LU502105B1 - Nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé et son procédé de préparation et applications - Google Patents

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chidamide
chi
squalenized
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nanoparticles
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Kaidi Chen
Mancang Gu
Shan Zhao
Yan Shi
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Univ Zhejiang Chinese Medical
Shanghai Jiaotong Univ School Of Medicine Ruijin Hospital
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Abstract

La présente invention divulgue des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé et son procédé de préparation et applications, comprenant: tout d’abod, dissoudre respectivement de l'acide squalénisénoïque et du chidamide dans du diméthylformamide, prendre du N-hydroxysuccinimide et du chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide comme catalyseur, mélanger et laisser réagir pour préparer une molécule de précurseur de chidamide squalénisé ; puis dissoudre respectivement de l’acide squalène et de l’acide folique-polyéthylène glycol-amino ou p-méthoxybenzamide-polyéthylène glycol-amino dans du diméthylformamide, prendre du 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl chlorhydrate de carbodiimide (EDCI) comme catalyseur, mélanger et laisser réagir pour obtenir un ligand de faible poids moléculaire, laisser auto-assembler le ligand de faible poids moléculaire, l’arginine-glycine-acide aspartique et la molécule de précurseur amphiphile de chidamide squalénisé en nanoparticules dans l’eau ; la présente invention permet de résoudre efficacement les inconvénients du chidamide dans le traitement des tumeurs solides, tels que faible pénétrabilité, un mauvais ciblage et des effets toxiques et secondaires graves.

Description

BL-5504 LU502105
DESCRIPTION Nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé et son procédé de préparation et applications
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne le domaine de la technologie pharmaceutique, et en particulier des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé et son procédé de préparation et applications.
CONTEXTE TECHNIQUE Le cancer du pancréas est une tumeur gastro-intestinale maligne avec une mortalité de 94% par rapport à la morbidité et une forte hétérogénéité tumorale. En raison d’absence de marqueurs diagnostiques précoces, à l’heure actuelle, les résultats du pronostic sont très mauvais et le taux de survie à 5 ans n'est que de 8 à 9%. Le cancer du pancréas présente un microenvironnement tumoral très complexe, comprenant de nombreux types de cellules inflammatoires. De plus, les fibroblastes liés à la tumeur forment une matrice extracellulaire dense, qui entrave la délivrance de médicament et comprime l'espace des vaisseaux, rendant difficile l'entrée de médicaments de faible poids moléculaire dans les tumeurs pour tuer les cellules tumorales. À l'heure actuelle, le traitement du cancer du pancréas consiste en résection chirurgicale traditionnelle, mais la proportion de patients satisfaisant à exigences de chirurgie est faible et la récidivité de post-résection est élevée. Le chidamide est un nouveau médicament solide moléculaire qui est conçu et synthétisé indépendamment par Société à responsabilité limitée de biotechnologie Chipscreen de Shenzhen, qui a un nouveau mécanisme et est le premier inhibiteur de désacétylase d'histone (HDAC) sélectif de hypotype du monde. Il est un médicament de classe de régulateur génétique apparent et peut être utilisé pour traiter diverses maladies telles que les cancers. Des études cliniques montrent que le chidamide a un effet thérapeutique exact sur divers lymphomes, y compris le lymphome périphérique à cellules T. Il est le premier médicament oral approuvé pour traiter le lymphome périphérique à cellules T, qui actionne en inhibant l'activité biologique de l'HDAC et provoque des 1
BL-5504 changements dans l'expression génique (c'est-à-dire des changements génétiques apparents) de > plusieurs voies de signalisation de tumorigenèse.
Les derniers résultats des études précliniques montrent que le chidamide a un bon effet antitumoral sur les tumeurs solides, y compris le cancer du sein et le cancer du pancréas, dont les indicateurs généraux sont meilleurs que ceux montrées par les résultats des études en même période sur des médicaments de mécanismes d'action similaires.
Cependant, comme compound hydrophile de faible poids moléculaire, le chidamide présente des inconvénients tels qu’un mauvais ciblage sur les tumeurs solides telles que le cancer du pancréas, une toxicité sanguine élevée et une faible efficacité de pénétrabilité dans le microenvironnement tumoral.
Ces inconvénients limitent considérablement les applications du chidamide dans le domaine de tumeurs solides.
Le squalène est un précurseur de lipide de cholestérol naturel ou synthétique, présente une bonne hydrophobicité et une bonne sécurité biologique, et est largement utilisé dans les domaines tels que les pharmaceutiques, les cosmétiques et les produits de santé.
De nombreux résultats des études montrent que le squalène présente une activité biologique antitumorale et que son mécanisme d'action consiste à inhiber la croissance des cellules tumorales et à augmenter l'immunité de l'organisme, améliorant ainsi la résistance aux tumeurs.
À l'heure actuelle, le groupe carboxyle a été introduit dans le squalène en modifiant sa structure et le squalène peut être lié de manière covalente à médicaments de faible poids moléculaire tels que la gemcitabine pour former une molécule de précurseur, telle molécule de précurseur résoudre efficacement l'inconvénient de courte demi-vie de la gemcitabine, améliore l’activité antitumorale, et s’auto-assemble de manière plus facile dans l’eau pour former les nanoparticules, révélant une bonne perspective pour les précurseurs squalénisénisés dans le traitement ciblé de tumeurs.
Cependant, aucuns rapports publiés sont disponibles sur des applications des précurseurs squalénisénisés pour améliorer la pénétrabilité dans le microenvironnement du cancer du pancréas et favoriser la libération de médicament en réponse aux cellules du cancer du pancréas.
DIVULGATION DE L’INVENTION Pour résoudre les inconvénients du chidamide lorsqu’il est utilisé dans le traitement les tumeurs solides, tels qu’un mauvais ciblage sur les tumeurs solides et une faible pénétrabilité dans le microenvironnement tumoral, la présente invention fournit des nanoparticules auto-assemblées de 2
BL-5504 précurseur de chidamide squalénisé et son procédé de préparation et applications.
La présente | 0° invention vise à améliorer la biocompatibilité du chidamide en liant le chidamide au squaléne pour former une molécule de précurseur, et préparer des nouvelles nanoparticules auto-assemblées a double ciblage en utilisant des ligands de faible poids moléculaire tels que l'acide folique, le p- méthoxybenzamide ou le RGD comme tête cible.
Ces nanoparticules auto-assemblées peuvent améliorer significativement la pénétrabilité du chidamide dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas, et présentent également un mieux ciblage sur le cancer du pancréas et une inhibition de la croissance des cellules tumorales.
Les objets de la présente invention peuvent être réalisés à travers une solution technique suivante : un procédé de préparation des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé, comprenant les étapes suivantes : (1) Préparation d’une molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) : dissoudre de l'acide squalénisénoïque (SQ-COOH) dans du diméthylformamide (DMF) pour préparer une première solution mère SQ-COOH a 100-200 mg/mL, ajouter 30 à 60 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 50 à 100 mg de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl chlorhydrate de carbodiimide (EDCI) dans 1 ml de solution mère SQ-COOH, et laisser réagir à température ambiante pendant 30 à 120 min pour obtenir une première solution de réaction SQ-COOH.
Prendre le chidamide (CHI) et résoudre dans du diméthylformamide (DMF) pour préparer une première solution mère CHI à 50- 100 mg/mL, et mélanger la solution de réaction SQ-COOH et la solution mère CHI dans un rapport volumique de 1 à 2 : 1 et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 48 à 96 h, une fois la réaction complète, purifier par chromatographie éclair sur colonne pour obtenir la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) ; l'éluant étant le dichlorométhane : méthanol = 85 à 495 : 5. (2) Préparation d'une molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand : dissoudre du SQ-COOH dans du DMF pour préparer une deuxième solution mère SQ-COOH à 1000-2000 mg/mL, ajouter à 60 mg du NHS et 50 à 100 mg de l’EDCI dans 1 ml de solution mère SQ-COOH et laisser réagir à température ambiante pendant 30 à 120 min pour obtenir une deuxième solution de réaction SQ-COOH.
Prendre de Jl’acide folique-polyéthylène glycol-amino (FA-PEG-NH»), p- méthoxybenzamide-polyéthylène glycol-amino (AEAA-PEG-NH2) ou arginine-glycine-acide 30 aspartique-polyéthylène glycol-amino (RGD-PEG -NHz), dissoudre dans du DMF pour préparer 3
BL-5504 une deuxième solution mère DMF à 50-100 mg/mL, mélanger la deuxième solution de réaction SOC 05 COOH et la deuxième solution mère DMF dans un rapport volumique de 1 à 2 : 1 et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 48 à 96 h. Une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction à l’aide d’un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 10000 à 14000 tr/min pendant 30-60 min pour éliminer le SQ-COOH libre et obtenir en fin la molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand. (3) Préparation des nanoparticules de précurseur de chidamide squalénisé modifiées par ligand. Dissoudre la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) préparée à l'étape 1 dans 95 à 100 % (concentration volumique) éthanol pour préparer une troisième solution mère à 3,32- 6,64 mg/mL. Prendre la molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand préparée à l'étape 2 et dissoudre dans 95 à 100% (concentration volumique) éthanol pour préparer une quatrième solution mère à 0,664-3,32 mg/mL. Mélanger la troisième solution mère et la quatrième solution mère dans un rapport volumique de 1 : 1 pour obtenir un mélange, dans le mélange obtenu, le rapport en masse de la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) a la molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand (SQ-CHI) était de 1 : 0.1 à 1. Utiliser la solution mélangée comme phase huileuse et l'eau déminéralisée comme phase aqueuse, le rapport volumique de la phase huileuse à la phase aqueuse étant de 1 : 1 à 20. Gouter la phase huileuse ci-dessus goutte à goutte dans la phase aqueuse, agiter pendant 5 à 10 min, évaporer sous pression réduite pour éliminer l'éthanol, puis traiter le mélange aux ultra-sons dans un sonicateur pendant 30 à 60 min, obtenant ainsi les nanoparticules de précurseur de chidamide squalénisé modifié par ligand. Nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé préparées selon le procédé ci-dessus. Applications des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé ci-dessus pour préparer des médicaments de traitement de tumeurs solides. Les nanoparticules auto- assemblées de précurseur de chidamide squalénisé peuvent être préparées en préparations pharmaceutiques, lesdites préparations pharmaceutiques peuvent améliorer le ciblage du chidamide sur les tumeurs solides et la pénétrabilité dans le microenvironnement tumoral, et améliorer les effets thérapeutiques du chidamide sur les tumeurs malignes, tels que le cancer du pancréas, le cancer colorectal, le cancer gastrique, le cancer de l'œsophage, le cancer du sein et le cancer du poumon. Des études d'avantage sur la présente invention sont proposées ci-après :
1. Détermination de la charge de médicament 4
BL-5504 Centrifuger les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé à une oranda’ 05 vitesse, prendre le surnageant, déterminer la teneur en CHI par chromatographie liquide a ultra haute performance (UPLC), et calculer la concentration correspondante en fonction de la courbe standard de chidamide pour calculer la charge de médicament. La charge de médicament finale des nanoparticules était de 50 à 80%.
2. Libération de médicament in vitro Selon la présente invention, grâce à un haute niveau de trypsine exprimée par les cellules du cancer du pancréas, un précurseur de chidamide squalénisé portant la molécule de liaison en réponse à la trypsine peut être construit. Ce précurseur peut libérer le chidamide en réponse dans un milieu contenant la pancréatine, tandis que libère peu de chidamide dans un milieu exempt de pancréatine. De plus, comme composé lipidique, le squalène peut améliorer la propriété lipophile d’un médicament en se liant au dernier, résolvant ainsi le problème d’une mauvaise perméabilité de la molécule de chidamide dans un microenvironnement tumoral et ayant de larges perspectives d'application. Prendre 2 ml de solution mère CHI fraîche ou les NPs CHI-SQ-PEG-FA dans une poche de dialyse (3 Kda), dialyser avec un milieu de dialyse contenant 0,1 à 0,25% de trypsine, prélever 1 ml à 0,1 à 72 h, ajouter une quantité égale de milieu de libération à la même température et déterminer la libération de médicament par UPLC. Enfin, le taux de libération cumulé de CHI libéré par les nanoparticules dans un milieu de 0,1% trypsine pendant 72 h devrait être de 60 à 70%, le taux de libération cumulé de CHI libéré dans un milieu de 0,25% trypsine pendant 72 h devrait être de 70 à 90%, et le taux de libération cumulé de CHI libéré par des nanomédicaments dans un milieu exempt de trypsine n'était que de 30 à 50%.
3. Détermination de la stabilité des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé dans le PBS Mélanger les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé préparées par le procédé de la présente invention avec du PBS, agiter à une température constante de 37 + 0,5 °C, et déterminer la taille des particules et le potentiel Zeta des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de squalène-chidamide à 0 à 96 h. Le changement de la taille des particules et le changement du potentiel Zeta sont considérés comme indices d'évaluation. La taille des particules finale des nanoparticules était de 170 à 210 nm à 96 h et le potentiel Zeta était de -25 à -10 mV. 5
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4. Détermination de la cytotoxicité par la méthode MTS 17908105 Selon la présente invention, l’inhibition de la lignée cellulaire du cancer du pancréas sensible à la chidaniline (PSN-1) et de la lignée cellulaire du cancer du pancréas résistante à la chidaniline (CFPAC-1) par des nanoparticules blanches peut être déterminée par la méthode MTS. Incuber les nanoporteurs blancs dans un milieu, déterminer la valeur OD à l'aide d’un lecteur de microplaques et calculer la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire finale de PSN-1 et de CFPAC-1 était de 93 à 97% après le traitement avec des nanoparticules blanches à différentes concentrations (3,125 uM à 100 uM).
5. Essai d'efficacité cellulaire (1) Essai d'efficacité cellulaire sur modèles de culture de cellules a monocouche Construire respectivement des modèles de cellules à monocouche de PSN-1 et de CFPAC-1 selon la présente invention, ajouter respectivement un milieu contenant des nanoparticules de 0,15625 à 50 uM, incuber pendant 96 h, et mesurer la valeur OD à l'aide d’un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire finale de PSN-1 et de CFPAC-1 était respectivement de 90 à 5% et de 95 à 10% apres le traitement avec des nanoparticules de 0,15625 à 50 uM. (2) Essai d'efficacité cellulaire sur modèles de sphère tumorale co-cultivée Selon la présente invention, mélanger PSN-1 ou CFPAC-1 en phase logarithmique avec une suspension cellulaire de HPSC dans un rapport de 2 : 7, placer le mélange à 5000 cellules/puits dans une plaque à ultra-faible adsorption pour former des modèles de sphère tumorale co-cultivée in vitro. Co-incuber différents nanomédicaments avec des sphères tumorales pendant 48 à 144 h, ajouter une quantité égale de réactif CellTiter-Glo, et mesurer la valeur du signal lumineux à 562 nm à l'aide d’un lecteur de microplaques à multifonctions. La viabilité cellulaire finale dans les modèles tridimensionnels de sphère tumorale de PSN-1/HPSC et de CFPAC-1/HPSC était respectivement de 70 à 20% et de 60 à 10% après le traitement avec les nanoparticules pendant 48 à 144h.
6. Essai d'absorption cellulaire (1) Essai d'absorption cellulaire sur modèles de culture de cellules à monocouche Selon la présente invention, préparer tout d’abord des nanoparticules auto-assemblées marquées par la coumarine 6. La construction de modèles de cellules à monocouche est la même que (1) de l'étape 5. Ajouter un milieu exempt de sérum et contenant les nanoparticules, traiter pendant 24 h, et 6
BL-5504 mesurer l'intensité de fluorescence de la coumarine 6 à l'aide d’un microscope à fluorescence Baz ® fin, l'absorption des nanoparticules est un processus lent, l'intensité de fluorescence atteint son pic 12 h apres l'administration et la vitesse d’élimination de signal fluorescent est faible, ce qui indique une bonne absorption des nanoparticules par les cellules tumorales et une libération prolongée. (2) Analyse quantitative de l’internalisation dans les cellules La construction de modèles de cellules à monocouche est la même que (1) de l'étape 5. Une fois les modèles construits, ajouter respectivement des milieux contenant les NPs CHI-SQ-FA/C6, les NPs CHI-SQ-AFAA /C6 et les NPs CHI-SQ-RGD/C6, incuber respectivement dans un incubateur pendant 4 à 24 h, et analyser de manière quantitative l'absorption cellulaire à l'aide d'un cytomètre de flux. L'intensité de fluorescence finale des nanoparticules atteint son pic à 12 h. L'intensité de fluorescence des nanoparticules dans les cellules PSN-1 à 12 h était de 400 à 800 x 10° et l'intensité de fluorescence dans les cellules CFPAC-1 à 12 h était de 800 à 1000 x 10°, les résultats étaient identiques à ceux à l’étape (1). (3) Essai d'absorption sur modèles de sphère tumorale co-cultivée La construction de modèles de sphère tumorale co-cultivée est la même que (2) de l'étape 5. Une fois les modèles construits, ajouter respectivement les NPs CHI-SQ-FA/C6, les NPs CHI-SQ- AEAA /C6 et les NPs CHI-SQ-RGD/C6, cultiver dans milieu exempt de sérum pendant 12 h, ajouter 0.5 mL de 0,2 ug/mL DAPI et incuber, et observer la distribution de médicament dans les sphères tumorales à l’aide d’une microscopie confocale laser. Enfin, les nanoparticules présentent un signal fluorescent significatif. La présente invention présente les effets bénéfiques suivants :
1. La molécule de précurseur de chidamide squalénisé construite selon la présente invention améliore significativement la biocompatibilité du médicament composé de molécules hydrophiles de faible poids moléculaire-chidamide grâce à la propriété lipophile du squalène, et améliore considérablement la perméabilité du chidamide dans un microenvironnement tumoral du cancer du pancréas, permettant ainsi au médicament d'entrer dans les cellules tumorales pour actionner.
2. La molécule de précurseur de chidamide squalénisé construite selon la présente invention est liée via une liaison en réponse à la trypsine, et peut libérer une grande quantité de chidamide dans un environnement de trypsine, améliorant ainsi considérablement la libération du chidamide dans un microenvironnement tumoral du cancer du pancréas. 7
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3. Selon la présente invention, une méthode d’évaporation à solvant inverse est utilisée Sons” 05 préparer les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé avec une facilité et une simplicité des opérations.
4. Les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé préparées selon la présente invention réalise un ciblage actif sur les cellules tumorales du cancer du pancréas en modifiant la surface du ligand de faible poids moléculaire, et réalise également un double ciblage grâce à l'effet EPR des nanoparticules, permettant ainsi de délivrer de manière spécifique plus de médicaments au site de la tumeur pour actionner avec des avantages thérapeutiques significatifs.
DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 est une vue au microscope électronique à balayage des nanoparticules auto-assemblées préparées dans l'exemple de réalisation 7 ; la figure 2 est une vue de distribution de taille des particules des nanoparticules auto-assemblées préparées dans l'exemple de réalisation 7 ; la figure 3 est une vue au microscope électronique à balayage des nanoparticules auto-assemblées préparées dans l'exemple de réalisation 8 ; la figure 4 est une vue de distribution de taille des particules des nanoparticules auto-assemblées préparées dans l'exemple de réalisation 8 ; la figure 5 montre des courbes de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-acide folique dans un milieu de (0 à 0,25) % trypsine ; où, (a) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-acide folique dans un milieu de 0 % trypsine ; (b) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-acide folique dans un milieu de 0,1 % trypsine ; et (c) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-acide folique dans un milieu de 0,25 % trypsine ; la figure 6 montre des courbes de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-p- méthoxybenzamide dans un milieu de (0 à 0,25) % trypsine ; où, (a) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-p-méthoxybenzamide dans un milieu de 0 % trypsine ; (b) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-p-méthoxybenzamide dans un milieu de 0,1 % trypsine ; et (c) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide- squaléne-p-méthoxybenzamide dans un milieu de 0,25 % trypsine ; 8
BL-5504 la figure 7 montre des courbes de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-argimines > glycine-acide aspartique dans un (0 à 0,25)% milieu de trypsine ; où, (a) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-arginine-glycine-acide aspartique dans un milieu de 0 % trypsine ; (b) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène- arginine-glycine-acide aspartique dans un milieu de 0,1 % trypsine ; et (c) est une courbe de libération des nanoparticules de chidamide-squalène-arginine-glycine-acide aspartique dans un milieu de 0,25 % trypsine ; la figure 8 est une vue de changement de la taille des particules et de changement du potentiel Zeta à 96 h après le mélange des nanoparticules avec le PBS ; la figure 9 est une vue montrant l’essai de la cytotoxicité de PSN-1 traité avec des nanoporteurs blancs ; la figure 10 est une vue montrant l’essai de la cytotoxicité de CFPAC-1 traité avec des nanoporteurs blancs ; la figure 11 est un histogramme de la prolifération cellulaire de cellules à monocouche de PSN-1 à 96h après le traitement avec les nanoparticules à différentes concentrations ; la figure 12 est un histogramme de la prolifération cellulaire de cellules à monocouche de CFPAC-1 à 96 h après le traitement avec les nanoparticules à différentes concentrations ; la figure 13 est une vue montrant la prolifération des cellules tumorales du modèle tridimensionnel de sphère tumorale de PSN-1/HPSC à 144 h après le traitement avec des nanoparticules ; la figure 14 est une vue montrant la prolifération des cellules tumorales du modèle tridimensionnel de sphère tumorale de CFPAC-1/HSPC à 144 h après le traitement avec des nanoparticules ; la figure 15 est un histogramme de l'intensité de fluorescence de cellules à monocouche de PSN-1 traitée avec les nanoparticules ; et la figure 16 est un histogramme de l'intensité de fluorescence des cellules à monocouche de CFPAC-1 traitée avec les nanoparticules.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION La présente invention apparaît plus clairement à la lecture de la description détaillée ci-dessous des solutions techniques en référence aux modes de réalisation spécifiques non limitatifs. Exemple de réalisation 1 Le procédé de Préparation d'une molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) 9
BL-5504 comprend les étapes suivantes : 17908105 Peser 100 mg de 1,1°,2-acide de tris-norsqualenoyl (1,1°,2-Tris-norsqualenoyl acid, SQ-COOH) et résoudre de manière homogène dans 1 mL de DMF, ajouter progressivement 30 mg de N- hydroxysuccinimide (NHS) et 100 mg de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl chlorhydrate de carbodiimide (EDCI) dans le système de réaction, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 30 min. Peser exactement 100 mg de chidamide et résoudre dans 1 mL de DMEF, ajouter dans le système de réaction ci-dessus, laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante sous agitation pendant 48 h, une fois la réaction complète, purifier par chromatographie éclair sur colonne (l'éluant étant dichlorométhane : méthanol = 99 : 1 ; 95 : 5). La molécule de précurseur de SQ-CHI est préparée ainsi avec succès.
Exemple de réalisation 2 Le procédé de Préparation d'une molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) comprend les étapes suivantes : Peser 200 mg de 1,1°,2-acide de tris-norsqualenoyl (1,1°,2-Tris-norsqualenoyl acid, SQ-COOH) et résoudre de manière homogène dans 1 mL de DMF, ajouter progressivement 60 mg de N- hydroxysuccinimide (NHS) et 50 mg de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl chlorhydrate de carbodiimide (EDCI) dans le système de réaction, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 120 min. Peser exactement 100 mg de chidamide et résoudre dans 1 mL de DMEF, ajouter dans le système de réaction ci-dessus, laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante sous agitation pendant 96 h, une fois la réaction complète, purifier par chromatographie éclair sur colonne (l'éluant étant le dichlorométhane : méthanol = 95 : S ; 85 : 5).
La molécule de précurseur de SQ-CHI est préparée ainsi avec succès.
La molécule de précurseur SQ-CHI a été préparée avec succès dans les exemples de réalisation 1 et 2, et la molécule de précurseur préparée dans l'exemple de réalisation 1 est préférée pour des études ultérieures.
Exemple de réalisation 3 Le procédé de préparation du ligand de faible poids moléculaire, soit acide folique-polyéthylène glycol-squalène (FA-PEG-SQ) comprend les étapes suivantes : Peser exactement 100 mg de SQ-COOH et résoudre de manière homogène dans 100 uL de DMF, ajouter progressivement 30 mg de NHS et 100 mg d’EDCI dans le système de réaction, et laisser 10
BL-5504 réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 30 min. Peser exactement 106 ral 05 de FA-PEG-NH; en poudre et résoudre dans 100 ul. de DMF, goutter dans le système de réaction ci-dessus, et laisser réagir sous atmosphère d'azote a température ambiante sous agitation pendant 48 h. Une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction par un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 10000 tr/min pendant 30 min. Un complexe SQ-PEG-FA est préparé ainsi avec succès. Exemple de réalisation 4 Le procédé de préparation du ligand de faible poids moléculaire, soit acide folique-polyéthylène glycol-squalène (FA-PEG-SQ) comprend les étapes suivantes : Peser exactement 200 mg de SQ-COOH et résoudre de manière homogène dans 100 uL de DMF, ajouter progressivement 60 mg de NHS et 50 mg d’EDCI dans le système de réaction, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 120 min. Peser exactement 100 mg de FA-PEG-NH> en poudre et résoudre dans 100 ul. de DMF, goutter dans le système de réaction ci-dessus, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante sous agitation pendant 96 h. Une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction par un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 14000 tr/min pendant 30 min. Un complexe SQ-PEG-FA est préparé ainsi avec succès.
Exemple de réalisation 5 Le procédé de préparation du ligand de faible poids moléculaire, soit p-méthoxybenzamide- polyéthylène glycol-squalène (AEAA-PEG-SQ) comprend les étapes suivantes : Peser exactement 100 mg de SQ-COOH et résoudre de manière homogène dans 100 uL de DMF, ajouter progressivement 30 mg de NHS et 100 mg d’EDCI dans le système de réaction, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 30 min. Peser exactement 100 mg de AFAA-PEG-NH> en poudre et résoudre dans 100 uL de DMF, goutter dans le système de réaction ci-dessus, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante sous agitation pendant 48 h. Une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction par un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 10000 tr/min pendant 30 min. Un complexe SQ-PEG-AFAA est préparé ainsi avec succès. Exemple de réalisation 6 Le procédé de préparation du ligand de faible poids moléculaire, soit arginine-glycine-acide 11
BL-5504 aspartique-polyéthylène glycol-squalène (RGD-PEG-SQ) comprend les étapes suivantes : 17908105 Peser exactement 200 mg de SQ-COOH et résoudre de manière homogène dans 100 uL de DMF, ajouter progressivement 60 mg de NHS et 50 mg d’EDCI dans le système de réaction, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 120 min. Peser exactement 100 mg de RGD-PEG-NH; en poudre et résoudre dans 100 uL de DMF, goutter dans le système de réaction ci-dessus, et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante sous agitation pendant 96 h. Une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction par un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 14000 tr/min pendant 30 min. Un complexe SQ-PEG-RGD est préparé ainsi avec succès.
Le complexe de ligand de faible poids moléculaire a été préparé avec succès dans les exemples de réalisation 3 à 6, et le ligand de faible poids moléculaire préparé dans l'exemple de réalisation 3 est préféré pour la préparation ultérieure des nanoparticules, ce qui n’est pas limitatif pour la présente invention.
Exemple de réalisation 7 Le procédé de préparation des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé comprend les étapes suivantes : peser exactement 6,64mg de SQ-CHI préparé dans l’exemple de réalisation 1, ajouter 2 mL de 95% éthanol et bien mélanger pour obtenir une solution mère SQ-CHI a 3,32 mg/mL. Peser exactement 6.64mg de SQ-PEG-FA préparé dans l’exemple de réalisation 3, et ajouter 2 mL de 95% éthanol et bien mélanger pour obtenir une solution mère de SQ-PEG-FA à 3.32 mg/mL. Bien mélanger la solution mère SQ-CHI et la solution mère SQ-PEG- FA dans un rapport volumique de 1 : 1, avec un rapport en masse de SQ-CHI à SQ-PEG-FA de 1 : 1. Utiliser la solution mélangée de SQ-CHI et de SQ-PEG-FA comme phase huileuse, et l'eau déminéralisée comme phase aqueuse. Gouter la phase huileuse goutte à goutte dans 1 mL de l'eau déminéralisée sous agitation, de manière que le rapport volumique de la phase huileuse à la phase aqueuse soit de 1 : 20, agiter pendant 5 min, évaporer sous pression réduite pour éliminer l'éthanol, puis traiter le mélange aux ultra-sons dans un sonicateur pendant 60 min pour obtenir une suspension de NPs CHI-SQ-FA. Déterminer la distribution de taille des particules et le potentiel Zeta des nanoparticules et observer l’aspect et la morphologie des nanoparticules à l’aide d'un microscope électronique de transmission. Les résultats sont montrés dans les figures 1 et 2, les nanoparticules FA-SQ-CHI obtenues présentent une taille des particules homogène et une structure 12
BL-5504 typique en forme de « coque », avec la taille des particules de 173,3 + 1,5 nm, PDI de 0,2 + OZ UE 05 le potentiel Zeta de -13,1 + 0,9 mV.
Exemple de réalisation 8 Le procédé de préparation des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé comprend les étapes suivantes : peser exactement 6,64 mg de SQ-CHI préparé dans l’exemple de réalisation 1, ajouter 1 mL de 100% éthanol et bien mélanger pour obtenir une solution mère SQ-CHI à 6,64 mg/mL.
Peser exactement 6,64 mg de SQ-PEG-AFAA préparé dans l’exemple de réalisation 3, ajouter 10 mL de 100% éthanol et bien mélanger pour obtenir une solution mère SQ-PEG-FA à 0.664 mg/mL.
Bien mélanger la solution mère SQ-CHI et la solution mère SQ-PEG-FA dans un rapport volumique de 1 : 1, avec un rapport en masse de SQ-CHI à SQ- PEG-FA de 1 : 0,1. Utiliser la solution mélangée de SQ-CHI et de SQ-PEG-FA comme phase huileuse, et l'eau déminéralisée comme phase aqueuse.
Gouter la phase huileuse goutte à goutte dans 1 mL de l'eau déminéralisée sous agitation, de manière que le rapport volumique de la phase huileuse à la phase aqueuse soit de 1 : 1, agiter pendant 10 min, évaporer sous pression réduite pour éliminer l'éthanol, puis traiter le mélange aux ultra-sons dans un sonicateur pendant 30 min pour obtenir une suspension de NPs CHI-SQ-AEAA.
Déterminer la distribution de taille des particules et le potentiel Zeta des nanoparticules et observer l’aspect et la morphologie des nanoparticules à l’aide d'un microscope électronique de transmission.
Les résultats sont montrés dans les figures 3 et 4, les nanoparticules CHI-SQ-AFAA obtenues présentent une taille des particules homogène et une structure typique en forme de « coque », avec la taille des particules de 168,2 + 0,7 nm, PDI de 0,4 + 0,1, et le potentiel Zeta de -7,2 + 1,1 mV.
Exemple de réalisation 9 : Détermination de la charge de médicament Reconstituer les NPs CHI-SQ-FA, les NPs CHI-SQ-AEAA et les NPs CHI-SQ-RGD préparées, centrifuger à une grande vitesse de 12000 tr/min pendant 30 min, filtrer à travers une membrane de filtration de 0,22 um pour obtenir un filtrat, déterminer la teneur en CHI dans le filtrat par UPLC, lyophiliser est peser les nanoparticules pour obtenir une masse totale, et calculer la charge de médicament des nanoparticule (DL%) en fonction d'une équation.
Conditions chromatographiques : colonne ACQUITY UPLC ® BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 um) ; débit volumique de 0,2 mL/min ; température de la colonne de 23 °C ; volume d'injection de 5 pL ; temps de détection de 10 min ; phase mobile : 0,1 % solution d'acide formique : acétonitrile (75 : 25) ; longueur d'onde de détection 13
BL-5504 de 258 nm.
LU502105 Calculer en fonction de la courbe standard CHI, la charge de médicament des NPs CHI-SQ-FA étant de 74,1 + 0,5% ; la charge de médicament des NPs CHI-SQ-AEAA étant de 59,8 + 0,4% ; la charge de médicament des NP CHI-SQ-RGD étant de 63,2 + 0,8 % SL Se ua nite de cH | dans les Bann rticulez 300% quantité des nanopartiraies Exemple de réalisation 10 : Libération du chidamide dans différents milieux de trypsine Peser exactement 2mL de la suspension de NPs CHI-SQ-FA, NPs CHI-SQ-AFAA et NPs CHI-SQ- RGD préparée dans l'exemple de réalisation 7, la mettre dans une poche de dialyse traitée préalablement (3 Kda), introduire 0,1% trypsine dans la poche de dialyse, placer dans 40mL de milieu de libération et agiter à une température constante de 37 + 0,5 °C (75 tr/min), prélever 1 mL respectivement à 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48 et 72 h, puis ajouter une quantité égale de milieu de libération à la même température, filtrer tous les échantillons à travers une membrane microporeuse de 0,22 um, déterminer la teneur en médicament par UPLC, et calculer le taux de libération cumulée de CHI (Q%) en fonction la courbe standard CHI.
Exemple de réalisation 11 : Libération du chidamide dans différents milieux de trypsine Peser exactement 2 mL de la suspension de NPs CHI-SQ-FA préparée dans l'exemple de réalisation 7, la mettre dans un poche de dialyse traitée préalablement (3 Kda), introduire 0,25% trypsine dans le poche de dialyse, le placer dans 40 mL de milieu de libération et agiter à une température constante de 37 + 0,5 °C (75 tr/min), prélever 1 mL respectivement à 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24,30, 36, 48 et 72 h, puis ajouter une quantité égale de milieu de libération à la même température, filtrer tous les échantillons à travers une membrane microporeuse de 0,22 um, déterminer la teneur en médicament par UPLC, et calculer le taux de libération cumulée de CHI (Q%) en fonction la courbe standard CHI.
La détermination de libération pour les NPs CHI-SQ-AEAA et les NPs CHI-SQ-RGD dans différents milieux de trypsine est la même que celle des NPs CHI-SQ-FA.
Les résultats sont montrés dans les figures 5 à 7, lorsque le milieu de libération est exempt de trypsine, le taux de libération cumulée des nanoparticules à 72 h n'était que de 41,0 + 2,0 % (NPs CHI-SQ-FA) ; 39,2 + 1,7% (NPs CHI -SQ-FA ; NPs SQ-AEAA) ; 35,1 + 1,3 % (NPs CHI-SQ- RGD). Lorsque le milieu de libération contient 0,1% de trypsine, le taux de libération cumulée des 14
BL-5504 nanoparticules à 72 h était de 68,2 + 3,8% ; 65,2 + 0,7% (NPs CHI-SQ-AEAA) ; 62,1 + 2,5% NB! 05 CHI-SQ-RGD). Lorsque le milieu de libération contient 0,25% de trypsine, le taux de libération cumulée des nanoparticules à 72 h était de 80,2 + 4,0% ; 79,243,4% (NPs CHI-SQ-AEAA) ; 85,1 + 0,3% (NPs CHI-SQ-RGD). La trypsine peut favoriser efficacement la libération des nanoparticules.
Exemple de réalisation 12 : Détermination de la stabilité des NPs CHI-SQ-FA dans le PBS Mélanger les NPs CHI-SQ-FA préparées dans l'exemple de réalisation 7 avec du PBS (pH 7.4) dans un rapport volumique de 1 : 20, puis agiter à une température constante de 37 + 0,5 °C (100 tr/min), et déterminer la taille des particules et le potentiel Zeta des NPs CHI-SQ-FA respectivement à 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72 et 96 h. Le changement de la taille des particules et le changement du potentiel Zeta sont considérés comme indices d'évaluation de la stabilité.
Les résultats sont montrés dans la figure 8, la taille des particules des NPs CHI-SQ-FA augmente légèrement à 96 h jusqu’à 205,6 + 3,2 nm, et le potentiel Zeta atteint -20,8 + 0,9 mV.
La détermination de la stabilité pour les NPs CHI-SQ-AFAA et les NPs CHI-SQ-RGD est la même que celle des NPs CHI-SQ-FA. Les résultats montrent que la taille des particules des NPs CHI-SQ- AEFAA atteint 196,6+3,8 nm et le potentiel Zeta atteint -10,3+1,2 mV à 96 h ; la taille des particules des NPs CHI-SQ-AEAA atteint 188,5+1,5nm et le potentiel Zeta atteint - 3,4+0,2 mV à 96 h.
Généralement, les nanoparticules présentent une bonne stabilité pendant 96 h.
Exemple de réalisation 13 : Détermination de la cytotoxicité par la méthode MTS Prendre les lignées cellulaires du cancer du pancréas sensibles au chidamide (PSN-1) et les lignées cellulaires du cancer du pancréas résistantes au chidamide (CFPAC-1) en phase de croissance logarithmique, inoculer une suspension cellulaires à 4-6 x 10* cellules / mL dans une plaque de 96 puits, cultiver à 37 °C pendant 24 h, ajouter respectivement les NPs SQ-PEG à 3,125, 6,25, 12,5, 25,0, 50,0 et 100,0 jumol-L! et incuber encore pendant 96 h, absorber le milieu contenant le médicament, ajouter une solution de travail contenant MTS à 100 uL/puits, incuber pendant 4 h dans un incubateur, sortir, agiter pendant 14 s, déterminer la valeur OD à 490 nm à l'aide d’un lecteur de microplaques et calculer la viabilité cellulaire.
Les résultats sont montrés dans les figures 9 et 10. Après le traitement avec les nanoparticules blanches, la viabilité cellulaire de PSN-1 et de CFPAC-1 était respectivement de 95,4 + 0,7% et 93,7 + 0,5%, et la viabilité cellulaire de PSN-1 et de CFPAC-1 à différentes concentrations était supérieure à 93%, avec une bonne sécurité.
15
BL-5504 Exemple de réalisation 14 : Essai d'efficacité cellulaire in vitro 17908105
1. Essai d'efficacité sur modèles de culture de cellules à monocouche Prendre les cellulaires de PSN-1 et de CFPAC-1 en phase de croissance logarithmique, digérer avec 0,25% trypsine pour obtenir une suspension cellulaire à 4-6 x 10* cellules/ml, puis inoculer 100 pL de la suspension cellulaire dans une plaque de 96 puits, et cultiver dans un incubateur à une température constante de 37 °C pendant 2 h pour rendre les cellules adhérentes. Ajouter 100 uL du milieu contenant NPs CHI-SQ-FA à 0,15625, 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25 et 50 umol-L*! à chaque puits, puis cultiver la plaque dans un incubateur pendant 96 h, jeter le milieu, ajouter 100 pL de solution de travail MTS (solution mère MTS/milieu cellulaire = 1 : 5) à chaque puits, incuber encore dans l'incubateur pendant 4 h, sortir, agiter pendant 15s, déterminer l'absorbance (valeur OD) à 490 nm de chaque puits à l’aide d'un lecteur de microplaques et calculer le taux de prolifération des cellules tumorales.
L'efficacité des NPs CHI-SQ-AEAA et des NPs CHI-SQ-RGD sur les cellules à monocouche PSN- 1 et CFPAC-1 est la même que celle des NPs CHI-SQ-FA.
Les résultats sont montrés dans les figures 11 et 12, lorsque la concentration de médicament atteint
3.125 jumol-L*, le CHI libre et les nanoparticules peuvent inhiber significativement la croissance des cellules tumorales, et lorsque la concentration atteint 50 umol-L*, la viabilité cellulaire de PSN- 1 dans le groupe NPs CHI- SQ-FA n'était que 10,1 + 3,7%, la viabilité cellulaire de CFPAC-1 était de 21,1 + 0,9%, la viabilité cellulaire de PSN-1 dans le groupe NPs CHI-SQ-PEG était de 15,7 + 14,0% et la viabilité cellulaire de CFPAC-1 était de 25,3 + 1,8%. Les résultats des NPs CHI-SQ- AEAA et des NPs CHI-SQ-RGD étaient cohérents avec les NPs CHI-SQ-FA. La viabilité cellulaire de PSN-1 dans le groupe NPs CHI- SQ-AFAA n'était que 18,7 + 4,2%, la viabilité cellulaire de CFPAC-1 était de 28,7 + 1,7% ; la viabilité cellulaire de PSN-1 dans le groupe NPs CHI-SQ-RGD était de 16,21%=+3,2% et la viabilité cellulaire de CFPAC-1 était de 14,7% + 1,5%.
2. Essai d'efficacité sur modèles de sphère tumorale co-cultivée Mélanger PSN-1 en phase logarithmique avec une suspension cellulaire de HPSC dans un rapport de 2 : 7, placer le mélange dans une plaque à ultra-faible adsorption à 5000 cellules/puits pour former des modèles de sphère tumorale co-cultivée in vitro. Co-incuber un milieu contenant NPs CHI-SQ-FA avec les sphères tumorales pendant 48, 96 et 144 h, ajouter une quantité égale de réactif CellTiter-Glo, agiter la plaque de culture cellulaire sur un agitateur orbital pendant 15 min, laisser à 16
BL-5504 température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 min, absorber un lysat cellulaire dans une 05 plaque noire de 96 puits, et déterminer la valeur du signal lumineux (à 562 nm) à l'aide d’un lecteur de microplaques à multifonctions. Le traitement sur les sphères tumorales de cellules co-cultivées CFPAC-1/HPSC est la même que celui sur les sphères tumorales de cellules co-cultivées PSN- 1/HPSC. Les résultats sont montrés dans les figures 13 et 14, après le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée CFPAC-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-FA pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 39,8+9,0% ; et après un traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée PSN-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-FA pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 28,6+4,6%. Apres le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée CFPAC-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-PEG pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 45,8+7,1% ; et apres le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée PSN-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-PEG pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 53,7+3,2%. Les résultats de l’efficacité des NPs CHI-SQ-AEAA et des NPs CHI-SQ-RGD sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée sont cohérents avec ceux des NPs CHI-SQ-FA : après le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée CFPAC-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-AFAA pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 23,7+2,3%, et après le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée PSN-1/HPSC pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 50,3+5,1% ; après le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée CFPAC-1/HPSC avec les NPs CHI-SQ-RGD pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 35,1+1,3%, et après le traitement sur le modèle de sphère tumorale co-cultivée PSN-1/HPSC pendant 144 h, la viabilité cellulaire était de 44,3+3,1%. Exemple de réalisation 15 : Essai d'absorption cellulaire in vitro
1. Essai d'absorption sur modèles de culture de cellules à monocouche Peser exactement 1mg de coumarine 6, dissoudre de manière homogène dans de l'éthanol absolu pour former une solution mère de coumarine 6 à 200 pg/mL. Bien mélanger 10 uL de coumarine 6 avec le CHI-SQ-FA préparé dans l’exemple de préparation 7 dans un rapport de 1 : 0,7, gouter 0.1 mL du mélange goutte à goutte à l’aide d’une seringue dans 1 mL de l'eau déminéralisée sous agitation, agiter pendant 5 min, évaporer sous pression réduite pour éliminer l'éthanol, puis traiter le mélange dans un sonicateur pendant 30 min. Ensuite, transférer les nanoparticules enveloppées de coumarine 6 dans un tube d'ultrafiltration 3 Kda et centrifuger à une grande vitesse de 12000 tr/min 17
BL-5504 pendant 20 min pour éliminer la coumarine 6 non enveloppée pour obtenir NPs CHI-SQ-FA/Co 7502) 05 Prendre les cellulaires de PSN-1 ou de CFPAC-1 en phase de croissance logarithmique, inoculer dans une plaque de 6 puits à 10° cellules/ml, cultiver de manière routine pendant 24 h pour rendre les cellules adhérentes, ajouter un milieu contenant NPs CHI-SQ-FA/C6, NPs CHI-SQ-AEAA/C6 ou NPs CHI-SQ-RGD/C6 et incuber dans un incubateur cellulaire pendant 4 h, 12 h et 24 h, jeter le milieu contenant médicament et ajouter du PBS froid (pH7,4) pour arrêter le processus d'absorption de cellules, laver 3 fois avec 1 mL de PBS (pH 7,4), puis digérer les cellules de la plaque de 6 puits avec 0,05% trypsine, arrêter la digestion avec du milieu frais, centrifuger, éliminer le surnageant, collecter les cellules, effectuer un comptage sur les cellules, de sorte que le nombre de cellules soit de 3 a 5x10° cellules/ml, disperser les cellules dans du PBS (pH 7,4), laver 3 fois, et analyser de manière quantitative l'absorption cellulaire à l'aide d'un cytomètre de flux. Les résultats sont montrés dans les figures 15 et 16, dans les cellules PSN-1 et CFPAC-1, les intensités de fluorescence des NPs CHI-SQ-FA, NPs CHI-SQ-AEAA et NPs CHI-SQ-RGD ont toutes atteint leurs pics à 12 h, soit 549,6+17,5x10° (PSN-1) et 620,7+30,0x10° (CFPAC-1) pour NPs CHI-SQ-FA, 613,3+12,7x10° (PSN-1) et 810,7+34.1x10° (CFPAC-1) pour NPs CHI-SQ- AEAA, 533,5 + 13,5 x 10° (PSN-1) et 792,5 + 21,1 x 10° (CFPAC-1) pour NPs CHI-SQ-RGD. Comparé avec la coumarine 6 libre, les nanoparticules auto-assemblées préparées selon la présente invention peuvent étre absorbées lentement et considérablement par les cellules tumorales.
2. Essai d'absorption sur modèles de sphère tumorale co-cultivée La culture des modèles tridimensionnels de sphère tumorale CFPAC-1/HPSC et PSN-1/HPSC est la même que celle de l'étape (3) de l'exemple de réalisation 14. Cultiver pendant 24 h, absorber et rejeter le milieu, laver 3 fois avec du PBS, ajouter les NPs CHI-SQ-FA/C6 préparées à l'étape (1), cultiver dans un milieu exempt de sérum pendant 12 h, absorber et rejeter le milieu, et rincer 3 fois avec du PBS refroidi préalablement. Fixer avec 4% paraformaldéhyde pendant 15 min, jeter, rincer 3 fois avec du PBS, puis ajouté 0,5 mL de DAPI (0,2 pg/mL) et incuber pendant 12 h, jeter, rincer 3 fois avec du PBS, transférer les sphères tumorales traitées dans une boîte confocale laser en quartiers, et observer la distribution de médicament dans les sphères tumorales à l’aide d’une microscopie confocale laser. Les résultats montrent que des signaux fluorescents évidents ont été déterminés dans les modèles tridimensionnels de sphère tumorale après le traitement avec les NPs CHI-PEG-FA préparées selon 18
BL-5504 la présente invention pendant 12 h, ce qui était plus fort que celui de la coumarine 6 libre et 4082105 nanoparticules de chidamide-squalene-polyethylene glycol. Une bonne penetrabilite etait montree dans les modeles de spheres tumorale. Les exemples de réalisation ci-dessus montrent que, selon la présente invention, le squalène est liée au chidamide par une liaison en réponse à la trypsine à travers une modification chimique créative, formant ainsi une molécule de précurseur amphiphile de chidamide squalénisé, telle molécule peut améliorer significativement la pénétrabilité du chidamide dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas, et se rompt souvent et est libéré dans un environnement à haute niveau de trypsine exprimée par les cellules du cancer du pancréas, réalisant ainsi une libération ciblée du médicament pour le cancer du pancréas. Le précurseur de chidamide squalénisé peut s'auto- assembler en nanoparticules dans une solution aqueuse, ce qui permet d’améliorer significativement le temps de rétention de la molécule de précurseur in vivo et le ciblage passif du microenvironnement du cancer du pancréas. De plus, selon la présente invention, les ligands de faible poids moléculaire tels que l'acide folique, le p-méthoxybenzamide ou le RGD sont utilisés comme tête cible, pour améliorer significativement d’avantage l'effet de ciblage actif du chidamide sur les cellules du cancer du pancréas. En un mot, selon la présente invention, les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé modifiées par ligand de faible poids moléculaire qui est utilisé comme tête cible, telles nanoparticules présentent une perméabilité améliorée dans le microenvironnement du cancer du pancréas, une libération en réponse aux cellules du cancer du pancréas, un ciblage actif sur les cellules du cancer du pancréas médiés par les ligands de faible poids moléculaire et un ciblage passif des nanoparticules auto-assemblées sur le tissu tumoral, une grande quantité de charge de médicament, une bonne stabilité et facilité d’opération. La présente invention propose une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer anti- pancréatique par le chidamide du point de vue de préparation.
19

Claims (4)

BL-5504 LU502105 REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : (1) préparation d’une molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) : dissoudre de l'acide squalénisénoïque (SQ-COOH) dans du diméthylformamide (DMF) pour préparer une première solution mère SQ-COOH à 100-200 mg/mL, ajouter 30 à 60 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 50 à 100 mg de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthyl chlorhydrate de carbodiimide (EDCI) dans 1 ml de solution mère SQ-COOH, et laisser réagir à température ambiante pendant 30 à 120 min pour obtenir une première solution de réaction SQ-COOH ; prendre le chidamide (CHI) et résoudre dans du diméthylformamide (DMF) pour préparer une première solution mère CHI à 50- 100 mg/mL, et mélanger la solution de réaction SQ-COOH et la solution mère CHI dans un rapport volumique de 1 à 2 : 1 et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 48 à 96 h, une fois la réaction complète, purifier par chromatographie éclair sur colonne pour obtenir la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) ; l'éluant étant le dichlorométhane : méthanol = 85 à 495 : S ; (2) préparation d'une molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand : dissoudre du SQ-COOH dans du DMF pour préparer une deuxième solution mère SQ-COOH à 1000-2000 mg/mL, ajouter 30 à 60 mg du NHS et 50 à 100 mg de l’EDCI dans 1 ml de solution mère SQ-COOH et laisser réagir à température ambiante pendant 30 à 120 min pour obtenir une deuxième solution de réaction SQ-COOH ; prendre de l’acide folique-polyéthylène glycol-amino (FA-PEG-NH,), p- méthoxybenzamide-polyéthylène glycol-amino (AEAA-PEG-NH2) ou arginine-glycine-acide aspartique-polyéthylène glycol-amino (RGD-PEG-NH;), dissoudre dans du DMF pour préparer une deuxième solution mère DMF à 50-100 mg/mL, mélanger la deuxième solution de réaction SQ- COOH et la deuxième solution mère DMF dans un rapport volumique de 1 à 2 : 1 et laisser réagir sous atmosphère d'azote à température ambiante pendant 48 à 96 h ; une fois la réaction complète, centrifuger le produit de réaction à l’aide d’un tube de centrifugation d'ultrafiltration ayant un seuil de retenue moléculaire de 3 Kda à une grande vitesse de 10000 à 14000 tr/min pendant 30-60 min pour éliminer le SQ-COOH libre et obtenir en fin la molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand ; 20
BL-5504 (3) préparation des nanoparticules de précurseur de chidamide squalénisé modifiées par ligdép02105 dissoudre la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) préparée à l'étape 1 dans 95 à 100 % (concentration volumique) éthanol pour préparer une troisième solution mère à 3,32-6,64 mg/mL ; prendre la molécule de squalene PEGylée modifiée par ligand préparée à l'étape 2 et dissoudre dans 95 à 100 % (concentration volumique) éthanol pour préparer une quatrième solution mère à 0,664-3,32 mg/mL ; mélanger la troisième solution mère et la quatrième solution mère dans un rapport volumique de 1 : 1 pour obtenir un mélange, dans le mélange obtenu, le rapport en masse de la molécule de précurseur de chidamide squalénisé (SQ-CHI) a la molécule de squalène PEGylée modifiée par ligand (SQ-CHI) étant de 1 : 0,1 à 1 ; utiliser la solution mélangée comme phase huileuse et l'eau déminéralisée comme phase aqueuse, le rapport volumique de la phase huileuse à la phase aqueuse étant de 1 : 1 à 20 ; gouter la phase huileuse ci-dessus goutte à goutte dans la phase aqueuse, agiter pendant 5 à 10 min, évaporer sous pression réduite pour éliminer l'éthanol, puis traiter le mélange aux ultra-sons dans un sonicateur pendant 30 à 60 min, obtenant ainsi les nanoparticules de précurseur de chidamide squalénisé modifiées par ligand.
2. Nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé préparées par le procédé selon la revendication 1.
3. Application des nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé selon la revendication 2 pour préparer des médicaments de traitement de tumeurs solides.
4. Application selon la revendication 3, caractérisée en ce que, les nanoparticules auto-assemblées de précurseur de chidamide squalénisé sont préparées en préparations pharmaceutiques, les préparations pharmaceutiques peuvent améliorer le ciblage du chidamide sur les tumeurs solides et la pénétrabilité dans un microenvironnement tumoral, et améliorer les effets thérapeutiques du chidamide sur les tumeurs malignes, tels que le cancer du pancréas, le cancer colorectal, le cancer gastrique, le cancer de l'œsophage, le cancer du sein et le cancer du poumon. 21
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