LU503099B1 - Milchsäurebakterienzubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen Weidegebieten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung offenbart eine gemischte Milchsäurebakterienzubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen Weidegebieten, Zusammensetzung aus ethanolresistentem Pediococcus. Nach dem Einsatz des Milchsäurebakterien-Mischpräparates ist der Gehalt an Milchsäure und Gesamtsäure in der Silage höher als bei Einweg- und handelsüblichen Produkten, und der pH-Wert, die Anzahl schädlicher Mikroorganismen, der Gehalt an Propionsäure, und das Verhältnis von Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff sind niedriger als die ihrer Einwegprodukte und bestehenden Produkte Kommerzielles Produkt, verbesserte aerobe Stabilität, weiter verbesserte Silagefermentationsqualität, erhöhter Gehalt an Silagerohprotein und in vitro-Trockenmasseverdaulichkeit und verlängerte Silagevorbereitung bis Mitte August.

Description

BESCHREIBUNG 7903099

Milchsäurebakterienzubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen

Weidegebieten

Technikbereich

Die Erfindung gehört zum Gebiet der Tierhaltung und betrifft insbesondere ein

Milchsäurebakterienzubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen

Weidegebieten.

Technischer Hintergrund

Mit der Entwicklung der Tierhaltung werden Milchsäurebakterienpräparate immer häufiger in der Silage eingesetzt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Wirkung der Zugabe von Milchsäurebakterien je nach Stoffwechselart, Rohstoffbeschaffenheit und klimatischer Umgebung unterschiedlich ist. Die Menge und Zusammensetzung von Milchsäurebakterien, die in kalten und kühlen Regionen an Futtergras haften, war anders als in gemäßigten und tropischen Regionen. Die derzeit verwendeten kommerziellen Milchsäurebakterien stammen hauptsächlich aus gemäßigten

Umgebungen, und einige Studien zielen darauf ab, die dominanten

Milchsäurebakterien zu untersuchen, die an die Silageherstellung in tropischen

Regionen angepasst sind.

Die Konservierung von eingewickelter Silage ist ähnlich der der meisten konventionellen Silage, aber die Nährstoffzusammensetzung und mikrobielle

Zusammensetzung von eingewickelter Silage sind unvereinbar mit konventioneller

Silage. Im Vergleich zu herkömmlicher Silage beginnt die gewickelte Silage später mit der Fermentation durch Milchsäurebakterien, die Konzentration an Gärsäure ist geringer und der pH-Wert sinkt langsamer, wodurch die gewickelte Silage leichter von schädlichen Mikroorganismen befallen werden kann. Kleinflächig gewickelte

Silage kann es Landwirten und Hirten ermöglichen, mit einer geringen Anzahl von

Züchtern in die Silageproduktion einzusteigen, ohne viel Geld in den

Silageanlagenbau und die Anschaffung von Maschinen und Geräten investieren zu 7505099 müssen, aber viele Faktoren beeinflussen auch die Fermentationsqualität und

Nährwert von verpackter Silage, einschließlich Rohstoffe, Eigenschaften, Textur der

Beschichtung, Lagermanagement usw.

Aufgrund des besonderen klimatischen Umfelds des alpinen Weidegebiets im

Nordwesten Sichuans kann durch kleinflächige Foliensilage sichergestellt werden, dass Landwirte und Hirten eine Futterkonservierung entsprechend Futterqualität und

Viehbestandsmenge sinnvoll durchführen können. Während der Silageproduktion hemmen niedrige Temperaturen oft die Fermentation der Milchsäurebakterien und erhöhen den Silageverlust. Gegenwärtig wird die Silagequalität durch die Zugabe von organischen Säuren (Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure), das Vorziehen der phänologischen Periode des Futtergrases und das rechtzeitige Anwelken zur

Verbesserung der Silagequalität verbessert, aber diesen Maßnahmen sind gewisse

Grenzen gesetzt . Die Zugabe von Milchsäurebakterien kann die Qualität der verpackten Silage und die Leistung der Tiere verbessern. Durch das Aussieben der für die Silageverpackung geeigneten Milchsäurebakterien in alpinen Weidegebieten wird die Fermentation von Milchsäurebakterien im frühen Stadium der Silage gefördert,

Milchsäure wird schnell produziert und die Silage kann schnell ein saures Milieu bilden und den Verlust von Silage reduzieren Silage.

Erfindungsinhalt

Das technische Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, ist:

Wie kann eine Milchsäurebakterienzubereitung bereitgestellt werden, die zum

Einwickeln von Silage in alpinen Weidegebieten geeignet ist.

Das technische Schema der vorliegenden Erfindung ist: eine gemischte

Lactobacillus-Zubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen Weidegebieten, die aus Lactobacillus plantarum 148 mit der Konservierungsnummer CGMCC Nr. 14117 und Lactobacillus paracasei mit der Konservierungsnummer CGMCC Nr. 14116 hergestellt wird. paracasei) 171 und ethanolresistenter Pediococcus ethanolidurans

P-14 mit der Hinterlegungsnummer CGMCC Nr. 14183. 7505099

Lactobacillus plantarum 148 wird als Stamm 148 abgekürzt, Lactobacillus paracasei 171 wird als Stamm 171 abgekürzt und Pediococcus ethanolidurans P-14 wird als

Stamm P-14 abgekürzt.

Lactobacillus plantarum 148 wurde am 11. Mai 2017 beim General Microbiology

Center of China Microbial Culture Collection Management Committee mit der

Aufbewahrungsaummer CGMCC Nr. 14117 hinterlegt, und die

Aufbewahrungsadresse lautet: Nr. 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Peking 3

Institut für Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften.

Lactobacillus paracasei 171 wurde am 11. Mai 2017 beim General Microbiology

Center of China Microbial Culture Collection and Management Commission mit der

Erhaltungsnummer CGMCC Nr. 14116 hinterlegt, und die Aufbewahrungsadresse lautet: Nr. 1, Beichen West Road, Chaoyang District , Peking Nr. 3 Institut für

Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften.

Pediococcus ethanolidurans P-14 wurde am 24. Mai 2017 im General Microbiology

Center der China Microbial Culture Collection and Administration Commission mit der Erhaltungsnummer CGMCC Nr. 14183 hinterlegt, und die Aufbewahrungsadresse lautet: Beichen West Road, Chaoyang District, Peking Nr. 1, Nr. 3, Institut für

Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften.

Verglichen mit dem Stand der Technik hat die vorliegende Erfindung die folgenden vorteilhaften Wirkungen:

Die optimale Wachstumstemperatur des Stammes P-14, Stamm 148 und Stamm 171 der vorliegenden Erfindung beträgt 15°C und hat die Eigenschaften einer schnellen

Wachstumsrate und einer hohen Säureproduktion, stellt günstige Bedingungen für die

Silageherstellung bereit und kann schnell abgeschlossen werden Fermentation unter

Niedertemperaturbedingungen (< 20d), Milchsäure- und Gesamtsäuregehalt erhöhen, pH-Wert, Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhéltnis, Propionsdure- und

Buttersäuregehalt senken, Silagefermentationsqualität verbessern,

Silagerohproteingehalt erhôhen und in vitro trocknen Verdaulichkeit von Stoffen Wird als Zusatzstoff bei der Silagebereitung verwendet.

Die drei Stämme dieser Bakterien wurden zu einem 7505099

Milchsäurebakterien-Mischpräparat verarbeitet und verwendet Der Gehalt an

Milchsäure und Gesamtsäure in der Silage war höher als der ihrer Einweg- und bestehenden Handelsprodukte, und der pH-Wert die Zahl der schädliche

Mikroorganismen, der Gehalt an Propionsdure und das Verhältnis

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff waren gering, aufgrund der alleinigen

Verwendung und vorhandener Handelsprodukte, die aerobe Stabilität wird verbessert, die Gärqualität der Silage wird weiter verbessert, der Rohproteingehalt der Silage und die Verdaulichkeit der Trockenmasse in vitro erhöht und die Silagebereitung bis Mitte

August verlängert werden.

Darstellung der Zeichnungen

Fig. 1 ist der pH-Wert und die Thallin-Absorption (OD600) nach Inokulation,

Stamm-Grünsaft-Fermentation 48 h;

Fig. 2 ist die OD600-Kurve der Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit nach Inokulation des Milchsäurebakterienstamms;

Fig. 3 ist die pH-Kurve der Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit nach Inokulation des

Milchsäurebakterienstamms;

Fig. 4 ist der Milchsäure-, Essigsäure-, Propionsäure- und Ethanolgehalt nach

Inokulationsstamm-Grünsaftfermentation 48 h;

Fig. 5 ist die Milchsäurekurve der Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit nach Inokulation des Milchsäurebakterienstamms;

Fig. 6 ist der Einfluss (48 h) der Temperatur auf den pH-Wert einer beimpften

Milchsäurebakterien-Grünsaft-fermentierten Flüssigkeit;

Fig. 7 ist ein Muster der Referenzelektrophorese eines PCR-amplifizierten Fragments von Milchsäurebakterien;

Fig. 8 ist das Elektrophoresemuster eines gescreenten, durch PCR amplifizierten

Milchsäurebakterien-Fragments;

Fig. 9: Einfluss von Milchsäurebakterien auf den pH-Wert von Silage;

Fig. 10 ist der Einfluss von Milchsäurebakterien auf den Milchsäuregehalt von Silage;

Fig. 11 ist der Einfluss von Niedrigtemperatur-Milchsäurebakterien auf das Verhältnis HUS03099 von ammoniakalischem Stickstoff/Gesamtstickstoff von Silage;

Fig. 12 zeigt die Wirkung von Milchsäurebakterien auf die aerobe Stabilität von verpackter Silage.

Konkrete Durchfiihrung 1. Materialien und Methoden 1.1 Isolierung von Milchsäurebakterien

Insgesamt 86 Proben natürlicher Silage (alter Grannenweizen und Hafer) wurden in den alpinen Weidegebieten im Nordwesten von Sichuan gesammelt, mit einer sterilen

Pinzette in sterile Druckverschlussbeutel gefüllt, versiegelt, in einem Autokühlschrank zurück ins Labor transportiert und dort gelagert -80°C für spätere Verwendung.

Tauen Sie die gefrorene Probe bei Raumtemperatur auf einer ultrareinen Werkbank auf, geben Sie 5 g der Probe in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben, fügen Sie 45 ml 0,9%ige sterile Kochsalzlôsung hinzu, versiegeln Sie sie mit Plastikfolie, schütteln

Sie sie 2-3 Stunden lang und filtrieren Sie sie mit steriler Gaze, und nehmen Sie 1 ml des Filtrats wurde seriell verdünnt, und 1 ml Probenlôsungen mit 10°, 10* und 107

Verdünnungen wurden entnommen und in sterilem Medium verteilt. 3-5 flache

Platten (#10 cm) wurden für jede Verdünnung beschichtet. Das Medium war

MRS-Medium, CaCO; + MRS-Verbindungsmedium, M17-Medium und

GYP-Medium (alle Medien wurden von Chengdu Litian Century Technology Co., Ltd. bereitgestellt, die gleichen unten). Für die Kultivierung wird ein anaerober Inkubator verwendet, die Kultivierungstemperatur beträgt 15 °C und die Kultivierungszeit 48— 96 h. Kolonien mit milchig-weillen, gelben oder Deckkreisen wurden fiir mehrere

Reinigungen ausgewählt und zunächst durch Gram-Färbung (positiv) und

Katalase-Reaktion (negativ) als Milchsäurebakterien (127 Stämme) identifiziert.

Gemäß dem Handbuch von Piaget durch Koloniemorphologie, Nitratreduktionstest,

Gelatineverflüssigungstest, H2s-Gasproduktionstest, Indoltest,

Glukosesäureproduktionsgastest, Kohlenhydratfermentationssäureproduktionstest usw. (alle biochemischen Röhrchen und Identifizierungsrôhrchen werden von Chengdu bereitgestellt Litian Century Biotechnology Co., Ltd.), klassifiziert als 44 Stämme von HUS03099

Milchsäurebakterien. Gemäß dem vorläufigen Screening wurden die Stämme erneut gereinigt und in der MRS-Brühe/M17-Brühe + Glycerol —20°C Kühlschrank zur späteren Verwendung gelagert. 1.2 Screening auf ~~ Milchsäurebakterien und Eigenschaften von

Grünsaft-Fermentationsbrühe nach Inokulation

Pressen Sie den Saft aus Silagemais (oder Luzerne in der Blütephase) in der

Verbindungsphase aus, filtern Sie ihn mit steriler Gaze und sammeln Sie das Filtrat als

Grünsaft-Fermentationsbrühe, um den pH-Wert der gesiebten Milchsäurebakterien und die Zusammensetzung der Fermentationsprodukte zu bewerten (Milchsäure,

Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure). Nehmen Sie nach dem Zentrifugieren der

Grünsaft-Fermentationsbrühe bei 4500 U/min den Uberstand, fügen Sie 2 %

Saccharose hinzu und rühren Sie gleichmäßig um. Nehmen Sie die konservierten

Stämme aus dem Ultratiefkühlschrank und inokulieren Sie sie in MRS-Bouillon oder

M17-Bouillon zur Aktivierung Die Impfmenge von 5 % (v/v) wird allmählich erweitert und kultiviert v/v) Die Inokulummenge wurde inokuliert in die

Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit gegeben und in einem anaeroben Inkubator bei 15°C für 3, 6, 12, 24 bzw. 48 Stunden kultiviert. Gleichzeitig wurden verschiedene

Stämme in die Grünsaft-Fermentationsbrühe geimpft und bei unterschiedlichen

Temperaturen (5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C) kultiviert. für 48 Stunden.

Der pH-Wert der =— Grünsaft-Fermentationsbrühe wurde mit einem

Mettler-Säuremessgerät (A20, Shanghai Cors Electronics Co., Ltd.) gemessen; die

Extinktion der Grünsaft-Fermentationsbrühe wurde mit einem Spektrophotometer (Shimadzu Modell UV-2501; Shimadzu Corp., Tokio, Japan) (OD 600); der grüne Saft fermentierte Flüssigkeit fermentierte Flüssigkeit fermentierte Flüssigkeit 10000

U/min niedrige Temperatur (4°C) zentrifugiert nach 48-stündiger Kultivierung wendet die Methode für Kapitel 1.4 an, um Milchsäure und flüchtige Fettsäuren zu messen, und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (SCR-101H, 10 um 8,0 mm x cm, Shim-pack, Shimadzu, Japan; Säulentemperatur 30 °C; Flussrate 0,6 ml/min (Perchlorsäure); 210 nm, SPD-Detektor), um Ethanol zu messen Inhalt. Bei diesem

Verfahren wurden 31 Milchsäurebakterienstämme herausgefiltert, die den pH-Wert HUS03099 der Grünsaft-Fermentationsbrühe schnell senken und den Gehalt an organischen

Säuren erhöhen konnten.

Um die Wachstumseigenschaften von Milchsäurebakterien zu bewerten, wurden

Kulturmedien mit unterschiedlichen Kulturtemperaturen, pH- und

NaCl-Konzentrationen eingerichtet, um ihre Wachstumsbedingungen zu beobachten.

Milchsäurebakterien in MRS-Bouillon oder M17-Bouillon inokulieren, anaerob bei 15°C für 48 Stunden kultivieren, die Konzentration der Bakteriensuspension (ODs6o) einstellen und beiseite stellen. Nehmen Sie 0,1 ml Milchsäurebakteriensuspension, inokulieren Sie sie in MRS-Bouillon oder M17-Bouillon bei bei 10°C, 15°C, 30°C, 45°C für 48-72 Stunden, beobachten Sie das Wachstum von Milchsäurebakterien, pH-Wert (2,0, 3,0, 4,0) Flüssigmedium, unterschiedliche NaCl-Konzentration (2,5, 4,5, 6,5, g/L%) Flüssigmedium und Milchsäurekonzentration (1,0, 3,0, 5,0, v/v%)

Flüssigmedium, mit pH7,0 Flüssigmedium als Kontrolle, anaerobe Kultur bei konstanter Temperatur (15°C) für 48h, Messung der Extinktion (OD 560) verschiedener Fermentationsbrühen, wenn das Verhältnis der Extinktion des beimpften Milchsäurebakterienmediums (OD 560-mokulaton) zur Extinktion des

Kontrollmediums (OD 560-Kontroile) größer als 1,0 ist, was anzeigt, dass

Milchsäurebakterien unter diesen Kulturbedingungen wachsen können. Jedes

Behandlungsset 3 bis 5 parallel. 1.3 Sicherheitsbewertung von Milchsäurebakterien

Wenden Sie die Scheibendiffusionsmethode an, um die Arzneimittelresistenz von

Milchsäurebakterienstämmen zu messen und zu überprüfen. Verschiedene Stämme wurden in MRS-Brühe oder M17-Brühe inokuliert, bei anaerober konstanter

Temperatur (15°C) für 48 Stunden kultiviert, und die Bakteriensuspension wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf die gleiche Extinktion (ODs60) eingestellt. 1 ml

Bakteriensuspension in eine sterile Petrischale in einer ultrareinen Werkbank aufziehen, steriles Medium MRS oder M17 zugeben, gut schütteln, fixieren, selbstgemachtes rundes arzneimittelresistentes Papier (®10mm) kleben, anaerobe konstante Temperatur (15°C) 48 Stunden lang die Hemmzone beobachten. Die verwendeten Antibiotika waren Gentamicin (10 pg/ml), Amikacin (30 pg/ml), HUS03099

Ciprofloxacin (5 pg/ml), Vancomycin (30 pg/ml), Chloramphenicol (30 pg/ml),

Penicillin (10 pg/ml). ) und Tetracyclin (30 ug/Tablette), jedes Antibiotika-Set 3 bis 5 parallel.

Die antibakterielle Aktivität der Fermentationsbrühe von

Milchsäurebakterienstämmen wurde durch das Agarlochdiffusionsverfahren bestimmt.

Indikatorbakterien (Escherichia coli, Escherichia coli DHSa; Pseudomonas aeruginosa;

Bacillus subtilis; Salmonella derby; Clostridium perfringens; Clostridium perfringens;

Aspergillus niger, Aspergillus niger; Pichia pastoris Hefe, Pichia pastoris) wurden von der Sichuan Academy of Grassland aus Silage isoliert und gescreent Wissenschaft

Bakterien wurden in LB-Medium konserviert und Pilze wurden in YPD-Medium konserviert. Entnehmen Sie die ausgesiebten Stämme, inokulieren Sie sie in

MRS-Bouillon oder M17-Bouillon, expandieren Sie die Kultur Schritt fiir Schritt mit 5% Inokulum, nehmen Sie den Uberstand, fügen Sie eine angemessene Menge

Katalase hinzu und erwärmen Sie ihn in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C für 1 Stunde, und stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 Mol/L NaOH-Lôsung auf 6,0 ein, um den Einfluss einiger Peroxide und saurer Substanzen, die während des

Wachstums und Stoffwechsels von Milchsäurebakterien entstehen, auf die antibakterielle Wirkung zu eliminieren. Die Suspension der Indikatorbakterien auf die gleiche Konzentration einstellen, 50 ml der Bakteriensuspension nehmen und mit dem festen Medium der Indikatorbakterien mischen und auf eine Platte gießen, nach dem

Erstarren ein Loch (®10mm) mit stanzen eine sterile Stanze und fügen Sie 0 hinzu..

Geben Sie 1 ml des Fermentationsüberstands von Milchsäurebakterienstäimmen auf die Vorderseite und inkubieren Sie bei 37 °C fir 18-24 Stunden, um die antibakterielle Wirkung zu beobachten, und verwenden Sie den Puffer mit dem gleichen pH-Wert wie die Negativkontrolle und Amp (30 ug/ml) als Positivkontrolle.

Richten Sie 3-5 Parallelen für jeden Milchsäurebakterienstamm ein. 1.4 Identifizierung von Milchsäurebakterien 16S rRNA bakterielle universelle Primer (7F 1 540R5'-CAGAGTTTGATC

CTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'und27F1492R,

S'-AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTT-GTTACGACTT) wurden zur 7505099

Identifizierung von Milchsdurebakterien verwendet. Die gescreenten

Milchsäurebakterienstämme werden bei einer geeigneten Temperatur kultiviert, um eine Bakteriensuspension zu bilden. Nehmen Sie 2 ml der Bakteriensuspension in ein steriles EP-Röhrchen, zentrifugieren Sie bei 8000 U/min für 5 min, sammeln Sie die

Bakterienzellen, fügen Sie 580 ml TE-Pufferlösung mit 2,0 mg/ml Lysozym hinzu, behandeln Sie bei 37 °C für 1 h , die Zellwand von Milchsäurebakterien zu zerstören, und ein Extrakt mit einem bakteriellen genomischen DNA-Kit (SK8255, Shanghai

Sangon Bioengineering Technology Service Co., Ltd.) wurde verwendet, um die genomische DNA von Milchsäurebakterien zu erhalten. Als Template für die

PCR-Amplifikation wurde chromosomale DNA verwendet

PCR-Amplifikationssystem (50 pL): 4,0 uL 2,5 mmol/L dNTP, 25 uL 10x Puffer

Mg?*, je 0,4 uL der beiden Primer (50 umol/L) rTaq-DNA-Polymerase und 2,0 pl

Template-DNA, ddHzO auf 50 pl hinzufügen. PCR-Reaktionsprogramm: 94 °C für 4 min, 94 °C für 45 s, 55 °C für 45 s, 72 °C für 1,0 min, 30 Zyklen, schließlich 72 °C für 10 min. Nehmen Sie 3,0 1 des Amplifikationsprodukts und führen Sie eine

Elektrophorese auf 1,0 % Agarosegel mit einer Spannung von 150 V, 100 mA fur 20

Minuten und einer Elektrophoreselosung von 50 x TAE durch. Nach der

Elektrophorese 10 min mit Ethidiumbromid (EB) färben und unter UV-Licht beobachten. Senden Sie das erfolgreich amplifizierte PCR-Produkt zur Sequenzierung an Shanghai Sangon Bioengineering Technology Service Co, Ltd. Nach der sequenzierten 16S-rDNA-Sequenz wird das Fragment mit besserer Peakform abgefangen und die umgekehrt komplementäre Sequenz angepasst. Anschließend wird es mit der bekannten verglichen Sequenz in der GenBank.Zur Analyse und zum

Vergleich wurden die anerkannten Standardsequenzdaten der relevantenStämme aus der LPSN-Datenbank bezogen. 1.5 Laborsilagebewertung von Milchsäurebakterien

Die 10 herausgescreenten Stämme von Niedertemperatur-Milchsäurebakterien wurden schrittweise expandiert und kultiviert, und die Zellkonzentration der

Bakteriensuspension wurde auf 1 x 10° KBE/mL eingestellt. Mais im

Milchreifestadium und Luzerne im Verzweigungsstadium bis zum Blühstadium (auf HUS03099 etwa 70 % Wassergehalt verwelkt) wurden als Testmaterialien verwendet, auf 1-2 cm gehäckselt und in spezielle Silagesäcke (30 cm x 50 cm x 0,14 mm) gefüllt , jeder

Beutel 1 kg), Zugabe von Bakteriensuspension (10° cfu/g FM) und Behandlung ohne

Zusatzstoffe als Negativkontrolle (CK, 3 ml/kg FM), Saccharosebehandlung (S, 2 %

FM), Kaliumcitrat (PC, 6,7 g /kg FM), Ameisensäure (FA, 5 ml/kg FM) und Qingbao

II (FS, 3 g/t FM) als positive Kontrollen, gleichmäßig gemischt, unter Verwendung einer Vakuumverpackungsmaschine (DZQ-600, Shanghai Shenyue Packaging

Machinery Co., Ltd, The Company) vakuumversiegelt Wie der Inkubator mit konstanter Temperatur (15°C), der für 5 Tage, 10 Tage, 15 Tage, 20 Tage, 30 Tage, 60

Tage, 90 Tage und 120 Tage gelagert wurde, wird ergeôffnet, um die

Fermentationsqualität und die Nährstoffe zu messen Gehalt und mikrobielle Menge der Silage Das spezifische Verfahren bezieht sich auf den nationalen Standard. Für jeden Zeitpunkt pro Behandlung wurden drei Wiederholungen angesetzt. 1.6 Datenanalyse

Excel 2007 wurde verwendet, um die Daten zu organisieren; SPSS19.0-Software wurde verwendet, um die Varianz (ANOVA) und mehrere Vergleiche zu analysieren;

Graph prime 5 wurde verwendet, um die Fermentationsparameter zu analysieren; der

Unterschied war signifikant bei P < 0,05. 2 Ergebnisse und Analyse 2.1 Isolierung von Milchsäurebakterien 1990 wurden Bakterienstimme aus alten Grannenweizen- und Hafer-Natursilagen isoliert. 127 Stämme von Milchsäurebakterien wurden vorläufig durch Gram-Färbung,

Katalase-Reaktion und physiologische und biochemische Eigenschaften identifiziert.

Gemäß dem Piaget-Handbuch werden 44 Stämme dominanter Milchsäurebakterien nach Koloniemorphologie, physiologischen und biochemischen Eigenschaften und

Reaktionen des Zuckerstoffwechsels klassifiziert. 2.2 Screening auf Milchsäurebakterien 44 Stämme dominanter Milchsäurebakterien wurden in die

Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit inokuliert, die Extinktion der

48-Stunden-Maisgrünsaft-Fermentationsflüssigkeit war 0,102-2,644, der pH-Wert HUS03099 war 2,64—4,88, die Extinktion der 48-Stunden-Luzerne-Grünsaft-Fermentationsflüssigkeit war 0,791-2,797, pH 2,64-4,78 (Abbildung 1). Darunter können 31 Stämme den Wert löslicher

Kohlenhydrate in der Grünsaft-Fermentationsbrühe schnell erhöhen und in relativ kurzer Zeit in die logarithmische Phase eintreten (Abbildung 2).

Während des Screening-Prozesses werden 68, 101, 108, 139, 146, 151, WK5, WK6,

WK88, WK121, WK130, CC3,

Die 13 Stämme wie CC31 wuchsen in der Grünsaft-Fermentationsbrühe schlecht, konnten den pH-Wert nicht effektiv senken und wurden dabei eliminiert. Einige

Stämme haben eine relativ starke Fähigkeit zur Säureproduktion, was den pH-Wert der Grünsaft-Fermentationsbrühe schnell senken kann (Abbildung 3).

Die Analyse der Metaboliten verschiedener Milchsäurebakterienstämme im

Endstadium (48 h) der Grünsaft-Fermentationsbrühe zeigte, dass die Gehalte an

Milchsäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure in der

Grünsaft-Fermentationsbrühe nach Inokulation mit signifikant unterschiedlich waren verschiedene Milchsäurebakterienstämme. Der Gehalt an Milchsäure in der

Fermentationsflüssigkeit von Maisgrünsaft beträgt 2,15-3,40 g/l, der Gehalt an

Essigsäure 0,51-0,73 g/l, der Gehalt an Propionsäure 0,01-0,18 g/l, der

Gesamtsäuregehalt 1 0,73—4,11 g/l, und der Ethanolgehalt betrug 1,73-4,54 mg/l (Abbildung 4). Der Gehalt an Milchsäure in der fermentierten Flüssigkeit von grünem

Luzernesaft beträgt 1,18-2,85 g/l, der Gehalt an Essigsäure 0,40-0,58 g/l, der Gehalt an Propionsäure 0,01-0,04 g/l und der Gehalt der Gesamtsäure beträgt 1,83-3,57 g/l, und der Ethanolgehalt betrug 2,78-5,38 mg/l (Abbildung 4). Im Vergleich dazu wurde festgestellt, dass 9 Milchsäurebakterienstämme wie CC1, CC7, SC2, SC4, SC7, SC29,

SCI, WK3 und CC17 eine geringere Milchsäureproduktion und eine höhere

Ethanolproduktion aufwiesen und während des Screening-Prozesses eliminiert wurden . Das Fermentationsprodukt ist hauptsächlich Milchsäure, die zur gleichen

Fermentationsart gehört.Die Milchsäureproduktionsgeschwindigkeit von 10 Stämmen von Milchsäurebakterien wie P-8, P-11, P-14, 65, 148, 157, 159 , 171, 192 und 220.

Der Milchsäuregehalt der Saftfermentationsflüssigkeit ist höher (wie in Abbildung 5 7505099 gezeigt).

Die Wachstumsbedingungen der Stämme unter verschiedenen Temperatur-, Säure-,

NaCl- und Milchsäure-Kulturbedingungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Alle Stämme können bei hohen Temperaturen (45 °C) nicht wachsen; die Stämme MU4Y-5,

MU4Y-7 und MU4Y-25 können bei niedrigeren Temperaturen (10 °C) nicht wachsen; die Stämme MU4Y-5, MU4Y-25 und M17-171 können nicht wachsen über 30 °C.

Darüber hinaus waren die Stämme MU4Y-5, MU4Y-7, MU4Y-25 und M17-171 alle nicht in der Lage, die Wachstumsumgebung mit hoher Konzentration und hoher

Milchsäure zu tolerieren. Einige Milchsäurebakterien können den pH-Wert der

Grünsaft-Fermentationsbrühe bei einer niedrigeren Temperatur schnell senken, und die optimale Wachstumstemperatur beträgt 20 °C (Abbildung 6).

Tabelle 1: Wachstum von Stämmen unter verschiedenen Temperatur-, Säure-, NaCl-,

Milchsäure-Kulturbedingungen pH ae Ce a 2. Temperature NaCl als Tache acid Lwrsta 3

MI7-271 + + + — + + + + + + + + —

MORE + + + + + + + + —_

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Hinweis: Das Wachstum des Stamms wird dargestellt, indem die Extinktion des inokulierten Stamms durch die Extinktion der Kontrolle dividiert wird (AODs60 =

OD560mokutation/ODS560kontrolte) (+, AODs60 > 1; -, AOD560 < 1).

Die Arzneimittelresistenz und Bakteriostase der Stämme sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 gezeigt. Der Stamm MQO-2 hat eine starke Resistenz gegen Amikacin,

Chloramphenicol, Penicillin und Tetracyclin, der Stamm 177 hat eine starke Resistenz gegen Gentamicin, Amikacin und Tetracyclin, und die Stämme MU4Y-8 und

MU4Y-15 hatten eine starke Resistenz gegen Vancomycin und Penicillin und U4Y-14 hatte starke Resistenz gegen Vancomycin und Chloramphenicol. Die

Fermentationsbrühe von Stamm 9, P-5 und NZ-2 hatte keine antibakterielle Wirkung.

Daher wurden während des Screening-Prozesses die Stämme 9, 177, MQ0-2, P-5,

a 200 ; LU503099

MUY4-8, MUY4-14, MU4Y-15, NZ-2 usw., die eine starke Arzneimittelresistenz oder schwache antibakterielle Aktivität aufweisen, eliminiert .

Tabelle 2: Arzneimittelresistenz verschiedener Milchsäurebakterienstämme

Strains ; . “ LL. ; . a ;

Gentänneis Axmkacia Ciprofloxaein Lincomyeis Chisramphentco! Penicillin ‘Tefrecychne

MOE + - + + - - -

MU4Y-8 + + + - + — + v1 + + w — ~~ w w saLidy-{5 + + + - & — +

NZZ w Ww w w w + Ww pos w + w + + + w

PR w x Ww EN EN he de

P-11 + Ww “sr Ww Ww Ww w

Pis + w + w w w w 9 w Ww Ww + w Ww +

WW w Ww Ww Ww Ww Ww 148 + wœ Ww Ww w w Ww 157 w + + w + w Ww 159 + + Ww Ww w + Ww

Lt w Ww Ww wa + Ww w 177 — — Ww + Ww Ww - 192 + Ww Ww Ww Ww = 55 220 w w + Ww w w we

Hinweis: Die Antibiotikaresistenz wird durch den Durchmesser der Hemmzone dargestellt (-, 10 mm (Durchmesser der Antibiotikascheibe); w, 10-15 mm; +, >15 mm).

Antibakterielle Wirkung verschiedener Bakterienstämme in Tabelle 1-3 ne E ER ERRER RETURN LU503099

LE CP Le “€ ER . 2 J. . A ; ow. . LA.

Strains co SS erases derby} 8 pexfinge passer nèger + a DH5ä3) sens > 83 REY. TE Hs) > EE

Pes > m u a a. a u. >

PS + w Ww ww Wr - —

P11 w w w w + — = — p-ta + + w + + - - -

Q 200 vase >. max a ne J a 65 Ww w + w w — -— — 148 + Ww w Ww + - — - 157 + Ww Ww + Ww — — — 139 Ww w + Ww we — — — tt + +- w + + - - - 152 + w + w w - - - 220 + w w Ww + — — —

Hinweis: Die antibakterielle Aktivität wird durch den Durchmesser der Hemmzone dargestellt (-, 10 mm (Durchmesser des Lochers); w, 10-15 mm; +, > 15 mm). 2.3 Identifizierung von Milchsäurebakterien

Verstärken Sie die DNA aller extrahierten Modellstämme mit PCR-Primern.Legen Sie sie nach der Agargelelektrophorese in einen Gel-Imager, um Bilder aufzunehmen und zu beobachten. Wenn eine klare Bande bei etwa 1500 bp erscheint (Abbildung 7), zeigt dies an, dass die Amplifikation erfolgreich ist . Die gescreente

Niedertemperatur-Milchsäurebakterien-DNA wurde mit PCR-Primern amplifiziert, und das amplifizierte Produkt wurde einer Agargelelektrophorese unterzogen, in einen

Gel-Imager gegeben, um Bilder aufzunehmen und zu beobachten ( 8 ), und durch

Amplifikation und Sequenzierung als 7 identifiziert 16S-rRNA-Fragment Plantarum (L. plantarum), 1 Stamm von Streptococcus faecalis (E. faecium), 1 Stamm von

Ethanol-resistentem Pediococcus (P. ethanolidurans) und 1 Stamm von Lactobacillus paracasei (L. paracasei) (Tabelle 4).

Tabelle 4: Molekularbiologische Identifizierung von Milchsäurebakterien

BLAST slignment

Stein {lode at NCBI Identity

PR L. plantarum FJ420976 0.596 #8 £. feactom AMOGSSTE 0,597

P-14 PRONS AY3567R9 0.9814 &s L. plantarum FMIGSTR DE {4% L. plantarum GU202428 0.996 137 de FESTEN EF204952 0,685 155 L. planiarun EF203682 (503

WA L. paracagei JOM 8130 0.948 92 L planterem MALMO HID 0.598 23) L. ploniarune HM218209 0.897 2.4 Laborsilagebewertung von Milchsäurebakterien 2.4.1 Néhrstoffkomponenten von Silagerohstoffen

Der Gehalt an Trockenmasse, lôslichen Kohlenhydraten, Rohprotein, neutralen

Detergensfasern, sauren Detergensfasern und Trockensubstanzverdaulichkeit der

Maissilage-Rohstoffe betrug 281,6 g/kg, 100,7 g/kg TS, 113,8 g/kg TS, 487,0 g/ kg

TM, 275,8 g/kg TM, 608,9 g/kg TM. Der Gehalt an Trockenmasse, lôslichen

Kohlenhydraten, Rohprotein, neutralen Detergensfasern, sauren Detergensfasern und

Trockensubstanzverdaulichkeit der Luzerne-Silagerohstoffe betrug 308,7 g/kg, 70,1 g/kg TS, 224,3 g/kg TS, 426,3 g/kg DM, 381,4 g/kg DM, 632,6 g/kg DM. 2 4 .2 Mikrobielle Zusammensetzung von Silagerohstoffen und Silage

Die mikrobielle Zusammensetzung von Silagerohstoffen und Silage ist in Tabelle 5 dargestellt. Nach 120 Tagen Lagerung bei Normaltemperatur war die Anzahl an Hefen,

Fadenpilzen und Escherichia coli in der Silage signifikant geringer als in der

Rohsilage (P < 0,05). Die Zahl der Milchsäurebakterien in der mit den Stämmen P-14, 148 und 171 behandelten Silage war signifikant höher als die von CK (P < 0,05). Die

Anzahl von E. coli in allen mit Stämmen behandelten Silage war niedriger als die von

CK. Mit Ausnahme der Stamme P-14, 148 und 171 unterschied sich die Zahl der

Fadenpilze in mit anderen Stämmen behandelter Silage nicht signifikant von der der

Kontrolle (P > 0,05). Mit Ausnahme von Stamm 220 war die Anzahl von E. coli in

Silage, die mit anderen Stämmen behandelt wurde, signifikant niedriger als die von

. . i Lo . _ LU503099

CK (P < 0,05). Die Anzahl der Milchsäurebakterien in der mit Stämmen behandelten

Silage war hôher als die von CK, und die Anzahl der Milchsäurebakterien in der mit den Stämmen P-14, 148 und 171 behandelten Silage war signifikant höher als die anderer Stämme (P < 0,05).

Tabelle 5: Finfluss von Milchsäurebakterien auf die mikrobielle Zusammensetzung von Silage (log KBE/g FM)

YEA FIL ENT LAB

Treatment

Corn Alfalfa Cort AUGE Com Alfaita Com ALERT

Fresh 83 7.9 83 50 5.8 a4 6.4 $5 fbrage

CE 5.9 62 47 45 48 49 5.4 5.2

S 4.5 ST 4.3 4.6 4.3 4.8 AR 53

PC 43 5.3 42 42 3,9 4.5 45 8,3

FA AS 54 42 43 45 47 50 52

PS 44 5.4 4.3 4,2 44 46 6.7 6.8

Pg 43 sé 43 4.3 4.0 4.4 64 6,4

PU 54 BA 44 41 43 42 Ad 6.5

Pd 4.2 47 3,7 3,6 3.7 4.8 72 7,3 65 35 83 45 39 4.4 44 39 6.5 £48 18 4.3 33 35 34 37 74 76 157 4.3 45 4.5 4.2 An 43 6.1 6,9 {59 47 sa 43 43 42 43 6.0 6.5 £71 4.0 4.1 13 7 4.1 34 7,6 T3 192 42 st 44 4.5 45 4.5 55 6.3 220 4.6 #4 4.5 45 46 +4 38 6.3 2.3 Einfluss dominanter Milchsäurebakterien auf die Gärqualität von Silage

Die Vergärungsqualität von Maissilage ist in Tabelle 6 dargestellt. Mit Ausnahme der

Stämme 65 und 157 konnten alle anderen Stämme den pH-Wert der Maissilage signifikant senken (P < 0,05), und der pH-Wert der mit Stamm 148 behandelten Silage war am niedrigsten (4,16). Der Milchsäuregehalt der mit

Niedertemperatur-Milchsäurebakterien behandelten Maissilage war signifikant hôher als der von CK (P < 0,05), und das Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis, der Essigsäure- und Propionsäuregehalt waren signifikant hôher als der von CK (P

Co ; Lo LU503099 <0,05). In Maissilage hatte Stamm 148 den höchsten Milchsäuregehalt (41,0 g/kg TS),

Stamm 65 hatte den niedrigsten Essigsäuregehalt (5,8 g/kg TS) und Stamm 171 hatte den niedrigsten Propionsäuregehalt (0,4 g/kg DM), Stamm 148 hatte den höchsten

Gesamtsäuregehalt (48,5 g/kg DM) und Stamm 171 hatte das niedrigste

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis (68,6 g/kg TN). Buttersäure wurde in keiner Maissilage nachgewiesen. Die umfassende Bewertung ergab, dass die 10 gescreenten Milchsäurebakterienstimme der Silage zugesetzt wurden und die

Säureproduktionsfähigkeit der Stämme P-11, 65, 157, 159 und 220 relativ schwach war und das Verhältnis von ammoniakalischem Stickstoff zu Gesamt Stickstoff war relativ hoch.

Tabelle 6: Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von

Maissilage pH LA AA PA TA NH NTH

Treatment ; a ; LL {gg DM} {pil TIMES {hg DA) {ekg DM) {ghey

UK AAO 139ÆLTF 9,740.8 LEE RABE 1,50 EN 8 4382003 171528 820048” Late” LET: 86.3042

PC 4400004 137436 SHHAS 15:89 MALAY Bohs

FA S16+005 139441 73408 SH m0t20 LS

FS 4322005 22548 SHL08$ 13h MIELE The” p-g 4200.03" IASH32T 6807 OS 421407 BAHL

Pi EIFEL 606 Las #74165 wae

P14 ALGEN GAS TEE“ LOK 443435 Tama 65 426-2002“ 268423 58H08 0501 RAH 22x43" 148 4.160001° 410509 66H04% BORMES 48541 TLL

E37 43800023 272429 Ach BREOIT 336326 838 KA

E59 4220001 34420” 75H04 SE 171 AUTO ISH £5405 aTmor™ SEI: Rene 392 AIRT0OT OITRHLST F7E0EY newer da TS 220 4230.00 31925 67H04 aden 3402 SEE

SEM 8.02 L6 02 0.1 15 24

Hinweis: SEM, Standardfehler des Mittelwerts; unterschiedliche Kleinbuchstaben in derselben Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied im Mittelwert hin (P < 0,05), dasselbe unten.

Die Vergärungsqualität von Luzernesilagen ist in Tabelle 7 dargestellt. Alle Stämme können den pH-Wert von Luzernesilagen und das Verhältnis 7505099

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff (P < 0,05) signifikant senken, der pH-Wert von mit Stamm 171 behandelter Luzernesilage ist am niedrigsten (4,31) und der pH-Wert von Luzernesilagen behandelt mit Stamm P-14 Das Verhältnis von zugeführtem

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff war am niedrigsten (82,8 g/kg TN). Der

Milchsäuregehalt der mit allen Stämmen behandelten Luzernesilage war signifikant höher als der der Kontrolle (P < 0,05), und der Milchsäuregehalt der mit Stamm 148 behandelten Luzernesilage war am höchsten (37,2 g/kg TM). Mit Ausnahme der

Stämme P-11, 148, 171 und 220 konnten die anderen Stämme den Gehalt an

Essigsäure in Luzernesilagen signifikant reduzieren (P < 0,05). Stamm 157 behandelte

Luzernesilage mit dem niedrigsten Acetatgehalt (5,1 g/kg TM). Mit Ausnahme der

Stämme P-14 und 148 war der Propionsäuregehalt von mit anderen Stämmen behandelten Luzernesilagen signifikant höher als der von CK (P < 0,05). Der

Buttersäuregehalt von mit Stämmen behandelter Luzernesilage war signifikant niedriger als der von CK (P<0,05), und der Buttersäuregehalt von mit den Stämmen

P-14 und 171 behandelter Luzernesilage war signifikant niedriger als der anderer

Stämme (P< 0,05). Mit den Stämmen P-8, P-11, 65, 157, 159, 192 und 220 behandelte

Alfalfa-Silage hatte einen Buttersäuregehalt von mehr als 1,0 g/kg TM und war von schlechter Qualität, sodass sie im Screening-Prozess eliminiert wurden. Die

Fermentationsqualität der Stämme P-14, 148 und 171 war besser, was der

Konservierung von Silage zugute kam.

Tabelle 7: Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von

Luzernesilagen

Tabelle 2-3. Die Auswirkungen von LAB-Isolaten auf die Fermentationsqualität von

Luzernesilagen a LU503099 pH LA AA FA BA FA NH-N;TN

Treatment Co . i I 4 (ke DM) (whe DM) {pk DM) (ak DM) (pke DM) (gig

CK 4642005 1532067 HUES 0852017 47202" STELLE ISATREIE 43700020 22023 sxe” a “0.1 22327 1570

FC $SSHOT HOELT O6X03T 12403) 231503 230520 24134026

FA AD4HG0IT 13415 90x08 «00.4 <i), | WAHL (ORES

FS 44262" 57h16 79x06 Lake iit 296243 14327 Y

Pg 434+902* 340407" 97307 17402 22304 260160 SL 10.47

P-if 4424001% 262425 106208 17x06" 24x01" 408515 15101607

Pis 43300007 36.0060 87208 08303 078020 466232° 184890 85 4492007 309517 G6k05° 123007 oko goa’ WAZ 148 4350027 372518 0408 L702 0.7407” 02426 8594810 157 45250017 281415 SIE06 13202 1407 359420 MLSE262° 159 4434000 3LILIU® S6H0ST 122007 222017 £23228 (R42 171 4315001 34TH 98206 JAR 07201 4672105 870k105° 192 4392002 MEELET 2700“ LORGT 2242077 432208% MORE 226 43630010 344 14° 05208 SHO Lad 47Th1l6 esa’

SEM 8.62 0.8 3 of £.2 08 FE

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf den pH-Wert von Silage ist in Abbildung 9 dargestellt. Der pH-Wert der mit Milchsäurebakterien beimpften Silage blieb am 20.

Tag der Lagerung relativ stabil (P > 0,05), während der pH-Wert der Silage ohne

Zusatz von Saccharose, Kaliumcitrat und dem handelsiiblichen

Milchsäurebakterienpräparat Qingbao II erhalten blieb am 30. Tag der Lagerung

Relativ stabil (P > 0,05).

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf den Milchsäuregehalt von Silage ist in

Abbildung 10 dargestellt. Im Vergleich zu CK und PC können alle

Niedrigtemperatur-Milchsäurebakterien die Produktion von Milchsäure in Maissilage beschleunigen (P < 0,05), im Vergleich zu S und FA die Milchsäure von Maissilage behandelt mit den Stämmen P-14, 148 und 171 am 20. Tag der Lagerung Der Gehalt blieb relativ stabil (P > 0,05). Im Vergleich zu CK, S, PC, FA und FS konnten

Milchsäurebakterien die Milchsäureproduktion in Luzernesilagen beschleunigen (P < 0,05), der Milchsäuregehalt von mit den Stämmen P-14, 148 und 171 behandelten

Luzernesilagen blieb relativ stabil nach 20 Tagen Lagerung (P > 0,05).

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf das 7505099

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis von Silage ist in Abbildung 11 dargestellt. Mit zunehmender Lagerzeit stieg das

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis von mit S, PC, FA und FS behandelter Maissilage weiter an (P < 0,05) und das

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis von mit Milchsäure behandelter

Maissilage Bakterien in den ersten 20 Tagen signifikant erhöht (P < 0,05) und blieb danach relativ stabil (P > 0,05). Das

Ammoniak-Stickstoff/Gesamt-Stickstoff-Verhältnis von mit PC behandelter

Luzernesilage stieg weiter an (P < 0,05), und das

Ammoniak-Stickstoff/Gesamt-Stickstoff-Verhältnis von mit anderen Behandlungen behandelter Luzernesilage stieg 30 Tage vor der Lagerung signifikant (P <0,05). 2.4 Einfluss dominanter Milchsäurebakterien auf die Nahrstoffkomponenten von

Silage

Die Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Nahrungsbestandteile von

Maissilage sind in Tabelle 8 dargestellt. Die mit Stamm 159 behandelte Maissilage hatte im Vergleich zu CK (P > 0,05) den niedrigsten Gehalt an löslichen

Kohlenhydraten (25,0 g/kg TS) in den Gehalten an lôslichen Kohlenhydraten und

Säurewaschmittelfasern. Der Rohproteingehalt von mit den Stämmen P-14, 149 und 171 behandelter Maissilage war signifikant höher als der von CK (P < 0,05), und der

Rohproteingehalt von mit den Stämmen P-8 und 157 behandelter Maissilage war signifikant niedriger als der von CK (P < 0,05) 0,05), unterschied sich der

Rohproteingehalt von mit anderen Stämmen behandelter Maissilage nicht signifikant von dem von CK (P > 0,05). Die Verdaulichkeit von Maissilage, die mit jedem Stamm behandelt wurde, war signifikant höher als die von CK (P < 0,05), und die in vitro-Verdaulichkeit der Trockensubstanz von Maissilage, die mit den Stämmen P-14, 148, 171 und 192 behandelt wurde, war höher als diese anderer Stämme (P<0,05).

Tabelle 8: Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Nahrungsbestandteile von

Maissilage

En 1503099 _ DM CF

Treatme WSC 4 A aNDF ADF IVDMD {ke} {g'kg DM} nt (kg DM (gke DM} {gke DM) {oka DM)

CK 290,613 253446 0384340 31164205 25584109 3149 143

S 2927239 339467 QB2ELL 521440112 2663È145 SRE

PC 294 .4.404.5 33.7438 961239" SIGSLI31 2802158 52434162

FA 288741 35.4487 1013 229° SIO4LH7 27014127 55991134

FS 2937551 312064 976 042° SISALIS ISRILIA7 SISIHI25

P-8 27382 298237 92.1:46,3° 5204160 27446213.) STSRHI46"

Pi LEASH 280441 O2SLES" 51024142 26074133 8213 &162°

P14 2864+73 32.8441 1043540 32284356 26314117 SEG8Les” 63 2852443 268261 06320" 5283493 2550103 5581-4 24.1° 148 20.6456 32184 10244 19% 80041144 25874139 58504202" 157 2874476 2500218 8894266 52024221 273502188 A634 kB 156 2826416 169439 55440" S2G4X139 26562129 55601610 173 294 146.0 34.3048 972476 490 ILI36 235.858 584.3 + 14.6" 192 2846139 305k63 OS1A76" SIIOLGI! 2564495 5755605" 220 2770250 307662 930436 532250 25804174 SITE LO

SEM 1,7 G9 10 12,9 2,3 6.8

Die Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Nahrungsbestandteile von

Luzernesilagen sind in Tabelle 9 dargestellt. Der Gehalt an 16slichen Kohlenhydraten von mit Stamm 148 behandelter Luzernesilage betrug 24,8 g/kg TS, was signifikant höher war als der von CK (P < 0,05). Mit Ausnahme der Stämme 65 und 157 war der

Rohproteingehalt der mit anderen Stämmen behandelten Luzernesilage signifikant hoher als der von CK (P < 0,05). Die Verdaulichkeit der Trockenmasse von

Luzernesilage, die mit allen Stämmen behandelt wurde, war signifikant niedriger als die von CK, und die in vitro-Verdaulichkeit der Trockenmasse von Stamm 148 war am höchsten (608,3 g/kg TM, P < 0,05).

Tabelle 9: Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Nahrungsbestandteile von

Luzernesilagen

DM CP aNDF ADF IVDMD

WSC . + cr ©

Treatment (gk (pp DM} (whe DM) {akg DM) {gkg DMD {ke DM}

CK 4914 83246 17432560 SO03XI01 LARIAT 50262258 8 MIJILSS 2061512 3988541 4822313 4334037 Afé6aM 8

PC 2206236 SITH4R JO) EE PSII 243208 53632242

FA 22,7420 ATTIRE 203 427 49135189 23400111 603.4 126.87

ES DISAHISE ROHSS ISIE 210265 24451102 SSS:

PS 206 7568 2320167 E276 JESUS Q536HLEE 58845208 pei 200.3: 13.1 285207 182.6173 48381220 MSTLITS SEAR UA

Pid 1959566 2118” OIRSRALS" GRTRRISD GSSGHIGI 60712287 65 208.177 235000 1ER 0282s 2ELLE2LS SISTER 148 2069235 248218 1974233" SMITA 24962220 60R3IX2TE 157 2079513 2265057 17563290 49360106 28736114 © SI26 927° 159 2081247 338232” 85712 0140s 28056200 STS 171 2063060 239548" 183.2432° R40 HA 24485173 60015041" #92 2087239 22812" ITO5X385 BIRGER 2596H180 508.80 10.58 220 083326 2TH IIA 487002143 238.6 6326 = 59622216"

SEM 11 0.4 13 is. 35 8.5 3. Fazit 127 Stämme von Milchsäurebakterien wurden aus 86 natürlichen Silageproben isoliert, und 10 Stämme von Niedertemperatur-Milchsäurebakterien wurden auf physiologische und biochemische, Fermentationsproduktzusammensetzung,

Arzneimittelresistenz und antibakterielle Eigenschaften untersucht, darunter 7 2

Stämme von Lactobacillus plantarum, 1 Stamm Streptococcus faecalis, 1 Stamm

Ethanol-resistenter Pediococcus und 1 Stamm Lactobacillus pseudocasei. Die optimale Wachstumstemperatur dieser Stämme liegt bei 15 °C, und sie haben die

Eigenschaften eines schnellen Wachstums und einer hohen Säureproduktion, die günstige Bedingungen fiir die Silagebereitung bieten. Darunter können die Stämme

P-14, Stamm 148 und Stamm 171 die Fermentation (< 20 d) unter

Niedrigtemperaturbedingungen schnell abschließen, den Milchsäure- und

Gesamtsäuregehalt erhôhen, den pH-Wert, das

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis, Propionsäure und Buttersäure senken , verbessern die Fermentationsqualität von Silage, erhöhen den HUS03099

Rohproteingehalt von Silage und die Verdaulichkeit der Trockenmasse in vitro und können als Zusatzstoff im Prozess der Silagebereitung verwendet werden.

Der Bakterienstamm P-14 ist ein ethanolresistenter Pediococcus (Pediococcus ethanolidurans) und die Konservierungsnummer ist CGMCC Nr. 14183. Der

Bakterienstamm 148 ist ein pflanzlicher Lactobacillus (Lactobacillus plantarum) und die Konservierungsnummer ist CGMCC Nr. 14117. Der Bakterienstamm 171 ist

Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei), die Hinterlegungsnummer ist

CGMCC Nr. 14116. 4. Optimieren Sie die App 4.1 Materialien

Als Testmaterialien wurden "Chuancao Nr. 2" alter Mangoweizen Ende Juli (Wachsreifezeit) und Qingyin Nr. 2 Hafer (Wachsreifezeit) Mitte August ausgewählt.

Stamm P-14 (9,60 x 10° KBE/g), Stamm 148 (6,67 x 10° KBE/g) und Käsemilch 171 (8,25 x 10!’ KBE/g), handelsübliche Milchsäurebakterien. Zur Verfügung gestellt vom Institut für Mikrobiologie, Anzahl effektiver Kolonien> 10° KBE/g, die

Hauptbestandteile sind Reinkulturen verschiedener Mikroorganismen wie

Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae) und

Qingbao II (FAST SILI, gefriergetrocknetes Pulver aus natürlichen

Milchsäurebakterien, Die effektive Koloniezahl beträgt 6,66x10!° KBE/g , bereitgestellt von Beijing Tashan Technology Co., Ltd.). 4.2 Experimentelles Design

Vor der Verwendung wurde das Trockenpulver von Milchsäurebakterien in 1 x 10° cfu/ml Bakteriensuspension mit physiologischer Kochsalzlösung zubereitet, und das randomisierte Blockdesign wurde übernommen, und die Behandlungsgruppen wurden eingerichtet: Ethanol-resistenter Pediococcus P-14 (PE, 1x10°cfu/g FM),

Pflanzenmilch Bacillus 148 (LPL, 1x10°cfu/g FM), Lactobacillus paracasei 171 (LPA, 1x10°cfu/g FM) und PE+PLP+PLA, ohne Zusatz als Kontrolle ( CK) mit Starfish

Micro Storage King (HX, 1,5 g/t FM) und Qingbao II (FS, 3 g/t FM) waren positive

Kontrollen. Der Mähdrescher mäht den alten Grannenweizen und Hafer an einer

Stelle, hinterlässt Stoppeln in 10 cm Höhe, nimmt sie auf und transportiert sie zurück 7505099 zur Silageproduktion, legt sie zum Trocknen flach auf den Zementboden und überwacht den Wassergehalt Wiegen, Milchsäurebakterienflüssigkeit gleichmäßig aufsprühen (die löslichen Kohlenhydrate von altem Mangoweizen sind niedriger als 3 %

TS, 2 % FM Saccharose vor dem Silieren zugeben), mit einer Rundballenpresse wickeln und wickeln (P55cm 50cm, gewickelt 8 Folienschichten, 25 um pro Schicht, ca. 40 kg pro Packung), 60 Tage bei Raumtemperatur (<10°C) gelagert und auf

Fermentationsprodukte, Nährstoffe und aerobe Stabilität analysiert. Für jede

Behandlung wurden drei Wiederholungen angesetzt. 4.3 Messgegenstände und -methoden

Probenahme: Nachdem Sie die Folie eingewickelt und entfernt haben, legen Sie sie auf die Halterung.Die Rundballen werden in drei Schichten geteilt, und in jeder

Schicht werden zufällig 5 Stellen beprobt.Jede Probenahmestelle nimmt 10-15 cm3

Silage, schneidet sie auf 2-3 cm und 15 Punkte in derselben Packung.Die Proben von jedem Probenpunkt wurden gleichmäßig gemischt, in sterile Silagebeutelgepackt, vakuumversiegelt, gekühlt und zurück ins Labor gebracht und bis zurVerwendung in einem —20°C-Kühlschrank gelagert.

Der Nachweis und die Analyse von Silagerohstoffen und Silagekeimmenge,

Nährstoffqualität und Gärqualität beziehen sich auf den nationalen Standard.

BewertungsmaBstab für die aerobe Stabilität von Silage: die Zeit (h), die erforderlich ist, wenn die Innentemperatur der Silage um 2 °C von der Umgebungstemperatur (25 °C) abweicht. 4.4 Datenanalyse

Varianzanalyse (ANOVA) und Mehrfachvergleiche wurden an den Daten durch

SPSS19.0-Software durchgeführt; Graph prime 5 wurde verwendet, um die aerobe

Stabilität von Silage zu analysieren; der signifikante Unterschiedspegel war P < 0,05. 5. Ergebnisse und Analyse 5.1 Nährstoffzusammensetzung und mikrobielle Zusammensetzung von

Silagerohstoffen

Der Gehalt an Trockenmasse, löslichen Kohlenhydraten, Rohprotein, neutralen

. . . . LU503099

Detergensfasern, sauren Detergensfasern und die In-vitro-Verdaulichkeit der

Trockensubstanz von altem Mangoweizen betrug 351,7 g/kg, 21,1 g/kg TS bzw. 78,3 g/kg TS. 558,3 g/kg TM, 325,4 g/kg TM und 539,5 g/kg TM. Der Gehalt an

Trockenmasse, lôslichen Kohlenhydraten, Rohprotein, neutralen Detergensfasern, sauren Detergensfasern und in-vitro-Trockensubstanzverdaulichkeit von Hafer betrug 326,6 g/kg, 76,7 g/kg TS, 100,84 g/kg TS, 521,0 g/kg TM, 314,8 g/kg TM und 605,8 g/kg TM. Die Zahl der an Silagerohstoffen anhaftenden Milchsäurebakterien war geringer als die von Hefen und Fadenpilzen (Tabelle 10).

Tabelle 10: Mikrobielle Zusammensetzung von Roh- und Foliensilage (loglOcfu/g

FM)

YEA Fit ENT LAB

Treatment Siberian Siberian Siberian Siberian wildrye Oar wikdrye Out wildeye Car wildrye Oat 6.1 53 48 46 SA 38 16 21 farage

CK 53 52 48 44 48 38 82 5.1

HX 4.7 49 45 41 47 39 36 6,5

EN 4.5 46 36 39 38 33 55 73

PE 33 34 35 35 40 33 33 72

LPL 44 45 36 38 42 32 59 77

LEA 3.2 43 35 33 37 32 55 7.4

PEHPLILEA LA 34 33 23 23 34 83 78 5.2 Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die mikrobielle Zusammensetzung von Silage

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf die mikrobielle Zusammensetzung von

Silage ist in Tabelle 10 dargestellt. Die Anzahl von Hefen, Fadenpilzen, Escherichia coli und Milchsäurebakterien in Weizensilage alter Männer betrug 3,52 — 5,12 log10

KBE/g FM, 2,29 — 4,80 log10 KBE/g FM, 2,28 — 4,81 log10 KBE/ gFM bzw. g FM und 5,21 — 5,89 logl0 KBE/g FM, die Anzahl von Hefen, Fadenpilzen, Escherichia coli und Milchsäurebakterien in Hafersilage betrug 3,36 — 5,18 logl0 KBE/g FM, 2,25 — 4 0,36 log10 KBE/g FM bzw. g FM, 3,18 bis 3,89 logl0 KBE/g FM und 5,12 bis 7,80 log10 KBE/g FM. Im Allgemeinen war nach der Behandlung mit 7505099

Milchsäurebakterien die Anzahl an Hefen, Fadenpilzen und Escherichia coli in der

Silage geringer als bei CK und die Anzahl an Milchsäurebakterien höher als bei CK. 5.3 Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Gärqualität von Silage

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von in Altweizen gewickelter Silage ist in Tabelle 11 gezeigt. Nach der Zugabe von

Milchsäurebakterien waren der pH-Wert und das Verhältnis

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff der alten Mangoweizen-Hüllsilage signifikant niedriger als die von CK (P < 0,05), und die Gehalte an Milchsäure und Gesamtsäure waren signifikant höher als die von CK (P < 0,05). Der Essigsäuregehalt der mit PE behandelten alten Grannenweizensilage lag mit 6,3 g/kg TM deutlich über dem von

CK (P < 0,05). Der Gehalt an Propionsäure in mit Milchsäurebakterien behandelter

Mangosilage lag mit 1,0-2,2 g/kg TS deutlich unter dem von CK (P < 0,05). Der pH-Wert und das Verhältnis von ammoniakalischem Stickstoff/Gesamtstickstoff der mit PE+LPL+LPA behandelten mit Mangoweizen umwickelten Silage waren niedriger und betrugen 4,01 bzw. 57,3 g/kg. Buttersäure wurde nicht in allen mit

Milchsäurebakterien behandelten alten Mangoweizensilage nachgewiesen.

Tabelle 11: Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von umhüllter Silage aus altem Grannenweizen pH LA AA sa BA TA SH NZER

Treatment Ra DM) gk DM) {php DM) (pla DM) (aka DM) LAAA (ok)

Hx 43200087 ITOLUI SOR09 324020 SER OEL Ohr Stores

Es ALLEN SELL ROBO 434805 10002 MERLE 19H03" BROT

PE ÖFEN 23 Game rage Notdeteded 272208 34002 TED

LPL IT RAT WHOLLY 43h00 LA 20437 Notdeteded 37 9 405% ATLAE SELL

LPA A3SE MALLS Akte Lampes Notdetedted IS gg 1 SILOS Sonn

PESEPLALEA Æ0ILDI3" 38617 83206" sopoat Notdetected ape (3 SA LOG STINILE

SEM 805 ii 52 82 0. Li 02 41

Hinweis: SEM, Standardfehler des Mittelwerts; unterschiedliche Kleinbuchstaben in derselben Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied im Mittelwert hin (P < HUS03099 0,05); dasselbe unten

Der Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von Hafersilage ist in Tabelle 12 dargestellt. Nach Zugabe von milchsäurearmen Bakterien waren der pH-Wert und das Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis von Hafersilage signifikant niedriger als CK (P < 0,05); Milchsäure, Gesamtsäuregehalt und

Milchsäure/Essigsäure-Verhältnis waren signifikant niedriger als CK (P < 0,05). höher als CK (P < 0,05). Die Behandlung mit Milchsäurebakterien verringerte den Gehalt an

Essigsäure und Propionsäure in Hafersilage (P < 0,05), aber Buttersäure wurde nicht in allen mit Milchsäurebakterien behandelten Hafersilage nachgewiesen. Die mit

PE+LPL+LPA behandelte Hafersilage hatte einen niedrigeren pH-Wert (3,97) und ein

Ammoniakstickstoff/Gesamtstickstoff-Verhältnis (51,9 g/kg), einen höheren

Milchsäuregehalt (38,5 g/kg TM) und Gesamtsäure Gehalt (44,1 g/kg TM).

Tabelle 12: Einfluss von Milchsäurebakterien auf die Fermentationsqualität von

Hafersilage

LA AA FA BA TA NHN raten p H fake DM} [ko DM) (wha DM) eke DK (ko PM} LATAR {uly

FIX Add HD} TER SEE Lae DEI MALE” EST had ¥5 HABE MERLE SBE 00HGI L404 ANTLLES ASS ulin

PE N2EEOT RELA A520 032007 Notdetected 348414” EHRE Sa

LPL AITEM0* 200408 AUTO Ga kl“ Notdeteded | 313223" TREES T3207

LEA 3SILOHÉ Moan RILOS GLOS Notdetected STHLIF* HZ SATA

PESLPLHLFA USTLOUS 3er 4302 nage’ Notdetected gg pba gifs’ SLELEET

SEM one ta G2 {3} a 14 4 #2 2.4 Wirkung von Milchsäurebakterien auf die Nahrungsbestandteile von Silage

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf die Néhrstoffkomponenten der alten, mit

Mangoweizen umwickelten Silage ist in Tabelle 13 gezeigt. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den lôslichen Kohlenhydraten der mit

Milchsäurebakterien und CK (P > 0,05) behandelten Weizensilage des alten Mannes und dem Rohproteingehalt der mit LPL, LPA und PE+LPL+ behandelten

Weizensilage des alten Mannes LPA war signifikant hôher als die von CK, LPA und

PE+LPL+LPA, HX und FA. Die Behandlung mit Milchsäurebakterien (P < 0,05) reduzierte die neutralen Waschmittelfasern in Silage, die mit altem Grannenweizen umwickelt war, aber der Unterschied zwischen sauren Waschmittelfasern und CK war nicht signifikant (P > 0,05). Die Behandlung mit Milchsäurebakterien (P < 0,05) verbesserte die In-vitro-Trockenmasseverdaulichkeit der alten Mango-Weizensilage, und die mit PE+HLPL+LPA behandelte alte Mango-Weizensilage hatte eine höhere

In-vitro-Trockenmasseverdaulichkeit (509,0 g/kg DM).

Tabelle 13: Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Néhrstoffkomponenten von umhüllter Silage aus altem Grannenweizen

000000000004 LU503099

DM op NDF Avr

WSC | Le IVOMD

Treats {eed kg DM ks DM] kg DM]

Treatment {ke} Gel DM Gia DIM ke DNS ka DAG tte DAD

CR 36141130 11.254 0 s0.8:0.8° S70.746.4" AEST dt 40088

HX 35375148 SER SERED SPASS 316.5428.7 444 $421 8°

FS 30588181 6.1442 SEGEL SEELE HORS ASEH

FE OIE U.2x3.2 Grae ss3 550 F REAR ESR 493.4333 1°

LBL 25004138 Wein 66.247.2° SE 206 39.1 OT GAR pa 164 8:41 7 10.928 SE SEN TRS 20188 402.5420.0°

PESLPLSTPA 36318142 17.5823 5.187.657 Sat hrs 4 BIS 34H18 SOP 0248

SEM 3.6 {LX LA LE RG 43

Die Auswirkungen von Milchsäurebakterien auf die Nährstoffzusammensetzung und die In-vitro-Trockenstoffverdaulichkeit von Hafersilage sind in Tabelle 14 dargestellt.

Die = lôslichen Kohlenhydrate und Saurewaschmittelfasern von mit

Milchsäurebakterien behandelter Hafersilage betrugen 8,9-17,7 g/kg TM bzw. 286,1- 313,5 g/kg TM, die sich nicht signifikant von CK unterschieden (P>0,05). . Der

Rohproteingehalt von mit LPA behandelter Hafersilage war signifikant hoher als der von CK und HX (P < 0,05). Der Gehalt an neutralen Detergensfasern und die

In-vitro-Verdaulichkeit der Trockenmasse von mit PE+LPL+LPA behandelter

Hafersilage waren signifikant hoher als bei anderen Behandlungen (P < 0,05).

Tabelle 14: Wirkung von Milchsäurebakterien auf die Nährstoffzusammensetzung von umhüllter Hafersilage

DM se CH aNDE ADF Asn

Treatment (pike) NE {aka DAN (aka TAD) fake DAD ML ve fail DIRES mo m ’ {pkp DMD

CE SHS 157412 FEAL SE 108 29864472 SIEHE

HX IE 89x44 78.960) STEEL 282 55143 S43Fa2i0®

FS MIS SUISSE 14 #32 83 930 8° STB 28734188 SARA

PE IE ESILS 157277 BOSH S6GMAELES RUEIL A 553282

LPL 1445226 164318 SE 388.30 10.6° SE 14162 3810ER

LFA S34 41146 17.7604.8 SpE RE DERE IYER SET ARLES

PESLPLALFA 30a3a228 LAGERN 45238 SERIES 208.1220,8 SRH

SEM 33 dé 36 2,59 3.9 6.0 5.5 Wirkung von Milchsäurebakterien auf die aerobe Stabilität von Silage

Die Wirkung von Milchsäurebakterien auf die aerobe Stabilität von verpackter Silage HUS03099 ist in Abbildung 12 dargestellt. Die aerobe Stabilität der mit PE behandelten Silage war höher als die der Kontrolle (P > 0,05). Die Behandlung mit Milchsäurebakterien hatte keine signifikante Auswirkung auf die aerobe Stabilität der umhüllten Silage (P>0,05), und die aerobe Stabilität der mit PE+LPL+LPA behandelten umhüllten

Silage war höher als die einer einzelnen Behandlung mit Milchsäurebakterien ( P>0,05). Die aerobe Stabilität der mit Altweizen umwickelten Silage war höher als die der mit Hafer umwickelten Silage (P > 0,05).

Die oben beschriebene Ausführungsform drückt nur die spezifische

Implementierungsweise der vorliegenden Anmeldung aus, und ihre Beschreibung ist vergleichsweise spezifisch und detailliert, kann aber daher nicht als Einschränkung des Schutzbereichs der vorliegenden Anmeldung interpretiert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass Fachleute mehrere Modifikationen und Verbesserungen vornehmen konnen, ohne vom Konzept der technischen Losung der vorliegenden Anmeldung abzuweichen, und diese alle zum Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung gehören.

Claims (2)

Patentanspruche 7508099

1. Gemischte Milchsäurebakterienzubereitung zum Einwickeln von Silage in alpinen Weidegebieten, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) 148 handelt, die Konservierungsnummer ist CGMCC Nr. 14117, die Konservierungsnummer ist Lactobacillus paracasei (Lactobacillus paracasei von CGMCC Nr. 14116) 171 und ethanolresistenter Pediococcus ethanolidurans P-14 mit der Hinterlegungsnummer CGMCC Nr. 14183.

2. Verwendung der Milchsäurebakterien-Mischzubereitung für Hiillsilage in alpinen Weidegebieten nach Anspruch 1 auf Hüllsilage.