KR20260061237A - 이중 특이성 항체 및 그 응용 - Google Patents

이중 특이성 항체 및 그 응용

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KR20260061237A
KR20260061237A KR1020267009802A KR20267009802A KR20260061237A KR 20260061237 A KR20260061237 A KR 20260061237A KR 1020267009802 A KR1020267009802 A KR 1020267009802A KR 20267009802 A KR20267009802 A KR 20267009802A KR 20260061237 A KR20260061237 A KR 20260061237A
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잉 청
양양 리
위에이 우
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허페이 티지 이뮤노파마 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 CD3 및 종양 타깃을 표적으로 하는 이중 특이성 항체 및 그 응용을 제공한다. 해당 이중 특이성 항체는 제1항원 결합 영역, 제2항원 결합 영역 및 Fc 부위를 포함하며; 상기 Fc 부위는 제1 Fc 펩타이드 및 제2 Fc 펩타이드를 포함하며; 상기 제1항원 결합 영역은 scFv 조각 및 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며; 상기 제2항원 결합 영역은 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며; 상기 제1분자는 상기 제2분자와 동일하며, 상기 scFv 조각은 CD3 결합 활성을 가진다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 T세포와의 결합이 약해 종양과의 결합이 강하며 안전성이 좋아 항암 활성이 높기에 적용 및 약물 개발 가치가 높다.

Description

이중 특이성 항체 및 그 응용
본 발명은 생물의약 분야에 속하며, 구체적으로, 본 발명은 이중 특이성 항체 및 그 응용에 관하여, 더욱 구체적으로, 본 발명은 항체, 핵산 분자, 벡터 또는 형질전환체, 세포, 약물 조합물 및 키트 그리고 그 응용에 관한 것이다.
암은 인류의 생존 및 발전에 영향을 미치는 중대한 질병이며, 최신 데이터에 따르면 전 세계에서 매년 약 1,900만 건의 새로운 암 사례가 발생하고, 매년 약 1,000만 건의 암 사망이 보고되고 있어 발생률 및 사망률이 증가 추세에 있다. 수술으로 인한 절제 외에 화학요법이나 방사선요법 등 기존 암 치료 방법은 부작용이 크고 재발하기 쉽다. 최근에는 종양 타깃 항체, 면역 체크포인트 항체, 이중 특이성 항체 등을 이용한 면역 치료가 암 치료의 새로운 관심사 및 새로운 희망이 되고 있다. PD-1/L1을 대표로 하는 면역 치료는 큰 가능성을 보여주고 있지만, 현재 승인된 가장 적용 범위가 넓은 PD-1/L1 치료법이라 하더라도 전체 반응률은 겨우 30%에 불과해 여전히 많은 환자들이 혜택을 받지 못하고 있다. 그 주요 이유 중 하나는 면역 체크포인트 요법이 "차가운 종양"에 대해 효과가 없다는 점이다. T세포는 표면의 T세포 수용체(TCR)를 통해 신생 항원(neo-antigen), 즉 종양 유전자 변이의 항원을 인식하지만, 일부 종양은 유전자 변이 빈도가 낮고 신생 항원의 종류가 적어 "차가운 종양”이라고 불린다. 면역 체크포인트 요법과 같은 현재의 PD-1/L1 요법은 T세포 자체의 기능을 회복시킴으로 항암 효과를 달성하지만, "차가운 종양"에서는 T세포가 종양을 효과적으로 인식하지 못하기 때문에 면역 체크포인트 요법은 "차가운 종양"에 대해 무효가 된다.
CD3에 기반한 이중 특이성 항체(이하 "CD3 이중 특이성 항체”라 약칭된다)는 T세포를 종양 국소에 유인해 T세포와 종양을 연결해 T세포의 활성화를 촉진해 종양을 말살함으로써, 새로운 항원을 필요로 하지 않고 T세포를 유도해 "차가운 종양”을 말살할 수 있다. CD3 이중 특이성 항체는 T세포 및 종양 세포를 결합한 뒤 강력한 활성화 신호를 일으키므로, 어느 정도 면역 체크포인트 분자의 억제 신호를 무시할 수도 있다. 그러나 CD3 이중 특이성 항체도 다량의 염증 촉진성 사이토카인, 예를 들어 TNFα, IL-6 등의 생성을 촉진하며 강력한 사이토카인 폭풍 및 과도한 면역 반응을 일으키고, 신체에 손상을 주며, 심한 경우 생명을 위협할 가능성이 있다. 따라서 CD3 기반 이중 특이성 항체는 임상에서 좋은 적용 전망을 가지고 있지만, 안전성을 더욱 높여야 한다.
CD3 이중 특이성 항체의 안전성 문제를 해결하는 방법 중 하나는, CD3 이중 특이성 항체와 종양 타깃 간의 결합 친화성을 높여 CD3와의 친화성을 낮춰 T세포와의 결합을 약화시킴으로, CD3 이중 특이성 항체 약물이 종양 부위에 더 많이 분포하도록 하여, 종양 부위의 약물 농도를 높여 말초의 약물 농도를 낮추어 오프 타깃 독성을 감소시키는 것이다. 따라서 임상에서는 안전성이 높여 임상 적용 가치가 높은 CD3 이중 특이성 항체의 개발이 시급한 과제가 된다.
본 발명은 기존 기술에 존재하는 기술 과제 중 최소 하나를 최소한 어느 정도 해결하는 것을 목표로 한다. 따라서 본 발명의 목적 중 하나는 CD3 및 종양 타깃을 표적으로 하는 이중 특이성 항체를 제공하는 데 있다. 해당 이중 특이성 항체는 CD3및 종양 타깃을 결합할 수 있으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며 T세포와의 결합이 약하며, T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하며, PBMC로 인한 종양 세포의 말살 활성을 효과적으로 촉진하기에, 향상된 T세포 활성화 성능을 가지고 있어 약물을 말초나 림프 조직이 아니라 종양 부위에 분포시킬 수 있다. 이로써 본 발명의 이중 특이성 항체는 안전성이 좋아 항암 활성이 높기에 적용 및 약물 개발 가치가 높다.
본 발명은 발명자가 다음 내용의 사실 및 문제를 발견해 인식한 것을 근거로 만들어진 것이다.
발명자는 CD3 및 MICA의 이중 특이성 항체의 안전성을 높이기 위해 대규모 선별 및 실험 검증을 통해 새로운 구조의 CD3 및 MICA의 이중 특이성 항체를 확보했다. 추가 실험 결과는 다음과 같은 결론을 검증했다. 해당 CD3 및 MICA의 이중 특이성 항체는 T세포와의 결합이 약해 종양과의 결합이 강하며 말살 활성도가 높고, PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 효과적으로 촉진하고, 뛰어난 항암 활성을 가지고 있다. 게다가 해당 이중 특이성 항체는 T세포 결합 활성이 감소해 T세포 활성화 능력이 높아져 안전성이 더욱 높아지고, 임상 적용 및 약물 개발에 가치가 있다.
따라서 본 발명의 제1양태에서는 본 발명해당 이중 특이성 항체를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 이중 특이성 항체는 제1항원 결합 영역, 제2항원 결합 영역 및 Fc 부위를 포함한다.
상기 Fc 부위는 제1 Fc 펩타이드 및 제2 Fc 펩타이드를 포함하다.
상기 제1항원 결합 영역은 scFv 조각 및 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다.
상기 제2항원 결합 영역은 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다.
상기 제1분자는 상기 제2분자와 동일하며, 상기 scFv 조각은 CD3 결합 활성을 가지다.
본 발명의 실시 형태에 따른 이중 특이성 항체는 CD3및 종양 타깃을 결합할 수 있으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며 T세포와의 결합이 약하며, T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하며, PBMC로 인한 종양 세포의 말살 활성을 효과적으로 촉진하기에, 향상된 T세포 활성화 성능을 가지고 있어 약물을 말초나 림프 조직이 아니라 종양 부위에 분포시킬 수 있다. 이로써 본 발명의 이중 특이성 항체는 안전성이 좋아 항암 활성이 높기에 적용 및 약물 개발 가치가 높다.
본 발명의 제2양태에서는 본 발명이 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 핵산 분자는 상기 이중 특이성 항체를 인코딩한다. 본 발명의 실시 형태에 따른 핵산 분자는 CD3 및 종양 타깃을 동시에 표적으로 할 수 있는 이중 특이성 항체를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 제3양태에서는 본 발명이 벡터 또는 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 벡터 또는 형질전환체는 상기 핵산 분자를 함유한다. 이에 따라 구축된 벡터 또는 형질전환체를 활용함으로써 상기 이중 특이성 항체를 효과적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 제4양태에서는 본 발명이 세포를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 세포는 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터 또는 형질전환체를 휴대하거나, 상기 이중 특이성 항체를 발현시킨다. 본 발명의 실시 형태에 따른 상기 세포는 상기 벡터 또는 형질전환체에 유전자를 도입하거나 전환을 함으로써 얻어지며, 상기 세포는 적합한 조건 하에서 상기 이중 특이성 항체를 고효율로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 제5양태에서는 본 발명이 약물 종합물을 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 약물 종합물은 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체 또는 상기 세포를 포함한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 이중 특이성 항체는 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 효과적으로 촉진해 항암 활성이 높으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며 안전성이 뛰어나다. 이로써 얻은 약물은 CD3 및/또는 종양 타깃이 매개하는 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 더 나아가 활용될 수 있다.
본 발명의 제6양태에서는 본 발명이 키트를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 키트는 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체 또는 상기 세포를 포함한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 키트는 CD3 및/또는 종양 타깃을 결합해 CD3 및/또는 종양 타깃을 효과적으로 감별할 수 있다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 해당 키트에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
본 발명의 제7양태에서는 본 발명이 키트의 제조를 위한 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 또는 상기 세포의 용도를 제공하며, 상기 키트는 CD3 및/또는 종양 타깃의 검출에 사용된다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 해당 키트의 제조를 위한 용도에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
본 발명의 제8양태에서는 본 발명이 약물의 제조를 위한 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물의 용도를 제공하며, 상기 약물은 CD3 및/또는 종양 타깃이 매개하는 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 활용된다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 해당 용도에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
본 발명의 추가 형태 및 장점은 일부가 다음 설명에서 제시되며, 기타 부분은 다음 설명을 통해 밝혀지거나, 본 발명의 실시를 통해 이해된다.
본 발명의 상기 및/또는 추가의 형태 및 장점은 다음 도면을 참조해 실시예를 기술함으로써 명확하고 이해하기 쉬워진다.
도 1은 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 CD3ХMICA 이중 특이성 항체의 모식을 묘사한다.
도 2는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체와 MICA 단백질과의 결합에 관한 ELISA 결과를 묘사한다.
도 3는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체와CD3E&D단백질과의 결합에 관한 ELISA 결과를 묘사한다.
도 4는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체 연결CD3E&D과의 MICA 단백질과의 결합에 관한 ELISA 결과를 묘사한다.
도 5는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체와 CD8+ T세포와의 결합에 관한 세포 유동 분석 결과를 묘사한다.
도 6는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체와 HCT-15결직장암 세포와의 결합에 관한 세포 유동 분석 결과를 묘사한다.
도 7는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 8는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 NCI-H1299 폐암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 9는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 PANC-1 췌장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 10는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 A498 신장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 11는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 PC-3 전립선암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 12는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC를HCT-15 결장·직장암 세포와 함께 배양한 후 면역 활성화성 사이토카인IL-2 및 IFN-γ의 분비를 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 13는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 2:1, SP34×h5A1002 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 14는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 2:1, Cross3×1D5 1:1, Cross3×1D5 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 15는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 2:1, Cross3×13A9 1:1, Cross3×13A9 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 16는 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한Cross3×h5A1002 2:1, Cross3×619 1:1, Cross3×619 2:1 항체를 통해 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 17은 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3Хh5A1002 2:1 항체를 통해 면역 재구성 마우스의 A-375 인간 흑색종 모델에서 체내 약효를 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 18은 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3Хh5A1002 2:1 항체를 통해 면역 재구성 마우스의 NCI-H1299 인간 폐암 모델에서 체내 약효를 촉진하는 결과를 묘사한다.
도 19은 본 발명의 구체적인 실시 형태에 의한 Cross3Хh5A1002 2:1 항체를 통해 면역 재구성 마우스의 PC-3 인간 전립선암 모델에서 체내 약효를 촉진하는 결과를 묘사한다.
다음은 본 발명의 실시 형태를 상세히 설명하고, 실시 형태의 사례는 첨부 도면에 제시되어 있다. 다음은 첨부된 도면을 참고하여 기술된 사례가 예시 적인 것이며, 본 발명을 설명하는 것을 목적으로 하고, 본 발명을 제한함으로 이해하면 안 된다.
또한 '제1', '제2'와 같은 용어는 묘사 목적에만 사용되며, 상대적인 중요성을 암시/의미함 또는 제시된 기술적 특징의 수량을 암시함으로 이해하면 안 된다. 이로 인해 '제1' 또는 '제2'에 한정된 특성은 최소 하나의 특성을 명시적이거나 암시적으로 포함할 가능성이 있다. 본 발명의 기술에서는 특별히 명확한 구체적 제한이 없는 한, ‘복수'의 의미는 최소 두 개, 예를 들어 두 개, 세 개 등을 가리킨다.
본 명세서에서 공개된 범위의 끝점 또는 임의의 값은 해당 정확한 범위 또는 값에 한정되는 것이 아니라, 이들 범위 또는 값은 그 범위 또는 값에 근접한 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 범위에 대해서는 각 범위의 끝점 값의 사이, 각 범위의 끝점 값과 개별 점 값과의 사이, 그리고 개별 점 값의 사이를 서로 결합함으로써 하나 또는 여러 개의 새로운 수치 범위를 얻을 가능성이 있으며, 이러한 수치 범위는 본 명세서에 구체적으로 공개된 것으로 간주되어야 한다.
용어 및 정의
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해, 다음 몇 가지 기술 및 과학 용어를 구체적으로 정의한다. 특별한 정의가 없는 한, 이 명세서에 사용된 모든 기타 기술 및 과학 용어는 해당 업계 종사자에게 일반적으로 이해된 의미를 가지고 있다. 아미노산 잔기의 약어는 이 분야에서 자주 사용되는 20가지 L-아미노산 중 하나를 나타내는 표준적인 3자리 및/또는 1자리 코드이다.
본 명세서에서 '항체'라는 용어는 보통 하나 또는 다중 항원인식부위를 식별할 수 있는 항체를 의미하며, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 이 합체, 다 합체, 이 특이성 항체, 중사슬 항체, 삼 중사슬 항체, 단사슬 Fv(scFv), 나노 항체 등을 포함하지만, 이들을 한정하지 않는다. 또한, 기대된 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 조각도 포함한다. 항체는 마우스, 인간, 인간화, 키메라, 혹은 기타 물종에서 유래했을 가능성이 있다. 항체는 전체 길이의 중사슬, 전체 길이의 경사슬, 완전한 면역글로불린 분자, 혹은 이들 펩타이드 중 하나의 면역 활성 부분을 가리킬 가능성이 있다. 즉, 해당 면역 활성 부분은 관심 있는 타깃 항원을 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자 또는 그 일부를 포함한다. 이러한 타깃은 암세포 또는 자가면역 질병과 관련된 자가면역 항체를 생산하는 세포를 포함하지만, 그것들에 한정되지 않는다.
이 명세서에서 아미노산의 조성 및 서열 순서가 더 높은 변화 정도를 갖는 가변 영역 중 일부는 '고 변이 영역(Hypervariable region, HVR)' 이라고 불린다. 고 변이 영역은 항원이 항체를 결합하는 위치이므로 결정 군상 보완 영역(complementarity-defining region, CDR)이라고도 불린다. 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역에는 각각 3개의 CDR 영역이 있다. 예를 들어, 고 변이 영역은 일반적으로 경사슬 가변 영역의 23-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3) 부근 및 중사슬 가변 영역의 31-35B(H1), 50-65(H2), 95-102(H3) 부근의 아미노산 잔기; 및 /또는 ‘고 변이 루프'에서 유래한 아미노산 잔기(예를 들어, 경사슬 가변 영역의 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3) 및 중사슬 가변 영역의 26-32(H1), 53-55(H2), 96-101(H3) 부근의 아미노산 잔기)를 포함한다.
이 명세서에서는 "항 CD3 항체”라는 용어가 CD3를 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이 항체는 본 명세서에서 "CD3 결합 항체”라고도 불린다. 이 명세서에서는 "항 MICA 항체”라는 용어가MICA를 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이 항체는 본 명세서에서 "MICA 결합 항체”라고도 불린다.
이 명세서에서는 용어 '항원 결합 조각'이 '항체 조각' 또는 '항원 결합성 항체 조각'과 동의어이며, 완전한 항체의 일부를 포함할 가능성이 있어 일반적으로 항원 결합부 또는 가변을 의미한다. 항원 결합 조각은 Fv, scFv, Fab, Fab', Fab'-SH, scFab(single chain Fab fragment，scFab), F(ab')2, scFv-Fc 조각, 혹은 이중 특이성 항체(Bispecific antibodies, BsAbs), 선형 항체 또는 화학 개질함 또는 리포솜에 섞어 넣음으로써 반감기를 연장할 수 있는 어떠한 조각도 포함하지만, 그것들에 한정되지 않는다. 상기 화학 개질함는 폴리(알킬렌) 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 첨가할 가능성이 있다('폴리에틸렌글리콜화, PEG화')(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG라고 불리는 폴리에틸렌글리콜화 조각)('PEG'는 폴리에틸렌글리콜이다).
이 명세서에서는 용어 '키메라 항체'가 재조합 DNA 기술을 이용해 특정 종(예: 마우스)의 모노클론 항체의 정상 영역의 아미노산 서열을 기타 종(예: 인간)의 항체의 정상 영역의 아미노산 서열으로 교체함으로써 얻어지는 재조합 항체를 의미한다.
이 명세서에서는 용어 '인간화 항체'가 재조합 DNA 기술을 이용해특정 종(예: 마우스)의 모노클론 항체의 정상 영역 및 가변 영역의 비-CDR(Fv 골격 영역(FR)) 아미노산 서열을 기타 종(예: 인간)의 항체의 정상 영역 및 가변 영역의 비-CDR아미노산 서열으로 모두 교체함으로써 얻어지는 재조합 항체를 의미한다. 다시 말해, 항체의 정상 영역은 인간화된 경우 키메라 항체라고 부르며, 정상 영역 및 가변 영역의 비-CDR 아미노산 서열은 모두 인간화된 경우 인간화 항체라고 부른다. 인간화 방법은 일반적인 항체공학 기술을 참고하여 수행할 수 있으며, 여기서는 반복되지 않는다.
뉴클레오티드에 대해 '동원성', '동일성' 또는 '유사성'이라는 용어는 두 개 이상의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 유사도를 기술하거나 비교하기 위해 이용된다. 제1서열과 제2서열 사이의 '서열 동원성' 비율은, 해당 위치에 대응하는 뉴클레오티드와 동일한 제1서열의 뉴클레오티드 수로 나눔으로 계산될 가능성이 있다. 제2서열 중의 뉴클레오티드에서 제1서열 중의 뉴클레오티드의 총수를 차감해 100%를 곱한다. 여기서, 제2서열 중의 각 뉴클레오티드의 결핍, 삽입, 치환 또는 추가는 제1서열에 대해 단일 뉴클레오티드(위치)상의 차이로 간주된다. 또는 표준 설정을 이용하면, 서열 대비에 사용되는 NCBI Blast v2.0 등 알려진 컴퓨터 알고리즘을 활용해 두 개 이상의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 정도를 계산할 수 있다. 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 기타 기술, 컴퓨터 알고리즘 및 설정은 예를 들어 WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 및 GB 2357768-A가 될 수 있다.
폴리 펩타이드에 대해 '(실질)동원성', '동일성' 또는 '유사성'이라는 용어는 최적 비교(적절히 뉴클레오티드를 삽입하거나 결핍한다) 경우 두 개 이상의 폴리 펩타이드 또는 그에 지정된 서열의 아미노산 유사도를 기술하거나 비교하기 위해 이용된다. 두 서열 간의 동원성 %는 최적 비교 경우 이 서열들이 공유하는 동일 위치의 수에 따라 변하며(즉, 동원성 % = 동일 위치의 수 χ 총 위치 수 Х 100), 앞서 말한 최적 비교는 두 서열의 최적 비교를 달성하기 위해 도입해야 하는 빈자리의 수 및 각 빈자리의 길이에 의해 결정된다. 두 서열 간의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 측정은 다음 내용의 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
본 명세서에서는 용어 '보수적 개질 형식의 아미노산 서열'이 그 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 항체 결합 특성에 현저한 영향 또는 변화를 주지 않는 아미노산 괴질을 의미하며, 그 개질은 아미노산의 치환, 추가 및 결핍을 포함한다. 예를 들어, 개질은 정점의 돌연변이 유도 및 PCR 매개의 돌연변이 유도 등 표준 기술을 통해 본 발명의 항체에 도입된다. 보수적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측사슬을 가진 아미노산 잔기로 치환하는 치환을 의미한다. 이 분야에서는 유사한 측사슬을 가진 아미노산 잔기의 족을 규명했다. 이들 족은 알칼리성 측사슬을 가진 아미노산(리신, 알기닌, 히스티딘 등), 산성 측사슬을 가진 아미노산(아스파라긴산, 글루타민산 등), 대전되지 않은 극성 측사슬을 가진 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 스레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판 등), 비극성 측사슬을 가진 아미노산(알라닌, 바린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 등), β-분지 측사슬을 가진 아미노산(스레오닌, 바린, 이소로이신 등) 및 방향족 측사슬을 가진 아미노산(티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 등)을 포함한다.
이 명세서에서 용어 '벡터'는 보통 적절한 숙주 내에 삽입되어 자체 복제가 가능한 핵산 분자를 의미하며, 삽입된 핵산 분자는 숙주 세포 내 및/혹은 숙주 세포 간으로 전환된다. 상기 벡터는 주로 DNA 또는 RNA를 세포에 삽입하기 위한 벡터, 주로 DNA 또는 RNA를 복제하기 위한 벡터, 및 주로 DNA 또는 RNA의 전사 및 또는 번역을 발현하기 위한 벡터를 포함할 가능성이 있다. 상기 벡터는 또한 여러 가지 이상의 기능을 갖는 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입될 때 전사되어 펩타이드로 번역된 폴리뉴클레오티드일 가능성이 있다. 일반적으로 해당 벡터를 포함한 적절한 숙주 세포를 배양함으로, 해당 벡터는 기대된 발현 산물을 생성할 수 있다.
본 명세서에서 '약물 종합물' 용어는 보통 단위 용량으로의 형태 의미하며, 제약 분야에서 알려진 방법 중 하나로 조제할 수 있다. 모든 방법에는 활성 성분을 하나 또는 여러 부속 성분으로 구성된 캐리어를 결합하는 스텝을 포함한다. 보통 활성 이중 특이성 항체를 액체 캐리어, 가늘고 조각난 고체 캐리어, 혹은 그 두 가지와 균일하게 충분히 혼합함으로 종합물을 조제한다.
본 명세서에서 용어 '약학적으로 허용되는 성분'은 인간 및/또는 포유동물에 적용했을 때 과도한 유해 부작용(독성, 자극, 알레르기 반응 등)이 없으며, 합리적인 이익/위험 비율을 갖는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 수용 가능한 부재료” 용어는 특정 목적의 제형에 적합한 모든 용매, 고형 부형제, 희석제, 기타 액체 부형제 등을 포함할 가능성이 있다. 본 발명의 이중 특이성 항체와 호환하지 않는 범위의 모든 일반적인 부재료, 예를 들어 모든 유해한 생물학적 효과를 발생하거나 약학적으로 허용되는 종합물의 기타 성분과 유해한 방식으로 상호작용하는 것을 제외하고, 그 용도도 본 발명의 검토 범위에 포함된다.
본 명세서에서 '투약' 용어는 정해진 양의 물질을 적절한 방법으로 환자에게 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 조각, 재조합 단백질, 이중 특이성 항체, 결합체 또는 약물 종합물은 예정된 조직에 도달할 수 있는 한, 임의의 일반적인 경로로 투약하 가능성이 있다. 투약의 다양한 방법은 예측 가능하며, 복막 주사, 정맥 주사, 근육 주사 및 피하 주사를 포함하지만 그것들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 종합물은 정맥주사 또는 피하주사로 투약한다.
본 명세서에서 용어 '치료'는 기대된 약리학적·및/또는 생리학적 효과의 획득을 위한 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 및 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 점에서 예방적이며, 및/또는 질병 및/또는 질병으로 인하는 유해 작용을 완전히 또는 부분적으로 치유하는 점에서 치료적일 가능성이 있다. 본 명세서에서 사용되는 '치료'는 포유동물, 특히 인간의 질병을 치료하는 것을 의미하며, 구체적으로 (a) 발병하기 쉬우나 아직 진단되지 않은 개체에서 질병 또는 병상의 발생을 예방하는 것; (b) 질병 억제, 예를 들어 질병 진행을 차단하는 것; 또는 (c) 질병 완화, 예를 들어 질병과 관련된 증상을 경감하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 '치료'는 개체 질병에 치료, 치유, 완화, 개선, 경감 또는 억제를 가하기 위해 약물 또는 이중 특이성 항체를 개체에 투여하는 모든 투약을 포함하며, 본 명세서에 기재된 이중 특이성 항체를 포함한 약물을 개체에 투여하는 것을 포함하지만, 이들을 제한하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바 용어 '유효 량' 또는 '유효 선량'은 사람 및 동물에게 기능 또는 활성을 제공하고, 그들이 받아들일 수 있는 양을 의미한다.
본 발명은 CD3 및 종양 타깃을 표적으로 하는 이중 특이성 항체, 핵산 분자, 벡터 또는 형질전환체, 세포, 약물 조합물, 키트 및 그 응용을 제공하며, 다음으로 그것들을 각각 자세히 설명한다.
이중 특이성 항체
본 발명은 이중 특이성 항체를 제공하다. 상기 이중 특이성 항체는 제1항원 결합 영역, 제2항원 결합 영역 및 Fc 부위를 포함한다. 상기 Fc 부위는 제1 Fc 펩타이드 및 제2 Fc 펩타이드를 포함하다. 상기 제1항원 결합 영역은 scFv 조각 및 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다. 상기 제2항원 결합 영역은 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다. 상기 제1분자는 상기 제2분자와 동일하며, 상기 scFv 조각은 CD3 결합 활성을 가지다.
본 발명의 실시 형태에 따른 이중 특이성 항체는 CD3및 종양 타깃을 결합할 수 있으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며 T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하며, PBMC로 인한 종양 세포의 말살 활성을 효과적으로 촉진하기에, 향상된 T세포 활성화 성능을 가지고 있어 약물을 말초나 림프 조직이 아니라 종양 부위에 분포시킬 수 있다. 이로써 본 발명의 이중 특이성 항체는 안전성이 좋아 항암 활성이 높기에 적용 및 약물 개발 가치가 높다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1분자 및 상기 제2분자는 MICA, PDL1, CD47, TIGIT, CD73, CD33, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, STING, WNT, Beta catenin, B7H3, VISITA, CD19, BCMA, CD22, CD20, CD123, CD38, CEA, CD25, CD46, CD138, PSCA, PSMA, PSA, MUC1, MUC16, NY-ESO-1, GD2, WT1, Mesothelin, MAGE-A3, GPC3, PRAME, Globo H, AFP, Trop2, FOLR1, SP, Sca-1, CD133또는 EPCAM에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1분자 및 상기 제2분자는 모두 MICA이다. 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 CD3및 MICA을 결합할 수 있으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하기 위해서, 해당 이중 특이성 항체는 T세포와의 결합 활성이 낮으며, 종양과의 결합 활성이 높으며, PBMC로 인한 종양 세포의 말살 활성을 효과적으로 촉진하기에 약물을 말초나 림프 조직이 아니라 종양 부위에 분포시킬 수 있다. 이로써 본 발명의 이중 특이성 항체는 안전성이 좋아 항암 활성이 높다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 결합 단백질 또는 그의 조각은 항체 또는 그의 항원 결합 조각, 수용체 및 리간드 중 최소 하나에서 선택된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제1 Fab 조각이며, 및/또는 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제2 Fab 조각이다.
설명이 필요한 것은, 본 발명의 아미노산 서열이 모두 N단에서 C단까지의 방향을 따라 표시된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며, 및/또는 상기 제2 Fab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제1 scFab 조각이며, 및/또는 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제2 scFab 조각이다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 제1 scFab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며, 및/또는 상기 제2 scFab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결된다.
본 발명의 실시 형태에 따른 이중 특이성 항체는 그의 scFv 조각기 구조상 제1 Fab 조각 또는 제1 scFb 조각에 잘 가려졌다. 이로써, 이중 특이성 항체는 CD3와의 결합 활성이 낮으며 T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하며 안전성이 좋다. 발명자의 예상을 넘어선 것은, 이 구조를 가진 이중 특이성 항체는 종양 세포와의 결합 활성이 확연히 향상되었다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 MICA 결합 활성을 가진다. 본 발명의 실시 형태에 따른 이중 특이성 항체는 그의 CD3 항원 결합 부위가 MICA 항원 결합 부위에 대한 친화력에 크게 영향을 주지 않는다. 따라서, 보다 바람직하게, MICA 항원 결합 부위는 높은 안전성과 높은 항암 활성을 가진 이중 특이성 항체를 얻기 위해, MICA 결합 능력이 높은 항MICA 항체의 항원 결합 조각으로 선택된다. 예를 들어, MICA 항원 결합 부위는 h5A1002 항체의 항원 결합 조각 Fab에서 선택된다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 제1 Fab 조각은 상기 제2 Fab 조각과 다르다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 제1 Fab 조각은 상기 제2 Fab 조각과 동일하다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 모두 제2중사슬 가변 영역 CDR1~3 및 제2경사슬 가변 영역 CDR1~3을 포함하며; 여기서,
제2중사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 7에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
제2중사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 8에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
제2중사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 9에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
제2경사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 10에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
제2경사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 11에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
제2경사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 12에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 CD3와의 결합 활성이 낮으며, T세포와 종양 세포를 연결하는 능력도 약하며, 종양 세포의 결합 활성이 높을 뿐만 아니라, PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 활성도 크게 강화된다.
설명이 필요한 것은, 본 발명의 중사슬 가변 영역 CDR 서열 또는 경사슬 가변 영역 CDR 서열 중 하나 또는 여러 아미노산 잔기는 같은 측사슬을 가진 족에서 유래한 기타 아미노산 잔기로 대체되며, 그 보유 기능은 본 명세서에서 설명한 기능 측정 방법을 이용해 변이된 항체를 검사할 수 있다. 보수적 개질 형식의 아미노산 서열의 개수는 1개 또는 2개를 초과하지 않는다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및/또는 상기 제 2 Fab 조각은 제2중사슬 프레임워크 영역 및/또는 제2경사슬 프레임워크 영역을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제2중사슬 프레임워크 영역 및/또는 상기 제2경사슬 프레임워크 영역의 최소 일부는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체, 영장류 유래 항체, 소 유래 항체, 말 유래 항체, 젖소 유래 항체, 돼지 유래 항체, 양 유래 항체, 산양 유래 항체, 개 유래 항체, 고양이 유래 항체, 토끼 유래 항체, 낙타 유래 항체, 당나귀 유래 항체, 사슴 유래 항체, 밍크 유래 항체, 닭 유래 항체, 오리 유래 항체, 거위 유래 항체, 칠면조 유래 항체, 투계 유래 항체 및 그것들의 변체 중 최소 하나에 유래하며, 바람직하게는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체 및 영장류 유래 항체 중 최소 하나에 유래한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 각각 독립적으로 SEQ ID NO:29에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제2중사슬 가변 영역, 및 SEQ ID NO:30에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제2경사슬 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및/또는 상기 제2 Fab 조각은 또한 CH1 조각 및 CL 조각을 포함하며, 여기서 상기 제2중사슬 가변 영역의 C 단은 상기 CH1 조각의 N 단에 연결되며, 상기 제2경사슬 가변 영역의 C 단은 상기 CL 조각의 N 단에 연결되며, 상기 CH1 조각은 사슬간 이황결합으로 상기 CL 조각에 연결된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 각각 독립적으로 SEQ ID NO: 31에 표시된 아미노산 서열을 가진 상기 제2중사슬 가변 영역 및 CH1 조각, 및 SEQ ID NO: 32에 표시된 아미노산 서열을 가진 상기 제2경사슬 가변 영역 및 CL 조각을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 scFv 조각은 제1중사슬 가변 영역 CDR1~3 및 제1경사슬 가변 영역 CDR1~3을 포함하며; 여기서,
제1중사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 1에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
제1중사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 2에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
제1중사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 3에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
제1경사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 4에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
제1경사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 5에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
제1경사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 6에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 scFv 조각이 상기 CDRs 아미노산 서열을 가지는 경우, CD3 결합 활성을 크게 낮추어 종양 세포 결합 능력을 크게 강화하며, 또한 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 활성을 높인다. 이를 통해 항암 효과와 안전성이 더욱 향상된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 scFv 조각은 제1중사슬 프레임워크 영역 및/또는 제1경사슬 프레임워크 영역을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1중사슬 프레임워크 영역 및/또는 상기 제1경사슬 프레임워크 영역의 최소 일부는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체, 영장류 유래 항체, 소 유래 항체, 말 유래 항체, 젖소 유래 항체, 돼지 유래 항체, 양 유래 항체, 산양 유래 항체, 개 유래 항체, 고양이 유래 항체, 토끼 유래 항체, 낙타 유래 항체, 당나귀 유래 항체, 사슴 유래 항체, 밍크 유래 항체, 닭 유래 항체, 오리 유래 항체, 거위 유래 항체, 칠면조 유래 항체, 투계 유래 항체 및 그것들의 변체 중 최소 하나에 유래하며, 바람직하게는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체 및 영장류 유래 항체 중 최소 하나에 유래한다.
설명이 필요한 것은, 본 명세서에 기재된 면역글로불린은 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA), 분류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) 또는 하위류의 면역글로불린 분자이며, 변경된 Fc 부위를 가진 공학화 하위류를 포함할 가능성이 있으며, 감소하거나 강화된 효과를 가진 세포 활성을 제공한다. 면역글로불린은 임의의 물종에서 유래했을 가능성이 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 scFv 조각은 SEQ ID NO:33에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제1중사슬 가변 영역, 및 SEQ ID NO:34에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제1경사슬 가변 영역을 포함한다.
설명이 필요한 것은, 본 발명의 중사슬 가변 영역 또는 경사슬 가변 영역 중 하나 또는 여러 아미노산 잔기는 같은 측사슬을 가진 족에서 유래한 기타 아미노산 잔기로 대체되며, 그 보유 기능은 본 명세서에서 설명한 기능 측정 방법을 이용해 변이된 항체를 검사할 수 있다. 보수적 개질 형식의 아미노산 서열의 개수는 1개 또는 2개를 초과하지 않는다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 scFv 조각은 또한 연결 펩타이드 1를 포함하며; 여기서, 상기 연결 펩타이드 1의 N단은 상기 제1중사슬 가변 영역의 C단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 1의 C단은 상기 제1경사슬 가변 영역의 N단에 연결된다. 또는, 상기 연결 펩타이드 1의 N단은 상기 제1경사슬 가변 영역의 C단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 1의 C단은 상기 제1중사슬 가변 영역의 N단에 연결된다.
상기 연결 펩타이드 1는 (GGGGS)n에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 여기서 n은 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 연결 펩타이드 1는 SEQ ID NO: 11에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 scFv 조각은 SEQ ID NO: 36 또는 37에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1항원 결합 영역은 또한 연결 펩타이드 2를 포함하며; 여기서, 상기 제1 Fab 조각의 CH1의 C단은 상기 연결 펩타이드 2의 N단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 2의 C단은 상기 scFv 조각의 N단에 연결된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 연결 펩타이드 2는 (GGGGS)n에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 여기서 n은 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 연결 펩타이드 2은 SEQ ID NO: 36 또는 37에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fc 펩타이드는 knob-into-hole 구조를 통해 상기 제2 Fc 펩타이드에 연결된다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fc 펩타이드 및 상기 제2 Fc 펩타이드는 모두 인간 Fc 펩타이드다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 인간 Fc 펩타이드는 인간 IgG1 Fc 펩타이드다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 제1 Fc 펩타이드는 SEQ ID NO: 38에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 Fc 펩타이드는 SEQ ID NO: 39 또는 40에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 이중 특이성 항체는
SEQ ID NO: 13, 18, 19, 22, 25 또는 28에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬;
SEQ ID NO: 14, 20, 23 또는 26에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬;
SEQ ID NO: 15, 21, 24 또는 27에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬; 및
SEQ ID NO: 15, 21, 24 또는 27에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.
설명이 필요한 것은, 이중 특이성 항체의 CD3 및 MICA 결합 활성(최소 95%의 활성을 유지)에 실질적으로 영향을 주지 않는 전제 하에서, 해당 기술분야의 기술자는 본 발명의 이중 특이성 항체에 포함된 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열에 1개 또는 다수(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상)의 아미노산의 치환, 추가, 및/또는 결핍을 가함으로써, 해당 이중 특이성 항체의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열의 변체를 얻을 가능성이 있다. 그 변체들은 본 발명의 보호 범위에 포함되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 사슬에서 유사한 성질을 가진 아미노산을 치환한다. 본 발명의 앞서 언급된 변체의 아미노산 서열은 기준이 되는 아미노산 서열과 최소 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성(또는 동원성)을 가지고 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 이중 특이성 항체는
SEQ ID NO: 13에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
SEQ ID NO: 18에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
SEQ ID NO: 19에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
SEQ ID NO: 22에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 20에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 21에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 21에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
SEQ ID NO: 25에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 23에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 24에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 24에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
SEQ ID NO: 28에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 26에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 27에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 27에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.
핵산
본 발명은 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 조각을 인코딩한다. 상기 핵산 분자는 상기 이중 특이성 항체를 인코딩한다. 본 발명의 실시 형태에 따른 핵산 분자는 CD3 및 종양 타깃을 동시에 표적으로 할 수 있는 이중 특이성 항체를 인코딩할 수 있다.
설명이 필요한 것은, 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 대해, 해당 기술분야의 기술자는 실제로 상호 보완적 이중사슬 중 하나 또는 양쪽을 포함하고 있음을 이해해야 한다. 편리함을 위해 이 명세서에서는 대부분 한 개의 사슬만 제시하지만, 실제로 그것과 보완하는 또 기타 사슬도 공개되어 있다. 게다가, 본 발명에 기재된 분자의 아미노산 서열은 DNA 형태 또는 RNA 형태를 포함하고, 한쪽을 공개하는 것은 기타 쪽도 공개한다는 의미이다.
벡터 또는 형질전환체
본 발명은 벡터 또는 형질전환체를 제공한다. 상가 벡터 또는 형질전환체는 상기 핵산을 포함한다. 본 발명의 실시 형태에 따른 벡터 또는 형질전환체는 선택 가능한 제어 서열을 포함할 가능성이 있으며, 예를 들어 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자에 조작 가능으로 연결된다. 상기 제어 서열은 상기 핵산 분자가 숙주 내에서 발현하도록 유도하는 하나 또는 여러 개의 제어 서열이다. 이를 통해 구축된 벡터 또는 형질전환체는 상기 이중 특이성 항체를 효과적으로 발현할 수 있다.
상기 핵산 분자를 상기 벡터 또는 형질전환체, 예를 들어 발현 벡터에 연결할 때, 제어 요소가 해당 핵산 분자의 번역 및 발현 등을 제어할 수 있는 한, 해당 핵산 분자를 발현 벡터상의 해당 제어 요소에 직접 또는 간접적으로 연결할 수 있다. 물론, 상기 제어 요소는 벡터 자체에 직접적으로 유래하거나 외부 요인에 의한 것이며, 즉 벡터 자체에 유래한 것이 아닐 가능성도 있다. 해당 핵산 분자는 제어 요소를 조작 가능으로 연결할 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 벡터는 클로닝 벡터를 의미하거나 발현 벡터를 의미하며, 상기 핵산을 시판되는 벡터(플라스미드, 바이러스 벡터 등)에 조작 가능으로 연결함으로써 얻어질 가능성이 있다. 본 발명 중의 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 pSeTag2, PEE14, pMH3 등 자주 사용되는 플라스미드를 모두 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "조작 가능으로 연결"은 외래 유전자를 벡터에 연결하고, 예를 들어 전사 제어의 아미노산 서열이나 번역 제어의 아미노산 서열 등 벡터 내의 제어 요소가 외래 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 예상 기능을 발휘할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 자주 사용되는 유전자는 바이러스 유전자, 플라스미드, 박테리오파지 등이 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 발현 벡터를 적절한 수용 세포에 도입한 뒤, 조절 시스템을 매개로 상기 핵산 분자의 발현을 효과적으로 구현하고, 나아가 상기 핵산 분자에 인코딩된 단백질을 체외에서 대량으로 획득할 수 있도록 한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 벡터는 진핵 벡터 또는 원핵 벡터이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아데노연관바이러스 벡터 중 최소 하나를 포함한다.
세포
본 발명은 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 핵산 또는 상기 벡터 또는 형질전환체를 휴대하거나, 상기 이중 특이성 항체를 발현시킨다. 본 발명의 실시 형태에 따른 상기 세포는 상기 벡터 또는 형질전환체에 유전자를 도입하거나 전환을 함으로써 얻어지며, 상기 세포는 적합한 조건 하에서 상기 이중 특이성 항체를 고효율로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 세포는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 박테리오파지이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 원핵 세포는 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스 또는 기이 변형균이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 진핵 세포는 균류, 곤충세포, 식물세포 또는 포유류세포이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 진균은 파스퇴르·피치 효모, 양조 효모, 출아 효모 또는 트리코델마이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 곤충 세포는 초지 점착벌레 세포이다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 식물 세포는 담배 식물의 세포이다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 포유동물 세포는 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포 또는 인간 배아 신장 293세포이며, 동물의 생식 세포, 수정란 또는 배아줄기세포를 포함하지 않는다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 세포는 BHK 세포, CHO 세포, COS 세포 또는 NSO 세포이다.
설명이 필요한 것은, 본 명세서에 기재된 "적합한 조건”은 본 출원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 조각의 발현에 적합한 조건을 의미한다. 해당 기술분야의 기술자가 이해하기 쉬운 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 조각의 발현에 적합한 조건은 유전자를 도입하거나 전환을 하는 적절한 방식, 유전자를 도입하거나 전환을 하는 적절한 조건, 건강한 숙주 세포의 상태, 적절한 숙주 세포 밀도, 적절한 세포 배양 환경, 적절한 세포 배양 시간을 포함하지만, 그것들에 한정되지 않는다. ‘적합한 조건'은 특별히 제한되지 않으며, 해당 기술분야의 기술자는 실험실의 구체적인 환경에 근거하여 상기 재조합 항체의 발현 조건을 최적화할 수 있다.
약물 종합물
본 발명은 약물 종합물을 제공한다. 상기 약물 종합물은 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산, 상기 벡터 또는 형질전환체 또는 상기 세포를 포함한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 이중 특이성 항체는 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 효과적으로 촉진해 항암 활성이 높으며, CD3와의 결합 활성이 낮으며 안전성이 뛰어나다. 이로써 얻은 약물은 CD3 및/또는 종양 타깃이 매개하는 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 더 나아가 활용될 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 약물 종합물은 또한 약학적으로 허용되는 부재료를 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 부재료는 약학적으로 허용되는 1종 이상의 부형제, 희석제, 안정제 또는 캐리어를 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 약물 종합물은 주사제이다.
설명이 필요한 것은, 상기 약물 종합물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 공동으로 작용하는 한, 시간적·및/또는 공간적으로 분리된 조합을 포함한다. 예를 들어, 종합물에 포함된 성분은 전체적으로 피험자에게 투여되거나, 나누어 피험자에게 투여될 가능성이 있다. 해당 종합물에 포함된 성분을 나누어 피험자에게 투여할 경우, 각 성분은 동시에 혹은 순차적으로 피험자에게 투여될 가능성이 있다.
본 발명의 약물은 안전한 및 유효한 양을 가진 본 발명의 활성 성분 및 약학적으로 허용되는 부재료를 포함한다. 이러한 부재료는 염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만, 그것들에 한정되지 않는다. 일반적으로 약물의 제형은 투약 방법에 맞추어야 하며, 본 발명의 약물의 제형은 주사제, 경구제(정제, 캡슐, 경구액), 경피제 또는 서방형제이다. 예를 들어, 부재료는 생리식염수 또는 포도당 및 기타 보조제를 포함한 수용액을 사용해 일반적인 방법으로 제조된다. 상기 약물은 무균 조건 하에서 제조되기에 적당하다.
본 발명에 기재된 활성 성분의 유효한 량은 투여 방법 및 치료 대상 질병의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 유효한 량의 선택은 다양한 요인에 근거하여 해당 기술분야의 기술자에 결정될 가능성이 있다(예를 들어, 임상실험을 통해). 상기 요인은 활성 성분의 약물동태학 파라미터(예를 들어 생체 이용률, 대사, 반감기 등), 환자에게 치료가 필요한 질병의 중증도, 환자의 체중, 환자의 면역 상태, 투여 경로 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황에 따라 급박한 요구가 있을 경우, 투여량을 매일 여러 차례에 나누어 투여하거나 투여량을 비례적으로 줄일 가능성이 있다.
본 발명에 기재된 약학적으로 허용되는 부재료는 물, 식염수, 리포솜, 리피드, 단백질, 단백질-항체 접합체, 펩타이드류 물질, 셀룰로오스, 나노겔 또는 그것들의 조합을 포함하지만 그것들에 국한되지 않는다. 캐리어의 선택은 투약 방법과 일치해야 하며, 이는 해당 기술분야의 기술자에게 널리 알려진 사실이다.
키트
본 발명은 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체 또는 상기 세포를 포함한다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 키트는 CD3 및/또는 종양 타깃을 결합해 CD3 및/또는 종양 타깃을 효과적으로 감별할 수 있다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 이 키트에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 종양 타깃은 MICA이다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 이중 특이성 항체가 CD3 및 MICA에 특이적으로 결합할 수 있다는 특성을 이용하여 개발된 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질과 관련된 키트는 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질에 관한 연구에 응용될 가능성이 있으며, 예를 들어 인간 또는 기타 포유류의 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질의 검출 및/또는 축적 및/또는 분리 순화에 응용됩니다. 상기 키트는 생물 시료 내의 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질을 유효하게 검출하거나 축적하거나 분리 순화할 수 있으며, 더 나아가 과학 연구에 응용되며, 예를 들어 생물 시료 내의 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질 분자를 정성 또는 정량으로 검출함에 응용된다. 보다 구체적으로, 상기 키트는 면역 블롯팅, 면역 침전 등 CD3 단백질 및/또는 MICA 단백질과 항체 간의 특이적 결합 성능을 이용하여 검출을 수행함 등에 응용된다. 이들 키트는 길항제, 본 발명의 이중 특이성 항체 또는 의약품의 참조 재료, 단백질 순화 컬럼, 면역글로불린을 친화 순화하기 위한 완충제 및 세포를 측정하기 위한 희석제 중 어느 하나 또는 여러 개를 포함한다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 다양한 종류의 진단 검사에 응용되며, 예를 들어 체외 또는 체내에서 다양한 질병이 또는 약물, 독소, 기타 단백질 등의 존재를 검출함에 활용될 수 있다. 예를 들어, 피험자의 혈청 또는 혈액을 검사함으로써 CD3 및/또는 MICA이 매개하는 질병을 검사할 수 있다.
키트의 제조를 위한 용도
본 발명은 키트의 제조를 위한 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 또는 상기 세포의 용도를 제공하며, 상기 키트는 CD3 및/또는 종양 타깃의 검출에 사용된다.
본 발명의 약간의 실시 형태에서, 상기 종양 타깃은 MICA이다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 이 키트의 제조를 위한 용도에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
약물의 제조를 위한 용도
본 발명은 약물의 제조를 위한 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물의 용도를 제공하며, 상기 약물은 CD3 및/또는 종양 타깃이 매개하는 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 활용된다.
해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물에 대해 기재된 특징 및 장점은 동일하게 이 용도에도 적용되며, 여기서는 반복되지 않는다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 CD3 이 매개하는 관련 질병은 자가면역성 질병을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 자가면역성 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스 관절염, 전신성 혈관염, 경피증, 피부근염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역성 질병, 궤양성 대장염, 만성 림프구성 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존형 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 악성 빈혈을 동반한 만성 위축성 위염, 폐출혈 신염 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 원발성 담즙성 간경변, 다발성 뇌척수경화증 및 급성 특발성 다신경염 중 최소 하나을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 종양 타깃은 MICA이다. 본 발명의 실시 형태에 따른 이중 특이성 항체 및 핵산, 벡터 또는 형질전환체, 또는 약물 종합물을 사용하여 약물을 제조할 수 있으며, 그 약물은 임상에서 CD3 및/또는 MICA이 매개하는 질병의 예방 및/또는 치료에 활용될 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 MICA 이 매개하는 관련 질병은 암, 이식 거부에 기인한 질병, 자가면역 질병 및 감염성 질병이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 대장암, 유방암, 신경교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평상피암 및 두경부암 중 최소 하나를 포함한다.
질병 치료 방법
본 발명은 CD3 및/또는 MICA이 매개하는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 방법은 피험자에게 약학적으로 허용되는 양의 상기 이중 특이성 항체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 형질전환체, 상기 세포 또는 상기 약물 종합물을 투여하는 것을 포함한다.
설명이 필요한 것은, 용어 '피험자', '개체' 및 '환자'는 이 명세서에서 상호 호환적으로 사용될 가능성이 있으며, 치료평가 및/또는 치료 대상이 되는 포유류 동물을 의미한다. 특정 시행 상황에서는 포유류 동물이 인간이다. 용어 '피험자', '개체' 및 '환자'는 암을 앓고 있는 개체, 자신의 면역 질병을 앓고 있는 개체, 병원체 감염을 앓고 있는 개체 등을 포함하지만, 그것들에 한정되지 않는다. 피험자는 인간 외에 기타 포유류 동물을 포함할 가능성이 있다. 특히 인간 질병의 실험 모델로 활용할 수 있는 포유류 동물, 예를 들어 마우스나 랫드 등이다.
본 발명에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 조각, 핵산, 벡터 또는 형질전환체, 또는 약물 종합물의 유효한 량은 투여 방법 및 치료 대상 질병의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 유효한 량의 선택은 다양한 요인에 근거하여 해당 기술분야의 기술자에 결정될 가능성이 있다(예를 들어, 임상실험을 통해). 상기 요인은 활성 성분의 약물동태학 파라미터(예를 들어 생체 이용률, 대사, 반감기 등), 환자에게 치료가 필요한 질병의 중증도, 환자의 체중, 환자의 면역 상태, 투여 경로 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 치료 상황에 따라 급박한 요구가 있을 경우, 투여량을 매일 여러 차례에 나누어 투여하거나 투여량을 비례적으로 줄일 가능성이 있다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 CD3 이 매개하는 관련 질병은 자가면역성 질병을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 자가면역성 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스 관절염, 전신성 혈관염, 경피증, 피부근염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역성 질병, 궤양성 대장염, 만성 림프구성 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존형 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 악성 빈혈을 동반한 만성 위축성 위염, 폐출혈 신염 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 원발성 담즙성 간경변, 다발성 뇌척수경화증 및 급성 특발성 다신경염 중 최소 하나를 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 종양 타깃은 MICA이다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 MICA 이 매개하는 관련 질병은 암, 이식 거부에 기인한 질병, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따라, 상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 대장암, 유방암, 신경교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평상피암 및 두경부암 중 최소 하나를 포함한다.
본 발명과 관련된 아미노산 서열에 대한 설명을 표 1에 제시한다.
아미노산 서열에 대한 설명의 표
SEQ ID NO: 서열 설명
1 GFTFNTYA Cross3 HCDR1
2 IRSKYNNYAT Cross3 HCDR2
3 VRHGNFGNSYVSWFAY Cross3 HCDR3
4 TGAVTTSNY Cross3 LCDR1
5 GTN Cross3 LCDR2
6 ALWYSNLWV Cross3 LCDR3
7 GFSLTTYGG h5A1002 HCDR1
8 IWTDGWT h5A1002 HCDR2
9 ARKGHGYYYAMDY h5A1002 HCDR3
10 SSVSSSY h5A1002 LCDR1
11 STSNLI h5A1002 LCDR2
12 HQYHRSPFT h5A1002 LCDR3
13 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK h5A1002-Cross3-kbss
14 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK h5A1002-hoss
15 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC h5A1002-hK
16 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Cross3-kbss
17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK UCHT1-kbss
18 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK h5A1002-UCHT1-kbss
19 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTITGAQAEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK h5A1002-SP34-kbss
20 EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSQNIYWVRQAPGQGLEWIGYIEPYNVVPMYNPKFKGRATLTVDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARSGSSNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 1D5-hoss
21 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSISSHYLHWYQQKPGKSPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSLPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 1D5-hK
22 EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTSQNIYWVRQAPGQGLEWIGYIEPYNVVPMYNPKFKGRATLTVDKSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARSGSSNFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 1D5-Cross3-kbss
23 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWIGAINPGSGATNYNEKFKDRATLTADKSTNTAYLELSSLRSEDTAVYFCARFLGNYFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 13A9-hoss
24 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHSYLAWYQQKPGKSPKLLVYYAETLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQFWTTPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 13A9-hK
25 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQGLEWIGAINPGSGATNYNEKFKDRATLTADKSTNTAYLELSSLRSEDTAVYFCARFLGNYFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 13A9-Cross3-kbss
26 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVSYISPGGDYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTDRRHYGSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 619-hoss
27 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNLNTYLYWFLQKPGQSPQILIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGPGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 619-hK
28 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWIRQAPGKGLEWVSYISPGGDYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTDRRHYGSYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 619-Cross3-kbss
29 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSS h5A1002 VH
30 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIK h5A1002 VL
31 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTTYGGHWIRQPPGKGLEWIGMIWTDGWTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGHGYYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE h5A1002 Fab VH-CH1
32 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC h5A1002 Fab VL-CL
33 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS Cross3 VH
34 ELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL Cross3 VL
35 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL Cross3 scFv
36 GGGGS 연결 펩타이드
37 GGGGSGGGGSGGGGS 연결 펩타이드
38 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 제1 Fc 펩타이드
39 PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 제2 Fc 펩타이드(MICA 항체가 Fab 또는 scFab 구조일 때)
40 PKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 제2 Fc 펩타이드(MICA 항체가 scFv 구조일 때)
다음 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명한다. 실시예 또는 실험예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 모두 일반 조건에 따라 진행된다.다음 실시예와 함께 본 발명의 방안을 설명한다. 해당 기술분야의 기술자가 이해할 수 있는바, 다음 내용의 실시예는 본 발명만을 설명하고, 본 발명의 범위를 제한한다고 보지 않는다. 실시예에 구체적인 기술 또는 조건을 명시하지 않은 경우에는, 해당 분야의 문헌에 기재된 기술 또는 조건 또는 제품 사용 설명서를 참고하여 이해한다. 사용되는 시약 또는 기구는 제조사를 명시하지 않은 경우 모두 시판을 통해 구매할 수 있는 일반적인 제품으로 간주된다.
실시예 1: 항체의 제조
항체의 제조에 관한 구체적인 실험 조작은 다음과 같다. (1) ExpiCHO Expression Medium배양기(Thermo Fisher에서 구입)를 사용해 ExpiCHO 세포(Thermo Fisher에서 구입)를 배양하고, 세포 농도를 6Х106/mL로 조정하여 ExpiCHO 세포 용액을 얻는다. (2) 이중 항체가 A 구조 인 경우(도 1), CD3 항체, MICA 항체 중사슬 및 MICA 항체 경사슬을 포함한 pcDNA3.4 벡터(南京金斯瑞에 의뢰해 합성)를 1:1:1 비율로 2mL의 OptiSFM 배양기(Thermo Fisher에서 구입)에 첨가해 용액 a를 얻는다. 또는 이중 항체가 B 구조 인 경우(도 1), MICA 중사슬-CD3 항체, MICA 항체 중사슬 및 MICA 항체 경사슬을 포함한 pcDNA3.4 벡터(南京金斯瑞에 의뢰해 합성)를 1:1:1 비율로 2mL OptiSFM 배양기(Thermo Fisher에서 구입)에 첨가해 용액 a를 얻는다. (3) 160μL의 ExpiFectamine CHO 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher에서 구입)을 2mL의 OptiSFM 배양기(Thermo Fisher에서 구입)에 첨가해, 용액 b를 얻는다. (4) 다음, 용액 a를 용액 b와 혼합해 트랜스펙션 혼합물을 획득하며, 5분간 이내에 그 트랜스펙션 혼합물을 50mL의 ExpiCHO 세포 용액에 모두 첨가한다. (5) 37℃ 및 5% CO2조건에서 1일간 배양한 뒤, 8mL Feed 및 300μL Enhancer (Thermo Fisher에서 구입)를 첨가하고, 32℃·및 5% CO2조건으로 바꾸어 9일간 배양한 뒤 배양 상층액을 수확한다. 그 사이에 5일째에 8mL의 사료를 첨가한다. (6) Protein A 순화 컬럼(納微에서 구입)을 사용해 배양 상층액을 친화 순화해 목표 항체를 얻는다.
본 실시예에서 총11종류의 CD3 및 MICA 이중 특이성 항체를 제조함으로써 본 발명의 이중 특이성 항체의 각종 성능을 검토한다. 각 항체의 구조 및 아미노산 서열에 대한 설명은 그림 1, 표 1 및 표 2를 참고하십시오.
실시예 1의 이중 특이성 항체의 구조 및 이에 대응하는 아미노산 서열
항체 이름 항체의 구조 제1항원 결합 영역 제2항원 결합 영역
Cross3Хh5A1002 1:1 A SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
Cross3Хh5A1002 2:1 B SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 15		 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
UCHT1Хh5A1002 1:1 A SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
UCHT1Хh5A1002 2:1 B SEQ ID NO: 18
SEQ ID NO: 15		 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
SP34Хh5A1002 2:1 B SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 15		 SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
Cross3Х1D5 1:1 A SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 21
Cross3Х1D5 2:1 B SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 21		 SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 21
Cross3Х13A9 1:1 A SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
Cross3Х13A9 2:1 B SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 24		 SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
Cross3Х619 1:1 A SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 26
SEQ ID NO: 27
Cross3Х619 2:1 B SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 27		 SEQ ID NO: 26
SEQ ID NO: 27
비고: A, B류 항체의 구조는 도 1을 참고하십시오.Cross3Хh5A1002 1:1의 CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 16에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다.
Cross3Хh5A1002 2:1의 MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 13에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다.
UCHT1Хh5A1002 1:1의 CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 17에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다.
UCHT1Хh5A1002 2:1의MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 18에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다.
SP34Хh5A1002 2:1의MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 19에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다.
Cross3Х1D5 1:1의CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 16에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 20에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 21에 보여준다.
Cross3Х1D5 2:1의MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 22에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 20에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 21에 보여준다.
Cross3Х13A9 1:1의CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 16에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 23에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 24에 보여준다.
Cross3Х13A9 2:1의MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 25에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 23에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 24에 보여준다.
Cross3Х619 1:1의CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 16에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 26에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 27에 보여준다.
Cross3Х619 2:1의MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 28에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 26에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 27에 보여준다.
실시예 2: 본 발명의 항체 ELISA 결합 실험
ELISA 실험은 이중 특이성 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 이용된다. 항원 단백질을 96공 플레이트에 첨가하고, 항체를 넣은 후 신호 강도를 통해 이중 특이성 항체와 항원 단백질 간의 결합 특성을 판단한다.
(1) PBS 완충액을 사용해 MICA-His 단백질(Acro에서 구입)을 2μg/ml로 희석하고, 96공 플레이트의 각 공에 100μl씩 넣어 4℃에서 하룻밤 두었다. 96공 플레이트 내부의 PBS 완충액을 흡수한 뒤, PBST (pH 7.2의 PBS가 0.1%Tween 20를 함유한다)완충액으로 6회 세척한 뒤, 각 공에 200μl씩 PBS/10% BSA를 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 배양하여 폐쇄를 수행한다. 폐쇄액을 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6회 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩 PBST/0.05% BSA로 경사도로 희석된(최고 농도 20μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석) 측정 대상인 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1, 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 배양한다. 반응계를 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩, PBST/0.05% BSA로 희석된, HRP(호스라디시 과산화효소)로 표시된 항인간 IgG 항체 이차항체(Jacksonlab에서 구입)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 배양한다. 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 80μl씩 TMB(테트라메틸벤지진)를 첨가한 뒤, 실온에서 3분간 배양한 뒤, 각 공에 80μl씩 4M 황산을 넣어 반응을 멈춘다. 효소 표시 장치를 이용해 450nm에서 흡광값을 읽어낸다.
결과는 도 2에 표시된 대로이다. Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체는 모두 MICA 단백질을 결합할 수 있으며, 결합 능력은 서로 동일하다.
(2) PBS 완충액을 사용해 CD3E&D 단백질(Acro에서 구입)을 2μg/ml로 희석하고, 96공 플레이트의 각 공에 100μl씩 넣어 4℃에서 하룻밤 두었다. 96공 플레이트 내부의 PBS 완충액을 흡수한 뒤, PBST (pH 7.2의 PBS가 0.1% Tween 20를 함유한다)완충액으로 6회 세척한 뒤, 각 공에 200μl씩 PBS/10% BSA를 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 배양하여 폐쇄를 수행한다. 폐쇄액을 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6회 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩 PBST/0.05% BSA로 경사도로 희석된(최고 농도 20μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석) 측정 대상인 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1, 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 배양한다. 반응계를 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩, PBST/0.05% BSA로 희석된, HRP(호스라디시 과산화효소)로 표시된 항인간 IgG 항체 이차항체(Southern biotech에서 구입)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 배양한다. 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 80μl씩 TMB(테트라메틸벤지진)를 첨가한 뒤, 실온에서 3분간 배양한 뒤, 각 공에 80μl씩 4M 황산을 넣어 반응을 멈춘다. 효소 표시 장치를 이용해 450nm에서 흡광값을 읽어낸다.
결과는 도 3에 표시된 대로이다. Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체는 모두 CD3E&D 단백질을 결합할 수 있으며, Cross3Хh5A1002 2:1과 CD3E&D와의 결합 능력이 Cross3Хh5A1002 1:1보다 약하고, 게다가 Cross3Хh5A1002 2:1 항체와 CD3와의 결합 활성이 가장 약하다.
앞의 실험 결과는 이중 특이성 항체의 구조를 조정한 후(도 1, 구조B), 항 CD3 항체의 항원 결합 조각이 구조적으로 잘 가리어 CD3와의 결합 능력이 감소했음을 보여준다.
실시예 3: 항체 ELISA 연결 실험
ELISA 실험은 이중 특이성 항체의 연결 특성을 검출하기 위해 이용된다. CD3E&D항원 단백질을 96공 플레이트에 첨가하고, 항체를 넣은 후, 비오틴에 표시된 MICA 단백질을 사용하여, 신호 강도를 통해 이중 특이성 항체가 CD3E&D 단백질을 MICA 단백질과 연결하는 결합 특성을 판단한다.
PBS 완충액을 사용해 MICA-His 단백질(Acro에서 구입)을 2μg/ml로 희석하고, 96공 플레이트의 각 공에 100μl씩 넣어 4℃에서 하룻밤 두었다. 96공 플레이트 내부의 PBS 완충액을 흡수한 뒤, PBST (pH 7.2의 PBS가 0.1% Tween 20를 함유한다)완충액으로 6회 세척한 뒤, 각 공에 200μl씩 PBS/10% BSA를 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 배양하여 폐쇄를 수행한다. 폐쇄액을 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6회 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩 PBST/0.05% BSA로 경사도로 희석된(최고 농도 20μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석) 측정 대상인 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1, 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 배양한다. 반응계를 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 적절한 농도로 희석된 MICA*002α3-Fc-Biotin을 첨가한 뒤, 37℃에서 1시간 배양한다. 반응계를 제거한 뒤, 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 100μl씩, PBST/0.05% BSA로 희석된, HRP(호스라디시 과산화효소)로 표시된 Streptavidin 이차항체(Southern biotech에서 구입)를 첨가하여, 37℃에서 1시간 배양한다. 플레이트를 PBST로 6번 세척한 뒤, 각 공에 80μl씩 TMB(테트라메틸벤지진)를 첨가한 뒤, 실온에서 3분간 배양한 뒤, 각 공에 80μl씩 4M 황산을 넣어 반응을 멈춘다. 효소 표시 장치를 이용해 450nm에서 흡광값을 읽어낸다.
결과는 도 4에 표시된 대로이다. Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체는 모두 CD3E&D 단백질을 MICA단백질과 연결할 수 있으며, Cross3Хh5A1002 2:1의 연결 능력이 Cross3Хh5A1002 1:1보다 약하고, 게다가 Cross3Хh5A1002 2:1의 연결 능력이 가장 약하다.
도 2 및 도 3의 결과 분석에 따르면, Cross3Хh5A1002 2:1 항체의 연결 능력이 낮은 것은 Cross3Хh5A1002 2:1 항체와 CD3와의 친화성이 낮기 때문이다.
실시예 4: 세포 유동 분석을 이용한 항체의 결합 실험
세포 유동 분석 실험은 이중 특이성 항체의 결합 특성을 검출하기 위해 이용된다. 세포에 이중 특이성 항체를 첨가하고, 항체를 넣은 뒤 신호 강도를 통해 항체와 세포 간의 결합 특성을 판단한다.
(1) PBS를 사용해 PBMC를 2Х106/ml로 희석한 뒤, 100μl 부피의 관을 사용해 1.5ml EP 튜브에 넣고, 그 안에 산양 혈청(100μl/튜브)을 첨가한 뒤, 4℃에서 30분간 폐쇄한다. 경사도로 희석된 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 1:1, UCT1Хh5A1002 2:1, 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 첨가한 뒤, 4℃에서 30분간 배양한다. EP튜브에 1ml의 PBS를 넣고, 4℃에서 3500rpm으로 5분간 원심분리한 뒤, 상층액을 버린 뒤, 다시 PBS로 한 번 세척한다. 원심분리 후 상청액을 모두 버린 뒤, PBS(100μl/튜브)로 세포를 현탁시킨 뒤, 그 안에 Alexa-647(1μl/튜브)에 표시된 산양 항 인간 IgG 이차항체(Jackson lab에서 구입) 및 PerCP-Cy5.5(0.5μl/튜브)에 표시된 항인간 CD8 항체를 첨가한 뒤, 4℃에서 차광 하에 30분간 배양한다. PBS로 두 번 세척한 뒤, 원심분리 후 상청액을 모두 버린 뒤, PBS(200μl/튜브)로 세포를 현탁시킨 뒤, 세포 유동 분석기로 검사를 실시한다.
결과는 도 5에 표시된 대로이다. Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 1:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체는 CD8 T세포를 결합할 수 있으며, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 T세포를 결합하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 약하며, Cross3Хh5A1002 2:1 이중 항체가 T세포를 결합하는 활성이 가장 약하다.
(2) PBS를 사용해 HCT-15종양 세포를 2Х106/ml로 희석한 뒤, 100μl/튜브의 부피에 따라 1.5ml EP 튜브에 넣고, 그 안에 산양 혈청(100μl/튜브)을 첨가한 뒤, 4℃에서 30분간 폐쇄한다. 경사도로 희석된 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 1:1, UCT1Хh5A1002 2:1, 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 첨가한 뒤, 4℃에서 30분간 배양한다. EP튜브에 1ml의 PBS를 넣고, 4℃에서 3500rpm으로 5분간 원심분리한 뒤, 상층액을 버린 뒤, 다시 PBS로 한 번 세척한다. 원심분리 후 상청액을 모두 버린 뒤, PBS(100μl/튜브)로 세포를 현탁시킨 뒤, 그 안에 Alexa-647(1μl/튜브)에 표시된 산양 항 인간 IgG 이차항체(Jackson lab에서 구입)를 첨가한 뒤, 4℃에서 차광 하에 30분간 배양한다. PBS로 두 번 세척한 뒤, 원심분리 후 상청액을 모두 버린 뒤, PBS(200μl/튜브)로 세포를 현탁시킨 뒤, 세포 유동 분석기로 검사를 실시한다.
결과는 도 6에 표시된 대로이다. (1) Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 1:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체는 종양 세포를 결합할 수 있다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 HCT-15 종양세포를 결합하는 EC50은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 작으며, 종양 세포를 결합하는 능력이 더욱 강해지며, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 2:1 항체가 종양을 결합하는 활성이 서로 동일하다.
실시예 5: 이중 특이성 항체가 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 실험
이중 특이성 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포, NCI-H1299 폐암 세포, PANC-1 췌장암 세포, A-498 신장암 세포, PC-3 전립선암 세포의 말살을 촉진하는 능력을 검출한다.
(1)50μL/공의 부피에 따라 16공 RTCA 플레이트에 완전 RPMI-1640 배양기를 첨가하며, 장비로 교정한다.
(2) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 종양 세포를 2Х105/mL로 희석하고, 50μL/공의 부피에 따라 스텝(1)에서 얻은 RTCA 플레이트에 개별적으로 첨가한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
(3) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 경사도로 희석한 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCT1Хh5A1002 1:1, UCT1Хh5A1002 2:1 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)( 최고 농도 0.2 μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석)를 스텝(2)에서 얻은 RTCA 플레이트에 50μL/공의 부피로 첨가한다.
(4) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 PBMC(賽笠生物에서 구입)를 1.25Х106개/ml로 희석하고, 스텝(3)에서 얻은 RTCA 플레이트에 80μL/공의 부피로 첨가한다.
(5) 스텝(4)에서 얻은 반응계에 대해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
결과는 도 7에 표시된 대로이다. (1) Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 1:1, UCHT1×h5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진한다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 강하며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
결과는 도 8에 표시된 대로이다. (1) Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 NCI-H1299 폐암 세포의 말살을 촉진한다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 강하며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
결과는 도 9에 표시된 대로이다. (1) Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 PANC-1 췌장암 세포의 말살을 촉진한다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 강하며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
결과는 도 10에 표시된 대로이다. (1) Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 A-498 신장암 세포의 말살을 촉진한다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 강하며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
결과는 도 11에 표시된 대로이다. (1) Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 1:1, UCHT1Хh5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 PC-3 전립선암 세포의 말살을 촉진한다. (2) 발명자의 예상을 넘어선 것은, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 능력은 1:1 구조(구조 A)의 이중 항체보다 강하며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
앞의 결과는 본 발명의 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포, NCI-H1299 폐암 세포, PANC-1 췌장암 세포, A-498 신장암 세포, PC-3 전립선암 세포의 말살을 촉진하는 능력이 크게 향상되었음을 보여준다. CD3 항원 결합 부위가 Cross3 항체의 항원 결합 조각인 경우, 본 발명의 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
실시예 6: 이중 특이성 항체가 PBMC로 인한 사이토카인의 분비을 촉진하는 실험
PBMC를 종양 세포와 함께 배양하는 시스템에 이중 특이 항체를 첨가하고, 48시간 배양한 뒤, 배양 상청액을 수집하여 상청액 내 사이토카인 함량을 측정하고, 이중 특이 항체에 기인한 사이토카인 방출 특성을 판단하기 위해 이용한다.
(1) 완전 RPMI 1640 배양기를 사용해 종양을 1Х105/ml로 희석하며, 96공 플레이트에 넣은 뒤 37℃ 및 5% CO2 조건에서 인큐베이터에서 24시간 배양한다.
(2) 완전 RPMI 1640 배양기를 사용해 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 1:1, Cross3Хh5A1002 2:1, 대조용 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)를 경사도로 희석하여 96공 플레이트에 20μL/공의 부피로 첨가한다.
(3) 완전 RPMI 1640 배양기를 사용해 이중 PBMC(賽笠生物에서 구입)를 1.25Х106/ml로 희석하여, 96공 플레이트에 80μL/공의 부피로 첨가한다.
(4) 37℃ 및 5% CO2 조건에서 96공 플레이트를 인큐베이터에 넣어 48시간 동안 배양한다.
(5) 실온에서 300rpm으로 10분간 원심분리한 뒤, 세포 배양 상청액을 수집한다.
(6) CBA 키트(BD에서 구입)를 이용하여 상청액의 사이토카인 함량을 검출한다.
결과는 도 12에 표시된 대로이다. (1) Cross3×h5A1002 1:1, Cross3×h5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 면역 활성화 사이토카인 IL-2 및 IFN-γ의 분비을 촉진한다. (2) Cross3Хh5A1002 2:1항체가 PBMC로 인한 면역 활성화 사이토카인의 분비을 촉진하는 능력이 더욱 강해지다.
앞의 결과는 본 발명의 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 PBMC로 인한 면역 활성화 사이토카인의 분비을 촉진하는 능력이 향상되었음을 보여준다. 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체는 T 세포와의 결합이 약하고, 종양 세포와의 결합이 강해기에 투약 후 더 많은 약물이 종양 부위에 분포하여 항암 효과가 높아진다.
실시예 7: E/T비 (효과 세포와 표적 세포와의 비율)가 다를 경우 이중 특이성 항체가 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 실험
E/T비(PBMC：종양)가 다를 경우 본 발명의 이중 특이성 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 능력을 검출한다.
(1)50μL/공의 부피에 따라 16공 RTCA 플레이트에 완전 RPMI-1640 배양기를 첨가하며, 장비로 교정한다.
(2) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 종양 세포를 2Х105/mL로 희석하고, 50μL/공의 부피에 따라 스텝(1)에서 얻은 RTCA 플레이트에 개별적으로 첨가한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
(3) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 경사도로 희석한 이중 특이성 항체 Cross3Хh5A1002 2:1, UCHT1Хh5A1002 2:1, SP34Хh5A1002 2:1 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)(최고 농도 0.2 μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석)를 스텝(2)에서 얻은 RTCA 플레이트에 20μL/공의 부피로 첨가한다.
(4) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 PBMC(賽笠生物에서 구입)를 1.25Х106개/ml(E/T비 10:1), 0.625Х106개/ml(E/T비 5:1) 및 0.3125Х106개/ml(E/T비 2.5:1)로 희석하고, 스텝(3)에서 얻은 RTCA 플레이트에 80μL/공의 부피로 첨가한다.
(5) 스텝(4)에서 얻은 반응계에 대해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
결과는 도 13에 표시된 대로이다. E/T비가 다를 경우 Cross3×h5A1002 2:1, UCHT1×h5A1002 2:1, SP34×h5A1002 2:1 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진할 수 있으며, Cross3Хh5A1002 2:1이 말살을 촉진하는 활성이 가장 높다.
실시예 8: 기타 MICA 이중 항체가 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 실험
기타 MICA 항체를 기반으로 형성된 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 능력을 검출함으로, 2:1 구조(구조 B)의 이중 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 능력을 평가하여, 1:1 구조(구조 A)보다 일반적으로 우수한지 여부를 판단한다. 기타 MICA 항체는 1D5(Genentech 단클론 항체, US20200055939A1), 13A9(Genentech 단클론 항체, US20200055939A1), 및 619(Cullinan 단클론 항체, US20210253711A1) 중에서 선택된다.
1 2:1 구조(구조 B) 항체의 발현은 실시예 1의 방법과 동일하다.
2 PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 촉진하는 능력에 대한 검토는 실시예 7을 참고해 다음 스텝에 따라 진행한다.
(1) 50μL/공의 부피에 따라 16공 RTCA 플레이트에 완전 RPMI-1640 배양기를 첨가하며, 장비로 교정한다.
(2) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 종양 세포를 2Х105/mL로 희석하고, 50μL/공의 부피에 따라 스텝(1)에서 얻은 RTCA 플레이트에 개별적으로 첨가한 뒤, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
(3) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 경사도로 희석한 이중 특이성 항체 Cross3×h5A1002 2:1, Cross3×1D5 1:1, Cross3×1D5 2:1, Cross3×13A9 1:1, Cross3×13A9 2:1, Cross3×619 1:1, Cross3×619 2:1 및 대조 hIgG1LALA(百英生物에서 구입)(최고 농도 0.2 μg/ml, 8개 경사도, 5배 희석)를 스텝(2)에서 얻은 RTCA 플레이트에 20μL/공의 부피로 첨가한다.
(4) 완전 RPMI-1640 배양기를 사용해 PBMC(賽笠生物에서 구입)를 1.25Х106개/ml로 희석하고, 스텝(3)에서 얻은 RTCA 플레이트에 80μL/공의 부피로 첨가한다.
(5) 스텝(4)에서 얻은 반응계에 대해 37℃ 및 5% CO2 조건에서 xCELLigence RTCA MP 장비를 사용해 24시간 세포 지수를 측정한다.
결과는 도 14에 표시된 대로이다. (1) 1D5 이중 항체에 기반한 2:1 구조의 이중 항체는 1:1 이중 항체보다 말살을 촉진하는 능력이 약하다. (2) Cross3Хh5A1002 2:1은 1D5에 기반한 이중 항체보다 말살을 촉진하는 활성이 더 높다.
결과는 도 15에 표시된 대로이다. (1) 13A9 이중 항체에 기반한 2:1 구조의 이중 항체는 1:1 이중 항체보다 말살을 촉진하는 능력이 약하다. (2) Cross3Хh5A1002 2:1은 13A9에 기반한 이중 항체보다 말살을 촉진하는 활성이 더 높다.
결과는 도 16에 표시된 대로이다. (1) 619 이중 항체에 기반한 2:1 구조의 이중 항체는 1:1 이중 항체보다 말살을 촉진하는 능력이 약하다. (2) Cross3Хh5A1002 2:1은 619에 기반한 이중 항체보다 말살을 촉진하는 활성이 더 높다.
앞의 결과는 MICA 항체가 h5A1002 항체에서 선택된 경우에만, 본 발명의 2:1 구조(구조 B) 이중 항체가 PBMC로 인한 HCT-15 결장·직장암 세포의 말살을 촉진하는 능력을 강화함을 나타내는 것을 보여준다.
실시예 9: CD3ХMICA 항체가 마우스에 대한 항암 작용에 미치는 영향
체내 약효 실험은 본 발명의 Cross3Хh5A1002 2:1 이중 특이성 항체가 면역 재구성 마우스의 항암 기능을 촉진하는지 검출하기 위해 이용된다.
(1) 14일째에 꼬리 정맥을 경유하여 인간 PBMC(賽笠生物에서 구입)를 NSG 마우스(南方模式에서 구입)에 1마리마다 5Х106씩 주사하다.
(2) 10일째에 NSG 마우스의 오른쪽 복측 피하에서 형성된 종양에 1마리마다 A-375 인간 흑색종 세포를 2Х106개씩, NCI-H1299 인간 폐암 세포를 2Х106개씩, 또는 PC3 인간 전립선암 세포를 5Х106개씩 주사한다.
(3) 0일째에 마우스의 체중을 측정하며 종양 부피를 측정한 뒤, 체중 및 종양 부피에 따라 마우스를 6개의 그룹으로 나눈다.
(4) 0일째, 4일째, 7일째 및 11일째에 각각 꼬리 정맥을 통해 마우스에 Cross3Хh5A1002 2:1(MICA 항체 중사슬-CD3 단일 사슬 항체의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 13에 보여주며, MICA 항체 중사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 14에 보여주며, MICA 항체 경사슬의 아미노산 서열을SEQ ID NO: 15에 보여준다 )(0.1mg/kg) 및 용매 대조 PBS를 1마리마다 250μl씩 주사한다.
(4) 앞의 항체를 주사한 후 종양 부피를 매주 2회씩 측정하며, 마우스의 체중을 측정한다.
결과는 도 17, 19 및 20에 표시된 대로이다. 본 발명의 Cross3Хh5A1002 2:1 항체는 면역 재구성 마우스의 항암 기능을 효과적으로 촉진하고, 종양 이식 마우스에 대한 치료에 사용될 때 종양을 완전히 소멸시킬 수 있다.
앞의 실험 결과는 본 발명의 이중 특이성 항체가 CD3 및 MICA를 결합해, T세포의 활성화와 사이토카인의 분비를 촉진하며, PBMC로 인한 종양 세포의 말살을 효과적으로 유도하고, 뛰어난 항암 활성을 가짐을, 및 본 발명의 이중 특이성 항체가 MICA와 높은 친화력으로 결합하며, CD3와 낮은 친화력으로 결합할 수 있으며, 항암 활성이 더욱 높고 안전성도 우수함을 보여준다. 결론적으로, 본 발명의 이중 특이성 항체는 면역세포의 항암 작용을 촉진할 수 있으며, 뛰어난 항암 활성 및 높은 안전성을 가지며, 임상 적용 가치 및 의약품 개발 가치가 높다.
위 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 상세히 설명한 것이지만, 본 발명은 여기서만 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 기술적 구상 범위 내에서는, 본 발명의 기술안에 대해 다양한 간단한 변형을 수행하고, 각 기술적 특성을 다른 적절한 방법으로 결합할 수 있으며, 이러한 간단한 변형 및 결합도 동일하게 본 발명에서 공개된 내용으로 간주되어 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
본 설명서의 서술에서 참고 용어인 '하나의 실시예', '여러 실시예', '예', '구체적인 예' 또는 '여러 예' 등은 해당 실시예 또는 예에 관련된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 최소한 하나의 실시예 또는 예에 포함되는 것을 의미이다. 본 명세서에서는 앞의 용어의 지시적 기술이 반드시 동일한 실시예 또는 예에 대해 이루어져야 하는 것은 아니다. 또한, 기술된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특성은 어느 하나 혹은 여러 실시예 또는 예에서 적절한 방법으로 결합할 수 있다. 그 밖에, 서로 모순되지 않는 경우에는 해당 기술분야의 기술자가 본 명세서에 기재된 다른 실시예 또는 예, 그리고 다른 실시예 또는 예의 특징을 서로 결합할 수 있다.
위 내용에서 본 발명의 실시예를 제시하거나 설명함에도 불구하고, 이러한 실시예는 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 해당 기술분야의 기술자는 본 발명의 범위 내에서 앞의 실시예에 대해 변형, 수정, 교체 및 변형을 가할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (54)

  1. 제1항원 결합 영역, 제2항원 결합 영역 및 Fc 부위를 포함하며;
    상기 Fc 부위는 제1 Fc 펩타이드 및 제2 Fc 펩타이드를 포함하며;
    상기 제1항원 결합 영역은 scFv 조각 및 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며;
    상기 제2항원 결합 영역은 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각을 포함하며, 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며;
    상기 제1분자는 상기 제2분자와 동일하며, 상기 scFv 조각은 CD3 결합 활성을 가지는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  2. 제1항 있어서,
    상기 제1분자 및 상기 제2분자는 MICA, PDL1, CD47, TIGIT, CD73, CD33, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, STING, WNT, Beta catenin, B7H3, VISITA, CD19, BCMA, CD22, CD20, CD123, CD38, CEA, CD25, CD46, CD138, PSCA, PSMA, PSA, MUC1, MUC16, NY-ESO-1, GD2, WT1, Mesothelin, MAGE-A3, GPC3, PRAME, Globo H, AFP, Trop2, FOLR1, SP, Sca-1, CD133또는 EPCAM에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  3. 제2항 있어서,
    상기 제1분자 및 상기 제2분자는 모두 MICA인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  4. 제1항 있어서,
    상기 결합 단백질 또는 그의 조각은 항체 또는 그의 항원 결합 조각, 수용체 및 리간드 중 최소 하나에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  5. 제1항 있어서,
    상기 제1분자의 결합 단백질 및/또는 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그들의 조각은 각각 독립적으로Fab 조각 및 scFab 중 하나에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  6. 제1항 있어서,
    상기 제1분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제1 Fab 조각이며, 및/또는 상기 제2분자의 결합 단백질 또는 그의 조각은 제2 Fab 조각인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  7. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되며, 상기 scFv 조각의 C단은 상기 제1 Fc 펩타이드의 N단에 연결되며, 및/또는
    상기 제2 Fab 조각의 CH1 조각의 C단은 상기 제2 Fc 펩타이드의 N단에 연결되는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  8. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 MICA 결합 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  9. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 모두 제2중사슬 가변 영역 CDR1~3 및 제2경사슬 가변 영역 CDR1~3을 포함하며; 여기서,
    제2중사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 7에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
    제2중사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 8에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
    제2중사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 9에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
    제2경사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 10에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
    제2경사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 11에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지며,
    제2경사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 12에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가지는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  10. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및/또는 상기 제 2 Fab 조각은 제2중사슬 프레임워크 영역 및/또는 제2경사슬 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  11. 제10항 있어서,
    상기 제2중사슬 프레임워크 영역 및/또는 상기 제2경사슬 프레임워크 영역의 최소 일부는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체, 영장류 유래 항체, 소 유래 항체, 말 유래 항체, 젖소 유래 항체, 돼지 유래 항체, 양 유래 항체, 산양 유래 항체, 개 유래 항체, 고양이 유래 항체, 토끼 유래 항체, 낙타 유래 항체, 당나귀 유래 항체, 사슴 유래 항체, 밍크 유래 항체, 닭 유래 항체, 오리 유래 항체, 거위 유래 항체, 칠면조 유래 항체, 투계 유래 항체 및 그것들의 변체 중 최소 하나에 유래하며, 바람직하게는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체 및 영장류 유래 항체 중 하나에 유래하는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  12. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 각각 독립적으로 SEQ ID NO:29에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제2중사슬 가변 영역, 및 SEQ ID NO:30에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제2경사슬 가변 영역을 포함한다.
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  13. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및/또는 상기 제2 Fab 조각은 또한 CH1 조각 및 CL 조각을 포함하며, 여기서
    상기 제2중사슬 가변 영역의 C 단은 상기 CH1 조각의 N 단에 연결되며, 상기 제2경사슬 가변 영역의 C 단은 상기 CL 조각의 N 단에 연결되며, 상기 CH1 조각은 사슬간 이황결합으로 상기 CL 조각에 연결되는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  14. 제6항 있어서,
    상기 제1 Fab 조각 및 상기 제2 Fab 조각은 각각 독립적으로 SEQ ID NO: 31에 표시된 아미노산 서열을 가진 상기 제2중사슬 가변 영역 및 CH1 조각, 및 SEQ ID NO: 32에 표시된 아미노산 서열을 가진 상기 제2경사슬 가변 영역 및 CL 조각을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 scFv 조각은 제1중사슬 가변 영역 CDR1~3 및 제1경사슬 가변 영역 CDR1~3을 포함하며; 여기서,
    제1중사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 1에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
    제1중사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 2에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
    제1중사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 3에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
    제1경사슬 가변 영역CDR1은 SEQ ID NO: 4에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
    제1경사슬 가변 영역CDR2은 SEQ ID NO: 5에 표시된 아미노산 서열을 가지며,
    제1경사슬 가변 영역CDR3은 SEQ ID NO: 6에 표시된 아미노산 서열을 가지는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 scFv 조각은 제1중사슬 프레임워크 영역 및/또는 제1경사슬 프레임워크 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  17. 제16항 있어서,
    상기 제1중사슬 프레임워크 영역 및/또는 상기 제1경사슬 프레임워크 영역의 최소 일부는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체, 영장류 유래 항체, 소 유래 항체, 말 유래 항체, 젖소 유래 항체, 돼지 유래 항체, 양 유래 항체, 산양 유래 항체, 개 유래 항체, 고양이 유래 항체, 토끼 유래 항체, 낙타 유래 항체, 당나귀 유래 항체, 사슴 유래 항체, 밍크 유래 항체, 닭 유래 항체, 오리 유래 항체, 거위 유래 항체, 칠면조 유래 항체, 투계 유래 항체 및 그것들의 변체 중 최소 하나에 유래하며, 바람직하게는 쥐 유래 항체, 인간 유래 항체 및 영장류 유래 항체 중 하나에 유래하는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 scFv 조각은 SEQ ID NO:33에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제1중사슬 가변 영역, 및 SEQ ID NO:34에 표시된 또는 그의 보수적 개질 형식의 아미노산 서열을 가진 제1경사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  19. 제18항 있어서,
    상기 scFv 조각은 또한 연결 펩타이드 1를 포함하며; 여기서
    상기 연결 펩타이드 1의 N단은 상기 제1중사슬 가변 영역의 C단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 1의 C단은 상기 제1경사슬 가변 영역의 N단에 연결되며, 또는
    상기 연결 펩타이드 1의 N단은 상기 제1경사슬 가변 영역의 C단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 1의 C단은 상기 제1중사슬 가변 영역의 N단에 연결되는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  20. 제19항 있어서,
    상기 연결 펩타이드 1는 （GGGGS）n에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 여기서 n은 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  21. 제19항 있어서,
    상기 scFv 조각은 SEQ ID NO: 35에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  22. 제19항 있어서,
    상기 제1항원 결합 영역은 또한 연결 펩타이드 2를 포함하며; 여기서, 상기 제1 Fab 조각의 CH1의 C단은 상기 연결 펩타이드 2의 N단에 연결되며, 상기 연결 펩타이드 2의 C단은 상기 scFv 조각의 N단에 연결되는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  23. 제22항 있어서,
    상기 연결 펩타이드 2는 （GGGGS）n에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 여기서 n은 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  24. 제22항 있어서,
    상기 연결 펩타이드 2은 SEQ ID NO: 36 또는 37에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 제1 Fc 펩타이드는 knob-into-hole 구조를 통해 상기 제2 Fc 펩타이드에 연결되는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 제1 Fc 펩타이드 및 상기 제2 Fc 펩타이드는 모두 인간 Fc 펩타이드인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  27. 제26항 있어서,
    상기 인간 Fc 펩타이드는 인간 IgG1 Fc 펩타이드인 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  28. 제26항 있어서,
    상기 제1 Fc 펩타이드는 SEQ ID NO: 38에 표시된 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 Fc 펩타이드는 SEQ ID NO: 39 또는 40에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  29. 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 13, 18, 19, 22, 25 또는 28에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬;
    SEQ ID NO: 14, 20, 23 또는 26에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬;
    SEQ ID NO: 15, 21, 24 또는 27에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬; 및
    SEQ ID NO: 15, 21, 24 또는 27에 표시된 아미노산 서열을 가지거나 그것과 최소 80%의 동일성의 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  30. 제29항 있어서,
    SEQ ID NO: 13에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
    SEQ ID NO: 18에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
    SEQ ID NO: 19에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 14에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 15에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
    SEQ ID NO: 22에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 20에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 21에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 21에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
    SEQ ID NO: 25에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 23에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 24에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 24에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬, 또는
    SEQ ID NO: 28에 표시된 아미노산 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 26에 표시된 아미노산 서열을 가진 제2 폴리펩타이드 사슬, SEQ ID NO: 27에 표시된 아미노산 서열을 가진 제3 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 27에 표시된 아미노산 서열을 가진 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함하는
    것을 특징으로 하는 이중 특이성 항체.
  31. 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  32. 청구항 31에 기재된 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터 또는 형질전환체.
  33. 제32항 있어서,
    상기 벡터는 진핵 벡터 또는 원핵 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터 또는 형질전환체.
  34. 제32항 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아데노연관바이러스 벡터 중 최소 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터 또는 형질전환체.
  35. 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 또는 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체를 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
  36. 제35항 있어서,
    상기 세포는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 세포.
  37. 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체, 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 또는 청구항 35 또는 36에 기재된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 종합물.
  38. 제37항 있어서,
    또한 약학적으로 허용되는 부재료를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 종합물.
  39. 제38항 있어서,
    상기 부재료는 약학적으로 허용되는 1종 이상의 부형제, 희석제, 안정제 또는 캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 종합물.
  40. 제37항 있어서,
    상기 약물 종합물은 주사제인 것을 특징으로 하는 약물 종합물.
  41. 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체, 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 또는 청구항 35 또는 36에 기재된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. CD3 및/또는 종양 타깃의 검출에 사용되는 키트의 제조를 위한 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체, 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 또는 청구항 35 또는 36에 기재된 세포의 용도.
  43. CD3 및/또는 종양 타깃이 매개하는 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 활용되는 약물의 제조를 위한 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체, 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 청구항 35 또는 36에 기재된 세포, 또는 청구항 37-40 중 어느 한 항에 기재된 약물 종합물의 용도.
  44. 제43항 있어서,
    상기 CD3 이 매개하는 관련 질병은 자가면역성 질병을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  45. 제44항 있어서,
    상기 자가면역성 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스 관절염, 전신성 혈관염, 경피증, 피부근염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역성 질병, 궤양성 대장염, 만성 림프구성 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존형 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 악성 빈혈을 동반한 만성 위축성 위염, 폐출혈 신염 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 원발성 담즙성 간경변, 다발성 뇌척수경화증 및 급성 특발성 다신경염 중 최소 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  46. 제43항 있어서,
    상기 종양 타깃은 MICA인 것을 특징으로 하는 용도.
  47. 제46항 있어서,
    상기 MICA 이 매개하는 관련 질병은 암, 이식 거부에 기인한 질병, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  48. 제47항 있어서,
    상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 대장암, 유방암, 신경교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평상피암 및 두경부암 중 최소 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  49. 피험자에게 약학적으로 허용되는 양의 청구항 1-30 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체, 청구항 31에 기재된 핵산, 청구항 32-34 중 어느 한 항에 기재된 벡터 또는 형질전환체, 청구항 35 또는 36에 기재된 세포, 또는 청구항 37-40 중 어느 한 항에 기재된 약물 종합물을 투여하는 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD3 및/또는 MICA이 매개하는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법.
  50. 제49항 있어서,
    상기 CD3 이 매개하는 관련 질병은 자가면역성 질병을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항 있어서,
    상기 자가면역성 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류머티스 관절염, 전신성 혈관염, 경피증, 피부근염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 갑상선 자가면역성 질병, 궤양성 대장염, 만성 림프구성 갑상선염, 갑상선 기능 항진증, 인슐린 의존형 당뇨병, 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 악성 빈혈을 동반한 만성 위축성 위염, 폐출혈 신염 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 원발성 담즙성 간경변, 다발성 뇌척수경화증 및 급성 특발성 다신경염 중 최소 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항 있어서,
    상기 종양 타깃은 MICA인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항 있어서,
    상기 MICA 이 매개하는 관련 질병은 암, 이식 거부에 기인한 질병, 자가면역 질병 및 감염성 질병을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항 있어서,
    상기 암은 폐암, 간암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 방광암, 대장암, 유방암, 신경교종, 신장암, 위암, 식도암, 구강 편평상피암 및 두경부암 중 최소 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020267009802A 2023-09-06 2024-09-04 이중 특이성 항체 및 그 응용 Pending KR20260061237A (ko)

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