216);
5'-GalNAc-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-3'(서열번호: 212);
5'-FA GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-3'(서열번호: 212);
5'-DCL-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-3'(서열번호: 212);
5'-UAMC1110-GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-3'(서열번호: 212);
6WJ-D:
5'-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-3'(서열번호: 217);
5'-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUCGCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3'(서열번호: 218);
5'-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUCGGGACCGAAAAAGACCUGACUUCUAUACUAAGUCUACGUUUCCC-3'(서열번호: 219);
5'-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUCGCGACUGGUUACCCGGUCG-3'(서열번호: 220);
5'-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUCCAGAACGUAUACUAUUCUG-3'(서열번호: 221);
5'-GalNAc-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-3'(서열번호: 217);
5'-FA-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-3'(서열번호: 217);
5'-DCL-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-3'(서열번호: 217); 또는
5'-UAMC1110-UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-3'(서열번호: 217).
5' XXGYYAXGXGXAXGXGGG 콜레스테롤-3'(서열번호: 222);
5' YYYAYAXAYXXXGXXGAXYY 콜레스테롤-3'(서열번호: 223);
5' GGAXYAAXYAXGGYAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 224);
5' XXAGGXAAAGYYAYYXGYAGGXGYXAYYGAXGXAAXXYAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 225);
5' XXGAAXXAYAXYGGXAGYAYGGGYXGXGYGAGGYXGAAYAG-콜레스테롤-3'(서열번호: 226);
5' YXGXXYAGYYXYGYAYAGYYAGYAYGYAYYXGAAXAGG-콜레스테롤-3'(서열번호: 227);
5' YYXAXXYAGGXGYGXGYXGGGYXGYAGGXGGYXXXAYYXAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 228);
5' GAGXAXAXGXXAGGYYXGGGXGAGXYYXXGYGXYXXYXAYYG-콜레스테롤-3'(서열번호: 229);
5' YGGXAGAAGAYGYAAGGAYXXGYXAGXXGXGGXAYXGXXYYY-콜레스테롤-3'(서열번호: 230);
5' GGGAAYAGXAYYAYAAYXAGXGXYYYGGGAXAGGGAYAXAYA-콜레스테롤-3'(서열번호: 231);
5' XGXAXGXYYYXAXYYYGGGAXGYYYAGGYYXAAYAXAXAYXY-콜레스테롤-3'(서열번호: 232), 여기서 X는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F)이고, Y는 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF)이다.
일부 구현예에서, 개시된 RNA 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 중 하나를 갖는다:
5' UUGYYAUGUGUAUGUGGG 콜레스테롤-3'(서열번호: 233);
5' YYYAYAUAYUUUGUUGAUYY 콜레스테롤-3'(서열번호: 234);
5' GGAUYAAUYAUGGYAA 콜레스테롤-3'(서열번호: 235);
5' UUAGGUAAAGYYAYYUGYAGGUGYUAYYGAUGUAAUUYAA 콜레스테롤-3'(서열번호: 236);
5' UUGAAUUAYAUYGGUAGYAYGGGYUGUGYGAGGYUGAAYAG 콜레스테롤-3'(서열번호: 237);
5' YUGUUYAGYYUYGYAYAGYYAGYAYGYAYYUGAAUAGG 콜레스테롤-3'(서열번호: 238);
5' YYUAUUYAGGUGYGUGYUGGGYUGYAGGUGGYUUUAYYUAA 콜레스테롤-3'(서열번호: 239);
5' GAGUAUAUGUUAGGYYUGGGUGAGUYYUUGYGUYUUYUAYYG 콜레스테롤-3'(서열번호: 240);
5' YGGUAGAAGAYGYAAGGAYUUGYUAGUUGUGGUAYUGUUYYY 콜레스테롤-3'(서열번호: 241);
5' GGGAAYAGUAYYAYAAYUAGUGUYYYGGGAUAGGGAYAUAYA 콜레스테롤-3'(서열번호: 242);
5' UGUAUGUYYYUAUYYYGGGAUGYYYAGGYYUAAYAUAUAYUY 콜레스테롤-3'(서열번호: 243), 여기서 Y는 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF)이다.
5' XXGCCAXGXGXAXGXGGG-콜레스테롤-3'(서열번호: 244);
5' CCCACAXACXXXGXXGAXCC-콜레스테롤-3' (서열번호: 245);
5' GGAXCAAXCAXGGCAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 246);
5' XXAGGXAAAGCCACCXGCAGGXGCXACCGAXGXAAXXCAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 247);
5' XXGAAXXACAXCGGXAGCACGGGCXGXGCGAGGCXGAACAG-콜레스테롤-3'(서열번호: 248);
5' CXGXXCAGCCXCGCACAGCCAGCACGCACCXGAAXAGG-콜레스테롤-3'(서열번호: 249);
5' CCXAXXCAGGXGCGXGCXGGGCXGCAGGXGGCXXXACCXAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 250);
5' GAGXAXAXGXXAGGCCXGGGXGAGXCCXXGCGXCXXCXACCG-콜레스테롤-3'(서열번호: 251);
5' CGGXAGAAGACGCAAGGACXXGCXAGXXGXGGXACXGXXCCC-콜레스테롤-3'(서열번호: 252);
5' GGGAACAGXACCACAACXAGXGXCCCGGGAXAGGGACAXACA-콜레스테롤-3'(서열번호: 253);
5' XGXAXGXCCCXAXCCCGGGAXGCCCAGGCCXAACAXAXACXC-콜레스테롤-3'(서열번호: 254), 여기서 X는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F)이다.
5' UUGCCAUGUGUAUGUGGG-콜레스테롤-3'(서열번호: 255);
5' CCCACAUACUUUGUUGAUCC-콜레스테롤-3'(서열번호: 256);
5' GGAUCAAUCAUGGCAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 257);
5' UUAGGUAAAGCCACCUGCAGGUGCUACCGAUGUAAUUCAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 258);
5' UUGAAUUACAUCGGUAGCACGGGCUGUGCGAGGCUGAACAG-콜레스테롤-3'(서열번호: 259);
5' CUGUUCAGCCUCGCACAGCCAGCACGCACCUGAAUAGG-콜레스테롤-3'(서열번호: 260);
5' CCUAUUCAGGUGCGUGCUGGGCUGCAGGUGGCUUUACCUAA-콜레스테롤-3'(서열번호: 261);
5' GAGUAUAUGUUAGGCCUGGGUGAGUCCUUGCGUCUUCUACCG-콜레스테롤-3'(서열번호: 262);
5' CGGUAGAAGACGCAAGGACUUGCUAGUUGUGGUACUGUUCCC-콜레스테롤-3'(서열번호: 263);
5' GGGAACAGUACCACAACUAGUGUCCCGGGAUAGGGACAUACA-콜레스테롤-3'(서열번호: 264);
5' UGUAUGUCCCUAUCCCGGGAUGCCCAGGCCUAACAUAUACUC-콜레스테롤-3'(서열번호: 265);
연장부가 포함된 서바이빈-센스
5' XXGYAGGXXYYXXAXYXGXYAXXAYAXAYAYYYX-콜레스테롤-3'(서열번호: 266);
5' UUGYAGGUUYYUUAUYUGUYAUUAYAUAYAYYYU-콜레스테롤-3'(서열번호: 267);
5' XXGCAGGXXCCXXAXCXGXCAXXACAXACACCCX-콜레스테롤-3'(서열번호: 268);
5' UUGCAGGUUCCUUAUCUGUCAUUACAUACACCCU-콜레스테롤-3'(서열번호: 269).
연장부가 포함된 RRM2-센스
5' XXGYGAXXXAGYYAAGAAGXXYAXXAYAXAYAYYYX-콜레스테롤-3'(서열번호: 270);
5' UUGYGAUUUAGYYAAGAAGUUYAUUAYAUAYAYYYU-콜레스테롤-3'(서열번호: 271);
5' XXGCGAXXXAGCCAAGAAGXXCAXXACAXACACCCX-콜레스테롤-3'(서열번호: 272);
5' UUGCGAUUUAGCCAAGAAGUUCAUUACAUACACCCU-콜레스테롤-3'(서열번호: 273);
여기서 X는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F)이고, Y는 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF)이고, C,U는 2F' 변형된 C,U이고, A,G는 변형되지 않았다.
서바이빈-안티센스
5' UGACAGAUAAGGAACCUGC 3'(서열번호: 1).
RRM2-안티센스
5' UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC 3'(서열번호: 3).
서바이빈-안티센스-연장부
5' GGGUGUAUGUAAUGACAGAUAAGGAACCUGC 3'(서열번호: 4).
RRM2-안티센스
5' GGGUGUAUGUAAUGAACUUCUUGGCUAAAUCGC 3'(서열번호: 2);
연장부
5' GGGUGUAUGUAA 3'(서열번호: 5), 여기서 A, C, G, U는 변형되지 않았다.
모듈식 RNA 나노 구조는 혼성화를 통해 RNA 나노 구조에 자가 조립될 수 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 각각의 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 16 내지 약 120개 염기일 수 있다. 각각의 모듈식 RNA 나노 구조에서 각각의 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드의 정확한 서열은 2개 이상의 다른 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로 조립될 때 특정 물리적 특성을 달성하도록 설계될 수 있다. RNA 나노 구조는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 자가 조립시 고도로 정렬된 2-D 및/또는 3-D 구조를 형성하도록 설계될 수 있다. RNA 나노 구조는 코어 도메인으로부터 뻗어 나오는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 이중 가닥 암(DA)을 가질 수 있다. DA는 코어 도메인 주위에 대칭 또는 비대칭으로 배열될 수 있다.
코어 도메인은 개별 DA를 분리하는 0-4개의 대칭 또는 비대칭 벌지 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 이를 통해 열역학적 안정성, 입체적 제약 및/또는 개별 루프의 구조적 배열을 최적화할 수 있다. 듀플렉스(duplex) 서열(DA)의 변화와 짝을 이루지 않은 코어 뉴클레오티드의 수는 모두 RNA 나노 구조의 열역학적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 물리적 특성 및 기능적 특성은 RNA 나노 구조를 형성하는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드의 서열을 변경함으로써 최적화될 수 있다.
RNA 나노 구조의 용융 온도(Tm)는 약 65℃ 또는 그 이상일 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조의 용융 온도는 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100℃보다 높을 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조의 Tm은 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100℃일 수 있다.
합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 각각의 개별 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 16-120개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 뉴클레오티드는 천연 리보뉴클레오티드일 수 있거나 변형될 수 있다. 일부 측면에서, 합성 RNA 올리고뉴클레오티드(들)는 2' 변형될 수 있다. 2' 또는 기타 변형은 2'플루오로-, 2'O-메틸-, LNA- 또는 기타 백본, 당 또는 염기 변형 리보뉴클레오티드 또는 천연, 백본, 당, 및 염기 변형 리보뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 변형은 본원의 다른 곳에서 추가로 논의된다. 각각의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 또는 120개의 뉴클레오티드 또는 그 내의 임의의 범위로 구성될 수 있다. 각각의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상의 다른 합성 RNA 올리고뉴클레오티드로 RNA 나노 구조 내로 자가 조립될 수 있도록 설계 및 구성될 수 있다.
본원에 기재된 뉴클레오시드 유사체 외에, 나머지 뉴클레오티드는 변형되지 않거나 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 변형은 5'-말단 변형 및/또는 3'-말단 변형 및/또는 2'-내부 당 변형 및/또는 염기-내부 변형일 수 있다. 전형적인 5' 말단 변형은 아미노, 카르복시, 포스페이트, 티올, 말레이미드, 알킨, 콜레스테롤, 알데히드, 탄소 스페이서, Peg-스페이서, 더블러, 트레블러, 광절단성 아미노, 광절단성 스페이서, 형광단(예를 들어, 시아닌 3, 3.5, 5, 5.5, 7, 플루오레세인 등), 비오틴, 데스티오비오틴, 디곡시게닌, 소광자(댑실(dabsyl), 댑실(dabcyl), 블랙홀(BlackHole), BBQ650 등) 또는 당업계의 숙련된 사용자에게 공지된 기타 5' 변형을 포함한다. 전형적인 3' 말단 변형은 아미노, 카르복시, 포스페이트, 티올, 알킨, 콜레스테롤, 탄소 스페이서, Peg-스페이서, 형광단(예를 들어, 시아닌 3, 3.5, 5, 5.5, 7, 플루오레세인 등), 비오틴, 데스티오비오틴, 디곡시게닌, 소광자(댑실(dabsyl), 댑실(dabcyl), 블랙홀(BlackHole), BBQ650 등) 또는 당업계의 숙련된 사용자에게 공지된 기타 3' 변형을 포함한다. 전형적인 내부 변형은 아미노-dA, 아미노-dC, 아미노-dT, 카르복시-dT, 2'O-프로파르길, 2'아미노, 2'플루오로, 2'메톡시, 5-에티닐-dU, C8-알킨-dC, C8-알킨-dT, 탄소 스페이서, Peg-스페이서, 형광단(예를 들어, 시아닌 3, 3.5, 5, 5.5, 7, 플루오레세인 등), 비오틴, 데스티오비오틴, 디곡시게닌, 소광자(댑실(dabsyl), 댑실(dabcyl), 블랙홀(BlackHole), BBQ650 등) 또는 당업계의 숙련된 사용자에게 공지된 기타 5' 변형을 포함한다. 변형은 뉴클레오티드에 부착된 알킨기일 수 있다. 변형은 뉴클레오티드에 부착된 작용기일 수 있다. 하나 이상의 말단(예를 들어 5' 및/또는 3' 말단) 뉴클레오티드는 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에서 변형될 수 있다.
RNA 나노 구조는 가장 길거나 가장 큰 치수를 따라 측정할 때 최대 마이크로미터 크기를 가질 수 있다. RNA 나노 구조의 크기는 가장 길거나 가장 큰 치수를 따라 측정할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 약 900nm일 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조의 크기는 가장 길거나 가장 큰 치수를 따라 측정할 때 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 , 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100nm 또는 그 내의 값의 임의의 범위일 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조의 크기는 가장 길거나 가장 큰 치수를 따라 측정할 때 약 1-30, 1-40, 1-50, 10-50, 10-40, 10-30, 30-50, 30-40 또는 40-50nm일 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조는 실질적으로 구형일 수 있다. 다른 측면에서 RNA 나노 구조는 삼각 평면, 삼각 피라미드, T자형, 사면체, 정사각 평면, 시소, 삼각 이중 피라미드, 사각 피라미드, 오각 평면, 팔면체, 삼각 프리즘, 오각 피라미드, 오각 이중 피라미드, 정사각 안티프리즘, 삼중으로 뚜껑을 덮은 삼각 프리즘, 뚜껑을 덮은 정사각 안티프리즘, 화살촉 모양, 화살 꼬리 모양, X자형 또는 이러한 모양의 왜곡된 버전일 수 있다.
자가 조립 핵산 나노 구조를 설계하는 원리는 핵산 가닥의 서열 상보성을 인코딩하여 상보적인 세그먼트를 짝지어 적절한 물리적 조건에서 핵산 가닥이 미리 정의된 나노 구조 내로 자가 조직화되도록 하는 것이다. 이 기본 원칙으로(예를 들어, Seeman N.C. J. Theor. Biol. 99: 237, 1982 참조, 본원에 참조로 포함됨), 연구자들은 다양한 합성 핵산 나노 구조를 만들었다(예를 들어, Seeman N.C. Nature 421: 427, 2003; Shih W.M. 등 Curr Opin Struct. Biol. 20: 276, 2010 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨). 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 핵산(예를 들어, DNA) 나노 구조 및 이러한 구조를 생산하는 방법의 예는 공지되어 있으며, 제한 없이 격자(예를 들어, Winfree E. 등 Nature 394: 539, 1998; Yan H. 등 Science 301: 1882, 2003; Yan H. 등 Proc. Natl. Acad. ofSci. USA 100; 8103, 2003; Liu D. 등 J. Am. Chem. Soc. 126: 2324, 2004; Rothemund P.W.K. 등 PLoS Biology 2: 2041, 2004 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨), 리본(예를 들어, Park S.H. 등 Nano Lett. 5: 729, 2005; Yin P. 등 Science 321: 824, 2008 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨), 튜브(예를 들어, Yan H. Science, 2003; P. Yin, 2008 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨), 정의된 모양을 갖는 유한한 2차원 및 3차원 객체(예를 들어, Chen J. 등 Nature 350: 631, 1991; Rothemund P. W. K., Nature, 2006; He Y. 등 Nature 452: 198, 2008; Ke Y. 등 Nano. Lett. 9: 2445, 2009; Douglas S. M. 등 Nature 459: 414, 2009; Dietz H. 등 Science 325: 725, 2009; Andersen E. S. 등 Nature 459: 73, 2009; Liedl T. 등 Nature Nanotech. 5: 520, 2010; Han D. 등 Science 332: 342, 2011 참조, 이들 각각은 본원에 참조로 포함됨), 및 거시적 결정(예를 들어, Meng J. P. 등 Nature 461: 74, 2009, 본원에 참조로 포함됨)이 포함된다. 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산 또는 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산의 조합일 수 있다.
RNA 나노 구조 구성요소(합성 RNA 올리고뉴클레오티드 및 모듈식 RNA 모티프는 본원에 기재된 컴퓨터 보조 설계 방법론을 사용하여 설계될 수 있다. 컴퓨터 설계는 특정 RNA 나노 구조를 사용하여 입증되었지만, 그 안에서 설명된 원리는 숙련된 기술자에 의해 임의의 원하는 RNA 나노 구조에 외삽될 수 있다는 점이 이해될 것이다.
각각의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 추가 합성 RNA 올리고뉴클레오티드와 결합할 때 염기쌍이 발생하여 가닥 간 염기쌍을 함유하거나 함유하지 않을 수 있고　DA 사이에 대칭 또는 비대칭 벌지를 형성하는 0-4개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는　코어 도메인을 둘러싼 3개 이상의 DA를 갖는 고도로 정렬된 2-D 및 3-D 구조를 생성하도록 설계할 수 있다. 각각의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 16-120개의 뉴클레오티드를 포함하도록 설계될 수 있다. 각각의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 1개 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하도록 설계될 수 있다.
본원에 기재된 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 및/또는 RNA 나노 구조의 합리적인 설계는 컴퓨팅 환경에서 수행될 수 있다. 컴퓨팅 환경에는 예를 들어 프로세서와 메모리를 가질 수 있는 적어도 하나의 프로세서 회로를 포함할 수 있는 하나 이상의 컴퓨팅 장치가 포함될 수 있다. 개시내용의 다양한 측면에 따라 컴퓨팅 환경에서 다양한 응용 프로그램 및/또는 기타 기능이 실행될 수 있다. 또한 컴퓨팅 환경에 액세스 할 수 있는 하나 이상의 데이터 스토어에 다양한 데이터를 저장할 수 있다.
예를 들어, 컴퓨팅 환경에서 실행된 구성요소는 합리적인 RNA 설계 시스템 및 본원에 자세히 설명되지 않은 기타 응용 프로그램, 서비스, 프로세스, 시스템, 엔진, 또는 기능을 포함할 수 있다. 합리적인 RNA 설계 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 및/또는 RNA 나노 구조의 설계를 용이하게 하기 위해 실행될 수 있다. 합리적인 RNA 설계 시스템은 또한 본원에 기재된 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 및/또는 RNA 나노 구조와 같은 RNA 올리고뉴클레오티드의 설계와 관련될 수 있는 다양한 백 엔드 기능을 수행할 수 있다.
합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 및 생화학 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 다시 말해, RNA 나노 입자를 형성할 수 있는 다양한 핵산은 원하는 대로 드 노보(de novo) 합성될 수 있다. 이러한 합성 기술은 숙련된 기술자에게 공지되어 있다.
약제학적 제형
본원에 기재된 RNA 복합체 또는 나노 구조의 양 및 이를 필요로 하는 개인에게 투여하기에 적합한 약제학적 담체를 포함할 수 있는 약제학적 제형이 본원에 제공된다. 이를 필요로 하는 개인은 치료 또는 예방이 필요한 암 또는 기타 질병 또는 장애를 가지고 있거나 의심될 수 있다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 이미징 절차와 같은 진단 절차가 필요하다. 약제학적 제형은 암을 치료하거나 예방하는 데 효과적일 수 있는 본원에 기재된 RNA 복합체 또는 나노 구조의 양을 포함할 수 있다.
제형은 임의의 적절한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 제형(및/또는 조성물)은 경구, 정맥 내, 안구, 안구 내, 근육 내, 질 내, 복강 내, 직장, 비경구, 국소적으로, 비강　내 또는 피하로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 적합한 경로는 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, RNA 복합체 또는 나노 구조는 유효양의 카고 분자를 함유한다.
RNA 복합체 또는 나노 구조는 용액 또는 현탁액의 형태로 주사 또는 주입과 같은 비경구 전달을 위해 제형화될 수 있다. 제형은 혈류와 같은 경로를 통해 또는 치료할 기관 또는 조직에 직접 투여될 수 있다.
비경구 제형은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수성 조성물로 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 주사 가능한 제형, 예를 들어 용액 또는 현탁액; 주사 전 재구성 매질의 첨가 시 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 적합한 고체 형태; 유중수(water-in-oil, w/o) 에멀젼, 수중유(oil-in-water, o/w) 에멀젼 및 이들의 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 에멀솜과 같은 에멀젼으로 제조될 수 있다.
담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 하나 이상의 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일(예를 들어, 땅콩유, 옥수수유, 참기름 등)과 같은 오일, 및 이들의 조합을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 기재된 RNA 나노 구조의 용액 및 분산액은 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 변형제 및 이들의 조합을 포함하되 이에 제한되지 않는 하나 이상의 제약학적으로 허용 가능한 부형제와 적합하게 혼합된 물 또는 다른 용매 또는 분산 매질에서 제조될 수 있다.
적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 표면 활성제일 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는 카르복실레이트, 설포네이트 및 설페이트 이온을 함유하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 음이온성 계면활성제는 소듐, 칼륨, 장쇄 알킬 설포네이트의 암모늄 및 알킬 아릴 설포네이트, 예컨대 소듐 도데실벤젠 설포네이트; 디알킬 소듐 설포숙시네이트, 예컨대 소듐 비스-(2-에틸티오실)-설포숙시네이트; 및 알킬 설페이트, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 적합한 양이온성 계면활성제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 세트리모늄 브로마이드, 스테아릴 디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민과 같은 4차 암모늄 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 미리스테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 폴리글리세릴-4-올레이트, 소르비탄 아실레이트, 수크로스 아실레이트, PEG-150 라우레이트, PEG-400 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 폴록사머® 401, 스테아로일 모노이소프로판올아미드 및 폴리옥시에틸렌 수소화 탈로우 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예는 소듐 N-도데실-β-알라닌, 소듐 N-라우릴-β-이미노디프로피오네이트, 미리스토암포아세테이트, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
제형은 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제에는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 제형은 또한 RNA 복합체 또는 나노 구조의 분해를 방지하기 위해 항산화제를 함유할 수 있다.
재구성시 비경구 투여를 위해 제형은 3-8의 pH로 완충될 수 있다. 적합한 완충제는 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제, 및 시트레이트 완충제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
수용성 중합체는 비경구 투여를 위한 제형에 사용될 수 있다. 적합한 수용성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 멸균 주사 가능한 용액은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 적절한 용매 또는 분산 매질에서 필요한 양으로 위에 나열된 하나 이상의 부형제에 포함시키고 필요한 경우 이어서 필터링된 멸균을 통해 제조될 수 있다. 분산액은 다양한 멸균된 RNA 복합체 또는 나노 구조를 기본 분산 매질 및 위에 나열된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말은 진공 건조 및 동결 건조 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이는 RNA 복합체 또는 나노 구조의 분말과 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 추가적인 원하는 성분을 생성한다. 분말은 입자가 본질적으로 다공성이 되는 방식으로 제조될 수 있으며, 이는 입자의 용해를 증가시킬 수 있다. 다공성 입자를 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 멸균 수용액 또는 하나 이상의 RNA 복합체 또는 나노 구조로부터 형성된 입자의 현탁액의 형태일 수 있다. 허용 가능한 용매에는 예를 들어 물, 링거 용액, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 등장성 염화나트륨 용액이 포함된다. 제형은 또한 1,3-부탄디올과 같은 무독성, 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.
경우에 따라, 제형은 액체 형태로 분포 또는 포장될 수 있다. 다른 측면에서, 비경구 투여를 위한 제형은 예를 들어 적합한 액체 제형의 동결 건조에 의해 수득된 고체로 포장될 수 있다. 고체는 투여 전에 적절한 담체 또는 희석제로 재구성될 수 있다.
비경구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 에멀젼은 안구 투여에 적합한 pH를 유지하는 데 필요한 유효량의 완충액으로 완충될 수 있다. 적합한 완충제는 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트, 시트레이트 및 포스페이트 완충액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 용액, 현탁액 또는 에멀젼은 또한 제형의 등장성 범위를 조정하기 위해 하나 이상의 장성 조절제(tonicity agent)를 함유할 수 있다. 적합한 장성 조절제는 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨 및 기타 전해질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 용액, 현탁액 또는 에멀젼은 또한 안과 제형의 박테리아 오염을 방지하기 위해 하나 이상의 방부제를 함유할 수 있다. 적합한 방부제는 폴리헥사메틸렌비구아니딘(PHMB), 벤잘코늄 클로라이드(BAK), 안정화된 옥시클로로 복합체(그 외에 Purite®라고도 함), 페닐수은 아세테이트, 클로로부탄올, 소르브산, 클로르헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤, 티메로살, 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비경구 투여를 위한 나노 제형을 포함한 나노 기술의 사용을 위한 용액, 현탁액 또는 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제, 예컨대 분산제, 습윤제 및 현탁제를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조는 국소 투여를 위해 제형화될 수 있다. 국소 투여에 적합한 투여 형태에는 크림, 연고, 살브(salves), 스프레이, 겔, 로션, 에멀젼, 액체, 및 경피 패치가 포함된다. 제형은 경점막, 경상피, 경내피 세포, 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 국소 제형은 하나 이상의 화학적 침투 향상제, 막 투과성 제제, 막 수송제, 연화제, 계면활성제, 안정화제, 및 이들의 조합을 함유할 수 있다.
일부 측면에서, RNA 복합체 또는 나노 구조는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형, 로션 또는 연고와 같은 반고체 제형, 또는 고체 제형으로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, RNA 나노 구조는 점안액과 같은 용액 및 현탁액을 포함한 액체 또는 피부, 눈, 질, 직장과 같은 점막에 대한 국소 도포를 위한 연고 또는 로션과 같은 반고체 제형으로 제형화될 수 있다.
제형은 연화제, 계면활성제, 유화제, 침투 향상제 등과 같은 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다.
적절한 연화제는 아몬드유, 피마자유, 세라토니아 추출물, 세토스테아로일 알코올, 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 콜레스테롤, 면실유, 사이클로메티콘, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 라놀린, 레시틴, 광 미네랄 오일, 중쇄 트리글리세리드, 미네랄 오일 및 라놀린 알코올, 페트로라튬 및 라놀린 알코올, 대두유, 전분, 스테아틸 알코올, 해바라기유, 자일리톨 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 연화제는 에틸헥실스테아레이트 및 에틸헥실 팔미테이트일 수 있다.
적합한 계면활성제는 유화 왁스, 글리세릴 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 사이클로덱스트린, 글리세린 모노스테아레이트, 폴록사머, 포비돈 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 계면활성제는 스테아릴 알코올일 수 있다.
적합한 유화제는 아카시아, 금속 비누, 특정 동물 및 식물성 오일 및 다양한 극성 화합물, 음이온성 유화 왁스, 칼슘 스테아레이트, 카르보머, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레이트, 하이드록스프로필 셀룰로스, 하이프로멜로스, 라놀린, 하이드러스, 라놀린 알코올, 레시틴, 중쇄 트리글리세리드, 메틸 셀룰로스, 미네랄 오일 및 라놀린 알코올, 모노베이식 소듐 포스페이트, 모노에탄올아민, 비이온성 유화 왁스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머들. 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자가 유화 글리세릴 모노스테아레이트, 소듐 시트레이트 데히드레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기유, 트라가칸트, 트리에탄올아민, 크산탄 검 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 유화제는 글리세롤 스테아레이트일 수 있다.
적절한 종류의 침투 향상제는 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 지방산, 지방 알코올 에테르, 아미노산, 인지질, 레시틴, 콜레이트 염, 효소, 아민 및 아미드, 복합제(리포솜, 사이클로덱스트린, 변형된 셀룰로스, 및 디이미드), 거대 고리, 예컨대, 거대 고리 락톤, 케톤, 및 무수물 및 고리형 우레아, 계면활성제, N-메틸 피롤리돈 및 이들의 유도체, DMSO 및 관련 화합물, 이온성 화합물, 아존 및 관련 화합물 및 알코올, 케톤, 아미드, 폴리올(예를 들어, 글리콜)과 같은 용매를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적절한 에멀젼에는 수중유 및 유중수 에멀젼이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 에멀젼의 둘 중 하나 또는 두 개의 상은 계면활성제, 유화제 및/또는 액체 비휘발성 비수성 물질을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 다른 측면에서, 유화제는 유화 왁스이다. 추가 측면에서, 액체 비휘발성 비수성 물질은 글리콜이다. 일부 측면에서, 글리콜은 프로필렌 글리콜이다. 오일상은 다른 적합한 오일성의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 오일성의 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 계면활성제 또는 유화제로서 오일상에서 사용할 수 있는 하이드록실화된 피마자유 또는 참기름을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 나노 구조를 함유하는 로션이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 로션은 100 내지 1000 센티스토크의 점도를 갖는 에멀젼의 형태일 수 있다. 로션의 유동성은 넓은 표면적에 빠르고 균일하게 도포되는 것을 가능하게 할 수 있다. 로션은 피부 상에서 말라 피부 표면에 의약 구성요소의 얇은 코팅을 남기도록 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 크림이 또한 제공된다. 크림은 유화제 및/또는 기타 안정화제를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 크림은 1000 센티스토크보다 큰 점도를 가진 크림의 형태이며, 일반적으로 20,000-50,000 센티스토크의 범위이다. 연고와 비교할 때 크림은 펴지기 더 쉽고 제거하기 더 쉬울 수 있다.
크림과 로션의 한 가지 차이점은 점도이며, 이는 다양한 오일의 양/사용 및 제형을 제조하는 데 사용되는 물의 백분율에 따라 달라진다. 크림은 로션보다 두꺼울 수 있고, 다양한 용도를 가질 수 있으며 피부에 대한 원하는 영향에 따라 더 다양한 오일/버터를 가질 수 있다. 크림 제형의 일부 측면에서, 총 100%에서 물 기반 백분율은 약 60% 내지 약 75%가 될 수 있으며, 오일 기반 백분율은 전체의 약 20% 내지 약 30%가 될 수 있으며, 다른 백분율은 유화제, 방부제 및 첨가제일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 연고 및 적합한 연고기제가 또한 제공된다. 적합한 연고기제는 탄화수소 기제(예를 들어, 페트로라튬, 백색 페트로라튬, 황색 연고, 및 미네랄 오일); 흡수 기제(친수성 페트로라튬, 무수 라놀린, 라놀린, 및 콜드 크림); 수-제거성 기제(예를 들어, 친수성 연고) 및 수용성 기제(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 연고)를 포함한다. 페이스트는 일반적으로 더 많은 백분율의 고체를 함유한다는 점에서 연고와 다르다. 페이스트는 일반적으로 동일한 구성요소로 제조된 연고보다 더 흡수성이고 기름기가 적다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조, 겔링 제제 및 액체 비히클을 함유하는 겔이 본원에 기재되어 있다. 적합한 겔링 제제는 변형된 셀룰로스, 예컨대 하이드록시 프로필 셀룰로스 및 하이드록시에틸 셀룰로스; 카르보폴 호모폴리머 및 공중합체; 열가역적 겔 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 액체 비히클의 적합한 용매는 디글리콜 모노에틸 에테르; 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜; 디메틸 이소소르비드; 이소프로필 알코올 및 에탄올과 같은 알코올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용매는 약물을 용해시키는 능력을 위해 선택될 수 있다. 피부 느낌 및/또는 제형의 연화성을 향상시킬 수 있는 다른 첨가제 또한 내포될 수 있다. 이러한 첨가제는 이소프로필 미리스테이트, 에틸 아세테이트, C12-C15 알킬 벤조에이트, 미네랄 오일, 스쿠알란, 사이클로메티콘, 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 포함할 수 있는 폼이 본원에 기재되어 있다. 폼은 가스 추진제가 포함된 에멀젼일 수 있다. 가스 추진제는 히드로플루오로알칸(HFA)을 포함할 수 있다. 적합한 추진제에는 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227)과 같은 HFA가 포함되지만 현재 의료용으로 승인되었거나 승인될 수 있는 이들의 혼합물 및 혼화제 및 기타 HFA도 적절하다. 추진제는 탄화수소 추진제 가스가 없을 수 있으며, 이는 분무 동안 가연성 또는 폭발성 증기를 생성할 수 있다. 또한, 폼은 휘발성 알코올을 함유하지 않을 수 있으며, 이는 사용 중에 가연성 또는 폭발성 증기를 생성할 수 있다.
완충액은 조성물의 pH를 조절하는 데 사용될 수 있다. 완충액은 약 4의 pH에서 약 7.5의 pH로, 약 4의 pH에서 약 7의 pH로, 또는 약 5의 pH에서 약 7의 pH로 조성물을 완충할 수 있다. 일부 측면에서, 완충액은 트리에탄올아민일 수 있다.
곰팡이 및 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제가 포함될 수 있다. 적합한 방부제는 벤조산, 부틸파라벤, 에틸 파라벤, 메틸 파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 소듐 프로피오네이트, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 및 티메로살을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 측면에서, 제형은 이를 필요로 하는 환자에게 하나 이상의 제형을 지속적으로 전달함으로써 제공될 수 있다. 국소 도포의 경우, 반복 도포가 수행될 수 있거나 패치를 사용하여 장기간에 걸쳐 노스카핀 유사체의 지속적인 투여를 제공할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조는 경구 투여용과 같은 경장 제형으로 제조될 수 있다. 적절한 경구 투여 형태에는 정제, 캡슐, 용액, 현탁액, 시럽, 및 로젠지가 포함된다. 정제는 당업계에 잘 알려진 압축 또는 성형 기술을 사용하여 만들 수 있다. 젤라틴 또는 비젤라틴 캡슐은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 액체, 고체, 및 반고체 충전 재료를 캡슐화할 수 있는 경질 또는 연질 캡슐 쉘로 제조될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 제형은 제약학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "담체"는 희석제, 방부제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 팽윤제, 충전제, 안정화제, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 투여 형태에 사용된 중합체는 적합한 소수성 또는 친수성 중합체 및 적합한 pH 의존적 또는 독립적인 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 소수성 및 친수성 중합체는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시 메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸셀룰로스, 미세 결정 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아세테이트, 및 이온 교환 수지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "담체"에는 또한 가소제, 안료, 착색제, 안정화제 및 활택제를 포함할 수 있는 코팅 조성물의 모든 구성요소가 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 제형은 희석제, 방부제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 팽윤제, 충전제, 안정화제, 및 이들의 조합을 포함한 하나 이상의 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 지연 방출 투여 제형은 "Pharmaceutical dosage form tablets", Liberman 등 편집 (New York, Marcel Dekker, Inc., 1989), "Remington - The science and practice of pharmacy", 20판, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, 및 "Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems", 6판, Ansel 등, (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995)과 같은 표준 참조문헌에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 이러한 참조문헌은 정제 및 캡슐, 지연 방출 투여 형태의 정제, 캡슐 및 과립을 제조하기 위한 부형제, 재료, 장비, 및 공정에 대한 정보를 제공합니다. 이러한 참조문헌은 정제 및 캡슐, 지연 방출 투여 형태의 정제, 캡슐 및 과립을 제조하기 위한 담체, 재료, 장비. 및 공정에 대한 정보를 제공합니다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 제형은 예를 들어 입자가 위의 산성 환경을 통과한 후에 방출을 지연시키기 위해 적합한 코팅 물질로 코팅될 수 있다. 적합한 코팅 물질은 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 및 하이드록시프로필 메틸 룰로스 숙시네이트; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 아크릴산 중합체 및 공중 합체 및 상표명 EUDRAGIT®(Roth Pharma, 서부도시(Westerstadt), 독일)로 시판되는 메타크릴 수지, 제인(zein), 셸락(shellac), 및 다당류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
원하는 방출 프로파일을 생성하기 위해 비수용성/수용성 비중합체 부형제가 포함되거나 포함되지 않은 수용성 중합체, 비수용성 중합체 및/또는 pH 의존적 중합체의 상이한 비율로 코팅을 형성할 수 있다. 코팅은 정제(코팅 비드 포함 또는 미포함 압축), 캡슐(코팅 비드 포함 또는 미포함), 비드, 입자 조성물, 현탁액 형태 또는 뿌리는 투여 형태(이에 제한되지 않음)로 제형화된 "있는 그대로의 성분"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여 형태(매트릭스 또는 단순 형태)에서 수행할 수 있다.
또한, 코팅 재료는 기존의 담체, 예컨대 가소제, 안료, 착색제, 활택제, 안정화제, 기공 형성제 및 계면활성제를 함유할 수 있다. 옵션의 제약학적으로 허용 가능한 부형제는 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 안정화제 및 계면활성제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"충전제"라고도 하는 희석제는 정제의 압축 또는 비드 및 과립의 형성을 위해 실용적인 크기가 제공되도록 대량의 고체 투여 형태를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 희석제는 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트, 칼슘 설페이트, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 미세 결정 셀룰로스, 카올린, 염화나트륨, 건조 전분, 가수분해된 전분, 호화 전분, 실리콘 디옥사이드, 티타늄 옥사이드, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 분당을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적인 희석제는 비활성 분말 물질, 예컨대 전분, 분말 셀룰로스, 특히 결정 및 미세 결정 셀룰로스, 당, 예컨대 프록토오스, 만니톨 및 수크로스, 곡물 가루 및 유사한 식용 파우더를 포함한다. 전형적인 희석제는 예를 들어 다양한 유형의 전분, 락토스, 만니톨, 카올린, 칼슘 포스페이트 또는 설페이트, 염화나트륨과 같은 무기 염 및 분당을 포함한다. 분말 셀룰로스 유도체 또한 유용하다.
결합제는 고체 투여 제형에 응집성을 부여하여 정제나 비드 또는 과립이 투여 제형 형성 후에도 온전한 상태를 유지할 수 있도록 한다. 적합한 결합제 재료는 전분, 호화 전분, 젤라틴, 당(수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 락토스 및 소르비톨 포함), 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트, 소듐 알기네이트, 셀룰로스(하이드록시프로피메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 에틸셀룰로스 포함), 및 비검(veegum), 및 합성 중합체, 예컨대 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리아크릴산/폴리메타크릴산 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적인 정제 결합제는 전분, 젤라틴 및 당, 예컨대 락토스, 프록토오스 및 글루코스와 같은 물질을 포함한다. 아카시아, 알기네이트, 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한 천연 및 합성 검도 사용될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜, 친수성 중합체, 에틸셀룰로스 및 왁스는 또한 결합제로서 작용할 수 있다.
윤활제는 정제 제조를 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 적합한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세롤비헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 활석, 및 미네랄 오일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 윤활제는 정제 제형에 포함되어 정제와 펀치가 다이에 달라붙는 것을 방지할 수 있다. 윤활제는 활석, 마그네슘 및 칼슘 스테아레이트, 스테아르산 및 수소화 식물성 오일과 같은 미끄러운 고체로부터 선택될 수 있다.
붕해제는 투여 후 투여 형태의 붕괴 또는 "파손"을 촉진하는데 사용될 수 있으며, 일반적으로 전분, 소듐 전분 글리콜레이트, 소듐 카르복시메틸 전분, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 호화 전분, 클레이, 셀룰로스, 알기닌, 검 또는 가교된 중합체, 예컨대 가교된 PVP(GAF Chemical Corp의 Polyplasdone® XL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
안정화제는 예를 들어 산화 반응을 포함하여 약물 분해 반응을 억제하거나 지연시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 안정화제는 산화 방지제, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT); 아스코르브산, 이의 염 및 에스테르; 비타민 E, 토코페롤 및 이의 염; 설페이트, 예컨대 소듐 메타비설파이트; 시스테인 및 이의 유도체; 시트르산; 프로필 갈레이트, 및 부틸화 하이드록시아니솔(BHA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, RNA 복합체 또는 나노 구조를 함유하는 약제학적 제형에 하나 이상의 추가 활성제가 포함된다. 적절한 추가 활성제는 DNA, RNA, 변형된 리보뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 압타머, 리보자임, 필수 종양 단백질 및 유전자의 번역 또는 전사를 억제하는 리보자임에 대한 서열, 호르몬, 면역조절제, 해열제, 항불안제, 항정신병제, 진통제, 진경제, 항염증제, 항히스타민제, 항감염제, 및 화학치료제(항암 약물)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 추가 활성제는 증감제(예컨대 방사선 증감제)를 포함한다. RNA 나노 구조는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 단일 요법 또는 다른 활성 작용제와 함께 사용될 수 있다.
적합한 호르몬은 아미노산 유래 호르몬(예를 들어, 멜라토닌 및 티록신), 작은 펩티드 호르몬 및 단백질 호르몬(예를 들어, 티로트로핀-방출 호르몬, 바소프레신, 인슐린, 성장 호르몬, 황체 형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 및 갑상선 자극 호르몬), 아이코사노이드(예를 들어, 아라키돈산, 리폭신, 및 프로스타글란딘) 및 스테로이드 호르몬(예를 들어, 에스트라디올, 테스토스테론, 테트라히드로 테스토스테론 코르티솔)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 면역 조절제는 프레드니손, 아자티오프린, 6-MP, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 메토트렉세이트, 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-7 및 IL-12), 시토카인(예를 들어, 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω 및 IFN-γ), 과립구 집단 자극 인자, 및 이미퀴모드), 케모카인(예를 들어, CCL3, CCL26 및 CXCL7), 시토신 포스페이트-구아노신, 올리고데옥시뉴클레오티드, 글루칸, 항체 및 압타머를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 진통제는 파라세타몰/아세트아미노펜, 비스테로이드성 항염증제(예를 들어, 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 및 니메설라이드), COX-2 억제제(예를 들어, 로페콕시브, 셀레콕시브, 및 에토리콕시브), 오피오이드(예를 들어, 모르핀, 코데인, 옥시코돈, 히드로코돈, 디히드로모르핀, 페티딘, 부프레노르핀), 트라마돌, 노르에피네프린, 플루피르틴, 네포팜, 오르페나드린, 프레가발린, 가바펜틴, 사이클로벤자프린, 스코폴라민, 메타돈, 케토베미돈, 피리트라미드, 및 아스피린 및 관련 살리실레이트(예를 들어, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트 및 소듐 살리실레이트)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 진경제에는 메베버린, 파프베린, 사이클로벤자프린, 카리소프로돌, 오르페나드린, 티자니딘, 메탁살론, 메토드카르바몰, 클로르족사존, 바클로펜, 단트롤렌, 바클로펜, 티자니딘, 및 단트롤렌이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 항염증제는 프레드니손, 비스테로이드성 항염증제(예를 들어, 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 및 니메설라이드), COX-2 억제제(예를 들어, 로페콕시브, 셀레콕시브, 에토리콕시브), 및 면역 선택적 항염증 유도체(예를 들어, 턱밑샘 펩티드-T 및 이의 유도체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 항-히스타민제는 H1-수용체 길항제제(예를 들어, 아크리바스틴, 아젤라스틴, 빌라스틴, 브롬페니라민, 부클리진, 브로모디펜하이드라민, 카르비녹사민, 세티리진, 클로르프로마진, 시클리진, 클로르페니라민, 클레마스틴, 시프로헵타딘, 데슬로라타딘, 덱스브롬아페니라민, 덱스클로르페니라민, 디멘히드리네이트, 디메틴덴, 디펜히드라민, 독실아민, 에바신, 엠브라민, 펙소페나딘, 하이드록시진, 레보세티르진, 로라타딘, 메클로진, 미르타자핀, 올로파타딘, 오르페나드린, 페닌다민, 페니라민, 페닐톨록사민, 프로메타진, 피릴라민, 쿠에티아핀, 루파타딘, 트리펠레나민 및 트리프롤리딘), H2-수용체 길항제(예를 들어, 시메티딘, 파모티딘, 라푸티딘, 니자티딘, 라피티딘 및 록사티딘), 트리토쿠알린, 카테킨, 크로모글리케이트, 네도크로밀, 및 β2-아드레날린 작용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 항감염제는 항아메바제(예를 들어, 니타족사니드, 파로모마이신, 메트로니다졸, 티니다졸, 클로로퀸, 및 아이오도퀴놀), 아미노글리코시드(예를 들어, 파로모마이신, 토브라마이신, 젠타마이신, 아미카신, 카나마이신 및 네오마이신), 구충제(예를 들어, 피란텔, 메벤다졸, 이베르멕틴, 프라지콴텔, 아벤다졸, 밀테포신, 티아벤다졸, 옥삼니퀸), 항진균제(예를 들어, 아졸 항진균제(예를 들어, 이트라코나졸, 플루코나졸, 포사코나졸, 케토코나졸, 클로트리마졸, 미코나졸 및 보리코나졸), 에키노칸딘(예를 들어, 카스포펀진, 아니둘라펀진 및 미카펀진), 그리세오풀빈, 테르비나핀, 플루시토신 및 폴리엔(예를 들어, 나이스타틴 및 암포테리신 b), 항말라리아제(예를 들어, 피리메타민/설파독신, 아르테메터/루메판트린, 아토바쿠온/프로쿠아닐, 퀴닌, 하이드록시클로로퀸, 메플로퀸, 클로로퀸, 독시사이클린, 피리메타민 및 할로판트린), 항결핵제(예를 들어, 아미노살리실레이트(예를 들어, 아미노살리실산), 이소니아지드/리팜핀, 이소니아지드/피라진아미드/리팜핀, 베다퀼린, 이소니아지드, 에탐부톨, 리팜핀, 리파부틴, 리파펜틴, 카프레오마이신 및 사이클로세린), 항바이러스제(예를 들어, 아만타딘, 리만타딘, 아바카비르/라미부딘, 엠트리시타빈/테노포비르, 코비시스타트/엘비테그라비르/엠트리시타빈/테노포비르, 에파비렌즈/엠트리시타빈/테노포비르, 아바카비르/라미부딘/지도부딘, 라미부딘/지도부딘, 엠트리시타빈/테노포비르, 엠트리시타빈/오피나비르/리토나비르/테노포비르, 인터페론 알파-2v/리바비린, 페그인터페론 알파-2b, 마라비로크, 랄테그라비르, 돌루테그라비르, 엔푸비르티드, 포스카넷, 포미비르센, 오셀타미비르, 자나미비르, 네비라핀, 에파비렌즈, 에트라비린, 릴피비린, 델라비리딘, 네비라핀, 엔테카비르, 라미부딘, 아데포비르, 소포스부비르, 디다노신, 테노포비르, 아바시비르, 지도부딘, 스타부딘, 엠트리시타빈, 잘시타빈, 텔비부딘, 시메프레비르, 보세프레비르, 텔라프레비르, 로피나비르/리토나비르, 포삼프렌비르, 드라누아비르, 리토나비르, 티프라나비르, 아타자나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 인디나비르, 사위나비르, 리바비린, 발사이클로비르, 아사이클로비르, 팜시클로비르, 간시클로비르 및 발간시클로비르), 카르바페넴(예를 들어, 도리페넴, 메로페넴, 에르타페넴 및 실라스타틴/이미페넴), 세팔로스포린(예를 들어, 세파드록실, 세프라딘, 세파졸린, 세팔렉신, 세페핌, 세플라롤린, 로라카르베프, 세포테탄, 세푸록심, 세프프로질, 로라카르베프, 세폭시틴, 세파클로르, 세프티부텐, 세프트리악손, 세포탁심, 세프포독심, 세프디니르, 세픽심, 세프디토렌, 세피족심 및 세프타지딤), 글리코펩티드 항생제(예를 들어, 반코마이신, 달바반신, 오리타반신 및 텔반신), 글리실사이클린(예를 들어, 티제사이클린), 나균저지제(예를 들어, 클로파지민 및 탈리도미드), 린코마이신 및 이의 유도체(예를 들어, 클린다마이신 및 린코마이신), 매크로라이드 및 이의 유도체(예를 들어, 텔리트로마이신, 피닥소마이신, 에르트로마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신 및 트롤레안도마이신), 리네졸리드, 설파메톡사졸/트리메토프림, 리팍시민, 클로람페니콜, 포스포마이신, 메트로니다졸, 아즈트레오남, 바시트라신, 베타 락탐 항생제(벤자틴 페니실린(벤자틴 및 벤질페니실린), 페녹시메틸페니실린, 클록사실린, 플루클록사실린, 메티실린, 테모실린, 메실리남, 아즐로실린, 메클로실린, 피페라실린, 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 피페라실린, 티카르실린, 아목시실린/클라불라네이트, 암피실린/설박탐, 피페라실린/타조박탐, 클라불라네이트/티카르실린, 페니실린, 프로카인 페니실린, 옥사실린, 디클록사실린 및 나프실린, 세파콜린, 세팔렉신, 세팔로스포린 C, 세팔로틴 세파클로르, 세파만돌, 세푸록신 세포테탄, 세폭시틴, 세픽시민, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤 데프트리악손, 세페핌, 세프피롬 세프타롤린, 비아페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴, 페로페넴, 파니페넴, 라주페넴, 테비페넴, 티에나마이신, 아즈레오남, 티게모남, 노카르디신 A, 타보시닌, 및 베타-락탐), 퀴놀론(예를 들어, 로메플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 콰티플록사신, 목시플록사신, 시프로플록사신, 레보플록사신, 제미플록사신, 목시플록사신, 시녹사신, 날리딕스산, 에녹사신, 그레파플록사신, 가티플록사신, 트로바플록사신 및 스파르플록사신), 설폰아미드(예를 들어, 설파메톡사졸/트리메토프림, 설파살라진 및 설파속사졸), 테트라사이클린(예를 들어, 독시사이클린, 데메클로사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린/살리실산, 독시사이클린/오메가-3 다중불포화 지방산 및 테트라사이클린) 및 비뇨기 항감염제(예를 들어, 니트로푸란토인, 메텐아민, 포스포마이신, 시녹사신, 날리딕스산, 트리메토프림 및 메틸렌 블루)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적합한 화학치료제는 파클리탁셀, 브렌툭시맙 베도틴, 독소루비신, 5-FU(플루오로우라실), 에베롤리무스, 페메트렉시드, 멜팔란, 파미드로네이트, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 넬라라빈, 오파투무맙, 베바시주맙, 벨리노스타트, 토시투모맙, 카르무스틴, 블레오마이신, 보수티닙, 부설판, 알렘투주맙, 이리노테칸, 반데타닙, 비칼루타미드, 로무스틴, 다우노루비신, 클로파라빈, 카보잔티닙, 닥티노마이신, 라무시루맙, 시타라빈, 시톡산, 사이클로포스파미드, 데시타빈, 덱사메타손, 도세탁셀, 하이드록시우레아, 데카르바진, 류프롤리드, 에피루비신, 옥살리플라틴, 아스파라기나제, 에스트라무스틴, 세툭시맙, 비스모데깁, 아스파르기나제 에르위니아 크리산테미, 아미포스틴, 에토포시드, 플루타미드, 토레미펜, 풀베스트란트, 레트로졸, 데가렐릭스, 프랄라트렉세이트, 메토트렉세이트, 플록슈리딘, 오비누투주맙, 젬시타빈, 아파티닙, 이마티닙 메실라템, 카르무스틴, 에리불린, 트라스투주맙, 알트레타민, 토포테칸, 포나티닙, 이다루비신, 이포스파미드, 이브루티닙, 악시티닙, 인터페론 알파-2a, 제피티닙, 로미뎁신, 익사베필론, 룩솔리티닙, 카바지탁셀, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 카르필조밉, 클로람부실, 사르그라모스팀, 클라드리빈, 미토탄, 빈크리스틴, 프로카르바진, 메게스트롤, 트라메티닙, 메스나, 스트론튬-89 클로라이드, 메클로르에타민, 미토마이신, 부설판, 젬투주맙 오조가미신, 비노렐빈, 필그라스팀, 페그필그라스팀, 소라페닙, 닐루타미드, 펜토스타틴, 타목시펜, 미톡산트론, 페그아스파르가제, 데니류킨 디프티톡스, 알리트레티노인, 카르보플라틴, 퍼투주맙, 시스플라틴, 포말리도미드, 프레드니손, 알데스류킨, 머캅토퓨린, 졸레드론산, 레날리도미드, 리툭시맙, 옥트레티드, 다사티닙, 레고라페닙, 히스트렐린, 수니티닙, 실툭시맙, 오마세탁신, 씨오구아닌(티오구아닌), 다브라페닙, 에를로티닙, 벡사로텐, 테모졸로미드, 티오테파, 탈리도미드, BCG, 템시롤리무스, 벤다무스틴 하이드로클로라이드, 트립토렐린, 비소삼산화물, 라파티닙, 발루비신, 파니투무맙, 빈블라스틴, 보르테조밉, 트레티노인, 아자시티딘, 파조파닙, 테니포시드, 류코보린, 크리조티닙, 카페시타빈, 엔잘루타미드, 이필리무맙, 고세렐린, 보리노스타트, 이델라리십, 세리티닙, 아비라테론, 에포틸론, 타플루포시드, 아자티오프린, 독시플루리딘, 빈데신 및 올-트랜스레티노산, 및 본원에 다른 곳에 나열된 기타 항암제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 복합체 및 나노 구조 및 이들의 제형을 사용하는 방법
본원에 제공된 바와 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조는 이들을 필요로 하는 대상체, 세포 또는 이들의 집단에 투여될 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 뉴클레오시드 유사체로부터 이익을 얻을 암 또는 기타 질병 또는 장애를 가질 수 있다. 전달된 양은 본원에 제공된 유효량의 RNA 복합체 또는 나노 구조일 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 증상이 있거나 무증상일 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 RNA 복합체 또는 나노 구조는 다른 활성제와 공동으로 투여될 수 있다. 공동 투여된 것은 제형에 포함되거나 RNA 복합체 또는 나노 구조 또는 이들의 제형으로부터 분리된 투여 형태로 제공되는 추가 화합물을 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 본원에 기재된 것과 같은 RNA 복합체 또는 나노 구조 또는 이들의 제형의 유효량은 약 0.1mg/kg 내지 약 500mg/kg의 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 유효량은 약 0.1mg/kg 내지 10mg/kg이다. 부가적 측면에서, 유효량은 약 0.1mg/kg 내지 100mg/kg이다. 추가 측면에서, 유효량은 약 0.1mg 내지 약 1000mg이다. 일부 측면에서, 유효량은 약 500mg 내지 약 1000mg 일 수 있다.
RNA 복합체 또는 나노 구조 및 이들의 제형의 투여는 전신 또는 국소화될 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및 제형은 하루에 한 번 이상 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 일 측면에서, 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 하루에 한 번 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 하루에 한 번 투여될 수 있다. 일 측면에서, 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 하루에 두 번 투여될 수 있다. 다른 측면에서, 투여될 때, 유효량의 화합물 및/또는 제형이 그 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다. 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 일주일에 한 번 이상 투여될 수 있다. 일부 측면에서 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 일주일에 1일 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 화합물(들) 및/또는 이들의 제형(들)은 일주일에 2일 내지 7일 투여될 수 있다.
일부 측면에서, RNA 복합체 또는 나노 구조 및/또는 이들의 제형은 투여 형태로 투여될 수 있다. 화합물(들) 및/또는 이들의 제형의 양 또는 유효량은 다수의 투여 형태로 나눌 수 있다. 예를 들어, 유효량은 두 가지 투여 형태로 분할될 수 있고, 예를 들어, 아침에 제1 투여 형태를 투여할 수 있으며, 제2 투여 형태는 저녁에 투여될 수 있다. 유효량은 두 번에 걸쳐 투여되지만 피험자는 하루에 유효량을 투여 받는다. 일부 측면에서 유효량은 하루에 약 0.1 내지 약 1000mg이다. 투여 형태의 유효량은 약 0.1mg/kg 내지 약 1000mg/kg의 범위일 수 있다. 투여 형태는 경구, 질, 정맥 내, 경피, 피하, 복강 내 또는 근육 내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 다양한 투여 경로에 대한 투여 형태의 제조는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
본원에 기재된 모듈식 RNA 모티프 및 본원에 기재된 RNA 복합체 또는 나노 구조는 질병 또는 암의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 다수의 실시예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시예는 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1:
도 2는 유방암 세포주에서 RNA-UB5F 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다.
도 3은 유방암 세포주에서 RNA-CR2FF 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다.
도 4는 유방암 세포주에서 RNA-CR2FF-UB5F 나노 입자의 세포 독성 연구 결과를 보여준다
도 5는 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥을 보여준다
도 6은 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 이에 연결된 연장부가 포함된 안티 센스 가닥을 보여준다
도 7은 서바이빈-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 인접한 연장부 RNA 구조를 갖는 안티 센스 가닥을 보여준다
도 8은 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥을 보여준다
도 9는 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 이에 연결된 연장부가 포함된 안티 센스 가닥을 보여준다
도 10은 RRM2-이중 가닥 구조: 3' 콜레스테롤 및 젬시타빈(Y)을 포함한 센스 가닥 및 인접한 연장부 RNA 구조를 갖는 안티 센스 가닥을 보여준다
도 11은 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체중 변화 연구 결과를 보여주는 곡선.
도 12는 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체중 변화 연구 결과를 보여주는 히스토그램.
도 13은 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체내 전이 억제 연구의 결과를 보여준다.
도 14는 인간 결직장 선암종 세포 폐 전이 동물 모델에서 RNA-CR2FF-콜레스테롤 나노 입자의 체외 전이 억제 연구의 결과를 보여준다.
실시예 2: siRNA와 젬시타빈을 운반하는 비독성 RNA 미셀에 의한 폐 CRC 전이의 효율적인 억제
재료 및 방법
RNA 미셀의 합성
원팟 단일 단계 조립을 사용하여 젬시타빈과 서바이빈 또는 RRM2 siRNA를 보유한 RNA-미셀을 구성하였다. 각각의 미셀은 두 가지 구성요소 가닥으로 구성되었다: 1) 콜레스테롤-젬시타빈-센스-siRNA 및 2) 안티-센스 siRNA. RNA 가닥은 고체상 합성과 시판되는 2′-TBDMS 아데노신(n-bz) CED의 포스포아미다이트 모노머, 2′-TBDMS 구아노신(n-ibu) CED, N4-벤조일-2'-데옥시-5'-O-DMT-2',2'-디플루오로시티딘 3'-CE 포스포아미다이트(젬시타빈 아미다이트), 및 2′-플루오로 우리딘 CED를 사용하여 제조하였고, 그 후 제조업체(Azco Biotech)가 제공하는 프로토콜에 따라 디프로텍션(deprotection)하였다. 콜레스테롤은 제조업체 지침에 따라 3'-콜레스테릴-TEG CPG(Glen Research Corp.)를 사용하여 센스 siRNA 가닥의 3'-말단에 부착되는 것을 지원한다. Alexa-Fluor 647 라벨은 콜레스테롤-젬시타빈-센스 siRNA 가닥의 미셀에 포함되었다. 접합 반응은 0.1 M 중탄산나트륨 완충액, pH = 8.5에서 1:10 몰 비율의 1차 아민 라벨링 RNA:NHS 에스테르-형광단을 혼합하여 수행하였다. 접합 반응은 전술한 바와 같이 빛으로부터 보호되는 동안 16시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다(Ghimire, C., 등 ACS Nano 2020, 14:13180-13191). 합성된 RNA는 이온쌍 역상 컬럼을 사용하여 종결 가닥으로부터 정제되며, 이는 일반적으로 고체상 합성 동안 콜레스테롤로의 완전한 라벨링을 산출한다.
서열:
콜레스테롤-젬시타빈-서바이빈 센스
5'-XXGYAGGXXYYXXAXYXGXYAXXAYAXAYAYYYX-3' - 콜레스테롤(서열번호: 274), 여기서 Y는 젬시타빈이고 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
서바이빈 안티-센스
5'-UGACAGAUAAGGAACCUGC-3'(서열번호: 1)
서바이빈 안티-센스-연장부
5'- GGGXGXAXGXAAUGACAGAUAAGGAACCUGC-3'(서열번호: 275), 여기서 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
콜레스테롤-젬시타빈-RRM2 센스
5'- XXGCGAXXXAGCCAAGAAGXXCAXXACAXACACCCX-3'(서열번호: 276), 여기서 Y는 젬시타빈이고 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
RRM2 안티-센스
5'- UGAACUUCUUGGCUAAAUCGC-3'(서열번호: 2)
콜레스테롤-젬시타빈-서바이빈 센스-Alexa647
5' Alexa647-XXGYAGGXXYYXXAXYXGXYAXXAYAXAYAYYYX-3' Cholesterol (서열번호: 277), 여기서 Y는 젬시타빈이고 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
젬시타빈-서바이빈 센스
5'- XXGYAGGXXYYXXAXYXGXYAXXACAXAYAYYYX-3'(서열번호: 278), 여기서 Y는 젬시타빈이고 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
서바이빈 센스
5'- GCAGGXXCCXXAXCXGXCAXX-3'(서열번호: 279), 여기서 Y는 젬시타빈이고 X는 2'-F 우리딘(플록슈리딘)이다.
두 가지 구성요소 미셀 가닥을 TMS 완충액(50mM Tris pH = 8.0, 100mM NaCl, 10mM MgCl2) 또는 PBS 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 및 2mM KH2PO4, pH 7.4) 내 동일한 몰 농도에서 혼합하여 미셀 내로 조립한 다음 전술한 대로 95℃로 5분 동안 가열하고 45분에 걸쳐 4℃로 천천히 냉각하였다(Shu, Y., 등 J. Control. Release 2018, 276:17-29; Yin, H., 등 ACS Nano 2019, 13:706-717; Guo, S., 등 Nat. Commun. 2020, 11:972-982; Li, H., 등 Adv. Mater. 2016, 28:7501-7507; Khisamutdinov, E. F., 등 Nucleic Acids Res. 2014, 42:9996-10004).
RNA 미셀의 특성화
1% 아가로스 겔을 사용하여 4℃, 100V에서 30분 동안 TAE 러닝 완충액에서 실행한 아가로스 겔 전기영동을 통해 RNA-미셀의 형성 여부를 분석하였다.
미리 조립된 RNA-미셀의 겉보기 유체역학적 크기 및 제타 전위를 측정하였다. 모든 RNA 샘플은 디에틸피로카르보네이트 H2O 및 PBS 완충액(137mmol/l NaCl, 2.7mmol/l KCl, 100mmol/l Na2HPO4, 2mmol/l KH2PO4, pH 7.4) 내 25℃에서 측정하였다.
세포 배양물
CO2 및 습한 분위기에서, 인간 CRC 세포주 HT29, HT29 G-L 폐M3을 5% 37℃ 인큐베이터에서 10% 소태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신 둘 다를 함유하는 배지에서 성장시키고 배양하였다.
NRA 미셀의 시험관내 증식 분석
세포 세포독성은 제조업체 지침에 따라 CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(Promega)을 사용하여 연구되었다. 간략하게, 5 × 103 HT29 세포를 밤새 96-웰 플레이트 상에 시딩하였다. RNA 미셀, 유리 젬시타빈 및 siRNA를 각 웰에 5, 25, 100 및 250nM의 젬시타빈 농도에서 3중(triplicate)으로 첨가하였다. 가습 5% CO2 환경에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 15μL의 MTT 염료 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 어둠에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 50μL 가용화 용액/정지 혼합물을 어둠에서 결정을 용해시키기 위해 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막으로, 각 웰의 결정을 균일하게 착색된 용액에 완전히 용해시키고 570nm에서의 흡광도를 Synergy 4 Microplate Reader(Bio-Tek)로 측정하였다. 데이터는 Gen5에 의해 수집되었고, 정규화된 데이터는 Origin을 사용하여 플롯팅하였다.
체내 종양 발달
암컷 및 수컷 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Wjl/SzJNCr 누드(8주령) 마우스를 Jackson Labs에서 구입하여 온도(27℃), 습도, 12시간 명암 주기가 제어된 환경에서 병원체가 없는 깨끗한 방에서 사육하였다. 마우스에게 표준 음식(chow)과 수돗물을 공급하고 1주일 동안 적응할 수 있게 하였다. 모든 동물 실험은 켄터키대학교에서 Institutional Animal Care and Use Committee 의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리를 위해 국립 보건원(National Institutes of Health)이 발행한 지침에 따라 수행되었다. HT29 세포는 초기 정맥 내 주사를 통해 폐를 대상으로 한 특화로 트레이닝되었다. 폐 전이를 수확하고 마우스에 재주사하고; 체내 선별 과정을 세 번 반복하여 HT29 G-L 폐M3 세포주를 발달시켰다. HT29 G-L 폐M3 종양 세포를 폐 전이 발달을 위해 마우스에 정맥 내 주사하였다. 이소플루란(0.6L/분 유량에서 산소 중 2%)을 사용하여 마우스를 마취시키고 100μL의 PBS 중 1 × 106 세포를 주사하였다.
CRC 전이 종양의 체내 종양 퇴행
HT29 G-L 폐M3 종양이 확인된 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Wjl/SzJNCr 누드 마우스를 샘플(PBS, 미셀 연장/siSurv, 미셀/siSurv, 미셀/siRRM2 포함)로 300μl에 1mg/kg 용량으로 주 2회 꼬리 정맥 주사로 처리하였다. 마우스를 총 6번 처리하였다. 26일째에 안락사시키고 Lago SII(Spectral Instruments Imaging, 투산, 애리조나주)로 생체 발광 및 GFP 신호를 이미징하였다. 마우스의 종양을 수집하고 10% 포름알데히드에 고정시키고 파라핀 블록에서 포매하였다. 종양 섹션을 Ki-67(세포 신호 전달 #9027) 또는 IHC 절단 카스파제 3(세포 신호 전달 #9579) 1차 항체에 대해 염색한 후 형광크롬 접합 2차 항체에 대해 염색하였다. 이어서, 종양 섹션을 현미경으로 이미징하였다.
Elisa에 의한 RNA 미셀의 케모카인 유도
RAW 264.7 세포를 웰당 2.5 × 105 세포의 밀도로 24웰 플레이트에 플레이팅하고 밤새 배양하였다. 이어서, RNA 미셀을 Opti-MEM 배지(Life Technologies Corporation, 칼즈배드, 캘리포니아주, 미국)에서 희석하고 세포에 첨가하였다. 세포를 5% CO2를 함유하는 가습 공기에서 37℃에서 8시간 동안 지속적으로 배양하고, 세포 배양 상청액을 수집하고 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 상청액에서 TNF-α 및 IL-6의 농도는 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 Mouse ELISA MAX™ Deluxe 세트(BioLegend, Inc., 캘리포니아주, 샌디에고)를 사용하여 효소-연결 면역 흡착 분석(ELISA)으로 측정하였다.
결과
RNA-미셀은 균질 미셀 구조로 형성함으로써 수많은 화학 약물 및 siRNA 카피를 보유하고 있다.
RNA-미셀은 이전에 구성요소 가닥 중 하나의 3' 말단에 콜레스테롤 태그를 포함함으로써 Phi29 DNA 패키징 모터의 pRNA로부터의 세 방향 접합 구조(three-way junction)(pRNA-3WJ)를 사용하여 개발되었다(Shu, Y., 등 J. Control. Release 2018, 276:17-29; Yin, H., 등 ACS Nano 2019, 13:706-717). 이들 미셀을 마우스에서 체내 종양 모델로 전달하기 위해 파클리탁셀 또는 항-miRNA 서열과 접합시켰다. 여기서, RNA-미셀은 도 15에서 볼 수 있듯이 콜레스테롤 siRNA 키메라로부터 자가 조립된 보다 단순한 구조로 재설계되었다. 또한, 젬시타빈은 시토신 리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드 대체를 통해 미셀 설계에 포함되었다. 각각의 RNA 키메라는 서바이빈 및 RRM2 siRNA의 센스 가닥에 12개의 젬시타빈 카피를 포함하도록 설계되었다. 따라서, 젬시타빈 방출 동안, 안티-센스 siRNA는 또한 Dicer 프로세싱 없이 RISC에 방출된다. RNA-미셀 구성요소는 포스포아미다이트 기술을 사용하여 고체상 합성을 통해 합성되었고; 3'-콜레스테롤-TEG CPG를 통해 콜레스테롤을, 젬시타빈 아미다이트를 통해 젬시타빈을 siRNA의 센스 가닥에 배치하였다. 두 개의 RNA 가닥을 정제하면 siRNA가 접히는 어닐링 단계를 통해 이들이 접히고 콜레스테롤 태그가 소수성 코어로 자가 조립되어 미셀을 형성하였다.
이어서, RNA-미셀을 형성 및 물리적 특성에 대해 특성화하였다. 첫 번째 미셀 형성은 단일 가닥 구성요소와 비교하여 1% 아가로스 겔을 통해 확인되었다. 조립 겔로부터, 콜레스테롤-센스 가닥은 상대적으로 느린 이동 속도에서 알 수 있듯이 미셀 구조로 자가 조립되며, 이 미셀 구조는 안티-센스 siRNA 가닥이 센스 가닥-미셀과 어닐링되면서 유지된다. 아가로스 겔에서 볼 수 있듯이, RNA-미셀은 균질 생성물의 형성을 나타내는 단일 밴드로 형성된다. 또한, 동적 광 산란(DLS) 분석을 생성된 결과물에 대해 수행하였다. 이러한 RNA-미셀은 대부분의 RNA 나노 입자보다 크지만(Ghimire, C., 등 ACS Nano 2020, 14:13180-13191; Guo, S., 등 Nat. Commun. 2020, 11:972-982; Li, H., 등 Adv. Mater. 2016, 28:7501-7507; Khisamutdinov, E. F., 등 Nucleic Acids Res. 2014, 42:9996-10004), 여전히 나노미터 범위 내에 속하며 RNA 나노 입자의 고유한 특성을 유지한다.
RNA-미셀은 DNase II에 의해 젬시타빈의 특정 방출을 위해 처리되며, 이는 차례로 siRNA 안티-센스 가닥을 방출한다.
젬시타빈은 이전에 종양 세포로의 개선된 치료 전달을 위해 핵산 서열에 내포되었다(Zhu, L., 등 J Am Chem Soc 2022, 144:1493-1497; Ma, Y., 등 Chem Commun (Camb) 2019, 55:6603-6606; Pan, G., 등 ACS Appl Mater Interfaces 2019, 11:41082-41090). 드럭테이머(drugtamer) 및 나노겔을 포함한 이러한 핵산 구조는 DNase와의 인큐베이션을 통해 젬시타빈을 절단하는 능력을 나타냈다. 구체적으로, DNase II는 젬시타빈을 방출할 수 있었고, 리소좀에서 높은 농도를 함유한다(Zhu, L., 등 J Am Chem Soc 2022, 144:1493-1497). RNA-미셀로부터 젬시타빈 및 서바이빈 또는 RRM2 siRNA의 안정성 및 제어 방출을 입증하기 위해, 나노 입자를 뉴클레아제 또는 DNase II 배열을 포함하는 소태아 혈청(FBS)과 함께 인큐베이션하였다. 타임-코스 인큐베이션 후, RNA 미셀 구조를 네이티브 PAGE로 분석하였다. 흥미롭게도, RNA-미셀은 FBS 분해에 대한 안정성을 나타내는 동시에, 젬시타빈 및 안티-센스 siRNA 가닥의 분해 및 방출을 보여주었다. 겔에서 볼 수 있듯이 RNA-미셀은 DNase II에 의해 분해되어 겔 바닥에 짧은 RNA 단편과 ~20nt의 단일 밴드가 생겨 안티-센스 서바이빈과 RRM2 가닥이 방출되었음을 나타내는 동시에 안정된 상태를 유지하였다. 결과는 RNA-미셀은 체내를 순환하는 동안 젬시타빈이나 siRNA의 조기 방출 없이 안정적으로 유지될 수 있지만 치료제의 세포 내 방출을 제어하기 위해 세포 내에서 처리됨을 나타낸다.
RNA-미셀은 자발적으로 CRC 세포 내로 표적화하고 내재화한다.
젬시타빈은 뉴클레오시드 수송체를 사용하여 세포막을 효율적으로 투과하지만, 종양 세포는 SLC29A1 SLC28A1 및 SLC28A3과 같은 뉴클레오시드 수송체를 하향 조절하여 내성을 빠르게 발달시킨다. 뉴클레오시드 수송체가 결여된 세포는 젬시타빈 유입을 허용하지 않으며 젬시타빈의 세포 독성 특성에 취약하지 않다. 또한, 나노 입자는 내부화 메커니즘으로서 세포 내 이입에 의존하여 종종 엔도솜 트래핑을 초래하여 치료 효능을 제한한다. 젬시타빈 및 siRNA의 세포 내 전달을 위한 RNA-미셀의 내재화를 시험하기 위해, Alexa-fluor 647 형광 태그를 RNA-미셀 설계에 포함시켰다. 이어서, RNA-미셀/Alexa647을 HT29 및 HCT116 CRC 세포주와 인큐베이션하고 라이브셀 공초점 현미경으로 이미징하였다. 타임 코스 이미징 동안, 공초점 현미경은 RNA-미셀이 세포에 결합하고 내재화될 수 있음을 나타내는 CRC 세포 내 형광 신호 전달의 증가를 보여주었다. RNA-미셀은 CRC 표적화 리간드를 함유하지 않기 때문에, 이 결합은 자발적이며 수용체 매개 세포 내 이입에 의존하지 않는다. 우리는 RNA-미셀의 큰 콜레스테롤 함량이 세포막에서 콜레스테롤 풍부 지질 라프트(lipid rafts)와의 상호 작용을 허용하여 라프트-의존성 세포 내 이입을 초래한다는 가설을 세웠다(El-Sayed, A., 등 Mol Ther 2013, 21:1118-1130). 이 세포 내 이입 경로는 콜레스테롤 의존적이며 카비올레(caveolae)를 포함할 수 있거나 포함할 수 없다(Lajoie, P., 등 Int Rev Cell Mol Biol 2010, 282:135-163; Lajoie, P., 등 J Cell Mol Med 2007, 11:644-653). RNA-미셀이 세포 내 이입되었는지 여부를 시험하기 위해 세포를 염색하면서 공초점 현미경 연구를 반복하였다(Zheng, Z. 등 J. Control. Release 2019, 311-312:43-49). 결과가 입증되었다. 엔도솜 트래핑은 약물 전달을 억제할 수 있지만 DNase II는 리소좀에서 높은 수준으로 발견되므로 Dicer 프로세싱 없이 젬시타빈과 siRNA의 방출을 처리하여 치료제를 효과적으로 유지할 수 있다(아래 참조)(Zhu, L., 등 J Am Chem Soc 2022, 144:1493-1497).
RNA-미셀은 면역 반응을 초래하지 않는다.
화학 요법 및 나노 입자 플랫폼을 포함한 암 치료제는 일반적으로 건강한 조직과의 상호 작용을 통한 독성을 가질 뿐만 아니라 사이토카인 유도를 통해 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다(Lee, C. S., 등 World J Gastroenterol 2014, 20:3751-3761; Driscoll, J., 등 Curr Protoc 2021, 1:e249; Hong, E., 등 Nano Lett. 2018, 18:4309-4321). RNA 나노 입자는 이전에 나노 입자 크기, 모양 및 서열을 통해 면역 반응을 제어하는 것으로 나타났다(Khisamutdinov, E. F., 등 Nucleic Acids Res. 2014, 42:9996-10004; Guo, S., 등 Mol. Ther. Nucleic Acids 2017, 9:399-408). 따라서, RNA 나노 입자는 면역 반응을 유도하거나 피하도록 설계될 수 있다. 또한, 파클리탁셀을 RNA 나노 입자에 접합하면 사이토카인 유도가 현저히 감소하였다(Guo, S., 등 Nat. Commun. 2020, 11:972-982). RNA-미셀을 RAW 264.7 대식세포와 함께 배양하고 Elisa로 사이토카인 반응에 대해 분석하였다. 그 결과, 대조군 RNA-미셀과 젬시타빈 및 서바이빈 또는 RRM2 siRNA를 보유한 RNA-미셀은 세포만 보유한 샘플에 비해 사이토카인 유도가 유의하게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 RNA-미셀이 큰 면역 반응을 활성화시키는 데 안전하고 체내 호환성을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
RNA-미셀은 신체에 부작용 없이 CRC 폐 전이를 특이적으로 억제한다.
RNA-미셀은 효과적인 CRC 억제 및 높은 수준의 젬시타빈 및 서바이빈 또는 RRM2 siRNA를 전달하는 능력을 보여주었다. 발달된 RNA-미셀은 마우스 모델에서 CRC 폐 전이 성장을 억제하는 능력에 대해 시험되었다. 폐를 대상으로 한 특화로 "트레이닝된" HT29 CRC 세포의 유도체인 HT29 G-L 폐M3 세포(Reichel, D., 등 Pharm Res 2017, 34:2385-2402; Rychahou, P., 등 J Control Release 2018, 275:85-91)를 누드 마우스에 정맥 주사하여 마우스의 폐에서 종양을 생성하였다. HT29 G-L 폐M3 세포는 GFP를 발현하여 종양 성장 및 퇴행의 모니터링을 가능하게 한다(도 16A 및 도 16B). 종양이 발달하면 일주일에 두 번씩 6번의 치료에 걸쳐 RNA 미셀을 마우스에게 전달하였다. 나노 입자 요법이 끝나면 마우스를 IVIS로 이미징하고 폐를 절제하여 이미징하였다. 결과는 폐 종양의 퇴행을 나타내는 두 이미지 세트에서 GFP 신호 전달의 현저한 감소를 보여준다(도 17A 및 도 17B). 흥미롭게도 젬시타빈과 서바이빈 siRNA 입자를 보유하는 RNA-미셀은 GFP 신호 전달이 거의 완전히 제거되었고 이는 종양의 완전한 치료를 암시한다. 마우스의 치료를 추가로 조사하기 위해 폐를 냉동 절개하고 Ki-67 및 카스파제 3 신호 전달에 대해 염색하였다(도 17C 및 도 17D). 치료 그룹의 Ki-67 신호 전달은 폐 전체에 걸쳐 미세 종양이 여전히 존재함을 나타내는 일부 신호 전달을 보여주었다. 또한 폐는 낮은 수준의 카스파제 신호 전달을 보여 종양 사멸이 카스파제 경로의 결과가 아님을 나타냈다. 전반적으로 RNA-미셀의 투여를 더욱 최적화하거나 더 긴 요법으로 종양을 치료하여 완전한 종양 퇴행을 유도할 수 있다. 그러나 제시된 데이터는 RNA-미셀이 CRC 폐 전이를 치료하는데 매우 효과적임을 나타낸다. 체내 실험 동안, 마우스의 체중을 모니터링하였다. 결과는 마우스에 대한 독성의 명백한 징후가 없음을 나타내는 PBS 그룹과 비교하여 서바이빈 또는 RRM2 siRNA를 운반하는 RNA-미셀 샘플에서 유의한 체중 감소가 보이지 않았다는 것을 나타낸다. 사이토카인 유도의 결여와 결합된 이 데이터는 RNA-미셀이 일반적으로 안전하고 체내 연구와 호환된다는 것을 나타낸다. 그러나 임상으로 나아가기 위해서는 RNA-미셀에 대한 추가적인 안전성 연구가 필요하다.
논의
나노 입자는 종종 접합 약물로 완성된 입자를 형성하기 위해 여러 합성 또는 화학 단계를 필요로 하는 복잡한 구조이다. 결과적으로, 제품 수율 감소, 생산 비용 및 노동 비용 증가 및 나노 입자 품질은 균질성 부족으로 어려움을 겪을 수 있다. 여기에 제시된 발달된 RNA-미셀은 균질하고 안정적인 미셀의 생산하는 단일 단계의 원팟 생산 방법을 사용하여 이러한 문제를 극복한다. 구성요소 RNA의 고체상 합성 동안, 젬시타빈은 98.5% 내포의 수율을 갖는 포스포아미다이트의 사용을 통해 직접적으로 내포되었고; 따라서 추가 화학적 접합 단계를 방지한다. 또한, RRM2 및 서바이빈 siRNA는 단순히 RNA-미셀로부터의 서열 연장 및 안티-센스 가닥으로의 간단한 혼성화를 통해 내포되었다. 결과적으로, 제시된 RNA 미셀은 설계에서 매우 단순하며, 핵산 접힘 및 콜레스테롤 상호 작용을 통해 쉽게 합성되고 자가 조립할 수 있다. RNA-미셀은 뉴클레아제에 대해 안정적으로 유지되고 작은 크기 분포를 갖는 균질 생성물로 형성되는 것으로 입증되었다.
전술한 바와 같이, RNA는 외부 힘 하에서 크기와 모양을 변화시킬 수 있는 알려진 엘라스토머이다(Bao, L., 등 Biophys. J. 2017, 112:1094-1104; Kriegel, F., 등 J. Struct. Biol. 2017, 197:26-36; Lipfert, J., 등 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014, 111:15408-15413; Chou, F. C., 등 PLoS Comput. Biol. 2014, 10:e1003756). 또한, 우리는 10nm RNA 나노 입자가 힘을 가하면 직사각형 구조로 늘어나고 힘이 풀리면 원래의 모양과 크기로 돌아갈 수 있음을 보여주었다(Ghimire, C., 등 ACS Nano 2020, 14:13180-13191). 이러한 결과와 RNA가 본질적으로 동적이며 지속적으로 재구성된다는 사실을 결합하면(Binzel, D.W., 등 Chem Rev 2021, 121:7398-7467; Li, X., 등 Adv Drug Deliv Rev 2022, 186:114316; Yu, A. M., 등 Mol Cell 2021, 81:870-883 e810; Hurst, T., 등 RNA Biol 2021, 1-11; Jing, Z., 등 J. Chem. Theory Comput. 2019, 15:6422-6432; Larsen, K. P., 등 Cold Spring Harb Perspect Biol 2019, 11), RNA 나노 입자는 변형적이고 동적이어서 새는 종양 혈관 구조를 통해 침투하여 자발적인 종양 축적을 가능하게 한다. 위의 결과는 종양 표적 리간드 없이도 폐 전이 종양으로의 자발적 치료 전달의 높은 수율을 보여준다. RNA-미셀은 크기를 변형하여 혈압 하에 새는 혈관 구조를 뚫고 들어가 혈액 순환으로 돌아갈 수 없는 종양 미세 환경에서 일단 래칫(ratchet)처럼 작용할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 매우 효과적인 치료 전달 플랫폼을 형성한다. 또한, 운동성이 있고 변형 가능한 RNA-미셀은 비종양 축적 RNA-미셀이 신장 사구체 여과를 통해 소변으로 빠르게 배출되도록 하며, 이는 낮은 주요 장기 축적과 빠른 체내 제거를 야기한다. 우리의 10-nm RNA 나노 입자는 정맥 주사 후 30분에서 1시간 이내에 5.5-nm 컷오프 크기의 신장 사구체를 통과하여 검출 가능한 독성 없이 신장으로 배설될 수 있음을 입증하였다(Ghimire, C., 등 ACS Nano 2020, 14:13180-13191; Guo, S., 등 Nat. Commun. 2020, 11:972-982). 따라서 마우스 체중 변화의 결여로 입증된 바와 같이 독성이 낮은 전달 플랫폼을 생성하였다.
자발적인 표적화를 통해 CRC 폐 전이에 축적되면, RNA-미셀은 CRC 세포로 내재화하는 능력을 보여주었다. 이 내재화는 높은 수준의 효능을 갖는 젬시타빈 및 siRNA를 전달할 수 있게 한다. RNA-미셀 내재화의 정확한 방법은 이해되지 않지만, 미셀은 수용체 매개 세포 내 이입을 위한 표적 리간드를 보유하지 않기 때문에 세포의 지질 라프트에서 콜레스테롤이 풍부하면 RNA-미셀의 코어에 있는 높은 수준의 콜레스테롤과 상호 작용할 수 있다고 가정된다(El-Sayed, A., 등 Mol Ther 2013, 21:1118-1130; Cho, Y. Y., 등 Molecules 2020, 25; Tian, N., 등 J Biol Chem 2012, 287:44447-44463; Nabi, I. R., 등 J Cell Biol 2003, 161:673-677). 따라서 미셀 콜레스테롤과 지질 라프트 콜레스테롤 사이의 이러한 상호 작용은 RNA-미셀의 세포 내 이입을 가능하게 할 수 있다. 미셀의 RNA-미셀 또는 개별 RNA 나노 입자가 내재화되면, 12개의 젬시타빈 카피는 DNase II에 의한 자동 처리에 의해 방출된다(Zhu, L., 등 J Am Chem Soc 2022, 144:1493-1497; Ma, Y., 등 Chem Commun (Camb) 2019, 55:6603-6606). RNA 서열의 일부로 내포된 젬시타빈이 포함된 RNA-미셀의 이러한 신중한 설계는 이어서 Dicer 프로세싱 없이 안티-센스 siRNA 가닥의 방출을 가능하게 한다. 젬시타빈은 siRNA의 센스 가닥에 배치되고, 이의 방출을 통해 센스 가닥을 분해하여, 그 결과 안티-센스 siRNA가 방출되어 RISC 내에 내포된다. 이 간단한 미셀 설계는 효율적인 세포 내재화, 약물 방출 및 높은 효능으로 이어진다.
제시된 데이터를 종합하면, 젬시타빈과 siRNA의 여러 카피를 보유한 RNA-미셀은 다른 종양 및 전이 유형으로 변환할 수 있는 능력으로 CRC 전이 치료에 대한 강력한 가능성을 보여준다. RNA-미셀은 신체 전체에 순환하는 동안 명백한 독성 또는 면역 반응을 유발하지 않는 것으로 입증되었다. 이것은 아마도 비종양 축적 RNA-미셀의 빠른 신장 배설 때문일 것이다. 또한, RNA-미셀의 세포 내 내재화는 siRNA 및 젬시타빈의 자동 처리를 야기한다. 따라서, 젬시타빈의 작용 메커니즘은 젬시타빈을 전달할 때 일반적으로 볼 수 있는 화학 저항성을 발달시키는데 사용될 수 있는 뉴클레오시드 수송체에 의존하지 않는다. 또한, 서바이빈 또는 RRM2 siRNA와 젬시타빈 전달의 결합은 강력한 조합 요법을 생성할 뿐만 아니라 화학 저항성 구축에 대한 요법을 더욱 다양화시킨다. RNA-미셀은 현재 임상에서 난제인 CRC 폐 전이를 치료하는 데 있어 뚜렷한 능력을 입증하였다. 향후 심층적인 전임상 연구를 통해 이러한 RNA 기반 나노 입자를 임상에 적용하기 위한 연구가 계속 진행되어야 한다.
결론
RNA 나노 기술은 그 개념이 정립된 이래 siRNA, miRNA, 소분자 화학 약물을 포함한 치료제를 전달하는 데 있어 그 능력을 지속적으로 입증하는 다목적 분야로 성장하였다. 여기서 우리는 여러 젬시타빈 카피와 서바이빈 또는 RRM2 siRNA 카피를 포함한 이중 가닥 RNA 서열에 소수성 콜레스테롤을 포함시킴으로써 새로운 RNA 미셀을 개발하였다. 이 새로운 RNA 미셀은 젬시타빈과 안티-센스 siRNA 가닥을 단일 단계에서 방출하는 세포 내 자동 처리를 가능하게 하였다. 결과적으로, RNA 미셀은 CRC 폐 전이를 자발적으로 표적화하여 높은 페이로드의 치료제를 전달하였고 이는 종양 신호의 거의 완전한 퇴행으로 이어졌다. 이 연구는 구성과 사용이 쉬운 간단한 1 단계 합성을 통해 강력한 치료 도구임을 입증한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 인용된 공보 및 인용된 물질은 명시적으로 참조로 원용된다.
통상의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에서 기재되는 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치료 RNA 복합체로서, 각각의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 25개 이상의 뉴클레오티드가 포함된 5' 말단 및 3' 말단, 상기 센스 가닥의 3' 말단에 접합된 콜레스테롤 분자를 갖고, 상기 센스 가닥에서 모든 피리미딘의 2'-위치는 산소를 함유하지 않으며,
    상기 안티센스 가닥은 18-25개의 정상 뉴클레오티드가 포함된 5' 말단 및 3' 말단을 갖고,
    상기 센스 가닥은 18개 이상의 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥에서 모든 피리미딘의 2'-위치는 2개의 불소를 함유하고 산소를 함유하지 않으며,
    상기 안티센스 가닥은 변형되지 않은 뉴클레오티드가 포함된 siRNA 서열을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥과 같은 길이거나 상기 안티센스 가닥보다 더 길고,
    상기 안티센스 가닥에서 뉴클레오티드의 적어도 95%는 상기 센스 가닥의 상보적인 뉴클레오티드에 혼성화되고,
    상기 복수의 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드는 중심에 상기 콜레스테롤 분자가 포함된 응집체에 있는, 치료 RNA 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 2'-디플루오로-데옥시피리미딘; 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 함유하는, 치료 RNA 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 센스 가닥의 5' 말단상의 GalNAc(N-아세틸갈락토사민), UAMC-1110(SP-13786; (S)-N-(2-(2-시아노-4,4-디플루오로피롤리딘-1-일)-2-옥소에틸)퀴놀린-4-카르복사미드), FA(엽산), 또는 DCL(N-[N-[(S)-1,3-디카르복시프로필]카르바모일]-(S)-리신)을 추가로 포함하는, 치료 RNA 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 생존 또는 세포사멸에 영향을 미치는 항암 siRNA인, 치료 RNA 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서바이빈 siRNA 또는 RRM2 siRNA인, 치료 RNA 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서바이빈 siRNA는 핵산 서열 서열번호: 1을 포함하는, 치료 RNA 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RRM2 siRNA는 핵산 서열 서열번호: 2를 포함하는, 치료 RNA 복합체.
  8. 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 안티센스 siRNA 가닥을 포함하는 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로서, 상기 센스 가닥은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 이상의 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는, 합성 이중 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드.
  9. 서로 결합된 적어도 3개의 합성 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 나노 입자로서, 상기 적어도 3개의 합성 RNA 올리고뉴클레오티드는 중심 코어 도메인 및 코어 도메인 주위에 배열되며 상기 중심 코어 도메인으로부터 연장되는 적어도 3개의 이중 가닥 암(arm)을 형성하고, 상기 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 서열번호: 1-273로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열, 또는 서열번호: 1-273로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함하는, RNA 나노 입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 서열번호: 167-221로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열, 또는 서열번호: 167-221로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함하는, RNA 나노 입자.
  11. 제9항에 있어서, 핵산 서열 서열번호: 6-9, 61, 280-283, 112-116 또는 167-171을 갖는 제1 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 핵산 서열 서열번호: 10-13, 62-66, 117-121, 또는 172-176을 갖는 제2 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 핵산 서열 서열번호: 14-18, 67-71, 122-126 또는 177-181을 갖는 제3 합성 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, RNA 나노 입자.
  12. 제9항에 있어서, 핵산 서열 서열번호: 21-25, 41-45, 72-76, 92-96, 127-131, 147-151, 182-186, 또는 202-206를 갖는 제1 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 핵산 서열 서열번호: 26-30, 46-50, 77-81, 97-101, 132-136, 152-156, 187-191, 또는 207-211을 갖는 제2 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 핵산 서열 서열번호: 31-35, 51-57, 82-86, 102-106, 137-141, 157-161, 192-196, 또는 212-216을 갖는 제3 합성 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 핵산 서열 서열번호: 36-40, 56-60, 87-91, 107-111, 142-146, 162-166, 197-201, 또는 217-221을 갖는 제4 합성 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, RNA 나노 입자.
  13. 치료 전달을 위한 siRNA의 안정화 방법으로서, 상기 방법은
    (a) siRNA 서열에 상보적인 복수의 합성 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계로서, 각각의 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 RNase 분해를 방지하도록 구성된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하며, 각각의 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 접합된 콜레스테롤 모이어티를 포함하는 단계; 및
    (b) 상기 siRNA가 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 적절한 조건에서 상기 siRNA를 상기 RNA 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜 중심에 상기 콜레스테롤 분자와 함께 응집된 이중 가닥 RNA 분자를 생성하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 플록슈리딘(5-플루오로데옥시우리딘, UB5F) 뉴클레오티드, 젬시타빈(2', 2'-디플루오로-2'-데옥시시티딘, dFdC, CR2FF) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
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