LT98186A - Fenilacetato katabolizmo fermentus koduojančių genų inaktyvavimo būdas, su tuo susijusios plazmidės ir jomis transformuoti kamienai - Google Patents

Description

1

Fenilacetato katabolizmo fermentus koduojančių genų inaktyvavimo būdas, su tuo susijusios plazmidės ir jomis transformuoti kamienai Išradimo sritis Šis išradimas priklauso genų inžinerijos sričiai ir yra susijęs su naujais DNR junginiais ir rekombinantinėmis DNR molekulėmis, kurios koduoja gaunamą iš filamentinių grybų Aspergillus nidulans ir Penicillium chrysogenum fermentą, fenilacetato 2-hidroksilazę, su transformuotais kamienais ir jų mutantiniais dariniais bei plazmidėmis, inaktyvuojančiomis šių kamienų geną, susijusį su fenilacetato skaldymu. Peniciliną produkuojančių kamienų transformacija aukščiau minėtais DNR junginiais leidžia padidinti šio antibiotiko produkcijos išeigą.

Ankstesnės žinios

Paskutinysis benzilpenicilino (penicilino G) biosintezės kelio žingsnis kai kuriuose filamentiniuose grybuose priklauso nuo izopenicilino N pavirtimo į peniciliną G. To priežastis yra transacilinimo reakcija, kurios metu izopenicilino N L-aminoadipato šoninė grandinė pakeičiama viena iš fenilacto rūgščių. Fermentas, kuris katalizuoja šią reakciją (acil-CoA:izopenicilin-N-transferazė) naudoja aktyvuotą fenilacto rūgštį kofermento A (CoA) tioesterio formoje kaip vieną iš savo substratų.

Penicillium chrysogenum, grybas naudojamas pramoninei penicilino gamybai, ir Aspergillus nidulans negali sintetinti fenilacetato. Todėl, norint palengvinti penicilino G biosintezę, būtina į pramonines P. chrysogenum kultūras pridėti fenilacetato perteklių. Šis perteklius, trukdantis nepageidaujamai kitų penicilinų su alifatinėmis šoninėmis grandinėmis biosintezei, padidina galutinę fermentacijos proceso kainą.

Dalis fenilacetato, dedamo į penicilino gamybos kultūras, gali būti metabolizuota. Tai yra pilnai nustatytas faktas, kad žymus 2-hidroksifenilacetato 2 kiekis kaupiamas P. chrysogenum fermentacijose. Ši šoninių grandinių pirmtakų frakcija aišku negali prisidėti prie penicilino G biosintezės.

Ir Aspergillus nidulans, ir P. chrysogenum sintetina peniciliną iš trijų pradinių aminorūgščių per tas pačias fermentines stadijas. Be to, panašiai P. chrysogenum, A. nidullans paverčia fenilacetato frakciją j 2-hidroksifenilacetatą, jeigu kultūroje yra pirmojo junginio perteklius. Be to, paverčiant fenilacetatą 2-hidroksifenilacetatu, A. nidulans taip pat gali katabolizuoti pastarąjį junginį ir iš tikrųjų gali panaudoti fenilacetatą kaip vienintelį anglies šaltinį.

Katabolinis A nidulans kelias pavaizduojamas sekančia schema: Fenilacetatas i fenilacetato hidroksilazė 2-hidroksifenilacetatas i 2-hidroksifenilacetato hidroksilazė

Homogenizatas i homogenizato dioksigenazė

Maleilacetoacetatas i maleilacetoacetato izomerązė

Fumarilacetoacetatas i fumarilacetoacetato hidrolazė

Fumaratas + acetoacetatas

Fenilacetato orto-hidroksilinimas yra pirmasis žingsnis šiame kelyje. Antroji hidroksilinimo reakcija paverčia 2-hidroksifenilacetatą į 2.5-dihidroksifenilacetatą (= homogenizatą). Homogenizatas skaidomas per fumarilacetoacetatą į fumaratą ir acetoacetatą, kuris įjungiamas į Krebso ciklą (žr. Fernandez Canon y Penalva, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9132-9136, 1995).

Aukščiau minėtų filamentinių grybų sugebėjimas pilnai ar dalinai skaldyti fenilacetatą yra žalinga charakteristika penicilino gamyboje. Dėl šios priežasties ši savybė turi būti pilnai ar dalinai pašalinta kamienuose, produkuojančiuose peniciliną G. Šios nepageidaujamos charakteristikos pašalinimas (būtent sugebėjimo dalinai ar pilnai skaidyti fenilacetatą) iš peniciliną produkuojančių grybų klasikinės 3 mutagenezės pagalba reikalautų milžiniškų selekcijos pastangų dideliame kamienų skaičiuje. Priešingu atveju, minėta mutagenezė dažnai sukelia antrines mutacijas, kurios gali pašalinti naudingas pradinių kamienų, produkuojančių, pavyzdžiui, auksotrofines mutacijas ar mutacijas, kurios mažina augimo ar sporų susidarymo intensyvumą, kurios yra lemiamos pramoninėse fermentacijose, savybes. Todėl tikslinga naudoti genų inžinerijos techniką, kuri neturi tokių apribojimų, pašalinant sugebėjimą dalinai ar pilnai skaidyti fenilacetatą. Būtina sąlyga genų inžinerijos kryptingam atlikimui - genų, kurie sukelia aukščiau minėtas nepageidaujamas peniciliną produkuojančių grybų savybes, klonavimas ir charakterizavimas.

Detalus išradimo aprašymas Šio išradimo tikslas - aukštame lygyje išspręsti aukščiau minėtas problemas. Jame charakterizuojamas grybų genas, kuris koduoja fenilacetato 2-hidroksilazę, fermentą, katalizuojantį Aspergillus ir Penicillium fenilacetato katabolizmo pirmą fermentinę stadiją, ir jo panaudojimas pašalinti geną, esantį peniciliną produkuojančių grybų genome, rekombinantinės DNR pagalba. Šiame išradime aprašoma, kaip šis genas inaktyvuojamas genų inžinerijos būdu sukonstruotame kamiene. Šis kamienas, negalintis skaidyti fenilacetato, gamina daugiau penicilino, negu pradinis kamienas.. Be to, maksimaliai penicilino gamybai šiame rekombinantiniame kamiene reikalingas mažesnis fenilacetato perteklius, negu naudojamas pradiniame kamiene. Fenilacetato katabolizmo inaktyvavimas, naudojant aukščiau minėtus DNR junginius, žymiai pagerina penicilino gamybą. A.nidulans 1986 bazių porų (bp) genomo DNR fragmento, turinčio naują geną, naudojamo šiame išradime, nukleotidų seka pavaizduota SEQ ID NO: 1. Genas pavadintas phacA (phac. nes phenyląęetate) ir koduoja fermentą, kuris ortohidroksilina fenilacetatą (ši reakcija yra A. nidulans fenilacetato katabolizmo pirmoji pakopa). Komplementaraus DNR klono (cDNR), apimančio visą 4 koduojančią sritj, nukleotidų seka ir jos vėlesnis palyginimas su genominės DNR seka atskleidžia sekančias šio geno charakteristikas:

Genas koduoja 518 aminorūgščių polipeptidą. Pirmasis metioninas yra kodojamas ATG tripleto 82 pozicijoje, tuo tarpu galinis kodonas (TAG) nustatytas 1810 pozicijoje. Šios pozicijos suderintos nukleotidų sekoje, kuri pavaizduota SEQ ID NO: 1.

Koduojanti sritis pertraukta trimis 65, 56 ir 53 nukleotidų ilgio intronais (SEQ ID NO: 1).

Nustatytas 518 grupių polipeptidas parodytas žemiau jo atitinkamų egzonų trijų raidžių aminorūgščių kode SEQ ID NO: 1, bei izoliuotas SEQ ID NO: 2. Nustatyto baltymo molekulinė masė 58,495 g/mol. Paieška, atlikta naudojant Nacionalinio Biotechnologijos Instituto centro viešą priėjimo serverį BLAST baltymų sekų duomenų bazėse (t.y. SvvissProt ir PIR) ir DNR sekų duomenų bazių (t.y. GenBank ir EMBL duomenų bazės) schematišką interpretavimą šešiuose galimuose skaitymo rėmeliuose parodė, kad aminorūgščių seka buvo panaši į citochromo P450 šeimos (hemotiolinto baltymo) struktūros elementus. Šie baltymai paprastai dalyvauja oksidaciniuose procesuose. Iš tikrųjų, sekos tarp 431 ir 439 liekanų atitinka peptidą, kuris turi aminorūgštį cisteiną, Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly (kur X bet kokia aminorūgštis), kuri yra susijusi su hemo grupės, būdingos šiems hemotiolintiems baltymams, surišimu.

Naujas DNR junginys, kurio struktūra detaliai aprašyta SEQ ID NO: 1 ir kuris buvo išskirtas iš natūralaus mikroorganizmo, gali būti pilnai sintezuojamas, naudojant automatinį DNR sintezatorių. Be to, dėka išsigimusios genetinio kodo prigimties, baltymas užkoduotas nauju DNR junginiu, gali būti užkoduotas alternatyvia DNR seka. Tai yra įskaityta ir šiame išradime. Iš kitos pusės, bet kuris natūralus genetinis variantas, kilęs iš naujo DNR junginio, aprašyto aukščiau, yra laikomas ekvivalentišku. Šie genetiniai variantai apima homologinius genus organizmuose, artimai susijusiuose su A nidulans evoliucijos eigoje, tokiuose kaip P. chrysogenum. Šie genai gali būti lengvai identifikuoti naudojant DNR junginį iš A. nidulans kaip hibridizacijos zondą, kaip aprašyta žemiau. 5 A nidulans phacA genas gali būti naudojamas kaip molekulinis zondas, hibridizacijos būdu ieškant funkciškai homologiškų genų kitų grybų rūšių genominės DNR ar cDNR bibliotekose. Tuo būdu, pavyzdžiui, šis išradimas aprašo jo panaudojimą P.chrysogenum DNR bibliotekos atrankai, parodant, kad A nidulans phacA genui homologinis genas gali būti išskirtas iš pramoninių P. chrysogenum kamienų. P. chrysogenum 2558 bp DNR sekos fragmentas, išskirtas hibridizuojant su phacA geno zondu, parodytas SEQ ID NO: 3. P. chrysogenum genas, homologinis A. nidulans phacA genui, buvo pažymėtas pahA (phenvlacetate hydroxylation) . P. chrysogenum phacA genas koduoja 516 aminorūgščių polipeptidą, kuris rodo 84% identiškumą PhacA aminorūgščių sekai, A. nidulans phacA geno produktui. P. chrysogenum pahA geno produkto seka parodyta SEQ ID NO: 4. Kaip buvo pažymėta anksčiau, šis naujas DNR junginys, išskirtas iš P. chrysogenum, taip pat įtrauktas į šį išradimą, kaip ir kiti homologiniai genai, kurie gali būti išskirti iš kitų grybų rūšių panašiu būdu.

Klonuoti genai gali būti naudojami atvirkštinėje genetikoje sukelti mutacijas, panaikinančias geno funkciją. Šiuo tikslu nauja rekombinantinė molekulė gali būti sukonstruota Escherichia coli vektoriuje, turinčiame grybo geno sutrumpintą versiją, kuri gali būti naudojama endogeninio geno inaktyvacijai. Pavyzdžiui, ši rekombinantinė plazmidė gali turėti A. nidulans phacA geno 5’ sritį, o po jos eina modifikacijos phacA geno koduojančioje srityje, kurios glūdi 289 bp NaeI - Kpn\ fragmento pakeitime 3,2 kb Xba\ -fragmentu, turinčiu Anidulans argB+ geną (žr. Fig. 1). Tada phacA geno 3’ sritis pasidaro prieinama. Šis mutuotas phacA genas turėtų ekspresuoti baltymą, kuris nukirptas ties 297 grupe, ir todėl neturi 221 karboksi-galo dalies. Pastarosios grupės, nesančios mutantiniame baltyme, turi anksčiau minėtą peptidą su Cys grupe, kuri dalyvauja hemo grupės surišime ir yra būtina šio tipo baltymų aktyvumui.

Linijinis DNR fragmentas, turintis aukščiau minėtas sritis, gali būti atitinkamomis restriktazėmis atskirtas nuo vektoriaus sekos ir išvalytas standartiniais metodais. Šis linijinis DNR fragmentas gali būti naudojamas A nidulans argB+ kamieno transformacijai į arginino prototrofą. Kadangi DNR 6 naudojama transformacijai neturi sekos, reikalingos autonominei replikacijai, prototrofiniai transformantai yra DNR fragmento integracijos j genomą išdava. Vienas iš galimų integracijos metodų, kuris gali sukelti argB+ fenotipą per dvigubą sukryžminimą linijinės molekulės ir turimo phacA lokuso, esančio grybų genome, parodytas fig. 1. Šio dvigubo sukryžminimo išdavoje originalus phacA genas pakeičiamas sutrumpintu, in vitro sukurtu genu, sukeliančiu phacA funkcijos netekimą. Transformantas, turintis šį pakitimą (t.y. su funkcijos praradimo mutacija) gali būti atpažintas jo hibridizacijos būdu, jeigu jo genomo DNR sukarpoma su tam tikrais restrikcijos fermentais ir analizuojama hibridizuojant Southern metodu, naudojant radioaktyviai 32P pažymėtus phacA arba argB genus kaip zondus. Tokiu būdu, kitų tipų transformantų hibridizacijos būdai gali būti lengvai atskirti nuo šio, sutinkamai su geno pakeitimu. Transformantas, kuris neturi geno suteikiamos funkcijos, tolimesniems tikslams gali būti išvalytas naudojant standartinius metodus.

Skirtingai nuo laukinio tipo A nidulans kamieno, transformantai, gauti atvirkštinės genetikos būdu, ir neturintys phacA geno funkcijos, negali augti terpėje, kur pagrindinis anglies šaltinis yra fenilacetatas. Tačiau jie gali augti terpėje su 2-hidroksifenilacetatu ir 2,5-dihidroksifenilacetatu. Tai rodo, kad naujas DNR darinys (A. nidulans phacA genas) koduoja fermentinį aktyvumą, reikalingą fenilacetato ortohidroksilinimui, t.y. pagrindinei A nidulans fenilacetato naudojimo stadijai. P. chrysogenum nenaudoja fenilacetato, kaip pagrindinio anglies šaltinio, bet, kaip parodyta anksčiau, turi geną, koduojantį homologą fermentui. Tokiu būdu, naujas DNR darinys suteikia metodą šalutinio metabolinio pavertimo, kuris gali sumažinti fenilacetato kaupimąsi penicilino biosintezės metu.

Panaši į aprašytąją metodika gali būti naudojama P. chrysogenum pahA geno inaktyvavimui, naudojant naują DNR junginį, įtrauktą į šį išradimą, ir bet kokią transformacijos žymę jau turimą P. chrysogenum, pavyzdžiui trpC geną. Reikėtų pripažinti, kad gali būti naudojamos naujo DNR junginio koduojančios srities pertraukimui ir kitos transformacijos žymės negu argB (A nidulans) arba trpC (P. chrysogenum). Tai galėtų būti auksotrofinės žymės (pvz., pyrG arba 7 riboB) ir atsparumo antibiotikams genai (pvz., genai, kurie suteikia grybams atsparumą fleomicinui arba higromicinui B). Tokie metodai, pagrindinai ekvivalentiški čia naudojamiems, taip pat yra įtraukti j šį išradimą. Fig. 2 pavaizduotas vienas iš šių metodų, kuris gali būti naudojamas P. chrysogenum pahA geno pakeitimui. Šiuo atveju, inaktyvacijos konstrukte vidinė pahA geno sritis pakeista chimeriniu genu, kur P. chrysogenum gdh geno (geno, kuris koduoja glutamatdehidrogenazę) promotorius reguliuoja bakterinį bleR geną, kuris suteikia atsparumą antibiotikui fleomicinui. Plazmidė, kuri turi inaktyvuojančią konstrukciją, pavadinta pALP696. Transformantai tokiu būdu gali būti atrenkami pagal jų sugebėjimą augti terpėje, turinčioje fleomicino (Kolar, M., Punt, P.J., van dėl Hondel, C.A.M.J.J. and Schwab, H. Gene 62: 127-134, 1988).

Be to, gali būti naudojamos ir kitos reversinės genetikos strategijos sukelti funkcijos praradimo mutacijas klonuotame ir charakterizuotame gene. Pavyzdžiui, transformacija žiedine plazmidė, turinčia vidinį geno-taikinio fragmentą, po vienos transformanto DNR kopijos homologinės integracijos, yra dviejų nepilnų genų kopijų, neturinčių funkcijos, priežastis, jeigu fragmentas, įjungtas į plazmidę yra tinkamai parinktas. Būdai, kurie naudoja šias ar kitas strategijas funkcijos praradimo mutacijų sukėlimui norimame gene reversinės genetikos pagalba, taip pat įjungti į šį išradimą.

Grybų kamienai, kuriuose buvo pašalinti genai, susiję su fenilacetato modifikacija arba metabolizmu, rodė padidintą penicilino gamybos ypatybę. Nepaisant to, jų sugebėjimas augti peniciliną produkuojančioje terpėje neskiriamas nuo pradinio kamieno sugebėjimo. Pavyzdžiui, A nidulans transformantas su phacA geno pakeitimu, aprašytu aukščiau (t.y. neturintis fenilacetato 2-hidroksilazinio aktyvumo), produkuoja 3-8 kartus daugiau penicilino, negu pradinis kamienas ir yra mažiau priklausomas nuo įdedamo fenilacetato (žr. fig. 3). Tokiu būdu, kai fenilacetato koncentracija sumažėja nuo 0,125 % (m/t) iki 0,0625 % (m/t), penicilino išeiga laukiniame kamiene žymiai krenta, o transformantai, netekę phacA geno funkcijos, produkuoja daug penicilino, esant abiems fenilacetato koncentracijoms. 8 8

Pagaliau, šis išradimas liečia ne tik phacA geną ir jo homologus, Mes čia naudojome geną, kuris koduoja fenilacetato 2-hidroksilazę, kadangi šis fermentas katalizuoja pirmą žingsnį fenilacetato metabolizmo kelyje, ir P. chrysogenum pramoniniai kamienai sekretuoja didelius 2-hidroksifenilacetato kiekius. Kiti genai, susiję su fenilacetato metabolizmu, gali būti inaktyvuoti naudojant metodą, panašų į čia aprašytą. Šis išradimas, t.y. kad penicilino išeiga grybuose gali būti pagerinta inaktyvuojant individualius fenilacetato metabolizmo genus reversinės genetikos metodais, taip pat apima šias alternatyvias galimybes.

Pavyzdžiai

1 PAVYZDYS. A. nidulansphacA GENO KLONAVIMAS IR CHARAKTERIZAVIMAS cDNR klonai, atitinkantys phacA geną, buvo gauti skirtingai atrenkant iš cDNR bibliotekos, taikant žemiau aprašytas stadijas: a) Gavimas cDNR populiacijos, atitinkančios transkriptus genų, kurie pirmenybiškai ekspresuojami, kai grybai auga esant fenilacetato (kaip “plius” zondas DNR bibliotekos atrinkimui).

Anidulans A26 kamienas iš Grybų genetikos kamienų centro kolekcijos (Mikrobiologijos departamentas, Kanzaso universiteto Medicinos centras) buvo auginamas 37 °C temperatūroje atitinkamai praturtintoje minimalioje terpėje, turinčioje (g/l) KP04H2, 13,6; (NH4)2S04, 2,0; MgS04.7H20 0,0005 ir 0,3% (nriA) gliukozės, kaip anglies šaltinio. Laikas, kai gliukozė buvo išnaudota, buvo nustatomas analizuojant gliukozės koncentraciją augimo terpėje (naudojant fermentų rinkinius). Tai paprastai būdavo po 18 valandų inkubacijos, pastoviai maišant. Po dviejų valandų j kultūrą buvo įvedamas fenilacetatas iki galutinės koncentracijos 10 mM, ir kultūra maišoma toliau 1 valandą 37 °C temperatūroje siekiant indukuoti nustatytų genų ekspresiją. Po šio laiko tarpo micelis buvo surinktas filtruojant, perplautas vandeniu, užšaldytas skystame azote, liofilizuotas v 9 ir naudojamas suminės RNR išskyrimui. Šis suminės RNR preparatas buvo naudojamas poly(A+) mRNR išskyrimui oligo-dT celiuliozės afinine chromatografija. Viengrandė cDNR buvo gaunama naudojant paukščių mieloblastozės viruso atvirkštinę transkriptazę (komercinės kilmės), matrica naudojant 2 μg aukščiau minėtos mRNR, išskirtos iš micelio indukavus fenilacetatu, ir oligo-dT (15-mer) pradmenį. Reakcijos mišinys buvo inkubuojamas 1 valandą 42 °C temperatūroje buferyje, turinčiame 10 mM Tris-HCI, pH8,8 (25 °C), 50 mM KCI, 0,1 % Triton Χ-100, 5 mM MgCI2, 10 mM dNTP ir 0,5 vieneto RN-azino. Susintetinus pirmą grandinę, RNR matrica buvo pašalinama inkubuojant 1 valandą 60 °C temperatūroje su 3M NaOH. Neutralizavus acto rūgštimi, viengrandė DNR buvo regeneruota išsodinant 2,5 tūrio absoliutaus etanolio 2 valandas -80 °C temperatūroje ir centrifuguojama. Ši cDNR buvo pašalinta su 30-kartiniu perteklium poly(A+)RNR, išskirtos iš micelio, regenuorant tuo metu, kai gliukozė išnaudota, naudojant būdą, aprašytą Sargent, T.D., Methods Enzymol. 152: 423-432, 1987. Hibridinės cDNR-RNR molekulės buvo atskirtos hidroksiapatito chromatografija 68 °C temperatūroje ir pašalintos.

Likusi cDNR buvo hibridizuota įprastai, su poly(A+)RNR pertekliumi iš micelio kultūros nesant fenilacetato. Hibridinės cDNR - RNR molekulės buvo pašalintos vėl kaip įprasta, ir susidariusi surinkta viengrandės cDNR populiacija, kurios atstovaujamų genų transkriptai pirmenybiškai ekspresuojami esant fenilacetato. Ši cDNR buvo vienodai pažymėta [ a ‘32P]dCTP ir visų likusių dNTP pertekliui, naudojant DNR polimerazės Klenovo fragmentą ir atsitiktines nukleotidų sekas kaip pradmenis. Gauta 32P pažymėta cDNR populiacija (specifinis aktyvumas > 108 ipm/mg) buvo naudojama kaip zondas atrenkant cDNR biblioteką, sukonstruotą kaip aprašyta skyriuje c). b) Gavimas cDNR zondo, atitinkančio genus, transkribuojamus nesant fenilacetato (“minus” zondas). ΙΟ IĄ

Viengrandė cDNR buvo sintetinama ir žymima 32P kaip aprašyta paragrafe a), bet naudojant mRNR iš micelio, kuris kultivuojamas tol, kol augimo terpėje išnaudojama gliukozė, ir dar inkubuojama 1 valandą ilgiau 37 °C temperatūroje nesant fenilacetato. c) cDNR bibliotekos konstravimas λgt10 vektoriuje, naudojant cDNR išskirtą iš micelio, auginamo esant 10 mM fenilacetato, kaip vienintelio anglies šaltinio. Šių cDNR bibliotekų konstravime pirmosios cDNR grandinės sintezės reakcija buvo atliekama kaip aprašyta anksčiau. Išskirtas cDNR-RNR hibridas buvo paverstas j dvigrandę cDNR, įvedant į RNR grandinę su RN-aze H atsitiktinius trūkius, kurie buvo naudojami kaip pradiniai taškai Escherichia coli DNR polimerazei I. Prie šio cDNR bukų galų preparato norint pridėti EcoRI galus, sintetiniai adaptoriai, kurie turi buką fosforilintą galą ir EcoRI išsikišusį (“lipnų”) galą, ir dvigrandė DNR buvo inkubuojama su T4 ligaze. cDNR su EcoRI galu po to buvo išgrynintos ir fosforilintos, naudojant T4 polinukleotidkinazę ir ATP. Fosforilintą cDNR buvo sumaišyta su Xgt10 vektoriumi, kuris prieš tai buvo sukarpytas su EcoRI ir defosforilintas, ir mišinys inkubuojamas su T4 DNR ligaze. Rekombinantinės DNR molekulės supokuotos in vitro, naudojant komercinius pokavimo ekstraktus. Rekombinantiniai fagai, kuriuose cDNR intarpai inaktyvavo cl geną (kuriuose yra EcoRI kirpimo vieta) buvo atrinkti pagal jų lyzės fenotipą E. coli hf1 kamiene (F-, thi-1, thr-1, IquB6, lacY1, tonA21, supE44, hflA150, [chr::Tn10]). d) cDNR bibliotekų atrinkimas. cDNR bibliotekos buvo išsėtos ant E. coli C600 kamieno ir susidarę lyzės dėmės buvo perkeltos dviem egzemplioriais ant nitroceliuliozės filtrų. Viena iš kopijų buvo hibridizuota su “plius” cDNR zondu (aprašyta a)), o antroji kopija buvo hibridizuota su “minus” cDNR zondu (aprašyta b)). Klonai, kurie hibridizavosi su “plius” zondu ir nesihibridizavo su “minus” zondu, buvo atrinkti ir išgryninti. 11 e) cDNR, atitinkančios phacA geną, identifikavimas. cDNR intarpas buvo iškirptas iš vektoriaus, veikiant endonukleaze Notl, naudojant Notl kirpimo vietas, esančias adaptoriuje. Atrinktų klonų intarpai buvo perklonuoti j pBluescript SK(+) plazmidę, sukarpyti su Notl ir po to sekvenuoti standartiniais metodais. cDNR intarpų sekos buvo schematiškai interpretuotos šešiuose skaitymo rėmeliuose ir sulygintos naudojant algoritmą BLAST su schematiniu (abstrakčiu) interpretavimu šešiuose skaitymo rėmeliuose viešai prieinamų DNR sekų duomenų bankų GenBank ir EMBL arba su baltymų sekų duomenų bazėmis SvvissProt ir PIR. Viena iš cDNR intarpo sekų duoda ekstensyvų atvirą skaitymo rėmelj, nepertraukiamą terminacijos kodonais. Išvestoji aminorūgščių seka rodo žymų tapatumą su citochromo P450 šeimos baltymų, kurie paprastai susiję su oksidacijos reakcijomis, aminorūgščių sekomis. Kaip bus parodyta vėliau (žr. 3 pavyzdj), atviras skaitymo rėmelis koduoja fenilacetato 2-hidroksilazę. Šis cDNR intarpas buvo panaudotas hibridizacijos būdu gauti naujus cDNR klonus, atitinkančius šį geną. Šie klonai buvo sekvenuoti nuo abiejų grandinių ir gauta 1554 bp nukleotidų seka, pavaizduota atviru skaitymo rėmeliu, kuris koduoja 518 aminorūgščių polipeptidą (SEQ ID NO: 2). Šios sekos identiškumas su citochromo P450 šeimos baltymais neabejotinai įrodo, kad šis nustatytas baltymas atstovauja naują šios šeimos narį. f) phacA geno klonavimas.

Anidulans DNR genomo biblioteka, sukonstruota λΕΜΒΙ_4 vektoriuje, buvo atrenkama su 32P žymėtu cDNR zondu, atitinkančiu beveik pilną transkriptą. Teigiami klonai buvo išvalyti ir jų intarpai charakterizuoti pagal skaidymą restrikcijos fermentais ir hibridizaciją aukščiau minėtu zondu.Tokiu būdu buvo pažymėta dviejų gretimų 2,4 ir 1,9 kb ilgio BamHI fragmentų hibridizacijos zona. Fig. 4 parodytas genomo srities, turinčios šiuos fragmentus, restrikcijos žemėlapis. Šie BamHI fragmentai buvo perklonuoti į pBluescript SK (+). 12

Rekombinantinė plazmidė, turinti 2,4 kb BamHI fragmentą, pavadinta pBS-FG4A, o plazmidė, turinti 1,9 kb BamHI fragmentą, pavadinta pBS-FG4B. 2 PAVYZDYS. P. chrysogenum pahA GENO, KURIS YRA FUNKCIŠKAI HOMOLOGIŠKAS A. niduians phacA GENUI, KLONAVIMAS IR CHARAKTERIZAVIMAS. a) P. chrysogenum pahA geno klonavimas ir jo nukleotidų sekos nustatymas. P. chrysogenum VVisconsin 54-1255 genomo biblioteka, sukonstruota dalinius Sau3A fragmentus klonavus j XEMBL4 BamHI kirpimo vietą, buvo atrenkama su radioaktyviai žymėtu (32P) cDNR zondu, atitinkančiu beveik pilną phacA geną. Naudojant standartines technikas, maždaug 12 000 klonų buvo perkelta ant celiuliozės filtrų. Po to jie buvo 24 valandas hibridizuoti 37°C buferyje, turinčiame 50 % formamido, 5 χ Denhard tirpalo, 5 χ SSC, 0,1 % SDS, 50 μΜ/ml ultragarsintos silkių spermos viengrandės DNR ir 50 ng žymėto zondo. Galutinis hibridizuotų filtrų plovimas buvo atliekamas 0,2 χ SSC ir 0,1 % SDS 37 °C temperatūroje. Šiuo būdu buvo išvalyta dešimt klonų ir išskirta jų DNR. Šių klonų intarpai po to buvo charakterizuoti karpant restrikcijos fermentais ir hibridizuojant su anksčiau minėtu zondu. Hibridizacijos sritis buvo lokalizuota 2,55 kb Xhol fragmente, kurio restrikcijos žemėlapis parodytas fig. 5. Šis DNR fragmentas buvo perklonuotas j plazmidę pBluescript SK(+), gaunant plazmidę pALP520. Xhol fragmento, turinčio pahA geną, nukleotidų seka (fig. 5) buvo nustatyta didezoksinukleotidų metodu (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467). b) P. chrysogenum cDNR bibliotekos iš išvalytos RNR konstravimas, esant penicilino gamybos sąlygoms. cDNR, atitinkančios pahA geną, charakterizavimas. 13

Micelis iš pramoninio P. chrysogenum kamieno fermentatoriaus kultūros, augančios penicilino gamybos sąlygomis, buvo surinktas po 100, 124 ir 148 valandų inkubacijos ir naudojamas išskirti poly(A+) mRNR, naudojant Poly (A)

Quick mRNR Kit (Sratagene). Ši poly(A+) mRNR buvo naudojama kaip matrica konstruojant cDNR biblioteką, naudojant Zap-cDNR Synthesis Kit (Stratagene), sutinkamai su gamintojo instrukcijomis. Dvigrandė cDNR buvo jterpta į vektoriaus λΖΑΡ EcoRI ir Xhol kirpimo vietas, transkripto 5’ galui esant EcoRI kirpimo vietos pusėje. cDNR biblioteka buvo supokuota naudojant Gigapack II Gold pokavimo ekstraktą (Stratagene), pagaminant apie 106 nepriklausomų klonų. Šios cDNR bibliotekos atrinkimas buvo vykdomas standartiniais metodais (Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T, (1989), Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), naudojant 1174 bp EcoRV fragmentą su pahA genu kaip zondą (fig. 5). Šiuo būdu buvo išskirta dvylika teigiamų rekombinantinių klonų (pavadinti #1 iki #12) ir klonas su didžiausiu intarpu (maždaug 1600 bp) buvo atrinktas charakterizavimui. Buvo nustatyta šio klono pilna nukleotidų seka. Pastebėta, kad ji turi 1548 bp atvirą skaitymo rėmelį (ORF), kuris koduoja 516 aminorūgščių polipeptidą, turintį 58112 Da molekulinę masę ir 84 % aminorūgščių sekos identiškumą su A nidulans phacA geno koduojamu baltymu. Kaip ir homologinio A nidulans geno atveju, duomenų bazės tyrimas parodė žymų identiškumą tarp PahA baltymo ir P450 baltymų šeimos narių. PahA baltymas turi seką Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly (liekanos 430-438, SEQ ID NO: 4), kuri charakterizuoja šį baltymų tipą (žiūrėti detalų šio išradimo aprašymą). Iš šių rezultatų daroma išvada, kad P. chrysogenum pahA genas yra homologinis A. nidulans phacA genui.

3 PAVYZDYS. A nidulans phacA GENO INAKTYVAVIMAS REVERSINE GENETIKA A.nidulans phacA geno laukinis alelis buvo pakeistas mutantiniu aleliu, kuriame dalis koduojančios srities, matyt esminės jos funkcijai (liekanos 298-392 14 sekoje SEQ ID NO:1), buvo supresuota, pakeičiant argB+ genu. Tokiu būdu ši genetinė manipuliacija nukirpo phacA geną ties 297 kodonu, pagamindama nulinį mutantinį alelį.

Be to iš plazmidės pBS-FG4B (fig. 4) būvi išskirtas Kpnl-EcoRI fragmentas ir perklonuotas į pUC18, sukarpytą šiais dviem fermentais, gaunant plazmidę pUCB. Po to iš plazmidės pBS-FG4A (fig. 4) buvo išskirtas 1,9 kb Nael fragmentas ir klonuotas į pBluescript SK(+), sukarpytą Smal. Buvo atrinkta plazmidė, kurioje nepilno phacA geno (prasidedančio nuo Nael kirpimo vietos) koduojanti grandinė buvo rasta toje pačioje orientacijoje, kaip genas, koduojantis β-galaktozidazę vektoriuje. Ši plazmidė pavadinta pBSA. Iš pBSA išskirtas Xbal-Hindlll DNR fragmentas, įstatytas į pUCB, sukarpytą Xbal- Hindlll, gaunant plazmidę pUCA-B. Galiausiai, 3,2 kb DNR fragmentas, turintis A nidulans argB+ geną, buvo įterptas pUCA-B Xbal kirpimo vietoje, gaunant phacA: :argB+. Pradedant nuo pUC18 lacZ promotoriaus, phacA: :argB turi 0,94 kb phacA geno 5’ srities fragmentą, einantį nuosekliai ties pirmais 297 jo genomo sekos kodonais, 3,2 kb fragmentą, turintį argB geną, phacA geno genomo seką, atitinkančią 393-518 kodonus, ir 1,2 kb phacA geno 3’ srities. Linijinis fragmentas, turintis visas šias sritis, gali būti išskirtas iš plazmidės, kerpant ją EcoRI (fig. 6).

Taip pat transformacija gali būti naudojama konstruoti A nidulans kamieną kuris turi phacA gene skaldymo-delecijos mutaciją, naudojant šį linijinį fragmentą ir taikant apibenrintą strategiją, aprašytą aukščiau. Šiuo tikslu A. nidulans biA1, methGI, argB2 kamienų protoplastai buvo transformuoti 2 μg šio DNR fragmento pagal Tilburn, J., Scazzocchio, C., Taylor, G.G., Zabicky-Zissman, J.H., Lockington, R.A. ir Davės, R.W.(1983) Gene 26: 205-211. Transformantai buvo atrinkti pagal arginino prototrofiškumą, naudojant tinkamą selektyvią terpę ir po to išvalyti. DNR buvo išskirta iš atitinkamos transformatų serijos micelio, sukarpyta su Pstl ir analizuota Sauthern’o hibridizacijos būdu, naudojant specifinius phacA ir argB genų zondus. Transformantų, kurie rodė hibridizaciją ir iš kurių buvo tikimasi sėkmingo dvigubo susikryžminimo, skaičius parodytas fig.1. Pavyzdžiui, naudojant zondu phacA geno 0,9 kb Pstl fragmentą (žr. fig. 4), 15 surasta, kad atskira 0.9 kb hibridizacijos grupė receptoriaus kamiene gali būti pakeista 3,8 kb grupe transformantuose, kurių atskleistas integracijos tipas parodytas fig. 1. Ši grupė taip pat hibridizuojasi su argB zondu. Du iš šių transformantų buvo atrinkti vėlesniam charakterizavimui ir pavadinti Δ phacA #1 ir Δ phacA #2. Šie transformuoti kamienai galėjo augti terpėse su fenilalaninu, 2-hidroksifenilacetatu arba 2,5-dihidroksifenilacetatu kaip vieninteliu anglies šaltiniu, bet priešingai jie negalėjo augti terpėje su fenilacetatu, kaip anglies šaltiniu. Tai parėmė išvadą, kad fermentas citochromas P450, koduojamas A nidulans phacA geno (arba koduojamas P. chrysogenum pahA geno), turi aktyvumą, kuris hidroksilina fenilacetatą iki 2-hidroksifenilacetato, šis aktyvumas katalizuoja A. nidulans fenilacetato panaudojimo kelio pirmą pakopą (žr. Ankstesnės žinios). A. nidulans A phacA #1 kamienas, kuris fenotipiškai neatskiriamas nuo Δ phacA #2 kamieno 1996 m. birželio 19 d. buvo atiduotas saugoti j Spanish Collection of Type Cultures (CECT), University of Valensia, Research Building, Burjasot Campus, 46100, Valensia , kaip A nidulans biA1 veA1 methGI argB2 phacA :: [pPhacA :: argB+] su registracijos numeriu CECT 20195. P. chrysogenum transformantų su inaktyvuotu pahA genu išskyrimas yra labai aiškus kvalifikuotam šios srities specialistui. P. chrysogenum pahA geno išskyrimas yra paprastas hibridizuojant su A. nidulans phacA genu, esančiu transformantų CECT 20195 arba pasirinktinai hibridizuojant su sintetiniais oligonukleotidais, esančiais SEQ ID NO: 1. Vėliau, naudojant plazmidę pALfleoZ (1997 m. vasario 20 d. atiduotą saugoti į Spanish Collection of Type Cultures (CECT), University of Valencia su registracijos numeriu CECT 4849), buvo sukonstruota plazmidė pALP696, kaip parodyta šio patento fig. 7. 4 PAVYZDYS. BANDYMAS IN AKTYVUOTI phacA GENO FUNKCIJĄ IR PADIDINTI PENICILINO IŠEIGĄ.

Norint nustatyti kas pagerina penicilino išeigą, reikia pašalinus geno phacA koduojamą fenilacetato 2-hidroksilazinj aktyvumą eksperimentiškai išmatuoti Δ 16 phacA kamieno produkuojamą penicilino lygį ir palyginti jį su kamieno phac + . Abu kamienai buvo palyginti pagal fermentaciją kolbose minimalioje terpėje, turinčioje 2,5 % (m/t) laktozės, kaip svarbiausias anglies šaltinis ir 2,5 % (m/t) grūdų ekstrakto agaro, su skirtingais kiekiais natrio fenilacetato (m/t) kaip pažymėta. Kultūros buvo inokuliuojamos lygiu skaičiumi gyvų konidiosporų (2 χ 106/ml) ir inkubuojama 37° C temperatūroje su sukamuoju maišymu (250 aps/min.). Mėginiai buvo imami skirtingu laiku, filtruojami per Miracloth, ir supernatantai buvo naudojami matuoti biopavyzdyje produkuotam penicilinui.

Biomėginiams 1ml Micrococcus luteus kultūros auginama iki OD6oo = 6, sumaišyta su 11 terpės Antibiotic No. 1 (Difco) 50 °C. Šis mišinys buvo išpilstytas j 13,6 cm Petri lėkšteles (65 ml/lėkšt.). 100 μΙ mėginiai su atitinkamu supernatantu iš kultūros (tinkamai praskiesti 10 mM natrio fosfato buferiu, pH 6,8) buvo sudėti j 8 mm diametro indelius. Pripildytos lėkštelės buvo inkubuojamos 2 valandas 4 °C temperatūroje ir toliau 22 valandas 37 °C temperatūroje. Po to, buvo išmatuotos bakterijų augimo inhibicijos zonos, susidariusios dėl penicilino buvimo pavyzdžiuose, ir nustatomas antibiotiko kiekis palyginant su kalibracine tiese, gauta su skirtingais penicilino G kalio kiekiais.

Fig. 3 rodo, kad aukščiausias penicilino lygis, atitinkantis kontrolinį kamieną phacA +, buvo išskirtas po 24 valandų, naudojant 0,125 % fenilacetato auginimo terpėje. Išeiga, pasiekta per šj laiką, buvo 1,8 μg/ml penicilino. Sumažinus fenilacetato koncentraciją, sumažėja maksimalus šio kamieno produkuojamas penicilino lygis iki 1,1 μg/ml.

Fig. 3 taip pat rodo žymų skirtumą tarp aukščiausio penicilino lygio Δ phacA kamieno kultūroje, kuris siekia 5,6 μg/ml, t.y. 3,1 karto aukštesnis negu pradiniame kamiene. Be to, kaip phacA geno inaktyvavimo rezultatas, penicilino produkcijos padidėjimas nebuvo veikiamas pradinės fenilacetato koncentracijos sumažėjimo iki 0,0625 %.

Daroma išvada, kad skilimo-delecijos mutacija phacA gene, koduojančiame fenilacetato 2-hidroksilazinj aktyvumą, gaunama reversinės 17

17 M genetikos technika, kaip parodyta fig. 1, turi mažiausiai du pritaikymus penicilino gamyboje iš A nidulans : (I) penicilino lygis yra žymiai padidėjęs ir (II) penicilino gamyba mažiau priklausoma nuo išorinio fenilacetato tiekimo.

Detalus figūrų aprašymas

Fig. 1: Strategija, naudojama skilimo-delecijos mutacijos įvedimui į A nidulans phacA geną homologinės rekombinacijos būdu. Tariamas sukryžminimas parodytas dideliais paryškintais kryžiais.

Fig. 2: Strategija, naudojama skilimo-delecijos mutacijos įvedimui į P. chrysogenum pahA geną homologinės rekombinacijos būdu. Tariamas sukryžminimas parodytas dideliais punktyrinių linijų kryžiais.

Fig. 3: Penicilino išeiga A nidulans transformuotame kamiene phacA::argB palyginus su laukinio tipo kamienu (phacA +). Abscisių ašyje: laikas valandomis (h); ordinačių: penicilino išeiga ^g/ml,). Ištisinė linija: fenilacetato koncentracija 0,125 %; punktyrinė linija: fenilacetato koncentracija 0,0625 %.

Fig. 4: A nidulans genomo srities, turinčios phacA geną, restrikcinis žemėlapis, rodantis fragmentus, kurie buvo perklonuoti sukuriant plazmides pFG4A ir pFG4B. Tamsi zona yra 3 intronai.

Fig. 5: P. chrysogenum genomo srities, turinčios pahA geną, restrikcinis žemėlapis, rodantis 2,55 kb Xhol fragmentą, kuris buvo perklonuotas sukuriant plazmidę pALP520. Tamsi zona yra 3 intronai.

Fig. 6: pPhacA :: argB+ inaktyvacijos konstrukto argB restrikcinis žemėlapis ir svarbios charakteristikos. Tamsi zona yra sekos sritis, turinti phacA geną; šviesi zona - šoninės zonos prieš ir už phacA geno; dryžuota zona yra argB+ sritis.

Fig. 7: pALP696 inaktyvacijos konstrukto restrikcinis žemėlapis ir svarbios charakteristikos. Tamsi zona yra sekos sritis, turinti pahA geną, (1745 bp); balta sritis - šoninės zonos prieš ir už pahA geno (4143 bp); dryžuota zona yra bleR geno fleomicino rezistentiškumo sritis (2048 bp). 18 18

SEKŲ SĄRAŠAS PAGRINDINE INFORMACIJA: PAREIŠKĖJAS: PAVADINIMAS: ANTIBIOTICOS S.A.U. GATVĖ: Avda. de Burgos, 8 -A MIESTAS: Madridas VALSTIJA ARBA PROVINCIJA: Madridas ŠALIS: Ispanija PAŠTO KODAS: 28036 TELEFONAS: 91-3841200 FAKSAS: 91-3841220

PAVADINIMAS: “FENILACETATO KATABOLIZMO FERMENTUS KODUOJANČIŲ GENŲ INAKTYVAVIMO BŪDAS, SU TUO SUSIJĘ PLAZMIDĖS IR JOMIS TRANSFORMUOTI KAMIENAI” SEKŲ SKAIČIUS: 4 KORESPONDENCIJOS ADRESAS: ADRESAS: ANTIBIOTICS, S.A.U. GATVĖ: Avda. de Burgos, 8 -A MIESTAS: Madridas VALSTIJA ARBA PROVINCIJA: Madridas ŠALIS: Ispanija PAŠTO KODAS: 28036 19 KOMPIUTERIU NUSKAITOMA FORMA:

LAIKMENOS TIPAS: 3,5 colio diskelis KOMPIUTERIS: PC OPERACINĖ SISTEMA: WINDOWS PROGRAMINĖ J RANGA: WORD INFORMACIJA APIE JURISTĄ/AGENTĄ: PAVARDĖ: ALBERTO DE ELZABURU REGISTRACIJOS NUMERIS: 232/1 INFORMACIJOS/REGISTRACIJOS NUMERIS: PTC-42 TELEKOMUNIKACINE INFORMACIJA: TELEFONAS: 91 7009400 FAKSAS: 91 3193810 TELEKSAS ARBA ELEKTRONINIS PAŠTAS: elzaburu@elzaburu.es INFORMACIJA SEQ ID NO: 1 SEKOS CHARAKTERISTIKOS: ILGIS: 1986 bazių poros TIPAS: nukleotidai VIJIŠKUMAS: 2 KONFIGŪRACIJA: linijinė

MOLEKULIŲ TIPAS: genominė DNR

HIPOTETIŠKUMAS: NĖRA

ANTISENSIŠKUMAS: NĖRA ORIGINALUS ŠALTINIS: Aspergillus nidulans TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidė pPhacA::argB+ PADĖTIS GENOME: nežinoma CHARAKTERISTIKOS: 20 PAVADINIMAS/RAKTAS: koduojanti sritis VIETA: 82...1810 KITA INFORMACIJA: phacA genas SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO: 1 C CAGCCAGATA TAAAGGCCGT 21 CCTTAGACGA CTTGATCTTA CTCTGGTTTC TAAAAGTTCA CTGATTATCG CAAGGTATCC 81 AT G TCT CTT CAA ACA AT C GGG AT C GCC GCT GTC GCG GTG GTC TAT TTT 129 Met Ser Leu Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ala Vai Ala Vai Vai Tyr Phe 5 10 15 CTC AT C CGC TAC TTC AAC CGC ACA GAC AT C CCA AAG AT C AAG GGT CTC 177 Leu Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys Gly Leu 20 25 30 CCT GAA GTT CCA GGC GTA CCG AT C TTT GGC AAC CTC AT C CAG CTC GGT 225 Pro Glu Vai Pro Gly Vai Pro Ile Phe Gly Asn Leu Ile Gln Leu Gly 35 40 45 GAC CAG CAC GCG ACC GTA GCG CAG AAA TGG GCG AAG AAA TTT GGA CCT 273 Asp Gln His Ala Thr Vai Ala Gln Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro 50 55 60 GTT TTC CAG GTT CGC ATG GGG AAT AAA GTGAGTTCRG TGTCTGCATT TGTAAC 326 Vai Phe Gln Vai Arg Met Gly Asn Lys 65 70 AGAC GACAATAT T G CGAGAATAAT TCTGACCTAA CACAG CGC GTT GTC TTC GCA 380 Arg Vai 75 GAT Vai Phe Ala AAC ACC TTC GAC TCT GTC CGT CAG CTA TGG AT C AAA CAG TCC GCG 428 Asn Thr Phe Asp Ser Vai Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Gln Ser Ala 80 85 90 CTC AT C TCC CGG CCG ACC TTT CAC ACC TTC CAC AGT GTA GTT TCC AGC 476 Leu Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Vai Vai Ser Ser 95 100 105 110 TCT CAG GGA TTC ACC AT C GGA ACG TCG CCG TGG GAC GAG TCG TGC AAG 524 Ser Gln GI y Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Glu Ser Cys Lys 115 120 125 CGT CGT CGG AAG GCT GCA GCT ACA GCC TTG AAC CGC CCG GCT ACC CAG 572 Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Thr Gln 130 135 140 TCG TAT ATG CCT ATT AT C GAT CTT GAG TCG ATG TCG AGT AT C CGG GAA 620 Ser Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Met Ser Ser Ile Arg Glu 145 150 155 TTG CTC AGG GAT AGC GCG AAT GGA ACA ATG GAT AT C AAC CCG ACA GCG 668 Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn Gly Thr Met Asp Ile Asn Pro Thr Ala 160 165 170 TAC TTC CAG CGG TTC GCG TTG AAC ACG AGC TTA ACA TTG AAC TAT GGA 716 Tyr Phe Gln Arg Phe Ala Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly 175 180 185 190 AT C CGA AT C GAG GGC AAT GTG AAC GAT GAG CTT TTG CGC GAA ATT GTC 764 Ile Arg Ile Glu Gly Asn Vai Asn Asp Glu Leu Leu Arg Glu Ile Vai 195 200 205 GAT GTC GAG CGC GGG GTG TCG AAC TTC CGG AGT ACC AGC AAC CAG TGG 812 Asp Vai Glu Arg Gly Vai Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Gln Trp 210 215 220

21 M CAG GAC TAT AT C CCG CTC CTG AGA AT C TTC CCG AAG ATG AAC CGC GAG 860 Gln Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Arg Glu 225 230 235 GCT GAG GAG TTC CGG GTG CGG AGA GAC AAG TAT CTT ACC TAT CTT TTG 908 Ala Glu Glu Phe Arg Vai Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu 240 245 250 GAT GTT CTC AAG GAT CGC ATT GCA AAG GGA ACC GAC AAG CCC TGT ATT 956 Asp Vai Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys GI y Thr Asp Lys Pro Cys Ile 255 260 265 270 ACT GGA AAC AT C CTC AAA GAC CCT GAG GCT AAG CTC AAT GAT G GTATG 1004 Thr GI y Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp 275 280 CCGTC CGGTCCTGTC CGCGCTTGAA GGAAAATAAA GATTAACAGA GTCTAG CC GAG 1060 Ala Glu 285 ATT AAA TCG AT C TGC TTG ACC ATG GTC TCC GCC GGC CTC GAT ACT GTT 1108 Ile Lys Ser Ile Cys Leu Thr Met Vai Ser Ala Gly Leu Asp Thr Vai 290 295 300 CCG GGC AAC TTG AT C ATG GGC AT C GCG TAC CTC GCC TCC GAA GAC GGC 1156 Pro Gly Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly 305 310 315 CAA AGG AT C CAG AAG CGC GCC CAC GAC GAG AT C ATG AAA GTC TAC CCG 1204 Gln Arg Ile Gln Lys Arg Ala His Asp Glu Ile Met Lys Vai Tyr Pro 320 325 330 GAC GGC GAT GCA TGG GAG AAA TGC CTG CTC GAA GAG AAA GTC CCC TAC 1252 Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu Glu Lys Vai Pro Tyr 335 340 345 350 GTC ACA GCT TTG GTC AAA GAA ACC CTC CGC TTC TGG ACT GTC ATT CCC 1300 Vai Thr Ala Leu Vai Lys Glu Thr Leu Arg Phe Trp Thr Vai Ile Pro 355 360 365 AT C TGT CTG CCT AGA GAA AAC ACC AAG GAT ATT GTC TGG AAC GGA GCC 1348 Ile Cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys Asp Ile Vai Trp Asn Gly Ala 370 375 380 GTT AT C CCT AAG GGA ACG ACC TTT TTC ATG AAC GCC TAC GCT GCA GAC 1396 Vai Ile Pro Lys Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Ala Tyr Ala Ala Asp 385 390 395 TAC GAC GAA ACA CAC TTC ACC AAT CCA CAC GCC TTT GAA CCA GAA CGC 1444 Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr Asn Pro His Ala Phe Glu Pro Glu Arg 400 405 410 TAC CTC ACC GCC TCA· • TCT GAC GGC TCC GGC ACT CCA CAC TAC GGC TAC 1492 Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gly Thr Pro His Tyr Gly Tyr 415 420 425 430 GGC GCG GGC TCG CGC ATG GTACCTCCCC CACAACCCAC ATGTTATATA GACAAT 1546 Gly Įla Gly Ser Arg Met 435 ACTG ATTTATTAT G AAG TGC GCT GGC TCG CAT CTT GCG AAC CGC GAG CTC 1596 Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu 440 445 TTC ACC GCT TAC GTC CGT CTG AT C ACA GCA TTT ACC ATG CAT CCA GCT 1644 Phe Thr Ala Tyr Vai Arg Leu Ile Thr Ala Phe Thr Met His Pro Ala 450 455 460 AAG AGG GCT GAG GAT CGG CCG AT C CTC GAT GCG ATT GAG TGT AAT GCG 1692 Lys Arg Ala Glu Asp Arg Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Cys Asn Ala 465 470 475 AT C CCG ACC GCT TTG ACG ACG GAG CCG AAG CCC TTC AAG GTT GGG TTT 1740 Ile Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Vai Gly Phe 480 485 490 495 22 AAA CCG AGA GAT CCT GTC TTG GTA AGG AAA TGG ATT GCG GAG AGT GAG 1788

Lys Pro Arg Asp Pro Vai Leu Vai Arg Lys Trp Ile Ala Glu Ser Glu 500 505 510 GAG AGG ACG AAG CAC CTG AAT TAGTTTTTCT TTTCTTTCTT GCGTGCAAGT TAC 1842 Glu Arg Thr Lys His Leu Asn 515 AGCGCAATTT ATACTTAGCT GGGACATGGT CGATTGGAGT ATACTGATTT CAGCAACAGC 1902 GCAAATAAAA ATAAGGCAAC CAATAGAAAT GCAACAATAT GCAATCTCCC AAGACCATTA 1962 AATGGTTGAT CAGATGATCC CAAG 1986 INFORMACIJA SEQ ID NO: 2 SEKOS CHARAKTERISTIKOS: ILGIS: 518 amino rūgščių VIJIŠKUMAS: 1 KONFIGŪRACIJA: linijinė MOLEKULĖS TIPAS: peptidas ORIGINALUS ŠALTINIS; Aspergillus nidulans CHARAKTERISTIKOS; KITA INFORMACIJA: fermento fenilacetato 2-hidroksilazės amino rūgščių seka CHARAKTERISTIKOS: KITA INFORMACIJA: Molekulinis svoris 58495 Da. SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO: 2

Met Ser Leu Gln Thr Ile Gly Ile Ala Ala Vai Ala Vai Vai Tyr 5 10 15 Phe Leu Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys 20 25 30 GI y Leu Pro Glu Vai Pro Gly Vai Pro Ile Phe Gly Asn Leu Ile 35 40 45 Gln Leu GI y Asp Gln His Ala Thr Vai Ala Gln Lys Trp Ala Lys 50 55 60 Lys Phe Gly Pro Vai Phe Gln Vai Arg Met Gly Asn Lys Arg Vai 65 70 75 Vai Phe Ala Asn Thr Phe Asp Ser Vai Arg Gln Leu Trp Ile Lys 80 85 90 Asp Gln Ser Ala Leu Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His 95 100 105 Ser Vai Vai Ser Ser Ser Gln Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro 110 115 120 Trp Asp Glu Ser Cys Lys Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala 23 125 Leu Asn Arg Pro Ala 140 Thr Gln Glu Ser Met Ser Ser 155 Ile Arg Gly Thr Met Asp Ile 170 Asn Pro Leu Asn Thr Ser Leu 185 Thr Leu Asn Vai Asn Asp Glu 200 Leu Leu Gly Vai Ser Asn Phe 215 Arg Ser Ile Pro Leu Leu Arg 230 Ile Phe Glu Phe Arg Vai Arg 245 Arg Asp Vai Leu Lys Asp Arg 260 Ile Ala Thr Gly Asn Ile Leu 275 Lys Asp Glu Ile Lys Ser Ile 290 Cys Leu Thr Vai Pro Gly Asn 305 Leu Ile Glu Asp Gly Gln Arg 320 Ile Gln Lys Vai Tyr Pro Asp 335 Gly Asp Glu Lys Vai Pro Tyr 350 Vai Thr Phe Trp Thr Vai Ile 365 Pro Ile Asp Ile Vai Trp Asn 380 Gly Ala Phe Met Asn Ala Tyr 395 Ala Ala Asn Pro His Ala Phe 410 Glu Pro Asp Gly Ser Gly Thr 425 Pro His Met Cys Ala Gly Ser 440 His Leu Tyr Vai Arg Leu Ile 455 Thr Ala Ala Glu Asp Arg Pro 470 Ile Leu Pro Thr Ala Leu Thr 485 Thr Glu Lys Pro Arg Asp Pro 500 Vai Leu Glu Glu Arg Thr Lys 515 His Leu 130 135 Ser Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu 145 150 Glu Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn 160 165 Thr Ala Tyr Phe Gln Arg Phe Ala 175 180 Asn Tyr Gly Ile Arg Ile Glu Gly 190 195 Arg Glu Ile Vai Asp Vai Glu Arg 205 210 Thr Ser Asn Gln Trp Gln Asp Tyr 220 225 Pro Lys Met Asn Arg Glu Ala Glu 235 240 Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp 250 255 Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile 265 270 Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala 280 285 Thr Met Vai Ser Ala Gly Leu Asp 295 300 Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser 310 315 Lys Arg Ala His Asp Glu Ile Met 325 330 Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu 340 345 Ala Leu Vai Lys Glu Thr Leu Arg 355 360 cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys 370 375 Vai Ile Pro Lys Gly Thr Thr Phe 385 390 Asp Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr 400 405 Glu Arg Tyr Leu Thr Ala Ser Ser 415 420 Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Arg 430 435 Ala Asn Arg Glu Leu Phe Thr Ala 445 450 Phe Thr Met His Pro Ala Lys Arg 460 465 Asp Ala Ile Glu Cys Asn Ala Ile 475 480 Pro Lys Pro Phe Lys Vai Gly Phe 490 495 Vai Arg Lys Trp Ile Ala Glu Ser 505 510 Asn 24 INFORMACIJA SEQ ID NO: 3 SEKOS CHARAKTERISTIKOS: ILGIS: 2558 bazių porų TIPAS: nukleotidai VIJIŠKUMAS: 2 KONFIGŪRACIJA: linijinė

MOLEKULĖS TIPAS: genominė DNR

HIPOTETIŠKŲ MAS; NĖRA

ANTIPRASMIŠKUMAS: NĖRA ORIGINALUS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidė pALP520 PADĖTIS GENOME: nežinoma CHARAKTERISTIKOS: PAVADI NIMAS/RAKTAS: koduojanti seka PADĖTIS: 371...2094 CHARAKTERISTIKOS: KITA INFORMACIJA: pahA genas SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO: 3 CTCGAGAAGG TCTGTTGACA CGAGTCCACA AGATGTTGCG AAGTATATAA TATGAGAAAT 60 GGATATACAG CGGAAAATTG AAGTTTCATT CCGCGGGGGC GGGGAACAAG AGGAAGCGCG 120 GAATGAACAT TCCGTCTATG CGCGGTGGAG AGATCTTCG1 ACTGGGGACT TGTGGACTTG 180 GACCTATGAG AGAGCTGCCT TTACTGATTC TGGGACTTGT GGCCAATGAA ACAT GT CAT G 240 GATGTTACAG CTTTCTTTAT GCGACTCTCT AAACTCGGAA ATATGCCGTA GCCGAAATGC 300 AGGAAAGGCT GGGCTATAAG AGATGCATGC TCCCACCGAA CGTCTGCAAT TCCTTGTTTC 360 ACTCTATATC ATG GCC AT C CAA ACA CTC GCA GTC GCC GTG AT C ACG GTG GTC 412 Met Ala Ile Gln Thr Leu Ala Vai Ala Vai Ile Thr Vai Vai 5 10 TAT TTC GTC ATT CGA TAC TTC AAC CGC ACT GAT AT C CCT AAG ATT AAA 4 60

Tyr Phe Vai Ile Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys 15 20 25 30 GGC CTC CCG GAG ATT CCT GGT ATA CCC ΑΤΑ TTT GGC AAT CTA TTG CAG 508

Gly Leu Pro Glu Ile Pro Gly Ile Pro Ile Phe Gly Asn Leu Leu Gln 35 40 45

CTA GGA GAT CAA CAT GCC ACA GTC ACG GGG AAA TGG GCA AAG AAA TTT

Leu Gly Asp Gln His Ala Thr Vai Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe 50 55 60 556 25 GGC CCA GTT TTC CAA GTG CGC ATG GGA AAC AAG GTAAGTAATC AAATAATCTT 609 Gly Pro Vai Phe Gln Vai Arg Met Gly Asn Lys 65 70 TTAAATCGGA CATTCTGATA ATCTAATGCC CTTTTAG CGC AT C GTG TTC GCC AAC 664

Arg Ile Vai Phe Ala Asn 75 GGC TTT GAC TCC GTT CGT CAA TTG TGG ATT AAG GAC TCG TCG GCT CTG 712 Gly Phe Asp Ser Vai Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Ser Ser Ala Leu 80 85 90 95 ATC TCC CGC CCA ACT TTC CAC ACT TTC CAC AGC GTC GTC TCC AGT TCA 760 Ile Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Vai Vai Ser Ser Ser 100 105 110 CAG GGC TTC ACG ATC GGA ACT TCC CCG TGG GAT GAT TCC TGT AAG AAA 808 Gln Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys 115 120 125 CGT CGC AAG GCA GCT GCC ACT GCG CTG AAT CGA CCG GCC GTG CAA TCG 856 Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Vai Gln Ser 130 135 140 TAT ATG CCC ATC ATC GAT CTT GAA TCC AAT TCC AGC ATC AAA GAA CTG 904 Tyr Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Asn Ser Ser Ile Lys Glu Leu 145 150 155 TAC CGG GAC AGC CAA AAT GGC AAA CGT GAT GTG AAT CCC ACT GCA TAC 952 Tyr Arg Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Vai Asn Pro Thr Ala Tyr 160 165 170 175 TTC CAG CGA TAC GCT TTC AAC ACC AGT TTG ACT TTG AAC TAT GGA TTC 1000 Phe Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe 180 185 190 CGC ATC GAG GGC AAT GTG GAT GAT ACG CTG CTG CAT GAG ATT GTG GAT 1048 Arg Ile Glu Gly Asn Vai Asp Asp Thr Leu Leu His Glu Ile Vai Asp 195 200 205 GTG GAG CGT GGT GTG TCC AAC TTC CGC AGC ACT TCG AAC AAC TGG CAG 1096 Vai Glu Arg Gly Vai Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln 210 215 220 GAC TAC ATT CCC CTA TTG CGC ATT TTC CCC AAG ATG AAC AAT GAG GCC 1144 Asp Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala 225 230 235 GCT GAC TTC CGG GGT CGC CGT GAT AAA TAT CTG ACC TAC TTG CTC GAT 1192 Ala Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp 240 245 250 255 ATG CTC AAG GAT CGA ATC GCC AAG GGA ACC GAT AAG CCT TGC ATC ACT 1240 Met Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile Thr 260 265 270 GGT AAT ATC TTG AAG' 'GAT CCC GAG GCT AAG CTG AAT GAT G GTGAGTTACA 1290 Gly Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp 275 280 AADTCTCGCG AAATCTTTGT GAATGTTGGT ATTGAGTACT CATCTATCGT CT AG CC 1346 Ala 285 GAG GTG AAA TCG ATC TGT TTG ACT ATG GTG TCG GCT GGC CTT GAC ACC 1394 Glu Vai Lys Ser Ile Cys Leu Thr Met Vai Ser Ala Gly Leu Asp Thr 290 295 300 GTT CCG GGC AAC TTG ATT ATG GGA ATT GCC TAC CTG GCA TCT GAA GAC 1442 Vai Pro, Gly Asn Leu Ile Met Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp 305 310 315 GGC CAA AGA ATT CAG AAA AAG GCC TAT GAT GCA ATC ATG GAG GTA TAC 1490 Gly Gln Arg Ile Gln Lys Lys Ala Tyr Asp Ala Ile Met Glu Vai Tyr 320 325 330 26 CCG GAC GGC GAT GCT TGG GAG AAA TGT TTG GTG GAG GAG AAG GTC CCT 1538 Pro Asp Gi y Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Vai Glu Glu Lys Vai Pro 335 340 345 TAT GTG ACG GCA CTG GTC AAG GAG GTC TTG CGC TTC TGG ACG GTC ATT 1586 Tyr Vai Thr Ala Leu Vai Lys Glu Vai Leu Arg Phe Trp Thr Vai Ile 350 355 360 365 CCT ATT TGT CTG CCA CGC GAG AGC ACC AAG GAT AT C CAG TGG AAT GGA 1634 Pro Ile Cys Leu Pro Arg Glu Ser Thr Lys Asp Ile Gln Trp Asn Gi y 370 375 380 GCT ACA AT C CCT GCC GGG ACG ACC TTT TTC AT G GTATGTTGCG CCTTGCTTCT 1687 Ala Thr Ile Pro Ala GI y Thr Thr Phe Phe Met 385 390 GTCCCT'DTCG GGACGTTGCT AACAGGATCT GATAG AAT GTT TGG GCT GCC GAT 1740

Asn Vai Trp Ala Ala Asp 395 TAC GAT GAA GAT CAC TTT AAG GAT GCC GAT AAA TTC AT C CCG GAG CGT 1788 Tyr Asp Glu Asp His Phe Lys Asp Ala Asp Lys Phe Ile Pro Glu Arg 400 405 410 TAT TTG GAG GCC AGT GAG GGT GCA GGC ACT CCA CAC TAT GCA TAT GGA 1836 Tyr Leu Glu Ala Ser Glu GI y Ala GI y Thr Pro His Tyr Ala Tyr Gly 415 420 425 430 GCG GGA TCA CGT AT G TGT GCA GGC TCA CAT CTC GCC AAT CGC GAG CTG 1884 Ala GI y Ser Arg Met Cys Ala GI y Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu 435 440 445 TTC ACT GCT TTT AT C CGC CTC GTC ACT GCT TTC AAC ATG cAc AcG GcG 1932 Phe Thr Ala Phe Ile Arg Leu Vai Thr Ala Phe Asn Met His Thr Ala 450 455 460 AAG GAG ACG GCC GAC. . CGA CCG ATT CTG AAT GCA ATT GAG TGC AAT TTG 1980 Lys Glu Thr Ala Asp Arg Pro Ile Leu Asn Ala Ile Glu Cys Asn Leu 465 470 475 ATT CCG ACA GCC TTG ACA ACC GAG CCG AAG CCA TTC AAG GTT GGC TTT 2028 Ile Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Vai GI y Phe 480 485 490 AGT GCA CGC GAC CCT AAG AAG CTT GAG CAG TGG ATT GCT GAG AGC GAT 2076 Ser Alą Arg Asp Pro Lys Lys Leu Glu Gln Trp Ile Ala Glu Ser Asp 495 500 505 510 GAA CGG ACC AAA GAT CTA TAAGAGGAAG TTTTATCTGA TATGATTCCC TTTTTTTTTT Glu Arg Thr Lys Asp Leu 515 TCGGAGGCTA TTTATGTATC TACTTGAATA TATGTGAAAT AAAGGCAATG AAGTATAGAT 2194 ATAGACCTGC CCAGGTGAGA CCTACATGTA TGTAATCGAC GTCTCCCAGT ACCTATTTAG 2254 GAACCGAATA GAAATTTGAG T GAT GAAGGG T GAAGAATAA CCT CAGAGAA CATAGGTCTA 2314 CTAAGATCTG CTAATTCTTA GACTCCTTTC CCTGAATTAT TGCCAATTTC CCCAGTTGTC 2374 TCTCTCCTCT ATGACTCCCG GCCTTGTCAC ACCGGCGGAA TCTCCCCGCA TTTTCCTCGA 2434 CCTCACCCTT TTCTTCCTCT TCACCCTCTC CCCATCCACT TGAAATGAAC CTCTGATCGC 2494 AATCAATTGC ATCCCGAAGT CATTTTGGAT GATGAATAAT CCGCAGATGT ACCCTGTCCT 2554 CGAG 2558 INFORMACIJA SEQ ID NO: 4 SEKOS CHARAKTERISTIKOS: ILGIS: 516 bazių porų TIPAS: amino rūgštys 27

VIJISKUMAS: 1 KONFIGŪRACIJA: linijinė MOLEKULĖS TIPAS: peptidas CHARAKTERISTIKOS: KITA INFORMACIJA: fermento fenilacetato 2-hidroksilazės amino rūgščių seka CHARAKTERISTIKOS: KITA INFORMACIJA: molekulinis svoris 58112 Da. SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID NO:

Met Ala Ile Gln Thr Leu Ala Vai Ala Vai Ile Thr Vai Vai Tyr Phe 1 5 10 15 Vai Ile Arg Tyr Phe Įsn Arg Thr Asp Ile Pro Lys Ile Lys Gly Leu 20 25 30 Pro Glu Ile Pro Gly Ile Pro Ile Phe Gly Asn Leu Leu Gln Leu Gly 35 40 45 Asp Gln His Ala Thr Vai Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro 50 55 60 Vai Phe Gln Vai Arg Met Gly Asn Lys Arg Ile Vai Phe Ala Asn Gly 65 70 75 80 Phe Asp Ser Vai Arg Gln Leu Trp Ile Lys Asp Ser Ser Ala Leu Ile 85 90 95 Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Vai Vai Ser Ser Ser Gln 100 105 110 Gly Phe Thr Ile Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys Arg 115 120 125 Ar g Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Vai Gln Ser Tyr 130 135 140 Met Pro Ile Ile Asp Leu Glu Ser Ash Ser Ser Ile Lys Glu Leu Tyr 145 150 155 160 Ar g Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Vai Asn Pro Thr Ala Tyr Phe 165 170 175 Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe Arg 180 185 190 Ile Glu Gly Asn Vai Asp Asp Thr Leu Leu His Glu Ile Vai Asp Vai 195 200 205 Glu Arg Gly Vai Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln Asp 210 215 220 Tyr Ile Pro Leu Leu Arg Ile Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala Ala 225 230 235 240 Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp Met 245 250 255 Leu Lys Asp Arg Ile Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys Ile Thr Gly 260 265 270 Asn Ile Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala Glu Vai Lys 275 280 285 28

Ser Ile 290 Cys Leu Asn 305 Leu Ile Met Ile GI n Lys Lys Asp Ala Trp Glu 340 Ala Leu Vai 355 Lys Leu Pro 370 Arg Glu Pro 385 Ala Gly Thr Glu Asp His Phe GI u Ala Ser Glu 420 Ser Arg Met 435 Cys Ala Phe 450 Ile Arg Thr 465 Ala Asp Arg Thr Ala Leu Thr Ar g Asp Pro Lys 500 Thr Lys Asp 515 Leu

Thr Met Vai 295 Ser Gly Ile 310 Ala Tyr Ala 325 Tyr Asp Ala Lys Cys Leu Vai Glu Vai Leu Arg 360 Ser Thr Lys 375 Asp Thr Phe 390 Phe Met Lys 405 Asp Ala Asp Gly Ala Gly Thr AlaDGly Ser His 440 Leu Vai Thr 455 Ala Pro Ile 470 Leu Asn Thr 485 Glu Pro Lys Lys Leu Glu Gln

Ala Gly Leu Asp 300 Leu Ala Ser 315 Glu Ile Met 330 Glu Vai Glu 345 Glu Lys Vai Phe Trp Thr Vai Ile Gln Trp Asn 380 Asn Vai Trp 395 Ala Lys Phe 410 Ile Pro Pro 425 His Tyr Ala Leu Ala Asn Arg Phe Asn Met His 460 Ala Ile Glu 475 Cys Pro Phe 490 Lys Vai Trp 505 Ile Ala Glu

Thr Vai Pro Gly Asp Gly Gln Arg 320 Tyr Pro Asp 335 Gly Pro Tyr 350 Vai Thr Ile 365 Pro Ile Cys Gly Ala Thr Ile Ala Asp Tyr Asp 400 Glu Arg Tyr 415 Leu Tyr Gly 430 Ala Gly Glu 445 Leu Phe Thr Thr Ala Lys Glu Asn Leu Ile Pro 480 Gly Phe Ser 495 Ala Ser Asp 510 Glu Arg

Claims (27)

1. 29 IŠRADIMO APIBRĖŽTIS 1. Mikroorganizmų genų, koduojančių fenilacetato katabolizmo fermentus ir konkuruojančių su penicilino biosintezės fermentais dėl šio junginio, inaktyvavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima integruotą transformaciją per homologinę rekombinaciją tarp bent vieno egzogeninio DNR junginio ir bent dalies inaktyvuojamo geno sekos.
2. 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad transformuotas DNR junginys yra žiedinė molekulė, kuri turi bent vieną geno, kuris turėtų būti inaktyvuojamas, ekspresuojamą fragmentą.
3. 3. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad transformuotas DNR junginys yra linijinė molekulė, kuri turi bent vieną DNR fragmentą, nejjungtą j seką geno, kuris turėtų būti inaktyvuojamas, bet kuris turi bent vieną transformacijos žymę, kuri pertraukia jo koduojančią seką.
4. 4. Būdas pagal ankstesnius punktus, besiskiriantis tuo, kad transformuota DNR molekulė turi, pilnai ar dalinai, kopiją sekos to geno, kuris turėtų būti inaktyvuojamas mutacija, geriau skaitymo rėmelio pasislinkimo mutacija, panaikinančia prasmę, arba delecija, kuri panaikina minėto geno funkcijos fenotipą.
5. 5. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad transformacijos, kuria inaktyvuojamas genas, objektu esantis mikroorganizmas, gali produkuoti peniciliną G arba V.
6. 6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikroorganizmas, produkuojantis peniciliną G arba V, yra grybas.
7. 7. Būdas pagal 1-6 punktus, besiskiriantis tuo, kad transformuojamas mikroorganizmas yraAspergilIusnidulans.
8. 8. Būdas pagal 1-6 punktus, besiskiriantis tuo, kad transformuojamas mikroorganizmas yra Penicillium chrysogenum. 30
9. 9. Būdas pagal 1-7 punktus, besiskiriantis tuo, kad naudojamas transformuotas DNR junginys yra pilnai ar dalinai įjungtas į vektorių, geriau į plazmidę pPhacA::argB.
10. 10. Būdas pagal 1-6 ir 8 punktus, besiskiriantis tuo, kad naudojamas transformuotas DNR junginys yra pilnai ar dalinai įjungtas į vektorių, geriau į plazmidę pALP696.
11. 11. Būdas pagal 1-7 ir 9 punktus, besiskiriantis tuo, kad inaktyvuotas genas yra atvaizduotas SEQ ID NO: 1, jo mutuoto geno sekos ir/arba homologiniai genai.
12. 12. Būdas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad inaktyvuotas genas koduoja polipeptidą, pavaizduotą SEQ ID NO: 2, ar panašias sekas, kurios ekspresuoja P450 fenilacetato 2-hidroksilazinį aktyvumą.
13. 13. Būdas pagal 1-6, 8 ir 10 punktus, besiskiriantis tuo, kad inaktyvuojamas genas yra atvaizduotas SEQ ID NO: 3, jo mutuoto geno sekos ir/arba homologiniai genai.
14. 14. Būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad inaktyvuojamas genas koduoja polipeptidą, atvaizduotą SEQ ID NO: 4, ar panašias sekas, kurios ekspresuoja P450 fenilacetato 2-hidroksilazinį aktyvumą.
15. 15. Transformuotas Aspergillus nidulans kamienas ir iš jo gauti mutantiniai dariniai, besiskiriantys tuo, kad juose yra bent vienas egzogeninis DNR junginys, kuris susideda iš sutrumpintos, nepilnos arba inaktyvuotos sekos bent vieno geno, kuris koduoja fenilacetato katabolizmo fermentą ir kuris inaktyvuoja endogeninį geną po jo integracijos per homologinę rekombinaciją.
16. 16. Transformuotas A. nidulans kamienas pagal 15 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad genas, kuris turėtų būti inaktyvuojamas, koduoja fermentą, tarpininkaujantį fenilacetato hidroksilinimui.
17. 17. Transformuotas A nidulans kamienas pagal 15 ir 16 punktus, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad genas, kuris turėtų būti inaktyvuojamas, yra phacA, kurio seka ir šoninės sritys yra pavaizduotos SEQ ID NO: 1, jo mutuotų ir homologinių genų sekos. 31
18. 18. Transformuotas A nldulans kamienas pagal 17 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad inaktyvuojamas genas yra homologinis phacA, kurio skirtinga negu A nidulans kilmė ir homologija su A nidulans phacA DNR seka yra pakankama homologinei rekombinacijai su endogeniniu A nidulans lokusu.
19. 19. Transformuotas kamienas pagal 15-18 punktus, besiskiriantis tuo, kad genas, kuris yra inaktyvuotas, koduoja polipeptidą, pavaizduotą baltymo seka SEQ ID NO: 2, ar panašiomis sekomis, kurios ekspresuoja P450 fenilacetato 2-hidroksilazinį aktyvumą.
20. 20. Transformuotas kamienas pagal 15-19 punktus, besiskiriantis tuo, kad jis yra grynas A nidulans CECT20195 kamienas, jo mutantai ir/arba transformuoti dariniai.
21. 21. Plazmidė pPhacA::argB inaktyvuojanti A nidulans phacA geną, kaip parodyta fig. 6 esančiame restrikciniame žemėlapyje, sudaryta iš plazmidės pUC18, turinčios 6,8 kb EcoRI intarpą, kuris turi A nidulans phacA geną, inaktyvuotą įterpus 3,2 kb fragmentą, kuris savo ruožtu turi A nidulans argB geną.
22. 22. Transformuotas Penicillium chrysogenum kamienas ir iš jo gauti mutantiniai dariniai, besiskiriantys tuo, kad turi DNR junginį, kuris susideda iš sutrumpintos, nepilnos arba inaktyvuotos sekos geno, kuris koduoja fenilacetato katabolizmo fermentą ir kuris inaktyvuoja endogeninį geną po jo integracijos per homologinę rekombinaciją.
23. 23. Transformuotas P. chrysogenum kamienas pagal 22 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad genas, kuris turėtų būti inaktyvuojamas, koduoja fermentą, tarpininkaujantį fenilacetato hidroksilinimui.
24. 24. Transformuotas P. chrysogenum kamienas pagal 22 ir 23 punktus, b e siskiriantis tuo, kad jame yra phacA genas, kurio seka ir šoninės sritys yra pavaizduotos SEQ ID NO: 3, jo mutuoto geno ir/arba homologinio geno sekos.
25. 25. Transformuotas P. chrysogenum kamienas pagal 22 ir 24 punktus, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad genas, kuris yra inaktyvuotas, koduoja polipeptidą, pavaizduotą baltymo seka SEQ ID NO: 4, ar panašiomis sekomis, kurios koduoja apibrėžtą P450 fenilacetato 2-hidroksilazinį aktyvumą.
26. 26. Transformuotas P. chrysogenum kamienas pagal 24 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad genas yra A. nidulans phacA arba bet kuris kitas homologinis DNR junginys, išskirtas iš skirtingo negu P. chrysogenum šaltinio ir kurio homologija su P. chrysogenum pahA DNR seka yra pakankama vykti homologinei rekombinacijai su P. chrysogenum endogeniniu lokusu.
27. 27. Plazmidė pPALP696 inaktyvuojanti P. chrysogenum pahA geną, kaip parodyta fig. 7 esančiame restrikciniame žemėlapyje, sudaryta iš plazmidės pBC KS+, turinčios 7,9 kb Sali intarpą, kuris turi P. chrysogenum pahA geną, inaktyvuotą įterpus 2,0 kb fragmentą, kuris savo ruožtu turi S. hindustanus bleR geną, reguliuojamą P. chrysogenum gdh promotoriumi.