KR20250131270A - 합성 단일 가닥 핵산 조성물 및 이의 방법 - Google Patents

합성 단일 가닥 핵산 조성물 및 이의 방법

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KR20250131270A
KR20250131270A KR1020257021790A KR20257021790A KR20250131270A KR 20250131270 A KR20250131270 A KR 20250131270A KR 1020257021790 A KR1020257021790 A KR 1020257021790A KR 20257021790 A KR20257021790 A KR 20257021790A KR 20250131270 A KR20250131270 A KR 20250131270A
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러셀 몬즈
캘리 앤 밀러
니콜라스 빅터 파손넷
루크 에스. 함
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제너레이션 바이오 컴퍼니
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Abstract

본 출원은 제1 적어도 하나의 스템 루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(DNA) 분자, 숙주 세포에서의 이식유전자의 전달 및 발현을 위한 제조 방법 및 사용 방법을 개시한다.

Description

합성 단일 가닥 핵산 조성물 및 이의 방법
관련 출원
본 출원은 2022년 12월 1일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/429,461호; 2023년 3월 3일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/449,872호; 2023년 7월 28일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/529,637호; 및 2023년 10월 17일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/544,571호에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 출원 각각의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
아데노 연관 바이러스 AAV에서 유래한 벡터(예컨대, 재조합 AAV(rAAV) 또는 AAV 벡터)는 유전 물질을 전달하는 데 있어 매력적인데, 그 이유는 (i) 근세포 및 신경세포와 같은 매우 다양한 분열 및 비분열 세포 유형을 감염("형질전환")시킬 수 있고; (ii) 바이러스 구조 유전자가 결여되어 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예컨대, 인터페론 매개 반응을 감소시키고; (iii) 야생형 AAV는 인간에서 병리학적이지 않은 것으로 간주되며; (iv) 숙주 세포 유전체에 혼입될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 복제 결핍된 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되어 있고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로 삽입 돌연변이 유발 또는 유전 독성의 위험이 크게 제한되기 때문이다.
그러나, AAV 입자를 유전자 전달 벡터로 사용하는 데에는 숙주 세포(예컨대, 대규모 생산 환경에서의 Sf9 곤충 세포)로부터 AAV를 생산하는 종래의 방식에 기인하는 몇 가지 주요 단점 및 결함이 있다. rAAV와 관련된 한 가지 주요 단점은 바이러스 패키징 용량이 약 4.5 kb의 이종 DNA로 제한된다는 점이다(Dong 등의 문헌(1996); Athanasopoulos 등의 문헌(2004); Lai 등의 문헌(2010)). 그 결과, AAV 벡터의 사용은 바이러스 패키징의 이러한 한계로 인해 150 kDa 미만의 단백질 코딩 용량으로 제한되었다. 두 번째 단점은 환자에게 재투여하는 것을 방해하는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 벡터에 반응할 수 있으며, 이는 면역계를 자극하는 부스터로서 효과적으로 작용하여 향후 치료를 불가능하게 하는 고역가 항AAV 항체를 생성한다. 최근 일부 보고에 따르면 고용량 상황에서의 면역원성에 대한 우려가 제기되고 있다. 주목할 만한 또 다른 단점은 바이러스 유전체의 제조를 위해 숙주 세포(예컨대, 곤충 세포)에서 AAV를 대규모로 생산할 경우 플러스(+)와 마이너스(-) 가닥 벡터의 무작위 혼합물이 생성된다는 점이다．이는 센스 가닥의 꼭 필요한 치료적 발현에 대한 이식유전자의 가닥 특이성을 현저하게 감소시킨다.
또한, 캡시드를 가진 종래의 AAV 비리온은 AAV 유전체, rep 유전자, 및 cap 유전자를 포함하는 플라스미드(들)를 도입함으로써 생산된다(Grimm 등의 문헌(1998)). 그러나, 이러한 캡슐화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질전환하는 것으로 밝혀졌으며, 캡시드 또한 숙주에서 중증 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 유전자 요법(유전자 편집 포함)을 위한 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터의 사용은 환자의 면역 반응, 최소 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)으로 인해 AAV 벡터로 전달하기에 적합한 이식유전자 유전 물질의 범위 제한, 및 느린 AAV 매개 유전자 발현으로 인해 환자에게 단회 투여하는 것으로 제한된다. 또한, 이러한 AAV 벡터의 생산은 전통적인 곤충 세포 의존 방법에 크게 의존해 왔다. 이러한 방법은 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포로부터의 오염 물질로 인해 방해를 받을 수 있는데, 이러한 오염 물질은 제거하거나 정제하는 데 불편하거나 비용이 많이 들고, 치료적 제형에 포함되는 경우 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수 있다.
따라서, 유전자 요법 분야에서는 면역원성이 최소화되고, 재투여 가능하고, 재조합 벡터를 대량으로 생성할 수 있는 기술로서, 이식유전자 크기의 용량을 증가시키는 동시에 발현 수준, 가닥 특이성, 및 순도를 증가시키는 기술에 대한 요구가 높다.
일부 양태에 따르면, 본 개시는 복제 및/또는 전사를 개시하기 위한 3' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 단리된 선형 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 본 개시의 ssDNA 분자의 특징은 상기 ssDNA 분자가 역위 말단 반복(ITR) 구조를 포함하지 않는다는 것이다.
생체 내에서 이중 가닥(ds) ceDNA와 비교했을 때, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자의 내약성 및 면역 반응이 ds ceDNA와 동등하거나 더 우수하다는 것은 예상치 못한 발견이었다. 실시예에서 볼 수 있듯이, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자에 대한 사이토카인 반응은 동등량을 투약했을 때 ds ceDNA에 비해 현저히 낮거나 검출되지 않았다. 본 개시의 ssDNA 분자에서 관찰되는 면역원성 감소는 반복 투약 또는 더 높은 용량 농도를 허용하기 때문에 유리하다.
제1 양태에 따르면, 본 개시는 (a) 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 선형 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자; 및 (b) 지질을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 그 길이 전체에 걸쳐 단일 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 길이가 적어도 300개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 400개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 600개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 700개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 800개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 900개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9500개 뉴클레오티드, 또는 길이가 적어도 10,000개 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열은 이의 3' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하며, 상기 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 복제 및/또는 전사를 개시하기에 충분하다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일부 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 500개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 5개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 3 내지 500개의 미결합 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 최소 3개의 미결합 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머이다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능하다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 이의 5' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하며, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA는 5' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 5' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 5' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 루프는 말단을 안정화시키기 위한 하나 이상(하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상)의 핵산을 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 루프는 화학적으로 변형된 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머이다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능하다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 리보자임이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 삼중가닥 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 분자 프로브를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내에서 합성적으로 생산된다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 면역 경로를 활성화하지 않거나 최소한으로 활성화한다. 추가적인 구현예에서, 상기 면역 경로는 선천성 면역 경로이다. 일부 구현예에서, 상기 선천성 면역 경로는 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 염증조절복합체 매개 경로, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 프로모터를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 인핸서를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 hAAT 프로모터이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 TTR 프로모터이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 인핸서는 세르핀(SERP) 인핸서이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 TTR 프로모터 및 SERP 인핸서를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 전사 시작 부위(TSS)를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 이중 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 TSS는 이중 가닥이다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 치료적 단백질 또는 이의 치료적 단편을 발현할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬, 및 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 유전 질환을 치료하는 데 유용하다.
다른 양태에 따르면, 본 개시는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 상기 지질 내에 캡슐화된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 스테롤을 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 스테롤은 콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 베타-시토스타놀, 캄페스테롤, 브라시카스테롤, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 스테롤은 콜레스테롤이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 스테롤은 베타-시토스테롤이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 비양이온성 지질을 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민(DSPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 소이 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디올리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 딜리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 적어도 하나의 페길화 지질을 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 PEG-딜라우릴옥시프로필; PEG-디미리스틸옥시프로필; PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필; l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG); PEG-딜라우릴글리세롤; PEG-디팔미토일글리세롤; PEG-디스테릴글리세롤; PEG-딜라우릴글리카마이드; PEG-디미리스틸글리카미드; PEG-디팔미토일글리카미드; PEG-디스테릴글리카마이드; (l-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐] 카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)(PEG-콜레스테롤); 3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) 에테르(PEG-DMB), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)(DSPE-PEG)로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 DMG-PEG, DSPE-PEG, 또는 둘 다이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, 또는 둘 다이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 모이어티를 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 또는 GalNAc 유도체이다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체이다. 또 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체는 전장 항체, Fab, Fab', 단일 도메인 항체, 및 단쇄 항체(scFv)로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체는 scFv이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 모이어티는 적어도 하나의 페길화 지질에 공유 결합되어 페길화 지질 접합체를 형성한다. 일 구현예에서, 상기 페길화 지질 접합체는 DSPE-PEG2000에 공유 결합된 4중 안테나구조 GalNAc를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 이온화성 지질을 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 양이온성 지질이다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), DLin-MC3-DMA, N-[1-(2,3-디오레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC); 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (14:1), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필) 아미노부틸카르복스아미도에틸-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5); 디옥타데실아미도-글리실스페르민(DOGS); 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일] 콜레스테롤(DC-Chol); 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); Saint 지질(예컨대, SAINT-2, N-메틸-4-(디올레일)메틸피리디늄); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); 1,2-디올레오일-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE); 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 클로라이드(DORI); 2알킬화된 아미노산(DILA2)(예컨대, C18 :1 -norArg -C16); 디올레일디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3 -에틸포스포콜린(POEPC); 및 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(MOEPC)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 변형예에서, 축합제, 예컨대, 양이온성 지질은 예컨대, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2디메틸아미노에틸)-[1,31-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODAP), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), 모르폴리노콜레스테롤(Mo-CHOL), (R)-5-(디메틸아미노)펜탄-1,2-디일 디올레에이트 하이드로클로라이드(DODAPen-C1), (R)-5-구아니디노펜탄-1,2-디일 디올레에이트 하이드로클로라이드(DOPen-G), 및 (R)-N,N,N-트리메틸-4,5-비스(올레오일옥시)펜탄-1-아미늄 클로라이드(DOTAPen), SS-절단성 지질, 및 이들의 혼합물과 같은 지질이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 약 30% 내지 약 80%, 예컨대, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70% 또는 약 70% 내지 약 80%의 몰 백분율로 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 스테롤은 약 20% 내지 약 50%, 예컨대, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 25% 내지 약 35%의 몰 백분율로 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 비양이온성 지질은 약 2% 내지 약 20%, 예컨대, 약 2% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15% 또는 약 2% 내지 약 5%의 몰 백분율로 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 약 2.1% 내지 약 10%, 예컨대, 약 2.1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 2.1% 내지 약 5%, 약 2.1% 내지 약 8%, 또는 약 5% 내지 약 7%의 몰 백분율로 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 페길화 지질 접합체는 약 0.1% 내지 약 10%, 예컨대, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 6%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 2%의 몰 백분율로 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 스테롤, 비양이온성 지질, 페길화 지질, 및 페길화 지질 접합체를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 덱사메타손 팔미테이트를 더 포함한다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 총 지질 대 ssDNA 비율이 약 10:1 내지 약 40:1, 예컨대, 약 10:1 내지 약 40:1, 약 10:1 내지 약 30:1, 또는 약 10:1 내지 약 20:1이다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 직경이 약 40 nm 내지 약 120 nm이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 직경이 약 100 nm 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 직경이 약 60 nm 내지 약 80 nm이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 40 nm 내지 약 120 nm인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 100 nm 미만인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 60 nm 내지 약 80 nm(예컨대, 약 60, 65, 70, 75 또는 80 nm)인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 대상체의 유전 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP 또는 본 명세서의 양태 또는 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 추가적인 일 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한(Lesch Nyhan) 증후군, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러(Hurler) 증후군(MPS I형), 샤이에(Scheie) 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오(Morquio) A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스(Tay-Sachs)병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증(Sialidosis) I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 시스틴증(cystinosis), 바텐병(Batten disease), 아스파틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 살라병(Salla disease), 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses, CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증(sphingolipidoses), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis), 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔(Usher) 증후군, 노인성 황반 변성(AMD), 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 A형 혈우병이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 B형 혈우병이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 페닐케톤뇨증(PKU)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 윌슨병이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 고셰병 I, II, 또는 III형이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 스타가르트 황반 이영양증이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 LCA10이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 어셔 증후군이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 유전 질환은 습성 AMD이다.
다른 일 양태에 따르면, 본 개시는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 시험관 내에 존재한다. 다른 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 생체 내에 존재한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP 및 본 명세서의 양태 및 구현예의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대상체는 인간이다.
다른 양태에 따르면, 본 개시는 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP 또는 본 명세서의 양태 및 구현예의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
다른 양태에 따르면, 본 개시는 치료적 유전자를 세포의 핵에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP 또는 본 명세서의 양태 및 구현예의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포의 핵에 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 시험관 내에 존재한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 세포는 생체 내에 존재한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 치료적 유전자 또는 치료적 단백질로 치료될 대상체의 면역 반응을 최소화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 LNP, 또는 본 명세서의 양태 및 구현예의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 관심 대상 핵산은 상기 치료적 유전자 또는 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대상체는 인간이다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.45 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.55 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.65 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.85 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.95 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 약 1.7 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 1.8 mg/kg, 약 1.9 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 2.1 mg/kg, 약 2.2 mg/kg, 약 2.25 mg/kg, 약 2.3 mg/kg, 약 2.4 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 2.6 mg/kg, 약 2.7 mg/kg, 약 2.75 mg/kg, 약 2.8 mg/kg, 약 2.9 mg/kg, 약 3.0 mg/kg, 약 3.1 mg/kg, 약 3.2 mg/kg, 약 3.25 mg/kg, 약 3.3 mg/kg, 약 3.4 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 3.6 mg/kg, 약 3.7 mg/kg, 약 3.75 mg/kg, 약 3.8 mg/kg, 약 3.9 mg/kg, 약 4.0 mg/kg, 약 4.1 mg/kg, 약 4.1 mg/kg, 약 4.2 mg/kg, 약 4.25 mg/kg, 약 4.3 mg/kg, 약 4.4 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 4.6 mg/kg, 약 4.7 mg/kg, 약 4.75 mg/kg, 약 4.8 mg/kg, 약 4.9 mg/kg, 및 약 5.0 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 4.0 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 3.0 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 2.0 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.75 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.5 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.25 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.0 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.75 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.5 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.25 mg/kg 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 2.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.75 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.5 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.25 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.75 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.5 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.25 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.075 mg/kg 내지 약 4.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.125 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.175 mg/kg 내지 약 1.25 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.2 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 적어도 2회 용량을 투여하는 단계를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 적어도 3회 용량을 투여하는 단계를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 4회 이상의 용량을 투여하는 단계를 더 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 단리된 선형 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자를 제공하며, 상기 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열은 이의 3' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하고, 상기 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 복제 및/또는 전사를 개시하기에 충분하다. 다른 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 500개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 5개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 3 내지 500개의 미결합 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 최소 3개의 미결합 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 3' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머이다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능하다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 이의 5' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하며, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA는 5' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 5' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 5' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 루프는 말단을 안정화시키기 위한 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 루프는 화학적으로 변형된 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머이다. 다른 추가적인 일 구현예에서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능하다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 리보자임이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 기능성 모이어티는 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 삼중가닥 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 분자 프로브를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내에서 합성적으로 생산된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 면역 경로를 활성화하지 않거나 최소한으로 활성화한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 면역 경로는 선천성 면역 경로이다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 선천성 면역 경로는 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 염증조절복합체 매개 경로, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 프로모터를 더 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 인핸서를 더 포함한다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 hAAT 프로모터이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 TTR 프로모터이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 인핸서는 세르핀(SERP) 인핸서이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 TTR 프로모터 및 SERP 인핸서를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 전사 시작 부위(TSS)를 포함한다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터는 이중 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 인핸서는 이중 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 TSS는 이중 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10개 염기쌍, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 30개 염기쌍, 적어도 40개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍, 적어도 60개 염기쌍, 적어도 70개 염기쌍, 적어도 80개 염기쌍, 적어도 90개 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍, 적어도 110개 염기쌍, 적어도 120개 염기쌍, 적어도 130개 염기쌍, 적어도 140개 염기쌍, 적어도 150개 염기쌍, 적어도 160개 염기쌍, 적어도 170개 염기쌍, 적어도 180개 염기쌍, 적어도 190개 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍, 적어도 220개 염기쌍, 적어도 240개 염기쌍, 적어도 260개 염기쌍, 적어도 280개 염기쌍, 적어도 300개 염기쌍, 적어도 320개 염기쌍, 적어도 340개 염기쌍, 적어도 360개 염기쌍, 적어도 380개 염기쌍, 적어도 400개 염기쌍, 적어도 420개 염기쌍, 적어도 440개 염기쌍, 적어도 460개 염기쌍, 적어도 480개 염기쌍, 적어도 500개 염기쌍, 적어도 550개 염기쌍, 적어도 600개 염기쌍, 적어도 650개 염기쌍, 적어도 700개 염기쌍, 적어도 750개 염기쌍, 적어도 800개 염기쌍, 적어도 850개 염기쌍, 적어도 900개 염기쌍, 적어도 950개 염기쌍, 적어도 1000개 염기쌍, 적어도 1100개 염기쌍, 적어도 1200개 염기쌍, 적어도 1300개 염기쌍, 적어도 1400개 염기쌍, 또는 적어도 1500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 1500개 염기쌍 미만, 1400개 염기쌍 미만, 1300개 염기쌍 미만, 1200개 염기쌍 미만, 1100개 염기쌍 미만, 1000개 염기쌍 미만, 950개 염기쌍 미만, 900개 염기쌍 미만, 850개 염기쌍 미만, 800개 염기쌍 미만, 750개 염기쌍 미만, 700개 염기쌍 미만, 650개 염기쌍 미만, 600개 염기쌍 미만, 550개 염기쌍 미만, 500개 염기쌍 미만, 480개 염기쌍 미만, 460개 염기쌍 미만, 440개 염기쌍 미만, 420개 염기쌍 미만, 400개 염기쌍 미만, 380개 염기쌍 미만, 360개 염기쌍 미만, 340개 염기쌍 미만, 320개 염기쌍 미만, 300개 염기쌍 미만, 280개 염기쌍 미만, 260개 염기쌍 미만, 240개 염기쌍 미만, 220개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 190개 염기쌍 미만, 180개 염기쌍 미만, 170개 염기쌍 미만, 160개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 140개 염기쌍 미만, 130개 염기쌍 미만, 120개 염기쌍 미만, 110개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만, 90개 염기쌍 미만, 80개 염기쌍 미만, 70개 염기쌍 미만, 60개 염기쌍 미만, 50개 염기쌍 미만, 40개 염기쌍 미만, 또는 30개 염기쌍 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 30 내지 1500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 40 내지 1400개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 50 내지 1300개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 60 내지 1200개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 70 내지 1100개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 80 내지 1000개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 100 내지 800개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 110 내지 700개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 120 내지 600개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 130 내지 500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 140 내지 400개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 150 내지 300개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 160 내지 200개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 170 내지 190개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 1381개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 499개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 치료적 단백질 또는 이의 치료적 단편을 발현할 수 있다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬, 및 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 유전 질환을 치료하는 데 유용하다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 지질을 더 포함한다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 상기 지질 내에 캡슐화된다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 지질은 지질 나노입자(LNP)이다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 본 개시는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 대상체의 유전 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 또는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 대상체에게 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 및 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 또는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 치료적 유전자를 세포의 핵에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 또는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포의 핵에 전달하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시는 치료적 유전자 또는 치료적 단백질로 치료될 대상체의 면역 반응을 최소화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ssDNA 분자 또는 본 명세서의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 관심 대상 핵산은 상기 치료적 유전자 또는 치료적 단백질을 인코딩한다.
본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 인핸서는 이중 가닥이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10개 염기쌍, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 30개 염기쌍, 적어도 40개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍, 적어도 60개 염기쌍, 적어도 70개 염기쌍, 적어도 80개 염기쌍, 적어도 90개 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍, 적어도 110개 염기쌍, 적어도 120개 염기쌍, 적어도 130개 염기쌍, 적어도 140개 염기쌍, 적어도 150개 염기쌍, 적어도 160개 염기쌍, 적어도 170개 염기쌍, 적어도 180개 염기쌍, 적어도 190개 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍, 적어도 220개 염기쌍, 적어도 240개 염기쌍, 적어도 260개 염기쌍, 적어도 280개 염기쌍, 적어도 300개 염기쌍, 적어도 320개 염기쌍, 적어도 340개 염기쌍, 적어도 360개 염기쌍, 적어도 380개 염기쌍, 적어도 400개 염기쌍, 적어도 420개 염기쌍, 적어도 440개 염기쌍, 적어도 460개 염기쌍, 적어도 480개 염기쌍, 적어도 500개 염기쌍, 적어도 550개 염기쌍, 적어도 600개 염기쌍, 적어도 650개 염기쌍, 적어도 700개 염기쌍, 적어도 750개 염기쌍, 적어도 800개 염기쌍, 적어도 850개 염기쌍, 적어도 900개 염기쌍, 적어도 950개 염기쌍, 적어도 1000개 염기쌍, 적어도 1100개 염기쌍, 적어도 1200개 염기쌍, 적어도 1300개 염기쌍, 적어도 1400개 염기쌍, 또는 적어도 1500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 1500개 염기쌍 미만, 1400개 염기쌍 미만, 1300개 염기쌍 미만, 1200개 염기쌍 미만, 1100개 염기쌍 미만, 1000개 염기쌍 미만, 950개 염기쌍 미만, 900개 염기쌍 미만, 850개 염기쌍 미만, 800개 염기쌍 미만, 750개 염기쌍 미만, 700개 염기쌍 미만, 650개 염기쌍 미만, 600개 염기쌍 미만, 550개 염기쌍 미만, 500개 염기쌍 미만, 480개 염기쌍 미만, 460개 염기쌍 미만, 440개 염기쌍 미만, 420개 염기쌍 미만, 400개 염기쌍 미만, 380개 염기쌍 미만, 360개 염기쌍 미만, 340개 염기쌍 미만, 320개 염기쌍 미만, 300개 염기쌍 미만, 280개 염기쌍 미만, 260개 염기쌍 미만, 240개 염기쌍 미만, 220개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 190개 염기쌍 미만, 180개 염기쌍 미만, 170개 염기쌍 미만, 160개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 140개 염기쌍 미만, 130개 염기쌍 미만, 120개 염기쌍 미만, 110개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만, 90개 염기쌍 미만, 80개 염기쌍 미만, 70개 염기쌍 미만, 60개 염기쌍 미만, 50개 염기쌍 미만, 40개 염기쌍 미만, 또는 30개 염기쌍 미만이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 30 내지 1500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 40 내지 1400개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 50 내지 1300개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 60 내지 1200개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 70 내지 1100개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 80 내지 1000개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 100 내지 800개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 110 내지 700개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 120 내지 600개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 130 내지 500개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 140 내지 400개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 150 내지 300개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 160 내지 200개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 1381개 염기쌍이다. 본 명세서의 양태 및 구현예 중 일 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 499개 염기쌍이다.
위에 간략하게 요약되고 이하에서 보다 상세히 논의되는 본 개시의 구현예는 첨부된 도면에 도시된 본 개시의 예시적인 구현예를 참조하여 이해될 수 있다. 그러나, 첨부된 도면은 본 개시의 전형적인 구현예만을 예시한 것이므로 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않으며, 본 개시에 대해 다른 동일하게 효과적인 구현예가 가능할 수 있다.
도 1a는 이중 가닥 ceDNA 작제물 10429에서 시작하여 ssDNA 엔도뉴클레아제 처리를 통해 ssAAV 벡터를 수득하였음을 보여준다. 도 1a에서 볼 수 있듯이, ssRES ss360 대조군에서는 약 830 bp의 명확한 밴드가 관찰되었으며, φX174 ssDNA 대조군에서는 명확한 분해가 나타났다. 웰에서 전체 크기의 ssRES ss429가 손실되었으며, 5U 녹두 뉴클레아제 처리를 통해 더 두드러지거나 명확하게 보이는 약 100 bp의 밴드 이동이 나타났다.
도 1b는 이중 가닥 ceDNA 10429 작제물("ds429")과 단일 가닥 10429 및 10360의 모식도이다.
도 2는 3'-OH의 존재를 뒷받침하는 ss 합성 AAV 벡터 분자의 Klenow 엑소뉴클레아제 충진을 도시한 것이다.
도 3은 대칭 및 비대칭 ITR 올리고의 모식도이다. 위쪽 도면은 대칭 오버행을 도시한 것이다. 아래쪽 도면은 비대칭 오버행을 도시한 것으로, 여기서 왼쪽 ITR의 3' 말단에는 PS 결합이 있고(분자의 3' 말단에 더 가까움) 오른쪽 ITR에는 2개 염기만큼 오른쪽으로 이동한 PS 결합이 있다.
도 4는 작제물 ss10429 및 ss10483의 대칭 ITR 올리고를 포함하는 단일 가닥 AAV 합성 벡터 hAAT-루시페라아제 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 도 4에 도시된 바와 같이, A/A' 스템의 RBE에 있는 일부 뉴클레오티드를 변경하는 CpG 없는 스페이서가 포함되었다. 닉(nick) 부위 Nb.BbvCI가 말단 분해 부위(trs)의 하류 영역에 조작되었다.
도 5는 작제물 ss10485의 비대칭 ITR 올리고를 포함하는 단일 가닥 AAV 합성 벡터 hAAT-루시페라아제 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, A/A' 스템의 RBE에 있는 일부 뉴클레오티드를 변경하는 CpG 없는 스페이서가 포함되었다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다.
도 6은 작제물 ss10491의 대칭 ITR 올리고를 포함하는 단일 가닥 AAV 합성 벡터 FVIII 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다.
도 7은 작제물 ss10484의 비대칭 ITR 올리고를 포함하는 단일 가닥 AAV 합성 벡터 FVIII 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다.
도 8은 단일 가닥 AAV 합성 벡터가 형질주입된 HepG2 세포의 루시페라아제 발현을 보여주는 그래프이다. ceDNA 및 단일 가닥 AAV 합성 벡터에서 명확한 용량 반응이 관찰되었다.
도 9는 겔 추출 및 Zymo 컬럼 정제 단일 가닥 AAV 합성 벡터가 ceDNA에 비해 더 낮은 선천성 면역 반응을 유도하였음을 보여주는 그래프이다. 단일 가닥 AAV 합성 벡터는 WT THP1 세포에서 매칭하는 분자 용량에서 ceDNA보다 루시아 IFN 리포터를 더 적게 유도하였다.
도 10은 겔 추출 및 Zymo 컬럼 정제 단일 가닥 AAV 합성 벡터가 ceDNA에 비해 더 낮은 선천성 면역 반응을 유도하였음을 보여주는 그래프이다. cGAS KO 세포에서, 가장 높은 ceDNA 용량 및 컬럼 정제 단일 가닥 AAV 합성 벡터에서 IFN 반응이 있었으나, 그 외에는 없었으며 이는 cGAS가 단일 가닥 AAV 합성 벡터 및 ceDNA를 감지함을 나타낸다.
도 11은 단일 가닥 합성 DNA(ssDNA) "SSD"(40004) 투약된 동물 및 이중 가닥(ds) ceDNA(10541) 투약된 동물의 중간 종단 체중을 보여주는 그래프이다.
도 12은 각 용량에 대해 단일 가닥 합성 DNA(ssDNA) "SSD"(40004) 투약된 동물 및 이중 가닥(ds) ceDNA(10541) 투약된 동물의 중간 종단 체중을 보여주는 그래프 패널이다.
도 13은 4일차에 실시한 IVIS 이미징의 결과를 도시한 것이다.
도 14는 4일차 내지 7일차에 실시한 IVIS 이미징의 결과를 도시한 것이다.
도 15는 이중 가닥(ds) ceDNA 작제물 10360(서열번호 1)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 15에서 알 수 있듯이, 인자 VIII ORF는 서열번호 1의 뉴클레오티드 828 내지 5219에 위치한다.
도 16은 ds ceDNA 작제물 10429(서열번호 2)의 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 16에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF는 서열번호 2의 뉴클레오티드 1449 내지 3101에 위치한다.
도 17은 ds ceDNA 작제물 10483(서열번호 3)의 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 17에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF는 서열번호 3의 뉴클레오티드 1449 내지 3101에 위치한다.
도 18은 ds ceDNA 작제물 10484(서열번호 4)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 18에서 알 수 있듯이, 인자 VIII ORF는 서열번호 4의 뉴클레오티드 835 내지 5226에 위치한다.
도 19는 ds ceDNA 작제물 10485(서열번호 5)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 19에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF는 서열번호 5의 뉴클레오티드 1449 내지 3101에 위치한다.
도 20은 ds ceDNA 작제물 10491(서열번호 6)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 20에서 알 수 있듯이, 인자 VIII ORF는 서열번호 6의 뉴클레오티드 835 내지 5226에 위치한다.
도 21은 ds ceDNA 작제물 10376(서열번호 7)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 21에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF는 서열번호 7의 뉴클레오티드 1443 내지 3095에 위치한다.
도 22는 ds ceDNA 작제물 10541(서열번호 8)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 22에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF는 서열번호 8의 뉴클레오티드 1449 내지 3101에 위치한다.
도 23은 예시적인 ds ceDNA 서열 중 하나를 포함하는 플라스미드 210150(서열번호 9)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 23에서 알 수 있듯이, 인자 VIII ORF는 뉴클레오티드 894 내지 5285에 위치한다.
도 24는 단일 가닥(ss) DNA 작제물 40004(서열번호 10)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 24에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF 역상보적 서열은 서열번호 10의 뉴클레오티드 503 내지 2155에 위치한다.
도 25는 분자 수에 매칭하는 다섯 가지 상이한 용량에 대해 단일 가닥 합성 DNA(ssDNA) "SSD"(ssDNA 작제물 40004, "ss004"로 지정됨) 투약된 동물 및 이중 가닥(ds) ceDNA(ds ceDNA 작제물 10541, "ds541"로 지정됨) 투약된 동물의 중간 종단 체중을 보여주는 그래프 패널이다.
도 26은 단일 가닥 합성 DNA(ssDNA) "SSD"(40004) 투약된 동물 및 이중 가닥(ds) ceDNA(10541) 투약된 동물의 5일간의 체중 감소를 보여주는 그래프 패널이다. 도 26에 도시된 바와 같이, BW 감소의 차이는 ssDNA가 투약된 동물이 감소된 체중을 빠르게 회복한 2일차에 가장 뚜렷하게 나타났다.
도 27은 6시간 후 사이토카인 발현에 대한 ssDNA(작제물 40004, "ss004"로 지정됨) 및 ds ceDNA(작제물 10541, "ds541"로 지정됨)의 효과를 보여주는 그래프 패널이다(ds ceDNA 작제물 10376("376")이 양성 대조군으로 사용됨). 도면 범례는 작제물에 PS 결합이 있었는지("PS 있음") 또는 없었는지("PS 없음")를 나타낸다.
도 28은 6시간 후 사이토카인 발현에 대한 ssDNA(작제물 40004, "ss004"로 지정됨) 및 ds ceDNA(작제물 10541, "ds541"로 지정됨)의 효과를 보여주는 두 번째 실험의 그래프 패널이다(ds ceDNA 작제물 10376("376")이 양성 대조군으로서 사용됨). 도면 범례는 작제물에 PS 결합이 있었는지("PS 있음") 또는 없었는지("PS 없음")를 나타낸다.
도 29는 qtPCR로 측정한 결과 ds ceDNA(작제물 10541, "ds541"로 지정됨) 및 ss DNA(작제물 40004, "ss004"로 지정됨)가 간에서 유사한 수준의 mRNA를 가졌음을 보여주는 그래프이다.
도 30은 LNP로 제형화된 mRNA, ceDNA, 및 ssDNA 카고가 마우스의 혈중 사이토카인 수준에 미치는 영향을 보여주는 그래프 패널이다. 마우스(그룹당 n=5)에게 LNP로 제형화된 mRNA, ceDNA, 또는 ssDNA를 정맥내 주사하였다. 주사 후 6시간에 IFN-α, IL-18, TNF-α, IL-6, 및 IFN-γ의 혈중 수준(pg/mL)을 측정하였다. 나중에 비인간 영장류(NHP)에서 사용하기 위해 대규모로 생산된 여러 배치의 ssDNA도 시험하였다. 각 그래프의 그룹은 왼쪽에서 오른쪽으로 다음과 같다: PBS 대조군, mRNA(2.0 mg/kg), ceDNA(2.0 mg/kg), ssDNA 배치 B1(2.0 mg/kg), ssDNA 배치 B1(NHP 스케일; 0.5 mg/kg), ssDNA 배치 B1(NHP 스케일; 2.0 mg/kg), ssDNA 배치 C(NHP 스케일; 0.5 mg/kg), ssDNA 배치 C(NHP 스케일; 2.0 mg/kg).
도 31은 시노몰구스 원숭이에게 정맥내 주입 후 6시간 및 24시간에 1.0 mg/kg의 LNP로 제형화된 ceDNA("DNA", 원), ssDNA(사각형), 및 mRNA(삼각형) 카고가 혈중 사이토카인 수준(pg/mL)에 미치는 효과를 보여주는 그래프 패널이다.
도 32는 1.0 mg/mL의 LNP로 제형화된 ceDNA(원), ssDNA(사각형), 또는 mRNA(삼각형)를 투여한 후 NHP에서 측정한 보체 활성화 수준(왼쪽: C3a; 오른쪽: C5b-9)을 도시한 것이다.
도 33은 시험관 내 PBMC 분석의 결과를 도시한 것이다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 LNP로 제형화된 ceDNA 또는 ssDNA와 접촉시키고, TNF-α 자극을 측정하였다. 첫 번째 시험(왼쪽의 두 개의 막대) 및 두 번째 시험(오른쪽의 미처리 대조군을 포함한 세 개의 막대) 모두에서, ssDNA는 ceDNA에 비해 유의하게 낮은 TNF-α 자극을 유도하였다(ssDNA 유도 TNF-α 자극은 미처리 대조군과 유사함).
도 34는 LNP로 제형화된 ssDNA로부터의 지속적이고 강력한 발현을 보여주는 그래프 패널이다. 마우스에게 루시페라아제 리포터 유전자를 포함하는 0.25 mg/kg의 LNP로 제형화된 ceDNA 또는 ssDNA를 정맥내 주사하였다. 루시페라아제 발현(IVIS)을 주사 후 1일과 4일(오른쪽) 및 최대 30일(왼쪽)까지의 추가 시점에 측정하였다.
도 35a 내지 도 35e는 상이한 성분을 가진 ssDNA 작제물의 모식도이다. 모든 작제물은 hAAT-루시페라아제 발현 작제물을 포함한다. 도 35a: 작제물 ss004(왼쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, 하단 가닥에 PS 결합 및 Nb.BbvCI 닉 부위가 있음; 오른쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, A 영역의 대부분이 제거되고 5' 말단에 PS 결합이 있음; 발현 작제물 - 가닥). 도 35b: 작제물 ss020(ss004와 동일하나 PS 결합이 없음). 도 35c: 작제물 ss021(ss004와 동일하나 야생형 AAV2 ITR이 있고 PS 결합이 없으며 Nb.BbvCI 닉 부위가 없음). 도 35d: 작제물 ss022(발현 작제물 + 가닥을 제외하고는 ss021과 유사함). 도 35e: ITR 서열이 없는 hAAT-루시페라아제 발현 작제물.
도 36은 ssDNA 작제물에 의한 시험관 내 루시페라아제 발현의 그래프이다. HepG2 세포에 각각 100 ng 또는 200 ng의 ss004 또는 ss011을 형질주입하고, 48시간 후에 루시페라아제 발현(세포 생존력으로 정규화)을 측정하였다.
도 37은 마우스에게 유체역학적 주입(HDI) 후 ssDNA 작제물에 의한 생체 내 루시페라아제 발현의 결과를 나타내는 그래프 패널이다. 마우스에게 ceDNA541(동물당 5 ng 또는 500 ng), 작제물 ss004, ss020, ss021, ss022, 또는 ss011(동물당 500 ng), 또는 ss021+ss022(동물당 250 ng) 또는 ss011+ss022(동물당 250 ng)의 혼합물을 주입하였다. 1일차(왼쪽 위) 및 4일차(왼쪽 아래)의 IVIS 루시페라아제 발현과 종단 플롯(오른쪽 위)이 도시되어 있다.
도 38은 LNP로 제형화된 ssDNA 작제물을 주입한 마우스에서의 생체 내 루시페라아제 발현의 결과를 도시하는 그래프이다. 결과는 왼쪽부터 오른쪽으로 PBS 대조군(역삼각형), ss011(다이아몬드, 이온화성 지질 MC3), ss011(속이 빈 원, 이온화성 지질 Y), ss011(정사각형, 이온화성 지질 Z), 및 ss004(이온화성 지질 Z)에 대한 것이다.
도 39a 내지 도 39d는 상이한 PS 결합 구성을 가진 ssDNA 작제물의 모식도이다. 모든 작제물은 hAAT-루시페라아제 발현 작제물을 포함한다. PS 결합의 위치가 화살표로 표시되어 있다. 도 39a: 작제물 ss004(왼쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, 하단 가닥에 PS 결합이 있음; 오른쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, A 영역의 대부분이 제거되고 5' 말단에 PS 결합이 있음). 도 39b: 작제물 034(ss004와 동일하나 왼쪽 ITR의 PS 결합이 3' 말단 근처의 상단 가닥에 있음). 도 39c: 작제물 ss039(ss034와 동일하나 오른쪽에 절단된 ITR이 있고 5' 말단 근처의 하단 가닥에 PS 결합 있음). 도 39d: 작제물 ss040(ss039와 동일하나 PS 결합이 없음).
도 40은 LNP로 제형화된 ssDNA 작제물을 주입한 마우스에서의 생체 내 루시페라아제 발현의 결과를 도시하는 그래프 패널이다. 마우스에게 ceDNA541, ceDNA654, ss004, ss034, ss039, 또는 ss040(0.25 mg/kg)을 주입하였다. 1일차(왼쪽 위) 및 4일차(오른쪽 위)의 IVIS 루시페라아제 발현과 종단 플롯(아래)이 도시되어 있다.
도 41은 LNP로 제형화된 mRNA, ceDNA, 및 ssDNA 카고가 마우스의 혈중 사이토카인 수준에 미치는 영향을 보여주는 그래프 패널이다. 마우스(그룹당 n=5)에게 LNP로 제형화된 ceDNA 또는 ssDNA 작제물을 정맥내 주사하였다. 주입 후 6시간에 IFN-α(왼쪽 위), IFN-γ(오른쪽 위), IL-6(왼쪽 가운데), TNF-α(오른쪽 가운데), 및 IL-18(왼쪽 아래)의 혈중 수준(pg/mL)을 측정하였다. 각 그래프의 그룹은 왼쪽에서 오른쪽으로 다음과 같다: PBS 대조군, ceDNA541, ceDNA654, ss004, ss034, ss039, 및 ss040.
도 42a 내지 도 42d는 단일 가닥 또는 이중 가닥 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물의 모식도이다. 모든 작제물은 루시페라아제 리포터를 포함한다. 도 43a: ss004, 단일 가닥 hAAT 인핸서/프로모터 세트. 도 43b: ss104, 이중 가닥 hAAT 인핸서/프로모터 세트. 도 43c: ss102, 단일 가닥 1xSERP/TTR 인핸서/프로모터 세트. 도 43d: ss104, 이중 가닥 1xSERP/TTR 인핸서/프로모터 세트.
도 43은 단일 가닥(ss004, ss102) 또는 이중 가닥(ss104, ss103) 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물을 HDI를 통해 주입한 마우스에서의 루시페라아제 발현을 측정한 그래프 패널이다. 왼쪽: 1일차의 루시페라아제 발현. 가운데: 7일차의 루시페라아제 발현. 오른쪽: 1일차부터 7일차까지의 종단 발현.
도 44는 단일 가닥 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물(각각 ss004, ss102)과 비교한 이중 가닥 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물(각각 ss104, ss103)의 발현 배수 변화를 보여주는 그래프 패널이다. 왼쪽: 1일차. 가운데: 7일차. 오른쪽: 1일차부터 7일차까지의 종단 배수 변화.
도 45는 단일 가닥(ss004, ss102) 또는 이중 가닥(ss104, ss103) 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물을 HDI를 통해 주입한 마우스에서의 루시페라아제 발현을 ceDNA541에 의한 발현과 비교하여 보여주는 그래프 패널이다. 왼쪽: 1일차째의 루시페라아제 발현. 오른쪽: 7일차째의 루시페라아제 발현.
I. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 가진다. 본 개시는 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 한정되지 않으며, 따라서 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 개시의 청구범위에 의해서만 정의되는 본 개시의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 면역학 및 분자 생물학에서 공통 용어의 정의는 다음의 문헌으로부터 찾을 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 제19판, Merck Sharp& Dohme Corp. 출판, 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter 등의 문헌(편집) [Fields Virology, 제6판, Lippincott Williams& Wilkins 출판, Philadelphia, PA, USA (2013)], Knipe, D.M. 및 Howley, P.M.의 문헌(편집) [The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 및 Robert A. Meyers의 문헌(편집) [Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 출판, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; Immunology by Werner Luttmann, Elsevier 출판, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (편집), Taylor& Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, Jones& Bartlett Publishers 출판, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green 및 Joseph Sambrook의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제4판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; Davis 등의 문헌 [Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch(편집) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel(편집), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan(편집), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe (편집) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), 이들 모두의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨.
본 명세서에서 사용되는 용어 "AAV" 또는 "아데노 연관 바이러스"는 세포에서만 성장하는 단일 가닥 DNA 파보바이러스를 지칭한다. AAV의 특정 기능은 헬퍼 바이러스를 동시감염시킴으로써만 제공된다. AAV의 13개의 혈청형이 식별되었다. AAV의 일반 정보 및 검토에 대해서는 예컨대, Carter의 문헌[1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, p. 169-228], 및 Berns의 문헌[1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)]에서 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 가닥(ss) 합성 DNA 분자", "단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터", "ss DNA 분자의 합성 생산", 및 "ss AAV 벡터의 합성 생산"은 완전한 무세포 환경에서의 단일 가닥(ss) 합성 DNA 분자(ssDNA), 단일 가닥 AAV 벡터, 및 이들의 합성 생산 방법을 지칭한다. 상기 생산은 세포에 의해 또는 세포 내부에서 분자를 복제하거나 달리 증식시키는 것 또는 세포 추출물을 사용하는 것을 포함하지 않는 방식으로 하나 이상의 분자를 생산하는 것을 포함할 수 있다. 합성 생산은 생산된 분자가 세포 오염 물질, 예컨대, 세포 단백질 또는 세포 핵산, 바이러스 단백질 또는 DNA, 곤충 단백질 또는 DNA로 오염되는 것을 방지하고, 또한 생산 프로세스 동안 분자의 원치 않는 세포 특이적 변형, 예컨대, 메틸화 또는 당질화 또는 다른 번역 후 변형을 방지한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "갭(gap)" 및 "닉(nick)"은 상호 교환적으로 사용되고, 본 개시의 합성 DNA 벡터의 불연속 부분을 지칭하며, 이는 달리 이중 가닥 ceDNA에서 단일 가닥 DNA 부분을 신장시킨다. 상기 갭은 길이가 1 내지 100개 염기쌍일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 설계 및 생성되는 전형적인 갭 및 상기 방법에 의해 생성되는 합성 벡터는 길이가 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60개 염기쌍(bp)일 수 있다. 본 개시에서 예시되는 갭은 1 bp 내지 10 bp의 길이, 1 내지 20 bp의 길이, 1 내지 30 bp의 길이, 또는 숙주 세포에서 발현 카세트의 효율적인 전사를 허용하거나 유지하기 위해 이중 가닥 DNA를 니킹하는 데 필요한 임의의 길이일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 갭은 발현 카세트의 5' 상류 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 갭은 발현 카세트의 3' 하류 영역에 존재할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 갭은 발현 카세트의 5' 상류 영역 및 발현 카세트의 3' 하류 영역에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "닉"은 일반적으로 손상 또는 효소 작용을 통해 한 가닥의 인접한 뉴클레오티드 사이에 인산디에스테르 결합이 없는 이중 가닥 DNA 분자의 불연속을 지칭한다. 하나 이상의 닉은 DNA 복제 중에 가닥의 .꼬임이 풀릴 수 있게 하며, 닉은 또한 전사 기구의 결합을 용이하게 하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ceDNA"는 비바이러스 유전자 전달, 합성 등을 위한 캡시드 결핍 폐쇄 말단 선형 이중 가닥(ds) 이중체 DNA를 지칭한다. ceDNA에 대한 상세한 설명은 2017년 3월 3일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2017/020828(국제 특허 공개 번호 WO2017152149A1로 공개됨)에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역위 말단 반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA를 생산하기 위한 특정 방법은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996(국제 특허 공개 번호 WO 2019/051255 A1로 공개됨)의 실시예 1 및 2018년 12월 6일자로 출원된 PCT/US2018/064242(국제 특허 공개 번호 WO 2019/113310 A1호로 공개됨)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은 예컨대, 2019년 1월 18일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2019/14122(국제 특허 공개 번호 WO 2019/143885 A1로 공개됨)에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ceDNA는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "neDNA" 또는 "니킹된 ceDNA"는 개방 해독 프레임(예컨대, 발현될 프로모터 및 이식유전자)의 상류 영역에 있는 스템 영역 또는 스페이서 영역에서 1 내지 100개 염기쌍의 닉 또는 갭이 있는 폐쇄 말단 DNA를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역위 말단 반복" 또는 "ITR"은 본 명세서에 개시된 ssDNA 벡터의 5' 및/또는 3' 말단에 위치한 핵산 서열을 지칭하는 것을 의미하며, 상기 ITR은 부분 이중체 및 적어도 하나의 루프를 포함하는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR은 인공 서열(예컨대, 바이러스로부터 유래된 서열을 포함하지 않는 서열)일 수 있다. 상기 ITR은 하나의 스템-루프 구조(예컨대, "헤어핀"), 또는 하나 초과의 스템-루프 구조를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 ITR은 2개의 스템-루프 구조(예컨대, "망치머리(hammerhead)", "개뼈(doggy-bone)", 또는 "덤벨(dumbbell)"), 3개의 스템-루프 구조(예컨대, "십자형"), 또는 보다 복잡한 구조를 포함할 수 있다. 상기 ITR은 압타머 서열 또는 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 "ITR"은 하나 이상의 바람직한 기능적 서열(예컨대, 회문 서열)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다. 상기 ITR 서열은 인공 AAV ITR, 인공 비AAV ITR, 또는 바이러스 AAV ITR로부터 물리적으로 유래된 ITR(예컨대, 바이러스 유전체로부터 제거된 ITR 단편)일 수 있다. 예를 들어, 상기 ITR은 파보바이러스(Parvoviruses) 및 데펜도바이러스(Dependoviruses)(예컨대, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에(Parvoviridae)과로부터 유래될 수 있거나, SV40의 복제 기원의 역할을 하는 SV40 헤어핀이 ITR로서 사용될 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입, 및/또는 추가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 파보비리다에과 바이러스는 두 개의 하위 계열로 이루어진다: 척추동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae), 및 무척추동물을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae). 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하되 이로 제한되지 않는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노 연관 바이러스(AAV)의 바이러스 계열을 포함한다. 일반적으로, 상기 ITR 서열은 AAV뿐만 아니라 파보바이러스, 렌티바이러스, 거위 바이러스, B19로부터 유래될 수도 있고, 야생형, "개뼈" 및 "덤벨 형상"의 구성으로 유래되고, 대칭 또는 비대칭의 ITR 배향으로 유래될 수도 있다. 일반적으로 상기 ITR은 AAV 벡터의 5' 및 3' 말단 모두에 존재하지만, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에서, ITR은 선형 벡터의 말단 중 하나에만 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 ITR은 5' 말단에만 존재할 수 있다. 일부 다른 경우에, 상기 ITR은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에서 3' 말단에만 존재할 수 있다. 본 명세서에서 편의상, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 발현 카세트의 5'에 ("이의 상류 영역에") 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "왼쪽 ITR"로서 지칭되고, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 발현 카세트의 3'에("이의 하류 영역에") 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "오른쪽 ITR"로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 "야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은 AAV 유전체 또는 다른 데펜도바이러스에서 예컨대, Rep 결합 활성 및 Rep 니킹 능력을 유지하는 자연 발생 ITR 서열의 서열을 지칭한다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드의 축퇴 또는 유전자 부동(drift)으로 인해 표준 자연 발생 서열과 다소 상이할 수 있으므로, 본 명세서에서 사용하도록 포함된 WT-ITR 서열은 자연 발생 변화(예컨대, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"은 둘 다 전체 길이에 걸쳐 역상보적 서열을 가지는 야생형 ITR인 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터) 내의 WT-ITR 쌍을 지칭한다. 예를 들어, ITR이 표준 자연 발생 표준 서열로부터 벗어나는 하나 이상의 뉴클레오티드를 가지는 경우에도, 그 변화가 서열의 기능적 특성 및 전체 3차원 구조(2차 및 3차 구조)에 영향을 미치지 않는 한, 해당 ITR은 야생형 서열로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 벗어나는 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 비제한적인 일례로서, (예컨대, 기본 설정에서 BLAST를 사용하여 측정 시) 표준 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성이 있고, 또한 다른 WT-ITR에 대한 대칭적인 3차원 공간 구조를 가짐으로써 이들의 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 하는 서열이 여기에 포함된다. 상기 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가진다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR이 WT임을 확인하는 것은 실질적으로 대칭인 WT-ITR이 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE') 및 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 말단 분해 부위(TRS)를 가진다는 것을 결정함으로써 기능적으로 확인할 수 있다. 당업자는 허용 가능한 조건에서의 이식유전자 발현을 포함하여, 다른 기능을 선택적으로 시험할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이체 ITR"이라는 문구는 상호 교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형으로부터의 WT-ITR과 비교 시 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드에서 돌연변이를 가진 ITR을 지칭한다. 이러한 돌연변이는 ITR에서 A, C, C', B, B' 영역 중 하나 이상에서의 변화를 야기할 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 조직과 비교 시 3차원 공간 조직(즉, 기하학적 공간 내의 3D 구조)의 변화를 야기할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비대칭 ITR"은 또한 "비대칭 ITR 쌍"으로도 지칭되며, 이는 이들의 전장에 걸쳐 역상보적 서열이 아닌 단일 ssDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. 비제한적인 일례로서, 비대칭 ITR 쌍은 이들의 동족 ITR에 대해 대칭적인 3차원 공간 구조를 가지지 않으며, 이에 따라 이들의 3D 구조는 기하학적 공간에서 상이하다. 달리 말하면, 비대칭 ITR 쌍은 상이한 전체 기하학적 구조를 가진다. 즉, 이들은 3D 공간에서 이의 A, C-C' 및 B-B' 루프의 상이한 구조를 가진다(예컨대, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교 시 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있다). 2개의 ITR 사이의 서열의 상이점은 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실, 절단, 또는 점 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 비대칭 ITR 쌍의 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 ITR은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 변형된 ITR(예컨대, 비야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 비대칭 ITR 쌍의 ITR은 모두 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상(즉, 상이한 전체 기하학적 구조)을 가진 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 하나의 mod-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 상이한 변형(예컨대, 단일 아암, 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있으며, 이에 따라 동족 비대칭 mod-ITR과 비교 시 상이한 3차원 공간 구조를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대칭 ITR"은 ssDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR로서, 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 대해 상대적으로 돌연변이되거나 변형되고, 이들의 전체 길이에 걸쳐 역상보적 서열인 한 쌍의 ITR을 지칭한다. ITR은 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이들은 돌연변이체 ITR로도 지칭되는 변형된 ITR임), 뉴클레오티드 첨가, 결실, 치환, 절단, 또는 점 돌연변이에 기인하는 야생형 ITR 대비 서열 상이점을 가질 수 있다. 본 명세서에서 편의상, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 발현 카세트의 5'에 (이의 상류 영역에) 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "왼쪽 ITR"로서 지칭되고, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 발현 카세트의 3'에(이의 하류 영역에) 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "오른쪽 ITR"로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 대칭인 변형 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"은 전체 길이에 걸쳐 역상보적 서열을 가지는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터) 내의 변형된 ITR 쌍을 지칭한다. 예를 들어, 변형된 ITR이 역상보체 서열로부터 벗어나는 일부 뉴클레오티드 서열을 가진 경우에도 그 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 변형된 ITR은 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 비제한적인 일례로서, (기본 설정에서 BLAST를 사용하여 측정했을 때) 표준 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로서, 변형된 동족 ITR과 대칭인 3차원 공간 구조를 또한 가짐으로써, 이들의 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되는 서열이 여기에 포함된다. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 스템-루프 구조를 가진다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역상보적 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만, 여전히 동일한 대칭 3차원 공간 구조를 가질 수 있으며, 즉, 둘 모두 동일한 전체 3D 형상을 야기하는 돌연변이를 가진다. 예를 들어, 바이러스 유래 ITR에서, mod-ITR 쌍의 하나의 ITR(예컨대, 5' ITR)은 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 하나의 ITR(예컨대, 3' ITR)은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있으나, 둘 모두는 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으며(예컨대, 5' ITR이 C 영역에서 결실을 가지는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에서 결실을 가짐), 이에 따라 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭 3차원 공간 구조를 가진다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍에서의 각각의 ITR은 AAV2 및 AAV6의 조합과 같은 상이한 혈청형(예컨대, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12)으로부터 유래될 수 있으며, 여기에서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형으로부터의 동족 ITR의 상응하는 위치에 반영된다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오티드 서열의 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 가지는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 하나의 쌍을 지칭한다. 비제한적인 예로서, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), 또는 BLASTN과 같은 당업계에 알려진 표준 수단으로 기본 설정에서 측정 시 표준 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지며, 또한 대칭인 3차원 공간 구조를 가짐으로써 이들의 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 하는 mod-ITR가 여기에 포함된다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예컨대, 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍 내의 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 가지며, 또한 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상의 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "측부에 위치하는(flanking)"은 하나의 핵산 서열의 또 다른 핵산 서열에 대한 상대 위치를 지칭한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B의 측부에 A와 C가 위치한다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 마찬가지이다. 따라서, 측부에 위치하는 서열은 이들 서열이 둘러싸는 서열의 앞 또는 뒤에 위치하지만, 해당 서열과 연속하거나, 바로 인접하지 않아도 된다. 일 구현예에서, 측부(flanking)라는 용어는 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 각 말단에서의 말단 반복부를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폐쇄 말단 DNA" 또는 "ceDNA"는 관심 대상 유전자 및 다른 조절 요소를 포함하는 적어도 하나의 공유 폐쇄 말단이 있는 합성, 이중 가닥, 선형, DNA 작제물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폐쇄 말단 DNA 벡터"는 적어도 하나의 공유적으로 폐쇄된 말단을 가지며 해당 벡터의 적어도 일부가 분자 내 이중체 구조를 가지는 캡시드 결핍 DNA 벡터를 지칭한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, "리포터(들)"는 검출 가능한 판독을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질(들)을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 광으로 여기될 때 세포를 형광화시키고, 루시페라아제는 세포로 하여금 광을 생성하는 반응을 촉매하고, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 착색된 생성물로 변환시킨다. 실험적 또는 진단적 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩티드는 β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 인산분해효소(AP), 티미딘 키나아제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시페라아제, 및 기타 당업계에 주지된 것을 포함하나, 이로 제한되지 않는다
본 명세서에서 사용되는 용어 "효과기 단백질"은 예컨대, 리포터 폴리펩티드로서, 또는 보다 적절하게, 세포를 살해하는 폴리펩티드, 예컨대, 독소로서, 또는 선택된 제제로 세포를 살해하기 쉽게 하거나 이의 결여로서 검출 가능한 판독을 제공하는 폴리펩티드를 지칭한다. 효과기 단백질은 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적화하거나 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 효과기 단백질은 숙주 세포 DNA 서열을 표적화하는 제한 엔도뉴클레아제(유전체 또는 염색체외 요소), 세포 생존에 필요한 폴리펩티드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라아제 억제제, 및 리보뉴클레아제 유형 독소를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 효과기 단백질의 발현은 다른 합성 생물학적 회로의 인자로서 참여하여 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절 인자는 관심 대상 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성화 인자 및 억제 인자를 지칭한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 일반적으로 전사 프로모터에 인접하여 결합하고 RNA 중합효소를 동원하여 전사를 직접 개시한다. 억제자는 전사 프로모터에 결합하고 RNA 중합효소에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절제는 이들이 결합하는 위치 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로서 기능할 수 있다. 전사 조절 부류의 비제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 아연 집게 단백질, 날개형 나선(포크헤드) 단백질, 및 류신 지퍼 단백질을 포함하되 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "억제자 단백질" 또는 "유도자 단백질"은 조절 서열 요소에 결합하고 조절 서열 요소에 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화하는 단백질이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 바람직한 억제자 및 유도자 단백질은 적어도 하나의 입력 제제 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 민감하다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은 예컨대, 분리형 DNA 결합제 및 입력 제제 결합제 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 모듈형 형태이다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 부형제, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 보충 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "약제학적으로 허용 가능한"은 숙주에 투여될 경우 독성, 알레르기성, 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "입력 제제 반응성 도메인"은 연결된 DNA 결합 융합 도메인을 해당 병태 또는 입력의 존재에 반응하게 하는 방식으로 병태 또는 입력 제제에 결합하거나 그렇지 않으면 이에 반응하는 전사 인자의 도메인이다. 일 구현예에서, 병태 또는 입력의 존재는 입력 제제 반응성 도메인 또는 그것이 융합되는 단백질에서 전사 인자의 전사 조절 활성을 조절하는 입체 변화를 야기한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생체 내"는 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 발생하는 분석 또는 프로세스를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 양태 중 일부에서, 방법 또는 용도는 세균와 같은 단세포 유기체가 사용될 경우 "생체 내"에서 발생하는 것으로 지칭될 수 있다. 용어 "생체 외"는 다세포 동물 또는 식물의 신체 외부에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포, 예를 들어, 외식편, 일차 세포 및 세포주를 포함하는 배양된 세포, 형질전환된 세포주, 및 혈액 세포를 포함하는 추출된 조직 또는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 지칭한다. 용어 "시험관 내"는 세포 추출물과 같은 온전한 막을 가진 세포의 존재를 필요로 하지 않는 분석 및 방법을 지칭하며, 세포 추출물과 같은 세포 또는 세포 시스템을 포함하지 않는 배지와 같은 비세포 시스템에 프로그램 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 핵산 서열의 전사를 유도함으로써 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 지칭하며, 이는 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지의 전사 개시 및 속도가 제어되는, 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전적 요소, 예컨대, RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 포함할 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위와 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 있다. 진핵생물 프로모터는 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함하는 경우가 많지만, 항상 그런 것은 아니다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터가 본 명세서에 개시된 단일 가닥(ssDNA) 분자에서 이식유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 경계를 이루고 상류(5' 방향)로 연장되어 백그라운드를 초과하는 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하는 데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 카세트" 및 "발현 단위"는 상호 교환적으로 사용되고, DNA 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ssDNA) 분자의 이식유전자의 전사를 유도하기에 충분한 프로모터 또는 다른 DNA 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 이종 DNA 서열을 지칭한다. 적절한 프로모터는 예컨대, 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "재생된(regenerated)"이란 용어가 "재생된 이중 가닥 발현 카세트" 또는 "재생된 이중 가닥 이식유전자"를 지칭하는 경우, 이 용어는 ssDNA 분자가 숙주 세포의 핵에 수송된 후에 형성되는 이중 가닥 발현 카세트 또는 이중 가닥 이식유전자로서, ssDNA 분자의 단일 가닥 부분을 충진함으로써 ssDNA로부터 이중 가닥 DNA를 생성하는 DNA 중합효소 활성에 반응하는 이중 가닥 발현 카세트 또는 이중 가닥 이식유전자를 지칭하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "작동 가능하게 연결된"은 설명된 구성 요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 상기 프로모터가 이의 전사 또는 발현에 영향을 미칠 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 프로모터가 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동 가능하게 위치된", "작동식으로 연결된", "제어하에", 및 "전사 조절하에"라는 문구는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하도록 조절하는 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 경우에, "역위 프로모터"는 핵산 서열이 역방향 배향이며 이에 따라 코딩 가닥이었던 것이 이제는 비-코딩 가닥이고 그 반대인 프로모터를 의미한다. 역위 프로모터 서열은 다양한 구현예에서 스위치의 상태를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "DNA 조절 서열", "제어 요소," 및 "조절 요소"는, 전사 및 번역 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호, 등을 지칭하며, 이는 비-코딩 서열(예컨대, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예컨대, 부위 지향 변형 폴리펩티드, 또는 Cas9/Csn1 폴리펩티드)을 제공하고/하거나 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 조절한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인핸서(enhancer)"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예컨대, 활성화제 단백질, 또는 전사 인자)에 결합하는 시스-작용 조절 서열(예컨대, 50 내지 1,500개 염기쌍)을 지칭한다. 자연적으로, 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 시작 부위의 상류 영역 또는 유전자 시작 부위의 하류 영역 최대 약 1,000,000개 염기쌍에 위치할 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내에, 또는 무관한 유전자의 엑손 영역에 위치할 수 있다. 20 내지 200개 염기쌍으로 이루어진 시스-작용 인핸서 서열은 일반적으로 이식유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치된 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관될 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 해당 서열의 하류 영역 또는 상류 영역에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 핵산 분절은 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 조절하에 위치하며, 이들 모두는 자연 환경에서 작동 가능하게 연결되는 인코딩된 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭한다. 유사하게, "재조합 또는 이종 인핸서"는 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 알려진 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에, 프로모터 서열은 본 명세서에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예컨대, 그 각각이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호 참조). 추가적으로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 조절 서열 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 유도자 또는 유도제의 존재하에서, 이의 영향하에서, 또는 이에 의해 접촉될 경우 전사 활성을 개시하거나 향상시키는 것으로 특징지어지는 것이다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 "유도자" 또는 "유도제"는 내인성일 수 있거나, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 있어서 활성인 방식으로 투여되는, 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유도자 또는 유도제, 즉 화학적, 화합물 또는 단백질 자체는 핵산 서열의 전사 또는 발현의 결과일 수 있으며(즉, 유도자 자체는 다른 성분 또는 모듈에 의해 발현된 유도자 단백질일 수 있음), 이는 그 자체가 대조군 또는 유도성 프로모터에 속할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 억제자와 같은 특정 제제의 부재하에 유도된다. 유도성 프로모터의 예는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 테트라사이클린린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유류 바이러스(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유방 종양 바이러스 장 말단 반복(MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 등.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 본 개시에 따라 단일 가닥(ssDNA) 분자를 이용한 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 지칭한다. 일반적으로, 상기 동물은 영장류, 설치류, 가축, 또는 사냥용 동물(game animal)과 같은 그러나 이로 제한되지 않는 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크, 예컨대, 붉은털 원숭이를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드척, 페렛, 토끼, 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥용 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 바이슨, 버팔로, 고양이과 종(예컨대, 애완용 고양이), 개과 종(예컨대, 개, 여우, 늑대), 조류 종(예컨대, 닭, 에뮤, 타조), 및 어류(예컨대, 송어, 매기, 및 연어)를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예컨대, 영장류 또는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상체는 영아 또는 아동일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 신생아 또는 태아 대상체일 수 있고, 예컨대, 대상체는 자궁 내 태아이다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물이다. 상기 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말, 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 한정되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물이 질병 및 장애의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 사용될 수 있다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종, 또는 민족 집단, 예컨대, 코카서스인(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 임상 환경에 있는 환자 또는 다른 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 이미 치료 중이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 배아, 태아, 신생아, 영아, 아동, 청소년, 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 태아, 인간 신생아, 인간 영아, 인간 아동, 인간 청소년, 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 동물 배아 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 배아이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 본 개시에 기재된 단일 가닥(ssDNA) 분자로 형질전환, 형질주입, 형질도입 등을 하기 쉬운 임의의 세포 유형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 숙주 세포는 단리된 일차 세포, 다능성 줄기 세포, CD34+ 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 다수의 불멸화 세포주(예컨대, HepG2 세포) 중 어느 하나일 수 있다. 또는, 숙주 세포는 조직, 기관 또는 유기체 내의 제자리(in situ) 또는 생체 내 세포일 수 있다. 또한, 숙주 세포는 예컨대, 포유류 대상체(예컨대, 유전자 요법을 필요로 하는 인간 환자)의 표적 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 고유 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 핵산(예컨대, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산) 또는 인간의 수작업을 포함하는 프로세스에 의해 정상적으로 발견되지 않고 핵산 또는 폴리펩티드를 이러한 세포 또는 유기체 내에 도입하고자 하는 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템 내로 도입된 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 또는, "외인성"은 생물학적 시스템에 인간의 수작업을 포함하는 프로세스에 의해 도입된 핵산 또는 폴리펩티드, 예컨대, 상대적으로 적은 양으로 발견되는 세포 또는 유기체 및 증가시키고자 하는, 예컨대, 이소성 발현 또는 수준을 생성하기 위한, 세포 또는 유기체 내 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 지칭할 수 있다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"와 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어에는 단일, 이중, 또는 복수 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린과 피리미딘 염기 또는 다른 자연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함된다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, 본 개시의 목적상 올리고뉴클레오티드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 "올리고머" 또는 "올리고"로도 알려져 있으며, 이는 당업계에 알려진 방법에 의해 유전자로부터 단리되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 기재되는 구현예에 적용 가능한 경우, 단일 가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에 따르면, 핵산은 본 개시에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자이다. DNA는 예컨대, 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 유도체 및 이들 그룹의 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 바크미드(bacmid), 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형 공유 폐쇄 DNA 벡터), 폐쇄 말단 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), 개뼈(doggybone)(dbDNA™) DNA, 덤벨 형상 DNA, 초미세 면역학적-정의 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 작은 간섭 RNA(siRNA), 다이서 기질 dsRNA, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스 RNA(vRNA), 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산은 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산을 포함하며, 이 핵산은 합성, 자연 발생, 및 비자연 발생 핵산이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가진다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 잠금 핵산(LNA™), 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하되 이로 제한되지 않는다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 암시적으로, 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 이종상동체, SNP, 및 상보성 서열뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "억제 폴리뉴클레오티드"는 제2 (표적) 폴리뉴클레오티드의 발현(전사 또는 번역)을 감소시키거나 방지하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 억제 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 및 외부 가이드 서열을 포함한다. 용어 "억제 폴리뉴클레오티드"는 DNA 및 RNA 분자, 예컨대, 실제 억제 종을 인코딩하는 RNAi, 예컨대, 리보자임을 인코딩하는 DNA 분자를 더 포함한다.
"뉴클레오티드"는 당 데옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기, 및 인산기를 포함한다. 뉴클레오티드는 인산기를 통해 함께 연결된다.
"염기"는 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 더 포함하는 퓨린 및 피리미딘, 및 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트, 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성 기를 배치하는 변형을 포함하되 이로 제한되지 않는 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체를 포함한다.
"혼성화성" 또는 "상보성" 또는 "실질적으로 상보성"이란 용어는, 핵산(예컨대, RNA)이 비공유 결합, 즉, Watson-Crick 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍을 형성할 수 있게 하고, 적절한 시험관 내 및/또는 생체 내 온도 및 용액 이온 강도 조건하에서 서열 특이적인, 역평행성, 방식으로 또 다른 핵산에 대해 "어닐링", 또는 "혼성화"(즉, 핵산이 상보성 핵산에 특이적으로 결합함)할 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열을 해당 핵산이 포함한다는 것을 의미한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 표준 Watson-Crick 염기 페어링은 다음을 포함한다: 티미딘(T)과 페어링된 아데닌(A), 우라실(U)과 페어링된 아데닌(A), 및 시토신(C)과 페어링된 구아닌(G). 추가적으로, 2개의 RNA 분자 사이의 혼성화에 대해(예컨대, dsRNA), 구아닌(G) 염기가 우라실(U)과 쌍을 이룬다는 것이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, G/U 염기쌍 형성은 mRNA의 코돈과 tRNA 안티-코돈 염기쌍 형성의 컨텍스트에서의 유전자 코드의 축퇴(즉, 중복)에 부분적으로 기인한다. 본 개시의 맥락에서, 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 이중체)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 상보적인 것으로 간주되며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기쌍이 주어진 뉴클레오티드 위치에서 대상 DNA 표적화 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 이중체)로 만들어질 수 있는 경우, 해당 위치는 비상보성인 것으로 간주되지 않지만, 그 대신 상보성인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 작제물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 자연 상태에서 달리 존재하지 않거나 합성적인 방식으로 핵산의 분절을 포함하도록 변형된, 단일 가닥 또는 이중 가닥인 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 작제물이 본 개시의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 경우, 용어 핵산 작제물은 용어 "발현 카세트"와 동의어이다. "발현 카세트"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "핵산 치료제", "치료적 핵산" 및 "TNA"는 상호 교환적으로 사용되며, 이는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 방식을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 경우에, 이들 문구는 RNA 기반 치료제 및 DNA 기반 치료제를 지칭한다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예는 mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스 DNA(예컨대, 렌티바이러스 또는 AAV 유전체) 또는 비바이러스 합성 DNA 벡터, 폐쇄 말단 선형 이중체 DNA(ceDNA / CELiD), 플라스미드, 바그미드, 도기본(dbDNA™) DNA 벡터, 초미세 면역학적 정의 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스 미니스트링 DNA 벡터(선형 공유 폐쇄 DNA 벡터), 또는 덤벨 형상 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA").
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 코딩된 아미노산 및 비-코딩된 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 지칭한다. 본 개시의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등의 문헌(2000), 전술함), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상에서 구현된 바와 같은 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970), 전술함)을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 개방 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)으로 표지된 Needle의 출력은 동일성 퍼센트로서 사용되고 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬의 길이-정렬 내 갭의 총 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 25개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 100개의 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성" 또는 "상동"은 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열 내 뉴클레오티드 잔기와 동일한 상동성 아암 내 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다. 뉴클레오티드 서열 상동성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 수선 주형의 상동성 아암의 핵산 서열(예컨대, DNA 서열)은 해당 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 또는 편집되지 않은 핵산 서열(예컨대, 유전체 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상 동일할 경우 "상동성"으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "상동성 아암"은 상동 재조합을 통해 유전체에 공여체 서열을 표적화하기에 적합한 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 통상적으로, 두 개의 상동성 아암이 상기 공여체 서열의 측부에 위치하며, 각각의 상동성 아암은 통합 유전자좌의 상류 영역 및 하류 영역에 유전체 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "공여체 서열"은 숙주 세포 유전체에 삽입되거나 숙주 세포 유전체의 복구 주형으로서 사용되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 공여체 서열은 유전자 편집 중에 원하는 변형을 포함할 수 있다. 혼입되는 서열은 표적 서열에서의 동형 방식 수선을 통해 표적 핵산 분자에 도입될 수 있으며, 이에 따라 원래 표적 서열로부터 공여체 서열로 구성된 서열로 표적 서열이 변경될 수 있다. 따라서, 상기 공여체 서열로 구성된 서열은 표적 서열에 대한 삽입, 결실, 인델, 점 돌연변이, 돌연변이 복구 등일 수 있다. 상기 공여체 서열은 예컨대, 단일 가닥 DNA 분자; 이중 가닥 DNA 분자; DNA/RNA 하이브리드 분자; 및 DNA/modRNA(변형된 RNA) 하이브리드 분자일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 공여체 서열은 상동성 아암에 대해 외래성이다. 상기 편집은 RNA와 DNA 편집이 될 수 있다. 상기 공여체 서열은 원하는 유전자 편집의 특성에 따라 숙주 세포 유전체에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "이종"은 천연 핵산 또는 단백질에서 각각 발견되지 않는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예컨대, 유전자 조작에 의해) 자연 발생 핵산 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예컨대, 유전자 조작에 의해) 변이체 폴리펩티드에 연결되어 융합 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "벡터" 또는 "발현 벡터"는 또 다른 DNA 분절, 즉 "삽입체" "이식유전자" 또는 "발현 카세트"가 부착되어, 부착된 분절("발현 카세트")이 세포에서 발현되거나 복제될 수 있도록 하는 플라스미드, 바크미드, 파지, 바이러스, 비리온, 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. 벡터는 숙주 세포에 대한 전달 또는 상이한 숙주 세포들 간의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우에, 벡터는 최종 형태가 바이러스 기원이거나 비바이러스 기원일 수 있다. 그러나, 본 개시의 목적상 "벡터"는 일반적으로 합성 AAV, 예를 들어, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터 또는 니킹된 ceDNA 벡터를 지칭한다. 따라서, 용어 "벡터"는 적절한 조절 요소와 연관될 경우 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포에 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "재조합 벡터"란 문구는 이종 핵산 서열을 포함하거나, 생체 내에서 발현될 수 있는 "이식유전자"를 포함하는 벡터를 의미한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 벡터는 다른 적절한 조성물 및 요법과 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 에피솜 벡터이다. 적절한 에피솜 벡터의 사용은 높은 카피 수의 염색체 외 DNA에서 대상체의 관심 대상 뉴클레오티드를 유지함으로써 염색체 통합의 잠재적 효과를 제거하는 수단을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 유도하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 숙주 세포에 대해 이종인 경우가 많지만 반드시 그렇지는 않다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있으므로, 2개의 유기체, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 RNA 및 단백질을 생산하고 적절한 경우 단백질을 분비하는 데 관여하는 세포 프로세스를 지칭하며, 여기에는 적용 가능한 경우, 예를 들어 전사, 전사물 처리, 번역 및 단백질 접힘, 변형 및 처리가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "발현 산물"이란 문구는 유전자(예컨대, 이식유전자)로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 경우 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열(DNA)을 의미한다. 상기 유전자는 코딩 영역, 예컨대, 5' 미번역(5' UTR) 또는 "선도" 서열 및 3' UTR 또는 "후미" 서열의 전후 영역과 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 전달"은 외래 DNA가 유전자 요법의 적용을 위해 숙주 세포로 전달되는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 편집 분자"는 단백질 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 지칭하며, 상기 단백질은 트랜스포사아제, 뉴클레아제, 인테그라아제, 가이드 RNA(gRNA), 가이드 DNA, 리보뉴클레오단백질(RNP), 또는 활성화제 RNA를 포함하는 군으로부터 선택된다. 뉴클레아제 유전자 편집 분자는 뉴클레아제 활성을 가진 단백질로, 비제한적인 예는 CRISPR 단백질(Cas), CRISPR 연관 단백질 9(Cas9); IIS형 제한 효소; 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN); 및 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, CRISPRi 또는 CRISPRa 시스템에 대한 조작된 부위 특이적 뉴클레아제 또는 비활성화된 CAS를 포함한다. 상기 유전자 편집 분자는 또한 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 유전자 편집 분자는 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 DNA 결합 도메인은 가이드 RNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 DNA 결합 도메인은 가이드 TALEN를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유전자 편집 분자는 하나 이상의 전이 인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 전이 인자는 고리형 DNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 전이 인자는 플라스미드 벡터 또는 미니서클 DNA 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 DNA 결합 도메인은 아연 집게 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유전자 편집 분자는 하나 이상의 전이 인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 전이 인자는 선형 DNA를 포함한다. 트랜스포존을 인코딩하는 선형 재조합 및 비자연 발생 DNA 서열은 시험관 내에서 생산될 수 있다. 본 개시의 선형 재조합 및 비자연 발생 DNA 서열은 고리형 DNA의 제한효소 분해 산물일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 고리형 DNA는 플라스미드 벡터 또는 미니서클 DNA 벡터이다. 본 개시의 선형 재조합 및 비자연 발생 DNA 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 산물일 수 있다. 본 개시의 선형 재조합 및 비자연 발생 DNA 서열은 이중 가닥 DOGGYBONE™ DNA 서열일 수 있다. 본 개시의 DOGGYBONE™ DNA 서열은 항원, 프로모터, 폴리-A 꼬리 및 텔로미어 말단을 포함하는 항원 발현 카세트만을 인코딩하는 효소 프로세스에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 편집 기능"은 유전체의 특정 부위에서DNA를 삽입, 삭제 또는 교체하여 기능을 상실하거나 획득하는 것을 지칭한다. 특정 부위에서의 DNA 삽입, 결실 또는 교체는 예컨대, 동형 방식 수선(HDR) 또는 비상동 말단 연결(NHEJ), 또는 단일 염기 변경 편집에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대, HDR의 경우, 공여체 주형이 사용되어 공여체 주형 내의 원하는 서열이 상동 재조합 이벤트에 의해 유전체 내에 삽입된다. 일 구현예에서, "공여체 주형" 또는 "수선 주형"은 숙주 유전체에 도입될 핵산 서열에 원하는 돌연변이 또는 삽입을 포함하는 공여체 서열의 양쪽 측부에 위치하는 두 개의 상동성 아암(예컨대, 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암)을 포함한다. 상기 5' 및 3' 상동성 아암은 엔도뉴클레아제 매개 절단 부위에서 표적 유전자의 유전체 서열과 실질적으로 상동성이다. 상기 3' 상동성 아암은 일반적으로 상기 엔도뉴클레아제가 DNA를 절단하거나(예컨대, 이중 가닥 DNA 절단), 일부 구현예에서는 니킹하는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위의 바로 하류 영역에 위치한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 편집 시스템"은 세포에서 유전체 편집을 수행하는 데 필요한 최소 구성요소를 지칭한다. 예를 들어, 아연 집게 뉴클레아제 또는 TALEN 시스템은 표적 유전자의 서열에 상보적인 핵산에 융합된 엔도뉴클레아제의 발현만을 필요로 할 수 있는 반면, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 경우, 최소 구성 요소로 예컨대, Cas 엔도뉴클레아제와 가이드 RNA가 필요할 수 있다. 상기 유전자 편집 시스템은 필요에 따라 단일 ceDNA 벡터 또는 다수의 벡터에 인코딩될 수 있다. 당업자라면 유전자 편집 시스템에 필요한 구성요소를 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기 편집 모이어티"는 서열에서 단일 뉴클레오티드, 예컨대, 시토신/구아닌 뉴클레오티드 쌍 "G/C"를 아데닌 및 티민 "T"/우리딘 "U" 뉴클레오티드 쌍(A/T,U)으로(예컨대, Shevidi 등의 문헌 Dev Dyn 31(2017) PMID:28857338; Kyoungmi 등의 문헌 Nature Biotechnology 35:435-437 (2017)참조, 이들 각각의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 또는 아데닌/티민 "A/T" 뉴클레오티드 쌍을 구아닌/시토신 "G/C" 뉴클레오티드 쌍으로(예컨대, Gaudelli 등의 문헌 Nature (2017), in press doi:10.1038/nature24644 참조, 해당 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 변경할 수 있는 효소 또는 효소 시스템을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전체 세이프 하버 유전자" 또는 "세이프 하버 유전자"는 핵산 서열이 삽입되어 내인성 유전자 활성, 또는 암 촉진에 유의한 부정적인 결과 없이 예측 가능한 방식으로 통합 및 기능(예컨대, 관심 대상 단백질 발현)할 수 있는 유전자 또는 유전자좌를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자는 삽입된 핵산 서열이 비세이프 하버 부위보다 효율적으로 그리고 더 높은 수준으로 발현될 수 있는 유전자좌 또는 유전자이기도 하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 전달"은 외래 DNA가 유전자 요법의 적용을 위해 숙주 세포로 전달되는 과정을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)의 약자로 CRISPR-Cas9 유전체 편집 기술의 기초를 형성하는 세균 방어 시스템의 특징이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동 재조합"은 두 개의 유사하거나 동일한 DNA 분자 사이에서 뉴클레오티드 서열이 교환되는 유전자 재조합의 한 유형을 지칭한다. 상동 재조합은 또한 DNA 서열의 새로운 조합을 생산한다. DNA의 이러한 새로운 조합은 유전적 변이를 나타낸다. 상동 재조합은 또한 상이한 균주와 바이러스 종 사이에서 유전 물질을 교환하기 위한 수평 유전자 전달에 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "교정", "유전체 편집" 및 "복원"은 절단된 단백질을 인코딩하거나 단백질을 인코딩하지 않는 돌연변이 유전자를 변경하여 전장 기능적 또는 부분 전장 기능적 단백질 발현이 수득되도록 하는 것을 지칭한다. 돌연변이 유전자를 교정하거나 복원하는 단계는 동형 방식 수선(HDR)과 같은 수선 메카니즘을 사용하여 돌연변이가 있는 유전자 영역을 대체하거나 돌연변이 유전자 전체를 돌연변이가 없는 유전자 카피로 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 돌연변이 유전자를 교정 또는 복원하는 단계는 또한 유전자에 이중 가닥 절단을 생성한 다음 비상동 말단 연결(NHEJ)을 사용하여 복구함으로써, 조기 정지 코돈, 비정상 스플라이스 수용체 부위 또는 비정상 스플라이스 공여체 부위를 유발하는 프레임시프트 돌연변이를 복구하는 단계를 포함할 수 있다. NHEJ는 수리 중에 적어도 하나의 베이스 쌍을 추가하거나 삭제할 수 있으며, 이를 통해 적절한 판독 프레임을 복원하고 조기 정지 코돈을 제거할 수 있다. 돌연변이 유전자를 교정하거나 복원하는 단계는 또한 비정상 스플라이스 수용체 부위 또는 스플라이스 공여체 서열을 파괴하는 단계를 포함할 수 있다. 돌연변이 유전자를 교정 또는 복원하는 단계는 또한 두 개의 뉴클레아제 표적 부위 사이의 DNA를 제거하고 NHEJ에 의한 DNA 절단을 복구함으로써 적절한 판독 프레임을 복원하기 위해 동일한 DNA 가닥에 두 개의 뉴클레아제가 동시에 작용하여 비필수 유전자 분절을 삭제하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "비상동 말단 연결(NHEJ) 경로"는 상동 주형 없이 절단 말단을 직접 연결함으로써 DNA의 이중 가닥 절단을 수선하는 경로를 지칭한다. NHEJ에 의한 DNA 말단의 주형 비의존 재연결은 DNA 절단점에 무작위 미세삽입 및 미세결실(인델)을 도입하는 확률적이고 오류 발생 가능성이 있는 수선 과정이다. 이 방법은 표적 유전자 서열의 판독 프레임을 의도적으로 파괴, 삭제 또는 변경하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 일반적으로 미세상동서열이라고 불리는 짧은 상동성 DNA 서열을 사용하여 수선을 가이드한다. 이들 미세상동서열은 이중 가닥 절단부의 말단에 있는 단일 가닥 오버행에 존재는 경우가 많다. 상기 오버행이 완벽하게 적합한 경우 NHEJ는 일반적으로 절단부를 정확하게 수선하지만, 뉴클레오티드의 손실을 초래하는 부정확한 수선도 발생할 수 있으나 이는 상기 오버행이 부적합한 경우에 훨씬 더 흔하게 발생한다. 본 명세서에서 사용되는 경우에, "뉴클레아제 매개 NHEJ"는 뉴클레아제, 예컨대, cas9 또는 기타 뉴클레아제가 이중 가닥 DNA를 절단한 후 개시되는 NHEJ를 지칭한다. CRISPR/CAS 시스템에서, NHEJ는 단일 가이드 RNA 서열을 사용함으로써 표적화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "부위 특이적 뉴클레아제" 또는 "서열 특이적 뉴클레아제"라는 용어는 DNA 서열을 특이적으로 인식하고 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 부위 특이적 뉴클레아제는 조작될 수 있다. 조작된 부위 특이적 뉴클레아제의 예는 다양한 천연 및 비천연 Cas 효소를 사용하는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR/Cas 기반 시스템을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유전 질환"이란 문구는 유전체에서 하나 이상의 이상에 의해 부분적으로 또는 전적으로, 직접 또는 간접적으로 야기되는 질환, 특히 출생 때부터 존재하고 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥(ssDNA) 분자에 의해 치료될 수 있는 병태를 지칭한다. 상기 이상은 돌연변이, 삽입, 또는 결실일 수 있다. 상기 이상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 상기 유전 질환은 페닐케톤뇨증(PKU), 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증, 헌팅턴 무도병, 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 및 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 쉬이 증후군(MPS I형 S), 헐러-시이 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르키오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 쉰들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염색 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적 질환 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스일 수 있으나 이로 제한되지는 않는다. 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌 실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근 이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시(LCA, 예컨대, LCA10 [CEP290]), 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 또는 카텝신 A 결핍증도 유전 질환에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료(treat 또는 treating 및/또는 treatment)"는 병태의 진행을 제거하는 것, 실질적으로 억제하는 것, 더디게 하거나 역전시키는 것, 병태의 임상 증상을 실질적으로 완화시키는 것, 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻는 것을 포함한다. 치료는 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 추가로 지칭한다: (a) 장애 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료 중인 장애(들)의 증상 특징이 발생하는 것을 제한하는 것; (c) 치료 중인 장애(들)의 증상 특징의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 가졌던 환자에서 장애(들)의 재발 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 무증상이었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것. 일부 구현예에서, 치료는 유전자 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 유전자 요법을 포함한다.
유익하거나 바람직한 임상 결과, 예컨대, 약리학적 및/또는 생리학적 효과는 다음을 포함하되 이로 제한되지는 않는다: 질병, 장애, 또는 병태에 취약할 수 있지만 해당 질병의 증상을 아직 경험하지 않았거나 증상이 아직 나타나지 않은 대상체에서 발생하는 질병, 장애, 또는 병태의 예방(예방적 치료), 질병, 장애, 또는 병태의 증상의 완화, 질병, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질병, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질병, 장애, 또는 병태의 진행 지연 또는 감쇠, 질병, 장애, 또는 병태의 완화 또는 경감, 및 이들의 조합, 그리고 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존 기간 대비 생존 기간의 연장.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증가", "강화", "상승"(및 유사한 용어)은 일반적으로 자연치, 예상치, 또는 평균치 대비, 또는 대조군 조건 대비 농도, 수준, 기능, 활성, 또는 거동을 직접 또는 간접적으로 증가시키는 작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제", "경감", "간섭", "억제" 및/또는 "감소"는(및 유사한 용어는) 일반적으로 자연치, 예상치, 또는 평균치 대비, 또는 대조군 조건 대비 농도, 수준, 기능, 활성, 또는 거동을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "합성 AAV 벡터", "단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터" 및 "AAV 벡터의 합성 생산"은 세포 없는 환경에서의 AAV 벡터 및 이의 합성 생산 방법을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising 또는 comprises)"는 조성물, 방법, 프로세스, 및 상기 프로세스, 방법, 또는 조성물에 필수적인 이들 각각의 구성요소와 관련하여 사용되나, 명시되지 않은 요소의 추가적인 포함에 대해서는 이러한 요소가 필수적인지 여부에 관계없이 개방되어 있다. "포함하는"의 사용은 제한적이기보다는 포괄적인 의미로 사용된다.
용어 "~로 구성되는"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 프로세스, 및 이들 각각의 구성요소를 지칭하며, 이는 해당 구현예의 해당 기재에 언급되지 않은 요소를 배제한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소를 지칭한다. 상기 용어는 본 개시의 해당 구현예의 기본적이고 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 문맥이 명확하게 달리 언급하지 않는 한, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함하며, 이는 본 개시를 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있다.
약어, "e.g.(예컨대)"는 라틴어 exempli gratia로부터 유래된 것이고, 본 명세서에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "e.g."는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.
작동 예시를 제외하고, 또는 달리 명시된 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로서 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 경우, 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다. 본 개시는 다음의 예시에 의해 보다 상세히 설명되지만, 본 개시의 범위는 이로 제한되지 않아야 한다.
본 명세서에 개시된 본 개시의 대안적인 요소 또는 구현예를 그룹화하는 것이 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹의 구성원은 개별적으로 언급되고 청구되거나 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 본 명세서에는 그룹이 변형된 상태로 포함된 것으로 본 명세서에서 간주되므로, 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠시(Markush) 그룹의 서면 설명이 충족된다.
상기 양태 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 개시는 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식선 유전적 동일성을 변형시키는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에 대한 임의의 실질적인 의학적 이익 없이 동물을 고통스럽게 할 가능성이 있는, 동물의 유전적 동일성을 변형시키는 방법에 관한 것이 아니며, 이러한 방법으로 생성된 동물에 관한 것도 아니다.
본 명세서에서 다른 용어는 본 개시의 다양한 양태에 대한 설명에서 정의된다.
참조 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공동 계류 중인 특허 출원을 포함하는 모든 특허 및 기타 간행물은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 해당 공개문헌에 기재된 방법론을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 인용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다. 이들 공개문헌은 본 출원의 출원일 이전의 개시에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 어떠한 내용도 본 발명자가 선행 개시에 의해 또는 임의의 다른 이유로 해당 개시에 선행하여 본 발명을 실시할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문서의 날짜 또는 내용에 대한 모든 진술은 본 출원인이 이용할 수 있는 정보에 근거한 것이며, 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인정도 포함하지 않는다.
본 개시의 구현예에 대한 기재는 본 개시를 개시된 정확한 형태로 제한하거나 한정짓는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시의 특정 구현예 및 예시는 예시적인 목적을 위해 본 명세서에 기재되지만, 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 동등한 변형이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능은 주어진 순서로 제시되지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 해당 기능을 수행할 수 있거나, 실질적으로 동시에 해당 기능을 수행할 수 있다. 본 명세서에 제공된 본 개시의 교시는 적절한 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 구현예는 추가 구현예의 제공을 위해 조합될 수 있다. 본 개시의 양태는 필요한 경우, 본 개시의 또 다른 구현예를 제공하기 위해 전술한 참조 및 출원의 조성물, 기능 및 개념을 사용하도록 변형될 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 등가성 고려 사항으로 인해, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않으며 해당 단백질 구조에서 일부 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 변경 및 다른 변경은 본 개시의 상세한 설명을 고려하여 본 개시에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 특정 요소는 다른 구현예에서의 요소와 조합되거나 이를 대체할 수 있다. 또한, 본 개시의 특정 구현예와 연관된 이점이 이들 구현예의 맥락에서 기재되었지만, 다른 구현예 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요는 없다.
본 명세서에 기재된 기술은 아래의 예시에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 보다 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시는 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 한정되지 않으며, 따라서 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 개시의 청구범위에 의해서만 정의되는 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
II. 단일 가닥(ss) DNA 분자
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시는 합성 단일 가닥(ssDNA) 분자에 관한 것이다. 일부 양태에 따르면, 본 개시는 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 3' 말단에 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하는 5' 말단을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자는 그 전체 길이에 걸쳐 완전히 단일 가닥인 선형, 단일 가닥 DNA 분자이다(즉, 이중 가닥 영역을 포함하지 않음).
A. 3' 말단
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 양태에 따르면, 본 개시는 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 3' 말단에 포함하는 ssDNA 분자를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 스템 구조는 복제 또는 전사를 개시하기 위한 부분 DNA 이중체(예컨대, 유리 3' -OH 기가 있는)를 포함한다. 상기 부분 DNA 이중체는 부분적으로 스템-루프 구조를 함께 유지하는 기능을 한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 부분 DNA 이중체는 4 내지 500개의 뉴클레오티드, 예컨대, 4 내지 10개의 뉴클레오티드, 4 내지 25개의 뉴클레오티드, 4 내지 50개의 뉴클레오티드, 4 내지 100개의 뉴클레오티드, 4 내지 200개의 뉴클레오티드, 4 내지 300개의 뉴클레오티드, 4 내지 400개의 뉴클레오티드, 20 내지 25개의 뉴클레오티드, 20 내지 50개의 뉴클레오티드, 20 내지 100개의 뉴클레오티드, 20 내지 200개의 뉴클레오티드, 20 내지 300개의 뉴클레오티드, 20 내지 400개의 뉴클레오티드, 20 내지 500개의 뉴클레오티드, 50 내지 100개의 뉴클레오티드, 50 내지 200개의 뉴클레오티드, 50 내지 300개의 뉴클레오티드, 50 내지 400개의 뉴클레오티드, 50 내지 500개의 뉴클레오티드, 150 내지 200개의 뉴클레오티드, 150 내지 300개의 뉴클레오티드, 150 내지 400개의 뉴클레오티드, 150 내지 500개의 뉴클레오티드, 200 내지 300개의 뉴클레오티드, 200 내지 400개의 뉴클레오티드, 200 내지 500개의 뉴클레오티드, 250 내지 300개의 뉴클레오티드, 250 내지 400개의 뉴클레오티드, 250 내지 500개의 뉴클레오티드, 300 내지 400개의 뉴클레오티드, 300 내지 500개의 뉴클레오티드, 350 내지 400개의 뉴클레오티드, 350 내지 500개의 뉴클레오티드, 400 내지 500개의 뉴클레오티드, 또는 450 내지 500개의 뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 루프를 3' 말단에 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 DNA 이중체는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개의 뉴클레오티드, 및 적어도 하나의 루프를 3' 말단에 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 루프 구조는 결합되지 않은 최소 3 내지 500개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 3 내지 450개의 뉴클레오티드, 3 내지 400개의 뉴클레오티드, 3 내지 350개의 뉴클레오티드, 3 내지 300개의 뉴클레오티드, 3 내지 250개의 뉴클레오티드, 3 내지 200개의 뉴클레오티드, 3 내지 150개의 뉴클레오티드, 3 내지 100개의 뉴클레오티드, 3 내지 90개의 뉴클레오티드, 3 내지 80개의 뉴클레오티드, 3 내지 70개의 뉴클레오티드, 3 내지 60개의 뉴클레오티드, 3 내지 50개의 뉴클레오티드, 3 내지 40개의 뉴클레오티드, 3 내지 30개의 뉴클레오티드, 3 내지 20개의 뉴클레오티드, 3 내지 10개의 뉴클레오티드, 3 내지 5개의 뉴클레오티드, 10 내지 450개의 뉴클레오티드, 10 내지 400개의 뉴클레오티드, 10 내지 350개의 뉴클레오티드, 10 내지 300개의 뉴클레오티드, 10 내지 250개의 뉴클레오티드, 10 내지 200개의 뉴클레오티드, 10 내지 150개의 뉴클레오티드, 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 10 내지 90개의 뉴클레오티드, 10 내지 80개의 뉴클레오티드, 10 내지 70개의 뉴클레오티드, 10 내지 60개의 뉴클레오티드, 10 내지 50개의 뉴클레오티드, 10 내지 40개의 뉴클레오티드, 10 내지 30개의 뉴클레오티드, 10 내지 20개의 뉴클레오티드, 50 내지 450개의 뉴클레오티드, 50 내지 400개의 뉴클레오티드, 50 내지 350개의 뉴클레오티드, 50 내지 300개의 뉴클레오티드, 50 내지 250개의 뉴클레오티드, 50 내지 200개의 뉴클레오티드, 50 내지 150개의 뉴클레오티드, 50 내지 100개의 뉴클레오티드, 50 내지 90개의 뉴클레오티드, 50 내지 80개의 뉴클레오티드, 50 내지 70개의 뉴클레오티드, 50 내지 60개의 뉴클레오티드, 100 내지 450개의 뉴클레오티드, 100 내지 400개의 뉴클레오티드, 100 내지 350개의 뉴클레오티드, 100 내지 300개의 뉴클레오티드, 100 내지 250개의 뉴클레오티드, 100 내지 200개의 뉴클레오티드, 150 내지 450개의 뉴클레오티드, 150 내지 400개의 뉴클레오티드, 150 내지 350개의 뉴클레오티드, 150 내지 300개의 뉴클레오티드, 150 내지 250개의 뉴클레오티드, 150 내지 200개의 뉴클레오티드, 200 내지 450개의 뉴클레오티드, 200 내지 400개의 뉴클레오티드, 200 내지 350개의 뉴클레오티드, 200 내지 300개의 뉴클레오티드, 200 내지 250개의 뉴클레오티드, 250 내지 450개의 뉴클레오티드, 250 내지 400개의 뉴클레오티드, 250 내지 350개의 뉴클레오티드, 250 내지 300개의 뉴클레오티드, 300 내지 450개의 뉴클레오티드, 300 내지 400개의 뉴클레오티드, 300 내지 350개의 뉴클레오티드, 350 내지 450개의 뉴클레오티드, 350 내지 400개의 뉴클레오티드, 또는 400 내지 450개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프의 스템 부분은 길이가 4 내지 500개 뉴클레오티드이고, 상기 스템-루프의 루프 부분은 길이가 3 내지 500개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프의 스템 부분은 길이가 4 내지 50개 뉴클레오티드이고, 상기 스템-루프의 루프 부분은 길이가 3 내지 50개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프의 스템 부분은 길이가 4 내지 20개 뉴클레오티드이고, 상기 스템-루프의 루프 부분은 길이가 3 내지 20개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프의 스템 부분은 길이가 4 내지 10개 뉴클레오티드이고, 상기 스템-루프의 루프 부분은 길이가 3 내지 10개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 양 말단을 안정화하는 데 사용되는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 치료적 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 진단 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 연구 목적으로 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA의 3' 말단에 필요한 최소 핵산 구조는 그 자체가 다시 루프되는 임의의 구조, 즉 헤어핀 구조이다. 그러나, 적어도 하나의 스템와 하나의 루프가 존재하는 한, 다양한 구조가 상기 3' 말단에서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ssDNA는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 3' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA는 적어도 2개의 루프 루프 구조를 3' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA는 적어도 3개의 루프 루프 구조를 3' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA는 적어도 4개의 루프 루프 구조를 3' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA는 적어도 5개의 루프 루프 구조를 3' 말단에 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 십자형 DNA 구조를 형성한다. DNA 십자형 구조는 양 가닥이 분자 내의 동일한 위치에서 스템-루프 구조를 형성할 때 형성될 수 있고, 하나의 4방향 접합 및 2개의 폐쇄된 헤어핀-형상 지점을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 헤어핀 DNA 구조를 형성한다.핵산 내의 헤어핀 루프 구조는 염기쌍을 형성한 스템 구조 및 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드 또는 왓슨-크릭 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드가 있는 루프 서열로 구성된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 보존된 서열의 짧은 링커에 의해 분리된 3개의 염기쌍을 형성한 나선으로 이루어진 망치머리 DNA 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 3' 말단의 뉴클레오티드는 4중체 DNA 구조를 형성한다. G-사중체는 특정 구아닌 풍부 서열로부터 형성되는 4가닥 DNA 이차 구조(G4)이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 팽출된 DNA 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 다중분지형 루프를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 2스템-루프 구조를 형성하지 않는다. 일 구현예에서, 상기 3' 말단의 뉴클레오티드는 AAV ITR 구조를 형성하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재하는 A, A', D, 및 D' 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재하는 A, A', B, B'C, C', D, 및 D' 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템 루프 구조는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 임의의 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 스템 구조는 엑소뉴클레아제 저항성이 되도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 스템 구조는 엑소뉴클레아제 저항성이 되도록 변형된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 스템 구조는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 스템 구조는 약 4 내지 약 10개, 예컨대, 약 4 내지 약 5개, 약 4 내지 약 6개, 약 4 내지 약 7개, 약 4 내지 약 8개, 약 4 내지 약 9개, 약 4 내지 약 10개, 약 5 내지 약 6개, 약 5 내지 약 7개, 약 5 내지 약 8개, 약 5 내지 약 9개, 약 5 내지 약 10개, 약 6 내지 약 7개, 약 6 내지 약 8개, 약 6 내지 약 9개, 약 6 내지 약 10개, 약 7 내지 약 8개, 약 7 내지 약 9개, 약 7 내지 약 10개, 약 8 내지 약 9개, 약 8 내지 약 10개, 또는 약 9 내지 약 10개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템 구조는 10개 초과의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드들은 서로 인접하게 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 3' 말단의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이다. 보라노포스페이트 변형된 DNA 또한 뉴클레아제 분해에 대해 저항상이며, 포스포로티오에이트 변형의 대안으로서 간주될 수 있다.
추가적인 구현예에 따르면, 상기 스템 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머 서열이다. 추가적인 구현예에서, 상기 압타머 서열은 핵 국소화된 단백질에 대한 높은 결합 친화도를 가진다.
일부 구현예에 따르면, 루프 내의 뉴클레오티드는 이들의 특성을 변경하기 위해 기능성 기에 의해 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 압타머를 더 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 압타머는 공개적으로 이용할 수 있는 압타머의 Apta-index 데이터베이스(aptagen.com/apta-index)로부터 식별된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 합성 리보자임을 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 분자 프로브, 예컨대, 핵산 기반 형광 프로브를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, "클릭" 아지드-알킨 고리첨가(Kolb 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 2004-2021])가 루프 내의 뉴클레오티드를 변형하는 데 사용된다. 클릭 화학은 다양한 범위의 기능성 기들이 존재하는 가운데 경미한 조건하에 유기 분자를 함께 결합시키기 위해 개발되었다. 대부분의 클릭 매개 변형은 신규한 염기 유사체를 도입하고, 분자 영상화를 위해 형광단 또는 동위원소 요소를 부착하고, 올리고뉴클레오티드들 간에 가닥간 결합을 형성함으로써 질소염기 상에서 수행되고, 분자의 생체접합을 위해서도 수행된다. 클릭 화학의 가장 좋은 예는 Huisgen의 [3 + 2] 아지드-알킨 부가환화 반응의 CuI 촉매화된 버전인데(Angew. Chem., Int. Ed. 1963, 2, 633-645), 이는 Sharpless와 Meldal에 의해 독립적으로 발견되었다(CuAAC 반응)(Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599).
일부 구현예에 따르면, 활성 아미노 또는 티올기를 합성된 올리고뉴클레오티드에 도입하면 예컨대, 후속 화학적 형광 표지화를 위한 수용체가 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프 구조는 리보핵산(RNA), 펩티드-핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA)을 포함하되 이로 제한되지 않는 대안적인 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프 구조의 루프 부분은 핵산을 포함하지 않는 화학 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단은 단일 가닥이며, 임의의 이중 가닥 영역을 포함하지 않는다. 실시예 5 및 도 35 내지 도 38에 기재된 바와 같이, 완전 단일 가닥 ssDNA 분자는 이식유전자 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 영역이 없는 완전 단일 가닥 ssDNA 분자는 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 400개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 600개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 700개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 800개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 900개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9500개 뉴클레오티드, 또는 길이가 적어도 10,000개 뉴클레오티드일 수 있다.
B. 5' 말단
본 명세서에 제시된 바와 같이, 일부 양태에 따르면, 본 개시는 위에 상세하게 제시된 바와 같이 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 3' 말단에 포함하는 ssDNA 분자를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하는 5' 말단을 더 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 DNA 구조는 3' 말단의 DNA 구조와 동일하다. 일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 DNA 구조는 3' 말단의 DNA 구조와 상이하다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ssDNA는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, ssDNA는 적어도 2개의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA는 적어도 3개의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA는 적어도 4개의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA는 적어도 5개의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 십자형 DNA 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 헤어핀 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 망치머리 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 4중체 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 팽출된 구조를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 다중분지형 루프를 형성한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 2스템-루프 구조를 형성하지 않는다. 일 구현예에서, 상기 5' 말단의 뉴클레오티드는 AAV ITR 구조를 형성하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재하는 A, A', D, 및 D' 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재하는 A, A', B, B'C, C', D, 및 D' 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템 루프 구조는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 임의의 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 스템 구조는 엑소뉴클레아제 저항성이 되도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 5' 말단의 스템 구조는 엑소뉴클레아제 저항성이 되도록 변형된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 스템 구조는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템 구조는 약 4 내지 약 10개, 예컨대, 약 4 내지 약 5개, 약 4 내지 약 6개, 약 4 내지 약 7개, 약 4 내지 약 8개, 약 4 내지 약 9개, 약 4 내지 약 10개, 약 5 내지 약 6개, 약 5 내지 약 7개, 약 5 내지 약 8개, 약 5 내지 약 9개, 약 5 내지 약 10개, 약 6 내지 약 7개, 약 6 내지 약 8개, 약 6 내지 약 9개, 약 6 내지 약 10개, 약 7 내지 약 8개, 약 7 내지 약 9개, 약 7 내지 약 10개, 약 8 내지 약 9개, 약 8 내지 약 10개, 또는 약 9 내지 약 10개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템 구조는 10개 초과의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드들은 서로 인접하게 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 양 말단을 안정화하는 데 사용되는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 치료적 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 진단 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 루프는 연구 목적으로 사용될 수 있는 하나 이상의 핵산을 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 루프 내의 뉴클레오티드는 이들의 특성을 변경하기 위해 기능성 기에 의해 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 압타머를 더 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 압타머는 공개적으로 이용할 수 있는 압타머의 Apta-index 데이터베이스(aptagen.com/apta-index)로부터 식별된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 합성 리보자임을 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 루프는 하나 이상의 분자 프로브, 예컨대, 핵산 기반 형광 프로브를 더 포함한다.
일부 구현예에 따르면, "클릭" 아지드-알킨 고리첨가(Kolb 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001, 40, 2004-2021])가 루프 내의 뉴클레오티드를 변형하는 데 사용된다. 클릭 화학은 다양한 범위의 기능성 기들이 존재하는 가운데 경미한 조건하에 유기 분자를 함께 결합시키기 위해 개발되었다. 대부분의 클릭 매개 변형은 신규한 염기 유사체를 도입하고, 분자 영상화를 위해 형광단 또는 동위원소 요소를 부착하고, 올리고뉴클레오티드들 간에 가닥간 결합을 형성함으로써 질소염기 상에서 수행되고, 분자의 생체접합을 위해서도 수행된다. 클릭 화학의 가장 좋은 예는 Huisgen의 [3 + 2] 아지드-알킨 부가환화 반응의 CuI 촉매화된 버전인데(Angew. Chem., Int. Ed. 1963, 2, 633-645), 이는 Sharpless와 Meldal에 의해 독립적으로 발견되었다(CuAAC 반응)(Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599).
일부 구현예에 따르면, 활성 아미노 또는 티올기를 합성된 올리고뉴클레오티드에 도입하면 예컨대, 후속 화학적 형광 표지화를 위한 수용체가 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프 구조는 리보핵산(RNA), 펩티드-핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA)을 포함하되 이로 제한되지 않는 대안적인 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 스템-루프 구조의 루프 부분은 핵산을 포함하지 않는 화학 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단은 단일 가닥이며, 임의의 이중 가닥 영역을 포함하지 않는다. 실시예 5 및 도 35 내지 도 38에 기재된 바와 같이, 완전 단일 가닥 ssDNA 분자는 이식유전자 발현을 유도할 수 있다.
C. 관심 대상 핵산 서열
본 명세서에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 바이러스 캡시드 내의 제한된 공간으로 인한 패키징 제약을 받지 않는다. 이는 하나 이상의 유전적 요소, 예컨대, 단일 가닥 인핸서, 단일 가닥 인트론, 단일 가닥 전사후 조절 요소, 단일 가닥 폴리아데닐화 신호, 및 단일 가닥 조절 스위치, 큰 이식유전자, 다수의 이식유전자 등의 삽입을 가능하게 한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 관심 대상 핵산 서열은 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열에 연결된 적어도 하나의 단일 가닥 프로모터를 더 포함한다.
본 개시의 다른 양태에서, 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 본 명세서에 더 상세히 기재된 바와 같이, 유전자 편집 응용예에 사용된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 관심 대상 핵산 서열(본 명세서에서 이식유전자로도 지칭됨)은 수용자 대상체에서 부재하거나, 비활성이거나, 활성이 불충분한 단백질을 인코딩하거나, 원하는 생물학적 효과 또는 치료적 효과를 가진 단백질을 인코딩하는 유전자를 인코딩한다. 상기 이식유전자는 결함 유전자 또는 전사물의 발현을 교정하도록 기능할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 원칙적으로, 상기 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되었거나 부재하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 RNA를 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 이점을 제공하는 임의의 유전자를 포함할 수 있고, 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
상기 관심 대상 핵산 서열은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 임의의 서열을 포함할 수 있다. ssDNA 분자는 대상체에서 임의의 관심 대상 유전자를 전달하고 발현하는 데 사용될 수 있으며, 여기에는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산(예컨대, RNAi, miR 등)뿐만 아니라, 대상체의 유전체 내의 바이러스 서열(예컨대, HIV 바이러스 서열 등)을 포함하는 외인성 유전자 및 뉴클레오티드 서열이 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 ssDNA 분자는 치료적 목적으로(예컨대, 의학적, 진단적, 또는 수의학적 용도로) 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 대상체에서 임의의 관심 대상 유전자를 발현하는 데 유용하며, 여기에는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩; 예컨대, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, mRNA 또는 gRNA, 및 이들의 안티센스 상대(예컨대, 안타고미르(antagoMiR)), 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 자연 서열(예컨대, 원핵 서열)의 적어도 하나, 하나 초과, 또는 유의한 수의 코돈을 해당 척추동물의 유전자에 보다 자주 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 대상 척추동물, 예컨대, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 강화를 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 일반적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 최적화된 코돈은 예컨대, Aptagen의 GENEFORGE® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ssDNA 분자에 의해 발현되는 이식유전자는 치료적 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료적 유전자는 항체, 또는 항체 단편, 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, 중화 항체 또는 항체 단편 등이다.
특히, 치료적 유전자는 질병, 기능장애, 상해, 및/또는 장애의 치료, 예방, 및/또는 이의 하나 이상의 증상의 완화에 사용하기 위한 하나 이상의 치료제(들)이며, 여기에는 예를 들어 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편뿐만 아니라 이들의 변이체 및/또는 이의 활성 단편이 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 예시적인 치료적 유전자는 "치료 방법"이라는 제목의 본 명세서의 섹션에 기재된다.
위의 양태 및 구현예 중 어느 하나에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 합성적으로 생산된다.
위의 양태 및 구현예 중 어느 하나에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다.
위의 양태 중 어느 하나에 따르면, 상기 DNA는 DNA의 합성 모방체인 펩티드 핵산(PNA)이다.
III. 단일 가닥 합성 AAV 벡터
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시는 단일 가닥(ssDNA) 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 ssDNA 분자는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는 이중 가닥 폐쇄 말단 DNA로부터 생산된, 예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터이다. PS 결합은 올리고뉴클레오티드의 인산염 백본에서 황 원자를 비가교 산소(non-bridging oxygen)로 치환한다. 유리하게는, 이러한 변형은 뉴클레오티드간 결합에 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 부여하고, 엑소뉴클레아제의 표적화를 위한 정확성을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 단일 가닥 이식유전자 카세트를 제공한다: 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자; 및 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 역위 말단 반복(ITR). 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 제1 ITR 및 임의의 제2 ITR을 포함하며, 여기서 제1 ITR 및 임의의 제2 ITR 중 적어도 하나는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 말단 분해 부위(trs) 서열을 포함하는 3' 말단 단편을 포함한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시는 다음을 포함하는 단리된 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 제공한다: 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자를 포함하는 단일 가닥 이식유전자 카세트; 및 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자 카세트의 측부에 각각 위치하는 제1 역위 말단 반복(ITR) 및 제2 ITR로서, 이들 중 적어도 하나는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 ITR 및 제2 ITR.
본 명세서에 보다 상세히 기재된 바와 같이, ssDNA 분자는 특정 니킹 부위에서부터 dsDNA의 PS 결합된 부위까지 하나의 DNA 가닥을 제거함으로써 포스포로티오에이트(PS) 결합("출발 물질")을 포함하는 dsDNA로부터 시험관 내에서 합성적으로 생산된다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 이중 가닥 DNA 분자(출발 물질)의 3' 말단 부분이 니카아제 인식 서열을 포함하는 것이 본 개시의 특징이다. 일 구현예에서, 상기 dsDNA 분자의 3' 말단 부분은 서열 5'-CCAA-3'을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 dsDNA 분자의 3' 말단 부분은 아래 표 1에 제시된 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 또한, 이들은 특수한 조작된 니킹 부위가 있는 이중 가닥 ceDNA가 표에 도시된 바와 같은 니킹 엔도뉴클레아제에 의해 니킹된 후의 고유한 서열이기 때문에, 생성된 ssDNA 분자 또한 아래 표에 도시된 서열 중 임의의 하나 이상을 이의 3' 말단 단편에 포함한다.
표 1.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단 단편은 상기 ssDNA가 숙주 세포의 핵에 전달된 후 중합효소 활성을 나타낼 수 있도록 하이드록실화된(-OH) 말단 잔기를 포함하며, 숙주 세포의 핵에 전달된 ssDNA는 발현될 수 있는 dsDNA로 전환된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 말단 분해 부위(trs) 서열을 포함하는 3' 말단 단편을 포함한다.
본 명세서에 기재된 ssDNA 분자는 숙주 세포의 세포액(cytosol)으로부터 핵 막을 관통하여 핵 내로 수송될 수 있으며, 도달한 후 숙주 세포 DNA 중합효소에 의해 숙주 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 이중 가닥 DNA("재생 dsDNA")를 생성할 수 있다는 것이 본 개시의 핵심적인 발견이다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 ssDNA 분자에서 하이드록실화된(-OH) 말단 잔기는 숙주 세포의 핵 내부에서 DNA 중합효소 활성에 반응하는 데 매우 중요하다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 DNA 중합효소는 dsDNA 분자를 생성한다.
중요하게는, 상기 ssDNA 분자는 숙주 세포 내부에서 선천성 면역 경로를 활성화하지 않거나 최소로 활성화시킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "선천성 면역 반응"은 병원균 연관 분자 패턴에 반응하고 RIG-I-유사 수용체, toll-유사 수용체, 또는 다른 병원균 연관 분자 패턴 수용체를 통해 방어 반응을 활성화시켜 인터페론, NF-카파-B, STAT, IRF, 및 병원균 감염으로부터 보호하는 다른 반응 경로를 활성화시키는 세포 경로를 지칭한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 선천성 면역 경로는 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 염증조절복합체(inflammasome) 매개 경로, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 선천성 면역 반응 활성화의 표시자는 IRF 계열 구성원의 발현 및/또는 인산화 증가, RIG-I 유사 수용체의 발현 증가, 및 인터페론 및/또는 케모카인의 발현 증가를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 단일 가닥 프로모터를 더 포함하고; dsDNA 분자는 적어도 하나의 재생된 이중 가닥 이식유전자, 및 재생된 이중 가닥 이식유전자에 작동 가능하게 연결되어 적어도 하나의 재생된 이중 가닥 이식 유전자의 발현을 조절하는 적어도 하나의 이중 가닥 프로모터를 포함하는 재생된 이중 가닥 발현 카세트를 포함한다. 상기 이중 가닥 발현 카세트는 숙주 세포에서, 예컨대, 생체 내 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 이중 가닥 발현 카세트는 적어도 하나의 치료적 단백질 또는 이의 단편으로 발현될 수 있다.
추가적인 구현예에서, 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 단일 가닥 인핸서, 단일 가닥 인트론, 단일 가닥 전사 후 조절 요소, 단일 가닥 폴리아데닐화 신호, 및 단일 가닥 조절 스위치로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 요소를 더 포함한다.
본 개시의 다른 양태에서, 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 유전자 편집 응용예에 사용된다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자 카세트는 프로모터가 없는 이식유전자 카세트이고; dsDNA 분자는 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자는 숙주 세포의 유전체 내의 표적 유전자좌에 삽입될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자는 생체 내에서 숙주 세포의 유전체 내의 표적 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자는 표적 유전자좌에 삽입되어 적어도 하나의 표적 유전자를 대체하거나 보충할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자는 동형 방식 재조합(HDR) 또는 미세상동성 매개 말단 결합(MMEJ)을 통해 표적 유전자좌에 삽입될 수 있다. 추가적인 다른 구현예에서, 상기 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자는 단일 가닥 공여체 서열이고; 단일 가닥 이식유전자 카세트는 단일 가닥 공여체 서열의 측부에 위치하는 단일 가닥 5' 상동성 아암 및 단일 가닥 3' 상동성 아암을 더 포함한다. 상기 단일 가닥 5' 상동성 아암 및 단일 가닥 3' 상동성 아암은 각각 약 10 내지 2000 nt의 길이, 예컨대, 약 100 내지 2000 nt의 길이 또는 약 1000 내지 2000 nt의 길이이거나, 약 10 내지 1000 nt의 길이, 예컨대, 약 100 내지 1000 nt의 길이 또는 약 10 내지 500 nt의 길이, 약 50 내지 500 nt의 길이 또는 약 100 내지 500 nt의 길이, 약 10 내지 50 nt의 길이, 약 50 내지 500 nt의 길이 또는 약 500 내지 1000 nt의 길이, 약 500 내지 1500 nt의 길이, 약 1500 내지 2000 nt의 길이, 약 2 내지 1000 nt의 길이, 약 2 내지 500 nt의 길이, 약 2 내지 100 nt의 길이, 또는 약 2 내지 50 nt의 길이이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 프로모터가 없는 재생된 이중 가닥 이식유전자는 비상동 말단 연결(NHEJ)을 통해 표적 유전자좌에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 단일 가닥 이식유전자는 단일 가닥 공여체 서열이고; 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 단일 가닥 5' 상동성 아암 및 단일 가닥 3' 상동성 아암이 결여되어 있다. 다른 구현예에서, 상기 단일 가닥 이식유전자 카세트는 절단성이고, 적어도 제1 단일 가닥 가이드 RNA(gRNA) 표적 서열(TS); 적어도 제1 단일 가닥 프로토스페이서 인접 모티프(PAM); 적어도 제2 단일 가닥 gRNA TS; 및 적어도 제2 단일 가닥 PAM을 더 포함한다.
본 명세서에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자는 다음을 포함하는 방법에 의해 dsDNA 작제물로부터 합성적으로 생산된다: a) 하나 이상의 니킹 부위에서 dsDNA 작제물의 단일 가닥 중 하나를 니킹하는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제와 dsDNA 작제물을 접촉시키는 단계; 및 b) dsDNA 작제물의 니킹된 가닥으로부터 뉴클레오티드를 제거할 수 있는 엑소뉴클레아제와 dsDNA 작제물을 접촉시켜 ssDNA 분자를 생산하는 단계.
A. 이중 가닥(ds) 폐쇄 말단 DNA(ceDNA)
일부 양태에서, 본 개시는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는 이중 가닥 폐쇄 말단 DNA(ceDNA)를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 변형은 유리하게는 엑소뉴클레아제가 활성인 공간 내의 ITR 영역에 위치하고, 5' 및/또는 3' 말단에서 잠금으로서 기능하여, 뉴클레오티드간 결합에 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 부여하고, 엑소뉴클레아제 활성의 정확성을 보장한다. 본 명세서에 기재된 이중 가닥 ceDNA는 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자를 생산하는 데 사용된다.
일 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 단리된 이중 가닥 DNA(dsDNA) 작제물을 제공한다: 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자를 포함하는 이중 가닥 이식유전자 카세트; 및 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자의 측부에 각각 위치하는 제1 역위 말단 반복(ITR) 및 선택적인 제2 ITR로서, 이들 중 적어도 하나는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 ITR 및 선택적인 제2 ITR. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 니카아제 인식 서열("닉 부위")을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 dsDNA 작제물은 닉 부위를 포함하는 AAV ITR의 말단 분해 부위(trs) 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI, Nt.CviPII, 및 전술한 것 중 어느 하나의 이소스키조머로부터 각각 독립적으로 선택되는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열은 아래 표 2에 제시된 다음 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
표 2.
일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열은 각각 조작된 서열이다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 닉 부위를 각각 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 닉 부위는 말단 분해 부위(trs)의 약 0 내지 약 20개 뉴클레오티드 하류 영역, 예컨대, 말단 분해 부위(trs)의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 하류 영역, 또는 예컨대, 말단 분해 부위(trs)의 약 0 내지 15개, 약 0 내지 10개, 약 0 내지 5개, 약 5 내지 15개, 약 10 내지 20개, 약 15 내지 20개, 약 10 내지 20개, 약 5 내지 20개 뉴클레오티드 하류 영역에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 엑소뉴클레아제 진입 부위의 역할을 하는 닉 부위는 단 하나이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 Nb.BbvCI 또는 이의 이소스키조머(isoschizomer)의 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 Nb.BbvCI 또는 이의 이소스키조머의 단일 인식 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 Nb.BtsI 또는 이의 이소스키조머의 하나 이상의 인식 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 Nb.BtsI 또는 이의 이소스키조머의 단일 인식 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시의 구현예에 따르면, 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트는 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자에 작동 가능하게 연결되어 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자의 발현을 조절하는 적어도 하나의 이중 가닥 프로모터를 더 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트는 이중 가닥 인핸서, 이중 가닥 인트론, 이중 가닥 전사 후 조절 요소, 이중 가닥 폴리아데닐화 신호, 및 이중 가닥 조절 스위치로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 요소를 더 포함한다. 다른 추가적인 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자는 프로모터가 없는 이중 가닥 이식유전자이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자는 이중 가닥 공여체 서열이고; 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트는 이중 가닥 5' 상동성 아암, 및 이중 가닥 공여체 서열의 측부에 위치하는 이중 가닥 3' 상동성 아암을 더 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 이중 가닥 5' 상동성 아암 및 이중 가닥 3' 상동성 아암은 각각 약 10 내지 2000 nt의 길이, 예컨대, 약 100 내지 2000 nt의 길이 또는 약 1000 내지 2000 nt의 길이이거나, 약 10 내지 1000 nt의 길이, 예컨대, 약 100 내지 1000 nt의 길이 또는 약 10 내지 500 nt의 길이, 약 50 내지 500 nt의 길이 또는 약 100 내지 500 nt의 길이, 약 10 내지 50 nt의 길이, 약 50 내지 500 nt의 길이 또는 약 500 내지 1000 nt의 길이, 약 500 내지 1500 nt의 길이, 약 1500 내지 2000 nt의 길이, 약 2 내지 1000 nt의 길이, 약 2 내지 500 nt의 길이, 약 2 내지 100 nt의 길이, 또는 약 2 내지 50 nt의 길이이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자는 이중 가닥 공여체 서열이고; 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트는 단일 가닥 5' 상동성 아암 및 단일 가닥 3' 상동성 아암이 결여되어 있다. 또한, 일부 구현예에서, 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트는 절단성이며, 다음을 더 포함한다: 적어도 하나의 제1 이중 가닥 가이드 RNA(gRNA) 표적 서열(TS); 적어도 하나의 제1 이중 가닥 프로토스페이서 인접 모티프(PAM); 적어도 하나의 제2 이중 가닥 gRNA TS; 및 적어도 하나의 제2 이중 가닥 PAM.
본 명세서에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 dsDNA 작제물은 a) dsDNA 주형을 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 주형은 상기 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자를 포함하는 이중 가닥 이식유전자 카세트; 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트의 상류 영역에 있는 제1 비-회문 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및 상응하는 제1 절단 부위; 및 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트의 하류 영역에 있는 제2 비-회문 제한 엔도뉴클레아제 인식 및 상응하는 제2 절단 부위를 포함하고; 상기 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제는 상기 제1 및 제2 절단 부위에서 상기 주형을 절단하여 5' 및 3' 말단에 단일 가닥 오버행이 있는 삽입물을 방출할 수 있는 것인 단계; 및 b) 상기 삽입물의 5' 및 3' 말단을 제1 역위 말단 반복(ITR) 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 ITR 올리고뉴클레오티드에 연결하여 상기 dsDNA 작제물을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 합성적으로 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 제1 ITR과 선택적인 제2 ITR 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 ITR과 선택적인 제2 ITR 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 압타머 서열이며, 선택적으로 상기 압타머 서열은 핵 국소화 단백질에 대한 높은 결합 친화도를 가진다. 다른 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나에 접합된 핵 국소화 펩티드이다. 다른 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 접합된 형광단이다.
B. 이중 가닥 DNA로부터 유래된 단일 가닥 DNA 분자 또는 벡터
본 개시의 구현예에 따른 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)가 이중 가닥 DNA(dsDNA) 작제물, 특히 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 가진 이중 가닥 ceDNA(ds ceDNA)에서 유래한다는 사실 때문에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에도 상기 ds ceDNA 벡터의 물리적 속성이 존재하며, 여기에는 예컨대, 핵 국소화 단백질에 대한 높은 결합 친화도를 가지는 예컨대, 압타머 서열과 같은 적어도 하나의 기능성 모이어티 또는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 접합된 형광단의 존재가 포함된다. 다른 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 접합된 형광단이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용하여 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터) 및 ds DNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)은 바이러스 캡시드 내의 제한된 공간에 의한 패키징 제약을 갖지 않는다. 이는 조절 요소, 예컨대, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 이식유전자, 다수의 이식유전자 등의 삽입을 가능하게 한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ss DNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A, A', B, B', C, C', 및 D'로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'으로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A, A', 및 D로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A, A', 및 D로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A 및 A'으로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ds DNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나의 A 및 A'으로부터 선택된 임의의 영역에 각각 독립적으로 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 제1 ITR에서 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 모두 상기 제1 ITR의 A' 영역 및/또는 D 영역에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 제1 ITR에서 dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 모두 상기 제1 ITR의 A' 영역 및/또는 D 영역에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 모두 상기 제1 ITR의 A 영역에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물의 제1 ITR에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 모두 상기 제1 ITR의 A 영역에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제2 ITR에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 모두 상기 제2 ITR의 A' 영역 및/또는 D 영역에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물의 제2 ITR에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 모두 상기 제2 ITR의 A' 영역 및/또는 D 영역에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제2 ITR에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 모두 상기 제2 ITR의 A 영역에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 제2 ITR에서 dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 모두 상기 제2 ITR의 A 영역에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 서로 인접한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 서로 인접한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 15개 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 15개 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 10개 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 10개 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 5개 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상기 제1 ITR 또는 선택적인 제2 ITR의 B-B' 아암 및 C-C' 아암으로부터 약 1 내지 5개 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물을 포함하는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 PS 결합 서열에서 엑소뉴클레아제 분해에 대해 저항성이 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 60개, 예컨대, 약 1 내지 약 3개, 약 1 내지 약 5개, 약 1 내지 약 7개, 약 1 내지 약 10개, 약 1 내지 약 20개, 약 1 내지 약 30개, 약 1 내지 약 40개, 약 1 내지 약 50개, 약 10 내지 약 20개, 약 10 내지 약 30개, 약 10 내지 약 40개, 약 10 내지 약 50개, 약 20 내지 약 30개, 약 20 내지 약 40개, 약 20 내지 약 50개, 약 30 내지 약 40개, 약 30 내지 약 50개, 약 40 내지 약 50개, 약 25 내지 약 50개, 약 5 내지 약 10개, 약 5 내지 약 15개, 약 5 내지 약 20개, 약 5 내지 약 25개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 60개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 5개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 10개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 15개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 20개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 25개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1 내지 약 30개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 ssDNA 분자의 5' 말단에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 ssDNA 분자의 3' 말단에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 상기 ssDNA 분자의 3' 말단, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단, 또는 둘 모두에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제 인식 서열 각각의 상류 영역에 위치한다. 일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 제1 ITR 및/또는 선택적인 제2 ITR의 5' 말단에 위치한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 상기 ssDNA 분자의 3' 말단, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단, 또는 둘 다에서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제 인식 서열 각각의 상류 영역에서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 제1 ITR의 5' 말단에서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하고/하거나 선택적인 제2 ITR의 5' 말단에서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 6개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 5개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 4개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 3개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 2개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 6개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 5개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 4개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 3개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 2개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 1개 이하의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 3, 약 4, 또는 약 5개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 및 선택적인 제2 ITR 중 적어도 하나는 약 3, 약 4, 또는 약 5개의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 각각 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR과 제2 ITR은 서로 대칭이거나 실질적으로 대칭이다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 ITR과 제2 ITR은 서로 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR과 제2 ITR은 서로 비대칭이다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 ITR과 제2 ITR은 서로 비대칭이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR이다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'으로부터 선택되는 영역 중 적어도 하나에서의 결실, 삽입, 및/또는 염기 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'으로부터 선택되는 영역 중 적어도 하나에서의 결실, 삽입, 및/또는 염기 치환에 의해 변형된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR은 각각 AAV ITR이고, 각각 독립적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 구성된 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형이다. 일부 구현예에 따르면, dsDNA 작제물의 제1 ITR 및 제2 ITR은 각각 AAV ITR이고, 각각 독립적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 구성된 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 하나 이상의 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 하나 이상의 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열을 포함한다.
C. 발현 카세트, 이식유전자 및 관심 대상 핵산 서열
상기 발현 카세트는 이식유전자(관심 대상 핵산 서열) 및 상기 이식유전자의 발현을 허용 및/또는 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예컨대, 상기 발현 카세트는 다음 중 하나 이상을 다음의 순서로 포함할 수 있다: 인핸서/프로모터, ORF 리포터(이식유전자), 전사 후 조절 요소(예컨대, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예컨대, BGH 폴리A). 상기 발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir 조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR은 이식유전자에 대한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물은 이식유전자 또는 관심 대상 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 추가 구성요소, 예컨대, 이식유전자의 발현을 통제하고 조절하기 위한 본 명세서의 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 기재된 조절 스위치(regulatory switch)를 포함하고, 원하는 경우, ssDNA 분자를 포함하는 세포의 조절된 세포 사멸을 가능하게 하는 킬 스위치(kill switch)인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
상기 ssDNA 작제물의 발현 카세트 또는 관심 대상 핵산 서열은 4000개, 5000개, 10,000개, 또는 20,000개 초과의 뉴클레오티드, 또는 30,000개, 또는 40,000개, 또는 50,000개의 뉴클레오티드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 사이 또는 10,000 내지 50,000개 사이의 임의의 범위의 뉴클레오티드, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 길이가 500 내지 50,000개 뉴클레오티드 범위인 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 길이가 500 내지 75,000개 뉴클레오티드 범위인 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 길이가 500 내지 10,000개 뉴클레오티드 범위인 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 길이가 1000 내지 10,000개 뉴클레오티드 범위인 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 길이가 500 내지 5,000개 뉴클레오티드 범위인 이식유전자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 캡슐화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없으므로 효율적인 이식유전자를 제공하기 위한 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 원핵생물 특이적 메틸화가 결여되어 있다.
발현 카세트는 예컨대, 수용 대상체에서 부재하거나, 비활성이거나, 활성이 불충분한 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열(예컨대, 개방 해독 프레임) 또는 이식유전자 또는 관심 대상 핵산 서열 또는 원하는 생물학적 효과 또는 치료적 효과를 가진 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 이식유전자 또는 관심 대상 핵산 서열은 결함 유전자 또는 전사물의 발현을 교정하도록 기능할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 원칙적으로, 상기 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되었거나 부재하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 RNA를 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 이점을 제공하는 임의의 유전자를 포함할 수 있고, 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
상기 발현 카세트는 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 임의의 이식유전자 또는 관심 대상 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용하여 생산된 dsDNA 작제물은 대상체에서 임의의 관심 대상 유전자를 전달하고 발현하는 데 사용될 수 있으며, 여기에는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산(예컨대, RNAi, miR 등)뿐만 아니라, 대상체의 유전체 내의 바이러스 서열(예컨대, HIV 바이러스 서열 등)을 포함하는 외인성 유전자 및 뉴클레오티드 서열이 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 치료적 목적(예컨대, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도)으로 사용된다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 대상체에서 임의의 관심 대상 유전자를 발현하는 데 유용하며, 여기에는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩; 예컨대, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, mRNA 또는 gRNA, 및 이들의 안티센스 상대(예컨대, 안타고미르)), 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
상기 발현 카세트는 또한 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩; 예컨대, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA, 및 이들의 안티센스 상대(예컨대, 안타고미르))를 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질, 예컨대, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 인산분해효소, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 루시페라아제, 및 당업계에 주지된 다른 것들을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
상기 발현 카세트에 제공된 서열, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자의 발현 작제물 및 본 명세서에 기재된 dsDNA 작제물은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 자연 서열(예컨대, 원핵 서열)의 적어도 하나, 하나 초과, 또는 유의한 수의 코돈을 해당 척추동물의 유전자에 보다 자주 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 대상 척추동물, 예컨대, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 강화를 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 일반적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 최적화된 코돈은 예컨대, Aptagen의 GENEFORGE® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물에 의해 발현되는 이식유전자 또는 관심 대상 핵산 서열은 치료적 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료적 유전자는 항체, 또는 항체 단편, 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, 중화 항체 또는 항체 단편 등이다.
특히, 치료적 유전자는 질병, 기능장애, 상해, 및/또는 장애의 치료, 예방, 및/또는 이의 하나 이상의 증상의 완화에 사용하기 위한 하나 이상의 치료제(들)이며, 여기에는 예를 들어 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편뿐만 아니라 이들의 변이체 및/또는 이의 활성 단편이 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 예시적인 치료적 유전자는 "치료 방법"이라는 제목의 본 명세서의 섹션에 기재된다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물에는 플라스미드 기반 발현 벡터와 상이한 많은 구조적 특징이 있다. 본 명세서의 파타 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자와 본 명세서의 합성 방법에 의해 생산된 dsDNA 작제물은 다음 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다: 원래 세균 DNA의 결여(즉, 삽입되지 않음); 원핵 복제 기점의 결여; 자기 포함형임(즉, Rep 결합 및 말단 분해 부위(RBS 및 TRS) 및 ITR 사이의 외인성 서열을 포함하여, 2개의 ITR 이외의 임의의 서열을 필요로 하지 않음); 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재; 및 세균형 DNA 메틸화, 또는 실제로 주어진 세포 유형에서의 생산과 연관되고 포유류 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 벡터는 임의의 원핵 DNA를 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 비제한적인 예로서, 일부 원핵 DNA가 프로모터 또는 인핸서 영역에서 외인성 서열로서 삽입될 수 있는 것으로 고려된다.
플라스미드 기반 발현 벡터에 비해 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물을 사용하는 데에는 여러 가지 이점이 있다. 이러한 이점은 다음을 포함하되 이로 제한되지는 않는다: 1) 플라스미드는 세균 DNA 서열을 포함하고 원핵 특이적 메틸화, 예컨대, 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화를 거치는 한편, 캡시드 결핍 AAV 벡터 서열은 진핵 기원이고 원핵-특이적 메틸화를 거치지 않으며; 결과적으로, 캡시드 결핍 AAV 벡터는 플라스미드에 비해 염증 및 면역 반응을 유도할 가능성이 적음; 2) 생산 프로세스 동안, 플라스미드는 저항성 유전자의 존재를 필요로 하는 반면, 본 개시의 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물은 그렇지 않음; 3) 원형 플라스미드가 세포 내에 도입된 후 핵에 전달되지 않고, 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해 과량 투여(overloading)를 필요로 하는 한편, ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 뉴클레아제에 대한 저항성을 부여하는 바이러스 시스-요소, 즉, ITR을 포함하고, 표적화되어 핵에 전달되도록 설계될 수 있음. ITR 기능에 필수적인 최소 정의 요소는 Rep 결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3') 및 말단 분해 부위(TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3') + 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문 서열인 것으로 가정함; 및 4) ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물 벡터는 톨 유사 수용체 계열의 구성원에 결합하여 T 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것으로 보고된 원핵생물 유래 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오티드의 중간한 표현을 가지지 않음.
D. 역위 말단 반복(ITR)
본 명세서에 제시된 바와 같이, 일부 양태에 따르면, 본 개시는 부분 DNA 이중체 및 적어도 하나의 루프를 포함하는 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하는 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 3' 말단에 포함하는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 부분 DNA 이중체 및 적어도 하나의 루프를 포함하는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 5' 말단에 포함한다.
일부 양태에 따르면, ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 2개의 역위 말단 반복(ITR) 서열 사이에 위치한 이식유전자 또는 이종 핵산 서열을 포함하며, 여기서 ITR 서열은 이들 용어가 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물은 (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역위 말단 반복(mod-ITR)(예컨대, 비대칭 변형된 ITR); (ii) mod-ITR 쌍이 서로에 대해 상이한 3차원 공간 조직을 갖는 2개의 변형된 ITR(예컨대, 비대칭 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기에서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 조직을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기에서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구조를 가짐) 중 어느 하나로부터 선택되는 ITR 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 본 개시의 방법은 리포솜 나노입자 전달 시스템과 같지만 이에 한정되지 않는 전달 시스템을 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ITR 서열은 다음과 같은 2개의 하위 계열을 포함하는 파보비리다에과의 바이러스로부터 유래될 수 있다: 척추동물을 감염시키는 파보비리나에, 및 곤충을 감염시키는 덴소비리나에. 파보비리나에 아과(파보바이러스로 지칭됨)는 데펜도바이러스 속을 포함하며, 이의 구성원은 대부분의 조건하에서 생산적 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와의 동시 감염을 필요로 한다. 데펜도바이러스 속은 일반적으로 인간(예컨대, 혈청형 2, 3A, 3B, 5, 및 6) 또는 영장류(예컨대, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노연관 바이러스(AAV), 및 다른 온혈 동물을 감염시키는 관련 바이러스(예컨대, 소, 개, 말, 및 양 아데노 연관 바이러스)를 포함한다. 파보바이러스 및 파보바이러스 계열의 다른 구성원은 일반적으로 Kenneth I. Berns의 문헌 ["Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69, FIELDS VIROLOGY (제3판. 1996)]에 기재되어 있다.
본 명세서 및 본 명세서의 실시예에 기재된 ITR은 AAV2 WT-ITR이지만, 당업자는 전술한 바와 같이 임의의 알려진 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스, 예컨대, AAV(예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ8 유전체. 예컨대, NCBI: NC002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)로부터의 ITR, 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV로부터의 ITR을 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 AAV는 온혈 동물, 예컨대, 조류(AAAV), 소(BAAV), 개, 말, 및 양 아데노 연관 바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ITR은 B19 파보바이러스(GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스(MVM)(GenBank 수탁 번호: NC 001510); 거위 파보바이러스(GenBank 수탁 번호: NC 001701); 뱀 파보바이러스 1(GenBank 수탁 번호: NC 006148)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 5' WT-ITR은 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
당업자는 ITR 서열이 일반적으로 T 형상 또는 Y 형상 헤어핀 구조인 이중 가닥 홀리데이 접합부(Holliday junction)의 공통 구조를 가지며, 각각의 WT-ITR은 더 큰 회문 아암(A-A')에 내장된 2개의 회문 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C') 및 단일 가닥 D 서열에 의해 형성된다는 것(여기서 이들 회문 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플롭 배향을 정의함)을 인지할 것이다. 예를 들어, 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6)으로부터의 ITR의 구조적 분석 및 서열 비교는 Grimm 등의 문헌 [J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]; Yan 등의 문헌 [J. Virology, 2005; 364-379]; Duan 등의 문헌 [Virology 1999; 261; 8-14]에 기재되어 있으며, 해당 내용을 참조한다. 당업자는 본 명세서에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 WT-ITR 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, Grimm 등의 문헌 [J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]에 기재된 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6, 및 조류 AAV(AAAV) 및 소 AAV(BAAV))로부터의 ITR의 서열 비교를 참조하며, 이는 다른 혈청형으로부터의 왼쪽 ITR에 대한 AAV2의 왼쪽 ITR의 동일성(%)을 다음과 같이 나타낸다: AAV-1(84%), AAV-3(86%), AAV-4(79%), AAV-5(58%), AAV-6(왼쪽 ITR)(100%) 및 AAV-6(오른쪽 ITR)(82%).
일부 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하는 제1 ITR 및 선택적인 제2 ITR 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 기능성 모이어티를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 압타머 서열이며, 선택적으로 상기 압타머 서열은 핵 국소화 단백질에 대한 높은 결합 친화도를 가진다. 다른 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나에 접합된 핵 국소화 펩티드이다. 다른 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 기능 모이어티는 상기 ITR 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 접합된 형광단이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 ITR은 완전 합성일 수 있으며, 예컨대, ITR은 바이러스 유래 서열을 포함하지 않을 수 있다.
E. 조절 요소
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 시스-조절 요소의 특이적 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir 조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 관심 이식유전자 또는 핵산의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어 관심 이식유전자 또는 핵산의 발현을 조절하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 스위치, 또는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포를 살해할 수 있는 킬 스위치를 포함한다. 본 개시에서 사용될 수 있는 조절 스위치를 포함하는 조절 요소는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 국제 출원 번호 PCT/US18/49996(국제 특허 공개 번호 WO 2019/051255 A1로 공개됨)에서 보다 상세하게 논의된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 조절 서열, 및 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 유전자 조절 서열은 상기 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 상기 조절 서열은 숙주 세포에서 상기 뉴클레아제 발현을 조절하는 데 적합하다. 특정 구현예에서, 상기 조절 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 유도할 수 있는 적절한 프로모터 서열, 예컨대, 본 개시의 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 상기 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 프로모터의 상류에 인핸서 서열이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 조절 서열은 인핸서 및 프로모터를 포함하며, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류 영역에 인트론 서열을 포함하고, 상기 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하며, 상기 프로모터는 상기 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명세서에 기재된 합성 프로세스를 사용하여 생산된 dsDNA 분자는 WHP 전사 후 조절 요소(WPRE) 및 BGH 폴리A와 같은 시스-조절 요소의 특정 조합을 더 포함할 수 있다. 발현 작제물에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과되는 패키징 제약 조건에 의해 제한되지 않는다.
(i) 프로모터
당업자는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 개시의 dsDNA 분자에 사용된 프로모터가 이들이 촉진하는 특정 서열에 맞게 적절히 맞춤화되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 가이드 RNA는 프로모터를 전혀 필요로 하지 않을 수 있는데, 이는 가이드 RNA의 기능이 천연 DNA의 특정 서열과 이중체를 형성하여 재조합 이벤트를 수행하는 것이기 때문이다. 대조적으로, 상기 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물 벡터에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 프로모터의 도움을 받아 상기 벡터로부터 효율적으로 발현될 수 있으며, 선택적으로 조절 가능한 방식으로 발현될 수 있다.
본 개시의 발현 카세트는 전체 발현 수준뿐만 아니라 세포 특이성에도 영향을 미칠 수 있는 프로모터를 포함한다. 이식유전자 발현의 경우, 발현 카세트는 고도로 활성인 바이러스 유래의 극초기 프로모터(immediate early promoter)를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 이식유전자 발현을 특정 세포 유형으로 제한하고, 조절되지 않은 이소성 발현에 기인하는 독성 효과 및 면역 반응을 감소시키기 위한 조직 특이적 진핵생물 프로모터를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현 카세트는 CAG 프로모터와 같은 합성 조절 요소를 포함할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 거대세포바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타 액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손, 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타 글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 또한, 발현 카세트는 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터, 간 특이적(LP1) 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(EF1a) 프로모터, 또는 인간 트랜스티레틴(TTR) 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현 카세트는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예컨대, 레트로바이러스 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 또는 거대세포바이러스(CMV)의 극초기 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)를 포함한다. 또한, 유도성 프로모터, 이식유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 또는 당업계에 알려진 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
위에 기재된 것들을 포함하여, 적절한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있으므로 바이러스 프로모터로서 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물을 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적절한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소(예컨대, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 메이저 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 포진 바이러스(HSV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대, CMV 극초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 작은 핵 프로모터(U6)(Miyagishi 등의 문헌[Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)]), 강화된 U6 프로모터(예컨대, Xia 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)]), 인간 H1 프로모터(H1), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 프로모터 등. 특정 구현예에서, 이들 프로모터는 이의 하류 인트론 포함 말단에서 변경되어 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 외래성이다.
일 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료적 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료적 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 알려져 있고 특성이 규명되어 있다. 사용된 프로모터 영역은 하나 이상의 추가 조절 서열(예컨대, 천연 인핸서)을 더 포함할 수 있다. 갭은 프로모터의 5' 상류 영역에 위치하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 상기 프로모터를 포함하는 ssDNA 분자의 영역은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터의 전사 시작 부위(TSS)는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 상기 ssDNA 분자는 인핸서와 같은 조절 요소를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인핸서는 세르핀 인핸서(예컨대, 1xSERP, 2xSERP, 또는 3xSERP)일 수 있다. 실시예 7 및 도 42 내지 도 45에 제시된 바와 같이, 이중 가닥 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS의 포함으로 인해 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자로부터의 발현이 실질적으로 증가할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10개 염기쌍, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 30개 염기쌍, 적어도 40개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍, 적어도 60개 염기쌍, 적어도 70개 염기쌍, 적어도 80개 염기쌍, 적어도 90개 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍, 적어도 110개 염기쌍, 적어도 120개 염기쌍, 적어도 130개 염기쌍, 적어도 140개 염기쌍, 적어도 150개 염기쌍, 적어도 160개 염기쌍, 적어도 170개 염기쌍, 적어도 180개 염기쌍, 적어도 190개 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍, 적어도 220개 염기쌍, 적어도 240개 염기쌍, 적어도 260개 염기쌍, 적어도 280개 염기쌍, 적어도 300개 염기쌍, 적어도 320개 염기쌍, 적어도 340개 염기쌍, 적어도 360개 염기쌍, 적어도 380개 염기쌍, 적어도 400개 염기쌍, 적어도 420개 염기쌍, 적어도 440개 염기쌍, 적어도 460개 염기쌍, 적어도 480개 염기쌍, 적어도 500개 염기쌍, 적어도 550개 염기쌍, 적어도 600개 염기쌍, 적어도 650개 염기쌍, 적어도 700개 염기쌍, 적어도 750개 염기쌍, 적어도 800개 염기쌍, 적어도 850개 염기쌍, 적어도 900개 염기쌍, 적어도 950개 염기쌍, 적어도 1000개 염기쌍, 적어도 1100개 염기쌍, 적어도 1200개 염기쌍, 적어도 1300개 염기쌍, 적어도 1400개 염기쌍, 또는 적어도 1500개 염기쌍이다.
일부 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 1500개 염기쌍 미만, 1400개 염기쌍 미만, 1300개 염기쌍 미만, 1200개 염기쌍 미만, 1100개 염기쌍 미만, 1000개 염기쌍 미만, 950개 염기쌍 미만, 900개 염기쌍 미만, 850개 염기쌍 미만, 800개 염기쌍 미만, 750개 염기쌍 미만, 700개 염기쌍 미만, 650개 염기쌍 미만, 600개 염기쌍 미만, 550개 염기쌍 미만, 500개 염기쌍 미만, 480개 염기쌍 미만, 460개 염기쌍 미만, 440개 염기쌍 미만, 420개 염기쌍 미만, 400개 염기쌍 미만, 380개 염기쌍 미만, 360개 염기쌍 미만, 340개 염기쌍 미만, 320개 염기쌍 미만, 300개 염기쌍 미만, 280개 염기쌍 미만, 260개 염기쌍 미만, 240개 염기쌍 미만, 220개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 190개 염기쌍 미만, 180개 염기쌍 미만, 170개 염기쌍 미만, 160개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 140개 염기쌍 미만, 130개 염기쌍 미만, 120개 염기쌍 미만, 110개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만, 90개 염기쌍 미만, 80개 염기쌍 미만, 70개 염기쌍 미만, 60개 염기쌍 미만, 50개 염기쌍 미만, 40개 염기쌍 미만, 또는 30개 염기쌍 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 30 내지 1500개 염기쌍, 길이가 약 40 내지 1400개 염기쌍, 길이가 약 50 내지 1300개 염기쌍, 길이가 약 60 내지 1200개 염기쌍, 길이가 약 70 내지 1100개 염기쌍, 길이가 약 80 내지 1000개 염기쌍, 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍, 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍, 길이가 약 100 내지 800개 염기쌍, 길이가 약 110 내지 700개 염기쌍, 길이가 약 120 내지 600개 염기쌍, 길이가 약 130 내지 500개 염기쌍, 길이가 약 140 내지 400개 염기쌍, 길이가 약 150 내지 300개 염기쌍, 길이가 약 160 내지 200개 염기쌍, 길이가 약 1381개 염기쌍, 또는 길이가 약 499개 염기쌍이다.
(ii) 폴리아데닐화 서열
폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열이 합성적으로 생산된 AAV 벡터에 포함되어 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)로부터 발현된 mRNA를 안정시키고, 핵 방출 및 번역에 도움을 줄 수 있다. 일 구현예에서, 합성적으로 생산된 AAV 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 이상의 아데닌 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오티드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 40 내지 55개의 뉴클레오티드, 약 45 내지 50개의 뉴클레오티드, 약 35 내지 50개의 뉴클레오티드, 또는 그 사이의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 발현 카세트는 당업계에 알려진 폴리 아데닐화 서열 또는 이의 변형, 예컨대, 소 BGHpA 또는 바이러스 SV40pA로부터 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리A 신호 상류 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE가 SV40pA 또는 이종 폴리-A 신호와 함께 사용될 수 있다.
상기 발현 카세트는 또한 이식유전자의 발현을 증가시키기 위한 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사 후 조절 요소(WPRE)가 이식유전자의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자로부터의 전사 후 요소, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 이식유전자, 예컨대, VH-02 및 VK-A26 서열에 연결될 수 있다.
(iii) 핵 국소화 서열
일부 구현예에서, RNA 유도 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS), 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 NLS는 아미노 말단 또는 그 근처에, 또는 카르복시 말단 또는 그 근처에, 또는 이들의 조합(예컨대, 하나 이상의 NLS는 아미노 말단에, 및/또는 하나 이상의 NLS는 카르복시 말단)에 위치한다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 이들 각각은 다른 하나와 독립적으로 선택될 수 있으므로, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 존재하고/하거나, 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 함께 존재한다. NLS의 비제한적인 예는 아래 표 3에 제시되어 있다.
표 3. 예시적인 핵 국소화 서열(NLS)
F. 추가 구성요소
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명새서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용해 생산된 dsDNA 분자는 유전자 발현을 위한 다른 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 표적화 이벤트용으로 선택하기 위해, 보호 shRNA는 마이크로RNA에 내장되고, 알부민 유전자좌와 같은 고도로 활성인 유전자좌 내에 부위 특이적으로 통합되도록 설계된 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 재조합 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 삽입될 수 있다. 이러한 구현예는 임의의 유전적 배경에서 유전자 변형 간세포의 생체 내 선택 및 증식을 위한 시스템, 예컨대, Nygaard 등의 문헌[A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016]에 기재된 시스템을 제공할 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 본 개시의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 형질전환된, 형질주입된, 형질도입된 등의 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다. 선택 마커는 그 산물이 살생물제 또는 바이러스 저항성, 중금속에 대한 저항성, 영양요구성에 대한 원영양성(prototrophy), NeoR 등을 제공하는 유전자이다. 특정 구현예에서, 양성 선택 마커는 NeoR과 같은 공여체 서열에 통합된다. 음성 선택 마커는 공여체 서열의 하류 영역에 통합될 수 있고, 예컨대, 음성 선택 마커를 인코딩하는 핵산 서열 HSV-tk는 공여체 서열의 하류 영역에 있는 핵산 작제물에 통합될 수 있다.
구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용해 생산된 dsDNA 분자는, 예컨대, 2018년 12월 6일자로에 출원되었고, 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 국제 출원 PCT/US2018/064242(국제 특허 공개 제WO 2019/113310 A1호로서 공개됨)에 개시된 바와 같이 유전자 편집에 사용될 수 있고, 및 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 5' 상동성 아암, 3' 상동성 아암, 상기 '' 상동성 아암의 상류 영역에 있고 이에 근접한 폴리아데닐화 부위. 예시적인 상동성 아암은 5' 및 3' 알부민 상동성 아암 또는 CCR5 5' 및 3' 상동성 아암이다.
G. 스위치
분자 조절 스위치는 신호에 응답하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 것이다. 이러한 조절 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명세서에 기재된 합성 프로세스를 사용하여 생산된 dsDNA 분자와 유용하게 조합되어 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로부터의 이식유전자의 발현의 결과를 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 이식유전자의 발현을 미세 조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 생물학적 봉쇄 기능의 역할을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 합성 AAV에서 관심 유전자의 발현을 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 시작하거나 정지하도록 (즉, 멈추도록) 설계된 "온/오프(ON/OFF)" 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포에게 상기 스위치가 활성화되면 예정된 세포 사멸을 수행하도록 지시할 수 있는 "킬 스위치(kill switch)"를 포함할 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 사용하기 위해 포함되는 예시적인 조절 스위치는 이식유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 국제 출원 PCT/US18/49996(국제 특허 공개 번호 WO 2019/051255 A1로 공개됨)에서 보다 상세하게 논의된다.
(i) 바이너리 조절 스위치
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용해 생산된 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 이식유전자의 발현을 통제 가능하게 조절하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 관심 대상 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 영역, 예컨대, 프로모터, 시스-요소, 억제 인자, 인핸서 등을 더 포함할 수 있으며, 상기 조절 영역은 하나 이상의 보조인자 또는 외인성 제제에 의해 조절된다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 호르몬 유도성 또는 금속 유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 RU486 유도성 프로모터, 엑디손 유도성 프로모터, 라파마이신 유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하되 이로 제한되지 않는다.
(ii) 소분자 조절 스위치
당업계에 알려진 다양한 소분자 기반 조절 스위치가 당업계에 알려져 있고, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자와 조합되어 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 조절 스위치 조절식 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조절 스위치는 다음 중 어느 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다: 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예컨대, 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI와 더불어, 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 발현을 조절하는 인공 프로모터, 예컨대, Taylor 등의 문헌[BMC Biotechnology 10 (2010): 15]에 개시된 것과 같은 것; 조작된 스테로이드 수용체, 예컨대, C 말단 절단에 의해 변형된 프로게스테론 수용체로서, 프로게스테론에는 결합할 수 없지만 RU486(미페프리스톤)에 결합하는, 변형된 프로게스테론 수용체(미국 특허 제5,364,791호); 초파리(Drosophila)의 엑디손 수용체 및 이들의 엑디스테로이드 리간드(Saez 등의 문헌[PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517]); 또는 Sando R 3rd의 문헌[Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8]에 개시된 것과 같은 같은 항생제 트리메토프림(TMP)에 의해 조절되는 스위치. 일부 구현예에서, 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)에 의해 발현되는 조절 스위치는 미국 특허 제8,771,679호 및 제6,339,070호에 개시된 것과 같은 전구약물 활성화 스위치이다.
(iii) "패스코드" 조절 스위치
일부 구현예에서, 상기 조절 스위치는 "패스코드 스위치(passcode switch)" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치는 특정 조건이 발생할 때, 즉 이식유전자 발현 및/또는 억제가 일어나기 위해서는 반드시 존재해야 하는 조건의 조합이 필요할 때, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로부터 이식유전자의 발현 조절을 미세하게 조정할 수 있게 한다. 예를 들어, 이식유전자의 발현이 일어나기 위해서는 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는 임의의 개수의 조건, 예컨대, 이식유전자 발현이 일어나기 위해서 존재해야 하는 적어도 2가지, 또는 적어도 3가지, 또는 적어도 4가지, 또는 적어도 5가지, 또는 적어도 6가지, 또는 적어도 7가지 이상의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2가지 조건(예컨대, A, B 조건)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서, 적어도 3가지 조건(예컨대, A, B, 및 C, 또는 A, B, 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치가 있는 합성 AAV로부터 유전자 발현이 일어나기 위해서는 조건 A, B, 및 C가 반드시 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다; 조건 A는 병태 또는 질병의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 이식유전자 발현에 대한 반응이다. 예를 들어, 이식유전자가 결함 있는 EPO 유전자를 편집하는 경우, 조건 A는 만성 신장 질환(CKD)의 존재이고, 대상체가 신장에서 저산소성 상태를 갖는 경우 조건 B가 발생하고, 조건 C는 신장에서 에리트로포이에틴 생성 세포(EPC) 동원이 손상되거나; 대안적으로 HIF-2 활성화가 손상된다. 산소 수준이 증가하거나 원하는 EPO 수준에 도달한 후, 이식유전자는 3가지 조건이 발생하여 다시 켜질 때까지 다시 꺼진다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 사용하기 위해 포함되는 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는 생화학적 봉쇄 조건을 정의하는 데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장하기 위한 하이브리드 전사 인자(TF)를 포함한다. 소정의 조건의 존재 시에 세포 사멸을 유발하는 데드맨 스위치(deadman switch)와 대조적으로, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재 시에 세포 생존 또는 이식유전자 발현을 허용하며, 소정의 환경 조건 또는 패스코드가 존재할 때에만 이식유전자 발현 및/또는 세포 생존을 허용하도록 쉽게 재프로그래밍될 수 있다.
본 명세서에 개시된 조절 스위치, 예컨대, 본 명세서에 개시된 것과 같은 소분자 스위치, 핵산 기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사후 이식유전자 조절 스위치, 번역후 조절, 방사선 조절식 스위치, 저산소증 매개 스위치, 및 당업자에게 알려진 다른 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합이 본 명세서에 개시된 것과 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 Kis 등의 검토 논문[J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015)]에서 논의되며, Kis 등의 논문의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는 아래 표 4의 스위치 중 어느 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
(iv) 이식유전자 발현을 조절하기 위한 핵산 기반 조절 스위치
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현된 이식유전자를 조절하기 위한 조절 스위치는 핵산 기반 조절 메커니즘에 기초한다. 예시적인 핵산 조절 메커니즘은 당업계에 알려져 있고 사용이 예상된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은 예컨대, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 9,222,093, 및 EP 출원 EP288071에 개시된 것들, 및 Villa JK 등의 검토 문헌[Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)]에도 개시된 것들과 같은 리보스위치(riboswitches)를 포함한다. 또한, WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것과 같은 대사산물 반응성 전사 바이오센서가 포함된다. 사용이 예상되는 당업계에 알려진 다른 메커니즘은 siRNA 또는 RNAi 분자(예컨대, miR, shRNA)로 이식유전자를 침묵화시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현된 이식유전자에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 이식유전자가 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현되더라도, 이러한 RNAi가 발현되는 경우, 이의 발현은 상보적 RNAi 분자에 의해 침묵화될 것이고, 이식유전자가 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현될 때, RNAi가 발현되지 않는 경우, 이식유전자는 RNAi에 의해 침묵화되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 조절 스위치는, 이식유전자 발현을 중단시키지 않으면 불리할 수 있는 부위에서 조절 스위치가 이식유전자 발현을 의도적으로 스위치 오프하는, 예컨대, US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직 특이적 자기 불활성화 조절 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 조절 스위치는 예컨대, US2014/0127162 및 미국 특허 제8,324,436호에 개시된 바와 같은 재조합효소 가역적 유전자 발현 시스템이다.
(v) 전사 후 및 번역 후 조절 스위치.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현된 이식유전자 또는 관심 대상 유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 전사 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 다음 문헌에 개시된 것과 같은 테트라사이클린린 또는 테오필린에 민감한 압타자임 리보스위치일 수 있다: US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 2707487, 및 Beilstein 등의 문헌[ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534]; Zhong 등의 문헌[Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858]. 일부 구현예에서, 당업자는 최종 결과가 리간드 민감성 온-스위치인 리간드 민감성(오프-스위치) 압타머를 포함하는 이식유전자 및 억제 siRNA 둘 모두를 인코딩할 수 있을 것으로 예상된다.
(vi) 다른 예시적인 조절 스위치
임의의 알려진 조절 스위치가 합성적으로 생산된 ssDNA 분자에 사용되어, 환경 변화에 의해 유발된 것들을 포함하여, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현된 이식유전자의 유전자 발현을 조절할 수 있다. 추가 예시는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: BOC 방법(Suzuki 등의 문헌[Scientific Reports 8; 10051 (2018)]; 유전자 코드 확장 및 비생리학적 아미노산; 방사선 제어식 또는 초음파 제어식 온/오프 스위치(예컨대, Scott S 등의 문헌[Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5]; 미국 특허 5,612,318; 5,571,797; 5,770,581; 5,817,636; 및 WO1999/025385A1 참조). 일부 구현예에서, 조절 스위치는 예컨대, 미국 특허 7,840,263; US2007/0190028A1에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어되며, 여기서 유전자 발현은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에서 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 활성화하는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 에너지 형태에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 사용될 것이 예상되는 조절 스위치는 예컨대, WO1999060142A2, 미국 특허 5,834,306; 6,218,179; 6,709,858; US2015/0322410; Greco 등의 문헌[(2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368]에 개시된 것들과 같은 저산소증 매개 스위치 또는 스트레스 활성화 스위치를 비롯하여, FROG, TOAD, 및 NRSE 요소, 및, 예컨대, 미국 특허 9,394,526에 개시된 것과 같은 저산소증 반응 요소(HRE), 염증 반응 요소(IRE), 및 전단 응력 활성화된 요소(SSAE)를 포함하는, 조건부 유도성 침묵화 요소이다. 이러한 구현예는 허혈 후 또는 허혈성 조직 및/또는 종양에서 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로부터 이식유전자의 발현을 켜는 데(turn on) 유용하다.
H. 킬 스위치
본 개시의 다른 구현예는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 킬 스위치(kill switch)를 포함하는 dsDNA 분자에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 킬 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포가 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 도입된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 대상체의 시스템으로부터 영구적으로 제거하는 수단으로서의 예정된 세포 사멸을 겪거나 살해되도록 할 수 있다. 당업자는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 본 개시의 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에서의 킬 스위치를 사용하는 것은 대상체가 허용 가능하게 상실할 수 있는 제한된 수의 세포 또는 세포자멸사가 바람직한 세포 유형(예컨대, 암세포)에 대해 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 표적화하는 것과 일반적으로 결합된다는 것을 이해할 것이다. 모든 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 "킬 스위치"는 입력 생존 신호 또는 다른 특정 조건의 부재 하에 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포의 신속하고 강력한 세포 살해를 제공하도록 설계된다. 다른 방식으로 말하면, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 인코딩된 킬 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정 입력 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 킬 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 대상체로부터 제거하거나 인코딩된 이식유전자를 발현하지 않게 하는 것이 바람직한 경우, 생물학적 생화학적 봉쇄 기능을 한다.
따라서, 킬 스위치는 환경 신호를 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물을 포함하는 세포의 조건부 생존과 결합시키는 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물 내의 합성 생물학적 회로이다. 일부 구현예에서, 상이한 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물은 상이한 킬 스위치를 가지도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 모듈형 생물학적 봉쇄 회로(biological containment circuit)인 킬 스위치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물에 사용하기 위해 포함되는 킬 스위치는 WO2017/059245에 개시되어 있는데, 상기 문헌에는 환경 신호가 작제물에서 제2 분자의 활성을 억제하도록(예컨대, 소분자 결합 전사 인자가 사용되어 독소 생산의 억제로 인한 "생존" 상태를 생성하도록) 적어도 2개의 억제 가능한 서열을 상호 억제 배열로 포함하는 "데드맨 킬 스위치"로 지칭되는 스위치가 기재되어 있다. 데드맨 킬 스위치를 포함하는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포에서, 환경 신호가 손실되면, 회로는 "사망(death)" 상태로 영구적으로 전환되고, 이 때부터 독소가 활성화되어 세포를 살해하는 독소를 생산한다. 다른 일 구현예에서, 하이브리드 전사 인자(TF)를 사용하여 세포 생존을 대한 복잡한 환경 요건을 구성하는, "패스코드 회로" 또는 "패스코드 킬 스위치"로서 지칭되는 합성 생물학적 회로가 제공된다. WO2017/059245에 기재된 데드맨 킬 스위치와 패스코드 킬 스위치는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 사용하기에 특이 유용한데, 이는 회로 활성화를 제어하는 환경 조건 및 세포 운명을 제어하는 출력 모듈 둘 다의 관점에서 이들이 모듈식이고 맞춤화가 가능하기 때문이다. 엔도뉴클레아제(예컨대, EcoRI)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 독소를 적절히 선택하면, ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물에 존재하는 패스코드 회로는 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물을 포함하는 숙주 세포를 살해할 뿐만 아니라 이의 유전체 및 동반 플라스미드를 분해하는 데에도 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 예컨대, US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568에 개시된 바와 같은, 당업자에게 알려진 다른 킬 스위치 뿐만 아니라, Jusiak 등의 문헌[Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56]; Kobayashi 등의 문헌[PNAS, 2004; 101; 8419-9]; Marchisio 등의 문헌[Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319]; 및 Reinshagen 등의 문헌[Science Translational Medicine, 2018, 11]에 개시된 킬 스위치도 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 사용되도록 포함된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 효과기 독소 또는 리포터 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 킬 스위치 핵산 작제물을 포함할 수 있으며, 여기서 효과기 독소(예컨대, 사멸 단백질) 또는 리포터 단백질의 발현은 소정의 조건에 의해 조절된다. 예를 들어, 소정의 조건은 예컨대, 외인성 제제와 같은 환경 제제의 존재일 수 있으며, 이러한 제제가 없으면 세포는 효과기 독소(예컨대, 사멸 단백질)를 발현하게 되고 살해된다. 대안적인 구현예에서, 소정의 조건은 예컨대, 2개 이상의 필수 외인성 제제가 공급되는 경우에만 세포가 생존하고, 이 중 하나라도 없으면, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포가 살해되는, 2개 이상의 환경 제제의 존재이다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물(예컨대, 치료적 유전자, 단백질, 또는 펩티드 등)에 의해 발현되는 이식유전자의 생체 내 발현을 효과적으로 종결시키기 위해 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 세포를 파괴하기 위한 킬 스위치를 포함하도록 변형된다. 상세하게는, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 정상적인 생리학적 조건하에 포유류 세포에서는 기능하지 않는 스위치 단백질을 발현하도록 추가로 유전자 조작된다. 이러한 스위치 단백질을 특이적으로 표적화하는 약물 또는 환경 조건이 투여된 경우에만, 스위치 단백질을 발현하는 세포가 파괴되어 치료적 단백질 또는 펩티드의 발현이 종료된다. 예를 들어, HSV-티미딘 키나아제를 발현하는 세포는 간시클로버 및 시토신 탈아미노효소와 같은 약물의 투여 시 살해될 수 있는 것으로 보고되었다. 예를 들어, Dey 및 Evans의 문헌[Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), in Targets in Gene Therapy, edited by You (2011)]; 및 Beltinger 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999)] 참조. 일부 구현예에서, ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물은 DISE(Death Induced by Survival gene Elimination, 생존 유전자 제거에 의해 유도되는 사멸)로서 지칭되는 siRNA 킬 스위치를 포함할 수 있다(Murmann 등의 문헌[Oncotarget. 2017; 8:84643-84658. Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo]).
일부 양태에서, 데드맨 킬 스위치는 세포 성장 환경에서 제제(예컨대, 외인성 제제)의 결여와 같은 소정의 조건에 민감한 세포 반응을 부여하는 생물학적 회로 또는 시스템이다. 이러한 회로 또는 시스템은 소정의 조건에 민감한 데드맨 조절 회로를 형성하는 발현 모듈, 조절 회로를 형성하는 발현 모듈을 포함하는 작제물로서, 상기 작제물은: 제1 억제 단백질 발현 모듈로서, 상기 제1 억제 단백질은 제1 억제 단백질 핵산 결합 요소에 결합하여 상기 제1 억제 단백질 결합 요소를 포함하는 코딩 서열로부터 전사를 억제하고, 상기 제1 억제 단백질의 억제 활성은 제1 외인성 제제에 의한 억제, 소정의 조건을 확립하는 제1 외인성 제제의 존재 또는 부재에 민감한 것인 제1 억제 단백질 발현 모듈;
ii) 제2 억제 단백질 발현 모듈로서, 상기 제2 억제 단백질은 제2 억제 단백질 핵산 결합 요소에 결합하여 상기 제2 억제 단백질 결합 요소를 포함하는 코딩 서열로부터 전사를 억제하고, 상기 제2 억제 단백질은 상기 제1 억제 단백질과 상이한 것인 제2 억제 단백질 발현 모듈; 및
iii) 효과기 발현 모듈로서, 효과기 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 억제 단백질의 발현으로 인해 효과기 발현 모듈로부터 효과기 발현이 억제되도록 상기 제2 억제 단백질에 대한 결합 요소를 포함하는 유전 요소에 작동 가능하게 연결되는 것인 효과기 발현 모듈을 포함하며, 상기 제2 발현 모듈은 제1 억제 단백질 핵산 결합 요소를 포함하고, 상기 제1 억제 단백질 핵산 결합 요소는 상기 제1 억제 단백질에 의해 결합될 때 상기 제2 억제 단백질의 전사를 억제할 수 있고; 제1 외인성 제제의 부재 시, 상기 제1 억제 단백질은 상기 제1 억제 단백질 발현 모듈로부터 생산되어 상기 제2 억제 단백질 발현 모듈로부터의 전사를 억제하고, 상기 제2 억제 단백질에 의한 효과기 발현의 억제가 완화되어 효과기 단백질이 발현되도록 상기 각각의 모듈이 조절 회로를 형성하지만; 상기 제1 외인성 제제의 존재 시, 상기 제1 억제 단백질의 활성이 억제되어 상기 제2 억제 단백질이 발현될 수 있고, 이는 효과기 단백질 발현을 "오프" 상태에서 유지시키고, 효과기 단백질 발현을 "오프" 상태로 유지하기 위해 회로에 의해 상기 제1 외인성 제제가 요구되고, 상기 제1 외인성 제제가 제거되거나 부재하면 상기 효과기 단백질이 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 효과기는 세포 사멸 프로그램을 유도하는 독소 또는 단백질이다. 숙주 세포에 독성이 있는 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 독소는 그것이 발현되는 세포만을 살해한다. 다른 구현예에서, 상기 독소는 동일한 숙주 유기체의 다른 세포를 살해한다. 세포 사멸을 초래할 다수의 생성물 중 임의의 것이 데드맨 킬 스위치에 사용될 수 있다. DNA 복제, 단백질 번역 또는 다른 프로세스를 억제하는 제제, 또는 예컨대, 숙주 세포의 핵산을 분해하는 제제는 특히 유용하다. 회로 활성화 후 숙주 세포를 살해하는 효율적인 메커니즘을 식별하기 위해, 숙주 세포의 DNA 또는 RNA를 직접적으로 손상시키는 여러 독소 유전자를 시험하였다. 엔도뉴클레아제 ecoRI, DNA 자이라아제 억제제 ccdB, 및 리보뉴클레아제형 독소 mazF를 시험하였는데, 이는 이들의 특성이 잘 규명되어 있고, 대장균에 고유하며, 다양한 살해 메커니즘을 제공하기 때문이다. 회로의 완건성을 증가시키고 회로 의존적 세포 사멸의 독립적인 방법을 제공하기 위해, 상기 시스템은 예컨대, 사멸 유전자를 "오프" 상태에서 유지하는 억제 인자를 추가로 방해하는 표적화된 프로테아제 또는 뉴클레아제를 발현하도록 추가로 구성될 수 있다. 생존 신호의 손실 또는 중단 후, 사멸 유전자 억제는 예컨대, 억제 단백질의 활발한 분해 또는 이의 메시지에 의해 훨씬 더 효율적으로 제거된다. 비제한적인 예로서, mf-Lon 프로테아제를 사용하여 LacI도 분해시키고 분해를 위한 필수 단백질도 표적화하였다. mf-Lon 분해 태그 pdt#1은 단백질 산물이 mf-Lon 분해에 특히 민감한 5개의 필수 유전자의 3' 말단에 부착될 수 있고, aTc를 제거한 후 세포 생존력을 측정하였다. 시험된 필수 유전자 표적 중에서, 펩티드글리칸 생합성 유전자 murC는 가장 강력하고 가장 빠른 세포 사멸 표현형을 제공하였다(6시간 이내에 생존율 < 1 x 10-4).
본 명세서에서 사용되는 용어 "소정의 입력(predetermined input)"은 전사 인자 폴리펩티드의 활성에 알려진 방식으로 영향을 미치는 제제 또는 조건을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 제제는 전사 인자 폴리펩티드에 결합하고/결합하거나 전사 인자 폴리펩티드의 형태를 변화시켜 전사 인자 폴리펩티드의 활성을 변경할 수 있다. 미리 결정된 입력의 예는 주어진 숙주 유기체의 생존에 필요하지 않은 (즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로가 없는) 환경 입력 제제를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 소정의 입력을 제공할 수 있는 조건은 예컨대, 온도(예컨대, 하나 이상의 인자의 활성이 온도에 민감한 경우); 광의 존재 또는 부재(주어진 파장 스펙트럼의 광 포함); 및 기체, 염, 금속, 또는 광물의 농도를 포함한다. 환경 입력 제제는 예컨대, 소분자, 생물학적 제제(예컨대, 페로몬, 호르몬, 성장 인자, 대사산물, 영양소 등), 및 이들의 유사체; 화학물질, 환경 부산물, 금속 이온, 및 다른 이러한 분자 또는 제제의 농도; 광 수준; 온도; 기계적 응력 또는 압력; 또는 전류 및 전압과 같은 전기 신호를 포함한다.
일부 구현예에서, 리포터는 본 개시의 모듈 또는 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로에 의해 수신된 신호의 강도 또는 활성을 정량화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 리포터는 다른 단백질 코딩 서열에 프레임 내에서 융합되어 단백질이 세포 또는 유기체 내 어디에 위치하는지를 식별할 수 있다. 루시페라아제는 본 명세서에 기재된 다양한 구현예를 위한, 예컨대, 낮은 수준의 유전자 발현을 측정하기 위한 효과기 단백질로서 사용될 수 있는데, 이는 루시페라아제의 부재 시, 세포에 배경 발광이 거의 없거나 전혀 없는 경향이 있기 때문이다. 다른 구현예에서, 착색된 기질을 생산하는 효소는 분광 광도계를 사용하거나, 플레이트 판독기를 포함하여, 흡광도 측정을 수행할 수 있는 다른 기기를 사용하여 정량화될 수 있다. 루시페라아제와 마찬가지로, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 낮은 수준의 유전자 발현을 측정하는 데 사용될 수 있는데, 이는 이들이 낮은 신호를 증폭시키는 경향이 있기 때문이다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 주어진 독소를 분해하거나 달리 파괴할 수 있는 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 기질를 방취 생성물로 변환하는 방취 효소(odorant enzyme)일 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 소분자 또는 다른 단백질을 인산화하거나 탈인산화하는 효소이거나, 다른 단백질 또는 DNA를 메틸화하거나 탈메틸화하는 효소일 수 있다.
일부 구현예에서, 효과기 단백질은 수용체, 리간드, 또는 용해 단백질일 수 있다. 수용체는 다음 3개의 도메인을 가지는 경향이 있다: 단백질, 펩티드, 또는 소분자와 같은 리간드에 결합하기 위한 세포 외 도메인, 막관통 도메인, 및 인산화와 같은 일종의 신호 전달 이벤트에 빈번하게 참여할 수 있는 세포 내 또는 세포질 도메인. 일부 구현예에서, 수송체, 채널, 또는 펌프 유전자 서열이 효과기 단백질로서 사용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 킬 스위치와 함께 사용하기 위한 효과기 단백질의 비제한적인 예 및 서열은 월드와이드웹 parts.igem.org의 Registry of Standard Biological Parts에서 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 경우에, "조절제 단백질(modulator protein)"은 표적 핵산 서열로부터의 발현을 조절하는 단백질이다. 조절제 단백질은 예컨대, 전사 활성화제 및 억제제를 포함하는 전사 인자, 및 특히 전사 인자에 결합하거나 이를 변형시키고 그 활성에 영향을 미치는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절제 단백질은 예컨대, 표적 핵산 서열로부터의 발현 조절에 관여하는 단백질 인자를 분해하는 프로테아제를 포함한다. 바람직한 조절제 단백질은 예컨대, DNA 결합 및 입력 제제 결합 또는 반응성 요소 또는 도메인이 분리 가능하고 전달 가능한 모듈형 단백질을 포함하므로, 예를 들어, 제1 조절제 단백질의 DNA 결합 도메인을 제2의 입력 제제 반응성 도메인에 융합하면, 제1 단백질에 의해 인식되는 DNA 서열에 결합하지만, 제2 단백질이 정상적으로 반응하는 입력 제제에 대해서는 여전히 민감한 새로운 단백질이 생성된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "조절제 폴리펩티드" 및 보다 구체적으로 "억제제 폴리펩티드"는 명시된 폴리펩티드에 추가하여, 예컨대, 상이한 또는 변이체 입력 제제에 반응하는 "LacI(억제제) 폴리펩티드" 또는 이러한 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 따라서, LacI 폴리펩티드의 경우, 락토오스 또는 IPTG 이외의 제제에 결합하는 LacI 돌연변이체 또는 변이체가 포함된다. 광범위한 이러한 제제가 당업계에 알려져 있다.
표 4. 예시적인 조절 스위치. b효과기에 의한 온 전환 가능성; 오프 상태를 부여하는 이펙터를 제거하는 것 이외의 것. c이펙터에 의한 오프 전환 가능성; 온 상태를 부여하는 효과기를 제거하는 것 이외의 것, d스위치를 온 또는 오프 상태에서 안정시키는 리간드 또는 다른 물리적 자극(예컨대, 온도, 전자기선, 전기), eKis 등의 문헌[J R Soc Interface. 12:20141000 (2015)]에 인용된 기준 번호를 지칭하며, 상기 문헌에 인용된 논문과 참고문헌은 모두 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
표 4.
IV. 합성 생산 방법
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 부분적으로 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥(ssDNA) 분자를 생성하는 데 유용한 합성 및 무세포 생산 프로세스 및 방법의 발견에 기초한다. 일부 구현예에 따르면, ss DNA 분자의 생산 방법에서, PS 결합은 올리고뉴클레오티드의 인산염 백본에서 황 원자를 비가교 산소로 치환한다. 유리하게는, 이러한 변형은 핵산을 안정화시키고, 뉴클레오티드 간 결합에 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 부여한다.
본 개시는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명세서에 기재된 이중 가닥 폐쇄 말단 DNA(ceDNA)의 합성 생산 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시의 방법 및/또는 생산 단계는 전체적으로 무세포 환경에서 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 본 개시의 방법 및/또는 생산 단계는 부분적으로 무세포 환경에서 수행된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물(예컨대, 선형 이중 가닥 ceDNA)은 시험관 내에서 합성적으로 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물(예컨대, 이중 가닥 ceDNA)은 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다.
추가적인 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내에서 합성적으로 생산된다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ssDNA 분자는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 작제물로부터 합성적으로 생산된다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자; 제1 ITR; 및 선택적인 제2 ITR을 포함하는 이중 가닥 이식유전자 카세트를 포함한다. 추가적인 다른 구현예에 따르면, 상기 dsDNA 작제물은 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자; 제1 ITR; 및 제2 ITR을 포함하는 이중 가닥 이식유전자 카세트를 포함한다.
일 양태에 따르면, 본 개시는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 작제물로부터 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)를 합성적으로 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 하나 이상의 니킹 부위에서 dsDNA 작제물의 단일 가닥 중 하나를 니킹하는 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제와 dsDNA 작제물을 접촉시키는 단계; 및 b) dsDNA 작제물의 니킹된 가닥으로부터 뉴클레오티드를 제거할 수 있는 엑소뉴클레아제와 dsDNA 작제물을 접촉시켜 ssDNA 분자를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 a)와 단계 b) 사이의 정제 단계를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 단계 a)와 단계 b) 사이의 정제 단계를 포함한다. 본 개시의 장점은 상기 ssDNA 분자를 합성적으로 제조하는 방법이 단계 a) 이후의 정제 단계를 포함하지 않으므로, DNA의 손실을 줄이거나 최소화할 수 있다는 것이다.
일부 구현예에 따르면, 단계 a)는 상기 dsDNA 작제물을 단일 니킹 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 단일 니킹 엔도뉴클레아제는 dsDNA 작제물의 단일 가닥 중 하나에 단일 닉을 생성한다. 추가적인 다른 구현예에서, 상기 단일 니킹 엔도뉴클레아제는 Nb.BbvCI 또는 이의 이소스키조머이거나, 상기 단일 니킹 엔도뉴클레아제는 Nb.BtsI 또는 이의 이소스키조머이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 엑소뉴클레아제는 하나 이상의 닉 부위에서 시작하여 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드에서 끝나는 dsDNA 작제물의 니킹된 가닥을 제거할 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 T7 엑소뉴클레아제, 람다 엑소뉴클레아제, T5 엑소뉴클레아제, 및 엑소뉴클레아제 V로부터 선택될 수 있으나 이로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에 따르면, 상기 엑소뉴클레아제는 T7 엑소뉴클레아제이다.
일부 구현예에 따르면, 단계 a) 및 단계 b)는 단일 반응 용기에서 동시에 또는 순차적으로 일어난다. 일부 구현예에 따르면, T7 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우, T7 엑소뉴클레아제의 짧은 분해 반응으로 인해 단계 a)와 단계 b)는 순차적으로 수행된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제는 Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI 및 Nt.CviPII, 및 전술한 것 중 어느 하나의 이소스키조머로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제는 Nb.BbvCI 또는 이의 이소스키조머를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 니킹 엔도뉴클레아제는 Nb.BtsI 또는 이의 이소스키조머를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 닉 부위는 말단 분해 부위(trs)의 약 0 내지 약 20개 뉴클레오티드 하류 영역, 예컨대, 말단 분해 부위(trs)의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 하류 영역, 또는 예컨대, 말단 분해 부위(trs)의 약 0 내지 15개, 약 0 내지 10개, 약 0 내지 5개, 약 5 내지 15개, 약 10 내지 20개, 약 15 내지 20개, 약 10 내지 20개, 약 5 내지 20개 뉴클레오티드 하류 영역에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, 닉 부위는 하나만 존재한다.
다른 양태에 따르면, 본 개시는 본 명세서에 기재된 바와 같은 dsDNA 작제물(예컨대, ds 폐쇄 말단 DNA)를 합성적으로 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) dsDNA 주형을 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 주형은 상기 적어도 하나의 이중 가닥 이식유전자를 포함하는 이중 가닥 이식유전자 카세트; 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트의 상류 영역에 있는 제1 비-회문 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및 상응하는 제1 절단 부위; 및 상기 이중 가닥 이식유전자 카세트의 하류 영역에 있는 제2 비-회문 제한 엔도뉴클레아제 인식 및 상응하는 제2 절단 부위를 포함하고; 상기 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제는 상기 제1 및 제2 절단 부위에서 상기 주형을 절단하여 5' 및 3' 말단에 단일 가닥 오버행이 있는 삽입물을 방출할 수 있는 것인 단계; 및 b) 상기 삽입물의 5' 및 3' 말단을 제1 역위 말단 반복(ITR) 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 ITR 올리고뉴클레오티드에 연결하여 상기 dsDNA 작제물을 형성하는 단계를 포함한다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 세포 배양 환경(예컨대, Sf9 세포주와 같은 곤충 세포주, 효모 세포, 또는 HEK 293과 같은 포유류 세포주)에서 생산된 DNA 벡터와 비교했을 때, 세포, 조직, 또는 대상체에서 이식유전자를 발현하는데 더 안전하게 사용될 수 있다는 점에서 다른 벡터에 비해 유리하다. 즉, 바람직하지 않은 부작용은 이러한 무세포 방법에 의해 선형 벡터를 생성함으로써 잠재적으로 최소화될 수 있는데, 이는 생성된 벡터에 세균 또는 곤충 세포 오염물이 없기 때문이다. 상기 합성 생산 방법은 원하는 벡터의 순도를 더 높게 만들 수도 있다. 상기 합성 생산 방법은 또한, 이러한 벡터에 대한 전통적인 세포 기반 생산 방법보다 더 효율적이고/이거나 비용면에서 더 효과적일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성된 벡터는 임의의 원하는 이식유전자, 예컨대, 주어진 질병을 치료하거나 치유하기 위한 이식유전자를 발현할 수 있다. 당업자는 종래의 재조합 벡터를 이용한 종래의 유전자 요법 방법에 사용되는 임의의 이식유전자가 특히 이식유전자 삽입체의 크기 용량의 제한 없이 예컨대, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)에 의해 발현되도록 구성될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
본 개시에서, 본 개시의 제조 프로세스는 필요한 경우 잠재적으로 완전한 무세포 환경에서 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 출발 물질에 따라, 일부 DNA 성분은 세포에서 원래 제조된 뉴클레오티드 단편(예컨대, 플라스미드-ceDNA, 곤충 세포로부터 생산된 AAV 벡터)으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 비바이러스 ssDNA는, ITR의 스템에 니킹 엔도뉴클레아제 결합 부위의 설계된 서열을 가지며 하나 또는 두 ITR에서 PS 결합을 형성하는, 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함하는 세포 복제에 의해 생산된 기존의 이중 가닥 ceDNA 벡터(예컨대, 곤충 또는 포유류 세포주)에 원하는 위치 및 길이로 닉을 도입함으로써 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)는 PS 결합이 있는 이중 가닥 ceDNA로부터 무세포 방식으로 합성된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 포스포로티오에이트 결합을 첨가한 후의 결과 중 하나는 엑소뉴클레아제가 ssDNA 생산을 위해 기능하는 위치의 정확성을 보장하기 위한 ITR의 안정화이다.
당업자는 상기 합성 생산 방법을 위한 하나 이상의 효소 또는 올리고뉴클레오티드 성분 중 하나 이상이 세포로부터 생산되어 정제된 형태로 본 개시의 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 합성 생산 방법은 무세포 방법이지만, 제한 효소 및/또는 리가아제 효소는 세포로부터 생산될 수 있다.
일 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 결찰 유능 단백질은 세포, 예컨대, 세균 세포에서 발현 벡터로부터 발현되거나 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 또는 리가아제 효소 중 하나 이상을 발현하는 발현 벡터를 포함하는 세균 세포와 같은 세포가 존재할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 주로 본 명세서에 개시된 ssDNA 분자를 생성하기 위한 무세포 합성 방법에 관한 것이지만, 일부 구현예에서는 세포, 예컨대, 곤충 세포가 아닌 세균 세포가 존재하고 상기 방법에 필요한 효소 중 하나 이상을 발현하는 데 사용될 수 있는 합성 생산 방법도 포함된다. 이러한 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 결찰 유능 단백질을 발현하는 세포는 곤충 세포가 아니다. 세포가 존재하고 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 또는 결찰 유능 단백질을 발현하는 모든 구현예에서, 세포는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)를 복제하지 않는다. 달리 말하면, 세포의 세포 내 기구는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)를 복제하지 않거나 이의 복제에 관여하지 않는다.
A. 단리 및 정제
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터) 및 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)을 생산하고 단리하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 본 명세서에 기재된 합성 방법에 의해 생산된 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)은 마지막 결창 반응 후 적절한 시점에 수확되거나 수집될 수 있고, 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 최적화될 수 있다. ssDNA 분자 및 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)는 DNA의 정제를 위해 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 일 구현예에서, ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)은 DNA 분자로서 정제된다. 일반적으로, 당업계에 알려진 임의의 핵산 정제 방법뿐만 아니라 시판되는 DNA 추출 키트가 채택될 수 있다.
정제는 반응 혼합물을 크로마토그래피로 분리함으로써 구현될 수 있다. 비제한적인 일례로서, 상기 프로세스는 핵산이 담긴 이온 교환 컬럼(예컨대, SARTOBIND Q®)에 반응 혼합물을 로딩한 다음, (예컨대, 1.2 M NaCl 용액으로) 용출하고, 겔 여과 컬럼(예컨대, 6개의 고속 유동 GE)을 이용해 추가로 크로마토그래피 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 그런 다음, DNA 벡터를 예컨대, 침전에 의해 회수한다.
상기 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물(예컨대, ds ceDNA)의 존재는 DNA 벡터에서 단일 인식 부위가 있는 제한 효소로 벡터 DNA를 분해하고, 겔 전기영동을 사용하여 분해된 DNA 물질과 분해되지 않은 DNA 물질을 모두 분석하여, 당업계에 알려진 선형 비연속 단일 가닥 DNA와 비교했을 때 선형 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 쉽게 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 다양한 적절한 방법에 의해 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포에 전달될 수 있다. 벡터는 단독으로 적용되거나 주입될 수 있다. 벡터는 형질주입 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 세포에 전달될 수 있다. 또는, 벡터는 DNA가 세포 내로 진입하는 것을 용이하게 하는 형질주입 시약 또는 다른 물리적 수단, 예컨대, 리포솜, 알코올, 폴리리신 풍부 화합물, 아르기닌 풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주입 등을 사용하여 전달될 수 있다.
V. 유전자 편집 용도
일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자, 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA); 및 적어도 하나의 부위 특이적 뉴클레아제 또는 상기 적어도 하나의 부위 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 전령 RNA(mRNA)를 포함하는 유전자 편집 시스템을 제공한다.
A. 핵산 유도 엔도뉴클레아제
본 발명의 조성물 및 방법에는 유전자 편집을 용이하게 하기 위해 다양한 유형의 핵산 유도 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 핵산 유도 엔도뉴클레아제의 예시적이고 비제한적인 유형에는 RNA 유도 엔도뉴클레아제, DNA 유도 엔도뉴클레아제, 및 단일 염기 편집기가 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 RNA 유도 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA 유도 엔도뉴클레아제"는 선택된 표적 DNA 서열과 상보적인 영역을 포함하는 RNA 분자와 복합체를 형성함으로써, 상기 RNA 분자가 선택된 서열에 결합하여 상기 선택된 표적 DNA 서열에 엔도뉴클레아제 활성을 유도하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다.
일 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제는 CRISPR 효소이다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제는 니카아제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제는 표적 서열의 위치, 예컨대, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제는 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 또는 500개 이상의 염기쌍 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 유도한다. 다른 구현예에서, 상기 니카아제 활성은 예컨대, 서열 제약 조건을 완화하여 HDR 주형이 표적 유전자의 유전체 서열과의 HDR 상호작용을 위해 노출되도록 ceDNA 벡터 자체의 하나 이상의 서열에 대해 유도된다.
특정 구현예에서, 상기 니카아제는 원하는 핵산 서열(예컨대, 상기 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물의 하나 이상의 영역)에서 적어도 1개 부위, 적어도 2개 부위, 적어도 3개 부위, 적어도 4개 부위, 적어도 5개 부위, 적어도 6개 부위, 적어도 7개 부위, 적어도 8개 부위, 적어도 9개 부위, 적어도 10개 부위 이상을 절단하는 것으로 고려된다. 다른 구현예에서, 상기 니카아제는 트랜스 니킹을 통해 1개 및/또는 2개의 부위를 절단하는 것으로 고려된다. 트랜스 니킹은 HDR에 의한 유전체 편집을 향상시킬 수 있으며, 이는 충실도가 높고 오류가 적게 발생시켜 원하지 않는 표적 외 효과를 줄여준다.
일부 구현예에서, 발현 작제물 또는 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 RNA 유도 엔도뉴클레아제를 인코딩하여, 상기 돌연변이된 엔도뉴클레아제가 표적 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드의 한 가닥을 절단하는 능력을 결여시킨다.
일부 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 상기 진핵 세포는 포유동물과 같은 특정 유기체로부터 유래될 수 있다. 포유동물의 비제한적인 예는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함할 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 50개 이상의 코돈)을 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 대상 숙주 세포에서 발현이 향상되도록 핵산 서열을 변형하는 프로세스를 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 RNA 유도 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예컨대, 엔도뉴클레아제 외에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. RNA 유도 엔도뉴클레아제 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열 및 선택적으로 임의의 두 개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. RNA 유도 엔도뉴클레아제에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 다음 활성 중 하나 이상을 가진 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 정제 태그, 형광 단백질 및 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 키틴 결합 단백질(CBP), 말토오스 결합 단백질(MBP), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, Glu-Glu, HSV, KT3, S, SI, T7, 비오틴 카복실 운반 단백질(BCCP), 카모둘린, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT) 베타 갈락토시다아제, 베타 글루쿠로니다아제, 루시페라아제, 녹색 형광 단백질(예컨대, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, 단량체 Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(예컨대, YFP, EYFP, Citrine, Venus yPet, PhiYFP, ZsYellow1), 시안 형광 단백질(예컨대, ECFP, Cerulean, CyPet AmCyan1, Midoriishi-Cyan) 적색 형광 단백질(예컨대, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 주황색 형광 단백질(예컨대, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 단량체 Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질. RNA 유도 엔도뉴클레아제는 DNA 분자에 결합하거나, 말토오스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합, GAL4 DNA 결합 도메인 융합, 및 단순포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합 등을 포함하도 이로 제한되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 태그된 엔도뉴클레아제는 표적 서열의 위치를 식별하는 데 사용된다.
본 명세서에서는 적어도 2개(예컨대, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 12개, 또는 적어도 15개 이상)의 상이한 Cas 효소가 실질적으로 동시에 투여되거나 세포와 접촉하는 것으로 고려된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 조합하여 사용하기 위해 이중 가닥 절단 유도 Cas 효소, Cas 니카아제, 촉매 비활성 Cas 효소(예컨대, dCas9), 변형된 Cas 효소, 절단된 Cas9 등의 임의의 조합이 고려된다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 유도 엔도뉴클레아제는 DNA 유도 엔도뉴클레아제이다. 예를 들어, Varshney and Burgess Genome Biol. 17:187(2016) 참조. 일 구현예에서, DNA 복구 및/또는 복제에 관여하는 효소는 엔도뉴클레아제에 융합되어 DNA 유도 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 비제한적인 하나의 예는 플랩 엔도뉴클레아제 1(FEN-1)을 Fok1 엔도뉴클레아제에 융합하는 것이다(Xu 등의 문헌 [Genome Biol. 17:186 (2016)]). 다른 구현예에서, 자연 발생 DNA 유도 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 이러한 자연 발생 뉴클레아제의 비제한적인 예는 아르고노트(Argonaute) 단백질 계열의 원핵 엔도뉴클레아제이다(Kropocheva 등의 문헌 [FEBS Open Bio. 8(S1): P01-074 (2018)]). 일부 구현예에서, 상기 핵산 유도 엔도뉴클레아제는 DNA 표적화 모듈 및 단일 유형의 뉴클레오티드 염기를 변형시킬 수 있는 촉매 도메인으로 구성된 키메라 단백질인 "단일 염기 편집기"이다(Rusk, N의 문헌 [Nature Methods 15:763 (2018)]; Eid 등의 문헌 [Biochem J. 475(11): 1955-64 (2018)]). 이러한 단일 염기 에디터는 표적 DNA에서 DNA 염기의 편집에 영향을 미치는 이중 가닥 절단을 생성하지 않으므로, 삽입 및 결실(예컨대, 인델)의 생성이 제한되어 편집 프로세스의 충실도가 개선된다. 다양한 유형의 단일 염기 편집기가 알려져 있다. 예를 들어, 시티딘 탈아미노효소(시토신의 우라실로의 전환을 촉매하는 효소)는 APOBEC-dCas9와 같은 뉴클레아제에 결합될 수 있으며, 여기서 APOBEC은 시티딘 탈아미노효소 기능에 기여하고 dCas9에 의해 유도되어 특정 시티딘을 우라실로 탈아미화한다. 그 결과 발생하는 U-G 미스매치는 복구 메커니즘을 통해 해결되고, C-T 점 돌연변이로 번역되는 U-A 염기쌍을 형성한다(Komor 등의 문헌 [Nature 533: 420-424 (2016)]; Shimatani 등의 문헌 [Nat. Biotechnol. 35: 441-443 (2017)]). 아데닌 탈아미노효소 기반 DNA 단일 염기 편집기가 조작되었다. 이들은 아데노신을 탈아민화하여 이노신을 형성하며, 이는 시티딘과 염기쌍을 이룰 수 있고 구아닌으로 교정되어 A-T 쌍이 G-C 쌍으로 변환될 수 있다. 이러한 편집기의 예는 TadA, ABE5.3, ABE7.8, ABE7.9, 및 ABE7.10을 포함한다(Gaudelli 등의 문헌 [Nature 551: 464-471 (2017)]).
B. 가이드 RNA(gRNA)
일반적으로 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하여 선택된 유전체 표적 서열에 대한 RNA 유도 엔도뉴클레아제 복합체의 서열 특이적 표적화를 유도할 만큼 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 가진 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA가 결합하여 예컨대, Cas 단백질이 리보핵단백질(RNP), 예컨대, CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 가이드 RNA(gRNA) 서열은 gRNA 서열을 유전체 내의 원하는 부위로 유도하는 표적 서열을 포함하며, 이는 가이드 서열과 RNA 유도 엔도뉴클레아제의 결합을 허용하는 crRNA 및/또는 tracrRNA 서열과 융합된다. 일부 구현예에서, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬했을 때 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적어도 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform(예컨대, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, San Diego, Calif.), SOAP, 및 Maq에 기반한 알고리즘과 같은 서열 정렬을 위한 임의의 적절한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드이다. 본 명세서에서, 가이드 RNA의 표적 서열과 표적 핵산 분자의 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 미스매치를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열은 회문 서열을 포함하며, 예컨대, 자가 표적 서열은 회문 구조를 포함한다. 가이드 RNA의 표적 서열은 일반적으로 길이가 19 내지 21개 염기쌍이며, 전체 가이드 RNA(표적 서열 + 헤어핀)를 Cas9와 같은 Cas에 결합하는 헤어핀 바로 앞에 위치한다. 회문 서열이 가이드 RNA의 자가 표적 서열로서 사용되는 경우, 역위 반복 요소는 길이가 예컨대, 9, 10, 11, 12개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 가이드 RNA의 표적 서열이 대부분 19 내지 21 bp인 경우, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드로 구성된 회문 역반복 요소는 바람직한 길이의 표적 서열을 제공한다. 그런 다음, Cas9 가이드 RNA 헤어핀 복합체는 임의의 뉴클레오티드 서열(DNA 또는 RNA), 예컨대, 19 내지 21 염기쌍 서열과 매칭하고 뒤에 "PAM" 서열, 예컨대, NGG 또는 NGA, 또는 다른 PAM이 이어지는 DNA 서열을 인식하고 절단할 수 있다.
RNA 유도 엔도뉴클레아제 복합체의 표적 서열에 대한 서열 특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 분석법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 유도 엔도뉴클레아제 복합체를 형성하기에 충분한 RNA 유도 엔도뉴클레아제 시스템의 구성요소는 예컨대, RNA 유도 엔도뉴클레아제 서열의 구성요소를 인코딩하는 벡터를 이용한 형질주입에 의해 상응하는 표적 서열을 가진 숙주 세포에 제공될 수 있으며, 이어서 Surveyor 분석(TRANSGENOMIC™, New Haven, CT)과 같은 방법을 통해 표적 서열 내의 우선적 절단을 평가할 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험할 가이드 서열 및 상기 시험 가이드 서열과 상이한 대조 가이드 서열을 포함하는 RNA 유도 엔도뉴클레아제 복합체의 구성요소를 제공하고, 표적 서열에서의 시험 및 대조 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험 튜브에서 평가할 수 있다. 당업자는 gRNA 서열을 시험하는 데 다른 분석법이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표적 서열은 세포 유전체 내의 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 자가 클로닝 플라스미드에서 제1 가이드 RNA를 인코딩하는 서열이다. 일반적으로, 유전체 내의 표적 서열은 RNA 유도 엔도뉴클레아제의 결합을 위한 프로토스페이서 인접(PAM) 서열을 포함한다. 당업자는 상기 PAM 서열 및 RNA 유도 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제와 표적 서열의 적절한 결합이 가능하도록 동일한 (세균성) 종에서 선택되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, CAS9의 PAM 서열은 cpF1의 PAM 서열과 상이하다. 설계는 적절한 PAM 서열을 기반으로 한다. 가이드 RNA의 분해를 방지하기 위해, 상기 가이드 RNA의 서열은 PAM 서열을 포함해서는 안 된다. 일부 구현예에서, 상기 가이드 RNA의 표적 서열의 길이는 12개 뉴클레오티드이고; 다른 구현예에서, 가이드 RNA의 표적 서열의 길이는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 또는 40개 뉴클레오티드이다. 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 어느 하나의 가닥에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입 또는 결실을 포함하도록 상기 유전체를 변형하는 경우, 상기 gRNA는 단백질 코딩 영역의 N 말단에 더 가깝게 표적화될 수 있다.
당업자는 RNA 유도 엔도뉴클레아제에 의한 표적화 절단의 목적상 유전체에서 두 번 이상 발생하는 표적 서열보다 유전체에서 고유한 표적 서열이 선호된는 것을 이해할 것이다. 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 가이드 RNA의 비표적 효과를 예측하고 최소화할 수 있다(예컨대, Naito 등의 "CRISPRdirect: 비표적 부위가 감소된 CRISPR/Cas 가이드 RNA를 설계하기 위한 소프트웨어" Bioinformatics(2014), epub; Heigwer, F. 등의 "E-CRISP: 고속 CRISPR 표적 부위 식별" Nat. Methods 11, 122-123(2014); Bae 등의 "Cas-OFFinder: Cas9 RNA 유도 엔도뉴클레아제의 잠재적 비표적 부위를 검색하는 빠르고 다양한 알고리즘" Bioinformatics 30(10):1473-1475(2014); Aach 등의 "CasFinder: 유전체에서 특정 Cas9 표적을 식별하기 위한 유연한 알고리즘" BioRxiv (2014) 등 참조).
S. 파이오게네스(S. pyogenes) Cas9의 경우, 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG 형태의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)는 상기 유전체 내에서 한 번만 존재한다. 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG 형태의 S. 파이오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXGG(서열번호 593)(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)는 상기 유전체 내에서 한 번만 존재한다. S.써모필루스(S. thermophilus) CRISPR1 Cas9의 경우, 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW 형태의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 상기 유전체 내에서 단 한 번만 존재한다. 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNXXAGAAW 형태의 S.써모필루스 CRISPR 1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 상기 유전체 내에서 한 번만 존재한다. S. 파이오게네스 Cas9의 경우, 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG 형태의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)는 상기 유전체 내에서 한 번만 존재한다. 유전체 내의 고유 표적 서열은 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG 형태의 S. 파이오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T, 또는 C이고; X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)는 상기 유전체 내에서 한 번만 존재한다. 이들 각각의 서열에서, "M"은 A, G, T, 또는 C일 수 있으며, 서열을 고유한 것으로 식별하는 데 고려할 필요는 없다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "crRNA/tracrRNA 융합 서열"은 고유한 표적 서열에 융합되어 가이드 RNA 및 RNA 유도 엔도뉴클레아제를 포함하는 복합체의 형성을 허용하는 기능을 하는 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 원핵생물에서 CRISPR RNA(crRNA) 서열 다음에 모델링될 수 있으며, 이는 (i) 본 명세서에 기재된 표적 서열에 상응하는 "프로토스페이서"라는 가변 서열, 및 (ii) CRISPR 반복을 포함한다. 유사하게, 상기 융합의 tracrRNA("전사촉진 CRISPR RNA") 부분은 상기 엔도뉴클레아제 복합체의 형성을 허용하기 위해 원핵생물의 tracrRNA 서열과 유사한 이차 구조(예컨대, 헤어핀)를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 융합은 (1) 상응하는 tracrRNA 서열을 포함하는 세포에서 tracrRNA 서열이 측부에 위치하는 가이드 서열의 절제; 및 (2) 표적 서열에서 엔도뉴클레아제 복합체의 형성 중 하나 이상을 촉진할 수 있을 만큼 tracrRNA 서열과 충분한 상보성을 가지며, 상기 복합체는 tracrRNA 서열에 혼성화된 crRNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 상보성의 정도는 두 개의 서열 중 더 짧은 것의 길이를 따라 crRNA 서열과 tracrRNA 서열이 최적 정렬되는 것을 기준으로 한다. 최적의 정렬은 임의의 적절한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있으며, tracrRNA 서열 또는 crRNA 서열 내의 자기 상보성과 같은 이차 구조를 추가로 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 최적으로 정렬되었을 때 두 개 중 더 짧은 길이를 따라 tracrRNA 서열과 crRNA 서열 간의 상보성 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 tracrRNA 서열은 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 이상의 뉴클레오티드(예컨대, 70 내지 80, 70 내지 75, 75 내지 80개 뉴클레오티드)이다. 일 구현예에서, 상기 crRNA는 길이가 60개 미만, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 또는 20개 미만의 뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 상기 crRNA는 길이가 30 내지 50개 뉴클레오티드이고; 다른 구현예에서, 상기 crRNA는 길이가 30 내지 50개, 35 내지 50개, 40 내지 50개, 40 내지 45개, 45 내지 50개, 또는 50 내지 55개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열은 단일 전사체 내에 포함되어 있어 둘 사이의 혼성화는 헤어핀과 같은 이차 구조를 가진 전사체를 생성한다. 일부 구현예에서, 헤어핀 구조에 사용되는 루프 형성 서열은 네 개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 서열 GAAA이다. 그러나, 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 사용될 수 있으며, 대체 서열도 사용될 수 있다. 상기 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드 삼중체(예컨대, AAA), 및 추가 뉴클레오티드(예컨대, C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예에는 CAAA 및 AAAG가 포함된다. 일 구현예에서, 상기 전사체 또는 전사된 gRNA 서열은 적어도 하나의 헤어핀을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 전사체 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 두 개 이상의 헤어핀을 가진다. 다른 구현예에서, 상기 전사체는 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 헤어핀을 가진다. 추가적인 구현예에서, 상기 전사체는 최대 다섯 개의 헤어핀을 가진다. 일부 구현예에서, 상기 단일 전사체는 전사 종결 서열, 예컨대, 폴리T 서열, 예컨대, 여섯 개의 T 뉴클레오티드를 더 포함한다. 가이드 서열, crRNA 서열, 및 tracr 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 다음과 같으며(5'에서 3' 방향으로 열거됨), 여기서 "N"은 가이드 서열의 염기를 나타내고, 소문자의 제1 블록은 crRNA 서열을 나타내고, 소문자의 제2 블록은 tracr 서열을 나타내며, 최종 폴리T 서열은 전사 종결자를 나타낸다: (i) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT); (ii) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAthcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (iii) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (iv) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (v) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtTTTTTTT; 및 (vi) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT. 일부 구현예에서, 서열 (i) 내지 (iii)은 S.써모필루스 CRISPR1의 Cas9와 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 서열 (iv) 내지 (vi)는 S. 파이오게네스로부터의 Cas9와 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, tracrRNA 서열은 crRNA 서열을 포함하는 전사체와 별개의 전사체이다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 두 개의 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 본 명세서에서는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 지칭된다. 일부 구현예에서, 상기 dgRNA는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자, 및 tracrRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 RNA 분자는 crRNA의 플래그폴과 tracrRNA 사이의 염기쌍 형성을 통해 RNA 이중체를 형성할 수 있다. dgRNA를 사용할 때, 상기 플래그폴은 길이에 대한 상한이 있을 필요가 없다.
다른 구현예에서, 가이드 RNA는 단일 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 본 명세서에서는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 지칭된다. 일부 구현예에서, 상기 sgRNA는 tracrRNA에 공유 결합된 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA 및 tracrRNA는 링커를 통해 공유 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 sgRNA는 crRNA의 플래그폴과 tracrRNA 사이의 염기쌍 형성을 통해 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가이드 RNA는 길이가 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개 이상의 뉴클레오티드(예컨대, 길이가 75 내지 120개, 75 내지 110개, 75 내지 100개, 75 내지 90개, 75 내지 80개, 80 내지 120개, 80 내지 110개, 80 내지 100개, 80 내지 90개, 85 내지 120개, 85 내지 110개, 85 내지 100개, 85 내지 90개, 90 내지 120개, 90 내지 110개, 90 내지 100개, 100 내지 120개, 100 내지 120개 뉴클레오티드)이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 적어도 1개의 gRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 gRNA, 적어도 2개의 gRNA, 적어도 3개의 gRNA, 적어도 4개의 gRNA, 적어도 5개의 gRNA, 적어도 6개의 gRNA, 적어도 7개의 gRNA, 적어도 8개의 gRNA, 적어도 9개의 gRNA, 적어도 10개의 gRNA, 적어도 11 gRNA, 적어도 12개의 gRNA, 적어도 13개의 gRNA, 적어도 14개의 gRNA, 적어도 15개의 gRNA, 적어도 16개의 gRNA, 적어도 17개의 gRNA, 적어도 18개의 gRNA, 적어도 19개의 gRNA, 적어도 20개의 gRNA, 적어도 25개의 gRNA, 적어도 30개의 gRNA, 적어도 35개의 gRNA, 적어도 40개의 gRNA, 적어도 45개의 gRNA, 또는 적어도 50개의 gRNA를 인코딩할 수 있다. 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 1개의 gRNA 내지 50개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 45개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 40개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 35개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 30개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 25개의 상이한 gRNA, 1개의 gRNA 내지 20개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 16개의 gRNA, 1개의 gRNA 내지 8개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 50개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 45개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 40개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 35개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 30개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 25개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 20개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 16개의 상이한 gRNA, 4개의 상이한 gRNA 내지 8개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 50개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 45개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 40개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 35개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 30개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 25개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 20개의 상이한 gRNA, 8개의 상이한 gRNA 내지 16개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 50개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 45개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 40개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 35개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 30개의 상이한 gRNA, 16개의 상이한 gRNA 내지 25개의 상이한 gRNA, 또는 16개의 상이한 gRNA 내지 20개의 상이한 gRNA를 인코딩할 수 있다. 상이한 gRNA를 인코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상이한 gRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 동일한 프로모터일 수 있다. 상이한 gRNA에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 상이한 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 항시성 프로모터, 유도성 프로모터, 억제성 프로모터, 또는 조절 가능 프로모터일 수 있다.
일부 실험에서, 상기 가이드 RNA는 녹인, 또는 녹아웃 결실, 또는 결함 유전자의 교정에 성공적인 알려진 ZFN 서열 표적 영역을 표적으로 한다. 알려진 ZFN 표적 영역에 결합하는 다수의 sgRNA 서열이 설계되었고, 이는 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개 제2015/0056705호의 표 1 내지 2에 기재되어 있으며, 예를 들어 인간 베타글로빈, 인간, BCLIIA, 인간 KLF1, 인간 CCR5, 인간 CXCR4, PPP1R12C, 마우스 및 인간 HPRT, 인간 알부민, 인간 인자 IX, 인간 인자 VIII, 인간 LRRK2, 인간 Htt, 인간 RH, CFTR, TRAC, TRBC, 인간 PD1, 인간 CTLA-4, HLA c11, HLA A2, HLA A3, HLA B, HLA C, HLA c1. II DBp2. DRA, Tap 1 및 2. 타파신, DMD, RFX5 등에 대한 gRNA 서열을 포함한다.
변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA 또는 mRNA에 존재할 수 있다. 가이드 RNA 또는 DNA 엔도뉴클레아제(예컨대, RNA 유도 뉴클레아제)를 인코딩하는 mRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; 이러한 mRNA는 표준 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 이에 추가하여 사용되는 하나 이상의 비천연 및/또는 자연 발생 성분 또는 구성이 있음을 설명하기 위해 "변형된"으로 불린다. 일부 구현예에서, 변형된 RNA는 본 명세서에서 "변형된"으로 불리는 비표준 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드로 합성된다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 백본 연결의 비연결 인산 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 인산 산소 중 하나 이상의 변경, 예컨대, 치환(예시적인 백본 변형); (ii) 리보스 당의 구성요소, 예컨대, 상기 리보스 당의 2' 하이드록실의 변경, 예컨대, 치환(예시적인 당 변형); (iii) 인산염 모이어티를 "탈포스포" 링커로 전체적으로 치환(예시적인 백본 변형); (iv) 자연 발생 핵염기를 비표준 핵염기 등으로 변형 또는 치환(예시적인 염기 변형); (v) 리보오스-인산 백본의 치환 또는 변형(예시적인 백본 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예컨대, 말단 인산기의 제거, 변형 또는 치환 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 치환(예시적인 당 변형). 변형되지 않은 핵산은 예컨대, 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 인산디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 가이드 RNA는 예컨대, 뉴클레아제에 대한 안정성을 얻기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 mRNA는 예컨대, 뉴클레아제에 대한 안정성을 얻기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 변형은 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 변형은 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
변형된 인산기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 인산염, 보라노 인산염 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 변형되지 않은 인산기 내의 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 비가교 산소 중 하나를 상기 원자 또는 원자군 중 하나로 치환하면 상기 인 원자가 키랄성을 가질 수 있다. 입체이성질체형성 인 원자는 "R" 구성(본 명세서에서 Rp) 또는 "S" 구성(본 명세서에서 Sp)을 가질 수 있다. 상기 백본은 또한 가교 산소(즉, 인산염을 뉴클레오시드에 연결하는 산소)를 질소(가교 포스포로아미네이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 치환함으로써 변형될 수 있다. 상기 치환은 연결 산소 중 하나 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 상기 인산기는 특정 백본 변형에서 인을 포함하지 않은 연결기로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 인산기는 중성 모이어티로 치환될 수 있다. 인산기를 치환할 수 있는 모이어티의 예는 예컨대, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시 메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당기에 대한 하나 이상의 변형, 즉 당 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 히드록실기(OH)는 변형될 수 있으며, 예컨대, 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 히드록실기에 대한 변형은 히드록실이 더 이상 탈양성자화되어 2'-알콕시드 이온을 형성할 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다. 2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은 예컨대, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 0(CH2CH20)nCH2CH2OR을 포함할 수 있으며, 여기서 R은 예컨대, H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20의 정수(예컨대, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8이고, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8이고, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2' 하이드록실기 변형은 2'-0-Me일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2' 히드록실기 변형은 2'-플루오로 변형일 수 있으며, 이는 2' 히드록실기를 불화물로 치환하는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 2' 히드록실기 변형은 2' 히드록실이 예컨대, Ci-6 알킬렌 또는 Ci-6 헤테로알킬렌 브리지에 의해 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠금" 핵산(LNA)을 포함할 수 있으며, 여기서 예시적인 브리지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브리지; O-아미노(여기서 아미노는 예컨대, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 다이알라미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, 0(CH2)n-아미노(여기서 아미노는 예컨대, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 다이알라미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2' 히드록실기 변형은 리보오스 고리에 C2'-C3' 결합이 없는 "잠금 해제된" 핵산(UNA)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2' 히드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE), (OCH2CH2OCH3, 예컨대, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
용어 "데옥시" 2' 변형은 수소(즉, 예컨대, 부분 dsRNA의 오버행 부분의 데옥시리보오스 당); 할로(예컨대, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오드); 아미노(여기서, 아미노는 예컨대, -NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 다이알라미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2- 아미노(여기서 아미노는 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(0)R(여기서 R은 예컨대, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 선택적으로 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노로 치환될 수 있다. 당 변형은 또한 리보오스의 대응하는 탄소와 반대되는 입체화학적 구성을 가진 하나 이상의 탄소를 포함할 수 있는 당기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 예컨대, 아라비노오스를 당으로서 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 변형된 핵산은 또한 무염기 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한 하나 이상의 구성 당 원자에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태의 당 예컨대, L-뉴클레오시드를 하나 이상 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵산에 혼입될 수 있으며, 핵염기라고도 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 및 우라실(U)을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 이들 핵염기는 변형되거나 완전히 치환되어 변형된 핵산에 혼입될 수 있는 변형된 잔기를 제공할 수 있다. 상기 뉴클레오티드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체, 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵염기는 예컨대, 자연 발생 염기 및 염기의 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 사용하는 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA는 각각 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 상기 crRNA 및/또는 tracr RNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 특정 구현예에서, 상기 sgRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있는 하나 이상의 잔기가 화학적으로 변형될 수 있거나, 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서는 5' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예에서는 3' 말단 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 분자의 단일 가닥 오버행에 있는 모든 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 전부는 데옥시뉴클레오티드이다. 상기 변형된 mRNA는 5' 말단 및/또는 3' 말단 변형을 포함할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물
다른 일 양태에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 상기 약제학적 조성물은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체의 세포, 조직, 또는 기관에 대한 생체 내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 통합될 수 있다. 일반적으로, 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 원하는 치료제 투여 경로(예컨대, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 통합될 수 있다. 고압 정맥 내 또는 동맥 내 주입뿐만 아니라 세포 내 주사, 예컨대, 핵 내 미세주입 또는 세포질 내 주입을 통한 수동 조직 형질도입도 고려된다. 치료적 목적의 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 필요한 양으로, 필요에 따라 위에 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적절한 완충액에 통합한 다음, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있고, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 제형화되어 이식유전자를 핵산에 포함된 상태로 수용자의 세포에 전달함으로써, 이식유전자 또는 그 안의 공여체 서열의 치료적 발현을 유도할 수 있다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 약제학적으로 활성인 조성물은 다양한 목적을 위해 이식유전자를 세포, 예컨대, 대상체의 세포에 전달하도록 제형화될 수 있다.
치료적 목적을 위한 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 높은 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사식 용액은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 필요한 양을 위에 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합이 필요에 따라 포함된 적절한 완충액에 넣은 다음, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 국소, 전신, 양막 내, 경막 내, 두개 내, 동맥 내, 정맥 내, 림프 내, 복강 내, 피하, 기관, 조직 내(예컨대, 근육 내, 심장 내, 간 내, 신장 내, 뇌 내), 경막 내, 방광 내, 결막(예컨대, 안와 외, 안와 내, 후안와, 망막 내, 망막 하, 맥락막, 맥락막 하, 기질 내, 장 내, 및 유리체 내), 달팽이관 내, 및 점막(예컨대, 경구, 직장, 비강) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 통합될 수 있다. 고압 정맥 내 또는 동맥 내 주입뿐만 아니라 세포 내 주사, 예컨대, 핵내 미세주입 또는 세포질 내 주입을 통한 수동 조직 형질도입도 고려된다.
일부 양태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 하나 이상의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 숙주 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생산된 유기체(예컨대, 동물, 식물, 또는 곰팡이)가 본 명세서에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 리포솜, 면역리포솜, 폴리케이션 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 DNA의 제제 강화 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은 예컨대, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매되고 있다(예컨대, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포(예컨대, 시험관 내 또는 생체 외 투여) 또는 표적 조직(예컨대, 생체 내 투여)으로의 전달일 수 있다.
핵산을 세포에 전달하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스, 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 일반적으로, LNP는 핵산 분자(예컨대, 본 명세서에 기재된 것과 같은 ssDNA 분자), 하나 이상의 이온화성 지질 또는 양이온성 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예컨대, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예컨대, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 선택적으로 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)로 구성된다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 세포에 전달하기 위한 또 다른 방법은 세포에 의해 내재화되는 리간드와 핵산을 접합시키는 것에 의한 방법이다. 예를 들어, 상기 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합할 수 있고 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산 내의 뉴클레오티드에 공유 결합될 수 있다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 예시적인 접합체는 예컨대, WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 형질주입에 의해 세포에 전달될 수도 있다. 유용한 형질주입 방법은 지질 매개 형질주입, 양이온성 중합체 매개 형질주입, 또는 인산칼슘 침전을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 형질주입 시약은 당업계에 알려져 있으며, 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: TurboFect 형질주입 시약(Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 형질주입 시약(New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 형질주입 시약(EMD Millipore), 293펙틴, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD(Roche), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™(Promega), TFX-20™(Promega), TFX-50™(Promega), TRANSFECTIN™(BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™(Bio-Rad), Effectene™(Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™(Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™(Dharmacon), DHARMAFECT 3™(Dharmacon), DHARMAFECT 4™(Dharmacon), ESCORT™ III(Sigma, St. Louis, Mo.), 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.). ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물과 같은 핵산도 당업자에게 알려진 미세유체 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.
생체 내 또는 생체 외에서 핵산의 비바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션(미국 특허 제5,049,386호; 제4,946,787호 및 상업적으로 이용 가능한 시약, 예컨대, Transfectam™ 및 Lipofectin™ 참조), 미세주입, 유전자총(biolistics), 비로좀, 리포솜(예컨대, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; Blaese 등의 문헌[Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)]; Behr 등의 문헌[Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; Remy 등의 문헌[Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)]; Gao 등의 문헌[Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; Ahmad 등의 문헌[Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 제4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787), 면역리포솜, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 DNA의 제제 강화 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 초음파 천공(sonoporation)이 핵산의 전달에 사용될 수도 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 생체 내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수도 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 도포 및 전기천공을 포함하되 이로 제한되지 않는, 혈액 또는 조직 세포와 분자를 궁극적으로 접촉시키기 위해 일반적으로 사용되는 경로 중 어느 하나에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적절한 방법은 당업자에게 이용 가능하고 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 다른 경로에 비해 보다 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 도입 방법은 예컨대, 미국 특허 제5,928,638호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 조혈 줄기세포에 전달될 수 있다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체의 세포 또는 표적 기관에 전달하기 위해 리포솜에 첨가될 수 있다. 리포솜은 적어도 하나의 지질 이중층을 가진 소포체이다. 리포솜은 일반적으로 약제학적 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 사용된다. 이들은 세포막과의 융합 및 이의 지질 구조의 재위치설정에 의해 약물 또는 활성 약제학적 성분(API)을 전달함으로써 작용한다. 이러한 전달을 위한 리포솜 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다. 예시적인 리포솜 및 리포솜 제형은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042(국제 특허 공개 번호 WO 2019/051289 A1로서 공개됨) 및 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242(국제 특허 공개 WO 2019/113310 A1로서 공개됨)에 개시되어 있으며, 예컨대, "약제학적 제형"이라는 제목의 항을 참조한다.
일부 양태에서, 본 개시는 화합물의 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기능성 기를 가진 하나 이상의 화합물(소위 "PEG화된 화합물")을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 또는, 상기 리포솜 제형은 단순히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 추가 성분으로서 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 PEG 또는 PEG 기능성 기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 수 시간 내지 수 주에 걸친 서방형 또는 조절 방출 프로파일을 가지는 API를 전달할 리포솜 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 상기 리포솜 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 상기 리포솜 제형은 수 시간 내지 수 주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는, 상승된 온도에서 물리적 전이를 거치는 성분을 사용하여 API를 캡슐화한다.
일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 스핑고미엘린 및 본 명세서에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 옵티솜(optisomes)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다: N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합 지질, HSPC(수소화 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(에그 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포포에탄올아민). 콜레스테롤 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합.
일부 양태에서, 본 개시는 인지질, 콜레스테롤, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 56:38:5의 몰비로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형의 전체 지질 함량은 2 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 PEG화된 지질을 각각 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 콜레스테롤, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기 및 콜레스테롤을 포함하는 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 PEG화된 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시는 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체, 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 하나 이상의 지질 및 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 스테롤(예컨대, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 약제학적 부형제, 예컨대, 수크로오스 및/또는 글리신을 더 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 단일층 구조 또는 다중층 구조의 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 다중 소포성 입자 및/또는 거품 기반 입자를 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 보통의 나노입자 대비 상대적으로 크기가 더 크고, 크기가 약 150 내지 250 nm인 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시는 리포솜 외부에 단리된 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물을 가진 혼합물에 약염기를 첨가함으로써 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 제조되고 로딩되는 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포솜 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고 API를 리포솜 내로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시는 리포솜의 내부에 산성 pH를 가진 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 경우, 해당 리포솜의 내부는 pH 4 내지 6.9, 보다 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시는 리포솜 내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 경우, 중합체 또는 비중합체성 고하전 음이온 및 리포솜 내 포획제, 예컨대, 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 사용된다.
다른 양태에서, 본 개시는 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.
리포솜, 나노캡슐, 미세입자, 미소구체, 지질 입자, 소포체 등과 같은 전달 시약이 본 개시의 조성물을 적절한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히, 핵산은 지질 입자, 리포솜, 소포체, 미소구체, 나노입자, 금 입자 등에 캡슐화된 상태로 전달되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 본 명세서에 개시된 핵산의 약제학적으로 허용 가능한 제형을 도입하는 데 바람직할 수 있다.
당업계에 알려진 다양한 전달 방법 또는 이의 변형이 시험관 내 또는 생체 내에서 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 표적 세포 내로의 DNA 진입이 용이해지도록 하기 위한 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학적, 또는 레이저 기반 에너지에 의한 세포막으로의 일시적인 침투에 의해 전달된다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 크기 제한 채널을 통해 또는 당업계에 알려진 다른 수단에 의해 세포를 압착하여 세포막을 일시적으로 파괴함으로써 전달될 수 있다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자만을 네이키드 DNA로서 피부, 흉선, 심장 근육, 골격근, 또는 간 세포 내에 직접 주입한다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전자 총(gene gun)에 의해 전달된다. 캡시드 결핍 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(직경 1 내지 3 μm)는 가압 기체에 의해 고속으로 가속되어 표적 조직 세포 내로 침투할 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 폐쇄 말단형 DNA 벡터를 전달하는 데 전기천공이 사용된다. 전기천공은 한 쌍의 전극을 조직 내로 삽입함으로써 세포막 표적 세포 조직의 일시적인 불안정화를 야기하여, 불안정화된 막을 둘러싼 배지 내의 DNA 분자가 세포의 세포질 내로 침투한 다음 핵원형질(nucleoplasm) 내로 침투할 수 있게 한다. 전기천공은 피부, 폐, 및 근육과 같은 많은 유형의 조직을 대상으로 생체 내에서 사용되어 왔다.
일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유체역학적 주입에 의해 전달되는데, 이는 전체 사지에서 내부 기관 및 골격근 내로 임의의 수용성 화합물 및 입자를 직접 세포내 전달하는 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 내부 기관 또는 종양의 세포 내로 DNA 입자의 세포 내 전달을 용이하게 하기 위해, 막 내에 나노 크기의 구멍을 형성함으로써 초음파에 의해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도가 이 시스템의 효율성에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 핵산을 포함하는 입자를 표적 세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하는 자기감염(magnetofection)에 의해 전달된다.
일부 경우에, 화학물질 전달 시스템은 예컨대, 양이온성 리포솜/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는, 양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축체를 포함하는 나노머 복합체를 사용함으로써 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 포함 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예컨대, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체), 및 지질-중합체 혼성체.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 구체적으로 고려된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 지질 전달 시스템, 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 리포솜과 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 숙련된 의사가 원하는 임의의 경로를 통해 투여된다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 구강 투여, 흉막 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 비강 내 경막 내, 및 관절 내 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 수의학적 용도의 경우, 상기 조성물은 정상적인 수의학적 관행에 따라 적절하게 허용 가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 투약 양생법 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 상기 조성물은 종래의 주사기, 무바늘 주입 장치, "마이크로분사 충돌 유전자 건", 또는 전기천공("EP"), 유체역학적 방법, 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유체역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 전체 사지에서 내부 기관 및 골격근 내로 임의의 수용성 화합물 및 입자를 직접 세포내 전달하는 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 내부 기관 또는 종양의 세포 내로 DNA 입자의 세포 내 전달을 용이하게 하기 위해, 막 내에 나노 크기의 구멍을 형성함으로써 초음파에 의해 전달되므로, ssDNA 분자의 크기 및 농도가 이 시스템의 효율성에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 핵산을 포함하는 입자를 표적 세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하는 자기감염(magnetofection)에 의해 전달된다.
일부 경우에, 화학물질 전달 시스템은 예컨대, 양이온성 리포솜/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는, 양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축체를 포함하는 나노머 복합체를 사용함으로써 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 포함 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예컨대, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체), 및 지질-중합체 혼성체.
A. 엑소좀
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 엑소좀에 패키징됨으로써 전달된다. 엑소좀은 세포 내 기원의 소형 막 소포체로서, 이는 형질막과 다중소포체의 융합 후 세포 외 환경으로 방출된다. 이들의 표면은 공여체 세포의 세포막으로부터의 지질 이중층으로 구성되며, 이들은 엑소좀을 생산한 세포로부터의 시토졸을 포함하고, 표면에 부모 세포로부터의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포(MC)뿐만 아니라 수지상 세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm의 직경을 가진 엑소좀의 사용이 예상된다. 엑소좀은 표적 세포로의 전달을 위해, 공여체 세포를 사용하거나 특이적 핵산을 그 안에 도입함으로써 단리될 수 있다. 당업계에 알려진 다양한 접근법이 본 개시의 캡시드 결핍 AAV 벡터를 포함하는 엑소좀을 생산하는 데 사용될 수 있다.
B. 미세입자/나노입자
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는 이온화성 아미노 지질(예컨대, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함하며, 이는 예컨대, Tam 등의 문헌(2013) [Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507에 개시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 평균 직경이 약 10 내지 약 1000 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 직경이 300 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 직경이 약 10 내지 약 300 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 직경이 200 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 직경이 약 25 내지 약 200 nm이다. 일부 구현예에 따르면, 지질 나노입자 제제(예컨대, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는 평균 크기(예컨대, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 보다 일반적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 가진다.
당업계에 알려진 다양한 지질 나노입자가 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은 예를 들어 Ding 등의 문헌에 기재된 바와 같이 금 나노입자에 공유 결합되거나 금 나노입자에 비공유 결합될 수 있다(예컨대, 전하-전하 상호 작용에 의한 결합)(Ding 등의 문헌[(2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083]). 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는 예컨대, 미국 특허 제6,812,334호에 기재된 방법을 사용하여 생산된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자는 고농도의 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물로 쉽게 제형화되어, 미국 특허 제8,846,102호; 제9,404,088호; 및 제9,850,323호(이들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 DNA 장용 코팅 알약으로 경구 투여될 수 있다.
C. 접합체
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 접합된다(예컨대, 세포 흡수를 증가시키는 제제에 공유 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 제제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예컨대, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩티드(CPP)(예컨대, 페네트라틴, TAT, Syn1B 등), 및 폴리아민(예컨대, 스페르민)에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 제제의 추가적인 예는 예컨대, Winkler의 문헌(2013) [Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 중합체(예컨대, 중합체 분자) 또는 엽산염 분자(예컨대, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 예컨대, WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재된 바와 같이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 예컨대, 미국 특허 제8,987,377호에 기재된 바와 같이 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시에 기재된 핵산은 미국 특허 제8,507,455호에 기재된 바와 같이 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 예컨대, 미국 특허 제8,450,467호에 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 캡슐화할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(약 0.1 μm 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 해당 용도를 위해 고려된다.
E. 리포솜
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체의 세포 또는 표적 기관에 전달하기 위해 리포솜에 첨가될 수 있다. 리포솜은 적어도 하나의 지질 이중층을 가진 소포체이다. 리포솜은 일반적으로 약제학적 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 사용된다. 이들은 세포막과의 융합 및 이의 지질 구조의 재위치설정에 의해 약물 또는 활성 약제학적 성분(API)을 전달함으로써 작용한다. 이러한 전달을 위한 리포솜 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
리포솜의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 리포솜은 혈청 안정성 및 순환 반감기가 개선되는 방향으로 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 또한, 잠재적 약물 담체로서의 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기술되었다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
F. 예시적인 리포솜 및 지질 나노입자(LNP) 조성물
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 세포, 예컨대, 이식유전자의 발현을 필요로 하는 세포에 전달하기 위해 리포솜에 첨가될 수 있다. 리포솜은 적어도 하나의 지질 이중층을 가진 소포체이다. 리포솜은 일반적으로 약제학적 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 사용된다. 이들은 세포막과의 융합 및 이의 지질 구조의 재위치설정에 의해 약물 또는 활성 약제학적 성분(API)을 전달함으로써 작용한다. 이러한 전달을 위한 리포솜 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자, 및 지질을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 지질 나노입자 조성물을 제공한다.
합성 AAV를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 그 전체가 각각 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042(국제 특허 공개 번호 WO 2019/051289 A1로 공개됨), 및 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242(국제 특허 공개 번호 WO 2019/113310 A1로 공개됨)에 개시되어 있으며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용될 예정이다.
일부 양태에서, 본 개시는 화합물의 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기능성 기를 가진 하나 이상의 화합물(소위 "PEG화된 화합물")을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 또는, 상기 리포솜 제형은 단순히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 추가 성분으로서 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 PEG 또는 PEG 기능성 기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 수 시간 내지 수 주에 걸친 서방형 또는 조절 방출 프로파일을 가지는 API를 전달할 리포솜 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 상기 리포솜 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 상기 리포솜 제형은 수 시간 내지 수 주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는, 상승된 온도에서 물리적 전이를 거치는 성분을 사용하여 API를 캡슐화한다.
일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 스핑고미엘린 및 본 명세서에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 옵티솜(optisomes)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다: N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합 지질, HSPC(수소화 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(에그 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포포에탄올아민). 콜레스테롤 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합.
일부 양태에서, 본 개시는 인지질, 콜레스테롤, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 56:38:5의 몰비로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형의 전체 지질 함량은 2 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 PEG화된 지질을 각각 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 콜레스테롤, 및 PEG화된 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기 및 콜레스테롤을 포함하는 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 PEG화된 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시는 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체, 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 하나 이상의 지질 및 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 포스파티딜콜린 기능성 기를 포함하는 지질, 에탄올아민 기능성 기를 포함하는 지질, 및 스테롤(예컨대, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 약제학적 부형제, 예컨대, 수크로오스 및/또는 글리신을 더 포함하는 리포솜 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 단일층 구조 또는 다중층 구조의 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 다중 소포성 입자 및/또는 거품 기반 입자를 포함하는 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 보통의 나노입자 대비 상대적으로 크기가 더 크고, 크기가 약 150 내지 250 nm인 리포솜 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 리포솜 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 개시되거나 기재된 바와 같이 제조된 리포솜 제형으로서, 리포솜 외부에 단리된 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물을 갖는 혼합물에 약염기를 첨가함으로써, 본 명세서에 개시되거나 기재된 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물이 로딩되는 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포솜 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고 API를 리포솜 내로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시는 리포솜의 내부에 산성 pH를 가진 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 경우, 해당 리포솜의 내부는 pH 4 내지 6.9, 보다 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시는 리포솜 내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포솜 제형을 제공한다. 이러한 경우, 중합체 또는 비중합체성 고하전 음이온 및 리포솜 내 포획제, 예컨대, 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 사용된다.
일부 양태에서, 본 개시는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 이온화성 지질을 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 포함되는 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042(국제 출원 공개 번호 WO 2019/051289 A1로서 공개됨)에 개시된 것과 같은 프로세스에 의해 제조되고, 상기 프로세스에 의해 수득된 합성 AAV가 로딩된 지질 나노입자 제형을 제공한다. 이는 이온화성 지질을 양성자화하고, 합성 AAV/지질 결합 및 입자의 핵 형성에 유리한 에너지원을 제공하는 수성 합성 AAV와 에탄올 지질을 낮은 pH에서 고에너지 혼합함으로써 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 원하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 상기 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 합성 AAV(질량 또는 중량) 비율로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ssDNA 분자 또는 dsDNA 작제물 비율(질량/질량 비율; w/w 비율)은 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 합성 AAV의 양은 원하는 N/P 비율, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 N/P 비율을 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 상기 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다.
이온화성 지질은 일반적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예컨대, 합성 AAV를 응축하고 막 결합 및 융합성을 유도하는 데 사용된다. 일반적으로, 이온화성 지질은 산성 조건에서, 예컨대, pH 6.5 이하에서 양으로 하전되거나 양성자화되는, 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화성 지질은 본 명세서에서 양이온성 지질로도 지칭된다.
예시적인 이온화성 지질은 국제 PCT 특허 공개 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공개 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458, 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 다음 구조를 가진 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트 (DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
지질 DLin-MC3-DMA는 Jayaraman 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 WO2015/074085에 기재된 것과 같은 지질 ATX-002이다.
일부 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 WO2012/040184에 기재된 것과 같은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 이온화성 지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 WO2015/199952에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이다.
비제한적으로, 이온화성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화성 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20 내지 70%(몰), 30 내지 60%(몰) 또는 40 내지 50%(몰)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 90 몰%를 차지한다.
일부 양태에 따르면, 상기 지질 나노입자는 비양이온성 지질을 더 포함할 수 있다. 비이온성 지질은 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성 비전하 지질, 양쪽성 이온 지질, 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 일반적으로 융합성을 증강시키기 위해 사용된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 프로세스를 사용해 생산된 합성 AAV 벡터를 포함하여, DNA 벡터를 포함하는 조성물 및 상기 방법에 사용할 것이 예상되는 예시적인 비양이온성 지질은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042(국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/051289 A1로서 공개됨), 및 2018년 12월 6일자로 출원된 PCT/US2018/064242(국제 특허 공개 번호 WO 2019/113310 A1로서 공개됨)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
예시적인 비양이온성 지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는, 국제 특허 출원 공개 WO2017/099823 및 미국 특허 공개 US2018/0028664에 기재되어 있다.
비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 비양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5 내지 20%(몰) 또는 10 내지 15%(몰)이다. 다양한 구현예에서, 이온화성 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 지질 나노입자는 어떠한 인지질도 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 지질 나노입자는 막 무결성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는, 국제 특허 출원 WO2009/127060 및 미국 특허 공개 US2010/0130588에 기재되어 있다.
막 무결성을 제공하는 성분, 예컨대, 스테롤은 상기 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 성분은 상기 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20 내지 50%(몰) 또는 30 내지 40%(몰)이다.
일부 양태에서, 상기 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합 지질 분자를 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 억제하고/하거나 입체 안정화를 제공하는 데 사용된다. 예시적인 접합 지질은 PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체 지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하되 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예서, 상기 접합 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예컨대, (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합 지질이다. 예시적인 PEG-지질 접합체는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), 페길화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙신산염 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, 또는 이들의 혼합물. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는 예컨대, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224, 및 US2017/0119904에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 US2018/0028664에 개시된 화합물이다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 US20150376115 또는 US2016/0376224에 개시되어 있다.
상기 PEG-DAA 접합체는 예컨대, PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필, 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. 상기 PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥탄일] 카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) 에테르), 및 1,2-디미리스트오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서, 상기 PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스트오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 PEG-지질을 대신하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 및 양이온성-중합체 지질(CPL) 접합체가 PEG-지질을 대신하거나 이에 추가하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합체 지질, 즉 PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104, 및 WO2010/006282, 미국 특허 출원 공개 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587, 및 US20110123453, 그리고 미국 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017, 및 US6,586,559에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 상기 치료제는 치료적 목적에 적합한 임의의 계열로부터 선택될 수 있다. 즉, 상기 치료제는 치료적 목적에 적합한 임의의 계열로부터 선택될 수 있다. 즉, 상기 치료제는 치료 목적 및 원하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내의 합성 AAV가 암을 치료하는 데 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예컨대, 화학요법제, 표적화된 암 요법(소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체를 포함하나 이로 제한되지 않음)일 수 있다. 다른 일례에서, 합성 AAV를 포함하는 LNP가 감염증을 치료하는 데 유용한 경우, 추가 화합물은 항균제(예컨대, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 또 다른 일례에서, 합성 AAV를 포함하는 LNP가 면역 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 경우, 추가 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물(예컨대, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특이적 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 화합물을 포함하는 상이한 지질 나노입자의 상이한 칵테일, 예컨대, 상이한 단백질을 인코딩하는 합성 AAV, 또는 치료제와 같은 상이한 화합물이 본 개시의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 추가 화합물은 면역 조절제이다. 예를 들어, 상기 추가 화합물은 면역 억제제이다. 일부 구현예에서, 상기 추가 화합물은 면역 자극제이다.
또한, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 지질 나노입자에 캡슐화된 합성 생산 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 약제학적 부형제를 더 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 지질 나노입자 제형은 수크로오스, 트리스, 트레할로오스 및/또는 글리신을 더 포함한다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나 지질 나노입자의 지질 위치에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 DNA 벡터는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예컨대, 수용액 중에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자에 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 DNA 벡터는 지질 나노입자가 37℃에서 적어도 약 20, 30, 45, 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출된 후 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 지질 나노입자 내의 합성 AAV는 입자를 37℃의 혈청 내에서 배양한 후 적어도 약 30, 45, 또는 60분 동안, 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36시간 동안 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 구현예에서, 상기 지질 나노입자는 대상체에 대해, 예컨대, 인간과 같은 포유동물에 대해 실질적으로 비독성이다. 일부 양태에서, 상기 지질나노입자 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 구현예에서, 상기 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 가진 고체상 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 상기 지질 나노입자는 비이중층 구조, 즉, 비층상(즉, 비이중층) 형태를 가진다. 비제한적으로, 상기 비이중층 형태는 예컨대, 3차원 튜브, 로드, 입방형 대칭체 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 지질 나노입자의 형태(층상 대 비층상)는 예컨대, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 쉽게 평가되고 특성이 규명될 수 있다.
일부 추가 구현예에서, 상기 비층상 형태를 가진 지질 나노입자는 전자 밀도가 높다. 일부 양태에서, 본 개시는 구조가 단일층 구조 또는 다중층 구조인 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 다중 소포성 입자 및/또는 거품 기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 성분의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체의 지질 입자로부터의 교환 속도, 및 결과적인 지질 나노입자가 융합성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 지질 나노입자가 융합성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어하기 위해 예컨대, pH, 온도, 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수가 사용될 수 있다. 지질 나노입자가 융합성이 되는 속도의 제어에 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 조절함으로써 지질 입자 크기를 조절할 수 있음이 또한 명백할 것이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(Jayaraman 등의 문헌[Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; Semple 등의 문헌[Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)]을 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 술폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 분석법을 사용하여 지질 나노입자에서 측정될 수 있다.
VII. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 전달 방법
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 다양한 적절한 방법을 통해 시험관 내 또는 생체 내에서 표적 세포에 전달될 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 적용되거나 주입될 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 형질주입 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 세포에 전달될 수 있다. 또는, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 DNA가 세포 내로 진입하는 것을 용이하게 하는 당업계에 알려진 형질주입 시약 또는 다른 당업계에 알려진 물리적 수단, 예컨대, 리포솜, 알코올, 폴리리신 풍부 화합물, 아르기닌 풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주입, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.
다른 일 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 중추신경계(예컨대, 뇌 또는 눈)에 투여된다. 예를 들어, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽, 전두엽을 포함한 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌, 및 하구 내로 도입될 수 있다. 상기 ssDNA 분자는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 (예컨대, 요추 천자에 의해) 뇌척수액 내로 전달될 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 또한 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예컨대, 뇌 종양 또는 뇌 경색)에서 CNS에 혈관 내 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 경막 내, 안구 내, 뇌 내, 뇌실 내, 정맥 내(예컨대, 만니톨과 같은 당의 존재하에), 비강 내, 귓속(intra-aural), 안구 내(예컨대, 유리체 내, 망막하, 안전방(anterior chamber)) 및 안구 주위(예컨대, 안각건하 영역(sub-Tenon's region)) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런으로의 역행 전달을 동반하는 근육 내 전달을 포함하되 이로 제한되지 않는 당업계에 알려진 임의의 경로를 통해 CNS의 원하는 영역에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 액체 제형으로 직접 주사(예컨대, 정위 주사)를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 원하는 영역에 국소 도포하거나 에어로졸 제형을 비강 내 투여하여 제공될 수 있다. 눈에 투여하는 경우 액적을 국소 도포할 수 있다. 다른 대안으로서, 예컨대, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제7,201,898호 참조). 또 다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 운동 뉴런과 관련된 질병 및 장애(예컨대, 근위축성 측색 경화증(ALS); 척수성 근위축증(SMA) 등)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 역방향 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 근육 조직에 전달되어 뉴런으로 이동할 수 있다.
VIII. 사용 방법
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자, 및 이를 포함하는 조성물은 다양한 목적으로 표적 유전자 또는 이식유전자(관심 대상 핵산 서열로도 지칭됨)를 발현하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 생성된 이식유전자(관심 대상 핵산)는 예컨대, 이식유전자 산물의 기능을 연구하기 위한 예컨대, 이식유전자를 보유하는 체세포 유전자이식 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용되도록 의도되는 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 인코딩한다. 다른 일례에서, 상기 이식유전자는 질병의 동물 모델을 생성하는 데 사용되도록 의도된 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 포유류 대상체의 질병 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 생성된 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질병을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 전달(예컨대, 발현)될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 이식유전자는 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬, 또는 융합 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 생성된 이식유전자가 억제하거나 그렇지 않으면 발현을 감소시키는 유전자의 증가된 발현, 유전자 산물의 활성, 또는 유전자의 부적절한 상향 조절과 관련된 질병을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에서 발현될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생성된 이식유전자는 천연 유전자의 결함 있는 카피를 대체하거나 보충한다. 당업자는 이식유전자가 전사될 유전자의 개방 해독 프레임이 아닐 수 있으며; 대신에, 이는 표적 유전자의 프로모터 영역 또는 억제 영역일 수 있고, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 관심 대상 유전자의 발현을 조절함으로써 이러한 영역을 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에 따르면, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 관심 대상 뉴클레오티드 서열(예컨대, 이식유전자)을 표적 세포(예컨대, 숙주 세포)에 전달하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 기술의 다른 양태는 포유류 세포 모집단에 형질도입하는 방법을 제공한다. 전체적 및 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 중 하나 이상의 유효량을 포함하는 조성물을 상기 모집단 하나 이상의 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 유전자 및/또는 단백질을 전달하는 방법일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 유전자 및/또는 단백질을 전달하는 방법일 수 있다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 유전자 및/또는 단백질은 세포의 핵에 전달된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 이식유전자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포에 전달하고 관심 대상 질병을 치료하기 위한 방법일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 전달하는 방법일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ssDNA 분자의 치료적 유효량을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 전달하는 방법일 수 있다. 추가적인 구현예에 따르면, 상기 유전자 및/또는 단백질은 세포의 핵에 전달된다. 본 개시는 이식유전자, 예컨대, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 인코딩된 단백질, 항체, miRNA와 같은 핵산 등의 생체 내 발현을 대상체의 세포 내에서 허용하여, 이식유전자 발현에 따른 치료적 효과가 발생하도록 한다. 이들 결과는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 생체 내 및 시험관 내 전달 모드 모두에서 관찰된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전달은 유전자 전달 및 유전자 편집 방식을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 또한 유전자 편집 분자(예컨대, 뉴클레아제 또는 가이드 서열)를 표적 세포(예컨대, 숙주 세포)에 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 유전자 편집 분자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포에 전달하고 관심 대상 표적 유전자를 편집하기 위한 방법일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 유전자 편집 분자, 예컨대, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 인코딩된 뉴클레아제 또는 가이드 서열의 생체 내 발현을 대상체의 세포 내에서 허용하여, 유전자 편집 기구의 치료적 효과가 발생하도록 한다. 이들 결과는 생체 내 및 시험관 내 전달 모드 모두에서 관찰된다.
또한, 본 개시는 이식유전자의 전달을 필요로 하는 대상체의 세포에 이를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 대상 핵산 또는 이식유전자를 포함하는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 다회 투여를 포함한다. 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 캡슐화된 바이러스 벡터 또는 이중 가닥 DNA에 대해 일반적으로 관찰되는 것과 같은 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다중 투여 전략은 합성 기반 시스템에서 더 큰 성공을 거둘 가능성이 높다.
일부 구현예에 따르면, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 투여될 세포는 신경 세포(말초 및 중추 신경계 세포, 특히 뇌 세포 포함), 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포(예컨대, 장 및 호흡 상피 세포), 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포(섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 골 세포(예컨대, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포 등을 포함하되 이로 제한되지 않는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 다른 대안으로서, 상기 세포는 줄기 세포(예컨대, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 상기 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 또한, 세포는 임의의 기원 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 세포는 인간으로부터 유래한 것이다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 원하는 조직의 세포를 형질전환하고 중간한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 정맥 내(예컨대, 리포솜 제형), 선택된 기관에 대한 직접 전달(예컨대, 간으로의 문맥내 전달), 근육 내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 투여 경로는 필요한 경우 조합될 수 있다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 전달은 유전자 교환 전달로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전자 요법의 일부를 제공하기 위해 제공되는 다른 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자와 조합될 수 있는 시스템의 한 비제한적인 예는 이식유전자의 효과적인 유전자 발현을 위해 하나 이상의 보조 인자 또는 면역 억제제를 별도로 전달하는 시스템을 포함한다.
이하에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 본 개시는 또한 대상체의 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 이를 필요로 하는 대상체의 표적 세포(특히, 근육 세포 또는 조직) 내에 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 도입하는 단계를 포함한다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 담체의 존재하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체가 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 선택된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 관심 대상 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 예컨대, 질병을 치료하는 데 유용한 이식유전자를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 상기 이식유전자는 포유류 대상체의 질병 상태를 치료 또는 예방하는 데 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 상기 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질병을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달(예컨대, 발현)될 수 있다. 특히, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 유도할 수 있는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 본 명세서에 제공된 바와 같은 임의의 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 하나의 종으로 제한되지 않는다. 따라서, 다른 일 양태에서, 상이한 이식유전자 또는 동일한 이식유전자를 포함하지만 상이한 프로모터 또는 시스 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 다수의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 전략은 다수의 유전자의 유전자 요법 또는 유전자 전달을 동시에 가능하게 할 수 있다. 또한, 이식유전자의 상이한 부분을 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있는 별도의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 이식유전자의 기능에 필요한 상이한 도메인 및/또는 보조 인자)로 분리하는 것이 가능하며, 별도로 조절할 수 있어 이식유전자의 발현 조절 수준을 추가할 수 있다. 또한, 전달은 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항캡시드 숙주 면역 반응이 결여된 것을 고려하여, 중요하게도 임상 환경에서의 유전자 요법의 경우 이후 용량을 증가시키거나 감소시켜 여러 번 수행될 수 있다. 캡시드가 없기 때문에 항캡시드 반응은 발생하지 않을 것으로 예상된다.
IX. 치료 방법
본 명세서에 기재된 기술은 또한 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 개시된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 제조하는 방법 및 예컨대, 제자리 외, 시험관 내 및 생체 내 적용, 방법론, 진단 절차, 유전자 요법 및/또는 유전자 편집 양생법을 포함하는 다양한 방식으로 사용하는 방법을 보여준다.
대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체의 표적 세포(예컨대, 근육 세포 또는 조직, 또는 다른 영향을 받는 세포 유형) 내에 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 도입하는 단계를 포함한다. 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 담체의 존재하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체가 반드시 필요한 것은 아니다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 질병을 치료하는 데 유용한 관심 대상 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 유도할 수 있는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 제공된 바와 같은 임의의 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 본 명세서에 개시되며, 이는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 완충액, 희석제 또는 부형제와 함께 본 개시의 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 중 하나 이상을 포함하는 조성물 및 제형이다. 이러한 조성물은 질병, 부상, 장애, 외상 또는 기능 장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 하나 이상의 진단 또는 치료적 키트에 포함될 수 있다. 일 양태에서, 상기 질병, 부상, 장애, 외상 또는 기능 장애는 인간의 질병, 부상, 장애, 외상 또는 기능 장애이다.
본 명세서에 기재된 기술의 다른 일 양태는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 진단적 또는 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 양의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직 또는 기관에 제공하는 단계; 및 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로부터의 이식유전자의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현되는 단백질, 펩티드, 핵산의 진단적 또는 치료적 유효량을 상기 대상체에 제공하는 단계를 포함한다. 추가적인 일 양태에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 명세서에 기재된 기술의 다른 일 양태는 대상체의 질병, 장애, 기능 장애, 부상, 비정상적인 병태, 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료, 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전체적 및 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 중 하나 이상을 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 대상체의 질병, 장애, 기능 장애, 부상, 비정상적인 병태, 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 및 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 일 양태에서, 상기 대상체는 인간이다.
다른 일 양태는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 질병 또는 질병 상태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 감소시키기 위한 도구로서의 용도이다. 결함이 있는 유전자가 알려져 있고, 일반적으로 다음 2개의 부류에 속하는 다수의 유전적 질환이 있다: 보통은 열성적 방식으로 유전되는 일반적으로 효소의 결핍 상태; 및 항상 그렇지는 않지만 일반적으로 우성적 방식으로 유전되고, 조절 단백질 또는 구조적 단백질과 관련이 있을 수 있는 불균형 상태. 결핍 상태 질병의 경우, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대체 요법을 위해 정상 유전자를 복구하기 위해 이식유전자를 손상된 조직 내로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 일부 구현예에서, 안티센스 돌연변이를 사용하여 해당 질병에 대한 동물 모델을 생성하는 데에도 사용될 수 있다. 불균형 질병 상태의 경우, 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자은 모델 시스템에서 질병 상태를 생성하는 데 사용된 다음, 질병 상태에 대항하기 위한 노력에 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 방법은 유전 질환의 치료를 가능하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 질병 상태는 질병을 야기하거나 이를 보다 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 완전히 개선함으로써 치료된다.
일 양태에 따르면, 본 개시는 대상체의 유전 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자, ssDNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 지질 나노입자 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 유전자 편집 시스템의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에 따르면, 본 개시는 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자, ssDNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 지질 나노입자 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 유전자 편집 시스템의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 치료적 단백질은 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬 또는 융합 단백질이다.
일부 구현예에서, 상기 치료적 단백질은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 유전 질환을 치료하는 데 유용하다.
다른 양태에 따르면, 본 개시는 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포에 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자를 포함하는 지질 나노입자 조성물, 또는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 ssDNA 분자를 포함하는 유전자 편집 시스템을 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에 따르면, 본 개시는 치료적 유전자를 세포 핵에 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포에 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자, ssDNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 지질 나노입자 조성물, 또는 ssDNA 분자를 포함하는 유전자 편집 시스템을 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포 핵에 전달하는 단계를 포함한다.
A. 숙주 세포
일부 구현예에서, (본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된) 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 상기 이식유전자를 대상 숙주 세포 내로 전달한다. 일부 구현예에서, 상기 대상 숙주 세포는 예컨대, 혈액 세포, 줄기 세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유아세포 또는 포유류 유래의 다른 세포(간 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 장 세포, 횡격막 세포, 신장 세포, 신경 세포, 혈액 세포, 골수 세포 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 하나 이상의 선택된 조직을 포함하되 이로 제한되지 않음)를 포함하는 인간 숙주 세포이다. 일 양태에서, 상기 대상 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본 개시는 또한 전술한 바와 같은 재조합 숙주 세포에 관한 것으로, 상기 재조합 숙주 세포는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함한다. 따라서, 당업자에게 명백한 바와 같이 목적에 따라 다수의 숙주 세포를 사용할 수 있다. 공여체 서열을 포함하는 작제물 또는 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 숙주 세포 내로 도입되어 공여체 서열이 전술한 바와 같이 염색체 통합제로서 유지되도록 한다. 숙주 세포라는 용어는 복제 과정에서 발생하는 돌연변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않은 부모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 공여체 서열 및 이의 출처에 따라 크게 달라진다. 상기 숙주 세포는 또한 포유류, 곤충, 식물, 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 인간 세포(예컨대, 일차 세포, 줄기 세포, 또는 불멸화 세포주)이다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 생체 외에서 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 투여된 다음 유전자 요법 이벤트 후에 대상체에게 전달될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형, 예컨대, 체세포 또는 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포, 또는 혈액 세포, 예컨대, T 세포 또는 B 세포, 또는 골수 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 숙주 세포는 동종 세포이다. 예를 들어, T 세포 유전체 조작은 암 면역요법, HIV 요법(예컨대, CXCR4 및 CCR5와 같은 수용체 녹아웃)과 같은 질병 조절 및 면역결핍 요법에 유용하다. B세포의 MHC 수용체는 면역요법의 표적이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포, 예컨대, 골수 줄기 세포, 예컨대, CD34+ 세포, 또는 유도 다능성 줄기 세포는 치료적 단백질의 발현을 위해 환자에게 다시 이식될 수 있다.
B. 예시적인 이식유전자 및 치료 대상 질병
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 결함 유전자를 교정하는 데에도 유용하다. 비제한적인 예로서, 뒤시엔느 근이영양증의 DMD 유전자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 합성적으로 생산된 ssDNA 분자를 사용하여 전달될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 조성물이 임의의 유전병 치료에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 조성물은 예컨대, 돌연변이 단백질이 신경, 심장, 위장관계 등에서 잘못 접혀 응집되는 희귀 질병인 트랜스티레틴 아밀로이드증(ATTR)의 치료에 사용될 수 있다. 상기 질병은 본 명세서에 기재된 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 시스템을 사용하여 돌연변이 질병 유전자(mutTTR)를 결실시킴으로써 치료될 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 이러한 유전병의 치료는 질병 진행을 멈추게 할 수 있으며, 이미 발병한 질병을 퇴행시키거나 질병의 적어도 하나의 증상을 적어도 10% 감소시킬 수 있다.
다른 일 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 조성물은 신생아 또는 영아의 암모니아 해독 능력을 손상시키는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증(OTC 결핍증), 고암모니아혈증 또는 기타 요소 회로 장애의 치료에 사용될 수 있다. 모든 선천성 대사 질환과 마찬가지로, 야생형 대조군과 비교했을 때 효소 활성이 부분적으로 회복된 경우(예컨대, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)에도 OTC 결핍증이 있는 대상체의 OTC 증상 중 적어도 하나를 감소시키고/시키거나 삶의 질을 개선하기에 충분할 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 일 구현예에서, OTC를 인코딩하는 핵산은 생체 내 단백질 치환을 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 조성물은 페닐알라닌 수산화효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달하여 페닐케톤뇨증(PKU) 환자에게 독성이 될 수 있는 식이성 페닐알라닌 축적을 감소시킴으로써 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 모든 선천성 대사 질환과 마찬가지로, 야생형 대조군과 비교했을 때 효소 활성이 부분적으로 회복된 경우(예컨대, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)에도 PKU가 있는 대상체의 PKU 증상 중 적어도 하나를 감소시키고/시키거나 삶의 질을 개선하기에 충분할 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 일 구현예에서, 페닐알라닌 수산화효소를 인코딩하는 핵산은 생체 내 단백질 치환을 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 약제학적 조성물은 글리코겐 축적병(GSD)이 있는 대상체에서 비정상적인 글리코겐 합성 또는 파괴를 교정하기 위한 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달함으로써 GSD의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성적으로 생산된 AAV 벡터 및 방법을 사용하여 전달 및 발현될 수 있는 효소의 비제한적인 예는 글리코겐 합성효소, 글루코오스-6-포스파타아제, 산-알파 글루코시다아제, 글리코겐 탈분지 효소, 글리코겐 분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라아제, 간 글리코겐 포스포릴라아제, 근육 포스포프럭토키나아제, 포스포릴라아제 키나아제, 글루코스 수송체-2(GLUT-2), 알돌라아제 A, 베타-에놀라아제, 포스포글루코무타아제-1(PGM-1), 및 글리코게닌-1을 포함한다. 모든 선천성 대사 질환과 마찬가지로, 야생형 대조군과 비교했을 때 효소 활성이 부분적으로 회복된 경우(예컨대, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)에도 GSD가 있는 대상체의 GSD 증상 중 적어도 하나를 감소시키고/시키거나 삶의 질을 개선하기에 충분할 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 일 구현예에서, 이상 글리코겐 저장을 교정하는 효소를 인코딩하는 핵산은 생체 내 단백질 치환을 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 또한 레버 선천성 흑암시(LCA), 폴리Q 반복을 포함하는 폴리글루타민 질환, 및 알파-1 항트립신 결핍증(A1AT) 중 어느 하나의 치료에 사용하기 위한 것으로 고려된다. LCA는 실명을 초래하는 희귀한 선천성 안구 질병으로, 다음 유전자 중 어느 하나의 돌연변이에 의해 발생할 수 있다: GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 및/또는 PRPH2. 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 조성물 및 방법은 LCA의 증상을 일으키는 유전자의 오류를 교정하기 위해 LCA와 관련된 하나 이상의 유전자를 전달하는 데 적합할 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 폴리글루타민 질환은 다음을 포함하되 이로 제한되지는 않는다: 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증, 헌팅턴병, 척수 및 연수 근위축증, 및 척수소뇌성 운동실조증 1, 2, 3형(마카도-조셉병이라고도 함), 6, 7, 및 17형. A1AT 결핍증은 알파-1 항트립신의 생성 결함을 일으키는 유전 질환으로, 혈액 및 폐에서 효소의 활성을 감소시켜 영향을 받는 대상체에서 폐기종 또는 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발할 수 있다. A1AT 결핍증이 있는 대상체의 치료는 본 명세서에 개략적으로 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 이의 조성물을 사용하여 본 명세서에서 구체적으로 고려된다. LCA, 폴리글루타민 질환 또는 A1AT 결핍증의 치료를 위해 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다.
추가적인 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 조성물은 바이러스 서열, 병원체 서열, 염색체 서열, 전좌 접합부(예컨대, 암과 연관된 전좌), 비-코딩 RNA 유전자 또는 RNA 서열, 질병 관련 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다.
임의의 관심 대상 핵산 또는 표적 유전자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 전달되거나 발현될 수 있다. 표적 핵산 및 표적 유전자는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산(예컨대, RNAi, miR 등)을 포함하되 이로 제한되지 않으며, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 치료적(예컨대, 의학적, 진단적, 또는 수의학적 용도를 위한) 또는 면역원성(예컨대, 백신용) 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 표적화되는 표적 핵산 또는 표적 유전자는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.
특히, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의한 발현을 위한 유전자 표적 또는 이식유전자는 질병, 기능 장애, 부상, 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 및/또는 개선에 사용하기 위한 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 효소, 항체, 항원 결합 단편 및 이의 변이체 및/또는 이의 활성 단편을 인코딩할 수 있으나 이로 제한되지는 않는다. 일 양태에서, 상기 질병, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애는 인간의 질병, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애이다.
상기 발현 카세트는 또한 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA(코딩 또는 비-코딩; 예컨대, siRNA, shRNA, 마이크로 RNA, 및 이들의 안티센스 상대(예컨대, 안타고미르))를 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질, 예컨대, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 인산분해효소, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 루시페라아제, 및 당업계에 주지된 다른 것들을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 발현 작제물인 발현 카세트에 제공되는 서열은 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 자연 서열(예컨대, 원핵 서열)의 적어도 하나, 하나 초과, 또는 유의한 수의 코돈을 해당 척추동물의 유전자에 보다 자주 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 대상 척추동물, 예컨대, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 강화를 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 일반적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 최적화된 코돈은 예컨대, Aptagen의 GENEFORGE® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
많은 유기체가 성장하는 펩티드 사슬에 특정 아미노산을 삽입하기 위한 인코딩를 위해 특정 코돈을 사용하는 편향을 나타낸다. 코돈 선호도 또는 코돈 편향, 유기체 간의 코돈 사용의 차이는 유전자 부호의 퇴행에 의해 발생하며, 많은 유기체에서 잘 알려져 있다. 코돈 편향은 전령 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있는 경우가 많으며, 이는 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전이 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 대해 사용할 수 있는 많은 수의 유전자 서열을 고려할 때, 코돈 사용의 상대 빈도를 계산하는 것이 가능하다(Nakamura, Y., 등의 문헌 [Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]).
본 명세서에 언급된 바와 같이, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 단백질 또는 펩티드, 치료적 핵산 서열 또는 치료제를 부호할 수 있으며, 이는 하나 이상의 작용제, 길항제, 항세포사멸 인자, 억제제, 수용체, 사이토카인, 세포독소, 적혈구 생성제, 당 단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라아제, 단백질 키나아제, 단백질 키나아제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 이의 하나 이상의 억제제, 세로토닌 수용체 또는 이의 하나 이상의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 억제제, 진단 분자, 화학요법제, 세포독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하되 이로 제한되지 않는다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전자 발현을 제거하는 데에도 유용하다. 예를 들어, 일 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 표적 유전자의 녹다운을 유도하기 위해 안티센스 핵산 또는 기능성 RNA를 발현하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, HIV 수용체인 CXCR4 및 CCR5의 발현은 일차 인간 T 세포에서 성공적으로 제거된 바 있다(그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 Schumann 등의 문헌(2015) [PNAS 112(33): 10437-10442] 참조). 표적 억제를 위한 또 다른 유전자는 PD-1로, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 PD-1의 발현을 억제하기 위해 억제 핵산 또는 RNAi 또는 기능적 RNA를 발현할 수 있다. PD-1은 악성 종양에서 발생하는 만성 활성 T세포의 면역 관문 세포 표면 수용체를 발현한다. 전술한 Schumann 등의 문헌 참조.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 질병 유전자를 표적으로 하는 이식유전자를 발현함으로써 결함 유전자를 교정하는 데 유용하다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 비제한적인 예는 미국 특허 공개 제2014/0170753호의 표 A 내지 C에 이들의 유전자 및 이들의 관련 유전자와 함께 나열되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
대안적인 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 세이프 하버 유전자, 예컨대, 비활성 인트론에 치료적 단백질 또는 리포터 단백질의 발현을 위한 발현 카세트를 삽입하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트가 상기 세이프 하버 유전자에 삽입된다. 이러한 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트는 세이프 하버 유전자 조절 요소(프로모터, 인핸서, 및 신호 전달 펩티드)를 이용할 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌에 대한 삽입의 비제한적인 예는 문헌 [Blood(2015) 126 (15): 1777-1784]에 기재된 알부민 유전자좌로의 삽입이며, 이는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 알부민으로의 삽입은 이식유전자의 혈액 내로의 분비를 가능하게 하는 이점이 있다(예컨대, 실시예 22 참조). 또한, 유전체 세이프 하버 부위는 당업계에 알려지고 예컨대, Papapetrou, ER& Schambach, A.의 문헌 [Molecular Therapy 24(4):678-684(2016)] 또는 Sadelain 등의 문헌 [Nature Reviews Cancer 12:51-58(2012)]에 기재된 기법을 사용하여 결정될 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다. 아데노 연관 바이러스(AAV) 유전체 내의 세이프 하버 부위(예컨대, AAVS1 세이프 하버 부위)가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 본 명세서에서 구체적으로 고려된다(예컨대, Oceguera-Yanez 등의 문헌 [Methods 101:43-55(2016)] 또는 Tiyaboonchai, A 등의 문헌 [Stem Cell Res 12(3):630-7(2014)] 참조, 이들 각각의 내용은 그 전체가 인용에 의해 포함됨). 예를 들어, AAVS1 유전체 세이프 하버 부위는 배아 줄기 세포(예컨대, 인간 배아 줄기 세포) 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)에서 조혈 특이적 이식유전자 발현 및 유전자 침묵의 목적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 또한, 염색체 19의 AASV1 세이프 하버 부위에 삽입하기 위한 합성 또는 상업적으로 입수 가능한 동형 방식 수선 공여체 주형이 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 또는 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 동형 방식 수선 주형 및 가이드 RNA는 예컨대, Palo Alto, CA 소재의 System Biosciences에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 이식유전자를 발현하거나 T세포에서 표적 유전자의 발현을 녹아웃 또는 감소시키는 데 사용되어 예컨대, 개선된 입양 세포 전달 및/또는 CAR-T 요법을 위해 T세포를 조작한다(예컨대, 실시예 24 참조). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전자를 녹아웃하는 이식유전자를 발현할 수 있다. 치료와 관련된 T세포의 녹아웃의 비제한적인 예는 문헌 [PNAS(2015) 112(33):10437-10442]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
C. 유전자 요법의 예시적인 질병
일반적으로, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 관련된 증상을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 상기 설명에 따라 임의의 이식유전자(관심 대상 핵산으로도 지칭됨)를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질병 상태는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A형, B, C, 및 D), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리시오드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근 이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간 내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2) 및 카텝신 A 결핍증, 낭성 섬유증(및 기타 폐 질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 기타 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증, 간질 및 기타 신경 장애, 암, 당뇨병, 근 이영양증(예컨대, 뒤시엔느, 베커), 헐러병, 아데노신 탈아미노효소 결핍증, 대사 결함, 망막 변성 질환(및 기타 눈의 질병), 미토콘드리아증(예컨대, 레버 유전성 시신경병증(LHON), 레이 증후군, 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예컨대, 안면견갑상완형 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 장기 질환(예컨대, 뇌, 간, 신장, 심장) 등. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 합성 생산 방법에 의해 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)는 대사 장애(예컨대, 오르니틴 트랜스카바밀라아제 결핍증)이 있는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 명세서에 기재된 ssDNA 분자는 A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증)을 치료하거나 예방하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증)은 유전자 또는 유전자 산물의 돌연변이에 의해 발생하는 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 대사 질환 또는 장애(예컨대, 파브리병, 고셰병, 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐 축적 질병); 요소 주기 질환 또는 장애(예컨대, 오르니틴 카르바밀 전달효소(OTC) 결핍증); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예컨대, 이염색 백색질장애(MLD), 점액다당류증 II형(MPSII; 헌터 증후군)); 간 질환 또는 장애(예컨대, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC)); 혈액 질환 또는 장애(예컨대, 혈우병(A형 및 B형), 지중해빈혈, 및 빈혈증); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애(예컨대, 낭성 섬유증).
또 다른 양태로서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 이식유전자 발현(예컨대, 본 명세서에 기재된 호르몬 또는 성장 인자를 인코딩하는 이식유전자)의 수준을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오티드 서열을 전달하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예컨대, 단백질의 부재 또는 단백질 결함)을 교정하는 데 사용될 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 단백질의 부재 또는 단백질 결함으로 인해 발생하는 특정 질환 또는 장애로 인한 증상을 경감 또는 감소시키거나 상기 질환 또는 장애에 이점을 부여하도록 기능적 단백질을 생산하고/하거나 단백질의 수준을 변경할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍증의 치료는 기능적 OTC 효소를 생산함으로써 달성될 수 있고; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX, 및 인자 X의 수준을 변경시킴으로써 달성될 수 있고; PKU의 치료는 페닐알라닌 하이드록실라아제 효소의 수준을 변경시킴으로써 달성될 수 있고; 파브리병 또는 고셰병의 치료는 기능적 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다아제를 생산함으로써 각각 달성될 수 있고; MLD 또는 MPSII의 치료는 기능적 아릴설파타아제 A 또는 이두로네이트-2-설파타아제를 생산함으로써 각각 달성될 수 있고; 낭성 섬유증의 치료는 기능적 낭성 섬유증 막관통 전도도 조절인자를 생산함으로써 달성될 수 있고; 글리코겐 축적 질병의 치료는 기능적 G6Pase 효소 기능을 복원함으로써 달성될 수 있고; 및 PFIC의 치료는 기능적 ATP8B1, ABCB11, ABCB4, 또는 TJP2 유전자를 생산함으로써 달성될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 시험관 내 또는 생체 내에서 세포에 안티센스 핵산을 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상 이식유전자 또는 핵산이 RNAi 분자인 경우, 표적 세포에서 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 이식유전자를 투여하여 이를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예컨대, 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관 내에서 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 인코딩된 예시적인 관심 대상 이식유전자 또는 핵산은 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: X, 리소좀 효소(예컨대, 테이-삭스병과 연관된 헥소사미니다아제 A, 또는 헌터 증후군/MPS II와 연관된 이두로네이트 설파타아제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 하이드록실라아제 뿐만 아니라 사이토카인(예컨대, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨 12, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소, 등), 펩티드 성장 인자 및 호르몬(예컨대, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 신경영양 인자-3 및 4, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 교세포 유래 성장 인자(GDNF), 변형 성장 인자-α 및 -β, 등), 수용체(예컨대, 종양 괴사 인자 수용체). 일부 예시적인 구현예에서, 상기 이식유전자는 하나 이상의 원하는 표적에 특이적인 단클론 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 이식유전자가 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 상기 이식유전자는 두 개의 상이한 관심 대상 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 상기 이식유전자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체를 인코딩하며, 여기에는 전장 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원 결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 이식유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제, 및 종양 괴사 인자), 암 요법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.
대표적인 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 발현된 이식유전자는 이를 필요로 하는 대상체의 근 이영양증을 치료하는 데 사용될 수 있고, 상기 방법은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 치료적, 개선적 또는 예방적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 디스트로핀, 미니 디스트로핀, 마이크로 디스트로핀, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, IGF-1, Ikappa B 우성 돌연변이체와 같은 항염증성 폴리펩티드, 사르코스판, 우트로핀, 마이크로 디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸, β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 인코딩하는 관심 대상 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 합성 생산 방법에 의해 생산된 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 골격근, 심장근 또는 횡격막근에 이식유전자를 전달하여, 일반적으로 혈액에서 순환하는 폴리펩티드(예컨대, 효소) 또는 기능성 RNA(예컨대, RNAi, 마이크로RNA, 안티센스 RNA)를 생산하거나, 장애(예컨대, 대사 장애, 당뇨병(예컨대, 인슐린), 혈우병(예컨대, VIII), 점액다당류 장애(예컨대, 슬라이 증후군, 헐러 증후군, 샤이 증후군, 헐러-샤이 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군 A, B, C, D, 모르키오 증후군, 마로토-라미 증후군 등) 또는 리소좀 축적 장애(예컨대, 고셰병[글루코세레브로시다제], 폼페병[리소좀산 알파-글루코시다제] 또는 파브리병[알파-갈락토시다제 A]) 또는 글리코겐 축적 장애(예컨대, 폼페병[리소좀산 알파-글루코시다제])를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 다른 조직에 전신적으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 다른 적절한 단백질이 위에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 이를 필요로 하는 대상체의 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법에서 이식유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 대사 장애 및 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자가 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 폴리펩티드는 선택적으로 분비된다(예컨대, 자연 상태에서 분비되는 폴리펩티드이거나, 예컨대, 당업계에 알려진 분비 신호 서열과의 작동 가능한 결합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩티드).
본 개시의 다른 일 양태는 이를 필요로 하는 대상체의 선천성 심부전 또는 PAD를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포유류 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 예컨대, 근형질 소포체 Ca2+-ATPase(SERCA2a), 혈관신생 인자, 인산가수분해효소 억제제 I(I-1), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람판 S16E와 같은 포스포람판 억제성 또는 우성 음성 분자, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 집게 단백질, β2-아드레날린 수용체, β2-아드레날린 수용체 키나아제(BARK), PI3 키나아제, 칼사르칸, β-아드레날린 수용체 키나아제 억제제(βARKct), 단백질 인산가수분해효소 1의 억제제 1, S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 고리화효소 6형, 절단된 조적적 활성 βARKct와 같은 G-단백질 결합 수용체 키나아제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208을 인코딩하는 관심 대상 유전자 또는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 임의의 적절한 수단에 의해 대상체의 폐에 투여될 수 있으며, 선택적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 호흡 가능 입자의 에어로졸 현탁액을 투여하여 대상체가 흡입할 수 있다. 상기 호흡 가능 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 알려진 임의의 적절한 수단, 예컨대, 압력 구동 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729를 참조한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약제학 분야에 알려진 기술에 의해 임의의 고체 미립자 약물 에어로졸 발생기에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 CNS 조직(예컨대, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 유전 질환, 신경퇴행성 장애, 정신 장애 및 종양을 포함하는 CNS 질병을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 예시적인 CNS 질병은 다음을 포함하되 이로 제한되지 않는다: 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 카나반병, 레이병, 레프숨병, 투렛 증후군, 원발성 측색 경화증, 근위축성 측색 경화증, 진행성 근위축증, 픽병, 근이영양증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스완거병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이 삭스병, 레쉬-니한병, 간질, 뇌경색증, 기분 장애를 포함하는 정신 장애(예컨대, 우울증, 양극성 정동 장애, 지속적인 정동 장애, 이차 기분 장애), 조현병, 약물 의존(예컨대, 알코올 중독 및 기타 물질 의존), 신경증(예컨대, 불안, 강박 장애, 신체형 장애, 해리성 장애, 슬픔, 산후 우울증), 정신병(예컨대, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성적 장애, 수면 장애, 통증 장애, 섭식 또는 체중 장애(예컨대, 비만, 악액질, 신경성 식욕부진, 및 폭식증) 및 CNS의 암 및 종양(예컨대, 뇌하수체 종양).
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 치료, 완화 또는 예방될 수 있는 안구 질환은 망막, 후관, 및 시신경(예컨대, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 및 기타 망막변성 질환, 포도막염, 노인성 황반변성, 녹내장)을 포함하는 안과 질환을 포함한다. 많은 안과 질환 및 장애는 (1) 혈관 신생, (2) 염증, 및 (3) 변성의 세 가지 유형의 적응증 중 하나 이상과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 항혈관신생 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지연시키거나, 세포 보존을 촉진하거나, 세포 성장을 촉진하는 인자 및 이들의 조합을 전달하는 데 사용될 수 있다. 당뇨병성 망막병증은 예컨대, 혈관신생으로 특징지어진다. 당뇨병성 망막병증은 하나 이상의 항혈관형성 인자를 안구 내(예컨대, 유리체) 또는 안구 주위(예컨대, 안각건하 영역)에 전달함으로써 치료될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자가 안구 내(예컨대, 유리체 내) 또는 안구 주위에 함께 전달될 수도 있다. 본 개시의 ssDNA 분자로 치료, 개선 또는 예방할 수 있는 추가적인 안구 질환은 지도모양 위축, 혈관성 또는 "습성" 황반 변성, 스타가르트병, 레버 선천성 흑암시(LCA), 어셔 증후군, 탄력섬유성 가황색종(PXE), x-연관 색소성 망막염(XLRP), x-연관 망막층간분리증(XLRS), 맥락막 결손증, 레버 유전성 시신경병증(LHON), 전색맹, 간상세포 이상증, 푹스 각막내피 이상증, 당뇨병성 황반부종 및 안구암과 종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 염증성 안구 질환 또는 장애(예컨대, 포도막염)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 치료, 개선, 또는 예방될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 안구 내(예컨대, 유리체 또는 안전방)에 투여하면 하나 이상의 항염증 인자가 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 망막 변성으로 특징지어지는 안구 질환 또는 장애(예컨대, 색소성 망막염)는 본 개시의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의해 치료, 개선, 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 신경영양 인자를 인코딩하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 안구 내(예컨대, 유리체) 투여는 이러한 망막 변성 기반 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈관신생 및 망막 변성을 모두 수반하는 질환 또는 장애(예컨대, 노인성 황반 변성)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 치료될 수 있다. 노인성 황반 변성은 하나 이상의 신경영양 인자를 안구 내(예컨대, 유리체)로 및/또는 하나 이상의 항혈관신생 인자를 안구 내 또는 안구 주위(예컨대, 안각건하 영역)로 인코딩하는 본 명세서에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 투여함으로써 치료될 수 있다. 녹내장은 안압 증가 및 망막 신경절 세포의 손실로 특징지어진다. 녹내장 치료에는 본 명세서에 개시된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 사용하여 흥분독성 손상으로부터 세포를 보호하는 하나 이상의 신경보호제를 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 제제는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 길항제, 사이토카인, 및 신경영양 인자를 포함하며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 사용하여 안구 내로, 선택적으로 유리체 내로 전달될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 발작의 치료, 예컨대, 발작의 발병, 발생 또는 중증도를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 발작에 대한 치료적 치료의 유효성은 행동(예컨대, 떨림, 눈 또는 입의 틱) 및/또는 뇌파상 수단(대부분의 발작은 특징적인 뇌파상 이상을 보임)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 시간이 지남에 따라 여러 번의 발작이 나타나는 뇌전증을 치료하는 데에도 사용될 수 있다. 하나의 대표적인 구현예에서, 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)이 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 사용하여 뇌에 투여된다. 본 구현예에 따르면, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)을 인코딩하는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 뇌하수체 내로의 미세주입에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료법은 말단비대증(뇌하수체로부터의 비정상적인 성장 호르몬 분비)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 소마토스타틴의 핵산(예컨대, GenBank 수탁 번호 J00306) 및 아미노산(예컨대, GenBank 수탁 번호 P01166; 처리된 활성 펩티드 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14 포함) 서열은 당업계에 알려져 있다. 특정 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 미국 특허 제7,071,172호에 기재된 바와 같이 분비 신호를 포함하는 이식유전자를 인코딩할 수 있다.
본 개시의 또 다른 양태는 생체 내에서 대상체에게 전신 전달하기 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능적 RNA(예컨대, 리보자임)를 생산하는 데 있어 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 안티센스 핵산, 리보자임(예컨대, 미국 특허 제5,877,022호에 기재된 바와 같음), 스플라이소좀 매개 트랜스스플라이싱에 영향을 미치는 RNA(Puttaraju 등의 문헌(1999) [Nature Biotech. 17:246]; 미국 특허 제6,013,487호; 미국 특허 제6,083,702호 참조), 유전자 침묵을 매개하는 간섭 RNA(RNAi)(Sharp 등의 문헌(2000) [Science 287:2431] 참조) 또는 "가이드" RNA와 같은 기타 비번역 RNA(Gorman 등의 문헌(1998) [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929]; Yuan 등의 미국 특허 제5,869,248호) 등을 인코딩하는 관심 대상 이식유전자 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 리포터 폴리펩티드(예컨대, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리 인산가수분해효소와 같은 효소)를 인코딩하는 이식유전자를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 실험 또는 진단 목적으로 유용한 리포터 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리 인산분해효소, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT), 루시페라아제, 및 당업계에 주지된 다른 것들 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 진단 목적으로, 또는 이들이 투여되는 대상체에서 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 활성 표지자로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 숙주 염색체의 유전자좌와 상동성을 공유하고 이의 유전자좌와 재조합되는 관심 대상 이식유전자 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 상기 숙주 세포의 유전적 결함을 교정하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 예컨대, 백신접종을 위해 대상체에서 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있는 관심 대상 이식유전자 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이식유전자는 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 세균 항원, 바이러스 항원 등의 면역원을 포함하되 이로 제한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 관심 대상 면역원을 인코딩할 수 있다.
D. 성공적인 유전자 발현의 시험
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의한 유전자 전달의 효율을 시험하기 위해 당업계에 주지된 분석법이 사용될 수 있으며, 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 수행될 수 있다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의한 원하는 이식유전자의 녹인 또는 녹아웃은 원하는 이식유전자의 mRNA 및 단백질 수준을 측정함으로써 당업자에 의해 평가될 수 있다(예컨대, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석, 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)). 본 명세서에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자에 의한 핵산 변경((예컨대, 점 돌연변이, 또는 DNA 영역의 결실)은 유전체 표적 DNA의 심층 서열분석에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 예컨대, 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기를 통해 리포터 단백질의 발현을 검사함으로써, 원하는 이식유전자 또는 관심 대상 핵산의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체 내 적용의 경우, 단백질 기능 분석을 사용하여 주어진 유전자 및/또는 유전자 산물의 기능을 시험하여 유전자 발현이 성공적으로 이루어졌는지 확인할 수 있다. 예를 들어, 음이온 채널을 통해 음이온(예컨대, Cl-)을 이동시키는 CFTR의 능력을 억제하는 낭성 섬유증 막관통 전도도 조절인자 유전자(CFTR)의 점 돌연변이는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자와 함께 기능적(즉, 돌연변이되지 않은) CFTR 유전자를 대상체에게 전달함으로써 교정될 수 있는 것으로 예상된다. 당업자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 투여 후, 음이온이 음이온 채널을 통해 이동할 수 있는 능력을 평가하여 CFTR 유전자가 전달되고 발현되었는지 여부를 확인할 수 있다. 당업자는 시험관 내 또는 생체 내에서 단백질의 기능성을 측정하기 위한 최상의 시험을 결정할 수 있을 것이다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로부터의 이식유전자의 세포 또는 대상체에서의 유전자 발현의 효과는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속될 수 있거나, 영구적일 수 있는 것으로 본 명세서에서 고려된다.
X. 투여
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강 내, 흡입(예컨대, 에어로졸을 통한), 구강(예컨대, 설하), 질, 경막 내, 안구 내, 경피, 내피 내, 자궁 내(또는 난소 내), 비경구(예컨대, 정맥 내, 피하, 피 내, 두개 내, 근육 내[골격, 횡격막, 및/또는 심근에 대한 투여 포함], 흉막 내, 뇌 내, 및 관절 내), 국소(예컨대, 피부 및 점막 표면(기도 표면 포함) 둘 다에 대한 국소 투여 및 경피 투여), 림프 내, 등 뿐만 아니라 (예컨대, 간, 눈, 골격근, 심근, 횡격막 근육, 또는 뇌에 대한) 직접적인 조직 또는 기관 주사를 포함한다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 투여는 대상체의 임의의 부위에 대한 투여일 수 있으며, 여기에는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부, 및 눈으로 구성된 군으로부터 선택되는 부위가 포함되나 이로 제한되지는 않는다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 투여는 또한 종양(예컨대, 종양 또는 림프절 내 또는 그 근처)에 대한 투여일 수 있다. 임의의 주어진 사례에 가장 적합한 경로는 치료, 개선, 및/또는 예방하려는 병태의 성질 및 중증도, 및 사용되는 특정 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 사용하면 단일 벡터, 또는 다수의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, ssDNA 칵테일)에 있는 하나 초과의 이식유전자를 투여할 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 투여는 본 개시에 따른 골격근에 대한 것일 수 있으며, 사지(예컨대, 상박, 하박, 상퇴, 및/또는 하퇴), 등, 경부, 두부(예컨대, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음부 및/또는 손가락의 골격근에 대한 투여를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 복강 내 투여, 사지 관류, (선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리 사지 관류; 예컨대, Arruda 등의 문헌(2005) [Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육 내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체(예컨대, DMD와 같은 근이영양증이 있는 대상체)의 사지(팔 및/또는 다리)에 사지 관류, 선택적으로 격리 사지 관류, 예컨대, 정맥 내 또는 관절 내 투여를 통해 투여된다. 특정 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 DNA 벡터는 '유체역학적' 기법을 사용하지 않고 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 고농도의 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물로 쉽게 제형화되어, 미국 특허 제8,846,102호; 제9,404,088호; 및 제9,850,323호(이들 각각은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 DNA 장용 코팅 알약으로 경구 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격을 포함하는 심장 근육에 투여될 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 예컨대, 대동맥내 투여, 직접 심장 주사(예컨대, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 내로), 및/또는 관상 동맥 관류를 통해 심장 근육에 전달될 수 있다. 횡격막근에 대한 투여는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 및/또는 복강 내 투여를 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근에 대한 투여는 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 및/또는 복강 내 투여를 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 평활근 내, 근처 및/또는 평활근에 존재하는 내피 세포에 대한 투여일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 DNA 벡터는 골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에 투여된다(예컨대, 근이영양증 또는 심장 질환(예컨대, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해).
특정 구현예에서, 다양한 간격의 기간, 예컨대, 하루, 일주일, 한 달, 일 년 등에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 하나 초과의 투여(예컨대, 2, 3, 또는 4회 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 하나의 종으로 제한되지 않는다. 따라서, 다른 일 양태에서, 상이한 이식유전자 또는 동일한 이식유전자를 포함하지만 상이한 프로모터 또는 시스 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 다수의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 전략은 다수의 유전자의 유전자 요법 또는 유전자 전달을 동시에 가능하게 할 수 있다. 또한, 이식유전자의 상이한 부분을 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있는 별도의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 분리하는 것이 가능하며, 별도로 조절할 수 있어 이식유전자의 발현 조절 수준을 추가할 수 있다. 또한, 전달은 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항캡시드 숙주 면역 반응이 결여된 것을 고려하여, 중요하게도 임상 환경에서의 유전자 요법의 경우 이후 용량을 증가시키거나 감소시켜 여러 번 수행될 수 있다. 캡시드가 없기 때문에 항캡시드 반응은 발생하지 않을 것으로 예상된다.
A. 생체 외 치료
일부 구현예에서, 대상체로부터 세포가 제거되고 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 그 안에 도입된 다음 상기 세포가 상기 대상체에게 다시 이식된다. 생체 외 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거한 다음, 해당 대상체에게 다시 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,399,346호 참조). 또는, 본 명세서에 기재된 합성 프로세스를 사용하여 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자(예컨대, 합성 AAV 벡터, 예컨대, 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터)가 다른 대상체로부터의 세포, 배양된 세포, 또는 임의의 다른 적절한 공급원으로부터의 세포 내로 도입되고, 해당 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 함께 "치료적 유효량"으로 상기 대상체에게 투여된다. 당업자는 상기 대상체에게 어느 정도의 이점이 제공되는 한, 치료적 효과가 완전하거나 치유적일 필요는 없다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 바람직하게는 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 세포에서 생산되는 임의의 폴리펩티드인 이식유전자를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 이전에 논의된 바와 같은 치료 방법에서의 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용도와 대조적으로, 일부 구현예에서, 예컨대, 항원 또는 백신을 생산하기 위해 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 배양된 세포 및 이로부터 단리된 발현 유전자 산물 내로 도입할 수 있다.
단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 수의학적 및 의학적 적용 분야에 모두 사용될 수 있다. 전술한 바와 같은 생체 외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체는 조류(예컨대, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유류(예컨대, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼목 동물) 둘 모두를 포함하며, 이중 포유류가 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체는 신생아, 영유아, 청소년, 및 성인을 포함한다.
본 명세서에 기재된 기술의 일 양태는 이식유전자(관심 대상 핵산)를 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 시험관 내 방법의 경우, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 바람직하게는 생물학적으로 유효한 양으로 세포에 투여된다. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자가 생체 내 세포에(예컨대, 대상체에게) 투여되는 경우, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 생물학적 유효량은 표적 세포에서 이식유전자의 형질도입 및 발현을 초래하기에 충분한 양이다.
B. 용량 범위
생체 내 및/또는 시험관 내 분석법은 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 사용을 위한 최적의 투여량 범위를 식별하는 데 선택적으로 사용될 수 있다. 제형에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 병태의 중증도에 따라 달라지며, 이는 당업자의 판단 및 개별 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험계에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 원하는 조직의 세포를 형질전환하고 중간한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 종래의 투여 경로 및 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 선택된 기관에 대한 직접 전달(예컨대, 간으로의 문맥 내 전달), 경구, 흡입(비강 내 및 기관 내 전달 포함), 안구 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피 내, 종양 내, 및 기타 비경구 투여 경로와 같은 "투여" 항에서 전술한 경로를 포함하되 이로 제한되지 않는다. 투여 경로는 필요한 경우 조합될 수 있다.
특정 "치료적 효과"의 달성을 위해 필요한 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 양의 투약은 핵산 투여 경로, 치료적 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현의 수준, 치료될 특정 질환 또는 장애, 및 유전자, RNA 산물, 또는 생성된 발현된 단백질의 안정성을 포함하되 이로 제한되지 않는 여러 인자에 따라 달라진다. 당업자는 전술한 인자뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 인자를 기반으로 특정 질환 또는 장애가 있는 환자를 치료하기 위한 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여량 양생법은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예컨대, 여러 용량이 매일 투여될 수 있거나, 치료적 상황의 긴급성이 나타내는 바에 따라 용량은 비례적으로 감소될 수 있다. 당업자는 이러한 올리고뉴클레오티드가 세포 또는 대상체에게 투여되어야 하는지의 여부에 관계없이, 해당 올리고뉴클레오티드의 적절한 용량 및 투여 일정을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이며, 특정 응용에 따라 상이할 것이다(신경 세포는 매우 적은 양을 필요로 하는 반면, 전신 주사는 많은 양을 필요로 할 것임). 예를 들어, 인간 대상체의 골격근 또는 심장근 내로의 직접적인 생체 내 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 정도일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 포함하는 DNA 벡터의 전달에 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예상된다. 또한, 치료적 유효 용량은 하나 이상의 질병 증상을 감소시키지만 유의한 표적 외 또는 유의한 부작용을 초래하지 않는, 대상체에게 영향을 미치기에 충분한 양의 이식유전자를 발현하는 단일가닥 DNA(ssDNA) 분자의 양이다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 당업자에게 주지되어 있으며, 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 다양한 치료 양생법에서 사용하기 위한 적절한 투약 및 치료 양생법의 개발도 마찬가지이다.
시험관 내 형질주입의 경우, 세포(lx106개 세포)에 전달되는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 유효량은 0.1 내지 100 μg, 바람직하게는 1 내지 20 μg, 보다 바람직하게는 1 내지 15 μg 또는 8 내지 10 μg 정도의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자일 것이다. 더 큰 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 더 많은 용량을 필요로 할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관 내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 일반적으로 동일한 양의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 전달하기 위한 것이다.
치료는 단일 용량 또는 다회 용량의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 용량이 대상체에게 투여될 수 있다. 실제로, 합성적으로 생산된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 바이러스 캡시드가 없으므로 항캡시드 숙주 면역 반응을 유도하지 않고, 합성적으로 생산되므로 그 제형에 원하지 않는 세포 오염물을 포함되지 않기 때문에 필요에 따라 다회 용량이 투여될 수 있다. 따라서, 당업자는 적절한 용량의 횟수를 용이하게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 횟수는 예컨대, 1 내지 100회, 바람직하게는 2 내지 20회 용량 정도일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자를 투여함으로써 유도되는 전형적인 항바이러스 면역 반응이 없다는 점(즉, 캡시드 성분의 부재)으로 인해 상기 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 숙주에 여러 번 투여될 수 있다. 일부 구현예서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 횟수는 2 내지 10회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회)의 범위이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자는 대상체에게 10회 넘게 전달된다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 1일에 1회(예컨대, 24시간 기간) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 1주(예컨대, 7일)에 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 2주에 1회(예컨대, 2주 기간에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 1개월에 1회(예컨대, 30일에 1회) 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, ssDNA 분자의 용량은 6개월에 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자의 용량은 1년(예컨대, 365일 또는 윤년의 경우 366일)에 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
C. 단위 투여형
일부 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 단위 투여형으로 편리하게 제공될 수 있다. 단위 투여형은 통상적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 적용된다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 흡입에 의해 투여되도록 구성된다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 기화기(vaporizer)에 의해 투여되도록 구성된다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 분무기(nebulizer)에 의해 투여되도록 구성된다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 연무기(aerosolizer)에 의해 투여되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 단위 투여형은 경구 투여, 구강 투여, 또는 설하 투여에 적합하다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 정맥 내, 근육 내, 또는 피하 투여에 적합하다. 일부 구현예서, 상기 단위 투여형은 경막 내 또는 뇌실 내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 제형을 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료적 효과를 내는 화합물의 양이다.
XI. 키트
본 개시는 본 명세서의 파트 II 또는 파트 III에 기재된 단일 가닥 DNA(ssDNA) 분자 중 하나 이상을 포함하거나, 하나 이상의 추가 성분과 함께 제형화되거나, 하나 이상의 사용 지침으로 조제된 조성물과 치료적 및/또는 진단적 키트를 제공한다.
실시예
실시예 1. ceDNA로부터 단일 가닥 합성 AAV 벡터의 합성 생산
포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 사용하여 이중 가닥 ceDNA로부터 단일 가닥(ss) 합성 AAV 벡터를 생성하는 프로세스 및 방법을 예시하였다. 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 형성한다. 천연 포스포디에스테르 결합은 뉴클레아제에 의한 급속한 분해에 매우 취약하지만, 포스포로티오에이트(PS) 결합 치환체를 사용한 뉴클레오티드 간 결합의 변형은 가수분해에 대해 훨씬 더 안정적이다. 이 방법을 사용하여, 이중 가닥 ceDNA 작제물로부터 두 개의 ITR이 있는 ss 합성 AAV 벡터를 생산하였다. 예시적인 이중 가닥 ceDNA 작제물 및 해당 핵산 서열 식별자(서열번호)가 아래 표 5에 제시되어 있다.
표 5.
도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 이중 가닥 ceDNA 작제물 10429에서 시작하여 ssDNA 엔도뉴클레아제 처리를 통해 ssAAV 벡터를 수득하였다.
간략하게, 800 ng dsDNA, ssDNA 대조군 또는 RES ssDNA(ssDNA Nanodrop으로 측정)에 대해 37℃에서 30분 동안 녹두 뉴클레아제 처리를 수행하였다. 이중 가닥 ceDNA 작제물 10360을 대조군으로서 사용하였다. 도 1a에서 볼 수 있듯이, ssRES ss360 대조군에서는 약 830 bp의 명확한 밴드가 관찰되었으며, φX174 ssDNA 대조군에서는 명확한 분해가 나타났다. 웰에서 전체 크기의 ssRES ss429가 손실되었으며, 5U 녹두 뉴클레아제 처리를 통해 더 두드러지거나 명확하게 보이는 약 100 bp의 밴드 이동이 나타났다. B/C 스템이 45 bp 스템과 여전히 염기쌍을 이루고 있을 수 있다는 가설이 세워졌는데, 이 가설이 예상보다 더 크게 나온 이유를 설명할 수 있을 것이다. 도 1b는 이중 가닥 ceDNA 10429 작제물("ds429")과 단일 가닥 10429 및 10360의 모식도이다.
Klenow 단편은 중합효소 활성을 보유하지만, 5'→> 3' 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성의 결여는 효소가 분자 3' 말단부터 제거하지 않는다는 것을 의미하며, 5'→3' 활성의 결여는 효소가 분자의 5' 말단에 도달했을 때 효소가 분자의 5' 말단을 파괴하지 않는다는 것을 의미한다. SDS-PAGE 결과는 ss10429 분자를 Klenow(3'→5' exo-)로 처리하면 밴드가 시작 ceDNA 분자의 크기로 이동한다는 것을 보여주었다. 도 2에 도시된 바와 같이, ss 합성 AAV 벡터 분자의 Klenow 엑소뉴클레아제 충진은 3'-OH의 존재를 뒷받침하였다.
T7 엑소뉴클레아제 처리
이 실시예에서, 이중 가닥 ceDNA 작제물 10429로부터 두 개의 ITR이 있는 단일 가닥 AAV 벡터를 생산하였다. T7 엑소뉴클레아제를 사용하여 90 μg의 이중 가닥 ceDNA 작제물 10429 + Nb.BbvCI 니킹 반응을 처리하였다.
표 6.
니킹 반응은 다음과 같이 수행하였다:
1.5 mL 마이크로퓨지 튜브 내 100 μg의 ds10483를 니킹한다. 아래 표 7과 같이 각 ds ceDNA에 대해 50 μg 반응을 두 번 설정한 다음 Thermomixer에서 37℃에서 2시간 10분 동안 배양한다. Zymo-25 Clean and Concentrate 키트 또는 Qiagen Qiaquick PCR 정제 컬럼으로 정제한다.
표 7.
이 실시예에서, T7-엑소뉴클레아제를 사용하여 Nb.BbvCI 닉 부위와 오른쪽 ITR 올리고의 5개 PS 결합 사이의 (+) 가닥을 선택적으로 제거하였다. PS 결합은 염기쌍을 안정화시키고 5' 및/또는 3' 말단에서 잠금부로서 작용하여 T7-엑소뉴클레아제가 기능하는 위치의 정확성을 보장하는 데 사용될 수 있다는 것이 본 개시의 발견이었다.
니킹된 ds10429는 약 7200개 뉴클레오티드(약 3600 bp)이다. 이 실험의 목적은 Nb.BbvCI 닉 부위와 오른쪽 ITR 올리고의 5개의 PS 결합 사이에 있는 3449개의 뉴클레오티드를 분해하는 것이었다(화학량론적 RES 엑셀의 잔류 DNA 크기에 3449를 입력). 화학량론적 RES 엑셀에 따르면 T5 엑소뉴클레아제(따라서 T7)가 90 ug의 3600 bp(7200 nt)로부터 3449 nt를 방출하는 데 280 U의 효소가 필요하다.
그런 다음, 이 반응의 규모를 확대하였다. 10 μg의 니킹된 시작 ceDNA를 50 μL의 반응 부피로 만들었다. 반응을 설정하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 최종 농도가 약 15 mM가 되도록 EDTA를 첨가하여 반응물을 퀀칭시켰다.
13.5 μL의 0.5 M EDTA를 450 μL의 반응물에 첨가하고(약 14.5 mM의 EDTA 최종 농도), Zymo-25 Clean and Concentrate 키트 또는 Qiagen Qiaquick PCR 정제 컬럼으로 혼합하고 정제하였다.
ssDNA의 무세포 합성을 위한 다른 방법
본 발명의 ssDNA 분자는 (전술한 바와 같이) 예컨대, 3' 및/또는 5' 말단에서 부분 DNA 이중체 구조에 포스포로티오에이트 결합을 혼입 처리하는 단계, ceDNA를 니킹하는 단계, 및 이어서 상기 분자를 엑소뉴클레아제(예컨대, T7 엑소뉴클레아제)로 처리하여 하나의 가닥을 제거하는 단계에 의해 생산된다. 본 발명의 ssDNA 분자는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 생산될 수도 있다. 예를 들어, 단일 프라이머 신장법을 사용하여 플라스미드 주형으로부터 선형 ssDNA 분자를 생성한 다음, 어닐링 단계를 거쳐 3' 및/또는 5' 말단의 부분 이중체가 형성되도록 할 수 있다. 다른 실시예에서, 이중 가닥 DNA 분자(예컨대, 플라스미드)를 제한 효소로 처리하여 ssDNA 분자를 이중 가닥 형태로 잘라낸 다음, 원하는 ssDNA 가닥의 변성 및 정제를 수행할 수 있다. 정제는 예컨대, 고체 지지체(예컨대, 컬럼, 어레이, 또는 비드)에 결합된 친화도 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 정제 후, 어닐링 단계는 전술한 바와 같이 수행된다.
실시예 2. 예시적인 단일 가닥 ceDNA ITR
단일 가닥 합성 DNA 분자의 요약은 아래 표 8에 나와 있다.
표 8.
도 3 내지 도 7은 예시적인 단일 가닥 AAV(ssAAV) 합성 벡터 왼쪽 및 오른쪽 ITR을 보여준다. 도 3은 대칭 대 비대칭 ITR 올리고의 모식도이다. 위쪽 도면은 대칭 오버행을 도시한 것이다. 아래쪽 도면은 비대칭 오버행을 도시한 것으로, 여기서 왼쪽 ITR의 3' 말단에는 PS 결합이 있고(분자의 3' 말단에 더 가까움) 오른쪽 ITR에는 2개 염기만큼 오른쪽으로 이동한 PS 결합이 있다.
도 3 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 비대칭 올리고에서는 ssAAV 합성 벡터의 3' 말단에 더 가까운 왼쪽 ITR에 PS 결합이 배치될 수 있다.
hAAT-루시페라아제 작제물은 trs 부위의 하류 영역에 단일 Nb.BbvCI 닉 부위만 조작되어 있기 때문에 유익하다. 도 4는 작제물 ss10429 및 ss10483의 대칭 ITR 올리고를 포함하는 ssAAV 합성 벡터 hAAT-루시페라아제 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 도 4에 도시된 바와 같이, A/A' 스템의 RBE에 있는 일부 뉴클레오티드를 변경하는 CpG 없는 스페이서가 포함되었다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다. 도 5는 작제물 ss10485의 비대칭 ITR 올리고를 포함하는 ssAAV 합성 벡터 hAAT-루시페라아제 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, A/A' 스템의 RBE에 있는 일부 뉴클레오티드를 변경하는 CpG 없는 스페이서가 포함되었다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다.
도 6은 작제물 ss10491의 대칭 ITR 올리고를 포함하는 ssAAV 합성 벡터 FVIII 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 도 7은 작제물 ss10484의 비대칭 ITR 올리고를 포함하는 ssAAV 합성 벡터 FVIII 왼쪽 및 오른쪽 ITR 서열의 모식도이다. 닉 부위 Nb.BbvCI가 trs의 하류 영역에 조작되었다.
이들 작제물은 포유류 세포 내에서 뉴클레아제에 의한 분해를 감소시키는 데 잠재적 이점을 제공한다.
실시예 3. ss 합성 DNA로 형질주입된 HepG2 세포는 시험관 내에서 루시페라아제를 발현한다
인간 간암 세포주인 HepG2 세포 30,000개를 100 μL DMEM + 10% FBS가 담긴 콜라겐-I 코팅 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩하였다. 그런 다음, 상기 플레이트를 5% CO2/37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다.
2일차에, 제조사의 지침에 따라 VIAFECT 형질주입 시약으로 형질주입 반응을 설정하였다. DNA 100 ng 당 0.4 μL의 VIAFECT 시약을 사용하였다. 모든 형질주입 혼합물을 최고 용량에서의 분자 수로 정규화한 후, OPTIMEM 배지를 사용하여 모든 혼합물의 10배 계단희석물을 제조하였다. 각 웰에 10 μL의 형질주입 혼합물을 첨가하고, 5% CO2/37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다.
3일차에, 루시페라아제 리포터 활성 및 세포 생존력을 측정하였다. 24시간 후, 상청액을 제거하였다. 96 웰 플레이트에 남아 있는 세포에 PBS를 첨가하고, 제조사의 지침에 따라 Promega CELL TITER FLOUR 키트 시약을 사용하여 세포 생존력을 분석하였다. 분석이 완료된 후, 웰에서 액체를 제거하였다. 액체를 제거한 직후, 제조사 지침에 따라 Promega ONE-GLO 루시페라아제 분석 시스템을 사용하여 반딧불 루시페라아제 리포터 활성을 측정하였다.
결과는 도 8에 나와 있으며, ssAAV 합성 벡터로 형질주입된 HepG2 세포가 루시페라아제를 발현하고 48시간째에 신호 증폭이 관찰된 ceDNA 및 ssAAV 합성 벡터에서 명확한 용량 반응이 있었음을 보여준다. ceDNA는 벤치마크 대조군으로서 사용되었다. 담체 DNA는 저용량 ssAAV 합성 벡터 발현을 약 10배 증가시켰다(미도시). Zymo 컬럼 정제 ssAAV 합성 벡터가 겔 추출 ssAAV 합성 벡터보다 높은 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 잠재적인 원인으로는 Zymo 컬럼 정제에 의한 ceDNA 불순물, 겔 추출 ssAAV 합성 벡터의 일부 분해(일부 3'OH 손실의 가능성), ssAAV 합성 벡터 루시퍼라제 발현이 ceDNA보다 약 10배 낮게 나타난 점 등이 있다. 세포 생존력 및 활성은 24, 48, 및 72시간째에 측정하였다.
도 9 및 도 10은 겔 추출 및 Zymo 컬럼 정제 ssAAV 합성 벡터가 ceDNA에 비해 더 낮은 선천성 면역 반응을 유도하였음을 보여준다.
인간 백혈병 단핵구 세포주인 THP-1은 일반적으로 단핵구 및 대식세포 활성의 조절을 추정하기 위한 모델로 사용된다. 여기서, THP-1 이중 리포터 분석을 다음과 같이 수행하였다. 1일차에, 200 μL RPMI + 10% FBS + 10 ng/mL PMA가 담긴 96웰 플레이트의 각 웰에 100,000개의 THP1 세포를 시딩하였다.
THP1-DUAL™ 세포는 5가지 IFN 자극 반응 요소와 함께 ISG54 최소 프로모터의 조절하에 분비되는 루시퍼라아제 리포터 유전자인 루시아 유전자를 특징으로 한다. THP1-DUAL™ 세포는 또한 NF-κB 컨센서스 전사 반응 요소의 5개의 카피 및 c-Rel 결합 부위의 3개의 카피에 융합된 IFN-β 최소 프로모터에 의해 유도되는 분비형 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP) 리포터 유전자를 발현한다. 그 결과, THP1-DUAL™ 세포는 루시아 루시페라아제의 활성을 평가하여 SEAP의 활성 및 IRF 경로를 모니터링함으로써 NF-κB 경로의 동시 연구를 가능하게 한다.
THP1-Dual WT 또는 THP1-Dual cGAS 녹아웃 세포주를 사용하였다. 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 사용하여 THP1 단핵구를 대식세포로 분화시켰다. 그런 다음, 세포를 5% CO2/37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다.
2일차에 세포를 형질주입하였다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 3000으로 형질주입 반응을 설정하였다. 모든 시험 핵산의 모든 형질주입 혼합물을 100 ng/웰에 해당하는 물질을 사용하여 제조하였다. 단, 이어서 형질주입 혼합물을 OPTIMEM 배지에서 적절히 희석하여 형질주입당 5.1E10 분자의 최대 희석에 필요한 복제 수와 매칭시켰다.
ss 합성 DNA의 경우, 50 ng/웰에 해당하는 양이 필요하였다. 형질주입 혼합물을 희석하여 최고 용량에 도달하였다.
ssDNA의 경우, 6.93 ng/웰에 해당하는 양이 필요하였다. 형질주입 혼합물을 희석하여 최고 용량에 도달하였다.
모든 형질주입 혼합물을 최고 용량에서의 분자 수로 정규화한 후, OPTIMEM 배지에 모든 혼합물의 10배 계단희석물을 제조하였다. 각 웰에 10 μL의 형질주입 혼합물을 첨가하고, 세포를 5% CO2/37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다.
3일차에, 루시아 리포터 활성 및 세포 생존력을 측정하였다. 형질주입 후 24시간째에, 상청액을 수집하고 제조사의 지침에 따라 Invivogen QUANTI-LUC 시약을 사용하여 IFN-루시아 리포터 활성을 측정하였다. 96웰 플레이트에 남아 있는 세포에 PBS를 첨가하고, 제조사의 지침에 따라 Promega CELL TITER FLUOR 키트 시약을 사용하여 세포 생존력을 분석하였다. ceDNA를 벤치마크 대조군으로서 사용하였다.
결과는 도 9 및 도 10에 나와 있다. ssAAV 합성 벡터는 매칭하는 분자 용량에서 ceDNA보다 WT THP1 세포에서 더 적은 루시아 IFN 리포터를 유도하였다. ssAAV 합성 벡터는 ssAAV 합성 벡터의 루시페라아제 이식유전자의 499 nt ssDNA 부분보다 WT 세포에서 더 많은 IFN 리포터를 유도하였다. 고리형 GMP-AMP 합성효소(cGAS) 녹아웃(KO) 세포에서, 최고 ceDNA 용량 및 컬럼 정제 ssAAV 합성 벡터에서 IFN 반응이 나타났으나, 그 외에는 나타나지 않아 cGAS가 ssAAV 합성 벡터 및 ceDNA를 감지했음을 나타낸다.
실시예 4. 단일 가닥 합성 DNA가 내약성 및 발현에 미치는 효과
이 실험은 단일 가닥(ss) 합성 DNA가 ceDNA에 비해 내약성을 개선하고 유전자 발현을 유지하는지 확인하기 위해 수행되었다. 두 가지 핵심 질문, 즉 발현 및 내약성 측면에서 ss 합성 DNA가 ceDNA와 어떻게 비교되는지, 및 용량(예컨대, 몰농도 대 체중) 측면에서 (ss) 합성 DNA(SSD)가 ceDNA와 어떻게 비교되는지를 조사하였다. 두 가지의 주요 판독 축을 사용하였다: IVIS에 의해 4일차, 7일차, 및 28일간 7일 간격으로 측정된 발현 및 6시간에 사이토카인으로 측정된 내약성; 4일차, 7일차, 및 28일간 7일 간격으로 측정된 BW.
아래에 기재된 시험에서는 단일 가닥 합성 AAV가 ceDNA에 비해 내약성을 개선하고 발현을 유지하는지 조사하였다. 시험 설계는 아래 표 9에 나와 있다.
표 9.
동물의 총 수는 45마리였다. 사용된 제형은 수성 완충액 및 유기(EtOH 지질) 혼합 공정에서의 느리고 낮은 농도의 DNA였다. NP 제형은 다음과 같았다: 이온화성 지질 : DSPC : 콜레스테롤, DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000-GalNAc(tri). 입자 크기는 77 내지 80 nM(직경)이었고, 캡슐화 효율은 >95%였다.
"잔류 10541 대조군"은 SSD-40004 2.0 mg/kg 그룹에서 투약된 10541의 양과 동일하였다. SSD-40004에는 1%의 잔류 10541이 있었다.
일차 판독값은 체중, 사이토카인 및 IVIS 영상이었다. 용량은 분자 수에 따라 매칭시켰다.
표 10.
중간 종단 체중을 측정하였으며, 이는 도 11 및 도 12에 나와 있다. 도 11 및 도 12에 도시된 바와 같이, 단일 가닥 합성 DNA(ssDNA) "SSD" 투약된 동물은 동등한 분자 수의 ds ceDNA(10541) 투약된 동물보다 체중이 덜 감소하였다.
도 13은 4일차에 실시한 IVIS 이미징의 결과를 도시한 것이다. 도 14는 4일차 내지 7일차에 실시한 IVIS 이미징의 결과를 도시한 것이다. 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이, 10541과 SSD-40004 간에는 (IVIS 노이즈 내에서) 유사한 발현이 있었다.
그런 다음, 연장된 용량 곡선으로 실험을 반복하였다. 시험 설계는 아래 표 11에 나와 있다.
도 21은 ds ceDNA 작제물 10376(서열번호 7)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 도 22는 ds ceDNA 작제물 10541(서열번호 8)의 핵산 서열을 도시한 것이다. 작제물 10541은 PS 결합을 형성하는 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 도 24는 부모 이중 가닥 10541 작제물로부터 유래한 단일 가닥(ss) DNA(SSD) 작제물 40004(서열번호 10)의 핵산 서열을 보여준다. 도 24에서 알 수 있듯이, 루시페라아제 ORF 역상보적 서열은 서열번호 10의 뉴클레오티드 503 내지 2155에 위치한다.
표 11.
*SSD = 단일 가닥 DNA; BW = 체중;
동물의 총 수는 80마리였다.
일차 판독값은 체중, 사이토카인, qtPRC, ISH 및 IVIS 영상이었다. 용량은 분자 수에 따라 매칭시켰다.
표 12.
도 25에 도시된 바와 같이, ssDNA(SSD)는 ceDNA에 비해 전체적으로 체중 감소가 적었다. BW 감소의 차이는 ssDNA가 투약된 동물이 감소된 체중을 빠르게 회복한 D2에 가장 뚜렷하게 나타났다(도 26).
면역 반응에 대한 단일 가닥(ss) DNA의 효과도 조사하였다. 6시간 후의 사이토카인 반응이 도 27에 나와 있다. 모든 ssDNA 그룹에서, 사이토카인 수준은 두 ceDNA에 비해 현저하게 감소하였다. 또한, ceDNA(PS 결합 없음)와 ceDNA(PS 결합) 그룹 사이에서 사이토카인 수준의 증가가 관찰되었는데, 이는 PS 결합이 면역원성을 증가시킨다는 추론으로 이어질 수 있다. 그러나 모든 ssDNA 그룹에서 PS 결합을 보였으며 모든 ssDNA 그룹에서 예상치 못하게 낮거나 검출 불가능한 사이토카인 수준을 보였다. 더 큰 용량 범위의 ssDNA(PBS(대조군); 이중 가닥(ds) ceDNA(PS 결합 없음) 2.0 mg/kg; ds ceDNA(PS 결합) 2.0 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 0.13 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 0.25 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 0.5 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 1.0 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 2.0 mg/kg; ssDNA(PS 결합) 4.0 mg/kg)로 실험을 반복하였으며, 유사한 결과가 관찰되었다(도 28). ssDNA에 대한 사이토카인 반응은 ceDNA에 비해 다시 현저하게 감소하였다. 사이토카인은 2 mpk(TNFa) 및 4 mpk(IL-18, IL-6, 및 TNFα)에서 상승하기 시작하였으나, 용량-매칭된 ceDNA보다는 그 정도가 더 낮았다. 도 29는 qtPCR로 측정된 바와 같이 ceDNA와 ssDNA는 간에서 유사한 mRNA 수준을 보였으며, 둘 다 흡수되고 있었음을 보여준다.
본 명세서에 기재된 두 가지 실험에 의해 입증된 바와 같이, 단일 가닥 DNA는 분자 수에 따라 용량을 매칭시켰을 때 체중 감소 예방 효과가 ceDNA보다 우수하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, ssDNA는 ceDNA에 비해 전반적으로 체중 감소가 적었으며, 가장 높은 매칭된 용량에서는 비슷한 체중 감소가 관찰되었으나 ssDNA 투약된 그룹에서 회복이 더 빨랐다.
이 실시예에서 볼 수 있듯이, 유사하거나 더 낮은 매칭된 용량으로 투여된 단일 가닥 DNA는 사이토카인 발현의 급격한 감소에서 알 수 있듯이, 면역원성에서 ceDNA보다 우수하였다(도 24 및 도 25). 또한, 기재된 실험에 사용된 ssDNA는 모두 포스포로티오에이트(PS) 결합이 있었고, 사이토카인 발현에 대해 PS 결합이 있는 이중 가닥 ceDNA와 PS 결합이 없는 이중 가닥 ceDNA를 비교한 결과 PS 결합이 있는 이중 가닥 ceDNA 작제물에서 사이토카인 발현이 증가한 것으로 나타났기 때문에 이들 결과는 예상치 못한 것이었다.
종합하면, 본 명세서에 기재된 ssDNA는 이중 가닥 DNA와 동등하거나 더 양호한 발현으로 우수한 내약성을 제공하고 면역원성 감소라는 추가적인 이점을 제공하여 반복 또는 장기 투약 기회를 제공한다.
추가 연구에서는 ssDNA에 대한 낮은 사이토카인 반응은 mRNA에 대한 반응과 유사한 것으로 나타났다. 도 30은 LNP로 제형화된 mRNA, ceDNA, 및 ssDNA 카고가 마우스의 혈중 사이토카인 수준에 미치는 영향을 보여준다. 마우스(그룹당 n=5)에게 LNP로 제형화된 mRNA, ceDNA, 또는 ssDNA를 정맥내 주사하였다. 주사 후 6시간에 IFN-α, IL-18, TNF-α, IL-6, 및 IFN-γ의 혈중 수준(pg/mL)을 측정하였다. 나중에 비인간 영장류(NHP)에서 사용하기 위해 대규모로 생산된 여러 배치의 ssDNA도 0.25 mg/kg 및 2.0 mg/kg의 용량으로 시험하였다. 도 30에서 볼 수 있듯이, 두 가지 용량 모두에서 ssDNA는 사이토카인 IFNα, IL-18, TNFα, IL-6, 및 IFNγ의 발현을 거의 유도하지 않거나 전혀 유도하지 않았으며, 이는 mRNA 및 PBS 대조군에 의해 유도된 반응과 거의 동일하다.
비인간 영장류에서도 유사한 결과를 얻었다. 도 31은 시노몰구스 원숭이에게 정맥 내 주입 후 6시간 및 24시간에 1.0 mg/kg의 LNP로 제형화된 ceDNA("DNA", 원), ssDNA(사각형), 및 mRNA(삼각형) 카고가 혈중 사이토카인 수준(pg/mL)에 미치는 효과를 보여준다. 도 31에서 볼 수 있듯이, ssDNA는 거의 검출할 수 없는 수준의 사이토카인 IL-6, IL-1B 및 IL-18을 유도하였으며, 이는 mRNA가 유도한 수준과 유사하다. 추가 연구에서는 모든 카고가 유사한 조직 분포 및 노출을 보이는 것으로 나타났다. 상세하게는, qPCR 분석을 기반으로 ceDNA, mRNA, 및 ssDNA 제형은 간과 비장 모두에서 유사한 총 조직 노출을 달성하였다. 제자리 부합(ISH) 결과는 간과 비장 모두에서 ceDNA와 ssDNA 간의 유사한 세포 분포를 보여준다.
1.0 mg/mL LNP로 제형화된 ceDNA(원), ssDNA(사각형), 또는 mRNA(삼각형)를 투여한 후 NHP에서 보체 활성화 또한 측정하였다. 도 32에서 볼 수 있는 바와 같이, NHP에서 ceDNA의 투여는 C3a 및 C5b-9 보체 활성화를 장기간 유도한 반면, ssDNA 및 mRNA에서는 보체 활성화가 초기에만 증가한 후 ceDNA에 비해 더 빠르게 감소하는 것으로 나타났다. 체온 상승은 모든 ceDNA 투여 동물에서 보고되었으며, 모든 ceDNA 투여 동물은 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 투여받은 반면, ssDNA 투여 동물은 NSAID 투여를 필요로 하지 않았다. 임상 관찰은 모든 시험 물품의 내약성이 양호함을 입증하였다.
시험관 내 PBMC 분석법을 사용하여 인간에서의 면역 반응 가능성을 평가하였다. 간략하게, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 시험관 내에서 LNP로 제형화된 ceDNA 또는 ssDNA와 접촉시키고, TNF-α 자극을 측정하였다. 도 33에서 볼 수 있듯이, 첫 번째 시험(그래프의 왼쪽 두 개의 막대) 및 반복 시험(그래프 오른쪽의 미처리 대조군을 포함한 세 개의 막대) 모두에서, ssDNA는 ceDNA에 비해 유의하게 낮은 TNF-α 자극을 유도하였다(ssDNA 유도 TNF-α 자극은 미처리 대조군과 유사함).
면역 반응을 측정하는 것 외에도, ssDNA의 유전자 발현 유도 능력을 평가하였다. 마우스에게 루시페라아제 리포터 유전자를 포함하는 0.25 mg/kg의 LNP로 제형화된 ceDNA 또는 ssDNA를 정맥내 주사하였다. 루시페라아제 발현(IVIS)을 주사 후 1일 및 4일째(오른쪽) 및 최대 30일(왼쪽)까지의 추가 시점에 측정하였다. 도 34에서 볼 수 있듯이, LNP로 제형화된 ssDNA는 ceDNA에 의해 유도된 것보다 더 높은 초기 발현을 포함하여, 마우스에서 지속적이고 강력한 발현을 유도한다.
실시예 5. ITR이 없는 ssDNA는 시험관 내 및 생체 내에서 이식유전자를 발현한다
ITR 변형이 발현에 미치는 효과를 시험하기 위해, 상이한 ITR 구성요소가 있거나 ITR이 전혀 없는 ssDNA 작제물을 생산하였다(도 35a 내지 도 35e). 모든 작제물은 hAAT-루시페라아제 발현 작제물을 포함하였다. 도 35a: 작제물 ss004(왼쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, 하단 가닥에 PS 결합 및 Nb.BbvCI 닉 부위가 있음; 오른쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, A 영역의 대부분이 제거되고 5' 말단에 PS 결합이 있음; 발현 작제물 - 가닥). 도 35b: 작제물 ss020(ss004와 동일하나 PS 결합이 없음). 도 35c: 작제물 ss021(ss004와 동일하나 야생형 AAV2 ITR이 있고 PS 결합이 없으며 Nb.BbvCI 닉 부위가 없음). 도 35d: 작제물 ss022(발현 작제물 + 가닥을 제외하고는 ss021과 유사함). 도 35e: ITR 서열이 없는 hAAT-루시페라아제 발현 작제물.
HepG2 세포에 각각 100 ng 또는 200 ng의 ss004 또는 ss011를 형질주입하고, 48시간째에 루시페라아제 발현(세포 생존력으로 정규화)을 측정하였다. ITR 서열이 없는 ss011은 전사 개시 부위로서 기능할 수 있는 이중가닥 영역이 없는 것으로 가정되었기 때문에 초기에는 음성 대조군으로 의도되었다. 또한, ss011의 인 실리코 폴딩 분석에서는 명확한 개시 부위가 발견되지 않았다. 또한, 도 36에서 볼 수 있듯이, ss011은 시험관 내에서 ss004와 유사한 수준으로 루시페라아제를 발현하였다. 전사 능력이 있는 이중 가닥 DNA가 형성되었는지 여부를 확인하기 위해 수행한 Klenow exo- 처리에서 두 가지 상이한 크기의 연장 생성물이 발견되었다.
생체 내 발현을 추가로 조사하기 위해, 마우스에게 유체역학적 주사(HDI)를 통해 작제물 ss004, ss020, ss021, ss022, 및 ss011(500 ng/동물)과 발현 카세트의 ± 가닥을 가진 ssDNA 작제물의 혼합물(동물당 ss021+ss022 또는 ss011+ss022, 250 ng)을 주입하였다. 도 37에서 볼 수 있듯이, 루시페라아제 발현은 1일차에 나타났고 4일차에는 안정적이었다. 모든 ssDNA 작제물은 5 ng/동물의 용량에서 ceDNA541과 유사한 수준의 발현을 보였다. ssDNA 작제물 ss004, ss020, ss021, 및 ss022는 동일한 수준의 발현을 보였으며, 이는 야생형 AAV ITR 말단을 복원해도 발현을 개선하지 않았음을 나타낸다(ss020과 ss021 비교). ITR 서열이 없는 작제물 ss011은 ITR이 있는 다른 ssDNA 작제물보다 약간 낮은 발현을 보였다. 그러나 발현의 존재는 ITR이 없는 ssDNA가 생체 내에서 형질전환 유전자 발현을 제공할 수 있다는 시험관 내 결과(도 36)를 더욱 확인시켜 주었다. ± 가닥(ss021+ss022 또는 ss011+ss022)의 공동-투약은 ss004 단독보다 약간 더 높은 발현을 보였다. 또한 PS 결합이 포함된 ss004와 PS 결합이 포함되지 않은 ss020, ss021, ss022를 비교한 결과, PS 결합의 존재가 1일차에는 발현을 약간 감소시켰지만 4일차에는 이식유전자 발현을 손상시키지 않는 것으로 나타났다.
이식유전자 발현을 유도하는 ss011의 능력을 추가로 조사하기 위해, ss011을 세 가지 상이한 이온화성 지질을 사용하여 LNP에 제형화하고 마우스에게 주입하였다. ss011을 포함하는 LNP를 47.5:10:40.2:2.3 비율의 이온화성:DSPC:콜레스테롤:DMG-PEG2k 성분으로 제조하였으며, 이온화성 지질로는 MC3, 지질 Y 또는 지질 Z를 사용하였다. 지질 Z로 제형화된 ss004는 양성 대조군으로 사용하였다. 도 38에서 볼 수 있듯이, ss011은 시험된 모든 제형에서 루시페라아제 발현을 유도하였다. ITR 서열을 포함하는 ss004에 비해 발현이 낮았지만, 이 데이터는 시험관 내 및 HDI 시험을 확인시켜 주었으며, LNP에 제형화된 ssDNA는 LNP에 제형화되었을 때 이식유전자 발현을 성공적으로 전달할 수 있음을 입증하였다.
실시예 6. PS 결합은 생체 내 이식유전자 발현, 내약성 또는 안정성에 영향을 미치지 않았다
PS 결합 유무와 위치가 이식유전자 발현에 미치는 영향을 추가로 조사하기 위해, 상단 또는 하단 가닥에 PS 결합이 있고 오른쪽 ITR이 잘린 ssDNA 작제물을 제조하였다. 도 39a 내지 도 39d는 상이한 PS 결합 구성을 가진 ssDNA 작제물의 모식도이다. 모든 작제물은 hAAT-루시페라아제 발현 작제물을 포함하였다. PS 결합의 위치가 화살표로 표시되어 있다. 도 39a: 작제물 ss004(왼쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, 하단 가닥에 PS 결합이 있음; 오른쪽 ITR은 AAV2로부터 유래한 것으로, A 영역의 대부분이 제거되고 5' 말단에 PS 결합이 있음). 도 39b: 작제물 034(ss004와 동일하나 왼쪽 ITR의 PS 결합이 3' 말단 근처의 상단 가닥에 있음). 도 39c: 작제물 ss039(ss034와 동일하나 오른쪽에 절단된 ITR이 있고 5' 말단 근처의 하단 가닥에 PS 결합 있음). 도 39d: 작제물 ss040(ss039와 동일하나 PS 결합이 없음).
마우스에게 LNP로 제형화된 ceDNA541, ceDNA654, ss004, ss034, ss039, 및 ss040(0.25 mg/kg)을 주입하였다. 도 40에서 볼 수 있듯이, 0.25 mg/kg 용량에서 상이한 ssDNA 작제물 간 또는 ssDNA 작제물과 ceDNA 대조군 간의 발현에 있어서 유의한 차이는 없었다. 혈중 사이토카인 수준도 측정하였다. 도 41에서 볼 수 있듯이, 모든 ssDNA 작제물은 ceDNA와 비교했을 때 사이토카인 수준이 전혀 없거나 매우 낮았으며, 이는 이전 결과와 일치한다. ssDNA 작제물이 투약된 마우스 중 체중 감소에 문제가 나타난 마우스는 없었다.
ssDNA 안정성을 평가하기 위해, 투약 후 6시간, 1일 및 4일에 마우스로부터 채취한 간 검체에서 qPCR을 통해 루시페라아제 DNA를 측정하였다. ssDNA 처리 검체에서 측정된 루시페라아제 DNA는 6시간째에 등가 ceDNA 용량(질량 기준)보다 약 2배 더 높았다(질량 기반 투약으로 인해 예상되는 수준임). (하나의 작제물 ss039는 6시간째에 다른 ssDNA 작제물보다 약간 더 높은 간 루시페라아제 DNA를 나타냈다.) 두 ssDNA 모두 4일까지 유사한 청소율을 보였다. 간 루시페라아제 mRNA 발현 또한 투약 후 1일차 및 4일차째에 qPCR을 통해 측정하였다. ss004가 4일차째에 mRNA 발현이 약간 증가한 것을 제외하고는, 모든 ssDNA 작제물은 1일차 및 4일차째에 ceDNA와 동등한 mRNA 발현을 보였다. 시험된 모든 제형에서 4일차 mRNA 및 IVIS 발현 데이터의 상관 관계가 확인되었다.
상기 결과를 종합해 볼 때, PS 결합의 존재는 위치에 관계없이 LNP로 제형화된 ssDNA 작제물의 생체 내 이식유전자 발현, 내약성 또는 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실시예 7. 이중 가닥 프로모터 영역은 ssDNA 작제물에서 이식유전자 발현을 유의하게 증가시켰다
왼쪽 ITR의 이중 가닥 영역이 전사 시작 부위(TSS)를 포함하는 인핸서/프로모터 영역을 통해 연장되는 ssDNA 작제물을 제조하였다.
도 42a 내지 도 42d는 단일 가닥 또는 이중 가닥 프로모터 영역이 있는 ssDNA 작제물의 모식도이다. 모든 작제물은 루시페라아제 리포터를 포함하였다. 도 43a: ss004, 단일 가닥 hAAT 인핸서/프로모터 세트, 왼쪽에 36 bp의 이중 가닥 DNA. 도 43b: ss104, 이중 가닥 hAAT 인핸서/프로모터 세트, 왼쪽에 1381 bp의 이중 가닥 DNA. 도 43c: ss102, 단일 가닥 1xSERP/TTR 인핸서/프로모터 세트, 왼쪽에 36 bp의 이중 가닥 DNA. 도 43d: ss104, 이중 가닥 1xSERP/TTR 인핸서/프로모터 세트, 왼쪽에 499 bp의 이중 가닥 DNA. (참고: 이중 가닥 bp 수에는 ITR 영역이 포함되지 않는다.) 각 작제물에 대한 추가 정보는 표 13에 나와 있다.
표 13.
작제물 ss105 및 ss106의 HBB/SV40 3'UTR/폴리A 부위는 WPRE/bGH보다 CpG 함량이 낮았다. ss105 및 ss106은 제조되었으나 아직 시험되지 않았다. 이중 가닥 프로모터 영역이 있는 모든 작제물은 천연 겔 및 RP-IP로 평가했을 때 잔류 ceDNA가 1% 미만이었다. 모든 작제물은 왼쪽 ITR의 하단 가닥 및 오른쪽 ITR의 말단에 위치한 대칭 PS 결합을 포함하였다.
마우스에게 작제물 ss004, ss104, ss102, 및 ss103을 몰-매칭된 양(ss104: 동물당 500 ng; ss104: 동물당 684 ng; ss102: 동물당 448 ng; ss103: 동물당 513 ng)으로 HDI를 통해 주입하였다. 도 43 및 도 44에서 볼 수 있듯이, 각각의 이중 가닥 프로모터 작제물은 1일차부터 7일차까지의 시점에 걸쳐 단일 가닥 프로모터 대조군보다 약 10배 더 우수한 성능을 보였다(ss104와 ss004 비교, ss103과 ss102 비교). 도 45에서 볼 수 있듯이, 이중 가닥 프로모터 작제물 ss103 및 ss104는 1일차 및 7일차째에 ceDNA(동물당 500 ng)와 유사한 발현을 보였다.
상기 결과는 놀랍게도 이중 가닥 프로모터 영역을 포함시키는 것이 ssDNA 작제물의 이식유전자 발현을 상당히 증가시킬 수 있음을 보여준다. 본 개시 이전에는 RNA 중합효소가 프로모터로부터 전사를 개시하고 개방 해독 프레임(ORF)을 통해 처리하여 mRNA를 생산하기 위해서는 이중 가닥 DNA가 필요한 것으로 여겨졌다. 따라서, 당업자라면 본 명세서에 기재된 ssDNA 작제물과 같은 단일 가닥 분자는 전사 능력을 갖추기 전에 제2 가닥 DNA 합성을 거쳐야 한다고 생각했을 것이다. 제2 가닥 DNA 합성에 대한 이러한 추정 요건을 고려할 때, 이중 가닥 프로모터가 있는 ssDNA 작제물은 단일 가닥 프로모터가 있는 ssDNA 작제물보다 더 나은 성능을 기대할 수 없었는데, 이는 둘 다 mRNA 합성 및 유전자 발현에 앞서 동일한 이식유전자의 제2 가닥 합성 단계를 거칠 것으로 예상되었기 때문이다. 그러나, 본 명세서의 실시예에서 입증된 바와 같이, ssDNA 작제물에 이중 가닥 프로모터 영역을 포함시키면 전술한 바와 같이 이식유전자 발현이 상당히 증가하였는데, 이는 RNA 중합효소가 결합 및 전사 개시를 위해 (즉, 프로모터에서) 이중 가닥 DNA만을 필요로 할 수 있고, 당업계에서 이전에 믿어져 온 바와 같이 이중 가닥 ORF는 필요하지 않을 수 있음을 시사한다.
참고문헌
본 명세서 및 본 명세서의 실시예에 언급된 특허 및 특허 출원을 포함하되 이로 제한되지 않는 모든 간행물 및 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 참고 문헌이 인용에 의해 본 명세서에 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이, 그 전체가 인용에 의해 통합된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원은 또한 간행물 및 참고문헌에 대해 전술한 방식으로 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
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Claims (283)

  1. 지질 나노입자(LNP)로서,
    (a) 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 선형 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자; 및
    (b) 지질을 포함하는, LNP.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 그 길이 전체에 걸쳐 단일 가닥인, LNP.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 임의의 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는, LNP.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드인, LNP.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 길이가 적어도 300개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 400개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 600개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 700개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 800개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 900개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 1500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 2500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 3500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 4500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 5500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 6500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 7500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 8500개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9000개 뉴클레오티드, 길이가 적어도 9500개 뉴클레오티드, 또는 길이가 적어도 10,000개 뉴클레오티드인, LNP.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열은 이의 3' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하며, 상기 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함하는, LNP.
  7. 제6항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 복제 및/또는 전사를 개시하기에 충분한, LNP.
  8. 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 500개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함하는, LNP.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 5개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함하는, LNP.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 3 내지 500개의 미결합 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 최소 3개의 미결합 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함하는, LNP.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함하는, LNP.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  20. 제6항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않고/않거나 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는, LNP.
  21. 제6항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 임의의 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는, LNP.
  22. 제6항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  23. 제6항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  24. 제23항에 있어서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드인, LNP.
  25. 제6항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함하는, LNP.
  26. 제6항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 더 포함하는, LNP.
  27. 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머인, LNP.
  28. 제27항에 있어서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능한, LNP.
  29. 제6항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 이의 5' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하며, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함하는, LNP.
  30. 제29항에 있어서, 상기 ssDNA는 상기 5' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  31. 제29항 또는 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 5' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 5' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함하는, LNP.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함하는, LNP.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함하는, LNP.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, LNP.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는, LNP.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는, LNP.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, LNP.
  42. 제29항에 있어서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드인, LNP.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 루프는 상기 말단을 안정화시키기 위한 하나 이상의 핵산을 더 포함하는, LNP.
  44. 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 루프는 화학적으로 변형된 하나 이상의 핵산을 더 포함하는, LNP.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함하는, LNP.
  46. 제45항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머인, LNP.
  47. 제46항에 있어서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능한, LNP.
  48. 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 리보자임인, LNP.
  49. 제27항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)인, LNP.
  50. 제27항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 짧은 간섭 RNA(siRNA)인, LNP.
  51. 제27항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)인, LNP.
  52. 제6항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 삼중가닥 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, LNP.
  53. 제6항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함하는, LNP.
  54. 제6항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 분자 프로브를 더 포함하는, LNP.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있는, LNP.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내에서 합성적으로 생산되는, LNP.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산되는, LNP.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 면역 경로를 활성화하지 않거나 최소한으로 활성화하는, LNP.
  59. 제58항에 있어서, 상기 면역 경로는 선천성 면역 경로인, LNP.
  60. 제59항에 있어서, 상기 선천성 면역 경로는 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 염증조절복합체 매개 경로, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 프로모터를 더 포함하는, LNP.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 인핸서를 더 포함하는, LNP.
  63. 제61항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 hAAT 프로모터인, LNP.
  64. 제61항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 TTR 프로모터인, LNP.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 세르핀(SERP) 인핸서인, LNP.
  66. 제61항 내지 제62항 또는 제64항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 TTR 프로모터 및 SERP 인핸서를 포함하는, LNP.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 전사 시작 부위(TSS)를 포함하는, LNP.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 이중 가닥인, LNP.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TSS는 이중 가닥인, LNP.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ss DNA 분자는 적어도 하나의 치료적 단백질 또는 이의 치료적 단편을 발현할 수 있는, LNP.
  71. 제70항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬, 및 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  72. 제70항 또는 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 유전 질환을 치료하는 데 유용한, LNP.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 LNP 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  74. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 지질 내에 캡슐화되는, LNP.
  75. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤을 더 포함하는, LNP.
  76. 제75항에 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 베타-시토스타놀, 캄페스테롤, 브라시카스테롤, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  77. 제75항 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤인, LNP.
  78. 제75항 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤은 베타-시토스테롤인, LNP.
  79. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질을 더 포함하는, LNP.
  80. 제79항에 있어서, 상기 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민(DSPE), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소화된 소이 포스파티딜콜린(HSPC), 에그 포스파티딜콜린(EPC), 디올레일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카르디올리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 딜리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  81. 제79항 또는 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 및 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  82. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 페길화 지질을 더 포함하는, LNP.
  83. 제82항에 있어서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 PEG-딜라우릴옥시프로필; PEG-디미리스틸옥시프로필; PEG-디팔미틸옥시프로필, PEG-디스테아릴옥시프로필; l-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG); PEG-딜라우릴글리세롤; PEG-디팔미토일글리세롤; PEG-디스테릴글리세롤; PEG-딜라우릴글리카마이드; PEG-디미리스틸글리카미드; PEG-디팔미토일글리카미드; PEG-디스테릴글리카마이드; (l-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐] 카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)(PEG-콜레스테롤); 3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) 에테르(PEG-DMB), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)(DSPE-PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는, LNP.
  84. 제82항 또는 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 DMG-PEG, DSPE-PEG, 또는 둘 모두인, LNP.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, 또는 둘 모두인, LNP.
  86. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 모이어티를 더 포함하는, LNP.
  87. 제86항에 있어서, 상기 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 또는 GalNAc 유도체인, LNP.
  88. 제86항에 있어서, 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체인, LNP.
  89. 제88항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체는 전장 항체, Fab, Fab', 단일 도메인 항체, 및 단쇄 항체(scFv)로 구성된 군으로부터 선택되는, 지질 나노입자.
  90. 제88항 또는 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체는 scFv인, 지질 나노입자.
  91. 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 및/또는 세포 유형 특이적 표적화 모이어티는 적어도 하나의 페길화 지질에 공유 결합되어 페길화 지질 접합체를 형성하는, LNP.
  92. 제91항에 있어서, 상기 페길화 지질 접합체는 DSPE-PEG2000에 공유 결합된 4중 안테나구조 GalNAc를 포함하는, LNP.
  93. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화성 지질을 더 포함하는, LNP.
  94. 제93항에 있어서, 상기 이온화성 지질은 양이온성 지질인, LNP.
  95. 제93항 또는 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화성 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), DLin-MC3-DMA, N-[1-(2,3-디오레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC); 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (14:1), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필) 아미노부틸카르복스아미도에틸-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드(MVL5); 디옥타데실아미도-글리실스페르민(DOGS); 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일] 콜레스테롤(DC-Chol); 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); Saint 지질(예컨대, SAINT-2, N-메틸-4-(디올레일)메틸피리디늄); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); 1,2-디올레오일-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE); 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 클로라이드(DORI); 2알킬화된 아미노산(DILA2)(예컨대, C18 :1 -norArg -C16); 디올레일디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3 -에틸포스포콜린(POEPC); 및 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(MOEPC)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 일부 변형예에서, 상기 축합제, 예컨대, 양이온성 지질은 예컨대, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2디메틸아미노에틸)-[1,31-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODAP), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), 모르폴리노콜레스테롤(Mo-CHOL), (R)-5-(디메틸아미노)펜탄-1,2-디일 디올레에이트 하이드로클로라이드(DODAPen-C1), (R)-5-구아니디노펜탄-1,2-디일 디올레에이트 하이드로클로라이드(DOPen-G), 및 (R)-N,N,N-트리메틸-4,5-비스(올레오일옥시)펜탄-1-아미늄 클로라이드(DOTAPen), SS-절단성 지질, 및 이들의 혼합물과 같은 지질인, LNP.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화성 지질은 약 30% 내지 약 80%의 몰 백분율로 존재하는, LNP.
  97. 제75항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테롤은 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, LNP.
  98. 제79항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비양이온성 지질은 약 2% 내지 약 20%의 몰 백분율로 존재하는, LNP.
  99. 제82항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 페길화 지질은 약 2.1% 내지 약 10%의 몰 백분율로 존재하는, LNP.
  100. 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페길화 지질 접합체는 약 0.1% 내지 약 10%의 몰 백분율로 존재하는, LNP.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤, 비양이온성 지질, 페길화 지질, 및 페길화 지질 접합체를 더 포함하는, LNP.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손 팔미테이트를 더 포함하는, LNP.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 총 지질 대 ssDNA 비율이 약 10:1 내지 약 40:1인, LNP.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 직경이 약 40 nm 내지 약 120 nm인, LNP.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 직경이 약 100 nm 미만인, LNP.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 직경이 약 60 nm 내지 약 80 nm인, LNP.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 40 nm 내지 약 120 nm인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재하는, LNP.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 100 nm 미만인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재하는, LNP.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 평균 직경이 약 60 nm 내지 약 80 nm인 복수의 LNP를 포함하는 LNP 조성물에 존재하는, LNP.
  110. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  111. 대상체의 유전 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 또는 제73항 또는 제110의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  113. 제111항 또는 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 A형 혈우병인, 방법.
  115. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 B형 혈우병인, 방법.
  116. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 페닐케톤뇨증(PKU)인, 방법.
  117. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 윌슨병인, 방법.
  118. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 고셰병 I형, II형, 또는 III형인, 방법.
  119. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 스타가르트 황반 이영양증인, 방법.
  120. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 LCA10인, 방법.
  121. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 어셔 증후군인, 방법.
  122. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전 질환은 습성 AMD인, 방법.
  123. 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP를 포함하는, 숙주 세포.
  124. 제123항에 있어서, 상기 숙주 세포는 시험관 내에 있는, 숙주 세포.
  125. 제123항에 있어서, 상기 숙주 세포는 생체 내에 있는, 숙주 세포.
  126. 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 대상체에게 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 또는 제73항 또는 제110항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  128. 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 세포에 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 또는 제73항 또는 제110항의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 치료적 유전자를 세포의 핵에 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 또는 제73항 또는 제110항의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포의 핵에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  130. 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관 내에 있는, 방법.
  131. 제128항 또는 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체 내에 있는, 방법.
  132. 치료적 유전자 또는 치료적 단백질로 치료될 대상체의 면역 반응을 최소화하는 방법으로서, 제1항 내지 제72항 또는 제74항 내지 제109항 중 어느 한 항의 LNP 또는 제73항 또는 제110항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 관심 대상 핵산은 상기 치료적 유전자 또는 치료적 단백질을 인코딩하는, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  134. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5.0 mg/kg인, 방법.
  135. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.45 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.55 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.65 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.85 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.95 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 약 1.7 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 1.8 mg/kg, 약 1.9 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 2.1 mg/kg, 약 2.2 mg/kg, 약 2.25 mg/kg, 약 2.3 mg/kg, 약 2.4 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 2.6 mg/kg, 약 2.7 mg/kg, 약 2.75 mg/kg, 약 2.8 mg/kg, 약 2.9 mg/kg, 약 3.0 mg/kg, 약 3.1 mg/kg, 약 3.2 mg/kg, 약 3.25 mg/kg, 약 3.3 mg/kg, 약 3.4 mg/kg, 약 3.5 mg/kg, 약 3.6 mg/kg, 약 3.7 mg/kg, 약 3.75 mg/kg, 약 3.8 mg/kg, 약 3.9 mg/kg, 약 4.0 mg/kg, 약 4.1 mg/kg, 약 4.1 mg/kg, 약 4.2 mg/kg, 약 4.25 mg/kg, 약 4.3 mg/kg, 약 4.4 mg/kg, 약 4.5 mg/kg, 약 4.6 mg/kg, 약 4.7 mg/kg, 약 4.75 mg/kg, 약 4.8 mg/kg, 약 4.9 mg/kg, 및 약 5.0 mg/kg으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  136. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 4.0 mg/kg 미만인, 방법.
  137. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 3.0 mg/kg 미만인, 방법.
  138. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 2.0 mg/kg 미만인, 방법.
  139. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.75 mg/kg 미만인, 방법.
  140. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.5 mg/kg 미만인, 방법.
  141. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.25 mg/kg 미만인, 방법.
  142. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.0 mg/kg 미만인, 방법.
  143. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.75 mg/kg 미만인, 방법.
  144. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.5 mg/kg 미만인, 방법.
  145. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.25 mg/kg 미만인, 방법.
  146. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 2.0 mg/kg인, 방법.
  147. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.75 mg/kg인, 방법.
  148. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.5 mg/kg인, 방법.
  149. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.25 mg/kg인, 방법.
  150. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 1.0 mg/kg인, 방법.
  151. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.75 mg/kg인, 방법.
  152. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.5 mg/kg인, 방법.
  153. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.25 mg/kg인, 방법.
  154. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.075 mg/kg 내지 약 4.0 mg/kg인, 방법.
  155. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 3.0 mg/kg인, 방법.
  156. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.125 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg인, 방법.
  157. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg인, 방법.
  158. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.175 mg/kg 내지 약 1.25 mg/kg인, 방법.
  159. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.2 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg인, 방법.
  160. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg인, 방법.
  161. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 투여되는 ssDNA 분자의 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg인, 방법.
  162. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 적어도 2회 용량을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  163. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 적어도 3회 용량을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  164. 제111항 내지 제122항, 제126항 내지 제129항, 또는 제131항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 또는 약제학적 조성물의 4회 이상의 용량을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  165. 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열을 포함하는 단리된 선형 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA) 분자로서, 상기 적어도 하나의 관심 대상 핵산 서열은 이의 3' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조가 측부에 위치하고, 상기 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함하는, ssDNA 분자.
  166. 제165항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 복제 및/또는 전사를 개시하기에 충분한, ssDNA 분자.
  167. 제165항 또는 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 500개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함하는, ssDNA 분자.
  168. 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템은 4 내지 5개 뉴클레오티드의 부분 DNA 이중체를 포함하는, ssDNA 분자.
  169. 제165항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 3 내지 500개의 미결합 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  170. 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 루프는 최소 3개의 미결합 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  171. 제165항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  172. 제165항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  173. 제165항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 3' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  174. 제165항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  175. 제165항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  176. 제165항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  177. 제165항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  178. 제165항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  179. 제165항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  180. 제165항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  181. 제165항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 임의의 바이러스 유래 서열을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  182. 제165항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  183. 제165항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 3' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  184. 제183항에 있어서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드인, ssDNA 분자.
  185. 제165항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함하는, ssDNA 분자.
  186. 제165항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  187. 제185항 또는 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머인, ssDNA 분자.
  188. 제187항에 있어서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능한, ssDNA 분자.
  189. 제165항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 이의 5' 말단에 적어도 하나의 스템-루프 구조를 포함하며, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 스템 및 적어도 하나의 루프를 포함하는, ssDNA 분자.
  190. 제189항에 있어서, 상기 ssDNA는 상기 5' 말단에 적어도 두 개의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  191. 제189항 또는 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 5' 말단에 적어도 세 개의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  192. 제189항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 5' 말단에 적어도 네 개 이상의 스템-루프 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  193. 제189항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 헤어핀 DNA 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  194. 제189항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 십자형 DNA 구조, 망치머리형 DNA 구조, 사중가닥 DNA 구조, 팽출 DNA 구조, 및 다중 분기 루프 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 구조를 포함하는, ssDNA 분자.
  195. 제189항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A 또는 A' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  196. 제189항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  197. 제189항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 AAV ITR에 존재할 수 있는 A, A', B, B', C, C', D, 또는 D' 영역을 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  198. 제189항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 rep 결합 요소(RBE)를 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  199. 제189항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 적어도 하나의 스템-루프 구조는 야생형 ITR에 존재할 수 있는 말단 분해 부위(trs)를 포함하지 않는, ssDNA 분자.
  200. 제189항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단의 스템은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  201. 제189항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자의 5' 말단은 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, ssDNA 분자.
  202. 제201항에 있어서, 엑소뉴클레아제 내성을 가지도록 변형된 상기 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 변형(PS) 뉴클레오티드인, ssDNA 분자.
  203. 제189항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 루프는 상기 말단을 안정화시키기 위한 하나 이상의 핵산을 더 포함하는, ssDNA 분자.
  204. 제189항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 루프는 화학적으로 변형된 하나 이상의 핵산을 더 포함하는, ssDNA 분자.
  205. 제189항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단의 스템-루프 구조는 적어도 하나의 기능성 모이어티를 포함하는, ssDNA 분자.
  206. 제205항에 있어서, 상기 적어도 하나의 기능성 모이어티는 압타머인, ssDNA 분자.
  207. 제206항에 있어서, 상기 압타머는 세포 내에서 핵 전위가 가능한, ssDNA 분자.
  208. 제186항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 리보자임인, ssDNA 분자.
  209. 제186항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)인, ssDNA 분자.
  210. 제186항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 짧은 간섭 RNA(siRNA)인, ssDNA 분자.
  211. 제186항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 모이어티는 항바이러스 뉴클레오시드 유사체(ANA)인, ssDNA 분자.
  212. 제165항 내지 제211항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 삼중가닥 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  213. 제165항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 gRNA 또는 gDNA를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  214. 제165항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및/또는 3' 말단의 루프는 하나 이상의 분자 프로브를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  215. 제165항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 결여되어 있는, ssDNA 분자.
  216. 제165항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내에서 합성적으로 생산되는, ssDNA 분자.
  217. 제165항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 시험관 내 무세포 환경에서 합성적으로 생산되는, ssDNA 분자.
  218. 제165항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 면역 경로를 활성화하지 않거나 최소한으로 활성화하는, ssDNA 분자.
  219. 제218항에 있어서, 상기 면역 경로는 선천성 면역 경로인, ssDNA 분자.
  220. 제219항에 있어서, 상기 선천성 면역 경로는 cGAS/STING 경로, TLR9 경로, 염증조절복합체 매개 경로, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, ssDNA 분자.
  221. 제165항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 프로모터를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  222. 제165항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 적어도 하나의 인핸서를 더 포함하는, ssDNA 분자.
  223. 제221항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 hAAT 프로모터인, ssDNA 분자.
  224. 제221항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 TTR 프로모터인, ssDNA 분자.
  225. 제222항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 세르핀(SERP) 인핸서인, ssDNA 분자.
  226. 제221항 내지 제222항 또는 제224항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 TTR 프로모터 및 SERP 인핸서를 포함하는, ssDNA 분자.
  227. 제221항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 전사 시작 부위(TSS)를 포함하는, ssDNA 분자.
  228. 제221항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 이중 가닥인, ssDNA 분자.
  229. 제222항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 이중 가닥인, ssDNA 분자.
  230. 제227항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TSS는 이중 가닥인, ssDNA 분자.
  231. 제228항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10개 염기쌍, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 30개 염기쌍, 적어도 40개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍, 적어도 60개 염기쌍, 적어도 70개 염기쌍, 적어도 80개 염기쌍, 적어도 90개 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍, 적어도 110개 염기쌍, 적어도 120개 염기쌍, 적어도 130개 염기쌍, 적어도 140개 염기쌍, 적어도 150개 염기쌍, 적어도 160개 염기쌍, 적어도 170개 염기쌍, 적어도 180개 염기쌍, 적어도 190개 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍, 적어도 220개 염기쌍, 적어도 240개 염기쌍, 적어도 260개 염기쌍, 적어도 280개 염기쌍, 적어도 300개 염기쌍, 적어도 320개 염기쌍, 적어도 340개 염기쌍, 적어도 360개 염기쌍, 적어도 380개 염기쌍, 적어도 400개 염기쌍, 적어도 420개 염기쌍, 적어도 440개 염기쌍, 적어도 460개 염기쌍, 적어도 480개 염기쌍, 적어도 500개 염기쌍, 적어도 550개 염기쌍, 적어도 600개 염기쌍, 적어도 650개 염기쌍, 적어도 700개 염기쌍, 적어도 750개 염기쌍, 적어도 800개 염기쌍, 적어도 850개 염기쌍, 적어도 900개 염기쌍, 적어도 950개 염기쌍, 적어도 1000개 염기쌍, 적어도 1100개 염기쌍, 적어도 1200개 염기쌍, 적어도 1300개 염기쌍, 적어도 1400개 염기쌍, 또는 적어도 1500개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  232. 제228항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 1500개 염기쌍 미만, 1400개 염기쌍 미만, 1300개 염기쌍 미만, 1200개 염기쌍 미만, 1100개 염기쌍 미만, 1000개 염기쌍 미만, 950개 염기쌍 미만, 900개 염기쌍 미만, 850개 염기쌍 미만, 800개 염기쌍 미만, 750개 염기쌍 미만, 700개 염기쌍 미만, 650개 염기쌍 미만, 600개 염기쌍 미만, 550개 염기쌍 미만, 500개 염기쌍 미만, 480개 염기쌍 미만, 460개 염기쌍 미만, 440개 염기쌍 미만, 420개 염기쌍 미만, 400개 염기쌍 미만, 380개 염기쌍 미만, 360개 염기쌍 미만, 340개 염기쌍 미만, 320개 염기쌍 미만, 300개 염기쌍 미만, 280개 염기쌍 미만, 260개 염기쌍 미만, 240개 염기쌍 미만, 220개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 190개 염기쌍 미만, 180개 염기쌍 미만, 170개 염기쌍 미만, 160개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 140개 염기쌍 미만, 130개 염기쌍 미만, 120개 염기쌍 미만, 110개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만, 90개 염기쌍 미만, 80개 염기쌍 미만, 70개 염기쌍 미만, 60개 염기쌍 미만, 50개 염기쌍 미만, 40개 염기쌍 미만, 또는 30개 염기쌍 미만인, ssDNA 분자.
  233. 제228항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 30 내지 1500개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  234. 제228항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 40 내지 1400개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  235. 제228항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 50 내지 1300개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  236. 제228항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 60 내지 1200개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  237. 제228항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 70 내지 1100개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  238. 제228항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 80 내지 1000개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  239. 제228항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  240. 제228항 내지 제239항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  241. 제228항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 100 내지 800개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  242. 제228항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 110 내지 700개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  243. 제228항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 120 내지 600개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  244. 제228항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 130 내지 500개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  245. 제228항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 140 내지 400개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  246. 제228항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 150 내지 300개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  247. 제228항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 160 내지 200개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  248. 제228항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 170 내지 190개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  249. 제228항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 1381개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  250. 제228항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 499개 염기쌍인, ssDNA 분자.
  251. 제165항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ss DNA 분자는 적어도 하나의 치료적 단백질 또는 이의 치료적 단편을 발현할 수 있는, ssDNA 분자.
  252. 제251항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 항체, 효소, 응고 인자, 전사 인자, 복제 인자, 성장 인자, 호르몬, 및 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, ssDNA 분자.
  253. 제251항 또는 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치료적 단백질은 겸상 적혈구 빈혈증, 흑색종, A형 혈우병(응고 인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고 인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성 섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사 장애, 레쉬 니한 증후군, 겸상 적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니 빈혈, 색소성 망막염, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군, 망막아종, 점액다당류 축적 질환(예컨대, 헐러 증후군(MPS I형), 샤이에 증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에 증후군(MPS I형 H-S), 헌터 증후군(MPS II형), 산필리포 A, B, C, 및 D형(MPS III A, B, C, 및 D형), 모르퀴오 A 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미 증후군(MPS VI형), 슬라이(Sly) 증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-픽병 A/B, C1, 및 C2형, 파브리병, 신들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 점액지질증 I, II/III, 및 IV형, 시알산증 I 및 II형, 글리코겐 축적병 I 및 II형(폼페병), 고셰병 I, II, 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병, 아스파틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산성 리파아제(LAL) 결핍증, 신경 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL, 및 LINCL), 스핑고지질증, 갈락토시알리도시스, 근위축성 측색 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조증, 척수성 근위축증, 프리드라이히 실조증, 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근 이영양증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제 1 결핍증, 영아기의 전신 동맥 석회화(GACI), 레버 선천성 흑암시, 스타가르트 황반 이영양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔 증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4), 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신 A 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 유전 질환을 치료하는 데 유용한, ssDNA 분자.
  254. 제165항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 지질을 더 포함하는, ssDNA 분자.
  255. 제254항에 있어서, 상기 ssDNA 분자는 상기 지질 내에 캡슐화되는, ssDNA 분자.
  256. 제254항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질은 지질 나노입자(LNP)인, ssDNA 분자.
  257. 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  258. 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  259. 대상체의 유전 질환을 치료하는 방법으로서, 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 또는 제257항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  260. 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 대상체에게 전달하는 방법으로서, 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 또는 제257항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  261. 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 세포에 전달하는 방법으로서, 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 또는 제257항의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  262. 치료적 유전자를 세포의 핵에 전달하는 방법으로서, 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 또는 제257항의 약제학적 조성물을 상기 세포에 접촉시켜 상기 치료적 유전자 및/또는 치료적 단백질을 상기 세포의 핵에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  263. 치료적 유전자 또는 치료적 단백질로 치료될 대상체의 면역 반응을 최소화하는 방법으로서, 제165항 내지 제256항 중 어느 한 항의 ssDNA 분자 또는 제257항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 관심 대상 핵산은 상기 치료적 유전자 또는 치료적 단백질을 인코딩하는, 방법.
  264. 제68항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서는 이중 가닥인, LNP.
  265. 제68항 내지 제109항 또는 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10개 염기쌍, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 30개 염기쌍, 적어도 40개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍, 적어도 60개 염기쌍, 적어도 70개 염기쌍, 적어도 80개 염기쌍, 적어도 90개 염기쌍, 적어도 100개 염기쌍, 적어도 110개 염기쌍, 적어도 120개 염기쌍, 적어도 130개 염기쌍, 적어도 140개 염기쌍, 적어도 150개 염기쌍, 적어도 160개 염기쌍, 적어도 170개 염기쌍, 적어도 180개 염기쌍, 적어도 190개 염기쌍, 적어도 200개 염기쌍, 적어도 220개 염기쌍, 적어도 240개 염기쌍, 적어도 260개 염기쌍, 적어도 280개 염기쌍, 적어도 300개 염기쌍, 적어도 320개 염기쌍, 적어도 340개 염기쌍, 적어도 360개 염기쌍, 적어도 380개 염기쌍, 적어도 400개 염기쌍, 적어도 420개 염기쌍, 적어도 440개 염기쌍, 적어도 460개 염기쌍, 적어도 480개 염기쌍, 적어도 500개 염기쌍, 적어도 550개 염기쌍, 적어도 600개 염기쌍, 적어도 650개 염기쌍, 적어도 700개 염기쌍, 적어도 750개 염기쌍, 적어도 800개 염기쌍, 적어도 850개 염기쌍, 적어도 900개 염기쌍, 적어도 950개 염기쌍, 적어도 1000개 염기쌍, 적어도 1100개 염기쌍, 적어도 1200개 염기쌍, 적어도 1300개 염기쌍, 적어도 1400개 염기쌍, 또는 적어도 1500개 염기쌍인, LNP.
  266. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 1500개 염기쌍 미만, 1400개 염기쌍 미만, 1300개 염기쌍 미만, 1200개 염기쌍 미만, 1100개 염기쌍 미만, 1000개 염기쌍 미만, 950개 염기쌍 미만, 900개 염기쌍 미만, 850개 염기쌍 미만, 800개 염기쌍 미만, 750개 염기쌍 미만, 700개 염기쌍 미만, 650개 염기쌍 미만, 600개 염기쌍 미만, 550개 염기쌍 미만, 500개 염기쌍 미만, 480개 염기쌍 미만, 460개 염기쌍 미만, 440개 염기쌍 미만, 420개 염기쌍 미만, 400개 염기쌍 미만, 380개 염기쌍 미만, 360개 염기쌍 미만, 340개 염기쌍 미만, 320개 염기쌍 미만, 300개 염기쌍 미만, 280개 염기쌍 미만, 260개 염기쌍 미만, 240개 염기쌍 미만, 220개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 190개 염기쌍 미만, 180개 염기쌍 미만, 170개 염기쌍 미만, 160개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 140개 염기쌍 미만, 130개 염기쌍 미만, 120개 염기쌍 미만, 110개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만, 90개 염기쌍 미만, 80개 염기쌍 미만, 70개 염기쌍 미만, 60개 염기쌍 미만, 50개 염기쌍 미만, 40개 염기쌍 미만, 또는 30개 염기쌍 미만인, LNP.
  267. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 30 내지 1500개 염기쌍인, LNP.
  268. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제267항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 40 내지 1400개 염기쌍인, LNP.
  269. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제268항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 50 내지 1300개 염기쌍인, LNP.
  270. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 60 내지 1200개 염기쌍인, LNP.
  271. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제270항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 70 내지 1100개 염기쌍인, LNP.
  272. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제271항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 80 내지 1000개 염기쌍인, LNP.
  273. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍인, LNP.
  274. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 90 내지 900개 염기쌍인, LNP.
  275. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 100 내지 800개 염기쌍인, LNP.
  276. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 110 내지 700개 염기쌍인, LNP.
  277. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 120 내지 600개 염기쌍인, LNP.
  278. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제277항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 130 내지 500개 염기쌍인, LNP.
  279. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제278항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 140 내지 400개 염기쌍인, LNP.
  280. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제279항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 150 내지 300개 염기쌍인, LNP.
  281. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제280항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 160 내지 200개 염기쌍인, LNP.
  282. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제268항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 1381개 염기쌍인, LNP.
  283. 제68항 내지 제72항, 제74항 내지 제109항 또는 제263항 내지 제277항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터, 인핸서, 및/또는 TSS를 포함하는 이중 가닥 영역은 길이가 약 499개 염기쌍인, LNP.
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