KR20260051069A - 안정화된 cd3 항원 결합제 및 그 사용 방법 - Google Patents

안정화된 cd3 항원 결합제 및 그 사용 방법

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KR20260051069A KR1020267006829A KR20267006829A KR20260051069A KR 20260051069 A KR20260051069 A KR 20260051069A KR 1020267006829 A KR1020267006829 A KR 1020267006829A KR 20267006829 A KR20267006829 A KR 20267006829A KR 20260051069 A KR20260051069 A KR 20260051069A
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

안정화된 CD3 항원 결합제 및 이의 사용 방법이 개시된다.

Description

안정화된 CD3 항원 결합제 및 그 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2023년 8월 7일에 출원된 미국 임시 출원 제63/518,049호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다.
서열 목록
본 출원은 XML 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다. 2024년 7월 29일에 생성된 XML 사본의 명칭은 JBI6831WOPCT1_SL.xml이고 크기는 161 킬로바이트이다.
기술분야
본원에 제공된 개시내용은 인간 및 비인간 분화 클러스터 3(CD3: cluster of differentiation 3)에 특이적으로 결합할 수 있는 스테이플링된(stapled) 항-CD3-항원-결합 단편에 관한 것이며, 특히 CD3 및 제2 표적 항원과 교차-반응성인 스테이플링된 항-CD3 항원-결합 단편을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 질환 또는 장애의 치료에서 이러한 항체 및 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
이중특이성 항체 및 항체 단편은 세포용해 T 세포를 동원하여 종양 세포를 살해하는 수단으로서 탐구되었다. 그러나, 다수의 T 세포-동원 이중특이성 항체의 임상 사용은 불리한 약동학, 잠재적인 면역원성, 및 제조 문제를 포함하는 난제에 의해 제한되었다. 따라서, 감소된 독성 및 유리한 제조 프로파일을 나타내는, 종양 세포를 살해하기 위해 세포용해 T 세포를 동원하는 이중특이성 항체에 대한 상당한 필요성이 존재한다.
인간 CD3 T 세포 항원 수용체 단백질 복합체는 6개의 별개의 사슬인 CD3γ 사슬(SwissProt P09693), CD3δ 사슬(SwissProt P04234), 2개의 CD3ε 사슬(SwissProt P07766), 및 1개의 CD3ζ 사슬 동종이량체(SwissProt P20963) (ε γ: ε δ:ζζ)로 구성되며, 이는 T 세포 수용체 α 및 β 사슬과 결합되어 있다. 이러한 복합체는 항원 인식을 몇몇 세포내 신호-전달 경로에 커플링하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. CD3 복합체는 신호 전달을 매개하여, T 세포 활성화 및 증식을 가져온다. CD3은 면역 반응을 위해 필요하다.
항원 결합 단일쇄 가변 단편(scFv)은 치료제, 조영제, 진단제로서, 또는 다중특이성 분자와 같은 이종 분자의 부분으로서 광범위하게 이용될 수 있는 모듈이다. scFv의 난제들 중 하나는 낮은 안정성 및 응집되는 경향이다(문헌[Worn and Pluckthun (2001) J Mol Biol 305: 989-1010]; 문헌[Rothlisberger et al., (2005) J Mol Biol 347: 773-789]; 문헌[Gross et al., (1989) Transplant Proc 21(1 Pt 1): 127-130], 문헌[Porter et al., (2011) J Cancer 2: 331-332]; 문헌[Porter et al.,(2011) N Engl J Med 365: 725-733]에서 검토됨). 따라서, 다중특이성 분자 및 이종 분자에 선택적으로 혼입될 수 있는 개선된 scFv 설계가 필요하다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε: cluster of differentiation 3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제가 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커(Linker) 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트(anchor point)로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일부 실시형태에서, spFv는 VH 및 VL 중 적어도 하나 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 앵커 포인트 사이에 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시형태에서, spFv는 2개의 이황화 결합을 포함하며, 여기서 제1 이황화 결합은 VH 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 제1 앵커 포인트 사이에 형성되고, 제2 이황화 결합은 VL 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 제2 앵커 포인트 사이에 형성된다.
일부 실시형태에서, spFv는 VH-링커-VL의 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 VL-링커-VH의 배향이다.
일부 실시형태에서, 링커는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 7의 HCDR1, 서열번호 8의 HCDR2, 서열번호 9의 HCDR3, 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 11의 LCDR2, 및 서열번호 12의 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 13의 HCDR1, 서열번호 14의 HCDR2, 서열번호 9의 HCDR3, 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 11의 LCDR2, 및 서열번호 12의 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 15의 HCDR1, 서열번호 16의 HCDR2, 서열번호 9의 HCDR3, 서열번호 10의 LCDR1, 서열번호 11의 LCDR2, 및 서열번호 12의 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 17의 HCDR1, 서열번호 18의 HCDR2, 서열번호 19의 HCDR3, 서열번호 20의 LCDR1, 서열번호 21의 LCDR2, 및 서열번호 22의 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 23의 HCDR1, 서열번호 24의 HCDR2, 서열번호 25의 HCDR3, 서열번호 26의 LCDR1, DSS의 LCDR2, 및 서열번호 12의 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 28에 기재된 바와 같은 VH 도메인 및 서열번호 29에 기재된 바와 같은 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 30에 기재된 바와 같은 spFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합제는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체이다.
일부 실시형태에서, 결합제는 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편을 더 포함하며, 여기서 선택적으로 Ig 불변 영역의 단편은 Fc 영역 또는 CH3 도메인이다.
일부 실시형태에서, Ig 불변 영역, Ig 불변 영역의 단편, Fc 영역 또는 CH3 도메인은 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 L234A/L235A/D265S, F234A/L235A, L234A/L235A, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/ L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스(index)에 따른다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V, T366W, T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366L, F405W, T394W, K392L, T394S, Y407T, Y407A, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, T366L/K392L/T394W, L351Y/Y407A, L351Y/Y407V, T366A/K409F, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V 및 T350V/T366L/K392L/T394W로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 결합제는 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이를 포함하며, 여기서 노브 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V를 포함하고, 홀 돌연변이는 T366W를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합제는 CD3ε 이외의 제2 항원과 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 항원은 종양 항원이다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제의 VH, VL, 또는 VH와 VL 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제의 VH, VL, 또는 VH와 VL 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제의 VH, VL, 또는 VH와 VL 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH)과 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH)과 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는 대상체에서 질환 또는 장애의 진행을 치료하거나 늦추는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 적어도 하나의 결합제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함한다.
일 양태에서, 본원에는, T 세포를, 표적 항원을 발현하는 표적 세포로 유도하는 방법으로서, T 세포를 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 유효량의 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 또는 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함하고, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 T 세포에 결합하고, CD3ε 이외의 제2 항원에 결합하는 항원 결합 영역은 표적 세포에 결합한다.
전술한 개요뿐만 아니라, 본 출원의 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원은 도면에 나타낸 정확한 실시형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 스테이플링된 scFv(spFv)의 예시적인 설계를 보여준다. VL과 VH는 스테이플(staple) 서열 CPPC(서열번호 157)를 포함하는, 도면에서 파선으로 도시된 유연한 링커(flexible linker)에 의해 연결되고, "SS"는 링커 내의 스테이플 서열과 앵커 포인트 사이의 이황화 결합을 나타낸다.
도 2는 VL-링커-VH 배향에서 spFv에 대한 앵커 포인트 선택의 그래픽 예시를 나타낸다. 생식세포계열(germline) 인간 항체(pdb id 5I19, GLk1)의 Fv가 그래픽 및 예시적 거리 측정에 사용되었다. 파선으로 도시된 거리는 잔기의 Cβ 원자들 사이(Å 단위)이다. 원하는 거리를 갖는 구조적으로 보존된 프레임워크 위치가 Cys로의 돌연변이를 위한 앵커 포인트로서 선택되었다. VL-링커-VH 배향에 대한 앵커 포인트는 VL에 대해 초티아(Chothia) 위치 42(도면에서 K42) 및 VH에 대해 위치 105(도면에서 Q105)이었다. C-말단 VL 잔기(K107) 및 N-말단 VH 잔기(Q1)가 또한 도시되어 있다.
도 3은 VH-링커-VL 배향에서 spFv에 대한 앵커 포인트 선택의 그래픽 예시를 나타낸다. 생식세포계열(germline) 인간 항체(pdb id 5I19, GLk1)의 Fv가 그래픽 및 예시적 거리 측정에 사용되었다. 파선으로 도시된 거리는 잔기의 Cβ 원자들 사이(Å 단위)이다. 원하는 거리를 갖는 구조적으로 보존된 프레임워크 위치가 Cys로의 돌연변이를 위한 앵커 포인트로서 선택되었다. VH-링커-VL 배향에 대한 앵커 포인트는 VH에 대해 초티아 위치 43(도면에서 K43) 및 VL에 대해 위치 100(도면에서 Q100)이었다. C-말단 VH 잔기(S114) 및 N-말단 VL 잔기(D1)가 또한 도시되어 있다.
도 4는 마우스 IgG2a(pdb id 1igt)의 2개의 중쇄 힌지 CPPC(서열번호 31)에서 2개의 Cys 잔기 사이의 Cβ(Cys1)-Cβ(Cys2) 거리의 그래픽 예시를 나타낸다. 도면에서 거리는 옹스트롬 단위로 표시된다.
도 5는 인간 IgG(pdb id 5dk3)의 2개의 중쇄 힌지 CPPC(서열번호 31)에서 2개의 Cys 잔기 사이의 Cβ(Cys1)-Cβ(Cys2) 거리의 그래픽 예시를 나타낸다. 도면에서 거리는 옹스트롬 단위로 표시된다.
도 6은 아미노산 정렬 아래에 1 및 2로 넘버링되고 회색으로 강조된 선택된 VL 앵커 포인트를 나타낸다. VL 서열은 초티아 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. VL 앵커 포인트 1(초티아 위치 42)이 VL-링커-VH 배향에서 spFv에 사용되었고 VL 앵커 포인트 2(초티아 위치 100)가 VH-링커-VL 배향에서 spFv에 사용되었다. GLk1VL: 서열번호 32, GLk2VL: 서열번호 33, CAT2200VL: 서열번호 34; CAT2200bVL: 서열번호 35.
도 7은 아미노산 정렬 아래에 1 및 2로 넘버링되고 회색으로 강조되어 있는 선택된 VH 앵커 포인트를 나타낸다. VH 서열은 초티아 넘버링 체계에 따라 넘버링된다. VH 앵커 포인트 1(초티아 위치 105)이 VL-링커-VH 배향에서 spFv에 사용되었고 VH 앵커 포인트 2(초티아 위치 43)가 VH-링커-VL 배향에서 spFv에 사용되었다. GLk1VH: 서열번호 36; GLk2VH: 서열번호 37, CAT2200aVH: 서열번호 38.
도 8은 GLk1 spFv VL-VH의 구조를 나타낸다. VH 및 VL 앵커 포인트와 링커 사이의 스테이플의 형성이 구조로부터 명백하다.
도 9는 GLk1 spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. VH 및 VL 앵커 포인트와 링커 사이의 스테이플의 형성이 구조로부터 명백하다.
도 10은 GLk2 spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. VH 및 VL 앵커 포인트와 링커 사이의 스테이플의 형성이 구조로부터 명백하다.
도 11은 CAT2200b spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. VH 및 VL 앵커 포인트와 링커 사이의 스테이플의 형성이 구조로부터 명백하다.
도 12는 IL-17A에 결합된 CAT2200a scFv VL-VH(하부)와 비교한 비결합 CAT2200b spFv VH-VL(상부)의 비교를 나타낸다.
도 13은 IL-17A에 결합된 CAT2200a spFv VL-VH(하부)와 비교한 비결합 CAT2200b spFv VH-VL(상부)의 구조의 정면도의 비교를 나타낸다.
도 14는 IL-17A에 결합된 CAT2200a spFv VL-VH(하부)와 비교한 비결합 CAT2200b spFv VH-VL(상부)의 구조의 배면도의 비교를 나타낸다.
도 15는 유세포 분석법에 의한 LNCap 인간 전립선 종양 세포에 대한 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 결합을 보여준다.
도 16은 유세포 분석법에 의한 PAN-T 세포에 대한 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 결합을 보여준다.
도 17은 인간 PBMC에서 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 세포독성을 보여준다.
도 18은 인간 Pan T 세포에서 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 세포독성을 보여준다.
도 19는 CD3 및 ENPP3을 표적화하는 이중특이성 항체인 NPP3B815(NPP3B56xCD3B2030-N106A)의 개요를 보여준다. AAS, L234A, L235A, D265S; CD, 분화 클러스터; Fab, 항원-결합 단편; 홀, T366S, L368A, Y407V; 노브, T366W; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3); Ig, 면역글로불린; spFv, 스테이플링된 단일쇄 가변 단편.
도 20은 다양한 발현 수준을 갖는 상이한 암 세포주에서의 ENPP3 발현(수용체 밀도)을 보여준다. 내인성 암 세포주 패널 상에서 상업적 ENPP3 항체(즉, 클론 NP4D6)를 사용하여 측정한, 유세포 분석법 기반 막 ENPP3 검출 및 수용체 점유 정량화. 높은, 중간 및 음성 세포주에서의 ENPP3 발현을 보여주는 대표적인 히스토그램. 약어: ABC, 항체 결합 용량; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; HCC, 간세포 암종; LD, 생사(live dead); LLOD, 검출 하한; Med, 중간; Neg, 음성; RCC, 신장 세포 암종; ULOD, 검출 상한.
도 21은 생체외(ex vivo) 종양으로부터의 상이한 생체내(in vivo) CDX 및 PDX 모델 시스템에서의 ENPP3 발현을 보여준다. 2종의 CDX 모델, 즉 VMRCRCW(RCC) 및 HepG2(HCC), 그리고 RCC PDX 모델, 즉 RXF488에서의 ENPP3 발현에 대한 유세포 분석법(상업적 항체 클론 NP4D6 사용) 및 IHC 기반 평가(상업적 항체 클론 E5M2W 사용). 배율은 모든 이미지에 대해 30배(30X)이다. 약어: ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; CDX, 세포주 유래 이종이식(cell-line-derived xenograft); HCC, 간세포 암종; IHC, 면역조직화학; LD, 생사; PDX, 환자 유래 이종이식; RCC, 신장 세포 암종.
도 22a 및 도 22b는 내인성 ENPP3-발현 종양 세포주 및 단리된 T 세포에 대한 NPP3B815의 결합을 보여준다. 도 22a는 A704(ENPP3-높음), VMRCRCW(ENPP3-중간) 및 HepG2 ENPP3KO(ENPP3-음성) 세포주 상에서 ENPP3xCD3(NPP3B815) 및 NullxCD3(CD3B2533)의 결합을 유세포 분석법으로 평가한 것을 보여준다. 도 22b는 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포 상에서 유세포 분석법으로 평가된 ENPP3xCD3(NPP3B815, NPP3B815) 및 이소형 대조군(79C3B613) 항체의 결합을 보여준다. 실선은 NPP3B815 결합을 나타내고 점선(그래프 하단)은 79C3B613 결합을 나타낸다. 약어: CD, 분화 클러스터; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; geomean, 기하 평균.
도 23은 ENPP1, ENPP2 및 ENPP3 과발현 세포주에 대한 NPP3B815의 결합을 보여준다. CHO 모 세포주 또는 ENPP1, ENPP2 또는 ENPP3을 과발현하는 CHO 세포주 상에서 ENPP3xCD3(NPP3B815) 및 이소형 대조군(79C3B613)의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 약어: CD, 분화 클러스터; ENPP1, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 1; ENPP2, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 2; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3.
도 24는 내인성 ENPP3 발현을 갖는 암 세포주 패널의 NPP3B815-유도 종양 세포 사멸을 보여준다. Incucyte 기반 종양 세포 사멸 평가(즉, Nuclight-red-양성 세포의 소실)는 세포주 패널 상에서 3:1의 E:T 비로 공여자 888668965로부터의 단리된 T 세포의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815, NPP3B815), ENPP3xNull(NPP3B812) 및 NullxCD3(79C3B615) 항체로 치료 시 측정되었다. 데이터는 처리 후 72시간에 플롯팅되었다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; SEM, 평균의 표준 오차.
도 25는 내인성 ENPP3 발현을 갖는 종양 세포주 패널에서의 NPP3B815-유도 T세포 활성화를 보여준다. A704(ENPP3-높음), VMRCRCW(ENPP3-중간), HepG2(ENPP3-중간) 및 HepG2 ENPP3 KO(ENPP3-음성) 세포주를 사용하여 3:1의 E:T 비로 공여자 888668965로부터의 단리된 T 세포의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815, NPP3B815), ENPP3xNull(NPP3B812) 및 NullxCD3(79C3B615) 항체로 48시간 동안 치료 시 유세포 분석법으로 T 세포 활성화(즉, CD25+ T 세포)를 측정했다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터(effector) 대 표적 세포 비.
도 26a 및 도 26b는 ENPP3-양성 및 ENPP3-음성 세포주에서 여러 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에 NPP3B815-유도 종양 세포 사멸 및 T 세포 활성화를 보여준다. (도 26a) A704(ENPP3-높음), VMRCRCW(ENPP3-중간) 및 HepG2 ENPP3 KO(ENPP3-음성) 세포주를 사용하여 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포(E:T 비 3:1)의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815) 항체로 치료 시 측정된, Incucyte 기반 종양 세포 사멸 평가(즉, Nuclight-red-양성 세포의 소실). 데이터는 처리 후 72시간에 플롯팅되었다. 오차 막대는 SEM이다. (도 26b) A704(ENPP3-높음), VMRCRCW(ENPP3-중간) 및 HepG2 ENPP3 KO(ENPP3-음성) 세포주를 사용하여 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포(E:T 비 3:1)의 존재 하에 48시간 동안 ENPP3xCD3(NPP3B815)로 처리 시 유세포 분석법으로 T 세포 활성화(즉, CD25+ T 세포)를 측정했다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; SEM, 평균의 표준 오차.
도 27a 및 도 27b는 상이한 E:T 비로 여러 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에 NPP3B815-유도 종양 세포 사멸을 보여준다. (도 27a) ENPP3-높음 세포주인 A704를 사용한 검정에 1:1 및 1:3의 2가지 상이한 E:T 비로 첨가되고 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815)로 치료 시 측정된, Incucyte 기반 종양 세포 사멸 평가(즉, Nuclight-red-양성 세포의 소실). 데이터는 치료 후 72시간 및 120시간에 플롯팅되었다. 오차 막대는 SEM이다. (도 27b) VMRCRCW(ENPP3-중간) 세포를 사용한 검정에 1:1 및 1:3의 2가지 상이한 E:T 비로 첨가되고 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815)로 치료 시 측정된, Incucyte 기반 종양 세포 사멸 평가(즉, Nuclight-red-양성 세포의 소실). 데이터는 치료 후 72시간 및 120시간에 플롯팅되었다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; Conc., 농도; D, 공여자; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; IFN, 인터페론; IL, 인터류킨; SEM, 평균의 표준 오차; TNF, 종양 괴사 인자.
도 28은 ENPP3-높음 암 세포주 A704에서 여러 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에 NPP3B815-유도 사이토카인 방출을 보여준다. A704(ENPP3-높음) 세포를 사용하여 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포(E:T 비 3:1)의 존재 하에 48시간 동안 ENPP3xCD3(NPP3B815)로 치료 시 유세포 분석법으로 사이토카인 방출을 측정했다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; Conc., 농도; D, 공여자; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; IFN, 인터페론; IL, 인터류킨; SEM, 평균의 표준 오차; TNF, 종양 괴사 인자.
도 29는 상이한 E:T 비로 PBMC 공여자들에 대해 NPP3B815-유도 종양 세포 사멸을 보여준다. A704(ENPP3-높음) 세포주를 사용하여 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 PBMC(NPP3B815: E:T 비 5:1, 3:1 또는 1:1; 79C3B615: E:T 비 5:1)의 존재 하에 ENPP3xCD3(NPP3B815) 및 NullxCD3(79C3B615) 항체로 치료 시 측정된, Incucyte 기반 종양 세포 사멸 평가(즉, Nuclight-red-양성 세포의 소실). 데이터는 치료 후 68시간 또는 72시간에 플롯팅되었다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; Conc., 농도; D, 공여자; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; PBMC, 말초 혈액 단핵 세포; SEM, 평균의 표준 오차.
도 30a 및 도 30b는 사이노몰구스(cynomolgus) ENPP3-발현 세포 및 T 세포에 대한 툼(toom) 분자 NPP3B847의 결합을 보여준다. (도 30a) 사이노 ENPP3-OE가 있는 HepG2-huENPP3-KO 세포주 상에서 ENPP3xCD3 도구(NPP3B847; 사이노 교차 반응성 CD3B219를 갖는 ENPP3 결합제 NPP3B56) 및 이소형 대조군(79C3B613)의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 오차 막대는 SEM이다. (도 30b) 인간 및 사이노 T 세포 상에서 ENPP3xCD3 도구(NPP3B847)의 결합을 평가하였다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; cyno, 시노몰구스 원숭이; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; Geomean, 기하 평균; SEM, 평균의 표준 오차.
도 31은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 T-세포 활성화 및 T-세포 매개 세포독성을 보여준다. 사이노 ENPP3-OE가 있는 HepG2-huENPP3-KO 세포주를 사용하여 시험된 인간 및 사이노 T 세포(E:T 비 3:1)의 존재 하에 48시간 동안 ENPP3xCD3(NPP3B815), 매칭된 NullxCD3(79C3B615; CD3B2030-N106A 아암(arm) 포함), ENPP3xCD3 도구(NPP3B847; 사이노 교차 반응성 CD3B219와 짝지어진 ENPP3 결합제 NPP3B56) 및 매칭된 NullxCD3(NPP3B41; CD3B219 아암 포함) 항체로 치료 시 유세포 분석법으로 종양 세포 사멸 및 T-세포 활성화(즉, CD25+ T 세포)를 측정했다. 오차 막대는 SEM이다. 약어: CD, 분화 클러스터; cyno, 시노몰구스 원숭이; ENPP3, 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3; E:T 비, 이펙터 대 표적 세포 비; SEM, 평균의 표준 오차.
도 32a 및 도 32b는 마우스에서 VMRCRCW 확립된 이종이식에 대한 NPP3B815의 효과를 보여준다(연구 ONC2022-035). 확립된 VMRCRCW 이종이식을 보유한 NSG 마우스에 NPP3B815 또는 NullxCD3 대조 항체를 표시된 용량으로 IP 투여하였다. (도 32a) 그룹 종양 부피를 평균 ± SEM으로 그래프화하였다. 종양 세포는 0일차에 이식되었고 T 세포는 10일차에 이식되었다. NPP3B815 또는 NullxCD3 대조 항체를 이용한 치료는 11, 14, 18, 21, 25, 28, 31 및 34일차에 수행되었다(X축 아래의 선으로 표시됨). (도 32b) CD3xNull 대조 항체 및 NPP3B815 1 mg/kg 치료 군에 대한 개별 종양 그래프. *는 39일차에 대조 그룹 대비 NPP3B815 치료 그룹(n=10/그룹)의 유의미한 차이를 나타낸다. 약어: CD, 분화 클러스터; IP, 복강내; NSG, 비-비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역결핍(scid) 감마 또는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; SEM, 평균의 표준 오차.
도 33a 및 도 33b는 마우스에서 HepG2 확립된 이종이식에 대한 NPP3B194(스테이플링되지 않은 [scFv] ENPP3xCD3)의 효과를 보여준다(연구 P764Y). 확립된 VMRCRCW 이종이식을 보유한 NSG 마우스에 NPP3B194 또는 NullxCD3 대조 항체를 표시된 용량으로 IP 투여하였다. (도 33a) 그룹 종양 부피를 평균 ± SEM으로 그래프화하였다. 종양 세포는 0일차에 이식되었고 T 세포는 21일차에 이식되었다. NPP3B194 또는 NullxCD3 대조 항체를 이용한 치료는 22, 25, 29, 32, 36 및 39일차에 수행되었다(X축 아래의 선으로 표시됨). (도 33b) 그룹에 대한 개별 종양 그래프. *는 52일차에 대조 그룹 대비 NPP3B194-치료된 그룹(n≥7/그룹)의 유의미한 차이를 나타낸다. 약어: CD, 분화 클러스터; IP, 복강내; NSG, 비-비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역결핍(scid) 감마 또는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; SEM, 평균의 표준 오차.
도 34는 인간 및 사이노 GUCY2C에 대한 GUCY2C_mAb의 결합을 보여준다.
도 35a는 T84 세포주에 대한 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2의 결합을 보여준다. 도 35b는 T 세포에 대한 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2의 결합을 보여준다.
도 36은 GUCY2C_biAb-1과 참조 biAb 사이의 경쟁 유세포 분석을 보여준다.
도 37은 GUCY2CxCD3_biAb-1, GUCY2CxCD3_biAb-2 및 참조 biAb의 T 세포 매개 세포독성(상부 패널) 및 T-세포 활성화를 보여준다.
도 38은 T-세포 인간화 HT55 CDX 모델에서 GUCY2CxCD3_biAb-1의 항종양 효능을 보여준다.
도 39는 NCI-H146 세포에 대한 CDC3B253의 결합을 보여준다.
도 40은 GSU 세포에 대한 CDC3B253의 결합을 보여준다.
도 41은 NUGC-4 세포에 대한 CDC3B253의 결합을 보여준다.
도 42는 NUGC-4 세포 CLDN18.2 KO 세포에 대한 CDC3B253의 결합을 보여준다.
본 개시 방법은 본 개시내용의 일부를 형성하는 첨부 도면과 관련하여 취해지는 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있다. 본 개시 방법은 본원에 기술되고/되거나 보여준 구체적인 방법으로 제한되지 않으며, 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태를 단지 예로서 기술하기 위한 것이고 청구된 방법을 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 가능한 작용 기전 또는 방식 또는 개선 이유에 대한 임의의 설명은 단지 예시적인 것으로 의미되며, 개시된 방법은 임의의 그러한 제시된 작용 기전 또는 방식 또는 개선 이유의 정확함 또는 부정확함에 의해 구속되어서는 안 된다.
본원에서 수치 값의 범위가 언급되거나 확립되어 있는 경우, 그러한 범위는 그의 종점 및 그러한 범위 내의 모든 개별적인 정수 및 분수를 포함하며, 또한 그러한 종점 및 내부 정수 및 분수의 모든 가능한 다양한 조합에 의해 형성된 그 안의 더 좁은 범위 각각을 포함하여, 마치 그러한 더 좁은 범위 각각이 명시적으로 언급된 것처럼 그와 동일한 정도로 언급된 범위 이내의 값의 더 큰 군의 하위군을 형성한다. 수치 값의 범위가 언급된 값을 초과하는 것으로 본원에 언급되는 경우, 그럼에도 불구하고 그 범위는 유한하며, 본원에 기재된 바와 같은 본 방법의 맥락 내에서 사용가능한 값에 의해 그의 상한치가 제한된다. 수치 값의 범위가 언급된 값 미만인 것으로 본원에 언급되는 경우, 그럼에도 불구하고 그 범위는 0이 아닌 값에 의해 그의 하한치가 제한된다. 범위를 한정할 때 언급된 특정 값으로 본 방법의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 모든 범위는 포괄적이며 조합가능하다.
값이 선행사 "약"의 사용에 의해 근사치로서 표현될 때, 특정 값은 다른 실시형태를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 특정 수치 값에 대한 언급은 적어도 그러한 특정 값을 포함한다.
명료함을 위하여, 개별적인 실시형태와 관련하여 본원에 기재된, 개시 방법의 소정 특징이 또한 단일 실시형태에서 조합되어 제공될 수 있음이 인식되어야 한다. 역으로, 간결함을 위해서, 단일 실시형태와 관련하여 기재된, 개시된 방법의 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 단수 형태(영문의 "a", "an", 및 "the"에 대응)는 복수 형태를 포함한다.
상세한 설명의 양태와 관련된 다양한 용어가 본원 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 나타내지 않으면 본 기술 분야에서의 그의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석된다.
용어 "약"은 특정된 값으로부터 ± 10% 이하의 변동, ± 5% 이하의 변동, ± 1% 이하의 변동, ± 0.5% 이하의 변동 또는 ± 0.1% 이하의 변동을 포함하기 위해 사용된다.
"포함하는", "본질적으로 ~로 이루어진" 및 "~로 이루어진"이라는 전이 용어는 특허 용어에서 일반적으로 허용되는 의미를 내포하도록 의도되며; 즉, (i) "구비하는", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"은 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않으며; (ii) "~로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제하고; (iii) "~로 본질적으로 이루어진"은 명시된 재료 또는 단계, 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"로 청구범위의 범위를 제한한다. "포함하는"(또는 이의 등가적 표현)이라는 어구의 관점에서 기술된 실시형태는 또한 "~로 이루어진"과 "본질적으로 ~로 이루어진"의 관점에서 독립적으로 기술되는 것들을 실시형태로서 제공한다. 어구 "~로 본질적으로 이루어진"(또는 이의 등가적 표현)의 관점에서 기술된 실시형태는 "~로 이루어진"의 관점에서 독립적으로 기술된 것들을 실시형태로서 또한 제공한다.
안정화된 CD3 항체 단편
본 개시내용은 CD3에 결합하는 항원-결합 항체 단편, 및 CD3에 결합하는 항원-결합 항체 단편을 포함하는 항원 결합 분자를 제공한다. 특정한 상황에서, 전체 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 더 작은 크기는 신속한 청소율(clearance)을 가능하게 하며, 세포, 조직 또는 기관에 대한 접근성 향상으로 이어질 수 있다. 특정 항체 단편에 관한 검토를 위해서는 문헌[Hudson et al., 2003, Nature Med. 9:129-34]을 참조한다.
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질 분해적 소화를 통해 유도되었다(예컨대, 문헌[Morimoto et al., 1992], 문헌[J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17]; 및 문헌[Brennan et al., 1985, Science 229:81-83] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv, scFv 및 spFv 항체 단편은 모두 대장균(E. coli) 또는 효모 세포에서 발현 및 분비될 수 있으며, 따라서 이들 단편의 용이한 대량 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 위에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌[Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-67]). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 구제 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편이, 예를 들어 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술이 숙련된 실무자에게 명백할 것이다. 특정 실시형태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다(예컨대, 국제공개 WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호 참조). 특정 실시형태에서, 항체는 스테이플링된 단일쇄 Fv 단편(spFv)이다(예컨대, 국제공개 WO 2021030657호 참조). Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 가지며; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 어느 하나에서 이펙터 단백질의 융합을 생성하도록 작제될 수 있다(예컨대, 문헌[Borrebaeck ed.] 참조). 항체 단편은 또한, 예를 들어 위에서 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체는 단일특이성 또는 다중특이성, 예컨대 이중특이성일 수 있다.
더 작은 항체-유래 결합 구조는 단일 가변 도메인 항체(sdAb)로도 불리는 별개의 가변 도메인(V 도메인)이다. 소정 유형의 유기체, 즉, 낙타과 및 연골 어류는 이들의 면역 시스템의 일부로서 Fc 등가 도메인 구조 상에 탑재된 고친화도 단일 V-유사 도메인을 갖는다. (문헌[Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101]; 및 문헌[Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49]). V-유사 도메인(낙타과에서는 VhH로 불리고, 상어에서는 V-NAR로 지칭됨)은 전형적으로 긴 표면 루프들을 디스플레이하며, 이들 루프는 표적 항원의 공동(cavity)의 침투를 가능하게 한다. 이들은 또한 소수성 표면 패치를 마스킹함으로써 단리된 VH 도메인을 안정화한다.
이들 VhH 및 V-NAR 도메인은 sdAb를 조작(engineer)하는 데 사용되어 왔다. 인간 V 도메인 변이체는 파지 라이브러리로부터의 선택, 및 안정한 고 결합 VL- 및 VH-유래 도메인을 생성한 다른 접근법을 사용하여 설계되어 왔다.
본원에 제공된 항원 결합 분자를 포함하는 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어 CD3 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 제공된 면역글로불린 분자는 임의의 클래스(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 또는 임의의 서브클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2)의 면역글로불린 분자일 수 있다.
항체의 변이체 및 유도체는 CD3 에피토프에 결합하는 능력을 보유하는 항체 기능적 단편을 포함한다. 예시적인 기능성 단편은 다음을 포함한다: Fab 단편(예컨대, 항원-결합 도메인을 함유하고, 이황화 결합에 의해 가교된 중쇄의 일부와 경쇄를 포함하는 항체 단편); Fab'(예컨대, Fab를 포함하는 단일 항원-결합 도메인 및 힌지 영역을 통한 중쇄의 추가 부분을 함유하는 항체 단편); F(ab')2(예컨대, 중쇄의 힌지 영역 내의 사슬간 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 분자; Fab' 분자들은 동일하거나 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음); 이중특이성 Fab(예컨대, 2개의 항원-결합 도메인을 갖는 Fab 분자; 이들 각각은 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음); scFv로도 알려진, 가변 영역을 포함하는 단일쇄(예컨대, 10 내지 25개 아미노산의 사슬에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄와 중쇄의 가변, 항원-결합 결정 영역); 이황화물-연결된 Fv, 또는 dsFv(예컨대, 이황화 결합에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄와 중쇄의 가변, 항원-결합 결정 영역); 스테이플링된 scFv, 또는 spFv(예컨대, VH 또는 VL과 링커 사이에 적어도 하나의 이황화 결합을 포함하는 scFv); 낙타화 VH(예컨대, VH 계면에서의 일부 아미노산이 자연 발생적인 낙타 항체의 중쇄에서 발견되는 것들인 항체의 단일 중쇄의 가변, 항원-결합 결정 영역); 이중특이성 scFv(예컨대, 2개의 항원-결합 도메인을 갖는 scFv 또는 dsFv 분자; 이들 각각은 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음); 다이아바디(예컨대, 제1 scFv의 VH 도메인이 제2 scFv의 VL 도메인과 조립될 때 형성되고, 제1 scFv의 VL 도메인이 제2 scFv의 VH 도메인과 조립될 때 형성되는 이량체화된 scFv; 다이아바디의 2개의 항원-결합 영역은 동일하거나 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음); 및 트리아바디(예컨대, 삼량체화된 scFv로서, 이는 다이아바디와 유사한 방식으로 형성되지만, 여기서는 3개의 항원-결합 도메인이 단일 복합체로 생성됨; 3개의 항원-결합 도메인은 동일하거나 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음).
일부 실시형태에서, CD3 결합 영역은 스테이플링된 단일쇄 항체 분자(예컨대, spFv)이다. 일부 실시형태에서, spFv CD3 결합 아암을 포함하는 항원 결합 분자는 항체, 다중특이성 항체, 나노바디, 다이아바디, 트리바디(tribody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디, 이중 가변 도메인 항체(DVD) 또는 단일 가변 도메인 항체(예컨대, 낙타과 항체)이다. CD3에 결합하는 임의의 VH 및 VL 도메인은 spFv CD3 결합 분자로 조작될 수 있다.
"CD3"은, 다분자 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 일부로서 T 세포 상에서 발현되고, 다음의 2개 또는 4개의 수용체 사슬의 회합으로부터 형성된 동종이량체 또는 이종이량체로 이루어진 항원을 지칭한다: CD3 엡실론(epsilon), CD3 델타, CD3 제타 및 CD3 감마. 인간 CD3 엡실론은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 세포외 도메인은 전장 CD3의 잔기 23 내지 126에 걸쳐 있다. 본원에서 단백질, 폴리펩티드, 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비인간 종으로부터 유래된 것으로 명시적으로 특정되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 한다. 따라서, "CD3"은 비인간 종, 예컨대, "마우스 CD3" 또는 "원숭이 CD3" 등으로부터의 것으로서 특정되지 않는 한, 인간 CD3을 의미한다.
서열번호 1(인간 CD3 엡실론) MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 광의로 의미되며, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 다중특이성 항체, 예컨대 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체라는 용어는 온전한 항체 및 항체 단편을 포함한다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라 5개의 주요 클래스(즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 분류될 수 있다. IgA 및 IgG는 이소형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 따라서, 본 발명의 항체는 5개의 주요 클래스 또는 상응하는 서브클래스 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 명확하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나로 지정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 항체는 래트 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 외에도, 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성된 항원-결합 영역을 포함하며, 이들 각각은 3개의 도메인(즉, 상보성 결정 영역 1-3; CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 지칭되며, 중쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 지칭된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 4개의 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
"상보성 결정 영역"(CDR)은 항원에 결합하는 항체 영역이다. VH에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다. CDR은 카바트(Kabat)(문헌[Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]), 초티아(Chothia)(문헌[Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17]), IMGT(문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]) 및 AbM(문헌[Martin et al. (1996) J Mol Biol 263: 800-15])과 같은 다양한 도식(delineation)을 사용하여 정의될 수 있다. 다양한 도식과 가변 영역 넘버링 사이의 대응관계가 기술되어 있다(예컨대, 문헌[Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]; 문헌[Honegger and Pluckthun (2001), J Mol Biol 309:657-70]; International ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스; 웹 리소스, http://www_imgt_org 참조). UCL Business PLC의 abYsis와 같은 이용 가능한 프로그램을 사용하여 CDR을 도식화(delineate)할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에 달리 명시적으로 기재되어 있지 않는 한, 상기에 기재된 방법들인 카바트, 초티아, IMGT 또는 AbM 중 임의의 것에 의해 정의된 CDR을 포함한다.
예를 들어 카바트 넘버링 및 IMGT 고유 넘버링 체계를 포함하는 넘버링 체계 사이의 대응 관계는 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Kabat]; 문헌[Chothia]; 문헌[Martin]; 문헌[Lefranc et al.] 참조).
[표 1]
"특이적으로 결합한다", "특이적 결합", "특이적으로 결합하는" 또는 "결합한다"는 단백질성 분자가 항원 또는 항원 내의 에피토프에 대해 다른 항원들에 대한 친화도보다 더 큰 친화도로 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 단백질성 분자는 약 1x10-7 M 이하, 예를 들어 약 5x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 또는 약 1x10-12 M 이하의 평형 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하며, 이때 전형적으로 KD는 비특이성 항원(예컨대, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 그의 KD보다 적어도 100배 더 적다. 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하며, 이는 KD 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 구해지고, 몰 농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 개시내용을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예컨대 바이오센서 시스템, 예컨대, Biacore® 시스템을 사용함으로써, 또는 생물층 간섭계 기술, 예컨대 Octet RED96 시스템을 사용함으로써 결정될 수 있다. 항체의 KD 값이 작을수록, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화도는 더 높다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "PSMA에 결합하는" 또는 "PSMA에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 1×10-9 M 이하, 5×10-10 M 이하, 또는 1×10-10 M, 5×10-11 M, 1×10-11 M, 5×10-12 M, 또는 1×10-12 M 이하의 KD로 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA에 결합하는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD3에 결합하는" 또는 "CD3에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 1×10-9 M 이하, 5×10-10 M 이하, 또는 1×10-10 M, 5×10-11 M, 1×10-11 M, 5×10-12 M, 또는 1×10-12 M 이하의 KD로 CD3, 바람직하게는 인간 CD3에 결합하는 항체를 지칭한다.
"이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 다른 관련 항원들에 대한, 예를 들어 다른 종(동족체), 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 사이노몰구스(cynomolgus, cyno) 또는 판 트로글로디테스와 동일한 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 사이에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
"이중특이성 CD3 항체"는 관심 제1 표적 항원에 결합하는 제1 결합 아암 및 CD3에 결합하는 제2 결합 아암을 갖는 항체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 CD3 항체의 하나 이상의 항원 결합 아암은 Fv 단편, 단일쇄 scFv 단편(scFv), 단일쇄 이황화 결합 안정화 scFv 단편 또는 스테이플링된 scFv 단편(spFv), Fab, F(ab)2, 또는 단일쇄 항체를 포함한다.
"온전한 항체"라는 용어는 천연 항체와 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. "온전한 항체"는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)뿐만 아니라 이의 다량체(예컨대, IgM)로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 다음의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
본원에서 사용되는 "항체 단편"이라는 용어는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편은 합성된, 효소적으로 수득 가능한 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드일 수 있으며, 항원에 결합하는 면역글로불린의 일부분, 예컨대 VH, VL, VH 및 VL, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 또는 이황화 안정화된 단일쇄 항체 분자(spFv 또는 스테이플링된 scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 1개의 VH 도메인 또는 1개의 VL 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb), 상어 가변 IgNAR 도메인, 낙타화 VH 도메인, VHH 도메인, 항체의 CDR을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위, 예컨대 FR3-CDR3-FR4 부분, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 항원에 결합하는 대안적 스캐폴드, 2가 도메인 항체, 항체를 포함하는 다중특이성 단백질, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 중쇄(HC), 경쇄(LC) 및 스테이플링된 단일쇄 Fv(spFv)를 포함하는 이중특이성 CD3 항체를 투여함으로써 실시된다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질이며, 여기서 VL 및 VH는 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단일쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. A
scFv는, 예컨대 폴리펩티드의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 대하여, 어느 순서로든 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다. scFv는 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커 내로 포함될 수 있는 예시적인 아미노산은 Gly, Ser Pro, Thr, Glu, Lys, Arg, Ile, Leu, His 및 The이다. 링커는 VH 및 VL이 서로에 대해 올바른 입체구조(conformation)를 형성하여 PSMA에 대한 결합 또는 CD3에 대한 결합과 같은 원하는 활성을 보유할 수 있도록 VH 및 VL을 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다.
"스테이플링된 단일쇄 Fv", "스테이플링된 scFv" 또는 "spFv"는 VH와 링커 사이 또는 VL과 링커 사이에 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 scFv를 지칭한다. 전형적으로, spFv는 VH와 링커 사이의 하나의 이황화 결합 및 VL과 링커 사이의 하나의 이황화 결합을 포함하거나, VH와 링커 및 VL과 링커 사이의 2개의 이황화 결합을 포함할 수 있다.
"스테이플(Staple)"은 앵커 포인트 Cys와 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나 또는 2개의 Cys 잔기를 함유하는 spFv 링커를 지칭한다.
"앵커 포인트"는 전체적인 scFv 구조에 악영향을 주지 않으면서 Cys로 돌연변이될 수 있고 scFv 링커에 상주하는 Cys와 이황화 결합을 형성할 수 있는 scFv 내의 VH 또는 VL 프레임워크 잔기를 지칭한다.
"VH 시스테인" 또는 "VH Cys"는 VH 프레임워크에 존재하는 Cys 잔기를 지칭한다.
"VL 시스테인" 또는 "VL Cys"는 VL 프레임워크에 존재하는 Cys 잔기를 지칭한다.
링커는 약 5 내지 50개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 40개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 35개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 30개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 25개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 10 내지 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 약 15 내지 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 6개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 7개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 8개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 9개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 10개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 11개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 12개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 13개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 14개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 15개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 16개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 17개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 18개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 19개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 20개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 21개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 22개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 23개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 24개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 25개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 26개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 27개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 28개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 29개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 30개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 31개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 32개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 33개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서,
링커는 34개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 35개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 36개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 37개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 38개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 39개 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 40개 아미노산 길이이다.
2개의 Cys 잔기를 함유하는 예시적인 링커들이 표 2에 열거되어 있다.
[표 2]
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 관심 종양 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이중특이성 CD3 항체를 투여함으로써 실시되며, 여기서 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인은 표 2의 링커를 포함하는 spFv를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 관심 종양 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이중특이성 CD3 항체를 투여함으로써 실시되며, 여기서 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인은 VL, 표 2의 링커 및 VH(VL-링커-VH)를 포함하는 spFv를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 관심 종양 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 CD3에 결합하는 결합 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이중특이성 CD3 항체를 투여함으로써 실시되며, 여기서 CD3에 결합하는 결합 도메인은 VH, 표 2의 링커 및 VL(VH-링커-VL)를 포함하는 spFv를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, spFv는 시스테인(Cys)으로 돌연변이된 구조적으로 보존된 표면 노출 VH 위치와 제1 링커 Cys 사이의 제1 이황화 결합; 및 Cys로 돌연변이된 구조적으로 보존된 표면 노출 VL 위치와 제2 링커 Cys 사이의 제2 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시형태에서, spFv의 VH Cys는 위치 H3, H5, H40, H43, H46 또는 H105에 있으며, 여기서 잔기 넘버링은 초티아에 따른다.
일부 실시형태에서, spFv의 VL Cys는 위치 L3, L5, L39, L42, L43, L45, L100 또는 L102에 있으며, 여기서 잔기 넘버링은 초티아에 따른다.
일부 실시형태에서, VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; VH Cys는 H3에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; VH Cys는 H5에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; VH Cys는 H40에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H43에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L42에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; VH Cys는 H46에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L3에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L5에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L39에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L43에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L45에 존재하거나; VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L100에 존재하거나; 또는 VH Cys는 H105에 존재하고 VL Cys는 L102에 존재하며, 여기서 잔기 넘버링은 초티아에 따른다.
일부 실시형태에서, spFv는 표 2의 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열 GGGSGGSGGCPPCGGSGG(서열번호 2)의 링커이다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열 GGGSGGCPPCGGGSGG(서열번호 3)의 링커이다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열 GGSGGSGGCPPCGSGG(서열번호 4)의 링커이다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열 GGGSGGSGGCPPCGSGG(서열번호 5)의 링커이다. 일부 실시형태에서, spFv 링커는 서열 GGGSGGGSGCPPCGGGG(서열번호 6)의 링커이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H105에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L42에 Cys를 포함하는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H105에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L42에 Cys를 포함하는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H105에 Cys를 포함하는 VH; L45에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H105에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L39에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H5에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L42에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H5에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L45에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H5에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L39에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H3에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L42에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H3에 Cys를 포함하는 VH; L45에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H3에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L39에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VL-L-VH 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H43에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L100에 Cys를 포함하는 VL; 및 서열번호2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H43에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L102에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H43에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L5에 Cys를 포함하는 VL; 및 서열번호2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H43에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L3에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H40에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L100에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H40에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L102에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H40에 Cys를 포함하는 VH; L5에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H40에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L3에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H46에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L100에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H46에 Cys를 포함하는 VH; L102에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H46에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L5에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
일부 실시형태에서, spFv는 H46에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VH; L3에 Cys를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 VL; 및 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 링커를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지며; 여기서 spFv는 VH-L-VL 배향이다.
특정 예는 2개의 이황화 결합을 갖는 spFv를 개시하지만, 링커 Cys와 VH Cys 또는 VL Cys 중 어느 하나 사이에 형성된 하나의 이황화 결합을 갖는 spFv를 제조 및 이용하여 "반-고정된" 분자를 생성할 수 있다는 것이 쉽게 구상된다. 앵커 위치는 1 또는 2개의 이황화 결합을 갖는 spFv에서와 동일하다. 링커 Cys 위치는 앵커 포인트와의 이황화 결합 형성에 대한 거리 및 기하학적 요건을 만족시키는 한 반-고정된 분자에서 다양할 수 있다. 반-고정된 spFv는 2개의 이황화 결합으로 안정화된 VL/VH 쌍과 유사하게 VL/VH 상대 이동을 억제하여 또한 안정화될 것으로 예상된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료 방법에서 사용되는 다중특이성 CD3 항체는 CD3에 특이적으로 결합하는 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체를 포함한다.
"인간 항체"는 인간 대상체에게 투여될 때 최소의 면역 반응을 갖도록 최적화된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 가변 영역은 인간 면역글로불린 서열에서 유도된다. 인간 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 함유하는 경우, 불변 영역 또한 인간 면역글로불린 서열에서 유도된다. 인간 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템에서 얻어지는 경우, 인간 항체는 인간 기원의 서열에서 "유도된" 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 예시적인 시스템은 파지에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리와, 인간 면역글로불린 유전자좌를 보유하는 마우스 또는 래트와 같은 유전자도입 비인간 동물이다. "인간 항체"는 전형적으로 인간 항체와 인간 면역글로불린 유전자좌를 얻는 데 사용되는 시스템 사이의 차이, 체세포 돌연변이의 도입, 또는 프레임워크 또는 CDR, 또는 둘 모두에의 의도적인 치환의 도입으로 인해 인간에서 발현되는 면역글로불린과 비교할 때 아미노산 차이를 함유한다.
전형적으로, "인간 항체"는 아미노산 서열에 있어서 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유도된 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열, 또는 예를 들어 문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 국제공개 WO 2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 제시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리에 통합된 합성에 의한 HCDR3을 함유할 수 있다. 적어도 하나의 CDR이 비인간 종에서 유도된 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
그 게놈 내에 인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 보유하는 마우스, 래트 또는 닭과 같은 유전자도입(transgenic) 동물은 본 개시내용의 방법에서 사용되는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 제6,150,584호, 국제공개 WO 1999/45962호, 국제공개 WO 2002/066630호, 국제공개 WO 2002/43478, 국제공개 WO 2002/043478호 및 국제공개 WO 1990/04036호에 기재되어 있다. 그러한 동물 내의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴 또는 결실될 수 있고, 적어도 하나의 완전한 또는 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌가 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 미니유전자(minigene)를 사용하여 동물의 게놈 내로 삽입될 수 있다. Regeneron(World Wide Web: regeneron.com), Harbour Antibodies(World Wide Web: harbourantibodies.com), Open Monoclonal Technology, Inc.(OMT)(World Wide Web: omtinc.net), KyMab(World Wide Web: kymab.com), Trianni(World Wide Web: trianni.com), 및 Ablexis(World Wide Web: ablexis.com)와 같은 회사가 관여하여 선택된 항원에 대해 지향된 인간 항체를 제공할 수 있다.
비-인간 동물을 면역화함으로써 생성된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법들을 사용하여 인간화될 수 있다. 일반적으로, 인간화되거나 조작된 항체는, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유동물과 같지만 이에 제한되지 않는 비인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간 수용체 프레임워크의 선택을 포함한 예시적인 인간화 기술은 CDR 그래프팅(미국 특허 제5,225,539호), SDR 그래프팅(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499]), 특이성 결정 잔기 재표면화(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 인간 프레임워크 적응화(미국 특허 제8,748,356호), 또는 초인간화(미국 특허 제7,709, 226호)를 포함한다. 이들 방법에서는, 모 항체의 CDR 또는 CDR 잔기들의 하위세트를 인간 프레임워크 상에 전달하는데, 이러한 인간 프레임워크는 모(parental) 프레임워크에 대한 그의 전체 상동성에 기초하여, CDR 길이의 유사성에 기초하여, 또는 표준 구조 동일성에 기초하여, 또는 이들의 조합에 기초하여 선택될 수 있다.
인간화 항원-결합 도메인은, 국제 특허 출원 공개 WO1090/007861호 및 WO1992/22653호에 기재된 것들과 같은 기술들에 의해, 변경된 프레임워크 지지 잔기를 도입시켜 결합 친화도를 보존함으로써(복귀 돌연변이(backmutation)), 또는 CDR들 중 임의의 것에서 변이를 도입하여, 예를 들어 항원-결합 도메인의 친화도를 개선함으로써 원하는 항원에 대한 그의 선택성 또는 친화도를 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용되는 이중특이성 CD3 spFv 항체는 포유류 세포 또는 유전자도입 제조로부터의 것을 포함하는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있거나, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 것과 같은 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 개시내용의 방법에서 사용되는 항체는 당업계에 잘 공지된 것과 같이, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화된(immortalized) 세포, 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 세포주는 본 개시내용의 항체를 발현하도록 조작될 수 있으며, 항체는 세포 내에서, 주변세포질 공간에서 생성되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다.
spFv CD3 항체를 포함하는 세포 용해물 또는 상청액은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피와 같은 단백질 정제를 위한 기타 기술들이 또한 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 서열번호 7, 13, 15, 17 또는 23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; (ii) 서열번호 8, 14, 16, 18 또는 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, (iii) 서열번호 9, 19 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; (iv) 서열번호 10, 20 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; (v) 서열번호 11, 21 또는 DSS의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및/또는 (vi) 서열번호 12 또는 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역에서, HCDR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역에서, HCDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역에서, HCDR1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역에서, HCDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역에서, HCDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 DSS의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH를 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, (i) 각각 서열번호 7, 8 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 (ii) 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다.
일 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 13, 14 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH를 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, (i) 각각 서열번호 13, 14 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 (ii) 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다.
일 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 15, 16 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH를 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, (i) 각각 서열번호 15, 16 및 9의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 (ii) 각각 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다.
일 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 17, 18 및 19의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH를 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 20, 21 및 22의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, (i) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 (ii) 각각 서열번호 20, 21 및 22의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다.
일 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH를 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, 각각 서열번호 26, DSS 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에, (i) 각각 서열번호 23, 24 및 25의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 (ii) 각각 서열번호 26, DSS 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL을 포함하는, CD3ε에 결합하는 결합 영역이 제공된다.
일부 실시형태에서, CD3ε 결합 영역은 하나 이상의 프레임워크 영역을 더 포함한다. 본원에 기재된 프레임워크 영역은 CDR 넘버링 체계의 경계에 기초하여 결정된다. 다시 말해서, 예컨대, 카바트, IMGT, 또는 초티아에 의해 CDR이 결정된다면, 프레임워크 영역은, N-말단으로부터 C-말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 포맷으로 가변 영역 내의 CDR을 둘러싸는 아미노산 잔기이다. 예를 들어, FR1은, 예컨대, 카바트 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, 또는 초티아 넘버링 체계에 의해 정의되는 바와 같이 CDR1 아미노산 잔기에 대해 N-말단인 아미노산 잔기로서 정의되고, FR2는, 예컨대, 카바트 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, 또는 초티아 넘버링 체계에 의해 정의되는 바와 같이 CDR1 및 CDR2 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR3은, 예컨대, 카바트 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, 또는 초티아 넘버링 체계에 의해 정의되는 바와 같이 CDR2 및 CDR3 아미노산 잔기 사이의 아미노산 잔기로서 정의되고, FR4는, 예컨대, 카바트 넘버링 체계, IMGT 넘버링 체계, 또는 초티아 넘버링 체계에 의해 정의되는 바와 같이 CDR3 아미노산 잔기에 대해 C-말단인 아미노산 잔기로서 정의된다. 일부 실시형태에서, CD3ε 결합 영역은 서열번호 28, 29, 202 또는 203의 1개 이상의 프레임워크 영역을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 본원에 제공된 임의의 CD3ε 결합 영역에 대해 특정 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 퍼센트 동일성의 결정은 당업계에 알려져 있거나 본원에 기재된 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 참조 서열에 비해 치환(예컨대, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 해당 서열을 포함하는 CD3ε 결합 영역은 CD3ε에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 실시형태에서는, 참조 아미노산 서열에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입, 및/또는 결실되었다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 선택적으로, 본원에 제공된 CD3ε 결합 영역은 참조 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
[표 3]
CD3B2030-N106A의 VH 아미노산 서열 서열번호 28 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRSTMHWVKQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPQVHYDYAGFPYWGCGTLVTVSS
CD3B2030-N106A의 VL 아미노산 서열. 서열번호 29 EIVLTQSPATLSASPGERVTLSCSASSSVSYMNWYQQKPGCAPRRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGRDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIK
CD3B2030-N106A의 spFv(VL-링커-VH) 아미노산 서열; 서열번호 30
EIVLTQSPATLSASPGERVTLSCSASSSVSYMNWYQQKPGCAPRRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGRDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIKGGGSGGSGGCPPCGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRSTMHWVKQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPQVHYDYAGFPYWGCGTLVTVSS
VH를 인코딩하는 DNA 서열(서열번호 68)
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAGATCCACCATGCACTGGGTCAAGCAGGCCCCTGGACAAGGCTTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCTCCGCCTACACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCTCCTCAGGTTCACTACGACTACGCCGGCTTTCCTTATTGGGGCTGTGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
VL을 인코딩하는 DNA 서열(서열번호 69)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGAGTGCTTCTCCAGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCTCCGCTTCCTCCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCTGCGCCCCTAGAAGATGGATCTACGACTCCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCTGCTAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCAGAGACTATACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCTAGGAACCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
CD3B2030-N106A의 spFv(VL-링커-VH) 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열(서열번호 70)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGAGTGCTTCTCCAGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCTCCGCTTCCTCCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCTGCGCCCCTAGAAGATGGATCTACGACTCCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCTGCTAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCAGAGACTATACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCTAGGAACCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGGGCGGAGGTTCTGGTGGATCTGGCGGATGTCCTCCTTGTGGTGGAAGCGGCGGACAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAGATCCACCATGCACTGGGTCAAGCAGGCCCCTGGACAAGGCTTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCTCCGCCTACACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCTCCTCAGGTTCACTACGACTACGCCGGCTTTCCTTATTGGGGCTGTGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
Fc 조작
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD3 spFv는 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 접합되어, Fc 이펙터 기능, 즉 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식균작용 또는 세포 표면 수용체(예컨대 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하는 항체-유사 특성을 부여한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CD3 spFv는 융합 단백질을 제조하는 데 사용되며, 여기서 융합 단백질은 CD3 spFv 및 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편을 포함하여 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 식균작용 또는 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하는 Fc 이펙터 기능을 비롯한 항체 유사 특성을 부여한다. Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 또한 본원에 논의된 바와 같이 반감기 연장 모이어티로서 기능한다. CD3 spFv는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 조작될 수 있다.
면역글로불린 중쇄 불변 영역은 하위도메인 CH1, 힌지, CH2 및 CH3로 구성된다. CH1 도메인은 중쇄 상의 잔기 A118 내지 V215, CH2 도메인은 잔기 A231 내지 K340, 그리고 CH3 도메인은 잔기 G341 내지 K447에 걸쳐 있으며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 경우에, G341은 CH2 도메인 잔기로 지칭된다. 힌지는 일반적으로 E216을 포함하고 인간 IgG1의 P230에서 종결되는 것으로 정의된다. 일부 실시형태에서, Ig Fc 영역은 Ig 불변 영역의 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 따라서 Ig 중쇄 불변 영역의 대략 A231 내지 K447 영역을 적어도 포함한다.
일부 실시형태에서, C-말단 라이신(CTL)은 Ig 불변 영역으로부터 제거된다. 따라서, 일부 실시형태에서, Ig Fc 영역은 Ig 중쇄 불변 영역의 약 A231로부터 G446까지의 적어도 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, CTL은 혈류 내의 내인성 순환 카르복시펩티다아제(문헌[Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412])에 의해 Ig 불변 영역으로부터 제거된다. 일부 실시형태에서, 제조 동안, CTL 제거는 미국특허출원공개 US 20140273092호에 기재된 바와 같이 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA - Fe3+ 농도의 제어에 의해 최대 수준 미만으로 제어될 수 있다. 단백질의 CTL 함량은 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
다른 실시형태에서, Ig 불변 영역에 융합된 CD3 spFv는 약 10% 내지 약 90%의 C-말단 라이신 함량을 갖는다. 다른 실시형태에서, C-말단 라이신 함량은 약 20% 내지 약 80%이다. 다른 실시형태에서, C-말단 라이신 함량은 약 40% 내지 약 70%이다. 다른 실시형태에서, C-말단 라이신 함량은 약 55% 내지 약 70%이다. 다른 실시형태에서, C-말단 라이신 함량은 약 60%이다.
본 개시내용은 또한 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 융합되거나 접합된 CD3 spFv를 제공한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 중쇄 불변 영역이다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역은 경쇄 불변 영역이다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 적어도 힌지의 일부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 힌지의 일부분은 Ig 힌지의 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD3 spFv는 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편의 N-말단에 융합되거나 접합된다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv는 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편의 C-말단에 융합되거나 접합된다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv는 제2 링커를 통해 Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 융합되거나 접합된다.
Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편에 융합되거나 접합된 본 개시내용의 CD3 spFv는 여러 알려진 검정법을 사용하여 그 기능성을 평가할 수 있다. CD3에 대한 결합은 본원에 기재된 방법들을 사용하여 평가될 수 있다. Ig 불변 도메인 또는 Ig 불변 영역의 단편, 예컨대 Fc 영역에 의해 부여된 변경된 특성은 예를 들어 ADCC, CDC 또는 ADCP를 측정하는 세포 기반 분석을 사용하여 또는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 또는 FcRn 수용체와 같은 수용체의 가용성 형태를 사용하여 Fc 수용체 결합 검정에서 분석될 수 있다.
ADCC는 NK 세포를 이펙터 세포로 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지(예컨대, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출될 수 있다. 예시적인 검정에서, 표적 세포는 1개의 표적 세포 대 4개의 이펙터 세포의 비로 사용된다. 표적 세포는 BATDA로 미리 표지되고, 이펙터 세포 및 시험 항체와 배합된다. 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 상청액 내로 방출된 BATDA를 측정함으로써 세포 용해를 측정한다. 0.67% Triton X-100(Sigma Aldrich)에 의한 최대 세포독성, 및 임의의 항체의 부재 하에서의 표적 세포로부터의 BATDA의 자발적인 방출에 의해 결정된 최소 대조군에 대해 데이터를 정규화한다.
ADCP는 이펙터 세포로서 단핵구 유래 대식세포를 사용하고, GFP 또는 다른 표지된 분자를 발현하도록 조작된 표적 세포를 사용하여 평가될 수 있다. 예시적인 검정에서, 이펙터:표적 세포 비는 예를 들어 4:1일 수 있다. 이펙터 세포는 본 발명의 항체와 함께 또는 이것 없이 4시간 동안 표적 세포와 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후에, 세포는 아큐타아제를 사용하여 탈착될 수 있다. 대식세포는 형광 표지에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체로 확인될 수 있으며, % 식균작용은 표준 방법을 사용하여 CD11+CD14+ 대식세포에서의 % GFP 형광에 기초하여 결정될 수 있다.
세포의 CDC는, 예를 들어 RPMI-B(1% BSA가 보충된 RPMI) 중에서 1x105 세포/웰(50 μL/웰)로 다우디 세포를 플레이팅하고, 0 내지 100 μg/mL의 최종 농도로 웰에 50 μL의 시험 단백질을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 반응물을 인큐베이션하고, 11 μL의 풀링된(pooled) 인간 혈청을 웰에 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 반응물을 인큐베이션함으로써 측정될 수 있다. 용해된 세포의 백분율(%)은 표준 방법을 사용하여 FACS 검정에서 % 프로피듐 요오다이드 염색된 세포로서 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc 조작(engineering)에 의해 본원에 제공된 항-CD3 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체의 Fc 영역의 변형은 항체의 이펙터 기능의 감소 또는 제거를 가져온다. 특정 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC이다. 일부 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC이다. 다른 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCP이다. 다른 실시형태에서, 이펙터 기능은 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC 및 ADCP이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC 및 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCP 및 CDC이다. 일 실시형태에서, 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC이다. 이는 항체의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 위치 233 내지 236에서의 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서의 IgG4 잔기를 사용한 인간 IgG1로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다(예컨대, 문헌들[Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29(8):2613-24]; 및 문헌[Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9): 6591-604] 참조). 다른 Fc 변이체는 본원의 다른 곳에 제공된다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 항체(특히, 항체 단편) 내로 구제 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있다. 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기의 증가를 담당하는 IgG 분자(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
일부 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 CD3 spFv의 반감기를 조절하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv의 반감기를 조절하는 적어도 하나의 돌연변이는 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두는 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, CD3 spFv의 반감기를 조절하는 적어도 1개의 돌연변이를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 FcγR에 대한 CD3 spFv의 결합 감소를 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, FcγR에 대한 CD3 spFv의 감소된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이는 F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두는 F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, CD3 spFv의 반감기를 조절하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편은 FcγR에 대한 CD3 spFv의 결합 향상을 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, FcγR에 대한 CD3 spFv의 향상된 결합을 야기하는 적어도 하나의 돌연변이는 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, FcγR은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, CD3 spFv는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두는 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, CD3 spFv의 반감기를 조절하는 적어도 1개의 돌연변이를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 결합제는 제1 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 내의 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 내의 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인에서의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인에서의 적어도 하나의 돌연변이는 T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, T366L, F405W, K392L, T394W, T394S, Y407T, Y407A, H435R, Y436F, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, T366L/K392L/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, L351Y/Y407V, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V, T350V/T366L/K392L/T394W, 및 H435R/L436F로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, CH3 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이는 H435R, Y436F 및 H435R/L436F로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은, 제1 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V 및 제2 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W 돌연변이; 또는 제1 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W 및 제2 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V 돌연변이를 포함한다.
대안적인 결합제
본 개시내용은 본원에서 개시된 CD3 spFv를 포함하는 비-면역글로불린 결합제를 포함한다. 이들 대안적인 결합제는, 예를 들어 당업계에 알려진 임의의 조작된 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드는 표 3에 도시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드는, 예를 들어, 리간드 결합 부위를 형성하는 4개의 초가변 루프를 지지하는 강성 베타-배럴을 특징으로 하는 단백질 구조인, 리포칼린 스캐폴드를 기반으로 하는 안티칼린을 포함한다. 신규한 결합 특이성은, 기능적 디스플레이 및 유도된 선택과 조합하여 루프 영역에서의 표적화된 무작위 돌연변이 생성에 의해 조작될 수 있다(예컨대, 문헌[Skerra, 2008, FEBS J. 275:2677-83] 참조). 다른 적합한 스캐폴드는, 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 인간 피브로넥틴 III의 제10 세포외 도메인에 기초한 애드넥틴 또는 모노바디(예컨대, 문헌[Koide and Koide, 2007, Methods Mol. Biol. 352: 95-109] 참조); 포도상구균 단백질 A의 Z 도메인에 기초한 아피바디(affibody)(예컨대, 문헌[Nygren et al., 2008, FEBS J. 275:2668-76] 참조); 안키린 반복 단백질에 기초한 DARPin(예컨대, 문헌[Stumpp et al., 2008, Drug. Discov. Today 13:695-701] 참조); 인간 Fyn 단백질 키나아제의 SH3 도메인에 기초한 피노머(fynomer)(예컨대, 문헌[Grabulovski et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:3196-204] 참조); 설폴로부스 아시돌라리우스(Sulfolobus acidolarius) 유래의 Sac7d에 기초한 아피틴(affitin)(예컨대, 문헌[Krehenbrink et al., 2008, J. Mol. Biol. 383:1058-68] 참조); 인간 y-B-크리스탈린에 기초한 아필린(affilin)(예컨대, 문헌[Ebersbach et al., 2007, J. Mol. Biol. 372:172-85] 참조); 막 수용체 단백질의 A 도메인에 기초한 아비머(avimer)(예컨대, 문헌[Silverman et al., 2005, Biotechnol. 23:1556-61] 참조); 시스테인-풍부한 노틴(knottin) 펩티드(예컨대, 문헌[Kolmar, 2008, FEBS J. 275:2684-90] 참조); 및 조작된 쿠니츠(Kunitz)형 억제제(예컨대, 문헌[Nixon and Wood, 2006, Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9:261-68] 참조). 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Gebauer and Skerra, 2009, Curr. Opin. Chem. Biol. 13:245-55]을 참조한다.
다중특이성 결합 단백질
본 개시내용의 일 양태에서, 본원에 기술된 CD3 spFv는 CD3 외에도 하나 이상의 다른 항원에 결합할 수 있는 다중특이성(예컨대, 이중특이성 또는 삼중특이성) 결합 분자에 혼입된다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 의한 것이며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(예컨대, 문헌[Milstein and Cuello, 1983, Nature 305:537-40] 참조). 이중특이성 항체 생성에 관한 추가적인 세부 사항은, 예를 들어 문헌[Bispecific Antibodies (Kontermann ed., 2011)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 이중특이성이다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 삼중특이성이다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 사중특이성이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기술된 결합제는 이중특이성 항체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 이중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시형태에서, 이중특이성 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시형태에서, 결합 특이성 중 하나는 CD3에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일부 실시형태에서, 결합 특이성 중 하나는 CD3에 대한 것이고, 다른 하나는 세포 상에 발현된 표면 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대, F(ab')2 이중특이성 항체)으로서 제조될 수 있다.
다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 1가(monovalent)이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 2가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 제2 항원에 대한 결합에 대해 1가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 제2 항원에 대한 결합에 대해 2가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 1가이고, 제2 항원에 대한 결합에 대해 1가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 2가이고, 제2 항원에 대한 결합에 대해 1가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 1가이고, 제2 항원에 대한 결합에 대해 2가이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 대한 결합에 대해 2가이고, 제2 항원에 대한 결합에 대해 2가이다.
일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 scFv, spFv, (scFv)2, Fv, Fab, F(ab')2, Fd, dAb 또는 VHH로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 Fab를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 F(ab')2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 VHH를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 Fv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 Fd를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 spFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이는 제1 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편에 융합되거나 접합되고/되거나, 종양 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인은 제2 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편에 융합되거나 접합된다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 단편 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 단편 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 CH2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 단편 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 단편 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 단편 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역의 단편은 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 도메인과 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 사이, 그리고 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인과 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편 사이에 제2 링커(L2)를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 IgG1, IgG2, 및 IgG3 또는 IgG4 이소형이다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 IgG1 이소형이다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 IgG2 이소형이다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 IgG3 이소형이다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 IgG4 이소형이다.
제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 본원에 기재된 바와 같이 추가로 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 FcγR에 대한 다중특이성 단백질의 감소된 결합을 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, FcγR에 대한 다중특이성 단백질의 감소된 결합을 가져오는 적어도 하나의 돌연변이는 F234A/L235A, L234A/L235A, L234A/L235A/D265S, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 다중특이성 단백질의 향상된 결합을 야기하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, FcγR에 대한 다중특이성 단백질의 향상된 결합을 야기하는 적어도 하나의 돌연변이는 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시형태에서, FcγR은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIII, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은 다중특이성 단백질의 반감기를 조절하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질의 반감기를 조절하는 적어도 하나의 돌연변이는 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 다중특이성 단백질은 제1 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 내의 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 내의 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인에서의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 제2 Ig 불변 영역의 CH3 도메인 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편의 CH3 도메인에서의 적어도 하나의 돌연변이는 T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366W, T366L, F405W, K392L, T394W, T394S, Y407T, Y407A, T366S/L368A/Y407V, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, T366L/K392L/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, L351Y/Y407A, L351Y/Y407V, T366A/K409F, L351Y/Y407A, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V 및 T350V/T366L/K392L/T394W로 이루어진 군으로부터 선택되고, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 제1 Ig 불변 영역의 단편 및 제2 Ig 불변 영역 또는 제2 Ig 불변 영역의 단편은, 제1 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V 및 제2 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W 돌연변이; 또는 제1 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_T366L_K392L_T394W 및 제2 Ig 불변 영역 내의 L234A_L235A_D265S_T350V_L351Y_F405A_Y407V 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 다중특이성 결합 단백질은 전장(full-length) 항체 구조를 갖는 항체이다. "전장 항체"는 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체 중쇄(HC)는 잘 알려진 중쇄 가변 및 불변 도메인 VH, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 전장 항체 경쇄(LC)는 잘 알려진 경쇄 가변 및 불변 도메인 VL 및 CL로 이루어진다. 전장 항체는 어느 하나 또는 둘 모두의 중쇄에 C-말단 라이신(K)이 결여되어 있을 수 있다. "Fab-아암" 또는 "반쪽 분자(half molecule)"는 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 반쪽 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공동발현을 사용하거나 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 반쪽 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 반쪽 분자의 이종이량체화를 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화 결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-결합의 결과이다. 모체 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화 결합은 환원된다. 모체 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모체 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화 결합을 형성하고, 동시에 모체 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 결과 생성물은 각각 별개의 에피토프, 즉 관심 표적 항원상의 에피토프 및 CD3상의 에피토프에 결합하는 2개의 Fab 아암 또는 반쪽 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
"동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 결합 단백질은 Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech), 노브-인-홀(Knob-in-Hole)(Genentech), CrossMAb(Roche) 및 정전기적 매칭(electrostatically-matched)(Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y(Genentech), 가닥 교환 조작된 도메인 바디(SEEDbody: Strand Exchange Engineered Domain body)(EMD Serono), Biclonic(Merus) 및 DuoBody(Genmab A/S)와 같은 설계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 다중특이성 결합 단백질은 노브-앤-홀 포맷이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 다중특이성 결합 단백질은 DuoBody 포맷이다.
Triomab Quadroma 기술이 본원에 제공된 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. Triomab 기술은 2개의 모 키메라 항체들 사이의 Fab 아암 교환을 촉진시키는데, 이때 하나의 모 mAb는 IgG2a를 갖고, 제2 모 mAb는 래트 IgG2b 불변 영역을 가져서, 키메라 이중특이성 항체를 생성한다.
"노브-인-홀" 전략(예컨대, 국제공개 WO 2006/028936호 참조)는 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이화되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
CrossMAb 기술이 본원에 제공된 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. Fab 아암 교환을 촉진하기 위하여 "노브-인-홀" 전략을 이용하는 것에 더하여, CrossMAb는 하프 아암들 중 하나에서, CH1 및 CL 도메인이 교환되어 있어서, 생성된 이중특이성 항체의 올바른 경쇄 쌍형성을 보장한다(예컨대, 미국 특허 제8,242,247호 참조).
한쪽 또는 양쪽 아암에서, 중쇄와 경쇄 사이에서 또는 이중특이성 항체 내의 중쇄 내에서 가변 또는 불변 도메인, 또는 두 도메인 모두를 교환함으로써 본원에 제공된 전장 이중특이성 항체를 생성하기 위하여 다른 크로스-오버 전략이 사용될 수 있다. 이들 교환은, 예를 들어 국제공개 WO 2009/080254호, WO 2009/080251호, WO 2009/018386호 및 WO 2009/080252호에 기재된 바와 같이 VL-CL과 VH-CH1, VL과 VH, CL과 CH3 및 CH1과 CH3의 교환을 포함한다.
미국특허출원공개 US 2010/0015133호; US 2009/0182127호; US2010/028637호; 또는 US 2011/0123532호에 기재된 바와 같이, 하나의 CH3 표면에는 양으로 대전된 잔기를 치환하고 제2 CH3 표면에는 음으로 대전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 이용하여 중쇄 이종이량체 형성을 촉진하는 것과 같은 다른 전략들이 사용될 수 있다. 다른 전략에서는, 미국특허출원공개 US 2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 US2013/0195849호에 기재된 바와 같이, 다음의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W. 동종이량체 및/또는 반쪽 분자 종의 제거를 용이하게 할 수 있는 다른 전략은 중쇄 CH3 도메인에 H435R 및 Y436F 치환을 모두 혼입하는 것을 포함한다.
LUZ-Y 기술이 본원에 제공된 이중특이성 항체를 생성하는 데 이용될 수 있다. 이 기술에서는, 류신 지퍼가 CH3 도메인의 C 말단 내로 첨가되어 모 mAb로부터 이종이량체 조립을 유도하고, 이것을 정제 후에 제거하는데, 이는 문헌[Wranik et al., (2012) J Biol Chem 287(52): 42221-9]에 기재된 바와 같다.
SEEDbody 기술이 본원에 제공된 이중특이성 항체를 생성하는 데 이용될 수 있다. SEEDbody는, 그의 불변 도메인에서, 선택된 IgG 잔기가 IgA 잔기로 치환되어 있어서, 이종이량체화를 촉진시키는데, 이는 미국특허출원공개 US 20070287170호에 기재된 바와 같다.
전술된 방법에 더하여, 본원에 제공된 결합제는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써, 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제공개 WO 2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다.
본원에 기술된 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 이중특이성 CD3 결합제는 CD3 spFv를 포함하는 제1 결합 영역 및 제2 항원에 결합하는 제2 결합 영역을 포함하며, 항체 CH3 불변 도메인 내에 적어도 하나의 치환을 포함한다. 치환은 전형적으로 표준 방법을 사용하여 항체의 불변 도메인과 같은 분자에 대해 DNA 수준에서 이루어진다.
본원에 제공된 항체는 다양한 잘 알려진 항체 형태로 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 다이아바디 또는 크로스-바디(cross-body)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 이종이량체화를 촉진하는 상보적 CH3 도메인을 갖는 IgG-유사 분자; 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자 - 여기서, 분자의 2개의 측 각각이 적어도 2개의 상이한 항체의 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부를 함유함 -; IgG 융합 분자 - 여기서, 전장 IgG 항체가 추가 Fab 단편 또는 Fab 단편의 일부에 융합됨 -; Fc 융합 분자 - 여기서, 단일쇄 Fv 분자 또는 안정화된 다이아바디가 중쇄 불변 도메인, Fc 영역 또는 이의 일부에 융합됨 -; Fab 융합 분자 - 여기서, 상이한 Fab 단편이 함께 융합됨 -; ScFv- 및 다이아바디-기반 및 중쇄 항체(예컨대, 도메인 항체, 나노바디) - 여기서, 상이한 단일쇄 Fv 분자들 또는 상이한 다이아바디들 또는 상이한 중쇄 항체들(예컨대, 도메인 항체, 나노바디)이 서로 또는 다른 단백질 또는 캐리어 분자에 융합됨 - 를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 IgG-유사 이중 표적화 분자는 이중 표적화(DT: Dual Targeting)-Ig (GSK/Domantis), 투-인-원 항체(Two-in-one Antibody)(Genentech), 가교결합된(Cross-linked) Mab(Karmanos Cancer Center), mAb2(F-Star) 및 CovX-바디(CovX/Pfizer)를 포함한다.
일부 실시형태에서, IgG 융합 분자는 이중 가변 도메인(DVD)-Ig(Abbott), IgG-유사 이중특이체(ImClone/Eli Lilly), Ts2Ab(MedImmune/AZ) 및 BsAb(Zymogenetics), HERCULES(Biogen Idec) 및 TvAb(Roche)를 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 융합 분자는 ScFv/Fc 융합체(Academic Institution), SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), 이중 친화성 재표적화 기술(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DART) (MacroGenics) 및 이중(Dual)(ScFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine-China)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Fab 융합 이중특이성 항체는 F(ab)2(Medarex/AMGEN), 이중-작용체(Dual-Action) 또는 Bis-Fab(Genentech), 독-앤드-록(DNL: Dock-and-Lock)(ImmunoMedics), 2가 이중특이체(Bivalent Bispecific)(Biotecnol) 및 Fab-Fv(UCB-Celltech)를 포함한다. ScFv-, 다이아바디-기반 및 도메인 항체는 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)(Micromet), 탠덤 다이아바디(Tandab)(Affimed), 이중 친화성 재표적화 기술(DART)(MacroGenics), 단일쇄 다이아바디(Academic), TCR-유사 항체(AIT, ReceptorLogics), 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체(Merrimack) 및 COMBODY(Epigen Biotech), 이중 표적화 나노바디(Ablynx), 이중 표적화 중쇄 단독 도메인 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 다양한 포맷의 이중특이성 항체는, 예를 들어 문헌[Chames and Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276] 및 문헌[Nunez-Prado et al., (2015) Drug Discovery Today 20(5):588-594]에 기재되어 있다.
이중특이성 spFv CD3 결합 단백질
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인은 VH 및 VL을 포함하고; CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 표 3의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인은 VH 및 VL을 포함하고; CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 관심 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인은 VH 및 VL을 포함하고; CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH, 서열번호 29의 VL 및 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 관심 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인은 VH 및 VL을 포함하고; CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, CD3 이외의 임의의 항원이 본 다중특이성 CD3 결합제에 대한 제2 항원 표적으로 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다중특이성 결합제는 다중특이성 결합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 치료 방법에서 사용되는 이중특이성 spFv CD3 항체는 CD3 및 하나 이상의 추가적인 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 전형적인 표적 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 항원, 자가면역 질환 또는 장애와 연관된 항원, 및 염증성 질환 또는 장애와 연관된 항원을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 항원은 종양 항원이다. 전형적인 종양 항원은 전립선 특이성 막 항원(PSMA) 및 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제 패밀리 멤버 3(ENPP3), 클라우딘(claudin) 및 GUCY2C를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
안정화된 PSMA x CD3 이중특이성 항체
"PSMA"는 전립선 특이성 막 항원을 지칭한다. 세포외 도메인은 전장 PSMA의 잔기 44 내지 750에 걸쳐 있다. 본원에서 단백질, 폴리펩티드, 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비인간 종으로부터 유래된 것으로 명시적으로 특정되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 한다. 따라서, "PSMA"는 비-인간 종으로부터의 것, 예컨대 "마우스 PSMA" 또는 "원숭이 PSMA" 등으로 특정되지 않는 한, 인간 PSMA를 의미한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 PSMAxCD3 항체를 포함하며, 여기서 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 또는 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 PSMAxCD3 항체를 포함하며, 여기서 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VL 시스테인을 포함하는 VL, 표 2의 링커, 및 VH 시스테인을 포함하는 VH(VL-링커-VH)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 및/또는 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 PSMAxCD3 항체를 포함하며, 여기서 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VH 시스테인을 포함하는 VH, 표 2의 링커, 및 VL 시스테인을 포함하는 VL(VH-링커-VL)을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
임의의 PSMA 결합 분자가 본 개시내용의 이중특이성 결합 분자에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 갖는 PSMAxCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH, 서열번호 29의 VL 및 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 PSMAxCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv를 포함한다.
안정화된 ENPP3 x CD3 이중특이성 항체
ENPP3(CD203c)은 세포 표면 엑토뉴클레오티드 피로포스파타아제/포스포디에스테라아제(ENPP) 패밀리의 구성원으로, 세포외 뉴클레오티드의 가수분해에 관여하는 ATPase 및 ATP 피로포스파타아제 활성을 갖는 구조적으로 연관된 7개의 분자로 이루어진다(문헌[Stefan et al., 2005, Trends Biochem Sci, 30(10):542-550]). ENPP3은 150 kDa의 단일-패스(single-pass) 2형 막관통 단백질이며, 뉴클레아제 유사 도메인, 촉매 도메인 및 소마토메딘 B 유사 도메인을 포함하는 세포외 영역을 갖는다(문헌[Borza et al., 2022, J Biol Chem, 298(2):101526]; 문헌[Hausmann et al., 2013, Adv Biol Regul, 53(1):112-117]).
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 ENPP3xCD3 항체를 포함하며, 여기서 PSMA에 결합하는 제1 가변 도메인 또는 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 ENPP3에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 ENPP3xCD3 항체를 포함하며, 여기서 ENPP3에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VL 시스테인을 포함하는 VL, 표 2의 링커, 및 VH 시스테인을 포함하는 VH(VL-링커-VH)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 및/또는 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 ENPP3에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 ENPP3xCD3 항체를 포함하며, 여기서 ENPP3에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VH 시스테인을 포함하는 VH, 표 2의 링커, 및 VL 시스테인을 포함하는 VL(VH-링커-VL)을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
임의의 ENPP3 결합 분자가 본 개시내용의 이중특이성 결합 분자에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 ENPP3에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 갖는 ENPP3xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH, 서열번호 29의 VL 및 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 ENPP3에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 ENPP3xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv를 포함한다.
안정화된 클라우딘 x CD3 이중특이성 항체
클라우딘 18.2(CLDN18.2)는 위 상피에서 세포-세포 접착 및 세포 간 이온 수송의 조절 역할을 하는 4-막관통 도메인 밀착 연접(tight junction) 단백질이다. 정상 조직에서, CLDN18.2 발현은 위 점막의 분화된 상피 세포에 엄격히 국한된다. CLDN18.2는 위암 및 췌장 선암종, 위식도 접합부(GEJ) 종양, 식도 선암종 및 전이성 병변을 포함한 소화기 계통의 암에서 고도로 발현된다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 CLDN18.2에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 CLDN18.2xCD3 항체를 포함하며, 여기서 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인 또는 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 CLDN18.2에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 CLDN18.2xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CLDN18.2에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VL 시스테인을 포함하는 VL, 표 2의 링커, 및 VH 시스테인을 포함하는 VH(VL-링커-VH)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 및/또는 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 CLDN18.2에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 CLDN18.2xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CLDN18.2에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VH 시스테인을 포함하는 VH, 표 2의 링커, 및 VL 시스테인을 포함하는 VL(VH-링커-VL)을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
임의의 CLDN18.2 결합 분자가 본 개시내용의 이중특이성 결합 분자에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 갖는 CLDN18.2xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH, 서열번호 29의 VL 및 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 CLDN18.2xCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv를 포함한다.
안정화된 GUCY2C x CD3 이중특이성 항체
"GUCY2C"는 구아닐레이트 시클라아제 2C를 지칭하며, 구아닐릴 시클라아제 C(GC-C), 장 구아닐레이트 시클라아제, 구아닐레이트 시클라아제-C 수용체, 또는 열안정성 엔테로톡신 수용체(hSTAR)로도 알려져 있다. GUCY2C는 장 상피의 내강 쪽과 뇌의 도파민 뉴런에서 발견되는 효소이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 GUCY2CxCD3 항체를 포함하며, 여기서 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인 또는 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 GUCY2CxCD3 항체를 포함하며, 여기서 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VL 시스테인을 포함하는 VL, 표 2의 링커, 및 VH 시스테인을 포함하는 VH(VL-링커-VH)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 및/또는 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 GUCY2CxCD3 항체를 포함하며, 여기서 GUCY2C에 결합하는 제1 가변 도메인은 Fab이고, CD3에 결합하는 제2 가변 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로, VH 시스테인을 포함하는 VH, 표 2의 링커, 및 VL 시스테인을 포함하는 VL(VH-링커-VL)을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나 본질적으로 이로 이루어지는 이황화 안정화된 scFv(spFv)이다.
임의의 GUCY2C 결합 분자가 본 개시내용의 이중특이성 결합 분자에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 갖는 GUCY2CxCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH, 서열번호 29의 VL 및 표 2의 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 항체는 GUCY2C에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하는 GUCY2CxCD3 항체를 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv를 포함한다.
CD3 항체 단편 변이체
본 개시내용은 또한 전술한 spFv CD3 결합 분자 및 spFv CD3 결합 분자를 포함하는 이중특이성 항체의 변이체를 포괄한다.
"변이체"라는 용어는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가를 포함하는 항체를 지칭한다. 그러한 부가, 치환 또는 결실은 분자 내의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 몇몇 아미노산이 부가되거나, 치환되거나, 결실되는 경우, 생성되는 항체가 여전히 본 발명의 항체의 적어도 유리한 특성을 갖는다는 조건 하에, 부가, 치환, 또는 결실의 임의의 조합이 고려될 수 있다.
spFv CD3 항체의 서열은 전술한 서열과 적어도 80%의 동일성 또는 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 전술한 CD3에 결합하는 항원 결합 도메인에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. CD3에 결합하는 항원 결합 도메인 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 아미노산 치환을 포함하는 CD3에 결합하는 항원 결합 도메인의 변이체의 사용은, 모 항원 결합 도메인과 비교할 때 이들이 개선된 기능적 특성을 유지하거나 갖는 한, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
CD3에 결합하는 항원 결합 도메인의 변이체는 하나 이상의 결실 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 부가를 포함한다. 그러한 부가, 치환 또는 결실은 분자 내의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 몇몇 아미노산이 부가되거나, 치환되거나, 결실되는 경우, 생성되는 항체가 여전히 본 발명의 항체의 적어도 유리한 특성을 갖는다는 조건 하에, 부가, 치환, 또는 결실의 임의의 조합이 고려될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 28의 VH와 적어도 80% 동일한 VH 및 서열번호 29의 VL과 적어도 80% 동일한 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이중특이성 spFv CD3 항체는 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하는 제1 가변 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인을 포함하며, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 가변 도메인은 서열번호 30의 spFv와 적어도 80% 동일한 spFv를 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예컨대, spFv CD3 항체 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 시각적 검사에 의해, 또는 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 참조 폴리펩티드에 대한 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성은 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한, 주어진 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트(%) 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은, BLAS, BLAST-2, ALIGN과 같은 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술수준 내에 있는 다양한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. Megalin(DNASTAR) 또는 GCG 소프트웨어 패키지에서 이용 가능한 GAP 프로그램.
폴리펩티드가 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 경우는, 예를 들어 이들 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우뿐이다. 본 발명의 항체는 또한 결합 특성, 기능적 또는 물리적 특성이 직접 돌연변이에 의해 개선된 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3에 결합하는 변이체 항원 결합 도메인은, CD3에 결합하는 모 항체의 원하는 기능적 특성을 유지하면서 임의의 CDR 영역에 하나 또는 둘의 보존적 치환을 포함한다.
"보존적 변형"은 아미노산 변형을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의미한 영향을 주지 않거나 그를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 잘 규정되어 있고, 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예컨대, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예컨대, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예컨대, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 황-함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 더욱이, 알라닌 스캐닝 돌연변이 생성에 대해 위에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 알라닌으로 치환될 수 있다(문헌[MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67]; 및 문헌[Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24]). 본 출원의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이 생성(미국 특허 제4,683,195호)에 의해 실행될 수 있다.
대안적으로, 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하여 생성할 수 있다. 생성되는 변이체들은 본원에 기재된 검정을 사용하여 그들의 특성에 대해 시험될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 개시내용의 spFv CD3 결합 분자를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 또한 개시된다. 본 개시내용의 spFv CD3 결합 분자를 인코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 동일하거나 상이한 벡터에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 리더(leader) 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 이용될 수 있다. 리더 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는, 비제한적으로, 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서), 선별 마커 및 폴리아데닐화 신호와 같은 하나 이상의 추가 서열을 함유할 수 있다.
상세한 설명의 범위 내의 재조합 발현 벡터는 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 인코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 핵산 단편을 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터는 또한 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹 미전사 서열, 5' 또는 3' 미번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 또는 전사 종결 서열과 같은 하나 이상의 미전사 요소를 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.
척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터는 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)]에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편 코딩 서열은 강력한 구성적 프로모터의 제어 하에 놓인다. 또한, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시형태와 함께 사용하기에 적합하다. 일 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 코딩 서열은 유도성 프로모터의 제어하에 놓인다.
본원에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위를 포함할 것이며, 이는 전술한 임의의 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
본원에 기재된 벡터는 다양한 세포를 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 유전자로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 본 개시내용의 이중특이성 spFv CD3 결합 분자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
외래 유전자를 세포에 도입하는 다수의 기술이 당업계에 알려져 있으며, 이러한 기술은 본원에 기재되고 예시된 다양한 실시형태에 따라 기재된 방법을 수행하기 위해 재조합 세포를 작제하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 기술은 이종 유전자 서열이 세포 자손에 의해 유전되고 발현되도록 이종 유전자 서열을 숙주세포로 안정적으로 전달하고, 수용 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 방해받지 않도록 제공되어야 한다. 사용될 수 있는 기술에는, 비제한적으로, 염색체 전달(예컨대, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로세포 매개 유전자 전달), 물리적 방법(예컨대, 형질감염, 스페로플라스트 융합, 미세주사, 전기천공, 리포좀 담체), 바이러스 벡터 전달(예컨대, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스) 등(문헌[Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)]에 기재된 것)이 포함된다. 인산칼슘 침전, 및 박테리아 원형질체와 포유류 세포의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도 융합이 또한 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 발현에 사용하기 적합한 세포는 바람직하게는 진핵 세포이며, 더 바람직하게는 식물, 설치류 또는 인간 기원의 세포이다. 또한, 항체의 발현은 하이브리도마 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 방법 또한 당업계에 잘 확립되어 있다.
본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합 양성 세포는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해, 고수준 발현, 증강된 성장 특성, 또는 목적하는 생화학적 특징을 갖는 단백질을 생성하는 능력과 같은 목적하는 표현형을 나타내는 서브클론에 대해 증식되고 스크리닝된다. 이러한 표현형은 소정의 서브클론의 고유한 특성 또는 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 미스매치 복구의 저해, 또는 이러한 방법들의 조합의 사용을 통해 생성될 수 있다.
치료 방법
본원에서는, 적어도 spFv CD3 결합 분자를 포함하는 결합 분자, spFv CD3 결합 분자를 포함하는 항체, 또는 spFv CD3 결합 분자의 변이체 또는 이의 임의의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 질환 또는 장애가 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 결합 분자는 spFv CD3 결합 아암 및 항원 결합 아암을 포함하는 이중특이성 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 아암은 치료 중인 질환 또는 장애와 연관된 항원에 결합하는 데 특이적이다.
본원에서 사용되는 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 완화, 경감 또는 개선시키는 것, 추가 증상을 예방하는 것, 질환 또는 병태를 저해하는 것, 예컨대, 질환 또는 병태의 발병을 저지하는 것, 질환 또는 병태를 완화하는 것, 질환 또는 병태의 퇴행을 유발하는 것, 병태의 진행을 지연하는 것, 질환 또는 병태로 인한 상태를 완화하는 것 또는 예방적 및/또는 치료적으로 질환 또는 병태의 증상을 중단시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 질병 또는 병태를 치료할 수 있는 화합물의 농도를 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 농도는 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 실제로 투여되는 본 발명의 항체의 양은 전형적으로 치료할 상태, 선택한 투여 경로, 실제로 투여되는 화합물, 대상체의 연령, 체중 및 반응, 대상체 증상의 심각도 등을 포함한 관련 상황을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 또한 투여량은 투여된 항체의 안정성에 따라 달라질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 수 있을 것이다.
유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 체중, 대상체의 신체 상태, 치료 기간, 병행 요법의 특성(있는 경우), 사용된 특정 제제, 항체 또는 그 변이체의 구조, 및 개체에게 원하는 반응을 이끌어내는 치료제나 치료제의 조합의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여되는 항체의 유효량은 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 및 항체 폴리펩티드 또는 항체의 약학적 조성물의 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형(영문의 "a", "an" 및 "the"에 대응)은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "펩티드 서열" 또는 "치료"에 대한 언급은 복수의 그러한 서열, 치료 등을 포함한다. 나아가, 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음에 유의해야 한다. 이와 같이, 이러한 진술은 청구항 요소의 기재와 관련하여 "오로지", "단지" 및 그와 유사한 배타적 용어의 사용 또는 "부정적" 제한의 사용을 위한 선행 근거 역할을 하도록 의도되었다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명확히 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한 단위의 10분의 1까지의 각 개재 값, 및 해당 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 개재 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 해당 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 구체적으로 제외된 임의의 한계치에 따라 본 발명 내에 또한 포함된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 해당 포함된 한계치 중 어느 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 값은 종종 본 문서 전반에 걸쳐 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 사용은 단지 편의상 및 간결성을 위한 것이며, 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 완강한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 따라서, 문맥상 달리 명확히 지시하지 않는 한, 범위의 사용은 모든 가능한 하위 범위, 해당 범위 내의 모든 개별 수치 값, 및 그러한 범위 내의 정수를 포함하는 모든 수치 값 또는 수치 범위와 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 명시적으로 포함한다. 이러한 구성은 범위의 폭에 관계없이 그리고 본 특허 문서 전반의 모든 문맥에서 적용된다. 따라서, 예를 들어 90 내지 100%의 범위에 대한 언급은 91 내지 99%, 92 내지 98%, 93 내지 95%, 91 내지 98%, 91 내지 97%, 91 내지 96%, 91 내지 95%, 91 내지 94%, 91 내지 93% 등을 포함한다. 90 내지 100% 범위에 대한 언급은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 등뿐만 아니라, 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등, 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등 및 그 외의 수치들을 또한 포함한다. 또한, 1 내지 3, 3 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 190 내지 200, 200 내지 225, 225 내지 250 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등을 포함한다. 추가적인 예에서, 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1,000, 1,000 내지 2,500, 2,500 내지 5,000, 5,000 내지 25,000, 또는 5,000 내지 50,000 범위에 대한 언급은 그러한 수치 내에 있거나 그러한 수치를 아우르는 임의의 수치 값 또는 범위를 포함하며, 예컨대 25, 26, 27, 28, 29…250, 251, 252, 253, 254….500, 501, 502, 503, 504… 등을 포함한다. 일련의 범위를 사용하는 것은 상한 및 하한 범위의 조합을 포함하여 또 다른 범위를 제공한다. 이러한 구성은 범위의 폭에 관계없이 그리고 본 특허 문서 전반의 모든 문맥에서 적용된다. 따라서, 예를 들어 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150과 같은 일련의 범위에 대한 언급은 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 50, 5 내지 75, 5 내지 100, 5 내지 150, 및 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 75, 10 내지 100, 10 내지 150, 및 20 내지 40, 20 내지 50, 20 내지 75, 20 내지 100, 20 내지 150 등과 같은 범위를 포함한다.
간결성을 위해, 소정 약어가 본원에 사용된다. 하나의 예는 아미노산 잔기를 나타내는 1-문자 약어이다. 아미노산 및 이의 상응하는 3-문자 및 1-문자 약어는 다음과 같다:
본 발명은 다수의 실시형태를 기술하기 위해 긍정 언어를 사용하여 일반적으로 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정, 또는 분석과 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제되는 실시형태를 구체적으로 포함한다. 따라서, 본 발명이 포함하지 않는 것의 관점에서 본 발명이 본원에 일반적으로 표현되지 않더라도, 그럼에도 불구하고 본 발명에 명시적으로 포함되지 않은 양태들이 본원에 개시된다.
본 발명의 특정 실시형태가 본원에 기술되어 있다. 전술한 설명의 해석 시, 개시된 실시형태들의 변형이 당업자에게 명백해질 수 있으며, 당업자는 적절한 이러한 변형을 이용할 수 있음이 예상된다. 따라서, 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 본원에 첨부된 청구범위에 나열된 기술 요지의 모든 변경 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 본원에서 달리 나타내거나, 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 이의 모든 가능한 변형에서 위에 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 의해 포함된다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 수탁 번호 및 기타 참조 문헌은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 마찬가지로, 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그 개시내용을 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명에 의거하여 그러한 간행물보다 날짜가 앞설 권리가 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 나아가, 제공된 간행물 날짜는 실제 간행일과 다를 수 있으며, 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
본 발명의 다수의 실시형태가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 실험 섹션의 기재는 예시를 위한 것이며 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시형태
분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제로서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 CD3ε에의 결합에 특이적인 가변 중쇄 서열(VH) 및 가변 경쇄 서열(VL), 및 VH와 VL 사이의 링커 서열을 포함하는 스테이플링된 scFv(spFv)를 포함하고, 링커는 앵커 포인트로서 역할을 하는 적어도 하나의 시스테인 잔기(Cys)를 포함하는, 결합제.
실시형태 1에 있어서, spFv는 VH 및 VL 중 적어도 하나 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 앵커 포인트 사이에 이황화 결합을 포함하는, 결합제.
실시형태 1에 있어서, spFv는 2개의 이황화 결합을 포함하며, 여기서 제1 이황화 결합은 VH 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 제1 앵커 포인트 사이에 형성되고, 제2 이황화 결합은 VL 상의 표면 노출된 시스테인 잔기와 링커의 제2 앵커 포인트 사이에 형성되는, 결합제.
실시형태 1에 있어서, spFv는 VH-링커-VL의 배향인, 결합제.
실시형태 1에 있어서, spFv는 VL-링커-VH의 배향인, 결합제.
실시형태 1 내지 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, 링커는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합제.
실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 포함하는, 결합제:
a) HCDR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
b) HCDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
c) HCDR1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
d) HCDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함함;
e) HCDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 DSS의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함.
실시형태 7에 있어서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 28에 기재된 바와 같은 VH 도메인 및 서열번호 29에 기재된 바와 같은 VL 도메인을 포함하는, 결합제.
실시형태 7에 있어서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 30에 기재된 바와 같은 spFv를 포함하는, 결합제.
실시형태 1 내지 실시형태 9 중 어느 하나에 있어서, 결합제는 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체인, 결합제.
실시형태 1 내지 실시형태 10 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편을 더 포함하며, 선택적으로 Ig 불변 영역의 단편은 Fc 영역 또는 CH3 도메인인, 결합제.
실시형태 11에 있어서, Ig 불변 영역, Ig 불변 영역의 단편, Fc 영역 또는 CH3 도메인은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 결합제.
실시형태 12에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 L234A/L235A/D265S, F234A/L235A, L234A/L235A, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/ L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 결합제.
실시형태 12에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V, T366W, T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366L, F405W, T394W, K392L, T394S, Y407T, Y407A, L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, T366L/K392L/T394W, L351Y/Y407A, L351Y/Y407V, T366A/K409F, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V 및 T350V/T366L/K392L/T394W로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 결합제.
실시형태 12에 있어서, 결합제는 노브-인-홀 돌연변이를 포함하며, 노브 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V를 포함하고, 홀 돌연변이는 T366W를 포함하는, 결합제.
실시형태 10 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 결합제는 CD3ε 이외의 제2 항원과 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 단백질을 포함하는, 결합제.
실시형태 16에 있어서, 제2 항원은 종양 항원인, 결합제.
실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 결합제의 VH, VL, 또는 VH와 VL 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시형태 19의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시형태 19의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 결합제를 포함하는 키트.
대상체에서 질환 또는 장애의 진행을 치료하거나 늦추는 방법으로서, 실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나의 적어도 하나의 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
T 세포를, 표적 항원을 발현하는 표적 세포로 유도하는 방법으로서, T 세포를 실시형태 16 또는 실시형태 17의 결합제, 또는 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하며, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 T 세포에 결합하고, CD3ε 이외의 제2 항원에 결합하는 항원 결합 영역은 표적 세포에 결합하는, 방법.
실시예
실시예 1: 안정화된 scFv의 설계
단일클론 항체(mAb)는 2개의 가변 도메인 VL 및 VH를 통해 그의 표적 항원을 인식한다. 단일쇄 Fv(scFv)는 먼저 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426 (1988)]에 의해 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL 배향으로 유연한 링커와 VL 및 VH의 유전적 융합으로 설계되었다. 유연한 링커는 전형적으로 글리신-세린 링커의 3회 또는 4회 반복이다. scFv는 그의 모 mAb의 항원 결합 특이성 및 대체로 친화성을 재현한다. 이러한 scFv 분자는 검출/진단 시약으로서 또는 이중특이성, 다중특이성 치료제(문헌[Brinkmann and Kontermann (2017) MAbs 9: 182-212]) 또는 CAR-T 치료제(문헌[Gross et al., (1989), Transplant Proc 21(1 Pt 1): 127-130]; 문헌[Porter et al., (2011) J Cancer 2: 331-332]; 문헌[Porter et al., (2011) N Engl J Med 365: 725-733])와 같은 더 정교한 분자를 제조하기 위한 빌딩 블록(building block)으로서의 광범위한 응용이 밝혀졌다.
scFv 분자의 과제 중 하나는 낮은 안정성과 응집 경향이다(문헌[Worn and Pluckthun (2001) J Mol Biol 305: 989-1010]; 문헌[Rothlisberger et al., (2005) J Mol Biol 347: 773-789]에서 검토됨). 그 특성을 개선하기 위해 다수의 전략이 시도되어 왔다(문헌[Arnd et al., (2001) J Mol Biol 312: 221-228]; 문헌[Monsellier et al., (2006) J Mol Biol 362: 580-593]; 문헌[Zhao et al., (2010) Int J Mol Sci 12: 1-11]; 문헌[Perchiacca and Tessier (2012) Annu Rev Chem Biomol Eng 3: 263-286]; 문헌[Asial et al., (2013) Nat Commmun 4: 2901]; 문헌[Gil and Schrum (2013) Adv Biosci Biteccchnol 4: 73-84]; 문헌[Tiller and Tessier (2015) Annu rev Biomed Eng 17: 191-216]). 이들 전략은 VL/VH 도메인 사이에 이황화 결합을 도입하는 것, 상이한 실험 방법을 사용하여 VL/VH 도메인 안정성 및/또는 계면 상호작용을 개선하는 것, 추가의 이량체화 모티프를 사용하는 것 등을 포함한다. 주요 어려움은 이들 전략의 대부분이 종종 VH/VL 쌍에 특이적이며 다른 VH/VL 쌍으로 쉽게 전달될 수 없다는 것이다. 때때로, 조작은 VL/VH 구조 및 scFv 특성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 최근, Zhang 등은 항-아플라톡신 B1 scFv(H4)의 VH의 위치 44와 VL의 위치 100 사이에 이황화물을 도입하였고 scFv의 결합 친화성을 보존하면서 scFv의 상당한 안정화를 성공적으로 달성하였다(문헌[Zhao et al., (2010) Int J Mol Sci 12: 1-11]). 그러나, 선택된 두 위치 사이의 거리 및 각도 제한 때문에, VL과 VH 간 이황화결합이 다른 VL/VH 쌍에 적용되는 경우, 결합에 종종 필요한 두 도메인 사이의 상대적 배향이 제한/왜곡될 수 있다.
Fab 단편의 중쇄와 경쇄 사이의 계면은 VH/VL 및 CH1/CL 상호작용을 포함한다. 두 가지 독립적인 상호작용 세트는 상승적인 안정화 효과를 제공한다. 또한, V/C 접합이 또한 약간의 안정화 효과에 기여한다. 이에 비해, scFv에서는 VH/VL 계면이 VH/VL 상호작용에 의해서만 유지된다. 이량체 및 올리고머 형성을 위한 scFv 간 상호작용을 촉진하기 위해 길이가 너무 짧게 설계된 경우를 제외하고는, 유연하고 비제한적이도록 설계되는 링커는 둘을 함께 느슨하게 커플링하기만 한다. 충분히 긴 경우, 링커의 길이 및 특성은 scFv의 안정성에 거의 기여하지 않는 것으로 알려져 있다.
1.1 "스테이플링" 설계
연구의 목적은 scFv를 형성하는 VH와 VL 사이의 상대적 이동을 억제하지만 이에 부정적인 영향을 미치지 않음으로써 안정화된 scFv를 설계하고 생성하는 것이었다. 이는 VH와 링커 사이에 그리고 VL과 링커 사이에 이황화 결합을 조작하여 scFv를 안정화시킴으로써 달성되었다. 억제자(restraint)(즉, 이황화 결합)는, 적절히 위치되는 경우, 위에 논의된 CH1/CL 및 V/C 상호작용에 의해 제공되는 상승 효과의 역할을 할 것이다. 이를 위해, VH 및 VL 상에 각각 하나씩 2개의 구조적으로 보존된 표면 노출된 프레임워크 위치(앵커 포인트)가 확인되었으며, 이는 전형적인 예측된 항원 결합 부위와 중첩되지 않고, 시스테인(Cys) 잔기로 돌연변이되었다. Cys 위치에 대한 유연한 링커에서 2개의 위치가 후속하여 선택되었다. 링커 Cys 잔기들 사이의 거리 및 위치가 링커 Cys와 각각의 앵커 포인트 사이의 이황화 결합의 형성을 촉진하는 방식으로 설계된 경우, VH 및 VL은 이황화 결합의 부재 하에서의 테더링(tethering)과 비교할 때 더 단단히 테더링될 것이다. 이 방식은 CPPC 서열(서열번호 31)을 함유하는 예시적인 링커와 함께 도 1에 도시되어 있다. 유연한 링커와 앵커 포인트 사이에 이황화 결합을 형성하는 개념은 본원에서 "스테이플링"으로 지칭된다. 생성된 "스테이플링된" scFv 분자는 본원에서 spFv("스테이플링된 Fv")로 지칭된다.
1.2 앵커 포인트의 선택, 스테이플 서열 및 링커의 설계
스테이플링 방식이 광범위하게 적용가능하기 위해서는, 앵커 포인트가 구조적으로 보존되고, VL 및 VH 둘 모두의 표면 상에 노출되고, Cys 잔기로의 그의 돌연변이가 VL 및 VH의 접힘 또는 항원에 대한 결합에 영향을 미치지 않는 것이 중요하다. 앵커 포인트 및 VL 및 VH 도메인의 N 말단 및 C 말단의 거리 및 기하학적 구조가 또한 적절한 이황화물 형성을 위한 중요한 고려사항이다.
앵커 포인트는 VL-링커-VH 및 VH-링커-VL 배향에서 spFv에 대해 별도로 선택되었다. VL-링커-VH 배향의 경우, VL에서 초티아 위치 42 및 VH에서 초티아 위치 105가 앵커 포인트로서 선택되었다. 인간 생식세포계열 항체(이하 pdb ID 5I19, GLk1)의 Fv 내에서, VL-링커-VH 배향에서 spFv에 대해 선택된 앵커 포인트의 그래픽 예시가 도 2에 나타나 있다. GLk1에서, VL 초티아 위치 42는 라이신(K)이고 VH 초티아 위치 105는 글루타민(Q)이다. VH-링커-VL 배향의 경우, VL에서 초티아 위치 100 및 VH에서 초티아 위치 43이 앵커 포인트로서 선택되었다. 도 3은 인간 생식세포계열 항체(pdb ID 5I19, GLk1)의 Fv 내에서, VH-링커-VL 배향에서 spFv에 대해 선택된 앵커 포인트의 그래픽 예시를 나타낸다. GLk1에서, VL 초티아 위치 100은 글루타민(Q)이고 VH 초티아 위치 43은 라이신(K)이다. 선택된 앵커 포인트는 구조적으로 보존되었고, 기하학은 카파 또는 람다 경쇄를 함유하는 항체에서 매우 유사하였다. 앵커 포인트 쌍들 사이의 거리는 대략 7 Å(VL-링커-VH 배향의 경우) 내지 대략 9 Å(VH-링커-VL 배향의 경우)의 범위였다.
VH와 VL을 연결하는 링커 내에 매립된(embedded) 스테이플 서열은 spFv 내의 앵커 포인트들 사이의 거리와 유사한 길이가 되도록 설계되었다. 스테이플 서열의 초기 예로서, CPPC(서열번호 31)가 가능한 스테이플 서열로서 선택되었는데, 그 이유는 부분적으로 이러한 서열이 인간 IgG1 힌지에서뿐만 아니라 일부 설치류 IgG에서 자연적으로 발생하기 때문이다. 인간 및 마우스 IgG 분자의 힌지의 구조는 마우스 IgG 힌지(도 4) 및 인간 IgG(도 5)에서 Cβ(cys1)-Cβ(cys2) 거리가 약 7 Å 내지 9 Å의 범위임을 입증하였다. 이 범위는 VL-링커-VH 및 VH-링커-VL 배향 둘 모두에서 2개의 앵커 포인트 사이의 거리와 매우 유사하였기 때문에, CPPC(서열번호 31) 스테이플 서열은 스테이플링, 즉, 앵커 포인트에 대해 효율적으로 그리고 정확하게 적절한 이황화 결합 형성을 위한 정확한 기하학적 구조를 제공할 가능성이 있었다. 일반적으로, 스테이플 서열은 2개의 Cys 잔기를 갖도록 설계되었다. 적절한 스테이플링을 위해, 스테이플 서열의 N-말단 Cys는 spFv N-말단 도메인 앵커 포인트와 이황화 결합을 형성하였고 스테이플 서열의 C-말단 Cys는 spFv C-말단 도메인 앵커 포인트와 이황화 결합을 형성하였다.
따라서, VH와 VL을 연결하는 링커는, VH 및 VL의 사슬내 접힘을 허용하고 스테이플 서열의 적절한 위치결정을 용이하게 하기에 충분한 링커 길이를 제공하도록 링커를 연장시키기 위해, 스테이플 서열 및 N-말단 및 C-말단 둘 모두를 스테이플 서열에 연결하는 서열을 포함하도록 설계되었다.
VL-링커-VH 설계에서, VL 앵커 포인트(K42), VH 앵커 포인트(Q105), VL의 C-말단(K107) 및 VH의 N-말단(Q1) 사이의 거리가 도 2에 나타나 있다. VH-링커-VL 설계에서, VL 앵커 포인트(Q100), VH 앵커 포인트(K43), VH의 C-말단(S114) 및 VL의 N-말단(D1) 사이의 거리가 도 3에 나타나 있다. 모델링은, 이러한 거리가 약 14 내지 19개의 잔기의 링커 길이에 걸쳐 있을 수 있으며, 여기서 4개의 잔기의 스테이플 서열은 약 6 내지 9개의 잔기의 N-말단 링커 연장 및 약 4 내지 6개의 잔기의 C-말단 링커 연장에 의해 플랭킹됨을 시사한다. 따라서, 설계된 링커 길이는 n+4+m으로 표현될 수 있으며, 여기서 n은 6 내지 9개의 잔기이고 m은 4 내지 6개의 잔기이고, 4는 CPPC(서열번호 31) 스테이플 서열의 길이를 나타낸다. n 및 m개의 잔기는 글리신 또는 세린, 또는 다른 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 링커 길이는 스테이플링을 허용하기에 충분히 길고 유연할 것이지만 스크램블링(scrambling)을 허용하기에는 너무 짧을 것으로 예상된다.
실시예 2: spFv의 생성 및 특성분석
스테이플링 설계를 평가하기 위해, scFv 및 상응하는 spFv를 생성하기 위해 3개의 인간 항체를 선택하였다: 합성 파지 항체 라이브러리(문헌[Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-396])로부터의 카파 경쇄를 갖는 2개의 항체(GLk1 및 GLk2) 및 간행물(문헌[Gerhardt et al. (2009) J Mol Biol 394:905-921])로부터 얻은 람다-함유 항체(CAT2200). CAT2200의 경우, T28G 돌연변이를 모 VH에 도입하여 그의 표적, IL-17과의 상호작용의 일부를 감소시키기 위한 변이체(CAT2200a)를 생성하였다. 또한, S42Q 돌연변이(초티아)를 모 CAT2200 VL 내로 조작하고 T28G VH와 쌍을 이루어 CAT2200b를 생성하였다. GLk1, GLk2, CAT2200a 및 CAT2200b의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열이 각각 도 6 및 도 7에 나타나 있다. VH 도메인 아미노산 서열은 BAT2200a와 CAT2200b 사이에서 동일하다. GLk1VH는 인간 IGHV2-23*01에 가장 가깝고, GLk2VH는 인간 IGHV5-51에 가장 가깝고, CAT2200VH는 인간 IGHV2-23*01에 가장 가깝다. GLk1VL은 인간 IGKV1-39*01에 가장 가깝고, GLk2VL은 인간 IGKV3-20*01에 가장 가깝고, CAT2200VL은 인간 IGLV6-57*01에 가장 가깝다.
모든 scFv 및 spFv 분자는 VL-링커-VH 및 VH-링커-VL 배향 둘 모두로 생성 및 발현되었다. scFv 작제물의 경우, 표준 링커(서열번호 39)가 사용되었다. spFv의 경우, n 및 m 범위 내의 상이한 링커 길이가 사용되었다. GLk1 spFv의 경우, 9-4-5 링커가 둘 모두의 배향에 사용되었다. GLk2 spFv의 경우, 9-4-5 및 6-4-6 링커 길이가 각각 VL-VH 및 VH-VL 배향에 사용되었다. CAT2200a spFv의 경우, VL-VH 분자는 각각 8-4-4 및 9-4-4 링커로 제조되었고, CAT2200b spFv VH-VL은 9-4-4 링커로 제조되었다. 표 4는 생성된 분자 및 그의 링커 서열을 나타낸다. 표 5는 아미노산 서열 또는 생성된 분자를 나타낸다.
[표 4]
[표 5]
CAT2200a scFv VL-VH를 제외한 모든 scFv 및 spFv 분자를 CMV 프로모터 구동된 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 작제물을, 제조사 프로토콜을 사용하여 Expi293 세포에 형질감염시키고 세포를 5일 동안 배양하였다. AKTAXPRESS 시스템(GE Healthcare)을 통해 1 ml His-TRAP HP 컬럼(GE Healthcare) 상에서 정화된 상청액으로부터 각각의 단백질을 정제하였다. 컬럼을 0 내지 100% 용출 완충액(세척 완충액: 50 mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸; 용출 완충액: 50 mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸)의 구배를 사용하여 준비하여, 느슨하게 결합된 니켈을 제거한 다음에, DPBS에서 다시 평형을 이루었다. 제거된 상청액을 먼저 50 mM Tris, pH 7.5 및 20 mM 이미다졸로 조정한 다음, 4℃에서 0.8 mL/min으로 1 mL HisTRAP HP 컬럼에 로딩하였다. 이어서, 안정적인 베이스라인이 얻어질 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 이어서, 컬럼을 20 CV의 세척 완충액으로 추가로 세척하고, 용출 완충액으로 단일 주입 루프로 용출하고, 26/10 HiPrep 탈염 컬럼을 통해 1X DPBS에서 탈염하고 분획을 수집하였다. 이어서, 정제된 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 농축하였다. Glk2 scFv 및 spFv 단백질을 열 안정성 측정(DSC 및 NanoDSF)을 위해 DPBS로 투석하고 다른 연구를 위해 25 mM Tris, pH 7.5 및 100 mM NaCl로 투석하였다. 다른 scFv 및 spFv 단백질을 25 mM MES, pH 6.0 및 100 mM NaCl로 투석하였다.
CAT2200a scFv VL-VH는 공급업체로부터 구입하였다. 농도는 DPBS(pH 7.2) 중에서 0.77 mg/mL이었다. IL-17의 돌연변이체(K70Q A132Q C106S 돌연변이를 갖는 12-132, 이하 약칭 IL-17(서열번호 22))는 Accelagen(미국 캘리포니아 소재)으로부터 구입하였다. 단백질은 그의 고유한 재접힘 프로토콜에 따라 대장균 봉입체로부터 재접힘되었고, 20 mM NaCl, 20 mM MES, pH 6.0 중에서 1.50 mg/mL로 제공되었다.
2.
2.1 생성된 scFv 및 spFv 분자의 열 안정성
scFv 및 spFv 분자의 열 안정성은 시차 열량계(DSC)에 의해 조사되었다. scFv 및 spFv 단백질은 GLk1 및 CAT2200a/CAT2200b의 경우 1x DPBS(Gibco) 또는 GLk2의 경우 MES(25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl)에 대해 하룻밤 투석되었다. 이어서, 투석 완충액을 0.22 미크론으로 여과하고 DSC 실험에서 기준 용액으로서 그리고 완충액-완충액 블랭크용으로 사용하였다. 단백질을 여과된 완충액 중 약 0.5 mg/mL로 희석하고 각각의 단백질 또는 완충액 샘플 400 μL을 96-딥웰(deepwell) 플레이트(MicroLiter Analytical Supplies, 07-2100)에 로딩하고 실험 과정에 걸쳐 오토샘플러 서랍 내에 4℃에서 유지하였다. 오토샘플러를 갖는 MicroCal Capillary DSC(Malvern)를 사용하여 DSC 실험을 수행하였다. 샘플 재스캔 없이 60℃/h 스캔 속도로 25℃부터 95℃까지 DSC 스캔을 수행하였다. 피드백은 선택되지 않았고, 여과 기간은 15초로 설정되었다. 각 시료 후, 세포를 10% Contrad-70 용액으로 세정하고 완충액-완충액 블랭크(blank)를 실행하였다. MicroCal VP-Capillary DSC 자동 분석 애드온(Malvern)을 갖는 Origin 7.0을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 베이스라인 범위 및 유형을 수동으로 선택한 다음 차감하였다. 샘플 곡선에서 이전의 완충액 블랭크를 차감한 후에 농도 의존성 정규화를 수행하였다. 2-상태 및 비-2-상태 전이 둘 모두를 사용하여 열 용융 프로파일을 분석하였다. 2-상태 피팅(fit)(하나의 전이)는 실험 곡선과 잘 일치하지 않았다. 따라서, 비-2-상태 피팅을 수동으로 수행함으로써 2개의 전이(Tm1 및 Tm2)를 계산하였다. Tm 데이터가 표 6에 기록되어 있다. 모든 scFv 및 spFv 단백질의 DSC 프로파일은 비-2-상태 전이로만 피팅될 수 있는 왜도(skewness)를 나타내었다. 따라서, 각각의 scFv 또는 spFv에 대해, 2개의 전이(Tm1 및 Tm2)가 기록되었다(표 6). 아마도, 이 두 가지 전이는 각각 VL 및 VH 도메인의 용융 Tm에 대응한다. 일반적으로, Tm1 또는 Tm2에 대한 scFv 및 spFv 사이의 차이 비교 시, 출발 scFv의 Tm에 관계없이, 스테이플링에 의한 대략 10℃ 증가가 존재한다. 약 7℃에서, 단 하나의 예외, 즉, GLk2 scFv 및 spFv(VH-VL 배향) 차이의 경우가 있다. 이는 스테이플링 기하학적 구조에 약간의 변형을 야기할 수 있는 더 짧은 6+4+6 링커로 인한 것일 수 있다. ΔTm1(VL)과 ΔTm2(VH)가 거의 동일하다는 사실은, 스테이플링이 VL/VH 상호작용을 강화하는 것 외에도 도메인 자체의 안정화를 야기한다는 것을 시사한다. 대안적으로, 더 강한 VH/VL 상호작용은 안정화 효과를 VL/VH 도메인의 안정화로 전달한다. 요약하면, 이 연구에 기재된 바와 같은 스테이플링은 scFv의 안정성을 유의미하게 증가시킨다.
[표 6]
실시예 3: 생성된 scFv 및 spFv 분자의 결정화에 의한 정확한 스테이플링의 검증
단백질을 각각의 완충액 중에서 다음과 같이 농축시켰다: GLk1 spFv VL-VH를 25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl 중에 8.67 mg/ml로; GLk1 spFv VH-VL을 25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl 중에 5 mg/ml로; GLk2 spFv VH-VL을 25 mM Tris, pH7.5, 100 mM NaCl 중에 8.66 mg/ml로; cat2200b spFv VH-VL을 25 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl로. Mosquito 로봇을 사용하여 Corning 3550 결정 트레이에서 시팅 드롭 포맷(sitting drop format)으로 각각의 단백질에 대한 결정화를 설정하였다. 각각의 웰은 100 nl의 단백질 및 100 nl의 저장 용액을 함유하고, 20℃에서 70 μl의 저장 용액에 대해 인큐베이션되었다. 저장 용액은 IH1 및 IH2 맞춤 조건뿐만 아니라 PEG 이온 스크린 HT(Hampton Research)이다. 최적화 시도에서 저장 용액 성분을 변화시킴으로써 일부 초기 조건을 개량(refine)하였다. scFv 및 spFv 단백질 중 일부에 대해 회절 품질 결정을 얻었다. 표 7은 사용된 조건의 요약을 나타낸다. 결정을 20% 글리세롤이 보충된 모액 중에 몇 초 동안 담그고 액체 N2 중에서 급속 동결시켰다. Argonne National Lab에서 IMCA-CAT Beamline 17ID에서 X선 데이터를 수집하였다.
[표 7]
3.1 IL-17과 복합체를 형성하는 CAT2200a scFv VL-VH 및 CAT2200a spFv VL-VH의 결정화
333 μL의 IL17(1.5 mg/ml)을 1.74 ml의 Cat2200a scFv(0.69 mg/mL)와 혼합하고 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여, IL-17/ CAT2200a scFv VL-VH 복합체를 생성하였다. 혼합물을 10 kDa 컷오프 Amicon Ultra 농축기로 약 400 μL로 농축하고 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5 중에서 평형화된 Superdex75 컬럼 상에 로딩하였다. 복합체에 대응하는 분획들을 풀링하고 150 μL의 부피로 농축하였다. 샘플을 4회 희석 및 농축하였다: 350 μL의 50 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5를 첨가하고 150 μL 직전까지 농축하였다. 부피를 약 105 μL가 되게 하였으며, 농도는 2.69 mg/mL로 결정되었다. 결정화는 80 μL 저장 용액에 대한 Corning3550 플레이트에서 150 nL 단백질 + 150 nL 저장 용액을 사용하는, 사내에서 미리 배합된 완충액 및 침전제 조건의 세트인, Mosquito 결정화 로봇을 사용하여 시팅 드롭 포맷으로 설정되었다. 플레이트를 20℃에서 인큐베이션하였다. 조건들 중 하나(Na 아세테이트, pH 4.5, 25% PEG 3K, 0.2 M Am 아세테이트)가 매우 작은 결정을 생성하였다. 이들을 수확하고, Hampton Seed Bead 튜브에서 100 μL 27% PEG 3350, 200 mM 암모늄 아세테이트, 100 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5 중의 Hampton Seed Bead를 사용하여 결정화 시드로 변화시켰다.
위의 시드의 첨가를 제외하고는 동일한 절차에 의해 회절 품질 결정을 얻었다: 150 nL 단백질 + 100 nL 저장 용액 + 50 μL 시드. 결정은 0.1 M Tris 8.5, 18% PEG3K, 0.2 M LiSO4로부터 성장하였고, 합성 모액(0.1 M Tris, pH 8.5, 10% PEG 3350, 0.2 M LiSO4 및 20% 글리세롤)으로 옮겨지고 액체 질소 중에서 급속 동결되었다. Argonne National Laboratory에서 IMCA-CAT ID17에서 X선 회절 데이터를 수집하였다.
167 μl의 IL-17(250 μg)을 154 μl의 MSCW274(250 mM NaCl, 20 mM MES, pH 6.5 중 467 μg)와 혼합하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 IL-17/ CAT2200a spFv VL-VH 복합체를 생성하였다. 혼합물을 10kDa MWCO Amicon Ultra 0.5 mL 농축기에서 약 100 μL로 농축한 다음, 희석 및 농축을 5회 반복하였다: 약 150 μL로 농축하고 350 μL 50 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5를 첨가함. 최종 부피는 100 μL이었고 복합체의 농도는 6.0 mg/ml인 것으로 결정되었다. 결정화는 Mosquito 로봇을 사용하여 시팅 드롭에서 scFv/IL-17 복합체에 대해서와 유사하게 설정되었다. 시팅 드롭은 150 nL 단백질 + 120 nL 저장 용액 + 30 nL 시드(위의 scFv/IL-17)로 구성된다. 저장 용액은 PEG 3350 농도 및 염을 변화시키는 조건들의 세트였다. 결정화 플레이트를 20℃에서 인큐베이션하였다. 15.5% PEG 3350, 0.4 M NaH2PO4로부터 작은 결정을 얻었다. 결정을 16% PEG 3350, 0.2 M NaH2PO4, 20% 글리세롤로 옮기고, LN2에서 급속 동결시켰다. Argonne National Laboratory에서 IMCA-CAT ID17에서 X선 회절 데이터를 수집하였다.
모든 X-선 회절 데이터는 XDS(문헌[Kabsch et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt. 2):125-132]; 문헌[Monsellier and Bedouelle (2006) J Mol Biol 362:580-593]) 및 CCP4(문헌[Collaborative Computational Project, N. (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255])를 사용하여 처리되었다. 모든 결정 구조는, pdb id 2vxs(문헌[Gerhardt et al. (2009) J Mol Biol 394:905-921]) 구조가 검색 모델로서 사용된 scFv CAT2200a scFv VL-VH/IL-17 복합체를 제외하고는, MOE(캐나다 몬트리올)에서 생성된 상동성 모델로 Phaser(문헌[Read (2001) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57(Pt 10):1373-1382])를 사용하여 분자 대체(MR)에 의해 해결되었다. 구조 모델들은 PHENIX(문헌[Adams et al. (2004) J Synchrotron Radiat 11(Pt 1):53-55])에서 개량되었으며 Coot(문헌[Emsley et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 4):486-501])에서 수동으로 조정되었다. 분자 그래픽 도면을 PyMol(www_schrodinger_com)에서 생성하였다.
3.1.1 구조
결합되지 않은 scFv 및 spFv 분자의 구조는 도 8, 도 9, 도 10 및 도 11에 도시되어 있다. 도 8은 GLk1 spFv VL-VH의 구조를 나타낸다. 도 9는 GLk1 spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. 도 10은 GLk2 spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. 도 11은 CAT2200b spFv VH-VL의 구조를 나타낸다. 구조는 VL 도메인 및 VH 도메인 둘 모두가 서로 패킹된 전형적인 Fv 구조와 일치하였다. 일반적으로, 대부분의 링커 잔기는 전자 밀도 맵에서 정렬 및 분해되었다. 스테이플과 앵커 포인트 사이의 이황화 결합은 일반적으로 VL-VH 배향 모두에서 잘 정렬되었다. 결합되지 않은 scFv 및 spFv 구조에 더하여, 본 발명자들은 또한 항원 결합에 대한 임의의 구조적 영향을 밝혀내고자 시도하였다. CAT2200 scFv 및 spFv 변이체 분자는 그의 동종 표적인 IL-17과의 복합체로 결정화되었다. 결정화된 CAT2200 변이체의 scFv 및 spFv의 경우, 구조는 결합된 표적을 갖는 것과 갖지 않는 것이 거의 동일하였다(도 12, 도 13, 도 14). 도 12는 IL-17에 결합된 CAT2200a scFv VL-VH와 비교하는 결합되지 않은 CAT2200b spFv VH-VL의 비교를 나타낸다. 도 13은 IL-17에 결합된 CAT2200a spFv VL-VH와 비교하는 결합되지 않은 CAT2200b spFv VH-VL의 구조의 정면도의 비교를 나타낸다. 도 14는 IL-17에 결합된 CAT2200a spFv VL-VH와 비교하는 결합되지 않은 CAT2200b spFv VH-VL의 구조의 배면도의 비교를 나타낸다. 구조는 또한 스테이플의 배향 또는 존재 또는 부재에 관계없이 동일하였다. 구조 쌍들 사이의 모든 매칭 Cα 원자에 대한 rmsd는 매우 작았다: 결합되지 않은 spFv-VH-VL과 항원-결합된 scFv-VL-VH 사이에서 0.41 Å(도 12), 결합되지 않은 spFv-VH-VL과 spFv-VL-VH 사이에서 0.46 Å(각각 도 13 및 도 14), 및 결합된 scFv와 결합된 spFv 사이에서 0.37 Å. 구조적 증거는 스테이플링이 설계된 대로 작동함을 보여준다. 또한, 스테이플링은 VL 및 VH의 도메인 구조 또는 상대적 VL/VH 패킹에 영향을 미치지 않는다.
실시예 4: 추가 앵커 포인트의 설계
실시예 1에 기술된 접근법을 사용하여 스테이플링을 위한 임의의 추가적인 앵커 포인트를 확인하였다. 다음의 앵커 포인트가 확인되었다:
VL-링커-VH 배향의 경우: VL 초티아 위치 42, 45 및 39와 VH 초티아 위치 105, 5 및 3. 도 6에서, GLk1VL 상의 VL 잔기는 K42, K45, K39이고 GLk1 상의 VH 잔기는 Q105, L5 및 Q3이다. 표시된 임의의 위치들 사이에 스테이플이 형성된다.
VH-링커-VL 배향의 경우: VH 초티아 위치 43, 40 및 46, VL 초티아 위치 102, 5 및 3, 임의의 위치들 사이에 스테이플이 형성된다.
실시예 5: 스테이플링된 PSMA×CD3 항체(PS3B2040)의 생성
PS3B1396은 CD3 및 PSMA 수용체에 대해 지향된 완전 인간 IgG1 항체이다. PS3B1396의 생성은 2021년 1월 28일에 출원된 미국 출원 제63/142,921호 및 2021년 3월 24일에 출원된 미국 출원 제63/165,448호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다. PS3B1396은 CD3B2030 N106A LH scFv의 CD3 결합 아암 및 PSMB896-G100A-Fab의 PSMA 결합 아암을 포함한다.
PS3B1396의 기능적 활성을 평가하기 위한 검정 및 예컨대 아미노산 서열과 같은 구조적 특성은 또한 2021년 1월 28일에 출원된 미국 출원 제63/142,921호 및 2021년 3월 24일에 출원된 미국 출원 제63/165,448호에 상세히 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다.
PS3B1396의 CD3 결합 아암의 scFv는 VH와 VL 사이의 상대적 이동에 부정적인 영향을 주지 않으면서 scFv 구조를 억제함으로써, 본원에서 spFv(또는 "스테이플링된 scFv")로 지칭되는 안정화된 scFv로 조작되었다. 안정화된 scFv는 VH와 링커 사이, 그리고 VL과 링커 사이에 이황화 결합을 조작함으로써 생성되었다. 항원 결합에 관여하지 않는, 구조적으로 보존되고 표면 노출된 2개의 프레임워크 위치(앵커 포인트), 즉 위치 H105의 VH에 하나, 그리고 위치 L42의 VL에 하나가 식별되고, 시스테인(Cys) 잔기로 돌연변이되어 서열번호 28의 VH 및 서열번호 29의 VL을 생성하였다. 2개의 Cys 잔기를 포함하는 서열 GGGSGGSGGCPPCGGSGG(서열번호 2)의 유연한 링커를 사용하여 VL-링커-VH(LH) 포맷으로 VL과 VH를 접합하였다. 링커의 Cys 잔기와 VH 및 VL의 Cys 잔기의 거리 및 위치는 링커의 Cys 잔기와 VH 및 VL의 각 앵커 포인트 사이의 이황화 결합 형성에 결정적이다.
이어서 VL-링커-VH 포맷의 항-CD3 스테이플링된 scFv(항-CD3 spFv)는 노브-인-홀 Fc 동종이량체화를 사용하여 항-PSMA Fab(PSMB896-G100A-Fab)와 쌍을 이루게 함으로써, 스테이플링된 PSMAxCD3 이중특이체(PS3B2040)를 생성하였다. PSMB896-G100A-Fab의 생성 및 특성분석은 2021년 1월 28일에 출원된 미국 출원 제63/142,921호 및 2021년 3월 24일에 출원된 미국 출원 제63/165,448호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용되어 포함된다. PS3B2040의 PSMA 및 CD3 결합 도메인의 서열은 아래에 기술되어 있다.
PS3B2040의 PSMA 결합 도메인은 카바트 도식을 사용하는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 54)의 HCDR1, 아미노산 서열 AISGGIGSTYYADSVKG(서열번호 55)의 HCDR2, 아미노산 서열 DAVGATPYYFDY(서열번호 56)의 HCDR3, 및 아미노산 서열 SGSSSNIGINYVS(서열번호 57)의 LCDR1, 아미노산 서열 DNNKRPS(서열번호 58)의 LCDR2, 및 아미노산 서열 GTWDSSLSAVV(서열번호 59)의 LCDR3을 포함한다.
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 VH, VL, HC, LC
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 VH 아미노산 서열; 서열번호 60
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGIGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLWLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAVGATPYYFDYWGQGTL VTVSS
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 VL 아미노산 서열; 서열번호 61 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGINYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPD RFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVL
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 HC1 아미노산 서열; 서열번호 62 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGGIGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLWLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAVGATPYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 LC1 아미노산 서열; 서열번호 63 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGINYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 HC1 핵산 서열; 서열번호 64 GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGATTGGTTCAGCCTGGCGGTTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCTATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGCTATCTCTGGCGGCATCGGCTCTACCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTGGCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAGGATGCCGTGGGCGCTACCCCTTACTACTTCGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGGTTCACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
PS3B2040 PSMA 결합 도메인의 LC1 핵산 서열; 서열번호 65 CAGTCTGTGCTGACCCAGCCTCCTTCTGTGTCTGCTGCTCCTGGCCAGAAAGTGACCATCTCCTGCTCCGGCTCCTCCTCCAACATCGGCATCAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACAGCTCCCAAACTGCTGATCTACGACAACAACAAGCGGCCCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGATCTAAGTCCGGCACCTCTGCTACCCTGGGCATCACAGGATTGCAGACAGGCGACGAGGCCGACTACTATTGCGGCACCTGGGACTCTTCTCTGTCCGCCGTTGTTTTTGGCGGTGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCCGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTCGAAACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
PS3B2040 CD3 결합 도메인의 VH, VL, VL-링커-VH, HC
PS3B2040 CD3 결합 도메인의 VH 아미노산 서열. 서열번호 28 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRSTMHWVKQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPQVHYDYAGFPYWGCGTLVTVSS
CD3 결합 도메인의 VL 아미노산 서열. 서열번호 29 EIVLTQSPATLSASPGERVTLSCSASSSVSYMNWYQQKPGCAPRRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGRDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIK
PS3B2040 CD3 결합 도메인의 spFv(VL-링커-VH) 아미노산 서열; 서열번호 30 EIVLTQSPATLSASPGERVTLSCSASSSVSYMNWYQQKPGCAPRRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGRDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIKGGGSGGSGGCPPCGGSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRSTMHWVKQAPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPQVHYDYAGFPYWGCGTLVTVSS
PS3B2040 CD3 결합 도메인의 HC2 (spFv-Fc) 아미노산 서열; 서열번호 66EIVLTQSPATLSASPGERVTLSCSASSSVSYMNWYQQKPGCAPRRWIYDSSKLASGVPAR FSGSGSGRDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSRNPPTFGGGTKVEIKGGGSGGSGGCPPCG GSGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRSTMHWVKQAPGQGLEWIGYINPSSA YTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASPQVHYDYAGFPYWGCGTL VTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVSVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PS3B2040 CD3 결합 도메인의 HC2 (scFv-Fc) 핵산 서열; 서열번호 67GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGAGTGCTTCTCCAGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCTCCGCTTCCTCCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCTGCGCCCCTAGAAGATGGATCTACGACTCCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCTGCTAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCAGAGACTATACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCTAGGAACCCTCCTACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGGGCGGAGGTTCTGGTGGATCTGGCGGATGTCCTCCTTGTGGTGGAAGCGGCGGACAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCTCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTACCAGATCCACCATGCACTGGGTCAAGCAGGCCCCTGGACAAGGCTTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCTCCGCCTACACCAACTACAACCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCTCTCCTCAGGTTCACTACGACTACGCCGGCTTTCCTTATTGGGGCTGTGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCCGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAGCGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCTCTCTCCCTGTCTCCGGGAAAA
5.1 PS3B2040의 발현
PS3B2040은 제조사의 권장 사항에 따라 정제된 플라스미드 DNA를 사용하여 일시적 형질감염에 의해 ExpiCHO™ 세포에서 발현되었다. 간략하게는, ExpiCHO™ 세포는 37℃, 8% CO2 및 125 RPM으로 설정된 회전 진탕 인큐베이터(orbital shaking incubator) 내의 ExpiCHO™ 발현 배지(ThermoFisher Scientific, Cat # A29100)에서 현탁 상태로 유지되었다. 세포를 계대배양하고 형질감염 전에 ml당 6.0 x 106개의 세포로 희석하여, 세포 생존력을 99.0% 이상으로 유지하였다. ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트(예컨대 ThermoFisher Scientific, Cat# A29131)를 사용하여 일시적인 형질감염을 실행하였다. 형질감염될 희석된 세포의 각 ml에 대해, PSMA HC 및 LC를 각각 하나의 카피로 포함하는 플라스미드 0.25 마이크로그램, CD3 HC 및 PSMA LC를 각각 하나의 카피로 포함하는 플라스미드 0.25 마이크로그램, 및 pAdVAntage DNA(Promega, Cat# E1711) 0.5 마이크로그램을 사용하여 OptiPRO™ SFM 복합체형성(complexation) 배지에 희석하였다. 세포의 각각의 L에 대해, 2.56 mL의 ExpiFectamine™ CHO 시약을 8 mL의 OptiPRO™로 희석하였다. 희석된 DNA와 형질감염 시약을 1분 동안 배합하여, DNA/지질 복합체 형성을 가능하게 하고, 이어서 세포에 첨가하였다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 제조사의 표준 프로토콜에 따라 ExpiCHO™ 공급물 및 ExpiFectamine™ CHO 인핸서를 세포에 첨가하였다. 세포는 배양 브로쓰를 수확하기 전에 7일 동안 37℃에서 회전 진탕(125 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 일시적으로 형질감염된 ExpiCHO-S™ 세포로부터의 배양 상청액을 원심분리(30분, 3000 rcf)에 이어서 여과(0.2 μm PES 막, 미국 뉴욕주 코닝 소재의 Corning)에 의해 청징화하였다.
5.2 PS3B2040의 정제
AKTA Avant 150 크로마토그래피 시스템을 사용하여 예비-평형화(1xDPBS, pH 7.2) 커스텀 120 mL MabSelect SuRe 단백질 A 컬럼(GE Healthcare) 상에 여과된 세포 배양 상청액을 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 5 컬럼 부피(CV)의 1xDPBS, pH 7.2로 세척하였다. 단백질을 8 CV의 0.1 M 소듐(Na) 아세테이트(pH 3.5)로 용리하였다. 15%(V/v)의 최종 부피에 2.5 M Tris HCl, pH 7.2를 첨가하여 단백질 분획을 완전히 중화하고, 주사기로 여과(0.2 μm)하였다. 다음으로, 중화된 단백질 용액을 예비-평형화(20 mM MES, pH 6.5)된 커스텀 Capto S ImpAct(170 mL) 컬럼에 로딩하기 전, 20 mM MES(pH 5.5)에 대해 투석하였다. 20 mM MES(pH 6.5)를 사용하여 19 mL/min으로 1.5 CV 동안 컬럼을 세척하였다. 단백질 용리 구배는 15 mL/min으로 1 CV에 걸쳐 0-5%에서 시작되었다. 그 다음 구배를 15 CV에 걸쳐 30%까지 증가시켰다(완충액 A: 20 mM MES, pH 6.5; 완충액 B: 20 mM MES, 1 M NaCl, pH 6.5). 주요 피크 분획들을 풀링하고 1×DPBS(pH 7.2)로 투석하고 여과(0.2 μm)하였다.
5.3 유세포 분석법을 통한 표적 세포 상의 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040) 결합.
PS3B2040은 PSMA를 발현하는 상업적 전립선암 세포주에 대한 결합에 대해 평가되었다. LNCap 인간 전립선 종양 세포를 DPBS로 세척하고, 0.25% 트립신을 첨가하여 세포가 탈착되도록 하였다. 배지를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 세포를 DPBS가 담긴 15 mL 코니컬 튜브에 옮겼다. 세포를 5분 동안 1300 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포를 Vi-Cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수하고, 100 μL의 DPBS 중에 100K/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 3분 동안 1200 rpm으로 원심분리하고, DPBS로 2회 세척하였다. 세포를 Violet Live/Dead 염색제(Thermo-Fisher)로 염색하고 암실에서 실온으로 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고 FACS 염색 완충액(BD Pharmingen)으로 2회 세척하였다.
PS3B2040을 FACS 염색 완충액 중 100 nM의 최종 출발 농도로 희석시키고, 출발 농도로부터 총 10개의 희석점을 위해 3배 연속 희석액을 제조하였다. 연속 희석된 PS3B2040(100 μL/웰)을 세포에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 염색 완충액으로 2회 세척하고, AlexaFluor 647-접합된 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immunoresearch)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 염색 완충액으로 2회 세척하고, 200 μL의 FACS 완충액 중에 재현탁하였다. FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 BD CELESTA 상에서 세포를 이동시키고, FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 15는 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)가 11.62 nM의 EC50으로 용량 의존적인 PSMA 세포 결합을 나타냄을 보여준다.
5.4 유동(Flow)을 통한 PAN-T 세포 상의 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040) 결합.
인간 PAN-T 세포(미국 펜실베이니아주 콜마 소재의 Biological Specialty Corporation)를 해동시키고, DPBS가 담긴 15 mL 코니컬 튜브에 옮겼다. 세포를 5분 동안 1300 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포를 Vi-Cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수하고, 100 uL의 DPBS 중에 100K/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 3분 동안 1200 rpm으로 원심분리하고, DPBS로 2회 세척하였다. 세포를 Violet Live/Dead 염색제(Thermo-Fisher)로 염색하고 암실에서 실온으로 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고 FACS 염색 완충액(BD Pharmingen)으로 2회 세척하였다. PS3B2040을 FACS 염색 완충액 중 1 μM의 최종 출발 농도로 희석시키고, 출발 농도로부터 총 10개의 희석점을 위해 3배 연속 희석액을 제조하였다.
연속 희석된 PS3B2040(100 μL/웰)을 세포에 첨가하고 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
세포를 FACS 염색 완충액으로 2회 세척하고, AlexaFluor 647-접합된 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immunoresearch)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 염색 완충액으로 2회 세척하고, 200 μL의 FACS 완충액 중에 재현탁하였다. FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 BD Celesta 상에서 세포를 이동시키고, FLOWJO 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 16은 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)가 유세포 분석법에 의해 용량 의존적인 CD3 세포 결합을 나타냄을 보여준다.
5.5 Incucyte를 통한 인간 PBMC를 이용한 표적 세포 상의 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 세포독성
LNCaP 인간 전립선 종양 세포를 DPBS로 세척하고, 0.05% 트립신을 첨가하여 세포가 탈착되도록 하였다. 배지를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 세포를 DPBS가 담긴 15 mL 코니컬 튜브에 옮겼다. 세포를 3분 동안 1200 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포를 Vi-Cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수하고, 100 μL의 DPBS 중에 15K/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 인간 PBMC 세포(Discovery Life Services)를 해동하여 DPBS가 있는 15 mL 코니컬 튜브로 옮겼다. 세포를 3분 동안 1500 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포는 Vi-cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수되고, 50 μL의 RPMI-10/웰에 3:1(%CD3으로 정규화됨)의 E:T로 플레이팅되었다. PS3B2040은 30 nM의 출발 농도로 희석 블록에서 준비되고, 미치료 대조군을 포함하여 총 10개의 희석점을 위해 3배 희석되었다. PS3B2040을 RPMI-10에 50 μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 Incucyte SX5 이미징 시스템(Essen)에 위치시키고 120시간 동안 6시간마다 스캔하였다. 데이터는 시간 0으로 정규화하여 분석되었으며, 비선형 피팅(non-linear fit), 로그(작용제) 대 반응 - 가변 기울기(4-파라미터)를 사용하여 %종양 용해를 결정하고 그래프로 나타냈다(GraphPad Prism). 도 17은 0.051 nM의 EC50을 갖는 인간 PBMC에서 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 세포독성을 보여준다.
5.6 Incucyte를 통한 Pan T 세포를 이용한 표적 상의 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 세포독성
LNCaP 인간 전립선 종양 세포를 DPBS로 세척하고, 0.05% 트립신을 첨가하여 세포가 탈착되도록 하였다. 배지를 첨가하여 트립신을 중화시키고, 세포를 DPBS가 담긴 15 mL 코니컬 튜브에 옮겼다. 세포를 3분 동안 1200 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포를 Vi-Cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수하고, 100 μL의 RPMI-10(***페놀 레드 없음)에 15K/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 인간 Pan T 세포(Discovery Life Sciences)를 해동하여 DPBS가 있는 15 mL 코니컬 튜브로 옮겼다. 세포를 3분 동안 1500 rpm으로 원심분리하였다. DPBS를 흡인하고, 세포를 DPBS 중에 재현탁하였다. 세포는 Vi-cell XR 세포 생존력 분석기를 사용하여 계수되고, 50 μL의 RPMI-10/웰에 3:1의 E:T로 플레이팅되었다. PS3B2040은 30 nM의 출발 농도로 희석 블록에서 준비되고, 미치료 대조군을 포함하여 총 10개의 희석점을 위해 3배 희석되었다. PS3B2040을 RPMI-10에 50 uL/웰로 첨가하고, 플레이트를 Incucyte SX5(Essen)에 위치시키고 120시간 동안 6시간마다 스캔하였다. 데이터는 시간 0으로 정규화하여 분석되었으며, 비선형 피팅, 로그(작용제) 대 반응 - 가변 기울기(4-파라미터)를 사용하여 %종양 용해를 결정하고 그래프로 나타냈다(GraphPad Prism). 도 18은 0.06 nM의 EC50을 갖는 인간 Pan T 세포에서 스테이플링된 PSMAxCD3 항체(PS3B2040)의 용량 의존적 세포독성을 보여준다.
실시예 6: 스테이플링된 CD3 x ENPP3 항체(NPP3B815)의 생성
NPP3B815는 NPP3B56 중쇄(HC)2 x CD3B2030 N106A-LH로 이루어진 이중특이성 항체(BsAb)이다. NPP3B56은 ENPP3에 특이적인 결합제이다. NPP3B815는 다른 무엇보다도 순도, 결합 친화도, 열 안정성, 용해도, 혈청 안정성, 비특이적 결합, 점도 및 응집 가능성에 대해 평가되었다. NPP3B815는 높은 순도를 유지하였고, 37℃ 스트레스 시험에서 2주 후에도 입체 구조적 변화를 보이지 않았고, 허용 가능한 점도와 함께 높은 용해도, 안정성 및 40℃에서 높은 단량체 비율(150 mg/mL에서)을 나타냈고, 인간 혈청에서 표적 결합을 유지하였으며, 비특이적 결합에 대한 증거를 보이지 않았다. 요약하면, NPP3B815는 상이한 생물물리학적 검정의 결과에 의해 입증된 바와 같이 이상적이거나 허용 가능한 기준을 충족하였으며, 전반적인 고유한 특성은 제조 가능성에 유리하였다.
6.1 NPP3B815
NPP3B815(NPP3B56xCD3B2030-N106A-spFv)는 T 세포 상의 CD3ε(Uniprot ID: P07766) 및 종양 세포 상의 ENPP3(Uniprot ID: O14638)에 동시에 결합하는 IgG1 BsAb이다(도 19). 항체는 Fc 수용체와의 상호작용을 제거하기 위해 Fc 영역에 L234A, L235A 및 D265S(AAS; EU 넘버링)의 돌연변이를 특징으로 하며, 노브-인-홀 돌연변이를 사용하여 이종이량체화가 향상된다. 분자는 HC1 상에 항-CD3 spFv를 포함한다.
가변 영역 경쇄(VL)와 가변 영역 중쇄(VH)를 어느 한쪽 배향으로 유연한 링커와 유전적으로 융합함으로써 생성된 ScFv는 모 Fv의 항원 결합 특이성과 대체로 그 친화도를 재현한다. scFv는 다양한 다중특이성 치료용 생물의약품의 빌딩 블록으로 이용되어 왔다. 그러나 scFv 함유 분자는 낮은 열 안정성과 일시적인 분리 및 분자 간 VL/VH 재결합('브리딩(breathing)')으로 인해 응집되기 쉽다.
이러한 취약점은 spFv로 약칭되는 scFv '스테이플링(stapling)'에 의해 해결되었다. 이를 위해, 유연한 링커와 VL 및 VH 도메인의 앵커 위치(각각 하나씩) 사이에 2개의 이황화 결합이 조작되었다. 이 신규한 전략은 거의 모든 Fv 도메인에 대해 VL-VH 및 VH-VL 배향 둘 모두에서 양립 가능하다. 여러 분자에 대한 광범위한 특성분석은 spFv 분자가 개선된 생물물리학적 특성과 함께 동일한 결합 및 기능을 유지할 뿐만 아니라, 스테이플링이 scFv에서 관찰되었던 단백질 품질 및 치료제의 응집을 유의미하게 개선하였음을 입증한다.
spFv는 중앙의 'C1PPC2' 모티프(서열번호 157)를 갖는 링커로 이루어지며, 여기서 C1은 ('경쇄-중쇄' 배향의 spFv인 경우) VL 도메인의 위치 43(초티아 넘버링)에 조작된 시스테인과 이황화 결합을 형성하고, C2는 VH 도메인의 위치 100에 조작된 시스테인과 이황화 결합을 형성한다. HC1은 '노브' 돌연변이 T366W를 특징으로 한다. HC2는 항-ENPP3 Fab 영역, 그리고 '홀' 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V를 특징으로 한다.
BsAb는 T-세포 재지향(redirection)을 위해 ENPP3를 표적화하는 치료적 잠재력을 평가하기 위해 개발되었다. NPP3B815는 세포 표면에 ENPP3가 고도로 발현되는 진행성 고형 종양의 치료를 위해 개발되었다.
NPP3B815는 항-CD3ε spFv '노브' HC와 '홀'을 포함하는 항-ENPP3 Fab HC를 공동 발현시키고 이를 경쇄(LC)와 쌍을 이룸으로써 생성되었다. 항-CD3ε 가변 영역은 Cris7로부터 유래되었으며, 야생형 마우스에서 식별되고 scFv 포맷으로 인간화되어 다양한 CD3ε 친화도를 갖는 scFv 포맷의 모 Cris7보다 더 높은 열 안정성을 갖는 인간화된 변이체를 식별하였다. 간략하게는, 마우스 상보성 결정 영역(CDR)은 IGHV1-69*02-IGHJ1-01 및 IGKV3-11*02-IGKJ4-01 인간 생식세포계열에 이식된 후 전술한 바와 같이 인간 프레임워크 적응(framework adaption)이 수행되었다. 모 HC는 아미노산 위치 106-107(카바트 넘버링에서 위치 100B-100C)의 CDR3에 NG 서열을 포함하였으며, 이는 잠재적 위험을 나타냈다. 이러한 위험은 돌연변이 N106A에 의해 제거되었다. 여러 돌연변이가 이 위험을 제거할 수 있었으나, CD3ε에 대한 더 낮은 친화도가 더 낮은 독성과 관련될 수 있으므로 모 v-영역에 비해 N106A 변이체의 더 낮은 친화도에 근거하여 N106A를 선택하였다. 그 다음 항-CD3 v-영역은 최종 분자 NPP3B815에서 spFv로 포맷팅되었다. 항-ENPP3 가변 영역은 전장 ENPP3(Genedata DNA 배치 ID VB000066101)를 발현하는 플라스미드로 유전자도입 마우스(Ablexis)를 면역화함으로써 발견되었다. NPP3B56 mAb의 특징인 모 항-ENPP3 가변 영역은 변형되지 않았으며, 최종 분자 NPP3B815에서 Fab로서 포맷팅되었다.
ENPP3 결합 도메인의 서열은 표 8에 제시되어 있다. CD3 결합 아암의 아미노산 서열은 서열번호 28(VH), 서열번호 29(VL), 서열번호 30(spFv(VL-링커-VH)), 및 서열번호 96(중쇄 spFv-Fc)에 제시되어 있다. CD3 결합 아암을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 68(VH), 서열번호 69(VL), 서열번호 70(spFv(VL-링커-VH)), 및 서열번호 99(중쇄 spFv-Fc)에 제시되어 있다. 핵산 서열은 표 10에 제시되어 있다.
[표 8]
[표 9]
[표 10]
6.2 NPP3B815 시험관내 및 생체내 평가를 위한 ENPP3-발현 암 세포주의 선택
NPP3B815 내의 ENPP3 결합제 아암과 유사한 에피토프에 결합하는 상업적 ENPP3 항체(클론 NP4D6)를 사용한 유세포 분석법에 의해, 13개의 시험관내 확립된 RCC 및 HCC 세포주의 패널에서 ENPP3 표면 발현 및 수용체 밀도를 초기에 평가하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, ENPP3 내인성 발현은 Caki1, HEK293T 및 RXF393(PDX) 세포주에서의 음성(<검출 하한[LLOD], 2,969 수용체/세포로 결정됨)부터, 786-O, ACHN, Huh7 및 Hep3B에서의 낮음(<15,000 수용체/세포), KMRC20, HepG2 및 VMRCRCW에서의 중간(15,000-40,000 수용체/세포), TUHR4TKB 및 TUHR10TKB에서의 중간-높음(50,000-100,000 수용체/세포), 그리고 A704 세포주에서의 높음(>100,000 수용체/세포)까지의 범위를 가졌다. 내인성 ENPP3은 HepG2 세포주에서 녹아웃(클러스터되고 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복[CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats]을 사용함)되어, 음성 세포주 HepG2 ENPP3-KO를 생성하였다. 반대로, ENPP3은 CHO-K1 세포주에서 과발현되어 과발현 세포주 CHO-K1 ENPP3OE를 생성하였다.
이들 세포주 상에서 NPP3B815에 의해 유사한 ENPP3 발현이 검출 가능한지 확인하기 위해, NPP3B815와 동일한 ENPP3 결합제인 NPP3B56을 갖는 직접 표지된 ENPP3xNull BsAb NPP3B812를 유세포 분석법 기반의 수용체 밀도 연구에 사용하였다. NPP3B812를 이용한 ENPP3 발현 수준은 시험된 세포주에서 상업적 항체에서 관찰된 수준과 유사한 것으로 관찰되었다. 이들 세포주는 다양한 범위의 ENPP3 발현을 나타내지만, 그 대부분은 ccRCC 종양보다 낮은 발현을 나타낸다. 이들 세포주 중, A704, VMRCRCW 및 HepG2 ENPP3-KO 세포주는 각각 높음, 중간 및 음성 ENPP3 발현 수준을 나타내므로 대부분의 주요 시험관내 기능 연구에 사용되었다.
이들 세포주 중 2개(즉, VMRCRCW 및 HepG2)는 또한 NPP3B815 효능 연구에 사용하기 위한 생체내 CDX 모델로 확립되었다. 생체외 ENPP3 발현은 이들 2개의 CDX 종양 모델에서 무작위 배정 시의 종양과 동등한 종양 부피에서 IHC 및 유세포 분석법(해리된 종양)에 의해 측정되었다. IHC는 둘 모두의 CDX 종양에서 ENPP3 양성을 나타냈으며, 수용체 밀도는 세포당 10,600(VMRCRCW) 및 22,000(HepG2) ENPP3 수용체인 것으로 밝혀졌다(도 21). 생체내 연구를 위해 더 높은 ENPP3 발현 종양 모델을 탐색하고자, IHC에 의해 여러 양성 ccRCC PDX 모델을 식별하였고; ENPP3 발현은 ccRCC PDX 모델 RXF488에서 생체외 평가되었으며, 이는 IHC에 의한 높은 ENPP3 발현 및 130,000 수용체/세포의 수용체 밀도 측정값을 나타냈다.
6.3 종양 세포 및 T 세포에 대한 NPP3B815의 시험관내 결합
높음(A704), 중간(VMRCRCW) 및 음성 내인성 ENPP3-발현 세포주에서 NPP3B815(NPP3B56xCD3B2030-N106A-spFv)의 시험관내 세포 결합을 평가하였다(표 11). NPP3B815는 둘 모두의 양성 세포주인 A704 및 VMRCRCW에 대해 각각 1.01 nM 및 0.5 nM의 EC50 값으로 용량 의존적인 결합을 나타냈다(도 22 및 표 12). NPP3B815는 ENPP3-음성 세포주 HepG2 ENPP3-KO에 대한 결합을 나타내지 않았다. NullxCD3(79C3B615) 또는 이소형 대조(79C3B613) 항체에서는 어떠한 세포주에 대해서도 결합이 관찰되지 않았다.
[표 11]
나아가, 6명의 상이한 건강한 공여자로부터 단리된 인간 T 세포에 대한 NPP3B815의 결합을 평가하였다. 6명의 모든 공여자로부터의 T 세포에 대해 용량 의존적인 결합이 관찰되었으며, 평균 EC50(± 평균의 표준 오차)은 177±18.5 nM이었다(도 22 및 표 12). 예상대로, 이소형 대조 항체인 79C3B613에서는 어떠한 T-세포 공여자에 대해서도 결합이 관찰되지 않았다.
다른 ENPP 패밀리 구성원들과 비교하여 NPP3B815의 ENPP3에 대한 특이성을 평가하기 위해, ENPP1, ENPP2 또는 ENPP3를 과발현하는 CHOK1 세포에서 세포 결합을 평가하였다(도 23). NPP3B815는 ENPP3를 과발현하는 CHOK1 세포에 대해서만 0.5 nM의 결합 친화도(EC50)로 용량 의존적인 결합을 나타냈다. NPP3B815는 ENPP3-음성 세포주인 CHOK1 모 세포, 또는 ENPP1 또는 ENPP2를 과발현하는 CHOK1 세포에 대해서는 어떠한 결합도 나타내지 않았다(도 23 및 표 12). 이소형 대조(79C3B613) 항체에서는 어떠한 세포주에 대해서도 결합이 관찰되지 않았다.
[표 12]
6.4 상이한 수준의 내인성 ENPP3 발현을 갖는 암 세포주 패널에서의 NPP3B815-유도 세포독성 및 T-세포 활성화
T-세포 매개 종양 세포 사멸을 유도하는 NPP3B815(NPP3B56xCD3B2030-N106A)의 능력은 상이한 ENPP3 발현 수준을 갖는 암 세포주 패널(표 13)에 대해 Incucyte(생세포 시간-경과) 기기를 사용하여 평가되었다: 높음(A704), 중간-높음(TUHR10TKB, TUHR4TKB), 중간(VMRCRCW, HepG2), 및 음성(HepG2 ENPP3-KO). NPP3B815는 모든 ENPP3-양성 세포주(A704, VMRCRCW, HepG2, TUHR4TKB 및 TUHR10TKB)에서 3:1의 이펙터 대 표적 세포(E:T) 비로 용량 의존적인 T-세포 매개 세포독성을 유도한 반면, 음성 세포주(HepG2 ENPP3-KO)에 대해서는 사멸이 관찰되지 않았다(도 24). 예상대로, 시험된 어떠한 세포주에서도 NullxCD3(79C3B615) 또는 ENPP3xNull(NPP3B812) 대조 항체의 경우 T-세포 매개 종양 세포 사멸이 관찰되지 않았다. 종양 세포 사멸에 대한 EC50 및 최대 활성 값은 표 13에 제시되어 있으며, ENPP3 발현이 높은 세포주일수록 높은 최대 종양 세포 사멸과 함께 더 낮은 EC50 값을 나타냈다.
ENPP3xCD3 이중특이성 항체에 의해 유도된 T 세포 활성화 수준을 평가하기 위해, 항체 치료 48시간 후에 유세포 분석법으로 T 세포 상의 CD25 발현을 측정하였다(도 25). 시험된 모든 ENPP3-양성 세포주(A704, VMRCRCW 및 HepG2)에서 NPP3B815에 의한 용량 의존적인 T 세포 활성화 증가(E:T 비 = 3:1)가 관찰된 반면, 음성 세포주(HepG2 ENPP3-KO)에서 NPP3B815에 의한 경우, 또는 시험된 임의의 세포주에서 NullxCD3 및 ENPP3xNull 대조 항체에 의한 경우에는 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다. T-세포 활성화에 대한 EC50 및 최대 활성 값은 표 13에 제시되어 있다.
표.
[표 13]
6.5 다수의 T 세포 공여자 및 E:T 비에 걸친 NPP3B815-유도 세포독성 및 T 세포 활성화
6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 T 세포의 존재 하에(3:1의 E:T 비로 시험됨), ENPP3-양성 세포주인 A704(높음) 및 VMRCRCW(중간), 그리고 ENPP3-음성 세포주인 HepG2 ENPP3-KO의 NPP3B815-유도 T-세포 매개 종양 세포 사멸을 평가하였다(도 26a). 6명의 모든 공여자에 걸친 NPP3B815에 의한 용량 의존적인 T-세포 매개 세포독성이 관찰되었으며, 상이한 공여자 간에 EC50 값 및 최대 세포 사멸에서 일부 변동성이 관찰되었다(표 14). 예상대로, 시험된 모든 세포주 및 T-세포 공여자에 대해 NullxCD3 대조 항체인 79C3B615에 의한 T-세포 매개 종양 세포 사멸은 관찰되지 않았다. A704와 마찬가지로, ENPP3-중간 세포주인 VMRCRCW에서도 모든 공여자에 걸쳐 NPP3B815에 의한 용량 의존적인 T-세포 매개 세포독성이 관찰된 반면, 음성 세포주(HepG2 ENPP3-KO)에 대해서는 사멸이 관찰되지 않았다. EC50 및 최대 사멸 값은 표 14에 제시되어 있다.
전술한 세포독성 평가에 더하여, 동일한 6명의 T-세포 공여자에 대해 3:1의 E:T 비로 NPP3B815-유도 T-세포 활성화(48시간에 유세포 분석법에 의한 CD25 발현)를 평가하였다(도 26b). NPP3B815에 의한 용량 의존적인 T 세포 활성화 증가는 둘 모두의 ENPP3-양성 세포주(A704 및 VMRCRCW)에서 6명의 모든 T 세포 공여자에 걸쳐 관찰되었다. 음성 세포주(HepG2 ENPP3-KO)에서 NPP3B815의 경우, 또는 시험된 모든 세포주에 대해 NullxCD3 대조 항체 79C3B615의 경우에는 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다. T 세포 활성화에 대한 EC50 및 최대 값은 표 15에 제시되어 있다.
NPP3B815-유도 세포독성은 또한 더 낮고 생리학적으로 더 관련이 있는 1:1 및 1:3의 E:T 비에서 평가되었으며, 이러한 E:T 비의 ENPP3-높음 세포주인 A704에서 용량 의존적인 사멸이 관찰되었다(도 27). 72시간에 측정하였을 때, 3:1의 E:T 비(71%)에서 ENPP3-높음 세포주 A704에서 관찰된 것과 비교하여, 더 낮은 E:T 비인 1:1(41%) 및 1:3(17%)에서 NPP3B815의 최대 사멸 활성의 완만한 감소가 관찰되었다(표 14). 흥미롭게도, 인큐베이션 시간이 길어짐에 따라(3일 대비 5일), 더 낮은 E:T 비인 1:3에서 A704에서의 NPP3B815의 최대 사멸은 E:T = 1:1의 경우 41%에서 91%로 증가하였고, E:T = 1:3의 경우 17%에서 65% 35%로 증가하여, 더 높은 E:T 비에서와 유사한 최대 사멸을 유도하였다. 더 낮은 E:T 비에서의 유사한 세포독성 검정을 ENPP3-중간 세포주인 VMRCRCW 및 음성 세포주인 HepG2 ENPP3-KO에서도 수행하였다. 더 낮은 E:T 비에서 VMRCRCW에서 용량 의존적인 사멸이 관찰된 반면, 음성 세포주인 HepG2 ENPP3-KO에 대해서는 사멸이 관찰되지 않았다(도 27). 예상대로, 시험된 어떠한 E:T 비 또는 세포주에서도 NullxCD3 대조 항체인 79C3B615에 의한 T-세포 매개 종양 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 종양 세포 사멸에 대한 EC50 및 최대 활성 값은 표 14에 제시되어 있다.
[표 14]
[표 15]
6.6 T 세포 및 종양 세포 존재 하에서의 NPP3B815-유도 사이토카인 방출
NPP3B815에 의한 T 세포 활성화를 추가로 특성분석하기 위해, 3:1의 E:T 비에서 6명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터의 T 세포와 인큐베이션한 후 48시간에, ENPP3-높음 세포주인 A704에서 인간 Vplex 전염증성 패널(MSD: Meso Scale Discovery)을 사용하여 10개의 확립된 염증성 사이토카인의 사이토카인 방출 프로파일을 측정하였다. 시험된 모든 전염증성 사이토카인에서 NPP3B815에 의한 용량 의존적인 증가가 6명의 모든 T 세포 공여자에 걸쳐 관찰되었으며, 공여자들 간에 반응의 일부 변동성이 관찰되었다(도 28). 인터페론(IFN)-γ, 인터류킨(IL)-2, IL-10, IL-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α와 같은 일부 사이토카인은 NPP3B815 치료에 의해 강한 용량 의존적 유도를 나타낸 반면(도 28 및 표 16), 다른 것들(IL-1β, IL-12p70, IL-4, IL-13, IL-8)은 완만하거나 낮은 용량 의존적 유도를 나타냈다. 유도된 사이토카인의 농도는 NPP3B815 치료에 따라 가장 낮게 유도된 사이토카인(IL-1β)의 한 자릿수 pg/mL부터 가장 높게 유도된 것(IFN-γ)의 세 자릿수 ng/mL 범위까지 매우 다양하였다. NullxCD3 대조 항체인 79C3B615는 예상대로 낮은/없는 사이토카인 반응을 유도하였으며, 높은 배경 신호를 나타낸 IL-8의 경우는 예외였다.
[표 16]
6.7 PBMC 공여자로부터의 NPP3B815-유도 세포독성
이전에 인간 T-세포가 단리되었던 해당 6명의 공여자로부터 단리된 PBMC 존재 하에서 NPP3B815-유도 종양 세포 사멸을 평가하였다. 5:1의 E:T 비로 ENPP3-높음 세포주인 A704에서 6명의 모든 PBMC 공여자 존재 하에 NPP3B815 치료에 의한 용량 의존적인 세포독성이 관찰되었다(도 29). ENPP3-중간 세포주인 VMRCRCW에서도 6명의 모든 PBMC 공여자 존재 하에 NPP3B815 치료에 의한 용량 의존적인 세포독성이 관찰된 반면, 음성 세포주인 HepG2 ENPP3-KO에 대해서는 사멸이 관찰되지 않았다.
나아가, PBMC 존재 하에서의 NPP3B815-유도 세포독성은 더 낮고 생리학적으로 더 관련이 있는 3:1 및 1:1의 E:T 비에서도 평가하였다. 6명의 모든 PBMC 공여자 존재 하에 더 낮은 E:T 비에서 ENPP3-양성 세포주인 A704의 용량 의존적인 사멸이 관찰되었다(도 29). 5:1(82%) 및 3:1(78%)의 E:T 비에서 관찰된 것과 비교하였을 때, 가장 낮은 E:T 비인 1:1(44%)에서 NPP3B815의 최대 사멸 활성의 중간 정도 감소가 관찰되었다. 예상대로, 시험된 어떠한 PBMC 공여자 및 세포주 존재 하에서도 NullxCD3 대조 항체인 79C3B615에 의한 종양 세포 사멸은 관찰되지 않았다(도 29). EC50 및 최대 사멸 값은 표 17에 제시되어 있다.
[표 17]
6.8 사이노 ENPP3 발현 세포에 의한 세포 결합 및 세포독성.
NPP3B815의 ENPP3-결합 아암은 사이노몰구스 원숭이와 교차 반응성이지만, 그의 CD3ε결합 아암은 인간 특이적이다. 따라서 NPP3B815와 동일한 ENPP3-결합 아암을 포함하지만 사이노몰구스 원숭이 교차 반응성 CD3ε결합 아암인 CD3B219(스테이플링 되지 않음, scFv)를 포함하는 도구 분자(즉, NPP3B847)를 생성하였다. 도구 분자인 NPP3B847의 시험관내 세포 결합을 인간 및 사이노 T-세포뿐만 아니라 사이노 ENPP3 세포주인 HepG2-KO cyENPP3 OE에서 평가하였다. NPP3B847은 사이노 ENPP3 과발현 세포주인 HepG2-KO cyENPP3 OE에 대해 1.6 nM의 EC50 값으로 용량 의존적인 결합을 나타냈으며, 이소형 대조(79C3B613) 항체에서는 결합이 관찰되지 않았다(도 30a 및 표 18). 나아가, NPP3B847의 유사한 용량 의존적 결합이 인간 및 사이노몰구스 원숭이 T 세포 둘 모두에서 관찰되었으며, 결합 친화도(EC50) 값은 각각 4.5 nM 및 5.2 nM이었다(도 30b 및 표 18).
[표 18]
인간 또는 사이노몰구스 원숭이 T 세포의 존재 하에서 T-세포 활성화 및 T-세포 매개 종양 세포 세포독성을 평가함으로써 도구 분자인 NPP3B847의 시험관내 기능적 활성에 대한 평가를 수행하였다. 이러한 판독값은 사이노 ENPP3를 과발현하는 HepG2 ENPP3-KO 세포에서 유세포 분석법으로 측정되었으며(도 31 및 표 19), 인간 T-세포 존재 하에서의 임상 후보 물질인 NPP3B815의 활성과 비교되었다.
4명의 상이한 공여자로부터 단리된 사이노 T 세포 존재 하에서(3:1의 E:T 비로 시험됨) HepG3-KO 사이노 ENPP3-OE 세포주에 대한 NPP3B847-유도 T-세포 매개 세포 사멸을 평가하였다(도 31). 4명의 모든 공여자에 걸쳐 NPP3B847에 의한 용량 의존적인 T-세포 매개 세포독성이 관찰되었으며, 상이한 공여자들 간에 EC50 값에서 일부 변동성(0.05 nM 내지 0.14 nM)이 관찰되었다(표 19). 예상대로, 시험된 사이노 T-세포 공여자들에서 NullxCD3 대조 항체인 NPP3B41에 의한 T-세포 매개 종양 세포 사멸은 관찰되지 않았다. 나아가, HepG2-KO 사이노 ENPP3-OE 세포주의 NPP3B847 유도 T-세포 매개 세포 사멸은 3:1의 E:T 비에서 인간 T-세포를 이펙터 세포로 사용하여 NPP3B815의 것과 비교되었다(도 31). NPP3B847 및 NPP3B815 둘 모두에서 각각 0.016 nM 및 0.079 nM의 EC50 값으로 용량 의존적인 T-세포 매개 세포독성이 관찰되었으며, 인간 T-세포를 이용한 NullxCD3 대조 항체 NPP3B41에서는 사멸이 관찰되지 않았다(표 19).
세포독성 평가에 더하여, 3:1의 E:T 비로 동일한 4명의 사이노 T-세포 공여자에 대해 NPP3B847-유도 T-세포 활성화(48시간에 유세포 분석법에 의한 CD25 발현)를 평가하였다(도 31). HepG3-KO 사이노 ENPP3-OE 세포주에서 시험된 4명의 모든 T-세포 공여자에서 NPP3B847에 의한 용량 의존적인 T-세포 활성화 증가(EC50 = 0.005 nM 내지 0.033 nM)가 관찰되었으며, NullxCD3 대조 항체 NPP3B41에서는 활성이 관찰되지 않았다. 나아가, 3:1의 E:T 비에서 HepG2-KO 사이노 ENPP3-OE 세포주를 사용하여 NPP3B847 및 NPP3B815 둘 모두에 대한 인간 T-세포 활성화를 평가하였다(도 31). 각각 0.004 nM 및 0.023 nM의 EC50 값으로 NPP3B847 및 NPP3B815 둘 모두에서 용량 의존적인 인간 T-세포 활성화가 관찰되었으며, NullxCD3 대조 항체 NPP3B41에서는 활성이 관찰되지 않았다. NPP3B815 및 NPP3B41을 이용한 사이노 및 인간 T-세포 활성화에 대한 EC50 값은 표 19에 제시되어 있다.
[표 19]
6.9 생체내 효능
NullxCD3 대조 항체와 비교하여 ENPP3xCD3 스테이플링된(spFv) BsAb NPP3B815 또는 스테이플링되지 않은(scFv) 버전 NPP3B194의 항종양 활성이 각각 확립된 ENPP3-낮음(약 10,600 수용체/세포) 인간 RCC CDX 모델 VMRCRCW 또는 ENPP3-중간(약 22,000 수용체/세포) 인간 HCC HepG2 모델에서 평가되었다. 효능 연구는 공여자 CD3+ pan T 세포로 인간화된 암컷 면역 결핍 NSG 마우스에서 수행되었다. SC 종양이 확립되고 복강내(IP) T 세포 생착 1일 후에, IP로 투여되는 NPP3B815 또는 NPP3B194를 이용한 주 2회 치료를 시작하였다. 인간 T 세포의 생착은 궁극적인 이식편대숙주질환(GvHD)으로 인한 체중 감소를 초래할 수 있지만; NPP3B815에 의한 치료는 NullxCD3 치료 대조 그룹과 비교하여 유의미한 체중 감소를 초래하지 않았다. HepG2 종양 모델에서, 종양 유발 악액질(cachexia)로 인한 체중 감소가 모든 군에서 관찰되었다.
연구 ONC2022-035[ELN ENPP3-00163]에서, 확립된 SC VMRCRCW 이종이식을 보유한 마우스에게 NPP3B815를 10, 1, 0.1, 및 0.01 mg/kg으로 주 2회 또는 Null×CD3 대조 항체(10 mg/kg)를 총 8회 용량으로 IP 투여하였다(n=10/군). 종양 이식 후 39일차에 NullxCD3-항체 치료 대조 마우스와 비교했을 때, 10 및 1 mg/kg의 NPP3B815 치료에 의해 시간에 따라 각각 70% 및 75%의 Δ 종양 성장 억제(TGI)로 유의미한 항종양 효능(p<0.05)이 관찰되었다(도 32a). 0.1 및 0.01 mg/kg의 NPP3B815 치료는 39일차에 NullxCD3-항체 치료 동물과 비교하여 각각 58% 및 42%의 ΔTGI를 나타냈다. 이러한 더 낮은 NPP3B815 용량에서의 데이터는 통계적으로는 유의미(p<0.05)하지만, 생물학적으로는 유의미하지 않다(문헌[Johnson et al., 2001, Br J Cancer, 84(10):1424-1431]). 0.1 및 0.01 mg/kg의 NPP3B815 치료에서 관찰된 생물학적으로 유의미한 효능(즉, >60% TGI)의 결여는, 낮은 ENPP3 표적 수준 모델에 대해 1 mg/kg이 최소 유효 용량임을 입증하였다.
연구 P764Y[ELN ENPP3-00166]에서, 확립된 SC HepG2 이종이식을 보유한 마우스에게 NPP3B194(NPP3B815의 ScFv 버전)를 5, 1, 및 0.05 mg/kg으로 주 2회, 또는 NullxCD3 대조 항체를 총 6회 용량으로 IP 투여하였다(n=10/군). 종양 이식 후 52일차에 NullxCD3-항체 치료 대조 마우스와 비교했을 때, 5 및 1 mg/kg의 NPP3B194 처리에 의해 시간에 따라 각각 90% 및 104%의 ΔTGI로 유의미한 항종양 효능(p<0.05)이 관찰되었다(도 33). 0.05 mg/kg의 NPP3B194에 의한 치료는 52일차에 NullxCD3-항체 치료 동물과 비교하여 통계적으로 유의미하지 않았다. 5 및 1 mg/kg의 NPP3B194에 의한 치료는 연구 마지막 날(61일차)에 각각 8개 중 2개 및 9개 중 7개의 완전한 종양 퇴행을 초래하였다. 모든 효능 결과는 표 20에 요약되어 있다.
[표 20]
실시예 7. 항-GUCY2C 항체의 생성
7.1 Ablexis Kappa 마우스의 면역화
Ablexis Kappa 마우스에게 10 μg의 사이노 GUCY2C 세포외 도메인(ECD)(0, 14, 28일차) 또는 인간 GUCY2C ECD(7, 21일차)를 교대로 부스팅하여 면역화하였다. 일부 경우에는 아연 키토산 나노입자가 함께 사용되었다. 마우스는 주 5회 부스팅을 받았으며, 44일차에 인간 GUCY2C ECD(일부 경우에 아연 키토산 나노입자) 및 50 μg의 항-마우스 CD40(R&D Systems MAB440)으로 최종 부스팅을 받았다.
면역 혈청 샘플은 면역화 동안 한 번(28일차) 수집되었으며, 유세포 분석법을 통해 T84(GUCY2C+) 및 T84 GUCY2C KO(GUCY2C-) 세포에 대한 결합이 시험되었다. 단백질 혈청학(serology)은 MSD를 통해 인간 및 사이노 GUCY2C ECD 단백질에 대해 수행되었다. 면역 반응 품질 분석은 인간 및 사이노 GUCY2C ECD 코팅된 칩에서 SPR에 의해 수행되었다.
7.2 단일 B-세포 회수
면역화 일정의 51일차에, 그룹 4의 각 마우스로부터 비장 및 서혜 림프절을 적출하였다. 모든 림프절을 풀링하고 단일 세포 현탁액으로 균질화하고, 이중 양성 AF647 표지된 사이노 GUCY2C 및 비오틴화된 인간 GUCY2C(스트렙타비딘-PE 검출 사용)에 대해 분류되었다. 그 다음 세포를 플레이팅하고 7일 동안 배양하였다.
분류된 B-세포로부터의 SBC 상청액을 비오틴화된 인간 및 사이노 GUCY2C에 대해 단백질 MSD로 스크리닝하였다. 1차 히트(primary hit)가 V 유전자 회수를 위해 보내졌다. 선택된 회수 히트는 인간 IgG1로 발현되었다.
7.3 Expi293 소규모 형질감염 및 정제
면역화 캠페인으로부터 식별된 항체를 클로닝하고 2 ml 규모로 인간 IgG1로 발현시키고 정제하였다. Expi293 세포는 37℃, 7% CO2에서 Expi293 발현 배지에서 배양되었다. 98 내지 99%의 생존율로 밀도가 2.5 내지 3 x 10^6 생존 세포/mL로 로그기 성장에 도달했을 때 세포를 계대-배양하였다. 형질감염 당일에, 생존 세포 밀도 및 생존율을 결정하였다. 제조사의 형질감염 프로토콜(24 및 96 딥 웰 블록 및 미니 생물반응기 튜브에 대한 ThermoFisher ExpiCHO 발현 시스템 프로토콜)에 따라 2.5 내지 3 x 10^6 생존 세포/mL의 밀도로 세포를 형질감염시켰다. 배양 상청액은 형질감염 후 5일차에 2000 RPM으로 15분 동안의 원심분리에 의해 수확된 후 정제되었다. Capture Select CH1-XL 레진 슬러리(Thermo Cat 2943452050)를 사용하여 청징화된 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 항체는 0.1 M Na-Acetate, pH 3.5로 용리되었으며, 각 용리 분획은 DPBS로 투석하기 전에 2.5 M Tris HCl, pH 7.5로 중화되었다. DropSense 기기(Trinean NV/SA)를 사용하여 여액에 대한 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
7.4 재조합 항체 스크리닝
항체는 T84 세포, CHO-huGUCY2C 및 EL4-huGUCY2C에서 결합에 대해 스크리닝되었고, 용량 반응 적정(titration)에서 형질감염되지 않은 EL4에 대해 카운터 스크리닝되었다. 그 다음 가장 우수한 결합제는 CHO-huGUCY2C, CHO-cynoGUCY2C, 형질감염되지 않은 CHO 및 EL-4 huGUCY2C에서 용량 반응 적정으로 재스크리닝되었다. 또한 이들은 CHO-huGUCY2C 세포에 대한 결합에 대해 지표 GUCY2C 결합제 및 공지된 GUCY2C 결합제(참조 결합제)와의 경쟁에 대해 시험되었다. 선택된 항체들의 가변 영역을 서열분석하였다. 추가 연구를 위해 GUCYC2_mAb로 불리는 mAb를 선택하였다.
7.5 GUCY2C_mAb의 서열
대표적인 GUCY2C_mAb의 서열이 표 21 내지 표 24에 제공되어 있다. 표 21은 카바트 도식 하의 GUCY2C_mAb의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 보여준다. 표 22는 초티아 도식 하의 GUCY2C_mAb의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 보여준다. 표 23은 ABM 도식 하의 GUCY2C_mAb의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 보여준다. 표 24는 Contact 도식 하의 GUCY2C_mAb의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 보여준다. 표 25는 IMGT 도식 하의 GUCY2C_mAb의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 보여준다.
[표 21]
[표 22]
[표 23]
[표 24]
[표 25]
표 26은 GUCY2C_mAb의 VH1 및 VL1 아미노산 서열을 보여준다. 표 27은 GUCY2C_mAb의 VH1 및 VL1 핵산 서열을 보여준다.
[표 26]
[표 27]
GUCY2C_mAb의 특성분석
3개의 세포주, 즉 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 사이노 GUCY2C로 형질감염된 CHO, 및 인간 GUCY2C로 형질감염된 CHO를 적정 용량(titrating dose)의 GUCY2C_mAb와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고 2회 세척한 다음, AF647 표지된 항-인간 이차와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 2회 세척하고 재현탁하고 유세포 분석기에서 분석하였다. 각 세포주에 대해 RL1H 채널에서 특이성 항체 결합을 평가하였다. 데이터는 신호/배경으로 제시되었으며, 여기서 배경은 이차만이다. 도 34에 나타난 바와 같이, 본원에서 생성된 GUCY2C_mAb는 인간 및 사이노 GUCY2C 모두에 결합하며, 인간 CUCY2C에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타낸다.
인간 또는 사이노 GUCY2C로 형질감염된 CHO 세포에 대한 GUCY2C_mAb 결합의 EC50 값은 표 28에 제시되어 있다.
[표 28]
GUCY2CxCD3 이중특이성 항체의 생성
7.6 GUCY2CxCD3 이중특이성 항체의 조작
본 실시예에서, 2개의 GUCY2CxCD3 이중특이성 항체(GUCY2CxCD3_biAb-1 및 GUCY2CxCD3_biAb-2)가 생성되었다. GUCY2CxCD3_biAb-1 및 GUCY2CxCD3_biAb-2는 전술한 GUCY2C_mAb에 대응하는 동일한 GUCY2C 결합 아암과, 각각 중간 친화도 및 고친화도의 CD3 결합 아암을 포함한다.
7.7 GUCY2CxCD3_biAb-1의 조작
간략하게, GUCY2CxCD3_biAb-1의 GUCY2C 결합 아암은 실시예 1에서 기술된 GUCY2C_mAb로부터 유도된 항-GUCY2C Fab(GUCY2C_Fab)를 포함한다. 이중특이성 항체를 제조하기 위해, GUCY2C_mAb의 VH1 및 VL1은 각각 VH1-CH1-힌지-CH2-CH3(중쇄 1, HC1) 및 VL1-CL(경쇄 1, LC1) 포맷으로 조작되었으며 IgG1로 발현되었다. Fc 침묵(silencing) 돌연변이 L234A/L235A/D265S가 HC1의 Fc 영역에 도입되었다. 선택적(selective) 이종이량체화를 촉진하도록 설계된 돌연변이("홀" 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V)가 또한 HC1의 Fc 도메인에 조작되었다.
GUCY2CxCD3_biAb-1의 CD3 결합 아암은 본원에서 spFv-1로 기술되는 안정화된(또는 스테이플링된) scFv 도메인을 포함한다. GUCY2CxCD3_biAb-1의 CD3 아암은 저-중간 친화도 CD3 결합 아암이며, 이는 본원에서 CD3_spFv-1로 지칭될 것이다. CD3_spFv-1은 그 전체가 본원에 원용되어 포함되는 국제공개 WO 2022/201053호에 기술된 항-CD3 scFv 단편으로부터 유도된다.
국제공개 WO 2022/201053호에 개시된 항-CD3 scFv는 VH2와 VL2 사이의 상대적 이동에 부정적인 영향을 주지 않으면서 scFv 구조를 억제함으로써 안정화된 scFv(본원에서 "스테이플링된 scFv" 또는 spFv로 지칭됨)로 조작되었다. 안정화된 scFv는 VH2와 링커 사이, 그리고 VL2와 링커 사이에 이황화 결합을 조작함으로써 생성되었다. 항원 결합에 관여하지 않는, 구조적으로 보존되고 표면 노출된 2개의 프레임워크 위치(앵커 포인트), 즉 위치 H105의 VH2에 하나, 그리고 위치 L42의 VL2에 하나가 식별되고, 시스테인(Cys) 잔기로 돌연변이되어 서열번호 17의 VH2 및 서열번호 18의 VL2를 생성하였다. 2개의 Cys 잔기를 포함하는 서열 GGGSGGSGGCPPCGGSGG(서열번호 2)의 유연한 링커를 사용하여 VL-링커-VH(LH) 포맷으로 VL2와 VH2를 접합하였다. 링커의 Cys 잔기와 VH2 및 VL2의 Cys 잔기의 거리 및 위치는 링커의 Cys 잔기와 VH2 및 VL2의 각 앵커 포인트 사이의 이황화 결합 형성에 결정적이다.
VL-링커-VH에서의 스테이플링된 scFv는 추가로 중쇄 2(HC2)로 조작되었으며 IgG1로 발현되었다. 또한, Fc 침묵 돌연변이 L234A/L235A/D265S 및 이종이량체화("노브" 돌연변이 T366W)가 HC2의 Fc 도메인에 조작되었다.
그 다음 CD3_spFv-1을 포함하는 HC2는 노브-인-홀 이종이량체화 기술을 사용하여 GUCY2C_Fab를 포함하는 HC1 및 LC1과 쌍을 이루어, 스테이플링된 GUCY2CxCD3_biAb-1을 생성하였다.
CD3-spFv-1의 CDR 서열, VH2, VL2 및 spFv 서열은 표 29 내지 표 31에 제시되어 있다.
[표 29]
[표 30]
[표 31]
GUCY2C-CD3-bisp-Ab1의 전장 아미노산 서열은 표 32 내지 표 33에 제시되어 있다. 표 32는 GUCY2C 아암(HC1 및 LC1) 및 CD3 아암(HC2)의 전장 아미노산 서열을 보여준다. 표 33은 GUCY2C 아암(HC1 및 LC1) 및 CD3 아암(HC2)의 핵산 서열을 보여준다.
[표 32]
[표 33]
7.8 GUCY2CxCD3_biAb-2의 조작
GUCY2CxCD3_biAb-2의 GUCY2C 결합 아암은 전술한 GUCY2CxCD3_biAb-1과 동일하다.
GUCY2CxCD3_biAb-2의 CD3 결합 아암은 spFv 포맷의 고친화도 CD3 결합 아암이며, 본원에서 항-CD3 spFv-2(CD3_spFv-2)로 지칭될 것이다. VL-링커-VH에서의 스테이플링된 scFv는 추가로 중쇄 2(HC2)로 조작되었고, Fc 도메인에 Fc 침묵 돌연변이 L234A/L235A/D265S 및 이종이량체화("노브" 돌연변이 T366W)를 포함하는 IgG1로 발현되었다. 그 다음 CD3_spFv-2를 포함하는 HC2는 노브-인-홀 이종이량체화 기술을 사용하여 GUCY2C_Fab를 포함하는 HC1 및 LC1과 쌍을 이루어, 스테이플링된 GUCY2CxCD3_biAb-2를 생성하였다.
7.9 GUCY2CxCD3 항체의 발현
GUCY2CxCD3 이중특이성 항체는 ExpiFectamine CHO 형질감염 키트(ThermoFisher; Cat # A29131)를 사용하여 LC1, HC1, 및 HC2를 인코딩하는 정제된 플라스미드 DNA로 일시적 형질감염함으로써 ExpiCHO-S 세포(ThermoFisher; Cat # A29127)에서 발현되었다. ExpiCHO-S 세포는 37℃, 8% CO2 및 125 rpm으로 설정된 회전 진탕 인큐베이터에서 ExpiCHO 발현 배지(ThermoFisher; Cat # A2910001)에 현탁 상태로 유지되었다. 세포는 플라스크당 400 mL의 출발 배양 부피로 4개의 멸균 통기성 비-배플형 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flasks)(Corning 431255)에 계대 배양되었다.
형질감염 당일(배양 0일차)에, 플라스크 배양물은 5.15 내지 8.99 × 10^6 생존 세포/mL였으며, 최소 생존율은 98.2%였다. 형질감염을 위해, HC2를 인코딩하는 플라스미드 DNA 200 μg, HC1을 인코딩하는 플라스미드 DNA 200 μg, 및 LC1을 인코딩하는 플라스미드 DNA 400 μg(HC2:HC1:LC1 사슬 비 1:1:2)을 64 mL의 OptiPRO 배지(ThermoFisher Cat # 12309019)에 희석하였다. 5.12 mL의 ExpiFectamine CHO 형질감염 시약을 다른 64 mL의 OptiPRO 배지에 희석하였다. 플라스미드 DNA + OptiPRO 배지 혼합물 및 ExpiFectamine CHO 시약 + OptiPRO 배지 혼합물을 합쳐서 실온에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 이를 4개의 세포 플라스크에 약 33 mL/플라스크로 동일하게 분배하였다. 형질감염된 세포를 회전 진탕 인큐베이터로 반환시켰다.
하룻밤 인큐베이션한 후(배양 1일차), 240 mL의 ExpiCHO Feed와 4.8 mL의 ExpiFectamine CHO Enhancer를 합친 다음 4개의 플라스크에 동일하게 분배하였다. 세포를 수확할 때(배양 7일차)까지 추가로 인큐베이션하였다. 일시적으로 형질감염된 세포(6.06×10^66 생존 세포/mL, 84.7% 생존율)로부터의 배양 상청액을 원심분리(15분, 5000 rpm (5316 RCF)) 후 0.2 μm 여과를 통해 청징화하였다.
7.10 GUCY2CxCD3 항체의 정제
GUCY2CxCD3 이중특이성 항체는 다음과 같이 정제되었다. 위에서 제조된 여과된 세포 배양 상청액을 AKTA Pure150을 사용하여 20 mL/min으로 사전 평형화된(1× DPBS, pH 7.2) 커스텀 60 mL MabSelect PrismA 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, UV가 베이스라인 근처에서 안정화될 때까지 컬럼을 1× DPBS, pH 7.2로 세척하였다. 단백질을 0.1 M 아세트산 나트륨, pH 3.45로 용리하고, 2.5 M Tris HCl, pH 7.5의 첨가에 의해 인라인(inline)으로 10%(v/v) 최종 부피로 중화하고, 여과(0.2 μm)하고, 20 mM MES, pH 5.5로 투석하였다. 투석된 용리액은 완충액 A(20 mM MES, pH 6.5)로 사전 평형화된 커스텀 Capto S ImpAct 컬럼(GE Healthcare, 2.6 cm × 36 cm, CV = 193 mL)을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의해 추가로 정제되었다. 단백질을 10 mL/min으로 로딩한 다음, 완충액 B(20 mM MES, pH 6.5, 1 M NaCl: 10분 동안 0 - 5% 완충액 B, 135분 동안 5 - 35% 완충액 B)의 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용리하였다. 단량체 단백질만을 포함하는 피크 분획들을 풀링하고, 1× dPBS, PH 7.2로 투석하고, 여과(0.2 μm)하였다.
GUCY2CxCD3 항체의 특성분석
7.11 종양 세포 결합 특이성 및 T-세포 결합 특이성
GUCY2CxCD3 이중특이성 항체(GUCY2CxCD3_biAb-1 및 GUCY2CxCD3_biAb-2), 공지된 참조 GUCY2CxCD3 이중특이성 항체(biAb), 및 Null×CD3 대조 분자에 대해 생리학적으로 관련 있는 온도(37℃)에서 유세포 분석법을 통한 1시간 세포 결합 연구를 수행하였다. 목적은 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2에 대한 특이적 세포 결합을 특성분석하고 정량화하는 것이었다. 도 35a에 나타낸 바와 같이, GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2는 GUCY2C 내인성 발현 세포주 T84에 대해 강하고 특이적인 결합을 나타냈다. GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2의 최대 결합은 참조 biAb보다 높았다. Null×CD3 대조군은 T84에 결합하지 않았다.
GUCY2CxCD3_biAb-1은 Null×CD3와 유사한 정도로 1차 T-세포에 결합하였으며, 이는 GUCY2C Fab 결합 아암이 T-세포 결합(engagement)에 영향을 미치지 않음을 시사한다. 더 높은 친화도의 CD3 결합제를 보유하는 GUCY2CxCD3 biAb-2는 GUCY2CxCD3-biAb-1 또는 Null×CD3보다 더 높은 효력으로 1차 T-세포에 결합하였다(도 35b). 참조 biAb 또한 예상대로 T-세포에 결합하였다.
GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2의 T84 세포 및 T-세포에 대한 결합의 EC50 값은 표 34에 요약되어 있다.
[표 34]
7.12 에피토프 비교
GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2의 GUCY2C 결합제가 참조 biAb와 동일한 에피토프를 공유하는지 여부를 결정하기 위해, GUCY2CxCD3_biAb-1, GUCY2CxCD3_biAb-2 및 참조 Ab가 유도된 모 GUCY2C mAb를 사용하여 경쟁 유세포 분석 실험을 수행하였다. 이를 위해, 인간 GUCY2C 형질감염된 CHO 세포는, GUCY2CxCD3 biAb-1 및 2가 유도된 비표지 GUCY2C mAb의 적정과 함께 AF647 표지된 참조 mAb로 염색되었다. 그 다음 플레이트를 세척한 다음, 결합된 AF647 표지 참조 mAb를 유세포 분석기에서 검출하였다. 도 36에 나타낸 바와 같이, 비표지(unlableled) GUCY2C mAb는 결합을 위해 AF647 표지 참조 mAb와 경쟁하지 않았지만, 비표지 참조 biAb는 경쟁하였다. 이는 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2에서의 GUCY2C 결합제의 에피토프가 참조 mAb의 에피토프와 구별됨을 나타낸다.
7.13 시험관내 사멸 및 T-세포 활성화
RTCA xCELLigence(Agilent) 플랫폼에서 수행된 임피던스 기반 세포독성 검정은 GUCY2CxCD3 이중특이성 항체(GUCY2CxCD3_biAb-1 및 GUCY2CxCD3_biAb-2), 참조 GUCY2CxCD3 이중특이성 항체(biAb) 및 Null×CD3 대조 분자의 시험관내 효력을 특성분석하는 데 사용된 주요 수단이었다. IncuCyte® S3(Sartorius) 실시간 생세포 이미징 시스템에서 수행된 실험은 직교적 판독(orthogonal readout)으로서 조사되었다. CRC 세포주 HT55, LS1034, 및 T84가 시험되었다. 이들은 15000 내지 40000 수용체/세포 범위로 GUCY2C를 발현하며, 이는 GUCY2C의 중간 수준으로 특성분석된다. 종양 미세환경(TME)에서의 생리학적 연관성을 가장 잘 근사하기 위해, 최대 세포독성에 도달하는 가장 낮은 E:T 비가 이중특이성 식별 및 특성분석에 사용되었다.
도 37에 나타낸 바와 같이, GUCY2CxCD3_biAb-1은 T84에 대해 1:1의 E:T 비에서, 그리고 HT55 및 LS1034 세포 모두에 대해 3:1의 E:T 비에서 T-세포 매개 세포독성 및 T-세포 활성화를 유도하였다. GUCY2CxCD3_biAb-2 또한 이들 세포주에 대해 T-세포 매개 세포독성 및 T-세포 활성화를 유도하였으나, 높은 농도에서 후크 효과(hook effect)를 나타냈다. 참조 biAb는 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2 둘 모두보다 약한 T-세포 매개 세포독성 및 T-세포 활성화를 나타냈다. 대조 nullxCD3 spFv는 이들 세포주에 대해 유의미한 T-세포 매개 세포독성 또는 T-세포 활성화를 나타내지 않았다.
EC50 값은 표 35에 제시되어 있다.
[표 35]
7.14 T-세포 인간화 HT55 CDX 모델에서의 항종양 효능
인간 공여자 CD3+ pan-T-세포로 인간화된 암컷 면역 결핍 NSG(즉, 비-비만 당뇨병[NOD] 중증 복합 면역 결핍[scid] 감마 또는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스의 확립된 SC 인간 결장직장 HT55 세포주 유래 이종이식(CDX) 모델에서 GUCY2CxCD3_biAb-1의 항종양 활성 및 PD 관계를 평가하였다.
확립된 SC HT55 이종이식을 보유한 마우스에 GUCY2CxCD3 biAb-1을 0.5, 1 및 5 mg/kg으로 주 2회 또는 DPBS를 총 8회 용량으로 복강내(IP) 투여하였다(n=10/그룹). 종양 이식 후 33일차에 DPBS 치료 대조 그룹과 비교했을 때, 0.5, 1, 및 5 mg/kg으로 GUCY2CxCD3 biAb-1 치료에서 3가지 용량 수준 모두에서 109% Δ 종양 성장 억제(TGI)와 함께 유의미한 항종양 효능이 관찰되었다(p≤0.0001; 도 38). 이는 연구 종료 시점까지 각 치료 그룹에서 100% 종양 퇴행(TR) 및 10 중 10의 완전 퇴행(CR)을 초래했다.
7.15 입체구조적 안정성
GUCY2CxCD3_biAb-1의 열 안정성은 모세관 VP-DSC 미세열량계(Malvern Panalytical Malvern, 영국 소재)에 의해 특성분석되었다. 온도 스캔은 25℃에서 100℃까지 중복으로 수행되었다. 완충액 기준 스캔을 단백질 스캔으로부터 차감하고, 단백질 농도를 열역학 분석 전에 정규화하였다. 데이터는 MicroCal PEAQ 소프트웨어를 사용하여 플로팅 및 분석되었다. 비-2상태(non-two-state) 모델을 사용하여 DSC 곡선을 피팅하여 엔탈피 및 겉보기 전이 온도(Tm) 값을 얻었다. GUCY2CxCD3_biAb-1은 양호한 열 안정성을 나타냈다(표 36).
[표 36]
7.16 탐색적 독성 연구
GUCY2CxCD3-biAb-1의 GUCY2C 아암은 사이노몰구스 원숭이와 교차 반응성을 갖지만, 그 CD3 결합 아암은 인간 특이적이며 원숭이에 대한 교차 반응성이 결여되어 있다. 따라서 사이노몰구스 원숭이에서 조직 교차 반응성을 갖는 GUCY2CxCD3 이중특이성(GUCY2CxCD3_biAb-3)이 본 연구를 위해 제조되었다. GUCY2CxCD3-biAb-3은 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2에 대해 전술한 바와 같이 제조되었다. GUCY2CxCD3_biAb-3은 GUCY2CxCD3_biAb-1 및 2와 동일한 GUCY2C Fab 아암(HC1 및 LC1)을 포함하지만, 또한 spFv 포맷이지만 사이노 CD3에 대한 교차 반응성을 갖는 상이한 CD3 결합 아암을 포함한다. GUCY2CxCD3-biAb-3의 CD3 아암은 본원에서 CD3_spFv-3으로 지칭된다. CD3_spFv-3의 사이노몰구스 원숭이 교차 반응성 CD3 아암의 결합 친화도는 GUCY2CxCD3-biAb-1의 CD3_spFv-1보다 2 내지 5배 더 높다. 더 높은 CD3 결합 친화도는 달리 GUCY2CxCD3-biAb-1에서 관찰되었을 수준보다 더 높은 수준의 사이토카인 방출을 초래할 수 있다. 그렇지만, GUCY2CxCD3-biAb-3은 인간에게 GUCY2CxCD3-biAb-1을 투여했을 때 발생하는 약리학 및 이와 관련된 잠재적 독성을 모델링하기 위해 사이노몰구스 원숭이에서의 적절한 대용(surrogate) 분자로 남아 있다.
GUCY2CxCD3_biAb-1의 독성 용량 수준을 평가하기 위해 GUCY2CxCD3_biAb-3을 사용하여 3가지 증량 용량 수준(0.03, 0.3, 및 1.2 mg/kg)을 시험하였다. 각 용량은 2주 동안 성별당 그룹당 1마리의 원숭이에게 2회(주 1회) 투여되었다.
결과는 모든 용량이 내약성을 가짐을 보여준다(HNSTD=1.2 mg/kg). 사망 또는 빈사 상태는 관찰되지 않았다. 임상 징후로는 최고 치료 그룹(1.2 mg/kg)에서 단지 제1 용량(1일차) 후에 일시적인 구토가 포함되었으나, 어떠한 중재도 필요하지 않았으며 제2 용량 투여(8일차) 후에는 구토가 관찰되지 않았다. GUCY2CxCD3_biAb-3(본 출원의 GUCY2C 결합제를 포함함)은 참조 biAb보다 원치 않는 부작용(예컨대 구토, 고체온, 활동 감소, 구부정한 자세, 식욕 감퇴, 탈수, 체중 감소(≤7%), 및 연변 또는 설사 중 하나 이상)을 더 적게 나타냈다.
실시예 8: 클라우딘 CD3 spfv 항체
8.1 CLDN18.2xCD3 항체의 조작
CD3 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH scFv 결합 분자 또는 VL-링커-VH spFv 분자는 IgG1로서 scFv-힌지-CH2-CH3 포맷으로, 또는 Fc 침묵 돌연변이(L234A/L235A/D265S) 및 이량체화 돌연변이를 포함하는 spFv-힌지-CH2-CH3 포맷으로 추가 조작되어 CLDN18.2와 CD3 중쇄의 이종이량체화 및 CLDN18.2xCD3 항체의 생성을 촉진하였다.
CLD18.2 특이적 VH 및 VL 영역은 각각 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL-CL 포맷으로 조작되었고 IgG1로서 발현되었다. Fc 침묵 돌연변이 L234A/L235A/D265S를 Fc 영역에 도입하였다. 선택적 이종이량체화를 촉진하도록 설계된 돌연변이가 또한 CLDN18.2 Fc 도메인에 조작되었다.
[표 37]
[표 38]
8.2 유세포 분석법에 의한 세포에 대한 이중특이성의 결합
정제된 CLDN18.2xCD3 항체는 내인성 CLDN18.2를 발현하는 세포주(SK-CO-1)에 결합하는 능력에 대해 평가되었다. SK-CO-1은 인간 결장직장 선암종 세포주이고, NUGC-4는 위장의 반지세포암(signet ring cell carcinoma)에서 유도된 세포주이다. DMS 454는 소세포 폐암종에서 유도된 세포주이다. NCI-H146은 폐암에서 유도된 세포주이다. GSU는 위암종에서 유도된 세포주이다. 모든 세포주는 다양한 수준으로 인간 클라우딘 18.2를 발현한다.
SK-CO-1 세포와 DMS 454 세포를 50 ml 코니컬 튜브당 2000만 내지 2200만 개의 세포로 50 ml 코니컬 튜브에 현탁하였다. 유세포 분석법을 멀티플렉싱(multiplex)하기 위해, SK-CO-1 세포는 0.02 uM CFSE로 염색되고, DMS 454 세포는 0.2 uM CTV로 염색되었으며, NUGC-4 세포는 염색되지 않은 상태로 유지되었다. 세포를 차광 상태로 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 400xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 염색 반응을 중단(quench)시키기 위해 세포를 HI FBS에 약 1.5x10^6 세포/mL로 재현탁하였다. 모든 세포를 새로운 배지에 약 1.5x10^6 세포/mL로 재현탁하였다. 동일한 부피의 CFSE 염색된 SK-CO-1 세포, CTV 염색된 DMS 454 세포 및 염색되지 않은 SK-CO-1 세포를 혼합하고, 혼합된 세포 50 μl를 검정 플레이트의 웰마다 플레이팅하였다(약 25k 세포/각 세포주; 약 75k/총 혼합 세포/웰). 항-인간 트랜스페린(transferrin) 인간 mAb 및 인간 IgG1_AAS 이소형(2가)을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 함유하는 각 웰에 2X 농도의 CLDN18.2xCD3 적정액(titration) 50 μl를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후 각 웰에 염색 완충액 150 μL를 첨가하였다. 플레이트를 500×g에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하였다. 다시 각 웰에 150 μl의 염색 완충액을 첨가하고 플레이트를 500xg에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고, 각 웰에 대한 염색 완충액에 2 μg/mL로 A647 접합 항-인간 IgG Fc 특이적 2차 검출 항체(Jackson ImmunoResearch) 50 μl를 첨가하였다. 플레이트를 호일로 덮고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 150 μL의 IntelliCyt 러닝 완충액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 500xg에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음 세포를 35 μL의 러닝 완충액에 재현탁하고 플레이트를 iQue Screener(Sartorius)에서 실행하였다. 간략하게, 잔해를 제거하기 위해 세포를 FCS 대 SCS 점도표(dot plot)에서 게이팅하였다. 싱글렛(singlet)은 SCS-A 대 SCS-H 점도표에서 게이팅되었다. 3개의 세포 집단을 분리하기 위해 BL1-H 및 VL1-H 채널에서 세포를 게이팅하였다. 생세포 집단으로부터의 RL1-H(A647) Geomeans을 음성/이소형 대조 결합과 비교함으로써 대조 mAb 또는 시험 패널 상청액(sup)의 결합에 대해 세포를 평가하였다. 표 39에 제시된 EC50 및 최대 결합 수준을 계산하기 위해 4개 파라미터 피팅을 사용하여 용량 반응 곡선을 생성하였다.
[표 39]
NCI-H146 및 GSU 세포에 대한 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 농도 의존적 결합은 37℃에서 1시간 인큐베이션 후 0 내지 1 uM 범위(12회의 3배 희석)에 걸쳐 평가하였다.
세포를 37℃ 수욕에서 해동하고 배양 플라스크로 옮기기 전 완전 검정 배지에 재현탁하였다. 본 실험에 사용된 세포는 활성 배양 상태로 유지되었고, 적어도 2회 계대 배양되었고, 검정 개시 시에 >90%의 생존율을 보였다. 동역학적(kinetic) 세포 결합 검정은 2 mL 96-웰 딥 플레이트의 각 웰에 200 μL의 세포와 200 μL의 항체를 첨가함으로써 시작되었고 37℃에서 인큐베이션되었다. 각 시점에 50 μL의 분취액(aliquot)을 취하여 차가운 FACS 완충액을 함유하는 둥근 바닥 96-웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 6 μg/mL의 2차 항체 AF 647 F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG를 포함한 50 μL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 2차 항체를 차광 상태로 4℃에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 3회 세척한 다음, 0.1% 플루로닉산(pluronic acid), 2 mM EDTA, 및 Sytox Green(1:1000으로 희석)을 포함하는 FACS 완충액에 재현탁하여 모든 사멸된 세포를 표지하였다. 염색은 즉시 Intellicyt iQue3(Sartorius)에서 분석되었다. NuGC-4 CLDN 18.2 KO 세포는 본 실험에서 음성 세포주로서 역할을 했으며, CLDN 18.2에 대한 특이성을 확인해주었다. 대표적인 용량-반응 곡선은 도 39 내지 도 42에 제시되어 있다. 종양 세포주에 결합하는 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4에 대한 피팅 EC50 값은 표 40에도 제시되어 있다. CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4는 CLDN 18.2 녹아웃(knockout) 세포와 비교했을 때 각 표적 세포주의 수용체 밀도와 일치하는 용량 의존적 특이적 결합을 나타냈다.
[표 40]
8.3 CLDN18.2×CD3 항체의 안정성 검정
C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 안정성을 아래에 기술된 바와 같이 평가하였다.
8.3.1 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 시차 주사 열량 측정법
CLDN18.2xCD3 항체 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 열 안정성은 모세관 VP-DSC 미세열량계(Malvern Panalytical Malvern, 영국 소재)에 의해 특성분석되었다. 단백질 농도는 10 mM 히스티딘 pH 6.5 완충액에서 0.450 mL의 세포 부피로 1℃/min의 스캔 속도에서 측정된 1.0 mg/mL였다. 온도 스캔은 25에서 100℃까지 중복으로 수행되었다. 완충액 기준 스캔을 단백질 스캔으로부터 차감하고, 단백질 농도를 열역학 분석 전에 정규화하였다. 데이터는 MicroCal PEAQ 소프트웨어를 사용하여 플로팅 및 분석되었다. 비-2상태 모델을 사용하여 DSC 곡선을 피팅하여 엔탈피 및 겉보기 전이 온도(Tm) 값을 얻었다.
CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4(스테이플링된)는 C18B1068에 비해 약 10도 더 높은 Tonset으로 증가된 열 안정성을 나타냈다(표 41).
[표 41]
8.3.2 HCLF 및 스트레스 조건 하에서의 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 안정성
고 농도 액체 제제(HCLF) 및 스트레스 조건 하에서 항체를 인큐베이션한 후 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 안정성을 또한 평가하였다. C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4를 pH 6.5의 10 mM 히스티딘 완충액에서 약 150 mg/ml로 농축하고 40℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 분석용 SEC(aSEC) 및 분석용 초원심분리(AUC)를 통해 항체를 분석하였다.
C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 분석용 크기 배제 크로마토그래피
단백질 응집체, 이량체, 단량체 및 단편을 모니터링하기 위해 분석용 크기 배제(aSEC)를 사용하여 HCLF 및 스트레스 조건에서 인큐베이션한 후 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 안정성을 분석하였다. aSEC 분석은 이동상으로서 0.2 M 인산나트륨, pH 6.8에서, 그리고 Agilent 1200-시리즈 HPLC(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 상에서 0.7 mL/min의 유량으로 TOSOH TSKgel BioAssist G3SWxL 컬럼(7.8 mm × 30 cm, 5 μm, TOSOH)을 사용하여 수행되었다. 이러한 기술된 절차에서, 2 내지 600 kDa의 생물의약품 크기 범위를 갖는 참조 표준의 그룹을 컬럼에 주입하였다. 실행(run)당 표적인 10 내지 20 μg의 총 단백질을 주입하였다. 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 피크를 모니터링하였다. 각 샘플에서 발견된 종(species)에 대한 데이터 분석은 ChemStation 소프트웨어(Agilent Technologies)를 사용하여 수행되었다(표 42).
[표 42]
분석용 초원심분리
C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 안정성을 또한 Beckman Optima AUC를 사용하여 항체 침강 속도(sedimentation velocity)를 살펴봄으로써 분석용 초원심분리에 의해 평가하였다. 샘플(450 μL)을 1.2 cm Beckman 센터피스(50k rpm 등급) 및 석영 창이 장착되고 130 in-lbs로 토크가 가해지는 Beckman 분석용 초원심분리 셀에 로딩하였다. 원심분리 셀을 An-50(8홀) 로터에 넣고 AUC의 챔버 내에 위치시켰다. 실행을 시작하기 전 로터가 챔버에 있는 상태에서 AUC의 온도를 대략 2시간 동안 20.5℃로 평형화하였다. 침강 속도 실행은 항체당 250회 스캔, 90초의 스캔 수집 빈도 및 10 μM의 데이터 해상도로 40k rpm에서 수행되었다. 흡광도 데이터를 280 nm에서 수집하였다. 초기에, 메니스커스 위치를 결정하고 침강 분포 프로파일을 관찰하기 위해 소프트웨어 프로그램 DCDT+를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 다음 분석 피팅 소프트웨어 SEDFIT을 사용하여 데이터를 분석하였다. 메니스커스 위치를 DCDT+에 의해 결정된 값으로 설정하고, 베이스라인을 7.2 cm로 설정하고, 피팅 범위를 수동으로 선택하였다. 데이터는 침강 계수 범위 0-20 s, 해상도 100, 정규화 없는 피크 통합을 위한 신뢰구간 0.49를 갖는 연속 c(s) 분포 모델을 사용하여 피팅되었다. 샘플 침강의 각 피크에 존재하는 상이한 올리고머 종의 상대적 풍부도를 추정하기 위해 적분(integration) 함수를 사용하였다.
CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4(스테이플링된)는 개선된 콜로이드 안정성을 나타내어, C18B1068에 대한 69.7%와 비교하여 2주간의 열 스트레스 후 150 mg/mL에서 >94.4%의 단량체를 유지하였다(표 43).
[표 43]
8.3.3 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 CLDN18.2 x CD3 항체의 혈청 안정성
혈청 안정성 검정은 인간 혈청 성분에 대한 비특이적 또는 표적 외(off-target) 결합에 대한 단백질 분자의 특성을 평가하기 위해 개발되었다. 본 연구는 불량한 약동학 및 생체 분포 특성을 예측할 수 있다. 형광 기반 크로마토그래피 방법을 사용하여 완충액 및 인간 혈청 모두에서 C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4의 결합 및 안정성을 평가하였다. C18B1068 및 CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4를 Alexa Fluor 488 접합체로 표지하고, HBS-EP 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20, 10X 완충액, GE, 카탈로그 번호 BR100669) 및 인간 혈청(BIOIVT/Bioreclamation, 카탈로그 번호 HUMANSRM)에서 37℃로 7일 동안 인큐베이션하고, 형광 검출기가 장착된 Agilent HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.
PBS 중 2.0 mg/mL의 각 항체 100 μl를 제조사의 프로토콜에 따라 Alexa Fluor™ 항체 표지 키트(ThermoFisher, 카탈로그 번호: A20181)로 표지하였다. 혈청 안정성 검정은 다음과 같이 설정되었다: 각각의 표지된 항체에 대해, 1X HBS-EP 완충액 또는 인간 혈청에서 최종 단백질 농도가 300 nM이 되도록 500 μl 샘플을 제조하였다. SEC-HPLC를 위해 샘플을 취하였다(t0). 그 다음 샘플을 두 세트로 나누어, 한 세트는 4℃에 보관하는 한편 다른 세트는 37℃에 보관하였다. 7일 후, 0.2 M 인산나트륨(pH 6.8)을 포함하는 이동상으로 사전 평형화된 TOSOH TSKgel BioAssist G3SWxL 컬럼(7.8 mm × 30 cm, 5 μm, TOSOH)에서 Agilent 1200-시리즈 HPLC(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 0.7 mL/min의 유량으로 SEC-HPLC에 의해 샘플을 평가하였다. 494 nm에서의 흡광도를 사용하여 피크를 모니터링하였다. 각 샘플에서 발견된 피크의 데이터 분석은 ChemStation 소프트웨어(Agilent Technologies)를 사용하여 수행되었다.
CD3B1068은 혈청에서 37℃로 7일간 인큐베이션한 후 90%의 단량체, 및 7일 후 고분자량(High Molecular Weight) 단백질의 9.5% 증가를 나타낸 한편, CLDN18.2xCD3 bisp-Ab4는 37℃에서 7일간 인큐베이션한 후 93.7%의 단량체, 및 7일 후 고분자량 단백질의 3.3% 증가를 나타냈다(표 44).
[표 44]
서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

  1. 분화 클러스터 3ε(CD3ε)에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 결합제로서, CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 스테이플링된 scFv(spFv) CDR 서열을 포함하는 결합제:
    a) HCDR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
    b) HCDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
    c) HCDR1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함;
    d) HCDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함함; 및
    e) HCDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 DSS의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 28에 기재된 바와 같은 VH 도메인 및 서열번호 29에 기재된 바와 같은 VL 도메인을 포함하는, 결합제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 서열번호 30에 기재된 바와 같은 spFv를 포함하는, 결합제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체인 결합제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 Ig 불변 영역의 단편을 더 포함하며, 선택적으로 상기 Ig 불변 영역의 단편은 Fc 영역 또는 CH3 도메인인, 결합제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Ig 불변 영역, 상기 Ig 불변 영역의 단편, 상기 Fc 영역 또는 상기 CH3 도메인은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 결합제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 L234A/L235A/D265S, F234A/L235A, L234A/L235A, V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, F234A/L235A, S228P/F234A/ L235A, N297A, V234A/G237A, K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, H268Q/V309L/A330S/P331S, S267E/L328F, L234F/L235E/D265A, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S 및 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 결합제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V, T366W, T350V, L351Y, F405A, Y407V, T366Y, T366L, F405W, T394W, K392L, T394S, Y407T, Y407A, , L351Y/F405A/Y407V, T366I/K392M/T394W, F405A/Y407V, T366L/K392M/T394W, T366L/K392L/T394W, L351Y/Y407A, L351Y/Y407V, T366A/K409F, T366V/K409F, T366A/K409F, T350V/L351Y/F405A/Y407V 및 T350V/T366L/K392L/T394W로 이루어진 군으로부터 선택되며, 잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따르는, 결합제.
  9. 제6항에 있어서, 상기 결합제는 노브-인-홀 돌연변이를 포함하며, 상기 노브 돌연변이는 T366S/L368A/Y407V를 포함하고, 상기 홀 돌연변이는 T366W를 포함하는, 결합제.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD3ε 이외의 제2 항원과 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이성 단백질을 포함하는 결합제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제2 항원은 종양 항원인, 결합제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합제의 VH, VL, 또는 VH와 VL 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  15. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합제를 포함하는 키트.
  17. 대상체에서 질환 또는 장애의 진행을 치료하거나 늦추는 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 결합 분자를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. T 세포를, 표적 항원을 발현하는 표적 세포로 유도하는 방법으로서, 상기 T 세포를 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합제, 또는 상기 결합제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 CD3ε에 결합하는 항원 결합 영역은 상기 T 세포에 결합하고, 상기 CD3ε 이외의 제2 항원에 결합하는 항원 결합 영역은 상기 표적 세포에 결합하는, 방법.
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